BRPI0107832B1 - Processo de extração sem o uso de solvente e lipídios obtidos - Google Patents

Processo de extração sem o uso de solvente e lipídios obtidos Download PDF

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Description

“PROCESSO PARA PRODUÇÃO AUMENTADA DE LIPÍDIOS CON- TENDO ÁCIDOS GRAXOS POLIENÓICOS POR MEIO DE CULTU- RAS DE DENSIDADE MUITO ALTA DE MICRÓBIOS EUCARIÓTI- COS EM FERMENTADORES; PROCESSO PARA DESENVOLVER MICROORGANISMOS EUCARIÓTICOS; PROCESSO PARA PRODU- ZIR LIPÍDIOS MICROBIANOS EUCARIÓTICOS; MÉTODO PARA
ENRIQUECER O TEOR DE ÁCIDO GRAXO POLIENÓICO DE UM
MICROORGANISMO; E PROCESSO HETEROTRÓFICO PARA PRODUZIR PRODUTOS E MICROORGANISMOS” CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção está direcionada para um processo novo para crescimento de microorganismos e recuperação de lipídios microbia- nos. Em especial, a presente invenção está direcionada para a produção de lipídios poliinsaturados microbianos.
HISTÓRICO DA INVENÇÃO A produção de ácidos graxos polienóicos (ácidos graxos con- tendo 2 ou mais ligações carbono-carbono insaturadas) em microorganis- mos eucarióticos tem sido, de modo geral, considerada requerer a presença de oxigênio molecular (isto é, condições aeróbicas). Isto se deve ao fato da ligação dupla cis, formada nos ácidos graxos de todos os microorganismos eucarióticos não parasíticos, ser considerada envolver uma reação de dessa- turação dependente de oxigênio (sistemas de dessaturase microbianos oxi- dativos). Outros lipídios microbianos eucarióticos que são conhecidos por requererem oxigênio molecular incluem esteróis de fungos e plantas, oxica- rotenóides (isto é, xantofila), ubiquinonas, e compostos feitos de qualquer um destes lipídios (isto é, metabólitos secundários).
Certos micróbios eucarióticos (tais como algas; fungos, inclu- indo fermento; e protistas) demonstraram ser bons produtores de ácidos graxos polienóicos em fermentadores. Entretanto, o cultivo com densidade muito alta (maior que aproximadamente 100 g/1 de biomassa microbiana, especificamente em escala comercial) pode conduzir a teores de ácido gra- xo polienóico diminuídos e, dessa maneira, produtividade diminuída de á- cido graxo polienóico. Isto pode ser devido, parcialmente, a vários fatores, incluindo a dificuldade de manutenção de níveis elevados de oxigênio dis- solvido devido a grande demanda de oxigênio desenvolvida pela alta con- centração de micróbios no caldo de fermentação. Métodos para manter um nível de oxigênio mais elevado incluem aumentar a taxa de aeração e/ou usar oxigênio puro ao invés de ar para aeração e/ou aumentar a taxa de agi- tação no fermentador. Estas soluções geralmente aumentam o custo de pro- dução de lipídio e o custo de capital de equipamento de fermentação, e po- dem causar problemas adicionais. Por exemplo, aeração aumentada pode facilmente conduzir a problemas graves de espumação no fermentador em densidades de células muito altas e a mistura aumentada pode conduzir à quebra de célula microbiana como um resultado das forças de cisalhamento aumentadas no caldo de fermentação (isto faz com que os lipídios sejam liberados no caldo de fermentação onde eles podem se tomar oxidados e/ou degradados por enzimas). A quebra de célula microbiana é um problema aumentado nas células que sofreram limitação ou falta de nitrogênio para induzir formação de lipídio, resultando em paredes de célula mais fracas.
Como um resultado, quando micróbios eucarióticos para pro- dução de lipídio são desenvolvidos em concentrações de célula muito ele- vadas, seus lipídios geralmente contêm apenas quantidades muito pequenas de ácidos graxos polienóicos. Por exemplo, o fermento Lipomyces starkeyi foi desenvolvido a uma densidade de 153 g/1 com concentração de lipídio resultante de 83 g/1 em 140 horas, usando álcool como uma fonte de carbo- no. Ainda, o teor de ácidos graxos polienóicos do fermento em concentra- ção maior que 100 g/1 foi em média de apenas 4,2% dos ácidos graxos to- tais (caindo de uma porcentagem elevada de 11,5% dos ácidos graxos totais em uma densidade de célula de 20-30 g/1). Yamauchi et al., J. Ferment. Te- chnol, 1983, 61, 275-280. Isto resulta em uma concentração de ácido graxo polienóico de apenas aproximadamente 3,5 g/1 e em uma produtividade média de ácido graxo polienóico de apenas aproximadamente 0,025 g/l/h.
Adicionalmente, o único ácido graxo polienóico relatado nos lipídios do fermento foi o Cl8:2.
Um outro fermento, Rhodotorula glutinus, demonstrou ter uma produtividade média de lipídio de aproximadamente 0,49 g/l/h, mas tam- bém um teor baixo de ácido graxo polienóico geral em seus lipídios (15,8% do total de ácidos graxos, 14,7% Cl8:2 e 1,2% Cl8:3) resultando em uma produtividade de ácido graxo polienóico na cultura de alimentação por lote de apenas aproximadamente 0,047 g/l/h e 0,077 g/l/h em cultura contínua.
Um dos presentes inventores demonstrou anteriormente que certas microalgas marinhas da ordem Thraustochytriales podem ser exce- lentes produtoras de ácidos graxos polienóicos em fermentadores, especifi- camente quando cultivadas em níveis de baixa salinidade e especialmente em níveis de cloreto muito baixos. Outros descreveram Thraustochytrids que exibem uma produtividade média de ácido graxo polienóico (DHA, C22:6n-3; e DPA, C22:5n-6) de aproximadamente 0,158 g/l/h, quando de- senvolvidos em densidade de célula de 59 g/1 em 120 horas. Entretanto, esta produtividade foi atingida apenas em uma salinidade de aproximada- mente 50% de água do mar, uma concentração que podería causar corrosão grave em fermentadores de ácido inoxidável convencionais.
Os custos de produção de lipídios microbianos contendo áci- dos graxos polienóicos, e especialmente os ácidos graxos altamente insatu- rados, tais como C18:4n-3, C20:4n-6, C20:5n3, C22:5n-3, C22:5n-6 e C22:6n-3, permaneceram altos, parcialmente devido às densidades limita- das nas quais o ácido graxo polienóico alto contendo micróbios eucarióti- cos foi cultivado e à disponibilidade limitada de oxigênio, nestas altas con- centrações de célula e temperaturas mais elevadas necessárias para atingir alta produtividade.
Portanto, existe a necessidade de um processo para desenvol- ver microorganismos em alta concentração que, além disso, facilite produ- ção aumentada de lipídios contendo ácidos graxos polienóicos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção provê um processo para cultivar microor- ganismos eucarióticos que sejam capazes de produzir pelo menos aproxi- madamente 20% de sua biomassa como lipídios e um método para produzir os lipídios. Preferivelmente, os lipídios contém um ou mais ácidos graxos polienóicos. O processo compreende adicionar a um meio de fermentação compreendendo microorganismos eucarióticos, uma fonte de carbono, pre- ferivelmente uma fonte de carbono diferente de álcool, e uma fonte nutrien- te limitativa. Preferivelmente, a fonte de carbono e a fonte de nutriente li- mitativo são adicionadas em uma taxa suficiente para aumentar a densidade da biomassa do meio de fermentação até pelo menos aproximadamente 100 g/i· Em um aspecto da presente invenção, a condição de fermenta- ção compreende um estágio de aumento da densidade de biomassa e um estágio de produção de lipídio, onde o estágio de aumento de densidade da biomassa compreende adicionar a fonte de carbono e a fonte de nitrogênio nutriente limitativa, e o estágio de produção de lipídio compreende adicio- nar a fonte de carbono sem adicionar a fonte de nitrogênio nutriente limita- tiva para criar condições que induzam a produção de lipídio.
Em um outro aspecto da presente invenção, a quantidade de oxigênio dissolvido presente no meio de fermentação durante o estágio de produção de lipídio é menor que a quantidade de oxigênio dissolvido pre- sente no meio de fermentação durante o estágio de aumento de densidade da biomassa.
Em ainda um outro aspecto da presente invenção, microorga- nismos são selecionados a partir do grupo consistindo de algas, fungos (in- cluindo fermentos), protistas, bactérias, e misturas dos mesmos, onde os microorganismos sejam capazes de produzir ácidos graxos polienóicos ou outros lipídios, os quais eram considerados, de forma geral, requererem o- xigênio molecular para sua síntese. Microorganismos especialmente úteis da presente invenção são microorganismos eucarióticos que sejam capazes de produzir lipídios em um nível de oxigênio no meio de fermentação de aproximadamente menos que 3% de saturação.
Em ainda um outro aspecto da presente invenção, microorga- nismos são desenvolvidos em um processo de alimentação por lote.
Ainda um outro aspecto da presente invenção provê a manutenção de um nível de oxigênio menor que aproximadamente 3% de saturação no meio de fermentação durante a segunda metade do processo de fermentação.
Uma outra configuração da presente invenção provê um pro- cesso para produzir lipídios microbianos eucarióticos compreendendo: (a) cultivar microorganismos eucarióticos em um meio de fermentação para aumentar a densidade da biomassa do referido meio de fermentação até pelo menos aproximadamente 100 g/1; (b) prover condições de fermentação suficientes para permitir que os referi- dos microorganismos produzam os referidos lipídios; e (c) recuperar os referidos lipídios,onde mais que aproximadamente 15% dos referidos lipídios sejam lipídios poliinsaturados.
Um outro aspecto da presente invenção provê um processo de recuperação de lipídio que compreende: (d) remover água do referido meio de fermentação para prover microorganismos secos; e (e) isolar os referidos lipídios dos referidos microorganismos secos.
Preferivelmente, a etapa de remoção de água compreende contatar o meio de fermentação diretamente em uma secadora de tambor sem centri- fugação prévia.
Um outro aspecto da presente invenção provê um processo de recuperação de lipídio que compreende: (d) tratar o caldo de fermentação para permeabilizar, lisar ou romper as cé- lulas microbianas; e (e) recuperar os lipídios do caldo de fermentação por separação de gravida- de, e preferivelmente centrifiigação, com ou sem o auxílio de um sol- vente solúvel em água para ajudar na quebra da emulsão de lipídio/água.
Preferivelmente, as células microbianas são tratadas na etapa (c) em um fermentador ou um recipiente similar.
Em um aspecto adicional da presente invenção, é provido um método para enriquecer o teor de ácido graxo polienóico de um microorga- nismo. O método inclui fermentação dos microorganismos em um meio de crescimento tendo um nível de oxigênio dissolvido menor que 10%.
Um aspecto adicional da invenção é um processo heterotrófico para produzir produtos e microorganismos. O processo inclui cultivar os microorganismos contendo genes de sintase de “policetídeo” (‘polyketide’) em um meio de crescimento e mantendo o nível de oxigênio dissolvido na cultura menor que aproximadamente 10 por cento.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é uma tabela e um gráfico de vários parâmetros de produção de lipídio de um microorganismo em relação à quantidade de o- xigênio dissolvido em um meio de fermentação.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção provê um processo para desenvolver mi- croorganismos, tais como, por exemplo, algas, fungos (incluindo fermen- tos), protistas, e bactérias. Preferivelmente, microorganismos são selecio- nados do grupo consistindo de algas, protistas e misturas dos mesmos. Mais preferivelmente, microorganismos são algas. Adicionalmente, o processo da presente invenção pode ser usado para produzir uma variedade de com- postos de lipídios, em especial lipídios insaturados, preferivelmente lipídios poliinsaturados (isto é, lipídios contendo pelo menos 2 ligações carbono- carbono insaturadas, por exemplo, ligações duplas), e mais preferivelmente lipídios altamente insaturados (isto é, lipídios contendo 4 ou mais ligações carbono-carbono insaturadas) tais como ácidos graxos poliinsaturados ô- mega-3 e/ou ômega-6, incluindo ácido docosa-hexaenóico (isto é, DHA); e outros compostos insaturados, poliinsaturados e altamente insaturados de ocorrência natural. Conforme usado aqui, o termo “lipídio” inclui fosfolipí- deos; ácidos graxo livres, ésteres de ácidos graxos, triacilgliceróis; esteróis e ésteres de esterol; carotenóides; xantofilas (por exemplo, oxicarotenói- des); hidrocarbonetos; compostos derivados de isoprenóide e outros lipí- dios conhecidos daqueles com especialização comum na técnica.
Mais especificamente, processos da presente invenção são fi- teis na produção de ácidos graxos polienóicos microbianos eucarióticos, carotenóides, esteróis fungicos, fítosteróis, xantofilas, ubiquinonas, e outros compostos derivados de isoprenóide que eram, de forma geral, considera- dos requererem oxigênio para produzir ligações carbono-carbono insatura- das (isto é, condições aeróbicas), e metabólitos secundários dos mesmos.
Especificamente, processos da presente invenção são úteis no crescimento de microorganismos que produzem ácidos graxos polienóicos, e para pro- duzir ácidos graxos polienóicos microbianos.
Embora os processos da presente invenção possam ser usados para cultivar uma grande variedade de microorganismos e para obter com- postos contendo lipídio poliinsaturado produzidos pelos mesmos, por uma questão de brevidade, conveniência e ilustração, esta descrição detalhada da invenção discutirá processos para cultivar microorganismos que são ca- pazes de produzir lipídios compreendendo ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 e/ou ômega-6, em especial microorganismos que sejam capazes de produzir DHA (ou compostos grandemente relacionados tais como DP A, EPA ou ARA). Microorganismos preferidos incluem microalgas, fungos (incluindo fermento), protistas e bactérias. Um grupo preferido de microorganismos são os membros do grupo microbiano denominado Stra- menopiles que incluem microalgas e microorganismos tipo alga. Os Stra- menopiles incluem os grupos a seguir de microorganismos: Hamatores, Proteromonads, Opalines, Developayella, Diplophrys, Labrinthulids, T- hraustochytrids, Biosecids, Oomycetes, Hypochytridiomycetes, Commati- on, Reticulosphaera, Pelagomonas, Pelagococcus, Ollicola, Aureococcus, Parmales, Diatoms, Xanthophytes, Phacophytes (algas marrons), Eustigma- tophytes, Raphidophytes, Synurids, Axodines (incluindo Rhizochromulina- ales, Pedinellales, Dictyochales), Chrysomeridales, Sarcinochrysidales, Hydrurales, Hibberdiales, e Chromulinales. Outros grupos preferidos de microalgas incluem os membros das algas verdes e dinoflagelados, incluin- do membros do gênero Crypthecodium. Mais especificamente, configura- ções específicas da presente invenção serão discutidas com referência a um processo para cultivar microorganismos marinhos, em especial algas, tais como Thraustochytrids da ordem Thraustochytriales, mais especificamente Thraustochytriales do gênero ü Thraustochytrium e Schizochytrium, inclu- indo Thraustochytriales que são apresentados nas Patentes Norte America- nas Nfl 5.340.594 e 5.340.742 de cessão comum, ambas emitidas por Bar- clay, todas as quais são incorporadas aqui por referência, em sua inteireza.
Deve ser observado que muitos especialistas concordam que Ulkenia não é um gênero separado, mas é, de fato, parte do gênero Schizochytrium. Con- forme usado aqui, o gênero Schizochytrium incluirá Ulkenia.
Microorganismos preferidos são aqueles que produzem os compostos de interesse através de sistemas de sintase de policetídeo. Estes microorganismos incluem microorganismos tendo um sistema de sintase de policetídeo endógeno e microorganismos nos quais um sistema de sintase de policetídeo foi geneticamente engenheirado. Policetídeos são produtos naturais estruturalmente diversos que possuem uma ampla faixa de ativida- des biológicas, incluindo propriedades antibióticas e farmacológicas. A bi- ossíntese da estrutura de cadeia de carbono de policetídeos é catalisada pe- las sintases de policetídeo. Como as sintases de ácido graxo se relacionam estrutural e mecanicamente, sintases de policetídeo catalisam as condensa- ções descarboxilativas repetidas entre tioésteres de acila que estendem a cadeia de carbono em dois carbonos de cada vez. Entretanto, diferente de sintases de ácido graxo, sintases de policetídeo podem gerar grande variabi- lidade estrutural no produto final. Sistemas de sintase de policetídeo indivi- duais podem fazer isto através do uso de unidades de partida diferentes de acetato, através da utilização de malonato de metila ou etila como a unida- de de extensão e através da variação do ciclo redutivo de ceto-redução, de- sidratação e redução por enoíla no grupo beta-ceto formado após cada con- densação. O que realmente interessa aqui é que as ligações duplas carbono- carbono, as quais são introduzidas pela etapa de desidratação, podem ser retidas no produto final. Adicionalmente, embora estas ligações duplas es- tejam inicialmente na configuração trans, elas podem ser convertidas na configuração cis encontrada no DHA (e outros ácidos graxos polienóicos de interesse) por isomerização enzimática. Ambas as reações de desidrase e isomerização podem ocorrer na ausência de oxigênio molecular.
Preferivelmente, de acordo com a presente invenção, um pro- cesso heterotrófico é provido para produzir produtos e microorganismos. O processo preferivelmente compreende cultivar os microorganismos em um meio de crescimento onde os microorganismos contém um sistema de sin- tase de policetídeo. Preferivelmente, o nível de oxigênio dissolvido é man- tido menor que aproximadamente 8 por cento, mais preferivelmente menor que aproximadamente 4 por cento, mais preferivelmente menor que apro- ximadamente 3 por cento, e mais preferivelmente menor que aproximada- mente 1 por cento.
Deve ser entendido, entretanto, que a invenção como um todo não objetiva ser assim limitada, e que alguém especializado na técnica re- conhecerá que o conceito da presente invenção será aplicável a outros mi- croorganismos produzindo uma variedade de outros compostos, incluindo outras composições de lipídios, de acordo com as técnicas discutidas aqui.
Presumindo uma taxa de produção relativamente constante de lipídios por uma alga, fica prontamente aparente que a densidade de bio- massa mais elevada conduzirá a uma quantidade total mais elevada de lipí- dios sendo produzida por volume. Processos de fermentação convencionais atuais para cultivar algas resultam em uma densidade de biomassa de apro- ximadamente 50 a aproximadamente 80 g/1 ou menor. Os presentes inven- tores descobriram que através do uso de processos da presente invenção, uma densidade de biomassa significativamente mais elevada do que a den- sidade de biomassa atualmente conhecida pode ser atingida. Preferivelmen- te, processos da presente invenção produzem densidade de biomassa de pe- lo menos aproximadamente 100 g/1, mais preferivelmente de pelo menos aproximadamente 130 g/1, ainda mais preferivelmente, pelo menos aproxi- madamente 150 g/1, ainda mais preferivelmente, pelo menos aproximada- mente 170 g/1, e mais preferivelmente maior que 200 g/1. Dessa maneira, com esta densidade de biomassa assim elevada, mesmo se a taxa de produ- ção de lipídios de algas for ligeiramente diminuída, a taxa de produção de lipídios geral por volume será significativamente mais elevada que os pro- cessos atualmente conhecidos.
Os processos da presente invenção para crescer microorganis- mos da ordem Thraustochytriales incluem a adição de uma fonte de carbo- no e uma fonte de um nutriente limitativo a um meio de fermentação com- preendendo os microorganismos a uma taxa suficiente para aumentar a densidade da biomassa do meio de fermentação até aquelas descritas acima.
Conforme usado aqui, o termo “fonte de nutriente limitativo” refere-se a uma fonte de um nutriente (incluindo o próprio nutriente) essencial para o crescimento de um microorganismo no qual, quando o nutriente limitativo é esgotado do meio de crescimento, sua ausência substancialmente limita o microorganismo de crescer ou duplicar adicionalmente. Entretanto, visto que outros nutrientes estão ainda em abundância, o organismo pode conti- nuar a fazer e acumular produtos intracelulares e/ou extracelulares. Esco- lhendo um nutriente limitativo específico, é possível controlar o tipo de produtos que são acumulados. Portanto, prover uma fonte de nutriente limi- tativo a uma certa taxa permite o controle de ambos, da taxa de crescimento do microorganismo e a produção ou acúmulo de produtos desejados (por exemplo, lipídios). Este processo de fermentação, onde um ou mais subs- tratos (por exemplo, uma fonte de carbono e uma fonte de nitrogênio nutri- ente limitativo) são adicionados em incrementos, é geralmente referido como um processo de fermentação de alimentação por lote. Foi descoberto que quando o substrato é adicionado a um processo de fermentação de lote, a grande quantidade de fonte de carbono presente (por exemplo, aproxima- damente 200 g/1 ou mais por 60 g/1 de densidade de biomassa) possuía um efeito prejudicial nos microorganismos. Sem estar ligada a qualquer teoria, esta alta quantidade de fonte de carbono é considerada a causadora de efei- tos prejudiciais, incluindo estresse osmótico, aos microorganismos e inibir a produtividade inicial de microorganismos. Os processos da presente in- venção evitam este efeito prejudicial indesejável enquanto provêem uma quantidade suficiente do substrato para atingir a densidade de biomassa dos microorganismos descrita acima.
Os processos da presente invenção para crescimento de micro- organismos podem incluir um estágio de aumento de densidade de biomas- sa. No estágio de aumento de densidade de biomassa, o objetivo primário do processo de fermentação é aumentar a densidade da biomassa no meio de fermentação com a finalidade de obter a densidade de biomassa descrita acima. A taxa de adição de fonte de carbono é tipicamente mantida em um nível ou faixa específica que não cause um efeito prejudicial significativo na produtividade de microorganismos, ou na viabilidade dos microorga- nismos resultantes de capacidades insuficientes do equipamento de fermen- tação para remover calor e transferir gases para o caldo líquido e do caldo líquido. Uma faixa apropriada da quantidade de fonte de carbono necessá- ria a um microorganismo específico durante um processo de fermentação é bem conhecida de alguém com especialização comum na técnica. Preferi- velmente, uma fonte de carbono da presente invenção é uma fonte de car- bono diferente de álcool, isto é, uma fonte de carbono que não contenha álcool. Conforme usado aqui, um “álcool” refere-se a um composto tendo 4 ou menos átomos de carbono com um grupo hidroxila, por exemplo, meta- nol, etanol e isopropanol, mas para o objetivo desta invenção não inclui ácidos orgânicos de hidroxila tais como ácido láctico e compostos simila- res. Mais preferivelmente, uma fonte de carbono da presente invenção é um carboidrato, incluindo frutose, glicose, sacarose, melaços, e amido mas não limitada a eles. Outras fontes de carbono simples e complexas e fontes de nitrogênio adequadas são apresentadas nas patentes em referência acima.
Tipicamente, entretanto, um carboidrato, preferivelmente xarope de milho, é usado como a fonte de carbono primária. Ácidos graxos, na forma de áci- dos graxos de hidroxi, triglicerídeos, e di- e monoglicerídeos podem tam- bém servir como a fonte de carbono.
Fontes de nitrogênio especificamente preferidas são uréia, ni- trato, nitrito, proteína de soja, aminoácidos, proteínas, licor de milho mace- rado (“com steep”), extrato de fermento, subprodutos animais, sal de amô- nio inorgânico, mais preferivelmente sais de amônio de sulfato, hidróxido, e mais preferivelmente hidróxido de amônio. Outras fontes de nutriente li- mitativo incluem fontes de carbono (conforme definido acima), fontes de fosfato, fontes de vitamina (tais como fontes de vitamina B12, fontes de pantotenato, fontes de tiamina), e fontes de metal de traço (tais como fontes de zinco, fontes de cobre, fontes de cobalto, fontes de níquel, fontes de fer- ro, fontes de manganês, fontes de molibdênio), e fontes de metais princi- pais (tais como fontes de magnésio, fontes de cálcio, fontes de sódio, fontes de potássio, e fontes de sílica, etc.). Fontes de metais de traço e fontes de metais principais podem incluir sais de sulfato e cloreto destes metais (por exemplo, MgS04*7H20; MnCl2«4H20; ZnS04*7H20; CoC12«6H20;
Na2Mo04*2H20; CuS04*5H20; NiS04*6H20; FeS04«7H20; CaCl2; K2S04, KC1; e Na2S04, mas não limitados a eles).
Quando amônio é usado como uma fonte de nitrogênio, o meio de fermentação se toma ácido se não for controlado pela adição de base ou tampões. Quando hidróxido de amônio for usado como a fonte primária de nitrogênio, ele pode também ser usado para prover um controle de pH. Os microorganismos da ordem Thraustochytriales, em especial Thraustochy- triales do gênero Thraustochytrium e Schizochytrium, crescerão em uma ampla faixa de pH, por exemplo, de um pH de aproximadamente 5 até um pH de aproximadamente 11. Uma faixa de pH apropriada para fermentação de um microorganismo específico está dentro do conhecimento de alguém especializado na técnica.
Processos da presente invenção para crescer microorganismos podem também incluir um estágio de produção. Neste estágio, o uso primá- rio do substrato pelos microorganismos não está aumentando a densidade da biomassa, mas ao invés disso usando o substrato para produzir lipídios.
Deve ser observado que lipídios são também produzidos pelos microorga- nismos durante o estágio de aumento de densidade de biomassa; entretanto, conforme mencionado acima, o objetivo primário do estágio de aumento de densidade de biomassa é aumentar a densidade da biomassa. Tipicamente, durante o estágio de produção, a adição do substrato de nutriente limitativo é reduzida ou preferivelmente cessada.
Anteriormente era considerado que a presença de oxigênio dis- solvido no meio de fermentação fosse crucial na produção de compostos poliinsaturados, incluindo ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 e/ou ô- mega-6, por microorganismos eucarióticos. Dessa maneira, uma quantidade relativamente grande de oxigênio dissolvido no meio de fermentação era, de forma geral, considerada preferida. Surpreendente e inesperadamente, entretanto, os presentes inventores descobriram que a taxa de produção de lipídios é aumentada dramaticamente quando o nível de oxigênio dissolvi- do durante o estágio de produção é reduzido. Dessa maneira, embora o ní- vel de oxigênio dissolvido no meio de fermentação durante o estágio de aumento de densidade da biomassa seja preferivelmente de pelo menos a- proximadamente 8% de saturação, e preferivelmente pelo menos aproxi- madamente 4% de saturação, durante o estágio de produção o oxigênio dis- solvido no meio de fermentação é reduzido para aproximadamente 3% de saturação ou menos, preferivelmente aproximadamente 1% de saturação ou menos, e mais preferivelmente aproximadamente 0% de saturação. No iní- cio da fermentação o OD pode estar no nível de saturação ou próximo e conforme os micróbios crescem, ele é deixado diminuir até estes pontos de ajuste baixos de OD. Em uma configuração específica da presente inven- ção, a quantidade de nível de oxigênio dissolvido no meio de fermentação é variada durante o processo de fermentação. Por exemplo, para um processo de fermentação com tempo de fermentação total de aproximadamente 90 horas a aproximadamente 100 horas, o nível de oxigênio dissolvido no meio de fermentação é mantido a aproximadamente 8% durante as primei- ras 24 horas, a aproximadamente 4% de cerca da 24a hora até cerca da 40a hora, e a aproximadamente 0,5% ou menos de cerca da 40a hora até o final do processo de fermentação. A quantidade de oxigênio dissolvido no meio de fermentação pode ser controlada através do controle da quantidade de oxigênio no espa- ço do cabeçote do fermentador, ou preferivelmente através do controle da velocidade na qual o meio de fermentação é agitado (ou misturado). Por exemplo, uma taxa alta de agitação (ou mistura) resulta em uma quantidade relativamente mais elevada de oxigênio dissolvido no meio de fermentação do que uma taxa de agitação baixa. Por exemplo, em um fermentador de aproximadamente 14.000 galões de capacidade, a taxa de agitação é defini- da de aproximadamente 50 rpm a aproximadamente 70 rpm durante as pri- meiras 12 horas, de aproximadamente 55 rpm a aproximadamente 80 rpm durante cerca da 12a hora até cerca da 18a hora e de aproximadamente 70 rpm a aproximadamente 90 rpm de cerca da 18a hora até o final do processo de fermentação, de modo a atingir um nível de oxigênio dissolvido discuti- do acima para um tempo total de processo de fermentação de aproximada- mente 90 horas a aproximadamente 100 horas. Uma faixa específica de ve- locidades de agitação necessária para atingir uma quantidade específica de oxigênio dissolvido no meio de fermentação pode ser prontamente deter- minada por alguém com especialização comum na técnica.
Uma temperatura preferida para processos da presente inven- ção é de aproximadamente 20°C, mais preferivelmente de pelo menos a- proximadamente 25°C, e mais preferivelmente de pelo menos aproxima- damente 30°C. Deve ser observado que água fria pode reter uma quantidade maior de oxigênio dissolvido do que água aquecida. Dessa maneira, uma temperatura de meio de fermentação mais elevada possui o benefício adi- cional de reduzir a quantidade de oxigênio dissolvido, que é especificamen- te desejado conforme descrito acima.
Certos microorganismos podem requerer uma certa quantidade de minerais salinos no meio de fermentação. Estes minerais salinos, especi- ficamente íons de cloreto, podem causar corrosão do fermentador e outros equipamentos de processo a jusante. Para impedir ou reduzir estes efeitos indesejados devido a uma quantidade relativamente grande de íons de clo- reto presentes no meio de fermentação, os processos da presente invenção podem também incluir o uso de sais de sódio que não contenham cloreto, preferivelmente sulfato de sódio, no meio de fermentação como uma fonte de sódio. Mais especificamente, uma porção significativa dos requisitos de sódio da fermentação é suprida como sais de sódio que não contêm cloreto.
Por exemplo, menos que aproximadamente 75% do sódio no meio de fer- mentação é suprido como cloreto de sódio, mais preferivelmente menos que aproximadamente 50% e mais preferivelmente menos que aproxima- damente 25%. Os microorganismos da presente invenção podem ser culti- vados em concentrações de cloreto menores que aproximadamente 3 g/1, mais preferivelmente menores que aproximadamente 500 mg/1, mais prefe- rivelmente menores que aproximadamente 250 mg/1 e mais preferivelmente entre aproximadamente 60 mg/1 e aproximadamente 120 mg/1.
Sais de sódio que não contêm cloreto podem incluir soda cal- cinada (uma mistura de carbonato de sódio e óxido de sódio), carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, sulfato de sódio e misturas dos mesmos e pre- ferivelmente incluem sulfato de sódio. Soda calcinada, carbonato de sódio e bicarbonato de sódio tendem a aumentar o pH do meio de fermentação, dessa maneira requerendo etapas de controle para manter o pH apropriado do meio. A concentração de sulfato de sódio é efetiva para atender aos re- quisitos de salinidade dos microorganismos, preferivelmente a concentra- ção de sódio está (expressa como g/1 de Na) a pelo menos aproximadamen- te 1 g/1, mais preferivelmente na faixa de aproximadamente 1 g/1 a aproxi- madamente 50 g/1 e mais preferivelmente na faixa de aproximadamente 2 g/1 a aproximadamente 25 g/1. Vários parâmetros de fermentação para inocular, desenvolver e recuperar microorganismos são discutidos em detalhe na Patente Norte Americana Nfl 5.130.242, que é incorporada aqui por referência em sua in- teireza. Quaisquer métodos de isolamento conhecidos atualmente podem ser usados para isolar microorganismos do meio de fermentação, incluindo centrifugação, filtração, ultrafiltração, decantação, e evaporação de solven- te. Foi descoberto pelos presentes inventores que devido a densidade de biomassa muito alta resultante dos processos da presente invenção, quando uma centrífuga é usada para recuperar os microorganismos, é preferível diluir o meio através da adição de água, o que reduz a densidade da bio- massa, portanto permitindo uma separação mais efetiva de microorganis- mos do meio de fermentação.
As densidades de biomassa muito elevadas obtidas na presente invenção também facilitam processos “sem solvente” para a recuperação de lipídios microbianos. Processos preferidos para lisar as células no fermen- tador são descritos no Pedido de Patente Provisória N° de Série 60/177.125 intitulado “SOLVENTLESS EXTRACTION PROCESS”, depositado em 19 de janeiro de 2000, Pedido de Patente Provisória N° de Série 09/766.500 intitulado “SOLVENTLESS EXTRACTION PROCESS”, depositado em 19 de janeiro de 2001, e Pedido de PCT N° de Série PCT/US01/01806 intitulado “SOLVENTLESS EXTRACTION PROCESS”, depositado em 19 de janeiro de 2001, os quais são incorporados aqui por referência em sua inteireza. Processos preferidos para recuperar os lipídios após as células serem permeabilizadas, quebradas ou lisadas no fermentador (que permite que a emulsão de lipídio seja quebrada, e a fração rica em lipídio seja recu- perada) incluem o processo de desengraxamento descrito na WO 96/05278, a qual é incorporada aqui por referência em sua inteireza. Neste processo, um composto solúvel em água, por exemplo, álcool ou acetona, é adiciona- do à emulsão de óleo/água para quebrar a emulsão e a mistura resultante é separada por separação de gravidade, por exemplo, centrifugação. Este pro- cesso pode ser também modificado para usar outros agentes (água e/ou so- lúvel de lipídio) para quebrar a emulsão Altemativamente, os microorganismos são recuperados de uma forma seca a partir do meio de fermentação pela evaporação de água do meio de fermentação, por exemplo, pelo contato do meio de fermenta- ção diretamente (isto é, sem pré-concentração, por exemplo, por centrifu- gação) com uma secadora, tal como um equipamento de secadora de tam- bor, isto é, um processo de recuperação de secadora de tambor direto. Ao usar o processo de recuperação de secadora de tambor direto para isolar microorganismos, tipicamente uma secadora de tambor aquecida por vapor é empregada. Além disso ao usar o processo de recuperação de secadora de tambor direto, a densidade de biomassa do meio de fermentação deve ser preferivelmente de pelo menos aproximadamente 130 g/1, mais preferivel- mente de pelo menos aproximadamente 150 g/1, e mais preferivelmente de pelo menos aproximadamente 180 g/1. Esta alta densidade de biomassa é, de forma geral, desejada para o processo de recuperação de secadora de tambor direto porque, em uma densidade de biomassa menor, o meio de fermentação compreende uma quantidade suficiente de água para resfriar o tambor significativamente, dessa maneira resultando em secagem incom- pleta de microorganismos. Outros métodos de secagem de células, incluin- do secagem por pulverização, são bem conhecidos de alguém com especia- lização comum na técnica.
Os processos da presente invenção provêem uma taxa média de produção de lipídio de pelo menos aproximadamente 0,5 g/l/h, preferi- velmente de pelo menos aproximadamente 0,7 g/l/h, mais preferivelmente de pelo menos aproximadamente 0,9 g/l/h, e mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 1,0 g/l/h. Além disso, os lipídios produzidos pelos processos da presente invenção contêm lipídios poliinsaturados em quanti- dades maiores que aproximadamente 15%, preferivelmente maiores que aproximadamente 20%, mais preferivelmente maiores que aproximadamen- te 25%, ainda mais preferivelmente maiores que aproximadamente 30%, e mais preferivelmente maiores que aproximadamente 35%. Os lipídios po- dem ser recuperados tanto de microorganismos secos ou dos microorga- nismos no meio de fermentação. Geralmente, pelo menos aproximadamen- te 20% dos lipídios produzidos pelos microorganismos nos processos da presente invenção são ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 e/ou ômega- 6, preferivelmente pelo menos aproximadamente 30% dos lipídios são áci- dos graxos poliinsaturados ômega-3 e/ou ômega-6, mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 40% dos lipídios são ácidos graxos poliinsa- turados ômega-3 e/ou ômega-6, e mais preferivelmente pelo menos apro- ximadamente 50% dos lipídios são ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 e/ou ômega-6. Altemativamente, processos da presente invenção provêem taxa média de produção de ácido graxo ômega-3 (por exemplo, DHA) de pelo menos aproximadamente 0,2 g de ácido graxo ômega-3 (por exemplo, DHA)/l/h, preferivelmente pelo menos aproximadamente 0,3 g de ácido graxo ômega-3 (por exemplo, DHA)/l/h, mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 0,4 g de ácido graxo ômega-3 (por exemplo, DHA)/l/h, e mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 0,5 g de ácido graxo ômega-3 (por exemplo, DHA)/l/h. Altemativamente, processos da presente invenção provêem uma taxa média de produção de ácido graxo ômega-6 (por exemplo, DPAn-6) de pelo menos aproximadamente 0,07 g de ácido graxo ômega-6 (por exemplo, DPAn-6)/l/h, preferivelmente pelo menos aproximadamente 0,1 g de ácido graxo ômega-6 (por exemplo, DPAn- 6)/l/h, mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 0,13 g de ácido graxo ômega-6 (por exemplo, DPAn-6)/l/h, e mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 0,17 g de ácido graxo ômega-6 (por exemplo, DPAn-6)/l/h. Ainda altemativamente, pelo menos aproximadamente 25% do lipídio é DHA (com base no éster metílico de ácido graxo total), prefe- rivelmente pelo menos aproximadamente 30%, mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 35%, e mais preferivelmente pelo menos aproxi- madamente 40%.
Microorganismos, lipídios extraídos deles, a biomassa rema- nescente após a extração do lipídio ou combinações deles podem ser usados diretamente como um ingrediente alimentar, tal como um ingrediente em bebidas, molhos, alimentos a base da laticínios (tais como leite, iogurte, queijo e sorvete) e alimentos assados; suplemento nutricional (nas formas de cápsula ou comprimido); alimento ou suplemento alimentar para qual- quer animal cuja carne ou produtos sejam consumidos por seres humanos; suplemento alimentar, incluindo alimento para bebês e fórmulas infantis; e produtos farmacêuticos (em aplicação de terapia direta ou adjunta). O ter- mo “animal” significa qualquer organismo pertencente ao reino Animal e inclui, sem limitação, qualquer animal do qual carne, frutos do mar, carne, porco ou ovelha sejam derivados. Frutos do mar são derivados de, sem li- mitação, peixe, camarão e ostras. O termo “produtos” inclui qualquer pro- duto diferente de carne derivada destes animais, incluindo, sem limitação, ovos, leite ou outros produtos. Quando providos a estes animais, lipídios poliinsaturados podem ser incorporados na carne, leite, ovos ou outros pro- dutos destes animais para aumentar seu teor destes lipídios.
Objetivos, vantagens e características novas adicionais desta invenção se tomarão aparentes para aqueles especializados na técnica me- diante exame dos exemplos a seguir da mesma, os quais não pretendem ser limitativos.
EXEMPLOS A classe de Schizochytrium usada nestes exemplos produz dois ácidos polienóicos primários, DHAn-3 e DPAn-6 na proporção, geralmen- te, de aproximadamente 3:1, e quantidades pequenas de outros ácidos poli- enóicos, tais como EPA e C20:3, sob uma grande variedade de condições de fermentação. Dessa maneira, embora os exemplos a seguir apenas listem a quantidade de DHA, pode-se calcular prontamente a quantidade de DPA(n-6) produzida através do uso da proporção apresentada acima.
Exemplo 1 Este exemplo ilustra o efeito do teor de oxigênio em um meio de fermentação na produtividade de lipídio.
Resultados de fermentação de Schizochytrium ATCC N° 20888 em vários níveis de teor de oxigênio dissolvido foram medidos. Os resultados são mostrados na Figura 1, onde RCS é a concentração residual de açúcar, e DCW é o peso seco da célula. £xemplo 2 Este exemplo também ilustra o efeito de baixo teor de oxigê- nio no meio de fermentação em teor de DHA (% de peso seco) do produto da biomassa final.
Um experimento do tipo “redução da escala” foi conduzido em frascos Erlenmeyer de 250 ml para imitar o efeito de baixo teor de oxigênio no teor de DHA em células Schizochytrium sp. cultivadas em fermentado- res de grande escala. Schizochytrium sp. (ATCC 20888) foi cultivada em meio 04-4. Este meio de cultura consistia do seguinte, em uma base por litro dissolvido em água desionizada: 12,61 g de Na2S04; 1,2 g de Mg- S04*7H20; 0,25 g de KC1; 0,05 g de CaCl2; 7,0 g de glutamato de monos- sódio; 10 g de glicose; 0,5 g de KH2P04; 0,1 g de NaHC03; 0,1 g de extra- to de fermento; 1,0 ml de mistura de vitamina; 1,00 ml de metais de PII. A mistura de metal PII contém (por litro): 6,0 g de Na2EDTA, 0,29 g de Fe- C13*6H20, 6,84 g de H3B03, 0,86 g de MnCl2»4H20, 0,06 g de ZnCl2, 0,026 g de CoC12*6H20, 0,052 g de NiS04*H20, 0,002 de CuS04*H20 e 0,005 g de Na2Mo04»2H20. A mistura de vitamina contém (por litro): 100 mg de tiamina, 0,5 mg de biotina e 0,5 mg de cianocobalamina. O pH do meio de cultura foi ajustado para 7,0 e foi então, esterilizado através de fil- tração. A idéia por trás do experimento de redução de escala foi culti- var as células em frascos de agitação com volumes diferentes de meio de cultura nos frascos - frascos quase cheios (por exemplo, 200 ml em um frasco de agitação de 250 ml) não misturam bem em uma mesa de agitação e portanto conforme as células crescem, condições com níveis baixos de oxigênio dissolvido seriam geradas. Portanto, 4 tratamentos foram estabe- lecidos no experimento, cada um conduzido em duplicata (1) frascos de 250 ml enchidos com 50 ml de meio de cultura; (2) frascos de 250 ml en- chidos com 100 ml de meio de cultura; (3) frascos de 250 ml enchidos com 150 ml de meio de cultura; (4) frascos de 250 ml enchidos com 200 ml de meio de cultura. Cada um dos oito frascos foi inoculado com células de uma cultura com 48 horas de idade de Schizochytrium cultivado em meio 04-4 sob as condições no tratamento 1, e a 28°C e 220 rpm em uma mesa de agitação.
Todos os oito frascos para o experimento foram colocados em uma mesa de agitação (220 rpm) em uma incubadora (28°C) e cultivados durante 48 horas no escuro. Ao final do experimento, os níveis de oxigênio dissolvido (OD) em cada frasco foram medidos com um medidor de oxigê- nio dissolvido YSI, o pH do meio de cultura foi também determinado, e o peso seco das células e seu teor de ácido graxo foram também medidos. Os resultados do experimento são descritos na Tabela 1.
Tabela 1. Resultados do experimento de redução de escala examinando o efeito de concentrações baixas de oxigênio dissolvido no teor de ácido gra- xo altamente insaturado de cadeia longa (% de peso seco de DHA) de Schi- zochytrium sp.
Os resultados indicam que o teor de lipídio (como % de FA- ME) e teor de DHA (% de peso seco) foram mais elevados para células cul- tivadas em níveis baixos de oxigênio dissolvido - quanto mais baixo o ní- vel de oxigênio dissolvido, mais elevado o teor de lipídio e DHA. Isto é inesperado porque oxigênio era, de forma geral, considerado necessário para formar ligações dessaturadas (duplas). É surpreendente que uma quan- tidade tão grande assim de DHA tenha sido formada em nível baixo de oxi- gênio dissolvido, porque DHA é um dos ácidos graxos mais insaturados.
Embora a produção de biomassa diminua conforme o nível de oxigênio dis- solvido aumenta, o teor de DHA é aumentado. Portanto, é vantajoso ter uma fase de crescimento com níveis de oxigênio dissolvido mais eievados para maximizar a formação de biomassa e então diminuir o nível de oxigê- nio dissolvido para maximizar a produção de ácido graxo de cadeia longa.
Exemplo 3 Este exemplo ilustra a reprodutibilidade de processos da pre- sente invenção.
Os microorganismos foram produzidos usando fermentadores com um volume de operação nominal de 1.200 galões. O caldo de fermen- tação resultante foi concentrado e os microorganismos foram secos usando uma secadora de tambor. Os lipídios de alíquotas dos microorganismos re- sultantes foram extraídos e purificados para produzir uma óleo refinado, branqueado e desodorizado. Aproximadamente 3.000 ppm de acetato de d- Ι-α-tocoferila foram adicionados para suplementação nutricional antes da análise do lipídio.
Nove fermentações de Schizochytrium ATCC N° 20888 foram executadas e os resultados são mostrados na Tabela 2. O nível de oxigênio dissolvido foi de aproximadamente 8% durante as primeiras 24 horas e de aproximadamente 4% posteriormente.
Tabela 2. Resultados de fermentação de alimentação por lote para a produ- ção de DHA de Schizochytrium sp. 1. Rendimento real de densidade de biomassa. 2. Teor de DHA como % de peso seco da célula. 3. Teor de ácido graxo total como % de peso seco de célula (medido como ésteres de metila). 4. (gramas de DHA)/l/h. 5. Média. 6. Desvio Padrão 7. Coeficiente de variabilidade. Os valores de coeficientes de variabili- dade abaixo de 5% indicam um processo que possui excelente repro- dutibilidade, valores entre 5% e 10% indicam um processo que pos- sui boa reprodutibilidade e valores entre 10% e 20% indicam um processo que possui reprodutibilidade razoável.
Xarope de milho foi provido até o volume no fermentador a- tingir aproximadamente 1.200 galões, quando então a adição de xarope de milho foi cessada. O processo de fermentação foi cessado após a concen- tração de açúcar residual cair abaixo de 5 g/1. A idade típica, a partir da i- noculação até o final, foi de aproximadamente 100 horas. O caldo de fermentação, isto é, meio de fermentação, foi diluí- do com água usando aproximadamente uma proporção de 2:1 para reduzir o teor de cinza do produto final e ajudar a melhorar a separação de fase du- rante a etapa de centrifugação. A pasta de célula concentrada foi aquecida até 160°F (aproximadamente 71°.C) e seca em uma secadora de tambor du- plo Blaw Knox (42”x36”). Preferivelmente, entretanto, os microorganis- mos são secos diretamente em uma secadora de tambor sem centrifugação prévia. O resultado da análise de lipídios extraídos de alíquotas de ca- da uma das entradas na Tabela 2 é resumido na Tabela 3.
Tabela 3. Análise da biomassa microbiana produzida na fermentação de alimentação por lote descrita na Tabela 2. 1. Veja Tabela 2. 2. Veja discussão acima. 3. Desvio padrão. 4. Coeficiente de variabilidade. Os valores de coeficientes de variabili- dade abaixo de 5% indicam um processo que possui excelente repro- dutibilidade, valores entre 5% e 10% indicam um processo que pos- sui boa reprodutibilidade e valores entre 10% e 20% indicam um processo que possui reprodutibilidade razoável. A menos que mencionado o contrário, o meio de fermentação usado durante a seção dos Exemplos inclui os seguintes ingredientes, onde o primeiro número indica concentração alvo nominal e o número entre pa- rênteses indica faixa aceitável: 12 g/1 (11-13) de sulfato de sódio; 0,5 g/1 (0,45-0,55) de KC1; 2 g/1 (1,8-2,2) de MgS04*7H20; 0,35 g/1 (0,3-0,4) de antiespumante Hodag K-60; 0,65 g/1 (0,60-0,70) de K2SO4; 1 g/1 (0,9-1,1) de KH2P04; 1 g/1 (0,95-1,1) de (NH4)2S04; 0,17 g/1 (0,15-0,19) de Ca- C12*2H20; 4,5 g/1 (2-10) de xarope de milho 95 DE (base de sólidos); 3 mg/1 (2,7-3,3) de MnCl2«4H20; 3 mg/1 (2,7-3,3) de ZnS04*7H20; 0,04 mg/1 (0,035-0,045) de CoC12»6H20; 0,04 mg/1 (0-0,045) de Na2Mo04«2H20; 2 mg/1 (1,8-2,2) de CuS04*5H20; 2 mg/1 (1,8-2,2) de Ni- S04»6H20; 10 mg/1 (9-11) de FeS04*7H20; 9,5 mg/1 (4-15) de tiamina; 0,15 mg/1 (0,05-0,25) de vitamina Bi2 e 3,2 mg/1 (1,3-5,1) de Pantotenato de Cálcioi/2. Além disso, uma solução de NH4OH a 28% é usada como a fonte de nitrogênio. O teor de cinzas dos microorganismos secos é de aproxima- damente 6% em peso.
Exemplo 4 Este exemplo ilustra o efeito de nível reduzido de oxigênio dissolvido no meio de fermentação na produtividade de microorganismos na escala de 14.000 galões.
Usando o procedimento descrito no Exemplo 3, uma fermenta- ção de volume nominal de 14.000 galões foi conduzida usando uma classe Schizochytrium do tipo selvagem, que pode ser obtida usando processos de isolamento apresentados nas Patentes Norte Americanas Nü 5.340.594 e 5.340.742. O nível de oxigênio dissolvido no meio de fermentação foi de aproximadamente 8% durante as primeiras 24 horas, aproximadamente 4% da 24a hora até a 40a hora e de aproximadamente 0,5% a partir da 40a hora até o final do processo de fermentação. Os resultados deste nível menor de oxigênio dissolvido em processos de meio de fermentação são mostrados na Tabela 4.
Tabela 4. Resultados de fermentação de alimentação por lote de Schizochy- trium em escala de 14.000 galões, em concentrações reduzidas de oxigênio dissolvido.
Exemplo 5 Este exemplo ilustra o efeito de nível reduzido de oxigênio dissolvido no meio de fermentação na produtividade de microorganismos em uma escala de 41.000 galões.
Os mesmos procedimentos do Exemplo 4 foram empregados, exceto que a fermentação foi conduzida em um fermentador de 41.000 ga- lões. Os volumes de meios de cultura foram aumentados para manter a concentração do composto alvo nesta escala. Os resultados são mostrados na Tabela 5.
Tabela 5. Fermentação de Schizochytrium em escala de 41.000 galões Exemplo 6 Este exemplo ilustra o efeito de nitrogênio extra no processo de fermentação da presente invenção.
Quatro conjuntos de experimentos de alimentação por lote em escala de 250 litros foram conduzidos usando um procedimento similar ao do Exemplo 4. Dois experimentos de controle e dois experimentos conten- do amônia extra (1,15x e l,25x a quantidade normal) foram conduzidos. Os resultados são mostrados na Tabela 6.
Tabela 6. Efeitos de amônia extra na fermentação de Schizochytrium.
Em geral, nitrogênio extra possui um efeito negativo no de- sempenho da fermentação, visto que reduções significativas foram obser- vadas na produtividade de DHA para os dois lotes onde amônia extra foi adicionada. Conforme mostrado na Tabela 6, os lotes de controle resulta- ram em níveis de DHA finais de 18,4% e 22,1% do peso seco celular total em relação a 9,2% (l,15x amônia) e 12,6% (l,25x amônia) para lotes su- plementados com nitrogênio extra.
Exemplo 7 Este exemplo mostra um perfil cinético de um processo de fermentação da presente invenção.
Um experimento de alimentação por lote em escala de 1000 galões foi conduzido usando um procedimento similar ao do Exemplo 4. O perfil cinético do processo de fermentação é mostrado na Tabela 7.
Tabela 7. Perfil Cinético para uma fermentação de Alimentação por Lote de Schizochytrium em escala de 1.000 galões. * Duas amostras separadas foram analisadas nas 48 horas. ** Este é para uma amostra de pesos de célula seca lavada (DCW). Ou- tros valores informados são para amostras não lavadas.
Exemplo 8 Este exemplo ilustra o efeito da quantidade de fonte de carbo- no na produtividade.
Três processos de fermentação diferentes usando o processo do Exemplo 4 foram conduzidos usando várias quantidades de fonte de carbono. Os resultados são mostrados na Tabela 8.
Tabela 8. Resultados de fermentação para várias quantidades de fonte de carbono na fermentação de Schizochytrium.
Exemplo 9 Este exemplo ilustra o efeito de limitação de nutriente na efici- ência de conversão de carbono na biomassa, lipídio e mais especificamente no DHA.
Um experimento de cultura contínuo para investigar o efeito de limitação de nutriente foi executado através do cultivo de Schizochytri- um ATCC N° 20888 em um fermentador Applikon com 2 litros de volume em meio de crescimento basal (ICM-2) consistindo dos seguintes compos- tos (concentração nominal): Ingredientes do Grupo I: Na2S04 (18,54 g/1), MgS04*7H20 (2,0 g/1) e KC1 (0,572 g/1); ingredientes do Grupo II (cada um preparado separadamente): glicose (43,81 g/1), KH2P04 (1,28 g/1), Ca- C12*2H20 (0,025 g/1) e (NH4)2S04 (6,538 g/1); ingredientes do Grupo III: Na2EDTA (6,0 mg/1), FeCl3*6H20 (0,29 mg/1), H3B03 (6,84 mg/1), Mn- C12*4H20 (0,86 mg/1), ZnS04»7H20 (0,237 mg/1), CoC12*2H20 (0,026 mg/1), Na2Mo04*2H20 (0,005 mg/1), CuS04*5H20 (0,002 mg/1) e Ni- S04*6H20 (0,052 mg/1); e ingredientes do Grupo IV: tiamina HC1 (0,2 mg/1), Vitamina BJ2 (0,005 mg/1), Pantotenato de cálcio (0,2 mg/1). Os Grupos I e II foram esterilizados em autoclave, enquanto os Grupos III e IV foram esterilizados por filtração antes da adição ao fermentador. O meio de crescimento foi, então, inoculado com Schizochytrium e desenvolvido sob condições controladas de 30°C, pH 5,5 e oxigênio dissolvido de 20% de saturação até a densidade de célula máxima ser atingida.
Um modo de operação contínuo foi, então, estabelecido por bombeamento simultâneo de meio de alimentação ICM-2 estéril no fermen- tador e remoção do caldo contendo células de Schizochytrium a uma taxa de fluxo suficiente para manter uma taxa de diluição de Ο,ΟόΙι'1, até um es- tado estável ser atingido. Para investigar o efeito de limitação de nutriente, o composto contendo o nutriente requerido especificado é diminuído no meio de alimentação ICM-2 de modo que este nutriente esteja esgotado no caldo de saída contendo célula, de modo que o crescimento das células seja limitado pela ausência do nutrientes específico requerido. Após a operação de estado estável ser estabelecida para cada condição, biomassa seca do caldo final, glicose residual, e concentrações de nutriente limitativas, o teor de lipídio da célula e o teor de DHA das células foram medidos. A eficiên- cia de conversão de glicose em biomassa foi calculada pela divisão da gli- cose total consumida pela biomassa seca total formada, e expressa em uma base de porcentagem.
Os efeitos de limitação de crescimento de cada nutriente indi- vidual foram estudados através da repetição deste experimento para cada nutriente individual listado na tabela a seguir. Os resultados finais são re- sumidos na tabela a seguir: Tabela 9. Efeito de limitação de nutriente no rendimento de biomassa, efi- ciência de conversão (glicose em biomassa), teor de lipídio e teor de DHA de Schizochytrium sp. 1. concentração de biomassa seca (gramas/litro) 2. coeficiente de rendimento (% de biomassa produzida/glicose consu- mida) 3. concentração residual de glicose no caldo (gramas/litro) 4. teor de lipídio de biomassa seca (g de lipídio (como FAME)/g de bi- omassa seca) 5. teor de DHA de biomassa seca (g DHA/g de biomassa seca) Fica evidente a partir da tabela que a limitação de nitrogênio resultou no maior acúmulo de DHA nas células, seguido por fosfato, sódio, níquel, manganês, glicose (carbono), zinco e ferro. Esta informação pode ser empregada comercialmente através da alimentação de um ou mais des- tes nutrientes a uma fermentação de lote a uma taxa suficiente para limitar o crescimento de célula. No caso mais preferido, nitrogênio é provido de uma maneira limitada à fermentação de lote para maximizar o teor de DHA das células. Outros nutrientes (ou misturas deles) podem ser providos de uma maneira limitativa para maximizar a produção de biomassa ou outros produtos de valor. Outros elementos biologicamente requeridos ou nutrien- tes que não foram avaliados, tais como enxofre, podem também ser empre- gados como nutrientes limitativos nesta estratégia de controle de fermenta- ção. A presente invenção, em várias configurações, inclui compo- nentes, métodos, processos, sistemas e/ou equipamentos substancialmente conforme ilustrados e descritos aqui, incluindo várias configurações, sub- combinações, e subconjuntos deles. Aqueles com especialização na técnica compreenderão como fazer e usar a presente invenção após compreensão da presente apresentação. A presente invenção, nas várias configurações, inclui prover dispositivos e processos na ausência de itens não ilustrados e/ou descritos aqui ou em várias configurações dela, incluindo a ausência destes itens como poderíam ter sido usados em dispositivos ou processos anteriores, por exemplo, para melhorar o desempenho, atingir facilidade e/ou reduzir o custo de implementação. A discussão anterior da invenção foi apresentada com objeti- vos ilustrativos e descritivos. A descrição anterior não pretende limitar a invenção à forma ou formas apresentadas aqui. Embora a descrição da in- venção tenha incluído descrição de uma ou mais configurações e certas va- riações e modificações, outras variações e modificações estão dentro do escopo da invenção, por exemplo, como podem estar dentro da especiali- dade e conhecimento daqueles na técnica, após compreensão da presente apresentação. A intenção é obter direitos que incluam configurações alter- nativas na extensão permitida, incluindo estruturas, funções, faixas ou eta- pas alternativas, intercambiáveis e/ou equivalentes àquelas reivindicadas, se estas estruturas, funções, faixas ou etapas alternativas, intercambiáveis e/ou equivalentes foram ou não apresentadas aqui, e sem a intenção de de- dicar-se publicamente a qualquer objeto patenteável.

Claims (13)

1. Processo para produção de lipídios microbianos contendo ácidos graxos polienóicos a partir de microrganismos da ordem Thraustochytriales capazes de produzir, pelo menos, 20% de sua biomassa como lipídeos, caracterizado por compreender: (a) um estágio de aumento da densidade da biomassa, onde o nível de oxigênio dissolvido no meio de fermentação é de pelo menos 4%; e (b) um estágio de produção de altos lipídeos, onde o nível de oxigênio dissolvido no meio de fermentação é menor do que 1% em que a biomassa compreende lipídios contendo, pelo menos, 15% de lipídios poli-insaturados; e (c) recuperação dos lipídios em que o processo é selecionado a partir de processo continuo de fermentação e processo de fermentação por alimentação por lote; e em que a fonte de nutriente limitante é selecionada a partir do grupo que consiste em fontes de nitrogênio, fontes de fosfato, fontes de vitamina, tais como fontes de vitamina BI2, fontes de pantotenato, fontes de tiamina, fontes de metal de traço, tais como fontes de zinco, fontes de cobre, fontes de cobalto, fontes de níquel, fontes de ferro, fontes de manganês, fontes de molibdênio, fontes de metal principal, tais como fontes de magnésio, fontes de cálcio, fontes de sódio, fontes de potássio, fontes de sílica e suas misturas.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, compreendendo um estágio de aumento da densidade da biomassa e um estágio de produção de lipídio, caracterizado por o estágio de aumento da densidade da biomassa compreender a adição da fonte de carbono não alcoólica e da fonte de nutriente limitante, e o estágio de produção de lipídio compreender a adição da fonte de carbono não alcoólica sem adição da citada fonte nutriente limitante para induzir o microrganismo a produzir lipídeos.
3. Processo, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por ser a fonte de carbono não alcoólica um carboidrato.
4. Processo, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por ser a fonte de metal de traço ou a fonte de metal principal selecionada a partir do grupo compreendendo os sais de sulfato e de cloreto desses metais, tais como MgS04*7H20; MnCl2e4H20; ZnS04»7H20; CoC12*6H20; Na2Mo04*2H20; CuS04*5H20; NiS04«6H20; FeS04«7H20; CaCl2; K2S04; KC1 e Na2S04, e suas misturas.
5. Processo, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por ser a fonte de nutriente limitante uma fonte de nitrogênio.
6. Processo, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por a fonte de nutriente limitante compreender um sal de amônio inorgânico.
7. Processo, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por a fonte de nutriente limitante compreender hidróxido de amônio.
8. Processo, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por o meio de fermentação ou o meio de cultivo estar na temperatura de pelo menos 20°C.
9. Processo, de acordo com as reivindicações le 2, caracterizado por ser o microrganismo da ordem Thraustochytriales selecionado a partir do gênero Thraustochytrium, gênero Schizochytrium e suas misturas.
10. Processo, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por ser um processo de alimentação por lote.
11. Processo, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por a etapa de recuperação de lipídeos compreender: (a) remoção da água do meio de fermentação para fornecer microrganismos secos; e (b) o isolamento dos lipídeos dos citados microrganismos secos.
12. Processo, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por a etapa de recuperação de lipídeos compreender: (a) o tratamento do caldo da fermentação para permeabilizar, lisar ou romper as células microbianas; e (b) a recuperação dos lipídeos do caldo de fermentação por meio de separação por gravidade, com ou sem o auxílio de um agente para ajudar na quebra da emulsão lipídeo/água.
13. Processo, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por a etapa de recuperação de lipídeos compreender: (a) a evaporação da água do meio de fermentação sem centrifugação prévia para fornecer microrganismos secos; e (b) o isolamento dos lipídeos a partir dos citados microrganismos secos.
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