KR20080088662A - 6-변형된 바이시클릭 핵산 유사체 - Google Patents

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에릭 이. 스웨이즈
푸니트 피. 세쓰
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아이시스 파마수티컬즈 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은, 6-변형된 바이시클릭 뉴클레오시드 유사체 및 이들 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 올리고머 화합물을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 뉴클레오시드 유사체는 6번 위치에서 (R) 또는 (S)-키랄성을 갖는다. 이들 바이시클릭-뉴클레오시드 유사체는 뉴클레아제 내성을 비롯한 올리고머 화합물의 특성을 향상시키기에 유용하다.
바이시클릭 뉴클레오시드 유사체, 뉴클레아제 내성, 유전자 발현 억제

Description

6-변형된 바이시클릭 핵산 유사체 {6-MODIFIED BICYCLIC NUCLEIC ACID ANALOGS}
<관련 출원의 상호 참조>
본원은, 미국 가출원 제60/762,722호 (2006년 1월 27일자로 출원됨, 발명의 명칭: "Subsituted Bicyclic Nucleic Acid Analogs") 및 미국 가출원 제60/805,660호 (2006년 6월 23일자로 출원됨, 발명의 명칭: "6-Substituted Bicyclic Nucleic Acid Analogs")의 우선권 이익을 청구하며, 이들 개시 각각의 전체가 본원에 참고로 도입된다.
본 발명은, 6-변형된 바이시클릭 뉴클레오시드, 및 그로부터 제조된 올리고머 화합물 및 조성물을 제공한다. 보다 특별하게는, 본 발명은, 2'-O-C(H)(R)-4' 브릿지를 갖는 뉴클레오시드, 및 그로부터 제조된 올리고머 및 조성물을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, R은 (R) 또는 (S) 이성질체를 형성하는 특정 배열로 존재한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고머 화합물 및 조성물은 표적 RNA의 일부에 혼성화되어 표적 RNA의 정상적 기능의 손실을 초래한다.
안티센스(antisense) 기술은 하나 이상의 특정 유전자 생성물의 발현을 감소 시키기 위한 효과적인 수단이고, 따라서 이는 많은 치료, 진단 및 연구 용도에서 특이하게 유용한 것으로 나타날 수 있다. 화학적으로 변형된 뉴클레오시드는, 예를 들어 뉴클레아제 내성과 같은 하나 이상의 특성을 향상시키기 위해 안티센스 서열내에 혼입하는 데 통용된다. 이러한 화학적 변형의 한가지 군은, 뉴클레오시드의 푸라노즈 부분이 푸라노즈 고리 상의 2개의 원자를 연결함으로써 바이시클릭 고리 시스템을 형성하는 브릿지를 포함한다. 이러한 바이시클릭 뉴클레오시드는, 각각 바이시클릭 핵산 또는 잠금 핵산에 대한 BNA 및 LNA를 비롯하여 다양한 명칭을 갖는다.
다양한 BNA가 제조되었고, 특허 문헌 뿐만 아니라 과학 문헌에서 보고되었다 (예를 들어, 각각의 본문이 전체적으로 본원에 참고로 도입된, 문헌 [Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456]; [Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630]; [Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638]; [Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222]; PCT 특허출원 제WO 98-DK393 19980914호 (Wengel et al.); 문헌 [Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039] 참조). 허여된 미국 특허 및 공개된 특허출원의 예로는, 예를 들어 미국 특허 제7,053,207호, 동 제6,770,748호, 동 제6,268,490호 및 동 제6,794,499호, 및 미국 특허출원 공개 제20040219565호, 동 제20040014959호, 동 제20030207841호, 동 제20040192918호, 동 제20030224377호, 동 제20040143114호 및 동 제20030082807호가 포함되며, 이들 각각의 본문은 전체적으로 본원에 참고로 도입된다.
많은 LNA는 독성이다 (예를 들어, 문헌 [Swayze, E. E.; Siwkowski, A. M.; Wancewicz, E. V.; Migawa, M. T.; Wyrzykiewicz, T. K.; Hung, G.; Monia, B. P.; Bennett, C. F., Antisense oligonucleotides containing locked nucleic acid improve potency but cause significant hepatotoxicity in animals. Nucl. Acids Res., doi: 10.1093/nar/gkll071 (Dec. 2006, advanced online publication)] 참조).
결과적으로, 안티센스 메카니즘을 통해 특이적으로 유전자 발현을 조절하는 제제에 대한 강한 필요성이 남아있다. 본원에서는, RNaseH, RNAi 및 dsRNA 효소 등의 작용 메카니즘 뿐만 아니라 표적 분해 또는 표적 점유에 기초한 다른 안티센스 메카니즘에 의존하는 것들을 포함하는, 유전자 발현 경로를 조절하는 데 유용한 6-치환된 BNA 및 그로부터 제조된 안티센스 화합물이 개시된다. 본원의 개시를 접한 당업자는 과도한 실험 없이 이들 용도를 위한 안티센스 화합물을 확인, 제조 및 활용할 수 있을 것이다.
<발명의 요약>
본 발명은, 하기 화학식 1을 갖는 바이시클릭 뉴클레오시드를 제공한다.
Figure 112008060828411-PCT00001
식 중,
Bx는 헤테로시클릭 염기 잔기이고;
T1은 H 또는 히드록실 보호기이며;
T2는 H, 히드록실 보호기 또는 반응성 인 기이고;
Z는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C1-C6 알킬, 치환된 C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알키닐, 아실, 치환된 아실 또는 치환된 아미드이다.
일 실시양태에서, 치환된 기는 각각 독립적으로, 할로겐, 옥소, 히드록실, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 및 CN으로부터 독립적으로 선택된 임의로 보호된 치환기로 일치환 또는 다치환되고, 여기서 J1, J2 및 J3은 각각 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이고, X는 O, S 또는 NJ1이다.
일 실시양태에서, 치환된 기는 각각 독립적으로, 할로겐, 옥소, 히드록실, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1 및 NJ3C(=X)NJ1J2로부터 독립적으로 선택된 치환기로 일치환 또는 다치환기되고, 여기서 J1, J2 및 J3은 각각 독립적으로, H, C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알킬이고, X는 O 또는 NJ1이다.
일 실시양태에서, Z는 C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알킬이다. 또다른 실시양태에서, Z는 C1-C6 알킬이다. 또다른 실시양태에서, Z는 메틸 (CH3-)이다. 또다른 실시양태에서, Z는 에틸 (CH3CH2-)이다. 또다른 실시양태에서, Z는 치환된 C1-C6 알킬이다. 또다른 실시양태에서, Z는 치환된 메틸이다. 또다른 실시양태에서, Z는 치환된 에틸이다.
일 실시양태에서, 치환기는 C1-C6 알콕시이다 (예를 들어, Z는 하나 이상의 C1-C6 알콕시로 치환된 C1-C6 알킬임). 또다른 실시양태에서, C1-C6 알콕시 치환기는 CH3O-이다 (예를 들어, Z는 CH3OCH2-임). 또다른 실시양태에서, C1-C6 알콕시 치환기는, N(J1J2)CH2O-와 같이 추가로 치환될 수 있다 (예를 들어, Z는 N(J1J2)CH2OCH2-임). 또다른 실시양태에서, 치환기는 할로겐이다 (예를 들어, Z는 하나 이상의 할로겐으로 치환된 C1-C6 알킬임). 또다른 실시양태에서, 할로겐 치환기는 플루오로이다 (예를 들어, Z는 CH2FCH2-, CHF2CH2- 또는 CF3CH2-임). 또다른 실시양태에서, 치환기는 히드록실이다 (예를 들어, Z는 하나 이상의 히드록실로 치환된 C1-C6 알킬임). 또다른 실시양태에서, Z는 HOCH2-이다. 또다른 실시양태에서, Z는 CH3-, CH3CH2-, -CH2OCH3, -CH2F 또는 HOCH2-이다.
일 실시양태에서, Z기는 하나 이상의 XX로 치환된 C1-C6 알킬이고, 여기서 XX는 각각 독립적으로, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)J1J2, NJ3C(=X)J1J2 또는 CN이며; 여기서 J1, J2 및 J3은 각각 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이고, X는 O, S 또는 NJ1이다. 또다른 실시양태에서, Z기는 하나 이상의 XX로 치환된 C1-C6 알킬이고, 여기서 XX는 각각 독립적으로, 할로 (예를 들어, 플루오로), 히드록실, 알콕시 (예를 들어, CH3O-), 치환된 알콕시 또는 아지도이다.
일 실시양태에서, Z기는 -CH2XX이고, 여기서 XX는 OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 또는 CN이고; 여기서 J1, J2 및 J3은 각각 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이며, X는 O, S 또는 NJ1이다. 또다른 실시양태에서, Z기는 -CH2XX이고, 여기서 XX는 할로 (예를 들어, 플루오로), 히드록실, 알콕시 (예를 들어, CH3O-) 또는 아지도이다.
일 실시양태에서, Z기는 하기와 같이 (R)-배열로 존재한다.
Figure 112008060828411-PCT00002
또다른 실시양태에서, Z기는 하기와 같이 (S)-배열로 존재한다.
Figure 112008060828411-PCT00003
일 실시양태에서, T1 및 T2는 각각 히드록실 보호기이다. 히드록실 보호기 의 바람직한 목록은, 벤질, 벤조일, 2,6-디클로로벤질, t-부틸디메틸실릴, t- 부틸디페닐실릴, 메실레이트, 토실레이트, 디메톡시트리틸 (DMT), 9-페닐크산틴-9-일 (픽실) 및 9-(p-메톡시페닐)크산틴-9-일 (MOX)을 포함한다. 일 실시양태에서, T1은 아세틸, 벤질, t-부틸디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴 및 디메톡시트리틸로부터 선택된 히드록실 보호기이고, 여기서 보다 바람직한 히드록실 보호기는 T1이 4,4'-디메톡시트리틸인 것이다.
일 실시양태에서, T2는 반응성 인 기이며, 여기서 바람직한 반응성 인 기는 디이소프로필시아노에톡시 포스포라미다이트 및 H-포스포네이트를 포함한다. 바람직한 일 실시양태에서, T1은 4,4'-디메톡시트리틸이고, T2는 디이소프로필시아노에톡시 포스포라미다이트이다.
본 발명은 또한, 하나 이상의 하기 화학식 I, II 또는 III의 단량체를 갖는 올리고머 화합물을 제공한다.
Figure 112008060828411-PCT00004
Figure 112008060828411-PCT00005
Figure 112008060828411-PCT00006
식 중,
Bx는 헤테로시클릭 염기 잔기이고;
T3은 H, 히드록실 보호기, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드, 단량체 서브유닛 또는 올리고머 화합물에 결합된 뉴클레오시드간 연결기 또는 연결 콘쥬게이트기이며;
T4는 H, 히드록실 보호기, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드, 단량체 서브유닛 또는 올리고머 화합물에 결합된 뉴클레오시드간 연결기 또는 연결 콘쥬게이트기이고;
여기서, T3 및 T4 중 적어도 하나는 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드, 단량체 서브유닛 또는 올리고머 화합물에 결합된 뉴클레오시드간 연결기이고;
Z는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C1-C6 알킬, 치환된 C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알키닐, 아실, 치환된 아실 또는 치환된 아미드이다.
일 실시양태에서, 치환된 기는 각각 독립적으로, 할로겐, 옥소, 히드록실, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 및 CN으로부터 독립적으 로 선택된 임의로 보호된 치환기로 일치환 또는 다치환되고, 여기서 J1, J2 및 J3은 각각 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이고, X는 O, S 또는 NJ1이다.
일 실시양태에서, 치환된 기는 각각 독립적으로, 할로겐, 옥소, 히드록실, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1 및 NJ3C(=X)NJ1J2로부터 독립적으로 선택된 치환기로 일치환 또는 다치환되고, 여기서 J1, J2 및 J3은 각각 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이고, X는 O 또는 NJ1이다.
일 실시양태에서, 하나 이상의 Z는 C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알킬이다. 또다른 실시양태에서, Z는 각각 독립적으로, C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알킬이다. 또다른 실시양태에서, 하나 이상의 Z는 C1-C6 알킬이다. 또다른 실시양태에서, Z는 각각 독립적으로, C1-C6 알킬이다. 또다른 실시양태에서, 하나 이상의 Z는 메틸이다. 또다른 실시양태에서, Z는 각각 메틸이다. 또다른 실시양태에서, 하나 이상의 Z는 에틸이다. 또다른 실시양태에서, Z는 각각 에틸이다. 또다른 실시양태에서, 하나 이상의 Z는 치환된 C1-C6 알킬이다. 또다른 실시양태에서, Z는 각각 독립적으로, 치환된 C1-C6 알킬이다. 또다른 실시양태에서, 하나 이상의 Z는 치환된 메틸이다. 또다른 실시양태에서, Z는 각각 치환된 메틸이다. 또다른 실시양태에서, 하나 이상의 Z는 치환된 에틸이다. 또다른 실시양태에서, Z는 각각 치환된 에틸이다.
일 실시양태에서, 하나 이상의 치환기는 C1-C6 알콕시이다 (예를 들어, 하나 이상의 Z는 하나 이상의 C1-C6 알콕시로 치환된 C1-C6 알킬임). 또다른 실시양태에서, 치환기는 각각 독립적으로, C1-C6 알콕시이다 (예를 들어, Z는 각각 독립적으로, 하나 이상의 C1-C6 알콕시로 치환된 C1-C6 알킬임).
일 실시양태에서, 하나 이상의 C1-C6 알콕시 치환기는 CH3O-이다 (예를 들어, 하나 이상의 Z는 CH3OCH2-임). 또다른 실시양태에서, C1-C6 알콕시 치환기는 각각 CH3O-이다 (예를 들어, Z는 각각 CH3OCH2-임).
일 실시양태에서, 하나 이상의 치환기는 할로겐이다 (예를 들어, 하나 이상의 Z는 하나 이상의 할로겐으로 치환된 C1-C6 알킬임). 또다른 실시양태에서, 치환기는 각각 독립적으로, 할로겐이다 (예를 들어, Z는 각각 독립적으로, 하나 이상의 할로겐으로 치환된 C1-C6 알킬임). 또다른 실시양태에서, 하나 이상의 할로겐 치환기는 플루오로이다 (예를 들어, 하나 이상의 Z는 CH2FCH2-, CHF2CH2- 또는 CF3CH2-임). 또다른 실시양태에서, 할로 치환기는 각각 플루오로이다 (예를 들어, Z는 각각 독립적으로, CH2FCH2-, CHF2CH2- 또는 CF3CH2-임).
일 실시양태에서, 하나 이상의 치환기는 히드록실이다 (예를 들어, 하나 이상의 Z는 하나 이상의 히드록실로 치환된 C1-C6 알킬임). 또다른 실시양태에서, 치 환기는 각각 독립적으로, 히드록실이다 (예를 들어, Z는 각각 독립적으로, 하나 이상의 히드록실로 치환된 C1-C6 알킬임). 또다른 실시양태에서, 하나 이상의 Z는 HOCH2-이다. 또다른 실시양태에서, Z는 각각 HOCH2-이다.
일 실시양태에서, 하나 이상의 Z는 CH3-, CH3CH2-, CH2OCH3-, CH2F- 또는 HOCH2-이다. 또다른 실시양태에서, Z는 각각 독립적으로, CH3-, CH3CH2-, CH2OCH3-, CH2F- 또는 HOCH2-이다.
일 실시양태에서, 하나 이상의 Z기는 하나 이상의 XX로 치환된 C1-C6 알킬이고, 여기서 XX는 각각 독립적으로, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)J1J2, NJ3C(=X)J1J2 또는 CN이며; 여기서 J1, J2 및 J3은 각각 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이고, X는 O, S 또는 NJ1이다. 또다른 실시양태에서, 하나 이상의 Z기는 하나 이상의 XX로 치환된 C1-C6 알킬이고, 여기서 XX는 각각 독립적으로, 할로 (예를 들어, 플루오로), 히드록실, 알콕시 (예를 들어, CH3O-) 또는 아지도이다.
일 실시양태에서, Z기는 각각 독립적으로, 하나 이상의 XX로 치환된 C1-C6 알킬이고, 여기서 XX는 각각 독립적으로, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)J1J2, NJ3C(=X)J1J2 또는 CN이며; 여기서 J1, J2 및 J3은 각각 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이고, X는 O, S 또는 NJ1이다. 또다른 실시양태에서, Z기는 각각 독립적으로, 하나 이상의 XX로 치환된 C1-C6 알킬이고, 여기서 XX는 각각 독립적으로, 할로 (예를 들어, 플루오로), 히드록실, 알콕시 (예를 들어, CH3O-) 또는 아지도이다.
일 실시양태에서, 하나 이상의 Z기는 -CH2XX이고, 여기서 XX는 OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 또는 CN이고; 여기서 J1, J2 및 J3은 각각 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이며, X는 O, S 또는 NJ1이다. 또다른 실시양태에서, 하나 이상의 Z기는 -CH2XX이고, 여기서 XX는 할로 (예를 들어, 플루오로), 히드록실, 알콕시 (예를 들어, CH3O-) 또는 아지도이다.
일 실시양태에서, Z기는 각각 독립적으로, -CH2XX이고, 여기서 XX는 각각 독립적으로, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 또는 CN이고; 여기서 J1, J2 및 J3은 각각 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이며, X는 O, S 또는 NJ1이다. 또다른 실시양태에서, Z기는 각각 독립적으로, -CH2XX이고, 여기서 XX는 각각 독립적으로, 할로 (예를 들어, 플루오로), 히드록실, 알콕시 (예를 들어, CH3O-) 또는 아지도이다.
일 실시양태에서, 하나 이상의 Z는 CH3-이다. 또다른 실시양태에서, Z는 각각 CH3-이다.
일 실시양태에서, 하나 이상의 단량체의 Z기는 하기 화학식 IV, V 또는 VI으로 표시되는 (R)-배열로 존재한다.
Figure 112008060828411-PCT00007
Figure 112008060828411-PCT00008
Figure 112008060828411-PCT00009
또다른 실시양태에서, 상기 화학식의 각각의 단량체의 Z기는 (R)-배열로 존재한다.
일 실시양태에서, 하나 이상의 단량체의 Z기는 하기 화학식 VII, VIII 또는 IX로 표시되는 바와 같이 (S)-배열로 존재한다.
Figure 112008060828411-PCT00010
Figure 112008060828411-PCT00011
Figure 112008060828411-PCT00012
또다른 실시양태에서, 상기 화학식의 각각의 단량체의 Z기는 (S)-배열로 존재한다.
일 실시양태에서, T3은 H 또는 히드록실 보호기이다. 또다른 실시양태에서, T4는 H 또는 히드록실 보호기이다. 추가의 실시양태에서, T3은 뉴클레오시드, 뉴클레오티드 또는 단량체 서브유닛에 결합된 뉴클레오시드간 연결기이다. 또다른 실시양태에서, T4는 뉴클레오시드, 뉴클레오티드 또는 단량체 서브유닛에 결합된 뉴클레오시드간 연결기이다. 또다른 실시양태에서, T3은 올리고뉴클레오시드 또는 올리고뉴클레오티드에 결합된 뉴클레오시드간 연결기이다. 추가의 실시양태에서, T4는 올리고뉴클레오시드 또는 올리고뉴클레오티드에 결합된 뉴클레오시드간 연결기이다. 일 실시양태에서, T3은 올리고머 화합물에 결합된 뉴클레오시드간 연결기이다. 추가의 실시양태에서, T4는 올리고머 화합물에 결합된 뉴클레오시드간 연결기이다. 또한 추가의 실시양태에서, T3 및 T4 중 적어도 하나는 포스포디스테르 또는 포스포로티오에이트로부터 선택된 뉴클레오시드간 연결기를 포함한다.
일 실시양태에서, 올리고머 화합물은 하기 화학식 I, II 또는 III의 2개 이상의 인접하는 단량체의 하나 이상의 영역을 갖는다.
<화학식 I>
Figure 112008060828411-PCT00013
<화학식 II>
Figure 112008060828411-PCT00014
<화학식 III>
Figure 112008060828411-PCT00015
또다른 실시양태에서, 올리고머 화합물은 상기 화학식의 2개 이상의 인접하는 단량체의 둘 이상의 영역을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 올리고머 화합물 은 갭을 갖는 올리고머 화합물을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 올리고머 화합물은 약 8개 내지 약 14개의 인접하는 β-D-2'-데옥시리보푸라노실 뉴클레오시드의 하나 이상의 영역을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 올리고머 화합물은 약 9개 내지 약 12개의 인접하는 β-D-2'-데옥시리보푸라노실 뉴클레오시드의 하나 이상의 영역을 포함한다.
일 실시양태에서, 올리고머 화합물은 상기 화학식의 2개 내지 3개의 인접하는 단량체의 하나 이상의 영역, 상기 화학식의 1개 또는 2개의 인접하는 단량체의 임의의 제2 영역, 및 8개 내지 14개의 β-D-2'-데옥시리보푸라노실 뉴클레오시드를 갖는 제3 영역을 포함하며, 여기서 제3 영역은 제1 영역과 제2 영역 사이에 위치한다. 또다른 실시양태에서, 올리고머 화합물은 8개 내지 10개의 β-D-2'-데옥시리보푸라노실 뉴클레오시드를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서는, 약 8개 내지 약 40개의 뉴클레오시드 및/또는 변형된 뉴클레오시드 또는 길이에 있어서의 모방체를 갖는 올리고머 화합물이 제공된다. 추가의 실시양태에서, 올리고머 화합물은 약 8개 내지 약 20개의 뉴클레오시드 및/또는 변형된 뉴클레오시드 또는 길이에 있어서의 모방체를 포함한다. 또한 추가의 실시양태에서, 올리고머 화합물은 약 10개 내지 약 16개의 뉴클레오시드 및/또는 변형된 뉴클레오시드 또는 길이에 있어서의 모방체를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 올리고머 화합물은 약 10개 내지 약 14개의 뉴클레오시드 및/또는 변형된 뉴클레오시드 또는 길이에 있어서의 모방체를 포함한다.
또한, 하나 이상의 세포, 조직 또는 동물을 본 발명의 올리고머 화합물과 접 촉시키는 것을 포함하는 유전자 발현 억제 방법이 제공된다.
본 발명은 6-변형된 바이시클릭 뉴클레오시드, 그로부터 제조된 올리고머 화합물 및 조성물, 신규한 합성 중간체, 및 상기 뉴클레오시드, 올리고머 화합물, 조성물 및 신규한 합성 중간체의 제조 방법을 제공한다. 보다 특별하게는, 본 발명은, 화학식: 2'-O-C(H)(Z)-4'를 갖는 리보스 부분의 4'-위치와 2'-위치 사이의 브릿지를 갖는 뉴클레오시드, 및 그로부터 제조된 올리고머 및 조성물을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, Z는 (R) 또는 (S) 이성질체를 제공하는 특정 배열로 존재한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고머 화합물 및 조성물은 표적 RNA의 일부에 혼성화되도록 디자인된다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 올리고머 화합물은 생체내 환경에서 이상 단백질에 결합될 수 있는 올리고머 화합물인 압타머(aptamer)의 디자인에 사용될 수 있다.
본 발명의 바이시클릭 뉴클레오시드는, 이들이 혼입되는 올리고머 화합물의 요망되는 특성을 향상시키는 데 유용하다. 본 발명의 올리고머는 또한, 진단 용도에서 프라이머 및 프로브로서 유용할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 6-변형된 바이시클릭 뉴클레오시드는 하기에 나타낸 구조를 갖는다.
본 발명의 일면에서는, 하기 화학식 1을 갖는 바이시클릭 뉴클레오시드가 제공된다.
<화학식 1>
Figure 112008060828411-PCT00016
식 중,
Bx는 헤테로시클릭 염기 잔기이고;
T1은 H 또는 히드록실 보호기이며;
T2는 H, 히드록실 보호기 또는 반응성 인 기이고;
Z는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C1-C6 알킬리데닐, C3-C6 알케닐리데닐, 치환된 C1-C6 알킬, 치환된 C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알키닐, 치환된 C1-C6 알킬리데닐, 치환된 C3-C6 알케닐리데닐, 아실, 치환된 아실, 치환된 아미드, 티올 또는 치환된 티오이다.
일 실시양태에서, 치환된 기는 각각 독립적으로, 할로겐, 옥소, 히드록실, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 및 CN으로부터 독립적으로 선택된 임의로 보호된 치환기로 일치환 또는 다치환되고, 여기서 J1, J2 및 J3은 각각 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이고, X는 O, S 또는 NJ1이다.
본 발명의 일면에서는, 직교 보호된 반응성기를 가지며, 반응성 인 기를 추가로 포함하는 바이시클릭 뉴클레오시드가 제조된다. 이러한 바이시클릭 뉴클레오시드는 올리고머 합성을 위한 단량체로서 유용하다. 이러한 바이시클릭 뉴클레오시드 단량체의 일례는 하기 화학식을 갖는다.
Figure 112008060828411-PCT00017
식 중, 점선 박스로 둘러싸인 기는 가변적이다.
6번 위치의 기는 또한, S 배열로 제조될 수 있다 (R 및 S 표시는 가변적 위치의 기에 따라 달라질 수 있음을 인지함). 나타낸 바이시클릭 뉴클레오시드 단량체는 일반적으로 디메톡시트리틸 포스포라미다이트로서, 또는 보다 공식적으로는 IUPAC 명명법을 이용하여 (1S,3R,4R,6R,7S)-7-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피녹시]-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(우라실-1-일)-6-메틸-2,5-디옥사-바이시클로[2.2.1]헵탄으로서 지칭된다.
본 발명의 6-변형된 바이시클릭 뉴클레오시드는 하나 이상의 위치에서 달리 변형되지 않은 올리고머 화합물을 변형하는 데 유용하다. 이러한 변형된 올리고머 화합물은 특정 모티프를 갖는 것으로 설명될 수 있다. 본 발명에 적용가능한 모티프는, 갭을 갖는 모티프, 헤미머(hemimer) 모티프, 블록머(blockmer) 모티프, 완전 변형된 모티프, 위치 변형된 모티프 및 교호 모티프를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이들 모티프와 함께, 균일하게 또는 조합하여 사용되는 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 연결기를 비롯한 (이에 제한되지는 않음) 폭넓게 다양한 연결기가 또한 사용될 수 있다. 6-변형된 바이시클릭 뉴클레오시드의 위치 결정 및 연결 전략의 이용은 특정 표적에 대한 최선의 활성을 위해 용이하게 최적화될 수 있다. 대표적 모티프의 제조가 교시되어 있는 대표적 미국 특허로는, 미국 특허 제5,013,830호; 동 제5,149,797호; 동 제5,220,007호; 동 제5,256,775호; 동 제5,366,878호; 동 제5,403,711호; 동 제5,491,133호; 동 제5,565,350호; 동 제5,623,065호; 동 제5,652,355호; 동 제5,652,356호; 및 동 제5,700,922호가 포함되나 이에 제한되지는 않으며, 이들 중 특정 특허는 본원과 공동 소유이며, 이들은 각각 전체가 본원에 참고로 도입된다. 모티프는 또한, 국제 특허출원 제PCT/US2005/019219호 (2005년 6월 2일자로 출원되고, 2005년 12월 22일자로 WO 2005/121371로 공개됨) 및 동 제PCT/US2005/019220호 (2005년 6월 2일자로 출원되고, 2005년 12월 22일자로 WO 2005/121372로 공개됨)에 개시되어 있으며, 이들은 각각 전체가 본원에 참고로 도입된다.
용어 "안정한 화합물" 및 "안정한 구조"는, 반응 혼합물로부터 유용한 순도로의 단리 및 효능있는 치료제로의 제제화에서도 유지되도록 충분히 강력한 화합물을 나타낸다. 안정한 화합물만이 본원에서 고려된다.
본원에 기재된 화합물내의 소정의 치환체는 반복적 정도로 존재한다. 이러한 맥락에서, "반복적 치환체"는 치환체가 그 자체의 또다른 경우에 나타날 수 있음을 의미한다. 이러한 치환체의 반복적 특성으로 인해, 이론적으로, 임의의 주어진 청구항에서 다수가 존재할 수 있다. 의약품 화학 및 유기 화학 분야의 숙련자는 이러한 치환체의 총수는 의도된 화합물의 요망되는 특성에 의해 적절히 제한됨을 이해한다. 이러한 특성은, 예를 들어 (제한적이지 않음) 물리적 특성, 예컨대 분자량, 용해도 또는 log P, 적용 특성, 예컨대 의도된 표적에 대한 활성, 및 실용적 특성, 예컨대 합성의 용이성을 포함한다.
반복적 치환체는 본 발명의 의도적인 면이다. 의약품 화학 및 유기 화학 분야의 숙련자는 이러한 치환체의 다용도성을 이해한다. 본 발명의 청구의 범위에서 반복적 치환체가 존재하는 정도까지, 총수는 상기한 바와 같이 결정될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "알킬"은, 24개 이하의 탄소 원자를 함유하는 포화된 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 알킬기의 예로는, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 이소프로필, n-헥실, 옥틸, 데실, 도데실 등이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 알킬기는 전형적으로 1개 내지 약 24개의 탄소 원자, 보다 전형적으로는 1개 내지 약 12개의 탄소 원자 (C1-C12 알킬)를 포함하며, 1개 내지 약 6개의 탄소 원자를 갖는 것이 보다 바람직하다. 본원에서 사용된 용어 "저급 알킬"은 1개 내지 약 6개의 탄소 원자를 포함한다. 본원에서 사용된 알킬기는, 임의로는 하나 이상의 추가의 치환기를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "알케닐"은 24개 이하의 탄소 원자를 함유하고, 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소쇄 라디칼을 지칭한다. 알케닐기의 예로는, 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 1-메틸-2-부텐-1-일, 디엔, 예컨대 1,3-부타디엔 등이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 알케닐기는 전형적으로 2개 내지 약 24개의 탄소 원자, 보다 전형적으로는 2개 내지 약 12개의 탄소 원자를 포함하며, 2개 내지 약 6개의 탄소 원자를 갖는 것이 보다 바람직하다. 본원에서 사용된 알케닐기는, 임의로는 하나 이상의 추가의 치환기를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "알키닐"은 24개 이하의 탄소 원자를 함유하고, 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소쇄 라디칼을 지칭한다. 알키닐기의 예로는, 에티닐, 1-프로피닐, 1-부티닐 등이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 알키닐기는 전형적으로 2개 내지 약 24개의 탄소 원자, 보다 전형적으로는 2개 내지 약 12개의 탄소 원자를 포함하며, 2개 내지 약 6개의 탄소 원자를 갖는 것이 보다 바람직하다. 본원에서 사용된 알키닐기는, 임의로는 하나 이상의 추가의 치환기를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "아미노알킬"은 아미노 치환된 알킬 라디칼을 지칭한다. 이 용어는 임의의 위치에 아미노 치환체를 갖는 C1-C12 알킬기를 포함하는 의미를 가지며, 여기서 알킬기는 모(parent) 분자에 아미노알킬기를 결합시킨다. 아미노알킬기의 알킬 및/또는 아미노 부분은 치환기로 추가로 치환될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "지방족"은 24개 이하의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 지칭하며, 여기서 임의의 2개의 탄소 원자간의 포화는 단일, 이중 또는 삼중 결합이다. 지방족기는 바람직하게는 1개 내지 약 24개의 탄소 원자, 보다 전형적으로는 1개 내지 약 12개의 탄소 원자를 가지며, 1개 내지 약 6개의 탄소 원자를 갖는 것이 보다 바람직하다. 지방족기의 직쇄 또는 분지쇄에는, 질소, 산소, 황 및 인을 포함하는 하나 이상의 헤테로 원자가 개재될 수 있다. 헤테로원자가 개재된 이러한 지방족기로는, 폴리알콕시, 예컨대 폴리알킬렌 글리콜, 폴리아민 및 폴리이민이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 사용된 지방족기는 임의로는 추가의 치환기를 포함할 수 있다.
용어 "지환족" ("alicyclic" 또는 "alicyclyl")은 고리가 지방족인 시클릭 고리 시스템을 지칭한다. 고리 시스템은 하나 이상의 고리가 지방족인 하나 이상의 고리를 포함할 수 있다. 바람직한 지환족은, 고리내에 약 5개 내지 약 9개의 탄소 원자를 갖는 고리를 포함한다. 본원에서 사용된 지환족은 임의로는 추가의 치환기를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "알콕시"는 알킬기와 산소 원자 사이에서 형성된 라디칼을 지칭하며, 여기서 산소 원자는 알콕시기를 모 분자에 결합시키는 데 사용된다. 알콕시기의 예로는, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시, n-펜톡시, 네오펜톡시, n-헥속시 등이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 사용된 알콕시기는 임의로는 추가의 치환기를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "할로" 및 "할로겐"은 플루오르, 염소, 브롬 및 요오드로부터 선택된 원자를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "아릴" 및 "방향족"은, 하나 이상의 방향족 고리를 갖는 모노- 또는 폴리시클릭 카르보시클릭 고리 시스템 라디칼을 지칭한다. 아릴기의 예로는, 페닐, 나프틸, 테트라히드로나프틸, 인다닐, 인데닐 등이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 아릴 고리 시스템은 하나 이상의 고리내에 약 5개 내지 약 20개의 탄소 원자를 갖는다. 본원에서 사용된 아릴기는 임의로는 추가의 치환기를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "아르알킬" 및 "아릴알킬"은, 알킬기와 아릴기 사이에서 형성된 라디칼을 지칭하며, 여기서 알킬기는 아르알킬기를 모 분자에 결합시키는 데 사용된다. 그 예로는, 벤질, 페네틸 등이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 사용된 아르알킬기는 임의로는 이 라디칼기를 형성하는 알킬, 아릴 또는 두가지 기 모두에 결합된 추가의 치환기를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "헤테로시클릭 라디칼"은, 하나 이상의 헤테로원자를 포함하고, 불포화, 부분 포화 또는 완전 포화됨으로써 헤테로아릴기를 포함하는 모노-, 또는 폴리시클릭 고리 시스템의 라디칼을 지칭한다. 헤테로시클릭은 또한, 하나 이상의 접합 고리가 하나 이상의 헤테로원자를 함유하고, 다른 고리가 하나 이상의 헤테로 원자를 함유하거나 임의로는 헤테로원자를 함유하지 않을 수 있는 접합 고리 시스템을 포함하는 의미를 갖는다. 헤테로시클릭기는 전형적으로, 황, 질소 또는 산소로부터 선택된 하나 이상의 원자를 포함한다. 헤테로시클릭기의 예로는, [1,3]디옥솔란, 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라히드로푸릴 등이 포함된다. 본원에서 사용된 헤테로시클릭기는 임의로는 추가의 치환기를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "헤테로아릴" 및 "헤테로방향족"은 모노- 또는 폴리시클릭 방향족 고리, 고리 시스템 또는 접합 고리 시스템을 포함하며, 여기서 하나 이상의 고리가 방향족이고, 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 라디칼을 지칭한다. 헤테로아릴은 또한, 하나 이상의 접합 고리가 헤테로원자를 함유하지 않는 시스템을 포함하는 접합 고리 시스템을 포함하는 의미를 갖는다. 헤테로아릴기는 전형적으로, 황, 질소 또는 산소로부터 선택된 하나의 고리 원자를 포함한다. 헤테로아릴기의 예로는, 피리디닐, 피라지닐, 피리미디닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 이소옥사졸릴, 티아디아졸릴, 옥사디아졸릴, 티오페닐, 푸라닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조옥사졸릴, 퀴녹살리닐 등이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 헤테로아릴 라디칼은 지방족기 또는 헤테로원자 등의 연결 잔기를 통해 또는 직접 모 분자에 결합될 수 있다. 본원에서 사용된 헤테로아릴기는 임의로는 추가의 치환기를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "헤테로아릴알킬"은, 헤테로아릴알킬기를 모 분자에 결합시킬 수 있는 알킬 라디칼을 갖는 상기에 정의된 바와 같은 헤테로아릴기를 지칭한다. 그 예로는, 피리디닐메틸, 피리미디닐에틸, 나피리디닐프로필 등이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 사용된 헤테로아릴알킬기는 임의로는 헤테로아릴 또는 알킬 부분 중 하나 또는 둘 다에 추가의 치환기를 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "모노- 또는 폴리시클릭 구조"는, 접합되거나 연결된 고리를 갖는 폴리시클릭 또는 단일의 모든 고리 시스템을 포함하며, 개별적으로 지방족, 지환족, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬, 아릴알킬, 헤테로시클릭, 헤테로아릴, 헤테로방향족, 헤테로아릴알킬로부터 선택된 혼합 및 단일 고리 시스템을 포함하는 의미를 갖는다. 이러한 모노- 및 폴리시클릭 구조는 균일하거나, 또는 완전 포화, 부분 포화 또는 완전 불포화를 비롯한 다양한 포화도를 갖는 고리를 함유할 수 있다. 각각의 고리는 C, N, O 및 S로부터 선택된 고리 원자를 포함하여 헤테로시클릭 고리를 형성할 수 있을 뿐만 아니라, C 고리 원자만을 포함하는 고리를 형성할 수 있고, 이는 예를 들어 하나의 고리는 탄소 고리 원자만을 갖고, 접합 고리는 2개의 질소 원자를 갖는 벤즈이미다졸과 같이 혼합 모티프로 존재할 수 있다. 모노- 또는 폴리시클릭 구조는, 예를 들어 하나의 고리에 결합된 2개의 =O기를 갖는 프탈이미드와 같이 치환기로 추가로 치환될 수 있다. 또다른 면에서, 모노- 또는 폴리시클릭 구조는 직접 고리 원자를 통해, 치환기 또는 이관능성 연결 잔기를 통해 모 분자에 결합될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "아실"은, 유기산으로부터 히드록실기의 제거에 의해 형성된 라디칼을 지칭하며, 이는 화학식 -C(O)-X (식 중, X는 전형적으로 지방족, 지환족 또는 방향족임)를 갖는다. 그 예로는, 지방족 카르보닐, 방향족 카르보닐, 지방족 술포닐, 방향족 술피닐, 지방족 술피닐, 방향족 포스페이트, 지방족 포스페이트 등이 포함된다. 본원에서 사용된 아실기는 임의로는 추가의 치환기를 포함할 수 있다.
용어 "히드로카르빌"은 C, O 및 H를 포함하는 기를 포함한다. 임의의 포화도를 갖는 직쇄, 분지쇄 및 시클릭기가 포함된다. 이러한 히드로카르빌기는 N, O 및 S로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있고, 추가로 하나 이상의 치환기로 일치환 또는 다치환될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "치환체" 및 "치환기"는 요망되는 특성을 향상시키거나 요망되는 효과를 제공하기 위해 다른 기 또는 모 화합물에 전형적으로 첨가되는 기를 포함하는 의미를 갖는다. 치환기는 보호되거나 보호되지 않을 수 있고, 모 화합물내의 하나의 이용가능한 위치에 또는 많은 이용가능한 위치에 첨가될 수 있다. 치환기는 또한, 다른 치환기로 추가로 치환될 수 있고, 알킬 또는 히드로카르빌기 등의 연결기를 통해 또는 직접 모 화합물에 결합될 수 있다. 이러한 기로는, 할로겐, 히드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아실 (-C(O)Raa), 카르복실 (-C(O)O-Raa), 지방족 기, 지환족 기, 알콕시, 치환된 옥시 (-O-Raa), 아릴, 아르알킬, 헤테로시클릭, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 아미노 (-NRbbRcc), 이미노 (=NRbb), 아미도 (-C(O)N-RbbRcc 또는 -N(Rbb)C(O)Raa), 아지도 (-N3), 니트로 (-NO2), 시아노 (-CN), 카르바미도 (-OC(O)NRbbRcc 또는 -N(Rbb)C(O)ORaa), 우레이도 (-N(Rbb)C(O)NRbbRcc), 티오우레이도 (-N(Rbb)C(S)NRbbRcc), 구아니디닐 (-N(Rbb)C(=NRbb)NRbbRcc), 아미디닐 (-C(=NRbb)NRbbRcc 또는 -N(Rbb)C(NRbb)Raa), 티올 (-SRbb), 술피닐 (-S(O)Rbb), 술포닐 (-S(O)2Rbb), 술폰아미딜 (-S(O)2NRbbRcc 또는 -N(Rbb)-S(O)2Rbb) 및 콘쥬게이트기가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 여기서, Raa, Rbb 및 Rcc는 각각 독립적으로, H, 임의로 연결된 화학 관능기, 또는 추가의 치환기이며, 바람직한 목록은 H, 알킬, 알케닐, 알키닐, 지방족, 알콕시, 아실, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 지환족, 헤테로시클릭 및 헤테로아릴알킬을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "옥소"는 (=O)기를 지칭한다.
본원에 기재된 화합물 (예를 들어, 바이시클릭 뉴클레오시드)는, 예를 들어 하기 실시예에서 예시되는 바와 같이 유기 합성의 임의의 적용가능한 기술에 의해 제조할 수 있다. 많은 이러한 기술이 공지되어 있다. 그러나, 공지된 기술은 문헌 [Compendium of Organic Synthetic Methods (John Wiley & Sons, New York) (Vol. 1, Ian T. Harrison and Shuyen Harrison (1971); Vol. 2, Ian T. Harrison and Shuyen Harrison (1974); Vol. 3, Louis S. Hegedus and Leroy Wade (1977); Vol. 4, Leroy G. Wade Jr., (1980); Vol. 5, Leroy G. Wade Jr. (1984); 및 Vol. 6, Michael B. Smith)] 뿐만 아니라 문헌 [March, J., Advanced Organic Chemistry, 3rd Edition, John Wiley & Sons, New York (1985)]; [Comprehensive Organic Synthesis. Selectivity, Strategy & Efficiency in Modern Organic Chemistry, In 9 Volumes, Barry M. Trost, Editor-in-Chief, Pergamon Press, New York (1993)]; [Advanced Organic Chemistry, P art B: Reactions and Synthesis, 4th Ed.; Carey and Sundberg; Kluwer Academic/Plenum Publishers: New York (2001)]; [Advanced Organic Chemistry, Reactions, Mechanisms, and Structure, 2nd Edition, March, McGraw Hill (1977)]; [Protecting Groups in Organic Synthesis, 2nd Edition, Greene, T. W., and Wutz, P.G.M., John Wiley & Sons, New York (1991)]; 및 [Comprehensive Organic Transformations, 2nd Edition, Larock, R.C., John Wiley & Sons, New York (1999)]에 상술되어 있다.
본 발명의 일면에서는, 올리고머 화합물이 하나 이상의 콘쥬게이트기의 공유 결합에 의해 변형된다. 일반적으로, 콘쥬게이트기는 약역학, 약동학, 결합, 흡수, 세포 분포, 세포 흡수, 전하 및 제거율(clearance)을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 결합된 올리고머 화합물의 하나 이상의 특성을 변형시킨다. 콘쥬게이트기는 화학 업계에서 통용되며, 이는 올리고머 화합물과 같은 모 화합물에 임의의 연결 잔기 또는 연결기를 통해 또는 직접 연결된다. 콘쥬게이트기의 바람직한 목록은, 개재기, 정보제공(reporter) 분자, 폴리아민, 폴리아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 티오에테르, 폴리에테르, 콜레스테롤,티오콜레스테롤, 콜산 잔기, 폴레이트, 지질, 인지질, 비오틴, 페나진, 페난트리딘, 안트라퀴논, 아다만탄, 아크리딘, 플루오레세인, 로다민, 쿠마린 및 염료를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
당업계에 공지된 것들과 같은 연결기 또는 이관능성 연결 잔기를 본 발명에 적용가능하다. 연결기는 화학적 관능기, 콘쥬게이트기, 정보제공기 및 다른 기를, 예를 들어 올리고머 화합물과 같은 모 화합물내의 선택적 자리에 결합시키는 데 유용하다. 일반적으로, 이관능성 연결 잔기는 2개의 관능기를 갖는 히드로카르빌 잔기를 포함한다. 관능기 중 하나는 관심있는 모 분자 또는 화합물에 결합되도록 선택되고, 다른 하나는 화학적 관능기 또는 콘쥬게이트기와 같은 임의의 선택된 기에 본질적으로 결합되도록 선택된다. 일부 실시양태에서, 연결기는 에틸렌 글리콜 또는 아미노산 단위와 같은 반복 단위를 갖는 쇄 구조 또는 올리고머를 포함한다. 이관능성 연결 잔기에 통용되는 관능기의 예로는, 친핵성 기와 반응하기 위한 친전자체 및 친전자성 기와 반응하기 위한 친핵체가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 이관능성 연결 잔기는 아미노, 히드록실, 카르복실산, 티올, 불포화기 (예를 들어, 이중 또는 삼중 결합) 등을 포함한다. 이관능성 연결 잔기의 일부 비제한적 예로는, 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산 (ADO), 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC) 및 6-아미노헥산산 (AHEX 또는 AHA)이 포함된다. 다른 연결기로는, 치환된 C1-C10 알킬, 치환되거나 비치환된 C2-C10 알케닐 또는 치환되거나 비치환된 C2-C10 알키닐이 포함되나 이에 제한되지는 않으며, 여기서 바람직한 치환기의 비제한적 목록은, 히드록실, 아미노, 알콕시, 카르복시, 벤질, 페닐, 니트로, 티올, 티오알콕시, 할로겐, 알킬, 아릴, 알케닐 및 알키닐을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "보호기"는, 합성 절차 동안 원치않는 반응에 대해 히드록실, 아미노 및 티올기를 포함하나 이에 제한되지는 않는 반응성 기를 보호하는 것으로 당업계에 공지되어 있는 불안정(labile) 화학 잔기를 지칭한다. 보호기는 전형적으로, 다른 반응 자리에서의 반응 동안 자리를 보호하기 위해 선택적으로 및/또는 직교로 사용되고, 이어서 제거되어 있는 그대로의 또는 추가의 반응에 이용가능한 보호되지 않은 기를 남길 수 있다. 당업계에 공지된 보호기는, 문헌 [Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd edition, John Wiley & Sons, New York (1999)]에 일반적으로 기재되어 있다.
기는 전구체로서 본 발명의 올리고머 화합물내에 선택적으로 혼입될 수 있다. 예를 들어, 아미노기는 합성 중 원하는 시점에 아미노기로 화학적으로 전환될 수 있는 아지도기로서 본 발명의 화합물내에 배치될 수 있다. 일반적으로, 기는 적절한 시점에 이들의 최종 기로 전환되기 위해 모 분자의 다른 영역을 변형하는 반응에 대해 불활성인 전구체로서 존재하거나 보호된다. 추가의 대표적 보호기 또는 전구체 기는 문헌 [Agrawal, et al., Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Eds, Humana Press; New Jersey, 1994; Vol. 26 pp. 1-72]에 논의되어 있다.
히드록실 보호기의 예로는, 아세틸, t-부틸, t-부톡시메틸, 메톡시메틸, 테트라히드로피라닐, 1-에톡시에틸, 1-(2-클로로에톡시)에틸, p-클로로페닐, 2,4-디니트로페닐, 벤질, 2,6-디클로로벤질, 디페닐메틸, p-니트로벤질, 비스(2-아세톡시에톡시)메틸 (ACE), 2-트리메틸실릴에틸, 트리메틸실릴, 트리에틸실릴, t-부틸디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴, 트리페닐실릴, [(트리이소프로필실릴)옥시]메틸 (TOM), 벤조일포르메이트, 클로로아세틸, 트리클로로아세틸, 트리플루오로아세틸, 피발로일, 벤조일, p-페닐벤조일, 9-플루오레닐메틸 카르보네이트, 메실레이트, 토실레이트, 트리페닐메틸 (트리틸), 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸 (DMT), 트리메톡시트리틸, 1-(2-플루오로페닐)-4-메톡시피페리딘-4-일 (FPMP), 9-페닐크산틴-9-일 (픽실) 및 9-(p-메톡시페닐)크산틴-9-일 (MOX)이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 보다 바람직한 히드록실 보호기로는, 벤질, 2,6-디클로로벤질, t-부틸디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴, 벤조일, 메실레이트, 토실레이트, 디메톡시트리틸 (DMT), 9-페닐크산틴-9-일 (픽실) 및 9-(p-메톡시페닐)크산틴-9-일 (MOX)이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
아미노 보호기의 예로는, 카르바메이트-보호기, 예컨대 2-트리메틸실릴에톡시카르보닐 (Teoc), 1-메틸-1-(4-비페닐릴)-에톡시카르보닐 (Bpoc), t-부톡시카르보닐 (BOC), 알릴옥시카르보닐 (Alloc), 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 (Fmoc) 및 벤질옥시카르보닐 (Cbz); 아미드-보호기, 예컨대 포르밀, 아세틸, 트리할로아세틸, 벤조일 및 니트로페닐아세틸; 술폰아미드-보호기, 예컨대 2-니트로벤젠술포닐; 및 이민- 및 시클릭 이미드-보호기, 예컨대 프탈이미드 및 디티아숙시노일이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
티올 보호기의 예로는, 트리페닐메틸 (트리틸), 벤질 (Bn) 등이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 바람직한 실시양태에서, 올리고머 화합물은 뉴클레오시드를 임의로 보호된 인 함유 뉴클레오시드간 연결기와 연결시킴으로써 제조된다. 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 연결기와 같은 인 함유 뉴클레오시드간 연결기에 대한 대표적 보호기로는, β-시아노에틸, 디페닐실릴에틸, δ-시아노부테닐, 시아노 p-크실릴 (CPX), N-메틸-N-트리플루오로아세틸 에틸 (META), 아세톡시 페녹시 에틸 (APE) 및 부텐-4-일기가 포함된다. 예를 들어, 미국 특허 제4,725,677호 및 Re. 34,069 (β-시아노에틸); 문헌 [Beaucage, S.L. and Iyer, R.P., Tetrahedron, 49 No. 10, pp. 1925- 1963 (1993)]; [Beaucage, S.L. and Iyer, R.P., Tetrahedron, 49 No. 46, pp. 10441-10488 (1993)]; 및 [Beaucage, S.L. and Iyer, R.P., Tetrahedron, 48 No. 12, pp. 2223-2311 (1992)]를 참조한다.
본원에서 사용된 용어 "직교 보호된"은, 상이한 부류의 보호기로 보호되고, 보호기의 각 부류가 임의의 순서로, 또한 모든 다른 부류의 존재 하에 제거될 수 있는 관능기를 지칭한다 (문헌 [Barany, G. and Merrifield, R.B., J. Am. Chem. Soc, 1977, 99, 7363; idem, 1980, 102, 3084.] 참조). 직교 보호는, 예를 들어 자동화 올리고뉴클레오티드 합성에서 폭넓게 사용된다. 관능기는 블록해제 절차에 의해 영향받지 않는 하나 이상의 다른 보호된 관능기의 존재 하에 블록해제된다. 이러한 블록해제된 관능기는 일부 방식으로 반응하고, 일부 시점에 추가의 직교 보호기가 상이한 세트의 반응 조건 하에 제거된다. 이는 요망되는 화합물 또는 올리고머 화합물에 도달하도록 하는 선택적 화학을 가능하게 한다.
본 발명은, 예를 들어 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기를 비롯한 뉴클레오시드간 연결기를 형성하는 데 유용한 반응성 인 기를 갖는 화합물을 제공한다. 이러한 반응성 인 기는 당업계에 공지되어 있으며, 이는 포스포라미다이트, H-포스포네이트, 포스페이트 트리에스테르 및 인 함유 키랄 보조제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 PIII 및 PV 원자가 상태의 인 원자를 함유한다. 바람직한 합성 고체상 합성에서는 반응성 포스파이트로서 포스포라미다이트 ( (PIII 화학)를 사용한다. 이어서, 공지된 방법을 이용하여 중간체 포스파이트 화합물을 PV 상태로 산화시켜, 바람직한 실시양태에서는 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결기를 수득한다. 추가의 반응성 포스페이트 및 포스파이트는 문헌 [Tetrahedron Report Number 309 (Beaucage and Iyer, Tetrahedron, 1992, 48, 2223-2311)]에 개시되어 있다.
본 발명에서 유용한 올리고머 화합물의 구체적 예로는, 변형된, 예를 들어 비-천연 뉴클레오시드간 연결기를 함유하는 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 두가지 주요 부류의 뉴클레오시드간 연결기는 인 원자의 존재 또는 부재에 의해 정의된다. 인 원자를 갖는 변형된 뉴클레오시드간 연결기로는, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬 포스포트리에스테르, 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트 (3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트 포함), 포스피네이트, 포스포라미데이트 (3'-아미노 포스포라미데이트 및 아미노알킬포스포라미데이트, 티오노포스포라미데이트 포함), 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 셀레노포스페이트 및 보라노포스페이트 (노르말 3'-5' 연결기를 가짐), 이들의 2'-5' 연결 유사체, 및 역전된 극성을 갖는 것들이 포함되나, 이에 제한되지는 않으며, 여기서 하나 이상의 뉴클레오티드간 연결기는 3'-3', 5'-5' 또는 2'-2' 연결기이다. 역전된 극성을 갖는 올리고뉴클레오티드는 대부분의 3'- 뉴클레오티드간 연결기에서의 단일 3'-3' 연결기, 즉 탈염기성(abasic)일 수 있는 단일의 역전된 뉴클레오시드 잔기 (핵산염기가 결여되거나 그 대신에 히드록실기를 가짐)를 포함할 수 있다. 다양한 염, 혼합 염 및 유리 산 형태 또한 포함된다.
상기 인 함유 연결기의 제조가 교시되어 있는 대표적 미국 특허로는, 미국 특허 제3,687,808호; 동 제4,469,863호; 동 제4,476,301호; 동 제5,023,243호; 동 제5,177,196호; 동 제5,188,897호; 동 제5,264,423호; 동 제5,276,019호; 동 제5,278,302호; 동 제5,286,717호; 동 제5,321,131호; 동 제5,399,676호; 동 제5,405,939호; 동 제5,453,496호; 동 제5,455,233호; 동 제5,466,677호; 동 제5,476,925호; 동 제5,519,126호; 동 제5,536,821호; 동 제5,541,306호; 동 제 5,550,111호; 동 제5,563,253호; 동 제5,571,799호; 동 제5,587,361호; 동 제5,194,599호; 동 제5,565,555호; 동 제5,527,899호; 동 제5,721,218호; 동 제5,672,697 및 동 제5,625,050호가 포함되나 이에 제한되지는 않으며, 이들 중 특정 특허는 본원과 공동 소유이며, 이들은 각각 전체가 본원에 참고로 도입된다.
인 원자를 갖지 않는 변형된 뉴클레오시드간 연결기로는, 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연결기, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연결기, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 뉴클레오시드간 연결기에 의해 형성된 것들이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 이들은, 실록산 주쇄; 술피드, 술폭시드 및 술폰 주쇄; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 주쇄; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 주쇄; 리보아세틸 주쇄; 알켄 함유 주쇄; 술파메이트 주쇄; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 주쇄; 술포네이트 및 술폰아미드 주쇄; 아미드 주쇄를 갖는 것들; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 갖는 다른 것들을 포함한다.
상기 올리고뉴클레오시드의 제조가 교시되어 있는 대표적 미국 특허로는, 미국 특허 제5,034,506호; 동 제5,166,315호; 동 제5,185,444호; 동 제5,214,134호; 동 제5,216,141호; 동 제5,235,033호; 동 제5,264,562호; 동 제5,264,564호; 동 제5,405,938호; 동 제5,434,257호; 동 제5,466,677호; 동 제5,470,967호; 동 제5,489,677호; 동 제5,541,307호; 동 제5,561,225호; 동 제5,596,086호; 동 제5,602,240호; 동 제5,610,289호; 동 제5,602,240호; 동 제5,608,046호; 동 제5,610,289호; 동 제5,618,704호; 동 제5,623,070호; 동 제5,663,312호; 동 제5,633,360호; 동 제5,677,437호; 동 제5,792,608호; 동 제5,646,269호 및 동 제5,677,439호가 포함되나 이에 제한되지는 않으며, 이들 중 특정 특허는 본원과 공동 소유이며, 이들은 각각 본원에 참고로 도입된다.
본원에 기재된 화합물은 하나 이상의 비대칭 중심을 갖고, 따라서 거울상이성질체, 부분입체이성질체 및 절대 입체화학에 대하여 (R)- 또는 (S)-, α 또는 β로서, 또는 아미노산에서와 같이 (D)- 또는 (L)-로서 정의될 수 있는 다른 입체이성질체 형태를 형성한다. 본 발명은 이러한 가능한 모든 이성질체 뿐만 아니라 이들의 라세미체 및 광학적으로 순수한 형태를 포함하는 의미를 갖는다. 광학 이성질체는, 상기한 절차에 의해, 또는 라세미 혼합물을 분리함으로써 이들 각각의 광학 활성 전구체로부터 제조할 수 있다. 분리는 분리제의 존재 하에, 크로마토그래피에 의해 또는 반복된 결정화에 의해, 또는 당업자에게 공지되어 있는 이들 기술의 일부 조합에 의해 수행할 수 있다. 분리에 대한 추가의 상세사항은 문헌 [Jacques, et al., Enantiomers, Racemates, and Resolutions (John Wiley & Sons, 1981)]에서 찾아볼 수 있다. 본원에 기재된 화합물이 올레핀계 이중 결합, 다른 불포화기, 또는 다른 기하학적 비대칭 중심을 갖는 경우, 또한 달리 특정되지 않는 한, 화합물은 E 및 Z의 기하 이성질체 또는 시스- 및 트랜스-이성질체 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 모든 호변이성질체 형태 또한 포함되는 것으로 의도된다. 본원에서 나타나는 임의의 탄소-탄소 이중 결합의 배열은 단지 편의상 선택된 것이며, 본문에서 언급되지 않는 한 특정 배열을 나타내도록 의도되지 않고; 따라서 본원에서 임의대로 트랜스로서 나타낸 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-헤테로원자 이중 결합은 시스, 트랜스 또는 임의 비율의 이들 둘의 혼합물일 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "올리고머 화합물"은 핵산 분자에 혼성화될 수 있는 하나 이상의 영역을 갖는 중합체를 지칭한다. 용어 "올리고머 화합물"은 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 유사체 및 올리고뉴클레오시드 뿐만 아니라 뉴클레오티드 모방체 및/또는 핵산 및 비-핵산 성분을 포함하는 혼합 중합체를 포함한다. 올리고머 화합물은 통상적으로 선형으로 제조되지만, 결합되거나 다른 방식으로 제조되어 원형이 될 수 있고, 또한 분지쇄를 포함할 수 있다. 올리고머 화합물은, 예를 들어 2개의 가닥이 혼성화되어 이중가닥 조성물을 형성하는 것과 같이 이중가닥 구조를 형성할 수 있다. 이중가닥 조성물은 연결되거나 분리될 수 있고, 말단에 돌출부(overhang)를 포함할 수 있다. 일반적으로, 올리고머 화합물은 각각의 연결된 단량체 서브유닛이 직접적으로 또는 간접적으로 헤테로시클릭 염기 잔기에 결합된 연결된 단량체 서브유닛을 갖는 주쇄를 포함한다. 올리고머 화합물은 또한, 헤테로시클릭 염기 잔기에 연결되지 않음으로써 탈염기성 자리를 제공하는 단량체 서브유닛을 포함할 수 있다. 단량체 서브유닛을 결합시키는 연결기, 당 잔기 또는 대용물 및 헤테로시클릭 염기 잔기는 독립적으로 변형될 수 있다. 헤테로시클릭 염기를 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 연결기-당 단위는, 펩티드 헥산내의 단량체와 같은 모방체로 대체될 수 있다. 변형 능력 또는 치환체 부분 또는 올리고머 화합물의 각각의 위치에서의 전체 단량체는 다수의 가능한 모티프를 제공한다.
당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 뉴클레오시드는 염기-당 조합이다. 뉴클레오시드의 염기 부분은 통상적으로 헤테로시클릭 염기 잔기이다. 이러한 헤테로시클릭 염기의 가장 통상적인 두가지 부류는 퓨린 및 피리미딘이다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드의 당 부분에 공유 결합된 포스페이트기를 추가로 포함하는 뉴클레오시드이다. 펜토푸라노실 당을 포함하는 뉴클레오시드의 경우, 포스페이트기는 당의 2', 3' 또는 5' 히드록실 잔기에 연결될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 형성에 있어서, 포스페이트기는 인접한 뉴클레오시드를 서로 공유 결합시켜 선형 중합체 화합물을 형성한다. 이러한 선형 중합체 구조의 각각의 말단이 결합되어 혼성화에 의해 또는 공유 결합 형성에 의해 원형 구조를 형성할 수 있으나, 일반적으로는 개방된 선형 구조가 바람직하다. 올리고뉴클레오티드 구조내에서, 포스페이트기는 통상적으로 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드간 연결기를 형성하는 것으로서 언급된다. RNA 및 DNA의 통상적인 뉴클레오시드간 연결기는 3'-5' 포스포디에스테르 연결기이다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "올리고뉴클레오티드"는, 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA)의 올리고머 또는 중합체를 지칭한다. 이 용어는 천연 핵산염기, 당 및 뉴클레오시드간 공유 결합기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 용어 "올리고뉴클레오티드 유사체"는 하나 이상의 비-천연 부분을 갖는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 이러한 비-천연 올리고뉴클레오티드는 흔히, 예를 들어 향상된 셀 흡수, 핵산 표적에 대한 향상된 친화력 및 뉴클레아제 존재 하에서의 증가된 안정성 등의 바람직한 특성으로 인해 천연 형태보다 바람직하다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "올리고뉴클레오시드"는, 인 원자를 갖지 않는 뉴클레오시드간 연결기에 의해 결합된 일련의 뉴클레오시드를 지칭한다. 이러한 유형의 뉴클레오시드간 연결기는, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 혼합 헤테로원자 알킬, 혼합 헤테로원자 시클로알킬, 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 및 하나 이상의 단쇄 헤테로시클릭을 포함한다. 이들 뉴클레오시드간 연결기로는, 실록산, 술피드, 술폭시드, 술폰, 아세틸, 포름아세틸, 티오포름아세틸, 메틸렌 포름아세틸, 티오포름아세틸, 알케닐, 술파메이트, 메틸렌이미노, 메틸렌히드라지노, 술포네이트, 술폰아미드, 아미드, 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 갖는 다른 것들이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 올리고뉴클레오시드의 제조가 교시되어 있는 대표적 미국 특허로는, 미국 특허 제5,034,506호; 동 제5,166,315호; 동 제5,185,444호; 동 제5,214,134호; 동 제5,216,141호; 동 제 5,235,033호; 동 제5,264,562호; 동 제5,264,564호; 동 제5,405,938호; 동 제5,434,257호; 동 제5,466,677호; 동 제5,470,967호; 동 제5,489,677호; 동 제5,541,307호; 동 제5,561,225호; 동 제5,596,086호; 동 제5,602,240호; 동 제5,610,289호; 동 제5,602,240호; 동 제5,608,046호; 동 제5,610,289호; 동 제5,618,704호; 동 제5,623,070호; 동 제5,663,312호; 동 제5,633,360호; 동 제5,677,437호; 동 제5,792,608호; 동 제5,646,269호 및 동 제5,677,439호가 포함되나 이에 제한되지는 않으며, 이들 중 특정 특허는 본원과 공동 소유이며, 이들은 각각 본원에 참고로 도입된다.
본원에서 사용된 용어 "핵산염기" 또는 "헤테로시클릭 염기 잔기"는 "핵산 염기 또는 그의 모방체"와 동의어로 의도된다. 일반적으로, 핵산염기는 핵산의 염기에 수소 결합될 수 있는 하나 이상의 원자 또는 기를 함유하는 임의의 하부구조이다.
본원에서 사용된 "비변형된" 또는 "천연" 핵산염기는 퓨린 염기 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 및 피리미딘 염기 티민 (T), 시토신 (C) 및 우라실 (U)을 포함한다. 변형된 핵산염기는, 다른 합성 및 천연 핵산염기, 예컨대 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 히포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 (-C≡C-CH3) 우라실 및 시토신, 및 피리미딘 염기의 다른 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌, 일반 염기, 소수성 염기, 뒤섞인 염기, 크기 확장된 염기, 및 본원에서 정의된 바와 같은 플루오르화된 염기를 포함한다. 추가의 변형된 핵산염기는, 트리시클릭 피리미딘, 예컨대 페녹사진 시티딘 (1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤족사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘 (1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프, 예컨대 치환된 페녹사진 시티딘 (예를 들어 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-b][1,4]벤족사진-2(3H)-온), 카르바졸 시티딘 (2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘 (H-피리도[3',2':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온)을 포함한다. 변형된 핵산염기는 또한, 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로사이클로 치환된 것들, 예를 들어 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈을 포함할 수 있다. 추가의 핵산염기는, 미국 특허 제3,687,808호에 개시된 것들, 문헌 [The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990]에 개시된 것들, 문헌 [Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613]에 개시된 것들, 및 문헌 [Sanghvi, Y.S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S.T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993]에 개시된 것들을 포함한다.
변형된 핵산염기로는, 일반 염기, 소수성 염기, 뒤섞인 염기, 크기 확장된 염기, 및 본원에서 정의된 바와 같은 플루오르화된 염기가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 이들 핵산염기는, 본 발명의 올리고머 화합물의 결합 친화력을 증가시키는 데 특히 유용하다. 이들은, 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N- 2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린 (2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신 포함)을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은 핵산 이중가닥 안정성을 0.6 내지 1.2℃로 증가시키는 것으로 나타났고 (문헌 [Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278]), 이는 훨씬 더 특별하게는 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합되는 경우에 현재 바람직한 염기 치환이다.
상기한 특정 변형된 핵산염기 뿐만 아니라 다른 변형된 핵산염기의 제조가 교시되어 있는 대표적 미국 특허로는, 상기한 미국 특허 제3,687,808호 뿐만 아니라, 동 제4,845,205호; 동 제5,130,302호; 동 제5,134,066호; 동 제5,175,273호; 동 제5,367,066호; 동 제5,432,272호; 동 제5,457,187호; 동 제5,459,255호; 동 제5,484,908호; 동 제5,502,177호; 동 제5,525,711호; 동 제5,552,540호; 동 제5,587,469호; 동 제5,594,121호; 동 제5,596,091호; 동 제5,614,617호; 동 제5,645,985호; 동 제5,830,653호; 동 제5,763,588호; 동 제6,005,096호; 및 동 제5,681,941호가 포함되나 이에 제한되지는 않으며, 이들 중 특정 특허는 본원과 공동 소유이며, 이들은 각각 본원에 참고로 도입되며, 또한 본원과 공동 소유이며, 또한 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,750,692호가 포함된다.
본 발명의 올리고머 화합물은 또한, 변형된 당 잔기를 갖는 하나 이상의 뉴클레오시드를 함유할 수 있다. 푸라노실 당 고리는, 치환기로의 치환, 브릿징에 의한 BNA 형성 및 4'-O의 S 또는 N(R) 등의 헤테로원자로의 치환을 비롯한 많은 방식으로 변형될 수 있다. 이러한 변형된 당의 제조가 교시되어 있는 일부 대표적 미국 특허로는, 미국 특허 제4,981,957호; 동 제5,118,800호; 동 제5,319,080호; 동 제5,359,044호; 동 제5,393,878호; 동 제5,446,137호; 동 제5,466,786호; 동 제5,514,785호; 동 제5,519,134호; 동 제5,567,811호; 동 제5,576,427호; 동 제5,591,722호; 동 제5,597,909호; 동 제5,610,300호; 동 제5,627,053호; 동 제5,639,873호; 동 제5,646,265호; 동 제5,658,873호; 동 제5,670,633호; 동 제5,792,747호; 동 제5,700,920호; 동 제6,600,032호 및 국제 특허출원 제PCT/US2005/019219호 (2005년 6월 2일자로 출원되고, 2005년 12월 22일자로 WO 2005/121371로 공개됨)가 포함되나 이에 제한되지는 않으며, 이들 중 특정 특허는 본원과 공동 소유이며, 이들은 각각 전체가 본원에 참고로 도입된다. 바람직한 변형된 당의 대표적 목록은, 2'-F, 2'-OCH2 또는 2'-O(CH2)2-OCH3 치환기를 갖는 치환된 당; 4'-티오 변형된 당 및 바이시클릭 변형된 당을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용된 용어 "뉴클레오시드 모방체"는, 올리고머 화합물의 하나 이상의 위치에서 연결기가 아닌 염기 및 당 또는 당을 대체하는 데 사용되는 구조, 예컨대 모르폴리노 또는 바이시클로[3.1.0]헥실 당 모방체, 예를 들어 포스포디에스테르 연결기를 갖는 비-푸라노즈 당 단위를 갖는 뉴클레오시드 모방체를 포함하도록 의도된다. 용어 "당 대용물"은 약간 더 폭넓은 용어 "뉴클레오시드 모방체"와 겹쳐지지만, 이는 당 단위 (푸라노즈 고리)만의 대체를 나타내도록 의도된다. 용어 "뉴클레오티드 모방체"는, 올리고머 화합물의 하나 이상의 위치에서 뉴클레오시드 및 연결기를 대체하는 데 사용되는 구조, 예컨대 펩티드 핵산 또는 모르폴리노 (-N(H)-C(=O)-O- 또는 다른 비-포스포디에스테르 연결기에 의해 연결된 모르폴리노)를 포함하도록 의도된다.
본 발명에 따른 올리고머 화합물은, 약 8개 내지 약 80개의 뉴클레오시드 및/또는 변형된 뉴클레오시드 또는 길이에 있어서의 모방체를 포함할 수 있다. 당업자는 본 발명이 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 뉴클레오시드 및/또는 변형된 뉴클레오시드 또는 길이에 있어서의 모방체, 또는 이들내의 임의의 범위의 올리고머 화합물을 구현함을 인지할 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 올리고머 화합물은 8개 내지 40개의 뉴클레오시드 및/또는 변형된 뉴클레오시드 또는 길이에 있어서의 모방체이다. 당업자는 이것이 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개의 뉴클레오시드 및/또는 변형된 뉴클레오시드 또는 길이에 있어서의 모방체, 또는 이들내의 임의의 범위의 올리고머 화합물을 구현함을 인지할 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 올리고머 화합물은, 8개 내지 20개의 뉴클레오시드 및/또는 변형된 뉴클레오시드 또는 길이에 있어서의 모방체이다. 당업자는 이것이 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오시드 및/또는 변형된 뉴클레오시드 또는 길이에 있어서의 모방체, 또는 이들내의 임의의 범위의 올리고머 화합물을 구현함을 인지할 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 올리고머 화합물은, 10개 내지 16개의 뉴클레오시드 및/또는 변형된 뉴클레오시드 또는 길이에 있어서의 모방체이다. 당업자는 이것이 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 뉴클레오시드 및/또는 변형된 뉴클레오시드 또는 길이에 있어서의 모방체, 또는 이들내의 임의의 범위의 올리고머 화합물을 구현함을 인지할 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 올리고머 화합물은, 10개 내지 14개의 뉴클레오시드 및/또는 변형된 뉴클레오시드 또는 길이에 있어서의 모방체이다. 당업자는 이것이 10, 11, 12, 13 또는 14개의 뉴클레오시드 및/또는 변형된 뉴클레오시드 또는 길이에 있어서의 모방체, 또는 이들내의 임의의 범위의 올리고머 화합물을 구현함을 인지할 것이다.
키메라 올리고머 화합물은, 둘 이상의 위치에서 차별적으로 변형된 뉴클레오시드를 가지며, 이는 일반적으로 하나의 모티프를 갖는 것으로 정의된다. 본 발명의 키메라 올리고머 화합물은 상기한 바와 같은 둘 이상의 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 유사체, 올리고뉴클레오시드 및/또는 올리고뉴클레오티드 모방체를 갖는 복합 구조로서 형성될 수 있다. 이러한 혼성 구조체의 제조가 교시되어 있는 대표적 미국 특허로는, 미국 특허 제5,013,830호; 동 제5,149,797호; 동 제5,220,007호; 동 제5,256,775호; 동 제5,366,878호; 동 제5,403,711호; 동 제5,491,133호; 동 제5,565,350호; 동 제5,623,065호; 동 제5,652,355호; 동 제5,652,356호; 및 동 제5,700,922호가 포함되나 이에 제한되지는 않으며, 이들 중 특정 특허는 본원과 공동 소유이며, 이들은 각각 전체가 본원에 참고로 도입된다.
본 발명의 일면에서, 변형된 및 비변형된 뉴클레오시드 및 그의 모방체의 올리고머화는, 적절하게 DNA 합성에 대한 문헌 (문헌 [Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Ed. Agrawal (1993), Humana Press]) 및/또는 RNA 합성에 대한 문헌 (문헌 [Scaringe, Methods (2001), 23, 206-217]; [Gait et al., Applications of Chemically synthesized RNA in RNA:Protein Interactions, Ed. Smith (1998), 1-36]; [Gallo et al., Tetrahedron (2001), 57, 5707-5713])의 절차에 따라 수행된다. 추가의 고체상 합성 방법은, 미국 특허 제4,415,732호; 동 제4,458,066호; 동 제4,500,707호; 동 제4,668,777호; 동 제4,973,679호; 및 동 제5,132,418호 (Caruthers); 및 미국 특허 제4,725,677호 및 Re. 34,069 (Koster)에서 찾아볼 수 있다.
지지체 매질 기재의 올리고머 화합물 및 관련 화합물의 합성에 통용되는 상업적으로 입수가능한 장비는, 여러 공급업체, 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)에 의해 시판된다. 당업계에 공지된 이러한 합성을 위한 임의의 다른 수단을 추가로 또는 이를 대신하여 사용할 수 있다. 자동화 합성 기술을 비롯한 적합한 고체상 기술은, 문헌 [F. Eckstein (ed.), Oligonucleotides and Analogues, a Practical Approach, Oxford University Press, New York (1991)]에 기재되어 있다.
RNA 및 관련 유사체의 합성은, DNA 및 관련 유사체의 합성에 비해 RNAi 증가에 있어서의 노력으로 증가되어 왔다. 현재 상업적으로 사용되고 있는 주된 RNA 합성 전략은, 5'-O-DMT-2'-O-t-부틸디메틸실릴 (TBDMS), 5'-O-DMT-2'-O-[1-(2-플루오로페닐)-4-메톡시피페리딘-4-일] (FPMP), 2'-O-[(트리이소프로필실릴)옥시]메틸 (2'-O-CH2-O-Si(iPr)3 (TOM), 및 5'-O-실릴 에테르-2'-ACE (5'-O-비스(트리메틸실록시)시클로도데실옥시실릴 에테르 (DOD)-2'-O-비스(2-아세톡시에톡시)메틸 (ACE)을 포함한다. 현재 RNA 생성물을 공급하고 있는 주요 회사의 일부의 현재의 목록은, 피어스 뉴클레익 애시드 테크놀로지스(Pierce Nucleic Acid Technologies), 마르마콘 리서치 인코포레이티드(Dharmacon Research Inc.), 아메리 바이오테크놀로지스 인코포레이티드(Ameri Biotechnologies Inc.), 및 인테그레이티드 DNA 테크놀로지스, 인코포레이티드(Integrated DNA Technologies, Inc)를 포함한다. 하나의 회사인 프린스톤 세퍼레이션(Princeton Separations)은, 특히 TOM 및 TBDMS 화학과 함께 커플링 시간을 감소시키는 것으로 광고된 RNA 합성 활성화제를 판매 중이다. 이러한 활성화제 또한 본 발명에 적용가능하다.
시판되는 RNA 합성에 사용되는 주요 기는,
TBDMS = 5'-O-DMT-2'-O-t-부틸디메틸실릴;
TOM = 2'-O-[(트리이소프로필실릴)옥시]메틸;
DOD/ACE = (5'-O-비스(트리메틸실록시)시클로도데실옥시실릴 에테르-2'-O-비스(2-아세톡시에톡시)메틸
FPMP = 5'-O-DMT-2'-O-[1-(2-플루오로페닐)-4-메톡시피페리딘-4-일]이다.
상기한 RNA 합성 전략 모두 본 발명에 적용가능하다. 상기한 것의 혼성, 예를 들어 하나의 전략으로부터의 5 '-보호기와 함께 또다른 전략으로부터의 2'-O-보호를 사용하는 전략 또한 본 발명에 적용가능하다.
본 발명의 문맥에서, "혼성화"는, 올리고머 화합물의 상보성 가닥의 짝짓기를 의미한다. 본 발명에서, 하나의 짝짓기 메카니즘은, 올리고머 화합물의 가닥의 상보성 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 염기 (핵산염기) 사이의 수소 결합 (왓슨-크릭(Watson-Crick), 후그스틴(Hoogsteen) 또는 역 후그스틴 수소 결합일 수 있음)을 포함한다. 예를 들어, 아데닌 및 티민은 수소 결합 형성을 통해 짝짓기되는 상보성 핵산염기이다. 혼성화는 다양한 환경 하에 일어날 수 있다.
올리고머 화합물은 화합물의 표적 핵산으로의 결합이 표적 핵산의 정상적 기능을 방해하여 활성 손실을 일으키고, 특이적 결합이 요망되는 조건 하에, 즉 생체내 분석 또는 치료적 처치의 경우 생리적 조건 하에, 또한 시험관내 분석의 경우 분석이 수행되는 조건 하에 올리고머 화합물의 비-표적 핵산 서열로의 비특이적 결합이 회피되도록 충분한 정도의 상보성이 존재하는 경우에 특이적으로 혼성화가능하다.
본원에서 사용된 "상보성"은, 두 핵산염기의 위치에 관계없이 두 핵산염기의 정확한 짝짓기 능력을 지칭한다. 예를 들어, 올리고머 화합물의 특정 위치의 핵산이 표적 핵산 (표적 핵산은 DNA, RNA 또는 올리고뉴클레오티드 분자임)의 특정 위치의 핵산염기와 수소 결합할 수 있는 경우, 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이의 수소 결합 위치가 상보성 위치인 것으로 간주된다. 올리고머 화합물 및 추가의 DNA, RNA 또는 올리고뉴클레오티드 분자는, 각 분자내에 충분한 수의 상보성 위치가 서로 수소 결합될 수 있는 핵산염기에 의해 점유된 경우 서로 상보성이다. 따라서, "특이적으로 혼성화가능한" 및 "상보성"은, 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이에 안정하고 특이적인 결합이 일어나도록 하는 충분한 수의 핵산염기 상의 충분한 정도의 정확한 짝짓기 또는 상보성을 나타내는 데 사용되는 용어이다.
당업계에서는, 올리고머 화합물의 서열이 특이적으로 혼성화가능하게 되도록 그의 표적 핵산의 서열과 100% 상보성일 필요는 없다고 이해된다. 또한, 올리고뉴클레오티드가 하나 이상의 세그먼트 상에서 혼성화되어, 개재되거나 인접한 세그먼트가 혼성화 수행에 관여하지 않을 수 있다 (예를 들어, 루프 구조 또는 헤어핀 구조). 본 발명의 올리고머 화합물은 이들의 표적이 되는 표적 핵산 서열내의 표적 영역에 대해 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상보성을 포함할 수 있다. 예를 들어, 올리고머 화합물의 20개의 핵산염기 중 18개가 표적 영역에 대해 상보성이고, 따라서 특이적으로 혼성화되는 올리고머 화합물은 90%의 상보성을 나타낸다. 이러한 예에서, 나머지 비상보성 핵산염기는 상보성 핵산염기와 함께 군집을 형성하거나 산재될 수 있고, 이는 서로에게 또는 상보성 핵산염기에 인접할 필요는 없다. 따라서, 표적 핵산과 완전한 상보성을 갖는 2개의 영역의 측면에 있는 4개 (네개)의 비상보성 핵산염기를 갖는 길이에 있어 18개의 핵산염기인 올리고머 화합물은 표적 핵산과 77.8%의 전체적 상보성을 갖고, 따라서 이는 본 발명의 범위내에 포함된다. 올리고머 화합물과 표적 핵산의 영역과의 백분율 상보성은 통상적으로 당업계에 공지된 블라스트(BLAST) 프로그램 (기본적 국소 배열 검색 도구) 및 파워블라스트(PowerBLAST) 프로그램을 이용하여 측정한다 (문헌 [Altschul et al., J. MoI. Biol., 1990, 215, 403-410]; 및 [Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656]).
안티센스 올리고머 화합물, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 외부 유도 서열 (EGS) 올리고뉴클레오티드, 교대 스플라이서, 프라이머, 프로브, 및 표적 핵산의 적어도 일부에 혼성화되는 다른 올리고머 화합물 등의 올리고머 화합물이 또한 본 발명에 포함된다. 따라서, 이들 올리고머 화합물은 단일 가닥, 이중가닥, 원형 또는 헤어핀 올리고머 화합물 형태로 도입될 수 있고, 내부 또는 말단 융기부 또는 루프 등의 구조 요소를 함유할 수 있다. 본 발명의 올리고머 화합물이 시스템에 도입되면, 이는 표적 핵산의 변형이 수행되도록 하나 이상의 효소 또는 구조 단백질의 작용을 유도할 수 있다.
이러한 효소의 비제한적 일례는, RNA:DNA 이중가닥의 RNA 가닥을 절단하는 세포 엔도뉴클레아제인 RNAse H이다. "DNA 유사" 단일 가닥 올리고머 화합물은 RNAse H를 유도하는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 따라서, RNase H의 활성화로 인해 RNA 표적이 절단되고, 따라서 올리고뉴클레오티드 매개된 유전자 발현 억제 효율이 크게 향상된다. 유사한 역할인 RNase III 및 리보뉴클레아제 L군의 효소에서와 같이 다른 리보뉴클레아제에 대해 요구된다.
올리고머 화합물의 한가지 형태는 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드이지만, 많은 종에서, 이중가닥 RNA (dsRNA) 분자와 같은 이중가닥 구조의 도입이 강력한 특정 안티센스 매개된 유전자 또는 그와 관련된 유전자 생성물의 기능 감소를 유도하는 것으로 나타난다. 이러한 현상은 식물 및 동물 둘 다에서 나타나고, 이는 바이러스 방어 및 트랜스포손 활성제거(silencing)에 대한 진화적 관련성을 갖는 것으로 여겨진다.
일부 실시양태에서는, "적합한 표적 세그먼트"가 선택된 단백질의 발현을 조절하는 추가의 올리고머 화합물에 대한 스크린에 사용될 수 있다. "조절제"는 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 발현을 감소시키거나 증가시키고, 적합한 표적 세그먼트에 대해 상보성인 하나 이상의 8-핵산염기 부분을 포함하는 올리고머 화합물이다. 스크리닝 방법은, 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 적합한 표적 세그먼트를 하나 이상의 후보 조절제과 접촉시키는 단계, 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 발현을 감소시키거나 증가시키는 하나 이상의 후보 조절제를 선택하는 단계를 포함한다. 후보 조절제(들)이 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 발현을 조절할 (예를 들어 감소시키거나 증가시킬) 수 있는 것으로 나타나면, 그 조절제를 펩티드 기능에 대한 추가의 조사 연구에, 또는 본 발명에 따른 연구, 진단 또는 치료용 제제로서 사용하기 위해 이용할 수 있다.
본 발명의 적합한 표적 세그먼트는 또한, 본 발명의 이들 각각의 상보성 안티센스 올리고머 화합물과 조합되어 안정화된 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 형성할 수 있다. 당업계에서, 이러한 이중가닥 올리고뉴클레오티드 잔기는 표적 발현을 조절하고, 안티센스 메카니즘을 통해 번역 뿐만 아니라 RNA 프로세싱을 조절하는 것으로 나타났다. 또한, 이중가닥 잔기는 화학적으로 변형될 수 있다 (문헌 [Fire et al., Nature, 1998, 391, 806-811]; [Timmons and Fire, Nature 1998, 395, 854]; [Timmons et al., Gene, 2001, 263, 103-112]; [Tabara et al., Science, 1998, 282, 430-431]; [Montgomery et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 15502-15507]; [Tuschl et al., Genes Dev., 1999, 13, 3191-3197]; [Elbashir et al., Nature, 2001, 411, 494-498]; 및 [Elbashir et al., Genes Dev. 2001, 15, 188-200]). 예를 들어, 이러한 이중가닥 잔기는 표적에 대한 이중가닥의 안티센스 가닥의 전형적인 혼성화에 의해 표적을 억제하고, 따라서 표적의 효소적 분해를 유발하는 것으로 나타났다 (문헌 [Tijsterman et al., Science, 2002, 295, 694-697]).
본 발명의 올리고머 화합물은, 약물 발견 및 표적 확인 분야에 적용될 수 있다. 본 발명은 본원에서 확인된 올리고머 화합물 및 표적을 약물 발견 수행에 이용하여 단백질과 질병 상태, 표현형 또는 상태 사이에 존재하는 관계를 설명하는 것을 포함한다. 이들 방법은, 샘플, 조직, 세포 또는 유기체를 본 발명의 올리고머 화합물과 접촉시키고, 처리 후 일부 시점에 핵산, 또는 표적 및/또는 관련 표현형 또는 화학적 종점의 단백질 농도를 측정하고, 임의로는 측정된 값을 처리되지 않은 샘플 또는 추가의 본 발명의 올리고머 화합물로 처리한 샘플과 비교하는 것을 포함하는, 표적 펩티드를 검출 또는 조절하는 것을 포함한다. 또한, 이들 방법을 다른 실험과 병행 또는 조합하여 수행하여 표적 확인 과정을 위해 알려지지 않은 유전자의 기능을 측정하거나, 또는 특정 질병, 상태 또는 표현형의 치료 또는 예방을 위한 표적으로서의 특정 유전자 생성물의 유효성을 측정할 수 있다.
RNAi 활성에 대한 뉴클레오시드 변형의 효과는 기존의 문헌 (문헌 [Elbashir et al., Nature (2001), 411, 494-498]; [Nishikura et al., Cell (2001), 107, 415- 416]; 및 [Bass et al., Cell (2000), 101, 235-238])에 따라 평가한다.
본 발명의 올리고머 화합물은 진단제, 치료제, 예방제 및 연구용 시약 및 키트로서 사용될 수 있다. 또한, 당업자는 특정 유전자의 기능을 설명하기 위해, 또는 생물학적 경로의 다양한 요소의 기능을 구별하기 위해 적절한 특이성을 갖는 유전자 발현을 억제할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 흔히 사용한다.
본 발명의 올리고머 화합물을, 키트 및 진단에 사용하기 위해, 단독으로 또는 다른 올리고머 화합물 또는 치료제와 조합하여 시차 분석 및/또는 조합 분석에서의 도구로서 사용하여 세포 및 조직내에서 발현되는 유전자의 일부 또는 전체 보체의 발현 패턴을 설명할 수 있다.
비제한적 일례로서, 하나 이상의 올리고머 화합물로 처리된 세포 또는 조직내의 발현 패턴을 올리고머 화합물로 처리되지 않은 대조군 세포 또는 조직과 비교하고, 생성된 패턴을 유전자 발현의 농도 차이에 대해 분석하는데, 이는 이들이 예를 들어 질병 연계, 신호전달 경로, 세포 위치형성, 검사되는 유전자의 발현 수준, 크기, 구조 또는 기능에 관련됨에 따른 것이다. 이들 분석은 자극된 또는 비자극된 세포 상에서, 또한 발현 패턴에 영향을 주는 다른 화합물 및/또는 올리고머 화합물의 존재 또는 부재 하에 수행될 수 있다.
당업계에 공지된 유전자 발현 분석 방법의 예로는, DNA 어레이 또는 마이크로어레이 (문헌 [Brazma and Vilo, FEBS Lett., 2000, 480, 17-24]; [Celis, et al., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16]), SAGE (유전자 발현의 연속 분석) (문헌 [Madden, et al., Drug Discov. Today, 2000, 5, 415-425]), READS (분해된 cDNA의 제한 효소 증폭) (문헌 [Prashar and Weissman, Methods Enzymol., 1999, 303, 258-72]), TOGA (전체 유전자 발현 분석) (문헌 [Sutcliffe, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 1976-81]), 단백질 어레이 및 프로테오믹스(proteomics) (문헌 [Celis, et al., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16]; [Jungblut, et al., Electrophoresis, 1999, 20, 2100-10]), 발현 서열 표지 (EST) 서열분석 (문헌 [Celis, et al., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16]; [Larsson, et al., J. Biotechnol., 2000, 80, 143-57]), 감법 RNA 핑거프린팅 (SuRF) (문헌 [Fuchs, et al., Anal. Biochem., 2000, 286, 91-98]; [Larson, et al., Cytometry, 2000, 41, 203-208]), 감법 클로닝(subtractive cloning), 차동 디스플레이 (DD) (문헌 [Jurecic and Belmont, Curr. Opin. Microbiol., 2000, 3, 316-21]), 비교 유전체 혼성화 (문헌 [Carulli, et al., J. Cell Biochem. Suppl., 1998, 31, 286-96]), FISH (제자리 형광 혼성화) 기술 (문헌 [Going and Gusterson, Eur. J. Cancer, 1999, 35, 1895-904]) 및 질량 분광측정법 (문헌 [To, Comb. Chem. High Throughput Screen, 2000, 3, 235-41])이 포함된다.
본 발명의 올리고머 화합물은, 이들 올리고머 화합물이 단백질을 코딩하는 핵산에 대해 혼성화되기 때문에 연구 및 진단에 유용하다. 예를 들어, 효과적인 단백질 억제제가 되도록 하는 본원에 개시된 바와 같은 효율을 갖고 이러한 조건 하에 혼성화되는 것으로 나타난 올리고뉴클레오티드는 또한, 각각 유전자 증폭 또는 검출을 용이하게 하는 조건 하에 효과적인 프라이머 또는 프로브이다. 이들 프라이머 및 프로브는 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 특이적 검출을 필요로 하는 방법 및 추가 연구에서의 사용 또는 검출을 위한 핵산 분자의 증폭에서 유용하다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 프라이머 및 프로브의 혼성화는 당업계에 공지된 수단에 의해 검출될 수 있다. 이러한 수단은, 올리고뉴클레오티드에 대한 효소의 콘쥬게이트, 올리고뉴클레오티드의 방사선표지 또는 임의의 다른 적합한 검출 수단을 포함할 수 있다. 샘플내의 소정의 단백질의 농도를 검출하기 위한 이러한 검출 수단을 이용하는 키트를 제조할 수도 있다.
본 발명을 그의 특정 실시양태에 따라 구체적으로 설명하였으며, 하기 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위해 제공되는 것이며, 본 발명을 제한하도록 의도되지 않는다.
실시예 1
우리딘 6-(R)-메틸 BNA 포스포라미다이트, (1S,3R,4R,6R,7S)-7-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피녹시]-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(우라실-1-일)-6-메틸-2,5-디옥사-바이시클로[2.2.1]헵탄 (15)의 제조
Figure 112008060828411-PCT00018
(a) TBSCl, Et3N, DMAP, CH2Cl2, 실온, 16시간, 3의 경우 59%; (b) 스웨른(Swern) 산화 (c) MeMgBr, CeCl3, THF, -78℃, 3으로부터 80%; (d) MsCl, Et3N, DMAP, CH2Cl2, 실온, 16시간, 91%; (e) AcOH, Ac2O, H2SO4, 실온, 16시간, 88%; (f) 우라실, BSA, TMSOTf, CH3CN, 환류, 2시간; (g) K2CO3, MeOH, 실온, 16시간; (h) TBDPSCl, Et3N, DMAP, CH2Cl2, 실온, 16시간, 8로부터 79%; (i) BCl3, CH2Cl2, -15℃, 60%; (j) Et3N.3HF, Et3N, THF, 실온, 16시간; (k) DMTCl, 피리딘, 실온, 16시간, 12로부터 89%; (I) CNCH2CH2OP(N-iPr2)2, 테트라졸, NMI, DMF.
A) 5-O-(tert-부틸디메틸실릴)-3-O-벤질-1,2-O-이소프로필리덴-4-C-히드록시메틸-α-D-에리트로-펜토푸라노즈 (3)
디클로로메탄 (10 mL) 중의 tert-부틸디메틸실릴클로라이드 (6.24 g, 40.7 mmol)의 용액을 첨가 깔대기를 통해 10분 동안 CH2Cl2 (184 mL) 중의 디올 2 (12 g, 38.8 mmol, 문헌 [Moffatt et al, J. Org. Chem. 1979, 44, 1301, Ref. 1]의 절차에 따라 제조됨), 트리에틸아민 (11.44 mL, 81.5 mmol) 및 4-디메틸아미노에틸피리딘 (0.47 g, 3.9 mmol)의 저온 (0℃) 용액에 첨가하였다. 첨가가 완료된 후, 반응물을 점차 실온으로 가온시키고, 추가의 16시간 동안 교반하였다. 반응물을 CH2Cl2로 희석하고, 순차적으로 5% 수성 HCl, 포화 NaHCO3, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 10% 내지 30% EtOAc/헥산으로 용출)로 정제하여 알콜 3 (11.53 g, 59%) 및 알콜 4 (3.93 g, 22%)를 백색 고체로서 수득하였다.
B) 알콜 (6)
디메틸술폭시드 (3.36 mL, 47.5 mmol)를 CH2Cl2 (130 mL) 중의 옥살릴 클로라이드 (2.08 mL, 23.7 mmol)의 저온 (-78℃) 용액에 적가하였다. 30분 동안 교반한 후, CH2Cl2 (20 mL) 중의 알콜 3 (6.7 g, 15.8 mmol)의 용액을 반응물에 첨가하 였다. -78℃에서 45분 동안 교반을 계속하고, 트리에틸아민 (10.0 mL, 71.2 mmol)을 반응물에 첨가하였다. 반응물을 -78℃에서 15분 동안 교반하고, 그 후 빙조를 제거하고, 반응물을 45분 동안 점차 가온시켰다. 이어서, 반응물을 CH2Cl2 중에 붓고, 유기상을 순차적으로 5% 수성 HCl, 포화 NaHCO3, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켜 알데히드 5를 수득하고, 이를 임의의 추가 정제 없이 사용하였℃다.
THF (130 mL) 중의 염화세륨(III) (5.84 g, 23.7 mmol)의 현탁액을 실온에서 90분 동안 교반하였다. 반응물을 빙조에서 냉각시키고, 메틸 마그네슘 브로마이드 (THF 중의 1 M 용액 17.0 mL)를 5분 동안 첨가하고, 추가의 90분 동안 교반을 계속하였다. THF (20 mL) 중의 조 알데히드 5의 용액 (상기로부터 얻음)을 반응물에 첨가하였다. 추가의 90분 동안 교반한 후, 반응물을 포화 NH4Cl 용액으로 켄칭시키고, EtOAc내에 부었다. 유기층을 순차적으로 5% 수성 HCl, 포화 NaHCO3, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 15% EtOAc/헥산으로 용출)로 정제하여 알콜 6 (5.52 g, 3으로부터 80%)을 수득하였다.
C) 메실레이트 (7)
메탄술포닐 클로라이드 (0.55 mL, 7.0 mmol)를 CH2Cl2 (14 mL) 중의 알콜 6 (2.77 g, 6.4 mmol), 트리에틸아민 (1.1 mL, 7.7 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘 (84 mg, 0.7 mmol)의 저온 (0℃) 용액에 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 반응물을 CHCl3내에 붓고, 유기층을 순차적으로 5% 수성 HCl, 포화 NaHCO3, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 15% EtOAc/헥산으로 용출)로 정제하여 메실레이트 7 (2.97 g, 91%)을 수득하였다.
D) 트리아세테이트 (8)
농축 H2SO4 (3 방울)를 빙초산 (29 mL) 및 아세트산 무수물 (5.8 mL) 중의 메실레이트 7 (2.97 g, 5.8 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 반응물을 EtOAc내에 붓고, 유기층을 물, 포화 NaHCO3, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 33% 내지 50% EtOAc/헥산으로 용출)로 정제하여 트리아세테이트 8 (2.48 g, 88%)을 수득하였다.
Figure 112008060828411-PCT00019
E) 뉴클레오시드 (11)
N,O-비스(트리메틸실릴)아세트아미드 (4.9 mL, 20.0 mmol)를 CH3CN (15 mL) 중의 트리아세테이트 8 (2.47 g, 5.0 mmol) 및 우라실 (0.70 g, 6.3 mmol)의 현탁 액에 첨가하였다. 40℃에서 15분 동안 가열하여 투명한 용액을 얻은 후, 트리메틸실릴 트리플레이트 (1.18 mL, 6.5 mmol)를 반응물에 첨가하였다. 2시간 동안 환류시킨 후, 반응물을 실온으로 냉각시키고, EtOAc내에 부었다. 유기층을 포화 NaHCO3, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켜 조 뉴클레오시드 9를 수득하고, 이를 임의의 정제 없이 사용하였다.
K2CO3 (2.07 g, 15 mmol)을 MeOH (50 mL) 중의 뉴클레오시드 9 (상기로부터 얻음)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 용매를 진공 하에 제거하고, 잔류물을 25% 피리딘/EtOAc와 염수 사이에 분배하였다. 유기상을 수집하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켜 10을 수득하고, 이를 임의의 추가 정제 없이 사용하였다.
1H NMR (MeOD): δ 7.74 (d, 2H), 7.29-7.14 (m, 5H), 5.53 (d, 1H), 5.38 (s, 1H), 4.48 (s, 2H), 4.18 (s, 1H), 4.14 (sm, 1H), 3.92 (s, 1H), 3.66 (s, 2H), 1.08 (d, 3H). LCMS: 체류 시간 2.40분; M+H 계산치 360.1, 실측치 361.0.
tert-부틸디페닐실릴 클로라이드 (1.73 mL, 6.7 mmol)를 CH2Cl2 (9 mL) 중의 뉴클레오시드 10 (상기로부터 얻음), 트리에틸아민 (1.4 mL, 10.0 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘 (80 mg, 0.7 mmol)의 저온 (0℃) 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응물을 EtOAc내에 붓고, 유기상을 순차적으로 5% 수성 HCl, 포화 NaHCO3로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 50% EtOAc/헥산으로 용출)로 정제하여 뉴클레오시드 11 (2.02 g, 8로부터 79%)을 백색 고체로서 수득하였다.
F) 뉴클레오시드 (12)
삼염화붕소 (CH2Cl2 중의 1 M 용액 16.7 mL)을 CH2Cl2 (40 mL) 중의 뉴클레오시드 11 (2.0 g, 3.3 mmol)의 저온 (-15℃) 용액에 조심스럽게 첨가하였다. -15℃에서 1시간 동안 교반한 후, 반응물을 -78℃로 냉각시키고, MeOH/CH2Cl2 (1:1, 10 mL)를 첨가하여 조심스럽게 켄칭시켰다. 추가의 10분 동안 교반한 후, 반응물을 CH2Cl2내에 붓고, 유기상을 순차적으로 5% 수성 HCl, 포화 NaHCO3, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 50% 내지 80% EtOAc/헥산으로 용출)로 정제하여 뉴클레오시드 12를 백색 고체로서 수득하였다 (1.02 g, 60%).
G) 뉴클레오시드 (13)
트리에틸아민 트리히드로플루오라이드 (2.98 mL, 18.3 mmol)를 폴리프로필렌 튜브내의 THF (36 mL) 중의 뉴클레오시드 12 (1.86 g, 3.7 mmol) 및 트리에틸아민 (1.03 mL, 7.3 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응물을 진공 하에 농축시키고, 잔류물을 EtOAc 중에 용해시켰다. 유기층을 순차적으로 물, 포화 NaHCO3, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 15% MeOH/CHCl3)로 정제하여 뉴클레오시드 13 (1.31 g, 트리에틸아민으로 오염된 생성물)을 백색 고체로서 수득하였다.
H) 뉴클레오시드 (14)
4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드 (DMTCl) (1.23 g, 3.7 mmol)를 피리딘 (18 mL) 중의 뉴클레오시드 13 (상기로부터 얻음)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 추가의 DMTCl (0.12 g)을 반응물에 첨가하고, 추가의 8시간 동안 교반을 계속하였다. 이어서, 반응물을 EtOAc내에 붓고, 유기층을 순차적으로 염수로 추출하고, 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 15% 아세톤/CHCl3으로 용출)로 정제하여 뉴클레오시드 14 (1.85 g, 89%)를 백색 발포체로서 수득하였다.
Figure 112008060828411-PCT00020
I) 포스포라미다이트, (1S,3R,4R,6R,7S)-7-[2-시아노에톡시-(디이소프로필아미노)포스피녹시]-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(우라실-1-일)-6-메틸-2,5-디옥사-바이시클로[2.2.1]헵탄 (15)의 제조
2-시아노에틸 테트라이소프로필포로디아미다이트 (0.69 mL, 2.2 mmol)를 DMF (7.2 mL) 중의 뉴클레오시드 14 (0.83 g, 1.4 mmol), 테트라졸 (80 mg, 1.2 mmol) 및 N-메틸이미다졸 (29 ㎕, 0.36 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 8시간 동안 교반한 후, 반응물을 EtOAc내에 붓고, 유기층을 90% 염수, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 잔류물을 최소량의 EtOAc 중에 용해시키고, 이 용 액을 헥산에 첨가하였다. 생성된 침전물을 수집하고, 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 66% 내지 75% EtOAc/헥산으로 용출)로 추가로 정제하여 포스포라미다이트 15를 백색 고체로서 수득하였다 (1.04 g, 94%). 31P NMR (CDCl3) δ: 149.21, 149.79.
실시예 2
우리딘 N-Bz-시토신-6-(R)-메틸 BNA 포스포라미다이트, (1S,3R,4R,6R,7S)-7-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피녹시]-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(4-N-벤조일시토신-1-일)-6-메틸-2,5-디옥사-바이시클로[2.2.1]헵탄 (21)의 제조
Figure 112008060828411-PCT00021
(a) TBSCl, 이미다졸, DMF, 실온, 16시간, 99%; (b) POCl3, 1,2,4-트리아졸, Et3N, CH3CN, 실온, 4시간; (c) 수성 NH3, 1,4-디옥산, 실온, 16시간; (d) Bz2O, DMF, 실온, 16시간, 15로부터 90%; (e) Et3N.3HF, Et3N, THF, 실온, 16시간, 93%; (f) CNCH2CH2OP(N-iPr2)2, 테트라졸, NMI, DMF, 95%.
A) 뉴클레오시드 (16)
tert-부틸디메틸실릴 클로라이드 (0.79 g, 5.2 mmol)를 DMF (3.5 mL) 중의 뉴클레오시드 14 (1.0 g, 1.7 mmol) 및 이미다졸 (0.70 g, 10.4 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응물을 EtOAc내에 붓고, 유기상을 순차적으로 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 50% EtOAc/헥산으로 용출)로 정제하여 뉴클레오시드 16 (1.17 g, 99%)을 백색 고체로서 수득하였다.
B) 뉴클레오시드 (19)
옥시염화인 (1.27 mL, 13.6 mmol)을 CH3CN (21 mL) 중의 1,2,4-트리아졸 (4.0 g, 58.0 mmol)의 저온 (0℃) 현탁액에 첨가하였다. 15분 동안 교반한 후, 트리에틸아민 (9.57 mL, 68 mmol)을 반응물에 첨가하고, 30분 동안 교반을 계속하였다. 0℃에서 CH3CN (10 mL) 중의 뉴클레오시드 16 (1.17 g, 1.7 mmol)의 용액을 반응물에 첨가하였다. 10분 동안 교반한 후, 빙조를 제거하고, 반응물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 이어서, 용매를 진공 하에 제거하고, 잔류물을 EtOAc와 물 사이에 분배하였다. 이어서, 유기층을 포화 NaHCO3, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켜 조 화합물 17을 수득하고, 이를 임의의 추가 정제 없 이 사용하였다.
수성 암모니아 (4 mL)를 디옥산 (20 mL) 중의 뉴클레오시드 17 (상기로부터 얻음)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응물을 진공 하에 농축시키고, 고 진공 하에 8시간 동안 건조시켜 뉴클레오시드 18을 수득하고, 이를 임의의 추가 정제 없이 사용하였다.
벤조산 무수물 (0.65 g, 2.9 mmol)을 DMF (3 mL) 중의 뉴클레오시드 18 (상기로부터 얻음)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응물을 EtOAc내에 붓고, 유기층을 포화 NaHCO3, 염수로 추출하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 50% EtOAc/헥산으로 용출)로 정제하여 뉴클레오시드 19 (1.2 g, 16으로부터 90%)를 백색 고체로서 수득하였다.
C) 뉴클레오시드 (20)
트리에틸아민 트리히드로플루오라이드 (1.48 mL, 9.1 mmol)를 폴리프로필렌 튜브내의 THF (15 mL) 중의 뉴클레오시드 19 (1.86 g, 3.7 mmol) 및 트리에틸아민 (1.03 mL, 7.3 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응물을 진공 하에 농축시키고, 잔류물을 EtOAc 중에 용해시키고, 유기층을 순차적으로 물, 포화 NaHCO3, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 5% MeOH/CHCl3로 용출)로 정제하여 뉴클레오시드 20 (0.91 g, 90%)을 백색 고체로서 수득하였다.
Figure 112008060828411-PCT00022
D) (1S,3R,4R,6R,7S)-7-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피녹시]-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(4-N-벤조일시토신-1-일)-6-메틸-2,5-디옥사-바이시클로-[2.2.1]헵탄 (21)
2-시아노에틸 테트라이소프로필포로디아미다이트 (0.63 mL, 2.0 mmol)를 DMF (6.6 mL) 중의 뉴클레오시드 20 (0.89 g, 1.3 mmol), 테트라졸 (73 mg, 1.1 mmol) 및 N-메틸이미다졸 (26 ㎕, 0.33 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 8시간 동안 교반한 후, 반응물을 EtOAc내에 붓고, 유기층을 90% 염수, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 잔류물을 최소량의 EtOAc 중에 용해시키고, 이 용액을 헥산에 첨가하였다. 생성된 침전물을 수집하고, 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 75% 내지 90% EtOAc/헥산으로 용출)로 추가로 정제하여 포스포라미다이트 21을 백색 고체로서 수득하였다 (1.1 g, 95%). 31P NMR (CDCl3) δ: 149.34, 149.77.
실시예 3
우리딘-6-(S)-메틸 BNA 포스포라미다이트, (1S,3R,4R,6S,7S)-7-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피녹시]-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(우라실-1-일)-6-메틸-2,5-디옥사-바이시클로[2.2.1]헵탄 (38)의 제조
Figure 112008060828411-PCT00023
(a) NaH, 나프틸 브로마이드, DMF, 실온, 2시간, 98%; (b) 아세트산, H2O, 실온, 16시간; (c) NaIO4, 디옥산, H2O, 실온, 90분; (d) HCHO, NaOH, THF, H2O, 실온, 16시간, 22로부터 80%; (e) TBDPSCl, Et3N, DMAP, CH2Cl2, 실온, 16시간, 61%; (f) 옥살릴 클로라이드, DMSO, Et3N, -78℃; (g) MeMgBr, CeCl3, 26으로부터 89%; (h) 옥살릴 클로라이드, DMSO, Et3N, -78℃; (i) DiBAL, CH2Cl2, -78℃; (j) MsCl, Et3N, DMAP, CH2Cl2, 실온, 1시간; (k) Ac2O, AcOH, H2SO4, 28로부터 58%; (l) BSA, 우라실, TMSOTf, MeCN, 환류, 2시간; (m) K2CO3, MeOH, 실온, 16시간, 34로부터 76%; (n) DDQ, CH2Cl2, H2O, 실온, 8시간, 80%; (o) Et3N. 3HF, Et3N, THF, 정량; (p) DMTCl, 피리딘, 실온, 16시간, 86%; (q) CN(CH2)2OP(NiPr2)2, 테트라졸, NMI, DMF, 97%.
A) 알콜 (22)
수소화나트륨 (2.39 g, 59.8 mmol)을 상업적으로 입수가능한 DMF (75 mL) 중의 1,2,5,6-디-O-이소프로필리덴-α-D-알로푸라노즈 1 (12.0 g, 46 mmol)의 저온 (0℃) 용액에 조심스럽게 첨가하였다. 20분 동안 교반한 후, 나프틸 브로마이드 (11.12 g, 50.8 mmol)를 반응물에 첨가하고, 추가의 2시간 동안 교반을 계속하였다. 반응물을 H2O로 조심스럽게 켄칭시키고, 이어서 EtOAc내에 붓고, 유기층을 물, 염수로 세척하고, 건조시키고, 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 10% 내지 33% EtOAc/헥산)로 정제하여 알콜 22를 백색 고체로서 수득하였다 (18.1 g, 98%).
B) 디올 (25)
알콜 22 (18 g, 46 mmol)를 빙초산 (150 mL) 및 H2O (60 mL) 중에 용해시켰다. 반응물을 실온에서 16시간 동안 교반하고, 그 후 이를 진공 하에 농축시켰다. 이어서, 잔류물을 EtOAc 중에 용해시키고, 유기층을 포화 NaHCO3, 염수로 세척하고, 건조시키고, 농축시켜 조 화합물 23을 수득하고, 이를 임의의 추가 정제 없이 사용하였다.
물 (350 mL) 중의 나트륨 페리오데이트 (48 mmol, 10 g)의 용액을 1,4-디옥산 (140 mL) 중의 상기에서 얻어진 조 디올 23의 용액에 첨가하였다. 실온에서 90분 동안 교반한 후, 반응물을 EtOAc로 추출하고, 유기층을 추가로 물, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켜 알데히드 24를 수득하고, 이를 임의의 추가 정제 없이 사용하였다.
상기로부터의 조 알데히드 24를 THF:H2O의 혼합물 (1:1, 100 mL) 중에 용해시키고, 반응물을 빙조에서 냉각시켰다. 포름알데히드 (25 mL, 35% w/w) 및 1 N NaOH (100 mL)를 반응물에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 포름알데히드 (5 mL)를 반응물에 첨가하고, 추가의 32시간 동안 교반을 계속하였다. 이어서, 반응물을 건조물로 농축시키고, 잔류물을 EtOAc와 물 사이에 분배하였다. 층을 분리하고, 유기층을 추가의 1 N NaOH, 물, 염수로 세척하고, 건조시키고, 농축시켜 디올 25 (12.96 g, 80%, 3 단계)를 백색 고체로서 수득하였다.
C) 알콜 (26)
tert-부틸디페닐실릴 클로라이드 (0.75 mL, 2.9 mmol)를 디올 25 (1 g, 2.8 mmol) 및 트리에틸아민 (0.45 mL, 3.2 mmol)의 저온 (0℃) 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응물을 EtOAc내에 붓고, 순차적으로 5% HCl, 포 화 NaHCO3, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 10% 내지 40% EtOAc/헥산으로 용출)로 정제하여 알콜 26 (1.02 g, 61%)을 오일로서 수득하였다 (위치이성질체 실릴 보호된 디올 0.42 g을 또한 단리됨).
D) 알콜 (28)
디메틸술폭시드 (1.6 mL, 22.4 mmol)를 CH2Cl2 (70 mL) 중의 옥살릴 클로라이드 (0.98 mL, 11.2 mmol)의 저온 (-78℃) 용액에 적가하였다. 30분 동안 교반한 후, CH2Cl2 (20 mL) 중의 알콜 26 (4.8 g, 8.0 mmol)의 용액을 반응물에 첨가하였다. -78℃에서 45분 동안 교반을 계속하고, 트리에틸아민 (4.72 mL, 33.7 mmol)을 반응물에 첨가하였다. 반응물을 -78℃에서 15분 동안 교반하고, 그 후 빙조를 제거하고, 반응물을 45분 동안 점차 가온시켰다. 이어서, 반응물을 CH2Cl2내에 붓고, 유기상을 순차적으로 5% 수성 HCl, 포화 NaHCO3, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켜 알데히드 27을 수득하고, 이를 임의의 추가 정제 없이 사용하였다.
THF (50 mL) 중의 염화세륨(III) (2.96 g, 12.0 mmol)의 현탁액을 실온에서 90분 동안 교반하였다. 반응물을 빙조에서 냉각시키고, 메틸 마그네슘 브로마이드 (THF 중의 1.4 M 용액 8.6 mL, 12 mmol)를 5분 동안 첨가하고, 추가의 90분 동안 교반을 계속하고, 그 후 반응물을 -78℃로 냉각시켰다. THF (20 mL) 중의 조 알데히드 27 (상기로부터 얻음)의 용액을 반응물에 첨가하였다. 추가의 90분 동안 교 반한 후, 반응물을 포화 NH4Cl 용액으로 켄칭시키고, EtOAc내에 부었다. 유기층을 순차적으로 5% 수성 HCl, 포화 NaHCO3, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 20% EtOAc/헥산으로 용출)로 정제하여 알콜 28 (4.37 g, 26으로부터 89%)을 수득하였다.
E) 디아세테이트 (32)
디메틸술폭시드 (1.41 mL, 19.9 mmol)를 CH2Cl2 (70 mL) 중의 옥살릴 클로라이드 (0.87 mL, 10.0 mmol)의 저온 (-78℃) 용액에 적가하였다. 30분 동안 교반한 후, CH2Cl2 (20 mL) 중의 알콜 28 (4.35 g, 7.1 mmol)의 용액을 반응물에 첨가하였다. -78℃에서 45분 동안 교반을 계속하고, 트리에틸아민 (4.20 mL, 30.0 mmol)을 반응물에 첨가하였다. 반응물을 -78℃에서 15분 동안 교반하고, 그 후 빙조를 제거하고, 반응물을 45분 동안 점차 가온시켰다. 이어서, 반응물을 CH2Cl2내에 붓고, 유기상을 순차적으로 5% 수성 HCl, 포화 NaHCO3, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켜 케톤 29를 수득하고, 이를 임의의 추가 정제 없이 사용하였다.
디이소부틸 알루미늄 히드리드 (CH2Cl2 중의 1 M 용액 13.7 mL, 13.7 mmol)를 CH2Cl2 (15 mL) 중의 케톤 29 (상기로부터 얻음)의 저온 용액에 첨가하였다. -78℃에서 2시간 동안 교반한 후, 포화 NH4Cl을 첨가하여 반응물을 켄칭시키고, CHCl3내에 부었다. 이어서, 유기층을 순차적으로 5% 수성 HCl, 포화 NaHCO3, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켜 알콜 30을 수득하고, 이를 임의의 추가 정제 없이 사용하였다.
메탄술포닐 클로라이드 (0.11 mL, 1.4 mmol)를 CH2Cl2 (21 mL) 중의 알콜 30 (상기로부터 얻음), 트리에틸아민 (1.77 mL, 10.5 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘 (85 mg, 0.7 mmol)의 저온 (0℃) 용액에 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 반응물을 CHCl3내에 붓고, 유기층을 순차적으로 5% 수성 HCl, 포화 NaHCO3, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켜 메실레이트 31을 수득하고, 이를 임의의 정제 없이 사용하였다.
농축 H2SO4 (2 방울)를 빙초산 (15 mL) 및 아세트산 무수물 (3.0 mL) 중의 메실레이트 31 (상기로부터 얻음)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 반응물을 EtOAc내에 붓고, 유기층을 물, 포화 NaHCO3, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 20% 내지 33% EtOAc/헥산으로 용출)로 정제하여 디아세테이트 32 (3.0 g, 28로부터 58%)를 수득하였다.
F) 뉴클레오시드 (34)
N,O-비스(트리메틸실릴)아세트아미드 (3.45 mL, 14.0 mmol)를 CH3CN (20 mL) 중의 디아세테이트 32 (3.0 g, 4.1 mmol) 및 우라실 (0.57 g, 5.1 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 40℃에서 15분 동안 가열하여 투명한 용액을 얻은 후, 트리메틸실릴 트리플레이트 (0.95 mL, 5.3 mmol)를 반응물에 첨가하였다. 2시간 동안 환류시킨 후, 반응물을 실온으로 냉각시키고, EtOAc내에 부었다. 유기층을 포화 NaHCO3, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켜 조 뉴클레오시드 33을 수득하고, 이를 임의의 정제 없이 사용하였다.
K2CO3 (1.66 g, 12.0 mmol)을 MeOH (40 mL) 중의 뉴클레오시드 33 (상기로부터 얻음)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응물을 진공 하에 농축시키고, 잔류물을 25% 피리딘/EtOAc 중에 용해시키고, 염수로 추출하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 40% EtOAc/헥산으로 용출)로 정제하여 뉴클레오시드 34 (2.0 g, 32로부터 76%)를 백색 고체로서 수득하였다.
G) 뉴클레오시드 (35)
2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논 (DDQ) (1.4 g, 6.2 mmol)을 디클로로메탄 (30 mL) 및 H2O (1.5 mL) 중의 뉴클레오시드 34 (2.0 g, 3.1 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 3시간 동안 교반한 후, 추가의 DDQ (0.5 g)를 반응물에 첨가하였다. 추가의 10분 동안 교반한 후, 반응물을 진공 하에 농축시키고, 잔류물을 EtOAc 중에 용해시켰다. 이어서, 유기층을 순차적으로 물, 물:포화 NaHCO3 (1:1), 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 80% EtOAc/헥산)로 정제하여 뉴클레오시드 35 (1.25 g, 80%)를 백색 고체로서 수득하였다.
H) 뉴클레오시드 (36)
트리에틸아민 트리히드로플루오라이드 (2.4 mL, 14.7 mmol)를 폴리프로필렌 튜브내의 THF (25 mL) 중의 뉴클레오시드 35 (1.25 g, 2.5 mmol) 및 트리에틸아민 (1.0 mL, 7.4 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 24시간 동안 교반한 후, 반응물을 진공 하에 농축시키고, 잔류물을 EtOAc 중에 용해시켰다. 이어서, 유기층을 물, 포화 NaHCO3, 염수로 세척하고, 건조 및 농축시켰다. (Na2SO4). 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 5% 내지 10% MeOH/CHCl3로 용출)로 정제하여 뉴클레오시드 36 (0.88 g)을 백색 고체로서 수득하였다 (Et3N으로 오염된 생성물).
I) 뉴클레오시드 (37)
디메톡시트리틸 클로라이드 (0.91 g, 2.7 mmol)를 피리딘 (12 mL) 중의 뉴클레오시드 36 (상기로부터 얻음)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응물을 EtOAc내에 붓고, 유기층을 염수로 세척하고, 건조시키고, 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 90% EtOAc/헥산으로 용출)로 정제하여 뉴클레오시드 37 (1.28 g, 36으로부터 86%)를 백색 고체로서 수득하였다.
J) (1S,3R,4R,6S,7S)-7-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피녹시]-1- (4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(우라실-1-일)-6-메틸-2,5-디옥사-바이시클로[2.2.1]헵탄 (38)
2-시아노에틸 테트라이소프로필포로디아미다이트 (0.46 mL, 1.5 mmol)를 DMF (5 mL) 중의 뉴클레오시드 37 (0.59 g, 1.0 mmol), 테트라졸 (57 mg, 0.82 mmol) 및 N-메틸이미다졸 (20 ㎕, 0.25 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 8시간 동안 교반한 후, 반응물을 EtOAc내에 붓고, 유기층을 90% 염수, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 66% 내지 75% EtOAc/헥산으로 용출)로 정제하여 포스포라미다이트 38을 백색 고체로서 수득하였다 (0.75 g, 97%). 31P NMR (CDCl3) δ: 149.36, 149.53.
실시예 4
N-Bz-시토신-6-(S)-메틸 BNA 포스포라미다이트, (1S,3R,4R,6S,7S)-7-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피녹시]-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(4-N-벤조일시토신-1-일)-6-메틸-2,5-디옥사-바이시클로[2.2.1]헵탄 (44)의 제조
Figure 112008060828411-PCT00024
(a) TBSCl, Et3N, DMAP, CH2Cl2, 실온, 16시간, 97%; (b) POCl3, 1,2,4-트리아졸, Et3N, CH3CN, 실온, 4시간; (c) 수성 NH3, 1,4-디옥산, 실온, 16시간; (d) Bz2O, DMF, 실온, 16시간, 39로부터 91%; (e) Et3N.3HF, Et3N, THF, 실온, 16시간, 87%; (f) CNCH2CH2OP(N-iPr2)2, 테트라졸, NMI, DMF, 90%.
A) 뉴클레오시드 (39)
tert-부틸디메틸실릴 클로라이드 (0.45 g, 3.0 mmol)를 DMF (2 mL) 중의 뉴클레오시드 37 (0.59 g, 1.0 mmol) 및 이미다졸 (0.41 g, 6.0 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응물을 EtOAc내에 붓고, 유기상을 순차적으로 염수로 추출하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켰다. 컬럼 크 로마토그래피 (SiO2, 50% EtOAc/헥산으로 용출)로 정제하여 뉴클레오시드 39 (0.68 g, 97%)를 백색 고체로서 수득하였다.
B) 뉴클레오시드 (42)
옥시염화인 (0.74 mL, 8.0 mmol)을 CH3CN (16 mL) 중의 1,2,4-트리아졸 (2.35 g, 34.0 mmol)의 저온 (0℃) 현탁액에 첨가하였다. 15분 동안 교반한 후, 트리에틸아민 (5.6 mL, 40 mmol)을 반응물에 첨가하고, 30분 동안 교반을 계속하였다. 0℃에서 CH3CN (7 mL) 중의 뉴클레오시드 39 (0.68 g, 1.0 mmol)의 용액을 반응물에 첨가하였다. 10분 동안 교반한 후, 빙조를 제거하고, 반응물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 이어서, 용매를 진공 하에 제거하고, 잔류물을 EtOAc와 물 사이에 분배하였다. 이어서, 유기층을 포화 NaHCO3, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켜 조 화합물 40을 수득하고, 이를 임의의 추가 정제 없이 사용하였다.
수성 암모니아 (2.5 mL)를 디옥산 (12 mL) 중의 뉴클레오시드 40 (상기로부터 얻음)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응물을 진공 하에 농축시키고, 고 진공 하에 8시간 동안 건조시켜 뉴클레오시드 41을 수득하고, 이를 임의의 추가 정제 없이 사용하였다.
벤조산 무수물 (0.38 g, 1.7 mmol)을 DMF (2 mL) 중의 뉴클레오시드 41 (상기로부터 얻음)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응물을 EtOAc내에 붓고, 유기층을 포화 NaHCO3, 염수로 추출하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 50% EtOAc/헥산으로 용출)로 정제하여 뉴클레오시드 42 (0.72 g, 39로부터 91%)를 백색 고체로서 수득하였다.
C) 뉴클레오시드 (43)
트리에틸아민 트리히드로플루오라이드 (0.89 mL, 5.5 mmol)를 폴리프로필렌 튜브내의 THF (9 mL) 중의 뉴클레오시드 42 (0.72 g, 0.91 mmol) 및 트리에틸아민 (0.30 mL, 2.2 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응물을 진공 하에 농축시키고, 잔류물을 EtOAc 중에 용해시키고, 유기층을 순차적으로 물, 포화 NaHCO3, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 25% 내지 40% 아세톤/CHCl3로 용출)로 정제하여 뉴클레오시드 43 (0.53 g, 87%)을 백색 고체로서 수득하였다.
Figure 112008060828411-PCT00025
D) (1S,3R,4R,6S,7S)-7-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피녹시]-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(4-N-벤조일시토신-1-일)-6-메틸-2,5-디옥사-바이시클로[2.2.1]헵탄 (44)
2-시아노에틸 테트라이소프로필포로디아미다이트 (0.37 mL, 1.2 mmol)를 DMF (4 mL) 중의 뉴클레오시드 43 (0.89 g, 1.3 mmol), 테트라졸 (43 mg, 0.63 mmol) 및 N-메틸이미다졸 (16 ㎕, 0.20 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 8시간 동 안 교반한 후, 반응물을 EtOAc내에 붓고, 유기층을 90% 염수, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 75% 내지 90% EtOAc/헥산으로 용출)로 정제하여 포스포라미다이트 44를 백색 고체로서 수득하였다 (0.61 g, 90%).
실시예 5
(1S,3R,4R,6S,7S)-7-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피녹시]-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(6-N-벤조일아데닌-9-일)-6-메틸-2,5-디옥사-바이시클로[2.2.1]헵탄 (51)
Figure 112008060828411-PCT00026
(a) 6-N-벤조일아데닌, BSA, TMSOTf, DCE, 환류, 8시간; (b) K2CO3, MeOH, 실온, 16시간, 32로부터 73%; (c) Bz2O, DMF, 실온; (d) DDQ, CH2Cl2, H2O, 실온; (e) Et3N.3HF, Et3N, THF, 실온, 16시간; (f) DMTCl, 피리딘, 실온, 16시간; (g) CNCH2CH2OP(N-iPr2)2, 테트라졸, NMI, DMF.
A) 뉴클레오시드 (46)
N,O-비스(트리메틸실릴)아세트아미드 (1.1 mL, 4.50 mmol)를 디클로로에탄 (14 mL) 중의 디아세테이트 32 (1.0 g, 1.4 mmol) 및 6-N-벤조일아데닌 (0.48 g, 2.0 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 45분 동안 환류시킨 후에 반응 혼합물이 투명해졌고, 이를 빙조에서 냉각시키고, 트리메틸실릴 트리플레이트 (0.49 mL, 2.7 mmol)를 첨가하였다. 8시간 동안 환류시킨 후, 반응물을 실온으로 냉각시키고, EtOAc내에 부었다. 유기층을 포화 NaHCO3 및 염수로 세척하고, 이어서 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켜 조 뉴클레오시드 45를 수득하고, 이를 정제 없이 사용하였다.
K2CO3 (0.38 g, 2.7 mmol)을 MeOH (14 mL) 중의 뉴클레오시드 45 (상기로부터 얻음)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 24시간 동안 교반한 후, 반응물을 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 EtOAc 중에 현탁시키고, 물 및 염수로 추출하고, 이어서 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 1 내지 2.5% MeOH/CHCl3으로 용출)로 정제하여 뉴클레오시드 46을 백색 고체로서 수득하였다 (0.69 g, 32로부터 73%).
B) 뉴클레오시드 47
뉴클레오시드 47를 무수 DMF 중의 벤조산 무수물 (1.5 내지 2 당량)과의 반응에 의해 뉴클레오시드 46으로부터 제조하였다.
C) 포스포라미다이트 51
뉴클레오시드 34로부터의 포스포라미다이트 38에 대해 실시예 3에 예시된 절차를 이용하여 뉴클레오시드 47로부터 스포라미다이트 51을 제조하였다.
실시예 6
(1S,3R,4R,6R,7S)-7-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피녹시]-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(6-N-벤조일아데닌-9-일)-6-메틸-2,5-디옥사-바이시클로[2.2.1]헵탄 (60)
Figure 112008060828411-PCT00027
(a) MsCl, Et3N, DMAP, CH2Cl2, 실온, 4시간; (b) Ac2O, AcOH, 촉매 H2SO4, 실온, 3시간, 28로부터 87%; (c) 6-N-벤조일아데닌, BSA, TMSOTf, DCE, 환류, 2시간; (d) K2CO3, MeOH, 실온, 16시간; (e) Bz2O, DMF, 실온; (f) DDQ, CH2Cl2, H2O, 실온; (g) Et3N.3HF, Et3N, THF, 실온, 16시간; (h) DMTCl, 피리딘, 실온, 16시간; (i) CNCH2CH2OP(N-iPr2)2, 테트라졸, NMI, DMF.
A) 디아세테이트 (52)
메탄술포닐 클로라이드 (1.33 mL, 16.8 mmol)를 디클로로메탄 (25 mL) 중의 알콜 28 (7.37 g, 12.0 mmol), 트리에틸아민 (2.82 mL, 20.2 mmol) 및 DMAP (0.20 g, 1.1 mmol)의 저온 (0℃) 용액에 적가하였다. 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 반응물을 디클로로메탄으로 희석하고, 유기층을 5% HCl, 포화 중탄산나트륨 용액, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 이렇게 수득된 조 메실레이트 52를 추가의 정제 없이 사용하였다.
B) 디아세테이트 (53)
농축 황산 (10 방울)을 아세트산 무수물 (7.2 mL) 및 아세트산 (36 mL) 중의 메실레이트 52 (상기로부터 얻음)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 반응물을 고 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트 중에 용해시키고, 유기층을 조심스럽게 물, 포화 중탄산나트륨 용액 (pH가 8 초과가 될 때까지) 및 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로 마토그래피 (SiO2, 25 내지 35% EtOAc/헥산으로 용출)로 정제하여 디아세테이트 53 (7.66 g, 28로부터 87%)을 점성 오일로서 수득하였다.
C) 포스포라미다이트 (60)
디아세테이트 32로부터의 포스포라미다이트 51에 대해 실시예 3에 예시된 절차를 이용하여 디아세테이트 53으로부터 포스포라미다이트 60을 제조하였다.
실시예 7
(1S,3R,4R,6S,7S)-7-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피녹시]-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(2-N-이소부티릴구아닌-9-일)-6-메틸-2,5-디옥사-바이시클로[2.2.1]헵탄 (67)
Figure 112008060828411-PCT00028
(a) 2-아미노-6-클로로퓨린, BSA, TMSOTf, DCE, 환류, 2시간; (b) 3-히드록시프로피오니트릴, NaH, THF, 4시간, 32로부터 82%; (c) 이소부티르산 무수물, DMAP, DMF, 60℃, 24시간, 71%; (d) DDQ, CH2Cl2, H2O, 실온, 16시간, 91%; (e) Et3N.3HF, Et3N, THF, 실온, 16시간, 97%; (f) DMTCl, 피리딘, 실온, 16시간, 85%; (g) CNCH2CH2OP(N-iPr2)2, 테트라졸, NMI, DMF.
A) 뉴클레오시드 (61)
N,O-비스(트리메틸실릴)아세트아미드 (3.8 mL, 15.5 mmol)를 디클로로에탄 (46 mL) 중의 디아세테이트 32 (3.44 g, 4.7 mmol) 및 2-아미노-6-클로로퓨린 (1.18 g, 7.0 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 45분 동안 환류시켜 투명한 용액을 얻은 후, 반응물을 빙조에서 냉각시키고, 트리메틸실릴 트리플레이트 (1.69 mL, 9.4 mmol)를 첨가하였다. 8시간 동안 환류시킨 후, 반응물을 실온으로 냉각시키고, 클로로포름내에 부었다. 유기층을 포화 NaHCO3 및 염수로 세척하고, 이어서 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켜 조 뉴클레오시드 61을 수득하고, 이를 정제 없이 사용하였다.
B) 뉴클레오시드 (62)
3-히드록시프로피오니트릴 (1.67 mL, 24.5 mmol)을 무수 THF (10 mL) 중의 수소화나트륨 (1.07 g, 27.0 mmol, 60% w/w)의 교반 현탁액에 적가하였다. 20분 동안 교반한 후, 무수 THF (25 mL) 중의 조 뉴클레오시드 61 (상기로부터 얻음)의 용액을 첨가하였다. 실온에서 5시간 동안 교반을 계속하고, 그 후, 포화 염화암모늄 용액을 첨가함으로써 반응물을 조심스럽게 켄칭시켰다. 반응물을 에틸 아세테 이트내에 붓고, 유기층을 염수로 추출하고, 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, CHCl3 내지 2.5% MeOH/CHCl3으로 용출)로 정제하여 뉴클레오시드 62 (3.18 g, 32로부터 82%)를 담갈색 고체로서 수득하였다.
C) 뉴클레오시드 (63)
이소부티르산 무수물 (1.5 mL, 9.3 mmol)을 DMF (27 mL) 중의 뉴클레오시드 62 (3.19 g, 4.6 mmol) 및 4-디메틸아미노메틸피리딘 (0.11 g, 0.93 mmol)의 용액에 첨가하였다. 60℃에서 14시간 동안 교반한 후, 추가량의 이소부티르산 무수물 (1.5 mL, 9.3 mmol)을 반응물에 첨가하고, 60℃에서 추가의 12시간 동안 교반을 계속하였다. 반응물을 실온으로 냉각시키고, EtOAc로 희석하고, 유기층을 물, 포화 중탄산나트륨 용액, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 5% 내지 10% 아세톤/CHCl3)로 정제하여 뉴클레오시드 63 (2.5 g, 71%)을 황색 발포체로서 수득하였다.
D) 뉴클레오시드 (64)
DDQ (1.12 g, 5.0 mmol)를 디클로로메탄 (33 mL) 및 H2O (1.7 mL) 중의 뉴클레오시드 63 (2.5 g, 3.3 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 추가의 DDQ (1.0 g)를 첨가하였다. 실온에서 추가의 6시간 동안 교반을 계속하고, 그 후, 반응물을 냉장고 (4℃)에 16시간 동안 저장하였다. 이어서, 반응물을 진공 하에 농축시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트 중에 용해시켰다. 유기층 을 물, 10% 중아황산나트륨 용액 (2x), 포화 중탄산나트륨 용액 및 염수로 세척하고, 이어서 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 5% MeOH/CHCl3로 용출)로 정제하여 뉴클레오시드 64 (1.84 g, 91%)를 수득하였다.
E) 뉴클레오시드 (65)
트리에틸아민 트리히드로플루오라이드 (2.88 mL, 17.9 mmol)를 폴리프로필렌 튜브내의 THF (30 mL) 중의 뉴클레오시드 64 (1.84 g, 3.0 mmol) 및 트리에틸아민 (1.25 mL, 8.9 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 24시간 동안 교반한 후, 반응물을 진공 하에 농축시키고, 잔류물을 EtOAc내에 부었다. 이어서, 유기층을 물, 포화 NaHCO3 및 염수로 세척하고, 이어서 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 5% 내지 10% MeOH/CHCl3으로 용출)로 정제하여 뉴클레오시드 65 (1.05 g, 97%)를 백색 고체로서 수득하였다.
F) 뉴클레오시드 (66)
디메톡시트리틸 클로라이드 (1.07 g, 3.2 mmol)를 피리딘 (13 mL) 중의 뉴클레오시드 65 (1.00 g, 2.7 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응물을 EtOAc내에 붓고, 유기층을 염수로 세척하고, 건조시키고, 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 2.5 내지 5% MeOH/CHCl3으로 용출)로 정제하여 뉴클레오시드 66 (1.52 g, 85%)을 백색 발포체로서 수득하였다.
G) (1S,3R,4R,6S,7S)-7-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피녹시]-1- (4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(2-N-이소부티릴구아닌-9-일)-6-메틸-2,5-디옥사-바이시클로[2.2.1]헵탄 (67)
2-시아노에틸 테트라이소프로필포스포르디아미다이트 (1.06 mL, 3.4 mmol)를 DMF (11 mL) 중의 뉴클레오시드 66 (1.52 g, 2.2 mmol), 테트라졸 (0.12 g, 1.7 mmol) 및 N-메틸이미다졸 (45 ㎕, 0.56 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 8시간 동안 교반한 후, 반응물을 EtOAc내에 붓고, 유기층을 90% 염수, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 2.5% MeOH/CHCl3으로 용출)로 정제하여 포스포라미다이트 67을 백색 고체로서 수득하였다 (1.65 g, 84%). 31P NMR (CDCl3) δ: 148.70, 145.81.
실시예 8
(1S,3R,4R,6R,7S)-7-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피녹시]-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(2-N-이소부티릴구아닌-9-일)-6-메틸-2,5-디옥사-바이시클로[2.2.1]헵탄 (74)
Figure 112008060828411-PCT00029
(a) 2-아미노-6-클로로퓨린, BSA, TMSOTf, DCE, 환류, 2시간; (b) 3-히드록시프로피오니트릴, NaH, THF, 4시간; (c) 이소부티르산 무수물, DMAP, DMF, 60℃, 24시간; (d) DDQ, CH2Cl2, H2O, 실온, 16시간; (e) Et3N.3HF, Et3N, THF, 실온, 16시간; (f) DMTCl, 피리딘, 실온, 16시간; (g) CNCH2CH2OP(N-iPr2)2, 테트라졸, NMI, DMF.
디아세테이트 32로부터의 포스포라미다이트 67에 대해 예시된 것과 동일한 절차를 이용하여 디아세테이트 53으로부터 포스포라미다이트 74를 제조하였다.
실시예 9
(1S,3R,4R,6R,7S)-7-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피녹시]-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(우라실-1-일)-6-메톡시메틸-2,5-디옥사-바이시클로[2.2.1]헵탄 (83)
Figure 112008060828411-PCT00030
(a) 옥살릴 클로라이드, DMSO, Et3N, CH2Cl2, -78℃; (b) MeOCH2Br, Mg, HgCl2, THF, -20℃, 26으로부터 >95%; (c) MsCl, Et3N, DMAP, CH2Cl2, 85%; (d) Ac2O, AcOH, H2SO4, 실온, 3시간, 84%; (e) 우라실, BSA, TMSOTf, MeCN, 환류, 2시간; (f) K2CO3, MeOH, 77a-b로부터 89%; (g) DDQ, CH2Cl2, H2O, 8시간, 실온, 80a 및 80b에 대해 합한 수율 98%; (h) Et3N.3HF, Et3N, THF, 실온, 16시간; (i) DMTCl, 피리딘, 16시간, 실온, 90%; G) CN(CH2)2OP(N-iPr2)2, 테트라졸, NMI, DMF, 96%.
A) 알콜 (75a-b)
-78℃에서 디메틸술폭시드 (3.5 mL, 50.0 mmol)를 디클로로메탄 (130 mL) 중에서 옥살릴 클로라이드 (2.2 mL, 25.0 mmol)의 용액에 첨가하였다. 30분 동안 교반한 후, 디클로로메탄 (30 mL) 중의 알콜 26 (10.0 g, 16.7 mmol)의 용액을 10분 동안 반응물에 첨가하였다. 추가의 45분 동안 교반한 후, 트리에틸아민 (10.5 mL, 75.0 mmol)을 반응물에 서서히 첨가하였다. 첨가가 완료된 후, 빙조를 제거하고, 반응물을 점차 0℃로 가온시키고 (약 1시간), 분별 깔대기로 옮겼다. 유기층을 순차적으로 5% HCl, 포화 중탄산나트륨 용액 및 염수로 세척하고, 이어서 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켜 알데히드 27을 수득하고, 이를 고 진공 하에 건조시키고 (18시간), 추가의 정제 없이 사용하였다.
마그네슘 터닝 (2.5 g, 102.8 mmol) 및 염화수은(II) (93 mg, 0.34 mmol)의 혼합물에 무수 THF (5 mL)를 가하고, 반응물을 -20℃로 냉각시켰다. 순수 (neat) 메톡시메틸 브로마이드 몇 방울을 첨가하여 반응을 개시하였다. 몇 분 동안 기다린 후, THF (12 mL) 중의 메톡시메틸 브로마이드 (9.33 mL, 102.8 mmol) 의 용액을 대략 3시간 동안 반응물에 (시린지를 통해 1 mL/10분으로) 첨가하였다. 첨가 동안 외부 반응조의 온도를 매우 조심스럽게 -20 내지 -25℃로 유지하였다. 소부피의 무수 THF (5 mL)를 간헐적으로 (3시간 동안) 반응물에 첨가하여 교반을 촉진시켰다. 브로마이드의 첨가가 완료된 후, 반응물을 -25℃에서 100분 동안 교반하고, THF (30 mL) 중의 조 알데히드 (27)의 용액을 첨가하였다. -20℃에서 45분 동안 교반한 후, TLC에 의해 출발 물질 알데히드 27은 검출되지 않았다. 반응물을 포화 염화암모늄 용액으로 조심스럽게 켄칭시키고, 에틸 아세테이트로 희석하였다. 유기층을 5% HCl, 중탄산나트륨의 포화 용액 및 염수로 세척하고, 이어서 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 25 내지 30% EtOAc/헥산으로 용출)로 정제하여 알콜 75a-b (정량)를 혼합물 (약 1:1의 이성질체 혼합물)로서 수득하였다.
B) 메실레이트 (76a-b)
메탄술포닐 클로라이드 (2.3 mL, 29.2 mmol)를 트리에틸아민 (5.3 mL, 37.9 mmol) 중에 용해된 알콜 75a-b (13.38 g, 20.8 mmol) 및 디클로로메탄 (42 mL) 중의 DMAP (0.36 g, 2.9 mmol)의 저온 (0℃) 용액에 첨가하였다. 2시간 동안 교반한 후, 추가의 메탄술포닐 클로라이드 (0.5 mL)를 첨가하였다. 1시간 동안 교반을 계속하고, 반응물을 클로로포름으로 희석하였다. 유기층을 순차적으로 5% HCl, 중탄산나트륨의 포화 용액 및 염수로 세척하고, 이어서 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 20% EtOAc/헥산으로 용출)로 정제하여 메실레이트 76a-b (12.8 g, 85%)를 점성 오일로서 수득하였다.
C) 디아세테이트 (77a-b)
농축 황산 (6 방울)을 메실레이트 76a-b (12.8 g, 17.8 mmol), 아세트산 (50 mL) 및 아세트산 무수물 (10 mL)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 3시간 동안 교반한 후, LCMS에 의해 반응이 완료된 것으로 평가되었고, 용매의 대부분을 고 진공 하에 증발시켰다. 농축된 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 유기층을 물, 중 탄산나트륨의 포화 용액 (pH가 10 초과가 될 때까지) 및 염수로 세척하고, 이어서 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 20% EtOAc/헥산으로 용출)로 정제하여 디아세테이트s 77a-b (11.44 g, 84%)의 아노머 혼합물을 점성 오일로서 수득하였다.
D) 뉴클레오시드 (79a-b)
N,O-비스(트리메틸실릴)아세트아미드 (14.76 mL, 59.9 mmol)를 CH3CN (75 mL) 중의 디아세테이트 77a-b (11.44 g, 15.0 mmol) 및 우라실 (3.35 g, 29.9 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 40℃에서 15분 동안 가열하여 투명한 용액을 얻은 후, 반응물을 빙조에서 냉각시키고, 트리메틸실릴트리플레이트 (4.06 mL, 22.5 mmol)를 첨가하였다. 2시간 동안 환류시킨 후, 반응물을 실온으로 냉각시키고, EtOAc내에 부었다. 유기층을 반 포화 중탄산나트륨 용액 및 염수로 세척하고, 이어서 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켜 조 뉴클레오시드 78a-b를 수득하고, 이를 정제 없이 사용하였다.
탄산칼륨 (5.30 g, 38.4 mmol)을 메탄올 (130 mL) 중의 뉴클레오시드 78a-b (상기로부터 얻음)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응물을 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트 중에 용해시키고, 물 및 염수로 추출하고, 이어서 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 5 내지 7.5% 아세톤/클로로포름으로 용출)로 정제하여 뉴클레오 시드 79a-b (9.0 g, 77a-b로부터 89%)를 백색 고체로서 수득하였다.
E) 뉴클레오시드 (80a 및 80b)
DDQ (20.0 mmol, 4.5 g)를 디클로로메탄 (130 mL) 및 물 (6.5 mL) 중의 뉴클레오시드 79a-b (9.0 g, 13.3 mmol)의 용액에 첨가하였다. 2상 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 그 후, 추가의 DDQ (2.75 g)을 반응물에 첨가하였다. 추가의 2시간 후에, 추가의 DDQ (1.1 g)를 반응물에 첨가하고, 추가의 4시간 동안 교반을 계속하였고, 그 후, 반응물을 16시간 동안 냉장고에 보관하였다. 다음날 아침, LCMS에서 미량의 뉴클레오시드 79a-b가 나타났고, 따라서 추가의 DDQ (0.9 g)를 반응물에 첨가하고, 2시간 동안 교반을 계속하였고, 이 시점에 TLC 및 LCMS에 의해 더 이상의 뉴클레오시드 79a-b가 검출되지 않았다. 용매를 진공 하에 증발시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트와 물 사이에 분배하였다. 유기층을 중아황산나트륨 용액 (2x), 포화 중탄산나트륨 용액 및 염수로 세척하고, 이어서 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 10 내지 20% 아세톤/클로로포름으로 용출)로 정제하여 뉴클레오시드 80a (보다 느리게 진행되는 점) 및 80b (보다 빠르게 진행되는 점)를 각각 수득하였다 (합한 수득량 7.0 g, 98%).
F) 뉴클레오시드 (81)
트리에틸아민 트리히드로플루오라이드 (12.2 mL, 74.8 mmol)를 THF (120 mL) 중의 뉴클레오시드 80a (6.7 g, 12.5 mmol) 및 트리에틸아민 (5.2 mL, 37.4 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응물을 진공 하에 건 조물로 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 7.5% 내지 12.5% MeOH/CHCl3으로 용출)로 정제하여 뉴클레오시드 81 (트리에틸아민.히드로플루오라이드염으로 오염됨, 수율 > 100%)을 수득하였고, 이를 추가의 정제 없이 사용하였다.
G) 뉴클레오시드 (82)
4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드 (DMTCl, 4.8 g, 14.3 mmol)를 피리딘 (75 mL) 중의 뉴클레오시드 81 (약 12.5 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 추가의 DMTCl (2.4 g)을 반응물에 첨가하였다. 추가의 4시간 동안 교반한 후, MeOH (10 mL)를 첨가하였다. 30분 동안 교반한 후, 반응물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 유기층을 물 및 염수로 세척하고, 이어서 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 60 내지 75% EtOAc/헥산)로 정제하여 뉴클레오시드 82 (6.73 g, 90%)를 백색 발포체로서 수득하였다.
H) (1S,3R,4R,6R,7S)-7-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피녹시]-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(우라실-1-일)-6-메톡시메틸-2,5-디옥사-바이시클로-[2.2.1]헵탄 (83)
2-시아노에틸 테트라이소프로필포스포르디아미다이트 (1.58 mL, 5.0 mmol)를 DMF (16 mL) 중의 뉴클레오시드 82 (2.0 g, 3.3 mmol), 테트라졸 (0.19 g, 2.6 mmol) 및 N-메틸이미다졸 (68 ㎕, 0.83 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 8시간 동안 교반한 후, 반응물을 EtOAc내에 부었다. 유기층을 90% 염수, 그 후 염수로 세척하고, 이어서 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 66% 내지 75% EtOAc/헥산으로 용출)로 정제하여 포스포라미다이트 83을 백색 고체로서 수득하였다 (2.54 g, 96%). 31P NMR (CDCl3) δ: 149.78, 149.44.
실시예 10
(1S,3R,4R,6S,7S)-7-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피녹시]-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(우라실-1-일)-6-메톡시메틸-2,5-디옥사-바이시클로-[2.2.1]헵탄 (86)
Figure 112008060828411-PCT00031
(a) Et3N.3HF, Et3N, THF, 실온, 16시간; (i) DMTCl, 피리딘, 16시간, 실온, 91%; G) CN(CH2)2OP(N-iPr2)2, 테트라졸, NMI, DMF, 96%.
A) 뉴클레오시드 (84)
트리에틸아민.트리히드로플루오라이드 (11.6 mL, 71.5 mmol)를 THF (125 mL) 중의 뉴클레오시드 80b (6.43 g, 12.0 mmol) 및 트리에틸아민 (5.0 mL, 35.7 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응물을 진공 하에 건조물로 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 7.5% 내지 12.5% MeOH/CHCl3으로 용출)로 정제하여 뉴클레오시드 84 (트리에틸아민.히드로플루오라이 드염으로 오염됨, 수율 > 100%)를 수득하고, 이를 추가의 정제 없이 사용하였다.
B) 뉴클레오시드 (85)
4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드 (DMTCl, 4.6 g, 13.8 mmol)를 피리딘 (72 mL) 중의 뉴클레오시드 84 (약 12.0 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 추가의 DMTCl (2.3 g)을 반응물에 첨가하였다. 추가의 4시간 동안 교반한 후, MeOH (10 mL)를 첨가하였다. 30분 동안 교반한 후, 반응물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 유기층을 물 및 염수로 세척하고, 이어서 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 60 내지 75% EtOAc/헥산)로 정제하여 뉴클레오시드 85 (6.52 g, 91%)를 백색 발포체로서 수득하였다.
C) (1S,3R,4R,6S,7S)-7-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피녹시]-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(우라실-1-일)-6-메톡시메틸-2,5-디옥사-바이시클로[2.2.1]헵탄 (86)
2-시아노에틸 테트라이소프로필포스포르디아미다이트 (1.58 mL, 5.0 mmol)를 DMF (17 mL) 중의 뉴클레오시드 85 (2.0 g, 3.3 mmol), 테트라졸 (0.19 g, 2.7 mmol) 및 N-메틸이미다졸 (68 ㎕, 0.83 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 8시간 동안 교반한 후, 반응물을 EtOAc내에 부었다. 유기층을 90% 염수, 이어서 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 66% 내지 75% EtOAc/헥산으로 용출)로 정제하여 포스포라미다이트 86을 백색 고체로서 수득하였다 (2.55 g, 96%). 31P NMR (CDCl3) δ: 149.97, 149.78.
실시예 11
(1S,3R,4R,6R,7S)-7-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피녹시]-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(4-N-벤조일시토신-1-일)-6-메톡시메틸-2,5-디옥사-바이시클로[2.2.1]헵탄 (92)
Figure 112008060828411-PCT00032
(a) TBSCl, Et3N, DMAP, CH2Cl2, 실온, 16시간, 98%; (b) POCl3, 1,2,4-트리아졸, Et3N, CH3CN, 실온, 4시간; (c) 수성 NH3, 1,4-디옥산, 실온, 16시간; (d) Bz2O, DMF, 실온, 16시간, 82로부터 91%; (e) Et3N.3HF, Et3N, THF, 실온, 16시간, 94%; (f) CNCH2CH2OP(N-iPr2)2, 테트라졸, NMI, DMF, 84%.
(A) 뉴클레오시드 (87)
tert-부틸디메틸실릴 클로라이드 (2.40 g, 15.9 mmol)를 DMF (10.6 mL) 중의 뉴클레오시드 82 (3.20 g, 5.3 mmol) 및 이미다졸 (2.16 g, 31.8 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응물을 EtOAc내에 부었다. 유기상을 순차적으로 염수로 추출하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 50% EtOAc/헥산으로 용출)로 정제하여 뉴클레오시드 87 (3.70 g, 98%)을 백색 고체로서 수득하였다.
B) 뉴클레오시드 (90)
옥시염화인 (3.86 mL, 41.4 mmol)을 CH3CN (80 mL) 중의 1,2,4-트리아졸 (12.15 g, 176.1 mmol)의 저온 (0℃) 현탁액에 첨가하였다. 15분 동안 교반한 후, 트리에틸아민 (29.0 mL, 207.2 mmol)을 첨가하고, 30분 동안 교반을 계속하였다. 0℃에서 CH3CN (20 mL) 중의 뉴클레오시드 87 (3.70 g, 5.2 mmol)의 용액을 반응 혼합물에 첨가하였다. 10분 동안 교반한 후, 빙조를 제거하고, 반응물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 하에 제거하고, 잔류물을 EtOAc와 물 사이에 분배하였다. 이어서, 유기층을 포화 NaHCO3 및 염수로 세척하고, 이어서 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켜 조 화합물 88을 수득하고, 이를 추가의 정제 없이 사용하였다.
수성 암모니아 (10 mL)를 디옥산 (50 mL) 중의 뉴클레오시드 88 (상기로부터 얻음)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응물을 진공 하 에 농축시키고, 고 진공 하에 8시간 동안 건조시켜 뉴클레오시드 89를 수득하고, 이를 추가의 정제 없이 사용하였다.
벤조산 무수물 (1.99 g, 8.8 mmol)을 DMF (10 mL) 중의 뉴클레오시드 89 (상기로부터 얻음)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응물을 EtOAc내에 부었다. 유기층을 포화 NaHCO3 및 염수로 추출하고, 이어서 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 50% EtOAc/헥산으로 용출)로 정제하여 뉴클레오시드 90 (3.86 g, 87로부터 91%)을 백색 고체로서 수득하였다.
C) 뉴클레오시드 (91)
트리에틸아민 트리히드로플루오라이드 (4.54 mL, 27.9 mmol)를 폴리프로필렌 튜브내의 THF (46 mL) 중의 뉴클레오시드 90 (3.81 g, 4.7 mmol) 및 트리에틸아민 (1.56 mL, 11.2 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응물을 진공 하에 건조시키고, 잔류물을 EtOAc 중에 용해시켰다. 유기층을 순차적으로 물, 포화 NaHCO3 및 염수로 세척하고, 이어서 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 5% MeOH/CHCl3으로 용출)로 정제하여 뉴클레오시드 91 (3.07 g, 94%)을 백색 고체로서 수득하였다.
D) (1S,3R,4R,6R,7S)-7-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피녹시]-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(4-N-벤조일시토신-1-일)-6-메틸-2,5-디옥사-바이시클로[2.2.1]헵탄 (92)
2-시아노에틸 테트라이소프로필포스포르디아미다이트 (0.90 mL, 4.3 mmol)를 DMF (14 mL) 중의 뉴클레오시드 91 (2.0 g, 2.8 mmol), 테트라졸 (0.16 g, 2.3 mmol) 및 N-메틸이미다졸 (58 ㎕, 0.71 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 8시간 동안 교반한 후, 반응물을 EtOAc내에 부었다. 유기층을 90% 염수, 그 후 염수로 세척하고, 이어서 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 잔류물을 최소량의 EtOAc 중에 용해시키고, 이 용액을 헥산에 첨가하였다. 생성된 침전물을 수집하고, 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 75% 내지 90% EtOAc/헥산으로 용출)로 추가로 정제하여 포스포라미다이트 92를 백색 고체로서 수득하였다 (2.14 g, 84%). 31P NMR (CDCl3) δ: 149.82.
실시예 12
(1S,3R,4R,6S,7S)-7-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피녹시]-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(4-N-벤조일시토신-1-일)-6-메톡시메틸-2,5-디옥사-바이시클로[2.2.1]헵탄 (98)
Figure 112008060828411-PCT00033
(a) TBSCl, Et3N, DMAP, CH2Cl2, 실온, 16시간, 97%; (b) POCl3, 1,2,4-트리아졸, Et3N, CH3CN, 실온, 4시간; (c) 수성 NH3, 1,4-디옥산, 실온, 16시간; (d) Bz2O, DMF, 실온, 16시간, 93으로부터 89%; (e) Et3N.3HF, Et3N, THF, 실온, 16시간, 89%; (f) CNCH2CH2OP(N-iPr2)2, 테트라졸, NMI, DMF, 84%.
A) 뉴클레오시드 (93)
tert-부틸디메틸실릴 클로라이드 (2.25 g, 15.0 mmol)를 DMF (10 mL) 중의 뉴클레오시드 85 (3.0 g, 5.0 mmol) 및 이미다졸 (2.03 g, 29.9 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응물을 EtOAc내에 부었다. 유기상을 순차적으로 염수로 추출하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켰다. 컬 럼 크로마토그래피 (SiO2, 50% EtOAc/헥산으로 용출)로 정제하여 뉴클레오시드 93 (3.45 g, 97%)을 백색 고체로서 수득하였다.
B) 뉴클레오시드 (96)
옥시염화인 (3.59 mL, 38.5 mmol)을 CH3CN (80 mL) 중의 1,2,4-트리아졸 (11.3 g, 163.9 mmol)의 저온 (0℃) 현탁액에 첨가하였다. 15분 동안 교반한 후, 트리에틸아민 (27.0 mL, 192.8 mmol)을 반응물에 첨가하고, 30분 동안 교반을 계속하였다. 0℃에서 CH3CN (20 mL) 중의 뉴클레오시드 93 (3.45 g, 4.82 mmol)의 용액을 반응물에 첨가하였다. 10분 동안 교반한 후, 빙조를 제거하고, 반응물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 이어서, 용매를 진공 하에 제거하고, 잔류물을 EtOAc와 물 사이에 분배하였다. 이어서, 유기층을 NaHCO3의 포화 용액 및 염수로 세척하고, 이어서 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켜 조 화합물 94를 수득하고, 이를 추가의 정제 없이 사용하였다.
수성 암모니아 (10 mL)를 디옥산 (50 mL) 중의 뉴클레오시드 94 (상기로부터 얻음)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응물을 진공 하에 농축시키고, 8시간 동안 고 진공 하에 건조시켜 뉴클레오시드 95를 수득하고, 이를 추가의 정제 없이 사용하였다.
벤조산 무수물 (1.63 g, 7.2 mmol)을 DMF (9 mL) 중의 뉴클레오시드 95 (상기로부터 얻음)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응물을 EtOAc내에 부었다. 유기층을 포화 NaHCO3 및 염수로 추출하고, 이어서 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 50% EtOAc/헥산으로 용출)로 정제하여 뉴클레오시드 96 (3.53 g, 93으로부터 89%)을 백색 고체로서 수득하였다.
C) 뉴클레오시드 (97)
트리에틸아민 트리히드로플루오라이드 (4.20 mL, 25.8 mmol)를 폴리프로필렌 튜브내의 THF (43 mL) 중의 뉴클레오시드 96 (3.53 g, 4.3 mmol) 및 트리에틸아민 (1.43 mL, 10.3 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응물을 진공 하에 건조시키고, 잔류물을 EtOAc 중에 용해시켰다. 유기층을 순차적으로 물, 포화 NaHCO3 및 염수로 세척하고, 이어서 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 25% 내지 40% 아세톤/CHCl3으로 용출)로 정제하여 뉴클레오시드 97 (2.87 g, 95%)을 백색 고체로서 수득하였다.
D) (1S,3R,4R,6S,7S)-7-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피녹시]-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(4-N-벤조일시토신-1-일)-6-메틸-2,5-디옥사-바이시클로[2.2.1] 헵탄 (98)
2-시아노에틸 테트라이소프로필포스포르디아미다이트 (1.35 mL, 4.3 mmol)를 DMF (14 mL) 중의 뉴클레오시드 97 (2.0 g, 2.8 mmol), 테트라졸 (0.16 mg, 2.3 mmol) 및 N-메틸이미다졸 (58 ㎕, 0.71 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 8시간 동안 교반한 후, 반응물을 EtOAc내에 붓고, 유기층을 90% 염수, 그 후 염수로 세척하고, 이어서 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 75% 내지 90% EtOAc/헥산으로 용출)로 정제하여 포스포라미다이트 98을 백색 고체로서 수득하였다 (2.15 g, 84%). 31P NMR (CDCl3) δ: 150.33.
실시예 13
(1S,3R,4R,6R,7S)-7-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피녹시]-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(6-N-벤조일아데닌-9-일)-6-메톡시메틸-2,5-디옥사-바이시클로[2.2.1]헵탄 (105)
Figure 112008060828411-PCT00034
(a) 6-N-벤조일아데닌, BSA, TMSOTf, CH3CN, 환류, 8시간; (b) K2CO3, MeOH, 실온, 16시간; (c) Bz2O, DMF, 실온; (d) DDQ, CH2Cl2, H2O, 실온; (e) Et3N.3HF, Et3N, THF, 실온, 16시간; (f) DMTCl, 피리딘, 실온, 16시간; (g) CNCH2CH2OP(N-iPr2)2, 테트라졸, NMI, DMF.
디아세테이트 혼합물 77a-b로부터의 포스포라미다이트 83의 합성에 대해 예시된 절차를 이용하여 디아세테이트 77a-b로부터 포스포라미다이트 105를 제조하였다.
실시예 14
(1S,3R,4R,6S,7S)-7-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피녹시]-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(6-N-벤조일아데닌-9-일)-6-메틸-2,5-디옥사-바이시클로[2.2.1]헵탄 (108)
Figure 112008060828411-PCT00035
(a) Et3N.3HF, Et3N, THF, 실온, 16시간; (b) DMTCl, 피리딘, 실온, 16시간; (c) CNCH2CH2OP(N-iPr2)2, 테트라졸, NMI, DMF.
80b로부터의 포스포라미다이트 86의 합성에 대해 예시된 절차를 이용하여 뉴 클레오시드 102b로부터 포스포라미다이트 108을 제조하였다.
실시예 15
(1S,3R,4R,6R,7S)-7-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피녹시]-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(2-N-이소부티릴구아닌-9-일)-6-메톡시메틸-2,5-디옥사-바이시클로[2.2.1]헵탄 (114)
Figure 112008060828411-PCT00036
(a) 2-아미노-6-클로로퓨린, BSA, TMSOTf, CH3CN, 환류, 2시간; (b) 3-히드록시프로피오니트릴, NaH, THF, 4시간; (c) 이소부티르산 무수물, DMAP, DMF, 60℃, 24시간; (d) DDQ, CH2Cl2, H2O, 실온, 16시간; (e) Et3N.3HF, Et3N, THF, 실온; (f) DMTCl, 피리딘, 실온; (g) CNCH2CH2OP(N-iPr2)2, 테트라졸, NMI, DMF.
혼합물 77a-b로부터의 포스포라미다이트 83의 합성에 대해 예시된 절차를 이용하여 디아세테이트 77a-b로부터 포스포라미다이트 114를 제조하였다.
실시예 16
(1S,3R,4R,6S,7S)-7-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피녹시]-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(2-N-이소부티릴구아닌-9-일)-6-메톡시메틸-2,5-디옥사-바이시클로[2.2.1]헵탄 (117)
Figure 112008060828411-PCT00037
(a) Et3N.3HF, Et3N, THF, 실온, 16시간; (b) DMTCl, 피리딘, 실온, 16시간; (c) CNCH2CH2OP(N-iPr2)2, 테트라졸, NMI, DMF.
80b로부터의 포스포라미다이트 86의 합성에 대해 예시된 절차를 이용하여 뉴클레오시드 111b로부터 포스포라미다이트 117을 제조하였다.
실시예 17
6-CH2OH BNA 합성
Figure 112008060828411-PCT00038
(a) 옥살릴 클로라이드, DMSO, Et3N, CH2Cl2, -78 내지 0℃; (b) Ph3PCH2Br, nBuLi, THF, -78℃ 내지 실온, 26으로부터 97%; (c) TBAF, THF, 실온, 16시간, 97%; (d) NaH, BnBr, DMF, 실온, 1시간, 정량; (e) OsO4, NMO, 95% 수성 아세톤, 실온, 48시간, 87%; (f) TBSCl, 피리딘, 0℃, 4시간, 정량; (g) MsCl, Et3N, DMAP, CH2Cl2, 실온, 16시간, 44% 및 40%의 회수된 sm; (h) Et3N.3HF, Et3N, THF, 정량; (i) PivCl, DIPEA, DMAP, CH2Cl2, 실온, 16시간; G) AcOH, Ac2O, 촉매 H2SO4, 125로부터 92%; (k) BSA, 우라실, TMSOTf, CH3CN, 환류 2시간; (I) K2CO3, MeOH, 127로부 터 74%.
A) 뉴클레오시드 118
디메틸술폭시드 (1.77 mL, 25.0 mmol)를 디클로로메탄 (60 mL) 중의 옥살릴 클로라이드 (1.10 mL, 12.5 mmol)의 저온 (-78℃) 용액에 적가하였다. 30분 동안 교반한 후, 디클로로메탄 (20 mL) 중의 알콜 26 (5.0 g, 8.4 mmol)의 용액을 반응물에 첨가하였다. -78℃에서 추가의 45분 동안 교반을 계속하고, 그 후, 트리에틸아민 (5.05 mL, 37.5 mmol)을 반응물에 적가하였다. 10분 동안 교반한 후, 빙조를 제거하고, 반응물을 약 0℃로 점차 가온시키고, 이 시점에 TLC 분석에서 출발 물질 알콜이 없는 것으로 나타났다. 반응물을 디클로로메탄으로 희석하고, 유기층을 순차적으로 10% HCl, 포화 NaHCO3, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켜 알데히드 27을 수득하고, 이를 임의의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
B) 뉴클레오시드 118
nBuLi (2.5 M, 4.34 mL, 10.9 mmol)를 무수 THF (60 mL) 중의 트리페닐포스포늄 브로마이드 (3.88 g, 10.9 mmol)의 저온 (0℃) 교반 용액에 적가하였다. 1시간 동안 교반한 후, 적색 용액을 -78℃로 냉각시키고, 무수 THF (15 mL) 중의 상기로부터의 알데히드 27의 용액을 반응물에 적가하였다. 반응물을 실온으로 점차 가온시키고, 추가의 16시간 동안 교반을 계속하였다. 이어서, 반응물을 포화 NH4Cl을 사용하여 조심스럽게 켄칭시키고, EtOAc와 물 사이에 분배하였다. 유기층을 순차적으로 순차적으로 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 컬럼 크로 마토그래피 (SiO2, 헥산 중의 10% EtOAc로 용출)로 정제하여 올레핀 118 (4.84 g, 26으로부터 97%)을 무색 오일로서 수득하였다.
C) 뉴클레오시드 119
테트라부틸암모늄 플루오라이드 (THF 중의 1 M, 10.00 mL, 10.0 mmol)를 THF (35 mL) 중의 올레핀 118 (4.83 g, 8.1 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 16시간 동안 교반하고, 그 후, 용매를 진공 하에 제거하고, 잔류물을 EtOAc 중에 용해시켰다. 유기층을 물, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 헥산 중의 40 % EtOAc로 용출)로 정제하여 알콜 119 (2.79 g, 97%)를 무색 오일로서 수득하였다.
D) 뉴클레오시드 120
수소화나트륨 (광유 중의 60% w/w, 0.4 g, 10 mmol)을 DMF (16 mL) 중의 알콜 119 (1.44 g, 4.1 mmol) 및 벤질 브로마이드 (0.71 mL, 6.0 mmol)의 저온 (0℃) 용액에 첨가하였다. 0℃에서 1시간 동안 교반한 후, 반응물을 조심스럽게 물로 켄칭시키고, EtOAc와 물 사이에 분배하였다. 유기층을 분리하고, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 헥산 중의 10 내지 25% EtOAc로 용출)로 정제하여 올레핀 120 (1.84 g, 정량)을 무색 오일로서 수득하였다.
E) 뉴클레오시드 121
사산화오스뮴 (OsO4, iPrOH 중의 25% 용액, 1 mL)을 95% 아세톤/물 (25 mL) 중의 올레핀 120 (1.80 g, 4.0 mmol) 및 N-메틸모르폴린-N-옥시드 (NMO, 0.94 g, 8.0 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 추가의 OsO4 용액 (0.5 mL) 및 NMO (0.40 g)를 반응물에 첨가하였다. 총 48시간 동안 교반한 후, 반응물을 EtOAc로 희석하고, 10% NaHSO3, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 헥산 중의 40 내지 50% EtOAc로 용출)로 정제하여 디올 121 (1.68 g, 87%, 약 1:1의 이성질체 혼합물)을 무색 오일로서 수득하였다.
F) 뉴클레오시드 122 및 123
TBSCl (0.66 g, 4.4 mmol)을 피리딘 (17 mL) 중의 디올 121 (1.63 g, 3.4 mmol)의 저온 (0℃) 용액에 첨가하였다. 0℃에서 4시간 동안 교반한 후, 반응물을 EtOAc로 희석하고, 유기층을 물, 염수로 세척하고, 건조시키고, 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 헥산 중의 10 내지 20% EtOAc로 용출)로 정제하여 알콜 122 및 123 (0.90 g 및 1.17 g, 절대 입체화학은 정해지지 않음)을 무색 오일로서 수득하였다.
G) 뉴클레오시드 124
메탄술포닐 클로라이드 (0.24 mL, 3.0 mmol)를 디클로로메탄 (5 mL) 중의 알콜 123 (절대 입체화학은 정해지지 않음, 0.9 g, 1.5 mmol), 트리에틸아민 (0.46 mL, 3.3 mmol) 및 디메틸아미노피리딘 (37 mg, 0.3 mmol)의 저온 (0℃) 용액에 첨가하였다. 실온에서 7시간 후, 추가의 메탄술포닐 클로라이드 (0.12 mL) 및 트리에틸아민 (0.23 mL)을 반응물에 첨가하였다. 실온에서 추가의 9시간 동안 교반한 후, 반응물을 EtOAc내에 붓고, 유기층을 10% HCl, 포화 NaHCO3, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 헥산 중의 10 내지 15% EtOAc로 용출)로 정제하여 메실레이트 124 (0.44 g, 44%) 및 출발 물질 디올 123 (0.32 g, 40%)을 수득하였다.
H) 뉴클레오시드 125
트리에틸아민 트리히드로플루오라이드 (0.64 mL, 4.0 mmol)를 THF (7 mL) 중의 메실레이트 124 (0.44 g, 0.6 mmol) 및 트리에틸아민 (0.23 mL, 1.7 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응물을 EtOAc로 희석하고, 유기상을 포화 NaHCO3, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 헥산 중의 50% EtOAc로 용출)로 정제하여 알콜 125 (0.40 g, 정량)를 수득하였다.
I) 뉴클레오시드 127
피발로일 클로라이드 (0.12 mL, 1.0 mmol)를 디클로로메탄 (2 mL) 중의 알콜 125 (0.72 mmol, 0.4 g), 디이소프로필에틸아민 (DIPEA, 0.17 mL, 1.0 mmol) 및 디메틸아미노피리딘 (12 mg, 0.1 mmol)의 저온 (0℃) 용액에 적가하였다. 이어서,빙조를 제거하고, 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 그 후, 추가의 DIPEA (0.17 mL) 및 피발로일 클로라이드 (0.12 mL)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 EtOAc로 희석하고, 유기층을 10% HCl, 포화 NaHCO3, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켜 조 피발로에이트 126을 수득하고, 이를 임의의 추가 정제 없이 사용하였다.
농축 황산 (2 방울)을 빙초산 (2.5 mL) 및 아세트산 무수물 (0.5 mL) 중의 조 피발로에이트 126 (상기로부터 얻음)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 용매를 고 진공 하에 제거하고, 잔류물을 EtOAc 중에 용해시키고, 유기층을 포화 NaHCO3, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 헥산 중의 10 내지 15% EtOAc로 용출)로 정제하여 디아세테이트 127 (0.45 g, 125로부터 92%)를 무색 오일로서 수득하였다 (아노머의 혼합물).
J) 뉴클레오시드 129a
N,O-비스(트리메틸실릴)아세트아미드 (0.8 mL, 3.3 mmol)를 CH3CN (3.5 mL) 중의 디아세테이트 127 (0.45 g, 0.65 mmol) 및 우라실 (0.15 g, 1.3 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 40℃에서 15분 동안 가열하여 투명한 용액을 얻은 후, 트리메틸실릴 트리플레이트 (0.24 mL, 1.3 mmol)를 반응물에 첨가하였다. 2시간 동안 환류시킨 후, 반응물을 실온으로 냉각시키고, EtOAc내에 부었다. 유기층을 포화 NaHCO3, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켜 조 뉴클레오시 드 128a를 수득하고, 이를 임의의 정제 없이 사용하였다.
K2CO3 (40 mg, 0.3 mmol)을 MeOH (1.5 mL) 중의 뉴클레오시드 128a (0.11 g, 0.15 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 용매를 진공 하에 제거하고, 잔류물을 EtOAc와 염수 사이에 분배하였다. 유기상을 수집하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켜 129a를 수득하였다 (절대 입체화학은 측정되지 않음). 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, CHCl3 중의 35% 아세톤으로 용출)로 정제하여 뉴클레오시드 129a (57 mg, 127로부터 74%)를 수득하였다.
Figure 112008060828411-PCT00039
실시예 18
Figure 112008060828411-PCT00040
(a) N-Bz-시토신 또는 6-N-Bz-아데닌 또는 2-아미노-6-클로로퓨린, BSA, TMSOTf, MeCH, 환류; (b) K2CO3, MeOH, 실온, 16시간 (129b 및 129c의 경우); (c) NaH, 3-히드록시프로피오니트릴, 실온 (129d의 경우); (d) TMSCl, 피리딘, BzCl 또는 Bz2O, DMF (130b 및 130c의 경우); (e) TMSCl, 피리딘, 이소부티릴 클로라이드 (130d의 경우).
뉴클레오시드 128b, 128c 및 128d는 각각 N-Bz-시토신, 6-N-Bz-아데닌 및 2-아미노-6-클로로퓨린을 사용하여 보르브루겐(Vorbrugen) 반응에 의해 당 전구체 127로부터 제조하였다 (반응식 18). 128b 및 128c를 K2CO3 및 MeOH로 처리하여 뉴클레오시드 129b 및 129c를 각각 수득하였다. 128d를 수소화나트륨 및 3-히드록시프로피오니트릴로 처리하여 뉴클레오시드 129d를 수득하였다. TMSCl로 히드록실기를 일시적으로 보호한 후, 벤조일 클로라이드와 반응시켜 뉴클레오시드 130b 및 130c를 각각 수득하였다. 별법으로, 상기 변환은, 뉴클레오시드 129b 및 129c를 용매로서 DMF를 사용하여 벤조산 무수물과 반응시킴으로써 달성할 수도 있다. 뉴클레오시드 130d는 피리딘 중의 과량의 TMSCl로 일시적으로 보호한 후, 이소부티릴 클로라이드와 반응시킴으로써 제조하였다.
실시예 19
6'-치환된 유사체의 제조
Figure 112008060828411-PCT00041
R, R1 및 R2는 각각 독립적으로, H, 알킬, 알케닐, 알키닐, 치환된 알킬, 치환된 알케닐, 치환된 알키닐 또는 보호기이다.
뉴클레오시드 131은 용매로서 디클로로메탄을 사용하여 DAST 등의 플루오르화제로 처리함으로써 뉴클레오시드 130으로부터 제조하였다. 뉴클레오시드 132는, 먼저 1급 히드록실기를 데스-마틴 페리오디난으로 또는 스웨른 조건 하에 산화시킨 후, 생성된 알데히드를 DAST로 처리함으로써 제조하였다. 뉴클레오시드 133은, 먼저 1급 히드록실기를 데스-마틴 페리오디난으로 또는 스웨른 조건 하에 산화시킨 후, 생성된 알데히드를 빙초산 및 환원제, 예컨대 나트륨 시아노보로히드리드의 존재 하에 1급 또는 2급 아민에 의해 환원적 아미노화시킴으로써 제조하였다. 뉴클레오시드 134는, 히드록실기를 이탈기 (메실레이트, 토실레이트, 할라이드)로 전환시킨 후, 과량의 나트륨 아지드와 함께 가열함으로써 130으로부터 제조하였다. 뉴클레오시드 135는, 1급 알콜을 카르복실산으로 산화시킨 후, HATU 또는 임의의 다른 펩티드 커플링제의 존재 하에 아민과 반응시킴으로써 130으로부터 제조하였다. 뉴클레오시드 136은, 히드록실기를 카르보닐 디미다졸에 의해 활성화시킨 후, 아민과 반응시킴으로써 130으로부터 제조하였다. 뉴클레오시드 137은, 히드록실기를 적절한 염기에 의해 탈양성자화시킨 후, 알킬화제에 의해 음이온을 켄칭시킴으로써 130으로부터 제조하였다. 뉴클레오시드 138은, 히드록실기를 이탈기로 전환시킨 후, 티올 친핵체로 치환시킴으로써 130으로부터 제조하였다. 뉴클레오시드 139는, 아지드기를 환원시킨 후, 이소시아네이트 또는 이소티오시아네이트와 반응시킴으로써 134로부터 제조하였다. 뉴클레오시드 140은, 아지도기를 환원시키고, FmocNCS와 반응시켜 활성화된 티오우레아를 수득함으로써 134로부터 제조하였다. fmoc 활성화된 티오우레아를 EDC의 존재 하에 아민과 추가로 반응시킴으로써 치환된 구아디닌을 수득하였다. fmoc 보호기를 제거하여 뉴클레오시드 140을 유리시켰다.
실시예 20
6-치환된 BNA 포스포라미다이트 뉴클레오시드의 제조
Figure 112008060828411-PCT00042
뉴클레오시드 142는, 촉매적 수소화에 의해 3'- 및 5'-O 보호기를 제거함으로써 뉴클레오시드 130 내지 140으로부터 제조하였다. 별법으로, 142는, 먼저 DDQ에 의해 3'O-Nap기를 제거한 후, 촉매적 수소화에 의해 5'O-벤질기를 제거함으로써 130 내지 140으로부터 제조할 수 있다. 후속되는 디메톡시트리틸 에테르로서의 5' 히드록실기의 보호 후, 포스파이틸화 반응에 의해 포스포라미다이트 143을 수득하였다.
실시예 21
O-CH2F 뉴클레오시드의 제조
Figure 112008060828411-PCT00043
(a) DAST, CH2Cl2, -78℃ 내지 실온, 16시간, 52% (b) DDQ, CH2Cl2, H2O, 실온, 8시간, 정량, (e) 10% Pd/C, H2 기구, 50% (d) DMTCl, 피리딘, 55% (e) (iPr2)2NPOCH2CH2CN, 테트라졸, NMI, DMF
A) 뉴클레오시드 (131a).
디에틸아미노설퍼트리플루오라이드 (DAST, 0.16 mL, 1.4 mmol)를 디클로로메탄 (2 mL) 중의 뉴클레오시드 129a (0.1 g, 0.2 mmol)의 저온 (-50℃) 용액에 첨가하였다. 반응물을 점차 실온으로 가온시키고, 16시간 동안 교반하고, 그 후, 이를 포화 NaHCO3 용액으로 조심스럽게 켄칭시켰다. 이어서, 반응물을 EtOAc와 염수 사이에 분배하고, 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 헥산 중의 33% EtOAc)로 정제하여 뉴클레오시드 131a (51 mg, 52%, 15 내지 20%의 개환 불순물로 오염됨)를 이성질체 혼합물로서 수득하였다.
Figure 112008060828411-PCT00044
B) 뉴클레오시드 (141a).
DDQ (44 mg, 0.2 mmol)를 디클로로메탄 (1 mL) 및 물 (2 방울) 중의 뉴클레오시드 131a (51 mg, 0.1 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 8시간 동안 교반한 후, 반응물을 EtOAc로 희석하고, 유기상을 10% NaHSO3 용액, 포화 NaHCO3 용액, 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 클로로포름 중의 30% 아세톤)로 정제하여 뉴클레오시드 141a (41 mg, 이성질체 혼합물로서 정량)를 수득하였다. 19F NMR (CDCl3): δ-229.3 (t) 및 -230.97 (dt). LCMS: 체류 시간 2.66분; M+H 계산치 379.12, 실측치 379.0
C) 뉴클레오시드 (142a).
메탄올 (2 mL) 중의 뉴클레오시드 141a (41 mg, 상기로부터 얻음) 및 목탄 상 팔라듐 (10%) (10 mg)의 혼합물을 수소 기구를 이용하여 수소화시켰다. 3시간 후, 모든 출발 물질 뉴클레오시드 141a가 소모되었다 (반응 혼합물의 LCMS 분석에 의해 나타남). 반응물을 셀라이트로 여과하고, 여액을 감압 하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 클로로포름 중의 10 내지 20% 메탄올)로 정제하여 뉴클레오시드 142a (14 mg, 50%)를 이성질체 혼합물로서 수득하였다. 19F NMR (CDCl3): δ-231.45 (t) 및 - 232.88 (dt). LCMS: 체류 시간 1.72분; M+Na 계산치 311.08, 실측치 311.0.
D) 뉴클레오시드 (142aa).
DMTCl (24 mg, 0.07 mmol)을 피리딘 (0.25 mL) 중의 뉴클레오시드 142a (14 mg, 0.049 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 3시간 동안 교반한 후, 반응물을 감압 하에 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 클로로포름 중의 20 내지 30% 아세톤)로 정제하여 뉴클레오시드 142aa (16 mg, 55%)를 이성질체 혼합물로서 수득하였다. 19F NMR (CDCl3): δ -228.6 (t) 및 -230.91 (dt). LCMS: 체류 시간 3.56분; M+Na 계산치 613.21, 실측치 613.1.
E) 아미다이트 (143a).
실시예 1에 기재된 바와 같이 포스파이틸화 반응을 이용하여 뉴클레오시드 142aa로부터 아미다이트 143a를 제조하였다.
실시예 22
뉴클레오시드 포스포라미다이트의 합성
본원에서 예시된, 또한 미국 특허 제6,426,220호 및 PCT 공개 제WO 02/36743호 (이에 제한되지는 않음) 등의 당업계에서 설명된 절차에 따라 뉴클레오시드 포스포라미다이트의 제조를 수행하였다.
실시예 23
올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오시드 합성
본 발명에 따라 사용되는 올리고머 화합물은 고체상 합성에 대한 공지된 기 술을 통해 편리하게 또한 통상적으로 제조할 수 있다. 이러한 합성을 위한 장비는 여러 공급업체, 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)에 의해 시판된다. 당업계에 공지된 이러한 합성을 위한 임의의 다른 수단을 추가로 또는 이를 대신하여 사용할 수 있다. 유사한 기술을 이용하여 올리고뉴클레오티드, 예컨대 포스포로티오에이트 및 알킬화된 유도체를 제조하는 것이 공지되어 있다.
올리고뉴클레오티드: 비치환된 및 치환된 포스포디에스테르 (P=O) 올리고뉴클레오티드는 요오드에 의한 산화와 함께 표준 포스포라미다이트 화학을 이용하여 자동화 DNA 합성기 (어플라이드 바이오시스템즈 모델 394)에서 합성할 수 있다.
포스포로티오에이트 (P=S)는 하기 예외사항을 제외하고는 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드와 유사하게 합성하였다. 포스파이트 연결기의 산화를 위해 아세토니트릴 중의 3, H-1,2-벤조디티올-3-온 1,1-디옥시드의 10% w/v 용액을 사용하여 티아화(thiation)를 수행하였다. 티아화 반응 단계의 시간을 180초로 증가시켰고, 이는 통상적 캡핑 단계에 이어졌다. CPG 컬럼으로부터 절단 및 55℃에서의 농축 수산화암모늄의 블록해제 (12 내지 16시간) 후, 올리고뉴클레오티드를 1 M NH4OAc 용액으로부터 3 부피 초과의 에탄올로 침전시킴으로써 회수하였다. 포스피네이트 올리고뉴클레오티드는 미국 특허 제5,508,270호에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
알킬 포스포네이트 올리고뉴클레오티드는 미국 특허 제4,469,863호에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
3'-데옥시-3'-메틸렌 포스포네이트 올리고뉴클레오티드는 미국 특허 제5,610,289호 또는 동 제5,625,050호에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
포스포라미다이트 올리고뉴클레오티드는 미국 특허 제5,256,775호 또는 동 제5,366,878에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
알킬포스포노티오에이트 올리고뉴클레오티드는 공개된 PCT 특허출원 제PCT/US94/00902호 및 동 제PCT/US93/06976호 (각각 WO 94/17093 및 WO 94/02499로서 공개됨)에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
3'-데옥시-3'-아미노 포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는 미국 특허 제5,476,925호에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
포스포트리에스테르 올리고뉴클레오티드는 미국 특허 제5,023,243호에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
보라노 포스페이트 올리고뉴클레오티드는 미국 특허 제5,130,302호 및 동 제5,177,198호에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
올리고뉴클레오시드: 메틸렌메틸이미노 연결된 올리고뉴클레오시드 (또한, MMI 연결된 올리고뉴클레오시드로서 식별됨), 메틸렌디메틸히드라조 연결된 올리고뉴클레오시드 (또한, MDH 연결된 올리고뉴클레오시드로서 식별됨), 및 메틸렌카르보닐아미노 연결된 올리고뉴클레오시드 (또한, 아미드-3 연결된 올리고뉴클레오시드로서 식별됨), 및 메틸렌아미노카르보닐 연결된 올리고뉴클레오시드 (또한, 아미드-4 연결된 올리고뉴클레오시드로서 식별됨), 뿐만 아니라 예를 들어 MMI 및 P=O 또는 P=S 연결기를 교대로 갖는 혼합된 주쇄 올리고머 화합물을, 미국 특허 제5,378,825호; 동 제5,386,023호; 동 제5,489,677호; 동 제5,602,240호 및 동 제5,610,289호에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
포름아세탈 및 티오포름아세탈 연결된 올리고뉴클레오시드는 미국 특허 제5,264,562호 및 동 제5,264,564호에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
에틸렌 옥시드 연결된 올리고뉴클레오시드는 미국 특허 제5,223,618호에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
실시예 24
올리고뉴클레오티드 단리
조절된 기공 유리 고체 지지체로부터의 절단 및 55℃에서 12 내지 16시간 동안의 농축 수산화암모늄에서의 블록해제 후, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오시드를 3 부피 초과의 에탄올로 1 M NH4OAc로부터 침전시킴으로써 회수하였다. 합성된 올리고뉴클레오티드를 전기분무 질량 분광측정법 (분자량 측정)에 의해, 또한 모세관 겔 전기영동법에 의해 분석하였다. 합성에서 얻어진 포스포로티오에이트 및 포스포디에스테르 연결기의 상대적 양을 -16 amu의 생성물에 대한 보정 분자량의 비율에 의해 정하였다 (+/-32 +/-48). 일부 연구에서는, 올리고뉴클레오티드를 문헌 [Chiang et al., J. Biol. Chem. 1991, 266, 18162-18171]에 기재된 바와 같이 HPLC로 정제하였다. HPLC-정제된 물질에서 얻어진 결과는 일반적으로 비-HPLC 정제된 물질에서 얻어진 결과와 유사하였다.
실시예 25
올리고뉴클레오티드 합성 - 96 웰 플레이트 포맷
올리고뉴클레오티드는, 96-웰 포맷에서 96개의 서열을 동시에 어셈블링할 수 있는 자동화 합성기에서 고체상 P(III) 포스포라미다이트 화학에 의해 합성할 수 있다. 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 연결기를 수성 요오드에 의한 산화에 의해 얻었다. 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결기를 무수 아세토니트릴 중의 3, H-1,2 벤조디티올-3-온 1,1 디옥시드 (뷰케이지 시약(Beaucage Reagent))를 사용한 황화에 의해 생성시켰다. 표준 염기-보호된 베타-시아노에틸-디이소-프로필 포스포라미다이트를 시판원 (예를 들어 PE-어플라이드 바이오시스템즈 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재), 또는 파마시아(Pharmacia) (미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재))로부터 구입하였다. 비-표준 뉴클레오시드는 표준 또는 특허 방법에 따라 합성하였다. 이들을 염기 보호된 베타-시아노에틸디이소프로필 포스포라미다이트로서 사용하였다.
올리고뉴클레오티드를 지지체로부터 절단시키고, 승온 (55 내지 60℃)에서 12 내지 16시간 동안 농축 NH4OH에 의해 탈보호시키고, 이어서 방출된 생성물을 진공에서 건조시켰다. 이어서, 건조된 생성물을 멸균수 중에 재현탁시켜 마스터 플레이트를 얻고, 이어서 이로부터 모든 분석 및 테스트 플레이트 샘플을 로봇 피펫터를 이용하여 희석시켰다.
실시예 26
96-웰 플레이트 포맷을 사용한 올리고뉴클레오티드 분석
각각의 웰내의 올리고뉴클레오티드의 농도를 샘플 희석 및 UV 흡수 분광측정법에 의해 평가하였다. 개별 생성물의 전장(full-length) 일체성을, 96-웰 포맷 (베크만(Beckman) P/ ACETM MDQ)내에서, 또는 개별적으로 제조된 샘플의 경우, 시판용 CE 장치 (예를 들어, 베크만 P/ACETM 5000, ABI 270)에서 모세관 전기영동법 (CE)에 의해 평가하였다. 염기 및 주쇄 조성을 전기분무 질량 분광측정법을 이용한 올리고머 화합물의 질량 분석에 의해 확인하였다. 모든 분석 테스트 플레이트를 단일 및 다중 채널 로봇 피펫터를 이용하여 마스터 플레이트로부터 희석하였다. 플레이트 상의 올리고머 화합물의 85% 이상이 85% 이상의 전장을 갖는 경우, 플레이트를 허용가능한 것으로 평가하였다.
실시예 27
세포 배양 및 올리고뉴클레오티드 처리
표적 핵산 발현에 대한 올리고머 화합물의 효과는, 표적 핵산이 측정가능한 농도로 존재한다면 다양한 세포 유형 중 어느 것에서도 테스트할 수 있다. 이는 통상적으로, 예를 들어 PCR 또는 노던 블럿(Northern blot) 분석을 이용하여 측정할 수 있다. 다수의 조직 및 종에서 유래된 세포주는 미국 미생물 보존 센터(American Type Culture Collection; ATCC) (미국 버지니아주 마나사스 소재)로부터 얻을 수 있다.
하기 세포 유형은 예시의 목적으로 제공된 것이며, 표적이 선택된 세포 유형 에서 발현된다면 다른 세포 유형을 통상적으로 사용할 수 있다. 이는 당업계에서 통상적인 방법, 예를 들어 노던 블럿 분석, 리보뉴클레아제 보호 분석 또는 RT-PCR에 의해 용이하게 정할 수 있다.
b.END 세포: 마우스 뇌 내피 세포주 b.END를 막스 플랑크 인스티튜트(Max Plank Institute) (독일 배드 나우하임 소재)의 베르너 리사우(Werner Risau) 박사로부터 얻었다. b.END 세포를 통상적으로 10% 우태아혈청 (인비트로겐 라이프 테크놀로지스(Invitrogen Life Technologies) (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재))으로 보충된 DMEM, 고 글루코스 (인비트로겐 라이프 테크놀로지스 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재))에서 배양시켰다. 세포가 대략 90% 융합에 도달하였을 때 세포에 통상적으로 트립신처리 및 희석을 적용하였다. 세포를 올리고머 화합물 형질감염 실험을 비롯한 (이에 제한되지는 않음) 용도로 사용하기 위해 대략 3000개 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트 (팔콘-프리마리아(Falcon-Primaria) #353872, BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences) (미국 매사추세츠주 베드포드 소재))내에 시딩하였다.
실험은 세포를 올리고머 화합물로 처리하는 것을 포함하였다.
세포가 적절한 융합에 도달하였을 때, 이들을 상기한 바와 같은 형질감염 방법을 이용하여 올리고머 화합물로 처리하였다.
리포펙틴(LIPOFECTIN)TM
세포가 65 내지 75%의 융합에 도달하였을 때, 이들을 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 올리고뉴클레오티드를 옵티-멤(Opti-MEM)TM-1 환원된 혈청 배지 (인비트로겐 라이프 테크놀로지스 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재))에서 리포펙틴TM (인비트로겐 라이프 테크놀로지스 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재))과 혼합하여 요망되는 농도의 올리고뉴클레오티드 및 리포펙틴TM 농도 (100 nM 올리고뉴클레오티드 당 2.5 또는 3 ㎍/mL임)를 달성하였다. 이 형질감염 혼합물을 실온에서 대략 0.5시간 동안 인큐베이션시켰다. 96-웰 플레이트에서의 세포 성장을 위해, 웰을 100 ㎕ 옵티-멤TM-1로 1회 세척하고, 이어서 형질감염 혼합물 130 ㎕로 처리하였다. 24-웰 플레이트 또는 다른 표준 세포 배양 플레이트에서의 세포 성장을, 적절한 부피의 배지 및 올리고뉴클레오티드를 사용하여 유사하게 처리하였다. 세포를 처리하고, 데이타를 이중 또는 삼중으로 얻었다. 37℃에서 처리한 지 대략 4 내지 7시간 후, 형질감염 혼합물을 함유하는 배지를 새로운 배양 배지로 대체하였다. 세포를 올리고뉴클레오티드 처리 후 16 내지 24시간에 수거하였다.
당업계에 공지된 다른 적합한 형질감염 시약으로는, 시토펙틴(CYTOFECTIN)TM, 리포펙타민(LIPOFECTAMINE)TM, 올리고펙타민(OLIGOFECTAMINE)TM 및 푸제네(FUGENE)TM가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 당업계에 공지된 다른 적합한 형질감염 방법으로는, 전기천공법이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
실시예 28
표적 발현의 올리고뉴클레오티드 억제에 대한 분석
표적 발현의 안티센스 조절은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 분석할 수 있다. 예를 들어, 표적 mRNA 농도는, 예를 들어 노던 블럿 분석, 경쟁적 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 또는 실시간 PCR에 의해 정량가능하다. 현재에는 실시간 정량 PCR이 바람직하다. RNA 분석은 전체 세포 RNA 또는 폴리(A)+ mRNA에 대해 수행할 수 있다. 본 발명의 한 가지 RNA 분석 방법은, 본원에서 다른 실시예에 기재된 바와 같이 전체 세포 RNA를 사용하는 것이다. RNA 단리 방법은 당업계에 공지되어 있다. 노던 블럿 분석 또한 당업계에서 통상적이다. 실시간 정량 (PCR)은 제조업자의 지시에 따라 사용되는 상업적으로 입수가능한 ABI 프리즘(ABI PRISM)TM 7600, 7700 또는 7900 서열 검출 시스템 (PE-어플라이드 바이오시스템즈 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)로부터 입수가능함)을 사용하여 편리하게 달성할 수 있다.
표적의 단백질 농도는, 면역침전, 웨스턴 블럿(Western blot) 분석 (면역블럿법), 효소 연관 면역흡착 분석법 (ELISA) 또는 형광 활성 세포 선별법 (FACS) 등의 당업계에 공지된 다양한 방법으로 정량가능하다. 표적을 향하는 항체는 다양한 공급원, 예컨대 항체의 MSRS 카탈로그 (아에리 코포레이션(Aerie Corporation) (미국 미시간주 버밍햄 소재))로부터 식별 및 구입가능하거나, 또는 당업계에 공지되어 있는 통상의 단일클론성 또는 다클론성 항체 생성 방법에 의해 제조할 수 있다. 다클론성 항혈청의 제조 방법은, 예를 들어 문헌 [Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.12.1-11.12.9, John Wiley & Sons, Inc., 1997]에 교시되어 있다. 단일클론성 항체의 제조 방법은, 예를 들어 문헌 [Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, V olume 2, pp. 11.4.1-11.11.5, John Wiley & Sons, Inc., 1997]에 교시되어 있다.
면역침전 방법은 당업계에서 표준이며, 예를 들어 문헌 [Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.16.1-10.16.11, John Wiley & Sons, Inc., 1998]에서 찾아볼 수 있다. 웨스턴 블럿 (면역블럿) 분석은 당업계에서 표준이며, 예를 들어 문헌 [Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.8.1-10.8.21, John Wiley & Sons, hie, 1997]에서 찾아볼 수 있다. 효소 연관 면역흡착 분석법 (ELISA)은 당업계에서 표준이며, 예를 들어 문헌 [Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.2.1-11.2.22, John Wiley & Sons, Inc., 1991]에서 찾아볼 수 있다.
실시예 29
표적 억제제 사용을 위한 표현형 분석 및 생체내 연구의 디자인
표현형 분석
본원에 개시된 방법에 의해 표적 억제제를 확인하면, 각각 특정 질병 상태 또는 질환의 치료에 있어서의 효능에 대한 측정가능한 종점 예측치를 갖는 하나 이상의 표현형 분석에서 올리고머 화합물을 추가로 조사하였다.
표현형 분석, 그의 사용을 위한 키트 및 시약은 당업자에게 공지되어 있으며, 이를 본원에서 사용하여 건강 및 질병 상태에서의 표적의 연관성 및/또는 역할 을 조사하였다. 여러 시판원 중 어느 하나로부터 구입가능한 대표적 표현형 분석은, 세포 생존율, 세포독성, 증식 또는 세포 생존을 측정하기 위한 것들 (몰레큘라 프로브즈(Molecular Probes) (미국 오레곤주 유젠 소재); 퍼킨엘머(PerkinElmer) (미국 매사추세츠주 보스톤 소재), 효소 분석을 포함한 단백질에 기초한 분석 (판베라 엘엘씨(Panvera, LLC) (미국 위스콘신주 매디슨 소재); BD 바이오사이언시즈 (미국 뉴저지주 프랭클린 래이크스 소재); 옹코진 리서치 프로덕츠(Oncogene Research Products) (미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)), 세포 조절, 신호 전달, 염증, 산화 방법 및 세포자멸 (어세이 디자인즈 인코포레이티드(Assay Designs Inc.) (미국 미시간주 앤 아보르 소재)), 트리글리세리드 축적 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) (미국 미주리주 세인트 루이스 소재)), 혈관신생 분석, 튜브 형성 분석, 시토킨 및 호르몬 분석 및 대사 분석 (케미콘 인터내쇼날 인코포레이티드(Chemicon International Inc.) (미국 캘리포니아주 테메쿨라 소재); 아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences) (미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재))을 포함한다.
비제한적 일례에서는, 특정 표현형 분석에 적절한 것으로 정해진 세포 (즉, 유방암 연구를 위해 선택된 MCF-7 세포; 비만 연구를 위한 지방세포)를 상기한 방법에 의해 측정된 최적 농도의 대조군 화합물 및 시험관내 연구로부터 확인된 표적 억제제로 처리하였다. 치료 기간 종료시, 처리된 및 비처리된 세포를 표현형 결과 및 종점을 측정하는 분석에 대해 특이적인 하나 이상의 방법에 의해 분석하였다.
표현형 종점은, 시간 또는 처리량에 따른 세포 형상 변화 뿐만 아니라 세포 성분, 예컨대 단백질, 지질, 핵산, 호르몬, 당류 또는 금속의 농도 변화를 포함하였다. pH, 세포 순환 단계, 세포에 의한 생물학적 지표의 흡수 또는 배출을 포함한 세포 상태의 측정 또한 관심있는 종점이었다.
처리 후 세포의 하나 이상의 유전자의 발현 측정 또한 표적 억제제의 효능 에 대한 지표로서 사용하였다. 홀마크(hallmark) 유전자, 또는 특정 질병 상태, 질환 또는 표현형과 관련되는 것으로 의심되는 유전자를 처리된 및 비처리된 세포 둘 다에서 측정하였다.
생체내 연구
본원에 기재된 생체내 연구의 개별 대상체는 인간을 포함한 온혈 척추 동물이었다.
실시예 30
RNA 단리
폴리(A)+ mRNA 단리
폴리(A)+ mRNA를 문헌 [Miura et al., Clin. Chem., 1996, 42, 1758-1764]에 따라 단리하였다. 폴리(A)+ mRNA 단리를 위한 다른 방법이 당업계에 공지되어 있다. 간단히, 96-웰 플레이트에서의 세포 성장을 위해, 성장 배지를 세포로부터 제거하고, 각각의 웰을 저온 PBS 200 ㎕로 세척하였다. 60 ㎕의 용해 완충액 (10 mM 트리스(Tris)-HCl, pH 7.6, 1 mM EDTA, 0.5 M NaCl, 0.5% NP-40, 20 mM 바나딜-리보뉴클레오시드 착체)을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 온화하게 교반하고, 이어서 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 용해질 55 ㎕를 올리고 d(T) 코팅된 96-웰 플레이트 (AGCT 인코포레이티드(AGCT Inc.) (미국 캘리포니아주 아르빈 소재))로 옮겼다. 플레이트를 실온에서 60분 동안 인큐베이션시키고, 세척 완충액 (10 mM 트리스-HCl, pH 7.6, 1 mM EDTA, 0.3 M NaCl)으로 3회 세척하였다. 최종 세척 후, 플레이트를 페이퍼 타월 상에서 블럿팅하여 과량의 세척 완충액을 제거하고, 이어서 5분 동안 통풍 건조시켰다. 70℃로 예열된 용출 완충액 (5 mM 트리스-HCl, pH 7.6) 60 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 90℃ 핫 플레이트에서 5분 동안 인큐베이션시키고, 이어서 용출물을 새로운 96-웰 플레이트로 옮겼다.
100 mm 또는 다른 표준 플레이트에서의 세포 성장을 적절한 부피의 모든 용액을 사용하여 유사하게 처리할 수 있다.
전체 RNA 단리
키아젠 인코포레이티드(Qiagen Inc.) (미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)로부터 구입된 RNEASY 96TM 키트 및 완충액을 사용하여 제조업체의 권장 절차에 따라 전체 RNA를 단리하였다. 간단히, 96-웰 플레이트에서의 세포 성장을 위해, 성장 배지를 세포로부터 제거하고, 저온 PBS 200 ㎕로 세척하였다. 완충액 RLT 150 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 20초 동안 격렬히 교반하였다. 이어서, 70% 에탄올 150 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고, 내용물을 상하로 3회 피펫팅함으로써 혼합하였다. 이어서, 샘플을 폐기물 수집 트레이가 장착되고 진공 공급원에 부착된 QIAVACTM 다기관에 부착된 RNEASY 96TM 웰 플레이트로 옮겼다. 진공을 1분 동안 적용하였다. 완충액 RW1 500 ㎕를 RNEASY 96TM 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 15 분 동안 인큐베이션시키고, 다시 진공을 1분 동안 적용하였다. 추가의 완충액 RW1 500 ㎕를 RNEASY 96TM 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 진공을 2분 동안 적용하였다. 이어서, 완충액 RPE 1 mL를 RNEASY 96TM 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 진공을 90초의 시간 동안 적용하였다. 이어서, 완충액 RPE 세척을 반복하고, 진공을 추가의 3분 동안 적용하였다. 이어서, 플레이트를 QIAVACTM 다기관으로부터 제거하고, 페이퍼 타월 상에서 블럿팅 건조시켰다. 이어서, 플레이트를 1.2 mL의 수집 튜브를 갖는 수집 튜브 랙이 장착된 QIAVACTM 다기관에 재부착시켰다. 이어서, RNA를 각각의 웰내에 RNAse를 함유하지 않는 물 140 ㎕를 피펫팅하고, 1분 동안 인큐베이션시키고, 이어서 진공을 3분 동안 적용함으로써 용출시켰다.
반복적 피펫팅 및 용출 단계는 키아젠 바이오-로봇(QIAGEN Bio-Robot) 9604 (키아젠, 인코포레이티드 (미국 캘리포니아주 발렌시아 소재))를 이용하여 자동화할 수 있다. 본질적으로, 배양 플레이트 상에서의 세포 용해 후, 플레이트를 로봇 데크로 옮기고, 여기서 피펫팅, DNase 처리 및 용출 단계를 수행하였다.
실시예 31
표적 mRNA 농도의 실시간 정량 PCR 분석
제조업자의 지시에 따라 ABI 프리즘TM 7600, 7700, 또는 7900 서열 검출 시스템 (PE-어플라이드 바이오시스템즈 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재))을 이용하여 실시간 정량 PCR에 의해 표적 mRNA 농도의 정량을 달성하였다. 이는 폐쇄 튜브, 비-겔(non-gel) 기재의 형광 검출 시스템이며, 이는 실시간으로 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 생성물의 고처리량 정량을 가능하게 한다. PCR 완료 후 증폭 생성물이 정량되지 않는 표준 PCR과 달리, 실시간 정량 PCR에서의 생성물은 이들이 축적됨에 따라 정량된다. 이는 정방향 및 역방향 PCR 프라이머 사이에서 특이적으로 어닐링되고, 2종의 형광 염료를 함유하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 PCR 반응에 포함시킴으로써 달성된다. 정보제공 염료 (예를 들어, FAM 또는 JOE, PE-어플라이드 바이오시스템즈 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재), 오페론 테크놀로지즈 인코포레이티드(Operon Technologies Inc.) (미국 캘리포니아주 알라메다 소재), 또는 인테그레이티드 DNA 테크놀로지스 (미국 아이오와주 코랄빌 소재)로부터 입수됨)를 프로브의 5' 말단에 결합시키고, 소광제 염료 (예를 들어 TAMRA, PE-어플라이드 바이오시스템즈 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재), 오페론 테크놀로지즈 인코포레이티드 (미국 캘리포니아주 알라메다 소재), 또는 인테그레이티드 DNA 테크놀로지스 (미국 아이오와주 코랄빌 소재)로부터 입수됨)를 프로브의 3' 말단에 결합시켰다. 프로브 및 염료가 그대로일 때, 정보제공 염료 발광을 3' 소광제 염료에 근접시킴으로써 소광시켰다. 증폭 동안, 표적 서열에 대한 프로브의 어닐링에 의해 기질이 생성되었고, 이는 Taq 중합효소의 5'-엑소뉴클레아제 활성에 의해 절단될 수 있다. PCR 증폭 사이클의 증식 단계 동안, Taq 중합효소에 의한 프로브의 절단에 의해, 나머지 프로브로부터 (또한 이에 따라 소광제 잔기로부터) 정보제공 염료가 방출되고, 서열-특이적 형광 신호가 생성되었다. 각각의 사이클에서, 추가의 정보제공 염료 분자를 그의 각각의 프로브로부터 절단시키고, ABI 프리즘TM 서열 검출 시스템내에 조립된 레이저 광학기기에 의해 일정 간격으로 형광 강도를 모니터링하였다. 추가의 정보제공 염료 분자를 그의 각각의 프로브로부터 절단시키고, ABI 프리즘 서열 검출 시스템으로의 레이저 광학 조립체에 의해 일정 간격으로 형광 강도를 모니터링하였다. 각각의 분석에서, 처리되지 않은 대조군 샘플로부터의 mRNA의 일련의 희석을 포함하는 일련의 병행 반응에 의해 표준 곡선이 생성되었고, 이를 이용하여 테스트 샘플의 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리 후의 억제율 (%)을 정량하였다.
정량 PCR 분석에 앞서, 측정되는 표적 유전자에 대해 특이적인 프라이머-프로브 세트를 GAPDH 증폭 반응에 의한 이들의 "다중가닥 형성" 능력에 대해 평가하였다. 다중가닥 형성에서는, 표적 유전자 및 내부 표준 유전자 GAPDH 둘 다 단일 샘플에서 동시에 증폭된다. 이 분석에서는, 처리되지 않은 세포로부터 단리된 mRNA를 연속적으로 희석하였다. 각각의 희석은 GAPDH에 대해서만, 표적 유전자에 대해서만 ("단일가닥 형성"), 또는 이들 둘 다에 대해 ("다중가닥 형성") 특이적인 프라이머-프로브 세트의 존재 하에 증폭되었다. PCR 증폭에 따라, 희석에 대한 함수로서의 GAPDH 및 표적 mRNA 신호의 표준 곡선이 단일가닥 및 다중가닥 샘플 둘 다로부터 생성되었다. 다중가닥 샘플로부터 생성된 GAPDH 및 표적 신호의 기울기 및 상관 계수 둘 다가 단일가닥 샘플로부터 생성된 이들의 상응하는 값의 10%내에 포함되는 경우, 그 표적에 대해 특이적인 프라이머-프로브 세트를 다중가닥형성가 능한 것으로 간주하였다. 다른 PCR 방법 또한 당업계에 공지되어 있다.
RT 및 PCR 시약은 인비트로겐 라이프 테크놀로지스 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)로부터 입수하였다. 20 ㎕의 PCR 칵테일 (2.5x PCR 완충액-MgCl2, 6.6 mM MgCl2, 각각 375 μM의 dATP, dCTP, dCTP 및 dGTP, 각각 375 nM의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 125 nM 프로브, 4 유닛의 RNAse 억제제, 1.25 유닛의 플래티넘(PLATINUM)® Taq, 5 유닛의 MuLV 역전사효소, 및 2.5x ROX 염료)을 30 ㎕의 전체 RNA 용액 (20 내지 200 ng)을 함유하는 96-웰 플레이트에 첨가함으로써 RT, 실시간 PCR을 수행하였다. RT 반응은, 48℃에서 30분 동안 인큐베이션시킴으로써 수행하였다. 95℃에서 10분 인큐베이션시켜 플래티넘® Taq을 활성화시킨 후, 40 사이클의 2 단계 PCR 프로토콜을 수행하였다: 95℃에서 15초 동안 (변성), 그 후 60℃에서 1.5분 동안 (어닐링/증식).
RT, 실시간 PCR에 의해 얻어진 유전자 표적 양을, 발현이 일정한 유전자, GAPDH의 발현 수준을 사용하여, 또는 리보그린(RIBOGREEN)TM (몰레큘라 프로브즈 (미국 오레곤주 유젠 소재))을 사용하여 전체 RNA를 정량함으로써 정규화하였다. GAPDH 발현은 실시간 RT-PCR에 의해, 다중가닥형성 표적과 동시에 또는 별도로 실행함으로써 정량하였다. 전체 RNA는 리보그린TM RNA 정량 시약 (몰레큘라 프로브즈, 인코포레이티드 (미국 오레곤주 유젠 소재))을 사용하여 정량하였다. 리보그 린TM에 의한 RNA 정량 방법은 문헌 [Jones, L. J., et al, Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374]에 교시되어 있다.
이 분석에서는, 리보그린TM 작용 시약 (1O mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5 중에 1:350으로 희석된 리보그린TM 시약) 170 ㎕를 정제된 세포 RNA 30 ㎕를 함유하는 96-웰 플레이트내에 피펫팅하였다. 플레이트를 485 nm의 여기 파장 및 530 nm의 발광 파장에서 시토플루오르(CytoFluor) 4000 (PE 어플라이드 바이오시스템즈)에서 판독하였다.
실시예 32
표적 특이적 프라이머 및 프로브
공개된 서열 정보를 이용하여 프로브 및 프라이머를 표적 서열에 부합되도록 디자인할 수 있다.
예를 들어, 인간 PTEN에 대해, 공개된 서열 정보 (진뱅크(GENBANK)TM 등록 번호 U92436.1, 서열 ID NO: 1)를 이용하여 하기 프라이머-프로브 세트를 디자인하였다.
정방향 프라이머: AATGGCTAAGTGAAGATGACAATCAT (서열 ID NO: 2)
역방향 프라이머: TGCACATATCATTACACCAGTTCGT (서열 ID NO: 3)
및 PCR 프로브:
FAM-TTGCAGCAATTCACTGTAAAGCTGGAAAGG-TAMRA (서열 ID NO: 4) (여기서, FAM은 형광 염료이고, TAMRA는 소광제 염료임)
실시예 33
표적 단백질 농도의 웨스턴 블럿 분석
표준 방법을 이용하여 웨스턴 블럿 분석 (면역블럿 분석)을 수행하였다. 세포를 올리고뉴클레오티드 처리 후 16 내지 20시간에 수거하고, PBS로 1회 세척하고, 라엠리(Laemmli) 완충액 (100 ㎕/웰) 중에 현탁시키고, 5분 동안 비등시키고, 16% SDS-PAGE 겔 상에 로딩하였다. 겔을 150 V에서 1.5시간 동안 진행시키고, 웨스턴 블럿팅을 위한 멤브레인으로 옮겼다. 표적을 향하는 적절한 1차 항체를 사용하고, 방사선표지되거나 형광 표지된 2차 항체는 1차 항체종에 반대로 향하도록 하였다. 밴드를 포스포르이미저(PHOSPHORIMAGER)TM (몰레큘라 다이나믹스(Molecular Dynamics) (미국 캘리포니아주 서니배일 소재))를 이용하여 가시화하였다.
실시예 34
PTEN을 표적으로 하는 6-(R 또는 S)-CH3 및 6-(R 또는 S)-CH2-O-CH3 BNA 2-10-2 갭을 갖는 올리고머: 시험관내 연구
본 발명에 따라, 올리고머 화합물을 합성하고, 일정 범위의 적용량에 걸쳐 PTEN 발현을 감소시키는 그의 능력에 대해 테스트하였다. b.END 세포를, 본원에 기재된 방법을 이용하여 0.3125, 0.0625, 1.25, 2.5, 5, 10 또는 20 nM 농도의 6-(R 또는 S)-CH3-BNA (각각 392748 및 392749) 및 6-(R 또는 S)-CH2-O-CH3 (각각 396004 및 396005) 변형된 올리고머로 처리하였다. 실시간 PCR을 이용하여 PTEN의 발현 수준을 측정하고, 본원에서 다른 실시예에 기재된 바와 같이 리보그린TM으로 정규화하였다. 생성된 적용량-반응 곡선을 이용하여 하기에 나타낸 바와 같은 EC50을 측정하였다. 4μM 6-(R 또는 S)-CH3-BNA 또는 6-(R 또는 S)-CH2-O-CH3 변형된 올리고머 및 4μM 상보성 RNA를 사용하여, 260 nm에서 100 mM 포스페이트 완충액 (0.1 mM EDTA, pH 7) 중에서 Tm을 평가하였다.
Figure 112008060828411-PCT00045
모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트이고, 굵게 표시된 뉴클레오시드는 6-(R 또는 S)-CH3 BNA 뉴클레오시드이며, 밑줄친 굵게 표시된 뉴클레오시드는 6-(R 또는 S)-CH2-O-CH3 BNA 뉴클레오시드이고, 아래첨자 R 및 S는 6번 탄소 원자에서의 배열을 나타낸다. 6-변형된 BNA 올리고머 화합물은 Tm의 약간의 감소에도 불구하고 보다 큰 효능을 나타내었음을 주목할 만하다.
실시예 35
PTEN을 표적으로 하는 6-(S)-CH3-BNA 및 6-(R)-CH3-BNA 2-10-2 갭을 갖는 올리고머: 생체내 연구
6주 된 Balb/c 마우스 (잭슨 래보래토리(Jackson Laboratory) (미국 메인주 바 하보 소재))에 PTEN을 표적으로 하는 6-CH3-BNA 변형된 올리고머 (6-(S) 또는 6-(R))을 0.5 또는 2 μmol/kg의 투여량으로 3주 동안 주 당 2회 주사하였다. 마우스를 최종 투여 후 48시간에 희생시켰다. 간 조직을 균질화하고, 본원에 기재된 바와 같은 실시간 PCR을 이용하여 mRNA 농도를 정량하여 처리되지 않은 대조군 농도와 비교하였다 (%UTC).
Figure 112008060828411-PCT00046
모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트이고, 굵게 표시된 뉴클레오시드는 6-CH3-BNA 뉴클레오시드이며, 아래첨자 R 및 S는 6번 탄소 원자에서의 배열을 나타낸다.
실시예 36
PTEN을 표적으로 하는 6-(S)-CH3-BNA 및 6-(R)-CH3-BNA 2-10-2 갭을 갖는 올리고머: 생체내 연구
6주 된 Balb/c 마우스 (잭슨 래보래토리 (미국 메인주 바 하보 소재))에 PTEN을 표적으로 하는 6-CH3-BNA 변형된 올리고머 (6-(S) 또는 6-(R))을 1, 2, 4 또는 8 μmol/kg의 투여량으로 1회 주사하였다. 마우스를 투여 후 72시간에 희생시켰다. 간 조직을 균질화하고, 본원에 기재된 바와 같은 실시간 PCR을 이용하여 mRNA 농도를 정량하여 처리되지 않은 대조군 농도와 비교하였다 (%UTC).
Figure 112008060828411-PCT00047
모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트이고, 굵게 표시된 뉴클레오시드는 6-CH3-BNA 뉴클레오시드이며, 아래첨자 S 및 R은 6번 탄소 원자에서의 배열을 나타낸다.
실시예 37
PTEN을 표적으로 하는 6-(S)-CH3-O-CH2-BNA 및 6-(R)-CH3-O-CH2-BNA 2-10-2 갭을 갖는 올리고머: 생체내 연구
6주 된 Balb/c 마우스 (잭슨 래보래토리 (미국 메인주 바 하보 소재))에 PTEN을 표적으로 하는 6-CH3-BNA 변형된 올리고머 (6-(S) 또는 6-(R))을 1, 2, 4 또는 8 μmol/kg의 투여량으로 1회 주사하였다 (8 μmol/kg의 데이타만 하기에 나타냄). 마우스를 투여 후 72시간에 희생시켰다. 간 조직을 균질화하고, 본원에 기재된 바와 같은 실시간 PCR을 이용하여 mRNA 농도를 정량하여 처리되지 않은 대조군 농도와 비교하였다 (%UTC).
Figure 112008060828411-PCT00048
모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트이고, 굵게 표시된 뉴클레오시드는 6-CH3-BNA 뉴클레오시드이며, 아래첨자 S 및 R은 6번 탄소 원자에서의 배열을 나타낸다.
실시예 38
SVPD로 처리된 6-(R 또는 S)-CH3-BNA 변형된 올리고머의 뉴클레아제 안정성
6-(R 또는 S)-CH3-BNA (각각 392748 및 392749) 변형된 올리고머의 뉴클레아제 안정성을 뱀독 포스포디에스테라제 (SVPD)를 사용하여 측정하였다. 이 연구는, 각각의 6-비치환된 갭머(gapmer) (4'-CH2-O-2' 브릿징된 BNA, 392745, 아래첨자 l) 및 비교용의 2'-O-MOE 갭머 (2'-O-(CH2)2-OCH3, 392753, 아래첨자 e)를 포함하였다. 100 μM 올리고머 5 ㎕, SVPD 완충액 (50 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 8 mM MgCl2) 중의 포스포디에스테라제 I 50 ㎕ (0.5 유닛/mL) (최종 농도 0.05 유닛/mL), SVP 완충액 445 ㎕를 함유하는 혼합물 500 ㎕로서 각각의 올리고머를 제조하였다. 샘플을 수조내 37℃에서 인큐베이션시켰다. 0, 1, 2 및 4일째에 분취량 (100 ㎕)을 취하고, 1 및 2일째에 새로운 효소를 첨가하였다. 제거 직후 EDTA를 분취량에 첨가하여 효소 활성을 소멸시켰다. 샘플을 IP HPLC/MS에서 분석하였다.
Figure 112008060828411-PCT00049
모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트이고, 굵게 표시된 뉴클레오시드는 변형된 뉴클레오시드이며, 아래첨자 R 및 S는 6-CH3-BNA 뉴클레오시드에 대한 6번 탄소 원자에서의 배열을, 아래첨자 e는 2'-O-MOE 뉴클레오시드를, 또한 아래첨자 l은 4'-CH2-O-2' 변형된 뉴클레오시드를 나타낸다. 6-메틸 치환된 BNA 함유 화합물 (각각 392748 및 392749)은 비치환된 BNA 함유 화합물 (392745)에 비해 현저한 향상을 가졌다.
실시예 39
SVPD로 처리된 6-(R 또는 S)-CH3-BNA, 4'-CH2-O-2' BNA 및 2'-O-MOE 변형된 올리고머의 뉴클레아제 안정성
6-CH3-BNA 변형된 올리고머의 뉴클레아제 안정성을 뱀독 포스포디에스테라제 (SVPD)를 사용하여 측정하였다. 각각의 올리고머를 올리고머 5 ㎕ (5 μM 올리고 머 2 ㎕ 및 5' 32P-표지된 올리고머 3 ㎕), H2O 75 ㎕, 및 10X 완충액 (500 mM 트리스-HCl, 700 mM NaCl, 및 140 mM MgCl2, pH 8.6) 10 ㎕를 함유하는 90 ㎕ 혼합물로서 제조하였다. 0분의 시간에, 상기에서 제조된 올리고머 샘플로부터 9 ㎕를 제거하고, 중지 완충액 (6.67 M 우레아, 16.67% 포름아미드 및 83.3 mM EDTA) 10 ㎕, 그 후 H2O 1 ㎕를 첨가하고, 100℃에서 2.5 내지 3분 동안 가열하였다. SVPD (0.5 유닛/mL) 9 ㎕를 첨가하여 분석 동력학을 개시하였다. 최종 효소 농도는 0.05 유닛/mL였다. 10 ㎕의 올리고머 동력학 용액의 각 분취량을 중지 완충액 10 ㎕에 첨가하고, 상기한 바와 같이 가열 실활시켰다. 동적 시점은 1, 3, 9, 27, 80, 240 및 1290분이었다. 샘플을 45 와트/겔로 2시간 동안 12% 아크릴로미드 PAGE 실행에 의해 분석하였다.
Figure 112008060828411-PCT00050
모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트이고, 굵게 표시된 뉴클레오시드는 변형된 뉴클레오시드이며, 아래첨자 R 및 S는 6-CH3-BNA 뉴클레오시드에 대한 6번 탄소 원자에서의 배열을, 아래첨자 e는 2'-O-MOE 뉴클레오시드를, 또한 아래첨자 l은 4'-CH2-O-2' 변형된 뉴클레오시드를 나타낸다.
Figure 112008060828411-PCT00051
실시예 40
3주내의 PTEN을 표적으로 하는 6-(S)-CH3-BNA, 4'-CH2-O-2-BNA, 및 2'-O MOE 갭을 갖는 올리고머, 다중 투여 생체내 연구
6주 된 Balb/c 마우스 (잭슨 래보래토리 (미국 메인주 바 하보 소재))에 PTEN을 표적으로 하는 6-(S)-CH3-BNA (2-10-2, 14량체), 4'-CH2-O-2'-BNA (2-10-2, 14량체) 및 2'-O-MOE (5-10-5, 20량체) 변형된 올리고머를 3.2, 1.0, 0.32 및 0.1 μmol/kg (3.2 및 1 μmol/kg의 데이타만 하기에 나타냄)의 투여량으로 3주 동안 주 당 2회 주사하였다. 마우스를 최종 투여 후 48시간에 희생시켰다. 간 조직을 균질화하고, 본원에 기재된 바와 같은 실시간 PCR을 이용하여 mRNA 농도를 정량하여 처리되지 않은 대조군 농도와 비교하였다 (%UTC). 희생 후 플라즈마 화학 및 간 중량을 측정하였다.
Figure 112008060828411-PCT00052
모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트이고, 굵게 표시된 뉴클레오시드는 변형된 위치이며, 아래첨자 s는 6-(S)-CH3-BNA를, 아래첨자 l은 4'-CH2-O-2' BNA를, 아래첨자 e는 2'-O-MOE를, MeC는 5'-메틸 시토신 뉴클레오시드를 나타낸다.
연구 완성시, 높은 투여량군의 동물은 4'-CH2-O-2' BNA (392063, 3.2 μmol/Kg 투여량군)를 함유하는 올리고머에 대해 간 중량에 있어 현저한 증가 (식염수에 대해 153%)를 나타내었다. 반면, 6-(S)-CH3 BNA (392749, 3.2 μmol/Kg 투여량군)를 함유하는 올리고머에 대한 간 중량은 식염수에 대해 117%였다. 2'O-MOE를 함유하는 올리고머 (116847, 1.0 μmol/Kg 투여량군)에 대한 간 중량은 식염수에 대해 116%였다. 본 실시예는, 6-(S)-CH3-BNA 변형이, 4'-CH2-O-2' BNA 변형된 화합물보다 ALR 농도의 현저한 증가를 가지면서 4'-CH2-O-2' BNA에 의해 제공된 효능을 유지하는 안티센스 올리고머의 디자인을 가능하게 함을 입증한다.
실시예 41
PTEN을 표적으로 하는 6-(R 또는 S)-CH3, 6-(R 또는 S)-CH2-OCH3, 4'-CH2-O-2' BNA 2-10-2 갭을 갖는 올리고머: 생체내 연구
6주 된 Balb/c 마우스 (잭슨 래보래토리 (미국 메인주 바 하보 소재))에 PTEN을 표적으로 하는 변형된 6-(R 또는 S)-CH3 (각각 396568 및 396024), 6-(R 또 는 S)-CH2-OCH3 (각각 396007 및 396008), 4'-CH2-O-2' BNA 2-10-2 갭을 갖는 올리고머를 2.5, 5, 10 및 20 μmol/kg (5 및 10 μmol/Kg의 데이타만 나타냄)의 투여량으로 1회 주사하였다. 마우스를 투여 후 66시간에 희생시켰다. 간 조직을 균질화하였다.
Figure 112008060828411-PCT00053
모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트이고, 굵게 표시된 뉴클레오시드는 변형된 뉴클레오시드이며, 아래첨자 R 및 S는 6-CH3-BNA (단지 굵게 표시됨), 및 6-CH2-O-CH3-BNA (밑줄과 함께 굵게 표시됨) 뉴클레오시드에 대한 6번 탄소 원자에서의 배열을, 아래첨자 l은 4'-CH2-O-2' 뉴클레오시드를, 또한 MeC는 5'-메틸 시토신 뉴클레오시드를 나타낸다.
상기 올리고뉴클레오시드에서, 하나 (ISIS No. 392063)는 6번 탄소 원자에서 키랄인 뉴클레오시드를 포함하지 않았고, 다른 4개 (ISIS No. 396024, 396568, 396008 및 396007)은 이를 포함하였다. 구체적으로, 이들 4개는 1, 2, 13 및 14번 위치에 이러한 하나의 뉴클레오시드를 포함하였다. 이를 포함하지 않는 하나가 이를 포함하는 4개의 올리고뉴클레오시드에 비해 간에서 비교적 높은 독성을 가졌다.
실시예 42
PTEN을 표적으로 하는 2-14-2 갭을 갖는 올리고머: 생체내 연구
6주 된 Balb/c 마우스 (잭슨 래보래토리 (미국 메인주 바 하보 소재))에 PTEN을 표적으로 하는 6-CH3-BNA 변형된 올리고머를 2 또는 10 μmol/kg의 투여량으로 1회 주사하였다. 마우스를 투여 후 72시간에 희생시켰다. 간 조직을 균질화하고, 본원에 기재된 바와 같은 실시간 PCR을 이용하여 mRNA 농도를 정량하여 처리되지 않은 대조군 농도와 비교하였다 (%UTC).
Figure 112008060828411-PCT00054
모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트이고, 굵게 표시된 뉴클레오시드는 변형된 뉴클레오시드이며, 아래첨자 R 및 S는 6-CH3-BNA 및 6-CH2-O-CH3-BNA 뉴클레오시드에 대한 6번 탄소 원자에서의 배열을, 아래첨자 e는 2'-O-MOE 뉴클레오시드를, 또한 MeC는 5'-메틸 시토신 뉴클레오시드를 나타낸다.
본원에서 언급된 모든 공개, 특허 및 특허출원은 본원에 참고로 도입된다. 상기 명세서에서는 본 발명을 그의 특정 바람직한 실시양태에 대해 설명하였고, 많은 상세사항이 예시의 목적으로 기재되었으나, 본 발명은 추가의 실시양태에 적용가능하고, 본원에 기재된 특정 상세사항은 본 발명의 기본 원리에서 벗어나지 않으면서 상당히 변화될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.

Claims (50)

  1. 하기 화학식 1을 갖는 바이시클릭 뉴클레오시드.
    <화학식 1>
    Figure 112008060828411-PCT00055
    식 중,
    Bx는 헤테로시클릭 염기 잔기이고;
    T1은 H 또는 히드록실 보호기이며;
    T2는 H, 히드록실 보호기 또는 반응성 인 기이고;
    Z는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C1-C6 알킬, 치환된 C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알키닐, 아실, 치환된 아실, 치환된 아미드, 티올 또는 치환된 티오이며;
    여기서 치환된 기는 각각 독립적으로, 할로겐, 옥소, 히드록실, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 및 CN으로부터 독립적으로 선택된 임의로 보호된 치환기로 일치환 또는 다치환되고, 여기서 J1, J2 및 J3은 각각 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이고, X는 O, S 또는 NJ1이다.
  2. 제1항에 있어서, Z가 C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알킬인 화합물.
  3. 제2항에 있어서, Z가 메틸인 화합물.
  4. 제2항에 있어서, Z가 치환된 C1-C6 알킬인 화합물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 치환기가 C1-C6 알콕시인 화합물.
  6. 제4항에 있어서, Z가 CH3OCH2-인 화합물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, Z기가 하기와 같이 (R)-배열로 존재하는 화합물.
    Figure 112008060828411-PCT00056
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, Z기가 하기와 같이 (S)-배열로 존재하는 화합물.
    Figure 112008060828411-PCT00057
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, T1 및 T2 중 적어도 하나가 히드록실 보호기인 화합물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 히드록실 보호기가 각각 독립적으로, 벤질, 벤조일, 2,6-디클로로벤질, t-부틸디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴, 메실레이트, 토실레이트, 디메톡시트리틸 (DMT), 9-페닐크산틴-9-일 (픽실) 및 9-(p-메톡시페닐)크산틴-9-일 (MOX)로부터 선택되는 화합물.
  11. 제9항에 있어서, T1이 아세틸, 벤질, t-부틸디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴 및 디메톡시트리틸로부터 선택되는 화합물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 T1이 4,4'-디메톡시트리틸인 화합물.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, T2가 반응성 인 기인 화합물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 반응성 인 기가 디이소프로필-시아노에톡시 포스포라미다이트 또는 H-포스포네이트인 화합물.
  15. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, T1이 4,4'-디메톡시트리틸이고, T2가 디이소프로필시아노에톡시 포스포라미다이트인 화합물.
  16. 하나 이상의 하기 화학식 I, II 또는 III의 단량체의 올리고머 화합물.
    <화학식 I>
    Figure 112008060828411-PCT00058
    <화학식 II>
    Figure 112008060828411-PCT00059
    <화학식 III>
    Figure 112008060828411-PCT00060
    식 중,
    Bx는 헤테로시클릭 염기 잔기이고;
    T3은 H, 히드록실 보호기, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드, 단량체 서브유닛 또는 올리고머 화합물에 결합된 뉴클레오시드간 연결기 또는 연결 콘쥬게이트기이며;
    T4는 H, 히드록실 보호기, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드, 단량체 서브유닛 또는 올리고머 화합물에 결합된 뉴클레오시드간 연결기 또는 연결 콘쥬게이트기이고;
    여기서, T3 및 T4 중 적어도 하나는 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드, 단량체 서브유닛 또는 올리고머 화합물에 결합된 뉴클레오시드간 연결기이고;
    Z는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C1-C6 알킬, 치환된 C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알키닐, 아실, 치환된 아실, 치환된 아미드, 티올 또는 치환된 티오이다.
  17. 제16항에 있어서, 치환된 기가 각각 독립적으로, 할로겐, 옥소, 히드록실, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 및 CN으로부터 독립적으로 선택된 임의로 보호된 치환기로 일치환 또는 다치환되고, 여기서 J1, J2 및 J3은 각각 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이고, X는 O, S 또는 NJ1인 올리고머 화합물.
  18. 제16항에 있어서, Z는 각각 독립적으로, C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알킬인 올리고머 화합물.
  19. 제18항에 있어서, 하나 이상의 Z가 메틸인 올리고머 화합물.
  20. 제18항에 있어서, 하나 이상의 Z가 치환된 C1-C6 알킬인 올리고머 화합물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 치환기가 각각 C1-C6 알콕시인 올리고머 화합물.
  22. 제20항에 있어서, 하나 이상의 Z가 CH3OCH2-인 올리고머 화합물.
  23. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, Z가 각각 메틸 또는 CH3OCH2-인 올리고머 화합물.
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 상기 화학식의 단량체의 Z기가 하기 화학식 IV, V 또는 VI으로 표시되는 바와 같이 (R)-배열로 존재하는 올리고머 화합물.
    <화학식 IV>
    Figure 112008060828411-PCT00061
    <화학식 V>
    Figure 112008060828411-PCT00062
    <화학식 VI>
    Figure 112008060828411-PCT00063
  25. 제24항에 있어서, 상기 화학식의 각각의 단량체의 Z기가 각각 (R)-배열로 존재하는 올리고머 화합물.
  26. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 단량체의 Z기가 하기 화학식 VII, VIII 또는 IX로 표시되는 바와 같이 (S)-배열로 존재하는 올리고머 화합물.
    <화학식 VII>
    Figure 112008060828411-PCT00064
    <화학식 VIII>
    Figure 112008060828411-PCT00065
    <화학식 IX>
    Figure 112008060828411-PCT00066
  27. 제26항에 있어서, 상기 화학식의 각각의 단량체의 Z기가 각각 (S)-배열로 존재하는 올리고머 화합물.
  28. 제16항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, T3이 H 또는 히드록실 보호기인 올리고머 화합물.
  29. 제16항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, T3이 뉴클레오시드, 뉴클레오티드 또는 단량체 서브유닛에 결합된 뉴클레오시드간 연결기인 올리고머 화합물.
  30. 제16항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, T3이 올리고뉴클레오시드 또는 올리고뉴클레오티드에 결합된 뉴클레오시드간 연결기인 올리고머 화합물.
  31. 제16항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, T3이 올리고머 화합물에 결합된 뉴클레오시드간 연결기인 올리고머 화합물.
  32. 제16항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, T4가 H 또는 히드록실 보호기인 올리고머 화합물.
  33. 제16항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, T4가 뉴클레오시드, 뉴클레오티드 또는 단량체 서브유닛에 결합된 뉴클레오시드간 연결기인 올리고머 화합물.
  34. 제16항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, T4가 올리고뉴클레오시드 또는 올리고뉴클레오티드에 결합된 뉴클레오시드간 연결기인 올리고머 화합물.
  35. 제16항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, T4가 올리고머 화합물에 결합된 뉴클레오시드간 연결기인 올리고머 화합물.
  36. 제16항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, T3 및 T4 중 적어도 하나가 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트로부터 선택된 뉴클레오시드간 연결기를 포함하는 올리고머 화합물.
  37. 제16항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식의 2개 이상의 인접하는 단량체의 하나 이상의 영역을 포함하는 올리고머 화합물.
  38. 제37항에 있어서, 상기 화학식의 2개 이상의 인접하는 단량체의 둘 이상의 영역을 포함하는 올리고머 화합물.
  39. 제38항에 있어서, 갭을 갖는 올리고머 화합물을 포함하는 올리고머 화합물.
  40. 제37항 또는 제38항에 있어서, 약 8개 내지 약 14개의 인접하는 β-D-2'-데옥시리보푸라노실 뉴클레오시드의 하나 이상의 영역을 추가로 포함하는 올리고머 화합물.
  41. 제40항에 있어서, 약 9개 내지 약 12개의 인접하는 β-D-2'-데옥시리보푸라노실 뉴클레오시드의 하나 이상의 영역을 추가로 포함하는 올리고머 화합물.
  42. 제37항에 있어서, 상기 화학식의 2개 내지 3개의 인접하는 단량체의 하나의 영역, 상기 화학식의 1개 또는 2개의 인접하는 단량체의 임의의 제2 영역, 및 8개 내지 14개의 β-D-2'-데옥시리보푸라노실 뉴클레오시드의 제3 영역을 포함하며, 여기서 상기 제3 영역은 상기 제1 영역과 상기 제2 영역 사이에 위치하는 올리고머 화합물.
  43. 제42항에 있어서, 8개 내지 10개의 β-D-2'-데옥시리보푸라노실 뉴클레오시드를 포함하는 올리고머 화합물.
  44. 제16항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 약 8개 내지 약 40개의 뉴클레오시드 및/또는 변형된 뉴클레오시드 또는 길이에 있어서의 모방체를 포함하는 올리고머 화합물.
  45. 제16항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 약 8개 내지 약 20개의 뉴클레오시드 및/또는 변형된 뉴클레오시드 또는 길이에 있어서의 모방체를 포함하는 올리고머 화합물.
  46. 제16항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 약 10개 내지 약 16개의 뉴클레오시드 및/또는 변형된 뉴클레오시드 또는 길이에 있어서의 모방체를 포함하는 올리고머 화합물.
  47. 제16항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 약 10개 내지 약 14개의 뉴클레오시드 및/또는 변형된 뉴클레오시드 또는 길이에 있어서의 모방체를 포함하는 올리고머 화합물.
  48. 하나 이상의 세포, 조직 또는 동물을 제16항 내지 제45항 중 어느 한 항의 올리고머 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는 유전자 발현 억제 방법.
  49. 약물 요법에 사용하기 위한, 제16항 내지 제47항 중 어느 한 항의 화합물.
  50. 유전자 발현 억제용 의약 제조를 위한 제16항 내지 제47항 중 어느 한 항의 화합물의 용도.
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