CN117642516A

CN117642516A - Dna检测方法和dna检测系统

Info

Publication number: CN117642516A
Application number: CN202180099075.8A
Authority: CN
Inventors: 田中淳子; 中川树生; 石田猛; 香村惟夫
Original assignee: Hitachi High Technologies Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2021-06-07
Filing date: 2021-06-07
Publication date: 2024-03-01
Also published as: WO2022259334A1; JPWO2022259334A1; EP4353810A1

Abstract

本发明的一个实施方式为一种DNA检测方法，其包括：将含有荧光标记探针或DNA嵌入剂和多种检测对象的DNA的检测体溶液分割成多个微小组分的第一工序；在包含上述微小组分的微小分区中进行核酸扩增反应的第二工序；在各个上述微小分区中，伴随温度变化，测定来自上述荧光标记探针或上述DNA嵌入剂的荧光强度的第三工序；根据上述测定得到的各荧光强度计算上述检测对象的DNA的熔解温度的第四工序；确定受到了气泡的影响的上述微小分区的第五工序；和从上述多个微小分区得到的总数据除去上述受到了气泡的影响的上述微小分区的数据的第六工序。

Description

DNA检测方法和DNA检测系统

技术领域

本发明涉及DNA检测方法和DNA检测系统，特别是涉及数字PCR。

背景技术

在以往的基因检查中，有PCR(专利文献2-4)或实时PCR(非专利文献1)等的方法。在这些方法中，成为检测对象的基因(在本说明书中，称为“目标基因”)为微量时，测定再现性降低。

作为解决该问题的方法，开发出了数字PCR(专利文献1)。如果使用数字PCR，则能够使用极限稀释后的样品，将DNA以0(无)或1(有)进行判定、检测，从而对微量的DNA进行定量。

以下表示使用数字PCR对检测体中的DNA进行定量方法的一例。首先，从检测体制备PCR反应液时，将PCR反应液在板的孔中或者分割为油中的微滴(droplet)时，在各微小分组(aliquot)中，分别稀释检测体，使其成为加入了或者没有加入1分子的目标基因的任意一种状态，并加入PCR所需要的DNA聚合酶、引物、荧光标记探针，制备PCR反应液。然后，将所得到的PCR反应液如上所述分成微小分组。

接着，利用PCR扩增各微小分组中的目标基因。PCR结束后测定各微小分组的荧光强度，对具有超过阈值的荧光强度的微小分区的数量进行计数。根据所得到的值，能够算出检测体所含的目标基因的量。

在这样的数字PCR中，由于使用极限稀释后的检测体，因此能够抑制成为阻碍PCR的反应的主要原因的来自检测体的成分的影响。另外，由于不需要标准曲线，因此能够直接测定作为对象的DNA的绝对量。

然而，在以往的PCR中，由于反应液中的反应抑制物的存在、模板DNA的二级结构的形成、引物的设计不充分等的理由，反应效率低。

另一方面，在数字PCR中，在反应的终点检测DNA为0还是为1，因此可以认为PCR的反应效率本身对测定结果的影响不大。但是实际上，即使在终点进行测定，由各微小分组间反应效率不均匀引起的荧光强度的偏差也大。这成为使得数字PCR的测定再现性和测定精度降低的原因。

因此，本发明的发明人为了提高数字PCR的测定再现性和测定精度，开发了如下技术：利用熔解曲线分析测定PCR扩增产物的熔解温度(Tm)，由此即使各微小分组间的PCR反应效率不均匀，也能够判断各微小分组内的目标基因的有无(专利文献5)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2013-521764号公开公报

专利文献2：美国专利第4683195号公报

专利文献3：美国专利第4683202号公报

专利文献4：美国专利第4800159号公报

专利文献5：日本特开2018-108063号公开公报

非专利文献

非专利文献1：Genome Res.，10，pp986-994，1996

发明内容

发明所要解决的技术问题

然而，在使用了熔解曲线分析的数字PCR中，在获取用于计算Tm的荧光图像时，如果在装有检测体的微小分组的微小分区(microcompartment)附近产生气泡，则会发生Tm值被计算成错误的值的问题。在使用了熔解曲线分析的数字PCR中，将检测体分割成微小分组，在配置于平面上的微小分区内，将微小分组中的目标基因扩增后，一边改变温度一边获取微小分区的荧光图像，在每个微小分区根据荧光强度变化算出微小分组内的基因的熔解温度。此时，在荧光图像获取中温度成为高温时就容易产生气泡。特别是在作为微小分区使用设置于基板的贯通孔并将添加在贯通孔中的PCR反应液用油等封住使反应发生的情况、或将油中的微滴在流路内在平面上排列而使反应发生的情况等，有时会在油中产生气泡。由于产生的气泡在获取荧光图像时移动，各微小分区的荧光强度会发生变动，而成为熔解曲线的噪声。其结果，有时算出与微小分区内的基因的熔解温度不同的数值，无法正确进行目标基因的定量。

因此，本发明的目的在于提供一种新的DNA检测方法和DNA检测系统，其在使用了熔解曲线分析的数字PCR中，通过测定装置探测位于产生的气泡附近的微小分区，高精度地对目标基因进行计数。

用于解决技术问题的技术方案

本发明的发明人在使用了熔解曲线分析的数字PCR中，对算出了与添加的检测体所含的基因型不同的熔解温度的微小分区进行分析，结果得知这样的微小分区的位置发生偏倚，而且其原因是气泡的存在。由此，发现通过将位于气泡附近的微小分区从分析数据中去除，基因型的错误判定降低，从而完成了本发明。

本发明的一个实施方式为一种DNA检测方法，其包括：将含有荧光标记探针或DNA嵌入剂和多种检测对象的DNA的检测体溶液分隔成多个微小组分的第一工序；在包含上述微小组分的微小分区中进行核酸扩增反应的第二工序；在各个上述微小分区中，伴随温度变化，测定来自上述荧光标记探针或上述DNA嵌入剂的荧光强度的第三工序；根据上述测定得到的各荧光强度计算上述检测对象的DNA的熔解温度的第四工序；确定受到了气泡的影响的上述微小分区的第五工序；和从上述多个微小分区得到的总数据除去上述受到了气泡的影响的上述微小分区的数据的第六工序。在第五工序中，作为上述受到了气泡的影响的上述微小分区，可以确定为根据第三工序中测定得到的各荧光强度制作的熔解曲线的微分曲线的峰数为规定值以上的微小分区。另外，在第五工序中，可以在相邻的2个以上的上述微小分区被确定为上述受到了气泡的影响的上述微小分区的情况下，在第六工序中，将该相邻的2个以上的上述微小分区的数据除去，且在第五工序中，单独的上述微小分区被确认到上述受到了气泡的影响的上述微小分区的情况下，在第六工序中，不除去该单独的上述微小分区的数据。另外，在第五工序中，上述受到了气泡的影响的上述微小分区可以通过上述微小分区的图像的解析来确定。另外，在第五工序中，可以选择从第三工序中测定得到的各荧光强度制作的熔解曲线的微分曲线的峰数为规定值以上的微小分区，通过上述选择的微小分区的图像的解析确认是否受到上述气泡的影响，由此确定上述受到了气泡的影响的上述微小分区。另外，在第五工序中，可以在相邻的2个以上的上述微小分区中，选择上述微分曲线的峰数为规定值以上的微小分区，且在第五工序中，在单独的上述微小分区中，不选择上述微分曲线的峰数为规定值以上的微小分区。此外，在第一工序中，上述DNA溶液可以被极限稀释。在第四工序中，可以在上述各微小分区中，根据上述熔解温度，判断上述多个检测对象的DNA的种类，在第五工序中，对于判断了种类的上述DNA的各种类，进一步根据表示规定的基准熔解温度的信息来确定上述微小分区。上述微小分区可以由以阵列状排列的孔或分散在油中的微滴构成。在第四工序中，上述熔解温度可以作为从第三工序中测定得到的各荧光强度制作的熔解曲线的拐点算出。

本发明的另一个实施方式为一种DNA检测系统，其包括：具有用于加入含有荧光标记探针或DNA嵌入剂的DNA溶液的多个微小分区的第一装置；用于拍摄第一装置的图像的第二装置；为了在上述微小分区进行核酸扩增反应，用于调整上述微小分区的温度的第三装置；在上述微小分区中，为了获得伴随温度变化而变化的荧光强度，使上述拍摄装置拍摄图像的、用于控制拍摄装置的第四装置；和用于从获得的上述微小分区的上述荧光强度探测气泡的产生的第五装置。

发明的效果

根据本发明，提供一种新型的DNA检测方法和DNA检测系统，其在使用了熔解曲线分析的数字PCR中，探测位于产生的气泡附近的微小分区，能够更高精度地定量目标基因。

附图说明

图1是表示在本发明的一个实施方式的DNA检测方法中，使用荧光标记探针测定DNA的熔解温度的方法的示意图。

图2是表示在本发明的一个实施方式的DNA检测方法中，作为微小分区，使用用于捕集PCR反应液的微滴的凹坑时的微滴与气泡的关系的示意图。

图3是表示在本发明的一个实施方式的DNA检测方法中，作为微小分区使用孔时的孔与气泡的关系的示意图。

图4是表示本发明的一个实施方式中的伴随温度变化的孔所包含的荧光色素的荧光强度所涉及的数据、和根据伴随温度变化的各孔的荧光强度变化得到的熔解温度所涉及的数据的图。

图5是表示利用本发明的一个实施方式的DNA检测方法得到的测定结果的图。

图6是本发明的一个实施方式的荧光测定部的示意图。

图7是本发明的一个实施方式的数字PCR系统的示意图。

图8是表示本发明的一个实施方式中DNA检测方法中使用的数据库的图。

图9是表示使用图6和图7的装置进行熔解温度测定的方法的一个实施方式的流程图。

图10是表示本发明的一个实施方式中的显示器所显示的测定结果的图。

图11是表示本发明的一个实施方式中的显示器所显示的测定结果的图。

图12是表示本发明的实施例中得到的测定结果的图。

具体实施方式

通过本说明书的记载，本领域技术人员能够知晓本发明的目的、特征和优点、以及它们所涉及的思想。只要是本领域技术人员就能够根据本说明书的记载容易地再现本发明。以下记载的发明的实施方式和具体的实施例等表示本发明的优选实施方式，是为了例示或说明的目的而表示的，并不是要将本发明限定于这些实施例。只要不脱离本说明书中公开的本发明的意图和范围，根据本说明书的记载，本领域技术人员能够知晓各种改变和修饰。

(1)DNA检测方法

本说明书公开的一个实施方式为如下的DNA检测方法，其包括：将含有荧光标记探针或DNA嵌入剂且含有多种检测对象的DNA的DNA溶液分割成多个微小组分的第一工序；在包含微小组分的微小分区中进行核酸扩增反应的第二工序；在各个微小分区中，伴随核酸扩增反应的温度变化，测定来自荧光标记探针或DNA嵌入剂的荧光强度的第三工序；根据测定得到的各荧光强度计算检测对象的DNA的熔解温度的第四工序；确定受到了气泡的影响的微小分区的第五工序；和从在多个微小分区得到的总数据除去受到了气泡的影响的微小分区的数据的第六工序。以下，参考图1～7的示意图，具体说明该DNA检测方法。

(第一工序)

在本工序中，将含有荧光标记探针或DNA嵌入剂和多种检测对象的DNA的检测体溶液分割成多个微小组分。

首先，准备来自生物体试样的包含DNA的检测体溶液。检测体溶液可以含有多种目标基因。将该检测体溶液添加到PCR反应液中。PCR反应液包含DNA聚合酶、引物、DNA嵌入剂或荧光标记探针、脱氧核糖核苷酸类、和缓冲液。由此，检测体溶液含有荧光标记探针或DNA嵌入剂。作为荧光标记探针，优选使用设计为具有能够与目标基因杂交的结构的分子信标。

检测体溶液在微小分区中进行微小分组。在微小分组时，优选将检测体溶液进行极限稀释，以使各微小分区中进入0分子或1分子DNA的方式进行分组。

使用的生物体试样没有特别限定，只要是包含检测对象的DNA的试样即可，能够例示个体试样(动植物的体液或组织、细胞、排泄物等)或土壤样品(包含真菌或细菌等)等。作为体液，能够例示血液、唾液、脊髓液等。在血液中包含细胞游离DNA(cfDNA)和血液循环肿瘤DNA(ctDNA)等。作为组织，能够例示通过外科手术或活检法得到的疾病的患处(例如乳房或肝脏等的癌组织)。组织可以是已经被固定的组织，例如可以是福尔马林固定石蜡包埋组织切片(FFPE)。作为细胞，能够例示通过活检法采集的细胞(患处或其附近的细胞)、或在血液中循环的血液循环肿瘤细胞等。

这些检测体的前处理没有特别限定，可以从生物体或环境等采集后添加到悬浮液中进行匀浆，或者用裂解液裂解后直接使用，优选使用将它们所包含的核酸提取、或纯化后的样品。

(第二工序)

在本工序中，在包含微小组分的各微小分区中进行核酸扩增反应。核酸扩增反应优选为所谓的PCR、特别是数字PCR。

(第三工序)

在本工序中，在各个微小分区中，伴随温度变化，测定来自荧光标记探针或DNA嵌入剂的荧光强度。该温度变化可以利用核酸扩增反应中的温度变化，也可以通过与核酸扩增反应独立地(例如在核酸扩增反应结束后)使检测体溶液升温来进行。另外，该工序中使用的荧光标记探针或DNA嵌入剂可以与用于PCR的荧光标记探针或DNA嵌入剂共用，也可以使用与用于PCR的荧光标记探针或DNA嵌入剂不同的物质。

图1是表示使反应液的温度变化时的荧光标记探针的行为的示意图。荧光标记探针能够例示分子信标或Taqman探针，这里以分子信标为例来说明图1。分子信标以寡核苷酸的形式构成，具有与位于使目标基因扩增的核酸扩增反应所使用的引物对之间的序列互补的序列。另外，分子信标在其两端具有彼此互补的序列，在一端设置有荧光色素103，在另一端设置有消光色素(淬灭剂)104。在核酸扩增反应中，在初期状态下，如图1B那样，分子信标102单独游离存在。此时，分子信标102形成茎环，荧光色素103和淬灭剂104靠近，因此不发出荧光。在最初的变性工序中，如果加热检测体溶液，则如图1C那样成为自由度高的结构，但由于荧光色素和消光色素一直不分离，所以荧光保持消光状态。在退火工序中，一旦降低温度，成为室温程度的温度时，如图1A那样，分子信标102的环部分在检测体溶液内扩增得到的DNA101上退火。由此，荧光色素103和淬灭剂104总是分离，因此荧光标记探针102发出强的荧光。在接下来的延伸工序中，分子信标102游离，再次成为图1B那样，荧光消光。在接下来的变性工序中，再次成为图1C那样，荧光保持消光状态。在核酸扩增反应中，重复该工序，因此，在某个阶段，在加温时或冷却时测定荧光强度即可。在核酸扩增反应结束后测定荧光强度的情况下，也能够同样进行测定。在使用DNA嵌入剂的情况下，在检测体DNA为双链时，DNA嵌入剂插入双链之间发出荧光，但在检测体DNA为单链时，DNA嵌入剂游离，荧光消光。因此，在核酸扩增反应中，与分子信标102同样，在某个阶段，在加温时或冷却时测定荧光强度即可。在核酸扩增反应结束后可以仅仅为了测定荧光强度，而进行加温或冷却，来测定荧光强度。

在这里所使用的分子信标102中，荧光色素103和淬灭剂104的组合只要是通常实时PCR所使用的组合即可，没有特别限定。例如，作为荧光色素103的例子，可以列举FAM、VIC、ROX、Cy3、Cy5等，作为淬灭剂104的例子，可以列举TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3等。

作为目标基因，在使用具有不同序列的2种基因时，分子信标102的序列准备与各个目标基因具有特异性的序列，使其与不同的荧光色素结合，由此能够在一个反应体系中，检测2种目标基因。

作为DNA嵌入剂，只要是通过与双链DNA结合而荧光强度增加、能够用于双链DNA的检测的物质即可，没有特别限定。具体而言，可以适用SYBR(注册商标)Green I、SYBR Gold、PicoGreen(注册商标)、SYTO(注册商标)Blue、SYTO Green、SYTO Orange、SYTO Red、POPO(注册商标)-1、BOBO(注册商标)-1、YOYO(注册商标)-1、TOTO(注册商标)-1、JOJO(注册商标)-1、POPO-3、LOLO(注册商标)-1、BOBO-3、YOYO-3、TOTO-3、PO-Pro(注册商标)-1、YO-Pro(注册商标)-1、TO-Pro(注册商标)-1、JO-Pro(注册商标)-1、PO-Pro-3、YO-Pro-3、TO-Pro-3、TO-Pro-5、溴化乙锭等。在DNA嵌入剂具有耐热性的情况下，可以在进行核酸扩增反应之前预先添加到反应液中。

(第四工序)

在本工序中，根据测定得到的各荧光强度计算检测对象的DNA的熔解温度。熔解温度的计算方法没有特别限定，可以得到荧光强度与温度的函数，求出该函数的导函数，通过计算求出取得极大值的温度，作为熔解温度。或者，可以将荧光强度和温度的函数绘制成曲线图制成熔解曲线(即表示相对于温度变化的荧光强度变化的曲线)，进而制成将荧光强度用温度微分的结果的微分曲线，将对应于其峰的温度作为熔解温度。将熔解曲线的一例表示于图4A，将由该熔解曲线得到的微分曲线表示于图4B。对应于熔解曲线的拐点的温度与微分曲线的峰对应，作为DNA双链的熔解温度401算出。此外，用于检测目标基因的荧光标记探针的熔解温度在设计荧光标记探针时能够根据公知技术调节。例如，能够通过改变探针的序列或链长进行调节。或者，也可以利用肽核酸(Peptide Nucleic Acid，PNA)或锁核酸(Locked Nucleic Acid，LNA)这样的人工DNA进行调节。

(第五工序)

在本工序中，从第四工序算出的熔解温度，确定受到了气泡的影响的微小分区。

作为一例，在图2和图3中表示在使用了熔解曲线分析的数字PCR中在微小分区附近产生的气泡的行为。

图2中例示的盒(cartridge)204具有作为微小分区用于捕集PCR反应液的微滴的凹坑。如图2A所示，盒204的内部被油203充满，在设置于盒204内部的微滴补充用的凹部202捕集有微滴201。在使用了熔解曲线分析的数字PCR中，一边使温度变化一边获得微滴的荧光图像，对每个微滴进行熔解曲线分析。此时，在盒204中有时产生气泡205，特别是一旦成为高温，则产生气泡的频度高。如果在微滴201下存在气泡205，则会成为荧光强度测定的噪声，因此需要如图2B那样将盒204倾斜而使气泡从微滴201下放出。但是，在如图2C那样微滴201没有被均等地捕集在微滴捕集用的凹部202的情况下，即使倾斜盒204，气泡205也被空的微滴捕集用的凹部202捕集，有时无法准确测定气泡附近的微滴201的荧光强度。

图3例示的盒304具有用于收纳PCR反应液的孔作为微小分区。如图3A所示，盒304的内部被油303充满，在设置于盒304内部的贯通孔片(chip)302的孔添加有PCR反应液301。在使用孔的情况下也与微滴同样，有时会在盒304中产生气泡305。特别是在高温下容易产生气泡305。如果在贯通孔片302下存在气泡305则会成为荧光强度测定的噪声，因此需要如图3B那样将盒304倾斜而使气泡从贯通孔片302下放出。但是，在如图3C那样在贯通孔片302没有均等地添加PCR反应液的情况下，即使倾斜盒304，气泡305也会被PCR反应液的液量少的孔捕集，有时无法准确测定气泡附近的孔的荧光强度。

图4表示不产生气泡的情况和产生了气泡的情况的微小分区的熔解曲线的例子。在产生气泡的情况下，测定伴随温度变化的微小分区的荧光强度变化时，则如图4A所示成为平滑的熔解曲线，求其微分曲线时，则如图4B所示具有单一的峰，该峰的温度就为熔解温度(Tm)401。但是，在产生了气泡的情况下，测定伴随温度变化的微小分区的荧光强度变化时，则如图4C所示，伴随气泡的移动，而荧光强度发生变动。因此，求微分曲线时，则如图4D那样具有多个峰，有时无法确定微小分区内的目标基因的熔解温度，或得到错误的熔解温度。

(第六工序)

在本工序中，从由多个微小分区得到的总数据除去受到了气泡的影响的微小分区的数据。

图5表示不产生气泡的情况和产生了气泡的情况的微小分区的熔解曲线分析结果的例子。如图5A所示，在包含具有野生型等位基因的目标基因的微小分区中，检测出与野生型等位基因的荧光标记探针对应的熔解温度501，在包含具有突变型等位基因的目标基因的微小分区中，检测出与突变型等位基因的荧光标记探针对应的熔解温度502。但是，在产生了气泡的情况下，如图5B所示，包含具有野生型等位基因的目标基因的微小分区有时错误地显示与野生型等位基因的熔解温度不同的值的熔解温度503或504。其结果，与野生型等位基因的熔解温度不同的值的熔解温度503的分布与突变型等位基因的熔解温度502的分布重叠，有时会将包含具有野生型等位基因的目标基因的微小分区确定为包含具有突变型等位基因的目标基因的微小分区。相反地，包含具有突变型等位基因的目标基因的微小分区有时也会错误地显示与突变型等位基因的熔解温度不同的值的熔解温度，也会将包含具有突变型等位基因的目标基因的微小分区确定为包含具有野生型等位基因的目标基因的微小分区。这里，如果探测到气泡的产生，得知气泡附近的微小分区的位置，则能够将显示与野生型等位基因的熔解温度不同的值的熔解温度503的微小分区从解析数据除去，降低微小分区内的基因的误判，能够实现更高精度的基因检测。

(2)DNA检测系统

本说明书中公开的DNA检测系统以检测DNA溶液中的目标基因为目的，包括：具有用于加入含有荧光标记探针或DNA嵌入剂的DNA溶液的多个微小分区的第一装置；用于拍摄第一装置的图像的第二装置；为了在微小分区中进行核酸扩增反应，用于调整微小分区的温度的第三装置；在微小分区中，为了获得伴随温度变化而变化的荧光强度，使拍摄装置拍摄图像的、用于控制拍摄装置的第四装置；和用于根据获得的微小分区的荧光强度探测气泡的产生的第五装置。该DNA检测系统实施上述DNA检测方法。

该DNA检测系统除了上述的各装置以外，可以包括：用于测定从DNA溶液放出的荧光的强度的第六装置；基于表示伴随DNA溶液的温度变化的荧光强度的变化的熔解曲线，计算DNA双链的熔解温度的计算机；和显示从计算机发送的信息的显示器。这些装置可以在物理上位于单一装置中，也可以分别作为单独的装置存在，还可以几个装置组合起来成为单一的装置，而其余的装置独立存在。

DNA溶液可以被任何载体保持，例如如图2所示，可以在设置于板或盒等的凹坑中作为微滴存在，也可以如图3所示，被收纳在板或盒等所具有的孔中。作为DNA检测系统的例子，使用图6和图7，表示具有荧光测定部的DNA检测系统。

图6是用于测定从DNA溶液放出的荧光的强度的荧光测定部的示意图，图7是数字PCR系统的示意图。图6的荧光测定部测定被极限稀释的微滴或孔所含的荧光色素的颜色和荧光强度。图7的数字PCR系统包括：图6中例示的荧光测定部；计算DNA双链的熔解温度、或分析测定数据的计算机；和显示结果的显示器。

图6A所示的荧光测定部包括：光源604、荧光滤光器605、和光电万用表(photomultiple meter)或照相机607等的检测部。荧光测定部可以对每个荧光色素的颜色设置多个光源和/或多个检测部，但也可以从1个光源通过多个荧光滤光器605，激发激发波长不同的多个荧光色素，1个检测部通过多个荧光滤光器605同时检测波长不同的多个荧光。

例如如图6B所示，将多个微滴611在如图2所示的微滴检测用盒610排列成阵列状，设置在作为温度调整部的调温台612上。调温台612为了在各分区中进行核酸扩增反应，而使各分区的温度变化。通过调温台612使微滴检测用盒的温度变化，测定伴随温度变化的微滴的荧光强度变化。在包含目标基因的微滴601和不包含目标基因的微滴602中，荧光强度分别发生不同的变化。

测定的步骤例如如下。首先，从光源604通过透镜608、荧光滤光器605和二向色镜609，对各微滴611照射激发光。由激发光激发各微滴611所含的荧光物质，使所发出的荧光通过二向色镜609、荧光滤光器605、透镜608，并由CCD照相机607检测。CCD照相机607为拍摄装置的例子。

另外，如图6C所示，也可以使用如图3所示的孔方式检测用盒613。在设置于孔方式检测用盒613的孔中添加包含检测体的反应液。然后，在孔内进行PCR，设置在作为温度调整部的调温台612上。利用调温台612使盒613的温度变化，测定伴随温度变化的孔的荧光强度变化。在包含目标基因的孔614和不含目标基因的孔615中，荧光强度分别发生不同的变化。

测定的步骤例如如下。首先，从光源604通过透镜608、荧光滤光器605和二向色镜609，对各孔照射激发光。由激发光激发孔内的反应液所含的荧光物质，使所发出的荧光通过二向色镜609、荧光滤光器605、透镜608，并由CCD照相机607检测。在如图6D那样使用孔的情况下，不进行将微滴排列在微滴检测用盒中的工序，就能够在盒613内从PCR进行到熔解曲线分析。

在观察伴随温度变化的微小分区的荧光强度变化时，也可以在调温台612的下方设置倾斜调整部(未图示)。倾斜调整部除去因调温台612的加热而在盒内产生的气泡。这防止在之后一边通过调温台612使试样的温度下降一边测量各孔的荧光强度时由于气泡而无法获得荧光图像。

如图7所示，由荧光测定部701检测出的荧光数据发送给计算机702。在计算机702中，由解析部703计算出扩增产物的熔解温度，并保存在存储器705。这样，存储器705存储各微小分区中的DNA的双链的熔解温度。此外，如后所述，熔解温度是基于由拍摄装置拍摄得到的图像中的、伴随温度变化的荧光强度的变化而得到的。

另外，预先在数据库704中准备了基因的种类与熔解温度的关系。特别是，数据库704针对目标基因的野生型和突变型分别储存表示成为基准的规定的熔解温度(以下称为基准熔解温度)的信息。参照数据库704，基于存储器705的熔解温度的测定值来确定目标基因的基因型。然后，对于各个基因型，测定确定的微小分区的数量。

将测定结果显示于显示器706。显示器706是输出装置的例子，也可以将显示器706中的显示处理置换成向其他输出装置(打印装置、非挥发性存储装置等)的输出处理。

本说明书中公开的DNA检测系统可以包括样品分割装置。样品分割装置将含有目标基因的DNA溶液进行极限稀释，并分割成微小组分。

另外，该DNA检测系统也可以包括用于对微小分区扩增DNA的扩增装置。

(3)使用DNA检测系统的DNA检测方法

使用图8和图9在以下说明使用如上所述的DNA检测系统的、检测DNA的方法的一个实施方式。在本实施方式中，在确定DNA的熔解温度时利用核酸扩增反应中的荧光强度的变化。另外，在确定熔解温度时使用熔解曲线和微分曲线。

图8表示在数字PCR的测量之前准备的、包含表示基因的基准熔解温度的信息的数据库的一例。图8所示的数据能够预先通过预实验等进行测量，并保存为数据库704。在图8的例子中，关于各基因，针对该基因的野生型和该基因的突变型，分别作为数据库在存储器中储存基准熔解温度的数据。另外，在该例子中，基准熔解温度与各基因型对应。可以对1个基因定义多个突变型。基准熔解温度在该例中被规定为表示单一温度的值，但也可以规定为表示温度的范围的信息。另外，在该例子中，除了基准熔解温度以外，关于各基因的各基因型，还存储有表示荧光色素的颜色的数据。

首先，将含有荧光标记探针或DNA嵌入剂与多种检测对象的DNA的DNA溶液分割在盒613内的微小分区(S901)。在本实施方式中，使用孔作为微小分区。

希望在DNA溶液的上表面添加油，以使分割成孔的DNA溶液在核酸扩增反应和熔解曲线分析的测量中不蒸发。油优选在PCR反应液中为不溶性或难溶性的化学惰性的物质，另外，优选对于PCR那样的高温下的温度变化稳定的物质。可以使用氟系油、有机硅系油、烃系油等。作为氟系油，例如可以列举全氟化碳(Perfluorocarbon)、氢氟醚(Hydrofluoroether)等。氟系油的碳链越长则挥发性越低，故而优选。作为有机硅系油，例如可以列举聚苯甲基硅氧烷(Polyphenylmethylsiloxane)或三甲基硅氧基硅酸酯(Trimethylsiloxysilicate)等。作为烃系油，例如可以列举矿物油、液体石蜡、十六烷等。油可以添加表面活性剂来使用。这里表面活性剂的种类没有特别限定，可以适用Tween 20、Tween 80、Span80、Triton X-100等。

接着，将盒613设置在热循环仪上(S902)。

首先，在各孔中，通过控制热循环仪的温度进行核酸扩增反应(S903)。通过重复包括变性工序、延伸工序和退火工序的循环，扩增DNA。在使用DNA嵌入剂的情况下，其插入扩增的DNA，在使用分子信标的情况下，其与扩增的DNA杂交。由此，在DNA扩增的同时，荧光强度变强。本领域技术人员能够容易地设定包括各工序的温度、时间、循环数等的反应条件。核酸扩增反应后，将温度降低到室温时，扩增得到的DNA形成双链。

此时，一边通过温度调节装置使温度变化，一边对各孔测定伴随温度变化而变化的荧光强度(S903)。具体的步骤如下所述。将盒613设置在DNA检测系统的调温台612上。一边通过调温台612使盒613的温度变化，一边通过荧光测定部701测定各孔的来自荧光标记探针或DNA嵌入剂的荧光强度。这里，荧光强度可以用光电万用表606直接测定，但也可以通过获得荧光图像，对图像进行解析来获得。具体而言，例如计算机702或其他的构成要素作为拍摄控制部发挥功能，使拍摄装置拍摄图像。将所得到的荧光图像送往计算机702，在解析部703由荧光图像算出各微小分区的荧光强度。将所得到的各微小分区的荧光强度数据存储于存储器705。

从所得到的各微小分区的荧光强度数据，判断包含目标基因的正孔、不含目标基因的负孔(S904)。

另一方面，解析部703基于其荧光强度数据制作熔解曲线(S905)，计算微分曲线的峰数(S906)。正孔中，鉴定熔解曲线的微分曲线的峰数为设定数以上的孔的位置(S907)。在熔解曲线的微分曲线的峰数为设定数以上的孔的位置接近的情况下，判断在该位置存在气泡(S908)。这里，作为气泡的探测中使用的信息，可以使用微小分区的荧光图像整体，通过图像识别检测出圆形气泡。从各孔的熔解曲线计算熔解温度，存储于存储器705中(S909)。将这样基于荧光强度的测定所算出的熔解温度称为“测定熔解温度”，与预先定义的基准熔解温度相区别。参照存储器705中的数据库704，从荧光的颜色和测定熔解温度，参照基准熔解温度，判断孔内DNA的种类(S910)。

显示包括判断为存在气泡的区域所含的孔在内、或除去了判断为存在气泡的区域所含的孔后的荧光强度与熔解温度的关系的曲线图等解析结果(S911)，用户选择在解析结果中包括或除去了气泡区域的孔(S912)。

最后在显示器显示盒内的目标基因的数量(S913)。以下，表示具体的显示例。

如图10A所示，在设置有微孔的盒内的片(chip)1001的图解或荧光图像中，可以重叠显示推测为存在气泡的部位的标记1002。这样如果在显示器还显示气泡附近的微小分区的位置及其分区数，则能够将这些信息在数字PCR的精度管理中利用。此外，在荧光强度与熔解温度的曲线图上，重叠野生型的熔解温度范围1003和突变型的熔解温度范围1004、由熔解曲线分析算出的各微小分区的图例1005，也可以显示包括判断为存在气泡的区域所含的孔在内的解析结果(图10B)和除去了判断为存在气泡的区域所含的孔的解析结果(图10C)。由此，用户就能够利用任何一种结果。

图11是显示器所显示的测定结果的一例。该例表示测定癌相关基因A和B的野生型和突变型作为目标基因的结果。在选择包括判断为存在泡的区域所含的孔的解析结果和除去了判断为存在泡的区域所含的孔的解析结果的任何一种结果后，可以如图11A所示，对于每个癌相关基因的种类和突变的种类，显示检测体溶液所含的计数得到的DNA的数量。此时，作为总基因数，可以显示由目标基因的野生型和突变型的合计算出的值。通过这样的显示，装置的使用者能够容易掌握检测体溶液的内容。或者，可以如图11B所示，对于每个癌相关基因的种类和突变的种类，显示检测体溶液所含的计数得到的DNA的比例。在图11B的例子中，显示了目标基因中的突变型基因的比例。

显示器所显示的结果可以是如图11这样的检测体溶液DNA的数量或比例，也可以如图10这样的在荧光标记探针的荧光强度和测定熔解温度的2个坐标轴绘制了检测体溶液的测量值的图表，还可以包括这两者。另外，还可以包括相对于荧光标记探针的荧光强度或测定熔解温度绘制检测体溶液的DNA的数量得到的直方图。

关于在对DNA的数量计数时使用的荧光标记探针的荧光强度相关的范围，用户可以任意变更。另外，关于在对DNA的数量计数时使用的基准熔解温度相关的范围，用户也可以任意变更。DNA检测系统可以接受用于使它们变更的操作，改变该范围。这样操作时，用户可以观察测定结果的曲线图或直方图，改变荧光强度和/或基准熔解温度的范围，再次对处于新的范围内的检测体溶液的DNA的数量进行计数。

此外，如上所述，由于检测体溶液以孔或微滴中的溶液的形式操作，所以也可以代替检测体溶液的DNA的数量，而表示为孔数或微滴数。

另外，在气泡附近的微小分区的分区数为一定数以上的情况下，可以作为测定错误在显示器706显示警报。该警报例如表示用户需要数字PCR系统的调整。

(4)多个目标基因的检测方法

在使用熔解曲线分析的数字PCR中，利用荧光标记探针和DNA的熔解温度根据目标基因而不同的现象，能够进行多个目标基因的判别。例如，能够例示作为目标基因，包含野生型等位基因和突变型等位基因的多个种类的情况，但多个种类的目标基因不特别限定于此。

例如，在检查对象的DNA溶液包含目标基因P和目标基因Q的情况下，在包含目标基因P的微小分区中，对应于目标基因P的荧光标记探针与通过PCR扩增得到的DNA杂交而发出荧光。通过解析所产生的荧光，能够算出与目标基因P的荧光标记探针对应的熔解温度。另外，在包含目标基因Q的微小分区中，与目标基因Q对应的荧光标记探针与通过PCR扩增得到的DNA杂交而发出荧光。通过解析所产生的荧光，能够算出与目标基因Q的荧光标记探针对应的熔解温度。这样，就能够根据荧光强度、荧光的种类(例如颜色)和熔解温度，判断目标基因P的有无、目标基因Q的有无。

DNA的熔解温度不受PCR的反应效率或荧光测定时的平面内测定偏差等影响，因此能够通过使用DNA的熔解温度，高精度地判别微小分区内的DNA的基因型。例如，以对于目标基因的各荧光标记探针的熔解温度(Tm)不同的方式，预先确定荧光标记探针的序列，对于微小分区内的DNA，测定伴随温度变化的荧光强度变化，进行熔解曲线分析，比较熔解温度，由此能够进行微小分区内的DNA的基因型判别。

在同时检测多个种类的目标基因的情况下，它们的区分能够根据基准熔解温度和测定熔解温度来进行，优选根据基准熔解温度范围进行区分。例如，某个孔所涉及的测定熔解温度如果在包含关于某个目标基因在数据库704所存储的基准熔解温度的规定范围内(例如基准熔解温度±1℃以内)，则判定在该孔中配置有该目标基因。如果使用这样的基准熔解温度范围，则能够进行适当考虑了容许范围的更加准确的判定。

或者，作为荧光强度的信息，也可以使用不同温度下的荧光强度的比或差。例如，通过使用比基准熔解温度低的温度下的荧光强度与比基准熔解温度高的温度下的荧光强度之比或差，能够将荧光强度标准化。例如，如果关于某个孔，该比或差在规定范围内，则将该的孔判定为正，如果不在规定范围内，则将该孔判定为负。

例如，通过将50℃时的荧光强度减去85℃时的荧光强度，能够去掉荧光标记探针本身的荧光的影响、即背景的影响。

此外，确定荧光强度的范围、基准熔解温度的范围的方法可以任意选择。例如，可以预先进行试行实验等，作业者从其结果统计地确定，也可以DNA检测系统自动确定。另外，还可以在数字PCR每次测定时，使用盒内的各孔的测定数据，统计地确定荧光强度的阈值和基准熔解温度的规定的范围。

用于统计地进行孔内的DNA的判别的数据可以包括如下项目的任意个或所有，也可以包括这些以外的项目。

-比基准熔解温度低的温度下的荧光强度

-比基准熔解温度高的温度下的荧光强度

-比基准熔解温度低的温度下的荧光强度相对于比基准熔解温度高的温度下的荧光强度之比

-比基准熔解温度低的温度下的荧光强度与比基准熔解温度高的温度下的荧光强度之差

-表示基准熔解温度的特征量

-表示熔解曲线的形状的特征量

(5)程序

本发明的实施方式为用于使DNA检测系统进行DNA检测方法的程序。另外，本发明的另一个实施方式为储存上述程序的存储介质。

实施例

在本实施例中，使用荧光标记探针，测定孔内的DNA的熔解温度，表示判别KRAS基因及其突变型G12A和G13D的结果。

首先，准备KRAS基因的野生型、G12A和G13D突变型的基因组DNA(最终浓度133分子/μL)，加入PCR所需要的正向引物(最终浓度0.25μM)、反向引物(最终浓度2.0μM)、与野生型对应的荧光标记探针(最终浓度0.5μM)、与G12A突变型对应的荧光标记探针(最终浓度0.5μM)、以及1x Master Mix(包含DNA聚合酶，dNTP)，制备PCR反应液。此时，引物对的浓度以非对称的方式添加，使得荧光标记探针的互补DNA链过剩扩增。G13D突变型使用与野生型对应的、包含错配碱基的荧光标记探针检测。引物和探针的序列如下所示。其中，荧光标记探针均在两端附近具有互补的序列，它们设计为在分子内能够形成双链。另外，在5'末端作为荧光色素结合有HEX，在3'末端作为淬灭剂结合有BHQ-1。

正向引物：5'-GTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGG-3'(序列编号1)

反向引物：5'-GTATCGTCAAGGCACTCTTGCC-3'(序列编号2)

与野生型对应的荧光标记探针：5'-TTGGAGCTGGTGGCGT-3'(序列编号3)

与突变型对应的荧光标记探针：5'-TTGGAGCTGCTGGCGT-3'(序列编号4)

然后，对于各孔，以放入KRAS基因的野生型或G12A、G13D突变型的DNA的任意1个或者都不放入的方式，在孔中添加15μL的PCR反应液，通过PCR扩增DNA。PCR的反应在96℃、10分钟处理后，进行(60℃，2分钟→98℃，30秒)59个循环，最后在60℃处理2分钟。反应后，一边将设置有孔的片在调温台上从85℃冷却到50℃一边观察各孔的荧光强度变化，进行熔解曲线的测定和解析。

图12A是测定KRAS基因的野生型与G12A、G13D突变型的混合检测体时的各孔的熔解曲线的微分曲线。各孔的熔解曲线的微分曲线具有一个峰，计算峰的位置的温度作为熔解温度。图12B是基于图12A的结果，将各孔的50℃的荧光强度表示在横轴，将熔解温度表示在纵轴的图。如果去除负孔1207，则正孔根据熔解温度的不同而分为3种分布：在69℃附近具有分布的集团1201为仅含野生型的孔，在66℃附近具有分布的集团1202为仅含G12A突变型的孔，在63℃附近具有分布的集团1203为仅含G13D突变型的孔。根据该结果，设定野生型的熔解温度范围1204、G12A突变型的熔解温度范围1205、G13D突变型的熔解温度范围1206。

这里，在测定仅含KRAS基因的野生型的检测体时，如图12D所示，观察具有偏离野生型的熔解温度范围的熔解温度的集团1208。该具有偏离野生型的熔解温度范围的熔解温度的集团1208的熔解曲线如图12C所示，具有多个峰，如图12E所示，将孔的位置映射到片的荧光图像，则可知为局部聚集。确认荧光图像，则该部位与气泡存在的位置一致。因此，通过将该气泡存在的附近的孔从数据中去除，能够判定作为G12A突变型误检的16个孔、作为G13D突变型误检的1个孔。

这样，在数字PCR的基因型的判别中，通过从熔解曲线的峰数探测气泡，去除气泡附近的孔的数据，能够去掉错误算成不同的熔解温度的孔，防止误判，提高测定精度。

符号说明

101…DNA

102…荧光标记探针

103…荧光色素

104…淬灭剂

201…微滴

202…微滴补充用的凹部

203…油

204…盒

205…气泡

301…PCR反应液

302…贯通孔片

303…油

304…盒

305…气泡

401…熔解温度

501…野生型等位基因的熔解温度

502…突变型等位基因的熔解温度

503、504…错误算出的熔解温度

601、602、611…微滴

603…微流路

604…光源

605…荧光滤光器

607…拍摄装置

608…透镜

609…二向色镜

610…微滴检测用盒

612…调温台

613…盒

614、615…孔

701…荧光测定部

702…计算机

703…解析部

704…数据库

705…存储器

706…显示器

1001…盒内的片

1002…推测存在气泡的部位

1003…野生型等位基因的熔解温度范围

1004…突变型等位基因的熔解温度范围

1005…由熔解曲线分析算出的各微小分区的图例

1201…包含野生型的孔

1202…包含G12A突变型的孔

1203…包含G13D突变型的孔

1204…野生型等位基因的熔解温度范围

1205…G12A突变型的熔解温度范围

1206…G13D突变型的熔解温度范围

1207…负孔

1208…具有偏离野生型的熔解温度范围的熔解温度的集团

1209…熔解曲线的微分曲线具有多个峰的孔。

序列表

<110> 株式会社日立高新技术

<120> DNA检测方法和DNA检测系统

<130> 342100492

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

gtcacatttt cattattttt attataag 28

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

gtatcgtcaa ggcactcttg cc 22

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

ttggagctgg tggcgt 16

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

ttggagctgc tggcgt 16

Claims

1.一种DNA检测方法，其特征在于，包括：

将含有荧光标记探针或DNA嵌入剂和多种检测对象的DNA的检测体溶液分割成多个微小组分的第一工序；

在包含所述微小组分的微小分区中进行核酸扩增反应的第二工序；

在各个所述微小分区中，伴随温度变化，测定来自所述荧光标记探针或所述DNA嵌入剂的荧光强度的第三工序；

根据所述测定得到的各荧光强度计算所述检测对象的DNA的熔解温度的第四工序；

确定受到了气泡的影响的所述微小分区的第五工序；和

从所述多个微小分区得到的总数据除去所述受到了气泡的影响的所述微小分区的数据的第六工序。

2.如权利要求1所述的DNA检测方法，其特征在于：

在第五工序中，作为所述受到了气泡的影响的所述微小分区，确定为根据第三工序中测定得到的各荧光强度制作的熔解曲线的微分曲线的峰数为规定值以上的微小分区。

3.如权利要求1或2所述的DNA检测方法，其特征在于：

在第五工序中，在相邻的2个以上的所述微小分区被确定为所述受到了气泡的影响的所述微小分区时，在第六工序中，将该相邻的2个以上的所述微小分区的数据除去，且

在第五工序中，在单独的所述微小分区被确定为所述受到了气泡的影响的所述微小分区时，在第六工序中，不除去该单独的所述微小分区的数据。

4.如权利要求1所述的DNA检测方法，其特征在于：

在第五工序中，通过所述微小分区的图像的解析来确定所述受到了气泡的影响的所述微小分区。

5.如权利要求1所述的DNA检测方法，其特征在于：

在第五工序中，选择根据第三工序测定得到的各荧光强度制作的熔解曲线的微分曲线的峰数为规定值以上的微小分区，通过所述选择的微小分区的图像的解析确认是否受到所述气泡的影响，由此确定所述受到了气泡的影响的所述微小分区。

6.如权利要求5所述的DNA检测方法，其特征在于：

在第五工序中，在相邻的2个以上的所述微小分区中，选择所述微分曲线的峰数为规定值以上的微小分区，且

在第五工序中，在单独的所述微小分区中，不选择所述微分曲线的峰数为规定值以上的微小分区。

7.如权利要求1～6中任一项所述的DNA检测方法，其特征在于：

在第一工序中，所述DNA溶液被极限稀释。

8.如权利要求1～7中任一项所述的DNA检测方法，其特征在于：

在第四工序中，在所述各微小分区中，根据所述熔解温度，判断所述多个检测对象的DNA的种类，

在第五工序中，对于判断了种类的所述DNA的各种类，进一步根据表示规定的基准熔解温度的信息确定所述微小分区。

9.如权利要求1～8中任一项所述的DNA检测方法，其特征在于：

所述微小分区由以阵列状排列的孔或分散在油中的微滴构成。

10.如权利要求1～9中任一项所述的DNA检测方法，其特征在于：

在第四工序中，所述熔解温度作为根据第三工序中测定得到的各荧光强度制作的熔解曲线的拐点算出。

11.一种DNA检测系统，其特征在于，包括：

具有用于加入含有荧光标记探针或DNA嵌入剂的DNA溶液的多个微小分区的第一装置；

用于拍摄第一装置的图像的第二装置；

为了在所述微小分区中进行核酸扩增反应，用于调整所述微小分区的温度的第三装置；

在所述微小分区中，为了获得伴随温度变化而变化的荧光强度，使所述拍摄装置拍摄图像的、用于控制拍摄装置的第四装置；和

用于根据获得的所述微小分区的所述荧光强度探测气泡的产生的第五装置。