JP7511542B2 - タンパク質複合体を特徴づけるための方法 - Google Patents
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関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年８月３０日に出願され、その全体が参照により援用される米国仮特許出願第６２／７２４，７００号の利益およびこれに対する優先権を主張するものである。
本出願は、２０１８年８月３０日に出願され、その全体が参照により援用される米国仮特許出願第６２／７２４，７００号の利益およびこれに対する優先権を主張するものである。
発明の技術分野
本発明は概して、タンパク質複合体を特徴づけるシステムおよび方法に関する。
本発明は概して、タンパク質複合体を特徴づけるシステムおよび方法に関する。
発明の背景
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は成長中の治療分野であり、現在５０を超えるモノクローナル抗体が市販されている。二つ以上のモノクローナル抗体の併用療法は、既存の単剤療法の有効性を改善する可能性がある。特定の可溶性物質、特に複数のエピトープが繰り返される多量体物質は、二つ以上の抗体と結合して、大きな複合体の形成につながる場合がある。大きくて不均質な抗体複合体の産生は、「ペーパードリング（ｐａｐｅｒ－ｄｏｌｌｉｎｇ）」と呼ばれる。抗体の大きな複合体は、貪食により速やかに除去され、抗体の有効性の低下につながる可能性がある。また、大きなタンパク質複合体は、ｍＡｂの免疫原性を増加させる可能性がある。
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は成長中の治療分野であり、現在５０を超えるモノクローナル抗体が市販されている。二つ以上のモノクローナル抗体の併用療法は、既存の単剤療法の有効性を改善する可能性がある。特定の可溶性物質、特に複数のエピトープが繰り返される多量体物質は、二つ以上の抗体と結合して、大きな複合体の形成につながる場合がある。大きくて不均質な抗体複合体の産生は、「ペーパードリング（ｐａｐｅｒ－ｄｏｌｌｉｎｇ）」と呼ばれる。抗体の大きな複合体は、貪食により速やかに除去され、抗体の有効性の低下につながる可能性がある。また、大きなタンパク質複合体は、ｍＡｂの免疫原性を増加させる可能性がある。
タンパク質複合体のサイズは、ナノメートルから可視粒子まで様々であるため、単一の分析技術によるその特徴づけが困難になる。約１ｎｍから約１μｍまでの粒子サイズの決定に使用される最も広く普及している技術の一つは、動的光散乱法（ＤＬＳ）である。ＤＬＳは、タンパク質サイズ分布プロファイルを決定するために使用される分析技術であり、ハイスループットアプリケーションに適している（Ｚｈｏｕ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ，１１：７３８－７５６（２０１６）（非特許文献１））。溶液中のタンパク質のブラウン運動により光が散乱し、結果として生じる散乱強度の変動は粒子サイズに依存する。したがって、多分散性の観点から、平均半径および分布の幅を決定することができる。しかし、ＤＬＳの結果は多くの場合、より大きな粒子に偏っており、粒子集団を分解するには、少なくとも三倍の差が必要である。したがって、ＤＬＳだけではタンパク質複合体の解析には不十分である。
多くの凝集体サンプルの高い多分散性は、タンパク質複合体のサイズ範囲が広いため、より詳細な情報を提供するために分離ベースの方法を必要とする。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、現在、タンパク質分離に最も一般的に使用されているクロマトグラフィー技術である（Ｂｒｕｓｏｔｔｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｒｏｍａｔｉｃａｔｏｇｒａｐｈｉａ，８１：３－２３（２０１８）（非特許文献２））。ＳＥＣでは、流体力学的体積または分子の大きさに応じて分離が生じる。小さい分子は、固定相の細孔内に拡散することができるため、より長く保持されるが、大きい分子は、細孔から除外されるため、最初に溶出する。しかし、ＳＥＣは、分子量排除限界の上限、固定相へのサンプル吸着、高圧および流量でのせん断劣化、および組成に基づいた分析物の分離ができないなどの制限がある。
フロー式フィールドフロー分画（ＦＦＦ）は、大きなタンパク質と高モル質量ポリマーの分離に関して、ＳＥＣに代わる有望な選択肢である。ＦＦＦサンプル分離は、フローアシスト分離および分画法を使用して、分析物が、その拡散係数の差異によって、リボン状のチャネルに沿って分離される（Ｆｒａｕｎｈｏｆｅｒ，Ｗ．ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ，５８：３６９－３８３（２００４）（非特許文献３））。ＦＦＦは、広いサイズ範囲（ナノメートルからミクロンまで）で分析物を分離できる。ＦＦＦのオープンチャネルは、サンプル損失の低減、低圧力、および低せん断速度を実現する。ＦＦＦは、タンパク質凝集体を検出するために光散乱法などの他の分子技術と組み合わせて使用されてきたが、ｍＡｂや可溶性リガンド複合体を含むタンパク質複合体の不均質性や構造をより完全に特徴づける必要性が依然として高まっている。
したがって、本発明の目的は、大きなタンパク質複合体を形成する能力を有するタンパク質薬物産物を特定する方法を提供することである。
タンパク質薬物産物および可溶性リガンド複合体を同定および特徴づける方法を提供することが、本発明の別の目的である。
Ｚｈｏｕ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ，１１：７３８－７５６（２０１６）
Ｂｒｕｓｏｔｔｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｒｏｍａｔｉｃａｔｏｇｒａｐｈｉａ，８１：３－２３（２０１８）
Ｆｒａｕｎｈｏｆｅｒ，Ｗ．ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ，５８：３６９－３８３（２００４）
サンプル中のタンパク質複合体を特徴づけるための方法が提供される。一実施形態は、非対称フロー式フィールドフロー分画（Ａ４Ｆ）によってサンプルを分画し、多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）を使用してサンプル中のタンパク質複合体のモル質量、化学量論、およびサイズ分布を決定することによって、サンプル中のタンパク質複合体の化学量論およびサイズ分布を評価する方法を提供する。いくつかの実施形態では、タンパク質複合体は、そのリガンドに結合した抗体または融合タンパク質を含有する。リガンドは、典型的には可溶性リガンドである。リガンドは、単量体または多量体であってもよい。一実施形態では、リガンドはホモ二量体またはヘテロ二量体であり得る。別の実施形態では、タンパク質複合体は、抗体：リガンド複合体または融合タンパク質：リガンド複合体を含むか、またはこれらからなる。
別の実施形態は、第一のタンパク質薬物産物をその標的またはリガンドに添加してタンパク質：リガンド複合体を生成し、第二のタンパク質薬物産物を第一のタンパク質薬物産物：リガンド複合体に添加して複数のタンパク質：リガンド複合体を形成することによって、リードタンパク質薬物産物を選択するための方法を提供する。本方法は、タンパク質：リガンド複合体を分離することと、非対称フロー式フィールドフロー分画－ＭＡＬＬＳを使用して、タンパク質：リガンド複合体のモル質量、化学量論、およびサイズ分布を決定することとを含む。本方法はまた、より少ない大きなタンパク質：リガンド複合体を形成するタンパク質薬物産物を、リード標的タンパク質薬物として選択することを含む。典型的に、タンパク質薬物産物は、抗体もしくはその抗原結合断片、融合タンパク質、または組み換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、リガンドは可溶性リガンドである。リガンドは、単量体または多量体であってもよい。いくつかの実施形態では、大きなタンパク質複合体は異量性である。
別の実施形態は、上述の方法を使用して選択されたリードタンパク質薬物産物を含有する医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、開示された方法を使用して、同じリガンドを標的とする二つの個別の抗体が、大きくて不均質な複合体を形成するかどうかを決定することができる。
さらに別の実施形態は、タンパク質薬物産物およびそのリガンドを含有するサンプルを調製して、タンパク質薬物産物：リガンド複合体を生成することにより、タンパク質薬物産物と可溶性リガンドとの間に形成されたタンパク質複合体を特徴づけるための方法を提供する。本方法は、タンパク質薬物：リガンド複合体を分画することと、多角度レーザー光散乱により分画されたタンパク質薬物：リガンド複合体を分析して、タンパク質複合体のモル質量および不均質性を決定することとを含む。一実施形態では、総タンパク質を分画することは、非対称フロー式フィールドフロー分画によって行われる。タンパク質の濃度は、ＵＶ／Ｖｉｓで測定される。
異なるタンパク質薬物産物によって形成されるタンパク質複合体の同じリガンドに対する構造の違いは、異なるタンパク質薬物産物によって形成されるタンパク質薬物産物：リガンド複合体の溶出プロファイル／時間を比較することによって決定することができる。同一のモル質量を有する異なる溶出プロファイル／複合体の時間は、複合体が異なる構造または形状を有し得ることを示す。一実施形態では、各タンパク質薬物産物および同一の可溶性リガンドは、個々の成分についてモル質量を計算するために別々に分析され、各成分のモル質量は、各タンパク質複合体中の該成分の推定化学量論を決定するために使用される。
別の実施形態は、非対称フロー式フィールドフロー分画を使用して、タンパク質薬物産物：リガンド複合体を分画することと、分画されたタンパク質薬物産物：リガンド複合体を多角度レーザー光散乱によって分析して、タンパク質薬物：リガンド複合体のモル質量、化学量論、またはその両方を特徴づけることと、各タンパク質複合体のサイズを、各個々の成分の推定サイズと比較して、各複合体を構成する成分を決定することにより、タンパク質複合体の不均質性を決定することとによって、タンパク質薬物産物と可溶性リガンドとの間に形成されるタンパク質複合体を特徴づけるための方法を提供する。
[本発明1001]
サンプル中のタンパク質複合体の化学量論およびサイズ分布を評価するための方法であって、
前記サンプルを、非対称フロー式フィールドフロー分画（Ａ4Ｆ）によって分画することと、
多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）を使用して、前記サンプル中の前記タンパク質複合体の前記モル質量、化学量論、およびサイズ分布を決定することであって、不均質な複合体が、不均質な抗体：リガンド複合体または不均質な融合タンパク質：リガンド複合体からなる、前記決定することと
を含む、前記方法。
[本発明1002]
前記リガンドが、可溶性リガンドである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記抗体が、モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片である、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
前記抗体が、二重特異性抗体、またはその抗原結合断片である、本発明1001～1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
リードタンパク質薬物産物を選択するための方法であって、
第一のタンパク質薬物産物の標的を含む第一のサンプルに前記第一のタンパク質薬物産物を添加して、不均質なタンパク質：リガンド複合体を生成することと、
同じ標的を含有する第二のサンプルに第二のタンパク質薬物産物を添加して、タンパク質：リガンド複合体を形成することと、
前記不均質なタンパク質：リガンド複合体を分離し、かつ、非対称フロー式フィールドフロー分画－多角度レーザー光散乱を使用して不均質なタンパク質：リガンド複合体のサイズ分布および化学量論を決定することと、
前記リード標的タンパク質薬物として、より少ないタンパク質：リガンド複合体を形成する前記タンパク質薬物産物を選択することと
を含む、前記方法。
[本発明1006]
選択される前記タンパク質薬物産物が、
3：2、2：3、4：4、6：6または［2：2］ ｎ のタンパク質薬物産物対リガンド比を有する、より少ないタンパク質薬物産物複合体
を形成する、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記リガンドが、可溶性リガンドである、本発明1005または1006の方法。
[本発明1008]
前記タンパク質薬物産物が、抗体もしくはその抗原結合断片、融合タンパク質、または組み換えタンパク質である、本発明1005～1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
選択される前記タンパク質薬物産物が、1：0、0：1、1：1、1：2、および2：1からなる群から選択されるタンパク質薬物産物対リガンド比を有するタンパク質薬物産物複合体を形成する、本発明1005～1007のいずれかの方法。
[本発明1010]
本発明1005～1009のいずれかに従って選択された前記リードタンパク質薬物産物を含む、医薬組成物。
[本発明1011]
タンパク質薬物産物とそのリガンドとの間に形成されるタンパク質複合体を特徴づけるための方法であって、
前記タンパク質薬物産物およびそのリガンドを溶液中で組み合わせて、タンパク質薬物産物：リガンド複合体を含むサンプルを形成することと、
前記サンプルを、非対称フロー式フィールドフロー分画を用いて分画することと、
分画されたタンパク質薬物産物：リガンド複合体を多角度レーザー光散乱に供して、タンパク質薬物産物：リガンド複合体の化学量論およびサイズを特徴づけることと
を含む、前記方法。
[本発明1001]
サンプル中のタンパク質複合体の化学量論およびサイズ分布を評価するための方法であって、
前記サンプルを、非対称フロー式フィールドフロー分画（Ａ4Ｆ）によって分画することと、
多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）を使用して、前記サンプル中の前記タンパク質複合体の前記モル質量、化学量論、およびサイズ分布を決定することであって、不均質な複合体が、不均質な抗体：リガンド複合体または不均質な融合タンパク質：リガンド複合体からなる、前記決定することと
を含む、前記方法。
[本発明1002]
前記リガンドが、可溶性リガンドである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記抗体が、モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片である、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
前記抗体が、二重特異性抗体、またはその抗原結合断片である、本発明1001～1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
リードタンパク質薬物産物を選択するための方法であって、
第一のタンパク質薬物産物の標的を含む第一のサンプルに前記第一のタンパク質薬物産物を添加して、不均質なタンパク質：リガンド複合体を生成することと、
同じ標的を含有する第二のサンプルに第二のタンパク質薬物産物を添加して、タンパク質：リガンド複合体を形成することと、
前記不均質なタンパク質：リガンド複合体を分離し、かつ、非対称フロー式フィールドフロー分画－多角度レーザー光散乱を使用して不均質なタンパク質：リガンド複合体のサイズ分布および化学量論を決定することと、
前記リード標的タンパク質薬物として、より少ないタンパク質：リガンド複合体を形成する前記タンパク質薬物産物を選択することと
を含む、前記方法。
[本発明1006]
選択される前記タンパク質薬物産物が、
3：2、2：3、4：4、6：6または［2：2］ ｎ のタンパク質薬物産物対リガンド比を有する、より少ないタンパク質薬物産物複合体
を形成する、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記リガンドが、可溶性リガンドである、本発明1005または1006の方法。
[本発明1008]
前記タンパク質薬物産物が、抗体もしくはその抗原結合断片、融合タンパク質、または組み換えタンパク質である、本発明1005～1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
選択される前記タンパク質薬物産物が、1：0、0：1、1：1、1：2、および2：1からなる群から選択されるタンパク質薬物産物対リガンド比を有するタンパク質薬物産物複合体を形成する、本発明1005～1007のいずれかの方法。
[本発明1010]
本発明1005～1009のいずれかに従って選択された前記リードタンパク質薬物産物を含む、医薬組成物。
[本発明1011]
タンパク質薬物産物とそのリガンドとの間に形成されるタンパク質複合体を特徴づけるための方法であって、
前記タンパク質薬物産物およびそのリガンドを溶液中で組み合わせて、タンパク質薬物産物：リガンド複合体を含むサンプルを形成することと、
前記サンプルを、非対称フロー式フィールドフロー分画を用いて分画することと、
分画されたタンパク質薬物産物：リガンド複合体を多角度レーザー光散乱に供して、タンパク質薬物産物：リガンド複合体の化学量論およびサイズを特徴づけることと
を含む、前記方法。
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本開示は、本明細書に記載される組成物および方法、ならびに記載された実験条件に限定されず、それ故、変化し得ることを理解されたい。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって制限されるため、本明細書に使用される用語は、ある実施形態のみを記述する目的で使用されており、制限することを意図しないことも理解されるべきである。
Ｉ．定義
本開示は、本明細書に記載される組成物および方法、ならびに記載された実験条件に限定されず、それ故、変化し得ることを理解されたい。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって制限されるため、本明細書に使用される用語は、ある実施形態のみを記述する目的で使用されており、制限することを意図しないことも理解されるべきである。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記述したものと類似または同等な任意の組成物、方法、および材料を本発明の実施または試験に使用することができる。述べたすべての出版物はその全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。
本明細書に別段の示唆がない限り、または文脈から相反することが明白でないかぎり、本明細書において請求される本発明を記載する文脈（特に請求の範囲の文脈）において、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および類似の指示対象の用語の使用は、単数および複数の両方を包含するとみなされる。
本明細書において別段の示唆が無い限り、本明細書において値の範囲の列挙は単に、当該範囲内にある別個の値のそれぞれを個々に言及するための簡潔表現法としての機能を果たすことが意図されており、個々の値のそれぞれが、それらが個々に本明細書において列挙されているように本明細書内に組み込まれる。
「約」という用語の使用は、記述される値のおよそ±１０％の範囲で上回る、または下回る値を記述することが意図されている。他の実施形態では、値は、記述される値のおよそ±５％の範囲で上回る、または下回る値の範囲であってもよい。他の実施形態では、値は、記述される値のおよそ±２％の範囲で上回る、または下回る値の範囲であってもよい。他の実施形態では、値は、記述される値のおよそ±１％の範囲で上回る、または下回る値の範囲であってもよい。先行する範囲は、文脈で明白となることが意図されており、さらなる限定は示唆されない。本明細書において別段の示唆が無い限り、または文脈から相反することが明白でない限り、本明細書に記載のすべての方法は、任意の適切な順序で実施されることができる。本明細書に提示される任意の、およびすべての例の使用、または例示的文言（例えば「～など」）は単に本発明をより詳細に解説することが意図されており、別段であることが請求されない限り、本発明範囲に対して限定を与えるものではない。本明細書において、請求されていない要素を、本発明の実施に必須の要素であると示唆すると解釈されるべき文言はない。
「タンパク質」とは、ペプチド結合によって相互に結合された二つ以上のアミノ酸残基を含む分子を指す。タンパク質にはポリペプチドとペプチドが含まれ、さらに例えばグリコシル化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ－カルボキシル化、アルキル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ－リボシル化などの修飾も含まれ得る。タンパク質は、タンパク質系薬剤を含む科学的または商業的な対象のタンパク質であってもよく、特に酵素、リガンド、受容体、抗体およびキメラタンパク質または融合タンパク質を含む。タンパク質は公知の細胞培養法を使用して様々なタイプの組み換え細胞により産生される。一般的に遺伝子操作技術により細胞内に導入され（例えばキメラタンパク質をコードする配列、またはコドン最適化配列、イントロンレス配列など）、そこでエピソームとして存在し、または細胞ゲノム内に統合され得る。
「抗体」とは、四つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互接続された二つの重（Ｈ）鎖と二つの軽（Ｌ）鎖からなる免疫グロブリン分子を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲまたはＶＨ）と重鎖定常領域を有する。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の三つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域と軽鎖定常領域を有する。軽鎖定常領域は、一つのドメイン（ＣＬ）からなる。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された三つのＣＤＲと四つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。「抗体」という用語は、任意のアイソタイプまたはサブクラスのグリコシル化および非グリコシル化された免疫グロブリンの両方への言及を含む。「抗体」という用語は、抗体を発現するためにトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体などの組み換え手段によって調製される、発現される、生成される、または単離される抗体分子を含む。抗体という用語はさらに、複数の異なるエピトープに結合することができるヘテロ四量体免疫グロブリンを含む、二重特異性抗体も含む。二重特異性抗体は米国特許第８，５８６，７１３号に概要が記載されており、当該特許出願は本明細書に参照により援用される。
「Ｆｃ融合タンパク質」は、二つ以上のタンパク質の一部またはすべてを含み、そのうちの一つは免疫グロブリン分子のＦｃ部分であり、これらは自然界では一緒には存在しないものである。抗体に由来するポリペプチド（Ｆｃドメインを含む）の様々な部分に融合された特定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えばＡｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ ＵＳＡ ８８：１０５３５，１９９１；Ｂｙｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７，１９９０；ａｎｄ Ｈｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐａｇｅｓ １０．１９．１－１０．１９．１１，１９９２に記載されている。「受容体Ｆｃ融合タンパク質」は、Ｆｃ部分に結合された受容体の細胞外ドメインを一つまたは複数含み、一部の実施形態では、ヒンジ領域の後に免疫グロブリンのＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを含む。一部の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、一つまたは複数のリガンドに結合する二つ以上の別個の受容体鎖を含有する。例えばＦｃ融合タンパク質は、ＩＬ－１トラップまたはＶＥＧＦトラップなどのトラップである。
本明細書で使用される場合、「可溶性リガンド」とは、細胞の形質膜を容易に通過することができない極性または荷電リガンドを指す。ほとんどの可溶性リガンドは、細胞表面受容体の細胞外ドメインに結合する。
「Ａ４Ｆ」は、サンプルと外部の垂直な物理フィールドとの相互作用によって分析物の分離が達成される分画技術である、非対称フロー式フィールドフロー分画を表す。
多角度光散乱法（ＭＡＬＳ）は、サンプルによって複数の角度に散乱された光を測定するための技法を説明する。これは、分子が光をどのように散乱するかを検出することによって、溶液中の分子の絶対モル質量と平均サイズの両方を測定するために使用される。レーザー光源からのコリメート光が最も頻繁に使用される場合には、この技術は多角度レーザー光散乱法（ＭＡＬＬＳ）と呼ばれ得る。実際には、ＭＡＬＳ と ＭＡＬＬＳ という用語は同じ意味で使用される。
本明細書で使用される場合、「ブラウン運動」とは、液体中に懸濁された粒子の連続的な動きを指す。
ＩＩ．タンパク質複合体を特徴づけるための方法
モノクローナル抗体併用療法は、複数のシグナル伝達経路が関与する癌や炎症性状態などの疾患に対する有望な治療戦略として登場した。さらに、同じ経路を標的とする複数のモノクローナル抗体の投与は、単剤療法だけでは経路を完全に阻害しない場合、疾患の発症に関与する経路を完全に遮断するのに有益であり得る。しかし、治療用ｍＡｂが可溶性の多量体標的に結合すると、大きくて不均質な複合体が形成される可能性がある。タンパク質複合体のサイズ、形状、および構造は、他の要因の中でも特に、免疫原性および抗体クリアランス時間に影響を及ぼす可能性がある。タンパク質複合体の分析は、薬剤開発中のｍＡｂの薬物動態に関する洞察を提供するために重要である。
モノクローナル抗体併用療法は、複数のシグナル伝達経路が関与する癌や炎症性状態などの疾患に対する有望な治療戦略として登場した。さらに、同じ経路を標的とする複数のモノクローナル抗体の投与は、単剤療法だけでは経路を完全に阻害しない場合、疾患の発症に関与する経路を完全に遮断するのに有益であり得る。しかし、治療用ｍＡｂが可溶性の多量体標的に結合すると、大きくて不均質な複合体が形成される可能性がある。タンパク質複合体のサイズ、形状、および構造は、他の要因の中でも特に、免疫原性および抗体クリアランス時間に影響を及ぼす可能性がある。タンパク質複合体の分析は、薬剤開発中のｍＡｂの薬物動態に関する洞察を提供するために重要である。
したがって、タンパク質複合体を特徴づけるための方法およびシステムが提供される。一実施形態は、非対称フロー式フィールドフロー分画を使用してサンプルを分画し、多角度レーザー光散乱を使用してサンプル中の不均質なタンパク質複合体のモル質量、化学量論、およびサイズ分布を決定することによって、サンプル中の不均質なタンパク質薬物産物：リガンド複合体の化学量論およびサイズ分布を評価する方法を提供する。タンパク質複合体は、典型的には、標的またはリガンドとも呼ばれる関心対象のタンパク質に特異的に結合するタンパク質から構成される。一実施形態では、標的に特異的に結合するタンパク質は、抗体または融合タンパク質である。
抗体または融合タンパク質が、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでその標的またはリガンドと組み合わされると、抗体：リガンドまたは融合タンパク質：リガンドの不均質な混合物が形成され得る。一実施形態では、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）または融合タンパク質などの治療用タンパク質の可溶性多量体標的への結合は、大きくて不均質な複合体または大きなヘテロマー複合体をもたらす。例えば、大きなタンパク質複合体は、３：２、２：３、４：４、６：６、または［２：２］ｎからなる群から選択されるタンパク質：リガンド比を有するタンパク質複合体として特徴づけられ得る。大きくて不均質な複合体は、複数の多量体リガンド分子と複数のタンパク質薬物産物分子の間に形成される複合体を指す。大きなヘテロマー複合体という用語は、二つの異なるタンパク質薬物産物、例えば二つの異なる抗体、二つの異なる融合タンパク質、または異なる部位で同じリガンドに結合する一つの抗体および一つの融合タンパク質によって結合されたリガンドを指す。
別の実施形態は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、または両方において可溶性標的を有する大きくて不均質な複合体を形成するタンパク質薬物産物を特定する方法を提供する。本方法は、タンパク質薬物産物およびその可溶性リガンドを含有するサンプルを調製してタンパク質薬物産物：リガンド複合体を生成することと、タンパク質薬物産物：リガンド複合体を分離するためにサンプルを分画することと、タンパク質複合体のサイズおよび不均質性を決定するために、多角度レーザー光散乱によって分画されたタンパク質薬物産物：リガンド複合体を分析することと、を含む。一実施形態では、タンパク質サンプルは、非対称フロー式フィールドフロー分画を使用して分画される。
開示された方法およびシステムのさらなる詳細は、以下に提供される。
Ａ．タンパク質複合体の特徴づけるためのシステム
一実施形態では、システムは、非対称フロー式フィールドフロー分画（Ａ４Ｆ）システムおよび多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）システムを含む。市販のＡ４Ｆシステムの一例は、Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）３＋ Ａ４Ｆ分離システムである。市販のＭＡＬＬＳシステムの一例は、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄａｗｎ ＨＥＬＥＯＳ（登録商標）ＩＩレーザー光散乱装置である。システムは、典型的には、ＵＶ／ＶＩＳ検出器および／または屈折率検出器を含む。例示的な市販のＵＶ／ＶＩＳ検出器は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＵＶ検出器である。例示的な市販の屈折率検出器は、Ｏｐｔｉｌａｂ（登録商標）Ｔ－ｒＥＸ屈折率検出器である。一実施形態では、Ａ４Ｆシステムは、３５０Ｗスペーサーおよび４ｋＤａ ＭＷＣＯ ＮＡＤＩＲ（登録商標）親水性ＰＥＳ（ＰＥＳＨ）膜を備えたＡ４Ｆ短チャネルを含む。別の実施形態では、Ａ４Ｆ短チャンネルには、４９０Ｗスペーサーおよび１０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｎａｄｉｒ（登録商標）再生セルロース膜が取り付けられている。例示的な移動相は、ｐＨ７．０での１０ｍＭのリン酸塩および５００ｍＭのＮａＣｌを含む。しかし、カラムクロマトグラフィー分離に対するＡ４Ｆの利点は、使用できる移動相またはキャリア流体の種類に制約がないことである。一実施形態では、サンプルは、６０分にわたる直線勾配を使用して分離される。一実施形態では、チャネルフローおよびクロスフロープログラムは、ケースバイケースで望ましい分解能を達成するために特別に最適化されている。当業者であれば、Ａ４Ｆを使用して分離される特定のサンプルに必要とされる分解能に従って、溶出プロファイルを修正および最適化できることが理解されるべきである。
一実施形態では、システムは、非対称フロー式フィールドフロー分画（Ａ４Ｆ）システムおよび多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）システムを含む。市販のＡ４Ｆシステムの一例は、Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）３＋ Ａ４Ｆ分離システムである。市販のＭＡＬＬＳシステムの一例は、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄａｗｎ ＨＥＬＥＯＳ（登録商標）ＩＩレーザー光散乱装置である。システムは、典型的には、ＵＶ／ＶＩＳ検出器および／または屈折率検出器を含む。例示的な市販のＵＶ／ＶＩＳ検出器は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＵＶ検出器である。例示的な市販の屈折率検出器は、Ｏｐｔｉｌａｂ（登録商標）Ｔ－ｒＥＸ屈折率検出器である。一実施形態では、Ａ４Ｆシステムは、３５０Ｗスペーサーおよび４ｋＤａ ＭＷＣＯ ＮＡＤＩＲ（登録商標）親水性ＰＥＳ（ＰＥＳＨ）膜を備えたＡ４Ｆ短チャネルを含む。別の実施形態では、Ａ４Ｆ短チャンネルには、４９０Ｗスペーサーおよび１０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｎａｄｉｒ（登録商標）再生セルロース膜が取り付けられている。例示的な移動相は、ｐＨ７．０での１０ｍＭのリン酸塩および５００ｍＭのＮａＣｌを含む。しかし、カラムクロマトグラフィー分離に対するＡ４Ｆの利点は、使用できる移動相またはキャリア流体の種類に制約がないことである。一実施形態では、サンプルは、６０分にわたる直線勾配を使用して分離される。一実施形態では、チャネルフローおよびクロスフロープログラムは、ケースバイケースで望ましい分解能を達成するために特別に最適化されている。当業者であれば、Ａ４Ｆを使用して分離される特定のサンプルに必要とされる分解能に従って、溶出プロファイルを修正および最適化できることが理解されるべきである。
典型的には、サンプルは、Ａ４Ｆチャネルのサンプル入口ポート内に注入される。次いで、サンプルは、キャリア流体を入口ポートおよび出口ポートの両方からチャネル内に流入させ、チャネル内の点、典型的にはサンプル入口ポートの近くで出会わせて集束ゾーンを形成することによって、集められる。集束期間中、注入されたサンプルからの粒子はこの集中ゾーンに保持され、分画前の緩和を可能にする。最終ステップは、粒子の分画である。粒子がチャネルに沿って流れると、垂直に対向するクロスフロー分離フィールドが、分子をチャネルの底部に向けて押し動かす。それらがチャネルの底部付近に蓄積すると、反対に作用する、クロスフローフィールドに逆らってチャネル内に戻る拡散を受ける。分子がチャネル内に拡散できる程度は、その自然なブラウン運動によって決定され、これは並進拡散係数によって定義される特徴であり、個々の種に固有のサイズおよび形状に関連する。一般に、小さな粒子は、大きな粒子よりも拡散係数が速く、クロスフローフィールドに対してチャネル内により高度に拡散することができる。チャネル内の層流の速度は均一ではない。これは放物線パターンで移動し、流れの速度はチャネルの中心に向かって増加し、チャネルの上壁と下壁に向かって減少する。したがって、粒子が通過する速度は、チャネル内のその位置に依存する。チャネルの中心付近に位置する、拡散が速いものは、より速い速度で輸送される。チャネルの底部蓄積壁付近の浅く、低速な移動ストリーム内のより大きな粒子は、より低い流速で輸送され、より小さな粒子よりも遅れて溶出する。その結果、最小から最大の順に、溶出する質量に基づいて粒子を穏やかに分離する。
サンプルがＡ４Ｆチャネルを通って流れているとき、サンプルのリード部分は、出口ポートを通ってチャネルから出る。多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）検出器は、Ａ４Ｆシステムと流体連通しており、Ａ４Ｆ出口ポートからサンプルを受ける。いくつかの実施形態では、サンプルはまず、ＵＶ／ＶＩＳ検出器を通って流れ、吸光度の関数としてサンプル濃度を測定する。ＭＡＬＬＳシステムは、偏光ビーム（またはレーザー）をサンプル分子上に集束させ、散乱光を光検出器で検出する。
多角度光散乱（ＭＡＬＳ）は、分子、粒子、またはタンパク質複合体を含有するサンプルから散乱した光を測定する。この散乱は、セットアップの光学的配置に依存し、典型的な実験的実現では、光は一つまたはいくつかの異なる角度で検出される。単一散乱角ソリューションで、最も一般的な三つの設計は、９０度（直角光散乱またはＲＡＬＳ）、７度（低角光散乱またはＬＡＬＳ）、または１７３度（非侵襲的後方散乱またはＮＩＢＳ）である。多角度構成では、原則として、角度が固定されているもの（これはＭＡＬＳまたはＭＡＬＬＳ構成と呼ばれることが多い）と、角度が可変であるもの（一般に光散乱ゴニオメーターまたは分光計と呼ばれる）がある。ＭＡＬＳは通常、粒子分離構成の一部として使用される複数の固定角度を有するシステム、例えばＡ４Ｆを指す。ＭＡＬＳの最も広範な用途は、濃度検出器（ＲＩまたは単一波長ＵＶなど）と組み合わせた絶対モル質量検出器としてである。
ＭＡＬＳは、以下を測定するために使用できる：Ｍｗ－タンパク質複合体の重量平均モル質量、Ｒｇ－タンパク質複合体の平均半径、およびＡ２－溶液中のタンパク質の溶解度。
Ｂ．タンパク質複合体を特徴づけるための方法
開示されたシステムおよび方法は、タンパク質複合体、例えば、サンプル中のタンパク質薬物産物：リガンド複合体を特徴づけるために使用され得る。一実施形態は、非対称フロー式フィールドフロー分画（Ａ４Ｆ）によってサンプルを分画し、多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）を使用してサンプル中のタンパク質複合体のモル質量、化学量論、およびサイズ分布を決定することによって、サンプル中の不均質なタンパク質複合体の化学量論およびサイズ分布を評価する方法を提供し、複合体は、抗体：リガンド複合体または融合タンパク質：リガンド複合体を含むか、またはこれらから成る。いくつかの実施形態では、リガンドは可溶性リガンドである。典型的に、抗体はモノクローナル抗体である。一実施形態では、タンパク質複合体は、その抗体または融合タンパク質対リガンド比によって特徴づけられる。非限定的な例では、抗体または融合タンパク質対リガンド比は、１：０、０：１、１：１、１：２、２：１、２：２、３：２、２：３、４：４、６：６、または［２：２］ｎからなる群から選択され得る。抗体または融合タンパク質対リガンド比は、試験される特定の抗体または融合タンパク質およびリガンドに依存することが理解されるべきである。
開示されたシステムおよび方法は、タンパク質複合体、例えば、サンプル中のタンパク質薬物産物：リガンド複合体を特徴づけるために使用され得る。一実施形態は、非対称フロー式フィールドフロー分画（Ａ４Ｆ）によってサンプルを分画し、多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）を使用してサンプル中のタンパク質複合体のモル質量、化学量論、およびサイズ分布を決定することによって、サンプル中の不均質なタンパク質複合体の化学量論およびサイズ分布を評価する方法を提供し、複合体は、抗体：リガンド複合体または融合タンパク質：リガンド複合体を含むか、またはこれらから成る。いくつかの実施形態では、リガンドは可溶性リガンドである。典型的に、抗体はモノクローナル抗体である。一実施形態では、タンパク質複合体は、その抗体または融合タンパク質対リガンド比によって特徴づけられる。非限定的な例では、抗体または融合タンパク質対リガンド比は、１：０、０：１、１：１、１：２、２：１、２：２、３：２、２：３、４：４、６：６、または［２：２］ｎからなる群から選択され得る。抗体または融合タンパク質対リガンド比は、試験される特定の抗体または融合タンパク質およびリガンドに依存することが理解されるべきである。
１．タンパク質複合体の混合物
タンパク質複合体の特性を決定するために、複合体の各成分についてモル質量を実験的に決定して、様々な化学量論を有する複合体の予測モル質量を計算することができる。一実施形態では、混合物中の各タンパク質およびリガンドは、各成分のモル質量を決定するために別々に分析される。一実施形態では、タンパク質薬物産物およびそのリガンドを混合して、タンパク質薬物産物：リガンド複合体を形成し、次いでその複合体を特徴づける。分画されたタンパク質薬物産物：リガンドをＡ４Ｆ－ＭＡＬＬＳに供して、複合体のモル質量を決定する。次に、分画された複合体の計算値を、実験的に決定された個々の成分のモル質量と比較して、各複合体中に存在する個々の成分の可能性のある化学量論比を決定する。一実施形態では、本方法は、１：１タンパク質薬物産物：リガンド複合体を検出することができる。別の実施形態では、本方法は、タンパク質薬物産物：リガンドの任意の比率を検出することができる。非限定的な例では、本方法は、１：０、０：１、２：１、１：２、２：２、３：２、２：３、４：４、６：６、または［２：２］ｎのタンパク質薬物産物：リガンド複合体を検出することができる。抗体または融合タンパク質対リガンド比は、試験される特定の抗体または融合タンパク質およびリガンドに依存することが理解されるべきである。いくつかの実施形態では、複合体は、共通の可溶性リガンドと複合体化された複数の異なるタンパク質薬物産物を含有する。
タンパク質複合体の特性を決定するために、複合体の各成分についてモル質量を実験的に決定して、様々な化学量論を有する複合体の予測モル質量を計算することができる。一実施形態では、混合物中の各タンパク質およびリガンドは、各成分のモル質量を決定するために別々に分析される。一実施形態では、タンパク質薬物産物およびそのリガンドを混合して、タンパク質薬物産物：リガンド複合体を形成し、次いでその複合体を特徴づける。分画されたタンパク質薬物産物：リガンドをＡ４Ｆ－ＭＡＬＬＳに供して、複合体のモル質量を決定する。次に、分画された複合体の計算値を、実験的に決定された個々の成分のモル質量と比較して、各複合体中に存在する個々の成分の可能性のある化学量論比を決定する。一実施形態では、本方法は、１：１タンパク質薬物産物：リガンド複合体を検出することができる。別の実施形態では、本方法は、タンパク質薬物産物：リガンドの任意の比率を検出することができる。非限定的な例では、本方法は、１：０、０：１、２：１、１：２、２：２、３：２、２：３、４：４、６：６、または［２：２］ｎのタンパク質薬物産物：リガンド複合体を検出することができる。抗体または融合タンパク質対リガンド比は、試験される特定の抗体または融合タンパク質およびリガンドに依存することが理解されるべきである。いくつかの実施形態では、複合体は、共通の可溶性リガンドと複合体化された複数の異なるタンパク質薬物産物を含有する。
ａ．リガンド
タンパク質薬物産物：リガンド複合体のリガンドは、単量体または多量体リガンドであり得る。一実施形態では、リガンドは可溶性リガンドである。いくつかの実施形態では、可溶性リガンドは、膜貫通受容体タンパク質を含むがこれに限定されない膜貫通タンパク質の細胞外部分に対応する。
タンパク質薬物産物：リガンド複合体のリガンドは、単量体または多量体リガンドであり得る。一実施形態では、リガンドは可溶性リガンドである。いくつかの実施形態では、可溶性リガンドは、膜貫通受容体タンパク質を含むがこれに限定されない膜貫通タンパク質の細胞外部分に対応する。
単量体リガンドは、一つのタンパク質または一つのタンパク質ユニットのみを含有する。多量体リガンドは、例えば、複数のタンパク質またはタンパク質サブユニットを含有する二量体、三量体などであり得る。例えば、リガンドは、ホモ二量体またはヘテロ二量体であり得る。いくつかの実施形態では、多量体リガンドは、タンパク質薬物産物のうちの複数の分子に結合する。図１Ａは、例示的な１：１の抗体：リガンド複合体を示す。図１Ｂは、例示的な１：２の抗体：リガンド複合体を示し、図１Ｃは、内部抗体の各アームが、異なるリガンドに結合して、大きくて不均質な複合体を生成する、「ペーパードリング」効果の一例を示す。
一実施形態では、大きくて不均質なタンパク質薬物産物：リガンド複合体は、５００ｋＤａ以上のサイズを有する。別の実施形態では、不均質なタンパク質薬物産物：リガンド複合体は、５００～４０００ｋＤａのサイズを有する。別の実施形態では、大きくて不均質なタンパク質薬物産物：リガンドは、３：２、２：３、４：４または６：６のタンパク質薬物産物：リガンドの比率を有する。
一実施形態では、開示された方法は、多量体リガンドを標的とするよう設計されたリードタンパク質薬物産物が、大きくて不均質なタンパク質薬物産物：リガンド複合体を形成するかどうかを決定するために使用される。
一実施形態では、開示された方法は、多量体リガンドが、複数のタンパク質薬物産物または融合タンパク質と複合体を形成するかどうかを決定するために使用することができる。形成され得る複合体としては、１：０、０：１、２：１、１：２、２：２、３：２、２：３、４：４、６：６、または［２：２］ｎのタンパク質：リガンド比が挙げられるが、これらに限定されない。図１Ａ～図１Ｃは、多量体リガンドとモノクローナル抗体との間に形成され得る例示的な複合体を示す。
ｂ．複数のｍＡｂの組合せ
同じ経路または同じリガンドを標的とする複数のタンパク質薬物産物を用いた併用療法は、人気が高まっている。いくつかの実施形態では、開示された方法を使用して、タンパク質薬物産物によって形成されるタンパク質複合体の化学量論およびサイズ分布に基づいて、同じリガンドを標的とする抗体の異なる組み合わせを区別することができる。二つのタンパク質薬物産物を単量体リガンドと混合すると、タンパク質薬物産物はヘテロマー複合体を形成する可能性がある。本明細書において定義されるヘテロマー複合体は、同じ標的分子に結合する二つの異なるタンパク質薬物産物を指す。さらに、同じ抗体の二つのアームの各々は、二つのリガンドを結合する能力を有し、それらは第二の抗体によって結合されて、ヘテロマー複合体を形成することもできる。図２Ａ～図２Ｄは、代表的なヘテロマー複合体を示す。図２Ａおよび図２Ｃは、一つのタンパク質薬物産物（黒）または抗体が、二つのリガンドに結合し、リガンドのうちの一方が第二の固有のタンパク質薬物産物（灰色）にも結合する場合に形成される複合体を示す。図２Ｂおよび図２Ｄに示すように、灰色タンパク質が別のリガンドに結合し、それが次いで黒色タンパク質に結合する場合、より大きく、より不均質な複合体が形成され得る。
同じ経路または同じリガンドを標的とする複数のタンパク質薬物産物を用いた併用療法は、人気が高まっている。いくつかの実施形態では、開示された方法を使用して、タンパク質薬物産物によって形成されるタンパク質複合体の化学量論およびサイズ分布に基づいて、同じリガンドを標的とする抗体の異なる組み合わせを区別することができる。二つのタンパク質薬物産物を単量体リガンドと混合すると、タンパク質薬物産物はヘテロマー複合体を形成する可能性がある。本明細書において定義されるヘテロマー複合体は、同じ標的分子に結合する二つの異なるタンパク質薬物産物を指す。さらに、同じ抗体の二つのアームの各々は、二つのリガンドを結合する能力を有し、それらは第二の抗体によって結合されて、ヘテロマー複合体を形成することもできる。図２Ａ～図２Ｄは、代表的なヘテロマー複合体を示す。図２Ａおよび図２Ｃは、一つのタンパク質薬物産物（黒）または抗体が、二つのリガンドに結合し、リガンドのうちの一方が第二の固有のタンパク質薬物産物（灰色）にも結合する場合に形成される複合体を示す。図２Ｂおよび図２Ｄに示すように、灰色タンパク質が別のリガンドに結合し、それが次いで黒色タンパク質に結合する場合、より大きく、より不均質な複合体が形成され得る。
２．リードタンパク質薬物産物の選択
別の実施形態は、第一のタンパク質薬物産物を、第一のタンパク薬物産物の標的を含む第一のサンプルに添加して、不均質なタンパク質：リガンド複合体を生成すること、および第二のタンパク質薬物産物を前記標的を含有する第二のサンプルに添加して、タンパク質：リガンド複合体を形成することによって、リードタンパク質薬物産物を選択するための方法を提供する。本方法は、不均質なタンパク質：リガンド複合体を分離することと、非対称フロー式フィールドフロー分画－多角度レーザー光散乱を使用して不均質なタンパク質：リガンド複合体のサイズ分布および化学量論を決定することとを含む。本方法はまた、より少ない不均質なタンパク質：リガンド複合体を形成するタンパク質薬物産物を、リード標的タンパク質薬物として選択することを含む。いくつかの実施形態では、リガンドは可溶性リガンドである。可溶性リガンドは、単量体リガンドまたは多量体リガンドとすることができる。典型的に、タンパク質薬物産物は、抗体もしくはその抗原結合断片、融合タンパク質、または組み換えタンパク質である。タンパク質複合体は、１：０、０：１、１：１、１：２、２：１、２：２、３：２、２：３、４：４、６：６、または［２：２］ｎからなる群から選択されるが、これらに限定されない、抗体または融合タンパク質対リガンド比を有するタンパク質複合体として特徴づけられ得る。別の実施形態は、上記の方法を使用して選択されたリードタンパク質薬物産物を含有する医薬組成物を提供する。
別の実施形態は、第一のタンパク質薬物産物を、第一のタンパク薬物産物の標的を含む第一のサンプルに添加して、不均質なタンパク質：リガンド複合体を生成すること、および第二のタンパク質薬物産物を前記標的を含有する第二のサンプルに添加して、タンパク質：リガンド複合体を形成することによって、リードタンパク質薬物産物を選択するための方法を提供する。本方法は、不均質なタンパク質：リガンド複合体を分離することと、非対称フロー式フィールドフロー分画－多角度レーザー光散乱を使用して不均質なタンパク質：リガンド複合体のサイズ分布および化学量論を決定することとを含む。本方法はまた、より少ない不均質なタンパク質：リガンド複合体を形成するタンパク質薬物産物を、リード標的タンパク質薬物として選択することを含む。いくつかの実施形態では、リガンドは可溶性リガンドである。可溶性リガンドは、単量体リガンドまたは多量体リガンドとすることができる。典型的に、タンパク質薬物産物は、抗体もしくはその抗原結合断片、融合タンパク質、または組み換えタンパク質である。タンパク質複合体は、１：０、０：１、１：１、１：２、２：１、２：２、３：２、２：３、４：４、６：６、または［２：２］ｎからなる群から選択されるが、これらに限定されない、抗体または融合タンパク質対リガンド比を有するタンパク質複合体として特徴づけられ得る。別の実施形態は、上記の方法を使用して選択されたリードタンパク質薬物産物を含有する医薬組成物を提供する。
３．タンパク質複合体のサイズと形状の決定
一実施形態では、開示された方法は、タンパク質複合体のサイズを決定するために使用され得る。タンパク質薬物産物、および任意で可溶性リガンドの混合物は、Ａ４Ｆ分画を使用して分離される。タンパク質複合体のサイズおよび化学量論は、その後、ＭＡＬＬＳ分析を用いて決定することができる。ＭＡＬＬＳ分析では、偏光ビーム（またはレーザー）がサンプル分子上に集束され、散乱光が光検出器で検出される。散乱光は、様々な角度で同時に検出される。各角度における散乱光の強度は、複合体のモル質量に比例する。一実施形態では、ＵＶ／Ｖｉｓ分光法を使用して、各タンパク質複合体の濃度を決定する。
一実施形態では、開示された方法は、タンパク質複合体のサイズを決定するために使用され得る。タンパク質薬物産物、および任意で可溶性リガンドの混合物は、Ａ４Ｆ分画を使用して分離される。タンパク質複合体のサイズおよび化学量論は、その後、ＭＡＬＬＳ分析を用いて決定することができる。ＭＡＬＬＳ分析では、偏光ビーム（またはレーザー）がサンプル分子上に集束され、散乱光が光検出器で検出される。散乱光は、様々な角度で同時に検出される。各角度における散乱光の強度は、複合体のモル質量に比例する。一実施形態では、ＵＶ／Ｖｉｓ分光法を使用して、各タンパク質複合体の濃度を決定する。
別の実施形態では、異なるタンパク質薬物産物間で形成されたタンパク質複合体の共通のリガンドに対する形状／構造は、開示された方法を使用して区別することができる。同じモル質量の複合体間の溶出時間または溶出プロファイルの違いは、タンパク質複合体の形状または構造の違いを示唆する。同一または類似のモル質量を有するが、溶出時間が異なる複合体は、溶出時間が遅い複合体が、複合体の形状または構造の違いにより、流体力学的体積が増加していることを示す。
タンパク質複合体のモル質量およびサイズの不均質性を使用して、タンパク質薬物産物のクリアランスを予測することができる。一実施形態では、タンパク質複合体が大きいほど、タンパク質薬物産物はより速く身体から除去される。
Ｃ．タンパク質複合体中のタンパク質
一実施形態では、タンパク質複合体中のタンパク質のうちの一つは、タンパク質薬物産物であるか、または原核生物もしくは真核生物細胞での発現に好適な対象タンパク質である。例えば、タンパク質複合体中のタンパク質は、抗体もしくはその抗原結合断片、キメラ抗体もしくはその抗原結合断片、ＳｃＦｖもしくはその断片、Ｆｃ融合タンパク質もしくはその断片、成長因子もしくはその断片、サイトカインもしくはその断片、または細胞表面受容体の細胞外ドメインもしくはその断片であり得る。複合体中のタンパク質は、単一のサブユニットからなる単一ポリペプチドであってもよく、または二つ以上のサブユニットを含む複合的なマルチサブユニットタンパク質であってもよい。対象タンパク質は、バイオ医薬品、食品添加物もしくは保存剤、または精製および品質標準に供される任意のタンパク質製品であってもよい。
一実施形態では、タンパク質複合体中のタンパク質のうちの一つは、タンパク質薬物産物であるか、または原核生物もしくは真核生物細胞での発現に好適な対象タンパク質である。例えば、タンパク質複合体中のタンパク質は、抗体もしくはその抗原結合断片、キメラ抗体もしくはその抗原結合断片、ＳｃＦｖもしくはその断片、Ｆｃ融合タンパク質もしくはその断片、成長因子もしくはその断片、サイトカインもしくはその断片、または細胞表面受容体の細胞外ドメインもしくはその断片であり得る。複合体中のタンパク質は、単一のサブユニットからなる単一ポリペプチドであってもよく、または二つ以上のサブユニットを含む複合的なマルチサブユニットタンパク質であってもよい。対象タンパク質は、バイオ医薬品、食品添加物もしくは保存剤、または精製および品質標準に供される任意のタンパク質製品であってもよい。
いくつかの実施形態では、タンパク質複合体中のタンパク質は、抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、多特異性抗体、二重特異性抗体、抗原結合抗体断片、一本鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディもしくはテトラボディ、二重の特異性、四価免疫グロブリンＧ様分子、二重可変領域免疫グロブリン（ＤＶＤ－ＩＧ）、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、またはＩｇＧ４抗体である。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体である。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２抗体である。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ４抗体である。別の実施形態では、抗体はキメラヒンジを含む。また他の実施形態では、抗体はキメラＦｃを含む。一実施形態では、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ４抗体である。一実施形態では、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１抗体である。一実施形態では、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１／ＩｇＧ４抗体である。
いくつかの実施形態では、抗体は、抗－Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ １抗体（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１５／０２０３５７９Ａ１に記載される抗ＰＤ１抗体）、抗－Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｌｉｇａｎｄ－１（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１５／０２０３５８０Ａ１に記載される抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、抗－Ｄｌｌ４抗体、抗アンジオポエチン－２抗体（例えば、米国特許第９，４０２，８９８号に記載される抗ＡＮＧ２抗体）、抗アンジオポエチン様３抗体（例えば、米国特許第９，０１８，３５６号に記載される抗－ＡｎｇＰｔｌ３抗体）、抗－血小板由来成長因子受容体抗体（例えば、米国特許第９，２６５，８２７号に記載される抗－ＰＤＧＦＲ抗体）、抗－Ｅｒｂ３抗体、抗プロラクチン受容体抗体（例えば、米国特許第９，３０２，０１５号に記載される抗－ＰＲＬＲ抗体）、抗補体Ｃ５抗体（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１５／０３１３１９４Ａ１に記載される抗－Ｃ５抗体）、抗－ＴＮＦ抗体、抗表皮成長因子受容体抗体（例えば米国特許第９，１３２，１９２号に記載される抗－ＥＧＦＲ抗体、または米国特許出願公開ＵＳ２０１５／０２５９４２３Ａ１に記載される抗－ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体）、抗－Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｋｅｘｉｎ－９抗体（例えば、米国特許第８，０６２，６４０号または米国特許第９，５４０，４４９号に記載される抗－ＰＣＳＫ９抗体）、抗－Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ－８抗体（例えば、米国特許第８，８７１，２０９号または第９，２６０，５１５号に記載される抗－ＧＤＦ８抗体。抗ミオスタチン抗体としても知られる）、抗グルカゴン受容体（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１５／０３３７０４５Ａ１またはＵＳ２０１６／００７５７７８Ａ１に記載される抗－ＧＣＧＲ抗体）、抗－ＶＥＧＦ抗体、抗－ＩＬ１Ｒ抗体、インターロイキン４受容体抗体（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１４／０２７１６８１Ａ１または米国特許第８，７３５，０９５号もしくは第８，９４５，５５９号に記載される抗－ＩＬ４Ｒ抗体）、抗インターロイキン６受容体抗体（例えば、米国特許第７，５８２，２９８号、第８，０４３，６１７号または第９，１７３，８８０号に記載される抗－ＩＬ６Ｒ抗体）、抗－ＩＬ１抗体、抗－ＩＬ２抗体、抗－ＩＬ３抗体、抗－ＩＬ４抗体、抗－ＩＬ５抗体、抗－ＩＬ６抗体、抗－ＩＬ７抗体、抗－インターロイキン３３（例えば、米国特許第９，４５３，０７２号または第９，６３７，５３５号に記載される抗－ＩＬ３３抗体）、抗呼吸器合胞体ウイルス抗体（例えば、米国特許第９，４４７，１７３号に記載される抗－ＲＳＶ抗体）、抗－Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ３（例えば、米国特許第９，４４７，１７３号および第９，４４７，１７３号、ならびに米国特許出願６２／２２２，６０５に記載される抗－ＣＤ３抗体）、抗－Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２０（例えば、米国特許第９，６５７，１０２号およびＵＳ２０１５０２６６９６６Ａ１、ならびに米国特許第７，８７９，９８４号に記載される抗－ＣＤ２０抗体）、抗－ＣＤ１９抗体、抗－ＣＤ２８抗体、抗－Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ－４８（例えば、米国特許第９，２２８，０１４号に記載される抗－ＣＤ４８抗体）、抗－Ｆｅｌ ｄ１抗体（例えば、米国特許第９，０７９，９４８号に記載される）、抗中東呼吸器症候群ウイルス（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１５／０３３７０２９Ａ１に記載される抗－ＭＥＲＳ抗体）、抗エボラウイルス抗体（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１６／０２１５０４０に記載される）、抗ジカウイルス抗体、抗－Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｇｅｎｅ ３抗体（例えば、抗－ＬＡＧ３抗体、または抗－ＣＤ２２３抗体）、抗神経成長因子抗体（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１６／００１７０２９ならびに米国特許第８，３０９，０８８号および第９，３５３，１７６号に記載される抗－ＮＧＦ抗体）、および抗－タンパク質Ｙ抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、抗ＣＤ３ｘ抗ＣＤ２０二重特異性抗体（米国特許出願公開ＵＳ２０１４／００８８２９５Ａ１およびＵＳ２０１５０２６６９６６Ａ１に記載される）、抗ＣＤ３ｘ抗Ｍｕｃｉｎ １６二重特異性抗体（例えば、抗ＣＤ３ｘ抗Ｍｕｃ１６二重特異性抗体）、および抗ＣＤ３ｘ抗前立腺特異的膜抗原二重特異性抗体（例えば、抗ＣＤ３ｘ抗ＰＳＭＡ二重特異性抗体）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、対象タンパク質は、アブシキシマブ（ａｂｃｉｘｉｍａｂ）、アダリムマブ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、アダリムマブ－ａｔｔｏ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ－ａｔｔｏ）、ａｄｏ－トラスツズマブ（ａｄｏ－ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、アレムツズマブ（ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、アリロクマブ（ａｌｉｒｏｃｕｍａｂ）、アテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）、バシリキシマブ（ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）、ベリムマブ（ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、ベンラリズマブ（ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、ベズロトクスマブ（ｂｅｚｌｏｔｏｘｕｍａｂ）、ブリナツモマブ（ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）、ブレンツキシマブ ベドチン（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ブロダルマブ（ｂｒｏｄａｌｕｍａｂ）、カナキヌマブ（ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ）、カプロマブ ペンデチド（ｃａｐｒｏｍａｂ ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）、セルトリズマブ ペゴル（ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、セミプリマブ（ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、デノスマブ（ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、ジヌツキシマブ（ｄｉｎｕｔｕｘｉｍａｂ）、デュピリマブ（ｄｕｐｉｌｕｍａｂ）、デュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、エクリズマブ（ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ）、エロツズマブ（ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、エミシズマブ－ｋｘｗｈ（ｅｍｉｃｉｚｕｍａｂ－ｋｘｗｈ）、エムタンシンアリロクマブ（ｅｍｔａｎｓｉｎｅａｌｉｒｏｃｕｍａｂ）、エビナクマブ（ｅｖｉｎａｃｕｍａｂ）、エボロクマブ（ｅｖｏｌｏｃｕｍａｂ）、ファシヌマブ（ｆａｓｉｎｕｍａｂ）、ゴリムマブ（ｇｏｌｉｍｕｍａｂ）、グセルクマブ（ｇｕｓｅｌｋｕｍａｂ）、イブリツモマブ チウキセタン（ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ ｔｉｕｘｅｔａｎ）、イダルシズマブ（ｉｄａｒｕｃｉｚｕｍａｂ）、インフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、インフリキシマブ－ａｂｄａ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ－ａｂｄａ）、インフリキシマブ－ｄｙｙｂ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ－ｄｙｙｂ）、イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、イキセキズマブ（ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ）、メポリズマブ（ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ）、ネシツムマブ（ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）、ネスバクマブ（ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ）、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、オビルトキサキシマブ（ｏｂｉｌｔｏｘａｘｉｍａｂ）、オビヌツズマブ（ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）、オクレリズマブ（ｏｃｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、オファツムマブ（ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、オララツマブ（ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）、オマリズマブ（ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ペルツズマブ（ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、ラムシルマブ（ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、ラニビズマブ（ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）、ラキシバクマブ（ｒａｘｉｂａｃｕｍａｂ）、レスリズマブ（ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ）、リヌクマブ（ｒｉｎｕｃｕｍａｂ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、サリルマブ（ｓａｒｉｌｕｍａｂ）、セクキヌマブ（ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ）、シルツキシマブ（ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）、トシリズマブ（ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、トシリズマブ（ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、トレボグルマブ（ｔｒｅｖｏｇｒｕｍａｂ）、ウステキヌマブ（ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）、およびベドリズマブ（ｖｅｄｏｌｉｚｕｍａｂ）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、複合体中のタンパク質は、Ｆｃ部分と別のドメインを含有する組み換えタンパク質（例えばＦｃ－融合タンパク質）である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ－融合タンパク質は、受容体Ｆｃ－融合タンパク質であり、Ｆｃ部分に連結された受容体の細胞外ドメインを一つまたは複数含有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ部分は、ヒンジ領域、それに続いてＩｇＧのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含有する。いくつかの実施形態では、受容体Ｆｃ－融合タンパク質は、単一のリガンドまたは複数のリガンドのいずれかに結合する二つ以上の別個の受容体鎖を含有する。例えばＦｃ－融合タンパク質は、ＴＲＡＰタンパク質であり、例えばＩＬ－１トラップ（例えば、リロナセプト（ｒｉｌｏｎａｃｅｐｔ）であり、これはｈＩｇＧ１のＦｃに融合されたＩｌ－１Ｒ１細胞外領域に融合されたＩＬ－１ＲＡｃＰリガンド結合領域を含有する；米国特許第６，９２７，００４号を参照のこと。当該特許はその全体で参照により本明細書に援用される）、またはＶＥＧＦトラップ（例えばアフリベルセプト（ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）またはｚｉｖ－アフリベルセプト（ｚｉｖ－ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）であり、これはｈＩｇＧ１のＦｃに融合されたＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３に融合されたＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２を含有する；米国特許第７，０８７，４１１号および第７，２７９，１５９号を参照のこと）である。他の実施形態では、Ｆｃ－融合タンパク質は、ＳｃＦｖ－Ｆｃ－融合タンパク質であり、これは例えばＦｃ部分に連結された抗体の可変重鎖断片および可変軽鎖断片などの一つまたは複数の抗原結合ドメインの一つまたは複数を含有する。
実施例１：Ａ４Ｆ分析は、ＳＥＣ分画と比較して、大きくて不均質な複合体を含有するサンプルに対して優れた分解能を提供する
方法
ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ移動相バッファ
ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ分析では、ＳＥＣ移動相バッファの組成は、１０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０であり、使用前にろ過（０．２μｍ）された。
方法
ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ移動相バッファ
ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ分析では、ＳＥＣ移動相バッファの組成は、１０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０であり、使用前にろ過（０．２μｍ）された。
ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ分析
ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳシステムは、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ ＧＬカラム（１０ｍｍ ｘ ３００ｍｍ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ｃａｔ＃ １７－５１７２－０１）からなり、紫外線（ＵＶ）ダイオードアレイ検出器、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｍｉｎｉＤａｗｎ ＴＲＥＯＳ（登録商標）レーザー光散乱装置（ＬＳ）、およびＯｐｔｉｌａｂ（登録商標）Ｔ－ｒＥＸ示差屈折計（ＲＩ）検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズのＨＰＬＣシステムに連結されている。検出器は、以下の順序で直列に接続した。ＵＶ－ＬＳ－ＲＩ。ＬＳおよびＲＩ検出器は、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙが提供する指示に従って較正された。
ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳシステムは、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ ＧＬカラム（１０ｍｍ ｘ ３００ｍｍ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ｃａｔ＃ １７－５１７２－０１）からなり、紫外線（ＵＶ）ダイオードアレイ検出器、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｍｉｎｉＤａｗｎ ＴＲＥＯＳ（登録商標）レーザー光散乱装置（ＬＳ）、およびＯｐｔｉｌａｂ（登録商標）Ｔ－ｒＥＸ示差屈折計（ＲＩ）検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズのＨＰＬＣシステムに連結されている。検出器は、以下の順序で直列に接続した。ＵＶ－ＬＳ－ＲＩ。ＬＳおよびＲＩ検出器は、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙが提供する指示に従って較正された。
定義された量の抗タンパク質Ｘ ｍＡｂをそれぞれ組み換え型タンパク質Ｘと混合し、ｐＨ７．４の１Ｘ ＤＰＢＳで希釈して、以下のモル比を得た：５μＭの抗タンパク質Ｘ ｍＡｂ：１μＭのタンパク質Ｘ、１μＭの抗タンパク質Ｘ ｍＡｂ：１μＭのタンパク質Ｘ、および１μＭの抗タンパク質Ｘ ｍＡｂ：５μＭのタンパク質Ｘ。すべてのサンプルを周囲温度で２時間インキュベートし、カラムに注入する前に４℃でろ過せずに維持した。カラムを、各サンプルの注入前に、０．３ｍＬ／分の流量で、移動相バッファ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０±０．１）で予め平衡化した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；２ｍｇ／ｍＬ；１５０μｇサンプル量）を別々に注入し、システム適合性対照として含めた。
ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ移動相バッファ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０±０．１）を分画全体で使用した。各サンプル（１００～２００μｇ）を注入し、０．３ｍＬ／分の流量で溶出した。ＢＳＡは、同じパラメータ設定を使用して分割された。
Ａ４Ｆ－ＭＡＬＬＳ移動相バッファ
ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ分析では、ＳＥＣ移動相バッファの組成は、１０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０であり、使用前にろ過（０．２μｍ）された。
ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ分析では、ＳＥＣ移動相バッファの組成は、１０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０であり、使用前にろ過（０．２μｍ）された。
Ａ４Ｆ－ＭＡＬＬＳ
Ａ４Ｆ－ＭＡＬＬＳシステムは、紫外線（ＵＶ）ダイオードアレイ検出器、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄａｗｎ ＨＥＬＥＯＳ（登録商標）ＩＩレーザー光散乱装置（ＬＳ）、およびＯｐｔｉｌａｂ（登録商標）Ｔ－ｒＥＸ示差屈折計（ＲＩ）検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズＨＰＬＣシステムに連結されたＥｃｌｉｐｓｅ（商標）３＋ Ａ４Ｆ分離システムで構成されている。検出器は、以下の順序で直列に接続した。ＵＶ－ＬＳ－ＲＩ。ＬＳおよびＲＩ検出器は、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙが提供する指示に従って較正された。
Ａ４Ｆ－ＭＡＬＬＳシステムは、紫外線（ＵＶ）ダイオードアレイ検出器、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄａｗｎ ＨＥＬＥＯＳ（登録商標）ＩＩレーザー光散乱装置（ＬＳ）、およびＯｐｔｉｌａｂ（登録商標）Ｔ－ｒＥＸ示差屈折計（ＲＩ）検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズＨＰＬＣシステムに連結されたＥｃｌｉｐｓｅ（商標）３＋ Ａ４Ｆ分離システムで構成されている。検出器は、以下の順序で直列に接続した。ＵＶ－ＬＳ－ＲＩ。ＬＳおよびＲＩ検出器は、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙが提供する指示に従って較正された。
定義された量の抗タンパク質Ｘ ｍＡｂをそれぞれ組み換え型タンパク質Ｘと混合し、ｐＨ７．４の１Ｘ ＤＰＢＳで希釈して、以下のモル比を得た：５μＭの抗タンパク質Ｘ ｍＡｂ：１μＭのタンパク質Ｘ、１μＭの抗タンパク質Ｘ ｍＡｂ：１μＭのタンパク質Ｘ、および１μＭの抗タンパク質Ｘ ｍＡｂ：５μＭのタンパク質Ｘ。すべてのサンプルは、周囲温度で２時間インキュベートし、４℃でろ過せずに維持した後、１０ｋＤａのＭＷＣＯ Ｎａｄｉｒ再生セルロース膜を使用して、Ｗ３５０スペーサーホイル（スペーサー厚さ３５０μｍ、スペーサー幅２．２ｃｍ）を取り付けたＥｃｌｉｐｓｅ（商標）短チャネルに注入した。チャネルを、各サンプルの注入前に、移動相バッファ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０±０．１）で予め平衡化した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；２ｍｇ／ｍＬ；１０μｇサンプル量）を別々に注入し、システム適合性対照として含めた。
分画法は、注入、集束、溶出、およびチャネルの「ウォッシュアウト」ステップの四つのステップで構成されている。Ａ４Ｆ－ＭＡＬＬＳ移動相バッファ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０±０．１）を分画法全体で使用した。各サンプル（７μｇ）を０．２ｍＬ／分の流量で１分間注入し、その後、集束流量１．５ｍＬ／分で２分間集束した。サンプルは、チャネル流量１．０ｍＬ／分、直線勾配クロスフロー３．０ｍＬ／分～０ｍＬ／分で４５分間にわたって溶出された。最後に、クロスフローを０ｍＬ／分でさらに５分間保持し、チャネルを洗浄した。ＢＳＡは、同じパラメータ設定を使用して分割された。
ＭＡＬＬＳデータ分析
データは、ＡＳＴＲＡ Ｖソフトウェア（バージョン５．３．４．１４、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて分析した。データは、過剰な散乱光を溶質濃度および重量平均モル質量Ｍｗに関連付ける式に適合した（Ｗｙａｔｔ，１９９３；Ｋｅｎｄｒｉｃｋ，２００１）。
データは、ＡＳＴＲＡ Ｖソフトウェア（バージョン５．３．４．１４、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて分析した。データは、過剰な散乱光を溶質濃度および重量平均モル質量Ｍｗに関連付ける式に適合した（Ｗｙａｔｔ，１９９３；Ｋｅｎｄｒｉｃｋ，２００１）。
式１：
式中、ｃは溶質濃度、Ｒ（θ、ｃ）は散乱角と濃度の関数としての溶質からの過剰なローリー比であり、Ｍｗはモル質量であり、Ｐ（θ）は散乱光の角依存性（回転半径＜５０ｎｍの粒子の場合、約１まで）を表し、Ａ２は浸透圧の膨張における第二のウイルス係数（測定は希釈溶液で行われるため無視できる）であり、
式２：
式中、ｎｏは溶媒屈折率、ＮＡはアボガドロの数字、λ０は真空中の入射光の波長、ｄｎ／ｄｃは溶質に対する特定の屈折率の増分を表す。
式２：
ＢＳＡモノマーのモル質量は、データ収集（システム適合性チェック）中に光散乱および示差屈折率検出器の較正定数を評価する役割を果たした。ＵＶおよびＲＩ検出器から求めたＢＳＡの平均モル質量の相対標準偏差（％ＲＳＤ）は≦５．０％であった。
光散乱検出器、検出器間遅延容量およびバンドブロードニング項の正規化係数は、採用したＡ４Ｆ－ＭＡＬＬＳ条件で収集したＢＳＡクロマトグラムから算出した。これらの値は、これらの用語を修正するために、他のすべてのサンプルについて収集されたデータファイルに適用された。
ｄｎ／ｄｃ値および２１５ｎｍまたは２８０ｎｍでの吸光係数（グリコシル化について補正）を、Ａｓｔｒａソフトウェアで提供されたタンパク質コンジュゲート分析を用いて実験的に決定した。補正した吸光係数およびｄｎ／ｄｃ値を用いて、全てのタンパク質－タンパク質複合体サンプルを分析した。
結果
サンプルのＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ分析では、高次複合体の分解能が不良であり（溶出量＝８～１４ｍＬ）、中間複合体の区別がないことが示された（図３Ａ、表１）。対照的に、サンプルのＡ４Ｆ－ＭＡＬＬＳ分析では、高次複合体の分解能が優れており（溶出時間＝約１１～３０分）、中間複合体の明確な区別が示された（図３Ｂ、表２）。
サンプルのＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ分析では、高次複合体の分解能が不良であり（溶出量＝８～１４ｍＬ）、中間複合体の区別がないことが示された（図３Ａ、表１）。対照的に、サンプルのＡ４Ｆ－ＭＡＬＬＳ分析では、高次複合体の分解能が優れており（溶出時間＝約１１～３０分）、中間複合体の明確な区別が示された（図３Ｂ、表２）。
（表１）ｍＡｂ：タンパク質Ｘ複合体のおおよそのモル質量と保持量
ＥＶ：溶出量、Ｍｗ：重量平均モル質量、ＮＡ：該当なし、ｍｉｎ：分、ｋＤａ：キロダルトン
（表２）ｍＡｂ：タンパク質Ｘ複合体のおおよそのモル質量と保持時間
Ｒｔ：保持時間、Ｍｗ：重量平均モル質量、ＮＡ：該当なし、ｍｉｎ：分、ｋＤａ：キロダルトン
実施例２：抗タンパク質Ｙ複合体
方法
Ａ４Ｆ ＭＡＬＬＳ移動相バッファ
１Ｘ ＤＰＢＳ、ｐＨ７．４は、ＨＰＬＣグレードの水で５００ｍＬの１０Ｘ ＤＰＢＳを総容量４．９Ｌに希釈することによって調製された。０．００２５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムの溶液を抗菌剤として添加した。塩酸（１２Ｍ）を少量ずつ徐々に添加し、ｐＨを７．４に調整してから、最終容量を５．０Ｌとした。バッファの最終測定ｐＨは７．４であった。バッファ溶液を仕様前に新たに調製し、ろ過（０．２μｍ）した。
方法
Ａ４Ｆ ＭＡＬＬＳ移動相バッファ
１Ｘ ＤＰＢＳ、ｐＨ７．４は、ＨＰＬＣグレードの水で５００ｍＬの１０Ｘ ＤＰＢＳを総容量４．９Ｌに希釈することによって調製された。０．００２５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムの溶液を抗菌剤として添加した。塩酸（１２Ｍ）を少量ずつ徐々に添加し、ｐＨを７．４に調整してから、最終容量を５．０Ｌとした。バッファの最終測定ｐＨは７．４であった。バッファ溶液を仕様前に新たに調製し、ろ過（０．２μｍ）した。
Ａ４Ｆ ＭＡＬＬＳ分析
定義された量の抗タンパク質Ｙ ｍＡｂ（リードＡおよびリードＢ）をそれぞれ組み換えヒトタンパク質Ｙと混合し、ｐＨ７．４の１Ｘ ＤＰＢＳで希釈して以下のモル比を得た：１μＭの抗タンパク質Ｙ ｍＡｂ：３μＭのｈＡｃｔＡ、１μＭの抗タンパク質Ｙ ｍＡｂ：１μＭのタンパク質Ｙ、および３μＭの抗タンパク質Ｙ ｍＡｂ：１μＭのタンパク質Ｙ。すべてのサンプルは、周囲温度で２時間インキュベートし、４℃でろ過せずに維持した後、１０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｎａｄｉｒ再生セルロース膜を使用して、Ｗ４９０スペーサーホイル（スペーサー厚さ４９０μｍ、スペーサー幅２．２ｃｍ）を取り付けたＥｃｌｉｐｓｅ（商標）短チャンネルに注入した。チャネルは、各サンプルの注入前に、ｐＨ７．４の１Ｘ ＤＰＢＳバッファで予め平衡化した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；２ｍｇ／ｍＬ；１０μｇサンプル量）を別々に注入し、システム適合性対照として含めた。
定義された量の抗タンパク質Ｙ ｍＡｂ（リードＡおよびリードＢ）をそれぞれ組み換えヒトタンパク質Ｙと混合し、ｐＨ７．４の１Ｘ ＤＰＢＳで希釈して以下のモル比を得た：１μＭの抗タンパク質Ｙ ｍＡｂ：３μＭのｈＡｃｔＡ、１μＭの抗タンパク質Ｙ ｍＡｂ：１μＭのタンパク質Ｙ、および３μＭの抗タンパク質Ｙ ｍＡｂ：１μＭのタンパク質Ｙ。すべてのサンプルは、周囲温度で２時間インキュベートし、４℃でろ過せずに維持した後、１０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｎａｄｉｒ再生セルロース膜を使用して、Ｗ４９０スペーサーホイル（スペーサー厚さ４９０μｍ、スペーサー幅２．２ｃｍ）を取り付けたＥｃｌｉｐｓｅ（商標）短チャンネルに注入した。チャネルは、各サンプルの注入前に、ｐＨ７．４の１Ｘ ＤＰＢＳバッファで予め平衡化した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；２ｍｇ／ｍＬ；１０μｇサンプル量）を別々に注入し、システム適合性対照として含めた。
分画法は、注入、集束、溶出、およびチャネルの「ウォッシュアウト」ステップの四つのステップで構成されている。Ａ４Ｆ－ＭＡＬＬＳ移動相バッファ（１Ｘ ＤＰＢＳ、ｐＨ７．４）を、分画法全体で使用した。各サンプル（１０μｇ）を０．２ｍＬ／分の流量で１分間注入し、その後、集束流量１．５ｍＬ／分で２分間集束した。サンプルは、チャネル流量１．０ｍＬ／分、直線勾配クロスフロー１．２ｍＬ／分～０ｍＬ／分で２０分間にわたって溶出された。最後に、クロスフローを０ｍＬ／分でさらに５分間保持し、チャネルを洗浄した。ＢＳＡは、同じパラメータ設定を使用して分割された。
マウス抗ヒト抗体力価
マウス抗ヒト抗体（ＭＡＨＡ）力価は、ｍＡｂ ＡまたはｍＡｂ ＢマウスＩｇＧの検出に特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して決定された。簡潔に述べると、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１μｇ／ｍＬのｍＡｂ ＡまたはｍＡｂ Ｂを、４℃で一晩マイクロタイタープレートに受動的に吸着させた後、ＰＢＳ中の５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で非特異的結合ブロックを行った。血清サンプルの連続希釈を、１：１００から始まる希釈バッファ（ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ）で調製した。したがって、対応する希釈係数（１００）をアッセイの検出下限（ＬＯＤ）として定義した。次いで、サンプルをｍＡｂ ＡまたはｍＡｂ Ｂでコーティングしたプレート（１００μＬ／ウェル）に加え、４℃で１６～１８時間インキュベートした。希釈バッファのみを添加したウェルは、バックグラウンドシグナルを決定するために含めた。その後、プレートで捕捉されたｍＡｂ ＡまたはｍＡｂ Ｂ特異的ＭＡＨＡを、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗マウスＦｃγを４０ｎｇ／ｍＬで使用して検出した。発色性ＨＲＰ基質、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用してＨＲＰ活性を検出し、その結果得られる４５０ｎｍ（ＯＤ４５０）での光学密度をＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ４マルチモードプレートリーダーで読み取った。結合シグナル対希釈係数のデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用した非線形回帰により解析し、力価を算出した。ＭＡＨＡ力価は、アッセイのバックグラウンドシグナルの二倍に相当する結合シグナルに対応する血清サンプルの計算された希釈係数として定義した。
マウス抗ヒト抗体（ＭＡＨＡ）力価は、ｍＡｂ ＡまたはｍＡｂ ＢマウスＩｇＧの検出に特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して決定された。簡潔に述べると、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１μｇ／ｍＬのｍＡｂ ＡまたはｍＡｂ Ｂを、４℃で一晩マイクロタイタープレートに受動的に吸着させた後、ＰＢＳ中の５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で非特異的結合ブロックを行った。血清サンプルの連続希釈を、１：１００から始まる希釈バッファ（ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ）で調製した。したがって、対応する希釈係数（１００）をアッセイの検出下限（ＬＯＤ）として定義した。次いで、サンプルをｍＡｂ ＡまたはｍＡｂ Ｂでコーティングしたプレート（１００μＬ／ウェル）に加え、４℃で１６～１８時間インキュベートした。希釈バッファのみを添加したウェルは、バックグラウンドシグナルを決定するために含めた。その後、プレートで捕捉されたｍＡｂ ＡまたはｍＡｂ Ｂ特異的ＭＡＨＡを、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗マウスＦｃγを４０ｎｇ／ｍＬで使用して検出した。発色性ＨＲＰ基質、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用してＨＲＰ活性を検出し、その結果得られる４５０ｎｍ（ＯＤ４５０）での光学密度をＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ４マルチモードプレートリーダーで読み取った。結合シグナル対希釈係数のデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用した非線形回帰により解析し、力価を算出した。ＭＡＨＡ力価は、アッセイのバックグラウンドシグナルの二倍に相当する結合シグナルに対応する血清サンプルの計算された希釈係数として定義した。
結果
二つのリードｍＡｂは、明確に異なる複合体をタンパク質Ｙと形成した。試験した全ての条件下で、ｍＡｂ リードＡは、ｍＡｂ リードＢよりも、より小さく、より不均質性の少ない複合体を、タンパク質Ｙと形成した（図４Ａ～図４Ｃ、表３～表５）。
二つのリードｍＡｂは、明確に異なる複合体をタンパク質Ｙと形成した。試験した全ての条件下で、ｍＡｂ リードＡは、ｍＡｂ リードＢよりも、より小さく、より不均質性の少ない複合体を、タンパク質Ｙと形成した（図４Ａ～図４Ｃ、表３～表５）。
（表３）ｍＡｂ：タンパク質Ｙ複合体のおおよそのモル質量と保持時間
Ｒｔ：保持時間、Ｍｗ：重量平均モル質量、ＮＡ：該当なし、ｍｉｎ：分、ｋＤａ：キロダルトン
（表４）ｍＡｂ：タンパク質Ｙ複合体のおおよそのモル質量と保持時間
Ｒｔ：保持時間、Ｍｗ：重量平均モル質量、ＮＡ：該当なし、ｍｉｎ：分、ｋＤａ：キロダルトン
（表５）ｍＡｂ：タンパク質Ｙ複合体のおおよそのモル質量と保持時間
Ｒｔ：保持時間、Ｍｗ：重量平均モル質量、ＮＡ：該当なし、ｍｉｎ：分、ｋＤａ：キロダルトン
抗タンパク質Ｙ複合体のサイズおよび不均質性は、マウスＰＫ観察と良好に相関した（図５Ａ～図５Ｂ）。タンパク質Ｙを有するリードＢについて観察されたより大きな複合体は、より速いクリアランスと相関した（図５Ｂ）。
実施例３：抗ヒトタンパク質Ｚ複合体
方法
サンプル調製
サンプルをｐＨ７．４の１Ｘ ＤＰＢＳで調製し、Ａ４Ｆ－ＭＡＬＬＳによる総タンパク質の分画前に室温で２時間インキュベートした。サンプルは以下のとおりであった：
１ｍＭの抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ１＋二次ｍＡｂ（０．５μＭ＋０．５μＭ）＋１μＭの補体タンパク質Ｚ（７つの組み合わせ）または１ｍＭの抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ６＋抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ７（０．５μＭ＋０．５μＭ）＋１μＭの補体タンパク質Ｚ。二次抗体のリストは表６に見出すことができる。
方法
サンプル調製
サンプルをｐＨ７．４の１Ｘ ＤＰＢＳで調製し、Ａ４Ｆ－ＭＡＬＬＳによる総タンパク質の分画前に室温で２時間インキュベートした。サンプルは以下のとおりであった：
１ｍＭの抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ１＋二次ｍＡｂ（０．５μＭ＋０．５μＭ）＋１μＭの補体タンパク質Ｚ（７つの組み合わせ）または１ｍＭの抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ６＋抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ７（０．５μＭ＋０．５μＭ）＋１μＭの補体タンパク質Ｚ。二次抗体のリストは表６に見出すことができる。
（表６）サンプル命名法
Ａ４Ｆ ＭＡＬＬＳ分析
すべてのサンプルは、周囲温度で合計２時間インキュベートし、４℃でろ過せずに維持した後、４ｋＤａのＭＷＣＯ親水性ＰＥＳ（ＰＥＳＨ）膜を使用して、Ｗ３５０スペーサーホイル（スペーサー厚さ３５０μｍ、スペーサー幅２．２ｃｍ）を取り付けたＥｃｌｉｐｓｅ（商標）短チャネルに注入した。チャネルを、各サンプルの注入前に、移動相バッファ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０±０．１）で予め平衡化した。ＢＳＡ（２ｍｇ／ｍＬ；１０μｇサンプル量）を別々に注入し、システム適合性対照として含めた。
すべてのサンプルは、周囲温度で合計２時間インキュベートし、４℃でろ過せずに維持した後、４ｋＤａのＭＷＣＯ親水性ＰＥＳ（ＰＥＳＨ）膜を使用して、Ｗ３５０スペーサーホイル（スペーサー厚さ３５０μｍ、スペーサー幅２．２ｃｍ）を取り付けたＥｃｌｉｐｓｅ（商標）短チャネルに注入した。チャネルを、各サンプルの注入前に、移動相バッファ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０±０．１）で予め平衡化した。ＢＳＡ（２ｍｇ／ｍＬ；１０μｇサンプル量）を別々に注入し、システム適合性対照として含めた。
分画法は、注入、集束、溶出、およびチャネルの「ウォッシュアウト」ステップの四つのステップで構成されている。Ａ４Ｆ－ＭＡＬＬＳ移動相バッファ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０±０．１）を分画法全体で使用した。各サンプル（７μｇ複合体または４μｇの個々の成分）を０．２ｍＬ／分の流量で注入し、集束流量１ｍＬ／分で５分間集束した。サンプルは、チャネル流量１ｍＬ／分、直線勾配クロスフロー２ｍＬ／分～０ｍＬ／分で４５分間にわたって溶出された。最後に、クロスフローを０ｍＬ／分でさらに５分間保持し、チャネルを洗浄した。ＢＳＡは、同じパラメータ設定を使用して分割された。
ＲＢＣ溶血アッセイ
代替経路（ＡＰ）溶血アッセイを補体活性化の尺度として使用して、抗タンパク質Ｚ ｍＡｂがウサギ赤血球（ＲｂＲＢＣ）の溶解を阻害する能力を評価した。膜侵襲複合体によるウサギ赤血球の溶解は、補体活性化を実験的に測定するアッセイの基礎である。
代替経路（ＡＰ）溶血アッセイを補体活性化の尺度として使用して、抗タンパク質Ｚ ｍＡｂがウサギ赤血球（ＲｂＲＢＣ）の溶解を阻害する能力を評価した。膜侵襲複合体によるウサギ赤血球の溶解は、補体活性化を実験的に測定するアッセイの基礎である。
所望の数のＲｂＲＢＣをＧＶＢ－Ｍｇ２＋／ＥＧＴＡバッファ中で洗浄し、２×１０８細胞／ｍＬで再懸濁する。単一の抗Ｃ５ ｍＡｂまたは抗Ｃ５ ｍＡｂの組み合わせのいずれかの有効性をテストするために、正常なヒト血清をＧＶＢ－Ｍｇ２＋／ＥＧＴＡバッファ中で５０～９６％に希釈し、ＲＢＣに添加した場合の最終濃度２５～４８％を得た。丸底９６ウェルプレートを用いて溶血活性を測定した。合計１００μＬのＲｂＲＢＣ（２×１０８細胞／ｍｌ）を、３７℃で９６ウェルプレートに播種し、次いで１００μＬの希釈された血清を添加した。細胞を穏やかに混合し、３７℃で３０～１２０分間インキュベートした。インキュベーション時間後、細胞を４℃で、１２５０ｘｇで遠心分離することによってスピンダウンした。合計１００μＬの上清を、新しい９６平底プレートに移し、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘマイクロプレートリーダーで４１２ｎｍで読み取った。溶血率の算出は、以下に説明するように行った。
以下の式を使用して、溶血率（％）を吸光度値で計算した：
式３：
この式では、「バックグラウンド細胞溶解」は、血清を含まないＧＶＢ－Ｍｇ２＋／ＥＧＴＡバッファのみでインキュベートした細胞からのＡ４１２ｎｍでのＯＤである。「最大細胞溶解」は、水で処理された細胞からのＡ４１２ｎｍでのＯＤである。溶解の最大阻害は、曲線の最低値と最高値との差を、最高値の割合として表したものとして計算した。データは平均値±平均値の標準誤差で表した。
式３：
結果
ＣＯＭＰ１ ｍＡｂまたは他のタンパク質Ｚ ｍＡｂと組み合わせた抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ１（リード抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ）は、溶血を完全にブロックしない単剤療法（図６Ａ、表７）と比較して、代替経路の活性化を介してウサギＲＢＣの溶血を完全にブロックする（図６Ｂ、表８）。全ての抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ１：抗タンパク質Ｚ ｍＡｂの組み合わせがウサギＲＢＣの溶血を完全にブロックしたため、免疫原性および／または標的介在性クリアランスなど、薬剤開発中のｍＡｂの薬物動態（ＰＫ）に関する知見を提供することができる、大きさ、形状および配向などの複合体形成における差異があるかどうかを判定することは重要であった。
ＣＯＭＰ１ ｍＡｂまたは他のタンパク質Ｚ ｍＡｂと組み合わせた抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ１（リード抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ）は、溶血を完全にブロックしない単剤療法（図６Ａ、表７）と比較して、代替経路の活性化を介してウサギＲＢＣの溶血を完全にブロックする（図６Ｂ、表８）。全ての抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ１：抗タンパク質Ｚ ｍＡｂの組み合わせがウサギＲＢＣの溶血を完全にブロックしたため、免疫原性および／または標的介在性クリアランスなど、薬剤開発中のｍＡｂの薬物動態（ＰＫ）に関する知見を提供することができる、大きさ、形状および配向などの複合体形成における差異があるかどうかを判定することは重要であった。
（表７）ウサギのＲＢＣ溶血に対する抗タンパク質Ｚ抗体の効果
（表８）ウサギのＲＢＣ溶血に対する抗タンパク質Ｚ抗体の組み合わせの効果
二次ｍＡｂの非存在下で、抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ１は、等モル量で混合すると、タンパク質Ｚと標準的な１：１および１：２の複合体を形成した（図７、表９）。
（表９）ｍＡｂ：タンパク質Ｚ複合体のおおよそのモル質量と保持時間
Ｒｔ：保持時間、Ｍｗ：重量平均モル質量、ｍｉｎ：分、ｋＤａ：キロダルトン
ほとんどの二次ｍＡｂの抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ１との組み合わせは、ヘテロマー２：２ ｍＡｂ：タンパク質Ｚ複合体と一致する、より小さく、明確に定義された複合体に有利であった（図８および図９ならびに表１０～１２）。
（表１０）ｍＡｂ：タンパク質Ｚ複合体のモル質量
（表１１）ｍＡｂ：タンパク質Ｚ複合体のおおよそのモル質量と保持時間
Ｒｔ：保持時間、Ｍｗ：重量平均モル質量、ｍｉｎ：分、ｋＤａ：キロダルトン
（表１２）ｍＡｂ：タンパク質Ｚ複合体のおおよそのモル質量と保持時間
抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ１／抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ３の混合物は、タンパク質Ｚと同程度のサイズの複合体を形成したが、溶出時間／プロファイルの差から、形成された複合体は他の混合物と比較して形状／配向に差があることが示唆された（図９）。抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ１と抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ２およびＣＯＭＰ１ ｍＡｂとの組み合わせは、「ペーパードリング」を示すタンパク質Ｚとのより大きくてより不均質な複合体に有利であった（図１０、表１３）。
（表１３）ｍＡｂ：タンパク質Ｚ複合体のおおよそのモル質量と保持時間
Ｒｔ：保持時間、Ｍｗ：重量平均モル質量、ｍｉｎ：分、ｋＤａ：キロダルトン
抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ１と抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ４との組み合わせは、タンパク質Ｚとヘテロマー複合体を形成する傾向の低下を示した（図１１、表１４）。遊離ｍＡｂおよび１：１ｍＡｂ：タンパク質Ｚ種の存在は、ヘテロマー複合体のタンパク質Ｚとの不完全な形成を示した。ホモマー複合体およびヘテロマー複合体のタンパク質Ｚとの混合物も明らかであった。
（表１４）ｍＡｂ：タンパク質Ｚ複合体のおおよそのモル質量と保持時間
Ｒｔ：保持時間、Ｍｗ：重量平均モル質量、ｍｉｎ：分、ｋＤａ：キロダルトン
実施例４：添加の順序は、抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ１、ＣＯＭＰ１ ｍＡｂ、およびタンパク質Ｚの間に形成されるモル質量および複合体の分布に大きく影響しない
方法
添加の順序が複合体形成に影響を及ぼすかどうかを判定するために、ＣＯＭＰ１ ｍＡｂとタンパク質Ｚの等モル混合物を１Ｘ ＤＰＢＳ、ｐＨ７．４で調製し、１μＭのＣＯＭＰ１ ｍＡｂ：１μＭのタンパク質Ｚのモル比を得て、周囲温度で１時間インキュベートした。インキュベーション後、様々な量の抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ１を、予め形成されたＣＯＭＰ１ ｍＡｂ：タンパク質Ｚ複合体に添加し、ｐＨ７．４の１Ｘ ＤＰＢＳで希釈して、以下のモル比を得た：０．３μＭの抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ１：１μＭの ＣＯＭＰ１ ｍＡｂ：１μＭのタンパク質Ｚ、１μＭの 抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ１：１μＭのＣＯＭＰ１ ｍＡｂ：１μＭのタンパク質Ｚ、および３μＭの抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ１：１μＭのＣＯＭＰ１ ｍＡｂ：１μＭの タンパク質Ｚ。そして、機器に注入する前にさらに一時間インキュベートした。実施例３のＡ４Ｆ ＭＡＬＬＳ分析方法に従った。
方法
添加の順序が複合体形成に影響を及ぼすかどうかを判定するために、ＣＯＭＰ１ ｍＡｂとタンパク質Ｚの等モル混合物を１Ｘ ＤＰＢＳ、ｐＨ７．４で調製し、１μＭのＣＯＭＰ１ ｍＡｂ：１μＭのタンパク質Ｚのモル比を得て、周囲温度で１時間インキュベートした。インキュベーション後、様々な量の抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ１を、予め形成されたＣＯＭＰ１ ｍＡｂ：タンパク質Ｚ複合体に添加し、ｐＨ７．４の１Ｘ ＤＰＢＳで希釈して、以下のモル比を得た：０．３μＭの抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ１：１μＭの ＣＯＭＰ１ ｍＡｂ：１μＭのタンパク質Ｚ、１μＭの 抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ１：１μＭのＣＯＭＰ１ ｍＡｂ：１μＭのタンパク質Ｚ、および３μＭの抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ１：１μＭのＣＯＭＰ１ ｍＡｂ：１μＭの タンパク質Ｚ。そして、機器に注入する前にさらに一時間インキュベートした。実施例３のＡ４Ｆ ＭＡＬＬＳ分析方法に従った。
結果
抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ１が他の成分に対して同時に（図１２Ａ、表１５）、または順次（図１２Ｂ、表１５）添加されたかどうかに関わらず、モル質量および分布に関して同様の複合体が、抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ１、ＣＯＭＰ１ ｍＡｂ、およびタンパク質Ｚの間に形成された。二つのデータセット間で観察された溶出時間のわずかなシフトは、本方法に固有の変動性を示すものであり、異常とはみなされない。
抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ１が他の成分に対して同時に（図１２Ａ、表１５）、または順次（図１２Ｂ、表１５）添加されたかどうかに関わらず、モル質量および分布に関して同様の複合体が、抗タンパク質Ｚ ｍＡｂ１、ＣＯＭＰ１ ｍＡｂ、およびタンパク質Ｚの間に形成された。二つのデータセット間で観察された溶出時間のわずかなシフトは、本方法に固有の変動性を示すものであり、異常とはみなされない。
（表１５）ｍＡｂ：タンパク質Ｚ複合体のおおよそのモル質量と保持時間
実施例５：抗タンパク質Ｗ複合体
方法
Ａ４Ｆ－ＭＡＬＬＳ移動相バッファ
移動相バッファ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０±０．１）は、１．４ｇのリン酸ナトリウム一塩基性一水和物、１０．７ｇのリン酸二塩基性七水和物、および５００ｍＬの５Ｍ塩化ナトリウムを混合することにより調製され、次いで、この溶液をＨＰＬＣグレードの水で５．０Ｌの容量にした。バッファの最終測定ｐＨは７．０であった。移動相バッファは使用前にろ過した（０．２μｍ）。
方法
Ａ４Ｆ－ＭＡＬＬＳ移動相バッファ
移動相バッファ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０±０．１）は、１．４ｇのリン酸ナトリウム一塩基性一水和物、１０．７ｇのリン酸二塩基性七水和物、および５００ｍＬの５Ｍ塩化ナトリウムを混合することにより調製され、次いで、この溶液をＨＰＬＣグレードの水で５．０Ｌの容量にした。バッファの最終測定ｐＨは７．０であった。移動相バッファは使用前にろ過した（０．２μｍ）。
Ａ４Ｆ ＭＡＬＬＳ分析
Ａ４Ｆ－ＭＡＬＬＳシステムは、紫外線（ＵＶ）ダイオードアレイ検出器、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄａｗｎ ＨＥＬＥＯＳ（登録商標）ＩＩレーザー光散乱装置（ＬＳ）、およびＯｐｔｉｌａｂ（登録商標）Ｔ－ｒＥＸ示差屈折計（ＲＩ）検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズＨＰＬＣシステムに連結されたＥｃｌｉｐｓｅ（商標）３＋ Ａ４Ｆ分離システムで構成されている。検出器は、以下の順序で直列に接続した。ＵＶ－ＬＳ－ＲＩ。ＬＳおよびＲＩ検出器は、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙが提供する指示に従って較正された。
Ａ４Ｆ－ＭＡＬＬＳシステムは、紫外線（ＵＶ）ダイオードアレイ検出器、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄａｗｎ ＨＥＬＥＯＳ（登録商標）ＩＩレーザー光散乱装置（ＬＳ）、およびＯｐｔｉｌａｂ（登録商標）Ｔ－ｒＥＸ示差屈折計（ＲＩ）検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズＨＰＬＣシステムに連結されたＥｃｌｉｐｓｅ（商標）３＋ Ａ４Ｆ分離システムで構成されている。検出器は、以下の順序で直列に接続した。ＵＶ－ＬＳ－ＲＩ。ＬＳおよびＲＩ検出器は、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙが提供する指示に従って較正された。
定義された量の抗タンパク質Ｗ ｍＡｂをそれぞれタンパク質Ｗと混合し、ｐＨ７．４の１Ｘ ＤＰＢＳで希釈して等モル比を得た：１μＭの抗タンパク質Ｗ ｍＡｂ：１μＭのタンパク質Ｗ。すべてのサンプルは、周囲温度で２時間インキュベートし、４℃でろ過せずに維持した後、１０ｋＤａ ＭＷＣＯ再生セルロース膜を使用して、Ｗ３５０スペーサーホイル（スペーサー厚さ３５０μｍ、スペーサー幅２．２ｃｍ）を取り付けたＥｃｌｉｐｓｅ（商標）短チャンネルに注入した。チャネルを、各サンプルの注入前に、移動相バッファ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０±０．１）で予め平衡化した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；２ｍｇ／ｍＬ；１０μｇサンプル量）を別々に注入し、システム適合性対照として含めた。
分画法は、注入、集束、溶出、およびチャネルの「ウォッシュアウト」ステップの四つのステップで構成されている。Ａ４Ｆ－ＭＡＬＬＳ移動相バッファ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０±０．１）を分画法全体で使用した。各サンプル（７μｇ）を０．２ｍＬ／分の流量で１分間注入し、その後、集束流量１．０ｍＬ／分で３分間集束した。サンプルは、チャネル流量１．０ｍＬ／分、直線勾配クロスフロー３．０ｍＬ／分～０ｍＬ／分で２５分間にわたって溶出された。最後に、クロスフローを０ｍＬ／分でさらに５分間保持し、チャネルを洗浄した。ＢＳＡは、同じパラメータ設定を使用して分割された。
結果
Ａ４Ｆ－ＭＡＬＬＳを使用して、タンパク質Ｗと、二量体のマルチドメインリガンドと、リガンド内の異なるドメインに特異的に結合するいくつかの抗タンパク質Ｗ抗体との間に形成された複合体の相対的なサイズ分布を評価した。タンパク質Ｗとの潜在的な抗体複合体の理論的なモル質量および予測される化学量論を、表１６に示す。
Ａ４Ｆ－ＭＡＬＬＳを使用して、タンパク質Ｗと、二量体のマルチドメインリガンドと、リガンド内の異なるドメインに特異的に結合するいくつかの抗タンパク質Ｗ抗体との間に形成された複合体の相対的なサイズ分布を評価した。タンパク質Ｗとの潜在的な抗体複合体の理論的なモル質量および予測される化学量論を、表１６に示す。
（表１６）ｍＡｂ：タンパク質Ｗ 複合体の理論モル質量
１不等比（例えば、１：２、および２：１）は、同じＭＷを有するため、区別できない。
全体として、ｍＡｂのパネルのうち、ドメインＡを標的とするｍＡｂ１は、等モル比で組み合わせた場合、タンパク質Ｗとの個別の１：１および２：２の複合体を表す優勢種を有する低次複合体の最も高い割合を形成した（ピーク２、約２８９ｋＤａ；およびピーク３、約５６２ｋＤａ、図１３、表１７）。
（表１７）ドメインＡを標的とするｍＡｂ１を有するヒトタンパク質Ｗ複合体のモル質量および保持時間
Ｒｔ：保持時間、Ｍｗ：重量平均モル質量、ＮＡ：該当なし、ｍｉｎ：分、ｋＤａ：キロダルトン
ドメインＢ（ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、およびＣＯＭＰ１）を標的とする各ｍＡｂは、主にタンパク質Ｗと個別の２：２複合体を形成し（ピーク３、約５６３～５８０ｋＤａ、図１４、表１８）、ｍＡｂ２およびＣＯＭＰ１は、試験した他のｍＡｂと比較して複合体の最も均質な分布を形成した。ドメインＡを標的とするＣＯＭＰ２は、主にタンパク質Ｗとの１：２および２：２複合体の混合物に有利であったが（ピーク３、約５５０ｋＤａ、図１５、表１９）、中程度の大きくて不均質な複合体も観察された。これは、ドメインＡも標的とするｍＡｂ１とは異なり、ＣＯＭＰ２がタンパク質Ｗ上の固有のエピトープに結合し、「ペーパードリング」と呼ばれるプロセスにおいて、拡張抗体－抗原格子の形成を可能にすることを示唆している。このサンプルでは、約８３５ｋＤａのモル質量を有する明確なピーク（ピーク４）が観察され、続いて、約１０００～１９００ｋＤａの範囲の幅広いモル質量分布を有する、一連の広範囲の低分解種（ピーク５）が観察された（図１５、表１９）。
（表１８）ドメインＢを標的とするｍＡｂを有するヒトタンパク質Ｗ複合体のモル質量および保持時間
Ｒｔ：保持時間、Ｍｗ：重量平均モル質量、ＮＡ：該当なし、ｍｉｎ：分、ｋＤａ：キロダルトン
（表１９）ドメインＡを標的とするＣＯＭＰ２を有するヒトタンパク質Ｗ複合体のモル質量および保持時間
Ｒｔ：保持時間、Ｍｗ：重量平均モル質量、ＮＡ：該当なし、ｍｉｎ：分、ｋＤａ：キロダルトン
個々の成分の計算されたモル質量に基づき、ピーク４は、タンパク質Ｗの２～３つの分子を配位するｍＡｂの少なくとも３つの分子を含む複合体を表す可能性が高いが、ピーク５は、タンパク質Ｗの４つ以上の分子を配位するｍＡｂの３つ以上の分子から構成される高次ヘテロマー複合体の不均質な分布に対応する（表１８）。対照的に、ドメインＣを標的とするｍＡｂ（ｍＡｂ４およびＣＯＭＰ３）は、ｍＡｂ４との大きくて不均質な複合体（モル質量範囲が約７００～８０００ｋＤａ）の広範な分布を形成し、試験したｍＡｂのパネルのうち最も広範な「ペーパードリング」を示した（図１６、表２０）。
（表２０）ドメインＣを標的とするｍＡｂを有するヒトタンパク質Ｗ複合体のモル質量および保持時間
前述の記載において、本発明はその特定の実施形態に関連付けて記載され、解説を目的として多くの詳細が提示されているが、当業者であれば、本発明はさらなる実施形態を受け入れることができること、および本明細書に記載される詳細の特定部分は、本発明の基礎となる主旨から逸脱することなく大きく変化しうることが明白であろう。
本明細書に引用されるすべての参照文献は、その全体を参照することにより組み込まれる。本発明は、その主旨および本質的な特質から逸脱することなく、他の具体的な形態で具現化されてもよく、したがって、前述の記載ではなく、本発明範囲を示す添付の請求の範囲に対して参照がなされるべきである。
本明細書に引用されるすべての参照文献は、その全体を参照することにより組み込まれる。本発明は、その主旨および本質的な特質から逸脱することなく、他の具体的な形態で具現化されてもよく、したがって、前述の記載ではなく、本発明範囲を示す添付の請求の範囲に対して参照がなされるべきである。
Claims (25)
- サンプル中の不均質なタンパク質複合体の化学量論およびサイズ分布を評価するための方法であって、以下の工程：
前記サンプルを、非対称フロー式フィールドフロー分画（Ａ４Ｆ）によって分画する工程と、
多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）を使用して、前記サンプル中の前記不均質なタンパク質複合体のモル質量、化学量論、およびサイズ分布を決定する工程であって、不均質なタンパク質複合体が、リガンドに結合した二つ以上の抗体を含む不均質なタンパク質：リガンド複合体またはリガンドに結合した二つ以上の融合タンパク質を含む不均質な融合タンパク質：リガンド複合体を含む、工程と
を含む、前記方法。 - 前記リガンドが、可溶性リガンドである、請求項１に記載の方法。
- 不均質なタンパク質：リガンド複合体中の前記抗体が、モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片である、請求項１または２に記載の方法。
- 不均質なタンパク質：リガンド複合体中の前記抗体が、二重特異性抗体、またはその抗原結合断片である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 不均質なタンパク質：リガンド複合体中の前記抗体が、同種の抗体である、請求項１に記載の方法。
- 不均質なタンパク質：リガンド複合体中の前記抗体が、２種類以上の抗体を含む、請求項１に記載の方法。
- 不均質なタンパク質：リガンド複合体が、２：１の抗体対リガンドモル比を有する抗体：リガンド複合体である、請求項１に記載の方法。
- 不均質なタンパク質：リガンド複合体が、３：２の抗体対リガンドモル比を有する抗体：リガンド複合体である、請求項１に記載の方法。
- 不均質なタンパク質：リガンド複合体が、２：３の抗体対リガンドモル比を有する抗体：リガンド複合体である、請求項１に記載の方法。
- 不均質なタンパク質：リガンド複合体が、３：３の抗体対リガンドモル比を有する抗体：リガンド複合体である、請求項１に記載の方法。
- 不均質なタンパク質：リガンド複合体が、３：４の抗体対リガンドモル比を有する抗体：リガンド複合体である、請求項１に記載の方法。
- 不均質なタンパク質：リガンド複合体が、４：４の抗体対リガンドモル比を有する抗体：リガンド複合体である、請求項１に記載の方法。
- 不均質なタンパク質：リガンド複合体が、６：６の抗体対リガンドモル比を有する抗体：リガンド複合体である、請求項１に記載の方法。
- 不均質な融合タンパク質：リガンド複合体中の融合タンパク質がＦｃ融合タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
- Ｆｃ融合タンパク質が受容体Ｆｃタンパク質である、請求項１４に記載の方法。
- 受容体Ｆｃタンパク質がＴＲＡＰタンパク質である、請求項１５に記載の方法。
- ＴＲＡＰタンパク質がＶＥＧＦトラップである、請求項１６に記載の方法。
- ＶＥＧＦトラップがアフリベルセプトである、請求項１７に記載の方法。
- 不均質な融合タンパク質：リガンド複合体が、リガンドに結合した２つ以上の融合タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
- 不均質なタンパク質：リガンド複合体が７００ｋＤａ～８０００ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載の方法。
- 不均質なタンパク質：リガンド複合体が５００ｋＤａ～４０００ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載の方法。
- Ａ４Ｆが、厚さ３５０μｍ、幅２．２ｃｍのＷ３５０スペーサーホイルを有するチャネルで実施される、請求項１に記載の方法。
- Ａ４Ｆが、厚さ４９０μｍ、幅２．２ｃｍのＷ４９０スペーサーホイルを有するチャネルで実施される、請求項１に記載の方法。
- 分画する工程が、（ｉ）Ａ４Ｆチャネルのサンプル入口ポートへのサンプルの注入、および（ｉｉ）それに次ぐ、キャリア流体を入口ポートおよび出口ポートからチャネル内に流入させることによる、サンプルの集束を含む、請求項１に記載の方法。
- より小さなタンパク質：リガンド複合体がより大きなタンパク質：リガンド複合体より前に溶出する、請求項２４に記載の方法。
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