PT1251744E - Produção melhorada de lípidos contendo ácidos gordos poliénoicos através de culturas de alta densidade de micróbios eucarióticos em fermentadores - Google Patents

Produção melhorada de lípidos contendo ácidos gordos poliénoicos através de culturas de alta densidade de micróbios eucarióticos em fermentadores Download PDF

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PT1251744E
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Craig M Ruecker
Don Dimasi
Jon M Hansen
Peter J Mirrasoul
Richard B Bailey
George T Weeder Iii
Tatsuo Kaneko
William R Barclay
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Description

DESCRIÇÃO "PRODUÇÃO MELHORADA DE LÍPIDOS CONTENDO ÁCIDOS GORDOS POLIENÓICOS ATRAVÉS DE CULTURAS DE ALTA DENSIDADE DE MICRÓBIOS EUCARIÓTICOS EM FERMENTADORES"
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção é dirigida a um novo processo para o crescimento de microrganismos e a recuperação de lipidos microbianos. Em particular, A presente invenção é dirigida à produção de lipidos polinsaturados microbianos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Crê-se, de forma geral, que a produção de ácidos gordos polienóicos (ácidos gordos contendo 2 ou mais ligações carbono-carbono insaturadas) em microrganismos eucarióticos requer a presença de oxigénio molecular (i. e., condições aeróbias). Isto é porque se acredita que a ligação dupla cis formada nos ácidos gordos de todos os microrganismos eucarióticos não parasitários envolve uma reacção directa de dessaturação dependente de oxigénio (sistemas microbianos oxidativos de desaturase) . Outros lipidos microbianos eucarióticos que são conhecidos por requererem o oxigénio molecular incluem esteróides fúngicos e vegetais, oxicarotenóides (i. e., xantofilas), ubiquinonas, e compostos feitos a partir de alguns destes lipidos (i. e., metabolitos secundários). 1
Foi demonstrado que determinados micróbios eucarióticos (tais como algas; fungos, incluindo leveduras; e protistas) são bons produtores de ácidos gordos polienóicos em fermentadores. Contudo, o cultivo a densidade muito elevada (maior do que cerca de 100 g/L de biomassa microbiana, especialmente na escala comercial) pode conduzir a teores diminuidos de ácidos gordos polienóicos e, deste modo, a produtividade diminuída de ácidos gordos polienóicos. Isto pode ser devido, em parte, a vários factores incluindo a dificuldade de manter os niveis elevados de oxigénio dissolvido devido à procura elevada de oxigénio desenvolvida pela concentração elevada de micróbios no caldo de fermentação. Os métodos para manter um nivel mais elevado de oxigénio dissolvido incluem o aumento da taxa de arejamento e/ou a utilização de oxigénio puro em vez de ar para o arejamento e/ou o aumento da taxa de agitação no fermentador. Estas soluções aumentam geralmente o custo da produção de lipidos e o custo capital de equipamento de fermentação, e podem causar problemas adicionais. Por exemplo, o arejamento aumentado pode facilmente conduzir a problemas graves de formação de espuma no fermentador a densidades celulares elevadas e a agitação aumentada pode conduzir à ruptura das células microbianas devido às forças de cisalhamento aumentadas no caldo de fermentação (esta faz com que os lipidos sejam libertados no caldo de fermentação onde se podem oxidar e/ou degradar através de enzimas). A ruptura das células microbianas é um problema crescente em células que sofreram limitação ou depleção de azoto para induzir a formação de lipidos, resultando em paredes celulares mais fracas.
Como resultado, quando micróbios eucarióticos produtores de lipidos são cultivados em concentrações celulares muito elevadas, os seus lipidos contêm geralmente apenas quantidades muito pequenas de ácidos gordos polienóicos. Por exemplo, a levedura Lipomyces starkeyi foi cultivada a uma densidade de 2 153 g/L com concentração resultante de lípidos de 83 g/L em 140 horas utilizando álcool como uma fonte de carbono. Contudo, o conteúdo de ácidos gordos polienóicos da levedura a concentração superior a 100 g/L apenas atingiu em média 4,2% dos ácidos gordos totais (caindo do elevado 11,5% de ácidos gordos totais a uma densidade celular de 20-30 g/L). Yamauchi et al., J. Ferment. Technol., 1983, 61, 275-280. Isto resulta num concentração de ácidos gordos polienóicos de apenas cerca de 3,5 g/L e uma produtividade média de ácidos gordos polienóicos de apenas cerca de 0,025 g/L/h. Adicionalmente, o único ácido gordo polienóico descrito nos lipidos de levedura foi C18:2.
Foi demonstrado que outra levedura, Rhodotorula glutinus, possui uma produtividade média de lipidos de cerca de 0,49 g/L/h, mas também um conteúdo total baixo de ácidos gordos polienóicos nos seus lipidos (15,8% de ácidos gordos totais, 14,7% de C18:2 e 1,2% de Cl8:3) resultando numa produtividade de ácidos gordos polienóicos na cultura em descontinuo de apenas cerca de 0,047 g/L/h e 0,077 g/L/h em cultura continua.
Um dos presentes inventores demonstrou previamente que determinadas microalgas marinhas da ordem Thraustochytriales podem ser excelentes produtores de ácidos gordos polienóicos em fermentadores, especialmente quando cultivados a níveis baixos de salinidade e, especialmente, a níveis muito baixos de cloreto. Outros descreveram Thraustochytriales que apresentam uma produtividade média de ácidos gordos polienóicos (DHA, C22:6n-3; e DPA, C22:Sn-6) de cerca de 0,158 g/L/h, quando cultivados a uma densidade celular de 59 g/L em 120 horas. Contudo, esta produtividade foi apenas conseguida a uma salinidade de cerca de 50% da água do mar, uma concentração que iria causar corrosão grave em fermentadores convencionais de aço inoxidável. 3
Os custos de produzir lípidos microbianos contendo ácidos gordos polienóicos, e especialmente de ácidos gordos muito insaturados, tais como Cl8:4n-3, C20:4n-6, C20:5n3, C22:5n-3, C22:5n-6 e C22:6n-3, têm permanecido elevados em parte devido às densidades limitadas a que os micróbios eucarióticos contendo elevados ácidos gordos polienóicos foram cultivados e à disponibilidade limitada de oxigénio tanto a estas concentrações celulares elevadas como às temperaturas elevadas necessárias para conseguir produtividade elevada.
Deste modo, existe a necessidade de um processo para o crescimento de microrganismos a concentração elevada que ainda facilite a produção aumentada de lipidos contendo ácidos gordos polienóicos. 0 documento WO-A-92/13086 divulga um método para a produção de um óleo contendo ácido araquidónico substancialmente livre de ácido eicosapentaenóico, compreendendo o cultivo de uma espécie de Pythium que produz um óleo araquidónico substancialmente livre de ácido eicosapentaenóico sob condições adequadas de cultura produtora de óleo; a recolha do referido Pythium; a extracção do referido óleo do referido Pythium recolhido, e a recuperação do referido óleo.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
De acordo com um aspecto da presente invenção é proporcionado um processo para a produção de lipidos microbianos compreendendo: 4 (a) realização de uma fermentação de um meio compreendendo microrganismos, uma fonte de carbono e uma fonte de nutriente limitante e proporcionar condições suficientes para manter um nível de oxigénio dissolvido de, pelo menos, cerca de 4% de saturação no referido meio de fermentação para aumentar a densidade da biomassa; (b) proporcionar subsequentemente condições suficientes para manter um nível de oxigénio dissolvido de cerca de 1% ou menos, de saturação no referido meio de fermentação e proporcionar condições suficientes para permitir aos referidos microrganismos produzirem os referidos lípidos; e (c) recuperar os referidos lípidos microbianos, em que, pelo menos, cerca de 15% dos referidos lípidos microbianos são lípidos polinsaturados; e em que é conseguida uma densidade de biomassa de, pelo menos, 100 g/L durante a fermentação.
De acordo com outro aspecto da presente invenção é proporcionado um processo para enriquecer o conteúdo de ácidos gordos polienóicos de um microrganismo compreendendo a fermentação do referido microrganismo num meio de crescimento que tem um nível de oxigénio dissolvido de menos de 1% de saturação.
De acordo com um aspecto adicional da presente invenção é proporcionado um processo heterotrófico para a produção de produtos e microrganismos, compreendendo o cultivo dos referidos microrganismos num meio de cultura que tem um nível de oxigénio dissolvido de menos do que cerca de 1% de saturação, em que os referidos microrganismos contêm genes da policétido sintase. 5 É também divulgado um processo para o cultivo de microrganismos eucarióticos que são capazes de produzir, pelo menos, cerca de 20% da sua biomassa como lipidos e um método para a produção de lipidos. De um modo preferido, os lipidos contêm um ou mais ácidos gordos polienóicos. As formas de realização do processo compreendem a adição a um meio de fermentação compreendendo microrganismos eucarióticos, uma fonte de carbono, de um modo preferido, uma fonte de carbono não alcoólica, e uma fonte de nutriente limitante. De um modo preferido, a fonte de carbono e a fonte de nutriente limitante são adicionados a uma taxa suficiente para aumentar a densidade de biomassa do meio de fermentação até, pelo menos, cerca de 100 g/L.
Numa forma de realização da presente invenção, a condição de fermentação compreende uma fase de aumento de densidade de biomassa e uma fase de produção de lipidos, em que a fase de aumento de densidade de biomassa compreende a adição da fonte de carbono e da fonte de nutriente limitante de azoto, e a fase de produção de lipidos compreende a adição da fonte de carbono sem adicionar a fonte de nutriente limitante para criar as condições que induzem a produção de lipidos.
Noutra forma de realização da presente invenção, a quantidade de oxigénio dissolvido presente no meio de fermentação durante a fase de produção de lipidos é mais baixa do que a quantidade de oxigénio dissolvido presente no meio de fermentação durante a fase de aumento de densidade de biomassa.
Ainda noutra forma de realização da presente invenção, os microrganismos são seleccionados do grupo consistindo em algas, fungos (incluindo leveduras), protistas, bactérias e suas misturas, em que os microrganismos são capazes de produzir os 6 ácidos gordos polienóicos ou outros lípidos que se acredita, de forma geral, requererem oxigénio molecular para a sua sintese. Os microrganismos particularmente úteis da presente invenção são microrganismos eucarióticos que são capazes de produzir lipidos a um nivel de oxigénio no meio de fermentação de cerca de menos de 3% de saturação.
Ainda noutra forma de realização da presente invenção, os microrganismos são cultivados num processo em descontinuo.
Contudo, ainda outra forma de realização da presente invenção proporciona a manutenção de um nivel de oxigénio de menos de cerca de 3% de saturação no meio de fermentação durante a segunda metade do processo de fermentação. É também divulgado um processo para a produção de lipidos microbianos eucarióticos compreendendo: (a) cultivo de microrganismos eucarióticos num meio de fermentação para aumentar a densidade de biomassa do referido meio de fermentação até, pelo menos, cerca de 100 g/L; (b) proporcionar condições de fermentação suficientes para permitir que os referidos microrganismos produzam os referidos lipidos; e (c) recuperar os referidos lipidos, em que mais do que cerca de 15% de referidos lipidos são lipidos polinsaturados. 7
Outro aspecto da presente invenção proporciona um processo de recuperação de lipidos que compreende: (d) remoção da água do referido meio de fermentação para proporcionar microrganismos secos; e (e) isolamento dos referidos lipidos a partir dos microrganismos secos.
De um modo preferido, o passo de remoção da água compreende colocar em contacto o meio de fermentação directamente num secador de tambor sem centrifugação prévia. Outra forma de realização da presente invenção proporciona um processo de recuperação de lipidos que compreende: (d) o tratamento do caldo de fermentação para permeabilizar, lisar ou quebrar as células microbianas; e (e) a recuperação dos lipidos do caldo de fermentação através de separação gravimétrica, e de um modo preferido, centrifugação, com ou sem a ajuda de um solvente hidrossolúvel para ajudar a quebrar a emulsão lípido/água.
De um modo preferido, as células microbianas são tratadas no passo (c) num fermentador ou num recipiente semelhante.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura I é uma tabela e um gráfico de vários parâmetros de produção de lipidos de um microrganismo versus a quantidade de oxigénio dissolvido num meio de fermentação. 8
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um processo para o cultivo de microrganismos, tais como, por exemplo, algas, fungos (incluindo levedura), protistas e bactérias. De um modo preferido, os microrganismos são seleccionados do grupo consistindo em algas, protistas e sua misturas. De um modo mais preferido, os microrganismos são algas. Além disso, processo da presente invenção pode ser utilizado para a produção de uma variedade de compostos lipidicos, em particular lipidos insaturados, de um modo preferido lipidos polinsaturados (i. e., lipidos contendo, pelo menos, 2 ligações carbono-carbono insaturadas, e. g., ligações duplas), e de um modo mais preferido lipidos muito insaturados (i. e., lipidos contendo 4 ou mais ligações carbono-carbono insaturadas) tais como ácidos gordos polinsaturados omega-3 e/ou omega-β, incluindo ácido docosa-hexaenóico (i. e., DHA); e outros compostos insaturados, polinsaturados e muito insaturados naturais. Como aqui utilizado, o termo "lipido" inclui fosfolipidos; ácidos gordos livres; ésteres de ácidos gordos; triacilgliceróis; esteróides e ésteres de esteróides; carotenóides; xantofilas (e. g., oxicarotenóides); hidrocarbonetos; compostos derivados de isoprenóides e outros lipidos conhecidos de um especialista na técnica.
Mais particularmente, os processos da presente invenção são úteis na produção de ácidos gordos polienóicos microbianos eucarióticos, carotenóides, esteróides fúngicos, fitoesteróides, xantofilas, ubiquinonas e outros compostos derivados de isoprenóides que se acreditava, de forma geral, requererem oxigénio para a produção de ligações carbono-carbono insaturadas (i. e.f condições aeróbias), e seus metabolitos secundários. Especificamente, os processos da presente invenção são úteis no 9 cultivo de microrganismos que produzem ácido(s) gordo(s) polienóico (s), e para a produção de ácido (s) gordo(s) polienóico (s) microbiano (s) .
Embora os processos da presente invenção possam ser utilizados para o cultivo de uma vasta variedade de microrganismos e para a obtenção de compostos contendo lipidos polinsaturados produzidos pelos mesmos, por questões de brevidade, conveniência e ilustração, esta descrição detalhada da invenção irá discutir processos para o cultivo de microrganismos que são capazes de produzir lipidos compreendendo ácidos gordos polinsaturados omega-3 e/ou omega-β, em particular microrganismos que são capazes de produzir DHA (ou compostos intimamente relacionados, tais como DPA, EPA ou ARA). Os microrganismos preferidos incluem microalgas, fungos (incluindo levedura), protistas e bactérias. Um grupo de microrganismos preferidos é o dos membros do grupo microbiano denominado Stramenopiles que inclui microalgas e microrganismos de tipo alga. 0 Stramenopiles inclui os seguintes grupos de microrganismos: Hamatores, Proteromonads, Opalines, Developayella, Diplophrys, Labrinthulids, Thraustochytrids, Biosecids, Oomycetes, Hypochytridiomycetes, Commation, Reticulosphaera, Pelagomonas, Pelagococcus, Ollicola, Aureococcus; Parmales, Diatoms, Xanthophytes, Phaeophytes (algas castanhas), Eustigmatophytes, Raphidophytes, Synurids, Axodines (incluindo Rhizochromulinaales, Pedinellales, Dictyochales), Chrysomeridales, Sarcinochrysidales, Hydrurales, Hibberdiales e Chromulinales. Outros grupos preferidos de microalgas incluem os membros das algas verdes e dinoflagelados, incluindo membros do género Crypthecodium. Mais particularmente, as formas de realização preferidas da presente invenção serão discutidas com referência a um processo para o cultivo de microrganismos marinhos, em particular algas, tais como Thraustochytrids da 10 ordem Thraustochytriales, mais especificamente
Thraustochytriales do género Thraustochytrium e Schizochytrium, incluindo Thraustochytriales que é divulgado geralmente nas Patentes U.S. N° 534,594 e 5340742 referenciadas, ambas concedidas à Barclay. Deve ser assinalado que muitos especialistas concordam que Ulkenia não é um género separado, mas é de facto parte do género Schizochytrium. Como aqui utilizado, o género Schizochytrium incluirá Ulkenia.
Os microrganismos preferidos são aqueles que produzem os compostos de interesse através de sistemas da policétido sintase. Tais microrganismos incluem os microrganismos que têm um sistema endógeno da policétido sintase e os microrganismos em que foi geneticamente manipulado um sistema da policétido sintase. Os policétidos são produtos naturais estruturalmente variados que têm uma vasta gama de actividades biológicas, incluindo propriedades antibióticas e farmacológicas. A biossintese do esqueleto da cadeia de carbono dos policétidos é catalizada por policétido sintases. Tal como as sintases de ácidos gordos estruturalmente e mecanicamente relacionadas, as policétido sintases catalizam as condensações descarboxilativas repetidas entre os tioésteres de acilo que prolongam a cadeia de carbono dois carbonos de cada vez. Contudo, ao contrário das sintases de ácidos gordos, as policétido sintases podem gerar uma grande variabilidade estrutural no produto final. Os sistemas individuais da policétido sintase podem fazer isto através da utilização de unidades iniciais diferentes de acetato, por utilização de metil- ou etil-malonato como a unidade de prolongamento e por variação do ciclo redutivo de cetorredução, desidratação e redução de enoilo no grupo beta-ceto formado após cada condensação. É de particular interesse aqui que as ligações duplas de carbono-carbono que são introduzidas pelo passo de desidratação possam ser retidas no 11 produto final. Além disso, embora estas ligações duplas estejam inicialmente na configuração trans, elas podem ser convertidas na configuração cis encontrada em DHA (e outros ácidos gordos polienóicos de interesse) por isomerização enzimática. Ambas as reacções de desidratação e isomerização podem ocorrer na ausência de oxigénio molecular.
De um modo preferido, de acordo com a presente invenção é proporcionado um processo heterotrófico para a produção de produtos e microrganismos. 0 processo compreende, de um modo preferido, o cultivo dos microrganismos em meio de cultura em que os microrganismos contêm um sistema da policétido sintase. 0 nivel de oxigénio dissolvido é mantido em menos de cerca de 1 por cento.
Assumindo uma taxa de produção de lipidos relativamente constante por uma alga, é prontamente evidente que a densidade mais elevada de biomassa conduzirá a uma quantidade total mais elevada de lipidos que são produzidos por volume. Os processos de fermentação convencionais actuais para o cultivo de algas produzem uma densidade de biomassa a partir de cerca de 50 a cerca de 80 g/L ou menos. Os presentes inventores verificaram que através da utilização de processos da presente invenção, pode ser conseguida uma densidade significativamente mais elevada de biomassa do que a densidade de biomassa actualmente conhecida. De um modo preferido, os processos da presente invenção produzem uma densidade de biomassa de, pelo menos, cerca de 100 g/L, de um modo mais preferido de, pelo menos, cerca de 130 g/L, ainda de um modo mais preferido de, pelo menos, cerca de 150 g/L, contudo ainda de um modo mais preferido de, pelo menos, cerca de 170 g/L, e de um modo muito preferido mais do que 200 g/L. Assim, com uma densidade de biomassa tão elevada, mesmo se a taxa de produção de lipidos de algas for ligeiramente diminuída, a taxa de produção de lipidos totais por 12 volume é significativamente superior do que os processos actualmente conhecidos.
Os processos da presente invenção para o cultivo de microrganismos da ordem Thraustochytiiales incluem a adição de uma fonte de carbono e de uma fonte de um nutriente limitante a um meio de fermentação compreendendo os microrganismos, a uma taxa suficiente para aumentar a densidade de biomassa do meio de fermentação relativamente àquelas acima descritas. Como aqui utilizado, o termo "fonte de nutriente limitante" refere-se a uma fonte de um nutriente (incluindo o próprio nutriente) essencial para o crescimento de um microrganismo em que, quando o nutriente limitante é esgotado do meio de cultura, a sua ausência limita substancialmente o microrganismo de crescer ou replicar mais. Contudo, uma vez que os outros nutrientes estão ainda em abundância, o organismo pode continuar a fazer e a acumular produtos intracelulares e/ou extracelulares. Através da escolha de um nutriente limitante especifico pode-se controlar o tipo de produtos que são acumulados. Deste modo, proporcionando uma fonte de nutriente limitante a uma determinada taxa permite o controlo da taxa de crescimento do microrganismo e a produção ou a acumulação de produtos desejados (e. g., lipidos). Este processo de fermentação, onde um ou mais substratos (e. g., uma fonte de carbono e uma fonte de nutriente limitante) são adicionados em incrementos, é geralmente referido como um processo de fermentação em descontinuo. Verificou-se que quando o substrato é adicionado a um processo de fermentação em descontínuo, a grande quantidade da fonte de carbono presente (e. g., cerca de 200 g/L ou mais por 60 g/L de densidade de biomassa) teve um efeito prejudicial nos microrganismos. Sem se estar limitado pela teoria, crê-se que uma tal quantidade tão elevada de fonte de carbono cause efeitos prejudiciais, incluindo stress osmótico, nos microrganismos e inibe a 13 produtividade inicial dos microrganismos. Os processos da presente invenção evitam este efeito prejudicial indesejado enquanto proporcionam uma quantidade suficiente do substrato para conseguir a densidade de biomassa acima descrita dos microrganismos.
Os processos da presente invenção para o cultivo de microrganismos podem incluir uma fase de aumento da densidade de biomassa. Na fase de aumento da densidade de biomassa, 0 objectivo principal do processo de fermentação é aumentar a densidade de biomassa no meio de fermentação para obter a densidade de biomassa acima descrita. A taxa de adição da fonte de carbono é mantida tipicamente a um nível ou gama particular que não cause um efeito prejudicial significativo na produtividade dos microrganismos, ou na viabilidade dos microrganismos resultando das potencialidades insuficientes do equipamento de fermentação para remover o calor e transferir gases de e para o caldo líquido. Uma gama apropriada da quantidade da fonte de carbono necessária para um microrganismo particular durante um processo de fermentação é bem conhecida de um especialista na técnica. De um modo preferido, uma fonte de carbono da presente invenção é uma fonte de carbono não alcoólica, í. e., uma fonte de carbono que não contenha álcool. Como aqui utilizado, um "álcool" refere-se a um composto que tem 4 ou menos átomos de carbono com um grupo hidroxilo, e. g., metanol, etanol e isopropanol, mas para o objectivo desta invenção não inclui hidroxiácidos orgânicos, tais como ácido láctico e compostos semelhantes. De um modo mais preferido, uma fonte de carbono da presente invenção é um hidrato de carbono, incluindo, mas não limitado a, frutose, glucose, sacarose, melaço e amido. Outras fontes simples e complexas adequadas de carbono e fontes de azoto são divulgadas nas patentes acima referenciadas. Tipicamente, contudo, é utilizado um hidrato de carbono, de um modo preferido xarope de milho, como a fonte 14 primária de carbono. Os ácidos gordos, na forma de hidroxiácidos gordos, triglicéridos, e di- e monoglicéridos podem também servir como a fonte de carbono
As fontes particularmente preferidas de azoto são a ureia, nitrato, nitrito, proteina de soja, aminoácidos, extracto proteico de maceração do milho, extracto de levedura, subprodutos animais, sal de amónio inorgânico, de um modo mais preferido sais de amónio de sulfato, hidróxido, e de um modo muito preferido, hidróxido de amónio. Outras fontes de nutrientes limitantes incluem fontes de carbono (como acima definido), fontes de fosfato, fontes de vitamina (tais como fontes de vitamina Bi2, fontes de pantotenato, fontes de tiamina), e fontes de metais vestigiais (tais como fontes de zinco, fontes de cobre, fontes de cobalto, fontes de níquel, fontes de ferro, fontes de manganês, fontes de molibdénio), e fontes de metais principais (tais como fontes de magnésio, fontes de cálcio, fontes de sódio, fontes de potássio e fontes de silica, etc.). As fontes de metais vestigiais e as fontes de metais principais podem incluir sais de sulfato e cloreto destes metais (por exemplo, mas não limitados a, MgS04*7H20; MnCl2*4H20; ZnS04·7H20; CoC12*6H20; Na2Mo04 · 2H20; CuS04*5H20; NíS04*6H20; FeS04 · 7H20; CaCl2; K2S04; KC1; e Na2S04) .
Quando for utilizado amónio como uma fonte de azoto, o meio de fermentação torna-se acidico se não for controlado por adição de base ou tampões. Quando for utilizado hidróxido de amónio como a fonte primária de azoto, este pode ser também utilizado para proporcionar um controlo de pH. Os microrganismos da ordem Thraustochytriales, em particular Thraustochytriales do género Thraustochytrium e Schizochytrium, irão crescer ao longo de uma vasta gama de pH, e. g., a partir de cerca de pH 5 a cerca de pH 11. Uma gama apropriada de pH para a fermentação de um 15 microrganismo particular está no âmbito do conhecimento de um especialista na técnica.
Os processos da presente invenção para o cultivo de microrganismos podem também incluir uma fase de produção. Nesta fase, a utilização primária do substrato pelos microrganismos não é para aumentar a densidade de biomassa mas antes a utilização do substrato para a produção de lipidos. Deve ser entendido que os lipidos são também produzidos pelos microrganismos durante a fase de aumento da densidade de biomassa; contudo, como acima referido, o objectivo primário na fase de aumento da densidade de biomassa é aumentar a densidade de biomassa. Tipicamente, durante a fase de produção, a adição do substrato de nutriente limitante é reduzida ou de um modo preferido parada.
Acreditava-se anteriormente, de forma geral, que a presença de oxigénio dissolvido no meio de fermentação era crucial na produção de compostos polinsaturados, incluindo ácidos gordos polinsaturados omega-3 e/ou omega-6, por microrganismos eucarióticos. Assim, acreditava-se, de forma geral, ser preferida uma quantidade relativamente grande de oxigénio dissolvido no meio de fermentação. Contudo, surpreendentemente e inesperadamente, os presentes inventores verificaram que a taxa de produção de lipidos aumenta dramaticamente quando o nível de oxigénio dissolvido durante a fase de produção é reduzido. Assim, quando o nível de oxigénio dissolvido no meio de fermentação durante a fase de aumento da densidade de biomassa for, pelo menos, cerca de 4% de saturação, e de um modo preferido, pelo menos, cerca de 8% de saturação, durante a fase de produção, o oxigénio dissolvido no meio de fermentação é reduzido a cerca de 1% de saturação ou menos, e de um modo mais preferido a cerca de 0% de saturação. No começo da fermentação o OD pode estar em saturação ou perto disso e como os micróbios 16 crescem é permitido que desça para estes pontos de referência de OD baixos. Numa forma de realização particular da presente invenção, a quantidade do nivel de oxigénio dissolvido no meio de fermentação varia durante o processo de fermentação. Por exemplo, para um processo de fermentação com um tempo total de fermentação de cerca de 90 horas a cerca de 100 horas, o nivel de oxigénio dissolvido no meio de fermentação é mantido em cerca de 8% durante as primeiras 24 horas, cerca de 4% a partir de cerca da 24a hora a cerca da 40a hora, e cerca de 0,5% ou menos a partir de cerca da 40a hora ao fim do processo de fermentação. A quantidade de oxigénio dissolvido presente no meio de fermentação pode ser controlada através de controlo da quantidade de oxigénio no espaço livre do fermentador, ou de um modo preferido através do controlo da velocidade a que o meio de fermentação é agitado (ou misturado). Por exemplo, uma taxa elevada de agitação (ou mistura) resulta numa quantidade relativamente maior de oxigénio dissolvido no meio de fermentação do que uma taxa baixa de agitação. Por exemplo, num fermentador com uma capacidade de cerca de 14000 galões, a taxa de agitação é definida a partir de cerca de 50 rpm a cerca de 70 rpm durante as primeiras 12 horas, a partir de cerca de 55 rpm a cerca de 80 rpm durante cerca da 12a hora a cerca da 18a hora e a partir de cerca de 70 rpm a cerca de 90 rpm a partir de cerca da 18a hora ao fim do processo de fermentação para conseguir o nivel de oxigénio dissolvido discutido acima, para um tempo total do processo de fermentação a partir de cerca de 90 horas a cerca de 100 horas. Uma gama particular de velocidades de agitação necessária para conseguir uma quantidade particular de oxigénio dissolvido no meio de fermentação pode ser prontamente determinada por um especialista na técnica.
Uma temperatura preferida para processos da presente invenção é, pelo menos, cerca de 20 °C, de um modo mais 17 preferido, pelo menos, cerca de 25 °C, e de um modo muito preferido, pelo menos, cerca de 30 °C. Deve ser entendido que a água fria pode reter uma quantidade mais elevada de oxigénio dissolvido do que a água morna. Assim, uma temperatura do meio de fermentação mais elevada tem o beneficio adicional de reduzir a quantidade de oxigénio dissolvido, que é particularmente desejada como acima descrito.
Determinados microrganismos podem requerer uma determinada quantidade de minerais salinos no meio de fermentação. Estes minerais salinos, especialmente iões de cloreto, podem causar corrosão do fermentador e de outro equipamento de processamento a jusante. Para prevenir ou reduzir estes efeitos indesejados devido a uma quantidade relativamente grande de iões de cloreto presentes no meio de fermentação, os processos da presente invenção podem também incluir sais de sódio não contendo cloreto, de um modo preferido sulfato de sódio, no meio de fermentação como uma fonte de sódio. Mais particularmente, uma porção significativa dos requisitos de sódio da fermentação é fornecida como sais de sódio não contendo cloreto. Por exemplo, menos do que cerca de 75% de sódio no meio de fermentação é fornecido como cloreto de sódio; de um modo mais preferido, menos do que cerca de 50% e, de um modo mais preferido, menos do que cerca de 25%. Os microrganismos da presente invenção podem ser cultivados em concentrações de cloreto de menos do que cerca de 3 g/L, de um modo mais preferido menos do que cerca de 500 mg/L, de um modo mais preferido menos do que cerca de 250 mg/L e de um modo mais preferido entre cerca de 60 mg/L e cerca de 120 mg/L.
Os sais de sódio não contendo cloreto incluem cinza de soda (uma mistura de carbonato de sódio e óxido de sódio), carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, sulfato de sódio e suas
misturas, e incluem de um modo preferido sulfato de sódio. A 18 cinza de soda, carbonato de sódio e bicarbonato de sódio tendem a aumentar o pH do meio de fermentação, requerendo assim passos de controlo para manter o pH apropriado do meio. A concentração de sulfato de sódio é eficaz para atingir os requisitos de salinidade dos microrganismos, de um modo preferido a concentração de sódio é (expressa como g/L de Na), pelo menos, cerca de 1 g/L, de um modo mais preferido na gama a partir de cerca de 1 g/L a cerca de 50 g/L e, de um modo mais preferido, na gama a partir de cerca de 2 g/L a cerca de 25 g/L. São discutidos em detalhe vários parâmetros de fermentação para inoculação, cultivo e recuperação de microrganismos na Patente U.S. N° 5130242. Qualquer método de isolamento actualmente conhecido pode ser utilizado para isolar microrganismos a partir do meio de fermentação, incluindo centrifugação, filtração, ultrafiltração, decantação e evaporação de solvente. Foi verificado pelos presentes inventores que por causa de uma tão elevada densidade de biomassa resultante de processos da presente invenção, quando é utilizada uma centrifugadora para recuperar os microrganismos é preferido diluir o meio de fermentação por adição de água, que reduz a densidade da biomassa, permitindo desse modo uma separação mais eficaz dos microrganismos do meio de fermentação.
As densidades de biomassa muito elevadas conseguidas na presente invenção facilitam também processos "sem solvente" para a recuperação de lípidos microbianos. Os processos preferidos para lise das células no fermentador são descritos no Pedido Provisório de Patente U.S. com N° de Série 60/177125 intitulado "Solventless Extraction Process" apresentado a 19 de Janeiro de 2000; O Pedido de Patente U.S. com N° de Série 09/766500 intitulado "Solventless Extraction Process" apresentado a 19 de Janeiro de 2001 (agora Patente U.S. N° 6750048), e Publicação de Patente PCT N° WO-A-0153512 intitulado "Solventless Extraction 19
Process" apresentado a 19 de Janeiro de 2001. Os processos preferidos para recuperação dos lipidos assim que as células estão permeabilizadas, quebradas ou lisadas no fermentador (que permite a emulsão lipidica ser quebrada, e a fracção rica em lipido ser recuperada) incluem o processo de remoção de óleo delineado no documento WO 96/05278 que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Neste processo, um composto solúvel em água, e. g., álcool ou acetona, é adicionado à emulsão de óleo/água para quebrar a emulsão e a mistura resultante é separada através de separação gravimétrica, e. g., centrifugação. Este processo também pode ser modificado para utilizar outros agentes (água e/ou lipido solúvel) para quebrar a emulsão.
Alternativamente, os microrganismos são recuperados numa forma seca a partir do meio de fermentação por evaporação da água do meio de fermentação, por exemplo, por contacto directo do meio de fermentação (í. e., sem pré-concentração, por exemplo, através de centrifugação) com um secador, tal como um dispositivo secador de tambor, i. e., um processo directo de recuperação de secador de tambor. Ao utilizar o processo directo de recuperação de secador de tambor para isolar microrganismos, é utilizado tipicamente um secador de tambor aquecido a vapor. Além disso, ao utilizar o processo directo de recuperação de secador de tambor, a densidade de biomassa do meio de fermentação é, de um modo preferido, pelo menos, cerca de 130 g/L, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 150 g/L, e de um modo muito preferido, pelo menos, cerca de 180 g/L. Esta densidade elevada de biomassa é geralmente desejada para o processo directo de recuperação de secador de tambor porque a uma densidade mais baixa de biomassa, o meio de fermentação compreende uma quantidade suficiente de água para arrefecer significativamente o tambor, resultando assim numa 20 secagem incompleta de microrganismos. Outros métodos de secar células, incluindo secagem por pulverização, são bem conhecidos do especialista na técnica.
Os processos da presente invenção proporcionam uma taxa média de produção de lipidos de, pelo menos, cerca de 0,5 g/L/h, de um modo preferido, pelo menos, cerca de 0,7 g/L/h, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 0,9 g/L/h, e de um modo muito preferido, pelo menos, cerca de 1,0 g/L/h. Além disso, os lipidos produzidos por processos da presente invenção contêm lipidos polinsaturados numa quantidade maior do que cerca de 15%, de um modo preferido maior do que cerca de 20%, de um modo mais preferido maior do que cerca de 25%, ainda de um modo mais preferido maior do que cerca de 30%, e de um modo muito preferido maior do que cerca de 35%. Os lipidos podem ser recuperados quer a partir de microrganismos secos quer a partir de microrganismos no meio de fermentação. Geralmente, pelo menos, cerca de 20% dos lipidos produzidos através os microrganismos nos processos da presente invenção são ácidos gordos polinsaturados omega-3 e/ou omega-6, de um modo preferido, pelo menos, cerca de 30% dos lipidos são ácidos gordos polinsaturados omega-3 e/ou omega-6, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 40% dos lipidos são ácidos gordos polinsaturados omega-3 e/ou omega-6, e de um modo muito preferido, pelo menos, cerca de 50% dos lipidos são ácidos gordos polinsaturados omega-3 e/ou omega-6. Alternativamente, os processos da presente invenção proporcionam uma taxa média de produção de ácidos gordos omega-3 (e. g., D HA) de, pelo menos, cerca de 0,2 g de ácidos gordos omega-3 (e. g., DHA) /L/h, de um modo preferido, pelo menos, cerca de 0,3 g de ácidos gordos omega-3 (e. g., DHA)/L/h, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 0,4 g de ácidos gordos omega-3 (e. g., DHA)/L/h, e de um modo muito preferido, pelo menos, cerca de 0,5 g de ácidos 21 gordos omega-3 (e. g., DHA)/L/h. Alternativamente, os processos da presente invenção proporcionam uma taxa média de produção de ácidos gordos omega-6 (e. g., DPAn-6) de, pelo menos, cerca de 0,07 g de ácidos gordos omega-6 (e. g., DPAn-6)/L/h, de um modo preferido, pelo menos, cerca de 0,1 g de ácidos gordos omega-6 (e. g., DPAn-6)/L/h, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 0,13 g de ácidos gordos omega-6 (e. g., DPAn-6)/L/h, e de um modo muito preferido, pelo menos, cerca de 0,17 g de ácidos gordos omega-6 (e. g., DPAn-6)/L/h. Ainda alternativamente, pelo menos, cerca de 25% de lípidos é DHA (com base no éster metilico total de ácidos gordos), de um modo preferido, pelo menos, cerca de 30%, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 35%, e de um modo muito preferido, pelo menos, cerca de 40%.
Os microrganismos, os lípidos extraídos daí, a biomassa restante após a extracção de lípidos ou suas combinações podem ser utilizados directamente como um ingrediente alimentar, tal como um ingrediente em bebidas, molhos, lacticínios (tais como o leite, iogurte, queijo e gelado) e produtos cozinhados; suplementos nutritivos (na forma de cápsula ou comprimido); alimento ou suplemento alimentar para qualquer animal cuja carne ou produtos sejam consumidos por seres humanos; suplemento alimentar, incluindo comida para bebé e fórmulas para crianças; e produtos farmacêuticos (em aplicação directa ou terapia adjunta). O termo "animal" significa qualquer organismo pertencente ao reino Animal e inclui, sem limitação, qualquer animal a partir do qual é derivada carne de aves, pescado, carne de vaca, porco ou carneiro. O pescado é derivado de, sem limitação, peixes, camarão e marisco. O termo "produtos" inclui qualquer produto diferente de carne derivada desses animais, incluindo, sem limitação, ovos, leite ou outros produtos. Quando adicionado à dieta desses animais, os lípidos polinsaturados 22 podem ser incorporados na carne, leite, ovos ou outros produtos desses animais para aumentar o seu conteúdo nestes lipidos.
Os objectivos, vantagens e novas caracteristicas adicionais desta invenção são ilustrados aos especialistas na técnica após examinação dos seus seguintes exemplos, que não pretendem ser limitativos.
EXEMPLOS A estirpe Schizochytrium utilizada nestes exemplos produz dois ácidos polienóicos primários, DHAn-3 e DPAn-β na proporção geralmente de cerca de 3:1, e pequenas quantidades de outros ácidos polienóicos, tais como EPA e C20:3, sob uma vasta variedade de condições de fermentação. Assim, embora os seguintes exemplos listem apenas a quantidade de DHA, a quantidade de DPA(n-6) produzida pode ser prontamente calculada através da utilização da proporção acima divulgada.
Exemplo 1 de Referência
Este exemplo ilustra o efeito do conteúdo de oxigénio num meio de fermentação sobre a produtividade de lipidos.
Os resultados da fermentação de Schizochytrium ATCC N° 20888 a vários niveis de conteúdo de oxigénio dissolvido foram medidos e são mostrados na Figura 1, onde RCS é a concentração residual de açúcar e DCW é o peso celular seco. 23
Exemplo 2 de Referência
Este exemplo também ilustra o efeito do conteúdo baixo de oxigénio no meio de fermentação sobre o conteúdo de DHA (% de peso seco) do produto final de biomassa.
Foi realizada uma experiência do tipo "pequena escala" em balões Erlenmeyer de 250 mL para mimetizar o efeito de baixo conteúdo de oxigénio sobre o conteúdo de DHA em células de Schizochytrium sp. cultivadas em fermentadores a grande escala. O Schizochytrium sp. (ATCC 20888) foi cultivado em meio 04-4. Este meio de cultura consistia no seguinte, numa base em litro dissolvido em água desionizada. Na2S04 12,61 g; MgS04*7H20 1,2 g; KC1 0,25 g; CaCl2 0, 05 g; glutamato monossódico 7,0 g; glucose 10 g; KH2P04 0, 5 g; NaHC03 0,1 g; extracto de levedura 0,1 g; mistura de vitaminas 1,0 mL; metais PII 1,00 mL; A mistura de metais PII contém (por litro): 6,0 g de Na2EDTA, 0,29 g de FeCl3· 6H20, 6, 84 g de H3B03, 0,86 g de Μη(712·4Η20, 0,06 g de ZnCl2, 0, 026 g de CoCl2-6H20, 0, 052 g de NiS04*H20, 0, 002 de CuS04*H20 e 0, 005 g de Na2Mo04*2H20. A mistura de vitaminas contém (por litro): 100 mg de tiamina, 0,5 mg de biotina e 0,5 mg de cianocobalamina. O pH do meio de cultura foi ajustado a 7,0 e foi depois esterilizado por filtração. A ideia por detrás desta experiência de pequena escala foi cultivar as células em balões de agitação com volumes diferentes de meio de cultura nos balões - balões quase cheios (e. g.,
200 mL num balão de agitação de 250 mL) não misturariam bem numa plataforma de agitação e, deste modo, à medida que as células cresciam, seriam geradas condições de baixo oxigénio dissolvido. Deste modo, foram estabelecidos 4 tratamentos na experiência, cada um realizado em duplicado: (1) balões de 250 mL cheios com 50 mL de meio de cultura; (2) balões de 250 mL cheios com 100 mL 24 de meio de cultura; (3) balões de 250 mL cheios com 150 mL de meio de cultura; e (4) balões de agitação de 250 mL cheios com 200 mL de meio de cultura. Cada um dos oito balões foi inoculado com células de uma cultura com 48 horas de Schizochytrium cultivada em meio 04-4 sob as condições no tratamento 1, e a 28 °C e 220 rpm numa plataforma de agitação. Todos os oito balões para a experiência foram colocados numa plataforma de agitação (220 rpm) numa incubadora (28 °C) e cultivados durante 48 horas no escuro. No fim da experiência, os níveis de oxigénio dissolvido (OD) em cada balão foram medidos com um medidor de oxigénio dissolvido YSI, (YSI, Inc.), o pH do meio de cultura foi também determinado, e o peso seco das células e o seu conteúdo em ácidos gordos foi também medido. Os resultados da experiência estão delineados na Tabela 1.
Tabela 1. Resultados da experiência de pequena escala que examina o efeito de baixas concentrações de oxigénio dissolvido sobre o conteúdo de ácidos gordos muito insaturados de cadeia longa (DHA, % de peso seco) de Schizochytrium sp. mL de FAME DHA (% de Biomassa pH Final OD Meio (%TFA) peso seco) (g/L) (% sat) 50 16, 5 7,4 4,2 7,4 31 100 17, 0 6, 5 3,9 7,2 29 150 22, 4 9,2 2,7 7,0 11 200 35, 9 14,5 1,8 6, 9 3
Os resultados indicam que o conteúdo de lípido (como % de FAME) e o conteúdo de DHA (% de peso seco) foi superior para células cultivadas a níveis baixos de oxigénio dissolvido -quanto mais baixo o nível de oxigénio dissolvido, mais elevado o 25 conteúdo de lípido e D HA. Este resultado é inesperado porque se acreditava, de forma geral, que era necessário oxigénio para formar ligações não saturadas (duplas). É surpreendente que se tenha formado tanto D HA a um nível baixo de oxigénio dissolvido, porque o D HA é um dos ácidos gordos mais insaturados. Embora a produção de biomassa diminua à medida que diminui o nível de oxigénio dissolvido, o conteúdo de DHA aumenta. Deste modo, é vantajoso ter uma fase de crescimento com níveis mais elevados de oxigénio dissolvido para maximizar a formação de biomassa e depois baixar o nível de oxigénio dissolvido para maximizar a produção de ácidos gordos de cadeia longa.
Exemplo 3 de Referência
Os microrganismos foram produzidos utilizando fermentadores com um volume nominal de trabalho de 1200 galões. O caldo de fermentação resultante foi concentrado e os microrganismos foram secos utilizando um secador de tambor. Os lípidos de fracções dos microrganismos resultantes foram extraídos e purificados para produzir um óleo refinado, descorado e sem odor. Foram adicionados aproximadamente 3000 ppm de acetato de d-l-a-tocoferilo para objectivos de suplemento nutritivo antes da análise do lípido.
Foram realizadas nove fermentações de Schizochytríum ATCC N° 20888 e os resultados são mostrados na Tabela 2. O nível de oxigénio dissolvido foi cerca de 8% durante as primeiras 24 horas e posteriormente cerca de 4%. 26
Tabela 2. Resultados da fermentação em descontínuo para a produção de DHA a partir de Schizochytrium sp.
Entrada Idade (h) Rendimento1 (g/L) DHA2 (%) FAME3 (%) Produtividade4 1 100, 3 160,7 17,8 49, 5 0, 285 2 99,8 172,4 19, 4 51, 3 0, 335 3 84, 7 148,7 14,4 41, 4 0,253 4 90,2 169,5 19, 7 53, 9 0,370 5 99, 0 164,1 12, 5 38, 9 0, 207 6 113, 0 187,1 19, 7 47, 2 0, 326 7 97, 0 153,5 13,7 41, 0 0, 217 8 92, 8 174,8 16,4 48, 6 0, 309 M.5 97,1 166,4 16,7 46, 5 0,288 Desv.P.6 8,4 12,3 2,9 5,4 0, 058 CV7 (%) 8,7 7,4 17,3 11, 7 20,2 1. rendimento real da densidade de biomassa. 2. Conteúdo de DHA como % de peso celular seco. 3. conteúdo total de ácidos gordos como % de peso celular seco (medido como ésteres metílicos). 4. (gramas de DHA)/L/h. 5. média. 6. desvio padrão 7. coeficientes de variabilidade. Os valores de coeficientes de variabilidade abaixo de 5% indicam um processo que tem uma reprodutibilidade excelente, os valores entre 5% e 10% indicam um processo que tem uma reprodutibilidade boa e os valores entre 10% e 20% indicam um processo que têm uma reprodutibilidade razoável. 27 0 xarope de milho foi adicionado até que o volume no fermentador alcançou cerca de 1200 galões, momento este em que foi parada a adição de xarope de milho. O processo de fermentação foi parado assim que a concentração residual de açúcar caiu abaixo de 5 g/L. A idade típica, desde a inoculação ao final, foi cerca de 100 horas. O caldo de fermentação, i. e., o meio de fermentação foi diluído com água utilizando aproximadamente uma proporção de 2:1 para reduzir o conteúdo de cinza do produto final e ajudar a melhorar a separação de fase durante o passo de centrifugação. A pasta celular concentrada foi aquecida a 160 °F (cerca de 71 °C) e seca num secador de tambor duplo Blaw Knox (42"x36") . De um modo preferido, contudo, os microrganismos são secos directamente num secador de tambor sem centrifugação prévia. 0 resultado da análise de lípidos extraídos de fracções em cada entrada na Tabela 2 é sumariado na Tabela 3.
Tabela 3. Análise da biomassa microbiana produzida nas fermentações em descontínuo delineadas na Tabela 2.
Entrada % de DHA relativamente a FAME1 Lípido total, % em peso 1 36,0 72, 3 2 37,8 70, 3 3 34,8 61, 5 4 36, 5 74,8 5 32,1 52, 8 6 41, 7 67, 7 28 (continuação)
Entrada % de DHA relativamente a FAME1 Lipido total, % em peso 7 33,4 49, 9 8 33,7 61, 4 Média 35, 8 63, 8 Desv.P.3 3,0 9,1 CV4 (%) 8, 5 14,2 1. ver Tabela 2. 2. ver a discussão acima. 3. desvio padrão. 4. coeficientes de variabilidade. Os valores de coeficientes de variabilidade abaixo de 5% indicam um processo que tem uma reprodutibilidade excelente, os valores entre 5% e 10% indicam um processo que tem uma reprodutibilidade boa e os valores entre 10% e 20% indicam um processo que têm uma reprodutibilidade razoável.
Salvo referência em contrário, o meio de fermentação utilizado ao longo da secção de Exemplos inclui os seguintes ingredientes, em que o primeiro número indica a concentração nominal alvo e o número em parênteses indica a gama aceitável: sulfato de sódio 12 g/L (11-13); KC1 0,5 g/L (0,45-0,55); MgS04*7H20 2 g/L (1,8-2,2); antiespumante Hodag K-60 0,35 g/L (0,3-0,4); K2S04 0, 65 g/L (0, 60-0, 70); KH2P04 1 g/L (0,9-1,1); (NH4)2S04 1 g/L (0,95-1,1); CaCl2*2H20 0, 17 g/L (0,115-0,19); xarope de milho 95 DE (base de sólidos) 4,5 g/L (2-10); MnCl2*4H20 3 mg (2,7-3,3); ZnS04*7H20 3 mg/mL (2,7-3,3);
C0C12*6H20 0, 04 mg/mL (0, 035-0,045); Na2Mo04*2H20 0, 04 mg/mL
(0-0,045); CuS04*5H20 2 mg/mL (1,8-2,2); NiS04*6H20 2 mg/mL 29 (1,8-2,2); FeS04*7H20 10 mg/mL (9-11); tiamina 9,5 mg/mL (4-15); vitamina Bi2 0,15 mg/mL (0,05-0,25) e Pantotenato de cálcio 3,2 mg/mL (1,3-5,1). Além disso, é utilizada uma solução de NH4OH a 28% como a fonte de azoto. O conteúdo de cinza dos microrganismos secos é cerca de 6% em peso.
Exemplo 4
Este exemplo ilustra o efeito do nivel reduzido de oxigénio dissolvido no meio de fermentação na produtividade dos microrganismos na escala de 14000 galões.
Utilizando o processo descrito no Exemplo 3, foi realizada uma fermentação num volume nominal de 14000 galões utilizando uma estirpe Schizochytrium de tipo selvagem que pode ser obtida utilizando processos de isolamento divulgados nas Patentes U.S. N° 5340594 e 5340742 acima mencionadas. O nivel de oxigénio dissolvido no meio de fermentação foi cerca de 8% durante as primeiras 24 horas, cerca de 4% a partir da 24a hora à 40a hora e cerca de 0,5% a partir da 40a hora ao fim do processo de fermentação. Os resultados deste nivel mais baixo de oxigénio dissolvido em processos de meio de fermentação são mostrados na Tabela 4. 30
Tabela 4. Resultados de fermentações em descontínuo na escala de 14000 galões de Schizochytrium em concentrações reduzidas de oxigénio dissolvido.
Entrada Idade (h) Rendi mento (g/L) %DHA %FAME %DHA rei. a FAME Produtividade de D HA (g de DHA/L/h) 1 82, 0 179, 3 21, 7 52, 4 41,4 0,474 2 99, 0 183, 1 22, 3 55, 0 40,5 0,412 3 72, 0 159, 3 - - 40, 9 - 4 77, 0 161, 3 - - 43,2 - 5 100,0 173, 0 23, 9 53, 3 44,9 0,413 6 102,0 183, 3 21,6 50, 8 42, 6 0,388 7 104,0 185, 1 23,7 55, 0 43,1 0,422 8 88, 0 179, 3 22,3 52, 6 42,4 0, 454 9 100,0 166, 4 22,5 53, 5 42,1 0, 374 10 97, 0 182, 6 22,8 51, 6 44,1 0,429 11 87, 5 176, 5 19,8 45, 6 43,5 0,399 12 67, 0 170, 8 18,8 48, 1 39,1 0, 479 13 97, 0 184, 9 23,2 52, 7 44,0 0, 442 14 102,0 181, 9 23,6 52, 9 44,6 0, 421 15 102,0 186, 9 19, 9 47, 8 41,8 0, 365 16 97, 0 184, 4 19, 6 45, 5 43,0 0,373 17 98, 0 174, 7 19,7 45, 1 43,7 0,351 18 103,5 178, 8 18,3 44, 5 41,2 0,316 19 102,0 173, 7 15,8 43, 1 36, 7 0,269 20 94,0 190, 4 19,3 46, 9 41,1 0,391 21 72, 0 172, 5 22,8 52, 8 43,2 0, 546 22 75, 0 173, 1 21,0 51, 7 40,8 0, 485 23 75, 0 152, 7 20,3 50, 3 40,4 0, 413 24 75, 5 172, 5 21,9 51, 7 42,3 0, 500 31
Entrada Idade (h) Rendi mento (g/L) %DHA %FAME %DHA rei. a FAME Produtividade de D HA (g de DHA/L/h) 25 61, 0 156,4 17,3 45,7 37,8 0, 444 26 74,5 150, 6 20,2 50,1 40,2 0,408 27 70, 5 134,3 14,8 40, 6 36,6 0,282 28 75, 5 146,1 21,3 49,7 42,8 0,412 29 82, 0 174,3 21, 4 50, 4 42,5 0,455 30 105,0 182,3 21,7 50, 7 42,8 0, 377 31 66, 0 146,2 16,4 44,6 36,7 0,363 Média 87,2 171, 5 20, 6 49, 5 41,6 0,409 Desv.P. 13, 9 14,1 2,4 3,8 2, 3 0,061 CV 16, 0% 8, 2% 11, 6% 7,7% 5, 5% 15, 0%
Exemplo 5
Este exemplo ilustra o efeito do nível reduzido de oxigénio dissolvido no meio de fermentação sobre a produtividade de microrganismos a uma escala de 41000 galões.
Os mesmos processos como no Exemplo 4 foram utilizados excepto gue a fermentação foi realizada num fermentador de 41000 galões. Os volumes do meio de cultura foram aumentados para manter as concentrações alvo dos compostos nesta escala. Os resultados são mostrados na Tabela 5. 32
Tabela 5. Fermentação na escala de 41000 galões de
Schizochytrium
Entrada idade (h) Rendi mento (g/L) %DHA %FAME %DHA rei. a FAME Produtividade de D HA (g de DHA/L/h) 1 75, 0 116,1 17,3 46,1 37, 4 0,268 2 99, 0 159, 3 17, 4 47, 0 37,1 0,280 3 103, 0 152,6 16,0 47,2 33,8 0,237 4 68, 0 136, 8 17, 9 45, 9 39,1 0,360 5 84,0 142,0 17, 5 47, 0 37,2 0,296 Média 85, 8 141,4 17,2 4 6,6 36, 9 0,288 Desv.P. 15,1 16, 6 0,7 0, 6 1,9 0,046 cv 17, 5% 11, 8 4,2% 1,3% 5,2% 15,8%
Exemplo 6
Este exemplo ilustra o efeito de azoto extra no processo de fermentação da presente invenção.
Foram realizados quatro conjuntos de experiências em descontinuo a uma escala de 250 L utilizando um processo semelhante ao Exemplo 4. Foram realizados duas experiências de controlo e duas experiências contendo amoníaco extra (l,15x e l,25x a quantidade normal). Os resultados são mostrados na Tabela 6. 33
Tabela 6. Efeito de amoníaco extra na fermentação de
Schizochytrium.
Idade (h) Rendi mento (g/L) Produtividade de Biomassa Eficiência da Conversão Conteúdo de DHA Conteúdo de FAME Produtividade de DHA Alvo de açúcar: 7 g/L, Ponto de referência de pH básico: 5,5. Ponto de referência de pH ácido: 7,3. 1,OX NH3 48 178 3,71 g/L/h 51,5% 10,7% 37,8% 0,40 g/L/h 60 185 3,08 g/L/h 46, 9% 16, 3% 47,2% 0,50 g/L/h 72 205 2,85 g/L/h 45,2% 17,4% 47,4% 0,50 g/L/h 84 219 2,61 g/L/h 43, 8% 17,1% 45,5% 0,45 g/L/h 90 221 2,46 g/L/h 44,1% 18,4% 48,9% 0,45 g/L/h Alvo de açúcar: 7 g/L, Ponto de referência de pH básico: 5,5. Ponto de referência de pH ácido: 7,3. 1,15X NH3 48 171 3,56 g/L/h 55, 6% 12,0% 36, 3% 0,43 g/L/h 60 197 3,28 g/L/h 54,6% 9, 4% 38,4% 0,31 g/L/h 72 191 2,65 g/L/h 52,8% 9, 4% 40,0% 0,25 g/L/h 84 190 2,26 g/L/h 52,5% 10,0% 42,5% 0,23 g/L/h 90 189 2,10 g/L/h 52,2% 9,2% 43,3% 0,19 g/L/h Alvo do açúcar: 7 g/L, Ponto de referência de pH básico: 5,5. Ponto de referência de pH ácido: 7,3. 1,25X NH3 48 178 3,71 g/L/h 56,4% 11,5% 33,7% 0,43 g/L/h 60 179 2,98 g/L/h 48,6% 10,3% 36,0% 0,31 g/L/h 72 180 2,50 g/L/h 48,8% 12,0% 37, 6% 0,30 g/L/h 84 181 2,15 g/L/h 46,1% 13, 6% 40,1% 0,29 g/L/h 90 185 2,06 g/L/h 45,7% 12, 6% 40,7% 0,26 g/L/h Alvo do açúcar: 7 g/L, Ponto de referência de pH básico: 5,5. Ponto de referência de pH ácido: 7,3. 1,0X NH3 48 158 3,29 g/L/h 55,7% 13,1% 36,5% 0,43 g/L/h 60 174 2,90 g/L/h 48,9% 17, 9% 39,2% 0,52g/L/h 72 189 2,63 g/L/h 45,7% 21,0% 39,4% 0,55 g/L/h 84 196 2,33 g/L/h 44,1% 22,4% 40,1% 0,52 g/L/h 90 206 2,29 g/L/h 44,8% 22,1% 40,3% 0,51 g/L/h
Em geral, o azoto extra tem um efeito negativo no desempenho da fermentação, uma vez que foram observadas reduções 34 significativas na produtividade de DHA para os dois lotes onde foi adicionado amoníaco extra. Como mostrado na Tabela 6, os lotes de controlo resultaram em níveis finais de DHA de 18,4% e 22,1% de peso celular seco total versus 9,2% (l,15x de amoníaco) e 12,6% (l,25x de amoníaco) para lotes suplementados com azoto extra.
Exemplo 7
Este exemplo mostra um perfil cinético de um processo de fermentação da presente invenção.
Foi realizada uma experiência em descontínuo a uma escala de 1000 galões utilizando um processo semelhante ao Exemplo 4. O perfil cinético do processo de fermentação é mostrado na Tabela 7.
Tabela 7. Perfil cinético para uma fermentação em descontínuo de uma escala de 1000 galões de Schizochytrium.
Idade (h) Rendi mento (g/L) Produtividade de Biomassa Eficiência da Conversão Conteúdo de DHA % Conteúdo de FAME % Produtividade de DHA 24 118 4,92 g/L/h 78,2% 7,4 18,8 0,36 g/L/h 30 138 4,60 g/L/h 60,3% 10,6 30,9 0,49 g/L/h 36 138 3,83 g/L/h 46, 6% 11,6 36, 5 0,44 g/L/h 42 175 4,17 g/L/h 49, 8% 13, 4 41,7 0,56 g/L/h 48 178 3,71 g/L/h 45,1% 18,7 52,8 0,69 g/L/h 48* 164 3,42 g/L/h 41,5% 15, 3 33, 1 0,52 g/L/h 54 196 3,63 g/L/h 45,7% 16, 6 51,2 0,60 g/L/h 60 190 3,17 g/L/h 41,7% 16, 9 33, 9 0,54 g/L/h 72 189 2,62 g/L/h 39,1% 15, 6 31,8 0,41 g/L/h 84 195 2,32 g/L/h 38,5% 16,4 32,7 0,38 g/L/h 35 (continuação)
Idade (h) Rendi mento (g/L) Produtividade de Biomassa Eficiência da Conversão Conteúdo de DHA % Conteúdo de FAME % Produtividade de D HA 90 200 2,22 g/L/h 39, 0% 18,8 33,3 0,42 g/L/h 90 171 1,90 g/L/h 33,3% 22,2 61, 6 0,42 g/L/h** * Foram analisadas duas amostras separadas às 48 horas. ** Isto é para uma amostra lavada de pesos celulares secos (DCW). Outros valores descritos são para amostras não lavadas.
Exemplo 8
Este exemplo ilustra o efeito da quantidade da fonte de carbono sobre a produtividade.
Foram realizados três processos de fermentação diferentes que utilizam o processo de Exemplo 4, utilizando várias quantidades da fonte de carbono. Os resultados são mostrados na Tabela 8.
Tabela 8. 0 fermentação resulta para várias quantidades de fonte de carbono na fermentação de Schizochytrium.
Idade (h) Rendi mento (g/L) Carga de Carbono Eficiência da Conversão Conteúdo de DHA % Conteúdo de FAME % Produtividade (g/L/h) 90 171 51, 3% 33, 3% 22, 2 61, 6 0, 42 94 122 40, 5% 30,1% 19, 1 57, 3 0, 25 59 73 20, 0% 36,5% 11,9 40, 8 0,15 36
Exemplo 9 de Referência
Este exemplo ilustra o efeito da limitação de nutriente na eficiência da conversão de carbono em biomassa, lípido e muito especificamente DHA.
Foi realizada uma experiência de cultura continua para investigar o efeito da limitação de nutriente através do cultivo de Schizochytrium ATCC N° 20888 num fermentador Applikon de volume 2 litros em meio de cultura basal (ICM-2) consistindo dos seguintes compostos (concentração nominal): ingredientes do Grupo I: Na2S04 (18, 54 g/L), MgS04»7H20 (2,0 g/L) e KC1 (0,572 g/L); ingredientes do Grupo II (cada um preparado separadamente): glucose (43,81 g/L), KH2P04 (1,28 g/L), CaCl2*2H20 (0, 025 g/L) e (NH4)2S04 (6, 538 g/L); Ingredientes do Grupo III:
Na2EDTA (6,0 mg/L), FeCl3*6H20 (0, 29 mg/L) , H3B03 (6, 84 mg/L) ,
MnCl2·4H20 (0,86 mg/L), ZnSO4‘7H20 (0,237 mg/L), CoCl2‘2H20 (0, 026 mg/L), Na2MoO4-2H20 (0,005 mg/L), CuSO4*5H20 (0, 002 mg/L) e NiSO4‘6H20 (0,052 mg/L); e ingredientes de Grupo IV: tiamina HC1 (0,2 mg/L), Vitamina B42 (0,005 mg/L), pantotenato de cálcio (0,2 mg/L). Os grupos I e II foram esterilizados por autoclave, enquanto os Grupos III e IV foram esterilizados por filtração antes de serem adicionados ao fermentador. O meio de cultura foi depois inoculado com Schizochytrium e cultivado sob condições controladas de 30 °C, pH 5,5 e oxigénio dissolvido de 20% de saturação até ser atingida uma densidade celular máxima.
Foi depois estabelecido um modo de operação contínuo através do bombeamento simultâneo de meio de alimentação estéril ICM-2 no fermentador e remoção do caldo contendo células
Schizochytrium, a um caudal suficiente para manter uma taxa de diluição de 0,06 h_1 até ser atingido um estado estacionário. Para investigar o efeito da limitação de nutriente, o composto 37 contendo o nutriente requerido especificado é diminuído no meio de alimentação ICM-2, de modo que este nutriente seja esgotado no caldo contendo células de saída, de modo que o crescimento das células esteja limitado pela ausência do nutriente requerido particular. Uma vez estabelecida a operação de estado estacionário para cada condição, foram medidas a biomassa seca do caldo final, glucose residual, e concentrações de nutrientes limitantes, conteúdo de lípidos da célula e conteúdo de DHA das células. A eficiência da conversão de glucose em biomassa foi calculada dividindo a glucose total consumida pela biomassa seca total formada, e expressa numa base percentual.
Os efeitos de limitação do crescimento por cada nutriente individual foram estudados através da repetição desta experiência para cada nutriente individual listado na seguinte tabela. Os resultados finais são sumariados na seguinte tabela:
Tabela 9. Efeito da limitação de nutriente sobre 0 rendimento de biomassa, eficiência de conversão (glucose -> biomassa), conteúdo de lípidos e conteúdo de DHA de
Schizochytrium sp.
Nutriente Limitante Biomassa1 (g/L) W RCS3 (g/L) Conteúdo de lípidos4 (%) Conteúdo de DHA5 (%) Glucose 18, 7 46, 8 0,0 19, 8 7,3 Azoto 14, 5 36,3 0, 6 47, 5 10,3 Fosfato 17, 8 44,5 0,8 37, 0 8,2 Tiamina 7,5 18,8 7,7 11,1 4,0 Zinco 16, 0 40,0 1,3 27, 8 7,2 Cobre 14, 0 35,0 10,4 13, 8 5,3 Cobalto 14, 5 36,3 0,0 22,2 6,9 Níquel 17, 8 44,5 0,0 21, 9 8,0 Ferro 15, 9 39, 8 3,5 18, 5 7,2 38 (continuação)
Nutriente Limitante Biomassa1 (g/L) Yx/s2 RCS3 (g/L) Conteúdo lipidos4 de (%) Conteúdo de DHA5 (%) Manganês 12, 5 31,3 3,4 26,1 8,0 Magnésio 13, 9 34,8 5,3 18, 7 6,4 Cálcio 16, 7 41,8 4,3 18, 7 6,4 Vitamina B12 19, 6 49,0 0, 0 17, 5 6,3 Molibdénio 18, 9 47,3 0, 0 19, 3 7,0 Pantotenato 19,2 48,0 0, 0 20,4 6,7 Sódio 17, 9 44,8 1,8 21, 8 8,2 Potássio 13, 0 32,5 8, 8 14,1 5,3 1. concentração de biomassa seca (gramas/litro) 2. coeficiente de rendimento (% de biomassa produzida/glucose consumida) 3. concentração de glucose residual no caldo (gramas/litro) 4. conteúdo de lipidos da biomassa seca (g de lípido (como FAME)/g de biomassa seca) 5. Conteúdo de DHA de biomassa seca (g de DHA/g de biomassa seca) É claro a partir da tabela que a limitação de azoto resultou na mais elevada acumulação de DHA nas células, seguida por fosfato, sódio, níquel, manganês, glucose (carbono), zinco e ferro. Esta informação pode ser utilizada comercialmente através da alimentação de um ou mais destes nutrientes numa fermentação em descontínuo a uma taxa suficiente para limitar o crescimento celular. No caso muito preferido, o azoto é alimentado de um modo limitante na fermentação em descontínuo para maximizar o conteúdo de DHA das células. Os outros nutrientes (ou suas misturas) podem ser alimentados de um modo limitante para maximizar a produção de biomassa ou de outros produtos valiosos. Outros elementos ou nutrientes biologicamente requeridos que não foram avaliados, tal como o enxofre, poderiam também ser utilizados como nutrientes limitantes nesta estratégia de controlo de fermentação.
Lisboa, 25 de Outubro de 2007 39

Claims (25)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a produção os lípidos microbianos compreendendo: (a) realização de uma fermentação de um meio compreendendo microrganismos, uma fonte de carbono e uma fonte de nutriente limitante e proporcionar condições suficientes para manter um nível de oxigénio dissolvido de, pelo menos, cerca de 4% de saturação no referido meio de fermentação para aumentar a densidade da biomassa; (b) proporcionar subsequentemente, condições suficientes para manter um nível de oxigénio dissolvido de cerca de 1% ou menos, de saturação no referido meio de fermentação e proporcionar condições suficientes para permitir aos referidos microrganismos produzirem os referidos lípidos; e (c) recuperar os referidos lípidos microbianos, em que, pelo menos, cerca de 15% dos referidos lípidos microbianos são lípidos polinsaturados; e em que é conseguida uma densidade de biomassa de, pelo menos, 100 g/L durante a fermentação.
  2. 2. Processo para enriquecer o conteúdo de ácidos gordos polienóicos de um microrganismo compreendendo a fermentação do referido microrganismo num meio de cultura que tem um nível de oxigénio dissolvido de menos de 1% de saturação. 1
  3. 3. Processo da Reivindicação 1 ou 2, em que o referido meio de fermentação ou meio de cultura está a uma temperatura de, pelo menos, cerca de 20 °C.
  4. 4. Processo da Reivindicação 1 ou 2, em que o referido processo produz lipidos a uma taxa média de, pelo menos, cerca de 0,5 g/L/h.
  5. 5. Processo da Reivindicação 1 ou 2, em que o referido processo produz lipidos a uma taxa média de, pelo menos, cerca de 0,5 g/L/h e em que, pelo menos, cerca de 15% dos referidos lipidos são lipidos polinsaturados.
  6. 6. Processo da Reivindicação 1 ou 2, em que o referido processo produz lipidos a uma taxa média de, pelo menos, cerca de 0,5 g/L/h e em que a quantidade total de ácidos gordos omega-3 e omega-6 é, pelo menos, cerca de 20% dos referidos lipidos.
  7. 7. Processo da Reivindicação 1 ou 2, em que o referido processo produz lipidos a uma taxa média de, pelo menos, cerca de 0,5 g/L/h e em que, pelo menos, cerca de 25% dos referidos lipidos é ácido docosa-hexaenóico.
  8. 8. Processo da Reivindicação 1 ou 2, em que os referidos microrganismos são seleccionados do grupo consistindo em algas, fungos (incluindo levedura), protistas, bactérias e suas misturas, em que os referidos microrganismos são capazes de produzir ácidos gordos polienóicos.
  9. 9. Processo da Reivindicação 1 ou 2, em que os referidos microrganismos são seleccionados do grupo consistindo em algas, fungos (incluindo levedura), protistas, bactérias e suas misturas, em que os referidos microrganismos são 2 capazes de produzir ácidos gordos polienóicos e em que os referidos microrganismos são cultivados num processo em descontinuo.
  10. 10. Processo da Reivindicação 1 ou 2, em que os referidos microrganismos são seleccionados do grupo consistindo em algas, fungos (incluindo levedura), protistas, bactérias e suas misturas, em que os referidos microrganismos são capazes de produzir ácidos gordos polienóicos e em que os referidos microrganismos são cultivados num processo em descontinuo e compreendendo ainda a manutenção de um nivel de oxigénio menor do que cerca de 3% de saturação no referido meio de fermentação durante o passo (a).
  11. 11. Processo da Reivindicação 1 ou 2, em que os referidos microrganismos são microalgas e microrganismos de tipo algas.
  12. 12. Processo da Reivindicação 1 ou 2, em que os referidos microrganismos são Stramenopiles.
  13. 13. Processo da Reivindicação 1 ou 2, em que os referidos microrganismos são da ordem Thraustochytriales.
  14. 14. Processo da Reivindicação 1 ou 2, em que os referidos microrganismos são seleccionados do grupo consistindo em Thraustochytrium, Schizochytrium, e suas misturas.
  15. 15. Processo da Reivindicação 1, em que a referida fonte de carbono é uma fonte de carbono não alcoólica. 3
  16. 16. Processo da Reivindicação 1 ou 2, em que o referido processo produz em média, pelo menos, cerca de 0,2 g/L/h de ácido docosa-hexaenóico.
  17. 17. Processo da Reivindicação 1, em que o referido passo de recuperação de lípidos compreende: (d) remoção da água do referido meio de fermentação para proporcionar microrganismos secos; e (e) isolamento dos referidos lipidos a partir dos microrganismos secos.
  18. 18. Processo da Reivindicação 1, em que o referido passo de recuperação de lipidos compreende: (d) evaporação da água do referido meio de fermentação sem centrifugação prévia para proporcionar microrganismos secos; e (e) isolamento dos referidos lipidos a partir dos microrganismos secos.
  19. 19. Processo da Reivindicação 1, em que o referido passo de recuperação de lipidos compreende: (d) o tratamento do caldo de fermentação para permeabilizar, lisar ou quebrar as células microbianas; e (e) a recuperação dos lipidos do caldo de fermentação através de separação gravimétrica, com ou sem a ajuda de um agente para ajudar a quebrar a emulsão lipido/água. 4
  20. 20. Processo da Reivindicação 2, em que durante uma fase inicial do crescimento, o nivel de oxigénio dissolvido é maior do que cerca de 10% de saturação e durante uma fase subsequente de produção, o nivel de oxigénio dissolvido é menor de 1% de saturação.
  21. 21. Processo da Reivindicação 2, em que o referido microrganismo contém genes da policétido sintase.
  22. 22. Processo heterotrófico para a produção de produtos e microrganismos compreendendo o cultivo dos referidos microrganismos num meio de cultura que tem um nivel de oxigénio dissolvido menor do que cerca de 1% de saturação, em que os referidos microrganismos contêm genes da policétido sintase.
  23. 23. Processo da reivindicação 22, em que os referidos genes da policétido sintase ocorrem naturalmente nos referidos microrganismos.
  24. 24. Processo da reivindicação 22, em que os referidos genes da policétido sintase são introduzidos geneticamente nos referidos microrganismos.
  25. 25. Processo da reivindicação 22, em que durante uma fase inicial do crescimento, o nível de oxigénio dissolvido é maior do que cerca de 10% de saturação e durante uma fase subsequente da produção, o nível de oxigénio dissolvido é menor do que cerca de 1%. Lisboa, 25 de Outubro de 2007 5
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