JPH07270319A - ヘテロポリ酸を用いたアデニル基含有物質の測定方法 - Google Patents
ヘテロポリ酸を用いたアデニル基含有物質の測定方法Info
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- JPH07270319A JPH07270319A JP6084085A JP8408594A JPH07270319A JP H07270319 A JPH07270319 A JP H07270319A JP 6084085 A JP6084085 A JP 6084085A JP 8408594 A JP8408594 A JP 8408594A JP H07270319 A JPH07270319 A JP H07270319A
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】アデニル基含有物質を簡便で特異的にＳ／Ｎ比
の高い高感度の測定を行うアデニル基含有物質の測定方
法の提供。 【構成】測定対象物質中のアデニル基に、ヘテロポリ酸
あるいはヘテロポリ酸の塩の存在下、グリオキサール誘
導体を反応させて化学発光性物質を誘導し、該化学発光
性物質から得られた発光活性を指標として該測定対象物
質を測定するアデニル基含有物質の測定方法。
の高い高感度の測定を行うアデニル基含有物質の測定方
法の提供。 【構成】測定対象物質中のアデニル基に、ヘテロポリ酸
あるいはヘテロポリ酸の塩の存在下、グリオキサール誘
導体を反応させて化学発光性物質を誘導し、該化学発光
性物質から得られた発光活性を指標として該測定対象物
質を測定するアデニル基含有物質の測定方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アデニル基を含む物質
の測定方法に関する。より詳細には、測定対象物質中の
アデニル基を化学的に修飾し、化学発光活性を指標とし
て測定対象物質を定性もしくは定量する方法に関する。
の測定方法に関する。より詳細には、測定対象物質中の
アデニル基を化学的に修飾し、化学発光活性を指標とし
て測定対象物質を定性もしくは定量する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アデニル基を含有する物質には、アデニ
ン、アデノシン、アデノシンリン酸化合物、ＤＮＡ、Ｒ
ＮＡ等があり、補酵素、高エネルギーリン酸化合物、遺
伝子等の構成成分として生体中で重要な役割を果たして
いる。従来、アデニン、アデノシンの、グアニン、グア
ノシン等の他の核酸塩基との分別測定は、クロマトグラ
フィーを利用した分離操作によりなされており、一般に
は高速液体クロマトグラフィーが用いられている。ま
た、核酸の測定には、260nm 付近の紫外部吸収を利用し
た方法が一般的であり、近年は、エチジウムブロマイド
を用いた蛍光色素法も用いられている。さらに、検体中
の標的核酸の測定は、直接的にあるいは間接的に標識さ
れた相補的な核酸を用いて行われており、その標識には
放射性同位元素、酵素、蛍光物質、化学発光物質等が利
用されている。また、検体中の標的核酸をポリメラーゼ
を用いた核酸増幅法で検出する方法では、核酸の電気泳
動とエチジウムブロマイドを用いた蛍光色素法とを組み
合わせて増幅核酸の検出を行っている。さらに、免疫学
的測定方法は抗体と抗原とが特異的に結合することを利
用する測定法である。これには、免疫反応を抗体と抗原
との複合体による沈降線や濁度として直接的に検出する
測定方法と、抗体あるいは抗原に標識を行いこれを指標
として測定を行う方法がある。後者においては、放射性
同位元素、酵素、蛍光物質、化学発光物質等が標識に利
用され、前者よりも高感度な測定が可能である。近年、
核酸を抗体に標識し、これにポリメラーゼを用いた核酸
増幅法を組み合わせた手法が高感度測定法として編み出
されている。この手法においても最終段階でエチジウム
ブロマイドを用いた蛍光色素法を使用し増幅核酸を検出
している。黒田らは、日本分析化学会第４１年会におい
て、アデニンに塩酸存在下でフェニルグリオキザールを
作用させて、発光性物質を誘導し、さらにＨ2 Ｏ2 の存
在下に水酸化ナトリウム水溶液を加えることにより発光
させて、発光活性からアデニンの定量が可能であること
を発表している。この方法は、アデニン当たりの発光量
が低く、アデニン非存在時のブランク値が高いという問
題点があったが、上述の測定方法のように煩雑な分離精
製の手順を必要とせず容易にアデニン特異的に測定でき
る点で有用である。一方、ヘテロポリ酸およびその塩
は、強い酸性と酸化力を示すための触媒として用いられ
ている。反応は多岐にわたり、炭化水素の酸化、アルケ
ンの重合、エポキシ化等に試みられている。
ン、アデノシン、アデノシンリン酸化合物、ＤＮＡ、Ｒ
ＮＡ等があり、補酵素、高エネルギーリン酸化合物、遺
伝子等の構成成分として生体中で重要な役割を果たして
いる。従来、アデニン、アデノシンの、グアニン、グア
ノシン等の他の核酸塩基との分別測定は、クロマトグラ
フィーを利用した分離操作によりなされており、一般に
は高速液体クロマトグラフィーが用いられている。ま
た、核酸の測定には、260nm 付近の紫外部吸収を利用し
た方法が一般的であり、近年は、エチジウムブロマイド
を用いた蛍光色素法も用いられている。さらに、検体中
の標的核酸の測定は、直接的にあるいは間接的に標識さ
れた相補的な核酸を用いて行われており、その標識には
放射性同位元素、酵素、蛍光物質、化学発光物質等が利
用されている。また、検体中の標的核酸をポリメラーゼ
を用いた核酸増幅法で検出する方法では、核酸の電気泳
動とエチジウムブロマイドを用いた蛍光色素法とを組み
合わせて増幅核酸の検出を行っている。さらに、免疫学
的測定方法は抗体と抗原とが特異的に結合することを利
用する測定法である。これには、免疫反応を抗体と抗原
との複合体による沈降線や濁度として直接的に検出する
測定方法と、抗体あるいは抗原に標識を行いこれを指標
として測定を行う方法がある。後者においては、放射性
同位元素、酵素、蛍光物質、化学発光物質等が標識に利
用され、前者よりも高感度な測定が可能である。近年、
核酸を抗体に標識し、これにポリメラーゼを用いた核酸
増幅法を組み合わせた手法が高感度測定法として編み出
されている。この手法においても最終段階でエチジウム
ブロマイドを用いた蛍光色素法を使用し増幅核酸を検出
している。黒田らは、日本分析化学会第４１年会におい
て、アデニンに塩酸存在下でフェニルグリオキザールを
作用させて、発光性物質を誘導し、さらにＨ2 Ｏ2 の存
在下に水酸化ナトリウム水溶液を加えることにより発光
させて、発光活性からアデニンの定量が可能であること
を発表している。この方法は、アデニン当たりの発光量
が低く、アデニン非存在時のブランク値が高いという問
題点があったが、上述の測定方法のように煩雑な分離精
製の手順を必要とせず容易にアデニン特異的に測定でき
る点で有用である。一方、ヘテロポリ酸およびその塩
は、強い酸性と酸化力を示すための触媒として用いられ
ている。反応は多岐にわたり、炭化水素の酸化、アルケ
ンの重合、エポキシ化等に試みられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上述の測定方法には次
のような課題を有していた。クロマトグラフィーを用い
て分離操作を行い検体中のアデニン、アデノシンを測定
する方法は煩雑であったり、高速液体クロマトグラフィ
ー等の装置が必要であった。さらに、アデニン含有物質
を測定対象とするときは、アデニン含有物質をアデニン
あるいはアデノシンまで分解する前処理が必要であっ
た。260nm 付近の紫外部吸収を利用した核酸の測定法
は、測定感度および特異性に問題があった。エチジウム
ブロマイドを用いた蛍光色素法による核酸測定法は、一
本鎖の核酸と二本鎖の核酸とでは蛍光強度が大きく変動
することや、さらにエチジウムブロマイドが強力な発癌
性物質であるため、取扱いに特別の注意を要した。相補
的な核酸を直接的にあるいは間接的に標識し、検体中の
標的核酸と相補的な核酸とを結合させて行う核酸測定法
は、相補的な核酸に標識を行う際に、標的核酸と相補的
核酸との結合を損なわないように標識位置等に工夫が必
要であった。検体中の標的核酸をポリメラーゼを用いた
核酸増幅法で検出する方法、および、免疫測定法で抗体
に核酸を標識し核酸増幅法を用いて高感度測定を行う測
定方法でも、最後の検出段階でエチジウムブロマイドを
使用するため、上述の問題を有していた。本発明の目的
は、これらの課題のうちいずれか１つ以上を解決するも
のである。
のような課題を有していた。クロマトグラフィーを用い
て分離操作を行い検体中のアデニン、アデノシンを測定
する方法は煩雑であったり、高速液体クロマトグラフィ
ー等の装置が必要であった。さらに、アデニン含有物質
を測定対象とするときは、アデニン含有物質をアデニン
あるいはアデノシンまで分解する前処理が必要であっ
た。260nm 付近の紫外部吸収を利用した核酸の測定法
は、測定感度および特異性に問題があった。エチジウム
ブロマイドを用いた蛍光色素法による核酸測定法は、一
本鎖の核酸と二本鎖の核酸とでは蛍光強度が大きく変動
することや、さらにエチジウムブロマイドが強力な発癌
性物質であるため、取扱いに特別の注意を要した。相補
的な核酸を直接的にあるいは間接的に標識し、検体中の
標的核酸と相補的な核酸とを結合させて行う核酸測定法
は、相補的な核酸に標識を行う際に、標的核酸と相補的
核酸との結合を損なわないように標識位置等に工夫が必
要であった。検体中の標的核酸をポリメラーゼを用いた
核酸増幅法で検出する方法、および、免疫測定法で抗体
に核酸を標識し核酸増幅法を用いて高感度測定を行う測
定方法でも、最後の検出段階でエチジウムブロマイドを
使用するため、上述の問題を有していた。本発明の目的
は、これらの課題のうちいずれか１つ以上を解決するも
のである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】発明者らは、前記課題を
解決するために鋭意研究を重ね、測定対象物質中のアデ
ニル基に、ヘテロポリ酸あるいはヘテロポリ酸の塩の存
在下で、式１に示すグリオキサール誘導体を作用させて
化学発光性物質を導き、この物質の発光量からアデニル
基含有物質の量を高感度に測定する方法を見い出し、本
発明に至った。
解決するために鋭意研究を重ね、測定対象物質中のアデ
ニル基に、ヘテロポリ酸あるいはヘテロポリ酸の塩の存
在下で、式１に示すグリオキサール誘導体を作用させて
化学発光性物質を導き、この物質の発光量からアデニル
基含有物質の量を高感度に測定する方法を見い出し、本
発明に至った。
【０００５】すなわち、本発明は、測定対象物質中のア
デニル基に、ヘテロポリ酸あるいはヘテロポリ酸の塩の
存在下、グリオキサール誘導体を反応させて化学発光性
物質を誘導し、該化学発光性物質から得られた発光活性
を指標として該測定対象物質を測定するアデニル基含有
物質の測定方法を提供する。ヘテロポリ酸あるいはヘテ
ロポリ酸の塩が、タングストケイ酸、タングストリン
酸、タングストヒ酸、タングストゲルマニウム酸、モリ
ブドケイ酸、モリブドリン酸、モリブドヒ酸、モリブド
ゲルマニウム酸、バナドリン酸あるいはそれらの塩であ
るアデニル基含有物質の測定方法を提供する。そして、
ヘテロポリ酸あるいはヘテロポリ酸の塩が、タングスト
ケイ酸、タングストリン酸、タングストヒ酸、モリブド
ケイ酸、モリブドリン酸、モリブドヒ酸またはモリブド
リン酸ナトリウムからなる群から選ばれる１つであるの
が好ましい。さらに、ヘテロポリ酸あるいはヘテロポリ
酸の塩が、タングストケイ酸、タングストリン酸、モリ
ブドリン酸またはモリブドリン酸ナトリウムからなる群
から選ばれる１つであるのが好ましい。
デニル基に、ヘテロポリ酸あるいはヘテロポリ酸の塩の
存在下、グリオキサール誘導体を反応させて化学発光性
物質を誘導し、該化学発光性物質から得られた発光活性
を指標として該測定対象物質を測定するアデニル基含有
物質の測定方法を提供する。ヘテロポリ酸あるいはヘテ
ロポリ酸の塩が、タングストケイ酸、タングストリン
酸、タングストヒ酸、タングストゲルマニウム酸、モリ
ブドケイ酸、モリブドリン酸、モリブドヒ酸、モリブド
ゲルマニウム酸、バナドリン酸あるいはそれらの塩であ
るアデニル基含有物質の測定方法を提供する。そして、
ヘテロポリ酸あるいはヘテロポリ酸の塩が、タングスト
ケイ酸、タングストリン酸、タングストヒ酸、モリブド
ケイ酸、モリブドリン酸、モリブドヒ酸またはモリブド
リン酸ナトリウムからなる群から選ばれる１つであるの
が好ましい。さらに、ヘテロポリ酸あるいはヘテロポリ
酸の塩が、タングストケイ酸、タングストリン酸、モリ
ブドリン酸またはモリブドリン酸ナトリウムからなる群
から選ばれる１つであるのが好ましい。
【０００６】グリオキサール誘導体が下記式（１）で表
される記載のアデニル基含有物質の測定方法を提供す
る。 Ｒ1 −ＣＯ−Ｒ2 ・・・・・・（１） （式中、Ｒ1 は、水素原子；１〜１２個の炭素原子を含
むアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基；１〜
１８個の炭素原子を含むアリール基または芳香族性を有
する複素環式基であり、置換基を有してもあるいは置換
基が縮環してもよく、Ｒ2 は、アルデヒド基または、−
ＣＨ（ＸＲ3 ）（Ｘ’Ｒ4 ）で表される基であり、Ｘお
よびＸ’は、酸素原子、スルホキシド基、スルホン基、
硫黄原子、セレノキシド基、セレン原子から選択される
基のいずれかであって、互いに同一でも異なっていても
よく、Ｒ3 およびＲ4 は、水素原子；１〜１２個の炭素
原子を含むアルキル基、アルケニル基またはアルキニル
基；もしくは１〜１６個の炭素原子を含むアリール基で
あり、置換基を有してもあるいは置換基が縮環してもよ
く、該Ｒ3 およびＲ4 は、互いに同一でも異なっていて
もよく、また、Ｒ3 およびＲ4 の一部が互いに結合し、
環を形成していてもよい。）を提供する。そして、グリ
オキサール誘導体が、Ｒ1 は、水素原子；１〜８個の炭
素原子を含むアルキル基；フェニル基または１〜８個の
炭素原子を含む芳香族性を有する複素環式基のいずれか
であって 、置換基を有してもあるいは置換基が縮環し
てもよく、Ｒ2 は、アルデヒド基または、−ＣＨ（ＸＲ
3 ）（Ｘ’Ｒ4 ）で表される基であり、ＸおよびＸ’
は、酸素原子、硫黄原子のいずれかであって、互いに同
一でも異なっていてもよく、Ｒ3 およびＲ4 は、水素原
子；１〜４個の炭素原子を含むアルキル基またはフェニ
ル基であり、置換基を有してもあるいは置換基が縮環し
てもよく、該Ｒ3 およびＲ4 は、互いに同一でも異なっ
ていてもよく、また、Ｒ3 およびＲ4 の一部が互いに結
合し、環を形成していてもよい。であるのが好ましい。
される記載のアデニル基含有物質の測定方法を提供す
る。 Ｒ1 −ＣＯ−Ｒ2 ・・・・・・（１） （式中、Ｒ1 は、水素原子；１〜１２個の炭素原子を含
むアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基；１〜
１８個の炭素原子を含むアリール基または芳香族性を有
する複素環式基であり、置換基を有してもあるいは置換
基が縮環してもよく、Ｒ2 は、アルデヒド基または、−
ＣＨ（ＸＲ3 ）（Ｘ’Ｒ4 ）で表される基であり、Ｘお
よびＸ’は、酸素原子、スルホキシド基、スルホン基、
硫黄原子、セレノキシド基、セレン原子から選択される
基のいずれかであって、互いに同一でも異なっていても
よく、Ｒ3 およびＲ4 は、水素原子；１〜１２個の炭素
原子を含むアルキル基、アルケニル基またはアルキニル
基；もしくは１〜１６個の炭素原子を含むアリール基で
あり、置換基を有してもあるいは置換基が縮環してもよ
く、該Ｒ3 およびＲ4 は、互いに同一でも異なっていて
もよく、また、Ｒ3 およびＲ4 の一部が互いに結合し、
環を形成していてもよい。）を提供する。そして、グリ
オキサール誘導体が、Ｒ1 は、水素原子；１〜８個の炭
素原子を含むアルキル基；フェニル基または１〜８個の
炭素原子を含む芳香族性を有する複素環式基のいずれか
であって 、置換基を有してもあるいは置換基が縮環し
てもよく、Ｒ2 は、アルデヒド基または、−ＣＨ（ＸＲ
3 ）（Ｘ’Ｒ4 ）で表される基であり、ＸおよびＸ’
は、酸素原子、硫黄原子のいずれかであって、互いに同
一でも異なっていてもよく、Ｒ3 およびＲ4 は、水素原
子；１〜４個の炭素原子を含むアルキル基またはフェニ
ル基であり、置換基を有してもあるいは置換基が縮環し
てもよく、該Ｒ3 およびＲ4 は、互いに同一でも異なっ
ていてもよく、また、Ｒ3 およびＲ4 の一部が互いに結
合し、環を形成していてもよい。であるのが好ましい。
【０００７】グリオキサール誘導体が、メチルグリオキ
サール、メチルグリオキサールジメチルアセタール、エ
チルグリオキサールジメチルアセタール、ｎ−ブチルグ
リオキサールジメチルアセタール、ｎ−オクチルグリオ
キサールジメチルアセタール、フェニルグリオキサー
ル、フェニルグリオキサールジメチルアセタール、ｐ−
メチルフェニルグリオキサールまたはｐ−フルオロフェ
ニルグリオキサールからなる群から選ばれる１つである
のが好ましい。
サール、メチルグリオキサールジメチルアセタール、エ
チルグリオキサールジメチルアセタール、ｎ−ブチルグ
リオキサールジメチルアセタール、ｎ−オクチルグリオ
キサールジメチルアセタール、フェニルグリオキサー
ル、フェニルグリオキサールジメチルアセタール、ｐ−
メチルフェニルグリオキサールまたはｐ−フルオロフェ
ニルグリオキサールからなる群から選ばれる１つである
のが好ましい。
【０００８】測定対象物質が、アデニン、アデノシン、
アデノシンリン酸化合物、ＤＮＡまたはＲＮＡであるア
デニル基含有物質の測定方法を提供する。化学発光性物
質を、発光溶媒の存在下で反応開始剤を添加して発光活
性を測定するアデニル基含有物質の測定方法を提供す
る。
アデノシンリン酸化合物、ＤＮＡまたはＲＮＡであるア
デニル基含有物質の測定方法を提供する。化学発光性物
質を、発光溶媒の存在下で反応開始剤を添加して発光活
性を測定するアデニル基含有物質の測定方法を提供す
る。
【０００９】発光溶媒が、ジメチルホルムアミド、イソ
プロパノール、アセトニトリル、ジオキサンまたはジメ
チルスルホキシドからなる群から選ばれる１つであるの
が好ましい。
プロパノール、アセトニトリル、ジオキサンまたはジメ
チルスルホキシドからなる群から選ばれる１つであるの
が好ましい。
【００１０】測定対象物質が、標的核酸を該標的核酸と
相補的に結合する捕獲プローブを用いて検出するＤＮＡ
プローブ法における捕獲プローブと相補的に結合した該
標的核酸および／またはその増幅産物であるアデニル基
含有物質の測定方法を提供する。測定対象物質が、検体
中の標的核酸を核酸増幅法で増幅して検出する標的核酸
測定方法における、該標的核酸および／またはその増幅
産物であるアデニル基含有物質の測定方法を提供する。
測定対象物質が、検体中の被検物質の免疫反応を用いて
検出する免疫学的測定方法におけるアデニル基を有する
物質で標識した抗体および／または核酸で標識した抗体
の核酸を標的核酸として核酸増幅法で増幅して得られた
増幅産物、あるいはアデニル基を有する物質で標識した
抗原および／または核酸で標識した抗原の核酸を標的核
酸として核酸増幅法で増幅して得られた増幅産物である
アデニル基含有物質の測定方法を提供する。
相補的に結合する捕獲プローブを用いて検出するＤＮＡ
プローブ法における捕獲プローブと相補的に結合した該
標的核酸および／またはその増幅産物であるアデニル基
含有物質の測定方法を提供する。測定対象物質が、検体
中の標的核酸を核酸増幅法で増幅して検出する標的核酸
測定方法における、該標的核酸および／またはその増幅
産物であるアデニル基含有物質の測定方法を提供する。
測定対象物質が、検体中の被検物質の免疫反応を用いて
検出する免疫学的測定方法におけるアデニル基を有する
物質で標識した抗体および／または核酸で標識した抗体
の核酸を標的核酸として核酸増幅法で増幅して得られた
増幅産物、あるいはアデニル基を有する物質で標識した
抗原および／または核酸で標識した抗原の核酸を標的核
酸として核酸増幅法で増幅して得られた増幅産物である
アデニル基含有物質の測定方法を提供する。
【００１１】また、検体中の標的核酸を該標的核酸と相
補的に結合する捕獲プローブを用いて検出するＤＮＡプ
ローブ法において、該標的核酸もしくはその増幅産物の
アデニル基に、ヘテロポリ酸あるいはヘテロポリ酸の塩
の存在下、前記式１のグリオキサール誘導体を反応させ
て化学発光性物質を誘導し、該化学発光性物質から得ら
れた発光活性を指標として該標的核酸を測定する測定方
法を提供する。
補的に結合する捕獲プローブを用いて検出するＤＮＡプ
ローブ法において、該標的核酸もしくはその増幅産物の
アデニル基に、ヘテロポリ酸あるいはヘテロポリ酸の塩
の存在下、前記式１のグリオキサール誘導体を反応させ
て化学発光性物質を誘導し、該化学発光性物質から得ら
れた発光活性を指標として該標的核酸を測定する測定方
法を提供する。
【００１２】そして、検体中の標的核酸を核酸増幅法で
増幅して検出する標的核酸測定方法において、該標的核
酸もしくはその増幅産物のアデニル基に、ヘテロポリ酸
あるいはヘテロポリ酸の塩の存在下、前記式１のグリオ
キサール誘導体を反応させて化学発光性物質を誘導し、
該化学発光性物質から得られた発光活性を指標として該
標的核酸を測定することを特徴とする測定方法を提供す
る。
増幅して検出する標的核酸測定方法において、該標的核
酸もしくはその増幅産物のアデニル基に、ヘテロポリ酸
あるいはヘテロポリ酸の塩の存在下、前記式１のグリオ
キサール誘導体を反応させて化学発光性物質を誘導し、
該化学発光性物質から得られた発光活性を指標として該
標的核酸を測定することを特徴とする測定方法を提供す
る。
【００１３】また、検体中の被検物質の免疫反応を用い
て検出する免疫学的測定方法において、アデニル基を有
する物質で標識した抗体および／または核酸で標識した
抗体の核酸を標的核酸として核酸増幅法で増幅して得ら
れた増幅産物のアデニル基に、あるいはアデニル基を有
する物質で標識した抗原および／または核酸で標識した
抗原の核酸を標的核酸として核酸増幅法で増幅して得ら
れた増幅産物のアデニル基に、ヘテロポリ酸あるいはヘ
テロポリ酸の塩の存在下、前記式１のグリオキサール誘
導体を反応させて化学発光性物質を誘導し、該化学発光
性物質から得られた発光活性を指標として該被検物質を
測定することを特徴とするアデニル基含有物質の測定方
法を提供する。
て検出する免疫学的測定方法において、アデニル基を有
する物質で標識した抗体および／または核酸で標識した
抗体の核酸を標的核酸として核酸増幅法で増幅して得ら
れた増幅産物のアデニル基に、あるいはアデニル基を有
する物質で標識した抗原および／または核酸で標識した
抗原の核酸を標的核酸として核酸増幅法で増幅して得ら
れた増幅産物のアデニル基に、ヘテロポリ酸あるいはヘ
テロポリ酸の塩の存在下、前記式１のグリオキサール誘
導体を反応させて化学発光性物質を誘導し、該化学発光
性物質から得られた発光活性を指標として該被検物質を
測定することを特徴とするアデニル基含有物質の測定方
法を提供する。
【００１４】以下で、本発明を詳細に説明する。
【００１５】本発明の測定方法は、測定対象物質を含有
する試料について測定する。このような試料としては、
例えば、血液、体液、尿、組織、微生物の培養液および
それらの抽出物、さらにはそれらに含まれる核酸のポリ
メラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）等の増幅産物
が挙げられる。本発明の測定方法における測定対象物質
とは、アデニル基を含有する物質であり、アデニン、ア
デノシン、アデノシンリン酸化合物、ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ等が代表的であるが、アデニル基を含有する人工的な
修飾核酸の測定にも応用することができる。
する試料について測定する。このような試料としては、
例えば、血液、体液、尿、組織、微生物の培養液および
それらの抽出物、さらにはそれらに含まれる核酸のポリ
メラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）等の増幅産物
が挙げられる。本発明の測定方法における測定対象物質
とは、アデニル基を含有する物質であり、アデニン、ア
デノシン、アデノシンリン酸化合物、ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ等が代表的であるが、アデニル基を含有する人工的な
修飾核酸の測定にも応用することができる。
【００１６】本発明の測定方法では、まず、ヘテロポリ
酸あるいはヘテロポリ酸の塩の存在下、測定対象物質と
グリオキサール誘導体とを反応させて、化学発光性物質
を誘導する。ヘテロポリ酸またはその塩としては、タン
グストケイ酸、タングストリン酸、タングストヒ酸、タ
ングストゲルマニウム酸、モリブドケイ酸、モリブドリ
ン酸、モリブドヒ酸、モリブドゲルマニウム酸、バナド
リン酸あるいはそれらのナトリウム、カリウム、アンモ
ニウム等の塩が用いられている。好ましくは、タングス
トケイ酸、タングストリン酸、タングストヒ酸、モリブ
ドケイ酸、モリブドリン酸、モリブドヒ酸あるいはモリ
ブドリン酸ナトリウムが用いられている。さらに好まし
くは、タングストケイ酸、タングストリン酸およびモリ
ブドリン酸を用いたとき、良好な結果が得られる。この
とき用いるヘテロポリ酸あるいはヘテロポリ酸の塩の濃
度は、反応溶液中での終濃度で、０．００１〜１Ｍ、特
に０．００３〜０．２Ｍ、さらに０．０１〜０．１Ｍと
なるように用いることが好ましい。
酸あるいはヘテロポリ酸の塩の存在下、測定対象物質と
グリオキサール誘導体とを反応させて、化学発光性物質
を誘導する。ヘテロポリ酸またはその塩としては、タン
グストケイ酸、タングストリン酸、タングストヒ酸、タ
ングストゲルマニウム酸、モリブドケイ酸、モリブドリ
ン酸、モリブドヒ酸、モリブドゲルマニウム酸、バナド
リン酸あるいはそれらのナトリウム、カリウム、アンモ
ニウム等の塩が用いられている。好ましくは、タングス
トケイ酸、タングストリン酸、タングストヒ酸、モリブ
ドケイ酸、モリブドリン酸、モリブドヒ酸あるいはモリ
ブドリン酸ナトリウムが用いられている。さらに好まし
くは、タングストケイ酸、タングストリン酸およびモリ
ブドリン酸を用いたとき、良好な結果が得られる。この
とき用いるヘテロポリ酸あるいはヘテロポリ酸の塩の濃
度は、反応溶液中での終濃度で、０．００１〜１Ｍ、特
に０．００３〜０．２Ｍ、さらに０．０１〜０．１Ｍと
なるように用いることが好ましい。
【００１７】本発明の測定方法に用いるグリオキサール
誘導体とは、下記式（１）で表される物質であり、Ｒ1
およびＲ2 は、下記の置換基のうちから選択されるいず
れかの基である。 Ｒ1 −ＣＯ−Ｒ2 ・・・・・・（１） 式中、Ｒ1 は、水素原子；１〜１２個の炭素原子を含む
アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基；１〜１
８個の炭素原子を含むアリール基または芳香族性を有す
る複素環式基であり、置換基を有してもあるいは置換基
が縮環していてもよい。特に、Ｒ1 は、水素原子；１〜
８個の炭素原子を含むアルキル基；フェニル基または１
〜８個の炭素原子を含む芳香族性を有する複素環式基で
あるのが好ましく、置換基を有してもあるいは置換基が
縮環してもよい。さらに、Ｒ1 の具体例としては、メチ
ル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、
ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、フェニル基、メ
チルフェニル基、フルオロフェニル基、ニトロフェニル
基、メトキシフェニル基、フラニル基、ベンゾフラニル
基が挙げられる。
誘導体とは、下記式（１）で表される物質であり、Ｒ1
およびＲ2 は、下記の置換基のうちから選択されるいず
れかの基である。 Ｒ1 −ＣＯ−Ｒ2 ・・・・・・（１） 式中、Ｒ1 は、水素原子；１〜１２個の炭素原子を含む
アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基；１〜１
８個の炭素原子を含むアリール基または芳香族性を有す
る複素環式基であり、置換基を有してもあるいは置換基
が縮環していてもよい。特に、Ｒ1 は、水素原子；１〜
８個の炭素原子を含むアルキル基；フェニル基または１
〜８個の炭素原子を含む芳香族性を有する複素環式基で
あるのが好ましく、置換基を有してもあるいは置換基が
縮環してもよい。さらに、Ｒ1 の具体例としては、メチ
ル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、
ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、フェニル基、メ
チルフェニル基、フルオロフェニル基、ニトロフェニル
基、メトキシフェニル基、フラニル基、ベンゾフラニル
基が挙げられる。
【００１８】Ｒ2 は、アルデヒド基または、−ＣＨ（Ｘ
Ｒ3 ）（Ｘ’Ｒ4 ）で表される基であり、ＸおよびＸ’
は、酸素原子、スルホキシド基、スルホン基、硫黄原
子、セレノキシド基、セレン原子から選択される基のい
ずれかであって、互いに同一でも異なっていてもよい。
さらに、ＸおよびＸ’は、酸素原子、硫黄原子のいずれ
かであるのが好ましく、互いに同一でも異なっていても
よい。また、Ｒ2 の具体例としては、アルデヒド基、ア
セタール基、チオアセタール基等が挙げられる。Ｒ3 お
よびＲ4 は、水素原子；１〜１２個の炭素原子を含むア
ルキル基、アルケニル基またはアルキニル基；もしくは
１〜１６個の炭素原子を含むアリール基であり、置換基
を有してもあるいは置換基が縮環してもよい。該Ｒ3 お
よびＲ4は、互いに同一でも異なっていてもよい。ま
た、Ｒ3 およびＲ4 の一部が互いに結合し、環を形成し
ていてもよい。Ｒ3 およびＲ4 は、水素原子；１〜４個
の炭素原子を含むアルキル基またはフェニル基であっ
て、置換基を有してもあるいは置換基が縮環してもよ
い。該Ｒ3およびＲ4 は、互いに同一でも異なっていて
もよい。また、Ｒ3 およびＲ4 の一部が互いに結合し、
環を形成していてもよい。Ｒ3 およびＲ4 の具体例とし
ては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、Ｒ
3 とＲ4 が結合した場合のエチレン基等が挙げられ、特
に、メチル基であるのが、合成上有利な点で好ましい。
Ｒ3 ）（Ｘ’Ｒ4 ）で表される基であり、ＸおよびＸ’
は、酸素原子、スルホキシド基、スルホン基、硫黄原
子、セレノキシド基、セレン原子から選択される基のい
ずれかであって、互いに同一でも異なっていてもよい。
さらに、ＸおよびＸ’は、酸素原子、硫黄原子のいずれ
かであるのが好ましく、互いに同一でも異なっていても
よい。また、Ｒ2 の具体例としては、アルデヒド基、ア
セタール基、チオアセタール基等が挙げられる。Ｒ3 お
よびＲ4 は、水素原子；１〜１２個の炭素原子を含むア
ルキル基、アルケニル基またはアルキニル基；もしくは
１〜１６個の炭素原子を含むアリール基であり、置換基
を有してもあるいは置換基が縮環してもよい。該Ｒ3 お
よびＲ4は、互いに同一でも異なっていてもよい。ま
た、Ｒ3 およびＲ4 の一部が互いに結合し、環を形成し
ていてもよい。Ｒ3 およびＲ4 は、水素原子；１〜４個
の炭素原子を含むアルキル基またはフェニル基であっ
て、置換基を有してもあるいは置換基が縮環してもよ
い。該Ｒ3およびＲ4 は、互いに同一でも異なっていて
もよい。また、Ｒ3 およびＲ4 の一部が互いに結合し、
環を形成していてもよい。Ｒ3 およびＲ4 の具体例とし
ては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、Ｒ
3 とＲ4 が結合した場合のエチレン基等が挙げられ、特
に、メチル基であるのが、合成上有利な点で好ましい。
【００１９】Ｒ1 に置換もしくは縮環する基を有する場
合は、カルボキシル基；ヒドロキシル基；アミノ基；ア
ミド基；スルホンアミド基；スルフィド基；スルフォキ
シド基；スルホン基；ニトロ基；ハライド原子；メルカ
プト基；アシル基；アジド基；１〜１２個の炭素原子を
含むアルキルアミノ基、アルキル基、アルケニル基、ア
ルキニル基またはアルコキシ基；ポリアルコキシ基；ア
リール基；アリールオキシ基および複素環式基からなる
群から少なくとも１種の基が選択される。Ｒ1 に置換も
しくは縮環する基を有する場合は、カルボキシル基；ヒ
ドロキシル基；アミノ基；ニトロ基；ハライド原子；メ
ルカプト基；アセチル基；ベンゾイル基；１〜４個の炭
素原子を含むアルキルアミノ基、アルキル基、アルケニ
ル基またはアルコキシ基；アリール基およびアリールオ
キシ基からなる群から選択される少なくとも１種の基が
選択されるのが好ましい。さらに、Ｒ1 に置換もしくは
縮環する基としては、ニトロ基、フルオロ基、メトキシ
基、ベンゾイル基、アセチル基、アミノ基、メチル基、
フェニル基であるのが好ましい。さらに、Ｒ1 を置換も
しくは縮環する基自身は、カルボキシル基；ヒドロキシ
ル基；アミノ基；アミド基；スルホンアミド基；スルフ
ィド基、スルフォキシド基；スルホン基；ニトロ基；ハ
ライド原子；メルカプト基；アシル基；アジド基；１〜
１２個の炭素原子を含むアルキルアミノ基、アルキル
基、アルケニル基、アルキニル基またはアルコキシ基；
ポリアルコキシ基；アリール基；アリールオキシ基およ
び複素環式基からなる群から選択される少なくとも１種
の基で置換もしくは縮環していてもよい。また、Ｒ3 お
よびＲ4 に置換もしくは縮環する基を有する場合は、カ
ルボキシル基；ヒドロキシル基；アミノ基；アミド基；
スルホンアミド基；スルフィド基；スルフォキシド基；
スルホン基；ニトロ基；ハライド原子；メルカプト基；
アシル基；アジド基；１〜１２個の炭素原子を含むアル
キルアミノ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル
基またはアルコキシ基；ポリアルコキシ基；アリール
基；アリールオキシ基および複素環式基からなる群から
少なくとも１種の基が選択される。また、Ｒ3 およびＲ
4 に置換もしくは縮環する基を有する場合は、カルボキ
シル基；ヒドロキシル基；アミノ基；ニトロ基；ハライ
ド原子；メルカプト基；アセチル基；ベンゾイル基；１
〜４個の炭素原子を含むアルキルアミノ基、アルキル
基、アルケニル基またはアルコキシ基；アリール基およ
びアリールオキシ基からなる群から選択される少なくと
も１種の基が選択されるのが好ましい。さらに、Ｒ3 お
よびＲ4 を置換もしくは縮環する基自身は、カルボキシ
ル基；ヒドロキシル基；アミノ基；アミド基；スルホン
アミド基；スルフィド基、スルフォキシド基；スルホン
基；ニトロ基；ハライド原子；メルカプト基；アシル
基；アジド基；１〜１２個の炭素原子を含むアルキルア
ミノ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基また
はアルコキシ基；ポリアルコキシ基；アリール基；アリ
ールオキシ基および複素環式基からなる群から選択され
る少なくとも１種の基で置換もしくは縮環していてもよ
い。
合は、カルボキシル基；ヒドロキシル基；アミノ基；ア
ミド基；スルホンアミド基；スルフィド基；スルフォキ
シド基；スルホン基；ニトロ基；ハライド原子；メルカ
プト基；アシル基；アジド基；１〜１２個の炭素原子を
含むアルキルアミノ基、アルキル基、アルケニル基、ア
ルキニル基またはアルコキシ基；ポリアルコキシ基；ア
リール基；アリールオキシ基および複素環式基からなる
群から少なくとも１種の基が選択される。Ｒ1 に置換も
しくは縮環する基を有する場合は、カルボキシル基；ヒ
ドロキシル基；アミノ基；ニトロ基；ハライド原子；メ
ルカプト基；アセチル基；ベンゾイル基；１〜４個の炭
素原子を含むアルキルアミノ基、アルキル基、アルケニ
ル基またはアルコキシ基；アリール基およびアリールオ
キシ基からなる群から選択される少なくとも１種の基が
選択されるのが好ましい。さらに、Ｒ1 に置換もしくは
縮環する基としては、ニトロ基、フルオロ基、メトキシ
基、ベンゾイル基、アセチル基、アミノ基、メチル基、
フェニル基であるのが好ましい。さらに、Ｒ1 を置換も
しくは縮環する基自身は、カルボキシル基；ヒドロキシ
ル基；アミノ基；アミド基；スルホンアミド基；スルフ
ィド基、スルフォキシド基；スルホン基；ニトロ基；ハ
ライド原子；メルカプト基；アシル基；アジド基；１〜
１２個の炭素原子を含むアルキルアミノ基、アルキル
基、アルケニル基、アルキニル基またはアルコキシ基；
ポリアルコキシ基；アリール基；アリールオキシ基およ
び複素環式基からなる群から選択される少なくとも１種
の基で置換もしくは縮環していてもよい。また、Ｒ3 お
よびＲ4 に置換もしくは縮環する基を有する場合は、カ
ルボキシル基；ヒドロキシル基；アミノ基；アミド基；
スルホンアミド基；スルフィド基；スルフォキシド基；
スルホン基；ニトロ基；ハライド原子；メルカプト基；
アシル基；アジド基；１〜１２個の炭素原子を含むアル
キルアミノ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル
基またはアルコキシ基；ポリアルコキシ基；アリール
基；アリールオキシ基および複素環式基からなる群から
少なくとも１種の基が選択される。また、Ｒ3 およびＲ
4 に置換もしくは縮環する基を有する場合は、カルボキ
シル基；ヒドロキシル基；アミノ基；ニトロ基；ハライ
ド原子；メルカプト基；アセチル基；ベンゾイル基；１
〜４個の炭素原子を含むアルキルアミノ基、アルキル
基、アルケニル基またはアルコキシ基；アリール基およ
びアリールオキシ基からなる群から選択される少なくと
も１種の基が選択されるのが好ましい。さらに、Ｒ3 お
よびＲ4 を置換もしくは縮環する基自身は、カルボキシ
ル基；ヒドロキシル基；アミノ基；アミド基；スルホン
アミド基；スルフィド基、スルフォキシド基；スルホン
基；ニトロ基；ハライド原子；メルカプト基；アシル
基；アジド基；１〜１２個の炭素原子を含むアルキルア
ミノ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基また
はアルコキシ基；ポリアルコキシ基；アリール基；アリ
ールオキシ基および複素環式基からなる群から選択され
る少なくとも１種の基で置換もしくは縮環していてもよ
い。
【００２０】Ｒ1 は、誘導される発光物質の共鳴構造に
影響する基であり、上記の置換基群から選択することが
できる。また、Ｒ2 は、アデニル基に直接結合する基で
あり、アルデヒド基または−ＣＨ（ＸＲ3 ）（Ｘ'
Ｒ4 ）で表される基であって、Ｘ、Ｘ' 、Ｒ3 およびＲ
4 は、上記の置換基群から選択することができる。
影響する基であり、上記の置換基群から選択することが
できる。また、Ｒ2 は、アデニル基に直接結合する基で
あり、アルデヒド基または−ＣＨ（ＸＲ3 ）（Ｘ'
Ｒ4 ）で表される基であって、Ｘ、Ｘ' 、Ｒ3 およびＲ
4 は、上記の置換基群から選択することができる。
【００２１】本発明の測定方法に用いるグリオキサール
誘導体として、上述の式（１）で示される化合物として
は、具体的には、下記の各化合物が例示される。 メチルグリオキサール、メチルグリオキサールジメチル
アセタール、エチルグリオキサール、エチルグリオキサ
ールジメチルアセタール、ｎ−プロピルグリオキサー
ル、ｎ−プロピルグリオキサールジメチルアセタール、
ｎ−ブチルグリオキサール、ｎ−ブチルグリオキサール
ジメチルアセタール、ｎ−ペンチルグリオキサール、ｎ
−ペンチルグリオキサールジメチルアセタール、ｎ−ヘ
キシルグリオキサール、ｎ−ヘキシルグリオキサールジ
メチルアセタール、ｎ−ヘプチルグリオキサール、ｎ−
ペプチルグリオキサールジメチルアセタール、ｎ−オク
チルグリオキサール、ｎ−オクチルグリオキサールジメ
チルアセタール、フェニルグリオキサール、フェニルグ
リオキサールジメチルアセタール、ｐ−メチルフェニル
グリオキサール、ｐ−メチルフェニルグリオキサールジ
メチルアセタール、ｐ−フルオロフェニルグリオキサー
ル、ｐ−フルオロフェニルグリオキサールジメチルアセ
タール、ｐ−ニトロフェニルグリオキサール、ｐ−ニト
ロフェニルグリオキサールジメチルアセタール、ｐ−メ
トキシフェニルグリオキサール、ｐ−メトキシフェニル
グリオキサールジメチルアセタール、２−ベンゾフラニ
ルグリオキサール、２−ベンゾフラニルグリオキサール
ジメチルアセタール
誘導体として、上述の式（１）で示される化合物として
は、具体的には、下記の各化合物が例示される。 メチルグリオキサール、メチルグリオキサールジメチル
アセタール、エチルグリオキサール、エチルグリオキサ
ールジメチルアセタール、ｎ−プロピルグリオキサー
ル、ｎ−プロピルグリオキサールジメチルアセタール、
ｎ−ブチルグリオキサール、ｎ−ブチルグリオキサール
ジメチルアセタール、ｎ−ペンチルグリオキサール、ｎ
−ペンチルグリオキサールジメチルアセタール、ｎ−ヘ
キシルグリオキサール、ｎ−ヘキシルグリオキサールジ
メチルアセタール、ｎ−ヘプチルグリオキサール、ｎ−
ペプチルグリオキサールジメチルアセタール、ｎ−オク
チルグリオキサール、ｎ−オクチルグリオキサールジメ
チルアセタール、フェニルグリオキサール、フェニルグ
リオキサールジメチルアセタール、ｐ−メチルフェニル
グリオキサール、ｐ−メチルフェニルグリオキサールジ
メチルアセタール、ｐ−フルオロフェニルグリオキサー
ル、ｐ−フルオロフェニルグリオキサールジメチルアセ
タール、ｐ−ニトロフェニルグリオキサール、ｐ−ニト
ロフェニルグリオキサールジメチルアセタール、ｐ−メ
トキシフェニルグリオキサール、ｐ−メトキシフェニル
グリオキサールジメチルアセタール、２−ベンゾフラニ
ルグリオキサール、２−ベンゾフラニルグリオキサール
ジメチルアセタール
【００２２】特に、グリオキサール誘導体の好適な例と
しては、メチルグリオキサール、メチルグリオキサール
ジメチルアセタール、エチルグリオキサールジメチルア
セタール、ｎ−ブチルグリオキサールジメチルアセター
ル、ｎ−オクチルグリオキサール、フェニルグリオキサ
ール、フェニルグリオキサールジメチルアセタール、ｐ
−メチルフェニルグリオキサールおよびｐ−フルオロフ
ェニルグリオキサールが挙げられる。
しては、メチルグリオキサール、メチルグリオキサール
ジメチルアセタール、エチルグリオキサールジメチルア
セタール、ｎ−ブチルグリオキサールジメチルアセター
ル、ｎ−オクチルグリオキサール、フェニルグリオキサ
ール、フェニルグリオキサールジメチルアセタール、ｐ
−メチルフェニルグリオキサールおよびｐ−フルオロフ
ェニルグリオキサールが挙げられる。
【００２３】本発明の測定方法では、まず、ヘテロポリ
酸あるいはヘテロポリ酸の塩の存在下、測定対象物とグ
リオキサール誘導体とを反応させて、化学発光性物質を
誘導する。また、グリオキサール誘導体の濃度は、反応
溶液中での終濃度として、０．０１〜１Ｍとなるように
用いることが好ましく、終濃度として０．０５〜０．２
Ｍとなるように用いることがさらに好ましい。この反応
に使用する反応溶媒としては、一般の極性溶媒が使用可
能であるが、イソプロパノール（ｉ−ＰｒＯＨ）、エタ
ノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が特に好適
である。反応温度は、１０〜１５０℃が好ましく、７０
〜１１０℃とするのが反応を迅速に行うために特に好適
である。反応時間は、５〜１２０分、特に３０〜９０分
であるのがシグナルノイズ（Ｓ／Ｎ比および発光量の点
で好ましい。
酸あるいはヘテロポリ酸の塩の存在下、測定対象物とグ
リオキサール誘導体とを反応させて、化学発光性物質を
誘導する。また、グリオキサール誘導体の濃度は、反応
溶液中での終濃度として、０．０１〜１Ｍとなるように
用いることが好ましく、終濃度として０．０５〜０．２
Ｍとなるように用いることがさらに好ましい。この反応
に使用する反応溶媒としては、一般の極性溶媒が使用可
能であるが、イソプロパノール（ｉ−ＰｒＯＨ）、エタ
ノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が特に好適
である。反応温度は、１０〜１５０℃が好ましく、７０
〜１１０℃とするのが反応を迅速に行うために特に好適
である。反応時間は、５〜１２０分、特に３０〜９０分
であるのがシグナルノイズ（Ｓ／Ｎ比および発光量の点
で好ましい。
【００２４】次に、上記の反応で生じた化学発光性物質
あるいは化学発光性物質を含有する反応溶液に、発光溶
媒を加え、さらに、界面活性剤を適宜添加した反応開始
剤を加えて発光させる。そして、発光させた化学発光性
物質について、発光量を測定する。発光溶媒としては、
一般の極性溶媒が使用可能で、具体的には、ｉ−ＰｒＯ
Ｈ、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジオキサン、ア
セトニトリル、ジグリム、ＤＭＳＯ等が挙げられるが、
ＤＭＦ、ｉ−ＰｒＯＨ、アセトニトリル、ジオキサン、
およびＤＭＳＯが特に好適である。
あるいは化学発光性物質を含有する反応溶液に、発光溶
媒を加え、さらに、界面活性剤を適宜添加した反応開始
剤を加えて発光させる。そして、発光させた化学発光性
物質について、発光量を測定する。発光溶媒としては、
一般の極性溶媒が使用可能で、具体的には、ｉ−ＰｒＯ
Ｈ、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジオキサン、ア
セトニトリル、ジグリム、ＤＭＳＯ等が挙げられるが、
ＤＭＦ、ｉ−ＰｒＯＨ、アセトニトリル、ジオキサン、
およびＤＭＳＯが特に好適である。
【００２５】一般に、化学発光性物質の発光反応には、
酸化剤が必要であるが、本発明の測定方法では発光溶媒
に酸化剤を加えてもよいし、加えなくてもよい。酸化剤
としてはＨ2 Ｏ2 、尿素過酸化水素（Ｕｒｅａ Ｈｙｄ
ｒｏｇｅｎ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ）、金属過酸化物等が挙
げられるが、Ｈ2 Ｏ2 を加えての測定が好適である。酸
化剤にＨ2 Ｏ2を用いた場合のＨ2 Ｏ2濃度は、反応溶液
中での終濃度として、０〜３００ｍＭとなるように用い
ることが好ましく、終濃度として５〜１００ｍＭとなる
ように用いることがさらに好ましい。また、発光溶媒に
硫黄化合物を加えることにより、発光時間、発光量等を
調節することができる。硫黄化合物としてはＬ−システ
インエチルエステル、Ｌ−システイン、２−メルカプト
エタノール、ハイドロキシエチルジスルフィド、チオジ
グリコール等が挙げられるが、Ｌ−システインエチルエ
ステルまたはＬ−システインを加えての測定が好適であ
る。添加する硫黄化合物は、反応溶液中の終濃度として
０．１〜３００ｍＭとなるように用いることが好まし
く、終濃度として０．５〜１０ｍＭとなるように用いる
ことがさらに好ましい。
酸化剤が必要であるが、本発明の測定方法では発光溶媒
に酸化剤を加えてもよいし、加えなくてもよい。酸化剤
としてはＨ2 Ｏ2 、尿素過酸化水素（Ｕｒｅａ Ｈｙｄ
ｒｏｇｅｎ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ）、金属過酸化物等が挙
げられるが、Ｈ2 Ｏ2 を加えての測定が好適である。酸
化剤にＨ2 Ｏ2を用いた場合のＨ2 Ｏ2濃度は、反応溶液
中での終濃度として、０〜３００ｍＭとなるように用い
ることが好ましく、終濃度として５〜１００ｍＭとなる
ように用いることがさらに好ましい。また、発光溶媒に
硫黄化合物を加えることにより、発光時間、発光量等を
調節することができる。硫黄化合物としてはＬ−システ
インエチルエステル、Ｌ−システイン、２−メルカプト
エタノール、ハイドロキシエチルジスルフィド、チオジ
グリコール等が挙げられるが、Ｌ−システインエチルエ
ステルまたはＬ−システインを加えての測定が好適であ
る。添加する硫黄化合物は、反応溶液中の終濃度として
０．１〜３００ｍＭとなるように用いることが好まし
く、終濃度として０．５〜１０ｍＭとなるように用いる
ことがさらに好ましい。
【００２６】発光反応の反応開始剤としては、蒸留水が
好適である。また、発光時間、発光量等を調節するた
め、反応開始剤にアルカリ溶液、界面活性剤等の添加剤
を加えてもよい。反応開始剤にアルカリ溶液として水酸
化ナトリウム水溶液を添加した場合、反応溶液中の水酸
化ナトリウムの終濃度が０．０１〜１規定になるように
用いると発光量が増大する。反応開始剤を添加した直後
から５秒、特に２秒までの発光量を測定するのが、シグ
ナルノイズ比（Ｓ／Ｎ比）の点で好ましい。発光の検出
方法は、フォトンカウンター、Ｘ線フィルム等による方
法等が可能であるが、フォトンカウンター等を用いる
と、定量的に測定できるので好適である。
好適である。また、発光時間、発光量等を調節するた
め、反応開始剤にアルカリ溶液、界面活性剤等の添加剤
を加えてもよい。反応開始剤にアルカリ溶液として水酸
化ナトリウム水溶液を添加した場合、反応溶液中の水酸
化ナトリウムの終濃度が０．０１〜１規定になるように
用いると発光量が増大する。反応開始剤を添加した直後
から５秒、特に２秒までの発光量を測定するのが、シグ
ナルノイズ比（Ｓ／Ｎ比）の点で好ましい。発光の検出
方法は、フォトンカウンター、Ｘ線フィルム等による方
法等が可能であるが、フォトンカウンター等を用いる
と、定量的に測定できるので好適である。
【００２７】本発明の方法は、アデニル基に特異的であ
り、チミン、シトシン、グアニン、ウラシル等の核酸塩
基およびその誘導体の影響をほとんど受けない。アデニ
ンの誘導体で天然にも存在するメチル化アデニンは、そ
のままでは検出されない。このような本発明の方法の特
異性の高さは、検体中の測定対象物である標的核酸をこ
れと相補的配列を持つ捕獲プローブとハイブリダイズさ
せ、標的核酸を配列特異的に検出するＤＮＡプローブ法
において、有効に利用することができる。すなわち、
１）捕獲プローブをアデニル基を含まない様に設計す
る、２）捕獲プローブのアデニル基相当部分の塩基を欠
失させる、３）捕獲プローブ中のアデニル基を上記のよ
うな非活性基へ修飾もしくは置換する、などのように捕
獲プローブがグリオキサール誘導体と反応して化学発光
性物質を誘導しないような捕獲プローブを作製し、検体
と反応させた反応生成物を本発明の方法により測定すれ
ば、検体中の標的核酸由来のアデニル基のみが検出され
る。また、アデニル基を含む捕獲プローブをそのまま用
い、検出発光量から捕獲プローブ由来の発光量を差し引
いて標的核酸由来のアデニル基を測定することもでき
る。
り、チミン、シトシン、グアニン、ウラシル等の核酸塩
基およびその誘導体の影響をほとんど受けない。アデニ
ンの誘導体で天然にも存在するメチル化アデニンは、そ
のままでは検出されない。このような本発明の方法の特
異性の高さは、検体中の測定対象物である標的核酸をこ
れと相補的配列を持つ捕獲プローブとハイブリダイズさ
せ、標的核酸を配列特異的に検出するＤＮＡプローブ法
において、有効に利用することができる。すなわち、
１）捕獲プローブをアデニル基を含まない様に設計す
る、２）捕獲プローブのアデニル基相当部分の塩基を欠
失させる、３）捕獲プローブ中のアデニル基を上記のよ
うな非活性基へ修飾もしくは置換する、などのように捕
獲プローブがグリオキサール誘導体と反応して化学発光
性物質を誘導しないような捕獲プローブを作製し、検体
と反応させた反応生成物を本発明の方法により測定すれ
ば、検体中の標的核酸由来のアデニル基のみが検出され
る。また、アデニル基を含む捕獲プローブをそのまま用
い、検出発光量から捕獲プローブ由来の発光量を差し引
いて標的核酸由来のアデニル基を測定することもでき
る。
【００２８】従来のＤＮＡプローブ法は、捕獲プローブ
に結合した標的核酸に、さらに標識プローブもしくは標
識抗体を反応させるものであり、操作が煩雑であった
が、本発明のＤＮＡプローブを用いた測定方法は、捕獲
プローブに結合した標的核酸を直接測定可能で、標識剤
も不要であり、従来にない簡便で有用な方法である。た
とえば、ＤＮＡ合成機で、アデニン部分をＵｎｉ−Ｌｉ
ｎｋTMＡｍｉｎｏＭｏｄｉｆｉｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
社製）の様な架橋試薬で置換した捕獲プローブを作製
し、これをグルタルアルデヒドを用いてアミノ基を導入
したマイクロタイタープレートに不溶化する。このプレ
ートに検体を加えて反応させ、洗浄後、本発明の測定方
法にて、測定すれば、標的核酸が検出できる。
に結合した標的核酸に、さらに標識プローブもしくは標
識抗体を反応させるものであり、操作が煩雑であった
が、本発明のＤＮＡプローブを用いた測定方法は、捕獲
プローブに結合した標的核酸を直接測定可能で、標識剤
も不要であり、従来にない簡便で有用な方法である。た
とえば、ＤＮＡ合成機で、アデニン部分をＵｎｉ−Ｌｉ
ｎｋTMＡｍｉｎｏＭｏｄｉｆｉｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
社製）の様な架橋試薬で置換した捕獲プローブを作製
し、これをグルタルアルデヒドを用いてアミノ基を導入
したマイクロタイタープレートに不溶化する。このプレ
ートに検体を加えて反応させ、洗浄後、本発明の測定方
法にて、測定すれば、標的核酸が検出できる。
【００２９】さらに、本発明の測定方法は、検体中の標
的核酸をＰＣＲの様なポリメラーゼを用いた核酸増幅法
にて増幅して得られた反応溶液中の標的核酸およびその
増幅産物の両者、あるいは標的核酸またはその増幅産物
を測定する標的核酸測定方法に応用しても有用である。
すなわち、標的核酸の増幅プライマーとして、上記捕獲
プローブのように化学発光性物質を誘導させない目的の
ためにアデニル基を含まないように設計、あるいはアデ
ニル基を、欠失、あるいは修飾または置換して不活性化
させたＤＮＡを増幅プライマーとして用い、その増幅プ
ライマーと結合するビオチン、抗原等の特異結合物質
（予め増幅プライマーと同様にアデニル基の化学発光性
物質を誘導しないように設計、あるいは修飾したもの）
と化学的に結合させたものを使用し、標的核酸にＰＣＲ
を行って増幅した後、得られた反応溶液中の特異結合物
質をその特異結合物質が結合する物質（アビシン、スト
レプトアビジン、抗体等）を不溶化した固相と反応させ
る。洗浄後、ヘテロポリ酸あるいはヘテロポリ酸の塩の
存在下、グリオキサール誘導体として前記式１に示され
る物質を使用して、前述の方法で測定すれば、測定には
余剰であるプライマーは発光しないため、増幅反応後、
電気泳動などにより反応溶液中の増幅産物とプライマー
を分離することなしに標的核酸のＰＣＲ増幅産物由来の
発光のみが検出される。
的核酸をＰＣＲの様なポリメラーゼを用いた核酸増幅法
にて増幅して得られた反応溶液中の標的核酸およびその
増幅産物の両者、あるいは標的核酸またはその増幅産物
を測定する標的核酸測定方法に応用しても有用である。
すなわち、標的核酸の増幅プライマーとして、上記捕獲
プローブのように化学発光性物質を誘導させない目的の
ためにアデニル基を含まないように設計、あるいはアデ
ニル基を、欠失、あるいは修飾または置換して不活性化
させたＤＮＡを増幅プライマーとして用い、その増幅プ
ライマーと結合するビオチン、抗原等の特異結合物質
（予め増幅プライマーと同様にアデニル基の化学発光性
物質を誘導しないように設計、あるいは修飾したもの）
と化学的に結合させたものを使用し、標的核酸にＰＣＲ
を行って増幅した後、得られた反応溶液中の特異結合物
質をその特異結合物質が結合する物質（アビシン、スト
レプトアビジン、抗体等）を不溶化した固相と反応させ
る。洗浄後、ヘテロポリ酸あるいはヘテロポリ酸の塩の
存在下、グリオキサール誘導体として前記式１に示され
る物質を使用して、前述の方法で測定すれば、測定には
余剰であるプライマーは発光しないため、増幅反応後、
電気泳動などにより反応溶液中の増幅産物とプライマー
を分離することなしに標的核酸のＰＣＲ増幅産物由来の
発光のみが検出される。
【００３０】近年開発されたＰＣＲ法をはじめとする核
酸増幅法の進歩に伴い、増幅された核酸の定量は、生化
学の基礎研究から医学における臨床応用まで幅広くその
重要性を増している。本発明の測定方法は、これら増幅
された核酸を、短時間で簡便に測定することが可能であ
り、さらに測定値は、アデニル基の量に依存するため、
蛍光色素法のように核酸の一本鎖および二本鎖の違いに
よるの影響を受けることがない。
酸増幅法の進歩に伴い、増幅された核酸の定量は、生化
学の基礎研究から医学における臨床応用まで幅広くその
重要性を増している。本発明の測定方法は、これら増幅
された核酸を、短時間で簡便に測定することが可能であ
り、さらに測定値は、アデニル基の量に依存するため、
蛍光色素法のように核酸の一本鎖および二本鎖の違いに
よるの影響を受けることがない。
【００３１】本発明の測定方法は、核酸の検出法以外の
以外の方法にも応用可能である。すなわち、検体中の被
検物質の免疫反応を用いて検出する免疫学的測定方法に
おいて、抗体あるいは抗原の標識物質としてアデニンの
ポリマーを用いることにより、核酸同様にアデニン発光
により、検体中の被検物質の量を求めることができる。
また、標識物質として核酸を用いた場合は、ＰＣＲ法に
より核酸を増幅後、ＰＣＲ増幅産物をアデニン発光によ
り測定することで、検体中の被検物質の量を求めること
ができる。例えば、アデニル基を有する物質で標識した
抗体または核酸あるいはそれらの混合物で標識した抗体
の核酸を標的核酸としてポリメラーゼを用いた核酸増幅
法で増幅して得られた増幅産物のアデニル基に、あるい
はアデニル基を有する物質で標識した抗原または核酸あ
るいはそれらの混合物で標識した核酸を標的核酸として
ポリメラーゼを用いた核酸増幅法で増幅して得られた増
幅産物のアデニル基に、ヘテロポリ酸あるいはヘテロポ
リ酸の塩の存在下、前述の式１のグリオキサール誘導体
を反応させて化学発光性物質を誘導し、その化学発光性
物質から得られた発光活性を指標としてその被検物質を
測定することができる。
以外の方法にも応用可能である。すなわち、検体中の被
検物質の免疫反応を用いて検出する免疫学的測定方法に
おいて、抗体あるいは抗原の標識物質としてアデニンの
ポリマーを用いることにより、核酸同様にアデニン発光
により、検体中の被検物質の量を求めることができる。
また、標識物質として核酸を用いた場合は、ＰＣＲ法に
より核酸を増幅後、ＰＣＲ増幅産物をアデニン発光によ
り測定することで、検体中の被検物質の量を求めること
ができる。例えば、アデニル基を有する物質で標識した
抗体または核酸あるいはそれらの混合物で標識した抗体
の核酸を標的核酸としてポリメラーゼを用いた核酸増幅
法で増幅して得られた増幅産物のアデニル基に、あるい
はアデニル基を有する物質で標識した抗原または核酸あ
るいはそれらの混合物で標識した核酸を標的核酸として
ポリメラーゼを用いた核酸増幅法で増幅して得られた増
幅産物のアデニル基に、ヘテロポリ酸あるいはヘテロポ
リ酸の塩の存在下、前述の式１のグリオキサール誘導体
を反応させて化学発光性物質を誘導し、その化学発光性
物質から得られた発光活性を指標としてその被検物質を
測定することができる。
【００３２】
【実施例】以下、本発明の実施例を挙げ、本発明をより
具体的に説明する。
具体的に説明する。
【００３３】（実施例１）フェニルグリオキサールを用
いたアデニン検量線の作成 アデニンを少量の０．１規定の塩酸で溶解後、ｉ−Ｐｒ
ＯＨにより０〜１×１０-3Ｍの希釈列を作成した。各濃
度の試料溶液１００μｌをガラスバイアルにとり、０．
４Ｍフェニルグリオキサールおよび０．１９６Ｍタング
ストケイ酸のｉ−ＰｒＯＨ溶液をそれぞれ５０μｌ加
え、密栓し、１００℃で、１時間加熱した。得られた反
応溶液を冷却した後、この反応溶液を用いて、以下の手
順で化学発光の測定を行った。測定用ガラスチューブに
反応溶液１０μｌを採り、５０ｍＭ過酸化水素および５
ｍＭシステインエチルエステル（ＣｙｓＥ）を含むＤＭ
Ｆ４００μｌを添加し混和した。この測定用サンプルチ
ューブを化学発光測定器（ＬＢ９５２Ｔ／１６ Ｂｅｒ
ｔｈｏｌｄ社製）にセットし、蒸留水３００μｌを添加
して発光を開始させ、添加直後から２秒間の発光量（Ｒ
ＬＵ）を測定した。得られた発光強度からアデニンの検
量線を作成したところ、図１に示す通り、１×１０-6〜
１×１０-3Ｍの間で良好な用量反応曲線が得られた。図
１中、横軸はアデニンの濃度を示し、縦軸はアデニンの
各濃度での発光強度を示す。
いたアデニン検量線の作成 アデニンを少量の０．１規定の塩酸で溶解後、ｉ−Ｐｒ
ＯＨにより０〜１×１０-3Ｍの希釈列を作成した。各濃
度の試料溶液１００μｌをガラスバイアルにとり、０．
４Ｍフェニルグリオキサールおよび０．１９６Ｍタング
ストケイ酸のｉ−ＰｒＯＨ溶液をそれぞれ５０μｌ加
え、密栓し、１００℃で、１時間加熱した。得られた反
応溶液を冷却した後、この反応溶液を用いて、以下の手
順で化学発光の測定を行った。測定用ガラスチューブに
反応溶液１０μｌを採り、５０ｍＭ過酸化水素および５
ｍＭシステインエチルエステル（ＣｙｓＥ）を含むＤＭ
Ｆ４００μｌを添加し混和した。この測定用サンプルチ
ューブを化学発光測定器（ＬＢ９５２Ｔ／１６ Ｂｅｒ
ｔｈｏｌｄ社製）にセットし、蒸留水３００μｌを添加
して発光を開始させ、添加直後から２秒間の発光量（Ｒ
ＬＵ）を測定した。得られた発光強度からアデニンの検
量線を作成したところ、図１に示す通り、１×１０-6〜
１×１０-3Ｍの間で良好な用量反応曲線が得られた。図
１中、横軸はアデニンの濃度を示し、縦軸はアデニンの
各濃度での発光強度を示す。
【００３４】（実施例２）メチルグリオキサールジメチ
ルアセタールを用いたアデニン検量線の作成 アデニンを少量の０．１規定の塩酸で溶解後、ｉ−Ｐｒ
ＯＨにより０〜１×１０-3Ｍの希釈列を作成した。各濃
度の試料溶液１００μｌをガラスバイアルにとり、０．
４Ｍメチルグリオキサールジメチルアセタール（ＭＧ
Ａ）および０．１９６Ｍタングストケイ酸のｉ−ＰｒＯ
Ｈ溶液をそれぞれ５０μｌ加え、密栓し、１００℃で、
１時間加熱した。得られた反応溶液を冷却した後、この
反応溶液を用いて、実施例１に従って発光量（ＲＬＵ）
を測定した。得られた発光強度からアデニンの検量線を
作成したところ、図２に示す通り、１×１０-7〜１×１
０-3Ｍの間で良好な用量反応曲線が得られた。図２中、
横軸はアデニンの濃度を示し、縦軸はアデニンの各濃度
での発光強度を示す。
ルアセタールを用いたアデニン検量線の作成 アデニンを少量の０．１規定の塩酸で溶解後、ｉ−Ｐｒ
ＯＨにより０〜１×１０-3Ｍの希釈列を作成した。各濃
度の試料溶液１００μｌをガラスバイアルにとり、０．
４Ｍメチルグリオキサールジメチルアセタール（ＭＧ
Ａ）および０．１９６Ｍタングストケイ酸のｉ−ＰｒＯ
Ｈ溶液をそれぞれ５０μｌ加え、密栓し、１００℃で、
１時間加熱した。得られた反応溶液を冷却した後、この
反応溶液を用いて、実施例１に従って発光量（ＲＬＵ）
を測定した。得られた発光強度からアデニンの検量線を
作成したところ、図２に示す通り、１×１０-7〜１×１
０-3Ｍの間で良好な用量反応曲線が得られた。図２中、
横軸はアデニンの濃度を示し、縦軸はアデニンの各濃度
での発光強度を示す。
【００３５】（実施例３）メチルグリオキサールジメチ
ルアセタールを用いたＤＮＡ、Ｐｏｌｙ Ａ、Ｐｏｌｙ
ｄＡ検量線の作成 Ｐｏｌｙ ｄＡ（ファルマシア社製）、Ｐｏｌｙ Ａ
（ファルマシア社製）、ＤＮＡ（サケ精子、ファルマシ
ア社製）を少量の蒸留水で溶解後、ｉ−ＰｒＯＨにより
０〜０．２ｍｇの希釈列を作成した。各濃度の試料溶液
１００μｌをガラスバイアルにとり、０．４Ｍメチルグ
リオキサールジメチルアセタール（ＭＧＡ）および０．
１９６Ｍタングストケイ酸のｉ−ＰｒＯＨ溶液をそれぞ
れ５０μｌ加え、密栓し、１００℃で、１時間加熱し
た。得られた反応溶液を冷却した後、この反応溶液を用
いて、実施例１に従って発光量（ＲＬＵ）を測定した。
得られた発光強度からＤＮＡ、Ｐｏｌｙ Ａ、Ｐｏｌｙ
ｄＡの検量線を作成したところ、図３に示す通り、１
×１０-4〜０．２ｍｇの間で良好な直線関係が得られ
た。図３中、横軸はＤＮＡ、Ｐｏｌｙ Ａ、Ｐｏｌｙ
ｄＡの濃度を示し、縦軸はＤＮＡ、Ｐｏｌｙ Ａ、Ｐｏ
ｌｙ ｄＡの各濃度での発光強度を示す。
ルアセタールを用いたＤＮＡ、Ｐｏｌｙ Ａ、Ｐｏｌｙ
ｄＡ検量線の作成 Ｐｏｌｙ ｄＡ（ファルマシア社製）、Ｐｏｌｙ Ａ
（ファルマシア社製）、ＤＮＡ（サケ精子、ファルマシ
ア社製）を少量の蒸留水で溶解後、ｉ−ＰｒＯＨにより
０〜０．２ｍｇの希釈列を作成した。各濃度の試料溶液
１００μｌをガラスバイアルにとり、０．４Ｍメチルグ
リオキサールジメチルアセタール（ＭＧＡ）および０．
１９６Ｍタングストケイ酸のｉ−ＰｒＯＨ溶液をそれぞ
れ５０μｌ加え、密栓し、１００℃で、１時間加熱し
た。得られた反応溶液を冷却した後、この反応溶液を用
いて、実施例１に従って発光量（ＲＬＵ）を測定した。
得られた発光強度からＤＮＡ、Ｐｏｌｙ Ａ、Ｐｏｌｙ
ｄＡの検量線を作成したところ、図３に示す通り、１
×１０-4〜０．２ｍｇの間で良好な直線関係が得られ
た。図３中、横軸はＤＮＡ、Ｐｏｌｙ Ａ、Ｐｏｌｙ
ｄＡの濃度を示し、縦軸はＤＮＡ、Ｐｏｌｙ Ａ、Ｐｏ
ｌｙ ｄＡの各濃度での発光強度を示す。
【００３６】（実施例４）アデニン発光におけるヘテロ
ポリ酸の効果 ｉ）アデニンを少量の０．１規定の塩酸で溶解後、ｉ−
ＰｒＯＨを用いて希釈し、それぞれ１×１０-4、５×１
０-4、１×１０-3Ｍの試料を作成した。各濃度の試料溶
液１００μｌをガラスバイアルにとり、０．４Ｍメチル
グリオキサールジメチルアセタール（ＭＧＡ）および
０．１９６Ｍタングストケイ酸のｉ−ＰｒＯＨ溶液もし
くは１．２規定塩酸のｉ−ＰｒＯＨ溶液のうちいずれか
をそれぞれ５０μｌ加え、密栓し、１００℃で、１時間
加熱した。得られた反応溶液を冷却した後、タングスト
ケイ酸を加えた方の反応溶液は、実施例１に従って発光
量を測定した。塩酸を加えた方の反応溶液は、以下の手
順で化学発光の測定を行った。測定用ガラスチューブに
反応溶液１０μｌを採り、５ｍＭシステインエチルエス
テル（ＣｙｓＥ）を含むＤＭＦ４００μｌを添加し混和
した。この測定用サンプルチューブを化学発光測定器に
セットし、０．２５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液３００μ
ｌを添加して発光を開始させ、添加直後から２秒間の発
光量（ＲＬＵ）を測定した。得られた発光強度からシグ
ナル・ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を計算したところ、図４に
示すとおり、タングストケイ酸を用いた系では塩酸を用
いた系と比較し、著しくＳ／Ｎ比が向上した。 ｉｉ）アデニンを少量の０．１規定の塩酸で溶解後、ｉ
−ＰｒＯＨにより１×１０-4Ｍの試料溶液を作成した。
試料溶液１００μｌをガラスバイアルにとり、０．４Ｍ
メチルグリオキサールジメチルアセタール（ＭＧＡ）
に、０．１９６Ｍタングストケイ酸（ＷＳｉ）、タング
ストリン酸（ＷＰ）、モリブドリン酸（ＭｏＰ）もしく
はモリブドリン酸ナトリウム（ＭｏＰＮａ）のうちいず
れか１種のヘテロポリ酸またはヘテロポリ酸の塩のｉ−
ＰｒＯＨ溶液をそれぞれ５０μｌ加え、密栓し、１００
℃で、１時間加熱した。対照として、アデニンを含有し
ない試料溶液についても同様の処理を行った。得られた
反応溶液を冷却した後、この反応溶液を用いて、実施例
１に従って発光量（ＲＬＵ）を測定した。４種類のヘテ
ロポリ酸すべてについて触媒活性が認められた（図
５）。図５中、アデニン（＋）は、アデニンを添加した
試料の発光強度を示し、アデニン（−）は、アデニン無
添加の対照試料の発光強度を示す。
ポリ酸の効果 ｉ）アデニンを少量の０．１規定の塩酸で溶解後、ｉ−
ＰｒＯＨを用いて希釈し、それぞれ１×１０-4、５×１
０-4、１×１０-3Ｍの試料を作成した。各濃度の試料溶
液１００μｌをガラスバイアルにとり、０．４Ｍメチル
グリオキサールジメチルアセタール（ＭＧＡ）および
０．１９６Ｍタングストケイ酸のｉ−ＰｒＯＨ溶液もし
くは１．２規定塩酸のｉ−ＰｒＯＨ溶液のうちいずれか
をそれぞれ５０μｌ加え、密栓し、１００℃で、１時間
加熱した。得られた反応溶液を冷却した後、タングスト
ケイ酸を加えた方の反応溶液は、実施例１に従って発光
量を測定した。塩酸を加えた方の反応溶液は、以下の手
順で化学発光の測定を行った。測定用ガラスチューブに
反応溶液１０μｌを採り、５ｍＭシステインエチルエス
テル（ＣｙｓＥ）を含むＤＭＦ４００μｌを添加し混和
した。この測定用サンプルチューブを化学発光測定器に
セットし、０．２５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液３００μ
ｌを添加して発光を開始させ、添加直後から２秒間の発
光量（ＲＬＵ）を測定した。得られた発光強度からシグ
ナル・ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を計算したところ、図４に
示すとおり、タングストケイ酸を用いた系では塩酸を用
いた系と比較し、著しくＳ／Ｎ比が向上した。 ｉｉ）アデニンを少量の０．１規定の塩酸で溶解後、ｉ
−ＰｒＯＨにより１×１０-4Ｍの試料溶液を作成した。
試料溶液１００μｌをガラスバイアルにとり、０．４Ｍ
メチルグリオキサールジメチルアセタール（ＭＧＡ）
に、０．１９６Ｍタングストケイ酸（ＷＳｉ）、タング
ストリン酸（ＷＰ）、モリブドリン酸（ＭｏＰ）もしく
はモリブドリン酸ナトリウム（ＭｏＰＮａ）のうちいず
れか１種のヘテロポリ酸またはヘテロポリ酸の塩のｉ−
ＰｒＯＨ溶液をそれぞれ５０μｌ加え、密栓し、１００
℃で、１時間加熱した。対照として、アデニンを含有し
ない試料溶液についても同様の処理を行った。得られた
反応溶液を冷却した後、この反応溶液を用いて、実施例
１に従って発光量（ＲＬＵ）を測定した。４種類のヘテ
ロポリ酸すべてについて触媒活性が認められた（図
５）。図５中、アデニン（＋）は、アデニンを添加した
試料の発光強度を示し、アデニン（−）は、アデニン無
添加の対照試料の発光強度を示す。
【００３７】（実施例５）各種グリオキサール化合物を
用いたアデニン発光 ｉ）フェニルグリオキサール（ＰＧ）およびＴ．Ｈ．Ｃ
ｈａｎらの方法（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２０３−２０５
（１９８３））により合成したフェニルグリオキサール
ジメチルアセタール（ＰＧＡ）、Ｍ．Ｂｒａｗｎｅｒ
Ｆｌｏｙｄらの方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５０，５
０２２−５０２７（１９８５））により合成したｐ−メ
チルフェニルグリオキサール（ＭＰＧ）、ｐ−フルオロ
フェニルグリオキサール（ＦＰＧ）の各グリオキサール
化合物の０．４Ｍｉ−ＰｒＯＨ溶液を調製した。アデニ
ンを少量の０．１規定の塩酸で溶解後、ｉ−ＰｒＯＨを
用いて希釈し、それぞれ１×１０-4Ｍの試料を作成し
た。試料溶液１００μｌをガラスバイアルにとり、上記
で調製した０．４Ｍグリオキサール化合物（ＰＧ、ＰＧ
Ａ、ＭＰＧまたはＦＰＧ）溶液および０．１９６Ｍタン
グストケイ酸のｉ−ＰｒＯＨ溶液をそれぞれ５０μｌ加
え、密栓し、１００℃で、１時間加熱した。得られた反
応溶液を冷却した後、この反応溶液を用いて、実施例１
に従って発光量（ＲＬＵ）を測定した。４種類のグリオ
キサール化合物すべてについて発光活性が認められた
（図６）。図６中、アデニン（＋）は、アデニン添加試
料の発光強度を示し、アデニン（−）は、アデニン無添
加の対照試料の発光強度を示す。 ｉｉ）メチルグリオキサール（ＭＧ）、メチルグリオキ
サールジメチルアセタール（ＭＧＡ）、およびＳｅｒｒ
ａｔｏｓａの方法（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１６，１
８５−１９１（１９６１））により合成したエチルグリ
オキサールジメチルアセタール（ＥＧＡ）、ｎ−ブチル
グリオキサールジメチルアセタール（ＢｕＧＡ）および
ｎ−オクチルグリオキサールジメチルアセタール（Ｏｃ
ＧＡ）の５種類のグリオキサール誘導体を、ｉ−ＰｒＯ
Ｈに溶解し、０．４Ｍ溶液を調製した。アデニンを少量
の０．１規定の塩酸で溶解後、ｉ−ＰｒＯＨを用いて希
釈し、それぞれ１×１０-4Ｍの試料を作成した。試料溶
液１００μｌをガラスバイアルにとり、上記で調製した
０．４Ｍグリオキサール化合物（ＭＧ、ＭＧＡ、ＥＧ
Ａ、ＢｕＧＡまたはＯｃＧＡ）溶液および０．１９６Ｍ
タングストケイ酸のｉ−ＰｒＯＨ溶液をそれぞれ５０μ
ｌ加え、密栓し、１００℃で、１時間加熱した。対照と
して、アデニンを含有しない試料溶液についても同様の
処理を行った。得られた反応溶液を冷却した後、この反
応溶液を用いて、実施例１に従って発光量（ＲＬＵ）を
測定した。５種類のグリオキサール化合物すべてについ
て発光活性が認められた（図７）。図７中、アデニン
（＋）は、アデニンを添加した試料の発光強度を示し、
アデニン（−）は、アデニン無添加の対照試料の発光強
度を示す。
用いたアデニン発光 ｉ）フェニルグリオキサール（ＰＧ）およびＴ．Ｈ．Ｃ
ｈａｎらの方法（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２０３−２０５
（１９８３））により合成したフェニルグリオキサール
ジメチルアセタール（ＰＧＡ）、Ｍ．Ｂｒａｗｎｅｒ
Ｆｌｏｙｄらの方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５０，５
０２２−５０２７（１９８５））により合成したｐ−メ
チルフェニルグリオキサール（ＭＰＧ）、ｐ−フルオロ
フェニルグリオキサール（ＦＰＧ）の各グリオキサール
化合物の０．４Ｍｉ−ＰｒＯＨ溶液を調製した。アデニ
ンを少量の０．１規定の塩酸で溶解後、ｉ−ＰｒＯＨを
用いて希釈し、それぞれ１×１０-4Ｍの試料を作成し
た。試料溶液１００μｌをガラスバイアルにとり、上記
で調製した０．４Ｍグリオキサール化合物（ＰＧ、ＰＧ
Ａ、ＭＰＧまたはＦＰＧ）溶液および０．１９６Ｍタン
グストケイ酸のｉ−ＰｒＯＨ溶液をそれぞれ５０μｌ加
え、密栓し、１００℃で、１時間加熱した。得られた反
応溶液を冷却した後、この反応溶液を用いて、実施例１
に従って発光量（ＲＬＵ）を測定した。４種類のグリオ
キサール化合物すべてについて発光活性が認められた
（図６）。図６中、アデニン（＋）は、アデニン添加試
料の発光強度を示し、アデニン（−）は、アデニン無添
加の対照試料の発光強度を示す。 ｉｉ）メチルグリオキサール（ＭＧ）、メチルグリオキ
サールジメチルアセタール（ＭＧＡ）、およびＳｅｒｒ
ａｔｏｓａの方法（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１６，１
８５−１９１（１９６１））により合成したエチルグリ
オキサールジメチルアセタール（ＥＧＡ）、ｎ−ブチル
グリオキサールジメチルアセタール（ＢｕＧＡ）および
ｎ−オクチルグリオキサールジメチルアセタール（Ｏｃ
ＧＡ）の５種類のグリオキサール誘導体を、ｉ−ＰｒＯ
Ｈに溶解し、０．４Ｍ溶液を調製した。アデニンを少量
の０．１規定の塩酸で溶解後、ｉ−ＰｒＯＨを用いて希
釈し、それぞれ１×１０-4Ｍの試料を作成した。試料溶
液１００μｌをガラスバイアルにとり、上記で調製した
０．４Ｍグリオキサール化合物（ＭＧ、ＭＧＡ、ＥＧ
Ａ、ＢｕＧＡまたはＯｃＧＡ）溶液および０．１９６Ｍ
タングストケイ酸のｉ−ＰｒＯＨ溶液をそれぞれ５０μ
ｌ加え、密栓し、１００℃で、１時間加熱した。対照と
して、アデニンを含有しない試料溶液についても同様の
処理を行った。得られた反応溶液を冷却した後、この反
応溶液を用いて、実施例１に従って発光量（ＲＬＵ）を
測定した。５種類のグリオキサール化合物すべてについ
て発光活性が認められた（図７）。図７中、アデニン
（＋）は、アデニンを添加した試料の発光強度を示し、
アデニン（−）は、アデニン無添加の対照試料の発光強
度を示す。
【００３８】（実施例６）メチルグリオキサールジメチ
ルアセタールによる各種核酸塩基の測定 ｉ）アデニル基含有物質のうちアデニン、アデノシン、
アデニル酸、ＰｏｌｙｄＡ（ファルマシア社製）、Ｐｏ
ｌｙ Ａ（ファルマシア社製）、ＤＮＡ（サケ精子、フ
ァルマシア社製）を少量の蒸留水で溶解後、ｉ−ＰｒＯ
Ｈにより希釈し２６０ｎｍの吸光度を指標にして試料を
調製した。すなわち、２６０ｎｍの吸光度が同一の溶液
を調製し試料溶液とした。各試料溶液１００μｌをガラ
スバイアルにとり、０．４Ｍメチルグリオキサールジメ
チルアセタール（ＭＧＡ）および０．１９６Ｍタングス
トケイ酸のｉ−ＰｒＯＨ溶液をそれぞれ５０μｌ加え、
密栓し、１００℃で、１時間加熱した。得られた反応溶
液を冷却した後、この反応溶液を用いて、実施例１に従
って発光量を測定した。図８に示すとおり、アデニル基
含有物質はすべて発光が見られた。図８中、各物質の発
光量（ＲＬＵ）は、各試料溶液の２６０ｎｍの吸光度１
あたりの値を示した。 ｉｉ）また、アデニル基を含まないグアニン、チミン、
シトシン、ウラシル、グアノシン、シチジン、チミジ
ン、ウリジンの各物質を少量の０．１規定の塩酸で溶解
後、ｉ−ＰｒＯＨにより５×１０-5Ｍまで希釈し試料溶
液とした。各試料溶液１００μｌをガラスバイアルにと
り、０．４Ｍメチルグリオキサールジメチルアセタール
（ＭＧＡ）および０．１９６Ｍタングストケイ酸のｉ−
ＰｒＯＨ溶液をそれぞれ５０μｌ加え、密栓し、１００
℃で、１時間加熱した。得られた反応溶液を冷却した
後、この反応溶液を用いて、実施例１に従って発光量
（ＲＬＵ）を測定した。その結果、下記表１に示すよう
にアデニル基を含まない物質では発光を認めなかった。
表１中ＲＬＵ比とは各検体のＲＬＵを、６−ｉ）で得ら
れたアデニンのＲＬＵを１００としたときの比で表した
ものであり、比較のため６−ｉ）で得られたアデノシン
についても記載した。
ルアセタールによる各種核酸塩基の測定 ｉ）アデニル基含有物質のうちアデニン、アデノシン、
アデニル酸、ＰｏｌｙｄＡ（ファルマシア社製）、Ｐｏ
ｌｙ Ａ（ファルマシア社製）、ＤＮＡ（サケ精子、フ
ァルマシア社製）を少量の蒸留水で溶解後、ｉ−ＰｒＯ
Ｈにより希釈し２６０ｎｍの吸光度を指標にして試料を
調製した。すなわち、２６０ｎｍの吸光度が同一の溶液
を調製し試料溶液とした。各試料溶液１００μｌをガラ
スバイアルにとり、０．４Ｍメチルグリオキサールジメ
チルアセタール（ＭＧＡ）および０．１９６Ｍタングス
トケイ酸のｉ−ＰｒＯＨ溶液をそれぞれ５０μｌ加え、
密栓し、１００℃で、１時間加熱した。得られた反応溶
液を冷却した後、この反応溶液を用いて、実施例１に従
って発光量を測定した。図８に示すとおり、アデニル基
含有物質はすべて発光が見られた。図８中、各物質の発
光量（ＲＬＵ）は、各試料溶液の２６０ｎｍの吸光度１
あたりの値を示した。 ｉｉ）また、アデニル基を含まないグアニン、チミン、
シトシン、ウラシル、グアノシン、シチジン、チミジ
ン、ウリジンの各物質を少量の０．１規定の塩酸で溶解
後、ｉ−ＰｒＯＨにより５×１０-5Ｍまで希釈し試料溶
液とした。各試料溶液１００μｌをガラスバイアルにと
り、０．４Ｍメチルグリオキサールジメチルアセタール
（ＭＧＡ）および０．１９６Ｍタングストケイ酸のｉ−
ＰｒＯＨ溶液をそれぞれ５０μｌ加え、密栓し、１００
℃で、１時間加熱した。得られた反応溶液を冷却した
後、この反応溶液を用いて、実施例１に従って発光量
（ＲＬＵ）を測定した。その結果、下記表１に示すよう
にアデニル基を含まない物質では発光を認めなかった。
表１中ＲＬＵ比とは各検体のＲＬＵを、６−ｉ）で得ら
れたアデニンのＲＬＵを１００としたときの比で表した
ものであり、比較のため６−ｉ）で得られたアデノシン
についても記載した。
【００３９】
【表１】
【００４０】（実施例７）発光溶媒中の硫黄化合物の効
果 ｉ）アデニンを少量の０．１規定の塩酸で溶解後、ｉ−
ＰｒＯＨにより１×１０-4Ｍの試料溶液を作成した。各
濃度の試料溶液１００μｌをガラスバイアルにとり、
０．４Ｍメチルグリオキサールジメチルアセタール（Ｍ
ＧＡ）および０．１９６Ｍタングストケイ酸のｉ−Ｐｒ
ＯＨ溶液をそれぞれ５０μｌ加え、密栓し、１００℃
で、１時間加熱した。得られた反応溶液を冷却した後、
この反応溶液を用いて、以下の手順で化学発光の測定を
行った。測定用ガラスチューブに反応溶液１０μｌを採
り、５０ｍＭ過酸化水素と、５ｍＭの２−メルカプトエ
タノール（２−ＭＥ）、ハイドロキシエチルジスルフィ
ド（ＨＤＳ）、Ｌ−システイン（Ｃｙｓ）、Ｌ−システ
インエチルエステル（ＣｙｓＥ）もしくはチオジグリコ
ール (TG) のいずれか１種とを含有するＤＭＦまたは５
０ｍＭ過酸化水素のみを含み硫黄化合物を含まない（Ｎ
ＯＮＥ）ＤＭＦ４００μｌを添加し混和した。この測定
用サンプルチューブを化学発光測定器（ＬＢ９５２Ｔ／
１６ Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製）にセットし、蒸留水３０
０μｌを添加して発光を開始させ、添加直後から２秒間
の発光量（ＲＬＵ）を測定した。図９に示すとおり、ど
の硫黄化合物を加えた系でも、また加えない系でも発光
したが、Ｌ−システイン（Ｃｙｓ）、Ｌ−システインエ
チルエステル（ＣｙｓＥ）を加えると、著しく発光を増
強させた。 ｉｉ）Ｐｏｌｙ Ａを少量の蒸留水で溶解後、ｉ−Ｐｒ
ＯＨにより０．２ｍｇの試料溶液を作成した。試料溶液
１００μｌをガラスバイアルにとり、０．４Ｍメチルグ
リオキサールジメチルアセタール（ＭＧＡ）および０．
１９６Ｍタングストケイ酸のｉ−ＰｒＯＨ溶液をそれぞ
れ５０μｌ加え、密栓し、１００℃で、１時間加熱し
た。得られた反応溶液を冷却した後、この反応溶液を用
いて、以下の手順で化学発光の測定を行った。測定用ガ
ラスチューブに反応溶液１０μｌを採り、５０ｍＭ過酸
化水素および０．１〜５０ｍＭ Ｌ−システインエチル
エステル（ＣｙｓＥ）を含むＤＭＦ４００μｌを添加し
混和した。この測定用サンプルチューブを化学発光測定
器にセットし、蒸留水３００μｌを添加して発光を開始
させ、添加直後から２秒間の発光量（ＲＬＵ）を測定し
た。図１０に示すとおり、５ｍＭのＬ−システインエチ
ルエステル（ＣｙｓＥ）を含むＤＭＦを添加した時が、
もっとも高い発光量を与えた。
果 ｉ）アデニンを少量の０．１規定の塩酸で溶解後、ｉ−
ＰｒＯＨにより１×１０-4Ｍの試料溶液を作成した。各
濃度の試料溶液１００μｌをガラスバイアルにとり、
０．４Ｍメチルグリオキサールジメチルアセタール（Ｍ
ＧＡ）および０．１９６Ｍタングストケイ酸のｉ−Ｐｒ
ＯＨ溶液をそれぞれ５０μｌ加え、密栓し、１００℃
で、１時間加熱した。得られた反応溶液を冷却した後、
この反応溶液を用いて、以下の手順で化学発光の測定を
行った。測定用ガラスチューブに反応溶液１０μｌを採
り、５０ｍＭ過酸化水素と、５ｍＭの２−メルカプトエ
タノール（２−ＭＥ）、ハイドロキシエチルジスルフィ
ド（ＨＤＳ）、Ｌ−システイン（Ｃｙｓ）、Ｌ−システ
インエチルエステル（ＣｙｓＥ）もしくはチオジグリコ
ール (TG) のいずれか１種とを含有するＤＭＦまたは５
０ｍＭ過酸化水素のみを含み硫黄化合物を含まない（Ｎ
ＯＮＥ）ＤＭＦ４００μｌを添加し混和した。この測定
用サンプルチューブを化学発光測定器（ＬＢ９５２Ｔ／
１６ Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製）にセットし、蒸留水３０
０μｌを添加して発光を開始させ、添加直後から２秒間
の発光量（ＲＬＵ）を測定した。図９に示すとおり、ど
の硫黄化合物を加えた系でも、また加えない系でも発光
したが、Ｌ−システイン（Ｃｙｓ）、Ｌ−システインエ
チルエステル（ＣｙｓＥ）を加えると、著しく発光を増
強させた。 ｉｉ）Ｐｏｌｙ Ａを少量の蒸留水で溶解後、ｉ−Ｐｒ
ＯＨにより０．２ｍｇの試料溶液を作成した。試料溶液
１００μｌをガラスバイアルにとり、０．４Ｍメチルグ
リオキサールジメチルアセタール（ＭＧＡ）および０．
１９６Ｍタングストケイ酸のｉ−ＰｒＯＨ溶液をそれぞ
れ５０μｌ加え、密栓し、１００℃で、１時間加熱し
た。得られた反応溶液を冷却した後、この反応溶液を用
いて、以下の手順で化学発光の測定を行った。測定用ガ
ラスチューブに反応溶液１０μｌを採り、５０ｍＭ過酸
化水素および０．１〜５０ｍＭ Ｌ−システインエチル
エステル（ＣｙｓＥ）を含むＤＭＦ４００μｌを添加し
混和した。この測定用サンプルチューブを化学発光測定
器にセットし、蒸留水３００μｌを添加して発光を開始
させ、添加直後から２秒間の発光量（ＲＬＵ）を測定し
た。図１０に示すとおり、５ｍＭのＬ−システインエチ
ルエステル（ＣｙｓＥ）を含むＤＭＦを添加した時が、
もっとも高い発光量を与えた。
【００４１】（実施例８）メチルグリオキサールジメチ
ルアセタールとアデニンとの反応時間 アデニンを少量の０．１規定の塩酸で溶解後、ｉ−Ｐｒ
ＯＨにより１×１０-3Ｍの試料溶液を作成した。試料溶
液１００μｌをガラスバイアルにとり、０．４Ｍメチル
グリオキサールジメチルアセタールおよび０．１９６Ｍ
タングストケイ酸のｉ−ＰｒＯＨ溶液をそれぞれ５０μ
ｌ加え、密栓し、１００℃で加熱した。反応溶液を経時
的に取り出し、冷却した後、この反応溶液を用いて、実
施例１に従って発光量（ＲＬＵ）を測定した。得られた
発光強度から発光量と反応時間との関係を調べたとこ
ろ、反応溶液の加熱開始から６０分経過した時点で、発
光強度が平衡に達する事がわかった（図１１）。図１１
中、横軸は経過時間を示し、縦軸は経時的に取り出した
反応溶液の発光強度を示す。また、アデニン（＋）は、
アデニン添加試料の発光強度を示し、アデニン（−）
は、アデニン無添加の対照試料の発光強度を示す。
ルアセタールとアデニンとの反応時間 アデニンを少量の０．１規定の塩酸で溶解後、ｉ−Ｐｒ
ＯＨにより１×１０-3Ｍの試料溶液を作成した。試料溶
液１００μｌをガラスバイアルにとり、０．４Ｍメチル
グリオキサールジメチルアセタールおよび０．１９６Ｍ
タングストケイ酸のｉ−ＰｒＯＨ溶液をそれぞれ５０μ
ｌ加え、密栓し、１００℃で加熱した。反応溶液を経時
的に取り出し、冷却した後、この反応溶液を用いて、実
施例１に従って発光量（ＲＬＵ）を測定した。得られた
発光強度から発光量と反応時間との関係を調べたとこ
ろ、反応溶液の加熱開始から６０分経過した時点で、発
光強度が平衡に達する事がわかった（図１１）。図１１
中、横軸は経過時間を示し、縦軸は経時的に取り出した
反応溶液の発光強度を示す。また、アデニン（＋）は、
アデニン添加試料の発光強度を示し、アデニン（−）
は、アデニン無添加の対照試料の発光強度を示す。
【００４２】（実施例９）タングストケイ酸を用いた精
製ＰＣＲ増幅産物の測定 ＨＢｅ抗原陽性慢性Ｂ型肝炎患者血漿（血清型ａｄｒ）
より、Ａ．Ｆｕｊｉｙａｍａらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｐ４６０１，１１
（１３），１９８３）に従い、Ｄａｎｅ粒子を精製し、
ＨＢＶ−ＤＮＡ（３．２ｋｂ）を分離した。これをプラ
スミド（ｐＢＲ３２２）にクローニングし、得られた組
換え体（ｐＢＲ−ＨＢＶ）を精製した。このプラスミド
ｐＢＲ−ＨＢＶより下記表２プライマーＢ１とＢ５Ｒを
用いて、市販酵素Ｔｔｈ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋
紡製）によりコアー領域８５０ｂｐを増幅した。得られ
た反応溶液をフェノール、クロロホルムで処理し、その
後ＮＡＰ−１０（ファルマシア製）にてゲルろ過を行っ
た。次に常法に従いエタノール沈殿を行い、遠心後回収
して得られた精製ＰＣＲ増幅産物を蒸留水で溶解し、２
６０ｎｍの吸光度より濃度を算出した。精製ＰＣＲ増幅
産物を蒸留水で希釈し０〜５００ｎｇ／２μｌのサンプ
ルを調整した。各２μｌをガラスバイアルにとり、１０
０℃で２分間処理して乾固させた後、０．１５Ｍｎ−ブ
チルグリオキサールジメチルアセタール（ＢＧＡ）およ
び０．１９６Ｍタングストケイ酸（ＷＳｉ）のｉ−Ｐｒ
ＯＨ溶液をそれぞれ５０μｌ加え、密栓し、１００℃
で、１時間加熱した。得られた反応溶液を冷却した後、
測定用ガラスチューブに反応溶液１０μｌをとり、５０
ｍＭ過酸化水素および２ｍＭシステインを含むＤＭＦ４
００μｌを添加し混和した。この測定用サンプルチュー
ブを化学発光測定機にセットし、蒸留水３００μｌを添
加して発光を開始させ、添加直後から２秒間の発光量
（ＲＬＵ）を測定した。図１２に示すとおり、発光強度
はＰＣＲ増幅産物の濃度に比例して増加した。
製ＰＣＲ増幅産物の測定 ＨＢｅ抗原陽性慢性Ｂ型肝炎患者血漿（血清型ａｄｒ）
より、Ａ．Ｆｕｊｉｙａｍａらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｐ４６０１，１１
（１３），１９８３）に従い、Ｄａｎｅ粒子を精製し、
ＨＢＶ−ＤＮＡ（３．２ｋｂ）を分離した。これをプラ
スミド（ｐＢＲ３２２）にクローニングし、得られた組
換え体（ｐＢＲ−ＨＢＶ）を精製した。このプラスミド
ｐＢＲ−ＨＢＶより下記表２プライマーＢ１とＢ５Ｒを
用いて、市販酵素Ｔｔｈ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋
紡製）によりコアー領域８５０ｂｐを増幅した。得られ
た反応溶液をフェノール、クロロホルムで処理し、その
後ＮＡＰ−１０（ファルマシア製）にてゲルろ過を行っ
た。次に常法に従いエタノール沈殿を行い、遠心後回収
して得られた精製ＰＣＲ増幅産物を蒸留水で溶解し、２
６０ｎｍの吸光度より濃度を算出した。精製ＰＣＲ増幅
産物を蒸留水で希釈し０〜５００ｎｇ／２μｌのサンプ
ルを調整した。各２μｌをガラスバイアルにとり、１０
０℃で２分間処理して乾固させた後、０．１５Ｍｎ−ブ
チルグリオキサールジメチルアセタール（ＢＧＡ）およ
び０．１９６Ｍタングストケイ酸（ＷＳｉ）のｉ−Ｐｒ
ＯＨ溶液をそれぞれ５０μｌ加え、密栓し、１００℃
で、１時間加熱した。得られた反応溶液を冷却した後、
測定用ガラスチューブに反応溶液１０μｌをとり、５０
ｍＭ過酸化水素および２ｍＭシステインを含むＤＭＦ４
００μｌを添加し混和した。この測定用サンプルチュー
ブを化学発光測定機にセットし、蒸留水３００μｌを添
加して発光を開始させ、添加直後から２秒間の発光量
（ＲＬＵ）を測定した。図１２に示すとおり、発光強度
はＰＣＲ増幅産物の濃度に比例して増加した。
【００４３】
【表２】
【００４４】（実施例１０）タングストケイ酸を用いた
核酸の測定 実施例９で使用したのと同じｐＢＲ−ＨＢＶを検体とし
て０〜１０００ｐｇ／サンプルの希釈系列を作製した。
各サンプルをプライマーＢ１とＢ５Ｒを用いて９４℃３
０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒にて３５サイクルＰ
ＣＲを行い増幅した。得られた反応溶液各５μｌを１％
のアガロースゲルで泳動し、エチジウムブロマイドにて
検出した。図１３に示すとおり、ｐＢＲ−ＨＢＶ１ｐｇ
／サンプルまで検出可能であった。次に反応溶液各５０
μｌを分子量３万カットのメンブレン付き遠心チューブ
（ＳＵＰＲＥＣ−０２、宝酒造製）で遠心し、ＰＣＲ増
幅産物を回収した後１００μｌの７０％ｉ−ＰｒＯＨで
洗浄し、蒸留水２０μｌに溶解した。全量をガラスバイ
アルに移し、１００℃で２分処理して、乾固させた後、
０．１５Ｍｎ−ブチルグリオキサールジメチルアセター
ル（ＢＧＡ）および０．１９６Ｍタングストケイ酸（Ｗ
Ｓｉ）のｉ−ＰｒＯＨ溶液をそれぞれ５０μｌ加え、密
栓し、１００℃で、１時間加熱した。得られた反応溶液
を冷却した後、測定用ガラスチューブに反応溶液１０μ
ｌをとり、５０ｍＭ過酸化水素および２ｍＭシステイン
を含むＤＭＦ４００μｌを添加し混和した。この測定用
サンプルチューブを化学発光測定機にセットし、蒸留水
３００μｌを添加して発光を開始させ、添加直後から２
秒間の発光量（ＲＬＵ）を測定した。図１４に示すよう
に、ｐＢＲ−ＨＢＶ０〜１００ｐｇ／サンプルまで良好
な用量反応曲線が得られた。検出感度は０．０１ｐｇ／
サンプル以下であり、エチジウムブロマイドを用いた方
法に比較して約１００倍高感度であった。
核酸の測定 実施例９で使用したのと同じｐＢＲ−ＨＢＶを検体とし
て０〜１０００ｐｇ／サンプルの希釈系列を作製した。
各サンプルをプライマーＢ１とＢ５Ｒを用いて９４℃３
０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒にて３５サイクルＰ
ＣＲを行い増幅した。得られた反応溶液各５μｌを１％
のアガロースゲルで泳動し、エチジウムブロマイドにて
検出した。図１３に示すとおり、ｐＢＲ−ＨＢＶ１ｐｇ
／サンプルまで検出可能であった。次に反応溶液各５０
μｌを分子量３万カットのメンブレン付き遠心チューブ
（ＳＵＰＲＥＣ−０２、宝酒造製）で遠心し、ＰＣＲ増
幅産物を回収した後１００μｌの７０％ｉ−ＰｒＯＨで
洗浄し、蒸留水２０μｌに溶解した。全量をガラスバイ
アルに移し、１００℃で２分処理して、乾固させた後、
０．１５Ｍｎ−ブチルグリオキサールジメチルアセター
ル（ＢＧＡ）および０．１９６Ｍタングストケイ酸（Ｗ
Ｓｉ）のｉ−ＰｒＯＨ溶液をそれぞれ５０μｌ加え、密
栓し、１００℃で、１時間加熱した。得られた反応溶液
を冷却した後、測定用ガラスチューブに反応溶液１０μ
ｌをとり、５０ｍＭ過酸化水素および２ｍＭシステイン
を含むＤＭＦ４００μｌを添加し混和した。この測定用
サンプルチューブを化学発光測定機にセットし、蒸留水
３００μｌを添加して発光を開始させ、添加直後から２
秒間の発光量（ＲＬＵ）を測定した。図１４に示すよう
に、ｐＢＲ−ＨＢＶ０〜１００ｐｇ／サンプルまで良好
な用量反応曲線が得られた。検出感度は０．０１ｐｇ／
サンプル以下であり、エチジウムブロマイドを用いた方
法に比較して約１００倍高感度であった。
【００４５】
【発明の効果】本発明の測定方法によって、アデニル基
含有物質を簡便で特異的にＳ／Ｎ比の高い高感度の測定
を行うことが可能となった。
含有物質を簡便で特異的にＳ／Ｎ比の高い高感度の測定
を行うことが可能となった。
【００４６】
配列番号 ：１ 配列の長さ：２０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ＣＴＣＴＧＣＣＴＡＡＴＣＡＴＣＴＣＡＴＧ
【００４７】配列番号 ：２ 配列の長さ：２０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ＴＡＧＧＡＴＡＧＡＡＣＣＴＡＧＣＡＧＧＣ
【図１】 タングストケイ酸存在下、フェニルグリオキ
サールを用いた場合のアデニンの検量線を示すグラフで
ある。
サールを用いた場合のアデニンの検量線を示すグラフで
ある。
【図２】 タングストケイ酸存在下、メチルグリオキサ
ールジメチルアセタールを用いた場合のアデニンの検量
線を示すグラフである。
ールジメチルアセタールを用いた場合のアデニンの検量
線を示すグラフである。
【図３】 タングストケイ酸存在下、メチルグリオキサ
ールジメチルアセタールを用いた場合のＤＮＡ、Ｐｏｌ
ｙ ＡおよびＰｏｌｙ ｄＡの検量線を示すグラフであ
る。
ールジメチルアセタールを用いた場合のＤＮＡ、Ｐｏｌ
ｙ ＡおよびＰｏｌｙ ｄＡの検量線を示すグラフであ
る。
【図４】 タングストケイ酸よるＳ／Ｎ比の向上を示す
グラフである。
グラフである。
【図５】 各種ヘテロポリ酸の触媒効果の比較を示すグ
ラフである。
ラフである。
【図６】 タングストケイ酸存在下、各種グリオキサー
ル化合物とアデニンとの反応性を示すグラフである。
ル化合物とアデニンとの反応性を示すグラフである。
【図７】 タングストケイ酸存在下、各種グリオキサー
ル化合物とアデニンとの反応性を示すグラフである。
ル化合物とアデニンとの反応性を示すグラフである。
【図８】 タングストケイ酸存在下、メチルグリオキサ
ールジメチルアセタールを用いた場合の各種核酸、核酸
塩基の反応性を示すグラフである。
ールジメチルアセタールを用いた場合の各種核酸、核酸
塩基の反応性を示すグラフである。
【図９】 発光溶媒中の各種硫黄化合物の効果を比較し
示したグラフである。
示したグラフである。
【図10】 発光溶媒中のＬ−システインエチルエステル
濃度の効果を示すグラフである。
濃度の効果を示すグラフである。
【図11】 タングストケイ酸存在下、メチルグリオキサ
ールジメチルアセタールとアデニンを反応させたときの
反応時間と発光量の関係を示すグラフである。
ールジメチルアセタールとアデニンを反応させたときの
反応時間と発光量の関係を示すグラフである。
【図12】 ＰＣＲ法による生成物の鎖長と化学発光量の
関係を示すグラフである。
関係を示すグラフである。
【図13】 電気泳動の結果を示す図面代用写真である。
【図14】 試料中のＤＮＡ量とＰＣＲ法による増幅産物
の発光強度の関係を示すグラフである。
の発光強度の関係を示すグラフである。
Claims (13)
- 【請求項１】測定対象物質中のアデニル基に、ヘテロポ
リ酸あるいはヘテロポリ酸の塩の存在下、グリオキサー
ル誘導体を反応させて化学発光性物質を誘導し、該化学
発光性物質から得られた発光活性を指標として該測定対
象物質を測定することを特徴とするアデニル基含有物質
の測定方法。 - 【請求項２】前記ヘテロポリ酸あるいはヘテロポリ酸の
塩が、タングストケイ酸、タングストリン酸、タングス
トヒ酸、タングストゲルマニウム酸、モリブドケイ酸、
モリブドリン酸、モリブドヒ酸、モリブドゲルマニウム
酸、バナドリン酸およびそれらの塩からなる群から選ば
れる少なくとも１つである請求項１に記載のアデニル基
含有物質の測定方法。 - 【請求項３】前記ヘテロポリ酸あるいはヘテロポリ酸の
塩が、タングストケイ酸、タングストリン酸、タングス
トヒ酸、モリブドケイ酸、モリブドリン酸、モリブドヒ
酸およびモリブドリン酸ナトリウムからなる群から選ば
れる少なくとも１つである請求項１または２に記載のア
デニル基含有物質の測定方法。 - 【請求項４】前記ヘテロポリ酸あるいはヘテロポリ酸の
塩が、タングストケイ酸、タングストリン酸、モリブド
リン酸およびモリブドリン酸ナトリウムからなる群から
選ばれる少なくとも１つである請求項１〜３のいずれか
に記載のアデニル基含有物質の測定方法。 - 【請求項５】前記グリオキサール誘導体が下記式（１）
で表される請求項１〜４のいずれかに記載のアデニル基
含有物質の測定方法。 Ｒ1 −ＣＯ−Ｒ2 ・・・・・・（１） （式中、Ｒ1 は、水素原子；１〜１２個の炭素原子を含
むアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基；１〜
１８個の炭素原子を含むアリール基または芳香族性を有
する複素環式基であり、置換基を有してもあるいは置換
基が縮環してもよく、Ｒ2 は、アルデヒド基または、−
ＣＨ（ＸＲ3 ）（Ｘ’Ｒ4 ）で表される基であり、Ｘお
よびＸ’は、酸素原子、スルホキシド基、スルホン基、
硫黄原子、セレノキシド基、セレン原子から選択される
基のいずれかであって、互いに同一でも異なっていても
よく、Ｒ3 およびＲ4 は、水素原子；１〜１２個の炭素
原子を含むアルキル基、アルケニル基またはアルキニル
基；もしくは１〜１６個の炭素原子を含むアリール基で
あり、置換基を有してもあるいは置換基が縮環してもよ
く、該Ｒ3 およびＲ4 は、互いに同一でも異なっていて
もよく、また、Ｒ3 およびＲ4 の一部が互いに結合し、
環を形成していてもよい。） - 【請求項６】前記グリオキサール誘導体が、Ｒ1 は、水
素原子；１〜８個の炭素原子を含むアルキル基；フェニ
ル基または１〜８個の炭素原子を含む芳香族性を有する
複素環式基のいずれかであって、置換基を有してもある
いは置換基が縮環してもよく、Ｒ2 は、アルデヒド基ま
たは、−ＣＨ（ＸＲ3 ）（Ｘ’Ｒ4 ）で表される基であ
り、ＸおよびＸ’は、酸素原子、硫黄原子のいずれかで
あって、互いに同一でも異なっていてもよく、Ｒ3 およ
びＲ4 は、水素原子；１〜４個の炭素原子を含むアルキ
ル基またはフェニル基であり、置換基を有してもあるい
は置換基が縮環してもよく、該Ｒ3 およびＲ4 は、互い
に同一でも異なっていてもよく、また、Ｒ3 およびＲ4
の一部が互いに結合し、環を形成していてもよい請求項
１〜５のいずれかに記載のアデニル基含有物質の測定方
法。 - 【請求項７】前記グリオキサール誘導体が、メチルグリ
オキサール、メチルグリオキサールジメチルアセター
ル、エチルグリオキサールジメチルアセタール、ｎ−ブ
チルグリオキサールジメチルアセタール、ｎ−オクチル
グリオキサールジメチルアセタール、フェニルグリオキ
サール、フェニルグリオキサールジメチルアセタール、
ｐ−メチルフェニルグリオキサールおよびｐ−フルオロ
フェニルグリオキサールからなる群から選ばれる少なく
とも１つである請求項１〜６のいずれかに記載のアデニ
ル基含有物質の測定方法。 - 【請求項８】前記測定対象物質が、アデニン、アデノシ
ン、アデノシンリン酸化合物、ＤＮＡまたはＲＮＡであ
る請求項１〜７のいずれかに記載のアデニル基含有物質
の測定方法。 - 【請求項９】前記化学発光性物質を、発光溶媒の存在下
で反応開始剤を添加して発光活性を測定する請求項１〜
８のいずれかに記載のアデニル基含有物質の測定方法。 - 【請求項１０】前記発光溶媒が、ジメチルホルムアミ
ド、イソプロパノール、アセトニトリル、ジオキサンお
よびジメチルスルホキシドからなる群から選ばれる少な
くとも１つである請求項９に記載のアデニル基含有物質
の測定方法。 - 【請求項１１】前記測定対象物質が、標的核酸を該標的
核酸と相補的に結合する捕獲プローブを用いて検出する
ＤＮＡプローブ法における捕獲プローブと相補的に結合
した該標的核酸および／またはその増幅産物である請求
項１〜１０のいずれかに記載のアデニル基含有物質の測
定方法。 - 【請求項１２】前記測定対象物質が、検体中の標的核酸
を核酸増幅法で増幅して検出する標的核酸測定方法にお
ける、該標的核酸および／またはその増幅産物である請
求項１〜１０のいずれかに記載のアデニル基含有物質の
測定方法。 - 【請求項１３】前記測定対象物質が、検体中の被検物質
の免疫反応を用いて検出する免疫学的測定方法における
アデニル基を有する物質で標識した抗体および／または
核酸で標識した抗体の核酸を標的核酸として核酸増幅法
で増幅して得られた増幅産物、あるいはアデニル基を有
する物質で標識した抗原および／または核酸で標識した
抗原の核酸を標的核酸として核酸増幅法で増幅して得ら
れた増幅産物である請求項１〜１０のいずれかに記載の
アデニル基含有物質の測定方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6084085A JPH07270319A (ja) | 1994-03-30 | 1994-03-30 | ヘテロポリ酸を用いたアデニル基含有物質の測定方法 |
| CA002145839A CA2145839A1 (en) | 1994-03-30 | 1995-03-29 | Method for measuring adenyl group-containing substances using heteropoly-acid |
| US08/413,279 US5610016A (en) | 1994-03-30 | 1995-03-30 | Method for measuring adenyl group-containing substances using heteropoly-acid |
| EP95104727A EP0675360A3 (en) | 1994-03-30 | 1995-03-30 | Method for the measurement of substances containing adenyl groups using heteropolyacids. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6084085A JPH07270319A (ja) | 1994-03-30 | 1994-03-30 | ヘテロポリ酸を用いたアデニル基含有物質の測定方法 |
Publications (1)
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|---|---|---|---|
| JP6084085A Withdrawn JPH07270319A (ja) | 1994-03-30 | 1994-03-30 | ヘテロポリ酸を用いたアデニル基含有物質の測定方法 |
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| JP (1) | JPH07270319A (ja) |
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- 1995-03-30 US US08/413,279 patent/US5610016A/en not_active Expired - Fee Related
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