KR20210152583A - Pd-1에 대한 사람 항체 - Google Patents

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니콜라스 제이. 파파도풀로스
앤드류 제이. 머피
가빈 서스턴
엘라 이오페
엘레나 부로바
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리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
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Abstract

본 발명은 T-세포 공-억제제 예정 사멸 인자-1(PD-1) 단백질에 결합하는 항체, 및 사용 방법을 제공한다. 본 발명의 다양한 양태에서, 상기 항체는 PD-1에 결합하는 완전 사람 항체이다. 특정 양태에서, 본 발명은 PD-1에 결합하는 제1 결합 특이성, 및 자가면역 조직 항원, 또 다른 T-세포 공-억제제, Fc 수용체 또는 T-세포 수용체에 결합하는 제2 결합 특이성을 포함하는 다중-특이적 항원-결합 분자를 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체는 PD-1 활성을 억제하거나 중화함으로써 암 또는 만성 바이러스 감염과 같은 질환 또는 장애의 치료 수단을 제공하는데 유용하다. 다른 양태에서, 상기 항체는 PD-1 활성을 증진시키거나 자극함으로써, 예를 들면, 자가면역 질환 또는 장애의 치료 수단을 제공하는데 유용하다.

Description

PD-1에 대한 사람 항체{HUMAN ANTIBODIES TO PD-1}
본 발명은 면역조절 수용체 예정 사멸 인자-1(programmed death-1; PD-1)에 특이적으로 결합하는 사람 항체 및 사람 항체의 항원-결합 단편, 및 이들 항체를 사용하는 치료 및 진단 방법에 관한 것이다.
예정 사멸 인자-1(PD-1)(CD279로도 지칭됨)은 활성화된 T-세포 및 B-세포, 자연 살해 세포 및 단핵구 상에서 발현되는 288개의 아미노산 단백질 수용체이다. PD-1은 T-세포 공-억제 수용체의 CD28/CTLA-4(세포독성 T 림프구 항원)/ICOS(유도가능 공-자극물질) 패밀리의 일원이다(Chen et al 2013, Nat. Rev. Immunol. 13: 227-242). PD-1의 주요 기능은 면역 반응을 약화시키는 것이다(Riley 2009, Immunol. Rev. 229: 114-125). PD-1은 2개의 리간드, PD-리간드1 (PD-L1) 및 PD-L2를 갖는다. PD-L1(CD274, B7H1)은 림프 및 비-림프 조직 둘 모두, 예를 들면, CD4 및 CD8 T-세포, 대식세포 계통 세포, 말초 조직 뿐만 아니라 종양 세포, 바이러스 감염된 세포 및 자가면역 조직 세포 상에서 광범위하게 발현된다. PD-L2(CD273, B7-DC)는 PD-L1보다 더 제한적으로 발현되며, 활성화된 수지상 세포 및 대식세포 상에서 발현된다(Dong et al 1999, Nature Med.). PD-L1은 흑색종, 신경아교종, 비-소세포 폐암, 두경부의 편평세포 암종, 백혈병, 췌장암, 신장세포 암종 및 간세포 암종을 포함하는 대부분의 사람 암에서 발현되며, 거의 모든 암 유형에서 유도가능할 수 있다(Zou and Chen 2008, Nat. Rev. Immunol. 8: 467-77). PD-1의 이의 리간드에의 결합은 T-세포 증식 및 사이토카인 분비의 감소를 초래하고, 암, 바이러스 감염 및 자가면역 질환과 같은 질환에서 체액 및 세포 면역 반응을 손상시킨다. 면역억제를 역전시키는 PD-1 결합의 차단은 자가면역, 바이러스 및 종양 면역요법에서 연구되었다(Ribas 2012, NEJM 366: 2517-2519; Watanabe et al 2012, Clin. Dev. Immunol. Volume 2012, Article ID: 269756; Wang et al 2013, J. Viral Hep. 20: 27-39).
T-세포 공-자극 및 공-억제 분자(총괄하여 공-시그널링 분자로 명명됨)는 T-세포 활성화의 조절, 서브셋 분화, 효과기(effector) 기능 및 생존에서 중대한 역할을 한다(Chen et al 2013, Nature Rev. Immunol. 13: 227-242). 항원-전달 세포 상의 동족(cognate) 펩타이드-MHC 복합체의 T-세포 수용체에 의한 인식 후, 공-시그널링 수용체는 면역 시냅스에서 T-세포 수용체와 함께 공동-국소화되고, 여기서 이들은 T-세포 활성화 및 기능을 촉진시키거나 억제하도록 TCR 시그널링과 상승작용한다(Flies et al 2011, Yale J. Biol. Med. 84: 409-421). 궁극적인 면역 반응은 공-자극과 공-억제 신호들("면역 체크포인트들") 간의 균형에 의해 조절된다(Pardoll 2012, Nature 12: 252-264). PD-1은 말초 T-세포 내성을 매개하고 자가면역을 피하는데 있어서 하나의 이러한 '면역 체크포인트'로서 기능한다. PD-1은 PD-L1 또는 PD-L2에 결합하여 T-세포 활성화를 억제한다. T-세포 활성화를 억제하는 PD1의 능력은 면역 반응을 피하기 위한 만성 바이러스 감염 및 종양에 의해 활용된다. 만성 바이러스 감염에서, PD-1은 바이러스-특이적 T-세포에서 고도로 발현되며, 이들 T-세포는 효과기 기능 및 증식능(proliferative capacity)의 손실과 함께 "고갈(exhausted)"된다(Freeman 2008, PNAS 105: 10275-10276). PD-L1은 광범위한 종양에서 발현되며, 동물 모델에서의 연구에 의하면 종양에서의 PD-L1은 T-세포 활성화 및 종양 세포의 용해를 억제하고 종양-특이적 T-세포의 사멸을 증가시킬 수 있는 것으로 나타났다. PD-1:PD-L1 시스템은 또한 유도된 T-조절(Treg) 세포 발달 및 Treg 기능 유지에 중요한 역할을 한다(Francisco et al 2010, Immunol. Rev. 236: 219-242).
PD-1이 자가면역, 종양 면역 및 감염 면역에서 중요한 역할을 하기 때문에, 이는 면역요법을 위한 이상적인 표적이다. PD-1의 모노클로날 항체를 포함하는 길항제에 대한 차단은 암 및 만성 바이러스 감염의 치료에서 연구되었다(Sheridan 2012, Nature Biotechnology 30: 729-730).
PD-1에 대한 모노클로날 항체는 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, US 특허/공보 8008449, 8168757, 20110008369, 20130017199, 20130022595, 및 WO2006121168, WO20091154335, WO2012145493, WO2013014668, WO2009101611, EP2262837, 및 EP2504028에 기재되었다.
본 발명은 PD-1과 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 본 발명의 항체는, 특히, PD-1을 발현하는 T 세포를 표적화하고 PD-1 활성을 조절하는데 유용하다. 특정 양태에서, 본 발명의 항체는 PD-1 활성의 억제 또는 중성화(neutralizing) 및/또는 예를 들면, T 세포-매개된 사멸이 유리하거나 바람직한 상황 하에서 T 세포 활성화의 자극에 유용하다. 대안적인 양태에서, 항체는 PD-1 결합 및/또는 활성을 증진시키고 T-세포 활성화를 억제하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 항-PD-1 항체, 또는 이의 항원-결합 부위는, 예를 들면, 면역 반응을 조절하고/하거나 항체를 특정 세포 유형, 예를 들면, 종양 세포, 자가면역 조직 세포 또는 바이러스 감염된 세포로 표적화하도록 다중-특이적 항원-결합 분자의 일부로서 포함될 수 있다. 항체는 암, 바이러스 감염 및 자가면역 질환과 같은 질환 또는 장애의 치료에 유용한다.
본 발명의 항체는 전장 항체(예를 들면, IgG1 또는 IgG4 항체)일 수 있거나 항원-결합 부위(예를 들면, Fab, F(ab')2 또는 scFv 단편)만을 포함할 수 있고, 기능에 영향을 주도록, 예를 들면, 잔존 효과기 기능을 제거하도록 변형될 수 있다(Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933). 특정 양태에서, 항체는 이중특이적일 수 있다.
제1 측면에서, 본 발명은 PD-1에 특이적으로 결합하는 단리된 재조합 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 양태에서, 상기 항체는 완전히 사람이다. 본 발명의 예시적인 항-PD-1 항체는 본원에 표 1 내지 3에 열거되어 있다. 표 1은 예시적인 항-PD-1 항체의 중쇄 가변 영역(HCVR), 경쇄 가변 영역(LCVR), 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3), 및 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)의 아미노산 서열 식별자(identifier)를 기재한다. 표 2는 예시적인 항-PD-1 항체의 HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 핵산 서열 식별자를 기재한다. 표 3은 예시적인 항-PD-1 항체의 중쇄 및 경쇄 서열의 아미노산 서열 식별자를 기재한다.
본 발명은 표 1에 열거된 HCVR 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 HCVR을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 LCVR 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 LCVR을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 LCVR 아미노산 서열 중 어느 것과 쌍을 이룬 표 1에 열거된 HCVR 아미노산 서열 중 어느 것을 포함하는 HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 쌍(HCVR/LCVR)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 양태에 따르면, 본 발명은 표 1에 열거된 예시적인 항-PD-1 항체 중 어느 것 내에 함유된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 양태에서, HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍은 서열 번호: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/202, 218/202, 226/202, 234/202, 242/202, 250/202, 258/202, 266/202, 274/202, 282/202, 290/202, 298/186, 306/186 및 314/186으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 양태에서, HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍은 서열 번호: 130/138(예: H2M7795N), 162/170(예: H2M7798N), 234/202(예: H4xH9048P), 또는 314/186(예: H4xH9008P) 중 하나로부터 선택된다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 HCDR1 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR1(HCDR1)를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 HCDR2 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR2(HCDR2)를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 HCDR3 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR3(HCDR3)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 LCDR1 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 경쇄 CDR1(LCDR1)를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 LCDR2 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 경쇄 CDR2(LCDR2)를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 LCDR3 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 경쇄 CDR3(LCDR3)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 LCDR3 아미노산 서열 중 어느 것과 쌍을 이룬 표 1에 열거된 HCDR3 아미노산 서열 중 어느 것을 포함하는 HCDR3 및 LCDR3 아미노산 서열 쌍(HCDR3/LCDR3)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 양태에 따르면, 본 발명은 표 1에 열거된 예시적인 항-PD-1 항체 중 어느 것 내에 함유된 HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 양태에서, HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍은 서열 번호: 136/144(예: H2M7795N), 168/176(예: H2M7798N), 240/208(예: H4xH9048P), 및 320/192(예: H4xH9008P)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명은 표 3에 열거된 HC 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 3에 열거된 LC 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 3에 열거된 LC 아미노산 서열 중 어느 것과 쌍을 이룬 표 3에 열거된 HC 아미노산 서열 중 어느 것을 포함하는 HC 및 LC 아미노산 서열 쌍(HC/LC)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 양태에 따르면, 본 발명은 표 3에 열거된 예시적인 항-PD-1 항체 중 어느 것 내에 함유된 HC/LC 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 양태에서, HC/LC 아미노산 서열 쌍은 서열 번호: 330/331, 332/333, 334/335, 및 336/337로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 예시적인 항-PD-1 항체 중 어느 것 내에 함유된 6개의 CDR 세트(즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 양태에서, 상기 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트는 서열 번호: 132-134-136-140-142-144(예: H2M7795N); 164-166-168-172-174-176(예: H2M7798N); 236-238-240-204-206-208(예: H4xH9048P); 및 316-318-320-188-190-192(예: H4xH9008P)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
관련 양태에서, 본 발명은 표 1에 열거된 예시적인 항-PD-1 항체 중 어느 것에 의해 정의된 바와 같이 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 내에 함유된 6개의 CDR 세트(즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 서열 번호: 130/138(예: H2M7795N); 162/170(예: H2M7798N); 234/202(예: H4xH9048P); 및 314/186(예: H4xH9008P)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 내에 함유된 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 내에서 CDR을 식별하는 방법 및 기술은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며 본원에 개시된 명시된 HCVR 및/또는 LCVR 아미노산 서열 내에서 CDR을 식별하는데 사용될 수 있다. CDR의 경계를 식별하는데 사용될 수 있는 예시적인 관행은, 예를 들면, 카밧(Kabat) 정의, 초티아(Chothia) 정의 및 AbM 정의를 포함한다. 일반적인 표현으로, 카밧 정의는 서열 가변성을 기초로 하며, 초티아 정의는 구조적 루프 영역의 위치를 기초로 하며, AbM 정의는 카밧과 초티아 접근법 간의 절충이다(참조: Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); 및 Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989)). 공용 데이타베이스도 항체 내의 CDR 서열을 식별하는데 이용가능하다.
본 발명은 변형된 당화 패턴을 갖는 항-PD-1 항체를 포함한다. 일부 양태에서, 바람직하지 않은 당화 부위를 제거하는 변형이 유용할 수 있거나, 또는, 예를 들면, 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC) 기능을 증가시키기 위해 올리고사카라이드 쇄에 존재하는 푸코스(fucose) 모이어티가 결핍된 항체가 유용할 수 있다(참조: Shield et al. (2002) JBC 277:26733). 다른 적용에서, 보체 의존성 세포독성(CDC)을 변형시키기 위해 갈락토실화(galactosylation)의 변형이 이루어질 수 있다.
본 발명은 또한 HCVR의 CDR 및 LCVR의 CDR을 포함하고, 상기 HCVR 및 LCVR 각각은 표 1에 열거된 HCVR 및 LCVR 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 PD-1에 대한 특이적 결합에 대해 경쟁하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 PD-L1 또는 PD-L2에 대한 PD-1 결합을 차단하는 단리된 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 양태에서, PD-L1에 대한 PD-1 결합을 차단하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 PD-L1로서 PD-1 상에 동일한 에피토프에 결합할 수 있거나 PD-L1로서 PD-1 상의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다.
대안적인 양태에서, 본 발명은 PD-L1에 대한 PD-1 결합을 자극하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명은 PD-1과 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 PD-L1에 대한 PD-1 결합을 증진시킨다. 일부 양태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 HCVR의 CDR(여기서 상기 HCVR은 서열 번호: 2, 98 및 250으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다); 및 LCVR의 CDR(여기서, 상기 LCVR은 서열 번호: 10, 106 및 202로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다)을 포함한다. 일부 양태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 2/10(예: H1M7789N), 98/106(예: H2M7791N), 및 250/202(예: H4H9068P2)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함한다.
본 발명은 또한 사람 또는 다른 종으로부터의 PD-1에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 양태에서, 상기 항체는 사람 PD-1 및/또는 사이노몰구스(cynomolgus) PD-1에 결합할 수 있다.
본 발명은 또한 HCVR의 CDR 및 LCVR의 CDR(여기서, 상기 HCVR 및 LCVR은 각각 표 1에 열거된 HCVR 및 LCVR 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다)을 포함하는 참조 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 PD-1에 대한 결합에 대해 교차-경쟁하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 하기 특성들 중 하나 이상을 갖는 단리된 항체 또는 항원-결합 단편을 제공한다: (a) PD-L1 또는 PD-L2에 대한 PD-1의 결합을 차단함; (b) 사람 PD-1 및/또는 사이노몰구스 PD-1에 특이적으로 결합함; (c) PD-1-유도된 T-세포 하향 조절을 차단하고 T-세포 시그널링을 되찾음(rescue); (d) 결장암을 갖는 피험자에서 종양 성장을 억제하고 생존을 증가시킴; (e) 혼합 림프구 반응(mixed lymphocyte reaction: MLR) 검정에서 T-세포 증식을 억제함; 및 (f) MLR 검정에서 IL-2 및/또는 인터페론-감마 분비를 증가시킴.
일부 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 PD-1에 작용제 방식으로 특이적으로 결합할 수 있으며, 즉, PD-1 결합 및/또는 활성을 증진시키거나 자극할 수 있으며; 다른 양태에서, 항체는 PD-1에 길항제 방식으로 특이적으로 결합할 수 있으며, 즉, 이는 PD-1이 이의 리간드에 결합하는 것을 차단할 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 PD-1에 대한 제1 결합 특이성 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이성이다. 제2 표적 에피토프는 PD-1 또는 상이한 단백질 상의 또 다른 에피토프일 수 있다. 특정 양태에서, 표적 에피토프는 상이한 T-세포, B-세포, 종양 세포, 자가면역 조직 세포 또는 바이러스 감염된 세포를 포함하는 상이한 세포 상에 있을 수 있다.
제2 측면에서, 본 발명은 항-PD-1 항체 또는 이의 일부를 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 표 1에 열거된 HCVR 아미노산 서열 중 어느 것을 인코딩하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 양태에서 핵산 분자는 표 2에 열거된 HCVR 핵산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 이에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 LCVR 아미노산 서열 중 어느 것을 인코딩하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 양태에서 핵산 분자는 표 2에 열거된 LCVR 핵산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 이에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 HCDR1 아미노산 서열 중 어느 것을 인코딩하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 양태에서 핵산 분자는 표 2에 열거된 HCDR1 핵산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 이에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 HCDR2 아미노산 서열 중 어느 것을 인코딩하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 양태에서 핵산 분자는 표 2에 열거된 HCDR2 핵산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 이에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 HCDR3 아미노산 서열 중 어느 것을 인코딩하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 양태에서 핵산 분자는 표 2에 열거된 HCDR3 핵산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 이에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 LCDR1 아미노산 서열 중 어느 것을 인코딩하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 양태에서 핵산 분자는 표 2에 열거된 LCDR1 핵산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 이에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 LCDR2 아미노산 서열 중 어느 것을 인코딩하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 양태에서 핵산 분자는 표 2에 열거된 LCDR2 핵산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 이에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 LCDR3 아미노산 서열 중 어느 것을 인코딩하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 양태에서 핵산 분자는 표 2에 열거된 LCDR3 핵산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 이에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 HCVR을 인코딩하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서 상기 HCVR은 3개의 CDR 세트(즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3)를 포함하고, 여기서 상기 HCDR1-HCDR2-HCDR3 아미노산 서열 세트는 표 1에 열거된 예시적인 항-PD-1 항체 중 어느 것에 의해 정의된 바와 같다.
본 발명은 또한 LCVR을 인코딩하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서 상기 LCVR은 3개의 CDR 세트(즉, LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하고, 여기서 상기 LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트는 표 1에 열거된 예시적인 항-PD-1 항체 중 어느 것에 의해 정의된 바와 같다.
본 발명은 또한 HCVR 및 LCVR 둘 모두를 인코딩하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서 상기 HCVR은 표 1에 열거된 HCVR 아미노산 서열 중 어느 것의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCVR은 표 1에 열거된 LCVR 아미노산 서열 중 어느 것의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 HCVR 핵산 서열 중 어느 것으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 이에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열, 및 표 2에 열거된 LCVR 핵산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 이에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다. 본 발명의 이러한 측면에 따르는 특정 양태에서, 핵산 분자는 HCVR 및 LCVR을 인코딩하며, 여기서 상기 HCVR 및 LCVR은 둘다 표 1에 열거된 동일한 항-PD-1 항체로부터 유도된다.
본 발명은 표 3에 열거된 중쇄 아미노산 서열 중 어느 것을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 표 3에 열거된 경쇄 아미노산 서열 중 어느 것을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명은 또한 중쇄(HC) 및 경쇄(LC) 둘 모두를 인코딩하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서 상기 HC는 표 3에 열거된 HC 아미노산 서열 중 어느 것의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LC는 표 3에 열거된 LC 아미노산 서열 중 어느 것의 아미노산 서열을 포함한다.
관련된 측면에서, 본 발명은 항-PD-1 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 상기 언급된 핵산 분자 중 어느 것, 즉, 표 1에 기재된 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 서열 중 어느 것을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함한다. 본 발명은 또한 항-PD-1 항체의 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 상기 언급된 핵산 분자 중 어느 것, 즉, 표 3에 기재된 중쇄 또는 경쇄 서열 중 어느 것을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함한다. 이러한 벡터가 도입되는 숙주 세포, 뿐만 아니라 상기 숙주 세포를 항체 또는 항체 단편의 생산을 허용하는 조건 하에 배양하고 이렇게 생산된 항체 및 항체 단편을 회수함으로써 항체 또는 이의 일부를 생산하는 방법도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
제3 측면에서, 본 발명은 PD-1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 특이성, 및 종양 세포-특이적 항원, 자가면역 조직-특이적 항원, 감염된-세포-특이적 항원, T-세포 공-억제제제, T-세포 수용체, Fc 수용체, PD-L1, 및 PD-1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 특이성을 포함하는 다중-특이적 항원-결합 분자 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 양태에서, 제1 항원-결합 특이성은 표 1에서 HCVR 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCVR로부터 유도된 3개의 CDR, 및 표 1에서 LCVR 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCVR로부터 유도된 3개의 CDR을 포함할 수 있다. 한 양태에서, 제1 항원-결합 특이성은 PD-L1의 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 제2 항원-결합 특이성은 PD-1로서 동일한 세포 상의 또는 동일한 조직 유형 또는 상이한 조직 유형의 상이한 세포 상의 항원을 표적화할 수 있다. 예를 들면, 다중 특이적 항원-결합 분자는 T-세포에 결합할 수 있으며, 여기서 제1 항원-결합 특이성은 PD-1에 특이적으로 결합할 수 있고, 제2 항원-결합 특이성은 T-세포 상의 T-세포 수용체에 결합할 수 있다. 대안적으로, 또 다른 양태에서, 제1 항원-결합 특이성은 T-세포 상의 PD-1에 특이적으로 결합할 수 있고, 제2 항원-결합 특이성은 B-세포 또는 대식세포 또한 항원-전달 세포 상의 항원/수용체에 표적화될 수 있다. 특정 양태에서, 제2 항원-결합 특이성은 자가면역 조직과 관련된 항원에 관한 것일 수 있다. 한 양태에서, 제1 항원-결합 특이성은 PD-L1의 세포외 도메인을 포함할 수 있고, 제2 항원-결합 특이성은 PD-1 상의 또 다른 에피토프에 결합할 수 있다. 특정 양태에서, 제1 항원-결합 특이성은 PD-1에 낮은 친화성으로, 예를 들면, 10-7M 초과, 10-6M 초과, 10-5M 초과 또는 10-4M 초과의 KD로 결합한다.
제4 측면에서, 본 발명은 PD-1과 특이적으로 결합하는 재조합 사람 항체 또는 이의 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 관련된 측면에서, 본 발명은 항-PD-1 항체 및 제2 치료제의 배합물인 조성물을 특징으로 한다. 한 양태에서, 제2 치료제는 항-PD-1 항체와 유리하게 배합되는 임의의 제제이다. 항-PD-1 항체와 유리하게 배합될 수 있는 예시적인 제제는, 제한 없이, PD-1 시그널링과 결합하고/하거나 이를 조절하는 다른 제제(다른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 등을 포함) 및/또는 PD-1과 직접적으로 결합하지는 않지만 그럼에도 면역 세포 활성화를 조절하는 제제들을 포함한다. 본 발명의 항-PD-1 항체를 수반하는 추가의 병용 요법 및 공-제형은 본원의 다른 곳에 개시되어 있다.
제5 측면에서, 본 발명은 피험자에서 면역 반응을 조절하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료적으로 유효량의 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 이를 필요로 하는 피험자에게 투여함을 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명은 피험자에서 면역 반응을 증진시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 PD-1과 결합하고 PD-L1에 대한 PD-1 결합을 차단하는 유효량의 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 상기 피험자에게 투여함을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명은 피험자에서 T-세포 자극을 자극하거나 증진시키는 방법을 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 피험자에서 T-조절(Treg) 세포를 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료적으로 유효량의 본 발명의 차단 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 이를 필요로 하는 피험자에게 투여함을 포함한다. 특정 양태에서, 이를 필요로 하는 피험자는 암 또는 바이러스 감염과 같은 질환 또는 장애를 앓고 있을 수 있다. 대안적인 양태에서, 본 발명은 피험자에서 T-세포 활성화를 억제하거나 저지하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료적으로 유효량의 본 발명의 활성화 항체 또는 이의 단편을 이를 필요로 하는 피험자에게 투여함을 포함한다. 한 양태에서, 상기 피험자는 자가면역 질환 또는 장애를 앓고 있을 수 있다.
제6 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 항체의 항원-결합 부위를 사용하여 피험자에서 암, 자가면역 질환 또는 바이러스 감염과 같은 질환 또는 장애를 치료하는 치료적 방법을 제공하며, 여기서 상기 치료적 방법은 치료적으로 유효량의 본 발명의 항체 또는 항체의 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 피험자에게 투여함을 포함한다. 치료될 장애는 PD-1 활성 또는 시그널링의 자극 또는 억제에 의해 향상되거나, 개선되거나, 억제되거나 예방되는 임의의 질환 또는 병태이다. 특정 양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 치료제와 함께 이를 필요로 하는 피험자에게 투여된다. 제2 치료제는 또 다른 T-세포 공-억제제에 대한 항체, 종양 세포 항원에 대한 항체, T-세포 수용체에 대한 항체, Fc 수용체에 대한 항체, 바이러스 감염된 세포 상의 에피토프에 대한 항체, 자가면역 조직 항원에 대한 항체, PD-L1에 대한 항체, 세포독성제, 항암 약물, 항바이러스 약물, 항염증 약물(예: 코르티코스테로이드), 화학요법제, 방사선 요법, 면역억제제 및 당해 분야에 공지된 임의의 다른 약물 또는 요법으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 특정 양태에서, 제2 치료제는 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 관련된 임의의 가능한 부작용(들)을, 이러한 부작용(들)이 일어날 것이라면, 대항하거나 감소시키는 것을 돕는 제제일 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명은 종양 성장을 저지하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명은 암 환자의 생존을 증진시키는 방법을 제공한다. 암의 예는, 뇌암(예: 다형성 교모세포종), 폐암(예: 비-소세포 폐암), 두경부의 편평세포 암종, 신장세포 암종, 흑색종, 다발성 골수종, 전립선암, 및 결장암을 포함하는, 원발성 및/또는 재발 암을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다. 상기 방법은 치료적으로 유효량의 본 발명의 항-PD-1 항체를, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 길항제(예: 아플리베르셉트(aflibercept), 베바시주맙), 안지오포이에틴-2(Ang2) 억제제(예: 항-Ang2 항체, 예를 들면, 네스바쿠맙), 림프구 활성화 유전자 3(LAG-3) 억제제, 세포독성 T-림프구 항원 4(CTLA-4) 억제제(예: 이플리무맙), 화학요법제, 및 방사선 요법으로 이루어진 그룹으로부 선택된 제2 치료제와 함께 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다. 암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항-PD-1 항체와 함께 사용될 수 있는 추가의 요법/치료제의 추가의 예는 본원의 다른 곳에 기재되어 있다.
항체 또는 이의 단편은 피하로, 정맥내로, 피내로, 복강내로, 경구로, 근육내로 또는 두개내로 투여될 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 피험자의 체중 1kg당 약 0.1mg 내지 약 100mg의 용량으로 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 PD-1 결합 및/또는 시그널링의 차단 또는 증진으로부터 유리할 수 있는 질환 또는 장애의 치료를 위한 약제의 제조에서 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도를 포함한다.
다른 양태는 잇따른 상세한 설명의 검토로부터 분명할 것이다.
본 발명은 PD-1에 특이적으로 결합하는 단리된 재조합 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 이를 이용하여 면역반응을 조절하고, 암, 자가면역 질환 또는 바이러스 감염과 같은 질환 또는 장애를 치료할 수 있다.
도 1은 본원의 실시예 8에 기재된 루시퍼라제-기반 PD-1 생물학적검정(bioassay)의 도식이다. 패널 A: 비활성 저캇(Jurkat) 세포; 패널 B: 저캇 세포는 CD3xCD20 이중특이적 항체를 통한 T-세포 수용체(TCR) 클러스터링(clustering)에 의해 활성화된다; 패널 C: PD-1 활성화는 활성화된 저캇 세포에서의 반응을 약화시킨다; 패널 D: PD-1의 차단은 활성화된 저캇 세포에서의 반응을 되찾는다.
도 2는 0일에 결장-26 종양 세포로 이식되고 3, 6, 10, 13 및 19일에 지시된 분자들의 배합물들로 주사에 의해 처리된 마우스에 대한 종양 성장 및 생존 결과를 설명한다("초기-치료 종양 모델"). 그래프는 이식 후 다양한 시점에서 상이한 실험 그룹에 대한 종양 용적(mm3)을 도시한다. X축을 따라 위로 향한 화살표는 처리 주사 시기를 나타낸다. "mIgG2a"는 IgG2 이소형 대조군이고; "Fc"는 사람 Fc 대조군이고; "VEGF Trap"은 아플리베르셉트이고; "항-PD-1"은 항-마우스 PD-1 클론 RPMI-14이고; "항-PD-L1"은 본원의 다른 곳에 기재된 항-PD-L1 모노클로날 항체이다.
도 3은 0일에 결장-26 종양 세포로 이식되고 3, 6, 10, 13 및 19일에 지시된 분자들의 배합물들로 주사에 의해 처리된 마우스에 대한 종양 성장 및 생존 결과를 설명한다("초기-치료 종양 모델"). 그래프는 이식 후 28일에 각각의 실험 그룹에서 개개의 마우스의 종양 용적(mm3)을 보여준다. "mIgG2a"는 IgG2 이소형 대조군이고; "Fc"는 사람 Fc 대조군이고; "VEGF Trap"은 아플리베르셉트이고; "항-PD-1"은 항-마우스 PD-1 클론 RPMI-14이고; "항-PD-L1"은 본원의 다른 곳에 기재된 항-PD-L1 모노클로날 항체이다.
본 발명을 기재하기 전에, 본 발명은 특정 방법 및 기재된 실험 조건이 가변적일 수 있으므로, 이러한 방법 및 조건에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 용어는, 본 발명의 범위가 단지 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 단지 특정 양태들을 기재하기 위한 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않음이 또한 이해되어야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에 사용될 수 있더라도, 바람직한 방법 및 물질이 이하 기재된다. 본원에 언급된 모든 공보는 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
용어 "PD-1"은 CD279로도 공지된, T-세포 공-억제제인 예정 사멸 인자-1 단백질을 나타낸다. 전장 PD-1의 아미노산 서열은 진뱅크(GenBank)에 수탁 번호 NP_005009.2로서 제공되고 또한 서열 번호: 327로 본원에 지칭된다. 용어 "PD-1"은 또한 서열 번호: 321, 322, 323 또는 324의 아미노산 서열을 갖는 PD-1의 단백질 변이체를 포함한다. 용어 "PD-1"은 재조합 PD-1 또는 이의 단편을 포함한다. 상기 용어는 또한, 예를 들면, 히스티딘 태그, 마우스 또는 사람 Fc, 또는 시그널 서열, 예를 들면, ROR1에 커플링된 PD-1 또는 이의 단편을 포함한다. 예를 들면, 상기 용어는 C93S 변화와 함께 전장 PD-1의 아미노산 잔기 25 내지 170에 커플링된, C-말단에서 마우스 Fc(mIgG2a) 또는 사람 Fc(hIgG1)를 포함하는, 서열 번호: 323 또는 324로 예시된 서열을 포함한다. 서열 번호: 321로 예시되는 단백질 변이체는 전장 PD-1의 아미노산 잔기 25 내지 170에 커플링된, C-말단에서 히스티딘 태그를 포함한다. 비-사람 종으로부터 기인한다고 명시되지 않는 한, 용어 "PD-1"은 사람 PD-1을 의미한다.
PD-1은 T-세포 공-억제제의 CD28/ CTLA-4/ICOS 패밀리의 일원이다. PD-1은 IgV-유사한 세포외 N-말단 도메인, 막통과 도메인 및 면역수용체 티로신-기반 억제(ITIM) 모티프 및 면역수용체 티로신-기반 스위치(ITSM) 모티프를 함유하는 세포내 도메인을 갖는 288-아미노산 단백질이다(Chattopadhyay et al 2009, Immunol. Rev.). PD-1 수용체는 2개의 리간드, PD-리간드-1(PD-L1) 및 PD-L2를 갖는다.
용어 "PD-L1"은 CD274 및 B7H1로도 공지된 PD-1 수용체의 리간드를 나타낸다. 전장 PD-L1의 아미노산 서열은 진뱅크에 수탁 번호 NP_054862.1로 제공되며 또한 서열 번호: 328로 본원에서 지칭된다. 상기 용어는 또한, 예를 들면, 히스티딘 태그, 마우스 또는 사람 Fc, 또는 시그널 서열, 예를 들면, ROR1에 커플링된 PD-L1 또는 이의 단편을 포함한다. 예를 들면, 상기 용어는 전장 PD-L1의 아미노산 잔기 19 내지 239에 커플링된, C-말단에서 마우스 Fc(mIgG2a) 또는 사람 Fc(hIgG1)를 포함하는, 서열 번호: 325 또는 326으로 예시된 서열을 포함한다. PD-L1은 세포외 IgV-유사 도메인, 막통과 도메인 및 대략 30개의 아미노산의 고도로 보존된 세포내 도메인을 갖는 290개의 아미노산 단백질이다. PD-L1은 항원 전달 세포(예: 수지상 세포, 대식세포 및 B-세포)와 같은 다수의 세포 및 조혈 및 비-조혈 세포(예: 혈관 내피 세포, 이자섬(pancreatic islets), 및 면역 특별 격리 부위(sites of immune privilege)) 상에서 항시적으로(constitutively) 발현된다. PD-L1은 또한 다양한 종양, 바이러스 감염된 세포 및 자가면역 조직에서 발현되고, 면역억제 환경의 구성 요소이다(Ribas 2012, NEJM 366: 2517-2519).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "T-세포 공-억제제"는 T-세포 활성화 또는 저지에 의해 면역 반응을 조절하는 리간드 및/또는 수용체를 나타낸다. T-세포 공-시그널링 분자로도 공지된 용어 T-세포 공-억제제"는 림프구 활성화 유전자 3 단백질(LAG-3, CD223으로도 공지됨), 세포독성 T-림프구 항원-4(CTLA-4), B 및 T 림프구 감쇠물(attenuator)(BTLA), CD-28, 2B4, LY108, T-세포 면역글로불린 및 뮤신 3(TIM3), 면역글로불린 및 ITIM을 갖는 T-세포 면역수용체(TIGIT; VSIG9로도 공지됨), 백혈구 관련된 면역글로불린-유사 수용체 1(LAIR1; CD305로도 공지됨), 유도성 T-세포 공자극물질(ICOS; CD278로도 공지됨), T-세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제제(VISTA) 및 CD160을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "Fc 수용체"는 항체의 Fc 영역에 대해 결합 특이성을 갖는, B 림프구, 자연 살해 세포, 대식세포, 호염기구, 중성구 및 비만 세포를 포함하는 면역 세포에서 발견되는 표면 수용체 단백질을 나타낸다. 용어 "Fc 수용체"는 Fcγ 수용체[예: FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32), FcγRIIB(CD32), FcγRIIIA(CD16a), 및 FcγRIIIB(CD16b)], Fcα 수용체(예: FcαRI 또는 CD89) 및 Fcε 수용체[예: FcεRI 및 FcεRII(CD23)]를 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 4개의 폴리펩타이드 쇄, 이황화 결합에 의해 내부-연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)로 이루어진 면역글로불린 분자(즉, "완전 항체 분자"), 뿐만 아니라 이의 다량체(예: IgM) 또는 이의 항원-결합 단편을 나타내는 것으로 의도된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역("HCVR" 또는 "VH") 및 중쇄 불변 영역(도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 구성됨)으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역("LCVR 또는 "VL") 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. VH 및 VL 영역들은 프레임워크 영역(framework region; FR)으로 불리는 더 보존된 영역들 사이에 배치된, 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 하기 순서로 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지 배열된, 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 본 발명의 특정 양태에서, 항체(또는 이의 항원 결합 단편)의 FR은 사람 생식세포(germline) 서열과 동일할 수 있거나 천연적으로 또는 인위적으로 변형될 수 있다. 아미노산 공통 서열은 2개 이상의 CDR의 사이드-바이-사이드(side-by-side) 분석을 토대로 한정될 수 있다.
하나 이상의 CDR 잔기의 치환 또는 하나 이상의 CDR의 생략이 또한 가능하다. 하나 또는 2개의 CDR이 결합에 생략될 수 있는 항체가 과학 문헌에 기재되었다. 패들란 등(Padlan et al., 1995 FASEB J. 9:133-139)은 항체와 이의 항원 간의 접촉 영역을 공개된 결정 구조를 기초로 분석했고, CDR 잔기의 단지 약 1/5 내지 1/3만이 실제로 항원과 접촉한다고 결론내렸다. 패들란은 또한 하나 또는 2개의 CDR이 항원과 접촉하고 있는 아미노산을 갖지 않는 다수의 항체를 발견했다(참조: Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320:415-428). 　　
항원과 접촉하지 않은 CDR 잔기는, 초티아 CDR을 벗어난 카밧 CDR의 영역으로부터, 분자 모델링에 의해 및/또는 경험적으로 이전의 연구(예를 들면, CDRH2에서 잔기 H60 내지 H65는 종종 필요로 하지 않는다)를 토대로 확인될 수 있다. CDR 또는 이의 잔기(들)가 생략된 경우, 이는 통상적으로 또 다른 사람 항체 서열 또는 이러한 서열의 컨센서스 내 상응하는 위치를 점유하는 아미노산으로 치환된다. CDR 내 치환 위치 및 치환할 아미노산도 경험적으로 선택될 수 있다. 경험적 치환은 보존적 또는 비-보존적 치환일 수 있다.
본원에 개시된 완전한 사람 항-PD-1 모노클로날 항체는 상응하는 생식세포 서열과 비교하여 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 프레임워크 및/또는 CDR 영역에서 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는 본원에 개시된 아미노산 서열을, 예를 들면, 공용 항체 서열 데이타베이스로부터 이용가능한 생식세포 서열과 비교함으로써 용이하게 확인될 수 있다. 본 발명은 본원에 개시된 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 유도된, 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함하며, 여기서 하나 이상의 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산은 항체가 유도된 생식세포 서열의 상응하는 잔기(들), 또는 또 다른 사람 생식세포 서열의 상응하는 잔기(들) 또는 상응하는 생식세포 잔기(들)의 보존적 아미노산 치환으로 돌연변이된다(이러한 서열 변화는 "생식세포 돌연변이"로서 본원에 총괄하여 지칭된다). 당업자는, 본원에 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열로 출발하여, 하나 이상의 개별적인 생식세포 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함하는 수많은 항체 및 항원-결합 단편을 용이하게 제작할 수 있다. 특정 양태에서, VH 및/또는 VL 도메인 내의 모든 프레임워크 및/또는 CDR 잔기는 항체가 유도된 최초 생식세포 서열에서 발견되는 잔기로 역 돌연변이된다. 다른 양태에서, 단지 특정 잔기, 예를 들면, FR1의 처음 8개의 아미노산 내에서 또는 FR4의 마지막 8개의 아미노산 내에서 발견된 돌연변이된 잔기만이 또는 CDR1, CDR2 또는 CDR3 내에서 발견되는 돌연변이된 잔기만이 최초 생식세포 서열로 역 돌연변이된다. 다른 양태에서, 프레임워크 및/또는 CDR 잔기(들) 중 하나 이상은 상이한 생식세포 서열(즉, 항체가 최초로 유도된 생식세포 서열과 상이한 생식세포 서열)의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이된다. 더욱이, 본 발명의 항체는 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내에서 2개 이상의 생식세포 돌연변이의 임의의 조합을 함유할 수 있으며, 예를 들면, 여기서, 특정 개별적인 잔기들은 특정 생식세포 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이되는 한편, 최초 생식세포 서열과 상이한 특정한 다른 잔기는 유지되거나 상이한 생식세포 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이된다. 하나 이상의 생식세포 돌연변이를 함유하는 항체 및 항원-결합 단편은, 수득되면, 하나 이상의 목적하는 특성, 예를 들면, 향상된 결합 특이성, 증가된 결합 친화성, 향상되거나 증진된 길항제 또는 작용제 생물학적 특성(경우에 따라), 감소된 면역원성 등에 대해 용이하게 시험될 수 있다. 이러한 일반적인 방식으로 수득된 항체 및 항원-결합 단편도 본 발명 내에 포함된다.
본 발명은 또한 하나 이상의 보존적 치환을 갖는 본원에 개시된 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열 중 어느 것의 변이체를 포함하는 완전 사람 항-PD-1 모노클로날 항체를 포함한다. 예를 들면, 본 발명은, 예를 들면, 본원에 개시된 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열 중 어느 것에 대해 10개 이하, 8개 이하, 6개 이하, 4개 이하 등의 보존적 아미노산 치환을 갖는 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열을 갖는 항-PD-1 항체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "사람 항체"는 사람 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 사람 mAb는, 예를 들면, CDR 및 특정 CDR3에서 사람 생식세포 면역글로불린 서열로 인코딩되지 않은 아미노산 잔기(예: 시험관내에서 랜덤 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 용어 "사람 항체"는 또 다른 포유동물 종(예: 마우스)의 생식세포로부터 유도된 CDR 서열이 사람 FR 서열로 그래프팅된 mAb를 포함하는 것으로 의도되지 않는다. 상기 용어는 비-사람 포유동물, 또는 비-사람 포유동물의 세포에서 재조합으로 생산된 항체를 포함한다. 상기 용어는 사람 피험자로부터 단리되거나 피험자에서 생성된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "재조합"은, 예를 들면, DNA 스플라이싱(splicing) 및 유전자이식 발현(transgenic expression)을 포함하는 재조합 DNA 기술로서 당해 분야에 공지된 기술 또는 방법에 의해 생성되거나, 발현되거나, 단리되거나 또는 수득된 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 나타낸다. 상기 용어는 비-사람 포유동물(유전자이식 비-사람 포유동물, 예를 들면, 유전자이식 마우스 포함) 또는 세포(예: CHO 세포) 발현 시스템에서 발현되거나 재조합 복합 사람 항체 라이브러리로부터 단리된 항체를 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "다중-특이적 항원-결합 분자"는 이중특이적, 삼중-특이적 또는 다중-특이적 항원-결합 분자, 및 이의 항원-결합 단편을 나타낸다. 다중-특이적 항원-결합 분자는 하나의 표적 폴리펩타이드의 상이한 에피토프들에 특이적일 수 있거나 1개 이상의 표적 폴리펩타이드의 에피토프들에 대해 특이적인 항원-결합 도메인을 함유할 수 있다. 다중-특이적 항원-결합 분자는 단일 다기능 폴리펩타이드일 수 있거나, 또는 서로 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합된 2개 이상의 폴리펩타이드의 다량체 복합체일 수 있다. 용어 "다중-특이적 항원-결합 분자"는 또 다른 기능성 분자, 예를 들면, 또 다른 펩타이드 또는 단백질에 연결되거나 이와 공동-발현될 수 있는 본 발명의 항체를 포함한다. 예를 들면, 항체 또는 이의 단편은 제2 결합 특이성을 갖는 이중특이적 또는 다중-특이적 항원-결합 분자를 생산하도록 하나 이상의 다른 분자 개체(entity), 예를 들면, 단백질 또는 이의 단편에 (예를 들면, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비-공유 결합 등에 의해) 기능적으로 연결될 수 있다. 본 발명에 따르면, 용어 "다중-특이적 항원-결합 분자"는 또한 이중특이적, 삼중-특이적 또는 다중-특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명의 항체는 제2 결합 특이성을 갖는 이중특이적 항체를 생산하도록 또 다른 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 기능적으로 연결된다. 본 발명의 이중특이적 및 다중-특이적 항체는 본원의 다른 곳에 기재된다.
용어 "특이적으로 결합한다" 또는 "~에 특이적으로 결합한다" 등은 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 생리적 조건 하에 비교적 안정한 항원과 복합체를 형성하는 것을 의미한다. 특이적 결합은 적어도 약 1x10-8 M 이하의 평형 해리 상수(예를 들면, KD가 작을수록 더 단단한 결합을 나타낸다)를 특징으로 할 수 있다. 2개의 분자가 특이적으로 결합하는지를 결정하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 평형 투석, 표면 플라즈몬 공명 등을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, PD-1에 특이적으로 결합하는 항체는 표면 플라즈몬 공명, 예를 들면, 비아코어(BIACORE™)에 의해 확인되었다. 더욱이, PD-1의 하나의 도메인 및 하나 이상의 추가의 항원에 결합하는 다중-특이적 항체 또는 PD-1의 2개의 상이한 영역에 결합하는 이중특이적 항체는 그럼에도, 본원에서 사용된 바와 같이, "특이적으로 결합하는" 항체로 간주된다.
용어 "고 친화성" 항체는 표면 플라즈몬 공명, 예를 들면, 비아코어 또는 용액-친화성(solution-affinity) ELISA에 의해 측정시, 적어도 10-7 M; 바람직하게는 10-8 M; 더 바람직하게는 10-9M, 더욱 더 바람직하게는 10-10 M, 더욱 더 바람직하게는 10-11 M의 KD로 표시되는 PD-1에 대한 결합 친화성을 갖는 mAb를 나타낸다.
용어 "슬로우 오프 속도(slow off rate)", "Koff" 또는 "kd"는, 표면 플라즈몬 공명, 예를 들면, 비아코어에 의해 측정시, 1 x 10-3 s-1 이하, 바람직하게는 1 x 10-4 s-1 이하의 속도 상수로 PD-1로부터 해리되는 항체를 의미한다.
본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 부위", 항체의 "항원-결합 단편" 등은 복합체를 형성하도록 항원과 특이적으로 결합하는 임의의 천연 발생, 효소적으로 수득가능한, 합성의 또는 유전적으로 조작된 폴리펩타이드 또는 당단백질을 포함한다. 본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 단편" 또는 "항체 단편"은 PD-1에 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 나타낸다.
특정 양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 리간드와 같은 모이어티(moiety), 또는 치료적 모이어티("면역접합체"), 예를 들면, 항생제, 제2 항-PD-1 항체, 또는 종양-특이적 항원, 자가면역 조직 항원, 바이러스 감염된 세포 항원, Fc 수용체, T-세포 수용체, 또는 T-세포 공-억제제와 같은 또 다른 항원에 대한 항체, 또는 면역독소, 또는 암, 자가면역 질환 또는 만성 바이러스 감염을 포함하는 질환 또는 병태를 치료하는데 유용한 임의의 다른 치료적 모이어티에 접합될 수 있다.
본원에 사용된 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체(Ab)가 실질적으로 없는 항체를 나타내도록 의도된다(예를 들면, PD-1과 특이적으로 결합하는 단리된 항체, 또는 이의 단편은 PD-1 이외의 항원과 특이적으로 결합하는 Ab가 실질적으로 없다).
본원에 사용된 "차단 항체" 또는 "중화 항체" (또는 "PD-1 활성을 중화하는 항체" 또는 "길항제 항체")는 PD-1에 대한 결합이 PD-1의 적어도 하나의 생물학적 활성의 억제를 초래하는 항체를 나타내는 것으로 의도된다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 PD-L1에 대한 PD-1 결합을 예방하거나 차단할 수 있다.
본원에 사용된 "활성화 항체" 또는 "증진 항체" (또는 "작용제 항체")는 PD-1에 대한 결합이 PD-1의 적어도 하나의 생물학적 활성의 증가나 자극을 초래하는 항체를 나타내는 것으로 의도된다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 PD-L1에 대한 PD-1 결합을 증가시킬 수 있다.
본원에 사용된 용어 "표면 플라즈몬 공명"은, 예를 들면, 비아코아 시스템(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.)을 사용하여 바이오센서 매트릭스 내의 단백질 농도의 변화를 검출하여 실시간 생체분자 상호작용의 분석을 가능하게 하는 광학 현상을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 나타내는 것으로 의도된다.
용어 "에피토프"는 파라토프로 공지된 항체 분자의 가변 영역에서의 특이적 항원 결합 부위와 상호작용하는 항원 결정인자를 나타낸다. 단일 항원은 1개 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 따라서, 상이한 항체는 항원 상의 상이한 영역에 결합할 수 있으며, 상이한 생물학적 효과를 가질 수 있다. 용어 "에피토프"는 또한 B 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 상의 부위를 나타낸다. 이는 또한 항체에 의해 결합되는 항원 상의 영역을 나타낸다. 에피토프는 구조적 또는 기능적인 것으로 정의될 수 있다. 기능적 에피토프는 일반적으로 구조적 에피토프의 서브셋이고 상호작용의 친화도에 직접적으로 기여하는 잔기를 갖는다. 에피토프는 또한 입체형태적일 수 있으며, 즉, 비-선형 아미노산으로 구성될 수 있다. 특정 양태에서, 에피토프는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 그룹, 또는 설포닐 그룹과 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹핑(grouping)인 결정인자를 포함할 수 있으며, 특정 양태에서, 특정 3차원 구조적 특성, 및/또는 특정 전하 특성을 가질 수 있다.
용어 "실질적 동일성" 또는 "실질적으로 동일한"은, 핵산 또는 이의 단편을 지칭하는 경우, 또 다른 핵산 (또는 이의 상보적 스트랜드)과 적절한 뉴클레오타이드 삽입 또는 결실에 대해 최적으로 정렬되는 경우, 하기 논의된 FASTA, BLAST 또는 GAP와 같은 임의의 익히-공지된 서열 동일성 알고리즘에 의해 측정시, 적어도 약 90%, 더 바람직하게는 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 뉴클레오타이드 염기에서 뉴클레오타이드 서열 동일성이 존재함을 나타낸다. 참조 핵산 분자에 실질적 동일성을 갖는 핵산 분자는, 특정 예에서, 참조 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드와 동일하거나 상당히 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다.
폴리펩타이드에 적용된 바와 같이, 용어 "실질적 유사성" 또는 "실질적으로 유사한"은 2개의 펩타이드 서열이, 예를 들면, 디폴트 갭 웨이트(default gap weight)를 사용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬될 때, 적어도 90% 서열 동일성, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 공유하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치들은 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예: 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄(R 그룹)를 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우에, 유사율 또는 유사도는 치환의 보존적 성질에 대해 보정되도록 상향으로 조정될 수 있다. 이러한 조정을 위한 수단은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 예를 들면, 본원에 참조로 포함되어 있는, 문헌(참조: Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331)을 참조한다. 유사한 화학적 특성을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산 그룹의 예는 1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; 2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; 3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; 4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판; 5) 염기성 측쇄: 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘; 6) 산성 측쇄: 아스파테이트 및 글루타메이트, 및 7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌을 포함한다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 그룹은 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파테이트, 및 아스파라긴-글루타민이다. 대안적으로, 보존적 대체는 본원에 참조로 포함된 문헌(참조: Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45)에 개시된 PAM250 로그-가능성 매트릭스(log-likelihood matrix)에서 양의 값을 갖는 임의의 변화이다. "중간정도(moderately) 보존적" 대체는 PAM250 로그-가능성 매트릭스에서 비-음의(nonnegative) 값을 갖는 임의의 변화이다.
폴리펩타이드에 대한 서열 유사성은 통상적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정된다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존적 아미노산 치환을 포함하는, 다양한 치환, 결실 및 다른 변형에 할당된 유사성 척도를 사용하여 유사한 서열을 매칭한다. 예를 들면, GCG 소프트웨어는 상이한 종의 유기체 기원의 동족의 폴리펩타이드와 같은 밀접하게 관련된 폴리펩타이드들 간의 또는 야생형 단백질 및 이의 뮤테인(mutein) 간의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 결정하기 위한 디폴트 파라미터(default parameter)와 함께 사용될 수 있는 GAP 및 BESTFIT과 같은 프로그램을 함유한다. 예를 들면, GCG 버전 6.1을 참조한다. 폴리펩타이드 서열을 또한 디폴트 또는 권장된 파라미터를 갖는 FASTA를 사용하여 비교할 수 있으며, GCG 버전 6.1. FASTA(예: FASTA2 및 FASTA3)의 프로그램은 쿼리(query) 및 검색 서열 간의 최적의 중첩 영역의 정렬 및 퍼센트 서열 동일성을 제공한다(상기 Pearson (2000)). 본 발명의 서열을 상이한 유기체 기원의 다수의 서열들을 함유하는 데이타베이스와 비교하는 경우 또 다른 바람직한 알고리즘은 디폴트 파라미터를 사용하는 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 BLASTP 또는 TBLASTN이다. 예를 들면, 각각이 본원에 참고로 포함된 문헌(참조: Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 and (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)을 참조한다.
어구 "치료적 유효량"은 투여되는 목적하는 효과를 초래하는 양을 의미한다. 정확한 양은 치료 목적에 의존적일 것이며, 공지된 기술을 사용하여 당업자에 의해 규명될 수 있을 것이다(참조: 예를 들면, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "피험자"는 만성 바이러스 감염, 암 또는 자가면역 질환과 같은 질환 또는 장애의 개선, 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 동물, 바람직하게는 포유동물을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, "항암 약물"은 항대사물질, 알킬화제, 안트라사이클린, 항생제, 항유사분열제, 프로카바진, 하이드록시우레아, 아스파라기나제, 코르티코스테로이드, 미토탄(O,P'-(DDD)), 생물제제(예: 항체 및 인터페론) 및 방사능제와 같은 제제 및 세포독소를 포함하지만, 이들에 제한되지 않는 암을 치료하는데 유용한 임의의 제제를 의미한다. 본원에 사용된 "세포독소 또는 세포독성제"는 또한 화학요법제를 나타내며, 세포에 유해한 임의의 제제를 의미한다. 예는 탁솔®(파클리탁셀), 테모졸라미드, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 시스플라틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈비아스틴, 코이치신, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 푸로마이신 및 이들의 유사체 또는 동족체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항바이러스 약물"은 숙주 피험자에서 바이러스 감염을 치료, 예방 또는 개선하는데 사용되는 임의의 약물 또는 요법을 나타낸다. 용어 "항바이러스 약물"은 지도부딘, 라미부딘, 아바카비르, 리바비린, 로피나비르, 에파비렌즈, 코비시스타트, 테노포비르, 릴피비린, 진통제 및 코르티코스테로이드를 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다. 본 발명의 맥락에서, 바이러스 감염은 사람 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus; HIV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 사람 유두종 바이러스(human papilloma virus; HPV), 림프구성 맥락수막염 바이러스(lymphocytic choriomeningitis virus; LCMV) 및 원숭이 면역결핍 바이러스(simian immunodeficiency virus; SIV)를 포함하지만, 이들에 제한되지 않는 바이러스에 의해 유발된 장기간 또는 만성 감염을 포함한다.
본 발명의 항체 및 항원-결합 단편은 PD-1에 특이적으로 결합하여 PD-1의 PD-L1과의 상호작용을 조절한다. 항-PD-1 항체는 높은 친화성 또는 낮은 친화성으로 PD-1에 결합할 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 항체는 차단 항체일 수 있으며, 여기서 상기 항체는 PD-1에 결합하여 PD-1의 PD-L1과의 상호작용을 차단할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 차단 항체는 PD-1의 PD-L1에 대한 결합을 차단하고/하거나 T-세포 활성화를 자극하거나 증진시킬 수 있다. 일부 양태에서, 차단 항체는 면역 반응의 자극 또는 증진 및/또는 암 또는 만성 바이러스 감염을 앓고 있는 피험자의 치료에 유용할 수 있다. 상기 항체는, 이를 필요로 하는 피험자에게 투여될 때, 피험자에서 바이러스, 예를 들면, HIV, LCMV 또는 HBV에 의한 만성 감염을 감소시킬 수 있다. 이는 피험자에서 종양 세포의 성장을 억제하는데 사용될 수 있다. 이는 단독으로 사용되거나 암 또는 바이러스 감염의 치료를 위한 당해 분야에 공지된 다른 치료의 일부분 또는 치료 양상과 함께 보조 요법으로 사용될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명의 항체는 활성화 항체일 수 있으며, 여기서 상기 항체는 PD-1에 결합하여 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 증진시킬 수 있다. 일부 양태에서, 활성화 항체는 PD-1의 PD-L1에 대한 결합을 증진시키고/시키거나 T-세포 활성화를 억제하거나 저지할 수 있다. 본 발명의 활성화 항체는 피험자에서 면역 반응을 억제하고/하거나 자가면역 질환을 치료하는데 유용할 수 있다.
특정 양태에서, 항-PD-1 항체는 다중-특이적 항원-결합 분자일 수 있으며, 여기서 이는 PD-1에 대한 제1 결합 특이성, 및 또 다른 T-세포 공-억제제, 자가면역 조직 항원, T-세포 수용체, Fc 수용체, T-세포 수용체, PD-L1, 및 PD-1의 상이한 에피토프로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원에 대한 제2 결합 특이성을 포함한다.
특정 양태에서, 본 발명의 항체는 1차 면역원, 예를 들면, 전장 PD-1[진뱅크 수탁 번호 NP_005009.2(서열 번호: 327) 참조] 또는 PD-1의 재조합 형태 또는 변형된 사람 PD-1 단편(서열 번호: 321, 323 또는 324) 또는 변형된 사이노몰구스 PD-1 단편(서열 번호: 322)으로 면역화되고 이어서 2차 면역원, 또는 PD-1의 면역원적 활성 단편으로 면역화된 마우스로부터 수득된다.
면역원은 PD-1의 생물학적 활성 및/또는 면역원 단편 또는 이의 활성 단편을 인코딩하는 DNA일 수 있다. 상기 단편은 PD-1의 N-말단 또는 C-말단 도메인으로부터 유도될 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 면역원은 C93S 변화를 갖는 서열 번호: 327의 아미노산 잔기 25 내지 170의 범위에 있는 PD-1의 단편이다.
펩타이드는 담체 분자, 예를 들면, KLH에 대한 태깅(tagging) 또는 접합을 위한 특정 잔기의 부가 또는 치환을 포함하도록 변형될 수 있다. 예를 들면, 시스테인이 펩타이드의 N 말단 또는 C 말단에 첨가될 수 있거나, 링커 서열을 첨가하여, 예를 들면, 면역화를 위한 KLH에 대한 접합을 위한 펩타이드를 제조할 수 있다.
전장 사람 PD-1의 전장 아미노산 서열은 서열 번호: 327로서 보여준다.
특정 양태에서, PD-1에 특이적으로 결합하는 항체는 상기-언급된 영역의 단편, 또는 본원에 기재된 영역의 N 또는 C 말단 중 어느 하나 또는 둘 다로부터 약 5 내지 약 20개의 아미노산 잔기로 지정된 영역을 넘어 연장되는 펩타이드를 사용하여 제조될 수 있다. 특정 양태에서, 상기-언급된 영역 또는 이의 단편의 임의의 조합이 PD-1 특이적 항체의 제조에 사용될 수 있다. 특정 양태에서, PD-1의 임의의 하나 이상의 상기-언급된 영역, 또는 이의 단편은 단일특이적, 이중특이적 또는 다중특이적 항체를 제조하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 항-PD-1 항체는, 시험관내 또는 생체내 검정에 의해 결정된 바와 같이, PD-1과 결합하여 PD-1의 활성을 중화시킬 수 있다. PD-1과 결합하여 PD-1의 활성을 중화시키는 본 발명의 항체의 능력은 본원에 기재된 바와 같은 결합 검정 또는 활성 검정을 포함하는, 당업자에게 공지된 임의의 표준 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
결합 활성을 측정하는 비제한적이고, 예시적인 시험관내 검정은 본원의 실시예에 예시된다. 실시예 3에서, 사람 PD-1 및 사이노몰구스 PD-1에 대한 사람 항-PD-1 항체의 결합 친화성 및 키네틱 상수(kinetic constant)를 표면 플라즈몬 공명으로 측정하고, 측정은 비아코어 4000 또는 T200 기기 상에서 수행되었다. 실시예 4 및 5에서, 차단 검정은 시험관내에서 PD-1의 PD-L1-결합 능력을 차단하는 항-PD-1 항체의 능력을 결정하는데 사용되었다. 실시예 6에서, 차단 검정은 항-PD-1 항체들 간에 교차-경쟁을 결정하는데 사용되었다. 실시예 7은 PD-1을 과발현하는 세포에 대한 항체의 결합을 기재한다. 실시예 8에서, 루시퍼라제 검정은 T-세포에서 PD-1/PD-L1 시그널링을 길항하는 항-PD-1 항체의 능력을 결정하는데 사용되었다.
특정 양태에서, 본 발명의 항체는 시험관내에서 및 암을 갖는 피험자 또는 LCMV와 같은 바이러스로 감염된 피험자에서 T-세포 활성화를 증진시키거나 자극할 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 항체는 피험자에서 면역 반응을 증진시키고 종양 성장을 억제하기 위해 제2 치료제, 예를 들면, 제2 T-세포 공-억제제에 대한 항체와 함께 사용된다.
PD-1에 특이적인 항체는 추가의 표지 또는 모이어티를 함유하지 않을 수 있거나, N-말단 또는 C-말단 표지 또는 모이어티를 함유할 수 있다. 한 양태에서, 상기 표지 또는 모이어티는 비오틴이다. 결합 검정에서, 표지(존재한다면)의 위치는 펩타이드가 결합되는 표면에 대한 펩타이드의 배향을 결정할 수 있다. 예를 들면, 표면이 아비딘으로 코팅되는 경우, N-말단 비오틴을 함유하는 펩타이드는 펩타이드의 C-말단 부분이 상기 표면에서 먼 쪽에 위치하도록 배향될 것이다. 한 양태에서, 상기 표지는 방사성핵종, 형광 염료 또는 MRI-검출가능한 표지일 수 있다. 특정 양태에서, 이러한 표지된 항체는 이미지화 검정을 포함하는 진단 검정에 사용될 수 있다.
항체의 항원-결합 단편
달리 구체적으로 지시되지 않는 한, 본원에 사용된 용어 "항체"는 2개의 면역글로불린 중쇄 및 2개의 면역글로불린 경쇄를 포함하는 항체 분자(즉, "완전 항체 분자") 뿐만 아니라 이의 항원-결합 단편을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 부위", 항체의 "항원-결합 단편" 등은 항원과 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 천연 발생, 효소적으로 수득가능한, 합성의 또는 유전적으로 조작된 폴리펩타이드 또는 당단백질을 포함한다. 본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 단편" 또는 "항체 단편"은 PD-1에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 나타낸다. 항체 단편은 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, dAb 단편, CDR을 함유하는 단편, 또는 단리된 CDR을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 용어 "항원-결합 단편"은 다중-특이적 항원-결합 분자의 폴리펩타이드 단편을 나타낸다. 이러한 양태에서, 용어 "항원-결합 단편"은, 예를 들면, PD-1에 특이적으로 결합하는 PD-L1의 세포외 도메인을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은, 예를 들면, 항체 가변 및 (임의로) 불변 도메인을 인코딩하는 DNA의 조작 및 발현을 수반하는 단백질분해 소화 또는 재조합 유전적 조작 기술과 같은 임의의 적합한 표준 기술을 사용하여 완전 항체 분자로부터 유도될 수 있다. 이러한 DNA는 공지되어 있고/있거나 예를 들면, 상업적 공급원, DNA 라이브러리(예를 들면, 파지-항체 라이브러리를 포함)로부터 용이하게 이용가능하거나 합성될 수 있다. DNA는, 예를 들면, 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적합한 입체배치로 배열하거나 코돈을 도입하거나, 시스테인 잔기를 생성하거나, 아미노산을 변형, 첨가 또는 결실시키는 등을 위해 서열분석되고 화학적으로 또는 분자 생물학 기술을 사용함으로써 조작될 수 있다.
항원-결합 단편의 비제한적인 예는 (i) Fab 단편; (ii) 　F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v)　단쇄 Fv (scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 및 (vii) 항체의 초가변(hypervariable) 영역을 모방하는 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인식 단위(예: 단리된 상보성　결정 영역(CDR), 예를 들면, CDR3 펩타이드) 또는 속박된 FR3-CDR3-FR4 펩타이드를 포함한다. 다른 조작된 분자, 예를 들면, 도메인-특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-결실된 항체, 키메라 항체, CDR-그래프팅된 항체, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 미니바디(minibody), 나노바디(nanobody)(예: 1가 나노바디, 2가 나노바디 등), 소형 모듈 면역약제(small modular immunopharmaceuticals: SMIPs), 및 샤크 가변(shark variable) IgNAR 도메인도 또한 본원에 사용된 표현 "항원-결합 단편" 내에 포함된다.
항체의 항원-결합 단편은 통상적으로 적어도 하나의 가변 도메인을 포함할 것이다. 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성을 가질 수 있으며 일반적으로 하나 이상의 프레임워크 서열에 인접하거나 하나 이상의 프레임워크 서열과 프레임(frame) 내에 있는 적어도 하나의 CDR을 포함할 것이다. VL 도메인과 결합된 VH 도메인을 갖는 항원-결합 단편에서, VH 및 VL 도메인은 서로에 대해 임의의 적합한 배열로 위치될 수 있다. 예를 들면, 가변 영역은 이량체일 수 있고, VH - VH, VH - VL 또는 VL-VL 이량체를 함유한다. 대안적으로, 항체의 항원-결합 단편은 단량체 VH 또는 VL 도메인을 함유할 수 있다.
특정 양태에서, 항체의 항원-결합 단편은 적어도 하나의 불변 도메인에 공유 연결된 적어도 하나의 가변 도메인을 함유할 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편 내에서 발견될 수 있는 가변 및 불변 도메인의 비제한적이고, 예시적인 입체배치는 (i) VH -CH1; (ii) VH -CH2; (iii) VH -CH3; (iv) VH -CH1-CH2; (v) VH -CH1-CH2-CH3; (vi) VH -CH2-CH3; (vii) VH -CL; (viii) VL -CH1; (ix) VL -CH2; (x) VL -CH3; (xi) VL -CH1-CH2; (xii) VL -CH1-CH2-CH3; (xiii) VL -CH2-CH3; 및 (xiv) VL -CL을 포함한다. 상기 열거된 예시적인 입체배치 중 어느 것을 포함하는, 가변 및 불변 도메인의 임의의 입체배치에서, 가변 및 불변 도메인은 서로 직접적으로 연결될 수 있거나 완전 또는 부분적 힌지 또는 링커 영역에 의해 연결될 수 있다. 힌지 영역은 단일 폴리펩타이드 분자에서 인접한 가변 및/또는 불변 도메인 간의 가요성 또는 반-가요성 연결을 초래하는 적어도 2개(예: 5, 10, 15, 20, 40, 60개 이상)의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 서로 및/또는 하나 이상의 단량체 VH 또는 VL 도메인과 비-공유 결합으로(예를 들면, 이황화 결합(들)에 의해) 상기 열거된 가변 및 불변 도메인 입체배치 중 어느 것의 호모-다이머 또는 헤테로-다이머(또는 다른 다량체)를 포함할 수 있다.
완전 항체 분자와 마찬가지로, 항원-결합 단편은 단일특이적 또는 다중-특이적(예: 이중특이적)일 수 있다. 항체의 다중-특이적 항원-결합 단편은 통상적으로 적어도 2개의 상이한 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서 각각의 가변 도메인은 별개의 항원에 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 본원에 개시된 예시적인 이중특이적 항체 포맷을 포함하는, 임의의 다중-특이적 항체 포맷은 당해 분야에서 사용가능한 일상적인 기술을 사용하여 본 발명의 항체의 항원-결합 단편의 맥락에서의 사용에 맞춰질 수 있다.
사람 항체의 제조
유전자이식 마우스에서 사람 항체를 생성하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 임의의 이러한 공지된 방법은 PD-1에 특이적으로 결합하는 사람 항체를 제조하는데 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다.
하기 중 어느 하나를 포함하는 면역원이 PD-1에 대한 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 항체는 전장, 천연 PD-1(진뱅크 수탁 번호 NP_005009.2 참조)(서열 번호: 327), 또는 재조합 PD-1 펩타이드로 면역화된 마우스로부터 수득된다. 대안적으로, PD-1 또는 이의 단편은 표준 생화학적 기술을 사용하여 생산되며 변형되고(서열 번호: 321 내지 324) 면역원으로 사용될 수 있다.
특정 양태에서, 면역원은 PD-1의 N 말단 또는 C 말단으로부터의 펩타이드일 수 있다. 한 양태에서, 면역원은 PD-1의 세포외 도메인 또는 IgV-유사 도메인이다. 본 발명의 특정 양태에서, 면역원은 C93S 변화를 갖는 서열 번호: 327의 대략 아미노산 잔기 25 내지 170 범위의 PD-1의 단편이다.
일부 양태에서, 면역원은 이. 콜라이(E. coli)에서 또는 임의의 다른 진핵세포 또는 포유동물 세포, 예를 들면, 차이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary: CHO) 세포에서 발현된 재조합 PD-1 펩타이드일 수 있다.
특정 양태에서, PD-1에 특이적으로 결합하는 항체는 상기-언급된 영역의 단편, 또는 본원에 기재된 영역의 N 또는 C 말단 중 어느 하나 또는 둘 다로부터의 약 5 내지 약 20개의 아미노산 잔기로 지정된 영역을 넘어 연장되는 펩타이드를 사용하여 제조될 수 있다. 특정 양태에서, 상기-언급된 영역 또는 이의 단편의 임의의 조합이 PD-1 특이적 항체의 제조에 사용될 수 있다.
벨록이뮨(VELOCIMMUNE®) 기술(예를 들면, US 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE® 참조) 또는 모노클로날 항체를 생성하는 임의의 다른 공지된 방법을 사용하여, 사람 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는 PD-1에 대한 고 친화성 키메라 항체가 초기에 단리된다. 벨록이뮨 기술은 마우스가 항원성 자극에 반응하여 사람 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 포함하는 항체를 생산하도록 내인성 마우스 불변 영역 유전자좌(loci)에 작동가능하게 연결된 사람 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 게놈을 갖는 유전자이식 마우스의 생성을 수반한다. 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 인코딩하는 DNA를 단리하고 사람 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결한다. 이어서 DNA는 완전 사람 항체를 발현할 수 있는 세포에서 발현된다.
생물학적등가성(bioequivalents)
본 발명의 항-PD-1 항체 및 항체 단편은 기재된 항체와 다르지만, PD-1과 결합하는 능력을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 이러한 변이체 항체 및 항체 단편은 모 서열과 비교하여 아미노산의 하나 이상의 첨가, 결실 또는 치환을 포함하지만, 기재된 항체의 것과 본질적으로 등가인 생물학적 활성을 나타낸다. 마찬가지로, 본 발명의 항체-인코딩 DNA 서열은 개시된 서열과 비교하여 뉴클레오타이드의 하나 이상의 첨가, 결실 또는 치환을 포함하지만, 본 발명의 항체 또는 항체 단편에 본질적으로 생물학적등가성인 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 서열을 포함한다.
2개의 항원-결합 단백질, 또는 항체는, 예를 들면, 이들이 단일 용량 또는 다중 용량으로 유사한 실험 조건 하에, 동일한 몰 용량으로 투여되는 경우 이의 흡수 속도 및 흡수 정도가 유의미한 차이를 보여주지 않는 약제학적 등가물 또는 약제학적 대체물인 경우, 생물학적등가성인 것으로 간주된다. 일부 항체는, 이들이 이들의 흡수 정도에 있어서 동등하지만 이들의 흡수 속도가 동등하지 않은 경우에도 등가물 또는 약제학적 대체물로 간주될 것이며, 흡수 속도에 있어서의 이러한 차이가 의도적이고 표지시 반영되기 때문에 생물학적등가성인 것으로 간주될 수 있고, 예를 들면, 만성적 사용시 유효한 신체 약물 농도의 획득에 필수적이지 않으며, 연구된 특정 약물 생성물에 대해 의학적으로 유의미하지 않은 것으로 간주된다.
한 양태에서, 2개의 항원-결합 단백질은, 이의 안전성, 순도 또는 효능에 있어서 임상적으로 의미있는 차이가 없는 경우 생물학적등가성이다.
한 양태에서, 2개의 항원-결합 단백질은, 환자가 스위칭(switching) 없이 지속된 치료법과 비교하여, 면역원성의 임상적으로 유의미한 변화, 또는 감소된 유효성을 포함하는 예상되는 부작용 위험의 증가 없이 참조 생성물과 생물학적 생성물 간에 1회 이상 스위칭될 수 있는 경우, 생물학적등가성이다.
한 양태에서, 2개의 항원-결합 단백질은, 이들이 둘 다 사용 조건 또는 조건들에 공통인 작용 기전 또는 작용 기전들에 의해 이러한 기전이 공지된 정도까지 작용하는 경우 생물학적등가성이다.
생물학적등가성은 생체내 및/또는 시험관내 방법으로 입증될 수 있다. 생물학적등가성 척도는, 예를 들면, (a) 항체 또는 이의 대사물질의 농도가 혈액, 혈장, 혈청, 또는 다른 생물학적 유체에서 시간의 함수로서 측정되는, 사람 또는 다른 포유동물에서의 생체내 시험; (b) 사람 생체내 생체이용률 데이타와 관련되고 이를 합리적으로 예측하는 시험관내 시험; (c) 항체(또는 이의 표적)의 적절한 급성 약리학적 효과가 시간의 함수로서 측정되는 사람 또는 다른 포유동물에서의 생체내 시험; 및 (d) 항체의 안전성, 효능, 또는 생체이용률 또는 생물학적등가성을 확립하는 잘-조절된 임상 시험을 포함한다.
본 발명의 항체의 생물학적등가성 변이체는, 예를 들면, 생물학적 활성에 필요하지 않은 잔기들 또는 서열들의 다양한 치환 또는 생물학적 활성에 필요하지 않은 말단 또는 내부 잔기들 또는 서열들의 결실에 의해 작제될 수 있다. 예를 들면, 생물학적 활성에 필수적이지 않은 시스테인 잔기를 결실시키거나 다른 아미노산으로 대체하여 복원시 불필요하거나 부정확한 분자내 이황화 브릿지(bridge)의 형성을 방지할 수 있다. 다른 맥락에서, 생물학적등가성인 항체는 항체의 당화 특성을 변형시키는 아미노산 변화, 예를 들면, 당화를 없애거나 제거하는 돌연변이를 포함하는 항체 변이체를 포함할 수 있다.
Fc 변이체를 포함하는 항-PD-1 항체
본 발명의 특정 양태에 따르면, 예를 들면, 중성 pH와 비교하여 산성 pH에서, FcRn 수용체에 대한 항체 결합을 증진시키거나 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인를 포함하는 항-PD-1 항체가 제공된다. 예를 들면, 본 발명은 Fc 도메인의 CH2 또는 CH3 영역에서 돌연변이를 포함하는 항-PD-1 항체를 포함하며, 여기서 상기 돌연변이(들)는 산성 환경에서(예: pH 범위가 약 5.5 내지 약 6.0인 엔도솜에서) FcRn에 대한 Fc 도메인의 친화성을 증가시킨다. 이러한 돌연변이는 동물에게 투여될 때 항체의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. 이러한 Fc 변형의 비제한적인 예는, 예를 들면, 위치 250(예: E 또는 Q); 250 및 428(예: L 또는 F); 252(예: L/Y/F/W 또는 T), 254(예: S 또는 T), 및 256(예: S/R/Q/E/D 또는 T)에서의 변형; 또는 위치 428 및/또는 433(예: H/L/R/S/P/Q 또는 K) 및/또는 434(예: A, W, H, F 또는 Y[N434A, N434W, N434H, N434F 또는 N434Y])에서의 변형; 또는 위치 250 및/또는 428에서의 변형; 또는 위치 307 또는 308(예: 308F, V308F) 및 434에서의 변형을 포함한다. 한 양태에서, 상기 변형은 428L(예: M428L) 및 434S(예: N434S) 변형; 428L, 259I(예: V259I), 및 308F(예: V308F) 변형; 433K(예: H433K) 및 434(예: 434Y) 변형; 252, 254 및 256(예: 252Y, 254T, 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형(예: T250Q 및 M428L); 및 307 및/또는 308 변형(예: 308F 또는 308P)을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 변형은 265A(예: D265A) 및/또는 297A(예: N297A) 변형을 포함한다.
예를 들면, 본 발명은 250Q 및 248L(예: T250Q 및 M248L); 252Y, 254T 및 256E(예: M252Y, S254T 및 T256E); 428L 및 434S(예: M428L 및 N434S); 257I 및 311I(예: P257I 및 Q311I); 257I 및 434H(예: P257I 및 N434H); 376V 및 434H(예: D376V 및 N434H); 307A, 380A 및 434A(예: T307A, E380A 및 N434A); 및 433K 및 434F(예: H433K 및 N434F)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 돌연변이의 하나 이상의 쌍 또는 그룹을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-PD-1 항체를 포함한다. 한 양태에서, 본 발명은 이량체 안정화를 촉진시키는 IgG4의 힌지 영역에서의 S108P 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-PD-1 항체를 포함한다. 상기 Fc 도메인 돌연변이의 모든 가능한 조합, 및 본원에 개시된 항체 가변 도메인 내의 다른 돌연변이도 본 발명의 범위 내에 고려된다.
본 발명은 또한 키메라 중쇄 불변(CH) 영역을 포함하는 항-PD-1 항체를 포함하며, 여기서 상기 키메라 CH 영역은 1개 이상의 면역글로불린 이소형의 CH 영역으로부터 유도된 분절(segment)을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 사람 IgG1, 사람 IgG2 또는 사람 IgG4 분자로부터 유도된 CH3 도메인의 일부 또는 모두와 조합된, 사람 IgG1, 사람 IgG2 또는 사람 IgG4 분자로부터 유도된 CH2 도메인의 일부 또는 모두를 포함하는 키메라 CH 영역을 포함할 수 있다. 특정 양태에 따르면, 본 발명의 항체는 키메라 힌지 영역을 갖는 키메라 CH 영역을 포함한다. 예를 들면, 키메라 힌지는 사람 IgG1, 사람 IgG2 또는 사람 IgG4 힌지 영역으로부터 유도된 "하부 힌지" 서열(EU 넘버링(numbering)에 따라 위치 228 내지 236의 아미노산 잔기)과 조합된, 사람 IgG1, 사람 IgG2 또는 사람 IgG4 힌지 영역으로부터 유도된 "상부 힌지" 아미노산 서열(EU 넘버링에 따라 위치 216 내지 227의 아미노산 잔기)를 포함할 수 있다. 특정 양태에 따르면, 키메라 힌지 영역은 사람 IgG1 또는 사람 IgG4 상부 힌지로부터 유도된 아미노산 잔기 및 사람 IgG2 하부 힌지로부터 유도된 아미노산 잔기를 포함한다. 본원에 기재된 키메라 CH 영역을 포함하는 항체는, 특정 양태에서, 항체의 치료적 또는 약동학 특성에 불리하게 영향을 주지 않으면서 변형된 Fc 효과기 기능을 나타낼 수 있다(참조: 예를 들면, 2014년 1월 31일자로 제출된 USSN. 14/170,166, 이의 개시내용은 이의 전문이 본원에 참조로 포함됨).
항체의 생물학적 특성
일반적으로, 본 발명의 항체는 PD-1에 결합하여 기능한다. 본 발명은 가용성 단량체성 또는 이량체성 PD-1 분자와 높은 친화성으로 결합하는 항-PD-1 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 예를 들면, 본 발명은, 예를 들면, 본원의 실시예 3에 정의된 검정 포맷을 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정시 약 50nM 미만의 KD로 (예를 들면, 25℃ 또는 37℃에서) 단량체성 PD-1과 결합하는 항체 및 항체의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 예를 들면, 본원의 실시예 3에 정의된 검정 포맷을 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 또는 실질적으로 유사한 검정에 의해 측정시 약 40nM 미만, 약 30nM 미만, 약 20nM 미만, 약 10nM 미만, 약 5nM 미만, 약 2nM 미만 또는 약 1nM 미만의 KD로 단량체성 PD-1과 결합한다.
본 발명은 또한, 예를 들면, 본원의 실시예 3에 정의된 검정 포맷을 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정시 약 400pM 미만의 KD로 (예를 들면, 25℃ 또는 37℃에서) 이량체성 PD-1과 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 예를 들면, 본원의 실시예 3에 정의된 검정 포맷을 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 또는 실질적으로 유사한 검정에 의해 측정시 약 300pM 미만, 약 250pM 미만, 약 200pM 미만, 약 100pM 미만, 또는 약 50pM 미만의 KD로 이량체성 PD-1과 결합한다.
본 발명은 또한, 예를 들면, 본원의 실시예 3에 정의된 검정 포맷을 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정시 약 35nM 미만의 KD로 (예를 들면, 25℃ 또는 37℃에서) 사이노몰구스(마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)) PD-1과 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 예를 들면, 본원의 실시예 3에 정의된 검정 포맷을 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 또는 실질적으로 유사한 검정에 의해 측정시 약 30nM 미만, 약 20nM 미만, 약 15nM 미만, 약 10nM 미만, 또는 약 5nM 미만의 KD로 사이노몰구스 PD-1과 결합한다.
본 발명은 또한, 예를 들면, 본원의 실시예 3에 정의된 검정 포맷을 사용하여 25℃ 또는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 또는 실질적으로 유사한 검정에 의해 측정시 약 1.1분 초과의 해리 반감기(t½)로 PD-1과 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은, 예를 들면, 본원의 실시예 3에 정의된 검정 포맷(예를 들면, mAb-포획 또는 항원-포획 포맷)을 사용하여 25℃ 또는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 또는 실질적으로 유사한 검정에 의해 측정시 약 5분 초과, 약 10분 초과, 약 30분 초과, 약 50분 초과, 약 60분 초과, 약 70분 초과, 약 80분 초과, 약 90분 초과, 약 100분 초과, 약 200분 초과, 약 300분 초과, 약 400분 초과, 약 500분 초과, 약 600분 초과, 약 700분 초과, 약 800분 초과, 약 900분 초과, 약 1000분 초과, 또는 약 1200분 초과의 t½로 PD-1과 결합한다.
본 발명은 또한, 예를 들면, 실시예 4에 나타난 ELISA-기반 면역검정 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 측정시 약 3nM 미만의 IC50으로 PD-L1에 대한 PD-1 결합을 차단하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 PD-1에 결합하여 PD-1의 PD-L1에 대한 결합을 증진시키는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 항체는 PD-1의 세포외 도메인 또는 상기 도메인의 단편에 결합할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체는 1개 이상의 도메인에 반응할 수 있다(교차-반응성 항체). 특정 양태에서, 본 발명의 항체는 PD-1(서열 번호: 327)의 아미노산 잔기 21 내지 171을 포함하는 세포외 도메인에 위치한 에피토프에 결합할 수 있다. 한 양태에서, 상기 항체는 서열 번호: 321 내지 324의 아미노산 잔기 1 내지 146으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 항체는 아미노산 서열을 서열 번호: 327에서 보여주는 전장 단백질의 임의의 다른 영역 또는 단편에 결합하여 PD-1과 연합된 PD-L1-결합 활성을 차단하거나 억제함으로써 기능할 수 있다. 특정 양태에서, 상기 항체는 PD-1과 PD-L1 간의 상호작용을 약화시키거나 조절할 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 항체는 이중특이적 항체일 수 있다. 본 발명의 이중특이적 항체는 PD-1의 하나의 도메인에서의 하나의 에피토프와 결합할 수 있으며, 또한 PD-1의 상이한 도메인에서의 제2 에피토프와 결합할 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 동일한 도메인에서의 2개의 상이한 에피토프와 결합할 수 있다. 한 양태에서, 다중-특이적 항원-결합 분자는 제1 결합 특이성(여기서 상기 제1 결합 특이성은 PD-L1의 세포외 도메인 또는 이의 단편을 포함한다); 및 PD-1의 또 다른 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 PD-1에 결합하는 단리된 완전 사람 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 상기 항체 또는 이의 단편은 하기 특성들 중 하나 이상을 나타낸다: (i) 서열 번호: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 218, 226, 234, 242, 250, 258, 266, 274, 282, 290, 298, 306 및 314로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 HCVR을 포함하고; (ii) 서열 번호: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186 및 202로 이루어진 그룹으로부 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 LCVR을 포함하고; (iii) 서열 번호: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 224, 232, 240, 248, 256, 264, 272, 280, 288, 296, 304, 312 및 320으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 HCDR3 도메인; 및 서열 번호: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192 및 208로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 LCDR3 도메인을 포함하고; (iv) 서열 번호: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 220, 228, 236, 244, 252, 260, 268, 276, 284, 292, 300, 308 및 316으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 HCDR1 도메인; 서열 번호: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 222, 230, 238, 246, 254, 262, 270, 278, 286, 294, 302, 310 및 318로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 HCDR2 도메인; 서열 번호: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188 및 204로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 LCDR1 도메인; 및 서열 번호: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190 및 206으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 LCDR2 도메인을 포함하고; (v) PD-1에 대한 제1 결합 특이성, 및 PD-1, 종양 특이적 항원, 자가면역 조직 특이적 항원, 바이러스 감염된 세포 항원, 상이한 T-세포 공-억제제, T-세포 수용체, 및 Fc 수용체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 다중-특이적 항원-결합 분자이고; (vi) 약 28pM 내지 약 1.5μM의 KD로 사람 PD-1에 결합하고; (vii) 약 3nM 내지 약 7.5μM의 KD로 사이노몰구스 PD-1에 결합하고; (viii) IC50 ≤ 약 3.3nM로 PD-L1에 대한 PD-1의 결합을 차단하거나 증진시키고; (ix) PD-1-유도된 T-세포 하향 조절을 차단하고/하거나 T-세포/APC 루시퍼라제 리포터 검정에서 T-세포 시그널링을 되찾고; (x) 혼합된 림프구 반응(MLR) 검정에서 T-세포 증식 및 활성을 자극하고; (xi) MLR 검정에서 IL-2 및/또는 IFNγ 생산을 유도하고; (xii) 암을 갖는 피험자에서 종양 성장을 억제하고 생존을 증가시킨다.
한 양태에서, 본 발명은 PD-L1에 대한 PD-1 결합을 차단하는 단리된 완전 사람 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 상기 항체 또는 이의 단편은 하기 특성들 중 하나 이상을 나타낸다: (i) 서열 번호: 130, 162, 234 및 314로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 HCVR을 포함하고; (ii) 서열 번호: 138, 170, 186 및 202로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 LCVR을 포함하고; (iii) 서열 번호: 136, 168, 240 및 320으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 HCDR3 도메인; 및 서열 번호: 144, 176, 192 및 208로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 LCDR3 도메인을 포함하고; (iv) 서열 번호: 132, 164, 236 및 316으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 HCDR1 도메인; 서열 번호: 134, 166, 238 및 318로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 HCDR2 도메인; 서열 번호: 140, 172, 188 및 204로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 LCDR1 도메인; 및 서열 번호: 142, 174, 190 및 206으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 LCDR2 도메인을 포함하고; (v) PD-1에 대한 제1 결합 특이성, 및 PD-1의 상이한 에피토프, 종양 특이적 항원, 자가면역 조직 특이적 항원, 바이러스 감염된 세포 항원, 상이한 T-세포 공-억제제, T-세포 수용체, 및 Fc 수용체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 다중-특이적 항원-결합 분자이고; (vi) KD ≤ 10-9M로 사람 PD-1에 결합하고; (vii) KD ≤ 10-8M로 사이노몰구스 PD-1에 결합하고; (viii) IC50 ≤ 10-10M로 PD-L1에 대한 PD-1의 결합을 차단하고; (ix) PD-1-유도된 T-세포 하향 조절을 차단하고/하거나 T-세포/APC 루시퍼라제 리포터 검정에서 T-세포 시그널링을 되찾고; (x) 혼합된 림프구 반응(MLR) 검정에서 T-세포 증식 및 활성을 자극하고; (xi) MLR 검정에서 IL-2 및/또는 IFNγ 생산을 유도하고; (xii) 암을 갖는 피험자에서 종양 성장을 억제하고 생존을 증가시킨다.
본 발명의 항체는 하나 이상의 상기 언급된 생물학적 특성, 또는 이들의 임의의 조합을 가질 수 있다. 본 발명의 항체의 다른 생물학적 특성은 본원의 실시예를 포함하는 본 개시내용의 검토로부터 당업자에게 분명할 것이다.
종 선택성 및 종 교차-반응성
본 발명의 특정 양태에 따르면, 항-PD-1 항체는 사람 PD-1에 결합하지만 다른 종 기원의 PD-1에는 결합하지 않는다. 대안적으로, 본 발명의 항-PD-1 항체는, 특정 양태에서, 사람 PD-1에 결합하고, 하나 이상의 비-사람 종 기원의 PD-1에도 결합한다. 예를 들면, 본 발명의 항-PD-1 항체는 사람 PD-1에 결합할 수 있으며, 경우에 따라, 마우스, 랫트, 기나아 피그, 햄스터, 저빌(gerbil), 돼지, 고양이, 개, 토끼, 염소, 양, 소, 말, 낙타, 사이노몰구스, 마모셋(marmoset), 리서스(rhesus) 또는 침팬지 PD-1 중 하나 이상에 결합하거나 결합하지 않을 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 동일한 친화성으로 또는 상이한 친화성으로 사람 및 사이노몰구스 PD-1에 결합할 수 있지만, 랫트 및 마우스 PD-1에는 결합하지 않는다.
에피토프 맵핑(Epitope Mapping) 및 관련 기술
본 발명은, 예를 들면, 세포외(IgV-유사) 도메인, 막통과 도메인, 및 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프(ITIM) 및 면역수용체 티로신-기반 스위치 모티프(ITSM)를 함유하는 세포내 도메인을 포함하는 PD-1 분자의 하나 이상의 도메인 내에서 발견되는 하나 이상의 아미노산과 상호작용하는 항-PD-1 항체를 포함한다. 항체가 결합하는 에피토프는 PD-1 분자의 상기 언급된 도메인 중 어느 것 내에 위치한 3개 이상(예: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상)의 아미노산의 단일 인접 서열로 이루어질 수 있다(예: 도메인 내의 선형 에피토프). 대안적으로, 상기 에피토프는 PD-1 분자의 상기 언급된 도메인들 중 어느 하나 또는 모두 내에 위치하는 다수의 비-인접 아미노산(또는 아미노산 서열)으로 이루어질 수 있다(예: 입체형태적 에피토프).
당업자에게 공지된 다양한 기술은 항체가 폴리펩타이드 또는 단백질 내의 "하나 이상의 아미노산과 상호작용하는지"를 결정하는데 사용될 수 있다. 예시적인 기술은, 예를 들면, 항체, 할로우 및 레인(Antibodies, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY)에 기재된 것과 같은 일상적인 교차-차단 검정을 포함한다. 다른 방법은 알라닌 스캐닝 돌연변이 분석(alanine scanning mutational analysis), 펩타이드 블롯 분석(Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248: 443-63), 펩타이드 절단 분석 결정학적 연구 및 NMR 분석을 포함한다. 또한, 항원의 에피토프 절제, 에피토프 추출 및 화학적 변형과 같은 방법이 이용될 수 있다(Tomer (2000) Prot. Sci. 9: 487-496). 항체가 상호작용하는 폴리펩타이드 내의 아미노산을 식별하는데 사용될 수 있는 또 다른 방법은 질량 분석법에 의해 검출된 수소/중수소 교환이다. 일반적으로, 상기 수소/중수소 교환 방법은 목적하는 단백질을 중수소-표지한 후 중수소-표지된 단백질에 항체를 결합시킴을 수반한다. 다음으로, 상기 단백질/항체 복합체를 물로 옮기고, 상기 항체 복합체에 의해 보호되는 아미노산 내의 교환가능한 양성자는 경계면 부분이 아닌 아미노산 내의 교환가능한 양성자보다 더 느린 속도로 중수소-대-수소 역-교환(back-exchange)을 겪는다. 그 결과, 단백질/항체 경계면 부분을 형성하는 아미노산은 중수소를 보유할 수 있으므로 상기 경계면에 포함되지 않는 아미노산과 비교하여 비교적 더 높은 질량을 나타낸다. 항체의 해리 후, 표적 단백질을 프로테아제 절단 및 질량 분석법 분석에 적용함으로써 항체가 상호작용하는 특이적 아미노산에 상응하는 중수소-표지된 잔기를 드러낸다(참조: 예를 들면, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267: 252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73: 256A-265A).
용어 "에피토프"는 B 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 상의 부위를 나타낸다. B-세포 에피토프는 단백질의 3차 폴딩(tertiary folding)에 의해 병치되는 인접 아미노산 또는 비인접 아미노산 둘 모두로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 통상적으로 변성 용매에 노출시 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 통상적으로 변성 용매로 처리시 소실된다. 에피토프는 통상적으로 고유한 공간 입체형태에서 적어도 3개, 더 통상적으로, 적어도 5개 또는 8개 내지 10개의 아미노산을 포함한다.
항원 구조-기반 항체 프로파일링(Antigen Structure-based Antibody Profiling; ASAP)으로도 공지된, 변형-보조된 프로파일링(Modification-Assisted Profiling; MAP)은 화학적으로 또는 효소적으로 변형된 항원 표면에 대한 각각의 항체의 결합 프로파일의 유사성에 따라서 동일한 항체로 향하는 상당수의 모노클로날 항체(mAb)를 분류하는 방법이다(참조: 이의 전문이 참조로 본원에 구체적으로 포함된, US 2004/0101920). 각각의 범주는 또 다른 범주로 나타낸 에피토프와 명백하게 상이하거나 부분적으로 중첩되는 고유한 에피토프를 반영할 수 있다. 이러한 기술은 유전적으로 동일한 항체의 신속한 필터링을 가능하게 하여 특성화가 유전적으로 상이한 항체에 집중될 수 있게 한다. 하이브리도마 스크리닝에 적용되는 경우, MAP는 목적하는 특성을 갖는 mAb를 생산하는 희귀 하이브리도마 클론의 식별을 용이하게 할 수 있다. MAP는 본 발명의 항체를 상이한 에피토프와 결합하는 항체의 그룹으로 분류하는데 사용될 수 있다.
특정 양태에서, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 327로 예시된 바와 같은 천연 형태의, 또는 서열 번호: 321 내지 324로 예시된 바와 같은 재조합으로 생산된, PD-1에서 예시된 임의의 하나 이상의 영역 내의 에피토프, 또는 이의 단편에 결합한다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체는 PD-1의 아미노산 잔기 21 내지 171로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 세포외 영역에 결합한다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호: 322로 예시된 바와 같은 사이노몰구스 PD-1의 아미노산 잔기 1 내지 146으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 세포외 영역에 결합한다.
특정 양태에서, 본 발명의 항체는, 표 1에서 보여주는 바와 같이, 서열 번호: 327의 대략 위치 21 내지 대략 위치 136 범위의 아미노산 잔기; 또는 서열 번호: 327의 대략 위치 136 내지 대략 위치 171 범위의 아미노산 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열과 상호작용한다. 이들 영역은 서열 번호: 321 내지 324에서 부분적으로 예시된다.
본 발명은, 본원의 표 1에 기재된 특정 예시적인 항체 중 어느 것, 또는 표 1에 기재된 예시적인 항체 중 어느 것의 CDR 서열을 갖는 항체와 동일한 에피토프, 또는 상기 에피토프의 일부에 결합하는 항-PD-1 항체를 포함한다. 마찬가지로, 본 발명은 또한 본원의 표 1에 기재된 특정 예시적인 항체 중 어느 것, 또는 표 1에 기재된 예시적인 항체 중 어느 것의 CDR 서열을 갖는 항체와 PD-1 또는 PD-1 단편에 대한 결합에 대해 경쟁하는 항-PD-1 항체를 포함한다. 예를 들면, 본 발명은 본원의 실시예 6에 정의된 하나 이상의 항체와 PD-1에 대한 결합에 대해 교차-경쟁하는 항-PD-1 항체를 포함한다(예: H2aM7788N, H4xH8992P, H4xH8999P, H1M7799N, H2aM7780N, H1M7800N, H2aM7794N, H2aM7798N, H4xH9145P2, H4H9057P2, H4xH9120P2, H4xH9128P2, H4H9019P, H4xH9119P2, H4xH9135P2, H4xH9034P, H2aM7790N, H4xH9035P, H4xH9037P, H4xH9045P 및 H2aM7795N).
항체가 참조 항-PD-1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 또는 참조 항-PD-1 항체와 결합에 대해 경쟁하는지 여부를 당해 분야에 공지된 일상적인 방법을 사용하여 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들면, 시험 항체가 본 발명의 참조 항-PD-1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해, 상기 참조 항체를 포화 조건 하에 PD-1 단백질 또는 펩타이드에 결합시킨다. 다음으로, PD-1 분자에 결합하는 시험 항체의 능력을 평가한다. 시험 항체가 참조 항-PD-1 항체와 포화 결합 후 PD-1에 결합할 수 있다면, 시험 항체는 참조 항-PD-1 항체와 상이한 에피토프에 결합한다고 결론지을 수 있다. 반면에, 시험 항체가 참조 항-PD-1 항체와 포화 결합 후 PD-1 단백질에 결합할 수 없다면, 시험 항체는 본 발명의 참조 항-PD-1 항체에 의해 결합된 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
항체가 참조 항-PD-1 항체와 결합에 대해 경쟁하는지를 결정하기 위해, 상기-기재된 결합 방법을 2가지 방향으로 수행한다: 첫 번째 방향에서, 참조 항체를 포화 조건 하에 PD-1 단백질에 결합시킨 후 PD-1 분자에 대한 시험 항체의 결합을 평가한다. 두 번째 방향에서, 시험 항체를 포화 조건 하에 PD-1 분자에 결합시킨 후 PD-1 분자에 대한 참조 항체의 결합을 평가한다. 양쪽 방향에서, 단지 첫 번째(포화) 항체가 PD-1 분자에 결합할 수 있다면, 시험 항체 및 참조 항체는 PD-1에 대한 결합에 대해 경쟁한다고 결론내려진다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 참조 항체와 결합에 대해 경쟁하는 항체는 반드시 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하지 않을 수 있지만, 중첩된 또는 인접 에피토프와 결합함으로써 참조 항체의 결합을 입체적으로 차단할 수 있다.
2개의 항체는, 각각의 항체가 항원에 대한 다른 항체의 결합을 경쟁적으로 억제(차단)하는 경우 동일한 또는 중첩된 에피토프에 결합한다. 즉, 1배, 5배, 10배, 20배 또는 100배 과량의 하나의 항체는 다른 항체의 결합을 경쟁적 결합 검정에서 측정시 적어도 50% 그러나 바람직하게는 75%, 90% 또는 심지어 99% 억제한다(참조: 예를 들면, Junghans et al., Cancer Res. 1990 50:1495-1502). 대안적으로, 2개의 항체는,　하나의 항체의 결합을 감소시키거나 없애는 항원에서의 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 없애는 경우 동일한 에피토프를 갖는다. 2개의 항체는, 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 없애는 일부 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 없애는 경우 중첩된 에피토프를 갖는다.
이후 추가의 일상적인 실험법(예: 펩타이드 돌연변이 및 결합 분석)을 시험 항체의 관찰된 결합 결여가 실제로 참조 항체와 동일한 에피토프에 대한 결합에 기인하는지 여부 또는 입체적 차단(또는 또 다른 현상)이 관찰된 결합의 결여에 원인이 되는지를 확증하기 위해 수행할 수 있다. 이러한 종류의 실험은 ELISA, RIA, 표면 플라즈몬 공명, 유동 세포 분석법 또는 당해 분야에서 이용가능한 임의의 다른 정량적 또는 정성적 항체-결합 분석을 사용하여 수행될 수 있다.
면역접합체
본 발명은 암을 치료하는 화학요법제 또는 세포독소와 같은 치료적 모이어티에 접합된 사람 항-PD-1 모노클로날 항체("면역접합체")를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역접합체"는 세포독소, 방사능제, 사이토카인, 인터페론, 표적 또는 리포터 모이어티, 효소, 독소, 펩타이드 또는 단백질 또는 치료제에 화학적으로 또는 생물학적으로 연결된 항체를 나타낸다. 상기 항체는 이의 표적과 결합할 수 있는 한 분자를 따라 어느 위치에서든 세포독소, 방사능제, 사이토카인, 인터페론, 표적 또는 리포터 모이어티, 효소, 독소, 펩타이드 또는 치료제에 연결될 수 있다. 면역접합체의 예는 항체 약물 접합체 및 항체-독소 융합 단백질을 포함한다. 한 양태에서, 상기 물질(agent)은 PD-1에 대한 제2 상이한 항체일 수 있다. 특정 양태에서, 상기 항체는 종양 세포 또는 바이러스 감염된 세포에 특이적인 물질에 접합될 수 있다. 항-PD-1 항체에 접합될 수 있는 치료적 모이어티의 유형은 치료될 병태 및 달성될 목적하는 치료 효과를 고려할 것이다. 면역접합체를 형성하기에 적합한 물질의 예는 당해 분야에 공지되어 있으며; 예를 들면, WO 05/103081을 참조한다.
다중-특이적 항체
본 발명의 항체는 단일특이적, 이중특이적 또는 다중-특이적일 수 있다. 다중-특이적 항체는 하나의 표적 폴리펩타이드의 상이한 에피토프들에 특이적일 수 있거나 1개 이상의 표적 폴리펩타이드에 특이적인 항원-결합 도메인들을 함유할 수 있다(참조: 예를 들면, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244).
한 측면에서, 본 발명은 다중-특이적 항원-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하며, 여기서 면역글로불린의 하나의 특이성은 PD-1의 세포외 도메인 또는 이의 단편에 특이적이고, 면역글로불린의 다른 특이성은 PD-1의 세포외 도메인 이외의 도메인의 결합, 또는 제2 치료 표적에 특이적이거나 치료적 모이어티에 접합된다. 특정 양태에서, 제1 항원-결합 특이성은 PD-L1 또는 PD-L2, 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 면역글로불린의 하나의 특이성은 PD-1(서열 번호: 327)의 아미노산 잔기 21 내지 171 또는 이의 단편을 포함하는 에피토프에 특이적이며, 면역글로불린의 다른 특이성은 제2 표적 항원에 특이적이다. 상기 제2 표적 항원은 PD-1과 동일한 세포 또는 상이한 세포 상에 존재할 수 있다. 한 양태에서, 제2 표적 세포는 B-세포, 항원-전달 세포, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포와 같은 T-세포 이외의 면역 세포 상에 있다. 일부 양태에서, 제2 표적 항원은 종양 세포 또는 자가면역 조직 세포 또는 바이러스 감염된 세포 상에 존재할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 PD-1에 결합하는 제1 항원-결합 특이성, 및 T-세포 수용체, B-세포 수용체 또는 Fc 수용체에 결합하는 제2 항원-결합 특이성을 포함하는 다중-특이적 항원-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 관련된 측면에서, 본 발명은 PD-1에 결합하는 제1 항원-결합 특이성, 및 LAG-3, CTLA-4, BTLA, CD-28, 2B4, LY108, TIGIT, TIM3, LAIR1, ICOS 및 CD160과 같은 상이한 T-세포 공-억제제에 결합하는 제2 항원-결합 특이성을 포함하는 다중-특이적 항원-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 PD-1에 결합하는 제1 항원-결합 특이성, 및 자가면역 조직-특이적 항원에 결합하는 제2 항원-결합 특이성을 포함하는 다중-특이적 항원-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 양태에서, 상기 항체는 활성화 또는 작용제 항체일 수 있다.
본 발명의 다중-특이적 항원-결합 분자 중 어느 것, 또는 이의 변이체는 당업자에게 공지된 바와 같은 표준 분자 생물학적 기술(예: 재조합 DNA 및 단백질 발현 기술)을 사용하여 작제될 수 있다.
일부 양태에서, PD-1-특이적 항체는 PD-1의 상이한 도메인에 결합하는 가변 영역가 함께 연결되어 단일 결합 분자 내에서 이중-도메인 특이성을 제공하는 이중특이적 포맷("이중특이적")으로 생성된다. 적절하게 디자인된 이중특이적 항체는 특이성 및 결합 활성(binding avidity) 둘 모두를 증가시킴으로써 전반적인 PD-1 억제 효능을 증진시킬 수 있다. 하나의 도메인 내의 상이한 영역들에 결합할 수 있거나 개개의 도메인들(예: N-말단 도메인의 분절들)에 대한 특이성을 갖는 가변 영역들은 각각의 영역을 별개의 에피토프들에 또는 하나의 도메인 내의 상이한 영역들에 동시에 결합시키는 구조적 프레임워크에서 쌍을 이룬다. 이중특이적 항체에 대한 하나의 예로, 중쇄 가변 영역(VH)에 대한 최초의 특이성을 파괴하지 않으면서 최초의 VH와 쌍을 이룰 수 있는 비-동족(non-cognate) VL 파트너를 식별하도록 하나의 도메인에 대한 특이성을 갖는 결합제로부터의 VH는 제2 도메인에 대한 특이성을 갖는 일련의 결합제로부터의 경쇄 가변 영역(VL)와 재조합된다. 이러한 방식으로, 단일 VL 분절(예: VL1)은 2개의 상이한 VH 도메인(예: VH1 및 VH2)과 조합하여 2개의 결합 "아암(arm)"(VH1- VL1 및 VH2- VL1)으로 구성된 이중특이적 항체를 생성할 수 있다. 단일 VL 분절의 사용은 상기 시스템의 복잡성을 감소시키므로 이중특이적 항체를 생성하는데 사용되는 클로닝, 발현 및 정제 공정에서 효율을 증가시킨다(예를 들면, USSN13/022759 및 US2010/0331527 참조).
대안적으로, 1개 이상의 도메인 및 제2 표적과 결합하는 항체, 예를 들면, 비제한적으로, 제2 상이한 항-PD-1 항체는 본원에 기재된 기술 또는 당업자에게 공지된 다른 기술을 사용하여 이중특이적 포맷으로 제조될 수 있다. 상이한 영역에 결합하는 항체 가변 영역을, 예를 들면, PD-1의 세포외 도메인 상의 관련 부위에 결합하는 가변 영역과 함께 연결하여 단일 결합 분자 내에 이중-항원 특이성을 제공할 수 있다. 이러한 특성의 적절하게 디자인된 이중특이적 항체는 이중 기능을 한다. 세포외 도메인에 대한 특이성을 갖는 가변 영역은 세포외 도메인 이외의 도메인에 대한 특이성을 갖는 가변 영역과 조합되고 각각의 가변 영역을 별개의 항원에 결합시키는 구조적 프레임워크에서 쌍을 이룬다.
본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 예시적인 이중특이적 항체 포맷은 제1 면역글로불린(Ig) CH3 도메인 및 제2 Ig CH3 도메인의 사용을 수반하며, 여기서 상기 제1 및 제2 Ig CH3 도메인은 서로 적어도 하나의 아미노산에 의해 상이하고, 적어도 하나의 아미노산 차이는 아미노산 차이가 없는 이중특이적 항체와 비교하여 단백질 A에 대한 이중특이적 항체의 결합을 감소시킨다. 한 양태에서, 상기 제1 Ig CH3 도메인은 단백질 A와 결합하고, 상기 제2 Ig CH3 도메인은 H95R 변형(IMGT 엑손 넘버링(numbering)에 의해; EU 넘버링에 의해서는 H435R)과 같이 단백질 A 결합을 감소시키거나 폐지하는 돌연변이를 함유한다. 상기 제2 CH3은 Y96F 변형(IMGT에 의해; EU에 의해서는 Y436F)을 추가로 포함할 수 있다. 제2 CH3 내에서 발견될 수 있는 추가의 변형은 IgG1 항체의 경우에 D16E, L18M, N44S, K52N, V57M 및 V82I(IMGT에 의해; EU에 의해서는 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M 및 V422I); IgG2 항체의 경우에 N44S, K52N 및 V82I(IMGT; EU에 의해서는 N384S, K392N 및 V422I); 및 IgG4 항체의 경우에 Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q 및 V82I(IMGT에 의해; EU에 의해서는 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q 및 V422I)를 포함한다. 상기 기재된 이중특이적 항체 포맷에 대한 변형도 본 발명의 범위 내에서 고려된다.
복 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 다른 예시적인 이중특이적 포맷은, 예를 들면, scFv-기반 또는 디아바디 이중특이적 포맷, IgG-scFv 융합물, 이중 가변 도메인(DVD)-Ig, 쿼드로마(Quadroma), 놉스-인투-홀즈(knobs-into-holes), 통상적인 경쇄(예: 놉스-인투-홀즈를 갖는 통상적인 경쇄 등), CrossMab, CrossFab, (SEED)body, 류신 지퍼(zipper), 듀오바디(Duobody), IgG1/IgG2, 이중 작용 Fab (DAF)-IgG, 및 Mab2 이중특이적 포맷(상기 포맷의 검토를 위해, 예를 들면, Klein et al. 2012, mAbs 4:6, 1-11, 및 본원에 인용된 참조문헌을 참조한다)을 제한 없이 포함한다. 이중특이적 항체는 또한 펩타이드/핵산 접합을 사용하여 작제될 수 있으며, 예를 들면, 여기서 직교 화학적 반응성(orthogonal chemical reactivity)을 갖는 비천연 아미노산은 부위-특이적 항체-올리고뉴클레오타이드 접합체를 생성하고 이어서 정의된 조성, 원자가(valency) 및 기하학을 갖는 다량체 복합체로 자가조립하는데 사용된다(참조: 예를 들면, Kazane et al., J. Am. Chem. Soc. [Epub: Dec. 4, 2012]).
치료적 투여 및 제형
본 발명은 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 치료적 조성물을 제공한다. 본 발명에 따르는 치료적 조성물은 적합한 담체, 부형제, 및 향상된 운반, 전달, 내성 등을 제공하도록 제형 내에 포함되는 다른 제제와 함께 투여될 것이다. 다수의 적절한 제형은 모든 약제 화학자(pharmaceutical chemist)에게 공지된 처방집(참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA)에서 확인될 수 있다. 이들 제형은, 예를 들면, 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 액체, 액체(양이온 또는 음이온) 함유 소포(vesicle)(예: 리포펙틴(LIPOFECTIN™)), DNA 접합체, 무수 흡수 페이스트, 수중유 및 유중수 에멀젼, 에멀젼 카보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고체 겔, 및 카보왁스를 함유하는 반고체 혼합물을 포함한다(참조: Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311).
항체의 용량은 투여될 피험자의 연령 및 사이즈, 표적 질환, 병태, 투여 경로 등에 따라 가변적일 수 있다. 본 발명의 항체가 성인 환자에서 질환 또는 장애의 치료에 또는 이러한 질환의 예방에 사용되는 경우, 본 발명의 항체를 통상적으로 체중 1kg당 약 0.1 내지 약 60mg, 더 바람직하게는 약 5 내지 약 60mg, 약 10 내지 약 50mg, 또는 약 20 내지 약 50mg의 단일 용량으로 투여하는 것이 유리하다. 병태의 중증도에 따라, 치료 빈도 및 치료 지속시간을 조절할 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 적어도 약 0.1mg 내지 약 800mg, 약 1 내지 약 500mg, 약 5 내지 약 300mg, 또는 약 10 내지 약 200mg, 내지 약 100mg까지, 또는 내지 약 50mg까지의 초기 용량으로 투여될 수 있다. 특정 양태에서, 상기 초기 용량은 초기 용량과 대략 동일하거나 이보다 적을 수 있는 양의 제2 또는 다수의 차후 용량의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 투여로 이어질 수 있으며, 여기서 상기 차후 용량은 적어도 1일 내지 3일; 적어도 1주, 적어도 2주; 적어도 3주; 적어도 4주; 적어도 5주; 적어도 6주; 적어도 7주; 적어도 8주; 적어도 9주; 적어도 10주; 적어도 12주; 또는 적어도 14주만큼 떨어진다.
다양한 전달 시스템, 예를 들면, 리포솜 내 캡슐화, 미세입자, 마이크로캡슐, 돌연변이 바이러스를 발현시킬 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개된 엔도시토시스(endocytosis)가 공지되어 있으며 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는데 사용될 수 있다(참조: 예를 들면, Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432). 도입 방법은 피내, 경피, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외 및 경구 경로를 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다. 상기 조성물은 임의의 통상적인 경로에 의해, 예를 들면, 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 내층(lining)(예: 경구 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있으며, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소 투여일 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 또한 소포, 특히 리포솜으로 전달될 수 있다(참조: 예를 들면, Langer (1990) Science 249:1527-1533).
본 발명의 항체를 전달하는 나노입자의 사용이 또한 본원에 고려된다. 항체-접합된 나노입자는 치료 및 진단 용도 둘 모두를 위해 사용될 수 있다. 항체-접합된 나노입자 및 제조 방법 및 용도는 본원에 참조로 포함된 문헌(참조: Arruebo, M., et al. 2009, "Antibody-conjugated nanoparticles for biomedical applications" in J. Nanomat. Volume 2009, Article ID 439389, 24 pages, doi: 10.1155/2009/439389)에 상세히 기재되어 있다. 나노입자를 개발하고, 약제학적 조성물에 함유된 항체에 접합시켜 종양 세포 또는 자가면역 조직 세포 또는 바이러스 감염된 세포를 표적화할 수 있다. 약물 전달을 위한 나노입자는 또한, 예를 들면, 각각 전문이 본원에 포함된, US 8257740 또는 US 8246995에 기재되어 있다.
특정 상황에서, 약제학적 조성물은 제어된 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 한 양태에서, 펌프가 사용될 수 있다. 또 다른 양태에서, 중합체성 물질이 사용될 수 있다. 또 다른 양태에서, 제어된 방출 시스템은 조성물의 표적 인근에 배치되어 전신 용량의 일부만을 필요로 하게 할 수 있다.
주사가능한 제제는 정맥내, 피하, 피내, 두개내, 복강내 및 근육내 주사, 점적 주입(drip infusion) 등을 위한 투여형을 포함할 수 있다. 이들 주사가능한 제제는 공식적으로 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 주사가능한 제제는, 예를 들면, 상기 기재된 항체 또는 이의 염을 멸균 수성 배지 또는 주사를 위해 통상적으로 사용되는 유성 배지 중에 용해시키거나 현탁시키거나 유화시킴으로써 제조될 수 있다. 주사용 수성 배지로서, 적절한 가용화제, 예를 들면, 알코올(예: 에탄올), 다가알코올(예: 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비이온성 계면활성제[예: 폴리소르베이트 80, 수소화된 피마자유의 HCO-50(폴리옥시에틸렌(50mol) 첨가물)] 등과 함께 사용될 수 있는, 예를 들면, 생리식염수, 글루코스를 함유하는 등장성 용액 및 다른 보조제 등이 존재한다. 유성 배지로서, 가용화제, 예를 들면, 벤질 벤조에이트, 벤질 알코올 등과 함께 사용될 수 있는, 예를 들면, 참깨유, 대두유 등이 이용된다. 이에 따라 제조된 주사액은 바람직하게는 적절한 앰풀에 채워진다.
본 발명의 약제학적 조성물은 표준 니들(standard needle) 및 시린지에 의해 피하로 또는 정맥내로 전달될 수 있다. 또한, 피하 전달에 대해, 펜 전달 장치(pen delivery device)가 본 발명의 약제학적 조성물을 전달하는데 손쉽게 사용된다. 이러한 펜 전달 장치는 재사용가능하거나 일회용일 수 있다. 재사용가능한 펜 전달 장치는 일반적으로 약제학적 조성물을 함유하는 교체가능한 카트리지를 이용한다. 카트리지 내의 모든 약제학적 조성물이 투여되고 카트리지가 비게 되면, 빈 카트리지는 손쉽게 폐기되고 약제학적 조성물을 함유하는 새로운 카트리지로 교체될 수 있다. 펜 전달 장치는 이후 재사용될 수 있다. 일회용 펜 전달 장치에서는, 교체가능한 카트리지가 없다. 그 대신, 일회용 펜 전달 장치는 상기 장치 내의 저장소에 수용된 약제학적 조성물로 미리충전된다. 상기 저장소에 약제학적 조성물이 고갈되면, 전체 장치를 폐기한다.
다수의 재사용가능한 펜 및 자기주사기(autoinjector) 전달 장치는 본 발명의 약제학적 조성물의 피하 전달에 사용된다. 예로는, 몇 개만 언급하면, 오토펜(AUTOPEN™, Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), 디세트로닉(DISETRONIC™) 펜(Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Switzerland), 휴말로그 믹스(HUMALOG MIX) 75/25™ 펜, 휴말로그(HUMALOG™) 펜, 휴말린(HUMALIN) 70/30™ 펜(Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), 노보펜(NOVOPEN™) I, II 및 III(Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), 노보펜 주니어(NOVOPEN JUNIOR™, Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD™ 펜(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), 옵티펜(OPTIPEN™), 옵티펜 프로(OPTIPEN PRO™), 옵티펜 스타렛(OPTIPEN STARLET™), 및 옵티클릭(OPTICLIK™, Sanofi-Aventis, Frankfurt, Germany)을 포함하지만, 반드시 이들에 제한되지 않는다. 본 발명의 약제학적 조성물의 피하 전달에 사용되는 일회용 펜 전달 장치의 예는, 몇 개만 언급하면, 솔로스타(SOLOSTAR™) 펜(Sanofi-Aventis), 플렉스펜(FLEXPEN™, Novo Nordisk), 및 크윅펜(KWIKPEN™, Eli Lilly), 수레클릭(SURECLICK™) 자기주사기(Amgen, Thousand Oaks, CA), 펜렛(PENLET™, Haselmeier, Stuttgart, Germany), 에피펜(EPIPEN, Dey, L.P.) 및 휴미라(HUMIRA™) 펜(Abbott Labs, Abbott Park, IL)을 포함하지만, 반드시 이들에 제한되지 않는다.
유리하게는, 상기 기재된 경구 또는 비경구 사용을 위한 약제학적 조성물은 활성 성분의 용량을 맞추기에 적합한 단위 용량의 투여형으로 제조된다. 이러한 단위 용량의 투여형은, 예를 들면, 정제, 알약, 캡슐, 주사액(앰풀), 좌제 등을 포함한다. 함유된 항체의 양은 일반적으로 단위 용량; 특히 주사 형태의 투여형당 약 5 내지 약 500mg이며, 항체가 약 5 내지 약 100mg 및 다른 투여형에 대해 약 10 내지 약 250mg으로 함유되는 것이 바람직하다.
항체의 치료적 용도
본 발명의 항체는, 특히, PD-1 발현, 시그널링 또는 활성과 관련되거나 이에 의해 매개되거나, 또는 PD-1과 PD-1 리간드(예: PD-L1 또는 PD-L2) 간의 상호작용을 차단하거나 그 밖에 PD-1 활성 및/또는 시그널링을 억제함으로써 치료가능한 임의의 질환 또는 장애의 치료, 예방 및/또는 개선에 유용하다. 예를 들면, 본 발명은 본원에 기재된 항-PD-1 항체(또는 항-PD-1 항체를 포함하는 약제학적 조성물)를 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 암(종양 성장 억제), 만성 바이러스 감염 및/또는 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 항체는 암, 자가면역 질환 또는 바이러스 감염과 같은 질환 또는 장애 또는 병태를 치료, 예방 및/또는 개선하는데 및/또는 이러한 질환, 장애 또는 병태와 관련된 적어도 하나의 증상을 개선하는데 유용하다. 본원에 기재된 치료 방법의 맥락에서, 항-PD-1 항체는 단일요법으로(즉, 유일한 치료제로서) 또는 하나 이상의 추가의 치료제(이의 예는 본원의 다른 곳에 기재되어 있다)와 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 일부 양태에서, 본원에 기재된 항체는 신장세포 암종, 결장직장 암, 비-소세포 폐암, 뇌암(예: 다형성 교모세포종), 두경부의 편평세포 암종, 위암, 전립선암, 난소암, 신장암, 유방암, 다발성 골수종 및 흑색종을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는 원발성 또는 재발성 암을 앓고 있는 피험자의 치료에 유용하다.
상기 항체는 암의 조기 단계 또는 후기-단계 증상을 치료하는데 사용될 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 전이암을 치료하는데 사용될 수 있다. 상기 항체는 고체 종양 및 혈액암(blood cancer) 둘 모두의 종양 성장을 감소시키거나 억제하거나 수축시키는데 유용하다. 특정 양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로의 처리는 피험자에서 종양의 50% 이상의 퇴행, 60% 이상의 퇴행, 70% 이상의 퇴행, 80% 이상의 퇴행, 90% 이상의 퇴행을 야기한다. 특정 양태에서, 상기 항체는 종양의 재발을 예방하는데 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 상기 항체는 암을 갖는 피험자에서 전체 생존을 연장하는데 유용하다. 일부 양태에서, 상기 항체는 암을 앓고 있는 환자에서 장기간 생존을 유지하면서 화학요법 또는 방사선요법으로 인한 독성을 감소시키는데 유용하다.
특정 양태에서, 본 발명의 항체는 만성 바이러스 감염을 앓고 있는 피험자를 치료하는데 유용하다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체는 숙주에서 바이러스 역가(viral titer)를 감소시키고/시키거나 고갈된 T-세포를 되찾는데 유용하다. 특정 양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 림프구성 맥락수막염 바이러스(LCMV)에 의한 만성 바이러스 감염을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 사람 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 사람 유두종 바이러스(HPV) 또는 B형/C형 간염 바이러스(HBV/HCV)에 의한 감염을 갖는 환자에게 치료적 용량으로 투여될 수 있다. 관련된 양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 사이노몰구스와 같은 원숭이 피험자에서 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV)에 의한 감염을 치료하는데 사용될 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 차단 항체는 암 또는 바이러스 감염을 앓고 있는 피험자에게 치료적 유효량으로 투여될 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 항체는 원형탈모증, 자가면역 간염, 복강 질환, 그레이브스병(Graves' disease), 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 하시모토병(Hashimoto's disease), 용혈 빈혈, 염증성 장 질환, 염증성 근육병증, 다발성 경화증, 원발성 담관 간경화, 건선, 류마티스 관절염, 피부경화증, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 전신 홍반성 낭창, 백반증, 자가면역 췌장염, 자가면역 두드러기(autoimmune urticaira), 자가면역 혈소판감소 자색반병, 크론병, 제I형 당뇨병, 호산구성 근막염, 호산구성 위장염, 굿파스처 증후군(Goodpasture's syndrome), 중증근육무력증, 건선성 관절염, 류마티스 열, 궤양성 대장염, 혈관염 및 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis)을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는 자가면역 질환을 치료하는데 유용하다. 특정 양태에서, 본 발명의 활성화 항체는 자가면역 질환을 앓는 피험자를 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 항체는 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상 또는 상태를 완화하거나 예방하거나 이의 중증도를 감소시키도록 투여될 수 있다.
암, 자가면역 질환 및 만성 바이러스 감염과 같은 질환 또는 장애의 발병 위험에 있는 환자에서 본 발명의 하나 이상의 항체를 예방적으로 사용하는 것이 본원에 또한 고려된다.
본 발명의 추가의 양태에서 본 항체는 암, 자가면역 질환 또는 바이러스 감염을 앓고 있는 환자를 치료하기 위한 약제학적 조성물의 제조에 사용된다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 본 항체는 암, 자가면역 질환 또는 바이러스 감염의 치료에 유용한 당업자에게 공지된 임의의 다른 제제 또는 임의의 다른 요법과 함께 보조 요법으로 사용된다.
병용 요법 및 제형
병용 요법은 본 발명의 항-PD-1 항체 및 본 발명의 항체, 또는 본 발명의 항체의 생물학적 활성 단편과 유리하게 배합될 수 있는 임의의 추가의 치료제를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는, 예를 들면, 신장세포 암종, 결장직장암, 다형성 교모세포종, 두경부의 편평세포 암종, 비-소세포 폐암, 결장암, 난소암, 선암종, 전립선암, 신경아교종 및 흑색종을 포함하는 암을 치료하는데 사용되는 하나 이상의 항암 약물 또는 요법과 상승적으로 배합될 수 있다. 종양 성장을 억제하고/하거나 암 환자의 생존을 증진시키기 위해 본 발명의 항-PD-1 항체를 면역자극 및/또는 면역억제 요법과 함께 사용하는 것이 본원에 고려된다. 면역자극 요법은 억제된 면역 세포에 대해 "브레이크를 풀거나(releasing the brake)" 면역 반응을 활성화시키기 위해 "가속페달을 밟음(stepping on the gas)"으로써 면역 세포 활성을 증가시키는 직접적인 면역자극 요법을 포함한다. 예로는 다른 체크포인트 수용체의 표적화, 백신화 및 애쥬번트(adjuvant)를 포함한다. 면역억제 방식은 면역원성 세포사, 염증을 촉진시킴으로써 종양의 항원성을 증가시킬 수 있거나 항-종양 면역 반응을 촉진시키는 다른 간접적인 효과를 갖는다. 예로는 방사선, 화학요법, 항-혈관형성 제제 및 수술을 포함한다.
다양한 양태에서, 본 발명의 하나 이상의 항체는 PD-L1에 대한 항체, PD-1에 대한 제2 항체(예: 니볼루맙), LAG-3 억제제, CTLA-4 억제제(예: 이플리무맙), TIM3 억제제, BTLA 억제제, TIGIT 억제제, CD47 억제제, 또 다른 T-세포 공-억제제 또는 리간드의 길항제(예: CD-28, 2B4, LY108, LAIR1, ICOS, CD160 또는 VISTA에 대한 항체), 인돌아민-2,3-디옥시게나제(IDO) 억제제, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 길항제[예: "VEGF-Trap" 예를 들면, US 7,087,411에 기재된 아플리베르셉트 또는 다른 VEGF-억제 융합 단백질, 또는 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예: 베바시주맙 또는 라니비주맙) 또는 VEGF 수용체의 소분자 키나제 억제제(예: 수니티닙, 소라페닙 또는 파조파닙)], Ang2 억제제(예: 네스바쿠맙), 형질전환 성장 인자 베타(TGFβ) 억제제, 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 억제제(예: 에를로티닙, 세툭시맙), 공-자극 수용체에 대한 작용제(예: 글루코코르티코이드-유도된 TNFR-관련된 단백질에 대한 작용제), 종양-특이적 항원에 대한 항체(예: CA9, CA125, 흑색종-관련된 항원 3(MAGE3), 암배아 항원(CEA), 비멘틴, 종양-M2-PK, 전립선-특이적 항원(PSA), 뮤신-1, MART-1 및 CA19-9), 백신(예: 바실러스 칼메트-게랭(Bacillus Calmette-Guerin), 암 백신), 항원 전달을 증가시키는 애쥬번트(예: 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자), 이중특이적 항체(예: CD3xCD20 이중특이적 항체, PSMAxCD3 이중특이적 항체), 세포독소, 화학요법제(예: 다카르바진, 테모졸로마이드, 사이클로포스파미드, 도세탁셀, 독소루비신, 다우노루비신, 시스플라틴, 카보플라틴, 겜시타빈, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 옥살리플라틴, 파클리탁셀 및 빈크리스틴), 사이클로포스파미드, 방사선요법, IL-6R 억제제(예: 사릴루맙), IL-4R 억제제(예: 두필루맙), IL-10 억제제, 사이토카인, 예를 들면, IL-2, IL-7, IL-21 및 IL-15, 항체-약물 접합체(ADC)(예: 항-CD19-DM4 ADC 및 항-DS6-DM4 ADC), 항염증 약물(예: 코르티코스테로이드 및 비-스테로이드 항염증 약물), 식이 보충제, 예를 들면, 항산화제 또는 암 치료를 위한 임의의 완화 치료(palliative care)와 함께 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 항-종양 반응을 증가시키기 위한 수지상 세포 백신, 종양용해(oncolytic) 바이러스, 종양 세포 백신 등을 포함하는 암 백신과 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 항-PD-1 항체와 함께 사용될 수 있는 암 백신의 예는 흑색종 및 방광암을 위한 MAGE3 백신, 유방암을 위한 MUC1 백신, 뇌암(다형성 교모세포종 포함)을 위한 EGFRv3(예: 린도페피무트), 또는 (CEA+ 암을 위한) ALVAC-CEA를 포함한다.
특정 양태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 장기간 지속가능한 항-종양 반응을 초래하고/하거나 암을 갖는 환자의 생존을 증진시키는 방법에서 방사선 요법과 함께 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 암 환자에게 방사선 요법의 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후 투여될 수 있다. 예를 들면, 방사선 요법을 종양 병변에 대해 하나 이상의 용량으로 투여한 후 하나 이상의 용량의 본 발명의 항-PD-1 항체를 투여할 수 있다. 일부 양태에서, 방사선 요법은 환자 종양의 국소 면역원성을 증진(보조(adjuvinating) 방사선)시키고/시키거나 종양 세포를 사멸(절제 방사선)시키도록 종양 병변에 국소적으로 투여된 후 본 발명의 항-PD-1 항체를 전신 투여할 수 있다. 예를 들면, 두개내 방사선은 본 발명의 항-PD-1 항체의 전신 투여와 함께 뇌암(예: 다형성 교모세포종)을 갖는 환자에게 투여될 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 방사선 요법 및 화학요법제(예: 테모졸로마이드) 또는 VEGF 길항제(예: 아플리베르셉트)와 함께 투여될 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 LCMV, HIV, HPV, HBV 또는 HCV에 의해 유발된 만성 바이러스 감염을 치료하기 위한 하나 이상의 항바이러스 약물와 함께 투여될 수 있다. 항바이러스 약물의 예는 지도부딘, 라미부딘, 아바카비르, 리바비린, 로피나비르, 에파비렌즈, 코비시스타트, 테노포비르, 릴피비린 및 코르티코스테로이드를 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 LAG3 억제제, CTLA-4 억제제 또는 만성 바이러스 감염을 치료하기 위한 또 다른 T-세포 공-억제제의 임의의 길항제와 함께 투여될 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 자가면역 질환의 치료를 위한 면역 세포 상의 Fc 수용체에 대한 항체와 조합될 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 자가면역 조직에 특이적인 항원에 표적화된 항체 또는 항원-결합 단백질과 함께 투여된다. 특정 양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, Fcα(예: CD89), Fcγ(예: CD64, CD32, CD16a 및 CD16b), CD19 등을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는, T-세포 수용체 또는 B-세포 수용체에 표적화된 항체 또는 항원-결합 단백질과 함께 투여된다. 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 원형탈모증, 자가면역 간염, 복강 질환, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토병, 용혈 빈혈, 염증성 장 질환, 염증성 근육병증, 다발성 경화증, 원발성 담관 간경화, 건선, 류마티스 관절염, 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 낭창, 백반증, 자가면역 췌장염, 자가면역 두드러기, 자가면역 혈소판감소 자색반병, 크론병, 제I형 당뇨병, 호산구성 근막염, 호산구성 위장염, 굿파스처 증후군, 중증근육무력증, 건선성 관절염, 류마티스 열, 궤양성 대장염, 혈관염 및 베게너 육아종증을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는 자가면역 질환 또는 장애를 치료하기 위한 당해 분야에 공지된 임의의 약물 또는 요법(예: 코르티코스테로이드 및 다른 면역억제제)과 함께 사용될 수 있다.
추가의 치료적 활성제(들)/활성 요소(들)는 본 발명의 항-PD-1 항체의 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후 투여될 수 있다. 본 개시내용의 목적을 위해, 이러한 투여 요법은 제2 치료적 활성 요소화 "함께" 항-PD-1 항체를 투여하는 것으로 여겨진다.
추가의 치료적 활성 요소(들)는 본 발명의 항-PD-1 항체의 투여 전에 피험자에게 투여될 수 있다. 예를 들면, 제1 요소는 상기 제1 요소가 제2 요소의 투여 1주 전, 72시간 전, 60시간 전, 48시간 전, 36시간 전, 24시간 전, 12시간 전, 6시간 전, 5시간 전, 4시간 전, 3시간 전, 2시간 전, 1시간 전, 30분 전, 15분 전, 10분 전, 5분 전, 1분 미만 전에 투여된 경우, 상기 제2 요소 투여 "전" 투여된 것으로 간주될 수 있다. 다른 양태에서, 추가의 치료적 활성 요소(들)는 본 발명의 항-PD-1 항체의 투여 후 피험자에게 투여될 수 있다. 예를 들면, 제1 요소는 상기 제1 요소가 제2 요소의 투여 1분 후, 5분 후, 10분 후, 15분 후, 30분 후, 1시간 후, 2시간 후, 3시간 후, 4시간 후, 5시간 후, 6시간 후, 12시간 후, 24시간 후, 36시간 후, 48시간 후, 60시간 후, 72시간 후 투여된 경우, 제2 요소 투여 "후" 투여된 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 양태에서, 추가의 치료적 활성 요소(들)는 본 발명의 항-PD-1 항체의 투여와 동시에 피험자에게 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위한 "동시" 투여는, 예를 들면, 항-PD-1 항체 및 추가의 치료적 활성 요소를 단일 투여형으로(예: 공-제형화됨), 또는 서로 약 30분 이하 내에 피험자에게 투여되는 독립된 투여형으로 피험자에게 투여함을 포함한다. 독립된 투여형으로 투여되는 경우, 각각의 투여형은 동일한 경로를 통해 투여될 수 있으며(예를 들면, 항-PD-1 항체 및 추가의 치료적 활성 요소 모두는 정맥내, 피하 등으로 투여될 수 있다); 대안적으로, 각각의 투여형은 상이한 경로를 통해 투여될 수 있다(예를 들면, 항-PD-1 항체는 정맥내로 투여될 수 있고, 추가의 치료적 활성 요소는 피하로 투여될 수 있다). 어느 경우든, 단일 투여형으로, 동일한 경로에 의한 독립된 투여형으로, 또는 상이한 경로에 의한 독립된 투여형으로의 요소들의 투여는 모두 본 개시내용의 목적을 위한 "동시 투여"인 것으로 여겨진다. 본 개시내용의 목적을 위해, 추가의 치료적 활성 요소의 투여 "전", 투여와 "동시에", 또는 투여 "후"(이들 용어들은 상기 본원에 정의됨) 항-PD-1 항체의 투여는 추가의 치료적 활성 요소와 "함께" 항-PD-1 항체를 투여하는 것으로 여겨진다.
본 발명은 본 발명의 항-PD-1 항체가 본원의 다른 곳에 기재된 하나 이상의 추가의 치료적 활성 요소(들)와 다양한 투여량 배합을 사용하여 공-제형화되는 약제학적 조성물을 포함한다.
본 발명의 항-PD-1 항체 및 VEGF 길항제를 포함하는 공-제형의 투여를 포함하는, 항-PD-1 항체가 VEGF 길항제(예: 아플리베르셉트와 같은 VEGF trap)와 함께 투여되는 예시적인 양태에서, 개별 요소들은 다양한 투여량 배합을 사용하여 피험자에게 투여되고/되거나 공-제형화될 수 있다. 예를 들면, 상기 항-PD-1 항체는 0.01mg, 0.02mg, 0.03mg, 0.04mg, 0.05mg, 0.1mg, 0.2mg, 0.3mg, 0.4mg, 0.5mg, 0.6mg, 0.7mg, 0.8mg, 0.9mg, 1.0mg, 1.5mg, 2.0mg, 2.5mg, 3.0mg, 3.5mg, 4.0mg, 4.5mg, 5.0mg, 6.0mg, 7.0mg, 8.0mg, 9.0mg 및 10.0mg으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 양으로 피험자에게 투여되고/되거나 공-제형에 함유될 수 있고; VEGF 길항제(예: 아플리베르셉트와 같은 VEGF trap)는 0.1mg, 0.2mg, 0.3mg, 0.4mg, 0.5mg, 0.6mg, 0.7mg, 0.8mg, 0.9mg, 1.0mg, 1.1mg, 1.2mg, 1.3mg, 1.4mg, 1.5mg, 1.6mg, 1.7mg, 1.8mg, 1.9mg, 2.0mg, 2.1mg, 2.2mg, 2.3mg, 2.4mg, 2.5mg, 2.6mg, 2.7mg, 2.8mg, 2.9mg 및 3.0mg으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 양으로 피험자에게 투여되고/되거나 공-제형에 함유될 수 있다. 상기 배합물/공-제형은, 예를 들면, 1주당 2회, 1주당 1회, 2주당 1회, 3주당 1회, 1개월당 1회, 2개월당 1회, 3개월당 1회, 4개월당 1회, 5개월당 1회, 6개월당 1회 등을 포함하는, 본원의 다른 곳에 개시된 투여 요법 중 어느 것에 따라서 피험자에게 투여될 수 있다.
투여 요법
본 발명의 특정 양태에 따르면, 다중 용량의 항-PD-1 항체(또는 항-PD-1 항체, 및 본원에 언급된 추가의 치료적 활성제 중 어느 것의 배합물을 포함하는 약제학적 조성물)는 한정된 시간에 걸쳐 피험자에게 투여될 수 있다. 본 발명의 이러한 측면에 따르는 방법은 다중 용량의 본 발명의 항-PD-1 항체를 피험자에게 순차적으로 투여함을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "순차적인 투여"는 각 용량의 항-PD-1 항체가 상이한 시점에, 예를 들면, 정해진 간격(예: 시간, 일, 주 또는 개월)으로 떨어진 상이한 날에 피험자에게 투여됨을 의미한다. 본 발명은 항-PD-1 항체의 단일 초기 용량, 이어서 항-PD-1 항체의 하나 이상의 2차 용량, 및 임의로 항-PD-1 항체의 하나 이상의 3차 용량을 환자에게 순차적으로 투여함을 포함하는 방법을 포함한다. 항-PD-1 항체는 0.1mg/kg 내지 100mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다.
용어 "초기 용량", "2차 용량" 및 "3차 용량"은 본 발명의 항-PD-1 항체의 투여의 시간적 순서를 나타낸다. 따라서, "초기 용량"은 치료 요법의 개시시 투여된 용량이고(또한 "기저선 용량"으로도 지칭됨); "2차 용량"은 초기 용량 후 투여된 용량이고; "3차 용량"은 2차 용량 후 투여된 용량이다. 초기, 2차 및 3차 용량은 모두 동일한 양의 항-PD-1 항체를 함유할 수 있지만, 일반적으로 투여 빈도의 측변에서 서로 상이할 수 있다. 그러나, 특정 양태에서, 초기, 2차 및/또는 3차 용량에 함유된 항-PD-1 항체의 양은 치료 과정 동안 서로 상이하다(예를 들면, 적절한 경우 상향 또는 하향으로 조정됨). 특정 양태에서, 2개 이상의(예: 2, 3, 4 또는 5개) 용량은 "부하 용량"으로서 치료 요법의 개시시 투여된 후 더 적은 빈도로 투여되는 차후의 용량(예: "유지 용량")으로 투여된다.
본 발명의 특정 예시적인 양태에서, 각각의 2차 및/또는 3차 용량은 직전 용량을 투여하고 1 내지 26주(예: 1, 1½, 2, 2½, 3, 3½, 4, 4½, 5, 5½, 6, 6½, 7, 7½, 8, 8½, 9, 9½, 10, 10½, 11, 11½, 12, 12½, 13, 13½, 14, 14½, 15, 15½, 16, 16½, 17, 17½, 18, 18½, 19, 19½, 20, 20½, 21, 21½, 22, 22½, 23, 23½, 24, 24½, 25, 25½, 26, 26½ 또는 그 이상의 주) 후에 투여된다. 본원에서 사용된 어구 "직전 용량"은, 다중 투여의 순서에서, 개재 용량 없이 상기 순서에서 바로 다음 용량의 투여 전 환자에게 투여되는 항-PD-1 항체의 용량을 의미한다.
본 발명의 이러한 측면에 따르는 방법은 임의의 수의 2차 및/또는 3차 용량의 항-PD-1 항체를 환자에게 투여함을 포함할 수 있다. 예를 들면, 특정 양태에서, 단지 단일 2차 용량을 환자에게 투여한다. 다른 양태에서, 2개 이상(예: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 이상)의 2차 용량을 환자에게 투여한다. 마찬가지로, 특정 양태에서, 단지 단일 3차 용량을 환자에게 투여한다. 다른 양태에서, 2개 이상(예: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 이상)의 3차 용량을 환자에게 투여한다.
다수의 2차 용량을 수반하는 양태에서, 각각의 2차 용량은 다른 2차 용량과 동일한 빈도로 투여될 수 있다. 예를 들면, 각각의 2차 용량은 직전 용량을 투여하고 1 내지 2주 또는 1 내지 2개월 후에 환자에게 투여될 수 있다. 유사하게, 다수의 3차 용량을 수반하는 양태에서, 각각의 3차 용량은 다른 3차 용량과 동일한 빈도로 투여될 수 있다. 예를 들면, 각각의 3차 용량은 직전 용량을 투여하고 2 내지 12주 후에 환자에게 투여될 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 2차 및/또는 3차 용량이 환자에게 투여되는 빈도는 치료 요법의 과정에 걸쳐서 가변적일 수 있다. 투여 빈도는 또한 임상 검사 후 개별 환자의 요구에 따라서 치료 과정 동안 의사에 의해 조정될 수 있다.
본 발명은 2 내지 6개의 부하 용량을 환자에게 제1 빈도(예: 1주당 1회, 2주당 2회, 3주당 1회, 1개월당 1회, 2개월당 1회 등)로 투여하고, 이어서 2개 이상의 유지 용량을 더 적은 빈도로 환자에게 투여하는 투여 요법을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 이러한 측면에 따르면, 부하 용량이, 예를 들면, 1개월당 1회의 빈도로 투여되는 경우(예를 들면, 2, 3, 4개 이상의 부하 용량이 1개월당 1회 투여되는 경우), 유지 용량은 5주당 1회, 6주당 1회, 7주당 1회, 8주당 1회, 10주당 1회, 12주당 1회 등으로 환자에게 투여될 수 있다.
항체의 진단 용도
본 발명의 항-PD-1 항체는, 예를 들면, 진단 목적을 위해 샘플에서 PD-1을 검출하고/하거나 측정하는데 사용될 수 있다. 일부 양태는 암, 자가면역 질환 또는 만성 바이러스 감염과 같은 질환 또는 장애를 검출하는 검정에서 본 발명의 하나 이상의 항체의 사용을 고려한다. PD-1에 대한 예시적인 진단 검정은, 예를 들면, 환자로부터 수득된 샘플을 본 발명의 항-PD-1 항체와 접촉시킴을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 항-PD-1 항체는 검출가능한 표지 또는 리포터 분자로 표지되거나 환자 샘플로부터 PD-1을 선택적으로 단리하는 포획 리간드로서 사용된다. 대안적으로, 표지되지 않은 항-PD-1 항체는 그 자체로 검출가능하게 표지되는 2차 항체와 함께 진단 용도로 사용될 수 있다. 검출가능한 표지 또는 리포터 분자는 방사성동위원소, 예를 들면, 3H, 14C, 32P, 35S 또는 125I; 플루오레세인 이소티오시아네이트 또는 로다민과 같은 형광성 또는 화학발광 모이어티; 또는 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 루시퍼라제와 같은 효소일 수 있다. 샘플에서 PD-1을 검출하거나 측정하는데 사용될 수 있는 구체적인 예시적 검정은 효소-결합 면역흡착 검정(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA), 방사면역측정법(RIA), 및 형광-활성화된 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting; FACS)를 포함한다.
본 발명에 따르는 PD-1 진단 검정에 사용될 수 있는 샘플은 환자로부터 수득가능한 임의의 조직 또는 유체 샘플을 포함하며, 이는 정상 또는 병적 상태 하에 검출가능한 양의 PD-1 단백질 또는 이의 단편을 함유한다. 일반적으로, 건강한 환자(예: 암 또는 자가면역 질환에 걸리지 않은 환자)로부터 수득된 특정 샘플에서의 PD-1 수준을 측정하여 PD-1의 기저선 또는 표준 수준을 초기에 확립할 것이다. 이후, 이러한 PD-1의 기저선 수준을 암-관련된 병태, 또는 이러한 병태와 관련된 증상을 갖는 것으로 의심되는 개인으로부터 수득된 샘플에서 측정된 PD-1의 수준과 비교할 수 있다.
PD-1에 특이적인 항체는 추가의 표지 또는 모이어티를 함유하지 않을 수 있거나, N-말단 또는 C-말단 표지 또는 모이어티를 함유할 수 있다. 한 양태에서, 상기 표지 또는 모이어티는 비오틴이다. 결합 검정에서, 표지(존재하는 경우)의 위치는 펩타이드가 결합되는 표면에 대한 펩타이드의 배향을 결정할 수 있다. 예를 들면, 표면이 아비딘으로 코팅되는 경우, N-말단 비오틴을 함유하는 펩타이드는 상기 펩타이드의 C-말단 부분이 표면에서 먼 쪽에 위치되도록 배향될 것이다.
본 발명의 측면은 환자에서 암 또는 자가면역 장애의 예후를 예측하기 위한 마커로서의 개시된 항체의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 환자에서 암의 예후를 평가하고 생존을 예측하기 위한 진단 검정에 사용될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 당업자에게 본 발명의 방법 및 조성물의 제조 방법 및 사용 방법의 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 기재되며, 본 발명자들이 이들의 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 사용된 수치들(예: 양, 온도 등)에 대해 정확도를 확보하려는 노력이 이루어졌지만, 일부 실험적인 오차 및 편차는 해명되어야 한다. 달리 지시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이고, 실온은 약 25℃이고, 압력은 대기압에서 또는 대기압 인근이다.
실시예 1: PD-1에 대한 사람 항체의 생성
PD-1에 대한 사람 항체를 C93S 변화를 갖는 진뱅크 수탁 NP_005009.2(서열 번호: 327)의 대략 아미노산 25 내지 170 범위의 PD-1의 단편을 사용하여 제조했다. 면역 반응을 자극하기 위해 면역원을 애쥬번트와 함께 사람 면역글로불린 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 DNA를 포함하는 벨록이뮨 마우스에 직접 투여했다. 항체 면역 반응을 PD-1-특이적 면역검정으로 모니터링했다. 목적하는 면역 반응을 달성하면, 비장세포를 수거하고, 마우스 골수종 세포와 융합하여 이의 생존력을 보존하고 하이브리도마 세포주를 형성했다. 하이브리도마 세포주를 스크리닝하고 선별하여 PD-1-특이적 항체를 생산하는 세포주를 확인했다. 이 기술 및 상기 기재된 면역원을 사용하여, 수 개의 항-PD-1 키메라 항체(즉, 사람 가변 도메인 및 마우스 불변 도메인을 갖는 항체)를 수득했으며; 이러한 방식으로 제조된 예시적인 항체는 H1M7789N, H1M7799N, H1M7800N, H2M7780N, H2M7788N, H2M7790N, H2M7791N, H2M7794N, H2M7795N, H2M7796N 및 H2M7798N으로서 지정하였다.
이의 전문이 참조로 본원에 구체적으로 포함된, U.S. 2007/0280945A1에 기재된 바와 같이, 항-PD-1 항체를 골수종 세포로의 융합 없이 항원-양성(antigen-positive) B 세포로부터 직접적으로 단리했다. 이 방법을 사용하여, 수 개의 완전 사람 항-PD-1 항체(즉, 사람 가변 도메인 및 사람 불변 도메인을 갖는 항체)를 수득했으며; 이러한 방식으로 제조된 예시적인 항체는 하기와 같이 지정하였다: H4H9019P, H4xH9034P2, H4xH9035P2, H4xH9037P2, H4xH9045P2, H4xH9048P2, H4H9057P2, H4H9068P2, H4xH9119P2, H4xH9120P2, H4xH9128P2, H4xH9135P2, H4xH9145P2, H4xH8992P, H4xH8999P 및 H4xH9008P.
본 실시예의 방법에 따라서 제조된 예시적인 항체의 생물학적 특성은 하기 기재된 실시예에 상세히 기재된다.
실시예 2: 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열
표 1은 본 발명의 선택된 항-PD-1 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 CDR의 아미노산 서열 식별자를 기재한다. 상응하는 핵산 서열 식별자는 표 2에 기재된다.
Figure pat00001
Figure pat00002
항체는 통상적으로 하기 명명법에 따라 본원에 지칭된다: Fc 접두사(예: "H4xH", "H1M", "H2M" 등), 이어서 수치적 식별자(예: 표 1에서 보여주는 바와 같이 "7789", "7799" 등), 이어서 "P", "P2", "N" 또는 "B" 접미사. 따라서, 상기 명명법에 따르면, 항체는 본원에서, 예를 들면, "H1H7789N", "H1M7799N", "H2M7780N" 등으로 지칭될 수 있다. 본원에 사용된 항체 명칭에서 H4xH, H1M, H2M 및 H2aM 접두사는 항체의 특정 Fc 영역 이소형을 지시한다. 예를 들면, "H4xH" 항체는 US20100331527에 개시된 바와 같이 2개 이상의 아미노산 변화를 갖는 사람 IgG4 Fc를 가지며, "H1M" 항체는 마우스 IgG1 Fc를 가지며, "H2M" 항체는 마우스 IgG2 Fc(a 또는 b 이소형)를 갖는다(모든 가변 영역은 항체 명칭에서 첫번째 'H'로 표시된 완전 사람이다). 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 특정 Fc 이소형을 갖는 항체는 상이한 Fc 이소형을 갖는 항체로 전환될 수 있으며(예를 들면, 마우스 IgG1 Fc를 갖는 항체는 사람 IgG4 등을 갖는 항체로 전환될 수 있다), 어떠한 경우든, 표 1에 나타난 수치적 식별자에 의해 지시된 가변 도메인(CDR 포함)은 동일하게 유지될 것이며, 항원에 대한 결합 특성은 Fc 도메인의 성질과 무관하게 동일하거나 실질적으로 유사한 것으로 예상된다.
특정 양태에서, 마우스 IgG1 Fc를 갖는 선별된 항체는 사람 IgG4 Fc를 갖는 항체로 전환되었다. 한 양태에서, IgG4 Fc 도메인은 이량체 안정화를 촉진시키기 위해 힌지 영역(S108P)에서 세린 대 프롤린 돌연변이를 포함한다. 표 3은 사람 IgG4 Fc를 갖는 선별된 항-PD-1 항체의 중쇄 및 경쇄 서열의 아미노산 서열 식별자를 기재한다.
Figure pat00003
표 3에서 각각의 중쇄 서열은 가변 영역(VH 또는 HCVR; HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 포함) 및 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3 도메인 포함)을 포함했다. 표 3에서 각각의 경쇄 서열은 가변 영역(VL 또는 LCVR; LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 포함) 및 불변 영역(CL)을 포함했다. 서열 번호: 330은 아미노산 1 내지 117을 포함하는 HCVR, 및 아미노산 118 내지 444를 포함하는 불변 영역을 포함했다. 서열 번호: 331은 아미노산 1 내지 107을 포함하는 LCVR, 및 아미노산 108 내지 214를 포함하는 불변 영역을 포함했다. 서열 번호: 332는 아미노산 1 내지 122를 포함하는 HCVR, 및 아미노산 123 내지 449를 포함하는 불변 영역을 포함했다. 서열 번호: 333은 아미노산 1 내지 107을 포함하는 LCVR, 및 아미노산 108 내지 214를 포함하는 불변 영역을 포함했다. 서열 번호: 334는 아미노산 1 내지 119를 포함하는 HCVR, 및 아미노산 120 내지 446을 포함하는 불변 영역을 포함했다. 서열 번호: 335는 아미노산 1 내지 108을 포함하는 LCVR, 및 아미노산 109 내지 215를 포함하는 불변 영역을 포함했다. 서열 번호: 336을 아미노산 1 내지 121을 포함하는 HCVR, 및 아미노산 122 내지 448을 포함하는 불변 영역을 포함했다. 서열 번호: 337은 아미노산 1 내지 108을 포함하는 LCVR, 및 아미노산 109 내지 215를 포함하는 불변 영역을 포함했다.
실시예 3: 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 PD-1에 대한 항체 결합
정제된 항-PD1 항체에 대한 항원 결합에 대한 결합 연합(association) 및 해리 속도 상수(각각 k a 및 k d), 평형 해리 상수 및 해리 반감기(각각 K D 및 t½)를 비아코어 4000 또는 비아코어 T200 기기상에서 실시간 표면 플라즈몬 공명 바이오센서 검정을 사용하여 측정하였다. 비아코어 센서 표면을 각각 마우스 Fc 또는 사람 Fc와 함께 발현된, 다클론 토끼 항-마우스 항체(GE, # BR-1008-38) 또는 모노클로날 마우스 항-사람 Fc 항체(GE, # BR-1008-39)로 유도체화시켜 대략 100 내지 900 RU의 항-PD-1 모노클로날 항체를 포획하였다. 항-PD-1 항체에 대한 결합에 대해 시험된 PD-1 시약은 C-말단 myc-myc-헥사히스티딘 태그와 함께 발현된 재조합 사람 PD-1(hPD-1-MMH; 서열 번호: 321), C-말단 myc-myc-헥사히스티딘 태그와 함께 발현된 재조합 사이노몰구스 원숭이 PD-1(MfPD-1-MMH; 서열 번호: 322), C-말단 마우스 IgG2a Fc 태그(hPD-1-mFc; 서열 번호: 323) 또는 C-말단 사람 IgG1 Fc(hPD1-hFc; 서열 번호: 324)와 함께 발현된 재조합 사람 PD-1 이량체, 및 mFc를 갖는 원숭이 PD-1(서열 번호: 329)을 포함했다. 200nM 내지 3.7nM 범위의 상이한 농도의 PD-1 시약을 비아코어 4000 상에서 30μL/min의 유속으로 또는 비아코어 T200 상에서 50μL/min의 유속으로 항-PD-1 모노클로날 항체 포획된 표면 위에 주입했다. 포획된 모노클로날 항체에 대한 PD-1 시약의 결합을 3 내지 5분 동안 모니터링하는 한편, 상기 항체로부터 이들의 해리를 HBST 실행 완충액(0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.05% v/v 계면활성제 P20)에서 7 내지 10분 동안 모니터링했다. 실험을 25℃ 및 37℃에서 수행했다. 키네틱 연합(k a) 및 해리(k d) 속도 상수를 스크러버(Scrubber) 2.0c 곡선 피팅 소프트웨어를 사용하여 데이타를 1:1 결합 모델로 처리하고 피팅하여 측정하였다. 이어서 결합 해리 평형 상수(K D) 및 해리 반감기(t1/2)를 키네틱 속도 상수로부터 계산했다: K D (M) = k d / k a 및 t½(min) = [ln2/(60*k d)]. 25℃ 및 37℃에서 상이한 PD-1 시약에 대한 상이한 항-PD-1 모노클로날 항체 결합의 결합 키네틱 파라미터는 표 4 내지 11에서 표로 작성되었다.
Figure pat00004
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표 4에서 보여주는 바와 같이, 25℃에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 29개 중 28개가 2.1nM 내지 291nM 범위의 K D 값으로 hPD-1-MMH에 결합했다. 하나의 항체, H4H9068P2는 25℃에서 hPD-1-MMH에 대한 임의의 측정가능한 결합을 입증하지 못했다. 표 5에서 보여주는 바와 같이, 37℃에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 29개 중 26개가 3.79nM 내지 1.51μM 범위의 K D 값으로 hPD-1-MMH에 결합했다. 본 발명의 3개의 항체는 37℃에서 hPD-1-MMH에 대한 임의의 확실한 결합을 입증하지 못했다. 표 6에서 보여주는 바와 같이, 25℃에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 29개 모두는 65.5pM 내지 59.4nM 범위의 K D 값으로 hPD-1 이량체 단백질에 결합했다. 표 7에서 보여주는 바와 같이, 37℃에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 27개 모두는 3.09pM 내지 551nM 범위의 K D 값으로 hPD-1 이량체 단백질에 결합했다. 표 8에서 보여주는 바와 같이, 25℃에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 29개 중 27개가 3.09nM 내지 551nM 범위의 K D 값으로 MfPD-1-MMH에 결합했다. 본 발명의 2개의 항체는 25℃에서 MfPD-1-MMH에 대한 임의의 확실한 결합을 입증하지 못했다. 표 9에서 보여주는 바와 같이, 37℃에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 29개 중 25개는 7.00nM 내지 7.54μM 범위의 K D 값으로 MfPD-1-MMH에 결합했다. 본 발명의 4개의 항체는 37℃에서 MfPD-1-MMH에 대한 임의의 확실한 결합을 입증하지 못했다. 표 10에서 보여주는 바와 같이, 25℃에서, 시험된 본 발명의 항-PD-1 항체 18개 모두는 137pM 내지 54.2nM 범위의 K D 값으로 MfPD-1 이량체에 결합했다. 표 11에서 보여주는 바와 같이, 37℃에서, 시험된 본 발명의 항-PD-1 항체 18개 모두는 49pM 미만 내지 86.3nM 범위의 K D 값으로 MfPD-1 이량체에 결합했다.
실시예 4: ELISA에 의해 측정된 PD-L1에 대한 PD-1 결합의 차단
리간드, PD-L1 수용체에 대한 사람 PD-1 결합을 차단하는 항-PD-1 항체의 능력을 3개의 경쟁 샌드위치 ELISA 포맷(competition sandwich ELISA format)을 사용하여 측정했다. C-말단 사람 Fc 태그(hPD-L1-hFc; 서열 번호: 325) 또는 C-말단 마우스 Fc 태그(hPD-L1-mFc; 서열 번호: 326)와 함께 발현된 사람 PD-L1 세포외 도메인의 일부로 구성된, 이량체성 사람 PD-L1 단백질, 또는 C-말단 사람 Fc 태그로 생산된 사람 PD-L2 세포외 영역로 구성된, 이량체성 사람 PD-L2(hPD-L2-hFc; R&D Systems, #1224-PL)를 4℃에서 밤새 96-웰 미량역가 플레이트 상에서 PBS 중 2μg/mL의 농도로 따로따로 코팅했다. 이후 비특이적 결합 부위를 PBS 중 0.5%(w/v) BSA 용액을 사용하여 차단했다. 제1 경쟁 포맷에서, C-말단 마우스 Fc 태그와 함께 발현된 사람 PD-1 세포외 도메인으로 구성된, 1.5nM의 이량체성 사람 PD-1 단백질(hPD-1-mFc; 서열 번호: 323)의 일정한 농도를 항-PD-1 항체 또는 이소형 대조군 항체의 연속적 희석물에 첨가하여 항체의 최종 농도가 0 내지 200nM 범위였다. 제2 경쟁 포맷에서, C-말단 사람 Fc 태그와 함께 발현된 사람 PD-1 세포외 도메인으로 구성된, 200pM의 이량체성 비오티닐화된 사람 PD-1 단백질(biot-hPD-1-hFc; 서열 번호: 323)의 일정한 농도를 0 내지 50nM 범위의 최종 항체 농도의 항-PD-1 항체 또는 이소형 대조군의 연속적 희석물에 유사하게 첨가했다. 제3 경쟁 포맷에서, 100pM의 이량체성 hPD-1-mFc 단백질의 일정한 농도를 0 내지 100nM 범위의 최종 항체 농도의 항-PD-1 항체 또는 이소형 대조군의 연속적 희석물에 유사하게 첨가했다. 이어서 이들 항체-단백질 복합체를 실온(RT)에서 1시간 동안 항온처리했다. 1.5nM 일정한 hPD-1-mFc를 갖는 항체-단백질 복합체를 hPD-L1-hFc로 코팅된 미량역가 플레이트에 옮기고, 200pM 일정한 biot-hPD-1-hFc를 갖는 항체-단백질 복합체를 hPD-L1-mFc 코팅된 플레이트에 옮기고, 100pM 일정한 hPD-1-mFc를 갖는 항체-단백질 복합체를 hPD-L2-hFc로 코팅된 미량역가 플레이트에 옮겼다. RT에서 1시간 동안 항온처리 후, 웰들을 세척하고, 플레이트-결합된 hPD-1-mFc를 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)와 접합된 항-mFc 다클론 항체(Jackson ImmunoResearch Inc., #115-035-164)로 검출하고, 플레이트-결합된 biot-hPD-1-hFc를 HRP와 접합된 스트렙타비딘으로 검출했다(Thermo Scientific, #N200). 샘플을 TMB 용액(BD Biosciences, #51-2606KC 및 #51-2607KC)으로 현상하여 비색 반응을 야기하고 이어서 1M 황산을 첨가하여 발색을 안정화시킨 후 빅터(Victor) X5 플레이트 판독기 상에서 450nm에서의 흡광도를 측정했다. 데이타 분석을 프리즘(Prism™) 소프트웨어(GraphPad) 내의 시그모이달(sigmoidal) 용량-반응 모델을 사용하여 수행했다. 사람 PD-L1 또는 PD-L2에 대한 사람 PD-1 결합의 50%를 감소시키는데 필요한 항체의 농도로서 정의된, 계산된 IC50 값을 차단 효능의 지표로서 사용했다. 퍼센트 최대 차단을 용량 곡선으로부터 결정된 바와 같이 플레이트 상의 사람 PD-L1 또는 PD-L2에 대한 사람 PD-1의 결합을 완전히 차단하는 항체 능력의 척도로서 계산했다. 이러한 퍼센트 최대 차단은 항-PD-1 항체를 함유하지 않는 사람 PD-1 샘플에 대해 관측된 신호(0% 차단)와 HRP-접합된 2차 항체 단독으로부터의 배경 신호(100% 차단) 사이의 차이에 대해 각각의 항체에 대한 최대 시험 농도의 존재 하에 관찰된 신호의 감소의 비를 100%로부터 공제하여 계산되었다.
35% 초과의 hPD-1 결합 신호를 차단하는 항체에 대한 퍼센트 최대 차단 및 계산된 IC50 값은 표 12 내지 표 14에서 보여준다. 35% 이하의 hPD-1 결합 신호의 감소를 나타내는 항체는 비-차단제로서 정의되었다. 사람 PD-1의 결합 신호에서 35% 이상의 증가를 보여주는 항체는 비-차단제/개선제(enhancer)로서 확인되었다. 상기 검정에서 사람 PD-1의 50% 결합 부위를 차지하는데 이론적으로 필요한 최소 항체 농도로서 정의된 이론적 검정 최저는 1.5nM 일정한 hPD-1-mFc를 사용한 포맷에 대해서는 0.75nM, 200pM 일정한 biot-hPD-1-hFc를 사용한 포맷에 대해서는 100pM, 100pM 일정한 hPD-1-mFc를 사용한 포맷에 대해서는 50pM이며, 이는 더 낮게 계산된 IC50 값이 정량적 단백질-항체 부위 결합을 나타내지 않을 수 있음을 지시한다. 이러한 이유로, hPD-1-mFc 일정 및 hPD-L1 코트(coat)를 갖는 검정에서 0.75nM 미만, biot-hPD-1-hFc 일정 및 hPD-L1 코트를 갖는 검정에서 100pM 미만, 및 hPD-1-mFc 일정 및 hPD-L2 코트를 갖는 검정에서 50pM 미만의 계산된 IC50 값을 갖는 항체는 표 12 내지 14에서 각각 <7.5E-10M, <1.0E-10M 및 <5.0E-11M로서 보고된다.
Figure pat00012
Figure pat00013
Figure pat00014
표 12에서 지시된 바와 같이, 제1 검정 포맷에서, 항-PD-1 항체 27개 중 23개는 190pM 내지 3.3nM 범위의 IC50 값 및 67% 내지 100% 범위의 최대 차단율로 1.5nM의 hPD-1-mFc가 hPD-L1-hFc에 결합하는 것을 차단했다. 하나의 항체, H2aM7796N은 비-차단제로서 확인되었다. 3개의 항-PD-1 항체(H4H9068P2, H1M7789N 및 H2aM7791N)는 비-차단제/개선제로서 확인되었다.
표 13에서 보여주는 바와 같이, 제2 검정 포맷에서, 항-PD-1 항체 27개 중 23개는 59pM 내지 1.3nM 범위의 IC50 값 및 60% 내지 101% 범위의 최대 차단율로 200pM의 biot-hPD-1-hFc가 hPD-L1-mFc에 결합하는 것을 차단했다. 하나의 항체, H1M7789N은 비-차단제로서 확인되었다. 3개의 항-PD-1 항체(H4H9057P2, H4H9068P2 및 H2aM7791N)는 비-차단제/개선제로서 확인되었다.
표 14에서 보여주는 바와 같은 제3 검정 포맷에서, 본 발명의 4개의 항-PD-1 항체, 및 이소형 대조군을 시험했다. 본 발명의 4개의 모든 항-PD-1 항체는 0.13nM 내지 1.3nM 범위의 IC50 값 및 94% 내지 100% 범위의 최대 차단율로 100pM(고정된 농도)의 hPD-1-mFc가 플레이트-코팅된 hPD-L2-hFc에 결합하는 것을 차단했다.
실시예 5: 바이오센서 검정 및 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 PD-L1에 대한 PD-1 결합의 차단
상이한 항-PD-1 모노클로날 항체에 의한 사람 PD-L1에 대한 사람 PD-1 결합의 억제를 Octet Red96 바이오센서 기기(Fortebio Inc.) 상에서 실시간 바이오-층(bio-layer) 간섭법 검정을 사용하거나 비아코어 3000 기기 상에서 실시간 표면 플라즈몬 공명 바이오센서 검정을 사용하여 연구하였다.
마우스 Fc와 함께 발현된 항-PD-1 모노클로날 항체에 대한 억제 연구를 Octet Red 96 기기상에서 수행했다. 우선, C-말단 마우스 IgG2a Fc 태그와 함께 발현된 재조합 사람 PD-1(hPD-1-mFc; 서열 번호: 323) 100nM를 각각의 항-PD-1 모노클로날 항체 500nM와 적어도 1시간 동안 항온처리한 후 억제 검정을 수행하였다. C-말단 사람 IgG1 Fc 태그와 함께 발현된 재조합 사람 PD-L1(hPD-L1-hFc; 서열 번호: 325) 대략 0.8nm 내지 1.2nm을 항-사람 IgG Fc 포획 Octet 바이오센서를 사용하여 포획했다. 이어서 hPD-L1-hFc로 코팅된 Octet 바이오센서를 hPD-1-mFc와 상이한 항-PD-1 모노클로날 항체의 혼합물을 함유하는 웰 내에 담궜다. 전체 실험은 플레이트를 1000rpm의 속도로 진탕시키면서 25℃에서 Octet HBST 완충액(0.01M HEPES pH7.4, 0.15M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% v/v 계면활성제 P20, 0.1mg/mL BSA) 중에서 수행되었다. 바이오센서를 실험의 각 단계 사이에서 Octet HBST 완충액으로 세척했다. 실시간 결합 반응을 전체 실험 과정 동안 모니터링하고 각 단계의 종료시 결합 반응을 기록했다. 포획된 hPD-L1-hFc에 대한 hPD-1-mFc의 결합을 상이한 항-PD-1 모노클로날 항체의 존재 및 부재 하에 비교하고 표 15에 나타난 바와 같이 시험된 항체의 차단 거동(blocking behavior)을 결정하는데 사용했다.
Figure pat00015
표 15에서 보여주는 바와 같이, Octet Red 96 기기상에서 시험된 항-PD-1 항체 11개 중 9개는 86% 내지 완전한 결합 차단에 이르는 hPD-L1-hFc에 대한 결합에 대한 hPD-1-mFc의 강력한 차단을 입증했다. 시험된 1개의 항-PD-1 항체(H1M7789N)는 29% 차단으로 hPD-L1-hFc에 대한 hPD-1-mFc 결합의 약한 차단을 보여주었다. 시험된 1개의 항체(H2aM7791N)는 hPD-L1-hFc에 대한 hPD-1-mFc의 결합을 증진시키는 능력을 입증했다.
다음으로, 사람 Fc와 함께 발현된 항-PD-1 모노클로날 항체에 대한 억제 연구를 비아코어 3000 기기상에서 수행했다. 우선, C-말단 사람 IgG1 Fc 태그(hPD-1-hFc; 서열 번호: 324)와 함께 발현된 재조합 사람 PD-1 100nM을 각각의 항-PD-1 모노클로날 항체 500nM과 적어도 2시간 동안 항온처리한 후 억제 검정을 수행하였다. CM5 비아코어 센서 표면을 우선 표준 EDC-NHS 화학을 사용하여 다클론 토끼 항-마우스 항체(GE Catalog# BR-1008-38)로 유도체화시켰다. 이어서 C-말단 마우스 IgG2a Fc 태그(hPD-L1.mFc; 서열 번호: 326)와 함께 발현된 재조합 사람 PD-L1 대략 730 RU를 포획한 후 상이한 항-PD-1 모노클로날 항체의 존재 및 부재 하에 100nM의 hPD-1.hFc를 25μL/min의 유속에서 3분 동안 주입했다. 전체 실험은 25℃에서 0.01M HEPES pH7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.05% v/v 계면활성제 Tween-20으로 구성된 러닝 완충액(running buffer)(HBS-ET 러닝 완충액) 중에서 수행했다. 실시간 결합 반응을 전체 실험 과정 동안 모니터링하고 각 단계의 종료시 결합 반응을 기록했다. 포획된 hPD-L1-mFc에 대한 hPD-1-hFc의 결합을 상이한 항-PD-1 모노클로날 항체의 존재 및 부재 하에 비교하고 표 16에서 보여주는 바와 같이 시험된 항체의 차단 거동을 결정하는데 사용했다.
Figure pat00016
표 16에서 보여주는 바와 같이, 비아코어 3000 기기상에서 시험된 본 발명의 항-PD-1 항체 20개 중 18개는 96% 내지 100%에 이르는 차단으로 hPD-L1-mFc에 대한 결합에 대해 hPD-1-hFc의 강력한 차단을 입증했다. 1개의 항체는 hPD-L1-mFc에 대한 hPD-1-hFc 결합의 결합을 증진시키는 능력을 입증했다. 이 연구에서, 본 발명의 시험된 항체 중 1개(H4H9057P2)는 항-마우스 Fc 포획 표면에 대한 비-특이적 배경 결합을 나타냈다.
실시예 6: 항-PD-1 항체들 간의 Octet 교차-경쟁
항-PD-1 모노클로날 항체들 간의 결합 경쟁을 Octet RED384 바이오센서(Pall ForteBio Corp.)상에서 실시간, 비표지 바이오-층 간섭법 검정(real time, label-free bio-layer interferometry assay)을 사용하여 결정했다. 전체 실험은 25℃에서 플레이트를 1000rpm의 속도로 진탕시키면서 0.01M HEPES pH7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.05% v/v 계면활성제 Tween-20, 0.1mg/mL BSA(Octet HBS-ET 완충액) 중에서 수행되었다. 2개의 항체가 C-말단 myc-myc-헥사히스티딘 태그와 함께 재조합으로 발현된 사람 PD-1(hPD-1-MMH; 서열 번호: 321) 상에서 이들의 각각의 에피토프에 대한 결합에 대해 서로 경쟁할 수 있는지를 평가하기 위해, 대략 0.1nM의 hPD-1-MMH를 우선, hPD-1-MMH의 50μg/mL 용액을 함유하는 웰들 내에 항-Penta-His 항체 코팅된 Octet 바이오센서 팁(tip)(Pall ForteBio Corp., # 18-5079)을 5분 동안 함침시킴으로써 상기 팁 상에 포획했다. 이어서 상기 항원 포획된 바이오센서 팁을 우선 제1 항-PD-1 모노클로날 항체(이후 mAb-1로 지칭됨)의 50μg/mL 용액을 함유하는 웰들 내에 5분 동안 담궈서 mAb-1로 포화시켰다. 이어서 상기 바이오센서 팁을 제2 항-PD-1 모노클로날 항체(이후 mAb-2로 지칭됨)의 50μg/mL 용액을 함유하는 웰들 내에 담궜다. 상기 바이오센서 팁을 실험의 각 단계 사이에서 Octet HBS-ET 완충액으로 세척했다. 실시간 결합 반응을 실험 과정 동안 모니터링하고, 각 단계의 종료시 결합 반응을 기록했다. mAb-1과 미리-복합체화된 hPD-1-MMH에 대한 mAb-2 결합 반응을 비교하고 상이한 항-PD-1 모노클로날 항체의 경쟁/비-경쟁 거동을 결정했다. 결과는 표 17에 요약되어 있다(*자가 경쟁 mAb2는 열거되지 않는다).
Figure pat00017
Figure pat00018
Figure pat00019
선별된 항-PD-1 모노클로날 항체들의 패널 간의 제2 결합 경쟁을 Octet HTX 바이오센서(Pall ForteBio Corp.) 상에서 실시간, 비표지 바이오-층 간섭법 검정을 사용하여 결정하였다. 전체 실험은 25℃에서 플레이트를 1000rpm의 속도로 진탕시키면서 0.01M HEPES pH7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.05% v/v 계면활성제 Tween-20, 0.1mg/mL BSA(Octet HBS-ET 완충액) 중에서 수행되었다. 2개의 항체가 hPD-1-MMH 상에서 이들의 각각의 에피토프에 대한 결합에 대해 서로 경쟁할 수 있는지를 평가하기 위해, 대략 0.25nm의 hPD-1-MMH를 우선, hPD-1-MMH의 10μg/mL 용액을 함유하는 웰들 내에 항-Penta-His 항체 코팅된 Octet 바이오센서 팁(Fortebio Inc, # 18-5079)을 150초 동안 함침시킴으로써 상기 팁 상에 포획했다. 이어서 상기 항원-포획된 바이오센서 팁을 제1 항-PD-1 모노클로날 항체(이후 mAb-1로 지칭됨)의 100μg/mL 용액을 함유하는 웰들 내에 5분 동안 담궈서 mAb-1로 포화시켰다. 이어서 상기 바이오센서 팁을 제2 항-PD-1 모노클로날 항체(이후 mAb-2로 지칭됨)의 100μg/mL 용액을 함유하는 웰들 내에 4분 동안 담궜다. 모든 바이오센서를 실험의 각 단계 사이에서 Octet HBS-ET 완충액으로 세척했다. 실시간 결합 반응을 실험 과정 동안 모니터링하고, 각 단계의 종료시 결합 반응을 도 2에 나타난 바와 같이 기록했다. mAb-1과 미리-복합체화된 hPD-1-MMH에 대한 mAb-2 결합 반응을 비교하고 상이한 항-PD-1 모노클로날 항체의 경쟁/비-경쟁 거동을 결정했다. 결과는 표 18에 요약되어 있다(*자가 경쟁 mAb2는 열거되지 않는다).
Figure pat00020
이 실시예에 개시된 실험 조건 하에, H4H7795N2는 H4H7798N과 교차-경쟁했고; H4H7798N은 H4H7795N2 및 H4H9008P와 교차-경쟁했고; H4H9008P는 H4H7798N 및 H4H9068P2와 교차-경쟁했고; H4H9068P2는 H4H9008P 및 H4H9048P2와 교차-경쟁했다.
실시예 7: PD-1을 발현시키는 세포에 대한 항체 결합
전장 사람 PD-1(수탁 번호 NP_005009.2의 아미노산 1 내지 289)로 안정하게 유전자이식된 사람 배아 신장 세포주(HEK293; ATCC, #CRL-1573)(HEK293/hPD-1)에 대한 항-PD-1 항체의 결합을 FACS로 측정했다.
상기 검정을 위해, 접착성 세포를 트립신 또는 효소-비함유 해리 완충액을 사용하여 분리하고 완전 배지로 차단했다. 세포를 원심분리하고 2% FBS를 함유하는 차가운 PBS 중에서 2.5-6x10^6 세포/mL의 농도로 재현탁시켰다. 이어서 HEK293 모세포 및 HEK293/hPD-1 세포를 각각의 항-PD-1 항체 100nM로 얼음에서 15 내지 30분 동안 항온처리했다. 결합되지 않은 항체를 2% FBS를 함유하는 D-PBS로 세척하여 제거한 후 세포를 얼음 위에서 사람 Fc(Jackson ImmunoResearch, # 109-136-170) 또는 마우스 Fc(Jackson ImmunoResearch, #115-136-146)를 인식하는 알로피코시아닌(allophycocyanin)-접합된 2차 F(ab')2로 15 내지 30분 동안 항온처리했다. 세포를 2% FBS를 함유하는 D-PBS로 세척하여 결합되지 않은 2차 F(ab')2를 제거하고 HyperCyte(IntelliCyt, Inc.) 유동 세포 분석법 또는 Accuri 유동 세포 분석법(BD Biosciences)을 사용하여 형광 측정치를 획득했다. 데이타는 FlowJo 소프트웨어(Tree Star)를 사용하여 분석되었다.
Figure pat00021
표 19에서 보여주는 바와 같이, 본 발명의 항-PD-1 항체 27개 중 25개는 HEK293 모세포주 상의 결합과 비교하여 HEK293/ hPD-1 세포에 대해 강한 결합을 보여주었다. 본 발명의 2개의 항체(H2aM7795N 및 H4H9068P2)는 시험된 다른 항체와 비교하여 사람 PD-1 발현 세포에 더 약하게 결합했다.
본 발명의 항-PD1 항체를 추가로 특성화하기 위해, 전장 사람 PD-1(수탁 번호 NP_005009.2의 아미노산 1 내지 289)로 안정하게 유전자이식된 사람 배아 신장 세포주(HEK293; ATCC, #CRL-1573)(HEK293/hPD-1)에 대한 용량-의존적 결합을 FACS로 결정했다.
상기 검정을 위해, 접착성 세포를 트립신을 사용하여 분리하고 완전 배지로 차단했다. 세포를 원심분리하고 염색 완충액(PBS 중 1% FBS) 중에서 6x10^6 세포/mL의 농도로 재현탁시켰다. 항-PD1 항체의 EC50 및 Emax를 결정하기 위해, 세포 현탁액 90uL를 얼음 위에서 염색 완충액 중에서 5pM 내지 100nM 범위의 최종 농도로 희석된 항-PD-1 항체 및 대조군의 연속적 희석물(mAb 샘플은 음성 대조군으로서 포함되지 않았다)과 30분 동안 항온처리했다. 이어서 세포를 원심분리하고 펠렛을 염색 완충액으로 1회 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거했다. 이후 세포를 얼음 위에서 사람 Fc(Jackson ImmunoResearch, # 109-136-170) 또는 마우스 Fc(Jackson ImmunoResearch, #115-136-071)를 인식하는 알로피코시아닌-접합된 2차 F(ab')2로 30분 동안 항온처리했다. 세포를 원심분리하고 펠렛을 염색 완충액으로 1회 세척하여 결합되지 않은 2차 F(ab')2를 제거한 후 Cytofix(BD Biosciences, # 554655)와 염색 완충액의 1:1 희석물로 밤새 고정시켰다. 다음날, 세포를 원심분리하고 펠렛을 염색 완충액으로 1회 세척하고, 재현탁시키고 여과했다. 평균 형광 강도(MFI)를 결정하기 위해 형광 측정치를 Hypercyt® 세포분석법으로 획득하고 ForeCyt™(IntelliCyt; Albuquerque, NM)에서 분석했다. EC50 값을 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)을 사용하여 11-포인트 반응 곡선에 걸쳐 4-파라미터 로지스틱 방정식으로부터 계산했다. 각각의 항체의 Emax를 시험된 가장 높은 항체 용량(100nM)에서의 결합으로 정의했다.
Figure pat00022
Figure pat00023
표 20에서 보여주는 바와 같이, 본 발명의 항-PD1 항체 28개 중 25개는 33.18pM 내지 2.59nM 범위의 EC50 값 및 37,789 내지 11,368 MFI 범위의 Emax 값으로 HEK293/hPD-1 세포에 대한 용량 의존적 결합을 보여주었다. 본 발명의 3개의 항-PD1 항체는 HEK293/hPD-1 세포에 대해 강한 결합을 입증하지 못했으므로 EC50 값은 결정되지 못할 것이다. 이소형 대조군 중 어느 것도 이러한 검정에서 임의의 측정가능한 결합을 입증하지 못했다.
표 21에서 보여주는 바와 같이, 본 발명의 항-PD1 항체 6개 중 3개는 509pM 내지 4.81nM 범위의 EC50 값 및 39,774 내지 14,111 MFI 범위의 Emax 값으로 HEK293/hPD-1 세포에 대해 용량 의존적 결합을 보여주었다. 시험된 본 발명의 3개의 항체는 HEK293/hPD-1 세포에 결합했지만, 안정기(plateau)에 도달하지는 못했다. 따라서 이들의 정확한 EC50 값을 결정할 수 없었고 이들의 EC50 값은 결정되지 않음으로 나타낸다. 이소형 대조군 중 어느 것도 이러한 검정에서 임의의 측정가능한 결합을 입증하지 못했다.
실시예 8: T-세포/APC 루시퍼라제 리포터 검정에서 PD-1-유도된 T-세포 하향-조절의 차단
T-세포 활성화는 항원-전달 세포(APC) 상의 주요 조직적합성 복합체 부류 I 또는 II 단백질에 의해 제공된 특정 펩타이드를 인지하는 T-세포 수용체(TcR)를 자극함으로써 달성된다. 활성화된 TcR은 또한 활성화제-단백질 1(AP-1), 활성화된 T-세포의 핵 인자(NFAT) 또는 활성화된 B 세포의 핵 인자 카파-경쇄-개선제(NFκb)와 같은 전사 인자에 의해 유도된 리포터 유전자에 의해 모니터링될 수 있는 시그널링 사건의 캐스케이드를 개시한다. T-세포 반응은 T-세포 상에서 항시적으로 또는 유도가능하게 발현되는 공-수용체의 진입(engagement)을 통해 조절된다. 하나의 이러한 수용체는 T-세포 활성의 음성 조절인자인 PD-1이다. PD-1은, APC 또는 암 세포를 포함하는 표적 세포 상에서 발현되는 이의 리간드, PD-L1과 상호작용하며, 포스파타제를 TcR 시그날로솜(signalosome)에 채용하여 양성 시그널링을 억제함으로써 억제 신호를 전달하는 역할을 한다.
사람 T 세포주에서 PD-1 수용체를 통해 PD-1/PD-L1-매개된 시그널링을 길항하는 항-PD-1 항체의 능력을 표 1에 나타난 시험관내 세포 기반 검정을 사용하여 평가했다. 2개의 포유동물 세포주: 저캇 세포(무한증식 T 세포주) 및 Raji 세포(B 세포주)로부터 유도된 혼합된 배양물을 이용함으로써 APC 및 T 세포 간의 상호작용에 의해 유도된 T 세포 시그널링을 측정하는 생물학적검정을 전개했다. 상기 생물학적검정의 제1 구성 요소를 위해, 저캇 클론 E6-1 세포(ATCC, #TIB-152)는 제조자의 지침서에 따라 Cignal Lenti AP-1 Luc 리포터(Qiagen - Sabiosciences, #CLS-011L)로 형질도입되었다. 렌티바이러스(lentivirus)는 최소 CMV 프로모터, TPA-유도성 전사 반응 요소(TRE)의 일렬 반복부(tandem repeat) 및 푸로마이신 내성 유전자의 제어 하에 개똥벌레 루시퍼라제 유전자(firefly luciferase gene)를 인코딩한다. 이후 조작된 저캇 세포주는 사람 PD-1의 세포외 도메인(사람 PD1의 아미노산 1 내지 170; 수탁 번호 NP_005009.2) 및 사람 CD300a의 막횡단 및 세포질 도메인(사람 CD300a의 아미노산 181 내지 299; 수탁 번호 NP_009192.2)을 포함하는 PD-1 키메라로 형질도입되었다. 수득된 안정한 세포주(저캇/AP1-Luc/ hPD1-hCD300a)를 선별하고 500ug/mL G418+1ug/mL 푸로마이신이 보충된 RPMI/10% FBS/ 페니실린/스트렙토마이신/글루타민에서 유지시켰다.
생물학적검정의 제2 구성 요소를 위해, Raji 세포(ATCC, #CCL-86)는 렌티바이러스(pLEX) 벡터 시스템(Thermo Scientific Biosystems, #OHS4735)으로 클로닝된 사람 PD-L1 유전자(수탁 번호 NP_054862.1의 아미노산 1 내지 290)로 형질도입되었다. PD-L1(Raji/ hPD-L1)에 대해 양성인, Raji 세포를 PD-L1 항체를 사용하여 FACS에 의해 단리하고 1ug/mL 푸로마이신이 보충된 Iscove/10% FBS/페니실린/스트렙토마이신/글루타민에서 유지시켰다.
APC/T 세포 상호작용을 자극하기 위해, T 세포 상의 CD3에 결합하는 하나의 Fab 아암, 및 Raji 세포 상의 CD20에 결합하는 다른 하나의 Fab 아암 결합으로 구성된 이중특이적 항체(CD3xCD20 이중특이적 항체; 예를 들면, US20140088295에 개시된 바와 같은 항체)를 사용했다. 상기 검정에서 이중특이적 분자의 존재는 T-세포 상의 CD3 서브유닛을 Raji 세포 상에서 내인성으로 발현된 CD20에 브릿징함으로써 T 세포 및 APC의 활성화를 초래한다. CD3의 항-CD3 항체와의 연결(ligation)은 T 세포의 활성화를 초래하는 것으로 입증되었다. 이러한 생물학적검정에서, PD1/PD-L1 상호작용을 차단하는 항체는 억제 시그널링을 무능하게 하고 이후 AP1-Luc 활성화를 증가시킴으로써 T-세포 활성을 되찾는다.
루시퍼라제-기반 생물학적검정에서, 10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신/글루타민이 보충된 RPMI1640을 검정 배지로서 사용하여 항-PD1 모노클로날 항체(mAb)의 스크리닝을 수행하기 위한 항체 희석물 및 세포 현탁액을 제조했다. 스크리닝하는 날에, 고정된 농도의 CD3xCD20 이중특이적 항체(30pM)의 존재 하에, 항-PD1 mAb의 EC50 값, 뿐만 아니라 이중특이적 항체 단독의 EC50을 결정했다. 다음 순서로, 세포 및 시약을 96웰 백색, 편평-바닥 플레이트에 첨가했다. 항-PD1 mAb EC50 결정을 위해, 우선 고정된 농도의 CD3xCD20 이중특이적 항체(최종 30pM)를 제조하고 미량역가 플레이트 웰들에 첨가했다. 이어서 항-PD1 mAb의 12-포인트 연속 희석물 및 대조군을 첨가했다(1.7pM 내지 100nM 범위의 최종 농도; 검정 배지 단독을 포함하는 웰들을 추가함). 이중특이적 항체(단독) EC50 결정을 위해, 0.17pM 내지 10nM 범위의 최종 농도의 이중특이적 항체(검정 배지 단독을 포함하는 웰들을 추가함)를 미량역가 플레이트 웰들에 첨가했다. 이후, 2.5x10^6/mL Raji/hPD-L1 세포 현탁액을 제조하고, 웰당 20uL를 첨가했다(최종 세포수/웰 5x10^4 세포). 플레이트를 실온에 (15-20분) 정치시키는 한편, 2.5x10^6/mL의 저캇/AP1-Luc/hPD1(ecto)-hCD300a(TM-Cyto)의 현탁액을 제조했다. 20uL의 상기 저캇 현탁액(최종 세포수/웰 5x10^4 세포)을 웰마다 첨가했다. 공-배양물을 함유하는 플레이트를 37℃/5% CO2에서 5 내지 6시간 동안 항온처리했다. 샘플을 이중으로 시험한 후 루시퍼라제 활성을 ONE-Glo™(Promega, # E6051) 시약의 첨가 후 검출하고 상대 광 유닛(relative light unit; RLU)을 빅터 루미노미터(Victor luminometer) 상에서 측정했다.
각각의 스크리닝된 항체에 대한 RLU 값을 항-PD-1 항체가 없는 고정된(30pM) 농도의 CD3/CD20 이중특이적 항체를 갖는 검정 조건을 100%로 설정함으로써 정규화했다. 이 조건은 PD-1/PD-L1 억제 신호의 존재 하에 이중특이적 분자에 의해 유도된 최대 AP1-Luc 반응에 상응한다. 항-PD-1 항체의 부가시, 억제 신호가 저지되고, 증가된 자극은, 시험된 최고 항체 용량(100nM)의 존재 하에 신호의 백분율 증가인, Emax로 본원에서 보여준다. 시험된 항-PD1 항체의 효능을 비교하기 위해, 정규화된 RLU 값이 150% 활성화에 도달하는 항체의 농도를 그래프패드 프리즘을 사용하여 12-포인트 반응 곡선에 걸쳐 4-파라미터 로지스틱 방정식으로부터 결정했다. 결과는 각각 표 22 및 표 23에서 요약된다.
Figure pat00024
Figure pat00025
표 22에서 보여주는 바와 같이, 시험된 본 발명의 항-PD-1 항체 31개 중 25개는 239 내지 163 범위의 Emax 값으로 PD-1/PD-L1 억제를 차단했다. 본 발명의 항-PD-1 항체 31개중 6개는 이 검정에서 시험될 때 PD1/PD-L1 상호작용의 실질적인 차단을 입증하지 못했다.
표 23에서 보여주는 바와 같이, 시험된 본 발명의 항-PD-1 항체 4개 중 2개는 각각 150 및 343%의 Emax 값으로 PD-1/PD-L1 억제를 차단했다. 본 발명의 항-PD-1 항체 4개 중 2개는 이 검정에서 시험될 때 PD1/PD-L1 상호작용의 실질적인 차단을 입증하지 못했다.
실시예 9: 항-PD-1 항체의 생체내 효능
관련 생체내 모델에서 선택된 수의 본 발명의 항-PD-1 항체의 효과를 결정하기 위해, 종양 세포의 피하 주사를 수반하고 상이한 날에 개시되는, 3개의 MC38.ova 종양 성장 연구를 75% C57/Bl6 / 25% 129 균주 배경에서 마우스 PD-1(PD-1 HumIn 마우스)의 세포외 도메인 대신에 사람 PD-1의 세포외 도메인의 발현에 대해 동형접합성인 마우스에서 수행했다.
상기 연구를 위해, 마우스를 체중에 따라 연구 1을 위한 5개의 처리 또는 대조 그룹(그룹당 5마리의 마우스), 연구 2를 위한 8개의 처리 또는 대조 그룹(그룹당 5마리의 마우스), 및 연구 3을 위한 5개의 처리 또는 대조 그룹(그룹당 7마리의 마우스)으로 나누었다. 0일에, 마우스를 이소플루란 흡입으로 마취시킨 후 연구 1을 위해 100uL의 DMEM의 현탁액 중 5x105 MC38.ova 세포, 또는 연구 2 및 연구 3을 위해 100uL의 DMEM의 현탁액 중 1x106 MC38.ova 세포를 오른쪽 옆구리에 피하로 주사했다. 연구 1을 위해, 처리 그룹에 본 발명의 항-PD-1 항체 3개 중 하나, 또는 관련없는 특이성을 갖는 이소형 대조군 항체 200ug을 실험 3, 7, 10, 14 및 17일에 복강내로 주사하는 한편, 한 그룹의 마우스는 처리하지 않은 채로 두었다. 연구 2를 위해, 처리 그룹에 용량당 10mg/kg 또는 5mg/kg의 본 발명의 항-PD-1 항체 3개중 하나, 용량당 10mg/kg의 본 발명의 하나의 항체(H4H7795N2), 또는 10mg/kg의 관련없는 특이성을 갖는 이소형 대조군 항체를 실험 3, 7, 10, 14 및 17일에 복강내로 주사했다. 연구 3을 위해, 처리 그룹에 용량당 5mg/kg 또는 2.5mg/kg의 본 발명의 항-PD-1 항체 2개 중 하나, 또는 5mg/kg의 관련없는 특이성을 갖는 이소형 대조군 항체를 실험 3, 7, 10, 14 및 17일에 복강내로 주사했다. 마우스 그룹에 대한 실험적 투여 및 처리 프로토콜은 표 24에서 보여준다.
Figure pat00026
연구를 위해, 각 처리 그룹에 대해 각 실험 14 또는 17일 및 23 또는 24일에 캘리퍼 측정(caliper measurement)에 의해 측정된 평균 종양 용적 및 생존율을 기록했다. 또한, 종양이 없는 마우스의 수를 또한 연구 종료시 평가했다(연구 1에 대해서는 42일, 연구 2 및 연구 3에 대해서는 31일). 평균 종양 용적(mm3)(±SD), 생존율, 및 종양이 없는 마우스의 수로 표현된 결과를 연구 1에 대해 표 23에서, 연구 2에 대해 표 3에서, 그리고 연구 3에 대해 표 4에서 보여준다.
Figure pat00027
연구 1에 대해 표 25에서 보여주는 바와 같이, 본 발명의 하나의 항체, H4H7798N으로 처리된 마우스는 연구 과정 동안 어떠한 검출가능한 종양도 발달되지 않았다. H4H9008P로 처리된 마우스는 연구 17일 및 24일에 대조군과 비교하여 지속적 감소된 종양 용적을 나타냈으며, 실험 종료시 각각 5마리 중 3마리 또는 5마리 중 4마리가 종양이 없었다. 그와 반대로, 하나의 항-PD1 항체, H4H7795N2로의 처리는 대조군과 비교하여 이 연구에서 종양 용적의 감소에서의 유의미한 효능을 입증하지 못했다. 연구 23일까지, H4H7795N2 그룹에서는 5마리 마우스 중 1마리가 사망했고, 이소형 대조 처리 그룹에서는 5마리 마우스 중 2마리가 사망했다. 미처리 그룹 및 이소형 대조 그룹에서, 일부 마우스는 종양의 자발적인 퇴행을 나타냈다(각각 5마리의 마우스 중 1마리 및 5마리의 마우스 중 2마리).
Figure pat00028
연구 2에 대해 표 26에서 보여주는 바와 같이, 10mg/kg의 본 발명의 하나의 항체, H4H7798N으로 처리된 마우스는 연구 과정 동안 검출가능한 종양도 발달되지 않았다. 10mg/kg의 H4H9008P 또는 H4H9048P2 중 하나로 처리된 마우스 그룹은 연구 17일 및 24일에 대조군과 비교하여 실질적으로 감소된 종양 용적을 나타냈다. 10mg/kg의 H4H9008P 또는 H4H9048P2 중 하나로 처리된 각 그룹에서 마우스 5마리 중 4마리는 31일에 종양이 없었던 반면, 이소형 대조군 처리 그룹에서는, 5마리 중 단지 1마리만이 자발적인 종양 퇴행의 결과로서 종양이 없었다. 10mg/kg에서 시험된 하나의 항체, H4H7795N2는 연구 17일 및 24일에 대조군과 비교하여 실질적으로 감소된 종양 용적을 입증했지만, 이 항체가 가장 적은 효능의 항-PD1 항체였고, 5마리 마우스 중 2마리만이 실험 종료시 생존했다.
시험된 용량(5mg/kg 및 10mg/kg)에서 종양 억제의 용량-의존적 반응을 H4H7798N, H4H9008P 및 H4H9048P2로 처리된 그룹에서 관찰했다. 5mg/kg에서의 H4H7798N 또는 H4H9008P 요법은 덜 효능이 있었고, 21일에 실험 종료시 5마리 마우스 중 4마리가 종양이 없었던 한편, H4H7798N 및 H4H9008P의 10mg/kg 용량 그룹 둘 모두에서는 5마리의 마우스 중 5마리가 종양이 없었다.
2원 ANOVA 다중 비교에서의 두넷 시험(Dunett's test)은 참조로서 10mg/kg의 이소형 대조군 항체로 처리된 그룹, 및 10mg/kg에서 H4H7798N, H4H9008P 또는 H4H9048P2로 처리된 그룹 간의 종양 성장의 차이가 p 값<0.005로 통계적으로 유의미했음을 나타냈다. 참조로서 10mg/kg의 이소형 대조군 항체로 처리된 그룹, 및 5mg/kg에서 H4H7798N , H4H9008P 또는 H4H9048P2로 처리된 그룹 간의 종양 성장의 차이도 또한 p 값<0.05로 통계적으로 유의미했다.
Figure pat00029
연구 3에 대해 표 27에서 보여주는 바와 같이, 5mg/kg에서 본 발명의 하나의 항체, H4H7798N, 또는 본 발명의 또 다른 항체, H4H9008P로 처리된 마우스 7마리 중 6마리는 실험 종료시 종양이 없는 반면, 이소형 대조 그룹에서는 종양이 없는 동물이 없었다. IgG4 대조 그룹에서 한 마리의 종양-보유 마우스가 이식후 17일에 사망했다. 2.5mg/kg 용량에서 H4H9008P로 처리된 마우스 7마리 중 4마리만이 실험 종료시 종양이 없었다. 21일에 시험된 항-PD-1 항체 및 이소형 대조 그룹 간의 종양 용적의 차이는 두넷의 다중 비교 후-시험과 함께 1원 ANOVA에 의해 p<0.01로 결정된 바와 같이 통계적으로 유의미했다. 모든 4개의 항-PD-1 항체는 2.5mg/kg 용량에서보다 5mg/kg 용량에서 동등하게 더 효능이 있었다.
실시예 10: 마우스 조기-처리 종양 모델에서 항-PD-1 항체 및 VEGF 길항제의 배합물의 항-종양 효과
항-PD-1 항체 및 VEGF 길항제의 배합물의 효능을 시험하기 위해 조기-처리 종양 모델을 발달시켰다. 이 모델에서, 배합 치료제를 종양 이식 직후 투여한다. 상기 실험은 또한 항-PD-L1 항체를 단독으로 그리고 VEGF 길항제와 함께 사용했다. 이 실험에서 사용된 항-PD-1 항체는 랫트 IgG2b(Bio X Cell, West Lebanon, NH)를 갖는 항-마우스 PD-1 클론 "RPMI-14"였다. 이 실험에 사용된 VEGF 길항제는 아플리베르셉트(VEGF 수용체-기반 키메라 분자, "VEGF-Trap" 또는 "VEGFR1R2-FcΔC1(a)"로도 공지됨, 이의 완전한 설명은 본원의 다른 곳에 제공됨)였다. 이 실험에 사용된 항-PD-L1 항체는 US20100203056A1(Genentech, Inc.)에 따르는 항체 "YW243.55S70"의 VH/VL 서열을 갖고, 마우스 IgG2a를 갖고, 마우스 PD-L1과 교차-반응성인 항-PD-L1 모노클로날 항체였다.
이 실험 모델을 위해, 1.0x106 결장-26 종양 세포를 0일에 BALB/c 마우스에 피하로 이식했다. 3일에 개시하여, 측정가능한 종양의 확립 전에, 마우스를 표 28에 기재된 바와 같이 단일치료제 또는 병용 치료제, 또는 대조군 배합물로 처리했다.
Figure pat00030
다양한 치료제를 2주 기간에 걸쳐 상이한 시점에 투여했다(즉, 3일, 6일, 10일, 13일 및 19일에 주사).
각 치료 그룹에서의 동물을 50일에 종양 발생, 종양 용적, 중간 생존 시간, 및 종양이 없는 동물의 수의 측면에서 평가했다. 종양 성장 정도는 도 2(종양 성장 곡선) 및 도 3(28일에서의 종양 용적)에 요약되어 있다. 결과는 또한 표 29에 요약되어 있다.
Figure pat00031
종양 성장은 치료제만을 수반하는 치료 요법과 비교하여 VEGF Trap + 항-PD-1 항체의 배합물로 치료된 동물에서 실질적으로 감소되었다(도 2 및 3 참조). 더욱이, 생존율은 VEGF Trap + 항-PD-1 항체 그룹에서 실질적으로 증가했으며, 70%의 동물이 종양 이식 후 적어도 50일까지 생존하였다. 그에 반해서, 항-PD-1 및 VEGF Trap 단일치료 그룹의 경우, 50일까지의 생존율은 각각 단지 40% 및 30%였다(도 3 및 표 29 참조).
실시예 11: 진행된 악성종양을 갖는 환자에서 항-PD-1 항체를 단일 요법으로서 그리고 다른 항암 요법과 함께 반복적 투여한 임상적 시험 연구
이것은 진행된 악성종양을 갖는 환자에서 항-PD-1 항체를 단독으로 또는 방사선 요법, 사이클로포스파미드, 또는 둘 모두와 함께 사용한 용량-상승(dose-escalation) 연구이다. 이 실시예에 사용된 예시적인 항-PD-1 항체("mAb")는 서열 번호: 162의 HCVR 및 서열 번호: 170의 LCVR을 포함한다.
연구 목적
본 연구의 1차 목적은 진행된 악성종양을 갖는 환자에서 단일요법으로서 또는 표적화된 방사선(주로 종양-절제 요법보다는 면역-자극 요법으로 제공할 의도임), 저용량 사이클로포스파미드(조절 T-세포 반응을 억제하는 것으로 나타난 치료법), 또는 둘 모두와 함께 IV 투여되는 mAb의 안전성, 내약성(tolerability), DLT를 특성화하기 위한 것이다.
본 연구의 2차 목적은 (1) 단일요법으로서 및 다른 항암 요법(표적화된 방사선, 저용량 사이클로포스파미드, 또는 둘 모두)과 함께 mAb의 권고된 2상 용량(recommended phase 2 dose; RP2D)을 결정하고; (2) mAb 단독의 및 각각의 병용 파트너(들)과 함께 mAb의 예비 항종양 활성을 기재하고; (3) 단일요법으로서 및 다른 항암 요법(표적화된 방사선, 저용량 사이클로포스파미드, 또는 둘 모두)과 함께 mAb의 PK를 확인하고; (4) mAb의 면역원성을 평가하기 위한 것이다.
연구 디자인
안전성을 각각의 표준 3 + 3 용량 상승 코호트(cohort)에서(단일요법으로, 방사선 요법과 함께, 사이클로포스파미드와 함께, 그리고 방사선 요법 + 사이클로포스파미드와 함께) 평가할 것이다. 방사선, 사이클로포스파미드, 또는 둘 모두와의 병용 요법의 선택은 스폰서와 협의하여 개별 환자에 대해 최상의 치료 선택이라는 조사자의 평가에 근거할 것이다. 방사선요법 코호트에 등록시키기 위해, 환자는 안전하게 조사될 수 있고 고려되는 제한된 완화 용량의 방사선이 의학적으로 적절할 것으로 고려될 병변, 및 반응 평가에 적합한 적어도 하나의 다른 병변을 가져야 한다. 환자는 선택된 치료에 대해 슬롯(slot)이 코호트에서 이용가능한 경우에만 등록이 허용될 것이다.
환자는 mAb의 초기 투여 전 28일 내에 적격성(eligibility)을 결정하기 위한 스크리닝 절차를 겪을 것이다. mAb 단일요법 코호트로의 환자의 등록 후, 차후의 코호트의 등록은 이전 코호트에서 DLT의 발생(즉, 3명의 환자의 코호트에서는 DLT가 없거나 6명의 환자의 확장된 코호트에서 1회 이하의 DLT) 및 환자 슬롯의 이용가능성에 의해 결정될 것이다. 계획된 단일요법 용량 수준은 14일(2주)마다 IV 투여되는 1, 3 또는 10mg/kg이다.
1mg/kg 또는 3mg/kg mAb 단일요법 코호트 DLT 관측기간의 하나 또는 둘 모두가 3명의 환자의 코호트에서 DLT 없이 또는 6명의 환자의 확장된 코호트에서 DLT가 1회 이하로 완료되면, 환자는 사이클로포스파미드 또는 방사선요법을 상기 단일요법 용량 수준의 mAb와 병용하는 코호트에 등록될 수 있다. 환자는 mAb 용량 수준 + 사이클로포스파미드에 대한 코호트 및 mAb 용량 수준 + 동일한 방사선요법 요법에 대한 코호트 둘 모두에 대한 DLT 관측기간이 3명의 환자의 코호트에서 DLT 없이 또는 6명의 환자의 확장된 코호트에서 DLT가 1회 이하로 완료되면, 병용 mAb + 사이클로포스파미드/방사선요법 코호트에 등록될 수 있다.
3mg/kg mAb 단일요법 코호트 DLT 관측기간이 3명의 환자의 코호트에서 DLT 없이 또는 6명의 환자의 확장된 코호트에서 DLT가 1회 이하로 완료되면, 10mg/kg mAb 단일요법 코호트에 또한 등록될 수 있다.
mAb 3mg/kg 및 10mg/kg 단일요법 코호트는 이전 단일요법 용량 코호트(즉, 각각 1mg/kg 및 3mg/kg)에서 필요한 수의 환자가 이 용량 수준에 대해 최대 허용 용량(maximum tolerated dose; MTD)을 나타내지 않으면서 28일　DLT 관측기간을 통과한 후에만 등록될 것이다. mAb 1mg/kg 병용 치료 코호트는 1mg/kg 단일요법 코호트에 대한 DLT 관측기간의 완료 후에만 등록될 것이다. 3mg/kg mAb를 투여받는 병용 코호트는 각각의 1mg/kg mAb 병용 코호트에서 필요한 수의 환자가 MTD를 나타내지 않으면서 DLT 관측기간을 통과한 경우에만 등록될 것이다. mAb를 사이클로포스파미드 및 방사선 요법과 병용한 3중 병용 코호트는 상기 투여 수준의 상응하는 2중 병용 코호트 둘 모두에서 필요한 수의 환자가 MTD를 나타내지 않으면서 DLT 관측기간을 통과한 경우에만 등록될 것이다.
표 30은 환자가 등록될 용량-상승 코호트를 요약한다.
Figure pat00032
DLT는 하기 중 어느 것과 같이 정의된다: 비-혈액 독성(예: 포도막염 또는 임의의 다른 irAE) 또는 혈액 독성(예: 중성구감소증, 저혈소판증, 열성 중성구감소증).
최대 허용 용량(MTD)은 6명 환자의 확장된 코호트 중 1/3 미만이 제1 치료 주기 동안 DLT를 경험하는 최고 용량으로 정의된다. 따라서, MTD는 6명 환자의 확장된 코호트에서 2회 이상의 DLT의 발생으로 인해 투여가 중단되는 수준 바로 아래의 용량 수준으로 정의된다. 용량 상승이 DLT의 발생으로 인해 중지되지 않는 경우, MTD는 결정되지 않는 것으로 여겨질 것이다. MTD가 이 연구에서 단일요법 그룹 또는 개별적인 병용 그룹에 대해 정의될 수 없음이 가능하다. 추가로, mAb MTD가 단일요법과 각각의 병용 치료 요법 간에 상이할 수 있음이 가능하다.
연구 기간
환자는 48주까지 치료를 받을 것이며, 이후 24주 추적조사 기간이 이어질 것이다. 환자는 48주 치료 기간이 완료될 때까지 또는 질환 진행, 허용될 수 없는 독성, 동의의 철회, 또는 또 다른 연구 철회 기준의 충족시까지 치료를 받을 것이다. 최소 24주의 치료 후, 완전 반응(CR)이 확증된 환자를 선정하여 치료를 중단하고 모든 관련된 연구 평가(예: 효능 평가)를 계속할 수 있다. 최소 24주의 치료 후, 3가지 연속적인 종양 평가에 대해 변하지 않는 안정한 질환(stable disease; SD) 또는 부분 반응(PR)의 종양 부담(tumor burden) 평가를 갖는 환자를 또한 선정하여 치료를 중단하고 모든 관련된 연구 평가(예: 효능 평가)를 계속할 수 있다.
연구 집단
이 연구를 위한 표적 집단은 표준 요법에 대한 후보가 아니거나, 표준 요법을 꺼리거나 또는 임상적 이익을 전달하는 것으로 예상되는 이용가능한 요법이 없는 환자; 및 불치의 악성종양을 갖거나 표준 요법에 반응하지 않거나 표준 요법에도 불구하고 종양 진행을 나타낸 환자를 포함한다.
포함 기준: 환자를 본 연구에 포함시키기 위해 하기 기준에 적격이어야 한다: (1) 이용가능한 대안적인 치료기준(standard-of-care) 치료 옵션이 없는 고형 종양의 입증된 진행; (2) 반응 평가에 대해 적어도 하나의 병변. 방사선요법에 배정된 환자는 지표 병변(index lesion)을 남겨두면서 안전하게 조사될 수 있고 고려되는 제한된, 완화 용량의 방사선이 의학적으로 적절한 것으로 여겨지는 적어도 하나의 추가의 병변을 필요로 한다; (3) 동부 협력 종양학 연구회(Eastern Cooperative Oncology Group; ECOG) 수행 상태 ≤ 1; (4) 18세 초과의 연령; (5) 간기능: a. 총 빌리루빈 ≤ 1.5x 정상의 상한치(ULN; 간 전이 ≤ 3x ULN인 경우), b. 트랜스아미나제 ≤ 3x ULN(또는 ≤5.0x ULN, 간 전이의 경우), c. 알칼리성 포스파타제(ALP) ≤2.5x ULN(또는 5.0x ULN, 간 전이의 경우); (6) 신장 기능: 혈청 크레아티닌 ≤ 1.5x ULN; (7) 중성구 수(ANC) ≥ 1.5 x 109/L, c. 혈소판 수 ≥ 75 x 109/L; (8) 서명된 사전 동의서(signed informed consent)를 제공할 능력; 및 (9) 예정된 방문, 치료 계획, 실험실 검사 및 기타 연구-관련된 절차를 준수할 능력 및 의지.
배제 기준: 하기 기준 중 어느 것을 충족시키는 환자는 본 연구로부터 배제될 것이다: (1) irAE에 대한 위험을 시사할 수 있는 전신 면역억제 치료로의 치료를 필요로 하는 유의미한 자가면역 질환의 진행중인 또는 최근(5년 이내) 증거; (2) PD-1/PD-L1 경로를 차단하는 제제로의 이전 치료; (3) 제1 용량의 mAb의 투여 전에, 어느 것이 더 크든, 4주 미만 또는 4의 반감기 내에 다른 면역조절제로의 이전 치료; (4) 면역 조절제의 예는 CTLA-4의 차단제, 4-1BB(CD137), OX-40, 치료 백신 또는 사이토카인 치료제를 포함한다; (5) 활성인 것으로 여겨질 수 있는 미치료된 뇌 전이. 이전에 뇌 전이가 치료된 환자는 이들이 안정하고(즉, 제1 용량의 연구 치료제의 투여 전 적어도 4주 동안 영상법에 의해 진행의 증거가 없음, 및 임의의 신경 증상이 기저선으로 복귀되었음), 신규 또는 확대된 뇌 전이의 증거가 없다면 참여할 수 있다; (6) 제1 용량의 mAb의 투여 전 4주 이내에 면역억제 코르티코스테로이드 용량(>10　mg 프레드니손 매일 또는 상응); (7) 제1 용량의 mAb의 투여 이전 6개월 이내에 심부 정맥 혈전증, 폐 색전증(영상법에서 확인된 무증상 폐 색전증 포함) 또는 다른 혈전색전성 사건; (8) 사람 면역결핍 바이러스에 의해 공지된 감염, 또는 B형 또는　C형 간염 바이러스에 의한 활동 감염(active infection)을 포함하는, 치료를 필요로 하는 활동 감염; (9) 지난 5년 이내에 폐렴 이력; (10) mAb의 초기 투여 전 30일 이내에 임의의 시험용(investigational) 또는 항종양 치료; (11) 일반적으로 항체 요법으로의 치료, 또는 본 연구에 특이적으로 사용되는 제제에 기인하는 문서상 기록된 알레르기 반응 또는 급성 과민 반응의 이력; (12) 독시사이클린 또는 테트라사이클린에 대한 알려진 알레르기(mAb에서 미량 요소의 존재로 인한 주의); (13) 모유 수유; (14) 양성의 혈청 임신 검사; (15) 절제된/제거된 피부의 기저세포 또는 편형세포 암종 또는 자궁경부의 상피내암종(carcinoma in situ) 또는 국소 치료에 의해 치료되는 것으로 여겨지는 다른 국소 종양을 제외하고는, 본 연구에서 치료되는 질환 이외에 지난 5년 이내의 침습성 악성종양의 이력; (16) 조사자의 평가 하에, 환자가 참여하기에 부적합한 것으로 보이게 하는 급성 또는 만성 정신 문제; 및 (17) 연구 동안 충분한 피임을 하고 싶어하지 않는 출산 가능성이 있는 여성 또는 남성에서 계속되는 성활동.
연구 치료
mAb는 멸균된, 1회용 바이알 중의 액체로서 공급될 것이다. 각각의 바이알은 25mg/mL의 농도에서 mAb 10mL를 채취하기에 충분한 용적을 함유할 것이다. 용량 제조에 대한 지침은 연구 참조 매뉴얼에 제공된다. mAb는 30분 IV 주입으로 설정하여 외래환자에게 투여될 것이다. 각각의 환자 용량은 개인 체중에 좌우될 것이다. mAb의 용량은 ≥10%의 체중 변화에 대해 매 사이클마다 조정되어야 한다. mAb는 단독으로 그리고 방사선 및/또는 사이클로포스파미드와 함께 투여될 것이다.
단일요법
mAb는 48주 동안 매 14일 마다(즉, 56일 주기의 1일, 15±3일, 29±3일 및 43±3일) 30분에 걸쳐 IV 주입으로 설정하여 외래환자에게 투여될 것이다. 배정될 계획된 단일요법 계획은 하기를 포함할 수 있다: (i) 48주 동안 매 14일마다 30분에 걸쳐 1mg/kg IV 주입; (ii) 48주 동안 매 14일마다 30분에 걸쳐 3mg/kg 주입; (iii) 48주 동안 매 14일마다 30분에 걸쳐 10mg/kg 주입; 및 (iv) 48주 동안 매 14일마다 30분에 걸쳐 0.3mg/kg 주입(MTD가 1mg/kg 미만인 것으로 결정되는 경우).
병용 요법
동시에 일어나는 방사선 요법 및 사이클로포스파미드는 처방을 통해 공급될 것이며, 이들의 용법, 용량, 용량 변형, 감소 또는 지연, 뿐만 아니라 이들의 사용으로부터 초래되는 임의의 잠재적인 AE는 mAb의 것와 함께 추적될 것이다.
mAb 및 방사선의 공-투여 : mAb는 8일 내지 12일의 방사선 치료와 함께 48주 동안 매 14일마다 30분에 걸쳐서 IV 주입으로 투여될 것이다. 계획된 병용 mAb 및 방사선 요법 계획은 하기를 포함할 수 있다:
ㆍ 48주 동안 매 14일마다 30분에 걸친 1mg/kg mAb 주입 +
30Gy 방사선요법(6Gy × 5회/주; 제1 용량의 mAb 투여 1주 후, 바람직하게는 매일 연속하여 주어짐)
ㆍ 48주 동안 매 14일마다 30분에 걸친 1mg/kg mAb 주입 +
27Gy 방사선요법(9Gy × 3회/주; 제1 용량의 mAb 투여 1주 후, 바람직하게는 연속적이지 않게 주어짐)
ㆍ 48주 동안 매 14일마다 30분에 걸친 3mg/kg mAb 주입 +
30Gy 방사선요법(6Gy × 5회/주; 제1 용량의 mAb 투여 1주 후, 바람직하게는 매일 연속하여 주어짐)
ㆍ 48주 동안 매 14일마다 30분에 걸친 3mg/kg mAb 주입 +
27Gy 방사선요법(9Gy × 3회/주; 제1 용량의 mAb 투여 1주 후, 바람직하게는 연속적이지 않게 주어짐)
환자는 제1 용량의 mAb 투여 1주 후 출발하여 매일 투여되는 6Gy의 5개의 분획으로 주어진 30Gy, 또는 제1 용량의 mAb 투여 1주 후 출발하여 격일로 투여되는 9Gy의 3개의 분획으로 주어진 27Gy를 받을 것이다. 방사선을 위한 선별된 병변은 지표 병변(들)을 남겨두면서 초점 조사에 의해 안전하게 조사될 수 있으며, 고려되는 제한된, 완화 용량의 방사선이 의학적으로 적절한 것으로 여겨질 병변이어야 한다. 환자를 위한 표적 용량은 코호트 배정을 토대로 할 것이며, 표준 방사선 종양학 실행에 따라서, 정상 조직 요건에 부합되어야 한다. 프로토콜-명시된 투여 계획에서의 치료는 정상 조직 기준이 충족된 경우에만 허용된다. 정상 조직 기준이 프로토콜에 명시된 방사선 요법 계획 중 어느 하나에서 충족될 수 없는 경우, 환자는 이 연구에서 병용 방사선 치료 코호트에 등록되지 못한다.
mAb 및 사이클로포스파미드의 공-투여 : mAb는 4개의 용량에 대해 매 14일마다 사이클로포스파미드 200mg/m2와 함께 48주 동안 매 14일(2주)마다 30분에 걸쳐 IV 주입으로 투여될 것이다. 4개의 사이클로포스파미드 용량 각각은 처음 4개의　mAb 용량 각각을 투여하기 1일 전 투여될 것이다(제1 56일 사이클의 -1, 14, 28 및 42일).
사이클로포스파미드가 다른 약물과 성공적으로 동시에 사용되었지만, 사이클로포스파미드의 대사 속도 및 백혈구감소성 활성은 알려진 바에 따르면 고용량의 페노바르비탈의 만성적 투여에 의해 증가된다. 사이클로포스파미드 치료는 콜린에스테라제 활성의 현저하고 지속적인 억제를 유발하므로 석시닐콜린 클로라이드의 효과를 강화시킨다. 계획된 병용 mAb 및 사이클로포스파미드 요법은 하기와 같이 배정된다:
ㆍ 총 4개의 용량에 대해 매 14일마다(제1 56일 사이클의 -1, 14, 28 및 42일) 사이클로포스파미드 200mg/m2 +
ㆍ 48주 동안 매 14일마다 30분에 걸친 3mg/kg mAb 주입(3mg/kg < MTD의 단일요법 용량으로 제공됨; 3mg/kg > MTD인 경우, 용량은 1mg/kg일 것이다).
mAb, 방사선 및 사이클로포스파미드의 공-투여 : 계획된 병용 mAb, 방사선 및 사이클로포스파미드 요법은 하기를 포함한다:
ㆍ 총 4개의 용량에 대해 매 14일마다(제1 56일 사이클의 -1, 14, 28 및 42일) 사이클로포스파미드 200mg/m2
+
ㆍ 27Gy 방사선요법(9Gy × 3회/주; 제1 용량의 mAb 투여 1주 후, 바람직하게는 연속적이지 않게 주어짐) 또는
30Gy 방사선요법(6Gy × 5회/주; 제1 용량의 mAb 투여 1주 후, 바람직하게는 매일 연속하여 주어짐)
+
ㆍ 48주 동안 매 14일마다 30분에 걸친 3mg/kg mAb 주입(3mg/kg < MTD의 단일요법 용량으로 제공됨; 3mg/kg > MTD인 경우, 용량은 1mg/kg일 것이다).
연구 변수
1차 변수: 1차 안전성 변수는 DLT의 발생, 치료-유발 유해 사례(TEAE)의 발생 및 중증도, 및 48주 치료 내내 비정상적인 검사 소견을 포함한다.
2차 변수: 주요 2차 변수는 하기를 포함한다:
ㆍ mAb의 혈청 농도 및 약동학(PK)
ㆍ 적응증에 대해 적절한 기준을 사용하여 평가된 항종양 활성:
o 컴퓨터 단층촬영(CT) 또는 자기공명영상(MRI)에 의해 측정된 고형 종양에서의 반응 평가 기준(RECIST) 기준
o 다른 평가 기준은 RECIST 측정이 표준이 아닌 특정 종양에 대해 또한 사용되어야 한다.
o RECIST 측정에 적용되는 면역-관련된 반응 기준(irRC).
모든 경우에, irRC는 질환의 진행(PD), SD, CR 또는 PR을 결정하는데 지배적인 툴일 것이다. 표준 RECIST 데이타는 정보 목적을 위해 또한 수집될 것이다.
ㆍ 항-mAb 항체
연구 절차
하기 절차는 연구 적격성을 결정하거나 기저선 집단을 특성화하기 위한 스크리닝시 수행될 것이다: (i) 혈청 β-HCG(결과는 제1 용량 투여 ≤72시간 전이어야 한다); (ii) 보관된 종양 재료의 수집: 환자에게 사전동의서가 주어진 후, 상기 환자는 임의의 이용가능한 이전에 수집된 종양 샘플을 제공하는데 합의하도록 요청될 것이다; (iii) 뇌 MRI: 뇌 MRI는 이전 60일 내에 수행되지 않은 경우 스크리닝시 필요로 한다; 및 (iv) 흉부 x-선: 흉부는 이전 60일 내에 수행되지 않은 경우 스크리닝시 X-선을 필요로 한다.
효능 절차: 종양 평가를 위한 CT 또는 MRI는 스크리닝 방문시(주입 전 28일 이내) 및 56±3일에 매 사이클 동안(대략 매 8주마다), 그리고 질환 진행이 의심될 때 수행될 것이다. 추가로, 연구에 진행되지 않은 환자에 대해, 종양 평가를 추적조사 방문 3, 5 및 7일 동안 수행될 것이다. CT 스캔 또는 MRI의 사용에 대한 선택이 이루어지면, 차후의 평가는 동일한 양상을 사용하여 이루어질 것이다.
종양 반응 평가는 면역-관련된 반응 기준(irRC; Nishino 2013)에 따라서 수행될 것이다. 고형 종양에서의 반응 평가 기준(RECIST) 버전 1.1(Eisenhauer 2009)에 따른 평가를 또한 지지 검사(supportive exploration)로서 수행할 것이며; 그러나, 개별 환자에 대한 질환 진행의 1차 결정은 irRC에 따라 이루어질 것이다. RECIST 평가에 대해 표적 병변으로서 선별된 측정가능한 병변은 또한 irRC 평가를 위한 지표 병변으로 포함될 것이다.
안전성 절차: 체온, 휴식기 혈압, 맥박 및 호흡을 포함하는 활력 징후를 수집할 것이다. 다른 절차와 동일한 방문이 예정될 때, 활력 징후는 임상 실험 평가, PK 또는 예비 샘플 수집 전에 측정되어야 한다. 사이클 1 동안, 활력 징후는 처리 전, 주입 종료시, 주입후 처음 4시간 동안 매 30분마다, 그리고 연구 약물 투여후 6 및 8시간의 치료일에 기록될 것이다. 이후의 사이클에서, 치료일의 활력 징후를 평가할 것이며, 주입 전, 처음 2시간 동안 매 30분 마다, 그리고 이어서 연구 약물 투여 후 4시간까지 매 시간마다 활력 징후를 기록할 것이다.
철저히 완전한 또는 제한된 신체 검사를 방문시 수행할 것이다. 완전한 신체 검사는 피부, 머리, 눈, 코, 목구멍, 목, 관절, 폐, 심장, 맥박, 복부(간 및 비장 포함), 림프절 및 팔다리의 검사, 뿐만 아니라 간단한 신경학적 검사를 포함할 것이다. 제한된 신체 검사는 폐, 심장, 복부 및 피부를 포함할 것이다.
표준 12-lead ECG를 수행할 것이다. 기저선 수치와 비교하여 임상적으로 유의미한 변화(악화)로서 조사자에 의해 판단된 임의의 ECG 발견은 AE인 것으로 여겨질 것이며, 기록되고 모니터링된다.
면역 안전성 검정은 류마티스 인자(RF), 갑상선 자극 호르몬(TSH), C-반응 단백질(CRP), 및 항핵 항체(ANA) 역가 및 패턴으로 이루어진다. 연구 과정 동안, RF 또는 ANA에서 기저선으로부터의 4배 이상의 증가 또는 비정상적인 수준의 TSH 또는 CRP가 관찰되는 경우, 하기 시험을 또한 수행할 수 있다: 항-DNA 항체, 항-쇼그렌 증후군 A 항원(SSA) 항체(Ro), 항-쇼그렌 증후군 B 항원(SSB) 항체(La), 항갑상선글로불린 항체, 항-LKM 항체, 항인지질 항체, 항-섬세포 항체, 항중성구 세포질 항체, C3, C4, CH50. 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 및 국제 표준화 비율(International Normalized Ratio; INR)은 현장의 지역 실험실에서 분석될 것이다.
안전성
유해 사례(AE)는 연구 약물과 인과 관계를 가질 수 있거나 가질 수 없는 연구 약물이 투여된 환자에서의 임의의 불리한 의학적 발생이다. 따라서, AE는, 연구 약물과 관련되는 것으로 여겨지든 아니든, 연구 약물의 사용과 일시적으로 관련되는 임의의 바람직하지 못한 및 의도되지 않은 징후(비정상적인 검사 소견 포함), 증상 또는 질환이다. AE는 또한 연구 약물의 사용과 일시적으로 관련되는 기존의 병태의 임의의 악화(즉, 빈도 및/또는 강도에서의 임의의 임상적으로 유의미한 변화)를 포함한다. 기저 악성종양의 진행은 기저 암의 전형적인 진행 패턴(시간 경로, 발생 기관 등 포함)과 명백히 일치하는 경우 AE로 여겨지지 않을 것이다. 진행의 임상적 증상은 증상이 배타적으로 기저 악성종양의 진행으로 인한 것으로 결정될 수 없거나 연구중인 질환에 대한 예상된 진행 패턴에 맞지 않는 경우 AE로서 보고될 수 있다.
심각한 유해 사례(SAE)는 임의의 용량에서 사망을 초래하거나, 생명을 위협하거나, 입원환자에 대한 입원(in-patient hospitalization) 또는 기존의 입원기간의 연장을 필요로 하거나, 지속적인 또는 유의미한 무능(disability)/무력(incapacity)(정상적인 생활 기능을 수행하는 능력이 실질적으로 붕괴됨)을 초래하거나, 선천성 이상/출생 결함인 임의의 불리한 의학적 발생이다.
모든 AE 및 SAE에 대한 환자 정보는 기록될 것이다.
통계적 계획
연구 용량 상승은 용량 수준에 따라 배정된 3 내지 6명의 환자와 함께 전통적인 3　+　3 디자인을 기초로 한다. 본 연구에 등록된 환자의 정확한 수는 관측된 프로토콜-한정된 DLT의 수, 및 현재 한정된 용량 수준의 확장 필요성, 또는 낮은 용량 수준에서의 추가의 개방 코호트에 의해 좌우될 것이다. 용량 상승에서 다음 코호트에 대해 요구되는 초기 등록이 일어난 후, 상기 치료에 대해 MTD 미만인 이전 코호트 각각에 대한 등록을 총 6명의　환자로 확장시킬 것이다(상승 동안 이미 확장되지 않은 경우).
데이타는 기술 통계만을 사용하여 요약될 것이다. 일반적으로, 데이타는 용량 수준 및 병용으로 요약될 것이다. 안전성 요약 및 분석은 안전성 분석 세트(SAF)에서 수행될 것이다. 안전성의 1차 분석은 치료-유발 AE(TEAE)를 기초로 할 것이다.
본 발명은 본원에 기재된 특정 양태에 의해 범위가 제한되지 않아야 한다. 실제로, 본원에 기재된 것들 이외에 본 발명의 다양한 변형이 상기 기재 및 수반하는 도면으로부터 당업자에게 분명할 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.
<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> Human Antibodies to PD-1 <130> A0028WO01 <140> PCT/US2015/012589 <141> 2015-01-23 <150> 61/930,576 <151> 2014-01-23 <150> 62/014,181 <151> 2014-06-19 <160> 337 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgttcag cctctggatt cacctttagc agctatacca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggt attagtgata ccggtggtaa cacatactac 180 acagactccg tgaagggccg gttcaccgtc tccagagaca attccaagaa cacactgtct 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatcag 300 ggtggaagtt acccctatta ctttcactac tggggccagg gatccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala 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ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagtag cctgcagtct 240 ggagattttg cagtttatta ctgtcagcag tataataact ggccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa t 321 <210> 26 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 26 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Gly Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Asn 100 105 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 27 cagagtgtta gcagcaac 18 <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic 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gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagaaaatg ccaagaactc cttgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagt cggggacacg gctgtgtatt actgtacaag agatatccat 300 tgtagtagta ccaggtgcta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 66 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 66 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gly Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr 20 25 30 Asp Met His Trp Val Arg Gln Ile Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Gly Ser Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 Arg Asp Ile His Cys Ser Ser Thr Arg Cys Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 67 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 67 ggattcacct tcaggaacta cgac 24 <210> 68 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240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctccgat caccttcggc 300 caagggacac gactggagat taaa 324 <210> 74 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 74 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 75 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 75 cagagcatta gcaactat 18 <210> 76 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 76 Gln Ser Ile Ser Asn Tyr 1 5 <210> 77 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 77 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tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccttg gacgttcggc 300 caagggacca aggtggaaat caaa 324 <210> 122 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 122 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Thr Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 123 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 123 cagagtgtta gtagtagtta t 21 <210> 124 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 124 Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr 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Thr Lys Asp Ile Ser Ile Thr Gly Thr Leu Asp Ala Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr 210 215 220 Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 445 Lys <210> 333 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H4H7795N2 aa1-107: LCVR aa108-214: LC constant <400> 333 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ile Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ile Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala His Ser Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 334 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H4H9008P aa1-119: HCVR aa120-446: HC constant <400> 334 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val 35 40 45 Ser Ala Ile Gly Gly Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Lys Val Arg Asn Tyr Asp Gly Ser Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 335 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H4H9008P aa1-108: LCVR aa109-215: LC constant <400> 335 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 336 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H4H9048P2 aa1-121: HCVR aa122-448: HC constant <400> 336 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Val Thr Phe Arg Asn Phe 20 25 30 Ala Ile Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Phe Phe Ser Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Pro Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Met Glu Leu Ala Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Glu Arg Gly His Thr Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 337 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H4H9048P2 aa1-108: LCVR aa109-215: LC constant <400> 337 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims (56)

  1. 중쇄 가변 영역(HCVR)의 상보성 결정 영역(CDR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)의 CDR을 포함하고, 상기 HCVR은 표 1에 열거된 HCVR 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, 상기 LCVR은 표 1에 열거된 LCVR 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는, 참조 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 사람 예정 사멸 인자-1(programmed death-1; PD-1) 단백질에 대한 결합에 대해 경쟁하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체는 하기 특성들 중 하나 이상을 갖는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (a) 25℃에서 경쟁 샌드위치 ELISA 검정(competition sandwich ELISA assay)에서 측정시 3nM 미만의 IC50으로 PD-L1에 대한 사람 PD-1 단백질 결합을 차단함;
    (b) 37℃에서 표면 플라즈몬 공명 검정에서 측정시 약 50nM 미만의 결합 해리 평형 상수(KD)로 단량체성 사람 PD-1과 결합함;
    (c) 25℃에서 표면 플라즈몬 공명 검정에서 약 12nM 미만의 KD로 단량체성 사람 PD-1과 결합함;
    (d) 25℃에서 표면 플라즈몬 공명 검정에서 약 8.5nM 미만의 KD로 단량체성 사이노몰구스 PD-1과 결합함;
    (e) 25℃에서 표면 플라즈몬 공명 검정에서 측정시 약 6.3분 초과의 해리 반감기(t½)로 단량체성 사람 PD-1과 결합함; 및
    (f) 37℃에서 표면 플라즈몬 공명 검정에서 측정시 약 0.9분 초과의 해리 반감기(t½)로 단량체성 사람 PD-1과 결합함.
  2. 제1항에 있어서, 상기 참조 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 표 1에 기재된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
  3. 제2항에 있어서, 상기 참조 항체가 서열 번호: 130/138, 162/170, 234/202 및 314/186으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
  4. 사람 PD-1에 특이적으로 결합하는 단리된 사람 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 HCVR 서열 중 어느 하나 내에 함유된 3개의 중쇄 CDR(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3); 및 표 1에 열거된 LCVR 서열 중 어느 하나 내에 함유된 3개의 경쇄 CDR(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하는, 단리된 사람 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 제4항에 있어서, 표 1에 열거된 HCVR 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCVR을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 표 1에 열거된 LCVR 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCVR을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 표 1에 열거된 HCVR 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCVR; 및 (b) 표 1에 열거된 LCVR 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCVR을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 서열 번호: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 220, 228, 236, 244, 252, 260, 268, 276, 284, 292, 300, 308 및 316으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1 도메인;
    (b) 서열 번호: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 222, 230, 238, 246, 254, 262, 270, 278, 286, 294, 302, 310 및 318로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCDR2 도메인;
    (c) 서열 번호: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 224, 232, 240, 248, 256, 264, 272, 280, 288, 296, 304, 312 및 320으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCDR3 도메인;
    (d) 서열 번호: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188 및 204로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1 도메인;
    (e) 서열 번호: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190 및 206으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCDR2 도메인; 및
    (f) 서열 번호: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192 및 208로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCDR3 도메인
    을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. HCVR의 CDR 및 LCVR의 CDR을 포함하는 PD-L1에 대한 PD-1 결합을 차단하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 HCVR은 서열 번호: 18, 34, 50, 66, 82, 114, 130, 162, 178, 194, 210, 218, 226, 234, 242, 258, 266, 274, 282, 290, 298, 306 및 314로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, 상기 LCVR은 서열 번호: 26, 42, 58, 74, 90, 122, 138, 170, 186 및 202로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 제9항에 있어서, 서열 번호: 130/138, 162/170, 234/202 및 314/186으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
  11. 사람 PD-1과 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 25℃에서 경쟁 샌드위치 ELISA 검정에 의해 측정된 바와 같이, PD-L1에 대한 PD-1 결합을 증진시키는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  12. 제11항에 있어서, 상기 항체가 HCVR의 CDR 및 LCVR의 CDR을 포함하고, 여기서 상기 HCVR은 서열 번호: 2, 98 및 250으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, 상기 LCVR은 서열 번호: 10, 106 및 202로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  13. 제12항에 있어서, 상기 항체가 서열 번호: 2/10, 98/106 및 250/202로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 다중-특이적 항원-결합 분자인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따르는 PD-1에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 항체의 HCVR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 항체의 LCVR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  18. 제16항 또는 제17항의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터.
  19. 제18항의 벡터를 발현하는 세포.
  20. PD-1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 특이성, 및 PD-L1 또는 PD-L2의 세포외 도메인, 또는 이의 단편을 포함하는 제2 항원-결합 특이성을 포함하는 다중-특이적 항원-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편.
  21. PD-1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 특이성, 및 T-세포 공-억제제에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 특이성을 포함하는 다중-특이적 항원-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 특이성이 표 1에 열거된 HCVR 서열 중 어느 하나 내에 함유된 3개의 중쇄 CDR(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3); 및 표 1에 열거된 LCVR 서열 중 어느 하나 내에 함유된 3개의 경쇄 CDR(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하는, 다중-특이적 항원-결합 분자 또는 이의 단편.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 특이성은 표 1에 열거된 HCVR 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCVR; 및 표 1에 열거된 LCVR 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCVR을 포함하는, 다중-특이적 항원-결합 분자 또는 이의 단편.
  24. 제23항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 특이성이 서열 번호: 130/138, 162/170, 234/202 및 314/186으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 다중-특이적 항원-결합 분자 또는 이의 단편.
  25. 제21항에 있어서, 상기 제2 항원-결합 특이성이 LAG3, TIM3, B7-1, CTLA-4, BTLA, CD28, 2B4, LY108, TIGIT, ICOS 및 CD160으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 T-세포 공-억제제에 특이적으로 결합하는, 다중-특이적 항원-결합 분자 또는 이의 단편.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 신장세포 암종, 결장직장암, 난소암, 전립선암, 유방암, 결장암, 비-소세포 폐암 및 흑색종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 암의 치료에 사용하기 위한, 다중-특이적 항원-결합 분자 또는 이의 단편.
  27. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus; HIV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 사람 유두종 바이러스(human papilloma virus; HPV), 림프구성 맥락수막염 바이러스(lymphocytic choriomeningitis virus; LCMV) 및 원숭이 면역결핍 바이러스(simian immunodeficiency virus; SIV)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 바이러스에 의해 유발된 만성 바이러스 감염의 치료에 사용하기 위한, 다중-특이적 항원-결합 분자 또는 이의 단편.
  28. PD-1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 특이성, 및 자가면역-조직-특이적 항원, T-세포 수용체 및 Fc 수용체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 특이성을 포함하는 다중-특이적 항원-결합 분자 또는 이의 단편.
  29. 제28항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 특이성이 표 1에 열거된 HCVR 서열 중 어느 하나 내에 함유된 3개의 중쇄 CDR(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3); 및 표 1에 열거된 LCVR 서열 중 어느 하나 내에 함유된 3개의 경쇄 CDR(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하는, 다중-특이적 항원-결합 분자 또는 이의 단편.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 특이성이 표 1에 열거된 HCVR 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCVR; 및 표 1에 열거된 LCVR 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCVR을 포함하는, 다중-특이적 항원-결합 분자 또는 이의 단편.
  31. 제30항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 특이성이 서열 번호: 130/138, 162/170, 234/202 및 314/186으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 다중-특이적 항원-결합 분자 또는 이의 단편.
  32. 제28항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 특이성이 PD-L1 및/또는 PD-L2의 세포외 도메인 또는 이의 단편을 포함하는, 다중-특이적 항원-결합 분자 또는 이의 단편.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 항원-결합 특이성이 자가면역-조직-특이적 항원에 특이적으로 결합하는, 다중-특이적 항원-결합 분자 또는 이의 단편.
  34. 제33항에 있어서, 상기 자가면역-조직-특이적 항원이 원형탈모증, 자가면역 간염, 복강 질환, 그레이브스병(Graves' disease), 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 하시모토병(Hashimoto's disease), 용혈 빈혈, 염증성 장 질환, 염증성 근육병증, 다발성 경화증, 원발성 담관 간경화, 건선, 류마티스 관절염, 피부경화증, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 전신 홍반성 낭창, 백반증, 자가면역 췌장염, 자가면역 두드러기(autoimmune urticaira), 자가면역 혈소판감소 자색반병, 크론병(Crohn's disease), 제I형 당뇨병, 호산구성 근막염, 호산구성 위장염, 굿파스처 증후군(Goodpasture's syndrome), 중증근육무력증, 건선성 관절염, 류마티스 열, 궤양성 대장염, 혈관염 또는 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis)과 관련되는, 다중-특이적 항원-결합 분자 또는 이의 단편.
  35. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 항원-결합 특이성이 T-세포 수용체, Fcα 수용체, Fcγ 수용체 또는 CD19 중 하나에 특이적으로 결합하는, 다중-특이적 항원-결합 분자 또는 이의 단편.
  36. 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 원형탈모증, 자가면역 간염, 복강 질환, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토병, 용혈 빈혈, 염증성 장 질환, 염증성 근육병증, 다발성 경화증, 원발성 담관 간경화, 건선, 류마티스 관절염, 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 낭창, 백반증, 자가면역 췌장염, 자가면역 두드러기, 자가면역 혈소판감소 자색반병, 크론병, 제I형 당뇨병, 호산구성 근막염, 호산구성 위장염, 굿파스처 증후군, 중증근육무력증, 건선성 관절염, 류마티스 열, 궤양성 대장염, 혈관염 및 베게너 육아종증으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 자가면역 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한, 다중-특이적 항원-결합 분자 또는 이의 단편.
  37. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따르는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 또는 제20항 내지 제25항 중 어느 한 한에 따르는 다중-특이적 항원-결합 분자 또는 이의 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함하는, 피험자에서 면역 반응을 증진시키는 방법.
  38. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따르는 단리된 사람 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 또는 제20항 내지 제25항 중 어느 한 한에 따르는 다중-특이적 항원-결합 분자 또는 이의 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함하는, 피험자에서 T-조절(Treg) 세포를 억제하는 방법.
  39. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따르는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 또는 제20항 내지 제25항 중 어느 한 한에 따르는 다중-특이적 항원-결합 분자 또는 이의 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함하는, 피험자에서 T-세포 활성화을 증진시키는 방법.
  40. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험자가 뇌암, 신장세포 암종, 난소암, 전립선암, 결장암, 비-소세포 폐암, 두경부의 편평세포 암종, 결장직장암 및 흑색종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환 또는 장애를 갖는, 방법.
  41. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험자가 HIV, HCV, HBV, HPV, LCMV 및 SIV로 이루어진 그룹으로부터 선택된 바이러스에 의해 유발된 만성 바이러스 감염을 갖는, 방법.
  42. 종양 또는 종양 세포의 성장을 억제하는 방법으로서, 상기 종양 또는 종양 세포를 치료적으로 유효량의 제1항 내지 제13항 또는 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체와 접촉시킴을 포함하는, 방법.
  43. 치료적으로 유효량의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따르는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 또는 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따르는 다중-특이적 항원-결합 분자 또는 이의 단편을 투여함을 포함하는, 피험자에서 T-세포 활성화를 억제하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 피험자가 원형탈모증, 자가면역 간염, 복강 질환, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토병, 용혈 빈혈, 염증성 장 질환, 염증성 근육병증, 다발성 경화증, 원발성 담관 간경화, 건선, 류마티스 관절염, 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 낭창, 백반증, 자가면역 췌장염, 자가면역 두드러기, 자가면역 혈소판감소 자색반병, 크론병, 제I형 당뇨병, 호산구성 근막염, 호산구성 위장염, 굿파스처 증후군, 중증근육무력증, 건선성 관절염, 류마티스 열, 궤양성 대장염, 혈관염 및 베게너 육아종증으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 자가면역 질환 또는 장애를 갖는, 방법.
  45. 제37항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 제2 치료제와 함께 상기 피험자에게 투여하는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 제2 치료제가 NSAID, 코르티코스테로이드, 상이한 T-세포 공-억제제에 대한 항체, 종양 특이적 항원에 대한 항체, 자가면역 조직 항원에 대한 항체, 바이러스 감염된-세포 항원에 대한 항체, PD-L1에 대한 항체, 항산화제와 같은 식이 보충제, VEGF 길항제, 화학요법제, 세포독성제, 항바이러스 약물, 방사선, 및 상기 질환 또는 장애와 관련된 적어도 하나의 증상을 개선하는데 유용한 임의의 다른 요법으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  47. 제37항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 피하로, 정맥내로, 피내로, 복강내로, 경구로, 근육내로 또는 두개내로 투여되는, 방법.
  48. 제37항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 피험자의 체중 1kg당 약 0.1mg 내지 약 60mg의 용량으로 투여되는, 방법.
  49. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 중쇄 및 경쇄를 포함하고 상기 중쇄는 서열 번호: 330, 332, 334 및 336으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 참조 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 사람 PD-1에 대한 결합에 대해 경쟁하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
  50. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 경쇄는 서열 번호: 331, 333, 335 및 337로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 참조 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 사람 PD-1에 대한 결합에 대해 경쟁하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
  51. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 서열 번호: 330/331, 332/333, 334/335 및 336/337로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄/경쇄 아미노산 서열 쌍을 포함하는 참조 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 사람 PD-1에 대한 결합에 대해 경쟁하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
  52. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따르는 PD-1과 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물.
  53. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 기재된 항체의 중쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  54. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 기재된 항체의 경쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  55. 제53항 또는 제54항의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터.
  56. 제55항의 벡터를 발현하는 세포.
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