TWI310788B - Enhanced production of lipids containing polyenoic fatty acids by very high density cultures of eukaryotic microbe in fermentors - Google Patents

Enhanced production of lipids containing polyenoic fatty acids by very high density cultures of eukaryotic microbe in fermentors Download PDF

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TWI310788B
TWI310788B TW093139784A TW93139784A TWI310788B TW I310788 B TWI310788 B TW I310788B TW 093139784 A TW093139784 A TW 093139784A TW 93139784 A TW93139784 A TW 93139784A TW I310788 B TWI310788 B TW I310788B
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Peter J Mirrasoul
Craig M Ruecker
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Tatsuo Kaneko
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Description

1310788 九、發明說明： t發明所屬之技術領域]1 本發明之相關領域 本發明係有關於一用於培養微生物並回收微生物的脂 5 質之新穎的方法。特別地，本發明係有關於生產微生物的 多元不飽和脂質。 C先前技術3 本發明之相關背景 在真核微生物中生產多烯酸脂肪酸（具有2或更多個不 10 飽和碳-碳鍵的脂肪酸）一般被§忍為是需要分子氧氣的存在 的（即有氧的情況）。這是因為在所有非寄生性真核微生物的 脂肪酸中形成的順式（cis)雙鍵，被認為牽涉到一直接需氧 的去飽和作用（氧化的微生物去飽和酶系統）。其他已知需要 分子氧氣的真核微生物脂質包括有真菌與植物硬脂醇、氧 15 基類胡蘿蔔素（即葉黃素）、輔酶Q與任何由這些脂質所製成 的化合物（即二次代謝產物）。 某些真核微生物（譬如藻類；真菌類，包括酵母菌；與 原生動物）已被證實為在發酵槽中的多烯酸脂肪酸之良好 生產者。然而，極高密度培養（生質（biomass)大於為約100 20 克/升，特別是在商業規模下）會導致多烯酸脂肪酸含量的減 少，並因此降低多烯酸脂肪酸的生產力。這可能係部分源 自於幾個因素，包括有因為在發酵培養湯液中高濃度的微 生物的南氧氣需求’導致的局溶氧量維持不易。用於維持 高溶氧量的方法包括有增加通氣速率、以及/或是使用純氧 5 1310788 而非空氣，以及/或是增加發酵槽的攪動速率。這些解決辦 法通常會增加生產脂質的成本與發酵設備的資金成本，而 且會導致額外的問題。例如，增加通氣作用會在高細胞密 度之發酵槽中輕易地導致嚴重的氣泡問題，而增加攪動作 5 用會因為在發酵培養湯液中增加剪力，而導致微生物細胞 破裂（這會導致該脂質釋放到將使其被氧化以及/或是被酵 素分解的發酵培養湯液中）。微生物細胞破裂對已經進行氮 氣限制或耗盡作用以誘發脂質之生成的細胞而言，係一增 加的問題，因其導致細胞壁變脆弱。 10 結果，當生產脂質的真核微生物成長到非常高細胞密 度時，其脂質通常僅含有非常少量的多烯酸脂肪酸。例如， 油脂酵母(Z/pomjKca 這種酵母菌在以醇類作為碳 源培養140小時到153克/升的密度時，所得到的脂質濃度為 83克/升。然而該酵母菌在濃度大於100克/升時，其多烯酸 15 脂肪酸含量僅佔全部脂肪酸的4.2%(自細胞濃度為20-30 克/升時之全部脂肪酸的11.5%驟降）。Yamauchi等人，
Tec/mo/·，1983, 61, 275-280。這導致了 一個僅有約 3.5克/升的多烯酸脂肪酸濃度與只有約0.025克/升/小時的 多烯酸脂肪酸生產力。另外，在該酵母菌的脂質中唯一發 20 現的多烯酸脂肪酸只有C18:2。 另一種酵母菌，紅酵母肋，被證實 具有約0.49克/升/小時的平均脂質生產力，但在其脂質中之 全部的多烯酸脂肪酸含量也是低的（全部脂肪酸的 ]5.8%，14.7%的C1 8:2與1.2%的C] 8:3)，導致於持續進行培 1310788 養的情況下，在批次培養(fed-batch)中僅有約0.047克/升/ 小時與0.077克/升/小時生產力。 在此之前本發明的發明人之一，已經證實了在破囊壺 菌目中，某些海生微生藻類可以成為發酵槽中很好的多烯 5 酸脂肪酸生產者，特別是當其培養在低鹽分含量以及尤其 是在低氯鹽含量下。其他被提及的破囊壺菌 (Thraustochytrids)在培養120小時後達到59克/升的細胞密 度後，展現了一約0.158克/升/小時的平均多烯酸脂肪酸 (DHA，C22:6n-3 ;與DPA，C22:5n-6)生產力。然而，此種 10 生產力僅在約50%的海水中，一種會導致不銹鋼發酵槽嚴 重腐蝕的濃度之中達成。 生產含有多烯酸脂肪酸的微生物脂質，特別是該高度 不飽和的脂肪酸，如 C18:4n-3、C20:4n-6、C20:5n3、 C22:5n-3、C22:5n-6與C22:6n-3，一部分由於該含有高多烯 15 酸脂肪酸真核微生物所能成長到之有限的密度，與在此種 高細胞濃度下的有限的氧氣供應，以及欲達成高生產力所 需的較高溫度，而使得其花費仍然很高。 因此，對於在有助於增加含有多烯酸脂肪酸脂質生產 之高濃度下培養微生物的方法仍然是有需要的。 20 【發明内容】 本發明之簡要說明 本發明提供培養能夠生產其生質之至少大約20% (biomass)的脂質的真核德[生物之一種方法，以及用於生產 該脂質的一個方法。該脂質係較佳地含有一或更多的多烯 1310788 酸脂肪酸。該方法包括加入一碳源，較佳地為一非醇類的 碳源，以及一限制營養源，到一含有真核微生物個發酵培 養液中。較佳地，該碳源與限制營養源係以一種足以增加 該發酵培養液之生質密度到大約100克/升的速率來加入。 5 在本發明的一個態樣中，發酵的條件包含有一生質密 度增加時期和一脂質生產時期，其中該生質密度增加時 期，包括有加入該碳源和限制營養源，而該脂質生產時期， 包括有加入該碳源而不加入該限制營養源以產生生產脂質 的狀況條件。 10 在本發明的另一個態樣中，在脂質生產時期中之發酵 培養液中的溶氧量，係較生質密度增加時期之發酵培養液 中的溶氧量來的低。 而在本發明的另一個態樣中，微生物係選自藻類、真 菌（包括酵母）、原生動物、細菌與其混合物的群組，其中該 15 微生物能夠生產一般被認為其合成是需要分子氧氣的多烯 酸脂肪酸或者其他的脂質。本發明之特別有用的微生物， 是能夠在不到3%飽和濃度的氧氣量之發酵培養液中生產 脂質的真核微生物。 仍然是在本發明的另一個態樣中，微生物係培養在一 20 批次培養（fed-batch)的過程中。 而仍然在本發明的另一個態樣中，在發酵過程後半部 分提供了在發酵培養液中維持不到3%飽和濃度的氧氣量。 本發明的另一個具體實施例，提供生產真核微生物脂 質的方法，其包括： 1310788 (a) 在一個發酵培養湯液中培養真核微生物，以至少增 加該發酵培養液的生質密度到約100克/升； (b) 提供使該微生物足以生產該脂質的發酵條件；與 (c) 回收該脂質， 5 其中超過15%的該脂質係為多元不飽和脂質。 本發明的另一個態樣提供了一個脂質回收方法，其包 括有： (d) 自該發酵培養湯液移除水份以取得乾的微生物；並 且 10 (e)自該乾的微生物分離該脂質。 較佳地，該移除水份的步驟包括在沒有先經離心下， 直接在一個筒型乾燥器上乾燥該發酵培養液。 本發明的另一個態樣提供一脂質回收方法，包括有： (d) 以通透化、溶解細胞或打破微生物細胞來處理該發 15 酵培養液；與 (e) 在有或沒有一水溶性溶劑的加入，以幫助一以打破 該脂質/水乳狀液的情況下，按比重分離的方式，較佳地為 一離心作用，自發酵培養液該脂質。 較佳地，在步驟(c)中該微生物細胞係在發酵槽或一類 20 似容器中進行處理。 在本發明的進一步態樣中，提供了一個增加微生物的 多烯酸脂肪酸含量的一個方法。該方法包括在有不到10% 溶氧量之一成長培養液中發酵該微生物。 本發明的進一步態樣，係用於生產產品與微生物的一 9 1310788 個異營方法。該方法包括有在一培養液中培養含有聚乙酰 合成酶基因的微生物，並維持不到約百分之10溶氧量。 圖式簡單說明 第1圖係為相對於發酵培養液中之溶氧量之各種脂質 5 的微生物生產參數之表和略圖。 I：實施方式3 本發明的詳細說明 本發明提供一培養微生物，如藻類、真菌（包括酵母）、 原生動物與細菌的方法。較佳地，該微生物係選自藻類、 10 原生動物與其混合物所組成的群組。更佳地，該微生物為 藻類。此外，本發明的方法能用於生產許多脂質化合物， 特別是不飽和脂質，較佳地為不飽和的脂質（即至少含有2 個不飽和碳-碳鍵的脂質，如雙鍵），與更佳地為高度不飽和 脂質（即至少含有4個或更多個不飽和碳-碳鍵的脂質），譬如 15 奥米加-3(omega-3 ; Ω-3)以及/或者奥米加-6(omega-6 ; Ω-6) 多元不飽和脂肪酸，包括二十二碳六烯酸 (docosahexaenoic，即DHA);與其他自然生成的不飽和、多 元不飽和與高度不飽和化合物。在這裡使用的字“脂質” 包括有磷脂質；游離脂肪酸；脂肪酸酯；三酸甘油酯；硬 20 脂醇與硬脂醚；類胡蘿蔔素；葉黃素（即氧基類胡蘿蔔素）； 碳氫化合物；類異戊二稀(isoprenoid)衍生化合物與其他在 本領域中之一般技藝所知的脂質。 更特別地，本發明的方法在生產真核微生物多稀酸脂 肪酸、類胡蘿蔔素、真菌的硬脂醇、植物的硬脂醇、葉黃 ]〇 1310788 素、輔酶Q ’肖其他一般相信在產纟不飽和碳-碳鍵時需要 氧氣（即需氧的條件）的其他類異戊二烯衍生化合物與其二 次代谢物時，是很有用的。特別地，本發明的方法對培養 會產生多烯酸脂肪酸的微生物與對生產微生物多烯酸脂肪 5 酸而言是很有用的。 但另一方面，本發明的方法能用於培養許多種微生 物’並獲得由其產生的含有多元不飽和脂質的化合物，為 了簡潔、方便與說明的緣故’本發明料細描述將討論用 以培養具有生產包括奥米加_3(〇mega_3 ; Ω_3)以及/或者奧 10米加_6(omega_6，Ω -6)多元不飽和脂肪酸的脂質之微生物 的方法，特別是能生產DHA(或其相關的化合物，如DpA、 EPA或ARA)的微生物。較佳的微生物包括有微生藻類、真 菌（包括酵母）、原生動物與細菌。較佳的微生物的一個小組 疋叫作的原生藻菌（汾⑺所⑼叩办)的成員’包括微生藻類與 15藻類類型的微生物。原生藻菌包括有下列的群組的微生物： Hamatores’ Proteromonads，蛙 μ 螽 B (0paiine)， Developayella，Diplophrys，網黏蛰魇（Labrinthulid)，琅囊 囷菌綱， Hypochytridiomycetes, Commation, Reticulosphaera， 20 Pelagomonas, Pelagococcus, Ollicola, Aureococcus, Parmales，專片暮(Diatoms)，音蘇忌（Xanthophytes)，竭薄 色（Phaeophytes ·，攝薄辕），Eustigmatophytes, Raphidophytes, Synurids, Axodines (♦Rh.izochromulinaales, Pedinellales，毛k 鞭条笆（DiciyochalesY), Chrysomeridales, Sarcinochiysidales, 11 1310788
Hydrurales，Hibberdiales與隼鞭金暮色 QChromulinales)。实 他較佳的微生藻類群組包括綠藻類的成員與溝鞭藻（雙鞭 毛蟲^ 目 ’ dinc^ageHate) ’ 包括滿鞭毛薄屬.（Crypthecodium) 這種屬的成員。更多特別的、更佳的本發明之具體實施例， 5將參照一培養特別是藻類之海生微生物的方法而加以討 論’如破囊壺菌目的破囊壺菌，更特別地是破囊壺菌屬和 裂殖壺菌屬的破囊壺菌目，包括其係揭示於一起讓渡給 丑31^^的美國專利第5,340,594與5,340,742號之中的破囊 壺菌目’其全部在此一併提供作為參考。應該注意的是許 10多專家同意，吾肯氏壺菌屬不是獨立的屬，而實際上是裂 殖壺菌屬的部分。如同在此所使用的，該裂殖壺菌屬將包 括吾肯氏壺菌屬。 較佳的微生物是經由聚乙酰(polyketide)合成酶系統， 生產感興趣之化合物的微生物。此種微生物包括具有一内 15生性聚乙酰合成崦系統微生物與一以基因工程轉殖入聚乙 酰合成酶系統的微生物。聚乙酰是具有各式各樣的生物活 性之結構上多樣化的天然產物，包括有抗生素和藥理學上 的特性。聚乙酰碳鏈主鏈的生物合成，是由聚乙酰合成酶 催化的。就像結構上與機制上相關的脂肪酸合成酶一般， 20聚乙酰合成酶重複催化在醯基硫酯之間的去羧基縮合作 用’在一次的反應中將該碳鏈延伸兩個碳。然而，聚乙酰 合成酶不像脂肪酸合成酶一樣，能夠產生較大結構可變異 性最終產物。藉由改變在每一個縮合作用後形成的酮基 (beta-keto group)上之還原反應、脫水作用和脂稀醯基的還 12 1310788 原作用，以及利用曱基-或乙基-丙二酸（methyl- or ethyl-malonate)作為延伸單元，單一聚乙®t合成酶系統，能 夠經由使用除了醋酸鹽以外的起始單元進行此作用。在這 裡特別感興趣的是由脫水步驟引入的碳-碳雙鍵，可以被保 5 留在最終產物中。進一步的說，雖然這些雙鍵最初是在反 式（trans)結構中，但是他們能夠藉由酵素的異構化 (isomerization)作用，轉變成在DHA(與其他感興趣的多稀酸 脂肪酸）中發現的順式（cis)結構。脫水酶的作用與異構化作 用反應都能夠在沒有分子氧氣的情況下發生。 10 較佳地，依據本發明提供了一用於生產產品與微生物 的異營方法。該方法係較佳地包括在一個成長培養液中培 養微生物，其中該微生物具有一個聚乙酰合成酶系統。較 佳地溶氧量係維持在不到大約百分之8、更佳地在不到大約 百分之4、再更佳地在不到百分之3且又更佳地在不到大約 15 百分之1。 然而，這為了去理解本發明，而非要本發明的整體如 此受到侷限，依照這裡的討論，習於此藝者將明白，本發 明的概念適用於產生許多其他化合物的其他微生物，包括 了其他脂質組成物。 20 假設藻類有一個相對不變的脂質生產速率，很明顯 的，更高的生質（Biomass)密度將導致每單位體積生產更高 總量的脂質。現行一般的藻類培養發酵方法，可以得到50 到80克/升或者更少的生質密度。本發明的發明者發現透過 本發明的方法，能夠達到較目前所知的生質密度有意義地 13 1310788 更问的生質密度。較佳地，本發明的方法產生至少大約100 克/升的生質密度，更佳地至少大約13〇克/升，再更值地至 少大約150克7升’又更較佳地至少大約170克/升且最隹地大 於克/升。因此，在這樣的一高生質密度下，即使該藤 5類的月曰貝生產率輕微地減少，該脂質每體積的總生虞率車乂 目前所知道的方法有意義地更高。 本發明之用於培養破囊壺菌目微生物的方法，包括有 藉由足以增加上述之發酵培養液中的生質密度之速率，加 入奴源與一限制養份到含有該微生物的發酵培養液中。 10如同在這裡使用的_樣，“限制營養源”這個術語孫指對於 -個對微生物的成長科或缺的營養源（包括有该營養本 身）田限制養分從成長培養液耗盡時，它的缺乏將實質上 限制該微生物的進—步生長或者複製。然而，因為其他的 皆養物仍然充裕’該有機體能夠繼續製造與累積細胞肉的 _/或、”曰胞外的的產物。藉由選擇特別的限制養分，人們能 夠控制累積產物的種類。因此，以某種速率提供限制營養 源使彳于人們能夠同時控制微生物成長速率與所欲產物（例 寊）勺生產或累積。此種在一增加量(increment)中加入 或更多的基質（例如一碳源與限制營養源）的發酵方法，通 ¥稱作個批次培養(fed-batch)的發酵方法。現已發現當該 貝力至抵次發酵過程（batch fermentation process)，該 大量出現的碳源（例如大約克/升或超過每60克/升的生 質密度)對該微生物有—個不利影響。沒有任何理論依據， 人們相L此種大量的碳源，對微生物產生包括渗透屢的不 14 1310788 利影響，並抑制微生物的初始生產力。在提供足量的基質 二達到上述的該微生物生f密度時，本發明的方法避免了 該非所欲的不利影響。 10 15 20 本發明之用於培養微生物的方法，包括了—生質心 1加時期。在生質密度增加時射，該發酵方法的首要= f是要增加發酵培養液巾的生質密度’叫得上述的生質 密度。該碳源的加入速率係典型地維持在—不會對該微: 物生產力或微生物造成不利影響，或因為該發酵裝備容量 不足以自該液體培養湯液中移除熱量與交換氣體，所導致 的對該微生物之生存能力造成一有意義的不利影響之特定 程度或範圍。在發酵過程期間特定微生物所需要的該碳源 之數量的適當範圍，係為習於此藝者所熟知的。較佳地， 本發明之-碳源為一非-醇類的碳源，即—不含醇類的碳 源。如同在這裡所使用的-樣，“醇類，，這個術語係指一呈 有一經基的4個或更少個碳原子的化合物，例如，甲醇、乙 醇與異丙醇，但對為了本發明的目的不包括如乳酸與類似 的化合物的經基有機酸。更佳地，本發明的碳源是一個碳 水化合物，包括有但不局限於果糖、葡萄糖、薦糖、糖密 與殿粉。其他合適的單元與複合的碳源和氮源，揭露於上 述引為參考的專利中。然而，典型地，一碳水化合物，較 佳地為玉米糖浆’係用作主要的碳源。以經基脂肪酸的形 式之脂肪酸、三-甘油脂、愈-4 Γ7留, I μ- 舳興和早-甘油脂的形式的脂肪 酸也能夠當作碳源。 特殊較佳的氮源為尿素、硝酸鹽、亞硝酸鹽、大豆蛋 15 1310788 白質、氨基酸、蛋白質、玉米浸液、酵母萃取物、動物副 產品、無機銨鹽、更佳地硫酸鹽、氫氧化物的銨鹽，而最 佳地是銨氫氧化物。其他限制營養源包括有碳源(如上述定 義）、填酸來源、維生素來源(例如維生素B12來源、泛酸鹽 5 (pantothenate)來源、硫胺素來源）、和微量的金屬來源（例如 鋅源、銅源、钻源、鎳源、鐵源、猛源、顧源），以及主要 金屬來源（例如鎂源、舞源、納源、鉀源與石夕源等等）。微量 金屬來源和主要金屬來源，包括有這些金屬的硫酸鹽和氯 化物的鹽（例如，但不局限於MgS〇4 · 7H2〇、MnCL · 4H2〇、 10 ZnS04 · 7H20、CoCl2 · 6H20、Na2Mo04 · 2H20、CuS04 · 5H20、NiS04 · 6H20、FeS04 · 7H20、CaCl2、K2S04、KC1 與Na2S04)。 當以4安作為氮源時，如果不經由添加驗或者缓衝液來 調控，發酵培養液將變為酸性。當以氫氧化銨作為主要氮 15 源時，其也可以用作pH值的調控。破囊壺菌目此種微生物， 特別是在破囊壺菌屬與裂殖壺菌屬中的特定破囊壺菌，可 以生長在如pH 5到pH 11的廣大範圍中。對一個特定微生物 進行發酵的適當pH值，係為習於此藝者的知識領域。 本發明之培養微生物的方法也包括了生產時期。在這 20 個時期，該微生物使用該基質的主要用途，不在增加生質 密度而是用該基質來生產脂質。應該瞭解的是，在生質密 度增加時期的期間，該微生物也生產脂質；然而，如上所 述，生質密度增加時期中的主要目地是要增加生質密度。 典型地，在該生產時期期間限制養分基質的加入，係被減 16 1310788 少的或較佳地被停止。 以往一般相信，在發酵培養液中含有溶解氧氣，對於 真核微生物生成包括Ω-3與/或Ω-6之多元不飽和脂肪酸的 多元不飽和化合物是至關緊要的。因此，一般相信在發酵 5 培養液中含有相對大量的溶解氧氣係較佳的。然而，令人 驚訝地和出乎意料地，本發明的發明者發現，當減少該生 產時期期間的溶氧氣量時，脂質的生產速率會急劇增加。 因此，在該生質密度增加時期的期間發酵培養液中的溶氧 量較佳地係至少約8%飽和濃度的含量，且更佳地至少約 10 4%飽和濃度的含量，而在該生產時期期間發酵培養液中 的溶解氧氣減少到約3%飽和濃度的含量或者少，較佳地約 1%飽和濃度含量或者少，且更佳地約〇%飽和濃度的含 量。在發酵開始時溶氧量值可能為飽和濃度或接近飽和濃 度，並且在該微生物生長時，其將會趨向於降低到這些低 15 溶氧量預設值。在本發明的一個特定具體實施例中，在發 酵培養液中的溶氧量在發酵過程期間會改變。譬如，對總 發酵時間為約90小時到約100小時的發酵過程而言，在開始 的24小時發酵培養液中的溶氧量維持在約8%，在約24小時 到約40小時為約4%，而從約40小時到發酵過程結束為約 20 0.5%或更少。 發酵培養液中的溶氧量能夠藉由控制發酵槽的上部空 間（head-space)中的氧氣量而加以調控，或較佳地藉由控制 該發酵培養液的擾動（或授拌）加以調控。譬如，高擾動（或 攪拌）速率較低攪動速率會導致在發酵培養液中之相對更 17 1310788 高的溶氧量。例如，在一約14,000加侖容量之發酵槽中， 在開始的12小時，把攪拌速率設定在從大約50轉/分到70 轉/分，在大約12小時到大約18小時的期間為約55轉/分到約 80轉/分，而自大約18小時到發酵過程的結束為約70轉/分到 5 約90轉/分，以在大約90小時到大約100小時的總發酵過程 時間中達到上面討論的溶氧量。為了在發酵培養液中達到 特定溶氧量之特定授拌速度範圍，是能夠輕易地由一個一 般的習於此藝者來確定的。 本發明之方法的一個較佳溫度為至少約20°C，更佳地 10 為25°C，最佳地為30 °C。 應該理解的是冷水比暖水能夠保有更高的溶氧量。因 此，一個較高的發酵培養液液溫具有減少溶氧量的附加優 點，其係如同上述一般特別適宜。 某些微生物在發酵培養液中可能需要某種數量的鹽水 15 礦物。這些鹽水礦物、尤其是氯化物離子，會導致發酵槽 與其他下游處理設備的腐蝕。為了避免存在發酵培養液中 的相對大量的氣化物離子所導致非所欲的效應，本發明的 方法也包括使用含有非-氣化物的鈉鹽，較佳地為鈉硫酸 鹽，以在發酵培養液中作為鈉來源。更特別地，發酵作用 20 中納需求的主要部分係由含有非氯化物的納鹽來提供。例 如，發酵培養液中不到約75%的鈉，係以鈉氯化物供給更 佳地不到約50%，且又更佳地不到約25%。本發明的微生物 能夠在不到約3克/升的氣化物濃度中生長，較佳地不到約 500毫克/升，更佳地不到約250毫克/升，且又較佳地在約60 18 1310788 毫克/升和柄1戰克/升之間。 化物之混2化!7_鹽包括小蘇打灰(碳酸納和納的氧 °和妷酸鈉、碳酸氫鈉、硫酸鈉和其混八物 25克/升 =::二小r、_—:於増 、㈣龍需要控制步驟以維持培養液的 、田P。硫酸鈉的濃度是足以滿足該微生物的鹽濃声雨 求的’較佳地此納濃度（以克/升的鈉表示)係至少！克而 更佳地k約1克/升到約如克/升，又更佳地從約2克/升到約 1〇 在美國專利第5，130,242號中，詳盡地討論對於接種、 i。養與回收微生物的各種發酵參數，其全都在這裡一併以 供參考。任何目前已知的分離方式，都能夠用來自發酵培 養液中分離微生物，包括有離心、過遽、超高速離心、重 覆傾析法和溶劑蒸發作用。本發明的發明者發現，由於本 15發明的方法所產生的的一高生質密度，當使用離心作用來 回收該微生物時，透過加入水來豨釋該發酵培養液是較佳 的，這將會減少生質密度，因而使得微生物能更有效的自 發酵培養液中分離。 本發明所達到的很高的生質密度，也有助於“無溶劑，， 20 的微生物脂質回收方法。用於在發酵槽中溶解細胞的較佳 方法’描述於2000年1月19日提出申請，標題為 ”SOLVENTLESS EXTRACTION PROCESS"之美國申請案 號第60/177,125號之暫准專利中、2001年1月19日提出申 請，標題為”SOLVENTLESS EXTRACTION PROCESS” 申 19 1310788 請序號第----------號之美國專利，與2001年1月19曰
提出申請，標題為 ”SOLVENTLESS EXTRACTION ------------------ 利，在這裡一併提供作為參考。在發酵槽中，一旦這些細 10 胞是可通透性的、破裂的或溶解的（其使得該脂質乳狀物被 打破而富有脂質的部分得以被回收），較佳的回收該脂質的 方法，包括W0 96/05278中所略述的去油方法，在此一併提 供作為參考。在這個方法中的水溶性化合物，例如醇類或 甲_ ’被加人油/水乳狀液中，而所得_混合液以比重分 離法’例如離心作用，加以分離。這個過程能夠變更為使 用其他試劑（水溶性與/或脂溶性）來打破該乳狀液。 15 20 PROCESS”申請序號第 另外，該乾燥的微生物經由蒸發發酵培養液的水而自 發酵培養液回收，例如經過直接將該發酵培養液與一鼓式 乾燥器裝置接觸（即不經如離心作用之預先濃縮作用），即>一 個直接鼓式絲器之时過程（方朴此直接鼓式乾 燥器回收方法來分賴生物時，典型料❹—個基汽加 ㈣鼓式朗11。此外當❹直接鼓式乾燥㈣收方法 時，發酵培養液的生質密度係較佳地至少13〇克/升，更佳 地^少是約15Q克/升，最佳地至少⑽克/升。此高生質密度 通常為直接鼓式賴過賴需的，因為在—低生質 密度’發酵培魏具有足量的水簡著地冷卻此鼓，因而 導致該微生物的乾燥不完全。其他乾燥細胞的方法，包括 喷灌乾燥法，為-般習於此藝者所知。 本發明的方法提供-至少約〇.5克/升/小時的平均月旨質 20 1310788 生產速率’較佳地至少約0.7克/升/小時，更佳地至少約〇·9 克/升/小時，最佳地約L0克/升/小時。此外，由本發明的方 法生產的脂質，所含有的多元不飽和脂質數量大於約 15%，較佳地大於約2〇%，更佳地大於約25%，再更佳地大 5於約3 G %，最佳地大於約3 5 %，f能夠從乾的微生物或者 從發酵培養液中的微生物之一中回收。一般而言，至少約 20%由本發明之方法中的微生物的脂質為Q _3與/或ω _6 之多元不飽和脂肪酸，較佳地至少大約3〇%的脂質為Ω 與/或Ω-6之多元不飽和脂肪酸，更佳地至少大約4〇%的脂 10負為卩-3與/或Ω -6之多元不餘和脂肪酸，且最佳地至少大 約50%的脂質為Ω_3與/或Ω_6之多元不飽和脂肪酸。另 外，本發明的方法提供一個平均為至少0.2克Ω_3脂肪酸 (例如DHA)/升厂j、時的Ω -3脂肪酸(例如ΟΗΑ)的生產速率， 較佳地至少0.3克Ω-3脂肪酸(例如DHA)/升/小時，更佳地至 15 少〇.4gQ-3脂肪酸（例如DHA)/升/小時，與最佳地至少〇 5 克Ω -3脂肪酸(例如DHA)/升/小時。另外，本發明的方法提 供一個平均為至少〇.〇7克Ω -6脂肪酸（例如DPAN-6)/升/小 時的Ω -6脂肪酸(例如DPAN-6)的生產速率，較佳地至少〇 1 克Ω -6脂肪酸（例如DPAN-6)/升/小時，更佳地至少〇. 13克 20 Ω-6脂肪酸(例如DPAN-6)/升/小時，與最佳地至少〇· 17克Q -6脂肪酸(例如DPAN-6)/升/小時。又另外，至少約25%的脂 質為DHA(以脂肪酸甲基酯的總量為基準），較佳地至少約 30%，更佳地至少約35%與最更佳地至少約40%。 脂質從而萃取的微生物，在經脂質萃取以後剩餘的該 21 1310788 生質或其合併物，可以直接作為食品原料，如飲料、醬汁、 乳品為主的食物（譬如牛奶、酸奶、乳酷與冰淇淋）與烘培商 品的原料；營養補充品（以膠囊或藥錠的形式）；提供任何一 種其肉或產品係供人類消費之用的動物之餵食或餵食物的 5 補充；包括了幼兒食品與嬰兒特別配方之食品添加物；與 藥物（間接或附屬的治療應用）。”動物”這個字代表了任何 屬於動物界(kingdom Animalia)的生物，同時，並非限制地， 包括了，從而獲得家禽肉、海鮮、牛肉、豬肉或者小羊肉 的任何動物。海鮮係，並非限制地，來自魚、小蝦與貝類。 10 ”產品”這個字包括除了肉以外的任何從這樣的動物獲得的 產品，並非限制地，包括了雞蛋、牛奶或者其他的產品。 當餵食此種動物時，多元不飽和脂質能夠結合到肉牛奶、 雞蛋或此種動物的其他的產品裡，以增進其之該種脂質的 含量。 15 本發明之另外的目的、優點與新穎的特徵，對習於此 藝者而言在以下並不是要來侷限本發明的實施例之驗證下 將更顯著。 實施例 在不同的發酵條件下，在這些例子中所使用的裂殖壺 20 菌屬菌株，以約3:1的比例產生兩種主要的多烯酸，DHAn-3 與DPAn-6，以及少量的其他多稀酸，例如EPA與C20:3。 因此，雖然下面的例子僅列出DHA的數量，人們可以藉由 使用上面所述的生產比例輕易地計算DPA(n-6)生產數量。 實施例1 22 1310788 此實施例說明了發酵培養液中的氧氣含量對脂質生產 力的影響。在許多不同程度的溶氧量下測量裂殖壺菌屬 ATCC第20888號菌株的發酵結果。其結果表示在第1圖中， 其中RCS為糖的剩餘濃度，而DCW是乾細胞的重量。 5 實施例2 此實施例也說明了發酵培養液中，低氧氣含量對最後 的生質產物之DHA含量之影響。 “縮小規模（scale-down)，，類型的實驗在250毫升的 Erl enmeyer燒瓶中進行，以模擬在大規模發酵槽培養的裂殖 10 壺菌種中，低氧氣含量對DHA含量的影響。裂殖壺菌種 (ATCC 20888)係培養在04-4培養液中。每升的培養液含有 以下溶解在去離子水中的成分：Na2S0412.61克；MgS04 · 7H20 1.2克；KC1 0.25克，CaCl2 0·05克；單鈉榖氨酸鹽7.0 克；葡萄糖10克；ΚΗ2Ρ〇4 0.5克；NaHC03 〇_1克；酵母萃 15 取物0.1克；維生素混合物1.0毫升；PII金屬1·00毫升。PII 金屬混合物含有（每升）：6_0克NazEDTA、0.29克FeC3 · 6H20、6.84克H3B〇3、0.86克MnCl2 · 4H20、0.06克 ZnCl2、 0.026克 CoCl2 · 6H20、0.052g NiS04 · H20、0.002克 CuS04 · H20與0.005克Na2Mo04· 2H20。維生素混合物含有（每升）： 20 100毫克硫胺素、0.5毫克維生素Η與0.5毫克維他命B12。此 培養液的pH值調整至7.0然後過濾滅菌。 縮小規模實驗背後的概念，係在近乎全滿之燒瓶中以 不同體積的培養液來培養細胞，（例如在25〇毫升搖動的燒 瓶中裝入200毫升的培養液），將無法在搖動桌上混合均 23 1310788 勻，而因此在細胞生長時，將會造成低溶氧量的情況。因 此，在實驗中制定了 4種處理方式，每一中都施行兩組：（1) 250毫升燒瓶裝滿50毫升的培養液；（2)250毫升燒瓶裝滿 100毫升的培養液；（3)250毫升燒瓶裝滿150毫升的培養液； 5 與(4)250毫升燒瓶裝滿200毫升的培養液。八個燒瓶中每一 個都接種以第一種處理方式，在28°C下220轉/分的振盪桌 上，用04-4培養液培養48小時的裂殖壺菌老細胞。該實驗 所有的八個燒瓶，係置於培養器中（28°C)之振動桌上（220 rpm)，並在黑暗中培養48小時。在實驗的末尾，用YSI溶氧 10 計測量每一個燒瓶子中的溶氧量，並測定培養液的pH值， 同時測量細胞的乾重量與其脂肪酸含量。實驗的結果略述 於表1。 表1.低溶氧濃度對裂殖壺菌的長鏈高度不飽和脂肪酸 (DHA%乾重）含量的影響的實驗結果。 培養液體積 (毫升） 脂肪酸曱基 酯(％TFA) DHA (%乾重） 生質 (克/升） 最終的 PH值 溶氧量 (%飽和） 50 16.5 7.4 4.2 7.4 31 100 17.0 6.5 3.9 7.2 29 150 22.4 9.2 2.7 7.0 11 200 35.9 14.5 1.8 6.9 3 15 該結果說明了在低溶氧量下培養的細胞之脂質含量（％ 脂肪酸曱基酯）與DHA的含量（％乾重）較高一溶氧量越低， 脂質和DHA的含量越高。這是未曾預料到的，因為一般相 信氧氣係形成去飽和（雙）鍵所必需。在低溶氧量的情況下有 那麼多的DHA生成是令人驚奇的，因為DHA是最不飽和的 24 1310788 脂肪酸之…雖然在溶氧量減少的情況下產生的生質會減 少’但是DHA的含量卻會增加。因此，在成長階段使用較 2的溶氧f以達到最大的生質生成量，_用較低的溶氧 ΐ以達到最大的長鏈脂肪酸的產生量是有利的。 5 實施例3 這個例子說明本發明方法的可再現性。 以—標示的工作體積為U00加侖的發酵槽生產微生 2。將所得到的發酵培養湯液濃縮並且以—鼓式乾燥器將 微生物乾燥。萃取與純化來自所得到的完整微生物之脂 10質，以得到精製的、變白的、除臭的油。為了添加營養的 目的在分析脂質之前加入大約百萬分之3，_的dl*維他 命E 〇 以裂殖壺菌ATCC第20888號菌株進行九組的發酵作 用、，其結果表示在表2中。溶氧量在開始的24小時期間是大 15約為8°/°，之後大約為4%。 25 1310788 表2.自裂殖壺菌中生產DHA的批次培養(Fed-batch)發酵作用。 組別 培養時間 (小時） 產率1 (克/升） DHA2 (%) 脂肪酸甲基酯3 (%) 生產力4 1 100.3 160.7 17.8 49.5 0.285 2 99.8 172.4 19.4 51.3 0.335 3 84.7 148.7 14.4 41.4 0.253 4 90.2 169.5 19.7 53.9 0.370 5 99.0 164.1 12.5 38.9 0.207 6 113.0 187.1 19.7 47.2 0.326 7 97.0 153.5 13.7 41.0 0.217 8 92.8 174.8 16.4 48.6 0.309 平均值5 97.1 166.4 16.7 46.5 0.288 標準差6 8.4 12.3 2.9 5.4 0.058 變異係數7 (%) 1 付 8.7 7.4 17.3 11.7 20.2 i 生質密度的實際產量。 ' - 2_ 以細胞乾重之百分比表示的DHA含量。 3. f細胞乾重之百分比表示的脂肪酸總含量（以曱基酯測 量）。 (DHA克數）/升/小時。 平均值。 標毕差 10 4. 5. 6. 變異係數。變異係數低於5%表示—個有 3法，變異係數界於5%和〗〇%之間表示一 的可再現性的方法。 之間表不一個合理 加入玉米糖漿直到發酵槽中的的體積到達約】2㈨加 命’在此時停止加人玉米㈣。―旦殘餘葡萄糖濃度低於; 克/升發酵過程便會停止。從接種到最後的典型 約100小時。 疋大 發酵培養湯液，即，發酵培養液，以約2:1的比例用水 26 15 Ι31〇788 稀釋以減少最终產物的殘骸含量，進而幫助改善在離心步 ~期間的相位分離效果(phase separation)。將該濃縮細胞的 糊狀物加熱到l6〇°F(約71°C)並以一Blaw Knox雙-鼓式乾 無器（42”χ3 6”)乾燥。然而，較佳地，微生物係不經離心在 ~個鼓式乾燥器上直接乾燥。 自表2中每個組別之整體中萃取的脂質之分析結果，如 表3所概述。
4·變異係數。變異係數低於5%表示一個有極佳的可 的方法’變異係數界於5%和10%之間表示一個^再現性 15 現性的方法’變異係數界於10%和20%之間表千，可再 的可再現性的方法。 不—個合理 除非有特別說明，在實施例部分中所使用的發酵拉、 :3有下列成分，其中第一個數目表示其標示的預定: 度，而在括弧中的數目表示其可接受的範圍：硫醆鈉 〜兄/ 27 1310788 升（11-13) ; KCl 0.5克/升(0.45-0.55) ; MgS04 · 7H20 2克/升 (1.8-2.2) ; Hodag K-60 antifoam 0.35克/升(0.3-0.4) ; K2S〇4 〇.65克/升.(0.60-0.70);1012?041克/升（0.9-1.1);@：94)23041 克/升(0.95-1.1) ; CaCl2 · 2H20 0.17克/升(0.15-0.19) ; 95DE 5 小麥糖漿（固態基礎)4.5克/升(2-10) ; MnCl2 · 4H20 3毫克/ 升(2.7-3.3) ; ZnS04 · 7H20 3毫克/升(2.7-3.3) ; CoCl2 · 6H20 0.04 毫克/升（0.035-0.045) ; Na2Mo04 · 2H20 0.04 毫克/升 (0-0.045);(^1804.51120 2毫克/升（1.8-2.2);沖804.61120 2毫克/升（1.8-2.2) ; FeS04 · 7H20 10毫克/升(9-11);硫胺素 10 9.5毫克/升(4-15);;維他命B12 0.15毫克/升（0.05-0.25)與泛酸 名丐（Calcium Pantothenate) 3.2毫克/升（1.3-5.1)。另外，利用 28%的NH4OH溶液作為氮來源。 乾的微生物殘骸含量約為重量的6%。 實施例4 15 本實施例說明在14,000加侖的規模下，在發酵培養液 中減少的溶氧量對微生物生產力的影響。 利用如實施例3中所描述的方法，使用一裂殖壺菌的野 生型來進行一標示體積為14,000-加侖發酵作用，該野生型 的裂殖壺菌可藉由上述的美國專利第5,340,742號與第 20 5,340,594號所揭示的分離方法而獲得。在開始的24小時 間，發酵培養液中的溶氧量大約是8%，從第24小時到第40 小時大約是4%，而從第40小時到發酵過程結束大約為 0.5%。在發酵過程中培養液的低溶氧量的結果如表4中所 示。 28 1310788 表4.在減少的溶解氧氣濃度中，14,000-加余規模的裂瘦壺 菌批次培養(fed-batch)發酵作用結果 組別 培養 時間 (小時） 產率 (克/升） %DHA %脂肪酸 甲基酯 %DHA含量相 對於脂肪酸甲 基醋含量 DHA 生產力 (DHA之克 數/升/小時) 1 82.0 179.3 21.7 52.4 41.4 0.474 2 99.0 183.1 22.3 55.0 40.5 0.412 3 72.0 159.3 - - 40.9 - 4 77.0 161.3 - - 43.2 - 5 100.0 173.0 23.9 53.3 44.9 0.413 6 102.0 183.3 21.6 50.8 42.6 0.388 7 104.0 185.1 23.7 55.0 43.1 0.422 8 88.0 179.3 22.3 52.6 42.4 0.454 9 100.0 166.4 22.5 53.5 42.1 0.374 10 97.0 182.6 22.8 51.6 44.1 0.429 11 87.5 176.5 19.8 45.6 43.5 0.399 12 67.0 170.8 18.8 48.1 39.1 0.479 13 97.0 184.9 23.2 52.7 44.0 0.442 14 102.0 181.9 23.6 52.9 44.6 0.421 15 102.0 186.9 19.9 47.8 41.8 0.365 16 97.0 184.4 19.6 45.5 43.0 0.373 17 98.0 174.7 19.7 45.1 43.7 0.351 18 103.5 178.8 18.3 44.5 41.2 0.316 19 102.0 173.7 15.8 43.1 36.7 0.269 20 94.0 190.4 19.3 46.9 41.1 0.391 21 72.0 172.5 22.8 52.8 43.2 0.546 22 75.0 173.1 21.0 51.7 40.8 0.485 23 75.0 152.7 20.3 50.3 40.4 0.413 24 75.5 172.5 21.9 51.7 42.3 0.500 25 61.0 156.4 17.3 45.7 37.8 0.444 26 74.5 150.6 20.2 50.1 40.2 0.408 27 70.5 134.3 14.8 40.6 36.6 0.282 28 75.5 146.1 21.3 49.7 42.8 0.412 29 82.0 174.3 21.4 50.4 42.5 0.455 30 105.0 182.3 21.7 50.7 42.8 0.377 31 66.0 146.2 16.4 44.6 36.7 0.363 平均值 87.2 171.5 20.6 49.5 41.6 0.409 標準差 13.9 14.1 2.4 3.8 2.3 0.061 變異 係數 16.0% 8.2% 11.6% 7.7% 5.5% 15.0% 29 1310788 實施例5 本實施例說明在41,000加侖的規模下，發酵培養液中 減少的溶氧量對微生物生產力的影響。 除了是在41,000加侖的發酵槽中進行發酵之外，本實 5 施例運用如實施例4中所描述的方法。增加培養液的體積以 在此規模下維持預定的化合物濃度。結果如表5中所示。 表5. 41,000-加侖規模的裂殖壺菌發酵作用。 組別 培養 時間 (小時） 產率 (克/升） % DHA %脂肪酸 甲基酯 %DHA相對 於脂肪酸曱 基酯之含量 DHA生產力 (DHA克數/升/ 小時） 1 75.0 116.1 17.3 46.1 37.4 0.268 2 99.0 159.3 17.4 47.0 37.1 0.280 3 103.0 152.6 16.0 47.2 33.8 0.237 4 68.0 136.8 17.9 45.9 39.1 0.360 5 84.0 142.0 17.5 47.0 37.2 0.296 平均值 85.8 141.4 17.2 46.6 36.9 0.288 標準差 15.1 16.6 0.7 0.6 1.9 0.046 變異係數 17.5% 11.8 4.2% 1.3% 5.2% 15.8% 實施例6 本實施例說明在本發明在發酵過程中額外的氮之影 10 響。 以類似實施例4的步驟，進行四組250-升規模的批次培 養貫驗。 進行兩組控制組與兩組具有額外的氨（正常數量的1.15 和1.25倍）之實驗組的實驗。結果如表6所示。 30 1310788 表6·額外的氨對裂殖壺菌發酵作用的影響。 培養 時間 (hrs) 產率 (克/升) 生質 生產力 轉換 效率 DHA 含量 脂肪酸曱 基酯含量 DHA 生產力 預設賴 濃度：7克/升，鹼性pH值設定值：5_5，酸性pH值設定值：7.3 48 178 3.71克/升/小時 51.5% 10.7% 37.8% 〇.4〇克/升ΛΙ、時 60 185 3.08克/升/小時 46.9% 16.3% 47.2% 0.50克/升/，丨、時 72 205 2.85克/升/小時 45.2% 17.4% 47.4% 0.50克/升/小時 84 219 2-61克/升/小時 43.8% 17.1% 45.5% 0.45克/升/小時 90 221 2.46克/升/小時 44.1% 18.4% 48.9% 0.45 克/升 預設糖 7克/升，鹼性pH值設定值：5.5，酸性 值設定值：7.3，l.i5Yxm_ 48 171 3.56克/升/小時 55.6% 12.0% 36.3% 0*43克/升/小時 60 197 3,28克/升/小時 54.6% 9.4% 38.4% 〇·31克/升/小時 72 191 2.65克/升/小時 52.8% 9.4% 40.0% 0·25克/升/小賠 84 190 2.26克/升/小時 52.5% 10.0% 42.5% 0.23克/升/d、n主 90 189 2.10克/升/小時 52.2% 9.2% 43.3% 0.19克/升/小時 預設糖 濞度：7克/升，鹼性pH值設定值：5.5，S曼性 )H值設定{ t: 73 > L255TnjhT 48 178 3.71克/升/小時 56.4% 11.5% 33.7% 〇_43克/井八|、只主 60 179 2.98克/升/小時 48.6% 10.3% 36.0% - /U' J\ / \ tlrf 0.31克/升時 72 180 2·50克/升/小時 48.8% 12.0% 37.6% 0*30克/升/小時 84 181 2·15克/升/小時 46.1% 13.6% 40.1% 0.29克/升/小啤 90 185 2.06克/升/小時 45.7% 12.6% 40.7% 〇·%克/升/小睹 • 一_ · ------- 1 預汉楓 HI ^ V升’鹼性pH值设定值：5_5，sm pH值設定值：7 3， 48 158 3_29克/升/小時 55.7% 13.1% 36.5% --— 0.43 弃 生’ 60 174 2.90克/升/小時 48.9% — _ 17.9% 39.2% ^ 7T/y in a-s· 0.52 克/升 72 189 2.63克/升/小時 45.7% 21.0% 39.4% 0.55夯/弁"1、〇主 84 196 2.33克/升/小時 44.8% 22.4% 22.1% 40.1% 40.3% -Q·52 0.51 秀 /手(~Λι、η 主 90 206 2·29克/升/小時 —般而言，額外的氮氣對發酵十 隹用有一 Α 几/ 丁1 "J、ϋ今 ** —j 負面的影響， 警如，在兩批增加額外氨的實驗組中所發現的〇1^八生產力 之顯著降低。如表6所示’相較於補充額外氮那—批所獲得 佔總細胞乾重的9.2%(1·15信的氨）與12 6%(1·25倍的氨=最後的DHA含量，對照組獲得之最後含量植偏 22.1%。 ” 31 1310788 實施例7 本實施例說明在本發明在發酵過程中之動態概貌 (Kinetic profile)。 使用與實施例4類似的一個步驟進行一 10 00 -加侖規模 5 的批次培養實驗。發酵過程的動態概貌如表7中所示。 表7.1000-加侖規模的裂殖壺菌批次培養發酵作用的動態概貌。 培養時間 產率 生質 轉換 %DHA %脂肪酸 DHA (小時） (克/升） 生產力 效率 含量 曱基酯含量 生產力 24 118 4.92克/升/小時 78.2% 7.4 18.8 0.36克/升/小時 30 138 4.60克/升/小時 60.3% 10.6 30.9 0.49克/升/小時 36 138 3.83克/升/小時 46.6% 11.6 36.5 0.44克/升/小時 42 175 4.17克/升/小時 49.8% 13.4 41.7 0.56克/升/小時 48 178 3J1克/升/小時 45.1% 18.7 52.8 0.69克/升/小時 48* 164 3.42克/升/小時 41.5% 15.3 33.1 0.52克/升/小時 54 196 3.63克/升/小時 45.7% 16.6 51.2 0.60克/升/小時 60 190 3.17克/升/小時 41.7% 16.9 33.9 0.54克/升/小時 72 189 2.62克/升/小時 39.1% 15.6 31.8 0.41克/升/小時 84 195 2.32克/升/小時 38.5% 16.4 32.7 0.38克/升/小時 90 200 2.22克/升/小時 39.0% 18.8 33.3 0.42克/升/小時 90 171 1.90克/升/小時 33.3% 22.2 61.6 0.42克/升/小時 氺氺 * 對在48個小時分離的兩個樣本加以分析。 ** 此為一個清洗過之乾細胞重量（DCW )的樣本。其他報告的 值為未清洗過之樣本。 10 實施例8 本實施例說明碳源數量對於生產力的影響。 運用實施例4之方法進行三組使用不同的數量的碳源 來的發酵過程。結果如表8所示。 32 1310788 菌發酵作用所得到 表8.以各種數量的碳源進行之裂殖壺 的發酵結果。 培養時間 (小時） 產率 (克/升） 碳源 進料 90 171 51.3% 94 122 40.5% 59 73 20.0% 實施例9
轉換 效率 %脂肪酸甲 基8旨含量 生產力 (克/升/小時)
本實施例說明限制養分對碳源轉變為生質、脂質盘特 5別是DHA之效率的影響。透過社公升之a响k〇n發酵槽 中，使时有以下化合物之基礎培輪(ICM_2)，來典養裂 殖壺菌菌種ATCC第扇8號菌株，以料一連續性培養實 驗來研究營養限制性的影響。 Λ 第一組成分：（標示濃度）：升）、 10 MgS〇4.7H2〇(2.0克/升)與KC1(〇·572克/升）；第二組成分(每 一種均分別配製）：葡萄糖(43·8丨克/升）、KH2P〇4(丨Μ克/ 升）、CaCU · 2邮(〇.〇25克/升）與(贿4)28〇4(6·538克/升）； 弟二組成刀.（才示示;辰度）.Na2EDTA(6_0毫克/升）' jreci3 · 6H2〇(〇.29毫克/升）、H3B〇3(6.84毫克/升）、MnCi2.4H2〇(〇 86 15 毫克/升）、ZnS〇4 · 7Η2Ο(0·237毫克/升）、c〇Cl2 · 2Η20(〇·〇26 毫克 / 升）、Na2Mo04 · 2Η2〇(0.005 毫克 / 升）、CuS04 . 5比〇(〇.〇〇2毫克/升）與NiS〇4 · 6Η2〇(〇·〇52毫克/升）；與第四 組成分：硫胺素（thiamine HC1; 0.2毫克/升）、維他命β,2(〇.〇〇5 毫克/升）、泛酸約（Calcium pantothenate ; 0_2毫克/升）。第 一與第二組以高溫高壓滅菌法滅菌，而第三與第四組在加 33 20 1310788 入到發酵槽之前以過濾滅菌法滅菌。然後以裂殖壺菌接種 成長培養液，並在30°C、pH5.5與20%的飽和濃度溶氧量的 控制條件下，培養直到到達了細胞密度的最大值。 經由不停地以一足以維持稀釋比率為0.06小時-1的流 5 速，將無菌ICM-2飼用培養液(feed medium)注入發酵槽並移 走含有裂殖壺菌細胞的培養湯液，而建立了 一個連續性的 操作模式，直到達成穩定狀態。為了瞭解營養局限性的影 響，該含有必需養份之特定的化合物在ICM-2飼用培養液中 的含量較低，所以該養份在出口之含有細胞的培養湯液中 10 被耗盡，因此該細胞的成長將因為缺乏特定的必需營養而 受到限制。一旦每一個條件都達到了穩定的操作狀態，測 量最終培養湯液的乾燥生質量、殘糖、與限制養份濃度、 該細胞的脂質含量與DHA含量。葡萄糖的轉變為生質量的 效率，藉著將葡萄糖總量除以總乾燥生質量而加以計算， 15 並以百分比的基礎形式表示。 每個單一的養份對限制成長的影響，藉由針對下面的 表中所列的養分，重複這個實驗而加以研究。最後的結果 統整在下面的表中。 34 1310788 表9·限制 生質）、靡 限制養分 ~~~ 養分對裂 _質含量與 殖壺菌的 DHA的名 生λ產i、轉換效率（葡萄糖 、量的影響。 生質1 ^IMr) 18.7 Yx/s2 46.8 殘糖濃度3 (克/升） 脂質含量4 (%) dha含量5 (%) 0.0 19.8 7.3 iL_ 14.5 17.8 36.3 44.5 _ ---------- 0.6 47.5 10.3 0.8 37.0 8 2 _ 7.5 18.8 7.7 11.1 4 0 16.0 40.0 1.3 27.8 7 9 _ 14.0 35.0 10.4 13.8 5.3 14.5 36.3 _ _ 0.0 22.2 A Ο .17.8 44.5 0.0 21.9 8.0 7 9 15.9 39.8 3.5 18.5 1 -~Μ 12.5 31.3 3.4 26 1 8.0 6.4 6.4 _ 6.3 7 0 —ϋ__ 」ϋ#Β12 13.9 -------- 16.7 --------- 19.6 34.8 41.8 49.0 5.3 — 4.3 — 0.0 18.7 ---- ，. 18.7 -------—. 17.5 18.9 47.3 0.0 19.3 —iu楚鹽 19.2 48.0 0.0 20.4 f. 7 —_鈉 17.9 44.8 1.8 21.8 〇. / Q O ~~~~5_ 13.0 32.5 8.8 ΛΑ 1 Ο,Δ 2·生產係數(％產生的生質/消耗的葡萄糖）。 3·培養湯液中剩餘的葡萄糖濃度（克/升）。 4' 5·乾燥生質的DHA含量(DHA之克數/乾燥生質之克數）。 10 從表中明顯可知，限制氮源將導致細胞中最高的dha 累積’其次是麟酸、納 '鎳、巍、葡萄糖(碳源）、辞和鐵。 經由以-個能夠關細胞成長的速率，對—批發酵反應供 給-或更多個此類營養’使得此資訊可供商業應用。在最 佳的情況中’氮氣係以-限制的方式提供給—批發酵反 應，以得到該細胞最大的DHA含量。其他養分（或其混合物） 35 15 1310788 可?由/制的方式提供’以達到生践者其他有價值的 產。口:取大生產力。其他未經評估的生物所需的元素或營 養言如硫’也能在此種發酵調控方式中當成限制養分使 ° ^所描寫與描述之本發明所包括的成分、方法、 過私、系統與/歧置的各種具體實施射，包含了其之名 種不同的具體實施例、次、组合與和子集合。那些習於此截 者在理解本發明之揭露内容⑽，將知道如何製備與❹ 10 15
2明的事物。在許多種具體實施例中，本發明包括了提 t W又有在此或有M於此的許多具體例中描寫與/或描述之 缺少項目的裝置與方法，包括有如許多已經用於以前的裝 置或者過各方法的缺少項目，例如，為改良其表現、達成 其便利性與/或減少操作的費用。 本發明前㈣討論是基於㈣與描述的目的而提伊 的。前面的討論並不是為了將本發明局限於在此所揭露的 形式中。
雖然本發明的叙述包括了 一或更多個具體實施例與某 些改變及修正的描述，但是在理解本揭露内容之後的其他 改變化與修正，例如，包含在此技藝中的技術與知識，也 20包含在本發明的範圍中。為了擴張可准專利之範圍，本發 明希望涵蓋包括其他具體例的權利，包括有所請求者之残 代物’可替換的和/或等效的結構、功能、範圍、或步驟: 不論此種替代物，可替換的和/或等效的結構、功能、範園、 或步驟是否有在此揭示出來，而不至於將任何可准專利標 36 1310788 的物貢獻給大眾。 I：圖式簡單說明3 【主要元件符號說明】

Claims (1)

13 10788第93139784號專利申請案申請專利範至本.97,0.3.15., 年月I 1) 十、申請專利範圍： 1. 一種用於生產微生物脂質的方法，其包括： (a) 在一發酵培養基中培養微生物，以增加該發酵培 養基之生質密度到至少約100克/升； (b) 提供足以供該微生物生產該脂質的發酵條件；並 且 (c) 回收該脂質，其中大於約15%的該脂質係為多元 不飽和脂質。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在該微生物生長步 驟中，該發酵培養基中之溶氧量，係高於在該脂質生產 步驟中發酵培養基之溶氧量。 3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在該微生物生長步 驟中，該發酵培養基中之溶氧量至少約為4%。 4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在該脂質生產步驟 中發酵培養基之溶氧量係少於約1%。 5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該微生物係選自包 括有藻類、真菌（包括酵母）、原生動物與細菌及其混合 物的群組，其中該微生物能夠生產多烯酸脂肪酸或其他 一般相信其合成需要氧氣之脂質。 6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該微生物為原生藻 菌。 7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該微生物為微生藻 類與藻類-類型的微生物。 8. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該微生物係屬於破 38 1310788 囊壺菌目。 9. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該微生物係選自由 破囊壺菌屬、裂殖壺菌屬及其混合物所組成的群組。 10. 如申請專利範圍第1項之方法，其中奥米加-3(omega-3) 與奥米加-6(omega-6)脂肪酸的總量至少約為該微生物 脂質的20%。 11. 如申請專利範圍第1項之方法，其中至少約25%的該微 生物脂質係為二十二碳六烯酸(DHA)。 12. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該方法以一至少約 0.2克/升/小時的平均速率生產二十二碳六浠酸(DHA)。 13. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該脂質回收步驟包 括有： 自該發酵培養基回收水分以得到乾燥的微生物；並 且 自該乾燥的微生物分離該脂質。 14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該水分回收步驟包 括有直接將該發酵培養基與一鼓式乾燥器接觸而不需 先經過離心作用。 15. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該脂質回收步驟包 括有： (d) 以通透化、溶解細胞或打破微生物細胞來處理該 發酵培養湯液；與 (e) 在有或沒有加入一水溶性溶劑以幫助打破該脂 質/水乳狀液的情況下，按比重分離的方式，自發酵培 39 1310788 養湯液該脂質。 16. 如申請專利範圍第15項之方法，其中該微生物細胞在(d) 步驟中係在一發酵槽或類似容器中被處理。 17. 如申請專利範圍第15項之方法，其中該比重分離的方式 包括離心作用。 18. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該微生物生長步驟 包括有加入一碳源與一限制營養源。 19. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該碳源係為一非醇 類。 20. 如申請專利範圍第19項之方法，其中該碳源包括一碳水 化合物。 21. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該限制營養源係選 自於包括有氮源、碳源、磷酸鹽來源、維生素來源(例 如，維生素仏2來源、泛酸鹽（pantothenate)來源、硫胺 素來源）、微量金屬源（例如鋅源、銅源、始源、鎳源、 鐵源、鐘源、銦源）、主要金屬來源(例如鎮源、妈源、 鈉源、鉀源）、矽源以及其混合物的群組。 22. 如申請專利範圍第21項之方法，其中微量金屬來源和主 要金屬來源，係選自於包括有這些金屬的硫酸鹽和氣化 物的鹽及其混合物群組(例W，MgS04*7H20、MnCl2· 4H20、ZnS04.7H20、CoCl2 . 6H20、Na2Mo04.2H20、 CuS04 · 5H20、NiS04 · 6H20、FeS04 · 7H20、CaCl2、 K2S04、KC1 與 Na2S04)。 23. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該限制營養源包括 40 1310788 一氮源。 24. 如申請專利範圍第23項之方法，其中該氮源包括一無機 銨鹽。 25. 如申請專利範圍第23項之方法，其中該限制營養源包括 一氫氧化銨。 26. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該脂質回收步驟包 括有： (d) 自該發酵培養基回收水分以得到乾燥的微生 物；並且 (e) 自該乾燥的微生物分離該脂質。 27. 如申請專利範圍第26項之方法，其中該水分回收步驟包 括有將水分自該發酵培養基蒸發而不需先經過離心作 用。 28. —種用於生產微生物脂質的方法，其包括： (a) 在一含有該微生物之發酵培養基中加入一碳源 與一限制營養源，並提供足以在該發酵培養基維持至少 約4%之溶氧量的條件，以產生至少約100克/升的生質密 度； (b) 提供足以在該發酵培養基維持約1 %或更少之溶 氧量的條件，以提供足以使該微生物生產該脂質的發酵 條件；並且 (c) 回收該微生物脂質， 其中至少約15%的該微生物脂質係為多元不飽和 脂質。 41 1310788 29. 如申請專利範圍第28項之方法，其中該微生物係選自包 括有藻類、真菌（包括酵母）、原生動物與細菌及其混合 物的群組。 30. 如申請專利範圍第28項之方法，其中該微生物係選自包 括有藻類、真菌（包括酵母）、原生動物與細菌及其混合 物的群組，其中該微生物能夠生產多烯酸脂肪酸或其他 一般相信其合成需要氧氣之脂質。 31. 如申請專利範圍第28項之方法，其中該微生物係為原生 藻菌。 32. 如申請專利範圍第28項之方法，其中該微生物係為微生 藻類與藻類-類型的微生物。 33. 如申請專利範圍第28項之方法，其中該微生物係屬於破 囊壺菌目。 34. 如申請專利範圍第28項之方法，其中該微生物係選自由 破囊壺菌屬、裂殖壺菌屬及其混合物所組成的群組。 35. 如申請專利範圍第28項之方法，其中奥米加-3(omega-3) 與奥米加-6(omega-6)脂肪酸的總量至少約為該微生物 脂質的20%。 36. 如申請專利範圍第28項之方法，其中至少約25%的該微 生物脂質為二十二碳六烯酸(DHA)。 37. 如申請專利範圍第28項之方法，其中該方法以一至少約 0.2克/升/小時的平均速率生產二十二碳六烯酸(DHA)。 38. 如申請專利範圍第28項之方法，其中該脂質回收步驟包 括有： 42 1310788 (d) 自該發酵培養基回收水分以得到乾燥的微生 物；並且 (e) 自該乾燥的微生物分離該脂質。 39. 如申請專利範圍第38項之方法，其中該水分回收步驟包 括有將水分自該發酵培養基蒸發而不需先經過離心作 用。 40. 如申請專利範圍第28項之方法，其中該脂質回收步驟包 括有： (d) 以通透化、溶解細胞或打破微生物細胞來處理該 發酵培養湯液；與 (e) 在有或沒有加入一水溶性溶劑以幫助一以打破 該脂質/水乳狀液的情況下，按比重分離的方式，自發 酵培養湯液該脂質。 41. 如申請專利範圍第28項之方法，其中該微生物細胞在(d) 步驟中係在一發酵槽或類似容器中被處理。 42. 如申請專利範圍第40項之方法，其中該比重分離的方式 包括離心作用。 43
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