CN103357199B

CN103357199B - 脱气方法

Info

Publication number: CN103357199B
Application number: CN201310239611.7A
Authority: CN
Inventors: 艾伯特·沙普; 迪尼埃尔·韦尔科埃尔简
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2003-12-30
Filing date: 2004-12-28
Publication date: 2019-02-01
Anticipated expiration: 2024-12-28
Also published as: PL2251429T3; ATE480634T1; ES2351697T3; EA200601261A1; JP4839454B2; MX2011004418A; JP5496920B2; EP2251430A1; BRPI0418239A; US20070148315A1; KR101167331B1; JP2014087357A; IL176417A0; EA009568B1; EP1706500B1; EP2251429B1; CA2551659A1; ES2624952T3; ES2563649T3; CN103357199A

Abstract

本发明描述了一种脱气方法，包括对包含细胞的含水液体进行脱气，然后从所述细胞获取油或PUFA。可采用多种技术进行脱气，包括：施加真空(或减压)；通过减少搅拌或使培养液经受离心力的机械脱气或除气；降低粘度(通过稀释或加热)；在发酵时减少氧气或空气供给或降低搅拌速率；降低pH(为了降低CO₂的溶解度)；用PTFE毛细管过滤；气体置换(通过鼓泡通入氮气或氦气)；或化学脱气(用除氧剂)。

Description

脱气方法

本申请是国际申请日为2004年12月28日，国家申请号为200480039457.8，发明名称为“脱气方法”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及生产油或多不饱和脂肪酸(PUFA)的方法。所述方法包括使包含(此后)从其得到油或PUFA的细胞的含水液体脱气，(然后)由此得到油或PUFA。脱气之后，可对细胞进行巴氏灭菌。然后可从所述细胞中提取、纯化或分离油或PUFA。

背景技术

天然发现了多不饱和脂肪酸(或PUFA)，而且不同的单细胞生物(藻类、真菌等)产生许多不同的PUFA。一种特别重要的PUFA是花生四烯酸(ARA)，其为众多长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)中的一种。化学上，花生四烯酸是顺式-5，8，11，14-二十碳四烯酸(20:4)并属于LC-PUFA的(n-6)族。

花生四烯酸是大量生物活性化合物的重要前体，这些生物活性化合物统称为类二十碳烷，包括前列腺素、血栓素和白三稀。花生四烯酸还是人类乳汁中脂类部分的组分之一，其被认为是婴儿神经系统最佳发育所必须的。花生四烯酸具有广泛的应用，包括用于婴儿配方、食品和动物饲料。

WO-A-97/37032提及了由经巴氏灭菌的生物质来制备微生物含PUFA的油。然而，该文献中并未公开在巴氏灭菌前进行脱气。

2003年12月31日出版的WO-A-04/001021对巴氏灭菌条件进行了更详细的描述。

包括加热生物质或微生物细胞的方法是已知的。WO-A-97/37032描述了可在以油的形式从其提取PUFA之前将微生物细胞进行巴氏灭菌。然而，本申请人已发现，包含脱气工艺可改善可从细胞提取的油的品质。更具体地，所得的油可较少地氧化或被氧化，并且可具有更低的过氧化值(POV)和/或茴香胺值(AnV)。

发明内容

因此，本发明提供了一种生产油或多不饱和脂肪酸(PUFA)的改进方法。所作的改进是优选在巴氏灭菌之前采用脱气处理。

因此，本发明的第一方面涉及产油或多不饱和脂肪酸(PUFA)的方法，所述方法包括：

a)对包含细胞的含水液体进行脱气；和

b)从所述细胞中获取油或PUFA。

含水液体优选为培养液或培养基，例如发酵培养液或由发酵得到的培养液。它可以是在发酵过程中取出或移出的液体，但是优选发酵结束后的培养液。细胞优选为微生物细胞。在脱气之前、期间和/或之后，微生物细胞可以是活的。

含水液体的脱气优选使空气得以去除，例如夹带的、裹入的、未溶解的和/或已溶解的空气。因而本发明可以是或包括除气。它可以去除气体(例如气泡)。优选地，本方法将去除氧气，例如溶解的氧气(例如以被裹入的形式，或作为气泡)。本文中，“溶解的”是指存在于或溶解于含水液体的气体(例如空气或氧气)(而不是细胞内部的任何气体)。

脱气工艺还可导致例如二氧化碳的其它气体被从含水液体中去除。

由于脱气可优选地去除至少部分溶解的和/或一些未溶解的氧气，因此可减少氧化。这意味着PUFA和/或油可更少地被氧化，因而具有更好的品质。

并不容易看出去除氧气带来的优越性，原因在于微生物细胞需要氧气来得以存活和生长。事实上，在包括本发明优选的工艺的很多发酵工艺中，空气被供给至微生物细胞，例如供给(例如鼓泡)至含水液体或培养基。细胞将分裂并生长，并且优选在分裂和生长过程中还生物合成一种或更多种PUFA。于是，在发酵过程中停止氧气或空气供给来进行脱气的想法并不一定被认为是有利的策略，因为这会导致细胞死亡，或者至少减弱其生产PUFA以及其它有价值的化合物的能力。

对于食品(例如生奶和橙汁)的脱气是已知的，在某些工业工艺(例如造纸)中的脱气也是已知的。然而，应当认识到这些工艺与微生物有机体的发酵(特别是为了生产待提取的化合物)属于不同的领域，而且那些(现有技术)体系中并无(活)细胞。在某些现有技术的工艺中，进行脱气是为了减少细菌生长，而在本发明中，为了生产PUFA，微生物细胞的生长和存活(包括细菌细胞)是需要氧气的发酵工艺的重要因素。

存在许多种进行脱气的方法，包括：

a)施加真空(或减压)；

b)机械脱气/除气(搅拌、振动、例如在离心机或旋风器中使用例如重力的加速力)；

c)改变粘度(通过用水或其它液体稀释，或通过改变温度)；

d)改变发酵条件，例如在发酵时减小空气提升、空气喷射或氧气或空气供给，或降低搅拌速率；

e)改变pH，例如通过降低pH或进行酸化(例如通过使用二氧化碳，其在溶于液体时形成碳酸)；

f)过滤，例如通过过滤器、毛细管或膜，例如(优选惰性的)聚合物，例如PTFE；

g)气体置换，用惰性气体(例如氮气)或稀有气体(例如氦气)；

h)化学脱气，例如使用除氧剂(例如亚硫酸钠或肼)；

i)时间，例如静置含水液体，或使其处于可使气体(例如氧气或空气)从液体中扩散出来的条件下；和/或

j)上述方法的一种或更多种的组合。

现分别对以上九种脱气方法进行详细讨论。

1.真空(或减压)

可在含水液体表面上方施加真空。但是，真正的真空并不总是必须的，作为替代手段，优选的方法包括减小含水液体(例如当其存在于例如发酵罐的容器中)表面上方的压力。优选地，含水液体上方的压力小于大气压或室压，或至少与发酵罐内的压力(或发酵时的压力)相比压力有所降低。因此，当脱气开始时，例如发酵完成后，存在压力的下降。

真空或减压可施加于与发生发酵的容器(例如发酵罐)不同的独立容器中。因此，液体可被输送至真空工作站或独立容器，在其中施加真空或可存在真空。在本文中，当提及施加“真空”作为脱气方法之一时，应当将此理解为对含水液体施加减压。这是因为施加完全真空并非绝对必要。

优选地，(在真空脱气阶段中)施加的压力不大于800mbara(毫巴绝对压力)，优选不大于600mbara，最优选不大于400mbara。在某些情况下，使用适当的装置，压力优选不大于200或100mbara。优选地，减压为50-600mbara，例如100-500mbara，最优选200-450mbara。

在一种优选的实施方式中，含水溶液(例如在发酵之后)被输送至具有减压(换言之，压力小于发酵罐(或含水液体从其中开始输送的容器)的压力)的容器中。含水液体在这两个容器(例如从发酵罐至减压容器)之间的输送可以借助于压差或由压差引起。因此可存在输送压力，其表示含水液体在从一个容器移动至另一个容器的过程中经受的压力。此输送压力优选不大于0.7bar，例如0.6bar，优选不大于0.5bar。输送压力可在0.7与0.3bar之间，例如0.6-0.4bar。

减压容器可具有增大含水液体表面积的装置，以帮助脱气。因此，含水液体可呈现为膜的形式，例如薄膜。可通过例如喷嘴(例如伞状喷嘴)或伞形脱气器的机械装置来使含水液体形成膜(例如薄膜)。因此，可在施加减压的同时将含水溶液压在曲面上。通过增大含水溶液的表面积(例如通过形成膜或喷雾)，可促进脱气过程，并可使除气更加有效。减压容器(包括其上施加水液体的曲面或喷嘴)内的含水溶液的水平可为全部充满的十分之一至十分之二。然后可将已脱气的含水液体输送至巴氏灭菌或加热容器或工作站。

2.机械脱气

通常在发酵期间，氧气或(更通常地)空气被供给至含水液体(培养基或发酵培养液)。这可使微生物细胞生长和分裂并生物合成PUFA。

在发酵过程中，可搅拌含水液体。为了脱气，搅拌量(或搅拌速率)可降低或减慢或完全停止。较慢的搅拌更不易造成气穴现象(例如在搅拌桨或移动表面上或附近)并且更不易(在含水溶液中)生成气泡。

停止搅拌，或降低搅拌程度，可使含水液体中的气泡聚结，从而朝着含水液体表面上升。在降低搅拌时，搅拌速率可降至不超过发酵时的二分之一、三分之一或甚至四分之一。例如，如果搅拌速率为80rpm，则为了脱气可将搅拌速率降至不超过40rpm。

机械脱气还可包括减少供给至含水液体(发酵培养液，通过充气)的空气或氧气的量。可减慢空气或氧气的添加速率，或完全停止。在脱气时，空气(或氧气)的供给速率可降至不超过(例如发酵时的速率)的二分之一、三分之一或甚至四分之一。因此，可在发酵结束时停止或中止对液体进行充气(例如，持续5、2或1小时)。

通常在发酵时将空气(或氧气)供给至含水液体，同时其处在发酵容器(或发酵罐)内。气体可被鼓泡至含水溶液中，这可通过喷射器完成。脱气可包括减小通过喷射器的空气或氧气供给速率。

还可通过在含水液体通过或进入(静态)振动容器(例如管)处进行振动来实现脱气。

含水液体可通过使用除气泵来脱气。含水液体可受到加速力，例如在旋风器中。因此，可对该液体施加离心力，这有助于脱气。旋风器可使含水液体在容器中快速旋转，使其受到离心力，从而可使从液体中逸出的气体上升，并从旋风器顶部将其取出或移出，而同时已脱气的液体可以以反方向(例如向下)流动。

可使用机械真空脱气器来使含水液体脱气。这可以是施加真空(或减压)的泵。可承受减压或可生成真空的改进的(例如离心的)泵是可购得的。优选地，真空泵具有旋转室，在其中气泡可被从含水液体移出，例如在离心力的作用下。

其它类型的装置包括除气泵。这可以对溶解气体的液体进行脱气。该泵可具有(例如，联锁的)真空泵。它可在没有任何化学添加剂的条件下进行除气。这样的系统能够脱气至0.5ppm或更低的水平。其流率可为25升/分钟或更小。合适的除气泵可从日本的Yokota制造公司获得。

3.调节粘度

可通过加热含水液体来增加粘度。此加热也可导致脱气。

粘度下降可使含水液体中的气体更有效地移至含水液体表面。因此，减小粘度的方法可促进脱气过程。这可通过添加例如水的另一种溶液(其本身是脱气的，或与含水溶液相比空气/氧气含量较少)来实现，并因此本方法可包括稀释。由于存在细胞和用于细胞同化的碳源和/或氮源，含水液体的粘度通常相当大。

减小粘度的另一种方法是加热含水液体。温度的升高降低了氧气在液体中的溶解度。

4.调节pH

可制备酸性更大的含水溶液。这可使空气/氧气在其中的溶解度下降。

应当认识到，含水溶液包含可合成有用化合物的活细胞。细胞“呼吸”是指它们消耗氧气并释放二氧化碳。二氧化碳可溶于含水液体，因而生成碳酸。通过降低pH，可使含水溶液酸性更高，从而降低二氧化碳(或氧气)在其中的溶解度。

5.过滤

含水液体可通过能够去除小气泡(例如空气小气泡)的过滤器或膜。这可在较小规模上进行。过滤器或膜优选包含惰性材料，例如聚合物。该材料(例如聚合物)可包含卤化烯烃，例如PTFE。

因而可使含水液体通过(例如，小的，或较细的)管或毛细管。其可在壁面包含聚合物或具有聚合物的涂层，聚合物例如是PTFE。管可具有洞或孔，溶解的气体或气泡和从其中通过。含水液体可在压力下通过这些管或毛细管。

6.气体置换

这包括置换或替换含水液体中的氧气或空气(溶解的或以其他方式存在的)。可用多种气体替换空气或氧气，只要，优选地，将溶解的氧气挤出溶液，然后氧气可离开含水液体。优选的是惰性气体(例如氮气)或稀有气体(例如氦气)。气体可被供至含水液体的上方、顶部(例如发酵罐的顶部空间)。例如，它可以被添加或供给至例如容器(例如发酵罐)中的液体上方的顶部空间。或者，可例如通过鼓泡或使用喷射器来将气体可供给至含水液体。优选的气体是氮气，但是可使用含氮气的气体(但氧气量减少，例如小于20％或小于10％或15％，使其低于大气中的水平)。

优选的工艺是在发酵结束之前减少供给至含水液体的空气(或氧气)的量或停止供给。首先，例如，在发酵结束前至少一个或两个小时，无空气例如通过喷射器供给。代替通过喷射器供给空气，可供给除空气或氧气外的气体，例如氧气含量低的气体(例如氮气)。因而，优选地，可在发酵结束前用一个或两个小时将氮气供给至含水液体。这可在含水液体上方形成惰性的或氧气含量降低(例如，富含氮气)的气氛，例如比大气的氮气含量高的气氛。含水液体上方的氮气压力可为0.4-0.8bar，例如约0.6bar。

7.化学脱气

这可通过使用可有利地与空气反应或更重要地与空气中的氧气反应的物质或化学制剂来实现。该物质可为除氧剂。可使此物质与含水液体接触。可例如在含水液体处于容器(例如发酵罐)中时将化学制剂添加至含水液体。合适的氧气反应材料(包括除氧剂)在本领域中是公知的，包括碱金属(例如钠)亚硫酸盐和含肼的化合物。如果PUFA或油将用于食品，则可采用其它(非化学)脱气方法。

8.时间

在静置时，含水液体会缓慢地释放出其中溶解的气体，例如氧气和空气。溶解的气体可从含水液体中扩散出来。因此，气体可随时间逐渐地从溶液中移出。

测定空气/氧气含量

这可通过本领域的标准技术来完成。例如，可使用EGT(夹带气体测试器)。可通过在线技术在含水液体(实际上是微生物细胞悬浮液)中测量空气的量。

可通过在测量单元中压缩样品对夹带的气体(气泡)进行测量。然后通过Boyle法则(pV为常数)来计算夹带气体的体积分数。另一方面，可通过使样品膨胀来测量可被释放的溶解气体。这模拟了压力的骤降。由于测量单元中的压力下降，气体的溶解度降低，从而被释放。悬浮液的体积因而增大。此操作可以是全自动的和/或可包括在线气体分析仪(在系统中的适当位置，合适在脱气后)。

脱气可导致O₂含量(在含水液体中)小于20或15ppm，例如2或5至15或20ppm。(例如溶解的)氧气的浓度可优选小于10ppm，例如小于5ppm，最优选小于2ppm。

优选地，发生脱气以使(溶解的)氧气的浓度小于0.03cc/l(44ppb)，优选小于0.005cc/l(7ppb)。

有利地，可对(根据本发明，通过对含细胞的含水液体进行脱气而得到的)脱气含水液体进行增压和/或升温。可在例如对细胞进行加热和/或巴氏灭菌时采用增加的压力和升高的温度。

在一种优选的实施方式中，根据本发明的方法包括使脱气含水液体经受至少1bara，优选至少1.5bara，优选至少2bara，优选至少2bara，优选至少5bara的压力。对于压力并无具体上限。例如可使脱气含水液体经受的压力低于40bar，例如低于20bar。

在一种优选的实施方式中，根据本发明的方法包括使脱气含水液体经受至少60℃，优选至少80℃，优选至少90℃，优选至少100℃，优选至少110℃的温度。对于温度并无具体上限。例如可使脱气含水液体经受的温度低于150℃。

优选地，可经历升温和/或增压的脱水含水液体具有本文公开的优选的O₂含量和/或优选的(溶解的)氧气的浓度

巴氏灭菌工艺

巴氏灭菌通常在脱气和/或发酵完成后发生。在一种优选的实施方式中，巴氏灭菌会结束发酵，因为巴氏灭菌时的加热会杀死细胞。因此，可对发酵培养液(或在液体(含水)介质中的细胞)进行巴氏灭菌，但是可对由培养液得到的微生物生物质进行巴氏灭菌。在前一种情况下，巴氏灭菌可在微生物细胞仍处于发酵罐内时发生。巴氏灭菌优选在对微生物细胞进行任何进一步处理(例如粒化(例如通过挤压)、粉碎或捏合)之前发生。

发酵完成后，发酵培养液可被过滤或进行其它处理以去除水或含水液体。去除水之后，可得到生物质“饼”。如果还未发生巴氏灭菌，则可对脱水细胞(生物质饼)进行巴氏灭菌。

可通过直接或间接加热(细胞)来进行巴氏灭菌。可通过将蒸汽通入发酵罐来进行直接加热。间接方法可使用通过换热器的介质，透过发酵罐的壁，或使用加热线圈，或外部换热器(例如板式换热器)。

通常，巴氏灭菌在已发生发酵的发酵容器中进行。然而，对某些生物体(例如细菌)，通常优选首先从容器中移出细胞，然后再进行巴氏灭菌。巴氏灭菌可在对生物体进行其它处理(例如干燥或粒化)前发生。

巴氏灭菌通常会杀死大多数(如果不是全部的话)微生物体。巴氏灭菌后，可能至少95％、96％或甚至98％的微生物体已被杀死，即是说，它们不是活的。

可在任何合适的温度下对细胞进行加热或巴氏灭菌，优选温度至少为60℃，优选至少80℃，优选至少90℃，优选至少100℃，优选至少110℃。对于温度并无具体上限。巴氏灭菌可例如在低于150℃的温度下进行。优选的巴氏灭菌方法在WO97/37032和WO-A-04/001021中有所描述。

提取PUFA

本发明可包括从(例如已巴氏灭菌的)细胞提取和/或分离PUFA。优选地，这是在发酵之后并且(可选地)还在巴氏灭菌之后。

提取可首先从添加碱土金属卤化物(例如氯化钙)开始。(然后)可将细胞进行过滤、洗涤和/或挤压，从而形成湿饼。

然后可对微生物细胞进行挤出，如果需要，对得到的挤出颗粒或挤出物进行干燥。然后得到的干燥颗粒或干燥生物质可用于提取一种PUFA，优选含一种或更多种PUFA的油。优选的用于从微生物细胞制备含PUFA的油的提取方法在国际专利申请No.PCT/EP99/01446(WO97/36996)、No.PCT/EP97/01448(WO97/37032)和No.PCT/EP01/08903(WO02/10423)中有描述。

多不饱和脂肪酸(PUFA)和微生物油

PUFA可以是单一的PUFA也可以是两种或更多种不同的PUFA。所述或每种PUFA可以是n-3或n-6族的。其优选为C₁₈、C₂₀或C₂₂PUFA。其可为具有至少18个碳原子和/或至少3或4个双键的PUFA。PUFA可以以游离脂肪酸、盐的形式，作为脂肪酸酯(例如甲酯或乙酯)，作为磷脂和/或以甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯的形式来提供。

合适的(n-3和n-6)PUFA包括：

二十二碳六烯酸(DHA，22:6Ω3)，合适地来源于藻类或真菌，例如(沟鞭藻，dinoflagellate)寇氏隐甲藻(Crypthecodinium)或(真菌)破囊壶菌(Thraustochytrium)；

γ-亚麻酸(GLA，18:3Ω6)；

α-亚麻酸(ALA，18:3Ω3)；

共轭亚麻酸(十八碳二烯酸，CLA)；

二高-γ-亚麻酸(DGLA，20:3Ω6)；

花生四烯酸(ARA，20:4Ω6)；和

二十碳五烯酸(EPA，20:5Ω3)。

优选的PUFA包括花生四烯酸(ARA)、二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)和/或γ-亚麻酸(GLA)。特别优选的是ARA。

在本发明的方法中可通过经巴氏灭菌的细胞(例如微生物细胞)来生产PUFA。这可以是细菌、藻类、真菌或酵母菌细胞。真菌是优选的，优选属于毛霉(Mucorales)目，例如被孢霉属(Mortierella)、须霉属(Phycomyces)、布拉霉属(Blakeslea)、曲霉属(Aspergillus)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)、腐霉属(Pythium)或虫霉属(Entomphthora)。ARA优选来源于高山被孢霉(Mortierella alpina)、三孢布拉霉(Blakeslea trispora)、土曲霉(Aspergillus terrus)或Pythium insidiosum。藻类可以是沟鞭藻和/或包括Porphyridium、Nitszchia或Crypthecodinium(例如Crypthecodiniumcohnii)。酵母菌包括毕赤氏酵母(Pichia)属或糖酵母(Saccharomyces)属，例如Pichiaciferii。细菌可以是丙酸杆菌(Propionibacterium)属。微生物油可以是液体(在室温下)。

优选大多数PUFA是以甘油三酯的形式。因此，优选至少50％、例如至少60％或最优选至少70％的PUFA是以甘油三酯的形式。但是，甘油三酯的量可以更高，例如是油的至少85％，优选至少90％，最优选至少93％或95％。这些甘油三酯中，优选至少40％、例如至少50％、最优选至少60％的PUFA存在于甘油的a位(位于甘油三酯骨架)，也称为1位或3位。优选至少20％、例如至少30％、最优选至少40％的PUFA是在b(2)位上。

微生物油可包含至少10％、35％、40％或45％或更多的所需PUFA(例如花生四烯酸)。其甘油三酯含量可为至少90％，例如92-94％。通常，微生物油的二十碳五烯酸(EPA)含量小于5％，优选小于1％，更优选小于0.5％。油中的C₂₀、C_20:3、C_22:0和/或C_24:0脂肪酸的每一种的含量可小于5％、小于2％、小于1％。游离脂肪酸(FFA)的含量可不大于1.0、0.4、0.2或0.1。油中可含很少或不含GLA和/或DGLA。

微生物油可以是粗制油。已通过使用例如有机液体(例如己烷或异丙醇)的溶剂将其从细胞中提取出来。

PUFA提取工艺

然后可从(已巴氏灭菌的)微生物细胞中将PUFA(或微生物油，通常包含PUFA)提取出来。优选地，从含细胞的(例如干燥的)颗粒(例如挤出物)中将其提取出来。提取可利用溶剂来进行。优选使用非极性溶剂，例如C_1-8、优选C_2-6烷烃，例如己烷。

优选地，使溶剂在干燥颗粒上渗透。WO-A-97/37032中描述了合适的微生物粒化和挤出技术以及随后对含PUFA的微生物油的提取。

利用溶剂可以得到含PUFA的粗制油。此油可以不进行进一步处理而以所述状态使用，或可使其经历一个或更多个精制步骤。然而，粗制油通常含有溶剂，例如用于提取油的溶剂(例如己烷，或例如异丙醇的醇)，或者粗制油并未进行后续精制步骤中的一个(或优选全部)。合适的精制方法在国际专利申请No.PCT/EP01/08902(此文献以及所有其它文献的内容通过引用被包含在本文中)中有所描述。例如，可使油经历一个或更多个精制步骤，可包括酸处理或脱胶、碱处理或游离脂肪酸去除、漂白或色素去除、过滤、冬化(或冷却，例如去除饱和甘油三酯)、除臭(或去除游离脂肪酸)和/或精加工(或去除不溶于油的物质)。所有这些精制步骤在PCT/EP01/08902中有更详细的描述，并经过必要的调整可用于本申请所述的步骤。

所得的油特别具有营养价值，可被添加至(人类)食品或(动物)饲料中。例子包括牛奶、婴儿配方、健康饮料、面包以及动物饲料。

细胞

细胞可以是任何可从其中得到油或PUFA的细胞。优选地，细胞是微生物细胞。用于本发明的微生物细胞(或微生物体)可以是在前面所述的特别是与PUFA和微生物油相关的部分中所述的那些微生物细胞。它们可以包含或能够生成PUFA或微生物油，并且可合适地将PUFA油从细胞中提取或分离。它们可以是丝状的，如真菌或细菌，或单细胞，如酵母菌、藻类和细菌。细胞可包含微生物体，该微生物体可为酵母菌、真菌、细菌或藻类。优选的真菌属于毛霉目，例如真菌可以是被孢霉属、须霉属、布拉霉属或曲霉属。优选的真菌是高山被孢霉种、三孢布拉霉种和土曲霉种。酵母菌优选的是毕赤氏酵母属(例如Pichia ciferii种)或糖酵母属。细菌可以是丙酸杆菌属。如果细胞来源于藻类，则藻类优选沟鞭藻和/或属于Crypthecodinium或Daniella种。优选的藻类是Crypthecodinium cohnii种或Daniellasalina种。

过氧化值(POV)

优选地，(微生物)油的POV为3至8或12。然而，用本发明的方法可得到较低的POV值，这些值可小于10.0或小于8.0。可采用本领域已知的技术来测量POV，例如根据AOCS Cd-8-53。(POV的)单位通常为meq/kg。

茴香胺值(AnV)

此值可给出醛含量的量度。优选地，(微生物)油的茴香胺值为5、6、7或10至15、20或25。合适地，AnV不大于20，例如不大于15。还可以不大于10甚至不大于5或2。(优选实验中的)AnV值为5-15，最优选7-12。优选地，AnV为2或5至12或15。可采用本领域已知的技术来测量AnV，例如根据AOCS Cd-18-90。

油和PUFA的用途

本发明的另一方面涉及包含油和(如果合适)或更多(另外的)物质的组合物。所述组合物可以是动物或人类的食品和/或食品添加剂。如果需要，通常通过对从微生物得到的油进行精制或纯化，可使该油适于人类食用。

此组合物可以是婴儿配方或(人类)食品。这里，可对配方的组合物进行调节以使其具有与正常母乳接近的脂类或PUFA含量。这可以包括将本发明的微生物油与其它油混合以获得适当的组合物。

此组合物可以是动物或水生动物的饲料组合物或添加剂。这样的饲料和添加剂可供给任何家畜，特别是羊、牛和家禽。此外，饲料或添加剂可供给养殖的水生生物，例如鱼和贝类。因此，针对这些动物，本组合物可包含一种或更多种饲料物质或成分。

本发明的油可以是粗制油或精制油。它可作为油而直接出售，并且装于适当的包装中，包装通常为内部涂布环氧酚醛漆并充以氮气的铝瓶。油可含有一种或更多种抗氧化剂(例如，生育酚、维生素E、棕榈酸酯)，其中每种抗氧化剂的浓度例如为50-800ppm，例如100-700ppm。

合适的组合物可包括(例如口服的)药物或兽药组合物，或化妆品组合物。油可以直接服用，或可将油封装在例如外壳中，因而形成胶囊。外壳或胶囊壳包含明胶和/或甘油。组合物可包含其它成分，例如调味剂(例如柠檬或莱檬味)或药物或兽药可接受的载体或赋形剂。

消泡剂

脱气时可在含水液体中形成气泡。这可在除气过程中发生，因为气体从溶液中出来并(作为气泡)朝着含水液体的表面上升。显然，这可在含水液体顶部形成泡沫。如果不需要泡沫，则可通过向含水液体添加一种或更多种消泡剂来减少或防止泡沫形成。这样的消泡剂在本领域中是已知的，因此可使用适当的消泡剂，例如磷酸三丁酯。消泡剂优选具有疏水性，并可不溶于水。其可包含例如由极性基团改性的非极性烃链。优选的消泡剂包括硅油、石蜡、烷氧基化脂肪醇和/或聚二醇。

优选的化学脱气剂包括脂族醇、脂肪酸酯、乙氧基化脂肪酸、脂肪酸聚醚和/或脂肪醇。

特别是如果微生物细胞将被加热(例如需要将其杀死或进行巴氏灭菌)，脱气可具有其它优点。在加热或巴氏灭菌时，可使细胞或含水液体(或包含适当阶段的细胞的任意组合物)经受高温和/或高压。这会使气体突然地或猛烈地离开含水液体，例如可在生物细胞输送过程中引起泵的气蚀。这是不期望的，因其可导致细胞壁破裂，即细胞破碎。因此，前面的脱气步骤可减少高温或高压时(例如在加热或巴氏灭菌时)可能引起的问题。

设备(例如工业过程设备)

本发明的第二方面涉及适用于进行第一方面的方法的设备。因此，第二方面可包括：

(a)培养(或发酵)微生物细胞的装置(例如发酵罐)，可选地连接至；

(b)对包含微生物细胞的含水液体进行脱气的装置；和

(c)可选的，从微生物细胞中得到(成品)油的装置。

在一种实施方式中，(b)中的脱气可在细胞(仍)在发酵罐内时发生。在另一种实施方式中，脱气装置可与(b)中的脱气装置分离(虽然可选地与其连接)。因此，细胞和培养基(例如培养液)可(直接地)通入或输送至(b)中的脱气装置。还可以有用于巴氏灭菌的装置。在(b)中的脱气之后，脱气的液体可输送至或通入巴氏灭菌装置或液体(和细胞)在其中进行巴氏灭菌的容器。每种装置以特定的顺序定位，以第一方面的方法的阶段的顺序排列。

在优选的系统中，含水液体可从发酵罐输送至(合适的管式)加热系统。含水液体可被(预)加热，这可引起其内部脱气。液体可被加热至40-80℃，例如50-70℃，例如55-65℃。因而加热(或预加热阶段)可成为脱气系统的一部分。可通过添加水(稀释技术)和/或蒸汽(气体替换技术)来进一步促进脱气。上述之一或两者可在(预)加热之前发生。

在例如预加热之后，可使含水液体经历进一步脱气阶段，例如真空或减压。然后可对液体进行巴氏灭菌。

本发明的一个方面的优选特点和特征经必要修正后可适用于另一个方面。

现在通过参考以下实施例来描述本发明，这些实施例仅作为示例而无意于限制本发明的范围。

对比实施例1和实施例2-4(发酵罐内的脱气)

在一些包括对真菌生物质(高山被孢霉)进行巴氏灭菌的实验中，出现了一定的氧化。可能的解释是发酵培养液中空气的存在导致了化学氧化，特别是在高温下。虽然微生物细胞需要空气来存活和生物合成PUFA，但还是决定在巴氏灭菌(热休克(heat shock)处理)之前对发酵培养液进行脱气。

用现有技术已描述的方法对真菌生物质(高山被孢霉)进行发酵。发酵以与WO97/36996所述类似的方式进行发酵(见实施例)。发酵持续约150-200小时。将培养液从发酵罐经由小容器(容量350升)输送至巴氏灭菌装置。

对发酵培养液进行大量发酵时间为150-200小时的相似的发酵试验。

在第一组实验中，使用各种脱气方法直接对仍在发酵罐内的培养液进行试验，包括在发酵结束前2小时内停止通过喷射器将空气鼓泡进入培养液(实施例2)以及用氮气置换发酵培养液上方的顶部空间中的空气(实施例3和4)。对于对比实施例1，不进行脱气。

对由热休克试验得到的干燥生物质进行TPC(总板数)分析。TPC结果并未偏离对在标准条件下进行巴氏灭菌的培养液所测量的结果。培养液(在脱气和巴氏灭菌之后)被用于分离含花生四烯酸(ARA)的微生物/单细胞油。对花生四烯酸粗制油进行回收和分析。回收系统包括(在对培养液进行脱气和巴氏灭菌之后)添加氯化钙、过滤/洗涤和挤压，从而形成湿饼。然后挤出此湿饼以形成挤出物，对其进行干燥，将得到的干燥生物质进行提取。

近似地，1升培养液包含约45-55克干燥生物质，以及约30-35％的油。

使用以下的实验室规模的回收方法。用实验室玻璃容器添加氯化钙(氯化钙薄片和水)。用CaCl₂.2H₂O配制25wt％的氯化钙溶液。将24克该溶液添加至1升已巴氏灭菌的培养液中，并充分混合。

用过滤来模拟膜压滤机，使用具有Sefar Fyltis AM25116滤布的1升的“赛氏”过滤器。在0.5-1bar的氮气下过滤1升的培养液。然后降低压力并添加0.6倍培养液体积的洗涤水，在添加水时不扰动滤饼。在0.5-1bar下洗涤滤饼，然后用1分钟将滤饼吹干。

然后用采用Pannevis滤布材料的Pannevis实验室规模的带式过滤器进行真空过滤。使用约400-500ml培养液，过滤至压力为0.45bara(真空度-0.55bar)。然后，添加0.6倍培养液体积的洗涤水，在0.45bara的压力下洗涤滤饼。然后将滤饼抽干。

然后在板间挤压生物质，直到不再有水被挤出。这通过使用粗棉布来完成。

然后用绞肉(Victoria)挤出机来进行挤出。然后用流化床干燥器(入口温度为50℃，流率设定为“5”)对所得颗粒干燥30分钟。干燥物质占91-96％。

然后进行提取，以500ml己烷在环境温度下对100克干燥生物质提取60分钟。倒出己烷，并用250ml新鲜的己烷在环境温度下洗涤滤饼30分钟。倒出己烷并添加至先前已提取的己烷中。使用玻璃过滤器通过真空过滤来净化提取物。

蒸发包括在60-70℃的水浴温度、200mbara下，在旋转蒸发器中用5-10分钟闪蒸出主体己烷。还可在相同的温度下，在低于100mbar的压力下，用5-10分钟蒸发剩余的己烷。为了使氧化最小化，用氮气来对该系统进行减压。

然后分析得到的含ARA的油的POV和AnV含量，如以下表1所示。

表1

*通过发酵罐中1.8-2bar的顶部压力来输送培养液

从表1中的数据可看出，培养液中空气量的减少导致POV和/或AnV的改善。基于这些结果，可认为脱气能够减少氧化，并改善POV和AnV值。然后进行另一个试验，采用更大的体积，并使用独立的脱气器。

实施例5-14(独立的脱气器)

安装永久式脱气系统，其具有“伞形喷嘴”，工作压力低于500mbara。通过低剪切泵(monho泵)来将发酵培养液从发酵罐输送至脱气器。

安装脱气系统(在发酵之后但在巴氏灭菌前)，用APV脱气系统来模拟伞形脱气器。发酵罐与脱气器相连，并在0.5bar的输送压力下输送培养液。脱气器连接至真空泵。在通过脱气器之后，在送去进行使用热休克处理装置(也是APV)的巴氏灭菌之前，将生物质(通过monho泵)送入存储罐中。monho泵的流率为10m³/h，脱气器内的压力为400mbara。

表2列出了用此脱气装置进行的试验的结果。微生物油的分离和分析如前所述。

表2

Claims

1.一种生产油或多不饱和脂肪酸的方法，所述方法包括：

(a)在发酵过程中对包含细胞的含水液体进行脱气；和

(b)从所述细胞获取所述油或多不饱和脂肪酸，

其中所述脱气导致溶解的氧气的浓度小于10ppm，其中所述细胞是微生物细胞，所述微生物为高山被孢霉(Mortierella alpina)，其中在(a)中的脱气之后但在阶段(b)之前对所述细胞进行加热或巴氏灭菌，且其中所述含水液体是发酵培养液。

2.如权利要求1的方法，所述方法还包括：

(c)提取、纯化或分离所述油或一种或更多种多不饱和脂肪酸。

3.如权利要求1-2中任何一项的方法，其中脱气包括：

a)施加真空；

b)机械脱气/除气；

c)改变粘度；

d)改变发酵条件；

e)改变pH；

f)过滤；

g)气体置换，用惰性气体、稀有气体或蒸汽；

h)化学脱气；

i)时间，在可使氧气或空气从所述液体中扩散出来的条件下静置所述含水液体；或

所述(a)至(i)的方法中的一种或更多种的组合。

4.如权利要求3的方法，其中所述步骤b)的机械脱气/除气是通过搅拌、振动、使用加速力或重力进行的。

5.如权利要求4的方法，其中所述步骤b)的机械脱气/除气是通过在离心机或旋风器中使用加速力或重力进行的。

6.如权利要求3的方法，其中所述步骤c)的改变粘度是通过用水或其它液体稀释，或通过升高温度进行的。

7.如权利要求3的方法，其中所述步骤d)的改变发酵条件是在发酵时减少空气提升、空气喷射或氧气或空气供给，或降低搅拌速率。

8.如权利要求3的方法，其中所述步骤e)的改变pH是通过降低pH或进行酸化进行的。

9.如权利要求3的方法，其中所述步骤f)的过滤是通过使用膜或过滤器进行的。

10.如权利要求9的方法，其中所述膜或过滤器包含聚合物。

11.如权利要求10的方法，其中所述聚合物是惰性聚合物。

12.如权利要求10的方法，其中所述聚合物是PTFE。

13.如权利要求3的方法，其中所述惰性气体是氮气。

14.如权利要求3的方法，其中所述稀有气体是氦气。

15.如权利要求3的方法，其中所述步骤h)的化学脱气是通过使用除氧剂进行的。

16.如权利要求15的方法，其中所述除氧剂是亚硫酸钠或肼。

17.如权利要求1或权利要求2的方法，其中所述脱气是通过减少搅拌和/或气体置换进行的。

18.如权利要求17的方法，其中使用不含氧气或所含氧气浓度水平低于大气的气体来进行气体置换。

19.如权利要求17的方法，其中所述气体是或包含氮气。

20.如权利要求1或权利要求2的方法，其中脱气包括使所述含水液体经受减压。

21.如权利要求20的方法，其中所述减压是不大于800mbara的压力。

22.如权利要求20的方法，其中所述减压是不大于600mbara的压力。

23.如权利要求20的方法，其中使用真空或除气泵、伞形脱气器或伞形喷嘴对所述含水液体进行脱气。

24.如权利要求1或权利要求2的方法，其中脱气导致溶解的氧气的浓度小于5ppm。

25.如权利要求1或权利要求2的方法，其中脱气导致溶解的氧气的浓度小于2ppm。

26.如权利要求1或权利要求2的方法，其中所述方法包括使所述已脱气的含水液体经受

(i)大于1bara的压力；和/或

(ii)大于60℃的温度。

27.如权利要求26的方法，其中所述方法包括使所述已脱气的含水液体经受大于1.5bara的压力。

28.如权利要求26的方法，其中所述方法包括使所述已脱气的含水液体经受大于2bara的压力。

29.如权利要求26的方法，其中所述方法包括使所述已脱气的含水液体经受大于80℃的温度。

30.如权利要求26的方法，其中所述方法包括使所述已脱气的含水液体经受大于100℃的温度。

31.如权利要求1或权利要求2的方法，其中在大于80℃的温度下对所述细胞进行加热或巴氏灭菌。

32.如权利要求31的方法，其中在大于90℃的温度下对所述细胞进行加热或巴氏灭菌。

33.如权利要求31的方法，其中在大于100℃的温度下对所述细胞进行加热或巴氏灭菌。

34.如权利要求1或权利要求2的方法，其中所述多不饱和脂肪酸或油包含C₁₈、C₂₀或C₂₂的Ω-3或Ω-6族的多不饱和脂肪酸。

35.如权利要求34的方法，其中所述多不饱和脂肪酸或油包含ARA、EPA、DHA和/或GLA。

36.如权利要求1或权利要求2的方法，其中(b)包括从所述细胞获取含多不饱和脂肪酸的油，所述油的POV小于12和/或AnV小于20。