JP2016146845A - デジタル検体分析 - Google Patents
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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-
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- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/172—Haplotypes
Abstract
Description
この本出願は、2010年10月1日に出願された米国仮出願第61/388,937
号、2010年5月21日に出願された米国仮出願第61/347,158号、2010
年5月5日に出願された米国仮出願第61/331,490号、および2010年2月1
2日に出願された米国仮出願第61/304,163号(これらの内容は、各々それらの
全体が参考として本明細書に援用される)に対する優先権を主張する。
本発明は、一般に、液滴ベースのデジタルPCR、およびそれを使用してターゲット核
酸を分析するための方法に関する。
され、このようにして癌などの一定の疾患の早期診断に至ってきた。しかし、典型的な体
液サンプルの場合、関心のある突然変異を含有するいずれの異常核酸も、その体液サンプ
ル中の核酸の総量に対して少量(例えば1%未満)で存在することが多い。この結果、確
率的サンプリングバイアスのため、その少量の異常核酸の検出に失敗することとなり得る
。
な見地からも、核酸の分析を大きく改善した。伝統的なPCR技術が、概して、アガロー
スゲル電気泳動法による増幅DNAターゲットのエンドポイント、および時として半定量
的、分析に依存するが、リアルタイムPCR(またはqPCR)法は、反応進行につれて
の指数関数的増幅の正確な定量に適合している。qPCR反応は、様々な高配列特異的蛍
光プローブ技術を用いて、または非特異的DNA挿入蛍光発生色素を使用することにより
、モニターされる。
び遺伝学の分野において漸増し続けているので、ならびにサンプルのより効率的な使用の
必要性が診断などの医学関連分野において増しているので、同じ反応体積の中で複数の増
幅を同時に実施および定量できること(多重化)が、PCRにとってもqPCRにとって
も最重要である。エンドポイントPCRは、高いレベルのアンプリコン多重化に対応する
ことができるが、プローブベースのqPCR反応の多重化についてのそのような十二分な
能力は、多くの理由のため依然として達成困難である。例えば、殆どの市販用リアルタイ
ム・サーマル・サイクラーは、一般的な蛍光体の限られたスペクトル分解能の結果として
4色までの異なる色の検出用蛍光体にしか対応しておらず、言い換えると4×の多重化能
力ということになる。加えて、単一ターゲットプライマー/プローブ反応の最適化は今や
標準作業であるが、複数の反応のためのプライマーとプローブの併用は、熱力学的効率お
よび/または化学的動態を変えるので、大々的な不具合対策および最適化を余儀なくさせ
る可能性を秘めている。100×より大きい非常に高度な多重化は、「スラッピー(sl
oppy)」分子ビーコンおよび融点をフィンガープリントとして使用する病原体同定の
ための「ワン・オブ・メニー(one of many)」検出形式で実証されているが
、このアプローチは、複数の同時に存在するターゲットの存在尤度がほんのわずかである
用途に限られる。半多重化法は、第一工程での一般的な多重化プレ増幅、続いて第二工程
での別のシングルプレックス定量的PCRを用いる2工程反応で、19×を達成した。し
かし、qPCR多重化に対する汎用シングルポットでの解決策は、まだ存在しない。
である。例えば、Brownら(特許文献1および特許文献2)およびVogelste
inら(特許文献3、特許文献4および特許文献5)を参照のこと;これらのそれぞれの
内容は、その全体が参照により本明細書に援用されている。反応間のターゲットDNA分
子のバックグラウンドからの分布はポアソン統計学に従い、いわゆる「終点希釈(ter
minal dilution)」では反応の大多数が実際には1つかゼロのターゲット
DNA分子を含有する。別の場合、いわゆる「限界希釈(limiting dilut
ion)」ではポアソン分布に従って、ゼロのDNA分子を含有する反応もあり、1つの
分子を含有する反応もあり、および多数の分子を含有する反応もしばしばある。終点希釈
および限界希釈は、反応容器へのDNA負荷量を説明するために有用な概念であるが、そ
れらは正式な数学的定義を有さず、必ずしも相互に排他的でないことは理解される。理想
的には、終点希釈でのPCRポジティブ反応(PCR(+))の数は、元々存在するテン
プレート分子の数と等しい。限界希釈では、DNAの根本的な量を明らかにするためにポ
アソン統計学を用いられる。qPCRと比較されるデジタルの原則利点は、初期サイクル
中の非指数関数的増幅の主な根本的不確実性に加えて蛍光強度−アナログシグナル−の時
間依存性を解釈する一切の必要を回避する点である。
。1つの態様において、本発明は、単一の核酸テンプレートと該テンプレート上の複数の
ターゲット部位に特異的な複数のプライマー対とを含有する液滴を提供する。前記単一の
核酸テンプレートは、DNA(例えば、ゲノムDNA、cDNAなど)である場合もあり
、またはRNAである場合もある。前記テンプレートを検出のために前記液滴内で増幅す
る;および好ましくは、本明細書に記載するように複数のプライマー対を使用して増幅す
ることができる。
、および核酸、とりわけ不均一サンプル中に存在するもの、の間の差別化が可能になる。
従って、本発明は、デジタル増幅技術に適用され、および特定の実施形態では、液滴内で
のマルチプレックスPCRを可能にする。例えば、液滴内の多重化プライマーは、インプ
ットDNAの量を同じにまたはより少なく保ち、同じまたはより大きなアンプリコン収量
を生じさせながら、同時にPCR液滴数を増加させることを可能にする。これは、結果と
して、より多くのDNAを消費することなくPCRポジティブ液滴の量およびアンプリコ
ン収量の総合的増加をもたらす。1液滴あたりのPCRプライマー対の数がたとえ1より
多くても、1液滴あたり1つのテンプレート分子しかなく、それ故、一部の実行では、1
滴あたり1つのプライマー対しか1度に利用されることとならない。従って、対立遺伝子
特異的PCRからのまたは異なるアンプリコン間の競合からのバイアスを無くすことにつ
いての液滴PCRの利点は維持される。しかし、ハプロタイプの検出に関して下で説明す
るように、他の実行は、好ましくはバイアスを最少にするように設計されたものである複
数のプライマー対を使用して、単一のテンプレート上の複数の遺伝子座の検出を有利に可
能にする。
るアンプリコンにハイブリダイズする複数のプローブを含有する。好ましくは、前記液滴
は、2つ以上のプローブ、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14
、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、60、
75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、1
60、170、180、190、200、500、またはそれ以上のプローブを含有する
。前記複数のプローブの一定の構成員(member)は、検出可能標識を含む。前記複
数のプローブの構成員は、それぞれ、同じ検出可能標識を含むことがあり、または異なる
検出可能標識を含むことがある。前記検出可能標識は、好ましくは蛍光標識である。前記
複数のプローブは、様々な濃度のプローブの1つ以上の群を含むことがある。前記プロー
ブの1つ以上の群は、同じ検出可能標識を含むことがあり、これらのプローブは、それら
の様々なプローブ濃度のため、検出時に強度が様々であるだろう。本発明の液滴は、ポリ
メラーゼ連鎖反応を行うための1つ以上の試薬、例えばDNAもしくはRNAポリメラー
ゼおよび/またはdNTP、をさらに含有することができる。
ゲットを検出するための方法にさらに関する。前記サンプルは、ヒト組織または体液であ
り得る。例示的体液:膿、痰、精液、尿、血液、唾液、および脳脊髄液。
に特異的なプライマー対とプローブの不均一混合物をそれぞれが含む、1つ以上の液滴を
形成する。例えば、単一の核酸テンプレート(DNAまたはRNA)を含有する第一の流
体(連続的、または液滴の場合のように不連続的)を、それぞれが該核酸テンプレートの
複数のターゲット部位に特異的な複数のプライマー対および複数のプローブを含有する第
二の流体(同じく、連続的、または液滴の場合のように不連続的)と合体させて、単一の
核酸テンプレートおよびプライマー対とプローブの不均一混合物を含有する液滴を形成す
る。前記第二の流体は、PCR反応を行うための試薬、例えばポリメラーゼおよびdNT
P、も含むことができる。
成員は、それぞれ、同じ検出可能標識を含むことがあり、または異なる検出可能標識を含
むことがある。前記検出可能標識は、好ましくは蛍光標識である。前記複数のプローブは
、様々な濃度のプローブの1つ以上の群を含むことがある。前記プローブの1つ以上の群
は、同じ検出可能標識を含むことがあり、これらのプローブは、それらの様々なプローブ
濃度のため、検出時に強度の点で様々である。
について当該技術分野において公知の任意の技術を本発明の方法と共に用いることができ
る。例示的方法は、核酸テンプレートを含有するサンプル流体のストリームを、流れてい
るキャリア流体の2つの対向するストリームを交差するように流すことを含む。前記キャ
リア流体は、前記サンプル流体と不混和性である。前記サンプル流体と前記流れているキ
ャリア流体の2つの対向するストリームとの交差の結果、該サンプル流体は区画化されて
、第一の流体を含有する個々のサンプル液滴となる。前記キャリア流体は、前記サンプル
流体と不混和性であるいずれの流体であってもよい。例示的キャリア流体は油である。一
定の実施形態において、前記キャリア流体は、フッ素系界面活性剤などの界面活性剤を含
む。同じ方法を利用して、プライマー対(および、一部の実行では、増幅試薬)を含有す
る第二の流体から個々の液滴を作ることができる。第一の流体を含有する液滴もしくは第
二の流体を含有する液滴のいずれか、または両方を形成して、後のマージのためにライブ
ラリーに保管してもよく、その一定の実行の態様は米国特許第出願第12/504,76
4号に記載されており、この出願は、あらゆる意味でその全体が参照により本明細書に援
用されている。形成したら、第一の流体を含有する液滴と第二の流体を含有する液滴を合
体させて、単一の核酸テンプレートおよびプライマー対とプローブの不均一混合物を含有
する、単一の液滴を形成することができる。例えば電場の存在下で、マージを果たすこと
ができる。さらに、マージを行うときに両方の流体が液滴の形態である必要はない。流体
部分と液滴を合体させるための1つの例示的方法は、例えば、本願と同日に出願された同
時係属米国特許出願第61/441,985号に教示されている。
を行うために十分な温度/条件下でのそれらの液滴の熱サイクリングによって、増幅する
。その後、前記液滴内の結果として生じたアンプリコンを分析することができる。例えば
、1つ以上の液滴内の複数のターゲットの存在または不在を光学的に、例えば複数のプロ
ーブ上の検出可能標識によって、検出する。
明の方法は、PCR反応中に発生するポリメラーゼエラーを検出することができ、および
ポリメラーゼエラーの結果である増幅産物を分析から排除することができる。本発明の方
法は、ポリメラーゼエラーが、突然変異体対立遺伝子を含有すると間違って同定される、
すなわち偽ポジティブである、サンプルの区分セクションをもたらすことがあるデジタル
PCRにおいて特に有用である。そのような偽ポジティブは、一般に、デジタルPCR結
果の妥当性および精度に大きな影響を及ぼす。本発明の方法は、同じ光色を有する複数の
ターゲットを一意的に検出することができる。本発明の方法は、出発試験流体中に存在し
得る複数の異なるターゲット分子を同定することが望ましいデジタルPCRにおいて、特
に有用である。
本発明の方法は、デジタルPCR用の液滴の形成を含む。好ましいデジタルPCR液滴は
、増幅すべき核酸の1つのコピーを含有するが、同じ核酸配列の複数のコピーを含有する
こともある。サンプル液滴を形成するための当該技術分野において公知の任意の技術を本
発明の方法と共に用いることができる。1つの例示的方法は、核酸を含むサンプル流体の
ストリームを、流れているキャリア流体の2つの対向するストリームを交差するように流
すことを含む。前記キャリア流体は、前記サンプル流体と不混和性である。前記サンプル
流体と前記流れているキャリア流体の2つの対向するストリームとの交差の結果、該サン
プル流体は区画化されて個々のサンプル液滴になる。前記キャリア流体は、前記サンプル
流体と不混和性であるいずれの流体であってもよい。例示的キャリア流体は油である。一
定の実施形態において、前記キャリア流体は、フッ素系界面活性剤などの界面活性剤を含
む。
法を用いて、ターゲット核酸を線形にまたは指数関数的に増幅することができる。好まし
い方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)である。本発明のために、当該技術分野にお
いて一般に公知の任意の増幅技術、例えば、ローリングサークル増幅、等温増幅、または
遺伝子座特異的プライマー、ネステッドプライマーもしくはランダムプライマーを使用す
る増幅法の任意の組み合わせ、を実行することができる(前述のプライマー、および/ま
たはPCRに使用されるプライマーは、用語「増幅試薬」に含まれる)。増幅したら、前
記ターゲットからのアンプリコンおよび前記ターゲットの変異体からのアンプリコンを含
有する液滴を排除する。アンプリコンの均一集団を含有する液滴からアンプリコンの不均
一集団を含有する液滴を排除する1つの方法は、検出可能に標識されたプローブをアンプ
リコンにハイブリダイズさせること、前記液滴を、マイクロ流体チャネルを通して流すこ
と、および前記ターゲットからのアンプリコンと前記ターゲットの変異体からのアンプリ
コンの両方が検出される液滴を排除することを含む。
有する液滴を分析する。当該技術分野において公知の任意の分析技術を用いることができ
る。一定の実施形態において、前記液滴の分析は、野生型ターゲットのみを含有する液滴
の数を決定すること、および該ターゲットの変異体のみを含有する液滴の数を決定するこ
とを含む。一般に、変異体のみを含有する液滴の存在は、癌などの疾患の指標となる。前
記変異体は、対立遺伝子変異体であることがある。例示的対立遺伝子変異体は、一塩基多
型である。前記変異体は特異的ハプロタイプである場合もある。ハプロタイプは、同じ核
酸鎖上の2つ以上の変異体の存在を指す。ハプロタイプは、疾患の存在もしくは重症度、
薬物療法への応答または細菌もしくはウイルス感染症の薬物耐性といったことを決定する
ために用いたとき、遺伝子型より多くの情報をもたらすまたは予測に役立つことができる
。各液滴は1本のテンプレート鎖しか含有しないので、それはハプロタイプの決定にとっ
て理想的な器である。1本の無損傷核酸鎖を含有する単一の液滴内の2つ以上の変異体の
検出により、その鎖上の変異体のハプロタイプが同定される。同じ液滴内の2つ以上のマ
ーカーの存在は、多色の色素の存在、または単一色素の強度の増加、または両方の組み合
わせといった手段によって同定することができる。単一の液滴内の多数の変異体の同定を
可能にする任意の方法によって、サンプルのハプロタイプを決定することができる。
法は、それぞれの部分が単一のターゲット核酸を含有する複数の部分に第一の流体を区画
化すること;前記部分の中の前記ターゲットを増幅すること;前記ターゲットからのアン
プリコンおよび前記ターゲットの変異体からのアンプリコンを含有する部分を排除するこ
と;およびターゲットアンプリコンを分析することを含む。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
単一の核酸テンプレートと前記テンプレート上の複数のターゲット部位に特異的な複数のプライマー対とを含む微小液滴。
(項目2)
前記液滴内で生産されたアンプリコンにハイブリダイズする複数のプローブをさらに含む、項目1に記載の微小液滴。
(項目3)
前記単一の核酸テンプレートがDNAまたはRNAである、項目1に記載の微小液滴
。
(項目4)
ポリメラーゼ連鎖反応を行うための試薬をさらに含む、項目1に記載の微小液滴。
(項目5)
前記複数のプローブの構成員が検出可能標識を含有する、項目2に記載の微小液滴。
(項目6)
前記複数のプローブが、様々な濃度のプローブの1つ以上の群を含む、項目6に記載
の微小液滴。
(項目7)
前記プローブの1つ以上の群の構成員それぞれが、同じ検出可能標識を含む、項目6
に記載の微小液滴。
(項目8)
前記複数のプローブの構成員それぞれが、異なる検出可能標識を含む、項目5に記載
の微小液滴。
(項目9)
前記検出可能標識が蛍光標識である、項目5に記載の微小液滴。
(項目10)
生体サンプル中の複数のターゲットを検出するための方法であって、
a)単一の核酸テンプレート、およびそれぞれが前記テンプレート上の複数のターゲット部位に特異的なプライマー対とプローブの不均一混合物をそれぞれが含む、1つ以上の微小液滴を形成する工程;
b)前記1つ以上の微小液滴内の前記核酸テンプレートを増幅する工程;および
c)前記1つ以上の微小液滴を分析する工程
を含む方法。
(項目11)
前記形成工程が、
a)単一の核酸テンプレートを含む第一の流体を供給すること;
b)それぞれが前記テンプレート上の複数のターゲット部位に特異的な複数のプライマーおよび複数のプローブを含む第二の流体を供給すること;
c)前記第一の流体と前記第二の流体を合体させて、前記単一の核酸テンプレートおよびプライマー対とプローブの不均一混合物を含む液滴を形成すること
を含む、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記第一の流体および前記第二の流体が、前記流体に対する電場の存在下で合体される、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記第一の流体および前記第二の流体が微小液滴である、項目11に記載の方法。
(項目14)
前記第二の流体が、ポリメラーゼ連鎖反応を行うための試薬をさらに含む、項目11
に記載の方法。
(項目15)
前記単一の核酸テンプレートがDNAまたはRNAである、項目10に記載の方法。
(項目16)
前記分析工程が、前記1つ以上の微小液滴内の前記複数のターゲットの存在または不在を検出することを含む、項目10に記載の方法。
(項目17)
前記複数のプローブの構成員が、検出可能標識を含有する、項目10に記載の方法。
(項目18)
前記複数のプローブが、様々な濃度のプローブの1つ以上の群を含む、項目17に記
載の微小液滴。
(項目19)
前記プローブの1つ以上の群の構成員それぞれが、同じ検出可能標識を含む、項目1
8に記載の微小液滴。
(項目20)
前記複数のプローブの構成員それぞれが、異なる検出可能標識を含む、項目17に記
載の微小液滴。
(項目21)
前記検出可能標識が蛍光標識である、項目17に記載の微小液滴。
(項目22)
ターゲット核酸を分析するための方法であって、
単一ターゲット核酸と1つ以上の増幅試薬とを含有する液滴を形成する工程;
前記液滴内の前記ターゲットを増幅する工程;
前記ターゲットからのアンプリコンおよび前記ターゲットの変異体からのアンプリコンとを含有する液滴を排除する工程;および
ターゲットアンプリコンを分析する工程
を含む方法。
(項目23)
前記増幅工程が、ポリメラーゼ連鎖反応であり、および前記1つ以上の増幅試薬が、1つ以上のプライマー対を含む、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記排除工程が、前記液滴をマイクロ流体チャネル内に流すことを含む、項目22に
記載の方法。
(項目25)
前記分析工程が、検出可能に標識されたプローブへのハイブリダイゼーションにより前記アンプリコンを検出することを含む、項目22に記載の方法。
(項目26)
前記分析工程が、前記排除工程で排除されなかった液滴からのアンプリコンに対して行われる、項目22に記載の方法。
(項目27)
前記形成工程が、
核酸を含む第一のサンプル流体のストリームを、流れているキャリア流体の2つの対向するストリームを交差するように流し、それによって、前記第一のサンプル流体を含む複数の第一の液滴を形成することであって、前記キャリア流体は前記サンプル流体と不混和性である、形成すること;および
前記第一のサンプル流体を含む複数の第一の液滴のそれぞれと、1つ以上の増幅試薬を含む第二の流体の部分とを合体させることであって、前記第二の流体の部分は場合により液滴である、合体させること
を含む、項目22に記載の方法。
(項目28)
前記キャリア流体が油である、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記油が界面活性剤を含む、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記界面活性剤がフッ素系界面活性剤である、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記分析工程が、
野生型ターゲットのみを含有する液滴の数を決定すること;
前記ターゲットの変異体のみを含有する液滴の数を決定すること
を含む、項目22に記載の方法。
(項目32)
前記変異体のみを含有する液滴の存在が疾患の指標となる、項目31に記載の方法。
(項目33)
前記疾患が癌である、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記変異体が対立遺伝子変異体である、項目31に記載の方法。
(項目35)
前記対立遺伝子変異体が一塩基多型である、項目34に記載の方法。
(項目36)
核酸サンプルを加工するための方法であって、
1つの核酸ターゲットを含む液滴を得る工程;
前記液滴内の前記核酸を増幅する工程;および
アンプリコンの不均一集団を含む液滴を、アンプリコンの均一集団を含有する液滴から分離する工程
を含む方法。
(項目37)
患者における癌の再発を検出するための方法であって、
平均して各液滴が患者サンプルから採取された単一ターゲット核酸を含む、サンプル液滴を形成する工程;
前記サンプル液滴を、チャネルを通して流す工程;
前記液滴内のターゲットを増幅する工程;
前記液滴内の増幅されたターゲットを検出する工程;
アンプリコンの不均一集団を含む液滴を排除する工程;および
排除されなかった液滴を分析して、再発の指標となる突然変異体対立遺伝子の存在を決定する工程
を含む方法。
(項目38)
前記形成工程が、
核酸を含むサンプル流体のストリームを、流れているキャリア流体の2つの対向するストリームを直行するように流すことであって、前記キャリア流体は前記サンプル流体と不混和性である、流すこと
を含む、項目37に記載の方法。
(項目39)
前記サンプルがヒト組織または体液である、項目37に記載の方法。
(項目40)
前記体液が、膿、痰、精液、尿、血液、唾液および脳脊髄液から成る群より選択される、項目39に記載の方法。
(項目41)
前記分析工程が、標識された捕捉プローブを使用して前記液滴から得られたアンプリコンを捕捉することを含む、項目37に記載の方法。
(項目42)
ターゲット核酸を分析するための方法であって、
各部分が単一ターゲット核酸を含有する複数の部分に第一の流体を区画化する工程;
前記部分中のターゲットを増幅する工程;
前記ターゲットからのアンプリコンおよび前記ターゲットの変異体からのアンプリコンを含有する部分を排除する工程;および
ターゲットアンプリコンを分析する工程
を含む、方法。
(項目43)
区画が、マイクロ流体デバイス内のチャンバを含む、項目42に記載の方法。
(項目44)
ターゲット核酸を分析するための方法であって、
単一ターゲット核酸を含有するサンプル液滴を形成する工程;
前記液滴内のターゲットを増幅する工程;
前記ターゲットからのアンプリコンおよび前記ターゲットの変異体からのアンプリコンを含有する液滴を排除する工程;および
ターゲットアンプリコンを分析する工程
を含む、方法。
(項目45)
前記第一の流体が第一の液滴内に含有され、および前記第二の流体がストリームの第一の部分であり、ならびにさらに、工程(c)が、前記第一の液滴を前記第一の部分と合体させることを含む、項目11に記載の方法。
(項目46)
前記第二の流体が第一の液滴内に含有され、および前記第一の流体がストリームの第一の部分であり、ならびにさらに、工程(c)が、前記第一の液滴を前記第一の部分と合体させることを含む、項目11に記載の方法。
本発明は、マイクロ流体液滴などの液滴におけるデジタル分析に備えるものである。本発
明は、デジタルPCRの実施を可能にし、およびエラーの有意な低減または排除に備えて
いる。
てのみ制限され、これが、(他の箇所で詳細に論ずる)何百万もの単一分子PCR反応を
並行して行うことができる、幾つかの超高スループットの小型化された方法の開発の動機
となった。本発明の好ましい実施形態では、マイクロフルイディクス・システムを使用し
て油によって分離された水性液滴においてデジタルPCRを行う。もう1つの好ましい実
施形態において、前記油は、Fluorinertオイル(3M)などのフッ素化油であ
る。なおさらに好ましい実施形態において、前記フッ素化油は、液滴を増幅工程中にまた
はそれらが互いに接触する任意の時点で合体しないように安定させるために、PFPE−
PEG−PFPEトリブロックコポリマーなどの界面活性剤を含有する。マイクロ流体ア
プローチは、ピコリットル容積の反応容器として機能する多数(例えば106以上)の非
常に均一なサイズの液滴の迅速な生成を可能にする(液滴ベースのマイクロフルイディク
スの総説を参照のこと)。しかし、説明するように、本発明は、油中水型エマルジョンに
おいて行われるdPCRに限定されず、むしろdPCRのためのすべての反応区画化法に
対して一般的である。後に続く説明の中で、本発明は、区画化のための液滴の使用に関し
て説明するが、説明のこの選択は本発明にとって限定的なものでないと、および本発明の
方法をdPCRのためのすべての他の反応区画化法と両立できると考える。
ターゲットの存在度を定量するための同じサンプルでの複数の異なる増幅反応の同時実施
についての新規戦略を含む。多重化dPCRアッセイのための本発明の方法は、既存のq
PCRまたはdPCR技術で可能なものより大きなプレキシティー(plexity)−
同時反応数−を約束する。それは、異なる対立遺伝子をターゲットにする複数のプライマ
ー/プローブが存在するときでさえ、最も多くの場合、いずれの1液滴内にも単一のター
ゲット対立遺伝子しか決して存在しないために生ずる、終点または限界希釈での特異な性
質の増幅に基づく。これは、指数関数期への様々な到達時間およびプライマー間の意図さ
れたものでない反応などの同時に存在する競争反応をそうでなければもたらす厄介な問題
を軽減する。
性を維持しながらアンプリコン収量を向上させるための材料および方法を提供する。より
具体的には、本発明は、単一の核酸テンプレートと多重化PCRプライマーとを含有する
液滴を提供し、ならびにそのような液滴を形成することおよび液滴ベースのデジタルPC
Rを用いて核酸テンプレートを増幅することによる生体サンプル中の複数のターゲットを
検出するための方法を提供する。
強度は、プローブ加水分解効率に依存する。従って、本発明の方法のもう1つの態様では
、異なる効率を有する異なる反応を、たとえそれらが同じ色を有したとしても、終点蛍光
強度のみに基づいて識別することができる。さらに、本発明のもう1つの方法では、単に
プローブ濃度を調整することによって効率をチューニングすることができ、その結果、使
用が容易な汎用多重化法が得られる。本発明の1つの実証実験において、5プレックスT
aqMan(登録商標)dPCRアッセイは、この程度に多重化するqPCRを象徴する
冗長な最適化とは対照的に、「すぐに(right out of the box)」
機能した。本発明のもう1つの態様において、複数の色の追加は、個々の反応を複数の蛍
光体で標識できるため、qPCRのように直線的にではなく幾何級数的に可能な反応の数
を増加させる。一例として、2つの蛍光体(VICおよびFAM)を使用して、本発明の
1回の実行で5つの異なる反応を区別した。
よびポリメラーゼエラーの結果である産物を分析から排除することができる。本質的に、
本発明の方法は、偽ポジティブである増幅産物を同定することおよび分析からそれらの産
物を排除することによって、デジタルPCRの感度を増大させる。
滴内の該ターゲットを増幅すること、該ターゲットからのアンプリコンおよび該ターゲッ
トの変異体からのアンプリコンを含有する液滴を排除すること、およびターゲットアンプ
リコンを分析することを含む。
核酸分子は、デオキシリボ核酸(DNA)および/またはリボ核酸(RNA)を包含す
る。核酸分子を合成することができ、または自然に存在する源から採取することができる
。1つの実施形態では、様々な他の成分、例えばタンパク質、脂質および非テンプレート
核酸、を含有する生体サンプルから核酸分子を単離する。動物、植物、細菌、真菌または
任意の他の細胞性生物から得られる、任意の細胞性材料から核酸テンプレート分子を得る
ことができる。一定の実施形態では、単個細胞から核酸分子を得る。本発明において使用
するための生体サンプルは、ウイルス粒子または調製物を含む。核酸分子を生物から直接
得ることができ、または生物から得た生体サンプルから、例えば血液、尿、脳脊髄液、精
液、唾液、痰、糞便および組織から、得ることができる。任意の組織または体液検体を本
発明において使用するための核酸の源として使用することができる。培養細胞、例えば一
次細胞培養物または細胞株、から核酸を単離することもできる。テンプレート核酸を得る
細胞または組織は、ウイルスまたは他の細胞内病原体に感染している場合がある。サンプ
ルは、生物検体、cDNAライブラリー、ウイルスまたはゲノムDNAから抽出された全
RNAである場合もある。一定の実施形態において、核酸分子は、他のターゲット分子、
例えばタンパク質、酵素、基質、抗体、結合剤、ビーズ、小分子、ペプチドまたは任意の
他の分子、に応じて確定され、ターゲット分子を定量および/もしくは検出するための代
用物として役立つ。
aboratory Manual、Cold Spring Harbor、N.Y.
、pp.280−281(1982)によって記載されたものなどの様々な技術によって
生体サンプルから抽出することができる。核酸分子は、一本鎖であってもよく、二本鎖で
あってもよく、または一本鎖領域を有する二本鎖(例えば、幹−およびループ−構造)で
あってもよい。
本発明の方法は、サンプル液滴を形成することを含み、この場合、ゼロのターゲット核
酸分子を含有する液滴もあり、1つのターゲット核酸分子を含有する液滴もあり、および
複数の核酸分子を含有することがあるまたはしないことがある液滴もある(上で定義した
とおりの限界または終点希釈にそれぞれ対応する)。好ましい実施形態において、液滴内
の分子の分布は、ポアソン分布に従う。しかし、液滴の非ポアソン負荷のための方法は当
業者に公知であり、それらの方法としては、液滴の能動的選別、例えばレーザー誘導蛍光
によるもの、または受動的な1対1負荷(one−to−one loading)によ
るものが挙げられるが、これに限定されない。後に続く説明は液滴のポアソン負荷を想定
しているが、本発明は限界または終点希釈に準拠するDNA負荷量のすべての分布と両立
できるので、そのような説明は非ポアソン負荷を排除することを意図したものではない。
な液滴を形成する方法は、例えば、Linkら(米国特許出願第2008/001458
9号、同第2008/0003142号、および同第2010/0137163号)、S
toneら(米国特許第7,708,949号および米国特許出願第2010/0172
803号)、Andersonら(米国特許第7,041,481号および再発行番号4
1,780として再発行されたもの)およびRaindance Technologi
es Inc.の欧州特許出願公開第2047910号に示されている。これらのそれぞ
れの内容は、その全体が参照により本明細書に援用されている。
ス100は、流入チャネル101と、流出チャネル102と、2つのキャリア流体チャネ
ル103および104とを備えている。チャネル101、102、103、および104
は、接合部105で出会う。流入チャネル101は、サンプル流体を接合部105に流す
。キャリア流体チャネル103および104は、サンプル流体と不混和性であるキャリア
流体を接合部105に流す。流入チャネル101は、接合部105に接続するその先端部
が狭くなっている(図2参照)。流入チャネル101は、キャリア流体チャネル103お
よび104に垂直になるような向きになっている。サンプル流体が流入チャネル101か
ら接合部105へと流れ、そこでサンプル流体が、キャリア流体チャネル103および1
04によって接合部105に供給される流れているキャリア流体と交差すると、液滴が形
成される。流出チャネル102は、キャリア流体によって包囲されたサンプル流体の液滴
を受け取る。
フィーによって得られる、例えば18メガオームの抵抗率)、10mM Tris HC
lおよび1mM EDTA(TE)緩衝液、リン酸緩衝食塩水(PBS)または酢酸緩衝
液、である。核酸分子と生理的に適合性である任意の液体または緩衝液を使用することが
できる。前記キャリア流体は、前記サンプル流体と不混和性であるものである。前記キャ
リア流体は、非極性溶剤、デカン(例えば、テトラデカンもしくはヘキサデカン)、フル
オロカーボン油、シリコーン油または他の油(例えば、鉱物油)であり得る。
トン表面張力を増加させる、低減するもしくは別様に作る作用物質(界面活性剤)および
/または接触時に自然に合体しないように液滴を安定させる作用物質、を含有する。界面
活性剤としては、Tween、Span、フッ素系界面活性剤、および水に比べて油に溶
ける他の作用物質を挙げることができる。幾つかの用途では、第二の界面活性剤または他
の作用物質、例えばポリマーもしくは他の添加剤、をサンプル流体に添加することによっ
て性能を向上させる。界面活性剤は、例えば交差チャネルに液滴を押し出すまたは注入す
るために必要な剪断力を低減することにより、液滴サイズ、流量および均一性の制御また
は最適化を助けることができる。これは、液滴体積および周期性、または液滴が交差チャ
ネルへと離脱する率または頻度に影響を及ぼすことができる。さらに、界面活性剤は、フ
ッ素化油中の水性エマルジョンが合体しないように安定させることに役立つことができる
。
きる。キャリア流体に添加することができる好ましい界面活性剤としては、ソルビタンモ
ノラウレート(Span 20)、ソルビタンモノパルミテート(Span 40)、ソ
ルビタンモノステアレート(Span 60)およびソルビタンモノオレエート(Spa
n 80)をはじめとするソルビタン系カルボン酸エステル(例えば、「Span」界面
活性剤、Fluka Chemika)ならびに過フッ素化ポリエーテル(例えば、Du
Pont Krytox 157 FSL、FSMおよび/またはFSH)などの界面活
性剤が挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる非イオン性界面活性
剤の他の非限定的な例としては、ポリオキシエチレン化アルキルフェノール(例えば、ノ
ニル−、p−ドデシル−、およびジノニルフェノール)、ポリオキシエチレン化直鎖アル
コール、ポリオキシエチレン化ポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化
メルカプタン、長鎖カルボン酸エステル(例えば、天然脂肪酸のグリセリルおよびポリグ
リセリルエステル、プロピレングリコール、ソルビトール、ポリオキシエチレン化ソルビ
トールエステル、ポリオキシエチレングリコールエステルなど)ならびにアルカノールア
ミン(例えば、ジエタノールアミン−脂肪酸縮合物およびイソプロパノールアミン−脂肪
酸縮合物)が挙げられる。
ャリア流体を、流出チャネルを通して流れさせることができる。1つの実施形態では、過
フッ素化ポリエーテルDuPont Krytox 157 FSL、FSMまたはFS
Hと水酸化アンモニウム水溶液とを揮発性フッ素化溶剤中で反応させることによって、フ
ッ素系界面活性剤を調製することができる。溶剤ならびに残留水およびアンモニアをロー
タリーエバポレータで除去することができる。その後、その界面活性剤をフッ素化油(例
えば、Flourinert(3M))に溶解することができ(例えば、2.5重量%)
、すると担体液として役立つ。
の1つのアプローチは、液滴を形成すること、および該液滴と流体ストリームを接触させ
ることを含み、この場合、該流体ストリームの一部分が該液滴と一体化して混合液滴を形
成する。このアプローチでは、1つの形態の液滴内のマージエリアに1つの相しか到達す
る必要がない。そのような方法のさらなる説明は、Yurkovetskyらの共同所有
および同時係属米国特許出願(米国特許出願第61/441,985号)に示されており
、前記出願の内容は、その全体が参照により本明細書に援用されている。
サンプル流体からのサンプル液滴の形成後、その液滴を第二のサンプル流体ストリームの
フローと接触させる。前記液滴と前記流体ストリームの接触の結果、該流体ストリームの
一部分が該液滴と一体化して混合液滴を形成することとなる。
濁している第一のサンプル流体の液滴が、第一のチャネルを通って流れる。液滴は、容積
式ポンプによって生成される圧力駆動フローによりマージエリア、すなわち第一のチャネ
ルと第二のチャネルの接合部、に送達される。液滴がそのマージエリアに到着すると、第
二のサンプル流体のボーラスが、第二のチャネルの開口部から第一のチャネルに押し出さ
れることとなる。好ましくは、これらのチャネルは、互いに垂直な向きである。しかし、
これらのチャネルを直行させる結果となる任意の角度を用いることができる。
のポンピング作用のためサイズを増しつづけ、それがマージエリアへの第二のサンプル流
体の定常ストリーム流を産出する。第一のサンプル流体を含有する流れている液滴は、そ
の第一のチャネルの中に押し出されている第二のサンプル流体のボーラスと最終的に接触
する。これら2つのサンプル流体間の接触の結果、第二のサンプル流体の一部分が、該第
二のサンプル流体ストリームから分けられ、第一のサンプル流体液滴と合流して混合液滴
を形成することとなる。一定の実施形態では、第一のサンプル流体の入って来る液滴それ
ぞれを同量の第二のサンプル流体と合体させる。
の電荷の印加についての説明は、Linkら(米国特許出願第2007/0003442
号)およびRaindance Technologies Incの欧州特許第200
4316号に提供されており、これらのそれぞれの内容はその全体が参照により本明細書
に援用されている。任意の適する技術を用いて、例えば、第一および第二のサンプル流体
を電場(AC、DCなどであり得る)の中に置くことにより、ならびに/または第一およ
び第二のサンプル流体に電荷を持たせる反応、例えば化学反応、イオン反応、光触媒反応
など、を起こさせることにより、キャリア流体内の第一および第二のサンプル流体内で電
荷を作り出すことができる。
きる電場を作り出すことができるデバイスまたはシステム、から発生される。電場発生器
は、AC場(すなわち、時間に対して周期的に、例えば正弦波的に、変動するもの、鋸歯
、方形など)、DC場(すなわち、時間に対して一定しているもの)、パルス場などを生
じさせることができる。チャネルまたはマイクロ流体チャネル内に収容された流体の中で
電場を作り出すように、電場発生器を構築および配置することができる。幾つかの実施形
態によると、電場発生器は、チャネルまたはマイクロ流体チャネルを含む流体システムと
一体型であることもあり、または別個であることもある。
例えば、1つの実施形態では、1対の電極の両端に電圧を印加することによって電場を生
じさせ、それらの電極を流体システム上に配置してもよく、もしくは流体システム内に(
例えば、チャネルもしくはマイクロ流体チャネルを規定する基板内に)埋め込んでもよく
、および/または電場の少なくとも一部分が流体と相互作用するように流体の近位に配置
してもよい。前記電極は、銀、金、銅、炭素、白金、銅、タングステン、スズ、カドミウ
ム、ニッケル、酸化インジウムスズ(「ITO」)など、ならびにこれらの組み合わせを
はじめとする(しかしそれらに限定されない)、当業者に公知の任意の適する電極材料(
単数または複数)から作ることができる。場合によっては、透明または実質的に透明な電
極を使用することができる。
二のサンプル流体のボーラスと第一のサンプル流体液滴のマージを助長する。形成混合液
滴は、第一のサンプル流体を含有する次の液滴の到着およびマージ前に第二のサンプル流
体の一部分が第二のサンプル流体ストリームから解放されるまたは分割するまで、大きく
なり続ける。第二のサンプル流体ストリームからの第二のサンプル流体の前記部分の分割
は、混和性キャリア流体によって形成混合液滴に及ぼされる剪断力が表面張力(この作用
は、第二のサンプル流体の分割部分を第二のサンプル流体ストリームとつながったままに
することである)に打ち勝つやいなや発生する。今や完全に形成された混合液滴が、第一
のチャネルを通って流れ続ける。
よって破断を助長することができる。任意の手段によって破断を生じさせることができる
ので、本発明は、界面での破断方法に関して限定されない。
含有する。前記第一のサンプル流体の液滴は、上で説明したように形成される。これらの
液滴は、核酸テンプレートを含むであろう。一定の実施形態において、前記液滴は、単一
の核酸テンプレートのみを含むこととなり、従って、デジタルPCRを行うことができる
。第二のサンプル流体は、PCR反応のための試薬を含有する。そのような試薬としては
、一般に、Taqポリメラーゼ、タイプA、C、GおよびTのデオキシヌクレオチド、塩
化マグネシウム、ならびにフォワードおよびリバースプライマーが挙げられ、これらのす
べてが水性緩衝液に懸濁されている。前記第二の流体は、増幅されたターゲット核酸を検
出するための検出可能に標識されたプローブも含み、これらの詳細は下で論ずる。次に、
核酸を含有する液滴を、上で説明したような第二の流体中のPCR試薬と合体させて、T
aqポリメラーゼ、タイプA、C、GおよびTのデオキシヌクレオチド、塩化マグネシウ
ム、フォワードおよびリバースプライマー、検出可能に標識されたプローブならびにター
ゲット核酸を含む液滴を生じさせる。もう1つの実施形態において、前記第一の流体は、
テンプレートDNAおよびPCRマスターミックス(下で定義する)を含有することがで
き、ならびに前記第二の流体は、フォワードおよびリバースプライマーならびにプローブ
を含有することができる。本発明は、PCRまたはデジタルPCRのための第一および第
二のフルイディクスの要素構成に関して如何なる点においても制限されない。例えば、幾
つかの実施形態において、前記テンプレートDNAは、液滴内部の第二の流体に含有され
る。
本発明の方法は、各液滴内のターゲット核酸を増幅することをさらに含む。増幅は、核
酸配列の追加のコピーの生産を指し、一般に、ポリメラーゼ連鎖反応または当該技術分野
において周知の他の技術を用いて行われる(例えば、Dieffenbach and
Dveksler、PCR Primer、a Laboratory Manual、
Cold Spring Harbor Press、Plainview、N.Y.[
1995])。増幅反応は、核酸分子を増幅する当該技術分野において公知の任意の増幅
反応、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖
反応(Barany F.(1991)PNAS 88:189−193;Barany
F.(1991)PCR Methods and Applications 1:
5−16)、リガーゼ検出反応(Barany F.(1991)PNAS 88:18
9−193)、鎖置換増幅、転写ベースの増幅システム、核酸配列ベースの増幅、ローリ
ングサークル増幅および超分岐ローリングサークル増幅であり得る。
ゼ連鎖反応(PCR)は、クローニングまたは精製なしでゲノムDNAの混合物中のター
ゲット配列のセグメントの濃度を増加させるためのK.B.Mullisによる方法(参
照により本明細書に援用されている、米国特許第4,683,195号および同第4,6
83,202号)を指す。ターゲット配列を増幅するためのプロセスは、所望のターゲッ
ト配列を含有するDNA混合物への過剰なオリゴヌクレオチドプライマーの導入、続いて
のDNAポリメラーゼの存在下での的確な順序の熱サイクリングを含む。前記プライマー
は、二本鎖ターゲット配列のそれらそれぞれの鎖に相補的である。
る。アニーリング後、それらのプライマーをポリメラーゼで伸長して、新たな相補鎖対を
形成する。変性、プライマーアニーリングおよびポリメラーゼ伸長の工程を何度も繰り返
して(すなわち、変性、アニーリングおよび伸長が1サイクルを構成する;非常に多くの
サイクルがあり得る)、所望のターゲット配列の高濃度の増幅セグメントを得ることがで
きる。所望のターゲット配列の増幅セグメントの長さは、プライマーの互いに対する相対
的位置によっておよびサイクリングパラメータによって決定され、従って、この長さは、
制御可能なパラメータである。
0014589号、同第2008/0003142号、および同第2010/01371
63号)、Andersonら(米国特許第7,041,481号および再発行番号41
,780として再発行されたもの)およびRaindance Technologie
s Inc.の欧州特許出願公開第2047910号に示されており、これらのそれぞれ
の内容はその全体が参照により本明細書に援用されている。
ー(単数もしくは複数)を前記液滴に添加してもよい。幾つかの実施形態では、出発サン
プルを分割することによって作られた液滴を、ターゲット核酸のための1つ以上のプライ
マーを含む第二のセットの液滴と合体させて、最終液滴を生じさせる。液滴のマージは、
例えば、Linkら(米国特許出願第2008/0014589号、同第2008/00
03142号、および同第2010/0137163号)およびRaindance T
echnologies Inc.の欧州特許出願公開第2047910号に記載されて
いる1つ以上の液滴マージ技術を用いて遂行することができる。
形態において、第一の液滴形成モジュールは、ターゲット核酸の限界または終点希釈に見
合ったサンプル液滴を生じさせる。第二の液滴形成または再注入モジュールは、PCR反
応用の試薬を含有する液滴を挿入する。そのような液滴は、一般に、「PCRマスターミ
ックス」(少なくともTaqポリメラーゼと、タイプA、C、GおよびTのデオキシヌク
レオチドと、塩化マグネシウムとを含有する混合物として当業者に公知)ならびにフォワ
ードおよびリバースプライマー(ひとまとめにして「プライマー」として当業者に公知)
を含み、これらのすべてが水性緩衝液に懸濁されている。前記第二の液滴は、増幅された
ターゲット核酸を検出するための検出可能に標識されたプローブも含み、これらの詳細は
下で論ずる。2つの液滴タイプ間での試薬の異なる取り合わせが考えられる。例えば、別
の実施形態では、テンプレート液滴もPCRマスターミックスを含有するが、プライマー
およびプローブは第二の液滴内に残存する。試薬およびテンプレートDNAの任意の取り
合わせを本発明に従って用いることができる。
Enzymol.、68:90(1979);Brownら、Methods Enzy
mol.、68:109(1979))を用いる適切な配列のクローニングおよび直接化
学合成をはじめとする(しかしこれらに限定されない)様々な方法によって調製すること
ができる。プライマーを商業的供給源、例えばOperon Technologies
、Amersham Pharmacia Biotech、SigmaおよびLife
Technologies、から得ることもできる。前記プライマーは、同一融解温度
を有することができる。前記プライマーの長さを5’末端または3’末端で伸長または短
縮して、所望の融解温度を有するプライマーを生成させることができる。また、プライマ
ー対の配列および長さが所望の融解温度を生じさせるように、各プライマー対のアニーリ
ング位置を設計することができる。25塩基対より小さいプライマーの融解温度を決定す
るための最も単純な方程式は、ウォーレスの法則(Wallace Rule)(Td=
2(A+T)+4(G+C))である。プライマーの融解温度を決定するためのもう1つ
の方法は、ニアレストネーバー法である。Array Designer Softwa
re(Arrayit Inc.)、Oligonucleotide Probe S
equence Design Software for Genetic Anal
ysis(Olympus Optical Co.)、NetPrimer、およびH
itachi Software EngineeringからのDNAsisをはじめ
とする(しかしこれらに限定されない)コンピュータプログラムを使用してプライマーを
設計することもできる。各プライマーのTM(融解またはアニーリング温度)は、Inv
itrogen Corp.から入手できるOligo Designなどのソフトウェ
アプログラムを使用して計算する。
合(interdigitation)を生じさせるように液滴形成モジュールを配置お
よび制御する。そのような配置は、例えば、Linkら(米国特許出願第2008/00
14589号、同第2008/0003142号、および同第2010/0137163
号)およびRaindance Technologies Inc.の欧州特許出願公
開第2047910号に記載されている。
マーと検出可能に標識されたプローブとターゲット核酸とを含む液滴を生成させる。例え
ば、電場勾配を用いて液滴に対する誘電泳動力を生じさせて、液滴を合体させるようにそ
の力を制御すること;異なるサイズの液滴であって、それ故、異なる速度で移動する液滴
を生成し、それによって液滴を合体させること;および異なる粘度を有する液滴であって
、それ故、異なる速度で移動する液滴を生成させ、それによって液滴を互いに合体させる
ことにより、液滴を合体することができる。これらの技術のそれぞれが、Linkら(米
国特許出願第2008/0014589号、同第2008/0003142号、および同
第2010/0137163号)およびRaindance Technologies
Inc.の欧州特許出願公開第2047910号にさらに記載されている。液滴を合体
させるための液滴に対する誘電泳動力の生成および制御についてのさらなる説明は、Li
nkら(米国特許出願第2007/0003442号)およびRaindance Te
chnologies Inc.の欧州特許出願公開第2004316号に記載されてい
る。
ターミックスとプライマーと検出可能に標識されたプローブとを既に含有する混合物から
液滴を生成させるように単一の液滴形成モジュールまたは多数の液滴形成モジュールを配
置する。コ・フローと呼ばれるさらにもう1つの実施形態では、単一の液滴形成モジュー
ルの上流で2つのチャネルが交差し、それによって2つのフローストリームを収束させる
。一方のフローストリームは、1セットの試薬とテンプレートDNAを含有し、他方は、
残りの試薬を含有する。コ・フローについての好ましい実施形態では、テンプレートDN
AおよびPCRマスターミックスが一方のフローストリームの中にあり、プライマーおよ
びプローブが他方の中にある。しかし、本発明は、いずれのフローストリームの要素構成
に関しても限定されない。例えば、もう1つの実施形態では、一方のフローストリームが
テンプレートDNAのみを含有し、他方はPCRマスターミックス、プライマーおよびプ
ローブを含有する。流体交差部においてフローストリームが収束するとき、該フロースト
リームは、液滴生成ノズルの前で混ざることもあり、または混ざらないこともある。いず
れの実施形態においても、第一のストリームからの多少の量の流体、および第二のストリ
ームからの多少の量の流体が単一の液滴内に封入される。封入後に完全混合が起こる。
を生成されたら、それらの液滴を熱サイクルに付して、各液滴内のターゲット核酸の増幅
を生じさせる。一定の実施形態では、液滴をPCR熱サイクリングチューブにエマルジョ
ンとしてオフチップで回収し、その後、従来の熱サイクラーでの熱サイクルに付す。熱サ
イクリングについての温度プロフィールは、PCRによる任意の従来のDNA増幅と同様
に調整および最適化することができる。
滴を流して、該液滴内の核酸を増幅する。前記チャネルの幅および深さを調整して各温度
での滞留時間を設定してもよく、1秒未満と数分の間のどのような程度にも滞留時間を制
御することができる。
ゾーン)、プライマーのアニーリング(低温ゾーン)および二本鎖核酸を生産するための
一本鎖核酸の増幅(中温ゾーン)を生じさせるように、前記3つの温度ゾーンを制御する
。これらのゾーン内の温度は、PCR反応を行うための当該技術分野において周知の範囲
内に入る。例えば、Sambrookら(Molecular Cloning、A L
aboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor
Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New
York、2001)を参照のこと。
:95℃(TH)、55℃(TL)、72℃(TM)。調製されたサンプル液滴は、制御
された速度でチャネルを通って流れる。サンプル液滴は、熱サイクリング前に初期変性ゾ
ーン(TH)を先ず通過する。初期予熱は、サンプル液滴内の核酸が熱サイクリング前に
首尾よく変性してしまうための拡張ゾーンである。予熱ゾーンの必要条件、および必要と
される変性時間の長さは、その反応において用いられることとなる化学に依存する。サン
プルは、おおよそ95℃の高温ゾーンを通過し、そこでサンプルは、変性と呼ばれるプロ
セスで先ず一本鎖DNAへと分離される。次に、サンプルは、おおよそ55℃の低温へと
流れ、そこでハイブリダイゼーションプロセスが発生し、その間にプライマーがサンプル
の相補配列にアニールする。最後に、サンプルがおおよそ72℃の第三の中温を通って流
れると、ポリメラーゼプロセスが発生し、このときプライマーは熱安定性酵素でDNAの
一本鎖に沿って伸長される。各ゾーンにおける温度を制御するための方法としては、電気
抵抗、ペルチェ接合、マイクロ波照射、および赤外線での照明を挙げることができるが、
これらに限定されない。
イクリングおよび化学反応を受ける。そのデバイスにおけるサイクルの総数は、熱ゾーン
の拡張によって、または連続ループ構造を作ることによって、容易に改変される。サンプ
ルは、それが完全熱デバイスのN回の増幅サイクルを通過するのと同じ熱サイクリングお
よび化学反応を受ける。
ゾーンを制御する。一定の実施形態では、前記2つの温度ゾーンを、次のような温度を有
するように制御する:95℃(TH)および60℃(TL)。サンプル液滴は、場合によ
り、熱サイクリングに入る前に初期予熱ゾーンを通って流れる。この予熱ゾーンは、活性
化のための、およびまた、熱サイクリング反応が始まる前に液滴内の二本鎖核酸を確実に
十分に変性させるための、何らかの化学にとって重要であり得る。例示的実施形態では、
その予熱ドウェル長が、より高温での液滴のおおよそ10分の予熱をもたらす。
呼ばれるプロセスで先ず一本鎖DNAに分離される。次に、そのサンプルは、そのデバイ
スを通っておおよそ60℃の低温ゾーンへと流れ、そこでハイブリダイゼーションプロセ
スが起こり、その間にプライマーがそのサンプルの相補配列にアニールする。最後に、ポ
リメラーゼプロセスが発生し、このときプライマーは熱安定性酵素でDNAの一本鎖に沿
って伸長される。サンプルは、完全デバイスの各熱サイクルを通過するのと同じ熱サイク
リングおよび化学反応を受ける。そのデバイスにおけるサイクルの総数は、ブロック長お
よび配管によって容易に改変される。
PCRチューブなどの何らかのタイプの保管容器内に同じチップ若しくは別のチップ上ま
たはオフチップで保管する。その後、液滴を収容しているチップまたは保管容器全体をサ
イクルに付して、所望のPCR加熱および冷却サイクルを達成する。
て油を迅速に交換することができるチャンバに、液滴を回収する。このとき、容器内の油
を異なる温度の油と交換することによって、液滴の温度を容易に変えることができる。こ
の技術は、大まかに、2および3工程温度サイクリングまたは任意の他の温度順序で有用
である。
ング法を用いることができる。
増幅後、増幅産物の検出のための検出モジュールに液滴を流す。液滴をオフチップで熱
サイクルに付す実施形態については、液滴は、読み出しのために第二の流体回路−液滴生
成のための流体回路(単数もしくは複数)と同じチップ上にあってもよいし、なくてもよ
い−への再注入を必要とし、または一定の実施形態では読み出しのために液滴を液滴生成
に使用した元の流体回路に戻って再注入してもよい。当該技術分野において公知の任意の
方法、例えばレポーターの存在または量の検出、を用いて、それらの液滴を個々に分析お
よび検出することができる。一般に、前記検出モジュールは、1つ以上の検出装置と連通
している。前記検出装置は、光学的もしくは電気的検出器またはこれらの組み合わせであ
り得る。適する検出装置の例としては、光導波路、顕微鏡、ダイオード、光刺激デバイス
(例えば、レーザー)、光電子倍増管およびプロセッサ(例えば、コンピュータおよびソ
フトウェア)、ならびに特性、マーカーまたはレポーターのシグナル表示を検出するため
におよび選別モジュールでの測定または選別動作を決定および命令するために共働するこ
れらの組み合わせが挙げられる。検出モジュールおよび液滴中の増幅産物の検出方法につ
いてのさらなる説明は、Linkら(米国特許出願第2008/0014589号、同第
2008/0003142号、および同第2010/0137163号)およびRain
dance Technologies Inc.の欧州特許出願公開第2047910
号に示されている。
して検出する。特定の実施形態において、前記検出可能に標識されたプローブは、蛍光標
識されたプローブなどの光学的に標識されたプローブである。蛍光標識の例としては、A
tto色素、4−アセトアミド−4’−イソチオシアナトスチルベン−2,2’ジスルホ
ン酸;アクリジンおよび誘導体;アクリジン、アクリジンイソチオシアネート;5−(2
’−アミノエチル)アミノナフタレン−1−スルホン酸(EDANS);4−アミノ−N
−[3−ビニルスルホニル)フェニル]ナフタルイミド−3,5ジスルホネート;N−(
4−アニリノ−1−ナフチル)マレイミド;アントラニルアミド;BODIPY;ブリリ
アント・イエロー;クマリンおよび誘導体;クマリン、7−アミノ−4−メチルクマリン
(AMC、クマリン120)、7−アミノ−4−トリフルオロメチルクマリン(trif
luoromethylcouluarin)(クマラン151);シアニン色素;シア
ノシン;4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI);5’,5’’ジ
ブロモピロガロール−スルホンフタレイン(sulfonaphthalein)(ブロ
モピロガロール・レッド);7−ジエチルアミノ−3−(4’−イソチオシアナトフェニ
ル)−4−メチルクマリン;ジエチレントリアミンペンタアセテート;4,4’−ジイソ
チオシアナトジヒドロ−スチルベン−2,2’−ジスルホン酸;4,4’−ジイソチオシ
アナトスチルベン−2,2’−ジスルホン酸;5−[ジメチルアミノ]ナフタレン−1−
スルホニルクロリド(DNS、ダンシルクロリド);4−ジメチルアミノフェニルアゾフ
ェニル−4’−イソチオシアネート(DABITC);エオシンおよび誘導体;エオシン
、エオシンイソチオシアネート、エリトロシンおよび誘導体;エリトロシンB、エリトロ
シン、イソチオシアネート;エチジウム;フルオレセインおよび誘導体;5−カルボキシ
フルオレセイン(FAM)、5−(4,6−ジクロロトリアジン−2−イル)アミノフル
オレセイン(DTAF)、2’,7’−ジメトキシ−4’5’−ジクロロ−6−カルボキ
シフルオレセイン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、QFITC、
(XRITC);フルオレスカミン;IR144;IR1446;マラカイトグリーンイ
ソチオシアネート;4−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン;ニトロチ
ロシン;パラローズアニリン;フェノールレッド;B−フィコエリトリン;o−フタルジ
アルデヒド;ピレンおよび誘導体;ピレン、ピレンブチレート、スクシンイミジル1−ピ
レン;ブチレート量子ドット;リアクティブレッド4(Cibacron(商標)ブリリ
アント・レッド 3B−A)ローダミンおよび誘導体;6−カルボキシ−X−ローダミン
(ROX)、6−カルボキシローダミン(R6G)、リサミンローダミンBスルホニルク
ロリドローダミン(Rhod)、ローダミンB、ローダミン123、ローダミンXイソチ
オシアネート、スルホローダミンB、スルホローダミン101、スルホローダミン101
のスルホニルクロリド誘導体(テキサス・レッド);N,N,N’,N’テトラメチル−
6−カルボキシローダミン(TAMRA);テトラメチルローダミン;テトラメチルロー
ダミンイソチオシアネート(TRITC);リボフラビン;ロゾール酸;テルビウムキレ
ート誘導体;Cy3;Cy5;Cy5.5;Cy7;IRD 700;IRD 800;
ラホーヤブルー(La Jolta Blue);フタロシアニン;ならびにナフタロシ
アニンが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい蛍光標識は、FAMおよびVI
C(商標)(Applied Biosystemsから)である。他の光学的に検出可
能な標識を含めて、蛍光標識以外の標識が本発明により考えられる。
イズする多数の検出可能プローブを含有する。前記複数のプローブの構成員は、それぞれ
、同じ検出可能標識を含むことがあり、または異なる検出可能標識を含むことがある。前
記複数のプローブは、様々な濃度のプローブの1つ以上の群を含むこともある。様々な濃
度のプローブの前記群は、様々なプローブ濃度のため強度の点で様々である、同じ検出可
能標識を含むことができる。
内の単層に閉じ込められた液滴のスキャンによって、検出を行うことができる。この仕方
で保管された液滴は、スキャナーによる保管デバイスの移動または保管デバイスの上での
スキャナー移動のいずれかによってスキャンすることができる。
すべての蛍光発生性DNAハイブリダイゼーションプローブ、例えば分子ビーコン、So
larisプローブ、スコーピオンプローブ、およびハイブリダイゼーションによるター
ゲットDNAの配列特異的認識によって機能し、そのターゲット配列の増幅により蛍光増
加を生じさせる任意の他のプローブ、の使用を包含する。
エマルジョン形式でのデジタルPCR性能を、参照遺伝子、分岐鎖ケト酸デヒドロゲナ
ーゼE1(BCKDHA)、の系列希釈物を測定することによって検証した。液滴生成マ
イクロ流体チップを使用して、PCRマスターミックスと、1×プライマーと、BCKD
HA用のプローブと、様々な濃度のヒトゲノムDNA混合物(1:1 NA14091と
NA13705)との混合物を、フッ素化油中水型エマルジョン中の100万個を超える
5.3pL液滴に区画化した。そのエマルジョンをオフチップで熱サイクルに付し、その
後、各液滴の蛍光を読み出しチップにおいて蛍光によって分析した(図3参照)。
滴生成および読み出しのためのマイクロ流体システム。図3a(液滴生成チップ)に示す
ように、PCRマスターミックスとプライマーとプローブとテンプレートDNAとを含有
する連続水性相が左から流体交差部へと流れ、キャリア油が上部および下部から入った。
水性液の新生ボーラスを、交差部内で、流体の張力が水性液の表面張力を超えはじめて耐
えきれなくなって別個の4pL液滴になる直前に撮像した。交差部を出て右へと向かう液
滴の定常的つらなりを熱サイクリング用の安定したエマルジョンとしてオフチップで回収
した。図3bは、読み出しのための液滴間隔どりを図示するものである。連続相の代わり
に(a)からのエマルジョンを熱サイクリング後に左から交差部に注入したことを除き、
3aの場合と同様にフローを準備した。オフチップ処理中にエマルジョンから油が排液さ
れる故、エマルジョンは、この画像では交差部の前は密充填されているように見えた。交
差部に導入された油によって液滴は分離され、矢印によってしるしをつけた位置で各液滴
の蛍光を測定した。図3cは、蛍光による液滴読み出しの漫画を描いたものである。比較
的頻度の低いPCR(+)液滴(薄灰色)が大多数のPCR(−)液滴(濃灰色)と一緒
に検出器のほうに流れる。液滴は、検出領域を通過している間にレーザー誘導蛍光による
問い合わせを逐次的に受ける。
率」と呼ぶ−は、DNA濃度に正比例して増加するはずである。この占有率は、当業者に
周知の次の方程式を用いてポアソン統計から計算した:
)。
およびPCR(−)液滴の数をカウントした(図3c参照)。各液滴が(図3bにおいて
矢印でしるしをつけた)検出ゾーンを通過すると、蛍光のバーストが観察された。異なる
チップ配置などのために起こり得る蛍光強度のラン間の小さな差を説明するために、各デ
ータセットを、空の液滴の平均蛍光強度が0.1Vになるように拡大縮小した。図4aは
、その系列の中で最高DNA濃度を有するサンプルについての個々の液滴からの蛍光バー
ストの典型的トレースの非常に短い継続時間を示している。PCR(+)およびPCR(
−)液滴は、蛍光強度によって容易に識別された。〜0.8Vでピークに達する2つの大
きな蛍光バーストがPCR(+)液滴から発生し、これに対してPCR(−)液滴では不
完全な蛍光消光に起因するより小さいバーストが〜0.1Vでピークに達した。完全デー
タセットからのピーク強度のヒストグラムは、0.10および0.78Vに中心を有する
2つの明確な集団を明示した(図4b)。これは、図4aにおける短いトレースにおいて
明白な傾向が、はるかに長い期間にわたって安定していたことの証拠となる。図4bにお
ける2つの集団の統合により、合計197,507個のPCR(+)および1,240,
126個のPCR(−)液滴を得た。従って、Eqn.1によりこのサンプルについての
占有率は0.15であり、これは、110ng/μLの測定DNA濃度に基づく0.18
の期待占有率に対応した。系列希釈での各サンプルについての占有率を測定し、希釈方程
式:
999であり、および当てはめられた希釈係数は5.0の期待値とほぼ一致して4.8で
あった。
Linkら(米国特許出願第2008/0014589号、同第2008/00031
42号、および同第2010/0137163号)、Andersonら(米国特許第7
,041,481号および再発行番号41,780として再発行されたもの)およびRa
indance Technologies Incの欧州特許出願公開第204791
0号(これらのそれぞれの内容は、それら全体が参照により本明細書に援用されている)
に記載されているような液滴ベースのデジタルPCR技術は、1ライブラリー液滴あたり
単一のプライマー対を用いる。このライブラリー液滴を、プライマーを除いてゲノムDN
Aを含むすべてのPCR試薬を含有するテンプレート液滴と合体させる。テンプレート液
滴とプライマーライブラリー液滴のマージ後、その新たな液滴は今やPCRを行うために
必要なすべての試薬を含有する。その後、その液滴を熱サイクルに付してアンプリコンを
生産する。1つの実施形態では、平均して1液滴あたり1未満の半数体が存在するように
テンプレートDNAをテンプレートミックスで希釈する。
、チューブまたはマイクロウエルにおける標準的なシングルプレックスまたはマルチプレ
ックスPCRに勝る液滴PCRの利点をもたらす。例えば、伝統的なPCRでは、両方の
対立遺伝子が反応ミックス中に存在するので、対立遺伝子間のPCR効率に差がある場合
、最高効率を有する対立遺伝子が過剰に示されることとなる。加えて、注意深いプライマ
ー設計にもかかわらず、PCRプライマーがハイブリダイズする配列に不一致がある場合
がある。プライマーハイブリダイゼーション配列の不一致は、野生型配列を有する対立遺
伝子と比較してこの不一致を有する対立遺伝子についてのほうが低いハイブリダイゼーシ
ョン効率をプライマーが有する原因となり得る。これは、両方の対立遺伝子が同じ反応ミ
ックス中に存在する場合、一方の対立遺伝子が他方の対立遺伝子より優先的に増幅される
原因にもなり得る。
1つの対立遺伝子、しか存在しないため、これらの問題は回避される。従って、1つの対
立遺伝子についてのPCR効率を低減するプライマー不一致がたとえ存在したとしても、
対立遺伝子は分離されるおよび従って均一に増幅されるため、対立遺伝子間の競合がない
。
しいことは公知である。同じ反応で産生される複数のPCRアンプリコンは、配列または
長さの違いのために異なる効率を有するアンプリコン間での競合をもたらすことがある。
これは、競合するアンプリコン間での収量の変動をもたらし、その結果、不均一なアンプ
リコン収量となり得る。しかし、液滴ベースのデジタルPCRは、1液滴あたり1つのテ
ンプレート分子しか利用しないため、液滴内に複数のPCRプライマー対がたとえ存在し
たとしても、1つのプライマー対しか活性にならない。1液滴あたり1つのアンプリコン
しか生成されることとならないので、アンプリコン間に競合はなく、その結果、異なるア
ンプリコン間でより均一なアンプリコン収量が得られる。
/または特定の数のPCRポジティブ液滴のいずれかを生成させるために、一定の量のD
NAが必要とされる。液滴のわずかな割合、標準的な手順でおおよそ3分の1、しかPC
Rポジティブでないため、テンプレートDNA分子あたりの当量PCR収率を達成するに
は、より多くのDNAがかかる。より多くのゲノムDNAを加えることにより、PCRポ
ジティブ液滴の数および従ってアンプリコン収量を増加させることができる。例えば、液
滴の数を一定に維持しながらのゲノムDNAの量を2倍増加させると、アンプリコン収量
は2倍になるだろう。しかし、同じ液滴内の遺伝子が両方の対立遺伝子を有する有意な機
会が存在する前に加えることができるゲノムDNAの量には限界があり、その結果、対立
遺伝子特異的PCRに打ち勝つことおよび対立遺伝子ドロップアウトをもたらすことにつ
いての液滴PCRの利点は無くなる。
成させて液滴あたりの半数体分子の比率を一定に保つことによる。例えば、DNAの量を
2倍にすることおよび液滴の量を2倍にすることで、同じ液滴あたりの半数体ゲノム比を
維持しながらアンプリコン収量を2X増加させる。しかし、液滴の数を2倍にすることは
問題が多い上、DNAの量を増加させることは、限られた量のDNAを有する使用者には
難しい。
く保って同等のまたはより大きいアンプリコン収量を生じさせながら、同時にPCR液滴
数を増加させることができる。これは、より多くのDNAを消費することなく、PCRポ
ジティブ液滴の量とアンプリコン収量の総合的増加をもたらす。
体ゲノムおよび1液滴あたり1つのPCRプライマーがある場合、液滴内にPCRプライ
マーにとって適正なテンプレートが存在する機会は、4分の1である。しかし、1液滴あ
たり2つのPCRプライマーがある場合には、液滴内に適切なテンプレートが存在するこ
ととなる機会は2倍になる。この結果、2個のうち1個の液滴がPCRポジティブとなり
、これは、インプットDNAを2倍にすることなくアンプリコン収量を2倍にする。2x
多重化プライマーを含有する液滴の数を2倍にし、DNAを一定に保った場合には、PC
Rポジティブ液滴の数は落ちて4分の1に戻るが、液滴数が倍増されているためPCR液
滴の総数は同じままである。各液滴内の多重化レベルを4xに増加させ、インプットDN
Aが同じである場合、各液滴内に適正なテンプレート分子が存在する機会は2倍になる。
この結果、PCRポジティブ液滴の数は2分の1に増加することとなり、これは、インプ
ットDNAの量を増加させることなくアンプリコン収量の量を2倍にする。このように、
各液滴内のPCRプライマーの多重化を増すことにより、および全体的に液滴の数を増加
させることにより、インプットDNAの量を増加させることなくアンプリコン収量を4倍
増加させることができる。
ついての多重化レベルを増すことにより、アンプリコン収量を犠牲にすることなくインプ
ットゲノムDNAの量を低下させることができる。例えば、PCRプライマーの多重化レ
ベルが1xから2xになると、同じ総アンプリコン収量をなお維持しながらインプットゲ
ノムDNAの量を2x減少させることができる。
液滴あたり1つのテンプレート分子しかなく、従って、1液滴あたり1つのプライマー対
しか一度に利用されることとならない。これは、対立遺伝子特異的PCRまたは異なるア
ンプリコン間の競合のいずれかからのバイアスを無くすことについての液滴PCRの利点
が維持されることを意味する。
証実験をここに示す。5セットのプライマー(TERT、RNaseP、E1a、SMN
1およびSMN2についてのプライマー)の複数のコピーを、テンプレートDNAおよび
PCRマスターミックスと一緒に、様々な濃度で単一の液滴に封入した。TERT、RN
aseP、E1a、SMN1またはSMN2に特異的に結合するプローブも、それらのプ
ライマーを含有する液滴に封入した。TERT、RNasePおよびE1aについてのプ
ローブをVIC色素で標識し、SMN1およびSMN2についてのプローブをFAM色素
で標識した。TERT、RNaseP、E1a、SMN1およびSMN2の配列をPCR
によって増幅した。標準的な熱サイクリング設定でPCRを行った。例えば:
10分間95℃
31サイクル
15秒間92℃
60秒間60℃ 。
にプロットした。対応する蛍光波長を有する液滴をそれぞれが表す6つのクラスタを示し
た。TERT、RNasePおよびE1aクラスタは、3つの別個の強度でVIC色素の
蛍光を示し、SMN1およびSMN1クラスタは、2つの別個の強度でFAM色素の蛍光
を示した(図5)。TERT、RNaseP、E1a、SMN1およびSMN2から選択
される1つ以上の配列をそれぞれが有する液滴の数をその散布図から決定することができ
る。
の実証実験では、5セットのプライマー(TERT、RNaseP、E1a、815Aお
よび815Gについてのプライマー)を、テンプレートDNA、PCRマスターミックス
およびプローブと一緒に、様々な濃度で単一の液滴に封入した。5つの異なるプローブT
ERT、RNaseP、E1a、815Aおよび815Gも、それらのプライマーを含有
する液滴に封入した。TERTおよび815AについてのプローブをVIC色素で標識し
、815GについてのプローブをFAM色素で標識した。RNasePおよびE1aのそ
れぞれについては、一方をVIC色素で標識し、他方をFAM色素で標識した、2つのプ
ローブを封入した。
せた。それらの融合液滴でPCR反応を行って、TERT、RNaseP、E1a、81
5Aおよび815Gの配列を増幅した。標準的な熱サイクリング設定でPCRを行った。
布図にプロットした。対応する蛍光波長および強度を有する液滴をそれぞれが表す6つの
クラスタを示した。TERTおよび815Aクラスタは、2つの別個の強度でVIC色素
の蛍光を示し;815Gクラスタは、FAM色素の蛍光を示し;ならびにRNasePお
よびE1aクラスタは、別個の強度でFAMおよびVIC両方の色素の蛍光を示した(図
6)。TERT、RNaseP、E1a、815Aおよび815Gから選択される1つ以
上の配列をそれぞれが有する液滴の数をその散布図から決定することができる。RNas
eP、E1a、815Aおよび/または815G配列を有する液滴の数とTERT配列を
有する液滴の数の間の比によって、テンプレート内のRNaseP、E1a、815Aお
よび815Gのコピー数を決定した(図6)。
実験では、2つの液滴ライブラリーを生成させた:各液滴が1つのプライマー対しか含有
しない、液滴ライブラリーAを生成させ;およびプライマー対が各液滴内で5xレベルで
多重化された、液滴ライブラリーBを生成させた。標準的な手順を用いて液滴ライブラリ
ーAおよびBでHapMapサンプルNA18858を二重反復で処理した。液滴ライブ
ラリーAには2μgのサンプルDNAを使用し、5xマルチプレックス液滴ライブラリー
Bには1μgのサンプルDNAを使用した。PCR増幅後、両方の液滴ライブラリーをば
らし、Qiagen MinEluteカラムで精製し、その後、Agilent Bi
oanalyzerにかけた。サンプルは、IlluminaによりIllumina
GAIIを用いて50ヌクレオチド読み取りでシークエンシングされ、標準的なシークエ
ンシング測定基準を用いてそれらのシークエンシング結果を分析した。下の表に示す標準
的な測定基準を用いて、5x多重化液滴ライブラリーBからの結果をシングルプレックス
液滴ライブラリーAと比較した。
価またはそれより良好であった。プライマーの多重化は、インプットDNA低減の追加の
利点と共に、塩基網羅(base coverage)、特異性および均一性について一
重化(singleplex)が成すものと同じシークエンシング結果をもたらす。
総数
位置づけられた読み取り(%):ヒトゲノムにマップされた全読み取りの百分率。
特異性:ターゲットを含むマップされた読み取りの百分率。前記ターゲットはすべてのア
ンプリコン配列を含むが、プライマー配列を含まない。
平均塩基網羅:ターゲット内の平均塩基網羅。前記ターゲットはすべてのアンプリコン配
列を含むが、プライマー配列を含まない。
C1:少なくとも1x塩基網羅を有するターゲットの%。注記:非一意的シークエンシン
グ読み取りがランダムにマップされる。
C20:少なくとも20x塩基網羅を有するターゲットの%。
C100:少なくとも100x塩基網羅を有するターゲットの%
塩基網羅(平均の0.2x):平均塩基網羅の少なくとも20%を有するターゲットの%
。
伝統的なデジタルPCR法は、個々のターゲットに特異的な単一標識プローブの使用を
含む。図7は、液滴ベースのデジタルPCRを用いるターゲット配列の一色検出を図示す
る概略図である。図7のパネルAに示すように、テンプレートDNAをフォワードプライ
マー(F1)およびリバースプライマー(R1)で増幅する。カラー1の蛍光体で標識さ
れたプローブ(P1)は、ターゲット遺伝子配列(ターゲット1)に結合する。限界また
は終点希釈条件下でテンプレートDNAの希釈溶液で微小液滴を作製する。ターゲット配
列を含有する液滴は蛍光を放射し、レーザによって検出される(パネルBおよびC)。タ
ーゲット配列を含有するまたは含有しないマイクロカプセルの数を、ヒストグラムで示し
(D)、定量した(E)。
る。図8のパネルAに示すように、テンプレートDNAを2セットのプライマー:フォワ
ードプライマー(F1)とリバースプライマー(R1)、およびフォワードプライマー(
F2)とリバースプライマー(R2)、で増幅する。カラー1の蛍光体で標識されたプロ
ーブ(P1)は、ターゲット1に結合し、カラー2の蛍光体で標識されたプローブ(P2
)は、ターゲット2に結合する(パネルBおよびC)。限界または終点希釈条件下でテン
プレートDNAの希釈溶液で微小液滴を作製する。ターゲット配列1または2を含有する
液滴は、カラー1または2の蛍光をそれぞれ放射し、レーザによって光学的に検出される
(パネルBおよびC)。ターゲット1または2を含有するマイクロカプセルの数を、ヒス
トグラムによってパネル(D)に示す。
DNAターゲットの正確な定量を行うことを含む。図9は、マイクロ流体デバイスでの3
つの遺伝子配列の二色検出を図示する概略図である。図9のパネルAに示すように、テン
プレートDNAを3セットのプライマー:フォワードプライマー(F1、F2およびF3
)とリバースプライマー(R1、R2およびR3)、で増幅する。プローブ(P1、P2
およびP3)は、蛍光体(カラー1、カラー2およびカラー1)で標識されており、ター
ゲット遺伝子配列(ターゲット1、ターゲット2およびターゲット3)に結合する(パネ
ルBおよびC)。限界または終点希釈条件下でテンプレートDNAの希釈溶液で微小液滴
を作製する。ターゲット配列1または3を含有する微小液滴は、2つの異なる強度でカラ
ー1の蛍光を放射し;ならびにターゲット配列2を含有する微小液滴は、カラー2の蛍光
を放射する。ターゲット1、2または3を含有する微小液滴の数を、ヒストグラムにより
パネルDに示す。
立したPCR反応をランでき、別々に定量できることを示している。とりわけ、SMN2
アッセイは、FAM検出チャネルにおいて有意に高いシグナルを有する予期せぬ液滴集団
を生じさせる。
MN1ブロッカーを有することの効果を図示している。左側のドットプロットに図示され
ている4つのクラスタは、次のとおりである:上部左クラスタは、参照配列(SMARC
C1)を含有する微小液滴を含み;下部左クラスタは、いずれの配列も含有しない微小液
滴を含み;下部中央クラスタは、SMN1の配列を含有する微小液滴を含み;および下部
右クラスタは、SMN2の配列を含有する微小液滴を含む。図10の右側のドットプロッ
トは、SMN1ブロッカーが反応に存在しなかった4つのクラスタを図示しており;上部
左クラスタは、参照配列(SMARCC1)を含有する微小液滴を含み;下部左クラスタ
は、いずれの配列も含有しない微小液滴を含み;下部中央クラスタは、SMN1の配列を
含有する微小液滴を含み;および下部右クラスタは、SMN2の配列を含有する微小液滴
を含む。左のパネルと比較して右のパネルにおける下部中央クラスタのシフトは、蛍光強
度により配列の存在についての非常に感度の高い測定がもたらされることを確証する。
プローブへの弱い会合から、その遺伝子に対するブロッカー(SMN1遺伝子に対する非
蛍光相補的プローブ)の存在にもかかわらず、クラスターが発生することが、その最も簡
単な説明である。
在への、この特徴の強度について観察される依存であった。より高いFAM蛍光強度への
明確なシフトが、ブロッカー不在下で観察された(図10)。もう1つの決定的確証では
、予想と完全に一致して0.96の参照サイズに対するSMN1(推定)集団サイズの比
(それぞれの2つのコピー)(S_131サンプル)。同数のSMN1コピーを有するも
う1つのサンプル、S_122、は、あるランでは0.88および別のランでは0.93
の比を生じさせ、これも予期せぬクラスタについて提案した説明と一致した。
DNAへのSMN2プローブの結合が高い蛍光シグナルを生じさせることを示している。
この現象を説明する単純な動態モデルは、ポリメラーゼが相補鎖をふさぐより速い速度で
SMN2プローブのSMN1 DNAへのハイブリダイゼーションが平衡に達することを
想定している。従って、各熱サイクルの際に放出されるプローブ蛍光体の量は、結合して
いるプローブの数に比例する(または等しいことさえある)。それ故、結合親和性が低い
ほど、放出されるプローブ蛍光体の数は少ない。SMN2プローブとSMN1配列のミス
マッチ(単数または複数)のため、プローブの親和性は、SMN2よりSMN1に対する
ほうが低いと確かに予想される。このモデルは、sMN1ブロッカーへのシグナル依存性
も説明する:該ブロッカーは、ポリメラーゼエキソヌクレアーゼ活性によるSMN2プロ
ーブ加水分解を競合的に阻害する。
ない場合もある。この場合、会合速度がより支配的な役割を果たすであろう。同様の理論
が適用される。マッチング部位への結合速度は、ミスマッチ部位へより速い可能性が高く
、ブロッカーは、ミスマッチ部位へのプローブ結合を減速させるように作用するであろう
。SMN1 DNAへのSMN2プローブの結合は、従来のバルクqPCRによって、と
りわけSMN2の不在下で、検出可能であり得るが、ここで示すもののような高定量的結
果は、非常に見込み薄である。確かに、同じ色の蛍光体で2つの異なるDNA配列モチー
フを定量するqPCRまたは任意の他の技術についての報告はない。液滴内での単一分子
増幅による個々の反応の隔離は、シグナルへの種々雑多な寄与に関する一切の混乱を無く
す。
高相同性配列の実施例を超えて広がる。むしろ、いかなる類似度または非類似度のいかに
多数の配列も、異なるプローブがそれらのそれぞれのDNA結合部位への有意に異なる結
合占有率を有する限り、定量することができる。
PCRアッセイでのように試薬について互いに競合しない点である。しかし、予期せぬ交
差反応性についての可能性は残存する。マルチプレクセスアッセイ(multiplex
es assay)は、より希薄なサンプルを必要とし得る。例えば、10%占有率で、
デュプレックス反応は、その時の2倍の占有率1%を有するであろう。それ故、10個の
PCR+液滴のうちの1つは2倍となり、その結果、2つのプローブの増白剤と少なくと
も同様の高さのおよびことによるとそれより高い最終強度をもたらす。単純なデュプレッ
クス系については、各プローブからの寄与を回収することができた。この実施例では、プ
ローブ1に対するPCR+液滴の総数は、(プローブ1)+(プローブ1+プローブ2)
となるだろう。多重度が高いほど、大きな希釈を必要とする。例えば、1%占有率での4
プレックスについては、他の3つのいずれかとオーバーラップする1つのプローブの確率
は、〜3%であり、その誤差は、一部の用途にとっては高すぎる。大きな希釈の必要は、
数の多いdPCR反応に好都合に働く。
子コピー数アッセイにおいて単一の蛍光体(FAM)を使用した。1細胞あたりターゲッ
ト遺伝子の0〜16コピーに相当する、参照遺伝子に対するターゲット遺伝子コピー数の
変化を表すために、様々な濃度のプラスミドDNAを有するモデルシステムを使用した。
BCKDHAおよびSMN2プラスミドDNAは、それぞれ1×および0.5×プライマ
ーおよびプローブと共に参照およびターゲットとして役立った。8:1 SMN2対BC
KDHAの出発比率で、サンプルを同じ濃度のBACDHAの溶液で2×系列希釈して、
SMN2の量だけを変動させた。得られたサンプルを乳化させ、熱サイクルに付し、10
5個を超える液滴を、前のセクションで説明したように各サンプルについて分析した。こ
のプロセスを三重反復で繰り返した。
。本発明のこの実施例では、3つの異なるテンプレートDNAサンプルについての液滴蛍
光強度のヒストグラムを図11aに示す:無テンプレート対照(点線)、BCKDHAの
み(実線)、および1:1 BCKDHA対SMN2(一点鎖線)。明瞭さのために、一
定のピークについての類似性を強調するためにオーバーラップさせたヒストグラム、およ
び特徴のすべてを明らかにするために互いに並置したヒストグラム、両方を示す。1:1
BCKDHA対SMN2の場合、3つの集団が容易に認められる:最も有力な特徴が0
.08Vに現れ、ならびに0.27および0.71Vでの2つの小さなピークがはっきり
わかった。無テンプレート対照では両方の小さいピークが消失したが、大きいものは残存
したので、0.08Vでの最も有力な特徴をPCR(−)液滴に割り当てた。0.71V
でのピークは、BCKDHAだけの添加に伴って生ずる唯一の特徴であるので、BCKD
HAに割り当て、そしてその後、SMN2を添加すると0.27Vでのピークが現れ、割
当てを終えた。図11aのスケールでは見えない非常に小さいピークが〜0.9Vに現れ
、これは、両方の遺伝子によって占有された液滴に対応する。本発明のもう1つの方法と
して、異なるピークが同定されたら、各ピーク内の液滴をそれぞれの可能な状態(BCK
DHAもしくはSMN2または両方についてはPCR(+)、あるいはPCR(−))に
応じてカウントし、その後、遺伝子コピー数を占有の比率から決定した。系列希釈での各
サンプルについての遺伝子コピー数を期待値に対して図11bにプロットし(SMN2の
BSKDHAに対する期待比率に対するSMN2のBCKDHAに対する観察比率)、十
分な範囲にわたって非常によく直線(y=1.01x)に当てはまった(R2=0.99
97、勾配1.01)。これは、1細胞あたり0から16のSMN2コピーの等価物の正
確で的確な測定を確証している。
同じ原理を用いて、選択的にスプライスされた転写産物を検出し、カウントした。RN
A転写産物内のそれぞれのエキソンに特異的であるTaqManアッセイ物を設計するこ
とができる。RNAをcDNAにした後、それを液滴に1液滴あたり1コピー以下で封入
することができる。この液滴は、それぞれのエキソンについての多重化TaqManアッ
セイ物も含有するであろう。それぞれのTaqManアッセイ物は、異なるプローブを含
有するが、すべてのプローブに同じ蛍光色素が付いているだろう。それらの液滴を熱サイ
クルに付して、それぞれのTaqManアッセイ物についてのシグナルを生成させること
となる。サンプル中に多数のスプライス変異体がある場合、それらは、スプライシング事
象に依存して異なる数のエキソンを含有するだろう。各液滴の蛍光強度は、存在するエキ
ソンの数に依存して異なるだろう。異なる強度を有する液滴の数をカウントすることによ
り、サンプル中の異なるスプライス変異体の存在および存在度を同定することが可能であ
ろう。
不均一サンプルが異なるコピーレベル数を有する成分を含有するかどうかを決定するこ
とが可能だろう。アッセイすべきコピー数変異体を染色体に沿って十分近い間隔で配置し
た場合、サンプルからのDNAをフラグメント化し、1液滴あたり1半数体ゲノム当量以
下のレベルで液滴に封入することができよう。この液滴は、そのコピー数変異体に特異的
なTaqManアッセイ物も含有するだろう。各液滴におけるシグナルの強度は、そのサ
ンプルについての存在するコピー数変異体の数に依存するであろう。異なる強度の液滴の
数のカウントは、特定のサンプル中の幾つの細胞が如何なるレベルのコピー数変異体を有
するかというようなことを示すだろう。
蛍光強度によるプローブの同定は、プローブ、特に、密なプローブパタンを有するより
高プレックスの(higher−plex)アッセイのためのプローブ、の輝度の調整を
必要とすることが多い。前のセクションにおいて、遺伝子コピー数アッセイ用のプローブ
は、非常によく分解されたピークを生じさせた(図11a)。明らかに、測定値の分解に
コピー数アッセイにおける1つまたは多数のさらなるプローブを適応させる余地が存在す
るが、既存のアッセイ物への干渉を避けるために新たなプローブの蛍光強度を調整するた
めの方法が求められる。本発明の1つの方法は、より高プレックスの反応における相対強
度を最適化するための非常に単純な技術としてプローブおよびプライマー濃度を共に変化
させることを含む。
チューニングについての概略図である。図12のパネルAに示すように、テンプレートD
NAを2セットのプライマー:フォワードプライマー(F1およびF2)およびリバース
プライマー(R1およびR2)、で増幅する。プローブ(P1およびP2)は、カラー1
の蛍光体で標識されており、ターゲット1およびターゲット2にそれぞれ結合する。ター
ゲット2からの蛍光は、P2とターゲット2の間の一塩基ミスマッチのため、ターゲット
1からのものより強度が低い。パネルBに示すように、テンプレートDNAを2セットの
プライマー:フォワードプライマー(F1およびF2)およびリバースプライマー(R1
およびR2)、で増幅する(パネルB)。ターゲット2からの蛍光は、蛍光体で標識され
ていない競合プローブ2の存在のため、ターゲット1からのものより強度が低い。パネル
Cに示すように、テンプレートDNAを2セットのプライマー:フォワードプライマー(
F1およびF2)およびリバースプライマー(R1およびR2)、で増幅する。プローブ
(P1およびP2)は、カラー1の蛍光体で標識されており、ターゲット1およびターゲ
ット2にそれぞれ結合する。ターゲット2からの蛍光は、異なる蛍光体で標識されている
競合プローブ2の存在のため、ターゲット1からのものより強度が低い。
ーブおよびプライマーの系列希釈全体を通してのプローブ蛍光強度を、1液滴あたり0.
02のターゲットDNA分子の占有率でCoriell細胞株NA3814からの一定量
のゲノムDNAに対して示すものである。プローブ蛍光強度は、希釈誤差および他のラン
間の差についての補正、例えば、PCR(−)液滴を参照として使用する光学的再アライ
ンメントの後、〜0.15から0.4μMにわたる狭い濃度範囲−大体、0.2μMの典
型的なプローブ濃度あたりが中心−にわたってプローブ濃度に正比例して変動した(R2
=0.995)。要約すると、増幅それ自体に影響を及ぼすことなく多重化アッセイのチ
ューニングのために小さいが適正な範囲にわたって希釈によりプローブ強度を変えること
ができる。
に同じ率で変えることを含むが、本発明は、プローブ強度を変えるためにこの方法のみに
限定されない。プローブ強度を変えるための当業者に公知の他の方法も考えられる。その
ような方法としては、プローブ濃度のみを変えること;プライマー濃度のみを変えること
;フォワードプライマー濃度のみを変えること;リバースプライマー濃度のみを変えるこ
と;プローブ、フォワードおよびリバースプライマー濃度を任意の方法で変えること;熱
サイクリングプログラムを変えること;PCRマスターミックスを変えること;蛍光体を
欠くプローブの何らかの部分をアッセイ物に組み込むこと;またはプローブ結合に対する
任意のハイブリダイゼーションベースの競合阻害剤、例えばブロッキングオリゴマーヌク
レオチド、ペプチド核酸およびロックド核酸、をアッセイ物に組み込むことが挙げられる
。本発明は、単独でまたは任意の組み合わせで用いられる、プローブ蛍光強度を調整する
これらの方法、またはプローブ蛍光強度を調整するための任意の他の方法の使用を援用す
る。
本発明の1つの方法は、単一プローブカラー(すなわち蛍光体)を用いてより高プレッ
クスのアッセイを行うことを含む。上で説明したように、様々な手段により、各強度レベ
ルがDNAターゲットを一意的に同定するようにプローブ蛍光強度を調整することができ
る。例えば、ターゲットT1、T2、T3およびT4は、強度レベルI1、I2、I3お
よびI4によって一意的に同定され得る。理論により拘束されることを意図しないが、タ
ーゲットの一意的同定のために可能な強度レベルの最大数は、異なる強度レベルの分解−
すなわち、プローブの平均強度間の隔たりと比較した特定のプローブそれぞれについての
強度の幅−に関連づけられ、ならびにプローブの数が増加するにつれて増す傾向がある空
の液滴の強度にも関係づけられる。強度レベル数は、0、または1、または2、または3
、または4、または10以下、または20以下、または50以下、または100以下であ
り得る。強度レベル数は、100より上であることもある。下に示す実施例においては、
3ほどもの多さの強度レベルを実証する。
より高プレックスのアッセイを行うことを含む。上の単色多重化アッセイについてと同様
に、各カラープローブについて、強度に基づき複数のターゲットを同定することができる
。加えて、スペクトル的に分離可能である多数の色を同時に使用することができる。例え
ば、単一の液滴が、4つの異なるターゲットのための4つの異なるプローブを含有しても
よい。2つのプローブが、異なる強度のカラーAのもの(例えば、A1およびA2)であ
ってもよく、他の2つのプローブが異なる強度を有するカラーBのもの(例えば、B1お
よびB2)であってもよい。対応するターゲットは、A1、A2、B1およびB2につい
てそれぞれT1、T2、T3およびT4である。液滴がカラーAの蛍光の増加を示す場合
には、その液滴はターゲットT1またはT2のいずれかを含有した。このとき、カラーA
の蛍光強度に基づき、ターゲットがT1と同定されることもあり、またはターゲットがT
2と同定されることもあった。しかし、液滴が、カラーBの蛍光の増加を示す場合には、
その液滴はターゲットT3またはT4のいずれかを含有した。このとき、カラーBの蛍光
強度に基づき、ターゲットがT3と同定されることもあり、またはターゲットがT4と同
定されることもあった。理論により拘束されることを意図しないが、可能な異なる色の最
大数は、異なる蛍光体の蛍光放射間のスペクトルのオーバーラップによって限定される。
色の最大数は、1、または2、または3、または4、または10以下、または20以下で
あり得る。色の最大数は、20より高いこともある。後続の実証実験において、色の最大
数は2である。
てより高プレックスのアッセイを行うことを含むが、一意的な色および強度を有する単一
のタイプのプローブで各ターゲットを同定する上記戦略とは異なり、代わりにこの方法で
は色と強度の両方の一意的シグネチャを構成する複数のプローブによって単一のターゲッ
トを同定することができる。例えば、単一の液滴が、3つの異なるターゲット(例えば、
T1、T2およびT3)を測定するために4つの異なるプローブを含有してもよい。2つ
のプローブがカラーAのもの(例えば、A1およびA2)であってもよく、2つのプロー
ブがカラーBのもの(例えば、B1およびB2)であってもよい。T1をプローブA1に
よって測定し、T2をプローブB1によって測定するが、T3は、プローブA2とB2の
両方によって測定する。従って、液滴がT1のみを含有するとき、カラーAの蛍光増加が
現れる。液滴がT2のみを含有するとき、カラーBの蛍光増加が現れる。しかし、液滴が
T3を含有するとき、カラーAとBの両方の蛍光増加が現れる。
ての上記3つの方法は、終点希釈の条件下で、すなわち、複数の異なるターゲット分子が
同じサンプルを共に占有する確率が、任意の単一のターゲットが液滴を占有する確率に比
べて非常に低いとき、実行が最も簡単である。多重占有により、同じ反応液滴内で競合す
る同時に存在するアッセイ物の複雑さ、およびまた、個々の反応生成物の2つの蛍光強度
の合計に等しいこともあり等しくないこともある2つの異なる反応生成物からの蛍光の組
み合わせを含む得られる蛍光強度の割り当ての複雑さが生ずる。しかし、本発明の方法は
、多重占有から生ずるこれらの複雑化に対応することができる。
る方法も含む。最も単純な場合、例えば、ターゲットが異なる細胞からのものであるとき
;またはターゲットが単一の細胞タイプの中の異なる染色体からのものであるとき;また
はターゲットが、単一の染色体の中で互いに遠く離れているので、DNAフラグメント化
中に物理的に分離した状態になるとき;またはターゲットが、染色体の中で互いに非常に
接近しているが、それにもかかわらず、DNAのターゲッティングされた切断により、例
えば制限酵素消化により、分離した状態になるとき;または任意の他の理由のため、ター
ゲットは同じDNAフラグメント上にある可能性が低い。そのような場合、各プローブを
単一のプライマー(フォワードおよびリバース)セットと対にすることができる。しかし
、他の場合、例えば、ターゲットが同じコドン内にあるとき、または任意の他の理由のた
め、ターゲット領域は、しばしば、同じDNAフラグメント上にあり得る。そのような場
合、単一のプライマーセットが複数のプローブのために役立つだろう(一例として、Pe
kinら参照)。
ができる。例えば、位置1に遺伝子型AまたはA’があり得、位置2にBまたはB’の遺
伝子型があり得ると仮定する。二倍体ゲノムでは、4つの特有のハプロタイプが可能であ
る(A、B;A、B’;A’、B;およびA’、B’)。例えば、A’およびB’が感染
に対する薬物耐性突然変異を表す場合、A’BおよびAB’は、細心の注意を払って処置
しなければならない有意な薬物耐性を表すA’B’より重症でなく、A’B’とは異なっ
て処置される場合が多い。強度識別を伴うデジタルPCRは、他の3つのハプロタイプの
混合物のバックグラウンドの中での低い頻度のA’B’の同定に理想的に適する。ハプロ
タイピング情報は、HLAにおけるハプロタイプの構築にも重要である。本実施例を構築
できる1つの方法は、カラー1をAのために用い、カラー1が、対立遺伝子AまたはA’
を示すそれぞれ高いまたは低い強度のものであり、およびカラー2をBのために用い、カ
ラー2が、BまたはB’を示すそれぞれ高いまたは低い強度のものであるようなアッセイ
設計による。[低、低]に対応する[カラー1、カラー2]の集団は、ABの対立遺伝子
の測度であり、[高、低]対立遺伝子A’Bおよび[A’B’]の対立遺伝子は、主にA
’BとAB’の混合物であるバックグラウンドにおいても[高、高]と容易に区別可能で
あろう。図22参照。ある場合には、A SNP位置とB SNP位置の両方を含有する
核酸の長い単一分子を液滴に封入することによって開始することが有利であろうし、別の
場合には、単個細胞、細菌または他の生物を液滴に封入することによって開始して、その
後、生物から核酸を放出させることが望ましいであろう。さらに他の実施形態では、ター
ゲット材料の結合相互作用または標識の複数のタイプについての代用マーカーとして、複
数の同時に存在するターゲットのマルチプレックス強度検出を用いることができる。この
技術もまた、単一分子検出に限定されず、および単個細胞(例えば、細菌、体細胞など)
におけるハプロタイプ検出に使用することができる。単個細胞分析の場合、選別工程をハ
プロタイピングの前に適用してもよい。
本発明の1つの態様を、棘筋萎縮症(SMA)についての幾つかの遺伝マーカーの定量
の実例実証実験の実施にまとめた。SMAは、その重要な臨床的有用性とその複雑な遺伝
的特質の両方のため、実例実証実験の1つに選択した。それは二番目に高頻度の致命的神
経変性疾患であり、10,000のうち〜1の出生を襲う。SMAは、生存運動ニューロ
ン1遺伝子(SMN1、Wirthらにより総説されている)内のエキソン7のホモ接合
不在に、最も多くの場合、起因するが、この容態の重症度は、SMN2の遺伝子コピーの
数によって変調され、1〜5コピー数で致死性から無症候性にわたる予後となる(Els
heikhらにより総説されている)。従って、SMN2コピー数の正確な定量は、臨床
的予後および遺伝学カウンセリングに重量である。SMN1の大きな欠失とは別に、同じ
遺伝子内の点突然変異または短い欠失/重複の数もSMAの症例の〜4%の原因である。
総合SMAアッセイへの有意な工程において、ここで実証実験する多重化dPCRアッセ
イは、(SMN1および2についての)コピー数アッセイと高頻度SNPのもの(c.8
15A>G)についてのアッセイの両方を含む。
プレックスアッセイは、SMAに影響を与える共通の遺伝子変異体を定量するものであり
、参照としてBCKDHAを用いるSMN1およびSMN2遺伝子についての2つのコピ
ー数アッセイおよびとc.815A>G突然変異についてのSNPアッセイを含む。2つ
の異なる色の蛍光体、FAMおよびVIC、を使用して、アッセイ物のそれぞれを一意的
に定量した。SMN1およびSMN2についてのプローブは、FAMのみを含有し、c.
815Aについてのプローブは、VICのみを含有した。しかし、BCKDHAおよびc
.815GにはVIC標識プローブとFAM標識プローブの混合物を使用した。この実施
例におけるVICおよびFAM蛍光体の使用は、本発明を限定せず、むしろ、TaqMa
nアッセイと適合性の任意のスペクトル分離可能蛍光体での、または任意の他の蛍光発生
性ハイブリダイゼーションベースのプローブ化学での、5プレックスアッセイを用いるこ
とができる。アッセイを検証するために、異なるプライマー/プローブ対のそれぞれにつ
いての単一のターゲット領域を含有するモデル染色体を合成した。EcoRV制限部位が
各ターゲットに隣接しており、それによってフラグメントを分離することができた。
る液滴の統計的に類似した集団の同定および特性付けのために、ならびに1つの液滴集団
と他のものとを識別するために、ヒストグラムベースのデータ提示および分析を本発明に
組み込む。図14aは、液滴蛍光強度の2次元ヒストグラムを等高線付きヒートマップ(
contoured heat map)として示すものであり、暖色ほど高い出現率を
表す。標準的な技術を用いて、FAMおよびVICシグナルのスペクトルのオーバーラッ
プを補正した。サンプルを1ターゲットあたり0.006占有率でランした。6集団、ア
ッセイ物について5およびPCR(−)液滴について1、が明瞭にはっきりと見える。本
発明の1つの方法として、前記集団をアッセイ成分の選択的排除によって割当てた。例え
ば、SMN2プライマーおよびプローブの排除は、前記ヒストグラムの下部右の集団を消
去したが、他の点では分布は、不変のままであった。図14aにおいて割り当てを標識し
た。本発明者らは、この多重化方法が一般に当てはまることを発見したので、各ターゲッ
トの十分分解されたまたは少なくとも区別可能な集団を対象に直ちにアッセイを行った。
次に、本発明のもう1つの方法として、前のセクションにおいて説明したようにプローブ
濃度をチューニングすることによって前記ヒストグラム中の異なる集団の相対的位置を調
整して規則正しい間隔の長方形アレイにした。通常、2回以下の反復が最適化に必要であ
る。
て統合することによって各集団内の液滴のカウントを可能にした。境界は、隣接ピーク間
の中間部に位置する。本発明の方法は、長方形の境界、およびピーク間の特定の境界位置
に拘束されない。むしろ、いずれの閉または開境界条件でも十分である。境界条件は、液
滴数に到達するために境界を越えて重み付け統合を行うこともできるという意味で、「バ
イナリ」である必要がない。各クラスタのピーク位置は、検出効率の変動を説明するため
の空の液滴の強度に対する正規化後、ラン間で2%より大きく変動しない(データを示さ
ない)。従って、一旦同定されると、統合のために同じ境界をサンプル間で再利用するこ
とができた。本発明の方法は、固定された境界位置に限定されない。サンプルまたは研究
間での動的集団同定および境界選択を前もって処理する。Coriell細胞レポジトリ
ーからの20の異なる患者サンプルをこのアッセイで分析した:SMAに罹患している4
つ、1つのSMA保因者、および15のネガティブ対照。アッセイ結果を図14bに示す
。遺伝子コピー数を、前のように、ターゲット液滴対参照液滴の数から誘導した占有率の
比として計算した。図11におけるコピー数測定と同様に、各アッセイによって期待整数
値に非常に近い比を得たが、患者データのすべてを期待整数比に対する実際の比としてプ
ロットしたとき、1の理想勾配から小さな系統的偏差が観察された。実測勾配は、SMN
1、SMN2およびc.815Aについてそれぞれ0.92、0.92および0.99で
あった。明瞭さのために、図14bにおけるデータを1の理想勾配に応じて拡大縮小した
。
者、または罹患している)と一致した。SMAに罹患している患者は、それぞれ、SMN
1のゼロ個のコピーを有し(図14b中の番号SMA1〜4)、保因者は、ちょうど1個
のコピーを有し、およびネガティブ対照すべてが、2個または3個のコピーを有した(番
号1〜15)。3人の無関係な個体(番号6、8および9)がSMN1の3個のコピーを
有し、これは、健常個体についての以前の報告と同様である20%の率で生じた。SMN
1コピー数のばらつきは、それが染色体5q13の不安定な領域内に存するので、驚くべ
きことではない。より多種多様なSMN2コピー数が観察された。1から2個のコピーが
対照群では最も一般的であったが、1人の個体は、ゼロ個のコピー(正常個体についての
期待値と一致する分布)を有した。SMA保因者および罹患患者は、平均してSMN2の
高いコピー数を有した:保因者は5;罹患している2人は3個のコピーを有し、その他は
2個のコピーを有した。罹患患者はすべて、Coriellレポジトリーによる臨床観察
に基づき、SMA タイプI、最重症形態、と診断された。SMN2コピー数と疾患重症
度の間の強い遺伝子型/表現型相関関係は、SMN2の3個のコピーを有する2人の個体
が、とりわけ、2年のSMAタイプIについての典型的な最大余命をはるかに超えてサン
プリング時点で3年より長く生きていた患者SMA1に関して、改善されたタイプII予
後を有し得ることを示唆している。しかし、他のあまり十分に特性づけされていないまた
は未知の修飾遺伝子が予後に影響を及ぼすかもしれないので、またすべてのSMN2コピ
ーが完全遺伝子であることができるとは限らないため、SMN2コピーのみに基づいて疾
患の結果を予測することは、依然としてためらわれる。さらに、一部のタイプI患者は、
より新しい臨床環境でより長く生存し始めている。従って、本発明者らが入手できる患者
に関するわずかな臨床情報で、本発明者らのSMN2アッセイ結果は、疾患重症度につい
ての広い期待値と一致した。
示し、c.815Gの事例は観察されなかった。突然変異は比較的稀であり、従って、小
さな患者パネルにおいて現れると予想されなかった。しかし、SNPアッセイでカバーさ
れなかった2人の無関係な個体における明らかな余分な遺伝子フラグメントの存在は、興
味深かった。c.815A>Gアッセイは、SMN1とSMN2とを、それらの高配列類
似性のため、識別せず、それ故、c8.15AおよびGの全コピーは、SMN1およびS
MN2のコピーの合計に等しいだろう。これは、健常患者、番号1および2(両方ともc
.815Aの1個の余分コピーを有した)を除いてすべての患者に当てはまった。c.8
15は、エキソン6上に存し、SMN1遺伝子とSMN2遺伝子とを識別するSNPは、
エキソン7上に存する故、前記余分な遺伝子は、エキソン7を欠くSMN1のフラグメン
トであり得る。これは、エキソン7の欠失がSMAの症例の95%の原因となる共通の突
然変異であり、1/40から1/60の成人がそれを保有するため、妥当と思われる。従
って、これらの患者は、同じ染色体上のSMN1の健常コピーを補償する少なくとも1個
の獲得がなかったなら、SMAの典型的保因者であっただろう。
一定のSMA関連ターゲットについての9プレックスアッセイも、2色(FAMおよび
VIC蛍光体を含有するプローブ)だけで実証した。最適化プライマーおよびプローブ濃
度を除いて、アッセイ条件および実験手順は、上記5プレックスアッセイと同一であった
。図15aは、プローブ濃度の最適化前の様々な液滴集団を2Dヒストグラムに示すもの
である。異なるターゲットの素性をその図自体に示す。本発明の1つの方法として、異な
る集団の同定を、前のように、1つ以上のアッセイ物の選択的排除および/または追加に
よって行った。空の液滴に対応するクラスタと極めて近接していたc.815A遺伝子型
についてのプローブを除き、集団の大部分は既に十分に分解されていた。プローブ濃度の
最適化を3回繰り返した後、すべてのターゲット集団は互いに十分に分解され、空の液滴
からも十分に分解され(図15b)。この実証実験では本発明の3つの方法に光を当てた
:(1)9つのDNAターゲットを、従来のqPCRの能力をはるかに超えて、二次元ヒ
ストグラムで一意的に同定した;(2)同じターゲットに対する1つまたは複数のプロー
ブから生ずる色と強度の両方の何らかの組み合わせに基づいてターゲットDNA分子を区
別した;および(3)様々な液滴集団間で増加された分解についての色および強度のパタ
ーンを最適化するようにプローブ濃度を変えることによって、ヒストグラム内のターゲッ
ト分子の相対位置を調整した。
よって、異なる液滴集団を同定した。しかし、本発明はこの方法のみに限定されない。む
しろ、当業者に公知の任意の集団割り当て方法が考えられる。本発明の方法は、プローブ
およびプライマーを共に同じ率または異なる率で変えること;プローブ濃度のみを変える
こと;プライマー濃度のみを変えること;熱サイクリング条件を変えること;ならびにマ
スターミックス組成を変えることを含めて、ヒストグラム内の1つ以上の集団の同定可能
な置換、出現または消失を生じさせることができる任意の方法を含む。本発明のもう1つ
の方法は、割り当てを支援するためにヒストグラム内のアッセイ物の位置についての以前
の知識を利用する。
前記SMA実施例において実証した多重化のレベルは、qPCRでの最大実行可能数を
有意に超える9×であった。理論により拘束されることを望まないが、2つの主な制限は
、アッセイ間の分解と、プローブの負荷量がより多い空の液滴の漸増蛍光強度とである。
本発明の方法は、最大多重化のために異なるプローブの色および強度のパターンを最適化
する上に、尚、個々の反応それぞれに対する適切な特異性を実現することを含む。液滴集
団の長方形アレイを5および9プレックス反応について実証したが、もう1つの望ましい
パターンは、密充填六角形アレイである。しかし、本発明はいずれの特定のアレイ戦略に
も拘束されない。
の蛍光が強まり続けるため、リターンは多少減少する。この能力は、より大きな差分シグ
ナルを生じさせるより良好なプローブ、例えば、接触消光によってバックグラウンドを低
減するが、遊離未消光蛍光体に特有の明るいシグナルを呈示するハイブリッド5’−ヌク
レアーゼ/分子ビーコンプローブを用いて、さらにいっそう増加させることができる。そ
のような改善により、50×を超える多重化能力を構想することができる。
液滴ベースのマイクロフルイディクスを用いて、複数のターゲットを異なる方法により
同時に測定することもできる。代替方法によると、アッセイ物を一意的に同定するための
光学的標識と共に、プライマーおよびプローブを液滴に個々に負荷することができる。典
型的に、前記光学的標識は、1つの蛍光体であるか、プローブ蛍光体とはスペクトル的に
違う異なる蛍光体の組み合わせである。異なる光学的標識によって一意的に同定される異
なるアッセイ物をそれぞれが含有する様々な異なるタイプの液滴を混合して液滴の「ライ
ブラリー」にすることができる。次に、上の本発明の方法に従って、テンプレートDNA
を含有する液滴とライブラリー液滴を1個ずつ合体させる。熱サイクリング後、テンプレ
ートDNAを含有する幾つかの液滴は、プローブの放射波長でより明るい蛍光を呈示する
。その後、これらのPCR(+)シグナルを生じさせる特異的ターゲットDNA分子を、
光学的プローブによって同定する。1つの研究では、異なるKRAS突然変異または野生
型KRASに特異的なTaqMan(登録商標)プローブおよび光学コードをそれぞれが
含有する7つの異なるタイプの液滴(7員ライブラリー)のいずれか1つとゲノムDNA
を含有する液滴とを1個ずつ融合させることによって、KRASコドン12における6つ
の共通突然変異を1回の実験で並行してスクリーニングした。
と光学的標識づけを併用することができる。例えば、単一の光学的標識は、上のKRAS
実施例の場合のように単一アッセイ物だけでなく、5プレックスSMAアッセイ物全体を
コードし得る。この要領で、他の光学的標識は、新生児についての種々のスクリーニング
アッセイ物をコードし得る。上の本発明の他の方法に従って、このとき、乳児からの単一
のDNAサンプルとすべてのアッセイ物とを、そのDNAを含有する液滴と光学的にコー
ドされたアッセイ物を含有するライブラリー液滴とを1個ずつ合体させることによって、
同時に分析することができるだろう。
プレックス反応と光学的標識づけを実証した(トリプレックスアッセイ物をそれぞれがコ
ードする、2つの蛍光体での3×3光学的標識づけ、合計で27プレックス)。それぞれ
が合計9つの光学的標識を生じさせる3つの強度レベルを有する2つの蛍光体、(640
nmレーザーによって励起される)Alexa633およびCF680、を光学的標識づ
けに利用した。前のSMAについての5および9プレックスアッセイでのように、Taq
Manアッセイ物を(488nmレーザーによって励起する)FAMおよびVIC蛍光体
と共に使用した。FAMおよびVIC蛍光体からの蛍光を光学的標識からの蛍光と同時に
記録し、これは、SMAアッセイについて説明した器械使用の光学的レイアウトへの変更
を必要とした(2レーザー励起および4色検出についての光学的概略図を全体として図1
6に示す)。また、この実施例ではコ・フロー・マイクロフルイディクスを用いた(本出
願のためのコ・フロー・ベースのマイクロフルイディクスの使用は、上で説明した本発明
の方法の1つである)。この場合、一方のフローにおいてチップにテンプレートDNAを
導入し、もう一方のフローにおいてチップに1回のトリプレックスアッセイのためのPC
Rマスターミックス、プライマーおよびプローブと光学的標識のための蛍光体の一意的組
成とを同時に導入した。それらの2つのフローストリームは、液滴形成モジュールの上流
の流体交差部で収束し、このようにして形成された各液滴は、両方のフローストリームの
内容物を含有した。コ・フロー・マイクロフルイディクスを実行する方法は当業者に周知
である。液滴を回収し、その後、次のトリプレックスアッセイ物および光学的標識を用い
てその手順を繰り返す。その手順を、アッセイ物と光学的標識のそれぞれの対について1
回、合計9回繰り返した。すべての液滴を1本のPCRチューブに回収し、オフチップで
熱サイクルに付した。熱サイクルに付した液滴の混合物を、上でSMAアッセイのために
使用したものと同じ読み出しチップに再注入し、4つすべての蛍光体からのアッセイ物の
蛍光強度を記録した。
すべての液滴からの累積結果を示すものである。この図は、液滴蛍光強度の2Dヒストグ
ラムを、すべての光学的標識からのヒストグラムを左に、およびアッセイ物からのヒスト
グラムを右に示すものである。標準的な方法を用いて、光学的標識のヒストグラムにおい
てスペクトルのオーバーラップを補正した。これらのヒストグラムをヒートマップとして
示し、暖色であるほど大きな液滴数を表す。液滴の9つの異なるクラスタが光学的標識の
ヒストグラムに明瞭にはっきりと見えた。これら9つのそれぞれが異なる光学的標識に対
応する:最低蛍光強度を有する光学的標識に対応する4つクラスタの小さな群がヒストグ
ラムの下部左隅にあり;ならびにより高い強度で直線状のすじのように見える5つのクラ
スタがある。アッセイ物についてのヒストグラムでは液滴クラスタがあまり明確でなかっ
たが、これは、示されている液滴がトリプレックスアッセイ物のすべてを含有するためと
予想された。下記のように、光学的標識を使用することによって単一のタイプアッセイ物
を選択すると、個々のアッセイ物が明瞭に明確になった。
ある液滴の、個々の集団を選択することを含む。本発明の幾つかの方法では、蛍光強度の
境界を用いて集団を特定した。ここに示す実施例では、長方形の境界を用いて、各蛍光体
についての最小および最大蛍光強度を特定した。しかし、本発明の方法は、長方形の境界
に拘束されない。閉じているまたは開いている任意の境界を用いることができる。さらに
、本発明の方法によると、液滴集団の選択は、任意の方法によって行うことができ、境界
選択などの閾値ベースの方法に拘束されない。
液滴蛍光強度(右ヒストグラム)を示すものである。光学的標識のヒストグラム上の重っ
た線により、両方の蛍光体に対して最低蛍光を有する光学的標識のみを選択するために使
用した長方形の境界が確認される。両方のヒストグラムが、選択された液滴のみを示した
。選択後、液滴の4つの別個のクラスタ、異なるアッセイ(この場合、SMN1、SMN
2およびTERTについてのアッセイ(TERTはもう1つの共通参照遺伝子である))
について3つおよび空の液滴に付いて1つ、が、アッセイヒストグラムに現れた。SMN
1およびSMN2についてのコピー数を、5プレックスSMAアッセイについて上で説明
したのと同じ本発明の方法によって測定し、それぞれ、2および1の期待値に近い1.8
および0.94の値であった。同じアッセイ物を2つの他の光学的標識と共にコード化し
た。それらの選択を図18BおよびCに示す。同様の結果が達成され、それぞれSMN1
およびSMN2の1.9±0.1および0.9±0.1コピーの総合測定値であり、実験
不確実性の範囲内の正確な測定値を示した。
およびBCKDHA(この図ではE1aと標識した))のための光学的標識選択を示すも
のである。各場合、4つの異なるクラスタも現れ、上と同じ本発明の方法により、3およ
び2と比較してそれぞれ2.9±0.1および2.0±0.2の、TERTを参照にして
c.5CおよびBCKDHAについての遺伝子コピー数の正確な測定を行った。図20A
、BおよびCは、第三のアッセイ(TERT、SMN1遺伝子中のc.88G、およびR
NaseP(RNasePは、共通参照遺伝子である))のための光学的標識選択を示す
ものである。2の期待値と比較して2.1±0.1の正確な遺伝子コピー数が、TERT
を参照してc.88GおよびRNasePの両方について測定された。
物の独立した測定を可能にする9つの異なる光学的標識の使用を示す。この実施例では前
記光学的標識のうちの幾つかが重複するアッセイ物をコードした(9つの光学的標識を有
するにもかかわらず3つの異なるアッセイ物しかない)が、本発明は、アッセイ物および
光学的標識のいずれの特定の形式設定にも限定されない。本発明の実施形態は、アッセイ
物のすべてが、光学的標識のすべてにわたって同じである形式;光学的標識のすべてにわ
たって同じであるアッセイ物がない形式;アッセイ物の幾つかが、光学的標識のすべてに
わたって同じである形式;アッセイ物の幾つかが、光学的標識のすべてにわたって他の物
より大きいプレキシティーを有する形式;アッセイ物のすべてが、光学的標識のすべてに
わたって同じプレキシティーを有する形式;および光学的標識のすべてにわたってアッセ
イ物の任意の他の取り合わせが考えられる形式を含む。
は、それらの光学的標識を含む蛍光体のいずれの特定の数にも限定されない。本発明の実
施形態は、1つの蛍光体、または2つの蛍光体、3つの蛍光体、または4つの蛍光体、ま
たは10以下の蛍光体、または20以下の蛍光体から成る光学的標識を含む。光学的標識
は、20より多い蛍光体を含むこともある。
リプレックスアッセイ物と光学的標識の使用に拘束されない。本発明の実施形態は、光学
的標識と共に使用するとき、次の量のプレキシティーを含む:シングルプレックス、デュ
プレックス、トリプレックス、4プレックス、10プレックス以下、20プレックス以下
、50プレックス以下、および100プレックス以下。本発明の実施形態は、光学的標識
と共に使用するとき、100を超えるプレキシティーも含む。
く液滴マージの使用を含む。コ・フローでの前記実施例の場合と同じ3×3×3アッセイ
で、液滴マージを使用する実証実験を行った。先ず、それらの一意的光学標識と併用され
るアッセイ物(プローブおよびプライマー)をPCRマスターミックスと共に液滴に封入
した。その後、上で説明した本発明の方法に従って、9つすべての光学的に標識されたア
ッセイ物からの液滴の混合物を含有するライブラリーを、同じ患者からのテンプレートD
NAを含有する液滴と、前の実施例の場合と同様に1つずつ合体させた。本発明のもう1
つの方法は、参照により本明細書に援用されている米国特許仮出願第61/441,98
5号に記載されているようなラムダ・インジェクタ型マージモジュールを使用して、液滴
マージを行った。コ・フローとマージとの違いを別にすれば、アッセイ物および実験手順
は上のコ・フロー実験のものと同一であった。図21は、図17〜20におけるものに類
似している光学的標識およびアッセイ物についての液滴蛍光強度の2Dヒストグラムを示
すものである。コ・フローについての場合と同様に、個々の光学的標識を含有する液滴の
選択に基づき、各アッセイ物に対応する液滴の予想された別個のクラスタが明確にはっき
りと見えた。さらに、各アッセイ物について、実測遺伝子コピー数は、実験不確実性の範
囲内の期待値と合致したまたは非常に近しく合致した(表1参照)。
ロフルイディクスのいずれかの使用を含むが、本発明は、これに関して限定されない。蛍
光発生性DNAハイブリダイゼーションプローブも含有する光学的に標識された液滴を生
成させることができる任意の流体工学的方法が考えられる。例えば、当該技術分野におい
て周知の他の実施形態は、液滴生成チップへの注入前にマイクロ流体環境で光学的標識と
アッセイ物を混合すること;およびサーペンタインミキサーなどで、専用混合モジュール
内の液滴形成モジュールの上流で光学的標識とアッセイ物を入念に混合することである。
本発明の1つの方法は、一意的プローブシグネチャ(色および強度)から生ずる統計的
に類似した液滴の集団を同定および特性づけするための、ならびに他のものからの液滴の
1つの集団を識別するための、ヒストグラムベースのデータ提示および分析を含む。本発
明のもう1つの方法は、光学的標識からの一意的シグネチャに基づいて液滴の集団を同定
および選択するための、ヒストグラムベースのデータ提示および分析を含む。これらの方
法についての一および二次元ヒストグラムの例を提供したが、本発明は、これに関して限
定されない。上で説明したように、より多くの色を多重化にも光学的標識にも使用するこ
ととなることが予想される。従って、本発明の実施形態は、2より大きい、例えば3、ま
たは4、または10以下、または20以下の次元数のヒストグラムを含む。20より大き
い次元数のヒストグラムも本発明に組み込まれる。
セイ物選択のための、または任意の他の目的のための、ヒストグラム内の液滴の選択を含
む。本発明の方法は、任意の可能な形状および次元の、閉じたまたは開いた、境界による
選択を含む。本発明の方法は、単一のタイプの蛍光体からの、または多数のタイプの蛍光
体からの、例えば共通のDNAターゲットに対して複数のプローブから生ずる、蛍光を呈
示する液滴の選択も含む。
超高感度を必要とする用途、例えば豊富な野生型DNAの中での稀な突然変異について
の検索、については、偽ポジティブ結果がDNAポリメラーゼ自体からのエラーから生ず
ることがある。例えば、初期熱サイクルうちの1つのサイクルの間に、ポリメラーゼは、
野生型テンプレートからDNAの突然変異体鎖を合成することがあるだろう。このタイプ
のエラーは、突然変異体と野生型の間の差が非常に小さいとき、例えば一塩基多型(SN
P)のとき、発生する可能性が最も高い。本発明のこの方法において、各液滴は、あった
としても単一のターゲット核酸しか含有しない。好ましい実施形態において、これは、終
点希釈条件下で遂行される。野生型のターゲットである増幅産物を含有する液滴を、その
野生型のターゲットにハイブリダイズするプローブから放出される蛍光体からの放射に基
づいて検出する。変異体のターゲットを含有する液滴を、その変異体のターゲットにハイ
ブリダイズするプローブから放出される蛍光体の放射に基づいて検出する。各液滴は、単
一の核酸分子のみで出発するので、各液滴内の結果として生ずる増幅産物は、ターゲット
について均一であるか、ターゲットの変異体について均一である。
ターゲット変異体両方の不均一混合物を含有するであろう。PCRのエラー率は、正確な
核酸配列、使用される熱安定性酵素、およびインビトロでのDNA合成条件に従って変動
する。例えば、熱安定性Thermus aquaticus(Taq)DNAポリメラ
ーゼによって触媒されるPCR中のエラー頻度(1サイクルあたりの1ヌクレオチドあた
りの突然変異)は、−2×10−4から<1×10−5まで、10倍より大きく変動する
。Eckertら(Genome Res.1:17−24、1991)、この内容はそ
の全体が参照により本明細書に援用されている。1サイクルあたり10,000ヌクレオ
チドにつき1の突然変異の頻度でのポリメラーゼ媒介エラーは、少量の出発原料(例えば
、合計10,000ヌクレオチド未満のターゲットDNA)で始まる、または最終PCR
集団中の個々のDNA分子に焦点を合わせている、いずれのPCR用途にとっても重要な
考慮事項である。
エラー率、増幅サイクル数、および出発集団サイズの関数である。改変DNA分子の集団
が、PCR中に2つの原因:(1)各PCRサイクルでの新たなエラー;および(2)前
のサイクルからのエラーを含有するDNA分子の増幅、から発生する。式
頻度
クル数(n)の関数として示す。PCRの指数関数的性質のため、初期エラーの発生は、
分子は各サイクルで増幅されることとなり、その結果、平均数より多い変異体を有する集
団となるからである。
ラーは、液滴内のターゲットおよびターゲット変異体の不均一集団を生じさせる結果とな
り、ならびに液滴がターゲットの変異体を含有すると不正確に同定されること(すなわち
、偽ポジティブ)に至ることがある。そのような偽ポジティブは、デジタルPCR結果の
妥当性および精度に大きな影響を及ぼす。
れらの液滴を分析から排除することができる。増幅産物を含有する液滴が検出モジュール
を通ってチャネル内を流れると、そのモジュールは、各液滴における蛍光放出を検出する
ことができる。単一のシグナルのみを生じさせる液滴を、ターゲットの均一集団を含有す
る液滴として分類する。野生型のターゲットにハイブリダイズするプローブは、野生型タ
ーゲットの変異体にハイブリダイズするプローブとは異なる蛍光体が付いているので、本
発明の方法は、それぞれの液滴を、ターゲットのアンプリコンの均一集団またはターゲッ
トの変異体のアンプリコンの均一集団のいずれかを含有するものとして分類することがで
きる。
。各液滴は、多くても単一のターゲット核酸で出発するので、ターゲットのアンプリコン
とターゲットの変異体のアンプリコンの両方である増幅産物を含む液滴は、ターゲットの
変異体がPCR反応中のポリメラーゼエラー、大抵の場合、PCR反応の初期サイクル中
のポリメラーゼエラー、によって生産された。そのような液滴を検出し、分析から排除す
る。
次に、分子の均一集団を含有する液滴のみに関して分析を行った。この分析は、カウン
ティング、すなわち、野生型ターゲットのみを含有する液滴の数の決定、および該ターゲ
ットの変異体のみを含有する液滴の数の決定、に基づくものであり得る。そのような方法
は、当該技術分野において周知である。例えば、Lapidusら(米国特許第5,67
0,325号および同第5,928,870号)ならびにShuberら(米国特許第6
,203,993号および同第6,214,558号)(これらのそれぞれの内容は、そ
の全体が参照により本明細書に援用されている)を参照のこと。
形態において、前記変異体は、対立遺伝子変異体、例えば挿入、欠失、置換、転座、また
は一塩基多型(SNP)、である。
に関連づけられるバイオマーカーは、Erlanderら(US 7,504,214)
、Daiら(US 7,514,209および7,171,311)、Bakerら(U
S 7,056,674およびUS 7,081,340)、Erlanderら(US
2009/0092973)に示されている。前記特許出願およびこれらの特許のそれ
ぞれの内容はそれら全体が参照により本明細書に援用されている。子宮頚癌の発達に関連
づけられるバイオマーカーは、Patel(US 7,300,765)、Pardee
ら(US 7,153,700)、Kim(US 6,905,844)、Robert
sら(US 6,316,208)、Schlegel(US 2008/011334
0)、Kwokら(US 2008/0044828)、Fisherら(US 200
5/0260566)、Sastryら(US 2005/0048467)、Lai(
US 2008/0311570)およびVan Der Zeeら(US 2009/
0023137)に示されている。膣癌の発達に関連づけられるバイオマーカーは、Gi
ordano(US 5,840,506)、Kruk(US 2008/000900
5)、Hellmanら(Br J Cancer.100(8):1303−1314
、2009)に示されている。脳の癌(例えば、神経膠腫、小脳、髄芽腫、星状細胞腫、
上衣腫、膠芽腫)の発達に関連づけられるバイオマーカーは、D’Andrea(US
2009/0081237)、Murphyら(US 2006/0269558)、G
ibsonら(US 2006/0281089)、およびZetterら(US 20
06/0160762)に示されている。腎癌の発達に関連づけられるバイオマーカーは
、Patel(US 7,300,765)、Soyupakら(US 7,482,1
29)、Sahinら(US 7,527,933)、Priceら(US 7,229
,770)、Raitano(US 7,507,541)、およびBeckerら(U
S 2007/0292869)に示されている。肝癌(例えば、肝細胞癌腫)の発達に
関連づけられるバイオマーカーは、Horneら(US 6,974,667)、Yua
nら(US 6,897,018)、Hanausek−Walaszekら(US 5
,310,653)、およびLiewら(US 2005/0152908)に示されて
いる。胃、胃腸および/または食道癌の発達に関連づけられるバイオマーカーは、Cha
ngら(US 7,507,532)、Baeら(US 7,368,255)、Mur
amatsuら(US 7,090,983)、Sahinら(US 7,527,93
3)、Chowら(US 2008/0138806)、Waldmanら(US 20
05/0100895)、Goldenring(US 2008/0057514)、
Anら(US 2007/0259368)、Guilfordら(US 2007/0
184439)、Wirtzら(US 2004/0018525)、Filellaら
(Acta Oncol.33(7):747−751、1994)、Waldmanら
(US 6,767,704)、およびLipkinら(Cancer Researc
h、48:235−245、1988)に示されている。卵巣癌の発達に関連づけられる
バイオマーカーは、Podustら(US 7,510,842)、Wang(US 7
,348,142)、O’Brienら(US 7,291,462、6,942,97
8、6,316,213、6,294,344、および6,268,165)、Gane
tta(US 7,078,180)、Malinowskiら(US 2009/00
87849)、Beyerら(US 2009/0081685)、Fischerら(
US 2009/0075307)、Mansfieldら(US 2009/0004
687)、Livingstonら(US 2008/0286199)、Farias
−Eisnerら(US 2008/0038754)、Ahmedら(US 2007
/0053896)、Giordano(US 5,840,506)、およびTcha
gangら(Mol Cancer Ther、7:27−37、2008)に示されて
いる。頭頸部および甲状腺癌の発達に関連づけられるバイオマーカーは、Sidrans
kyら(US 7,378,233)、Skolnickら(US 5,989,815
)、Budimanら(US 2009/0075265)、Hasinaら(Canc
er Research、63:555−559、2003)、Kebebewら(US
2008/0280302)、およびRalhan(Mol Cell Proteo
mics、7(6):1162−1173、2008)に示されている。前記論文、特許
および特許出願のそれぞれについての内容はそれら全体が参照により本明細書に援用され
ている。結腸直腸癌の発達に関連づけられるバイオマーカーは、Raitanoら(US
7,507,541)、Reinhardら(US 7,501,244)、Wald
manら(US 7,479,376);Schleyerら(US 7,198,89
9);Reed(US 7,163,801)、Robbinsら(US 7,022,
472)、Mackら(US 6,682,890)、Tabitiら(US 5,88
8,746)、Budimanら(US 2009/0098542)、Karl(US
2009/0075311)、Arjolら(US 2008/0286801)、L
eeら(US 2008/0206756)、Moriら(US 2008/00813
33)、Wangら(US 2008/0058432)、Belacelら(US 2
008/0050723)、Stedronskyら(US 2008/0020940
)、Anら(US 2006/0234254)、Eveleighら(US 2004
/0146921)、およびYeatmanら(US 2006/0195269)に示
されている。前立腺癌の発達に関連づけられるバイオマーカーは、Sidransky(
US 7,524,633)、Platica(US 7,510,707)、Salc
edaら(US 7,432,064およびUS 7,364,862)、Siegle
rら(US 7,361,474)、Wang(US 7,348,142)、Aliら
(US 7,326,529)、Priceら(US 7,229,770)、O’Br
ienら(US 7,291,462)、Golubら(US 6,949,342)、
Ogdenら(US 6,841,350)、Anら(US 6,171,796)、B
erganら(US 2009/0124569)、Bhowmick(US 2009
/0017463)、Srivastavaら(US 2008/0269157)、C
hinnaiyanら(US 2008/0222741)、Thaxtonら(US
2008/0181850)、Daharyら(US 2008/0014590)、D
iamandisら(US 2006/0269971)、Rubinら(US 200
6/0234259)、Einsteinら(US 2006/0115821)、Pa
risら(US 2006/0110759)、Condon−Cardo(US 20
04/0053247)、およびRitchieら(US 2009/0127454)
に示されている。膵臓癌の発達に関連づけられるバイオマーカーは、Sahinら(US
7,527,933)、Ratainoら(US 7,507,541)、Schle
yerら(US 7,476,506)、Domonら(US 7,473,531)、
McCaffeyら(US 7,358,231)、Priceら(US 7,229,
770)、Chanら(US 2005/0095611)、Mitchlら(US 2
006/0258841)、およびFacaら(PLoS Med 5(6):e123
、2008)に示されている。肺癌の発達に関連づけられるバイオマーカーは、Sahi
nら(US 7,527,933)、Hutteman(US 7,473,530)、
Baeら(US 7,368,255)、Wang(US 7,348,142)、Na
chtら(US 7,332,590)、Gureら(US 7,314,721)、P
atel(US 7,300,765)、Priceら(US 7,229,770)、
O’Brienら(US 7,291,462およびUS 6,316,213)、Mu
ramatsuら(US 7,090,983)、Carsonら(US 6,576,
420)、Giordano(US 5,840,506)、Guo(US 2009/
0062144)、Tsaoら(US 2008/0176236)、Nakamura
ら(US 2008/0050378)、Raponiら(US 2006/02520
57)、Yipら(US 2006/0223127)、Pollockら(US 20
06/0046257)、Moonら(US 2003/0224509)、およびBu
dimanら(US 2009/0098543)に示されている。皮膚癌(例えば、基
底細胞癌腫、扁平上皮癌腫、および黒色腫)の発達に関連づけられるバイオマーカーは、
Robertsら(US 6,316,208)、Polsky(US 7,442,5
07)、Priceら(US 7,229,770)、Genetta(US 7,07
8,180)、Carsonら(US 6,576,420)、Mosesら(US 2
008/0286811)、Mosesら(US 2008/0268473)、Doo
leyら(US 2003/0232356)、Changら(US 2008/027
4908)、Alaniら(US 2008/0118462)、Wang(US 20
07/0154889)、およびZetterら(US 2008/0064047)に
示されている。多発性骨髄腫の発達に関連づけられるバイオマーカーは、Coignet
(US 7,449,303)、Shaughnessyら(US 7,308,364
)、Seshi(US 7,049,072)、およびShaughnessyら(US
2008/0293578、US 2008/0234139、およびUS 2008
/0234138)に示されている。白血病の発達に関連づけられるバイオマーカーは、
Andoら(US 7,479,371)、Coignet(US 7,479,370
およびUS 7,449,303)、Daviら(US 7,416,851)、Chi
orazzi(US 7,316,906)、Seshi(US 7,049,072)
、Van Barenら(US 6,130,052)、Taniguchi(US 5
,643,729)、Inselら(US 2009/0131353)、およびVan
Bockstaeleら(Blood Rev.23(1):25−47、2009)
に示されている。リンパ腫の発達に関連づけられるバイオマーカーは、Andoら(US
7,479,371)、Levyら(US 7,332,280)、およびArnol
d(US 5,858,655)に示されている。膀胱癌の発達に関連づけられるバイオ
マーカーは、Priceら(US 7,229,770)、Orntoft(US 6,
936,417)、Haak−Frendschoら(US 6,008,003)、F
einsteinら(US 6,998,232)、Eltingら(US 2008/
0311604)、およびWewerら(2009/0029372)に示されている。
上記参考文献のそれぞれについての内容はその全体が参照により本明細書に援用されてい
る。
に用いることができる。患者は、既に癌の処置を受けているので、その患者の癌に関連づ
けられる遺伝子プロファイルおよび特定の突然変異(単数または複数)は既にわかってい
る。患者が以前に治療を受けた癌の指標となる突然変異(単数または複数)を含有する核
酸の領域に特異的にハイブリダイズするプローブを設計することができる。その後、患者
のサンプル(例えば、膿、痰、精液、尿、血液、唾液、糞便、または脳脊髄液)を上で説
明したように分析して、突然変異体対立遺伝子(単数または複数)がサンプル中で検出さ
れるかどうかを決定することができ、その突然変異体対立遺伝子(単数または複数)が癌
の再発の指標となる。
本発明の方法は、液滴が分子の均一な集団を含有するかまたは分子の不均一な集団を含
有するかに基づく液滴の選別を含む。選別モジュールは、検出モジュール内での液滴問い
合わせに関連して受け取るシグナルに依存して液滴のフローが1つ以上の他のチャネル、
例えば枝チャネル、に入るように方向を変えることができるチャネルの接合部であり得る
。典型的に、選別モジュールはモニターされ、および/または検出モジュールの制御下に
あり、従って、選別モジュールは検出モジュールに応答することができる。選別領域は1
つ以上の選別装置と連通しており、それらによる影響を受ける。
クロ−)バルブなどを含む。制御システムは、様々な選別技術を用いて、分子、細胞、小
分子または粒子のフローを所定の枝チャネルに変えるまたは向けることができる。枝チャ
ネルは、選別領域および主チャネルと連通しているチャネルである。主チャネルは、例え
ばT形またはY形を形成するように、選別モジュールまたは分岐点で2つ以上の枝チャネ
ルと連通し得る。他の形およびチャネル幾何形状を望みどおりに用いることができる。典
型的に、枝チャネルは、検出モジュールにより検出され、選別モジュールで選別されると
、関心のある液滴を受け取る。枝チャネルは、流出モジュールを有することができ、およ
び/または分子、細胞、小分子もしくは粒子の回収または廃棄を可能にするウエルもしく
はレザバー(それぞれ、回収モジュールもしくは廃棄モジュール)を末端に有することが
できる。あるいは、枝チャネルは、追加の選別を可能にするために他のチャネルと連通し
ていることがある。
もしくは決定することができ(例えば、流体液滴の蛍光を決定することができ)、および
、呼応して、流体液滴を特定の領域(例えば、チャネル)に向けるために電場を印加する
または除去することができる。一定の実施形態では、非荷電流体液滴(最初は、荷電され
ていることもあり、または非荷電であることもある)内に双極子を誘導すること、および
印加された電場を用いてその液滴を選別するまたは指向させることにより、流体液滴を選
別するまたは指向させる。前記電場は、AC場、DC場などであり得る。例えば、流体液
滴とキャリア流体とを含有するチャネルは、分岐点で第一および第二のチャネルに分かれ
る。一般に、前記流体液滴は、非荷電である。分岐点の後に、第一の電極を第一のチャネ
ル付近に配置し、第二の電極を第二のチャネルの付近に配置する。第三の電極は、第一チ
ャネルと第二チャネルの分岐点の付近に配置する。その後、これらの電極の組み合わせを
用いて、流体液滴内に双極子を誘導する。このように、適当な電場を印加することにより
、液滴を望みどおりに第一または第二のチャネルのいずれかに向けることができる。液滴
選別についてのさらなる説明は、例えば、Linkら(米国特許出願第2008/001
4589号、同第2008/0003142号、および同第2010/0137163号
)およびRaindance Technologies Inc.の欧州特許出願公開
第2047910号に示されている。
、分子の均一集団を含有する液滴から選別除去する。液滴をさらに選別して、ターゲット
のアンプリコンの均一集団を含有する液滴を、ターゲットの変異体のアンプリコンの均一
集団を含有する液滴から分離することができる。
本発明の方法は、さらなる分析のために液滴から増幅ターゲット分子を放出させること
をさらに含むことができる。液滴から増幅ターゲット分子を放出させる方法は、例えば、
Linkら(米国特許出願第2008/0014589号、同第2008/000314
2号、および同第2010/0137163号)およびRaindance Techn
ologies Inc.の欧州特許出願公開第2047910号に示されている。
限定的な例として、前記キャリア流体には、1つ以上の安定化界面活性剤を有することが
できるパーフルオロカーボン油を挙げることができる。液滴は、その液滴を構成する水性
相のものより大きいキャリア流体の密度によって、キャリア流体から上に上昇するまたは
分離する。例えば、本発明の方法の1つの実施形態において使用するパーフルオロカーボ
ン油は、1.0である液滴の水性相の密度と比較して、1.8である。
ール(例えば、1H,1H,2H,2H−パーフルオロ−1−オクタノール)、を含有す
る第二のキャリア流体上に置く。前記第二のキャリア流体もパーフルオロカーボン油であ
ることがある。混合すると、水性液滴は合体し始め、合体を低速での短い遠心分離(例え
ば、遠心分離器において2000rpmで1分)によって完了させる。合体した水性相を
今や除去し、さらに分析することができる。
り、さらなる増幅に付すこともできる。この実施形態において、液滴内のプライマーは、
該プライマーの配列特異的部分の5’末端に付加された追加の配列またはテイルを含有す
る。これらのテイル付き領域についての配列は、各プライマー対と同じであり、PCRサ
イクリング中にアンプリコンの5’部分に組み込まれる。アンプリコンを液滴から除去し
たら、そのアンプリコンのテイル領域にハイブリダイズすることができるもう1セットの
PCRプライマーを使用して、追加のPCRラウンドにより産物をさらに増幅することが
できる。前記第二のプライマーは、前記テイル付き領域と長さおよび配列の点で厳密に合
致することがあり、またはそれら自体、該プライマーのテイル部分の5’末端に追加の配
列を含有することがある。第二のPCRサイクリング中、これらの追加の領域もアンプリ
コンに組み込まれた状態になる。これらの追加の配列としては、ライブラリー調製および
シークエンシングのためのシークエンシングプラットホームによって用いられるアダプタ
ー領域、同じ反応に多重化されたサンプルの同定のためにバーコード化機能として用いら
れる配列、ビオチン、ジゴキシン、ペプチドまたは抗体などの反応材料の残部からのアン
プリコンの分離のための分子、およびフラグメントを同定するために使用することができ
る蛍光マーカーなどの分子を挙げることができるが、それらに限定されない。
定の実施形態において、前記シークエンシングは、合成ごとの単一分子シークエンシング
(single−molecule sequencing−by−synthesis
)である。単一分子シークエンシングは、例えば、Lapidusら(米国特許第7,1
69,560号)、Quakeら(米国特許第6,818,395号)、Harris(
米国特許第7,282,337号)、Quakeら(米国特許出願第2002/0164
629号)、およびBraslavskyら、PNAS(USA)、100:3960−
3964(2003)に示されており、これらの参考文献のそれぞれの内容はその全体が
参照により本明細書に援用されている。
ば、DNAまたはcDNA)をハイブリダイズさせる。それらの一本鎖核酸を、当該技術
分野において公知の方法、例えばLapidus(米国特許第7,666,593号)に
示されているもの、によって捕捉することができる。前記オリゴヌクレオチドは、前記表
面に共有結合で付着させることができ、または当業者に公知であるような共有結合以外の
様々な付着を用いることができる。さらに、この付着は、間接的であってもよく、例えば
、前記表面に直接または間接的に付着された本発明のポリメラーゼによるものであっても
よい。前記表面は、平面であってもよいし、そうでなくてもよく、および/または多孔性
もしくは無孔性、または付着に適することが当業者に知られている任意の他のタイプであ
ってもよい。次に、成長鎖表面オリゴヌクレオチドに組み込まれた蛍光標識されたヌクレ
オチドのポリメラーゼ媒介付加を単一分子分解で撮像することにより、核酸をシークエン
シングする。
次に続くのは、上で詳述した様々な実験についての実験の詳細である。
ここで使用したすべてのTaqMan(登録商標)プライマーおよびプローブを表2に
リストする。表中に参考文献による別の注記がない限り、プライマーおよびプローブは、
Applied Biosystems Inc.(ABI)からの「Custom T
aqMan(登録商標)Assay Design Tool」で設計し、ABI(カリ
フォルニア州カールズバッド)を通じて調達した。プローブを6−カルボキシフルオレセ
イン(FAM、λ励起494nm\λ放射494nm)またはVIC(商標)(ABIか
ら、λ励起538nm\λ放射554nm)で標識した。
幾つかの遺伝子ターゲット、BCKDHAおよびSMN2、について、プライマー対の
間にわたる配列(表2参照)を含有するプラスミドDNAを合成し(ドイツ、レーゲンス
ブルクのGeneArt)、GeneArt標準ベクター(2.5kb)にクローニング
した。アッセイに影響を及ぼし得る一切のDNAスーパーコイル化を回避するために、S
fiIでの制限消化によってターゲットフラグメントをクローニングベクターから放出さ
せた。簡略化のために、本文全体を通してこれらの遺伝子フラグメントを「プラスミドD
NA」と呼ぶ。多重化反応の実証実験のために異なる遺伝子フラグメントのストリングも
合成し(GeneArt)、GeneArt標準ベクターにクローニングした。それを本
文では「人工染色体」と呼ぶ。この場合はフラグメントを隣接EcoRV部位での制限消
化によって互いに分離した。細胞株(表3参照;ニュージャージー州カムデンのCori
ell)から既に精製された形態でヒトDNAを得、使用前に製造業者(カリフォルニア
州カールズバッドのInvtrogen)の説示に従ってK7025−05ネブライザー
でフラグメント化した。Nanodrop 2000分光光度計(デラウェア州ウィルミ
ントンのThermo Scientific)を用いて260nmでの吸収を測定する
ことにより、DNA濃度を定量した。
従来のソフトリソグラフィーによってマイクロ流体チップを製造した。6インチシリコ
ンウェハ上にSU−8ネガティブフォトレジスト(マサチューセッツ州ニュートンのMi
croChem Corp.)をスピンコートし、OAI Hybralign Ser
ies 200アライナー(カリフォルニア州サンホゼのOAI)でのコンタクトリソグ
ラフィーによりフォトマスク(オレゴン州バンドンのCAD/Art Services
)から流体形状を転写することによって、成形用マスターを作製した。チップは、そのチ
ップの外部ポートから機能領域に流体を移送するための低い流体力学的抵抗を有する深い
チャネル(100±10um)と液滴操作および検出のための浅いチャネル(20±1u
m)である、2つの深度を有するチャネルを含有した。SU−8フォトレジスト2100
および2025を深いおよび浅いチャネルにそれぞれ使用した。ポリジメチルシロキサン
(PDMA)(Sylgard(登録商標)184、ミシガン州ミッドランドのDow
Corning)チップを注文設計の金型ハウジング内でネガティブマスターから成形し
た。AutoGlow(商標)酸素プラズマシステム(アリゾナ州フェニックスのGlo
w Research)での表面活性化、続いて即座の圧着により、それらのチップの流
体側にガラス・カバー・スライドを永久接着した。疎水性表面を作るために、100uL
の溶剤中の18gのシランの混合物として調製したFC−3283(ミネソタ州セントポ
ールの3M Specialty Materials)に溶解した1H,1H,2H,
2H−パーフルオロデシルトリクロロシラン(マサチューセッツ州ワードヒルのAlfa
Aesar)に〜2分間、それらのマイクロ流体チャネルを暴露した。
一方は液滴生成用および他方は熱サイクリング後の蛍光読み出し用である2つの異なるマ
イクロ流体デバイスを使用した。液滴生成チップは、この時点以降「キャリア油」と呼ぶ
、エマルジョン安定化界面活性剤を伴う不活性フッ素化油(REBキャリア油;マサチュ
ーセッツ州レキシントンのRainDance Technologies)に懸濁され
たテンプレートDNAおよびPCRマスターミックスの均一なサイズの水性液滴のエマル
ジョンを生じさせた。十字形のマイクロ流体交差部、すなわち「ノズル」、内で液滴を生
成させた。図3aに示すように、典型的な動作のもとで、水性相は、右からノズルに流れ
込み(160uL/時)、上部および下部からのキャリア油のフロー(750uL/時の
全油)に合流し、11kHzの速度で4pLの液滴を生じさせた。交差部でのチャネル幅
は、水溶液流入口については15um、油流入口については12.5の測定値であり、お
よび流出口では15umが40umに広がっていた。特注OEMポンプ(イリノイ州ノー
スブルックのIDEX Corporation)によってフローを駆動した。
、DNA Engine(カリフォルニア州ハーキュリーズのBio−Rad)での熱サ
イクルに付した。その反応混合物は、1×TaqMan(登録商標)汎用PCRマスター
ミックス(カリフォルニア州カールズバッドのApplied Biosystems)
、0.2mM dNTP(ウィスコンシン州マディソンのTakara Bio)ならび
に結果の中で説明するような様々な量のプライマー対およびプローブを含有した。すべて
の場合、1×濃度から変動させるとき、プライマーおよびプローブを同じ量、変動させた
。サイクルプログラムは、95℃での10分のホットスタート、ならびに95℃で15秒
および60℃で60秒の45サイクルを含んだ。
処理中に液滴が濃縮されてきた。それ故、一方の液滴を他方と正しく区別するために読み
出し前に希釈を必要とする密充填エマルジョンとして、液滴を読み出しチップに再注入し
た。上の液滴生成ノズルに類似した「スペーサー」ノズルを使用して、余分なキャリア油
の均一なプラグを読み出し直前に液滴間に注入した。図3bに示すように、ノズルへの液
滴入口は、ほぼ個々の液滴サイズのくびれに先細になっていて、液滴を単一の列で、それ
故、安定した速度でノズルに入らせた。上部および下部チャネルからのキャリア油の対向
フローがそれらの液滴を均一に分離した。スペーサーノズルから出て行くノズルは、フロ
ー方向に沿って幅が増大し、液滴は、その幅が液滴径より小さいまたは液滴径に等しいそ
のチャネルに沿った位置(図3bに矢印でしるしをつけた)でレーザー誘導蛍光による問
い合わせを受けた。前記ノズルの寸法は、液滴入口および出口については15um、およ
び油ラインについては20umであった。
特注の顕微鏡での従来の落射蛍光顕微鏡法により、蛍光読み出しを行った。20mW、
488nmレーザー源(Cyan;カリフォルニア州サニーヴェールのPicarro)
を2×拡大し、対物レンズ(20×/0.45NA;日本の株式会社ニコン(Nikon
)によってマイクロ流体チャネルに焦点を合わせた。2つのバンド・パス・フィルターが
、対物レンズによって集められた蛍光を識別した:FAMおよびVIC蛍光体についてそ
れぞれ512/25nmおよび529/28nm(ニューヨーク州ロチェスターのSem
rock)。2つのH5784−20光電子倍増管(Hamamatsu、日本)により
蛍光を検出し、USB−6259データ取得カード(テキサス州オースチンのNatio
nal Instruments)を用いて200kHzのサンプリング速度で概して記
録した。後の分析の前に7点二次Savitzky−Golayアルゴリズムによりデー
タトレースを平滑化した。蛍光読み出しと当時に、850nm LED(TSHG620
0;コネチカット州シェルトンのVishay Semiconductors)からの
背面照明で同じ対物レンズと、蛍光検出および撮像のために光路を分離するためのショー
ト・パス・フィルタと、Guppy CCDカメラ(マサチューセッツ州ニューベリーポ
ートのAllied Vision Technologies)とによって、液滴を撮
像した。画像にすじが入らないように短い照明パルス(5〜20マイクロ秒)で液滴を撮
像した。
液滴事象を閾値より上の蛍光強度の継続的バーストと解釈する特注LabViewソフ
トウェア(テキサス州オースチンのNational Instruments)でデー
タを分析した。シグナル対ノイズ比は一般に相当高く、シグナルレベルは日ごとに一致し
ており、従って、50mVの固定閾値を主として用い、他の状況では閾値を目視によって
設定した。VIC蛍光体とFAM蛍光体の両方について液滴事象ごとにピーク蛍光強度を
記録した。熱サイクリング中に液滴の多少の合体が、概して2個の無損傷液滴間の孤立し
た事象として発生して、「ダブレット」を形成した。ダブレットおよび稀なより大きい合
体事象を蛍光バーストの継続期間に基づいてデータセットから容易に濾過した。
他の文献、例えば特許、特許出願、特許公開公報、ジャーナル、本、論文、ウェブコン
テンツ、の参照および引用を本開示全体を通して行った。すべてのそのような文献は、あ
らゆる意味でそれら全体が参照により本明細書に援用されている。
本発明の精神または本質的特徴を逸脱することなく他の特定の形態で本発明を具現する
ことができる。従って、上述の実施形態は、すべての点で、本明細書に記載する本発明を
制限するものではなく例証するためのものであると解釈すべきである。
Claims (1)
- 明細書に記載された発明。
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