ES2208141T5 - Producción aumentada de lípidos que contienen ácidos grasos polienoicos mediante cultivos de alta densidad de microbios eucariotas en fermentadores - Google Patents
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Description
DESCRIPCIÓN
Producción aumentada de lípidos que contienen ácidos grasos polienoicos mediante cultivos de alta densidad de microbios eucariotas en fermentadores. 5
La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento para el cultivo de microorganismos y la recuperación de lípidos microbianos. Particularmente, la presente invención se refiere a la producción de lípidos microbianos
10 poliinsaturados.
En general se ha creído que la producción de ácidos grasos polienoicos (ácidos grasos que contienen 2 o más
15 enlaces carbono-carbono insaturados) en los microorganismos eucarióticos requería la presencia de oxígeno molecular (es decir, condiciones aeróbicas). Esto es debido a la creencia de que el doble enlace cis de carbono formado en los ácidos grasos de todos los microorganismos eucarióticos no parasitarios implica una reacción de desaturación que depende del oxígeno (sistemas de desaturación microbianos oxidativos). Entre otros lípidos microbianos eucarióticos que es conocido que requieren oxígeno molecular se incluyen los esteroles fúngicos y
20 vegetales, los oxicarotenoides (es decir, las xantofilas), las ubiquinonas y los compuestos preparados a partir de cualquiera de estos lípidos (es decir, los metabolitos secundarios).
Se ha demostrado que determinados microbios eucarióticos (tales como algas; hongos, incluyendo la levadura; y protistas) representan buenos productores de ácidos grasos polienoicos en los fermentadores. Sin embargo, los 25 cultivos de muy alta densidad (con biomasa microbiana superior a 100 g/l, especialmente a escala comercial) pueden conducir a contenidos reducidos de ácidos grasos polienoicos y, por lo tanto, a una productividad reducida de ácidos grasos polienoicos. Esto puede deberse, en parte, a una serie de factores, entre los que se incluyen la dificultad para mantener los niveles elevados de oxígeno disuelto, debido a la gran demanda de oxígeno desarrollada por la gran concentración de microbios en el caldo de fermentación. Entre los procedimientos utilizados 30 para el mantenimiento del nivel elevado de oxígeno disuelto se incluyen el aumento de la velocidad de aireación y/o la utilización de oxígeno puro en vez de aire, para la aireación, y/o el incremento de la velocidad de agitación en el fermentador. Generalmente, estas soluciones incrementan el coste de la producción de los lípidos y los costes de instalación de las máquinas de fermentación, y pueden causar problemas adicionales. Por ejemplo, el incremento de la aireación puede ocasionar fácilmente serios problemas de creación de espumas en el fermentador a altas
35 densidades celulares y un incremento del mezclado puede ocasionar la rotura de células microbianas debido al incremento de las fuerzas de cizalla en el caldo de fermentación (causando así la liberación de los lípidos en el caldo de fermentación, en el que pueden oxidarse y/o resultar degradados por enzimas). La rotura de las células microbianas se considera un problema particularmente importante en las células que han experimentado limitación o agotamiento del nitrógeno para inducir la formación de lípidos, resultando en paredes celulares más débiles.
40 Como resultado, cuando se cultivan microbios eucarióticos productores de lípidos a concentraciones muy altas, sus lípidos generalmente sólo contienen cantidades reducidas de ácidos grasos polienoicos. Por ejemplo, la levadura Lipomyces starkeyi ha sido cultivada a una densidad de 153 g/l con una concentración de lípidos resultante de 83 g/l a las 140 horas, utilizando alcohol como fuente de carbono. Sin embargo, el contenido de ácidos grasos polienoicos
45 en la levadura, a concentraciones superiores a 100 g/l, de media era de 4,2% del total de ácidos grasos (reduciéndose desde un máximo de 11,5% del total de ácidos grasos a una densidad celular de entre 20 y 30 g/l; Yamauchi et al., J. Ferment. Technol. 61: 275-280, 1983). Esto resulta en una concentración de ácidos grasos polienoicos de sólo aproximadamente 3,5 g/l y una productividad media de ácidos grasos polienoicos de sólo aproximadamente 0,025 g/l/hr. Además, el único ácido graso polenóico descrito en los lípidos de la levadura era
50 C18:2.
Se ha demostrado que otra levadura, Rhodotorula glutinus, presenta una productividad media de lípidos de aproximadamente 0,49 g/l/hr, pero que además presenta un contenido muy reducido de ácidos grasos polienoicos en sus lípidos (15,8% del total de ácidos grasos, 14,7 de C18:2 y 1,2% de C18:3), resultando en una productividad
55 de ácidos grasos polienoicos en cultivo de alimentación por lotes de aproximadamente 0,047 g/l/hr y de 0,077 g/l/hr en un cultivo continuo.
Uno de los presentes inventores ha demostrado anteriormente que determinadas microalgas marinas del orden traustoquitriales puede representar un productor excelente de ácidos grasos polienoicos en fermentadores, 60 especialmente cuando se cultivan a niveles de salinidad reducidos y especialmente a niveles muy reducidos de cloruro. Otros inventores han dado a conocer que los traustoquítridos muestran una productividad media de ácidos grasos polienoicos (DHA, C22:6n-3; y DPA, C22:5n-6) de aproximadamente 0,158 g/l/hr cuando se cultivan a una densidad celular de 59 g/l durante 120 horas. Sin embargo, esta productividad se alcanzó sólo con un valor de salinidad de 50% de la del agua marina, una concentración que causaría serias corrosiones en los fermentadores de
65 acero inoxidable convencionales.
Los costes de producción de lípidos microbianos que contienen ácidos grasos polienoicos, en especial ácidos grasos altamente insaturados, tales como C18:4n-3, C20:4n-6, C20:5n-3, C22:5n-3, C22:5n-6 y C22:6n-3, se han mantenido altos debido, en parte, a las densidades limitadas a las que se han cultivado los microbios eucarióticos que contienen los ácidos grasos polienoicos y a la limitada disponibilidad de oxígeno tanto a estas altas
5 concentraciones celulares como a las altas temperaturas necesarias para conseguir altas productividades.
Por lo tanto, existe la necesidad de un procedimiento para el cultivo de microorganismos a altas concentraciones que simultáneamente permita un incremento de la producción de lípidos que contienen ácidos grasos polienoicos.
El documento WO-A-92/13.086 describe un procedimiento para la producción de un aceite que contiene ácido araquidónico sustancialmente libre de ácido eicosapentaneoico, que comprende el cultivo de una especie de Pythium que produce un aceite araquidónico sustancialmente libre de ácido eicosapentaneoico bajo condiciones adecuadas para la producción de cultivos de aceite; la recolección de dicho Pythium; la extracción de dicho aceite de dicho Pythium recolectado y la recuperación de dicho aceite.
15
Según la presente invención, se proporciona un procedimiento para la producción de lípidos microbianos que comprende:
(a) llevar a cabo una fermentación de un medio que comprende microorganismos, una fuente de carbono y una fuente de nutriente limitante y proporcionar las condiciones suficientes para el mantenimiento de un nivel de oxígeno disuelto de por lo menos aproximadamente 4% de la saturación en dicho medio de fermentación para aumentar la densidad de biomasa;
25
- (b)
- suministrar posteriormente las condiciones suficientes para el mantenimiento de un nivel de oxígeno disuelto de aproximadamente 1% o inferior de la saturación en dicho medio de fermentación y proporcionar las condiciones suficientes para permitir a dichos microorganismos la producción de dichos lípidos, y
- (c)
- recuperar dichos lípidos microbianos.
en el que por lo menos 15% de dichos lípidos microbianos son lípidos poliinsaturados, y
en el que una densidad de biomasa de por lo menos 100g/l se alcanza durante la fermentación en el que dichos 35 microorganismos son del orden Thraustochytriales.
Se describe un procedimiento para el enriquecimiento del contenido de ácidos grasos polienoicos de un microorganismo, que comprende la fermentación de dicho microorganismo en un medio de cultivo que presenta un nivel de oxígeno disuelto inferior a 1% de la saturación.
Se describe un procedimiento heterotrófico para la producción de productos y microorganismos, que comprende el cultivo de dichos microorganismos en un medio de cultivo que presenta un nivel de oxígeno disuelto inferior a 1% de la saturación en el que dichos microorganismos presentan genes de la policétido sintasa.
45 Se da asimismo a conocer un procedimiento para el cultivo de microorganismos eucarióticos capaces de producir por lo menos aproximadamente 20% de su biomasa en forma de lípidos y un procedimiento para la producción de los lípidos. Preferentemente, los lípidos contienen uno o más ácidos grasos polienoicos. Las formas de realización del procedimiento comprenden la adición a un medio de fermentación que comprende microorganismos eucarióticos, de una fuente de carbono, preferentemente una fuente de carbono sin alcohol, y una fuente de nutriente limitante. Preferentemente, la fuente de carbono y la fuente de nutriente limitante se añaden en una proporción suficiente para incrementar la densidad de la biomasa del medio de fermentación hasta, por lo menos, 100 g/l.
En una forma de realización de la presente invención, la condición de fermentación comprende una etapa de incremento de la densidad de la biomasa y una etapa de producción de lípidos, en la que la etapa de incremento de
55 la densidad de la biomasa comprende la adición de la fuente de carbono y la fuente de nutriente limitante, y en la que la etapa de producción de lípidos comprende la adición de la fuente de carbono sin añadir la fuente de nutriente limitante para la creación de las condiciones que inducen la producción de los lípidos.
Los microorganismos del orden Thraustochytriales, capaces de producir lípidos en un medio de fermentación con un nivel de oxígeno inferior a aproximadamente 3% de la saturación, son microorganismos particularmente útiles de la presente invención.
Todavía en otra forma de realización de la presente invención, los microorganismos se cultivan en un proceso de alimentación por lote.
65 Se da asimismo a conocer un procedimiento para la producción de lípidos microbianos eucarióticos, que comprende:
(a) el cultivo de los microorganismos eucarióticos en un medio de fermentación para incrementar la densidad de la biomasa de dicho medio de fermentación hasta por lo menos aproximadamente 100 g/l.
5 (b) proporcionar las condiciones de fermentación suficientes para permitir que dichos microorganismos produzcan dichos lípidos; y
(c) la recuperación de dichos lípidos,
en el que más de aproximadamente 15% de dichos lípidos son lípidos poliinsaturados.
Otro aspecto de la presente invención proporciona un procedimiento de recuperación de los lípidos, que comprende:
(d) la eliminación del agua de dicho medio de fermentación para proporcionar microorganismos secos; y 15 (e) el aislamiento de dichos lípidos de dichos microorganismos secos.
Preferentemente, la etapa de eliminación de agua comprende el contacto del medio de fermentación directamente con un secador de tambor sin centrifugación previa. Otra forma de realización de la presente invención proporciona un procedimiento de recuperación de lípidos, que comprende:
- (d)
- el tratamiento del caldo de fermentación para permeabilizar, lisar o romper las paredes celulares; y
- (e)
- la recuperación de los lípidos del caldo de fermentación mediante separación por gravedad, y
preferentemente mediante centrifugación, con o sin la ayuda de un solvente soluble en agua que facilite la 25 ruptura de la emulsión lípido/agua.
Preferentemente, las células microbianas se tratan en la etapa (c) en un fermentador o en un recipiente similar.
La figura 1 es una tabla y un gráfico de diversos parámetros de la producción de lípidos de un microorganismo frente a la cantidad de oxígeno disuelto en el medio de fermentación.
35 La presente invención se refiere a un procedimiento para el cultivo de microorganismos del orden de los Thraustochytriales. Además, el procedimiento de la presente invención puede utilizarse para la producción de una diversidad de compuestos lipídicos, particularmente, lípidos insaturados, preferentemente lípidos poliinsaturados (es decir, lípidos que contienen por lo menos 2 enlaces carbono-carbono insaturados, por ejemplo dobles enlaces), y más preferentemente lípidos altamente insaturados (es decir, lípidos que contienen 4 o más enlaces carbono-carbono insaturados) tales como los ácidos grasos poliinsaturados omega-3 y/o omega-6, incluyendo el ácido docosahexaenoico (es decir, DHA); y otros compuestos insaturados, poliinsaturados y altamente insaturados de origen natural. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “lípido” incluye fosfolípidos; ácidos grasos libres; ésteres de ácidos grasos, triacilgliceroles; esteroles y ésteres de esteroles; carotenoides; xantofilas (por
45 ejemplo, oxicarotenoides), hidrocarburos; compuestos derivados del isoprenoide y otros lípidos conocidos por un experto ordinario en la materia.
Específicamente, los procedimientos de la presente invención resultan útiles en el cultivo de microorganismos del orden Thraustochytriales que producen uno o más ácidos grasos polienoicos y para la producción de uno o más ácidos grasos polienoicos.
Aunque los procedimientos de la presente invención pueden utilizarse para el cultivo de una gran diversidad de microorganismos del orden Thraustochytriales y para la obtención de compuestos que contienen lípidos poliinsaturados producidos por los mismos, en aras de la brevedad, por conveniencia y a título ilustrativo, la presente
55 descripción detallada de la invención expone procedimientos para el cultivo de microorganismos del orden Thraustochytriales que son capaces de producir lípidos que comprenden los ácidos grasos poliinsaturados omega-3 y omega-6, particularmente, los microorganismos del orden Thraustochytriales capaces de producir DHA (o compuestos afines, tales como DPA, EPA o ARA). Preferentemente la presente invención se refiere a la utilización de traustoquitriales del género Thraustochytrium y Schizochytrium, incluyendo las traustoquitriales descritas en las patentes en cotitularidad US nº 5.340.594 y nº 5.340.742, concedidas a Barclay. Debe indicarse que gran cantidad de expertos se muestran de acuerdo en que la Ulkenia no representa un género separado, sino que de hecho forma parte del género Schizochytrium. Tal como se utiliza en la presente memoria, el género Schizochytrium incluye a Ulkenia.
65 Los microorganismos preferidos son los que producen los compuestos de interés mediante sistemas de policétido sintasa. Entre estos microorganismos se incluyen los microorganismos con sistemas de policétido sintasa
endógenos y microorganismos en los que se ha introducido artificialmente un sistema de policétido sintasa. Los policétidos son productos naturales estructuralmente diversos que presentan un gran abanico de actividades biológicas, entre las que se incluyen las propiedades antibióticas y farmacológicas. La biosíntesis del esqueleto de cadena de carbonos de los policétidos es catalizada por las policétido sintasas. De manera similar a las sintasas de 5 los ácidos grasos, con las que se encuentran relacionadas estructural y mecánicamente, las policétido sintasas catalizan las condensaciones descarboxilativas repetidas entre los tioésteres de acilo, que extienden la cadena de carbonos en dos carbonos cada vez. Sin embargo, a diferencia de las sintasas de los ácidos grasos, las policétido sintasas pueden generar una gran variabilidad estructural en el producto final. Los sistemas individuales de policétido sintasa pueden conseguir esta variabilidad estructural partiendo de unidades iniciales diferentes del acetato, utilizando el metilmalonato o el etilmalonato como unidad extensora y modificando el ciclo reductivo de la cetorreducción, deshidratación y reducción de enoilos en el grupo beta-ceto formado tras cada condensación. Resulta de particular interés que los dobles enlaces carbono-carbono introducidos en la etapa de deshidratación pueden conservarse en el producto final. Además, aunque estos dobles enlaces se encuentran inicialmente en la configuración trans, pueden convertirse en la configuración cis, presente en la DHA (y en otros ácidos grasos
15 polienoicos de interés) mediante isomerización enzimática. Ambas reacciones de deshidratación y de isomerización pueden producirse en ausencia de oxígeno molecular.
Se describe un procedimiento heterotrófico para la producción de productos y microorganismos. El procedimiento puede comprender el cultivo de microorganismos en un medio de cultivo en el que los microorganismos contienen un sistema de policétido sintasa. El nivel del oxígeno disuelto se mantiene por debajo de aproximadamente 1%.
Suponiendo una velocidad de producción de lípidos relativamente constante por parte de un alga, resulta evidente que una densidad de biomasa superior proporcionará una cantidad superior de lípidos por unidad de volumen. Los procesos de fermentación convencionales actuales para el cultivo de algas rinden una densidad de biomasa de entre
25 aproximadamente 50 g/l y aproximadamente 80 g/l o inferior. Los presentes inventores han descubierto que utilizando los procedimientos de la presente invención se puede conseguir una densidad de biomasa significativamente superior a las densidades de biomasa conocidas de la técnica. Preferentemente, los procedimientos de la presente invención proporcionan una densidad de biomasa de por lo menos aproximadamente 100 g/l, más preferentemente de por lo menos 130 g/l, todavía más preferentemente de por lo menos 150 g/l, todavía más preferentemente de por lo menos 170 g/l, y más preferentemente superiores a 200 g/l. Por lo tanto, con estas densidades de biomasa, aunque se reduzca ligeramente la velocidad de producción de lípidos de las algas, la velocidad de producción de lípidos total por unidad de volumen resulta significativamente superior que en los procedimientos conocidos en la actualidad.
35 Los procedimientos para el cultivo de microorganismos del orden de las traustoquitriales, incluyen la adición de una fuente de carbono y una fuente de un nutriente limitante a un medio de fermentación, que comprende los microorganismos, en una proporción suficiente para incrementar la densidad de la biomasa del medio de fermentación indicado anteriormente. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “fuente de nutriente limitante” se refiere a una fuente de nutriente (incluyendo el nutriente mismo) esencial para el crecimiento de un microorganismo, en el sentido de que cuando el nutriente limitante se elimina del medio, su ausencia limita sustancialmente el crecimiento del microorganismo o su replicación. Sin embargo, debido a que el resto de los nutrientes todavía son abundantes, el microorganismo puede continuar fabricando y acumulando productos intracelulares y/o extracelulares. Mediante la selección de un nutriente limitante específico, resulta posible controlar el tipo de producto que se acumula. Por lo tanto, la provisión de una fuente de nutriente limitante en una proporción
45 determinada permite el control tanto de la velocidad de crecimiento del microorganismo como la producción o acumulación de los productos deseados (por ejemplo lípidos). Este proceso de fermentación, en el que uno o más sustratos (por ejemplo, una fuente de carbono y una fuente de nutriente limitante) se añaden en incrementos, se conoce generalmente como procedimiento de fermentación por lotes. Se ha observado que, al añadir el sustrato a un proceso de fermentación por lotes, la presencia de una fuente abundante de carbono (por ejemplo, aproximadamente 200 g/l o más en 60 g/l de densidad de biomasa) presentaba un efecto perjudicial sobre los microorganismos. Sin limitarse a ninguna teoría particular, se cree que una fuente de carbono tan abundante causa efectos perjudiciales, incluyendo estrés osmótico, en los microorganismos e inhibe la productividad inicial de éstos. Los procedimientos de la presente invención evitan este efecto perjudicial no deseado proporcionando simultáneamente una cantidad suficiente de sustrato para alcanzar la densidad de biomasa de los microorganismos
55 anteriormente indicada.
Los procedimientos para el cultivo de microorganismos pueden incluir una etapa de incremento de la densidad de biomasa. En la etapa de incremento de la densidad de biomasa, el objetivo principal del proceso de fermentación es incrementar la densidad de biomasa en el medio de fermentación para obtener la densidad de biomasa indicada anteriormente. La velocidad de adición de la fuente de carbono se mantiene típicamente en un nivel o en un intervalo que no cause un efecto perjudicial significativo sobre la productividad de los microorganismos, o sobre la viabilidad de los microorganismos como resultado de la incapacidad del sistema de fermentación para eliminar el calor de los gases y transferirlo hacia o desde el caldo líquido. Es bien conocido por el experto ordinario en la materia el intervalo apropiado para la cantidad de fuente de carbono necesaria durante el proceso de fermentación para un 65 microorganismo particular. Preferentemente, una fuente de carbono de la presente invención representa una fuente de carbono sin alcohol, es decir, una fuente de carbono que no contiene alcohol. Tal como se utiliza en la presente
memoria, el término “alcohol” se refiere a un compuesto que presenta 4 átomos de carbono o menos con un grupo hidroxi, por ejemplo, metanol, etanol e isopropanol, aunque para el propósito de la presente invención no se incluyen los ácidos hidroxiorgánicos, tales como el ácido láctico y compuestos similares. Más preferentemente, una fuente de carbono de la presente invención es un carbohidrato, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, fructosa, glucosa,
5 sacarosa, melaza y almidón. Se dan a conocer otras fuentes de carbono y de nitrógeno simples y complejas en las patentes mencionadas anteriormente. Típicamente, sin embargo, se utiliza un carbohidrato, preferentemente jarabe de maíz, como la fuente principal de carbono. Los ácidos grasos, en la forma de ácidos grasos hidroxi, triglicéridos y monoglicéridos y diglicéridos pueden también utilizarse como fuentes de carbono.
Las fuentes de nitrógeno preferidas son urea, nitrato, proteína de soja, aminoácidos, proteínas, licor de maíz, extracto de levadura, subproductos animales, sal inorgánicas de amonio, más preferentemente sales sulfato de amonio, hidróxidos y más preferentemente hidróxido de amonio. Entre otras fuentes de nutriente limitante se incluyen fuentes de carbono (tal como se han definido anteriormente), fuentes de fosfato, fuentes de vitaminas (tales como las fuentes de vitaminas B12, fuentes de pantotenato, fuentes de tiamina) y fuentes de metales traza (tales
15 como fuentes de zinc, fuentes de cobre, fuentes de cobalto, fuentes de níquel, fuentes de hierro, fuentes de manganeso, fuentes de molibdeno), y fuentes de metales mayores (tales como fuentes de magnesio, fuentes de calcio, fuentes de sodio, fuente de potasio, fuentes de silicio, etc.). Las fuentes de metales traza y las fuentes de metales principales pueden incluir sales de sulfato y sales de cloruro de estos metales (por ejemplo, aunque sin limitarse a ellos, MgSO4·7H2O; MnCl2·4H2O; ZnSO4·7H2O; CoCl2·6H2O; Na2MoO4·2H2O; CuSO4·5H2O; NiSO4·6H2O; FeSO4·7H2O; CaCl2; K2SO4; KCl; y Na2SO4).
Cuando se utiliza amonio como fuente de nitrógeno, el medio de fermentación se acidifica, si no se controla mediante la adición de bases o tampones. Cuando se utiliza hidróxido de amonio como fuente principal de nitrógeno, se puede utilizar asimismo para controlar el pH. Los microorganismos del orden de las traustoquitriales,
25 particularmente las traustoquitriales de los géneros Thraustochytrium y Schizochytrium, crecen en un gran intervalo de valores de pH, por ejemplo, entre aproximadamente pH 5 y aproximadamente pH 11. Es conocido por el experto en la materia el intervalo de pH apropiado para la fermentación de un microorganismo particular.
Los procedimientos para el cultivo de microorganismos también pueden incluir una etapa de producción. En esta etapa, la utilidad principal del sustrato para los microorganismos no es incrementar la densidad de biomasa sino utilizar el sustrato para la producción de lípidos. Debe apreciarse que los lípidos también son producidos por los microorganismos durante la etapa de incremento de la densidad de biomasa; sin embargo, tal como se ha indicado anteriormente, el objetivo principal de la etapa de incremento de la densidad de biomasa es incrementar la densidad de biomasa. Típicamente, durante la etapa de producción, la adición del nutriente limitante se reduce o
35 preferentemente se detiene.
Anteriormente se aceptaba de manera general que la presencia de oxígeno disuelto en el medio de fermentación resultaba crucial para que los microorganismos eucarióticos produjesen compuestos poliinsaturados, incluyendo ácidos poliinsaturados omega-3 y/o omega-6. De esta manera, se creía generalmente que resultaba preferida la presencia de cantidades relativamente grandes de oxígeno disuelto en el medio de fermentación. Sorprendente e inesperadamente, sin embargo, los presentes inventores han demostrado que la velocidad de producción de los lípidos se incrementa drásticamente cuando se reduce la presencia de oxígeno disuelto durante la etapa de producción. De este manera, mientras el nivel de oxígeno disuelto en el medio de fermentación durante la etapa de incremento de la densidad de biomasa es de por lo menos 4% de la saturación aproximadamente, y
45 preferentemente de por lo menos aproximadamente 8% de la saturación, la presencia de oxígeno disuelto en el medio de fermentación se reduce hasta aproximadamente el 1% o menos de la saturación durante la etapa de producción, más preferentemente hasta el 0% de la saturación. Al iniciarse la fermentación, el nivel del oxígeno disuelto (DO) puede encontrarse cerca del nivel de saturación o alcanzar este nivel, y conforme los microbios crecen, se permite que vaya bajando hasta estos valores reducidos de DO. En la presente invención, la cantidad de oxígeno disuelto en el medio de fermentación varía durante el proceso de fermentación. Por ejemplo, para un proceso de fermentación con un tiempo de fermentación total de entre aproximadamente 90 y aproximadamente 100 horas, el nivel de oxígeno disuelto en el medio de fermentación se mantiene aproximadamente al 8% durante las primeras 24 horas, aproximadamente al 4% entre las 24 y las 40 horas, y aproximadamente al 0,5% o menos a partir de las 40 horas hasta el final del proceso de fermentación.
55 Resulta posible controlar la cantidad de oxígeno disuelto en el medio de fermentación mediante el control de la cantidad de oxígeno en el espacio de cabeza del fermentador, o preferentemente mediante el control de la velocidad a la que se agita (o se mezcla) el medio de fermentación. Por ejemplo, una velocidad de agitación (o mezcla) elevada resulta en una cantidad relativamente alta de oxígeno disuelto en el medio de fermentación en comparación con una velocidad de agitación baja. Por ejemplo, en un fermentador con una capacidad aproximada de 14.000 galones, se ajusta la velocidad de agitación a un valor aproximado de entre aproximadamente 50 rpm y aproximadamente 70 rpm durante las primeras 12 horas, a un valor entre aproximadamente 55 rpm y aproximadamente 80 rpm entre las 12 y las 18 horas y a un valor entre aproximadamente 70 rpm y aproximadamente 90 rpm desde aproximadamente las 18 horas hasta el final del proceso de fermentación para
65 conseguir el nivel de oxígeno expuesto anteriormente para un tiempo total del proceso de fermentación de entre aproximadamente 90 y aproximadamente 100 horas. Un experto ordinario en la materia podrá determinar con facilidad el intervalo particular de velocidades de agitación necesarias para conseguir una cantidad particular de oxígeno disuelto en el medio de fermentación.
Una temperatura preferida para los procedimientos de la presente invención es de por lo menos aproximadamente
5 20ºC, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 25ºC, y todavía más preferentemente de por lo menos aproximadamente 30ºC. Debe apreciarse que el agua fría puede retener una cantidad superior de oxígeno disuelto que el agua caliente. De esta manera, una temperatura superior del medio de fermentación presenta el beneficio adicional de reducir el nivel de oxígeno disuelto, lo que resulta particularmente deseable, tal como se ha descrito anteriormente.
Determinados microorganismos pueden requerir una cantidad determinada de minerales salinos en el medio de fermentación. Estos materiales salinos, especialmente los iones cloruro, pueden causar la corrosión del fermentador y otros equipos de tratamiento situados a continuación del mismo. Para evitar o reducir estos efectos no deseados debido a la presencia de cantidades relativamente grandes de iones cloruro presentes en el medio de fermentación,
15 los procedimientos de la presente invención también pueden incluir la utilización de sales sódicas que no contienen cloruros, preferentemente sulfato sódico, en el medio de fermentación como fuente de sodio. Más particularmente, una parte significativa de las necesidades de sodio de la fermentación se proporciona en forma de sales sódicas que no contienen cloruros. Por ejemplo, una cantidad inferior a aproximadamente 75% del sodio en el medio de fermentación se proporciona en forma de cloruro sódico; más preferentemente inferior al aproximadamente 50%, y todavía más preferentemente inferior al aproximadamente 25%. Los microorganismos de la presente invención pueden cultivarse a concentraciones de cloruros inferiores a aproximadamente 3 g/l, más preferentemente inferiores a aproximadamente 500 mg/l, más preferentemente inferiores a aproximadamente 250 mg/l y todavía más preferentemente de entre aproximadamente 60 mg/l y aproximadamente 120 mg/l.
25 Entre las sales sódicas que no contienen cloruros se incluyen el carbonato de sosa (una mezcla de carbonato sódico y óxido sódico), carbonato sódico, bicarbonato sódico, sulfato sódico y las mezclas de los mismos, y preferentemente se incluye el sulfato sódico. El carbonato de sosa, el carbonato sódico y el bicarbonato sódico tienden a incrementar el pH del medio de fermentación, por lo que requieren etapas de control para mantener un pH apropiado del medio. La concentración de sulfato sódico resulta efectiva para satisfacer los requisitos de salinidad de los microorganismos, preferentemente la concentración de sodio (expresada como g/l de Na) es de por lo menos aproximadamente 1 g/l, más preferentemente de entre aproximadamente 1 g/l y aproximadamente 50 g/l, y más preferentemente de entre aproximadamente 2 g/l y aproximadamente 25 g/l.
Se exponen en detalle en la patente US nº 5.130.242 diversos parámetros de fermentación para la inoculación,
35 cultivo y recuperación de los microorganismos. Resulta posible utilizar cualquiera de los procedimientos de aislamiento conocidos en la técnica para aislar los microorganismos del medio de fermentación, procedimientos entre los que se incluyen la centrifugación, la filtración, la ultrafiltración, la decantación y la evaporación del solvente. Los presentes inventores han observado que, debido a la elevada densidad de biomasa que resulta de los procedimientos de la presente invención, cuando se utiliza la centrifugación para recuperar los microorganismos, resulta preferido diluir el medio de fermentación añadiendo agua, lo que reduce la densidad de biomasa, facilitando de esta manera la separación de los microorganismos del medio de fermentación.
Las densidades de biomasa muy elevadas alcanzadas en la presente invención también facilitan procedimientos "libres de solventes" para la recuperación de los lípidos microbianos. Los procedimientos preferidos para lisar las 45 células en el fermentador se describen en la solicitud provisional de patente US nº 60/177.125 titulada “Solventless extraction process”, presentada el 19 de enero de 2000; la solicitud de patente US nº 09/766.500 titulada “Solventless extraction process”, preentada el 19 de enero de 2001 (en la actualidad, patente US nº 6.750.048), y la publicación de patente PCT WO nº A-0153512 titulada “Solventless extraction process”. presentada el 19 de enero de 2001. Entre los procedimientos preferidos para la recuperación de los lípidos una vez que las células han sido permeabilizadas, rotas o lisadas en el fermentador (que permite romper la emulsión de lípidos, y la recuperación de la fracción rica en lípidos) se incluye el procedimiento de desaceitado descrito de manera general en la patente WO nº 96/05278, que se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad. En este procedimiento, un compuesto soluble en agua, por ejemplo alcohol o acetona, se añade a una emulsión de aceite/agua para romper la emulsión y la mezcla resultante se separa por gravedad, por ejemplo mediante centrifugación. Este procedimiento
55 también puede modificarse para utilizar otros agentes (soluble en agua y/o en lípido) para la ruptura de la emulsión.
Alternativamente, los microorganismos se recuperan en forma seca del medio de fermentación mediante la evaporación del agua del medio de fermentación, por ejemplo, poniendo en contacto directo el medio de fermentación (es decir, sin preconcentración, por ejemplo mediante centrifugación) con un secador, tal como un secador de tambor, es decir, un procedimiento directo de recuperación de secador de tambor. Cuando se utiliza el procedimiento directo de recuperación de secador de tambor para aislar los microorganismos, típicamente se utiliza un secador de tambor calentado por vapor. Además, cuando se utiliza el procedimiento directo de recuperación de secador de tambor, la densidad de biomasa del medio de fermentación es, preferentemente, de por lo menos aproximadamente 130 g/l, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 150 g/l y más preferentemente 65 de por lo menos aproximadamente 180 g/l. Esta elevada densidad de biomasa resulta generalmente deseable para el procedimiento directo de recuperación de secador de tambor porque a una densidad de biomasa inferior, el medio
de fermentación comprende una cantidad suficiente de agua para enfriar significativamente el tambor, resultando por lo tanto en un secado incompleto de los microorganismos. Otros procedimientos de secado de células, incluyendo la deshidratación por aspersión, son bien conocidos por el experto ordinario en la materia.
5 Los procedimientos de la presente invención proporcionan una tasa media de producción de lípidos de por lo menos aproximadamente 0,5 g/l/h, preferentemente de por lo menos aproximadamente 0,7 g/l/h, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 0,9 g/l/h, y más preferentemente de por lo menos aproximadamente 1,0 g/l/h. Además, los lípidos producidos mediante los procedimientos de la presente invención contienen lípidos poliinsaturados en una cantidad superior a aproximadamente 15%, preferentemente superior a aproximadamente
10 20%, preferentemente superior a aproximadamente 25%, todavía más preferentemente superior a aproximadamente 30% y más preferentemente superior a aproximadamente 35%. Los lípidos pueden recuperarse de microorganismos secados o de los microorganismos en el medio de fermentación. Generalmente, por lo menos el 20% de los lípidos producidos por los microorganismos en los procedimientos de la presente invención son ácidos grasos poliinsaturados omega-3 y/o omega-6, preferentemente por lo menos aproximadamente el 30% son ácidos grasos
15 poliinsaturados omega-3 y/o omega-6, más preferentemente por lo menos aproximadamente el 40% son ácidos grasos poliinsaturados omega-3 y/o omega-6, y más preferentemente por lo menos aproximadamente el 50% son ácidos grasos poliinsaturados omega-3 y/o omega-6. Alternativamente, los procedimientos de la presente invención proporcionan una tasa de producción media de ácidos grasos omega-3 (por ejemplo, DHA) de por lo menos aproximadamente 0,2 g de ácidos grasos omega-3 (por ejemplo, DHA)/l/h, preferentemente de aproximadamente
20 0,3 g de ácidos grasos omega-3 (por ejemplo, DHA)/l/h, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 0,4 g de ácidos grasos omega-3 (por ejemplo, DHA)/l/h, y más preferentemente de por lo menos aproximadamente 0,5 g de ácidos grasos omega-3 (por ejemplo, DHA)/l/h. Alternativamente, los procedimientos de la presente invención proporcionan una tasa media de producción de ácidos grasos omega-6 (por ejemplo, DPAn-6) de por lo menos aproximadamente 0,07 g de ácidos grasos omega-6 (por ejemplo, DPAn-6)/l/h, más preferentemente de por
25 lo menos aproximadamente 0,1 g de ácidos grasos omega-6 (por ejemplo, DPAn-6)/l/h, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 0,13 g de ácidos grasos omega-6 (por ejemplo, DPAn-6)/l/h, y más preferentemente de por lo menos aproximadamente 0,17 g de ácidos grasos omega-6 (por ejemplo, DPAn-6)/l/h. Todavía más alternativamente, por lo menos aproximadamente el 25% de los lípidos son DHA (basado en el total de metil éster de ácido graso), preferentemente por lo menos aproximadamente el 30%, más preferentemente por lo menos
30 aproximadamente el 35% y más preferentemente por lo menos aproximadamente el 40%.
Los microorganismos, los lípidos extraídos de los mismos, la biomasa restante tras la extracción de los lípidos, o las combinaciones de los mismos pueden utilizarse directamente como ingrediente alimentario, tal como un ingrediente de bebidas, salsas, alimentos lácteos (tales como leche, yogurt, queso y helado) y alimentos horneados; 35 suplementos nutricionales (en forma de cápsula o de tableta); piensos o suplementos de piensos para animales cuya carne o productos resulten consumidos por los seres humanos; suplementos alimentarios, incluyendo alimentos y fórmulas infantiles; y productos farmacéuticos (en aplicaciones de terapia directa o complementaria). El término “animal” se refiere a cualquier organismo perteneciente al reino animal e incluye, sin limitación, cualquier animal del que proceda carne de ave, marisco, carne de vacuno, de cerdo o de cordero. El marisco se deriva, sin limitarse a
40 ellos, de pescado, de gambas y de crustáceos. El término “productos” incluye cualquier producto, además de la carne, derivado de dichos animales, incluyendo, sin limitarse a ellos, huevos, leche u otros productos. Cuando se alimentan a dichos animales, los lípidos poliinsaturados pueden incorporarse a carne, leche, huevos u otros productos de dichos animales, para incrementar el contenido de dichos lípidos.
45 Se proporcionan a continuación ejemplos no limitativos que ilustran aplicaciones, ventajas y nuevas características adicionales de la presente invención.
50 La cepa de Schizochytrium utilizada en estos ejemplos produce dos ácidos polienoicos primarios, el DHAn-3 y el DPAn-6, generalmente en proporción 3:1, y pequeñas cantidades de otros ácidos polienoicos, tales como EPA y C20:3, bajo una amplia diversidad de condiciones de fermentación. De esta manera, aunque los ejemplos siguientes sólo indican la cantidad de DHA, puede calcularse con facilidad la cantidad de DPA(n-6) producida mediante la utilización de la proporción anteriormente dada a conocer.
55
El presente ejemplo ilustra el efecto del contenido de oxígeno en un medio de fermentación sobre la productividad de lípidos.
60 Se realizaron mediciones de los resultados de la fermentación de Schizochytrium ATCC nº 20.888 bajo diversos niveles de oxígeno disuelto. Los resultados se muestran en la figura 1, en la que RCS representa la concentración residual de azúcar y DCW representa el peso de las células secas.
El presente ejemplo también ilustra el efecto del contenido de oxígeno reducido en el medio de fermentación sobre el contenido de DHA (% de peso en seco) del producto biomasa final.
5 Se realizó un experimento "a escala reducida" en matraces Erlenmeyer de 250 ml para imitar el efecto del contenido de oxígeno reducido sobre el contenido de DHA en células de Schizochytrium sp. en cultivo en fermentadores a gran escala. Se cultivó Schizochytrium sp. (ATCC nº 20.888) en un medio O4-4. Este medio de cultivo está constituido por (sobre base por litro disuelto en agua desionizada): 12,61 g de Na2SO4; 1,2 g de MgSO4·7H2O; 0,25 g de KCl; 0,05 g
10 de CaCl2 7,0 g de glutamato de monosodio; 10 g de glucosa; 0,5 g de KH2PO4; 0,1 g de NaHCO3; 0,1 g de extracto de levadura; 1,0 ml de mezcla de vitaminas; 1,0 ml de metales PII. La mezcla de metales PII contiene (por litro): 6,0 g de Na2EDTA, 0,29 g de FeCl3·6H2O, 6,84 g de H3BO3, 0,86 g de MnCl2*4H20, 0,06 g de ZnCl2, 0,026 g de CoCl2·6H2O, 0,052 g de NiSO4·H2O, 0,002 de CuSO4·H2O y 0,005 g de Na2MoO4·2H2O. La mezcla de vitaminas contiene (por litro): 100 mg de tiamina, 0,5 mg de biotina y 0,5 mg de cianocobalamina. El pH del medio de cultivo se
15 ajustó a un valor de 7,0 y, a continuación, se esterilizó mediante filtración.
La idea subyacente a este experimento a escala reducida era cultivar las células en matraces agitados con diferentes volúmenes de medio de cultivo en los matraces. Los matraces prácticamente llenos (por ejemplo 200 ml en un matraz de 250 ml) no se mezclarían bien en una mesa de agitación y, por lo tanto, se generarían condiciones 20 de oxígeno reducido a medida que las células fuesen creciendo. Por lo tanto, se establecieron 4 tratamientos en el experimento, cada uno de ellos llevado a cabo por duplicado: (1) matraces de 250 ml llenos con 50 ml de medio de cultivo; (2) matraces de 250 ml llenos con 100 ml de medio de cultivo; (3) matraces de 250 ml llenos con 150 ml de medio de cultivo; y (4) matraces de 250 ml llenos con 200 ml de medio de cultivo. Cada una de los ocho matraces se inoculó con células procedentes de un cultivo de 48 horas de Schizochytrium cultivado en medio O4-4 bajo las
25 condiciones del tratamiento 1, y a 28ºC y 220 rpm en una mesa de agitación.
La totalidad de los ocho matraces del experimento se colocaron en una mesa de agitación (220 rpm) dentro de un incubador (a 28ºC) y se cultivaron durante 48 horas en la oscuridad. Al final del experimento, se realizaron mediciones del nivel de oxígeno disuelto en cada matraz con un medidor (YSI) de oxígeno disuelto (YSI, Inc.), se
30 determinó también el pH del medio de cultivo, del peso seco de las células y de su contenido de ácidos grasos. Los resultados del experimento se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1. Resultados del experimento a escala reducida para el análisis del efecto de las concentraciones reducidas de oxígeno disuelto sobre el contenido de ácidos grasos de cadena larga altamente insaturados (DHA % en peso 35 seco) de Schizochytrium sp.
- ml de medio
- FAME (% de TFA) DHA (% de peso seco) Biomasa (g/l) pH final DO (% sat.)
- 50
- 16,5 7,4 4,2 7,4 31
- 100
- 17,0 6,5 3,9 7,2 29
- 150
- 22,4 9,2 2,7 7,0 11
- 200
- 35,9 14,5 1,8 6,9 3
Los resultados indican que el contenido de lípidos (en % de FAME) y el contenido de DHA (% del peso seco) eran superiores para las células cultivadas bajo niveles reducidos de oxígeno disuelto: Cuanto menor era el nivel de 40 oxígeno disuelto, más elevado era el contenido de lípidos y de DHA). Este resultado resulta inesperado debido a que generalmente se ha considerado que el oxígeno resultaba necesario para formar enlaces (dobles) insaturados. Resulta sorprendente que se formase tanto DHA a niveles reducidos de oxígeno disuelto, debido a que el DHA representa uno de los ácidos grasos más insaturados. Aunque la producción de biomasa se reduce conforme decrece el nivel de oxígeno disuelto, el contenido de DHA se incrementa. Por lo tanto, resulta ventajoso disponer de
45 una etapa de crecimiento con niveles de oxígeno disuelto superiores para maximizar la formación de biomasa y reducir posteriormente el nivel de oxígeno disuelto para maximizar la producción de ácidos grasos de cadena larga.
50 Se produjeron microorganismos utilizando fermentadores con un volumen de trabajo nominal de 1.200 galones. Se concentró el caldo de fermentación resultante y los microorganismos se secaron utilizando un secador de tambor. Se extrajeron los lípidos de alícuotas de los microorganismos resultantes y se purificaron para producir un aceite refinado, blanqueado y desodorizado. Se añadieron aproximadamente 3.000 ppm de acetato de d-l-α-tocoferilo como suplemento nutricional previamente al análisis del lípido.
55 Se llevaron a cabo nueve fermentaciones de Schizochytrium ATCC nº 20.888 y los resultados se muestran en la Tabla 2. El nivel de oxígeno disuelto era de aproximadamente 8% durante las primeras 24 horas y de aproximadamente 4% en las horas siguientes.
Tabla 2. Resultados de la fermentación de alimentación por lote para la producción de DHA con la especie Schizochytrium.
- Entrada
- Edad (horas) Producción1 (g/l) DHA2 (%) FAME3 (%) Productividad4
- 1
- 100,3 160,7 17,8 49,5 0,285
- 2
- 99,8 172,4 19,4 51,3 0,335
- 3
- 84,7 148,7 14,4 41,4 0,253
- 4
- 90,2 169,5 19,7 53,9 0,370
- 5
- 99,0 164,1 12,5 38,9 0,207
- 6
- 113,0 187,1 19,7 47,2 0,326
- 7
- 97,0 153,5 13,7 41,0 0,217
- 8
- 92,8 174,8 16,4 48,6 0,309
- Media5
- 97,1 166,4 16,7 46,5 0,288
- Desv. Est.6
- 8,4 12,3 2,9 5,4 0,058
- CV7 (%)
- 8,7 7,4 17,3 11,7 20,2
5 1. producción real de densidad de biomasa.
2. contenido de DHA (expresado en % de peso celular seco).
3. contenido total de ácidos grasos expresado en % de peso celular seco (medido como metil ésteres) 10
- 4.
- (gramos de DHA)/l/h.
- 5.
- media.
15 6. desviación estándar.
7. coeficientes de variabilidad. Los coeficientes de variabilidad inferiores a 5% indican un procedimiento de excelente repetibilidad, los valores de entre 5% y 10% indican un procedimiento de buena reproducibilidad, y los valores de entre 10% y 20% indican un procedimiento de reproducibilidad razonable.
20 Se alimentó jarabe de maíz hasta alcanzar un volumen en el fermentador de aproximadamente 1.200 galones, momento en el que se detuvo la adición del jarabe. El proceso de fermentación se detuvo al caer la concentración residual de azúcar por debajo de 5 g/l. La edad típica, desde la inoculación hasta el final, era de aproximadamente 100 horas.
25 El caldo de fermentación, es decir, el medio de fermentación, se diluyó con agua a una proporción de aproximadamente 2:1 para reducir el contenido de ceniza en el producto final y para ayudar de esta manera a la fase de separación durante la etapa de centrifugación. La pasta de concentrado celular se calentó a 160ºF (aproximadamente 71ºC) y se secó utilizando un secador de doble tambor “Blaw Knox” (42” x 36”). Preferentemente,
30 sin embargo, los microorganismos se secan directamente en un secador de tambor sin centrifugación previa.
El análisis de los resultados de los lípidos extraídos de las alícuotas de cada entrada de la Tabla 2 se resume en la Tabla 3.
35 Tabla 3. Análisis de la biomasa microbiana producida en las fermentaciones de alimentación por lotes detalladas en la Tabla 2.
- Entrada
- % de DHA respecto al % de FAME1 % de lípidos totales % en peso
- 1
- 36,0 72,3
- 2
- 37,8 70,3
- 3
- 34,8 61,5
- 4
- 36,5 74,8
- 5
- 32,1 52,8
- 6
- 41,7 67,7
- 7
- 33,4 49,9
- 8
- 33,7 61,4
- Media
- 35,8 63,8
- Desv. Est.3
- 3,0 9,1
- CV4 (%)
- 8,5 14,2
- 1.
- ver Tabla 2.
- 2.
- ver los comentarios anteriores.
- 3.
- desviación estándar.
- 4.
- coeficientes de variabilidad. Los coeficientes de variabilidad inferiores al 5% indican un procedimiento de
10
5 excelente repetibilidad, los valores de entre 5% y 10% indican un procedimiento de buena reproducibilidad, y los valores de entre 10% y 20% indican un procedimiento de reproducibilidad razonable.
A menos que se indique lo contrario, el medio de fermentación utilizado en toda la sección de Ejemplos incluye los ingredientes siguientes, en los que el primer número indica la concentración diana nominal y el número entre 10 paréntesis indica un intervalo aceptable: 12 (11-13) g/l de sulfato sódico; 0,5 (0,45-0,55) g/l de KCl; 2 (1,8-2,2) g/l de MgSO4·7H2O; 0,35 (0,3-0,4) g/l de antiespumante Hodag K-60; 0,65 (0,60-0,70) g/l de K2SO4; 1,0 (0,9-1,1) g/l de KH2PO4; 1,0 (0,95-1,1) g/l de (NH4)2SO4; 0,17 (0,15-0,19) g/l de CaCl2·2H2O; 4,5 (2-10) g/l de jarabe de maíz (base sólida) 95 DE; 3 (2,7-3,3) mg/l de MnCl2·4H2O; 3 (2,7-3,3) mg/l de ZnSO4·7H2O; 0,04 (0,035-0,045) mg/l de CoCl2·6H2O; 0,04 (0,0-0,045) mg/l de Na2MoO4·2H2O; 2 (1,8-2,2) mg/l de CuSO4·5H2O; 2 (1,8-2,2) mg/l de 15 NiSO4·6H2O; 10 (9-11) mg/l de FeSO4·7H2O; 9,5 (4-15) mg/l de tiamina; 0,15 (0,05-0,25) mg/l de vitamina B12 y 3,2 (1,3-5,1) mg/l de pantotenato de calcio. Además, como fuente de nitrógeno se utilizó una solución de NH4OH al 28%.
El contenido de ceniza en los microorganismos secos era aproximadamente del 6%.
El presente ejemplo ilustra el efecto de un nivel reducido de oxígeno disuelto en el medio de fermentación sobre la productividad de los microorganismos a la escala de 14.000 galones.
25 Utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 3, se llevó a cabo una fermentación con un volumen nominal de
14.000 galones utilizando una cepa de tipo salvaje de Schizochytrium, que puede obtenerse mediante procedimientos de aislamiento dados a conocer en las patentes US nº 5.340.594 y nº 5.340.742 mencionadas anteriormente. El nivel de oxígeno disuelto en el medio de fermentación era de aproximadamente 8% durante las primeras 24 horas, aproximadamente de 4% entre las 24 y las 40 horas y aproximadamente de 0,5% entre las 40
30 horas y el final del proceso de fermentación. Los resultados de estos niveles reducidos de oxígeno disuelto en procesos en medios de fermentación se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4. Resultados de las fermentaciones de alimentación por lotes a una escala de 14.000 galones, de Schizochytrium bajo concentraciones reducidas de oxígeno disuelto.
35
- Entrada
- Edad (horas) Producción (g/l) % de DHA % de FAME % de DHA respecto al % de FAME Productividad de DHA (g DHA/l/h)
- 1
- 82,0 179,3 21,7 52,4 41,4 0,474
- 2
- 99,0 183,1 22,3 55,0 40,5 0,412
- 3
- 72,0 159,3 - - 40,9 -
- 4
- 77,0 161,3 - - 43,2 -
- 5
- 100,0 173,0 23,9 53,3 44,9 0,413
- 6
- 102,0 183,3 21,6 50,8 42,6 0,388
- 7
- 104,0 185,1 23,7 55,0 43,1 0,422
- 8
- 88,0 179,3 22,3 52,6 42,4 0,454
- 9
- 100,0 166,4 22,5 53,5 42,1 0,374
- 10
- 97,0 182,6 22,8 51,6 44,1 0,429
- 11
- 87,5 176,5 19,8 45,6 43,5 0,399
- 12
- 67,0 170,8 18,8 48,1 39,1 0,479
- 13
- 97,0 184,9 23,2 52,7 44,0 0,442
- 14
- 102,0 181,9 23,6 52,9 44,6 0,421
- 15
- 102,0 186,9 19,9 47,8 41,8 0,365
- 16
- 97,0 184,4 19,6 45,5 43,0 0,373
- 17
- 98,0 174,7 19,7 45,1 43,7 0,351
- 18
- 103,5 178,8 18,3 44,5 41,2 0,316
- 19
- 102,0 173,7 15,8 43,1 36,7 0,269
- 20
- 94,0 190,4 19,3 46,9 41,1 0,391
- 21
- 72,0 172,5 22,8 52,8 43,2 0,546
- 22
- 75,0 173,1 21,0 51,7 40,8 0,485
- 23
- 75,0 152,7 20,3 50,3 40,4 0,413
- 24
- 75,5 172,5 21,9 51,7 42,3 0,500
- 25
- 61,0 156,4 17,3 45,7 37,8 0,444
- 26
- 74,5 150,6 20,2 50,1 40,2 0,408
- 27
- 70,5 134,3 14,8 40,6 36,6 0,282
- Entrada
- Edad (horas) Producción (g/l) % de DHA % de FAME % de DHA respecto al % de FAME Productividad de DHA (g DHA/l/h)
- 28
- 75,5 146,1 21,3 49,7 42,8 0,412
- 29
- 82,0 174,3 21,4 50,4 42,5 0,455
- 30
- 105,0 182,3 21,7 50,7 42,8 0,377
- 31
- 66,0 146,2 16,4 44,6 36,7 0,363
- Media
- 87,2 171,5 20,6 49,5 41,6 0,409
- Desv. Es.
- 13,9 14,1 2,4 3,8 2,3 0,061
- CV
- 16,0% 8,2% 11,6% 7,7% 5,5% 15,0%
Ejemplo 5
El presente ejemplo ilustra el efecto del nivel reducido de oxígeno disuelto en el medio de fermentación sobre la 5 productividad de los microorganismos a una escala de 41.000 galones.
Se utilizaron los mismos procedimientos que en el Ejemplo 4, con la excepción de que la fermentación se realizó en un fermentador de 41.000 galones. Los volúmenes del medio de cultivo se incrementaron para mantener las concentraciones diana de los compuestos a esta escala. Los resultados se muestran en la Tabla 5.
10 Tabla 5. Fermentación de Schizochytrium a una escala de 41.000 galones.
- Entrada
- Edad (horas) Producción (g/l) % DHA % FAME % de DHA respecto al % de FAME Productividad de DHA (g DHA/l/h)
- 1
- 75,0 116,1 17,3 46,1 37,4 0,268
- 2
- 99,0 159,3 17,4 47,0 37,1 0,280
- 3
- 103,0 152,6 16,0 47,2 33,8 0,237
- 4
- 68,0 136,8 17,9 45,9 39,1 0,360
- 5
- 84,0 142,0 17,5 47,0 37,2 0,296
- Media
- 85,8 141,4 17,2 46,6 36,9 0,288
- Desv. Es.
- 15,1 16,6 0,7 0,6 1,9 0,046
- CV
- 17,5% 11,8% 4,2% 1,3% 5,2% 15,8%
Ejemplo 6
15 El presente ejemplo ilustra el efecto del nitrógeno suplementario sobre el proceso de fermentación de la presente invención.
Se llevaron a cabo 4 conjuntos de experimentos de alimentación por lotes a escala de 250 L utilizando un 20 procedimiento similar al del Ejemplo 4. Se realizaron 2 experimentos de control y 2 experimentos que contenían amonio suplementario (1,15 y 1,25 veces la cantidad normal). Los resultados se muestran en la Tabla 6.
Tabla 6. Efectos del amonio suplementario sobre la fermentación de Schizochytrium.
- Edad (horas)
- Producción (g/l) Productividad de biomasa Eficiencia de conversión Contenido de DHA Contenido de FAME Productividad DHA
- Diana de azúcares: 7 g/l, valor de pH básico: 5,5, valor de pH ácido: 7,3, 1,0X NH3
- 48
- 178 3,71 g/l/h 51,5% 10,7% 37,8% 0,40 g/l/hr
- 60
- 185 3,08 g/l/h 46,9% 16,3% 47,2% 0,50 g/l/hr
- 72
- 205 2,85 g/l/h 45,2% 17,4% 47,4% 0,50 g/l/hr
- 84
- 219 2,61 g/l/h 43,8% 17,1% 45,5% 0,45 g/l/hr
- 90
- 221 2,46 g/l/h 44,1% 18,4% 48,9% 0,45 g/l/hr
- Diana de azúcares: 7 g/l, valor de pH básico: 5,5, valor de pH ácido: 7,3, 1,15X NH3
- 48
- 171 3,56 g/l/h 55,6 12,0 36,3 0,43 g/l/hr
- 60
- 197 3,28 g/l/h 54,6 9,4 38,4 0,31 g/l/hr
- 72
- 191 2,65 g/l/h 52,8 9,4 40,0 0,25 g/l/hr
- 84
- 190 2,26 g/l/h 52,5 10,0 42,5 0,23 g/l/hr
- 90
- 189 2,10 g/l/h 52,2 9,2 43,3 0,19 g/l/hr
- Diana de azúcares: 7 g/l, valor de pH básico: 5,5, valor de pH ácido: 7,3, 1,25X NH3
- 48
- 178 3,71 g/l/h 56,4 11,5 33,7 0,43 g/l/hr
- 60
- 179 2,98 g/l/h 48,6 10,3 36,0 0,31 g/l/hr
- Edad (horas)
- Producción (g/l) Productividad de biomasa Eficiencia de conversión Contenido de DHA Contenido de FAME Productividad DHA
- 72
- 180 2,50 g/l/h 48,8 12,0 37,6 0,30 g/l/hr
- 84
- 181 2,15 g/l/h 46,1 13,6 40,1 0,29 g/l/hr
- 90
- 185 2,06 g/l/h 45,7 12,6 40,7 0,26 g/l/hr
- Diana de azúcares: 7 g/l, valor de pH básico: 5,5, valor de pH ácido: 7,3, 1,0X NH3
- 48
- 158 3,29 g/l/h 55,7 13,1 36,5 0,43 g/l/hr
- 60
- 174 2,90 g/l/h 48,9 17,9 39,2 0,52 g/l/hr
- 72
- 189 2,63 g/l/h 45,7 21,0 39,4 0,55 g/l/hr
- 84
- 196 2,33 g/l/h 44,1 22,4 40,1 0,52 g/l/hr
- 90
- 206 2,29 g/l/h 44,8 22,1 40,3 0,51 g/l/hr
En general, el nitrógeno suplementario presenta efectos negativos sobre el rendimiento de la fermentación, debido a que se aprecian reducciones significativas de productividad de DHA en los dos lotes a los que se le añadió amonio suplementario. Tal como se muestra en la Tabla 6, los lotes de control resultaron en niveles finales de DHA de
5 18,4% y 22,1% del peso celular seco total frente a 9,2% (lote con 1,15x amonio) y 12,6% (lote con 1,25x amonio) para los lotes suplementados con nitrógeno adicional.
Ejemplo 7
10 El presente ejemplo muestra un perfil cinético del proceso de fermentación de la presente invención.
Se realizó un experimento de alimentación por lotes a una escala de 1.000 galones utilizando un procedimiento similar al del Ejemplo 4. El perfil cinético del proceso de fermentación se muestra en la Tabla 7.
15 Tabla 7. Perfil cinético para un experimento de fermentación de alimentación por lotes de Schizochytrium a una escala de 1.000 galones.
- Edad (horas)
- Producción (g/l) Productividad de biomasa Eficiencia de conversión % de contenido de DHA % de contenido de FAME Productividad de DHA
- 24
- 118 4,92 g/l/hr 78,2% 7,4 18,8 0,36 g/l/hr
- 30
- 138 4,60 g/l/hr 60,3% 10,6 30,9 0,49 g/l/hr
- 36
- 138 3,83 g/l/hr 46,6% 11,6 36,5 0,44 g/l/hr
- 42
- 175 4,17 g/l/hr 49,8% 13,4 41,7 0,56 g/l/hr
- 48
- 178 3,71 g/l/hr 45,1% 18,7 52,8 0,69 g/l/hr
- 48*
- 164 3,42 g/l/hr 41,5% 15,3 33,1 0,52 g/l/hr
- 54
- 196 3,63 g/l/hr 45,7% 16,6 51,2 0,60 g/l/hr
- 60
- 190 3,17 g/l/hr 41,7% 16,9 33,9 0,54 g/l/hr
- 72
- 189 2,62 g/l/hr 39,1% 15,6 31,8 0,41 g/l/hr
- 84
- 195 2,32 g/l/hr 38,5% 16,4 32,7 0,38 g/l/hr
- 90
- 200 2,22 g/l/hr 39,0% 18,8 33,3 0,42 g/l/hr
- 90
- 171 1,90 g/l/hr 33,3% 22,2 61,6 0,42 g/l/hr**
*Se analizaron dos muestras separadas a las 48 horas.
20 **Este valor corresponde a una muestra de pesos celulares secos lavados. El resto de valores corresponden a muestras no lavadas.
Ejemplo 8
25 El presente ejemplo ilustra el efecto de la cantidad de la fuente de carbono sobre la productividad.
Se realizaron tres diferentes procesos de fermentación utilizando el procedimiento del Ejemplo 4 con diversas cantidades de la fuente de carbono. Los resultados se muestran en la Tabla 8. 30 Tabla 8. Resultados de la fermentación de la Schizochytrium para diversas cantidades de la fuente de carbono.
- Edad (horas)
- Producción (g/l) Carga de carbono Eficiencia de conversión Contenido de DHA Contenido de FAME Productividad de DHA
- 90
- 171 51,3% 33,3% 22,2 61,6 0,42 g/l/hr
- 94
- 122 40,5% 30,1% 19,1 57,3 0,25 g/l/hr
- 59
- 73 20,0% 36,5% 11,9 40,8 0,15 g/l/hr
El presente ejemplo ilustra el efecto de la limitación de nutrientes sobre la eficiencia de conversión del carbono en 5 biomasa, en lípidos y más específicamente en DHA.
Se realizó un estudio de cultivo continuo con el fin de estudiar el efecto de la limitación de nutrientes, cultivando Schizochytrium ATCC nº 20.888 en un fermentador Applikon de 2 litros de volumen en un medio de crecimiento basal (ICM-2) constituido por los compuestos siguientes (concentración nominal): ingredientes del grupo I: Na2SO4 10 (18,54 g/l), MgSO4·7H2O (2,0 g/l) y KCl (0,572 g/l); ingredientes del grupo II (cada uno preparado de manera separada): glucosa (43,81 g/l), KH2PO4 (1,28 g/l), CaCl2*2H2O (0,025 g/l) y (NH4)2SO4 (6,538 g/l); ingredientes del grupo III: Na2EDTA (6,0 mg/l), FeCl3·6H2O (0,29 mg/l), H3BO3 (6,84 mg/l), MnCl2·4H2O (0,86 mg/l), ZnSO4·7H2O (0,237 mg/l), CoCl2·2H2O (0,026 mg/l), Na2MoO4·2H2O (0,005 mg/l), CuSO4·5H2O (0,002 mg/l) y NiSO4·6H2O (0,052 mg/l); e ingredientes del grupo IV: HCl de tiamina (0,2 mg/l), vitamina B12 (0,005 mg/l), pantotenato de calcio
15 (0,2 mg/l). Los grupos I y II se esterilizaron con autoclave, mientras que los grupos III y IV se esterilizaron por filtración antes de añadirlos al fermentador. El medio de crecimiento se inoculó con Schizochytrium y se cultivó bajo condiciones controladas de 30ºC, pH 5,5 y un nivel de oxígeno disuelto de 20% de la saturación hasta alcanzar el máximo de densidad celular.
20 A continuación, se estableció un modo de operación continua bombeando medio nutritivo ICM-2 estéril al fermentador mientras simultáneamente se agitaba el caldo que contenía las células de Schizochytrium a una tasa de flujo suficiente para mantener una tasa de dilución de 0,06 h-1, hasta alcanzar una situación de equilibrio dinámico. Con el fin de investigar el efecto de la limitación de nutrientes, la concentración del compuesto que contenía el nutriente específico requerido se redujo en el medio de alimentación ICM-2, de manera que este nutriente se
25 agotase en el caldo de salida que contenía células, de manera que el crecimiento de las células se encontrase limitado por la ausencia del nutriente neceparticular requerido. Tras establecer la operación en equilibrio dinámico para cada condición, se realizaron mediciones de biomasa seca final del caldo, de glucosa residual, concentraciones de nutrientes limitantes, contenido de lípidos de las células y contenido de DHA de las células. La eficiencia de conversión de glucosa en biomasa se calculó mediante la división del total de glucosa consumida por el total de
30 biomasa seca formada, expresándose como porcentaje.
Los efectos de la limitación del crecimiento por cada nutriente individual se estudiaron mediante la repetición de este experimento para cada nutriente individual indicado en la tabla siguiente. Los resultados finales se resumen en la tabla siguiente:
35 Tabla 9. Efecto de la limitación de nutrientes sobre la producción de biomasa, eficiencia de conversión (glucosa -> biomasa), contenido de lípidos y contenido de DHA de Schizochytrium sp.
- Nutriente limitante
- Biomasa1 (g/l) Yx/s 2 RCS3 (g/l) Contenido de lípidos4 (%) Contenido de DHA5 (%)
- Glucosa
- 18,7 46,8 0,0 19,8 7,3
- Nitrógeno
- 14,5 36,3 0,6 47,5 10,3
- Fosfato
- 17,8 44,5 0,8 37,0 8,2
- Tiamina
- 7,5 18,8 7,7 11,1 4,0
- Zinc
- 16,0 40,0 1,3 27,8 7,2
- Cobre
- 14,0 35,0 10,4 13,8 5,3
- Cobalto
- 14,5 36,3 0,0 22,2 6,9
- Níquel
- 17,8 44,5 0,0 21,9 8,0
- Hierro
- 15,9 39,8 3,5 18,5 7,2
- Manganeso
- 12,5 31,3 3,4 26,1 8,0
- Magnesio
- 13,9 34,8 5,3 18,7 6,4
- Calcio
- 16,7 41,8 4,3 18,7 6,4
- Vitamina B12
- 19,6 49,0 0,0 17,5 6,3
- Molibdeno
- 18,9 47,3 0,0 19,3 7,0
- Pantotenato
- 19,2 48,0 0,0 20,4 6,7
- Sodio
- 17,9 44,8 1,8 21,8 8,2
- Potasio
- 13,0 32,5 8,8 14,1 5,3
40 1. concentración de biomasa seca (g/l)
- 2.
- coeficiente de producción (% biomasa producida/glucosa consumida)
- 3.
- concentración residual de glucosa en el caldo (g/l)
- 4.
- contenido de lípidos de la biomasa seca (g de lípidos (como FAME)/g de biomasa seca)
5. contenido de DHA de la biomasa seca (g de DHA /g de biomasa seca) 45
Resulta evidente a partir de la tabla que la limitación de nitrógeno produjo la mayor acumulación de DHA en las células, seguido del fosfato, sodio, níquel, manganeso, glucosa (carbono), cinc y hierro. Esta información puede utilizarse comercialmente alimentando uno o más de estos nutrientes a una fermentación por lotes a una tasa suficiente para limitar el crecimiento de las células. En el caso más preferido, se proporciona nitrógeno de manera limitada a una fermentación por lotes para maximizar el contenido de DHA de las células. Pueden alimentarse otros nutrientes (o mezclas de los mismos) de manera limitante para maximizar la producción de biomasa y otros productos valiosos. Otros elementos o nutrientes biológicamente requeridos que no se analizaron, tales como el azufre, también podrían utilizarse como nutrientes limitantes en esta estrategia de control de la fermentación.
Claims (10)
-
imagen1 REIVINDICACIONES1. Procedimiento para la producción de lípidos microbianos, que comprende:5 (a) llevar a cabo una fermentación de un medio que comprende microorganismos, una fuente de carbono y una fuente de nutriente limitante, y proporcionar las condiciones suficientes para el mantenimiento de un nivel de oxígeno disuelto de por lo menos aproximadamente 4% de la saturación en dicho medio de fermentación para aumentar la densidad de biomasa;- (b)
- proporcionar posteriormente las condiciones suficientes para el mantenimiento de un nivel de oxígeno disuelto de aproximadamente 1% o inferior de la saturación en dicho medio de fermentación y proporcionar las condiciones suficientes para permitir que dichos microorganismos produzcan dichos lípidos; y
- (c)
- recuperar dichos lípidos microbianos,
15 en el que por lo menos aproximadamente 15% de dichos lípidos microbianos son lípidos poliinsaturados; yen el que se alcanza una densidad de biomasa de por lo menos 100 g/l durante la fermentación;en el que dichos mircoorganismos pertenecen al orden Traustochytriales. - 2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho medio de fermentación o medio de crecimiento se encuentra a una temperatura de por lo menos aproximadamente 20ºC.25 3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho procedimiento produce lípidos a una tasa media de por lo menos aproximadamente 0,5 g/l/h.
-
- 4.
- Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho procedimiento produce lípidos a una tasa media de por lo menos aproximadamente 0,5 g/l/h, y en el que por lo menos aproximadamente 15% de dichos lípidos son lípidos poliinsaturados.
-
- 5.
- Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho procedimiento produce lípidos a una tasa media de por lo menos aproximadamente 0,5 g/l/h, y en el que la cantidad total de ácidos grasos omega-3 y omega-6 es de por lo menos aproximadamente 20% de dichos lípidos.
35 -
- 6.
- Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho procedimiento produce lípidos a una tasa media de por lo menos aproximadamente 0,5 g/l/h, y en el que por lo menos aproximadamente 25% de dichos lípidos es ácido docosahexaenoico.
-
- 7.
- Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dichos microorganismos se seleccionan de entre el grupo que consiste en Thraustochytrium, Schizochytrium y las mezclas de los mismos.
-
- 8.
- Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha fuente de carbono es una fuente de carbono sin alcohol.
45 9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho procedimiento produce de media por lo menos aproximadamente 0,2 g/l/h de ácido docosahexaenoico. - 10. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha etapa de recuperación de lípidos comprende:
- (d)
- eliminar el agua de dicho medio de fermentación para proporcionar microorganismos secos; y
- (e)
- aislar dichos lípidos de dichos microorganismos secos.
- 11. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha etapa de recuperación de lípidos comprende: 55
- (d)
- evaporar el agua de dicho medio de fermentación sin centrifugación previa, para proporcionar microorganismos secos; y
- (e)
- aislar dichos lípidos de dichos microorganismos secos.
- 12. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha etapa de recuperación de lípidos comprende:(d) tratar el caldo de fermentación para permeabilizar, lisar o romper las células microbianas; y65 (e) recuperar los lípidos del caldo de fermentación mediante separación por gravedad, con o sin la ayuda de un agente para facilitar la ruptura de la emulsión de lípido/agua.16
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