CN116925223A

CN116925223A - 抗pd-1单克隆抗体及其衍生物和用途

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Publication number: CN116925223A
Application number: CN202210345658.0A
Authority: CN
Inventors: 翟天航; 黄威峰; 彭绍岗; 陈圆洪; 闫尧; 曾竣玮; 诺埃尔·保利; 内尔斯·尼尔森
Original assignee: Biotheus Inc
Current assignee: Biotheus Inc
Priority date: 2022-04-02
Filing date: 2022-04-02
Publication date: 2023-10-24
Also published as: WO2023186077A1

Abstract

本发明涉及生物医学或生物制药技术领域，更具体地涉及一种抗PD‑1单克隆抗体及其衍生物和用途。

Description

抗PD-1单克隆抗体及其衍生物和用途

技术领域

本发明涉及生物医学或生物制药技术领域，更具体地涉及一种抗PD-1单克隆抗体及其衍生物和用途。

背景技术

程序性死亡蛋白1(Programmed cell death protein-1,PD-1，又称CD279)通常在活化的淋巴细胞上表达，并在肿瘤浸润淋巴细胞上进一步上调。PD-1可通过与肿瘤细胞和抗原递呈细胞上高表达的配体PD-L1和PD-L2结合，抑制T细胞的过度活化和增殖，发挥负向免疫调节作用，介导肿瘤发生免疫逃逸。

目前，已有多款抗PD-1单抗获准用于多种肿瘤的治疗(如经典霍奇金淋巴瘤、鳞状或非鳞状NSCLC、肝细胞癌、鼻咽癌、尿路上皮癌、食管鳞状细胞癌、黑色素瘤等)，然而目前抗PD-1单抗已获批适应症多集在于某些对免疫治疗响应敏感的瘤种，且单药治疗对大部分瘤种的客观缓解率较低(多数低于30％)。其中一个重要原因可能是肿瘤组织中浸润的免疫细胞少和/或存在较高比例的是免疫抑制性细胞(如Treg，MDSC)，以及其他免疫抑制性通路的参与等。

因此，发展具有更优的临床药效的抗PD-1抗体或其衍生物是迫切而必要的，这将给癌症、感染等疾病患者提供更多的用药选择。

发明内容

本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，得到了新的抗PD-1抗体及其衍生物。本发明人惊奇地发现，本发明的抗PD-1抗体及其衍生物具有良好的亲和力和生物活性，具有抗肿瘤的潜力。由此提供了下述发明：

本发明的抗体

因此，在一个方面，本发明提供了一种能够特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：

包含下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO:7或13的VHCDR1、序列为SEQ ID NO:8的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:9的VH CDR3；和/或，

包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO:10的VLCDR1、序列为SEQ ID NO:11或14的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:12的VL CDR3。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO:7的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:8的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:9的VH CDR3；和/或，包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO:10的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:11的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:12的VL CDR3。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO:13的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:8的VHCDR2、序列为SEQ ID NO:9的VH CDR3；和/或，包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO:10的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:14的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:12的VL CDR3。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:1、3或5所示的序列或其变体；和/或，轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:2、4或6所示的序列或其变体。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:1或3所示的序列或其变体；和/或，轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:2或4所示的序列或其变体。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:1所示的序列或其变体；和/或，轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:2所示的序列或其变体。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:3所示的序列或其变体；和/或，轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:4所示的序列或其变体。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:5所示的序列或其变体；和/或，轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:6所示的序列或其变体。

上述任意实施方案中所述的变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)，或具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；优选地，所述的置换是保守置换。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：

(1)包含如SEQ ID NO:1所示的序列的VH和包含如SEQ ID NO:2所示的序列的VL；

(2)包含如SEQ ID NO:3所示的序列的VH和包含如SEQ ID NO:4所示的序列的VL；或，

(3)包含如SEQ ID NO:5所示的序列的VH和包含如SEQ ID NO:6所示的序列的VL。

在某些实施方案中，上述任一实施方案中的抗体或其抗原结合片段可以进一步包含来源于哺乳动物(例如，鼠或人)免疫球蛋白的恒定区序列。

在某些实施方案中，上述任一实施方案中的抗体或其抗原结合片段的重链包含来源于鼠或人免疫球蛋白(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的重链恒定区。在某些实施方案中，上述任一实施方案中的抗体或其抗原结合片段的轻链包含来源于鼠或人免疫球蛋白(例如κ或λ)的轻链恒定区。

在某些实施方案中，所述重链恒定区是IgG重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区。

在某些实施方案中，所述重链恒定区(CH)具有与野生型重链恒定区序列相同或基本相同的效应子功能。

在某些实施方案中，所述重链恒定区(CH)可以包含一个或多个氨基酸突变或化学修饰以改变本发明抗体的下列中的一个或更多个特性：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数目、效应细胞功能或补体功能等。可以通过将抗体恒定区中的至少一个氨基酸残基替换为不同残基或化学修饰，产生功能改变，例如，改变抗体对效应子配体(如FcR或补体C1q)的亲和力，从而改变效应子功能(例如降低或增强)。抗体的Fc区介导几种重要的效应子功能，例如ADCC、吞噬作用、CDC等。

在某些实施方案中，所述重链恒定区(CH)具备降低或消除的ADCC活性，例如包含LALA突变(L234A,L235A)。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:15所示的重链恒定区(CH)和/或如SEQ ID NO:16所示的轻链恒定区(CL)。

在某些实施方案中，上述任一实施方案中的抗原结合片段可以选自Fab、Fab’、(Fab’)₂、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双抗体(diabody)。

在某些实施方案中，上述任一实施方案中的抗体为嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。

scFv

在某些实施方案中，上述任一实施方案中的抗原结合片段是scFv。本领域已知，scFv结构中可以通过形成链间二硫键来增强其稳定性。因此，在某些实施方案中，所述scFv包含二硫键。在scFv中引入二硫键的方法是本领域技术人员熟知的，例如可以通过在scFv的VH和VL中分别引入半胱氨酸(C)来实现。在某些实施方案中，所述第一抗原结合结构域的VH和VL分别包含一个位于FR区的残基被突变为半胱氨酸(C)，从而所述VH和VL形成的scFv可以包含二硫键。在某些实施方案中，所述第一抗原结合结构域的VH的FR2区中的一个残基和VL的FR4区中的一个残基被突变为半胱氨酸(C)。

在某些实施方案中，所述scFv优选地包含SEQ ID NO:3所示的VH和SEQ ID NO:4所示的VL，或者包含SEQ ID NO:5所示的VH和SEQ ID NO:6所示的VL。在此类实施方案中，所述scFv包含链间二硫键。

在某些实施方案中，所述scFv具有VH-L-VL或VL-L-VH所示的结构，其中L为肽接头。在某些实施方案中，L为包含一个或多个甘氨酸(G)和/或一个或多个丝氨酸(S)和/或一个或多个丙氨酸(A)的肽接头，例如包含(G4S)n或(G4A)n的柔性肽，n＝1、2、3或4。在某些示例性实施方案中，L为(G4S)4。

在某些实施方案中，所述scFv在其N段和/或C段可进一步包含另外的生物活性多肽以延长其半衰期，形成多肽构建体。在某些实施方案中，所述另外的生物活性多肽是免疫球蛋白Fc结构域。

在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域任选地通过肽接头连接至所述scFv的N端或C端(例如N端)。在某些实施方案中，所述肽接头包含一个或多个甘氨酸(G)和/或一个或多个丝氨酸(S)和/或一个或多个丙氨酸(A)，例如包含(G4S)n或(G4A)n的柔性肽，n＝1、2、3或4。在某些示例性实施方案中，所述肽接头为(G4S)2或(G4A)2。

在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域是IgG的Fc结构域(例如IgG1的Fc结构域)。

在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域包含SEQ ID NO:22所示的序列。

在某些示例性实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:23或24所示的序列。

在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段具备以下生物学功能中的至少一项：

(1)特异性识别/结合PD-1(特别是人PD-1)；

(2)阻断PD-1与PD-L1的结合，或者抑制和/或阻断由PD-1结合PD-L1介导的细胞内信号传导；

(3)在体外及受试者体内提高免疫细胞(如T细胞)活性，例如提高效应细胞因子(例如，IL-2、IFN-γ等)的分泌水平、增殖活性、活化标记(例如，CD25、CD69等)的表达水平、和/或细胞杀伤活性；

(4)在体外及受试者体内增强免疫应答(如T细胞介导的免疫应答)；

(5)在受试者中预防和/治疗肿瘤或感染。

在本文中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以包括这样的变体，所述变体与其所源自的抗体或其抗原结合片段相比差异仅在于一个或多个(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换)氨基酸残基的保守置换，或者与其所源自的抗体或其抗原结合片段具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，且基本保留了其所源自的抗体或其抗原结合片段的上述生物学功能。

衍生的抗体

本发明的抗体或其抗原结合片段可进行衍生化，例如被连接至另一个分子(例如另一个多肽或蛋白)。通常，抗体或其抗原结合片段的衍生化(例如，标记)不会不利影响其对PD-1(特别是人PD-1)的结合。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段还意欲包括此类衍生化的形式。例如，可以将本发明的抗体或其抗原结合片段功能性连接(通过化学偶合、基因融合、非共价连接或其它方式)于一个或多个其它分子基团，例如另一个抗体(例如，形成双特异性抗体)，检测试剂，药用试剂，和/或能够介导抗体或抗原结合片段与另一个分子结合的蛋白或多肽(例如，抗生物素蛋白或多组氨酸标签)。此外，本发明的抗体或其抗原结合片段还可以用化学基团进行衍生，例如聚乙二醇(PEG)，甲基或乙基，或者糖基。这些基团可用于改善抗体的生物学特性，例如增加血清半衰期。

因此，在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段带有标记。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记，例如酶、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。本发明所述的可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的，其实例包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³²P)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物)、磁珠(例如，)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。在某些实施方案中，此类标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。在某些实施方案中，可通过不同长度的接头(linker)将如上所述的可检测的标记连接至本发明的抗体或其抗原结合片段，以降低潜在的位阻。

在另一个方面，本发明还提供了一种缀合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段以及连接于所述抗体或其抗原结合片段的治疗剂。

在某些实施方案中，所述缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)。在某些优选的实施方案中，所述治疗剂选自细胞毒素或放射性同位素。在本发明中，合适的治疗剂的非限制性实例包括，抗代谢物、烷化剂、DNA小沟结合剂、DNA嵌入剂、DNA交联剂、组蛋白去乙酰基酶抑制剂、核输出抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶I或II抑制剂、热激蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素及抗有丝分裂剂。

在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段任选地通过接头与所述治疗剂缀合。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段通过可裂解的接头(例如肽接头、二硫化物或腙接头)与所述治疗剂缀合。

融合蛋白

如上文中所述的，由于肿瘤组织中浸润的免疫细胞少和/或存在较高比例的是免疫抑制性细胞(如Treg，MDSC)，以及其他免疫抑制性通路的参与等原因，抗PD-1抗体单药治疗对一些瘤种的客观缓解率较低。

为解决上述问题，本申请的发明人在获得具备优良性能的PD-1抗体的基础上，进一步提供了一种融合蛋白，以提供更好的发挥抗肿瘤活性。

在另一个方面，本发明还提供了一种融合蛋白，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段以及与其融合的另外的生物活性多肽。

在某些实施方案中，所述另外的生物活性多肽通过肽接头与所述抗体或其抗原结合片段连接。在某些实施方案中，所述肽接头包含一个或多个甘氨酸(G)和/或一个或多个丝氨酸(S)和/或一个或多个丙氨酸(A)，例如包含(G4S)n或(G4A)n的柔性肽，n＝1、2、3或4。在某些示例性实施方案中，所述肽接头为(G4A)4G。

在某些实施方案中，所述另外的生物活性多肽为免疫调节剂。

在某些实施方案中，所述免疫调节剂为TGF-β/TGF-βR通路抑制剂。

转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)是一类具有多种生物学活性的细胞因子，由肿瘤细胞或免疫细胞分泌，主要包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。TGF-β信号通路是造成免疫抑制性肿瘤微环境的重要因素，血清中TGF-β浓度与临床结局负相关，主要机制包括：(1)抑制CD8+T细胞的增殖和活化；(2)抑制NK细胞的杀伤活性；(3)诱导产生M2巨噬细胞、MDSC和Treg等免疫抑制性细胞。此外，TGF-β也可通过诱导纤维化和血管生成促进肿瘤细胞侵袭。中和肿瘤微环境中的TGF-β有助于降低肿瘤侵袭、抑制肿瘤生长和恢复血管正常化。同时，阻断TGF-β信号可能增强免疫检查点抑制剂的临床疗效。

基于此，本申请的发明人开发了包含本发明的PD-1抗体以及TGF-β/TGF-βR通路抑制剂的融合蛋白，其同时特异性地结合PD-1和TGF-β并阻断PD-L1/PD-1和TGF-β/TGF-βR通路，解除T细胞免疫抑制，更好的发挥抗肿瘤活性，提高肿瘤患者的客观响应率，延长肿瘤患者的生存期。

在某些实施方案中，所述免疫调节剂为TGF-βRII胞外结构域。在某些实施方案中，所述TGF-βRII胞外结构域包含SEQ ID NO:19所示的序列。

在某些实施方案中，所述融合蛋白包含：包含所述抗体或其抗原结合片段的轻链的第一肽链：以及，包含所述抗体或其抗原结合片段的重链和所述另外的生物活性多肽的第二肽链。

在某些实施方案中，所述第一肽链包含如SEQ ID NO:17所示的序列，和/或，所述第二肽链包含如SEQ ID NO:18所示的序列。

多肽构建体

当使用本发明的抗原结合片段时，为增加其半衰期，可将其与能够增加半衰期的生物活性多肽连接形成构建体。因此，本发明也提供了此类多肽构建体。

在另一个方面，本发明还提供了一种多肽构建体，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段以及与免疫球蛋白Fc结构域。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段为抗原结合片段。在某些实施方案中，所述抗原结合片段为Fab、Fab’、(Fab’)₂、Fv、二硫键连接的Fv、scFv或diabody。

在本文中，所述Fc结构域也称为Fc区，是指包含CH2和CH3的重链恒定区的一部分。在一些实施方案中，Fc结构域包含铰链、CH2和CH3。当Fc结构域包含铰链时，铰链调节两个含Fc的多肽之间的二聚作用。Fc结构域可为任何抗体重链恒定区同型。在一些实施方案中，Fc结构域是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

在某些实施方案中，本发明多肽构建体所包含的Fc结构域是天然Fc区，其包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列一致的氨基酸序列。例如，所述Fc结构域可以是天然序列人类IgG1 Fc区、天然序列人类IgG2 Fc区、天然序列人类IgG3 Fc区或天然序列人类IgG4Fc区。天然Fc区可具有效应子功能。示例性“效应子功能”包括与Fc受体结合；Clq结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；噬菌作用；对细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞活化等。可以通过将天然Fc区中的至少一个氨基酸残基替换为不同残基或化学修饰，产生功能改变，例如，改变抗体对效应子配体(如FcR或补体C1q)的亲和力，从而改变效应子功能(例如降低或增强)。

因此，在某些实施方案中，本发明多肽构建体所包含的Fc结构域也可以是变异Fc区，其与天然Fc区相比可以包含一个或多个(例如1-10个，例如1-5个)氨基酸突变或化学修饰以改变本发明抗体的下列中的一个或更多个特性：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数目、效应细胞功能或补体功能等。

在某些实施方案中，所述Fc结构域具备降低或消除的ADCC活性，例如包含LALA突变(L234A,L235A)。

在某些示例性实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域包含SEQ ID NO:22所示的序列。

在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域任选地通过肽接头与所述抗体或其抗原结合片段(例如N端和/或C端)连接。在某些实施方案中，所述肽接头包含一个或多个甘氨酸(G)和/或一个或多个丝氨酸(S)和/或一个或多个丙氨酸(A)，例如包含(G4S)n或(G4A)n的柔性肽，n＝1、2、3或4。在某些示例性实施方案中，所述肽接头为(G4S)2或(G4A)2。

在某些实施方案中，所述多肽构建体包含上文中所述的scFv以及免疫球蛋白Fc结构域。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域连接至所述scFv的N端。

在某些示例性实施方案中，所述多肽构建体包含SEQ ID NO:23或24所示的序列。

抗体、融合蛋白以及多肽构建体的制备

本发明的抗体可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明抗体的重链和轻链基因的DNA分子。将所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体。

本发明的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得(参见Morimoto etal.,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-117(1992)and Brennan et al.,Science 229:81(1985))。另外，这些抗原结合片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewed inHudson,Curr.Opin.Immunol.11:548-557(1999)；Little et al.,Immunol.Today,21:364-370(2000))。比如，Fab’片段可以直接从宿主细胞中获得；可以将Fab’片段化学偶联形成F(ab’)₂片段(Carter et al.,Bio/Technology,10:163-167(1992))。另外，Fv、Fab或F(ab’)₂片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓制备这些抗原结合片段的其它技术。

因此，在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述分离的核酸分子编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。

在另一个方面，本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含上述分离的核酸分子。

在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含上述分离的核酸分子或载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。

在另一个方面，提供了制备本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养上述宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。

在另一个方面，本发明还提供了包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列的分离的核酸分子。在某些实施方案中，所述分离的核酸分子编码本发明的融合蛋白。本发明还提供了包含上述分离的核酸分子的载体(例如克隆载体或表达载体)。本发明还提供了包含上述分离的核酸分子或载体的宿主细胞。本发明还提供了制备本发明的融合蛋白的方法，其包括，在允许所述融合蛋白表达的条件下，培养上述宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述融合蛋白。

在另一个方面，本发明还提供了包含编码本发明的多肽构建体的核苷酸序列的分离的核酸分子。在某些实施方案中，所述分离的核酸分子编码本发明的多肽构建体。本发明还提供了包含上述分离的核酸分子的载体(例如克隆载体或表达载体)。本发明还提供了包含上述分离的核酸分子或载体的宿主细胞。本发明还提供了制备本发明的多肽构建体的方法，其包括，在允许所述多肽构建体表达的条件下，培养上述宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述多肽构建体。

组合物

在另一个方面，本发明还提供了组合物，其包含：(1)本发明的抗体或其抗原结合片段或多肽构建体；以及(2)免疫调节剂。

在某些实施方案中，所述免疫调节剂为TGF-β/TGF-βR通路抑制剂，例如TGF-βRII胞外结构域。

在某些实施方案中，所述组合物包含：本发明的抗体或其抗原结合片段(例如，包含如SEQ ID NO:1所示的序列的VH和包含如SEQ ID NO:2所示的序列的VL)，以及TGF-βRII胞外结构域。

在某些实施方案中，(1)和(2)所述的试剂作为分离的组分或作为同一组合物的组分提供。因此，(1)和(2)所述的试剂可以同时、分开或相继施用。

药物组合物及治疗应用

本发明的抗体或其抗原结合片段可用于体外或在受试者体内抑制和/或阻断由PD-1结合PD-L1介导的细胞内信号传导，提高免疫细胞活性，增强免疫应答，以及用于预防和/或治疗肿瘤或感染。

因此，在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有本发明的抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、多肽构建体或缀合物、或组合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

在某些实施方案中，所述药物组合物包括包含本发明的抗体或其抗原结合片段以及TGF-β/TGF-βR通路抑制剂(例如TGF-βRII胞外结构域)的融合蛋白，其同时特异性地结合PD-1和TGF-β并阻断PD-L1/PD-1和TGF-β/TGF-βR通路，解除T细胞免疫抑制，更好的发挥抗肿瘤活性，提高肿瘤患者的客观响应率，延长肿瘤患者的生存期。

在某些实施方案中，所述药物组合物还可以包含另外的药学活性剂。

在某些实施方案中，所述另外的药学活性剂是具有抗肿瘤活性的药物，例如另外的免疫检查点抑制剂、溶瘤病毒、化学治疗剂、抗血管生成药物、抗代谢药物、靶向肿瘤药物、免疫刺激剂等。

在某些实施方案中，所述另外的药学活性剂是用于治疗感染的药物，例如抗病毒剂、抗真菌剂、抗细菌剂、免疫刺激剂等。

在某些实施方案中，在所述药物组合物中，本发明的抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、多肽构建体或缀合物、或组合物与所述另外的药学活性剂作为分离的组分或作为同一组合物的组分提供。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、多肽构建体或缀合物、或组合物与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。

在某些示例性实施方案中，所述药物包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。

在另一个方面，本发明涉及本发明的抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、多肽构建体或缀合物、或组合物在制备药物中的用途，所述药物用于：

(1)在体外或受试者(例如人)体内提高免疫细胞(例如T细胞)活性；

(2)在受试者(例如人)中增强免疫应答(例如T细胞介导的免疫应答)；

(3)在受试者(例如人)中治疗肿瘤；或

(4)在受试者(例如人)中治疗感染。

在某些实施方案中，所述药物包括包含本发明的抗体或其抗原结合片段以及TGF-β/TGF-βR通路抑制剂(例如TGF-βRII胞外结构域)的融合蛋白，其同时特异性地结合PD-1和TGF-β并阻断PD-L1/PD-1和TGF-β/TGF-βR通路，解除T细胞免疫抑制，更好的发挥抗肿瘤活性，提高肿瘤患者的客观响应率，延长肿瘤患者的生存期。

在另一个方面，本发明提供了一种在受试者中提高免疫细胞活性和/或增强免疫应答的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的本发明的抗体(或其抗原结合片段)、融合蛋白、多肽构建体、缀合物、组合物或药物组合物。

在某些实施方案中，所述免疫应答是T细胞介导的免疫应答。

在某些实施方案中，所述方法用于预防和/或治疗肿瘤。在此类实施方案中，所述受试者患有肿瘤。

在某些实施方案中，所述方法用于预防和/或治疗感染。在此类实施方案中，所述受试者患有感染。

在某些实施方案中，所述免疫细胞为T细胞，例如细胞毒性T细胞(CTL)、抗原特异性T细胞或肿瘤浸润性T细胞(TIL-T)。在某些示例性实施方案中，所述免疫细胞为肿瘤浸润性淋巴细胞，例如肿瘤浸润性T细胞。

在某些实施方案中，向所述受试者施用包含本发明的抗体或其抗原结合片段以及TGF-β/TGF-βR通路抑制剂(例如TGF-βRII胞外结构域)的融合蛋白，其同时特异性地结合PD-1和TGF-β并阻断PD-L1/PD-1和TGF-β/TGF-βR通路，解除T细胞免疫抑制，更好的发挥抗肿瘤活性，提高肿瘤患者的客观响应率，延长肿瘤患者的生存期。

在另一个方面，本发明提供了一种用于在受试者(例如人)中预防和/或治疗肿瘤的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的本发明的抗体(或其抗原结合片段)、融合蛋白、多肽构建体、缀合物、组合物或药物组合物。

在某些实施方案中，将本发明的抗体(或其抗原结合片段)、融合蛋白、多肽构建体或缀合物、或组合物与另外的具有抗肿瘤活性的药物联合使用。这种另外的具有抗肿瘤活性的药物可以在施用抗体(或其抗原结合片段)、融合蛋白、多肽构建体或缀合物、或组合物之前、同时或之后施用。

在某些实施方案中，将本发明的抗体(或其抗原结合片段)、融合蛋白、多肽构建体、缀合物、组合物或药物组合物与额外的疗法组合施用。这种额外的疗法可以是已知用于肿瘤的任何疗法，例如手术、化学治疗、放射治疗、靶向治疗、免疫治疗、激素治疗、基因治疗或姑息治疗。这种额外的疗法可以在施用本发明的抗体(或其抗原结合片段)、融合蛋白、多肽构建体、缀合物、组合物或药物组合物之前、同时或之后施用。

在另一个方面，本发明提供了一种用于在受试者(例如人)中预防和/或治疗感染的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的本发明的抗体(或其抗原结合片段)、融合蛋白、多肽构建体、缀合物、组合物或药物组合物。

在某些实施方案中，将本发明的抗体(或其抗原结合片段)、融合蛋白、多肽构建体或缀合物、或组合物与另外的用于治疗感染的药物联合使用。这种另外的用于治疗感染的药物可以在施用抗体(或其抗原结合片段)、融合蛋白、多肽构建体或缀合物、或组合物之前、同时或之后施用。

在如上所述的用途、方法的某些实施方案中，所述肿瘤是具有微卫星高度不稳定性(MSI-H)和/或错配修复缺陷(dMMR)的肿瘤。

根据美国国家癌症研究所(NCI)制定的MSI检测分类标准(Boland CR,etal.Cancer Res.1998Nov 15；58(22):5248-57.)，对于5个微卫星标准位点，BAT26、BAT25、D2S123、D5S346、D17S250，与正常组织比较，如果肿瘤组织包含2个及以上位点不稳定，则判定为微卫星高不稳定(MSI-H)，即错配修复功能缺陷(dMMR)；如果小于2个位点不稳定或无位点不稳定，则判定为微卫星低不稳定(MSI-L)或微卫星稳定(MSS)，即错配修复功能完整(pMMR)。

用于检测微卫星高度不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)的方法是本领域技术人员已知的，例如通过PCR或二代测序来检测肿瘤组织中上述5个标准微卫星位点的长度改变，如有2个或以上位点不稳定，则判定为MSI-H。另外，也可通过免疫组化(ICH)检测肿瘤组织中MLH1、MSH2、MSH6、PSM2的表达情况，如果四个蛋白均表达阳性，则判定为pMMR，任一蛋白阴性表达，则判定为dMMR。

在如上所述的用途、方法的某些实施方案中，所述肿瘤为实体瘤，例如黑色素瘤(例如，转移性恶性黑素瘤)、乳腺癌、肾癌(例如，透明细胞癌)、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、结肠癌、食道癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤。

在如上所述的用途、方法的某些实施方案中，所述肿瘤为血液肿瘤，例如淋巴瘤、白血病。在某些实施方案中，所述淋巴瘤为霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。在某些实施方案中，所述非霍奇金淋巴瘤为外周T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤、伴EB病毒阳性的NK/T细胞淋巴瘤(鼻型)和B细胞非霍奇金淋巴瘤中的一种或多种。

在如上所述的用途、方法的某些实施方案中，所述感染是指病毒、细菌、真菌、寄生虫等任何病原微生物所导致的任何感染。在某些实施方案中，所述感染选自病毒感染、细菌感染、真菌感染和寄生虫感染。

在如上所述的用途、方法的某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。

本发明的抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、多肽构建体、缀合物、组合物、药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的重组蛋白，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。

此外，本发明的抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、多肽构建体、缀合物可以以单位剂量形式存在于药物组合物中，以便于施用。

本发明的抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、多肽构建体、缀合物、组合物、药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、多肽构建体、缀合物、组合物、药物组合物通过静脉注射或推注给予。

本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、多肽构建体、缀合物、组合物。“预防有效量”是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量。“治疗有效量”是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。本发明的抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、多肽构建体或缀合物、或组合物的治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。

试剂盒及检测应用

本发明的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合PD-1，从而可用于检测PD-1在样品中的存在或其水平。

因此，在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别本发明的抗体或其抗原结合片段。优选地，所述第二抗体还包括可检测的标记。

在本发明中，所述可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。特别优选的是，此类标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。这类标记是本领域熟知的，包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³²P)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物)、磁珠(例如，)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。在某些实施方案中，可通过不同长度的接头将如上所述的可检测的标记连接至本发明的抗体或其抗原结合片段，以降低潜在的位阻。

在另一个方面，本发明提供了检测PD-1在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用本发明的抗体或其抗原结合片段的步骤。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段还带有可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用带有可检测的标记的试剂来检测本发明的抗体或其抗原结合片段。所述方法可以用于诊断目的，或者非诊断目的(例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品)。在某些实施方案中，所述PD-1是人PD-1。

在另一个方面，提供了本发明的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测PD-1在样品中的存在或其水平。在某些实施方案中，所述PD-1是人PD-1。

在某些实施方案中，所述样品为来自受试者(例如哺乳动物，例如人)的细胞样品(例如，肿瘤细胞)或组织样品(例如肿瘤组织)。

术语定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、生物化学、核酸化学、免疫学实验室等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条轻链(LC)和一条重链(HC))组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各V_H和V_L由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。氨基酸在各区域或结构域的分配可遵循Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。

如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。这些氨基酸残基的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照Kabat编号系统(Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)或IMGT编号系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。

在本发明中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR可根据本领域已知的各种编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR通过如LuX,Nobrega RP,Lynaugh H,et al.Deamidation and isomerization liability analysisof 131clinical-stage antibodies.MAbs.2019Jan；11(1):45-57.doi:10.1080/19420862.2018.1548233.第11页“Sequence analysis”部分所述的编号方法确定，其全部内容通过引用并入本文。

如本文中所使用的，术语“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。

术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)、线性抗体(linear antibody)、纳米抗体(技术来自Domantis)、结构域抗体(技术来自Ablynx)、probody和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于Holliger等,2005；Nat Biotechnol,23:1126-1136中。

如本文中所使用的，术语“全长抗体”意指，由两条“全长重链”和两条“全长轻链”组成的抗体。其中，“全长重链”是指这样的多肽链，其在N端到C端的方向上由重链可变区(VH)、重链恒定区CH1结构域、铰链区(HR)、重链恒定区CH2结构域、重链恒定区CH3结构域组成；并且，当所述全长抗体为IgE同种型时，任选地还包括重链恒定区CH4结构域。优选地，“全长重链”是在N端到C端方向上由VH、CH1、HR、CH2和CH3组成的多肽链。“全长轻链”是在N端到C端方向上由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链。两对全长抗体链通过在CL和CH1之间的二硫键和两条全长重链的HR之间的二硫键连接在一起。本发明的全长抗体可以来自单一物种，例如人；也可以是嵌合抗体或人源化抗体。本发明的全长抗体包含分别由VH和VL对形成的两个抗原结合部位，这两个抗原结合部位特异性识别/结合相同的抗原。

如本文中所使用的，术语“Fd片段”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人,Nature 341:544 546(1989))；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab’)₂片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段；术语“Fab’片段”意指还原连接F(ab’)₂片段中两个重链片段的二硫键后所获片段，由一条完整的轻链和重链的Fd片段(由VH和CH1结构域组成)组成。

如本文中所使用的，术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段。Fv片段通常被认为是，能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。一般认为，六个CDR赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即便是一个可变区(例如Fd片段，其仅仅含有三个对抗原特异的CDR)也能够识别并结合抗原，尽管其亲和力可能低于完整的结合位点。

如本文中所使用的，术语“Fc片段”意指，由抗体的第一重链的第二、第三恒定区与第二重链的第二、第三恒定区经二硫键结合而形成的抗体片段。抗体的Fc片段具有多种不同的功能，但不参与抗原的结合。

如本文中所使用的，术语“scFv”是指，包含VL和VH结构域的单个多肽链，其中所述VL和VH通过接头(linker)相连。此类scFv分子可具有一般结构：NH₂-VL-接头-VH-COOH或NH₂-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)₄的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。在一些情况下，scFv的VH与VL之间还可以存在二硫键。如本文中所使用的，术语“di-scFv”是指，由两个scFv连接形成的抗体片段。

如本文中所使用的，术语“双抗体”意指，其VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,Holliger P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)，和Poljak R.J.等人,Structure 2:1121-1123(1994))。

上述各个抗体片段均保持了特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合。

可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的抗体)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。

在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。

如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”、“单抗”、“mAb”具有相同的含义且可互换使用可互换，其是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即，除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。此外，修饰语“单克隆”仅表明该抗体的特征为从高度同源的抗体群中获得，不能理解为需要通过任何特定方法来制备所述抗体。

如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(K_D)表示。在本发明中，术语“K_D”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于约10^-9M，例如小于约10^-9M、10^-10M、10^-11M或10^-12M或更小的亲和力(K_D)结合该抗原。两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定，例如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定。

如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。

如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(JMoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。

如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。

本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。

如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。

如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状(例如，肿瘤或感染)在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于，减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。

如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。在某些实施方式中，所述受试者(例如人)患有肿瘤或感染，或者，具有患有上述疾病的风险。

如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如，肿瘤或感染)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如，肿瘤或感染)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。

发明的有益效果

本发明的抗体不仅能够特异性识别/结合PD-1，阻断PD-1与PD-L1的结合，并且能够在体外/体内增强免疫细胞活性，刺激免疫应答。因此，本发明的抗体具有用于预防和/或治疗肿瘤或感染的潜力。此外，本发明还提供了包含本发明抗体以及TGF-β/TGF-βR通路抑制剂的融合蛋白，同时特异性地结合PD-1和TGF-β并阻断PD-L1/PD-1和TGF-β/TGF-βR通路，解除T细胞免疫抑制，更好的发挥抗肿瘤活性，提高肿瘤患者的客观响应率，延长肿瘤患者的生存期。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1A：抗PD-1抗体/scFv与CHO细胞上过表达的人PD-1的结合曲线图。

图1B：抗PD-1抗体/scFv与CHO细胞上过表达的食蟹猴PD-1的结合曲线图。

图2：抗PD-1抗体/scFv阻断人PD-L1与CHO细胞上过表达的人PD-1结合的曲线图。

图3：抗PD-1抗体/scFv与激活的人原代T细胞上PD-1的结合的曲线图。

图4：抗PD-1抗体/scFv阻断PD-L1/PD-1荧光素酶报告基因的曲线图。

图5：抗PD-1抗体/scFv在混合淋巴细胞试验中刺激IL-2的分泌柱状图。

图6：抗PD-1抗体在h-PD-1KI小鼠h-PD-L1 KI MC38肿瘤模型的药效图。

图7：抗PD-1抗体在B-NDG B2M KO plus小鼠A375肿瘤模型的药效图。

图8：抗PD-1/TGF-β双抗PM8005分子结构示意图。

图9A：抗PD-1/TGF-β双抗PM8005与CHO细胞上过表达的人PD-1的结合曲线图。

图9B：抗PD-1/TGF-β双抗PM8005与CHO细胞上过表达的食蟹猴PD-1的结合曲线图。

图10：抗PD-1/TGF-β双抗PM8005阻断人PD-L1与CHO细胞上过表达的人PD-1结合的曲线图。

图11：抗PD-1/TGF-β双抗PM8005阻断PD-L1/PD-1荧光素酶报告基因的曲线图。

图12A至12C：抗PD-1/TGF-β双抗PM8005与人TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3结合的曲线图。

图13：抗PD-1/TGF-β双抗PM8005阻断TGF-β1/SMAD的曲线图。

图14A：PM8005分子与人PD-1蛋白和抗TGF-bR2抗体ELISA水平共结合曲线图(包被人PD-1蛋白检测Biotin的抗TGF-βR2抗体)。

图14B：PM8005分子与TGF-β1和人PD-1蛋白ELISA水平共结合曲线图(包被TGF-β1检测Biotin的PD-1蛋曲线图(包被人PD-1蛋白检测Biotin的抗TGF-βR2抗体)。

图15：TGF-β1结合与否不影响PM8005分子与过表达人PD-1

CHO细胞结合的曲线图。

图16：TGF-β1结合与否不影响PM8005分子阻断人PD-L1与CHO细胞上过表达的人PD-1结合的曲线图。

图17A至17B：PM8005分子在混合淋巴细胞试验中刺激IL-2和IFN-γ的分泌柱状图。

图18：PM8005分子在B-NDG B2M KO plus小鼠A375肿瘤模型的药效图。

图19：PM8005分子在小鼠体内血药浓度随时间变化曲线图。

序列信息

本发明涉及序列的信息提供于下面的表1中。

表1：序列的描述

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具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。

实施例1：抗体的筛选，序列设计、表达和纯化

1、动物免疫与单细胞分选

取PD-1胞外段(Genbank序列号：AY238517)mouse IgG1 Fc融合蛋白，与Ribi佐剂(sigma)混合，10μg/只皮下免疫6到8周龄的BALB/c小鼠。取PD-1胞外段-his融合蛋白,10μg/只小鼠腹腔注射进行加强免疫，安乐死小鼠，取脾脏和淋巴结，放置于细胞筛网上，轻轻碾磨，PBS冲洗，获得单细胞悬液。细胞和biotin标记的PD-1蛋白和结合biotin的荧光二抗共孵育，洗涤，FACS液重悬细胞，流式上机分选，单个细胞分选至96孔PCR板中(BioRad),每孔加有20μL裂解液(5μL的5X单链cDNA缓冲液(Invitrogen),0.625μL的NP-40(New EnglandBiolabs),0.25μL的RNaseOUT(Invitrogen),1.25μL的dithiothreitol(Invitrogen),and12.6μL的双蒸水)。分选完成板子立即转移至-80℃保存。

2、单B细胞抗体可变区序列克隆与扩增

根据前期报告(Tiller等2009 J Immunol Methods 350:183-93)，采用特定的IgG,IgM特定混合引物，经反转录PCR和巢式PCR从B细胞裂解液中扩曾出编码抗体重链可变区和轻链可变区的cDNA序列。将10μL PCR扩展出来的重轻链可变区序列和200ng酶切的酵母表达质粒共同转染到酵母细胞中，转染后的单酵母细胞进行后续富集，扩增，抗体表达，筛选，测序等工作。

3、抗PD-1抗体人源化改造

为例降低鼠源抗体潜在的免疫原性，对抗体进行人源化改造。通常来说，人源化的抗体包含非人源抗体的CDR区和人源抗体的骨架区和恒定区，在一些案例中，也会对人源抗体骨架区的部分氨基酸进行回复突变，以更好的保持抗体的活性。人源化根据前期报告(lmagro等Front.Biosci.13:1619-1633(2008)；Riechmann等Nature 332:323-329(1988)；Queen等Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；U.S.Pat.Nos.5,821,337,7,527,791,6,982,321,7,087,409；Kashmiri等Methods 36:25-34(2005)Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)；Dall′Acqua等Methods 36:43-60(2005))进行。选择人源抗体骨架区的方法包括但不限于“最适选择法”(Sims et al.J.Immunol.151:2296(1993))。抗体骨架区来源于重轻链可变区库序列比对法(Carter etal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)等。本发明抗体人源化改造基于人源化抗体序列库计算生物学选择与鼠源抗体最适配人源抗体骨架区，将鼠源抗体CDR区嫁接到人源骨架区。对每个人源化的母本抗体，按上述方法选择构建3到4个最适人源抗体重链可变区，和3到4个最适人源抗体轻链可变区。转染酵母表达抗体进行人猴PD-1蛋白结合筛选。

4、抗体工程优化

人源化后单克隆抗体/scFv的进一步工程优化按如下方法进行：对抗体重链可变区CDR1,2,3进行随机点突变和原轻链配对转染酵母，建库筛选获得亲和力提升的酵母群体；抽提获得重链亲和力提升质粒库。对抗体轻链可变区CDR1,2,3进行随机点突变和原重链链配对转染酵母，建库筛选获得亲和力提升的酵母群体；抽提获得轻链亲和力提升质粒库。将重链亲和力提升质粒库和轻链亲和力提升质粒库随机混合转染酵母，进行建库筛选，获得最终亲和力提升的酵母单克隆，进行测序，获得亲和力提升的抗体序列。

经上述方法进行筛选与改造最终获得抗PD-1抗体ADI-54872，基于ADI-54872的可变区序列进一步获得其衍生物(抗PD-1scFv分子)，命名为ADI-54872-1,对ADI-54872-1经进一步工程化改造获得其衍生物ADI-63628，ADI-54872-1和ADI-63628的全长序列分别如SEQ ID NO:23和24所示，其包含IgG1 CH2/CH3恒定区序列以及scFv序列。上述抗PD-1抗体及其scFv衍生物的CDR及可变区序列如下表所示。

表2：抗体CDR及可变区序列

将ADI-54872重链可变区核酸序列与重链恒定区(SEQ ID NO:19)核酸序列连接，将ADI-54872轻链可变区核酸序列与轻链恒定区(SEQ ID NO:20)核酸序列连接，分别克隆到pcDNA3.1表达载体，经由HEK293表达系统瞬时表达纯化抗体ADI-54872。将ADI-54872-1序列(SEQ ID NO:23)，ADI-63628(SEQ ID NO:24)序列分别克隆到pcDNA3.1表达载体，经由HEK293表达系统瞬时表达纯化相应的scFv衍生物ADI-54872-1、ADI-63628。具体操作如下：使用化学转染的方法将带有抗体重链和/或轻链的pcDNA3.1载体转入HEK293细胞中，在37℃，8％CO₂条件下，培养7天。收集细胞液，13000rpm离心20分钟。取上清液，Protein A纯化上清液，SEC检测抗体纯度，同时控制内毒素含量。

实施例2：抗体亲和力检测

采用生物膜层光学干涉技术(ForteBio)测定实施例1获得的抗体结合人、食蟹猴PD-1的结合解离常数(KD)。Fortebio亲和力测定按照现有方法(Este,P等人Highthroughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity andepitope binning.Mabs,2013.5(2):p.270-8)进行，所述人、食蟹猴PD-1的胞外段氨基酸序列分别如SEQ ID NO:20、21所示。

测量完整抗体(全长IgG)或抗PD-1Fc-scFv蛋白与人、食蟹猴PD-1-his蛋白的单价亲和力：传感器在分析缓冲液中线下平衡20分钟，然后线上检测120s建立基线，加载完整的PD-1抗体或Fc-scFv至AHQ传感器至厚度1nm进行亲和力检测。将已加载抗体的传感器于100nM PD-1-his抗原中作用至平台期，然后将传感器转移到分析缓冲液中至少2分钟用于解离速率测量。使用1:1结合模型进行动力学分析。

结果如下表所示，ADI-54872、ADI-54872-1和ADI-63628结合人和食蟹猴PD-1蛋白单价亲和力优于对照抗体pembrolizumab。

表3：抗体KD值

实施例3：抗PD-1抗体/scFv与过表达人/食蟹猴PD-1CHO细胞的结合活性

通过转染克隆到MCS的人PD-1(Uniprot:Q15116)、食蟹猴PD-1(Uniprot:B0LAJ3)cDNA的pCHO1.0载体(购自Invitrogen)加压筛选产生过表达人PD-1的CHO-S细胞(CHO-huPD-1细胞)，过表达食蟹猴PD-1的CHO-S细胞(CHO-cynoPD-1细胞)。将扩大培养的过表达细胞调整至合适细胞密度加入96孔流式板，离心后加入梯度稀释的待测样品，4℃孵育30分钟。PBS清洗两次，加入对应稀释至合适浓度的荧光二抗，4℃孵育30分钟，PBS清洗两次。加入PBS重悬细胞，在CytoFlex流式细胞仪上进行检测并计算对应的MFI。采用Graphpad软件作图分析获得EC50数值。结果如表4和图1A和图1B所示：ADI-54872，ADI-54872-1，ADI-63628具备良好的结合过表达人PD-1，食蟹猴PD-1的CHO细胞活性。

表4：抗PD-1抗体/scFv在过表达细胞水平结合与阻断活性汇总表

实施例4：抗PD-1抗体/scFv阻断PD-L1与过表达人PD-1CHO细胞的结合活性

将扩大培养的CHO-huPD-1细胞调整细胞密度至2×10⁶/mL，100μL/孔加入96孔流式板，离心备用。将纯化的单克隆抗体用PBS稀释，400nM开始3倍稀释共12个点。将稀释好的样品60μL/孔加入上述带有细胞的96孔流式板中，4℃共孵育30分钟。然后60μL/孔加入bio-human PD-L1-Fc蛋白，终浓度为0.5μg/mL，4℃共孵育30分钟，PBS清洗两次。100μL/孔加入用PBS稀释100倍的SA-PE，4℃孵育30分钟，PBS清洗两次。100μL/孔加入PBS重悬细胞，在CytoFlex流式细胞仪上进行检测并计算对应的MFI。结果如表4和图2所示：ADI-54872，ADI-54872-1，ADI-63628具备良好的阻断活性。

实施例5：抗PD-1抗体/scFv与原代T细胞表面PD-1结合

基于流式细胞术检测法检测发明抗PD-1抗体/scFv与激活T细胞表面的PD-1结合活性。

具体地，将人PBMC按照STEMCELL公司提供的试验方案(STEMCELL,货号：#17951C)进行分选获得human total T细胞。用X-VIVO15培养基(购自lonza，货号：04-418Q)调整T细胞浓度至1.0×10⁶/mL，加入1μL IL-2储备液(100万IU)，同时1:1(bead-to-cell)加入CD3/CD28 Dynabeads(购自gibco，货号：11132D)，于37℃，5％CO₂培养箱内培养48小时。将活化后的T细胞调整至合适细胞密度加入96孔流式板，离心后加入梯度稀释的待测样品，4℃孵育30分钟。PBS清洗两次，加入对应稀释至合适浓度的荧光二抗，4℃孵育30分钟，PBS清洗两次。加入PBS重悬细胞，在CytoFlex流式细胞仪上进行检测并计算对应的MFI。结果如图3所示，本发明抗PD-1抗体/scFv ADI-54872，ADI-54872-1，ADI-63628可以结合激活T细胞表面的PD-1分子，ADI-54872优于对照抗体pembrolizumab。

实施例6：抗PD-1抗体/scFv阻断PD-L1/PD-1荧光素酶报告基因试验

为进一步在细胞水平检测PD-1抗体/scFv的阻断活性，本实施例构建了荧光素酶报告基因系统，简言之，利用慢病毒转染细胞，构建了过表达人PD-L1和OKT-3scFv的CHO-K1细胞株(CHO-K1-PD-L1)，构建了过表达人PD-1和NF-AT luciferase报告基因(购自promega)的Jurkat细胞株(Jurkat-PD-1-luc)，后续利用这一报告基因系统开展相关试验。

具体地，消化获取CHO-K1-PD-L1功能细胞，调整细胞密度，100μL/孔加入96孔白底板中，贴壁培养过夜。第二天，制备Jurkat-PD-1-luc效应细胞悬液，将待测样品用反应培养基(RPMI1640+10％FBS)梯度稀释。取出白底板，吸去培养上清，将上述稀释好的样品40μL/孔加入白底板，同时40μL/孔加入Jurkat-TIGIT-luc效应细胞悬液，置于37℃，5％CO₂培养箱培养6小时，期间将Bio-Glo TM reagent(购自promega，货号：G7940)恢复至室温。培养完成，取出细胞，室温平衡5分钟，80μL/孔加入Bio-Glo TM reagent，使用多功能酶标仪读取荧光信号值。结果如图4所示，本发明抗PD-1抗体/scFv ADI-54872，ADI-54872-1，ADI-63628可以阻断PD-L1介导的PD-1下游信号通路，上调报告基因荧光素酶表达。

实施例7：混合淋巴细胞反应试验

本实施例通过混合淋巴细胞反应实验(MLR)检测PD-1抗体/scFv激活T细胞的活性。具体试验方法如下。

复苏PBMC细胞(购自SAILY BIO,SLB-HPB)，离心，用10ml X-VIVO-15培养基(购自LONZA)重悬PBMC，于细胞培养箱内37℃贴壁培养2h，吸去未贴壁细胞。加入10ml DC培养基：X-VIVO-15培养基加入10ng/ml GM-CSF(购自R&D)，20ng/ml IL-4，培养3天，补加5ml DC培养基，继续培养至第6天，加入DC成熟培养基：X-VIVO-15培养基加入1000U/ml TNF-α(购自R&D)，10ng/ml IL-6(购自R&D)，5ng/ml IL-1β(购自R&D)，1μM PGE2(购自Tocris),培养2天，收集成熟的DC细胞，用X-VIVO-15培养基调整细胞密度为2×10⁵/ml。

复苏另一位捐献者的PBMC细胞(购自SAILY BIO,SLB-HPB)，离心，用10ml X-VIVO-15培养基重悬PBMC。用total T细胞分选试剂盒(购自Stemcell)富集total T细胞，X-VIVO-15重悬total T细胞，调整细胞密度为2×10⁶/ml.将T细胞与上述收集的成熟DC细胞按1:1比例混合，100μl/孔加入96孔U底板。

用X-VIVO-15培养基稀释PD-1抗体/scFv，200nM开始5倍稀释共5个点，100μl/孔加入上述混合细胞孔，培养3天，收集上清，ELISA(购自eBioscience)方法检测IL2表达量。

结果如图5所示，本发明抗PD-1抗体/scFv ADI-54872，ADI-54872-1，ADI-63628可以在MLR试验中激活T细胞分泌IL-2，ADI-54872的激活活性优于对照抗体pembrolizumab。

实施例8：抗PD-1抗体在人PD-1转基因小鼠体内药效学研究

本实验采用在人PD-1转基因C57小鼠(huPD-1KI小鼠)皮下接种人PD-L1 KI MC38肿瘤细胞(MC38-huPD-L1细胞)测定本发明PD-1抗体抗肿瘤作用。

具体地，首先采用皮下接种的方式建立MC38-huPD-L1细胞荷瘤小鼠模型，待平均肿瘤体积长至约173mm3时进行分组，腹腔注射给予PBS、5mg/kg的ADI-54872、5mg/kg的Pembrolizumab治疗，监测各组小鼠瘤体积和体重变化，监测频率均为2-4天/次，连续监测3周，给药剂量和方式如表5。结果如图6所示，本发明的抗PD-1抗体ADI-54872具备显著的抗肿瘤活性。

表5：抗PD-1抗体给药方案

组别	给药剂量	给药频率/次数
			阴性对照(PBS)	N/A	Q2d×4
ADI-54872	5mg/kg	Q2d×4

实施例9：抗PD-1抗体在B-NDG小鼠混合接种A375和人PBMC体内药效学研究

本实验在B-NDG小鼠混合接种A375和人PBMC的肿瘤模型中测定本发明抗PD-1抗体的抗肿瘤活性。

具体地，首先采用皮下混合接种A375+PBMC的方式建立A375荷瘤小鼠模型，待平均肿瘤体积长至约147mm3左右时进行分组，腹腔注射给予PBS、2.1mg/kg的ADI-54872、2.1mg/kg的Pembrolizumab治疗，监测各组小鼠瘤体积和体重变化，监测频率均为2天/次，连续监测2周，给药剂量和方式如表6。结果如图7所示，本发明的抗PD-1抗体ADI-54872具备显著的抗肿瘤活性。

表6：抗PD-1抗体给药方案

组别	给药剂量	给药频率/次数
			阴性对照(PBS)	N/A	Q2d×3
ADI-54872	2.1mg/kg	Q2d×3

实施例10：抗PD-1/TGF-βtrap融合蛋白克隆和表达

在本实施例中，采用TGF-βR2胞外结构域(SEQ ID NO:19)作为融合蛋白中免疫调节分子部分，将PD-1抗体作为融合蛋白的靶向部分，形成PD-1抗体/TGF-βRII胞外区融合蛋白，命名为PM8005。

利用分子克隆技术将ADI-54872的重链C末端氨基酸通过(G4A)4G连接TGF-βRII胞外区，通过Expi-CHO表达系统进行常规表达，表达纯化方法同实施例1，得到结构如图8所示的融合蛋白PM8005，其全长重链序列和轻链序列分别如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示。

实施例11：PM8005分子与过表达人/食蟹猴PD-1CHO细胞的结合活性

检测纯化的PD-1抗体ADI-54872、PM8005分子、TGF-βR2-Fc融合蛋白和细胞表面PD-1结合活性的方法同实施例3。在如上方法的测定实验中，实验结果如图9A-9B所示，本发明PM8005分子与过表达人PD-1，食蟹猴PD-1的CHO细胞有结合活性。

实施例12:PM8005分子阻断PD-L1与过表达人PD-1CHO细胞的结合活性

检测纯化的PD-1抗体ADI-54872、PM8005分子、TGF-βR2-Fc融合蛋白阻断PD-L1和过表达人PD-1CHO细胞结合活性的方法同实施例4。在如上方法的测定实验中，实验结果如图10所示，本发明PM8005分子可以阻断PD-L1与过表达人PD-1CHO细胞的结合。

实施例13：PM8005分子阻断PD-L1/PD-1荧光素酶报告基因试验

检测纯化的PD-1抗体ADI-54872、PM8005分子、TGF-βR2-Fc融合蛋白及阴性对照在细胞水平上阻断PD-L1介导的PD-1下游信号通路的方法同实施例6。在如上方法的测定实验中，实验结果如图11所示，本发明PM8005分子可以阻断PD-L1介导的PD-1下游信号通路，上调报告基因荧光素酶表达。

实施例14：PM8005分子与人TGF-β家族蛋白ELISA水平结合实验

用ELISA包被液将人TGF-β1(Acrobiosystems，TG1-H421)，TGF-β2(PeproTech，100-35B)，TGF-β3(PeproTech，100-36E)蛋白稀释后加入ELISA板，4℃包被过夜。弃去包被液，250μL/孔加入PBST洗3次，用5％BSA室温封闭1小时备用。将纯化的PD-1抗体ADI-54872，PM8005分子，TGF-βR2-Fc融合蛋白，阴性对照用1％BSA梯度稀释后加入封闭好的ELISA板，室温孵育2小时。加入PBST洗3次，向孔中加入鼠抗人Fc-HRP(SouthernBiotech，9040-05)，室温孵育1小时，加入PBST洗3次后加入ELISA显色液，室温放置3min后加入ELISA终止液，读取450nm处吸光度数值。

在如上方法的测定实验中，实验结果如图12A-12C所示，本发明PM8005分子在ELISA水平与人TGF-β1，TGF-β3蛋白有较好的结合，与人TGF-β2蛋白结合活性较弱。

实施例15：PM8005分子阻断TGF-β/SMAD信号通路实验

取适量293-TGF-β/SMAD效应胞接种于96孔细胞培养白底板，置于37℃，5％CO₂培养箱培养过夜。将纯化的PD-1抗体ADI-54872，PM8005分子，TGF-βR2-Fc融合蛋白，阴性对照梯度稀释后和TGF-β1(Acrobiosystems,TG1-H421)混合，室温孵育30min。将上述混合物加入带有细胞的白底板中继续培养过夜。向每孔中加入Bio-Glo TM试剂(Promega)，使用多功能酶标仪读取荧光信号值。

在如上方法的测定实验中，实验结果如图13所示，本发明PM8005分子可以体外阻断TGF-β/SMAD信号通路。

实施例16：PM8005分子与人TGF-β1/PD-1蛋白ELISA水平共结合实验

用ELISA包被液将人TGF-β1(Acrobiosystems，TG1-H421)或人PD-1蛋白稀释后加入ELISA板，4℃包被过夜。弃去包被液，250μL/孔加入PBST洗3次，用5％BSA室温封闭1小时备用。将纯化的PD-1抗体ADI-54872，PM8005分子，TGF-βR2-Fc融合蛋白，阴性对照用1％BSA梯度稀释后加入封闭好的ELISA板，室温孵育2小时。加入PBST洗3次，向孔中加入Biotin-PD-1或Biotin-Anti-TGFβR2，室温孵育1h。加入PBST洗3次，向孔中加入Streptavidin-HRP(abcam，ab7403)，室温孵育半小时，加入PBST洗3次后加入ELISA显色液，室温放置3min后加入ELISA终止液，读取450nm处吸光度数值。

在如上方法的测定实验中，实验结果如图14A-14B所示，本发明PM8005分子在ELISA水平与人TGF-β1，PD-1蛋白共结合。

实施例17：PM8005分子在人TGF-β1蛋白存在的条件下与过表达人PD-1CHO细胞的结合活性

将PM8005分子梯度稀释后，加入等体积的人TGF-β1蛋白，室温孵育30min。将扩大培养的过表达人PD-1CHO细胞调整至合适细胞密度加入96孔流式板，离心后加入上述孵育的样品，4℃孵育30分钟。后续检测方法同实施例3。在如上方法的测定实验中，实验结果如图15所示，人TGF-β1蛋白的存在不影响本发明PM8005分子与过表达人PD-1CHO细胞的结合活性。

实施例18：PM8005分子在人TGF-β1蛋白存在的条件下阻断PD-L1与过表达人PD-1CHO细胞的结合活性

将PM8005分子梯度稀释后，加入等体积的人TGF-β1蛋白，室温孵育30分钟。将扩大培养的过表达人PD-1CHO细胞调整至合适细胞密度加入96孔流式板，离心后加入上述孵育的样品，4℃孵育30分钟。后续检测方法同实施例4。在如上方法的测定实验中，实验结果如图16所示，人TGF-β1蛋白的存在不影响本发明PM8005分子阻断PD-L1与过表达人PD-1CHO细胞的结合活性。

实施例19：混合淋巴细胞反应试验

混合淋巴细胞检测纯化的PD-1抗体ADI-54872、PM8005分子、TGF-βR2-Fc融合蛋白、及阴性对照激活人T淋巴细胞的方法同实施例7。结果如图17A-17B所示，本发明PM8005分子可以在MLR试验中激活T细胞分泌IL-2和IFN-γ。

实施例20：PM8005分子在B-NDG小鼠混合接种A375和人PBMC体内药效学研究

具体地，首先采用皮下混合接种A375+PBMC的方式建立A375荷瘤小鼠模型，待平均肿瘤体积长至约150mm3左右时进行分组，腹腔注射给予PBS、5mg/kg的Keytruda(Pembrolizumab)、5mg/kg的ADI-54872联合2.5mg/kg的TGF-βRII-Fc、6mg/kg的PM8005(与5mg/kg的Keytruda是相等的摩尔剂量)治疗，监测各组小鼠瘤体积和体重变化，监测频率均为2-3天/次，连续监测2到3周，给药剂量和方式如表7。结果如图18所示，本发明的PM8005分子抗肿瘤活性优于等摩尔剂量的Keytruda。

表7：PM8005分子给药方案

组别	给药剂量	给药频率/次数
			阴性对照(PBS)	N/A	Q3d×3
Keytruda	5mg/kg	Q3d×3
			ADI-54872+TGF-βRII-Fc-	5+2.5mg/kg	Q3d×3
PM8005	6mg/kg	Q3d×3

实施例13：PM8005分子小鼠药代动力学评价

实验用BALB/C小鼠18只，雌雄各半，12/12小时光/暗调节，温度24±2℃，湿度40-70％,自由进水饮食。购自浙江维通利华实验技术有限公司。实验当天对小鼠单次尾静脉注射PM8005分子，注射剂量为10mg/kg。

取血时间点：给药后5分钟、0.5小时、2小时、6小时、24小时、48小时、96小时、168小时、336小时于小鼠眼眶静脉采血。全血样品2-8℃放置30分钟，12000rpm离心5分钟收集血清，所得血清再于2-8℃，12000rpm离心5分钟，-80℃保存，ELISA检测血清中游离PM8005分子量。结果如图19，表8所示，本发明PM8005游离状态分子在BALB/C小鼠体内半衰期约为160小时。

表8：PM8005在小鼠中的T1/2

受试药物	给药方式	T1/2
			PM8005	IV	160小时

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

SEQUENCE LISTING

<110> 普米斯生物技术（珠海）有限公司

<120> 抗PD-1单克隆抗体及其衍生物和用途

<130> IDC220123

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ADI-54872 VH

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr

20 25 30

Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Pro Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Val Arg Asp Phe Arg Phe Asp Lys Gly Phe Lys Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

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<213> 人工序列

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<223> ADI-54872 VL

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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Leu Asn Tyr Val His Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Tyr Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

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65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp

85 90 95

Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> ADI-54872-1 VH

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr

20 25 30

Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Pro Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Thr Val Arg Asp Phe Arg Phe Asp Lys Gly Phe Lys Tyr Trp Gly Gln

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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> ADI-54872-1 VL

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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Leu Asn Tyr Val His Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Tyr Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp

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Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

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<223> ADI-63628 VH

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Glu Tyr

20 25 30

Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Pro Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Val Arg Asp Phe Arg Phe Asp Lys Gly Phe Lys Tyr Trp Gly Gln

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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

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<212> PRT

<213> 人工序列

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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Leu Asn Tyr Val His Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Tyr Arg Asp Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp

85 90 95

Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

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<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ADI-54872/ADI-54872-1/ADI-63628 HCDR-2

<400> 8

Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Pro

<210> 9

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ADI-54872/ADI-54872-1/ADI-63628 HCDR-3

<400> 9

Thr Val Arg Asp Phe Arg Phe Asp Lys Gly Phe Lys Tyr

1 5 10

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ADI-54872/ADI-54872-1/ADI-63628 LCDR-1

<400> 10

Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Leu Asn Tyr Val His

1 5 10 15

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> ADI-54872/ADI-54872-1 LCDR-2

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Leu Gly Ser Tyr Leu Asp Ser

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ADI-54872/ADI-54872-1/ADI-63628 LCDR-3

<400> 12

Gln Gln Ser Trp Glu Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ADI-63628 HCDR-1

<400> 13

Phe Thr Phe Thr Glu Tyr Tyr Ile Tyr

1 5

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ADI-63628 LCDR-2

<400> 14

Leu Gly Ser Tyr Arg Asp Ser

1 5

<210> 15

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人IgG1 LALA重链恒定区

<400> 15

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

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100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

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130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

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180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

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275 280 285

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305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

325

<210> 16

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链恒定区

<400> 16

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 17

<211> 606

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PM8005重链

<400> 17

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr

20 25 30

Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Pro Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Val Arg Asp Phe Arg Phe Asp Lys Gly Phe Lys Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala

450 455 460

Gly Gly Gly Gly Ala Gly Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn

465 470 475 480

Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln

485 490 495

Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys

500 505 510

Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln

515 520 525

Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu

530 535 540

Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu

545 550 555 560

Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro

565 570 575

Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp

580 585 590

Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp

595 600 605

<210> 18

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PM8005轻链

<400> 18

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Leu Asn Tyr Val His Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Tyr Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp

85 90 95

Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 19

<211> 136

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TGF-βRII胞外区

<400> 19

Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr

1 5 10 15

Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp

20 25 30

Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys

35 40 45

Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val

50 55 60

Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp

65 70 75 80

Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro

85 90 95

Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met

100 105 110

Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu

115 120 125

Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp

130 135

<210> 20

<211> 147

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人PD-1 ECD

<400> 20

Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro

1 5 10 15

Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser

20 25 30

Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser

35 40 45

Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser

50 55 60

Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly

65 70 75 80

Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly

85 90 95

Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys

100 105 110

Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val

115 120 125

Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln

130 135 140

Thr Leu Val

145

<210> 21

<211> 165

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 食蟹猴PD-1 ECD

<400> 21

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Glu Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Ala Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Leu Val Thr Glu Gly Asp

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Ala Ser Glu Ser Phe Val

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Arg Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Arg Pro Ala Gly Gln

165

<210> 22

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG1 CH2/CH3-LALA 恒定区序列（Fc）

<400> 22

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly

225

<210> 23

<211> 487

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ADI-54872-1 序列

<400> 23

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu

225 230 235 240

Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val

245 250 255

Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Tyr Ile Tyr Trp

260 265 270

Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile Gly Gly Ile Asn

275 280 285

Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys Pro Arg Val

290 295 300

Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser

305 310 315 320

Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Val Arg Asp

325 330 335

Phe Arg Phe Asp Lys Gly Phe Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

340 345 350

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

355 360 365

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro

370 375 380

Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg

385 390 395 400

Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Leu Asn Tyr Val His Trp Tyr

405 410 415

Gln Arg Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser

420 425 430

Tyr Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

435 440 445

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala

450 455 460

Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Cys

465 470 475 480

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

485

<210> 24

<211> 487

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ADI-63628序列

<400> 24

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gln Val Gln Leu

225 230 235 240

Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val

245 250 255

Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Glu Tyr Tyr Ile Tyr Trp

260 265 270

Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile Gly Gly Ile Asn

275 280 285

Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys Pro Arg Val

290 295 300

Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser

305 310 315 320

Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Val Arg Asp

325 330 335

Phe Arg Phe Asp Lys Gly Phe Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

340 345 350

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

355 360 365

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro

370 375 380

Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg

385 390 395 400

Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Leu Asn Tyr Val His Trp Tyr

405 410 415

Gln Arg Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser

420 425 430

Tyr Arg Asp Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

435 440 445

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala

450 455 460

Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Cys

465 470 475 480

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

485

Claims

1.能够特异性结合PD-1的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：

包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO:10的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:11或14的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:12的VL CDR3。

2.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：

(a)包含下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO:7的VHCDR1、序列为SEQ ID NO:8的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:9的VH CDR3；和/或，包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO:10的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:11的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:12的VL CDR3；

或

(b)包含下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO:13的VHCDR1、序列为SEQ ID NO:8的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:9的VH CDR3；和/或，包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO:10的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:14的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:12的VL CDR3。

3.权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含SEQ ID NO:1、3或5所示的序列或其变体的重链可变区(VH)；和/或，包含SEQ IDNO:2、4或6所示的序列或其变体的轻链可变区(VL)；

其中，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)，或具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；优选地，所述的置换是保守置换。

4.权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：

(a)包含SEQ ID NO:1或3所示的序列或其变体的重链可变区(VH)；和/或，包含SEQ IDNO:2或4所示的序列或其变体的轻链可变区(VL)；或，

(b)包含SEQ ID NO:5所示的序列或其变体的重链可变区(VH)；和/或，包含SEQ ID NO:6所示的序列或其变体的轻链可变区(VL)；

5.权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：

6.权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含来源于人免疫球蛋白的恒定区；

优选地，所述抗体或其抗原结合片段的重链包含来源于人免疫球蛋白(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的重链恒定区，所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含来源于人免疫球蛋白(例如κ或λ)的轻链恒定区；

优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:15所示的重链恒定区(CH)和/或如SEQ ID NO:16所示的轻链恒定区(CL)。

7.权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’)₂、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双抗体(diabody)、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。

8.权利要求1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体为IgG抗体(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体)。

9.权利要求1-8任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段带有标记；优选地，所述抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。

10.融合蛋白，其包含权利要求1-9任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及另外的生物活性多肽。

11.权利要求10所述的融合蛋白，其中，所述另外的生物活性多肽为免疫调节剂。

12.权利要求11所述的融合蛋白，其中，所述另外的生物活性多肽为TGF-β/TGF-βR通路抑制剂，例如TGF-βRII胞外结构域。

13.权利要求10-12任一项所述的融合蛋白，其中，所述抗体或其抗原结合片段与另外的生物活性多肽任选地通过肽接头连接。

14.权利要求10-13任一项所述的融合蛋白，其包含：

包含所述抗体或其抗原结合片段的轻链的第一肽链：以及

包含所述抗体或其抗原结合片段的重链和所述另外的生物活性多肽的第二肽链。

15.权利要求14所述的融合蛋白，其中，所述第一肽链包含如SEQ ID NO:17所示的序列，和/或，所述第二肽链包含如SEQ ID NO:18所示的序列。

16.多肽构建体，其包含权利要求1-9任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及免疫球蛋白Fc结构域；

优选地，所述抗体或其抗原结合片段为抗原结合片段，例如Fab、Fab’、(Fab’)₂、Fv、二硫键连接的Fv、scFv或diabody。

17.权利要求16所述的多肽构建体，其中，所述抗体或其抗原结合片段为scFv；

优选地，所述scFv包含二硫键；

优选地，所述另外的生物活性多肽任选地通过肽接头连接至所述scFv的N端。

18.权利要求17所述的多肽构建体，其包含SEQ ID NO:23或24任一项所示的序列。

19.分离的核酸分子，其编码权利要求1-9任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区，或者编码权利要求10-15任一项所述的融合蛋白，或者编码权利要求16-18任一项所述的多肽构建体。

20.载体，其包含权利要求19所述的核酸分子；优选地，所述载体为克隆载体或表达载体。

21.宿主细胞，其包含权利要求19所述的核酸分子或权利要求20所述的载体。

22.制备权利要求1-9任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求10-15任一项所述的融合蛋白或权利要求16-18任一项所述的多肽构建体的方法，其包括，在允许蛋白表达的条件下，培养权利要求21所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段或融合蛋白或多肽构建体。

23.缀合物，其包含权利要求1-9任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及连接于所述抗体或其抗原结合片段的治疗剂；

优选地，所述治疗剂选自细胞毒素或放射性同位素。

24.组合物，其包含：(1)权利要求1-9任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求16-18任一项所述的多肽构建体；以及(2)免疫调节剂。

25.权利要求24所述的组合物，其中，所述免疫调节剂为TGF-β/TGF-βR通路抑制剂，例如TGF-βRII胞外结构域。

26.药物组合物，其含有权利要求1-9任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求10-15任一项所述的融合蛋白、权利要求16-18任一项所述的多肽构建体、权利要求23所述的缀合物、或权利要求24或25所述的组合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂；

优选地，药物组合物还包含另外的药学活性剂；

优选地，所述另外的药学活性剂是具有抗肿瘤活性的药物，例如另外的免疫检查点抑制剂、溶瘤病毒、化学治疗剂、抗血管生成药物、抗代谢药物、靶向肿瘤药物或免疫刺激剂；

优选地，所述另外的药学活性剂是用于治疗感染的药物，例如抗病毒剂、抗真菌剂、抗细菌剂或免疫刺激剂；

优选地，所述抗体或其抗原结合片段、所述融合蛋白、所述缀合物或所述组合物与所述另外的药学活性剂作为分离的组分或作为同一组合物的组分提供。

27.权利要求1-9任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求10-15任一项所述的融合蛋白、权利要求16-18任一项所述的多肽构建体、权利要求23所述的缀合物、权利要求24或25所述的组合物、或权利要求26所述的药物组合物，在制备药物中的用途，所述药物用于：

(1)在体外或受试者(例如人)体内提高免疫细胞活性；

(2)在受试者(例如人)中增强免疫应答；

(3)在受试者(例如人)中预防和/治疗肿瘤；

(4)在受试者(例如人)中预防和/治疗感染；

优选地，所述肿瘤是具有微卫星高度不稳定性(MSI-H)和/或错配修复缺陷(dMMR)的肿瘤；

优选地，所述肿瘤为实体瘤，例如黑色素瘤(例如，转移性恶性黑素瘤)、乳腺癌、肾癌(例如，透明细胞癌)、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、结肠癌、食道癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤；

优选地，所述肿瘤为血液肿瘤，例如淋巴瘤、白血病；优选地，所述淋巴瘤为霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤；优选地，所述非霍奇金淋巴瘤为外周T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤、伴EB病毒阳性的NK/T细胞淋巴瘤(鼻型)和B细胞非霍奇金淋巴瘤中的一种或多种；

优选地，所述感染选自病毒感染、细菌感染、真菌感染和寄生虫感染；

优选地，所述受试者为哺乳动物，例如人。

28.一种用于在受试者中增强免疫应答，和/或，预防和/或治疗肿瘤或感染的方法；所述方法包括：给有此需要的受试者施用有效量的权利要求1-9任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求10-15任一项所述的融合蛋白、权利要求16-18任一项所述的多肽构建体、权利要求23所述的缀合物、或权利要求24或25所述的组合物、或权利要求26所述的药物组合物；

优选地，所述受试者为哺乳动物，例如人。

29.试剂盒，其包括权利要求1-9任一项所述的抗体或其抗原结合片段；

优选地，所述试剂盒包含权利要求9所述的抗体或其抗原结合片段；

优选地，所述试剂盒包含权利要求1-8任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及特异性识别所述抗体或其抗原结合片段的第二抗体；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。

30.用于检测PD-1在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用权利要求1-9任一项所述的抗体或其抗原结合片段；

优选地，所述方法是免疫学检测，例如免疫印迹法、酶免疫测定法(例如ELISA)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法；

优选地，所述方法包括使用权利要求9所述的抗体或其抗原结合片段；

优选地，所述方法包括使用权利要求1-8任一项所述的抗体或其抗原结合片段，并且所述方法还包括使用携带可检测的标记(例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素)的第二抗体来检测所述抗体或其抗原结合片段；

优选地，所述样品为来自受试者(例如哺乳动物，例如人)的细胞样品(例如，肿瘤细胞)或组织样品(例如肿瘤组织)。

31.权利要求1-9任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备检测试剂中的用途，所述检测试剂用于检测PD-1在样品中的存在或其水平；

优选地，所述检测试剂通过权利要求30所述的方法来检测PD-1在样品中的存在或其水平；

优选地，所述样品为来自受试者(例如哺乳动物，例如人)的细胞样品(例如，肿瘤细胞)。