ES2277785B1 - Metodo de analisis de expresion diferencial en cancer colorectal. - Google Patents
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Abstract
Método de análisis de expresión diferencial en cáncer colorectal. La presente invención describe un método de análisis de expresión diferencial en cáncer colorectal basado en la variación en los niveles de expresión de genes que codifican proteínas del complejo condensina y proteínas asociadas que tiene lugar en pacientes afectados de dicha enfermedad y que pueden ser utilizadas como marcadores para el diagnóstico de dichos tumores así como en la prevención y tratamiento de los mismos.
Description
Método de análisis de expresión diferencial en
cáncer colorectal.
La presente invención se refiere a un método de
análisis de la expresión diferencial basado en la sobreexpresión de
proteínas del complejo condensina y proteínas asociadas en
pacientes de cáncer colorectal que puede ser utilizado como criterio
de diagnóstico de dichos tumores así como en la prevención y
tratamiento de los mismos.
En términos absolutos, el cáncer es la segunda
causa de muerte en España. De entre los múltiples tipos de cáncer
destaca el cáncer colorectal que causó el 11% de las defunciones
por cáncer en hombres y el 15% en mujeres según los datos de 1999.
En España se estima que el número de casos nuevos por año se sitúa
en torno a los 18.000 en ambos sexos frente a 11.300 defunciones.
Los tumores de colon y recto suelen analizarse conjuntamente debido
a los frecuentes errores de clasificación de los tumores de la
porción recto-sigmoide. La mortalidad es muy
elevada, constituyendo la segunda localización tumoral en
importancia en hombres y en mujeres, con una tendencia temporal
ascendente (2,2% anual en hombres y 0,7% en mujeres). En la
actualidad la mortalidad es más alta en hombres, aunque en los años
60 lo era más en mujeres.
En estos tumores los datos de mortalidad no
reflejan la verdadera incidencia de la enfermedad, ya que la
supervivencia ha mejorado en los últimos años, principalmente en
personas jóvenes. La tendencia a la estabilización de la mortalidad
puede reflejar las mejoras terapéuticas obtenidas con un
diagnóstico precoz, por tratarse de tumores bastante accesibles a
la exploración con sigmoidoscopio y a la generalización de las
colonoscopias completas en grupos de riesgo identificados.
El riesgo acumulativo durante la vida de
contraer la enfermedad es del 5-6%, estando
influenciado por hábitos de vida y factores hereditarios. La forma
de cáncer colorectal más frecuente es el de tipo esporádico (90%)
existiendo casos con componentes hereditarios: la poliposis
adenomatosa familiar (0,01%) y el cáncer colorectal hereditario
no-polipósico (5-10%). Estos últimos
son causados por síndromes familiares definidos por unos pocos
genes. Sin embargo, los genes responsables de los cánceres
esporádicos permanecen sin identificar. Se considera que el
desarrollo tumoral colorectal es posiblemente la consecuencia de
una serie de eventos moleculares que se inician con una o varias
mutaciones o eventos epigenéticos y sigue con fenómenos de
progresión, en los que pueden estar involucrados factores tanto
genéticos como ambientales.
En general, el cáncer colorectal no suele dar
síntomas hasta fases avanzadas de crecimiento en la pared
intestinal, por lo que se hace necesaria la identificación de
nuevos genes y/o mutaciones responsables y/o indicadores de este
tipo de cáncer y el consiguiente desarrollo de métodos analíticos
que permitan un diagnóstico molecular selectivo y rápido de la
enfermedad para que puedan ser incluidos en la práctica clínica
habitual.
También se produciría un ahorro de costes
sanitarios y una reducción en los tiempos de espera, la adopción de
nuevos criterios pronósticos y de orientación terapéutica en los
casos positivos así como el diseño de terapias selectivas
relacionadas con estos genes.
La proteína codificada por el gen SMC2L1
(ortólogo humano de SMC2 de S. cerevisiae, también
denominado hCAP-E) es una proteína central en los
complejos de condensación y compactación cromosómica que podría
tener funciones relacionadas con la regulación de la transcripción
génica (Hagstrom & Meyer, 2003; Hirano, 2002;
Legagneux et al., 2004).
Legagneux et al., 2004).
Esta proteína forma parte de una familia de
proteínas denominadas SMC (por "structural maintenance of
chromosomes") y que está formada por 6 proteínas numeradas de 1 a
6 (SMC1, SMC2, SMC3, SMC4, SMC5 y SMC6). Estas proteínas forman
dímeros entre ellas y complejos activos con otras proteínas
denominadas no-SMC (divididas en dos familias, HEAT
y Kleisina). En su conjunto forman tres complejos principales:
condensina (en humanos existen dos complejos diferenciados,
condensina I y condensina II), cohesina y el complejo
hSMC5-hSMC6, relacionado con la reparación genómica
(Hagstrom & Meyer, 2003; Hirano, 2002). En las tablas 1 y 2 se
describen las proteínas y los complejos que forman en distintas
especies.
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SMC2L1 forma parte de los complejos de
condensina I y II. Ambos complejos tienen funciones relacionadas
con la compactación de cromatina (Hirano et al., 1994; Ono
et al., 2004; Ono et al., 2003):
Condensina I: formada por el dímero
SMC2-SMC4
(hCAP-E-hCAP-C), las
subunidades HEAT hCAP-D2/CNAPI y
hCAP-G, y la subunidad Kleisina
hCAP-H. El dímero
hCAP-E-hCAP-C se
encuentra en el citoplasma en células interfásicas (fuera de
mitosis). Una vez llegada la mitosis, las subunidades
no-SMC se fosforilan, interaccionan con el dímero
hCAP-E-hCAP-C,
forman el complejo y se trasladan al núcleo donde interaccionan con
el DNA y lo compactan (Hagstrom & Meyer, 2003).
Condensina II: formada por el dímero
SMC2-SMC4
(hCAP-E-hCAP-C), las
subunidades HEAT hCAP-D3 y hCAP-G2,
y la subunidad Kleisina hCAP-H2. Parece ser que el
complejo se encuentra en el núcleo en células interfásicas (fuera de
mitosis) (Fig. 1A) y podría tener relación con la regulación
transcripcional génica, ayudando a compactar la zona promotora de
determinados genes. Esto situaría la condensina en zonas de
eucromatina y asociadas a regiones transcripcionalmente activas (las
zonas donde existe regulación transcripcional, es decir, activación
o inhibición de la transcripción), como son las equivalentes a la
zona interna nuclear (Fig. 1A y 1B) y a las bandas R de los
cromosomas, con otros factores reguladores como histonas acetiladas
(por ejemplo la histona H3 acetilada en la lisina K3) (Fig. 2 y
3).
No existen evidencias en la literatura que hayan
relacionado estas proteínas con este tipo de cáncer. Sin embargo,
la posible relación de la condensina con el silenciamiento
transcripcional y la correcta compactación cromosómica hace pensar
que podría estar alterada en cáncer. La mayoría de cánceres
presentan hipometilación general del genoma acompañada de una
hiperacetilación general. No obstante, se ha demostrado que
determinadas zonas promotoras génicas ricas en islas CpG tiene
hipermetilación y los genes están silenciados (no se transcriben).
En la presente invención se describe que la condensina colabora en
estos procesos de silenciamiento y que las proteínas que forman
estos complejos y proteínas asociadas están sobreexpresadas.
Asimismo, dado que se considera que la mayoría de alteraciones
epigenéticas son muy iniciales en los procesos neoplásicos, esta
sobreexpresión también puede ser característica de procesos
incipientes como los adenomas.
La presente invención tiene por objeto un método
de análisis de expresión diferencial en cáncer colorectal que
comprende detectar en una muestra biológica aislada de un paciente
una variación en los niveles de expresión de uno o más genes que
codifican proteínas que forman parte del complejo condensina u
otras proteínas que interaccionan con dicho complejo, donde dicha
variación en los niveles de expresión del gen se utiliza como
diagnóstico de la presencia de cáncer colorectal o de una condición
pre-maligna del mismo.
En particular, el gen o genes a analizar se
seleccionan entre el grupo formado por hCap-E,
hCap-C, hCap-D2,
hCap-D3, hCap-G,
hCap-G2, hCap-H, y KIF4A y la
variación en los niveles de expresión del gen o genes es un
incremento en los niveles de expresión.
En particular, dicha muestra puede ser DNA o RNA
y puede aislarse a partir de células obtenidas por biopsia o
cualquier otro método de extracción.
En una realización de la invención, la detección
se lleva a cabo mediante una amplificación por PCR, SDA o cualquier
otro método de amplificación de ácidos nucleicos.
En otra realización de la invención, la
detección se puede llevar a cabo mediante biochips de DNA
elaborados con oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo
o por biochips de DNA elaborados con oligonucleótidos sintetizados
in situ mediante fotolitografía o por cualquier otro
mecanismo.
En otra realización de la invención, la
detección se lleva a cabo mediante hibridación in situ
utilizando sondas específicas marcadas con cualquier método de
marcaje.
En otra realización de la invención, la
detección se lleva a cabo mediante geles de electroforesis.
Opcionalmente, la detección se puede llevar a cabo mediante
transferencia a membrana e hibridación con una sonda
específica.
En otra realización de la invención, la
detección se lleva a cabo mediante RMN o cualquier otra técnica de
diagnóstico por imagen.
En otra realización de la invención, la
detección se lleva a cabo mediante RMN o cualquier otra técnica de
diagnóstico por imagen mediante la utilización de nanopartículas
paramagnéticas o cualquier otro tipo de nanopartículas detectables
funcionalizadas con anticuerpos o por cualquier otro medio.
Opcionalmente, la muestra analizada puede ser la
proteína codificada por el gen o fragmentos de la misma.
En otra realización de la invención, la
detección se lleva a cabo mediante incubación con un anticuerpo
específico. Opcionalmente, la detección se puede llevar a cabo
mediante Western blot o mediante inmunohistoquímica.
En otra realización de la invención, la
detección se lleva a cabo mediante geles de electroforesis de
proteína.
En otra realización de la invención, la
detección se lleva a cabo mediante chips de proteína.
En otra realización de la invención, la
detección se lleva a cabo mediante ELISA o cualquier otro método
enzimático.
La presente invención también tiene por objeto
un método de análisis de expresión diferencial en cáncer colorectal
donde la variación en los niveles de expresión de uno o más de los
genes descritos se utiliza como pronóstico de la progresión del
cáncer colorectal o de una condición pre-maligna
del mismo o como pronóstico del riesgo de recurrencia de dicha
enfermedad.
La presente invención también tiene por objeto
un kit para llevar a cabo el método de análisis de expresión
diferencial que comprende los reactivos y aditivos apropiados para
detectar la variación en los niveles de expresión del gen o
genes.
La presente invención tiene también por objeto
adicional un método de análisis de compuestos con potencialidad
terapéutica en cáncer colorectal que comprende determinar la
capacidad de dichos compuestos de disminuir los niveles de expresión
de uno o más de los genes descritos donde los compuestos son
compuestos obtenidos de la información de la secuencia tales como
oligonucleótidos antisentido o de interferencia de RNA u otros
basados en la desestabilización y eliminación del mRNA o el
impedimento de su traducción a proteína.
La presente invención tiene también por objeto
adicional un método de análisis de compuestos con potencialidad
terapéutica en cáncer colorectal que comprende determinar la
capacidad de dichos compuestos de contrarrestar la variación en los
niveles de expresión de uno o más de los genes descritos donde los
compuestos son nanopartículas paramagnéticas o nanopartículas de
excitación térmica.
La presente invención tiene también por objeto
adicional un método de análisis de compuestos con potencialidad
terapéutica en cáncer colorectal que comprende determinar la
capacidad de dichos compuestos de contrarrestar la variación en los
niveles de expresión de uno o más de los genes descritos donde los
compuestos son nanopartículas funcionalizadas con anticuerpos
específicos y compuestos tóxicos vehiculados de forma simple,
binaria o modular para la célula maligna.
Asimismo, la presente invención tiene por objeto
una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de
compuestos con potencialidad terapéutica obtenidos según los
métodos descritos anteriormente y uno o más excipientes
farmacéuticamente aceptables.
Por otra parte, la presente invención también
tiene por objeto el uso de compuestos con potencialidad terapéutica
obtenidos según los métodos descritos anteriormente para la
preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención del
cáncer colorectal o de una condición pre-maligna
del mismo.
La presente invención se basa en la
sobreexpresión de las proteínas del complejo condensina y proteínas
asociadas observada en pacientes afectados de cáncer colorectal.
Los datos demostraban una sobreexpresión de hCAP-E
en el análisis por Western blot utilizando anticuerpos específicos
anti-hCAP-E en muestras de cáncer
colorectal en comparación con muestras de tejido normal, de manera
independiente de su estadiaje tumoral y con una incidencia de
sobreexpresión del 90% de los tumores (18/20) (Fig. 4). Esta
sobreexpresión también se observó en todos los análisis por
inmunohistoquímica en tejidos tumorales de cáncer colorectal (Fig.
5).
Asimismo, se observó que la expresión de
hCAP-E es también específica de las células
pluripotenciales (stem) de la cripta del colon (Fig. 6), que son las
células indiferenciadas a partir de las cuales se originan los
tumores colorectales. Su patrón de expresión indica que ésta
prácticamente desaparece conforme la célula pluripotencial se
transforma en célula epitelial (célula Globbet) en una cripta
normal para formar el epitelio, por lo que podría considerarse como
un marcador de diferenciación celular.
En la Tabla 3 se muestran los niveles de
sobreexpresión de hCAP-E en cáncer colorectal de
acuerdo con el estadiaje.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La incidencia de sobreexpresión (+) fue del 90%
(18 sobre 20 tumores). Solamente se observó un caso en el que la
expresión era inferior al normal (-) y un caso en el que el tejido
normal y el tejido tumoral mostraban niveles similares de expresión
(=).
Asimismo, se analizaron mediante PCR en tiempo
real (real-time PCR) los niveles de expresión de
otras proteínas que forman el complejo condensina, tales como
hCap-C, hCap-D2,
hCap-D3, hCap-G,
hCap-G2 y hCap-H así como de otras
proteínas asociadas que interactúan con el complejo, como KIF4A, en
algunos casos tumorales en los que se había observado la
sobreexpresión de hCap-E. Los resultados indicaron
que todas las proteínas analizadas presentaban un incremento en los
niveles de expresión en tejido tumoral en relación con los niveles
en tejido normal (Fig. 7). Por lo tanto, se puede concluir que
todas las proteínas que integran el complejo condensina y otras
proteínas que interactúan con dicho complejo están sobreexpresadas
en los tumores.
Así pues, las proteínas que forman el complejo
condensina y otras proteínas asociadas que interactúan con el mismo
pueden ser utilizadas como marcadores de cáncer colorectal o de una
condición pre-maligna del mismo teniendo potencial
como marcador de diagnóstico y/o de recomendación para la
colonoscopia.
Asimismo, estas proteínas pueden ser marcadores
de células pluripotenciales (stem cells) de la cripta del colon
como marcadores de diferenciación celular. Por otra parte, estas
proteínas pueden ser marcadores histológicos de cáncer y/o pueden
tener utilidad en sistemas de análisis por imagen.
Además, estas proteínas pueden constituir dianas
terapéuticas directas o indirectas, permitiendo la llegada de
tratamientos antitumorales vehiculizados al tumor a través de
interacciones con cualquiera de estas proteínas o mediante la
modulación de sus niveles de expresión.
Cabe destacar que recientemente se ha descrito
que los niveles de expresión de las proteínas del complejo
condensina no varían a lo largo de ciclo celular y, por lo tanto, no
varían durante la mitosis (Takemoto et al., 2004). Así pues,
el hecho de encontrar niveles elevados de estas proteínas en
células cancerosas tal como se describe en la presente invención no
puede ser atribuido simplemente a un aumento de la actividad
replicativa (mitosis) de la célula tumoral, sino que se trata de una
sobreexpresión relativa real debida al desarrollo de la
enfermedad.
Por lo tanto, la presente invención demuestra
una asociación total entre los niveles de expresión de las
proteínas que integran el complejo condensina y otras proteínas
asociadas a dicho complejo y la presencia de cáncer colorectal
cualquiera que sea su estadio de desarrollo, lo que supone disponer
de una nueva herramienta molecular que permite el diagnóstico de la
enfermedad incluso en sus estadios más iniciales, lo cual no es
posible con los métodos actuales.
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La figura 1A indica la localización de
hCAP-E en células interfásicas, representado por los
cúmulos blanquecinos. La figura 1B representa la imagen de un
núcleo celular obtenida por microscopía electrónica. En ella pueden
observarse separadas la heterocromatina y la eucromatina
La figura 2 representa la colocalización de
hCAP-E en las regiones cromosómicas equivalentes a
la eucromatina (bandas R). Se representa el mismo cromosoma teñido
con hCAP-E y por bandas G. La heterocromatina se
identifica por las zonas más oscuras, en cada una de las figuras la
derecha.
La figura 3 indica la colocalización de
hCAP-E con histona 4 acetilada (H4Ac) y las bandas
R en cromosomas metafásicos (bandas claras en el cromosoma).
La figura 4 representa los resultados del
análisis por Western blot de hCAP-E en muestras
normales (N) y tumorales (T) de cáncer colorectal. La actina se
utilizó como control de carga.
La figura 5 corresponde a un análisis por
inmunohistoquímica de tejido colorectal utilizando un anticuerpo
específico anti-hCAP-E. Se observa
la zona correspondiente a la cripta normal (N) y la zona
correspondiente al adenocarcinoma de colon (T) que presenta una
mayor expresión de hCAP-E.
La figura 6 corresponde a un análisis por
inmunohistoquímica en criptas normales de colon utilizando un
anticuerpo específico anti-hCAP-E,
en la que se observa que las células pluripotenciales (stem)
presentan una tinción específica más fuerte para
hCAP-E que las células Globbet.
La figura 7 representa los resultados del
análisis por PCR a tiempo real de otras proteínas del complejo
condensina y de la proteína asociada KIF4A. La muestra analizada
fue la muestra 67T en la que se había observado previamente una
sobreexpresión de hCAP-E en comparación con su
muestra normal correspondiente. El análisis se hizo por triplicado
y se utilizó el ribosomal 18S como control interno.
A continuación se describe una realización
preferente, aunque no limitativa, de la invención.
Se obtuvieron biopsias de tejido normal y
tumoral de 20 pacientes diagnosticados con cáncer colorectal. Las
muestras obtenidas quirúrgicamente fueron congeladas de inmediato
en nitrógeno líquido y mantenidas a -80ºC para la posterior
extracción de proteínas y RNA. Además, se realizaron cortes
histológicos para realizar pruebas de inmunohistoquímica. Se
registraron las características clínico-patológicas
incluyendo el estadio y grado de diferenciación de los tumores así
como de un seguimiento de al menos tres años para detectar los
casos con recidiva temprana.
Western blot: Las proteínas fueron
extraídas a partir de las muestras de tejido normal y colorectal
mediante métodos estándar, utilizando tampón de tisis RIPA. Noventa
\mug de proteína fueron fraccionados en un gel
SDS-PAGE al 10%, transferidas a una membrana de
nitrocelulosa (BioRad, USA), bloqueadas con 5% leche en
TBS-T, e hibridadas con un anticuerpo primario
anti-hCAP-E (Abcam, UK) diluido
1:2500 en solución de bloqueo, y luego con un anticuerpo secundario
anti-conejo (Dako Cytomation, Denmark) diluido
1:500. La señal quimioluminescente fue detectada utilizando el kit
ECL (Amersham, USA) y se compararon los niveles de expresión de las
muestras tumorales con su contraparte normal. Finalmente, la
membrana fue rehibridada con anticuerpo anti-actina
(Invitrogen, USA) que fue utilizada como control de carga. Como se
observa en la figura 4, todas las muestras tumorales presentaban un
incremento en los niveles de expresión de
hCAP-E.
Inmunohistoquímica: Los cortes
histológicos correspondientes a los tejidos de pacientes con cáncer
colorectal fueron desparafinados con xileno y rehidratados en series
decrecientes de etanol y agua destilada. Las secciones fueron
tratadas con tampón citrato pH 6 (5 min 800 W y 10 min 450 W, al
microondas), la peroxidasa endógena fue bloqueada con
H_{2}O_{2}, y luego fueron hibridadas con el anticuerpo primario
anti-hCAP-E (Abcam, UK). Para el
análisis inmunohistoquímico se empleó el kit EnVision + Dual Link
System (Dako Cytomation, Denmark) de acuerdo a las recomendaciones
del fabricante. Finalmente, se comparó el nivel de expresión de
hCAP-E entre zonas de tejido normal y tumoral. En
la figura 5 se observa una mayor expresión de hCAP-E
en tejido tumoral respecto al tejido control.
Real-time PCR: Los
niveles de mRNA correspondientes a otras proteínas del complejo
condensina y proteínas asociadas fueron cuantificados mediante PCR
en tiempo real (real-time PCR), para lo cual el RNA
fue extraído a partir de las muestras de tejido normal y colorectal
mantenidas a -80ºC, utilizando Trizol (Invitrogen, USA). Diez \mug
de RNA fueron retrotranscritos empleando el kit High Capacity cDNA
Archive (Applied Biosystems, USA) y amplificados con TaqMan® Gene
Expression Assays (Applied Biosystems, USA) para
hCAP-C, hCAP-D2,
hCAP-D3, hCAP-G,
hCAP-G2, hCAP-H y KIF4A,
respectivamente. La reacción de amplificación se llevó a cabo
utilizando TaqMan Universal PCR Master Mix en el equipo 7500 Real
Time PCR system (ambos de Applied Biosystems, USA). Los niveles
relativos de mRNA de cada gen fueron cuantificados empleando el
método \Delta\DeltaC_{T}, con el programa asociado al sistema.
Se realizó el ensayo por triplicado y se utilizó 18S rRNA como
control endógeno, y se comparó la expresión entre tejido normal y
tumoral del mismo paciente. Como se observa en la figura 7, las
muestras tumorales presentaban unos niveles de mRNA muy
incrementados respecto a las muestras control para todos los genes
analizados.
Claims (23)
1. Método de análisis de expresión diferencial
en cáncer colorectal caracterizado porque comprende detectar
en una muestra biológica aislada de un paciente un incremento en
los niveles de expresión de uno o más genes que codifican proteínas
que forman parte del complejo condensina u otras proteínas que
interaccionan con dicho complejo, seleccionados entre el grupo
formado por hCap-E, hCap-C,
hCap-D2, hCap-D3,
hCap-G, hCap-G2,
hCap-H, y KIF4A, donde dicho incremento en los
niveles de expresión del gen se utiliza como diagnóstico de la
presencia de cáncer colorectal o de una condición
pre-maligna del mismo.
2. Método de análisis de expresión diferencial
en cáncer colorectal según la reivindicación 1,
caracterizado porque la muestra es aislada de células
obtenidas por biopsia o cualquier otro método de extracción.
3. Método de análisis de expresión diferencial
en cáncer colorectal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
2, caracterizado porque la muestra a analizar es DNA.
4. Método de análisis de expresión diferencial
en cáncer colorectal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
2, caracterizado porque la muestra a analizar es RNA.
5. Método de análisis de expresión diferencial
en cáncer colorectal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
4, caracterizado porque la detección se realiza mediante una
amplificación por PCR, SDA o cualquier otro método de amplificación
de ácidos nucleicos.
6. Método de análisis de expresión diferencial
en cáncer colorectal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
4, caracterizado porque la detección se lleva a cabo por
chips de DNA elaborados con oligonucleótidos depositados por
cualquier mecanismo.
7. Método de análisis de expresión diferencial
en cáncer colorectal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
4, caracterizado porque la detección se lleva a cabo por
chips de DNA elaborados con oligonucleótidos sintetizados in
situ mediante fotolitografía o por cualquier otro
mecanismo.
8. Método de análisis de expresión diferencial
en cáncer colorectal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
4, caracterizado porque la detección se lleva a cabo mediante
hibridación in situ utilizando sondas específicas marcadas
con cualquier método de marcaje.
9. Método de análisis de expresión diferencial
en cáncer colorectal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
4, caracterizado porque la detección se lleva a cabo mediante
geles de electroforesis.
10. Método de análisis de expresión diferencial
en cáncer colorectal según la reivindicación 9,
caracterizado porque la detección se lleva a cabo mediante
transferencia a membrana e hibridación con una sonda
específica.
11. Método de análisis de expresión diferencial
en cáncer colorectal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
4, caracterizado porque la detección se lleva a cabo mediante
RMN o cualquier otra técnica de diagnóstico por
imagen.
imagen.
12. Método de análisis de expresión diferencial
en cáncer colorectal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
4, caracterizado porque la detección se lleva a cabo mediante
RMN o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen mediante la
utilización de nanopartículas paramagnéticas o cualquier otro tipo
de nanopartículas detectables funcionalizadas con anticuerpos o por
cualquier otro medio.
13. Método de análisis de expresión diferencial
en cáncer colorectal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
4, caracterizado porque la muestra analizada es la proteína
codificada por el gen o fragmentos de la misma.
14. Método de análisis de expresión diferencial
en cáncer colorectal según la reivindicación 13,
caracterizado porque la detección se lleva a cabo mediante
incubación con un anticuerpo específico.
15. Método de análisis de expresión diferencial
en cáncer colorectal según la reivindicación 14,
caracterizado porque la detección se lleva a cabo mediante
Western blot.
16. Método de análisis de expresión diferencial
en cáncer colorectal según la reivindicación 14,
caracterizado porque la detección se lleva a cabo mediante
inmunohistoquímica.
17. Método de análisis de expresión diferencial
en cáncer colorectal según la reivindicación 13,
caracterizado porque la detección se lleva a cabo mediante
geles de electroforesis.
18. Método de análisis de expresión diferencial
en cáncer colorectal según la reivindicación 13,
caracterizado porque la detección se lleva a cabo mediante
chips de proteína.
19. Método de análisis de expresión diferencial
en cáncer colorectal según la reivindicación 13,
caracterizado porque la detección se lleva a cabo mediante
ELISA o cualquier otro método enzimático.
20. Método de análisis de expresión diferencial
en cáncer colorectal según la reivindicación 13,
caracterizado porque la detección se lleva a cabo mediante
RMN o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen.
21. Método de análisis de expresión diferencial
en cáncer colorectal según la reivindicación 13,
caracterizado porque la detección se lleva a cabo mediante
RMN o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen mediante la
utilización de nanopartículas paramagnéticas o cualquier otro tipo
de nanopartículas detectables funcionalizadas con anticuerpos o por
cualquier otro medio.
22. Método de análisis de expresión diferencial
en cáncer colorectal según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, donde el incremento en los niveles de expresión del gen
o genes se utiliza como pronóstico de la progresión del cáncer
colorectal o de una condición pre-maligna del mismo
o como pronóstico del riesgo de recurrencia de dicha
enfermedad.
23. Kit para llevar a cabo el método según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 que comprende los
reactivos y aditivos apropiados para detectar el incremento en los
niveles de expresión del gen o genes.
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