CN114929894A - Dna检测方法以及dna检测系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种在使用熔解曲线分析的数字PCR中，通过测定装置准确地区分配置有目标基因的微小分区和配置有假基因的微小分区，高精度地对目标基因进行计数的方法及系统。方法包括：在多个分区分别配置DNA溶液的工序；进行核酸扩增反应的工序；使各所述分区温度变化并测定荧光强度的工序；针对各所述分区计算DNA的双链的熔解温度的工序；针对所述DNA的各种类计数分区的数量的工序；输出针对所述DNA的各种类计数的分区的数量的工序；以及根据所述熔解温度和所述计数的分区的数量判别所述第一基因和所述假基因的工序。

Description

DNA检测方法以及DNA检测系统

技术领域

本发明涉及DNA检测方法以及DNA检测系统，特别涉及数字PCR。

背景技术

在以往的基因检查中，有PCR(专利文献2-4)、实时PCR(非专利文献1)等方法。在这些方法中，存在作为检测对象的基因(在本说明书中称为“目标基因”)为微量时测定再现性降低的课题。

作为解决该课题的方法，开发了数字PCR(专利文献1)。若使用数字PCR，则使用极限稀释后的样本，判定、检测DNA是0(无)还是1(有)，由此能够定量微量的DNA。

以下示出数字PCR的检测方法的一例。首先，在极限稀释的检体中加入PCR所需的DNA聚合酶、引物(primer)、荧光标记探针(probe)，调制PCR反应液。将PCR反应液分割成孔或微滴等微小分区。此时，使各分区分别为1个分子的目标基因进入或未进入中的任一个。

接着，通过PCR扩增微小分区内的目标基因。PCR后测定各微小分区的荧光强度，计数具有超过阈值的荧光强度的微小分区的数量，由此能够对目标基因进行定量。

在这样的数字PCR中，由于使用极限稀释的检体，所以能够抑制成为阻碍PCR的反应的主要原因的来自检体的成分的影响。另外，由于不需要标准曲线，因此能够直接测定作为对象的DNA的绝对量。

然而，已知在以往的PCR中，由于反应液中的反应阻碍物的存在、模板DNA的二次结构的形成、引物的设计不充分等理由，反应效率降低。

另一方面，在数字PCR中，由于在反应的终点进行测定，因此PCR的反应效率本身对测定结果没有大的影响。但是，实际上，即使在终点进行测定，由各微小分区的PCR反应效率的不均匀性引起的荧光强度偏差也大，使数字PCR的测定再现性和测定精度降低。

因此，本发明人等为了提高数字PCR的测定再现性和测定精度，开发了即使各微小分区的PCR反应效率不均匀，也能够通过测定PCR扩增产物的熔解温度(Tm)来判别微小分区内的目标基因的技术(专利文献5)。具体而言，例如，在PCR后，通过测定在微小分区内扩增的目标基因与荧光标记探针解离的熔解温度(Tm)，即使PCR的反应效率不均匀，也能够根据熔解温度的不同来鉴定目标基因的基因型。

在目标基因的检测中，存在假基因的存在成为问题的情况。在生物进化的过程中获得新的基因，另一方面，还产生失去了功能的假基因。假基因是在某个基因进化的过程中制作拷贝，一方在具有本来的功能的状态下使另一方变化，变化后的基因未获得新的功能而失去功能的物质。因此，例如KRAS基因和作为其假基因的KRASP1基因那样，两者的序列的同源性极高。

因此，在目标基因中存在假基因的情况下，有时无法判别目标基因及其假基因，将假基因错误地计数为目标基因，目标基因的拷贝数变得比真实的值多。

在以往的定量PCR中，由于在相同的1个分区内存在目标基因和假基因，因此如果选择目标基因和假基因的序列即使只有几个碱基也不一致的部分来设计引物，则目标基因和假基因的扩增竞争，假基因的扩增被抑制，能够优先扩增目标基因。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2013-521764号公开公报

专利文献2：美国专利第4683195号公报

专利文献3：美国专利第4683202号公报

专利文献4：美国专利第4800159号公报

专利文献5：日本特开2018-108063号公开公报

非专利文献

非专利文献1：Genome Res.，10，pp986-994，1996

发明内容

发明所要解决的课题

然而，在数字PCR中，存在难以判别上述的假基因的问题。

在数字PCR中，与定量PCR不同，将添加了检体的反应液分割为微小的分区，使得1个分子的目标基因进入或不进入1个分区。因此，在1个分区仅存在目标基因和假基因中的任一方。

因此，存在如下问题：即使与针对目标基因设计的引物区域不一致的部分在假基因中存在几个碱基，在仅包含假基因的微小分区中，由于没有与目标基因的竞争，因此假基因扩增，假基因成为目标基因的假阳性。

判别目标基因和假基因在降低假阳性和假阴性、提高测定再现性和测定精度方面是重要的。

因此，本发明的目的在于提供一种新的DNA检测方法及DNA检测系统，其在使用熔解曲线分析的数字PCR中，通过测定装置准确地区分配置有目标基因的微小分区和配置有假基因的微小分区，高精度地对目标基因进行计数。

用于解决课题的手段

本发明人等发现，在使用了熔解曲线分析的数字PCR中，如果以目标基因和假基因的熔解温度不同的方式设计探针，则能够根据熔解温度将目标基因和假基因判别为不同的基因，并且能够根据2个基因的计数数量的对应关系将它们确定为目标基因及其假基因，从而完成了本发明。

本发明的DNA检测方法的一个例子包括如下工序：

配置DNA溶液的工序，是在多个分区分别配置DNA溶液的工序，所述DNA溶液能够含有包含第一基因及其假基因的多种DNA，所述DNA溶液含有荧光标记探针或DNA嵌入剂；

在各所述分区进行核酸扩增反应的工序；

在所述核酸扩增反应中或在所述核酸扩增反应后，使各所述分区温度变化，并且对各所述分区测定随着所述温度变化而变化的荧光强度的工序；

基于随着所述温度变化的所述荧光强度的变化，针对各所述分区，计算出配置于该分区的DNA的双链的熔解温度的工序；

基于所述熔解温度对各所述分区判别DNA的种类，并且对所述DNA的各种类计数分区的数量的工序；

输出对所述DNA的各种类计数的分区的数量的工序；以及

根据所述熔解温度和所述计数的分区的数量来判别所述第一基因和所述假基因的工序。

本发明的DNA检测系统的一个例子具备：

拍摄装置，其对能够在多个分区分别配置DNA溶液的设备的图像进行拍摄，所述DNA溶液能够含有包含第一基因及其假基因的多种DNA，所述DNA溶液含有荧光标记探针或DNA嵌入剂；

温度调整部，其为了在各所述分区进行核酸扩增反应而使各所述分区的温度变化；

数据库，其针对所述第一基因和所述第一基因的假基因，分别存储表示基准熔解温度的信息；

拍摄控制部，其为了针对各所述分区取得随着温度变化而变化的荧光强度，使所述拍摄装置拍摄图像；

熔解温度存储器，其针对各所述分区存储表示配置于该分区的所述DNA的双链的熔解温度的信息，所述熔解温度是基于由所述拍摄装置拍摄到的图像中的随着温度变化的荧光强度的变化而得到的；以及

解析部，其使用所述数据库和所述熔解温度存储器，对配置有所述第一基因的所述分区的数量和配置有所述假基因的分区的数量进行计数，所述解析部输出对所述DNA的各种类进行计数而得到的分区的数量，根据所述熔解温度和所述计数而得到的分区的数量来判别所述第一基因和所述假基因。

发明效果

根据本发明，提供一种新的DNA检测方法和DNA检测系统，其在使用了熔解曲线分析的数字PCR中，通过测定装置更准确地辨别配置有目标基因的微小分区和配置有假基因的微小分区，更高精度地对目标基因进行计数。

附图说明

图1是基于实施方式1的DNA检测方法的原理的测定结果的例子。

图2是通过测量2种不同的荧光色素的荧光强度来检测目标基因的野生型和变异型的数字PCR的测定结果的例子。

图3是实施方式1的荧光测定部的示意图。

图4是实施方式1的数字PCR系统的示意图。

图5是实施方式1的DNA检测方法中使用的数据库的一例。

图6是表示在实施方式1的DNA检测方法中，使用荧光标记探针测定DNA的熔解温度的方法的示意图。

图7是实施方式1中的、与伴随温度变化的孔所包含的荧光色素的荧光强度相关的数据的一例。

图8是实施方式1中的、与由伴随温度变化的各孔的荧光强度变化得到的熔解温度相关的数据的一例。

图9是表示在实施方式1中对各分区的基因进行计数而得的结果的一例。

图10是表示使用图3和图4的装置进行熔解温度测定的方法的一个实施方式的流程图。

图11是显示于监视器的测定结果的一例。

图12是实施方式1的测定结果的一例。

具体实施方式

本发明的目的、特征、优点以及它们所涉及的构思通过本说明书的记载，对于本领域技术人员而言是显而易见的。根据本说明书的记载，本领域技术人员能够容易地再现本发明。以下记载的发明的实施方式及具体的实施例等表示本发明的优选的实施方式，是为了例示或说明而示出的，并不将本发明限定于此。在不脱离本说明书所公开的本发明的意图以及范围的情况下，基于本说明书的记载，能够进行各种改变以及修饰，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。

[实施方式1]

(1)DNA检测方法的原理和效果

图1表示基于实施方式1的DNA检测方法的原理的测定结果的例子。该例子是在如下方法的代表性的实施方式中设想的：对于PCR扩增产物，基于伴随温度变化的荧光强度变化来计算出DNA双链的熔解温度，由此检测出目标基因的野生型、目标基因的变异型以及目标基因的假基因(pseudogene)。

针对包含目标基因的野生型等位基因的微小分区101、包含目标基因的变异型等位基因的微小分区102、以及包含目标基因的假基因的微小分区103，绘制了荧光强度与熔解温度的关系。

另外，图2中示出了通过测量2种不同的荧光色素的荧光强度来检测目标基因的野生型和变异型的数字PCR的测定结果的例子。

在数字PCR中，有时针对DNA的每个变异(基因型)使用不同颜色的荧光标记探针，通过一次测定来检测多种变异。图2的例子是示意性地表示对目标基因的野生型等位基因使用黄色的荧光标记探针、对目标基因的变异型等位基因使用绿色的荧光标记探针时的结果的图。对于包含目标基因的野生型等位基因的微小分区201、包含目标基因的变异型等位基因的微小分区202、以及包含目标基因的假基因的微小分区203，绘制了绿色的荧光强度与黄色的荧光强度的关系。

在此，荧光标记探针与位于用于PCR的引物对之间的序列互补，并且构成为在引物伸长时探针被分解，荧光标记发出荧光。具体而言，可以例示TaqMan(注册商标)探针。

若在PCR中DNA扩增，则在包含目标基因的野生型等位基因的微小分区201中，与目标基因的野生型等位基因对应的黄色的荧光标记探针被分解，发出黄色的荧光。另外，在包含目标基因的变异型等位基因的微小分区202中，与目标基因的变异型A等位基因对应的绿色的荧光标记探针被分解，发出绿色的荧光。不包含目标基因的空的微滴，未检测出绿色和黄色的荧光中的任一方(未图示)。

但是，实际上如图2所示，有时在目标基因中存在序列非常相似的假基因。即使与针对目标基因设计的引物区域不一致的部分在假基因中有几个碱基，在包含假基因的微小分区203中，由于没有与目标基因的竞争，因此假基因扩增。由此，目标基因的荧光标记探针被分解，发出黄色的荧光，有时与包含目标基因的野生型等位基因的微小分区201的分布重叠。

在使用熔解曲线分析的数字PCR中，利用荧光标记探针和DNA的熔解温度根据基因型而不同，能够进行基因型的判别。图1的例子是示意性地表示对于目标基因，使用与野生型、变异型、假基因分别对应的荧光标记探针，测定各微小分区内的DNA的熔解温度的结果的图。

在此，作为荧光标记探针，例如可以使用公知的分子信标。以下，以分子信标为例，详细说明DNA检测方法。分子信标构成为寡核苷酸，具有与位于用于扩增目标基因的PCR的引物对之间的序列互补的序列。另外，分子信标在其两端具有相互互补的序列，在一端设置有荧光色素，在另一端设置有消光色素(淬火剂)。

分子信标与目标基因杂交时，位于两端的荧光色素与消光色素分离而发出荧光，但随着温度上升而从目标基因解离时，两端的互补序列相互杂交而形成茎环结构，荧光色素与消光色素接近而荧光色素消光。

在包含目标基因的野生型等位基因的微小分区101，与目标基因的野生型等位基因对应的荧光标记探针与通过PCR扩增的DNA杂交而发出荧光，观察与野生型等位基因的荧光标记探针对应的熔解温度。

另外，在包含目标基因的变异型等位基因的微小分区102，与目标基因的变异型等位基因对应的荧光标记探针与通过PCR扩增的DNA杂交而发出荧光，观察与变异型等位基因的荧光标记探针对应的熔解温度。

并且，在包含目标基因的假基因的微小分区103，与目标基因的野生型等位基因对应的荧光标记探针以包含错配碱基的形式与通过PCR扩增的DNA杂交而发出荧光，观察与该错配杂交对应的熔解温度。

这样，基于荧光强度、荧光的种类(例如颜色)和熔解温度，能够判断有无具有野生型等位基因的目标基因、有无具有变异型等位基因的目标基因、有无具有假基因的目标基因。

DNA的熔解温度不受PCR的反应效率、荧光测定时的平面内测定偏差等影响，因此能够高精度地判别微小分区内的DNA的基因型。例如，以各荧光标记探针相对于目标基因的熔解温度(Tm)不同的方式决定荧光标记探针的序列，对微小分区内的DNA测定伴随温度变化的荧光强度变化，进行熔解曲线分析，比较熔解温度，由此能够进行微小分区内的DNA的基因型判别。

并且，目标基因的拷贝数与其假基因的拷贝数的关系(例如比)由各个基因在染色体上的位置决定，例如在两者存在于常染色体上的情况下，它们的拷贝数彼此相等。因此，对各微小分区的DNA的基因型进行计数，确认目标基因的野生型的拷贝数和变异型的拷贝数的合计与假基因的拷贝数的关系是否符合所期待的关系(例如1：1)，从而能够进行更高精度的基因检测。

(2)DNA检测装置的结构例

实施方式1的DNA检测系统具备用于检测DNA溶液中的目标基因的DNA检测装置，执行本说明书中记载的DNA检测方法。在本实施方式中，DNA检测装置单独构成DNA检测系统，但也可以设计成多个装置协作而构成DNA检测系统。

DNA检测装置具备：温度调整部，其用于加热DNA溶液；荧光测定部，其用于测定从DNA溶液释放的荧光的强度；计算机，其基于表示伴随DNA溶液的温度变化的所述荧光的强度的变化的熔解曲线，计算DNA双链的熔解温度；以及监视器，其显示从计算机发送的信息。

DNA溶液可以在任何载体中，例如，可以作为油中的微滴提供，也可以配置在板等的孔内。作为DNA检测装置的例子，使用图3和图4表示具有荧光测定部的DNA检测装置。

图3是实施方式1的荧光测定部的示意图，图4是实施方式1的数字PCR系统的示意图。图3的荧光测定部测定被极限稀释的微滴或孔所包含的荧光色素的颜色和荧光强度。图4的数字PCR系统具备图3所例示的荧光测定部、解析测定数据的计算机、以及显示结果的监视器，使用熔解曲线分析。在这些例子中，荧光测定部测定微滴或孔中的DNA溶液所包含的荧光色素的颜色和荧光强度，但本发明的DNA检测装置的结构不限于此。

在图3A所示的荧光测定部的例子中，使用微流路来测定微滴的荧光强度。微滴301在微流路303中向箭头的方向流动。如果微滴流动到测定位置(在图3A中为微滴302的位置)，则一边通过温度调整部(未图示)对微滴进行加温，一边通过光源304对微滴照射激发光。通过光源304激发微滴中包含的荧光物质，通过荧光滤光器305用光电万用表(photomultiple meter)306检测发出的荧光。光电万用表306是拍摄能够在多个分区分别配置DNA溶液的设备的图像的拍摄装置的例子。

荧光测定部具备光源304、荧光滤光器305和光电万用表306。荧光测定部可以按照荧光色素的每个颜色分别设置，也可以如图3A所示那样构成为利用1个光源的激发光激发2种荧光色素，利用2个荧光滤光器同时检测各自的荧光。

另外，也可以如图3B以及图3C那样将微滴排列在平面上，测定各微滴的荧光色素的颜色以及荧光强度。

更具体地进行说明。例如，将多个微滴311在微滴检测用盒310中排列成阵列状，设置在作为温度调整部的调温台312上。调温台312为了在各分区进行核酸扩增反应而使各分区的温度变化。通过调温台312使微滴检测用盒的温度变化，测定伴随温度变化的微滴的荧光强度变化。在包含目标基因的微滴301和不包含目标基因的微滴302中，荧光强度分别进行不同的变化。

测定的顺序例如如下。首先，从光源304通过透镜308、荧光滤光器305以及分色镜309，将激发光照射到各微滴311。通过激发光激发各微滴311中包含的荧光物质，通过分色镜309、荧光滤光器305、透镜308由CCD照相机307检测发出的荧光。CCD照相机307是拍摄装置的示例。

在图3A中，需要逐个处理微滴，但在能够一次处理多个微滴这一点上，优选图3B以及图3C的装置。另外，在图3B和图3C的装置中，在也能够将调温台312用于DNA的扩增反应这一点上，也比图3A更优选。

并且，也可以如图3D那样代替微滴而使用排列成阵列状的孔。以1个或0个目标基因进入1个孔的方式添加检体，在孔内进行PCR，测定孔的荧光色素的颜色和荧光强度。

更具体地进行说明。例如，向设置于孔方式检测用的盒313的孔中添加包含检体的反应液。然后，在孔内进行PCR，设置在作为温度调整部的调温台312上。通过调温台312使盒313的温度变化，测定伴随温度变化的孔的荧光强度变化。在包含目标基因的孔314和不包含目标基因的孔315中，荧光强度分别进行不同的变化。

测定的顺序例如如下。首先，从光源304通过透镜308、荧光滤光器305以及分色镜309，向各孔照射激发光。通过激发光激发孔内的反应液中含有的荧光物质，通过分色镜309、荧光滤光器305、透镜308由CCD照相机307检测发出的荧光。在如图3D那样使用孔的情况下，不进行将微滴排列在微滴检测用盒中的工序，就能够在盒313内进行从PCR到熔解曲线分析。

在观察伴随温度变化的孔的荧光强度变化时，也可以在调温台312的下方设置倾斜调整部(未图示)。倾斜调整部去除因调温台312的加热而在盒313内产生的气泡。这防止在之后一边通过调温台312使试样的温度下降一边测量各孔的荧光强度时，由于气泡而无法取得荧光图像。

如图4所示，将由荧光测定部401检测出的荧光数据发送给计算机402。在计算机402中，由解析部403计算出扩增产物的熔解温度，并保存在存储器405中。这样，存储器405作为融解温度存储器发挥功能，针对各分区，存储表示配置于该分区的DNA的双链的融解温度的信息。另外，如后所述，熔解温度是基于由拍摄装置(例如光电万用表306)拍摄的图像中的、伴随温度变化的荧光强度的变化而得到的。

另外，预先在数据库404中准备了基因的种类、熔解温度、数量的关系。特别是，数据库404针对目标基因(第一基因)和目标基因的假基因分别存储表示成为基准的预定的熔解温度(基准熔解温度)的信息。参照数据库404，基于存储器405的熔解温度的测定值来判别目标基因的基因型，按基因型进行计数。

将计数结果显示在监视器406上。监视器406是输出装置的例子，也可以将监视器406中的显示处理置换为向其他输出装置(打印装置、非易失性存储装置等)的输出处理。

实施方式1的DNA检测装置可以具备样本分割部。样本分割部将含有目标基因的DNA溶液分割成微小分区。微小分区可以构成为在盒内排列成阵列状的孔，也可以构成为分散在油中的微滴。通过这样构成分区，能够适当地进行极限稀释。

另外，实施方式1的DNA检测装置也可以包括用于对微小分区扩增DNA的扩增部。

(3)分析熔解曲线的方法的例子

图5表示在数字PCR的测量之前准备的、存储表示基因的基准熔解温度的信息的数据库的一例。图5所示的数据能够预先通过预实验等进行测量，并保存在数据库404中。

在图5的例子中，关于各基因，针对该基因和该基因的假基因分别存储有基准熔解温度。另外，在该例中，按每个基因型存储基准熔解温度。也可以针对1个基因定义多个变异型。

表示基准熔解温度的信息在该例中被定义为表示单一的温度的值，但也可以被定义为表示温度的范围的信息。

另外，在该例中，除了基准熔解温度以外，关于各基因的各基因型，还存储有表示荧光色素的颜色的信息。

另外，在该例子中，关于各基因，存储有表示目标基因(不区分基因型)的数量与其假基因的数量的关系的信息。该关系例如表示为比。在图5的例子中，关于基因A，示出了在目标基因存在x个拷贝的情况下，假基因存在x个拷贝，即示出了假基因的数量相对于目标基因的数量之比为1。

目标基因与其假基因的拷贝数的关系由各自的染色体上的位置决定，因此也可以按染色体上的每个位置关系定义拷贝数的关系。具体例如下所示。

首先，对目标基因位于常染色体上的情况进行说明。在这种情况下，如果假基因位于常染色体上，则假基因的数量与目标基因的数量相等(图5的基因A有对应于该情况的可能性)。当假基因位于X染色体上时，如果是女性的检体，则假基因的数量与目标基因的数量相等，另一方面，如果是男性的检体，则假基因的数量为目标基因的数量的一半(图5的基因B相当于该情况)。如果假基因位于Y染色体上，则如果是女性的检体，则假基因的数量为0，如果是男性的检体，则假基因的数量为目标基因的数量的一半。

接着，对目标基因位于X染色体上的情况进行说明。在这种情况下，当假基因位于常染色体上时，如果是女性的检体，则假基因的数量与目标基因的数量相等，另一方面，如果是男性的检体，则假基因的数量为目标基因的2倍。当假基因位于X染色体上时，假基因的数量与目标基因的数量相等(图5的基因A也有对应于该情况的可能性)。当假基因位于Y染色体上时，如果是女性的检体，则假基因的数量为0，如果是男性的检体，则假基因的数量与目标基因的数量相等。

并且，对目标基因位于Y染色体上的情况进行说明。在这种情况下，如果是女性的检体，则目标基因的数量为0。如果是男性的检体，且假基因位于常染色体上，则假基因的数量为目标基因的数量的2倍。如果是男性的检体，且假基因位于X染色体上，则假基因的数量与目标基因的数量相等。如果是男性的检体，且假基因位于Y染色体上，则假基因的数量与目标基因的数量相等。

图6是表示能够使用荧光标记探针测量目标基因和假基因的熔解温度的原理的示意图。作为荧光标记探针，优选使用被设计成具有能够与目标基因杂交的结构的分子信标。

如图6A所示，当荧光标记探针602单独游离存在时，形成茎环，并且荧光色素603和淬火剂604彼此靠近，因此不发出荧光。若将荧光标记探针602添加到PCR反应结束的检体溶液中，则在室温左右的温度下，如图6B所示，荧光标记探针602的环部分对在检体溶液内扩增的DNA601进行退火。由此，荧光色素603与淬火剂604分离，因此荧光标记探针602发出强荧光。

之后，当加热检体溶液时，如图6C所示，DNA601和荧光标记探针602解离，再次如图6A所示，在荧光标记探针602内形成茎环，因此来自荧光标记探针602的荧光强度降低。

图6D表示将此时的熔解曲线(表示荧光强度变化相对于温度变化的曲线)绘制成图表的结果一例。另外，该荧光标记探针可以与用于PCR的荧光标记探针共用，也可以制作使用与用于PCR的荧光标记探针不同的探针。

另外，熔解曲线的测定可以与核酸扩增反应并行地进行，也可以通过与核酸扩增反应独立地(例如，核酸扩增反应完成后)使检体溶液升温来进行。

图6E表示在图6D的熔解曲线中，将荧光强度以温度进行微分的结果(或荧光强度变化除以温度变化的结果)的微分曲线。另外，在图6E中使符号反转。计算出与荧光强度的拐点对应的温度作为DNA双链的熔解温度605。图6D的荧光强度的拐点处的温度对应于图6E的微分曲线的最大值处的温度。

这样，可以将熔解温度作为荧光强度的拐点而计算。根据这样的计算方法，能够高精度地计算熔解温度。

此外，可以基于公知技术来控制用于检测目标基因的荧光标记探针的熔解温度。例如，可以通过改变探针的序列、链长来进行控制。或者，也可以通过利用肽核酸(PeptideNucleic Acid，PNA)、锁核酸(Locked Nucleic Acid，LNA)那样的人工DNA来进行控制。

在此使用的荧光标记探针602中，荧光色素603和淬火剂604的组合只要是通常用于实时PCR的组合就没有特别限定。例如，作为荧光色素603的例子，可举出FAM、VIC、ROX、Cy3、Cy5等，作为淬火剂604的例子，可举出TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3等。

关于荧光标记探针602的序列，也可以分别准备目标基因的野生型、目标基因的变异型以及目标基因的假基因各自特异性的序列，并分别对它们进行检测。在该情况下，如图6F所示，荧光标记探针602可以包括具有与目标基因对应的序列的第一荧光标记探针和具有与假基因对应的序列的第二荧光标记探针。在这样的构成中，能够更容易地区分目标基因和假基因。

或者，也可以针对目标基因的野生型和目标基因的变异型分别准备特异性的序列，针对假基因，使特异性的序列的荧光标记探针与目标基因的野生型杂交而进行检测。此时，如图6G所示，荧光标记探针602可以包含具有与目标基因对应的序列的第一荧光标记探针。在这样的结构中，能够减少要准备的荧光标记探针的数量。

在实施方式1的变形例中，作为荧光标记探针的替代，也可以使用DNA嵌入剂。具体的方法是，首先，将DNA嵌入剂添加到PCR反应液中制作检体溶液，进行PCR等核酸扩增反应。在室温左右的温度下，DNA嵌入剂与在检体溶液内扩增的2条链DNA结合，发出强荧光。

之后，随着检体溶液的温度上升，检体溶液内的2条链DNA解离而成为1条链DNA，DNA嵌入剂不再结合，因此荧光强度减少。另外，荧光强度变化相对于温度变化的测定也可以与核酸扩增反应独立地(例如，核酸扩增反应结束后)通过使检体溶液升温来进行。

此外，目标基因的熔解温度可以通过改变引物的设计而依赖于PCR扩增产物的序列、序列的链长进行控制。

作为DNA嵌入剂，使用通过与2条链DNA结合而荧光强度增加、能够用于2条链DNA的检测的嵌入剂。具体而言，可应用SYBR(注册商标)Green I、SYBR Gold、PicoGreen(注册商标)、SYTO(注册商标)Blue、SYTO Green、SYTO Orange、SYTO Red、POPO(注册商标)-1、BOBO(注册商标)-1、YOYO(注册商标)-1、TOTO(注册商标)-1、JOJO(注册商标)-1、POPO-3、LOLO(注册商标)-1、BOBO-3、YOYO-3、TOTO-3、PO-Pro(注册商标)-1、YO-Pro(注册商标)-1、TO-Pro(注册商标)-1、JO-Pro(注册商标)-1、PO-Pro-3、YO-Pro-3、TO-Pro-3、TO-Pro-5、溴化乙锭等。在DNA嵌入剂是耐热的情况下，可以在进行PCR反应之前预先添加到孔或微滴中。

以下示出了使用图6的原理分析目标基因和假基因的熔解温度的方法。

将包含检体、荧光标记探针和酶类的PCR反应液分割为微小分区。在PCR处理之后，基于一边改变温度一边取得的荧光图像，计算各分区的荧光强度，如图7所示存储在存储器405中。图7表示在实施方式1中存储在存储器中的数据的一例。该数据例如是针对各孔，通过解析部对伴随温度变化的荧光色素的荧光强度进行解析而取得的。

在图7的例子中，对多种颜色测定荧光强度。这样，能够进行精度更高的判别。但是，荧光强度也可以对单一的颜色进行测定。

接着，基于相对于各分区的温度变化的荧光强度变化，制作各分区的熔解曲线。接着，根据各分区的熔解曲线，计算各分区的熔解温度的值，如图8所示存储在存储器405中。以下，将这样基于荧光强度的测定而计算出的熔解温度称为“测定熔解温度”，与预先定义的基准熔解温度进行区分。

图9是表示对各分区的基因进行计数而得的结果的一例。如图9所示，判定配置于各分区的基因是数据库404中的目标基因的野生型、还是目标基因的变异型、还是目标基因的假基因、或者都不是。接着，对目标基因的野生型的数量(配置有目标基因的野生型的分区的数量)、目标基因的变异型的数量(配置有目标基因的变异型的分区的数量)、以及目标基因的假基因的数量(配置有目标基因的假基因的分区的数量)进行计数。

接着，参照数据库404，对目标基因的数量(野生型和变异型的合计数)与假基因数量的关系进行判定。判定例如根据测定的假基因数量相对于目标基因数量的比是否与记录在数据库404中的比匹配来进行。

作为具体例，在检测图5所示的基因A的情况下，如果测定出的假基因数量相对于目标基因的数量的比为1，则判定为匹配，如果不为1，则判定为不匹配。此外，匹配的判定可以使用范围来进行，例如，在检测图5所示的基因A的情况下，如果测定的比在0.8～1.2的范围内，则判定为匹配，否则判定为不匹配。

此外，在图5的基因A的情况下，比为1或约1，但比根据基因而不同，为1/2、1、2、0中的任一个。

在测定出的比与记录于数据库404的比匹配的情况下，将表示它们匹配的信息显示于监视器406。在不匹配的情况下，将表示它们不匹配的信息(例如表示产生了测定错误的信息)显示于监视器406。可以将这些信息反映于数字PCR的精度管理。另外，在测定错误以预先设定的基准以上的频度发生的情况下，也可以在监视器406上显示警报。该警报例如包含表示对用户指示需要进行数字PCR系统的调整的信息。

(4)测定熔解温度的方法

参照图10的流程图对进行熔解温度测定的方法的一例进行说明。该例子是使用图3和图4所示的装置和盒进行熔解温度测定的方法的一实施方式。在该例子中，使用图3B的装置、具备图3D的孔的盒、DNA嵌入剂或分子信标。

首先，准备与通过数字PCR测定的目标的基因相关的数据库404(S1001)。接着，准备来自包含DNA的生物体试样的检体溶液(DNA溶液)。检体溶液有含有包含目标基因(第一基因)及其假基因的多种DNA的可能性。将该检体溶液添加到PCR反应液中。PCR反应液包含DNA聚合酶、引物、DNA嵌入剂或分子信标、脱氧核糖核苷酸类和缓冲液。由此，检体溶液含有荧光标记探针或DNA嵌入剂。

将该PCR反应液分割为在盒313内排列成阵列状的孔(S1002)。该工序是在多个分区分别配置检体溶液的工序。在此，在本实施方式中实施数字PCR处理。即，配置于各分区的检体溶液被极限稀释，由此能够执行数字PCR。

接着，将盒313设置于热循环器，通过热循环器的温度控制进行PCR(S1003)。这是在各分区进行核酸扩增反应的工序。通过反复进行包含变性工序、延伸工序和退火工序的循环，DNA扩增。

在使用DNA嵌入剂的情况下，其嵌入到扩增的DNA中，在使用分子信标的情况下，其与扩增的DNA杂交。由此，荧光强度变高。包含各工序的温度、时间、循环数等的反应条件可以由本领域技术人员容易地设定。PCR后，使温度降低至室温时，DNA形成2条链。

PCR后，取得荧光图像(S1004)。详细的步骤例如下所述。将盒313放置在DNA检测装置的调温台312上。在通过调温台312使盒313温度改变的同时，荧光测定部401测定来自各孔的DNA嵌入剂或分子信标的荧光强度。由此，取得荧光图像。

S1004的工序是使各分区温度变化，并且对各分区测定随着温度变化而变化的荧光强度的工序。S1004的工序可以在核酸扩增反应中进行，也可以在核酸扩增反应后进行。

在S1004的工序中，计算机402或其他构成要素也可以作为拍摄控制部发挥功能。拍摄控制部为了针对各分区取得随着温度变化而变化的荧光强度，使拍摄装置(例如光电万用表306)拍摄图像。

接着，将得到的荧光图像发送给计算机402，由解析部403计算各微小分区的荧光强度，并存储到存储器405中(S1005)。

解析部403根据该荧光强度数据生成熔解曲线(S1006)，使用该熔解曲线计算熔解温度，并存储在存储器405中(S1007)。该工序包括如下工序：基于随着温度变化的荧光强度的变化，针对各分区，计算出配置于该分区的DNA的双链的熔解温度。由此取得测定熔解温度。

另外，解析部403参照数据库404的与基准熔解温度相关的数据，基于存储器405的测定熔解温度，对目标基因的野生型、变异型、假基因各自的数量进行计数(S1008)。S1008的工序包括基于基准熔解温度和测定熔解温度对各分区判别DNA的种类，并且对DNA的各种类计数分区的数量的工序。

这样，在S1008中，解析部403使用数据库404和存储器405，对配置有目标基因(第一基因)的分区的数量和配置有假基因的分区的数量进行计数。另外，在S1008中，解析部403也可以判定检体溶液中是否含有目标基因和目标基因的假基因。

野生型、变异型、假基因的区分可以基于基准熔解温度和测定熔解温度来进行。例如，在图5的基因A的情况下，如果测定熔解温度为63℃，则可以判定为是目标基因的野生型。

该判定也可以基于范围来进行。例如，如果某个孔的测定熔解温度在包含针对某个遗传型记录在数据库404中的基准熔解温度的预定范围内(例如基准熔解温度±1℃以内)，则能够判定为在该孔中配置有该遗传型的基因。若使用这样具有宽度的范围，则能够进行适当地考虑了容许范围的牢固的判定。

接着，解析部403对目标基因的数量(野生型和变异型的合计数)与假基因数量的关系进行判定。即，根据熔解温度和计数得到的分区的数量来判别目标基因和假基因。例如，判定比是1、还是1/2、还是2、还是0、或者不是它们中的任一个。输出结果(S1009)。在此，如上所述，该判定也可以基于范围来进行。例如，解析部403在S1009的工序中，判定配置有假基因的分区的数量相对于配置有目标基因(第一基因)的分区的数量的比是与1对应的范围内的值、还是与1/2对应的范围内的值、还是与2对应的范围内的值、还是与0对应的范围内的值、或者是不在这些范围内的值。这样，通过自动地判定对应关系，装置的使用者能够更容易地掌握检体溶液的内容。

最后，监视器406将盒内的目标基因的数量和总基因数输出给监视器(S1010)。例如，输出针对DNA的各种类计数的分区的数量。

在S1008中，在各孔的DNA是阳性(即在该孔中配置有基因)还是阴性(即在该孔中未配置基因)的判定中，也可以利用荧光强度的信息。

作为荧光强度的信息，例如能够使用荧光强度的值本身。如果某孔的荧光强度在预定范围内，则判定该孔为阳性，否则判定该孔为阴性。

或者，作为荧光强度的信息，也可以使用不同温度下的荧光强度之比或差。例如，通过使用低于基准熔解温度的温度下的荧光强度与高于基准熔解温度的温度下的荧光强度之比或差，能够将荧光强度标准化。例如，对于某个孔，如果该比或差在预定范围内，则判定为该孔是阳性，否则判定为该孔是阴性。

例如，从50℃下的荧光强度减去85℃下的荧光强度，从而能够去除荧光标记探针自身的荧光的影响、即背景的影响。

此外，决定荧光强度的范围、基准熔解温度的范围、以及目标基因与假基因的拷贝数的对应关系(例如比)的范围的方法可以任意选择。例如，可以预先进行预实验等，由作业者根据其结果统计地决定，也可以由DNA检测系统自动地决定。另外，也可以在每次进行数字PCR测定时，使用盒内的各孔的测定数据，统计性地决定荧光强度的阈值和基准熔解温度的预定范围。

用于统计地进行孔内的DNA的判别的数据可以包含以下项目中的任一项或全部，也可以包含这些以外的项目。

-低于基准熔解温度的温度下的荧光强度

-高于基准熔解温度的温度下的荧光强度

-低于基准熔解温度的温度下的荧光强度相对于高于基准熔解温度的温度下的荧光强度之比

-低于基准熔解温度低的温度下的荧光强度与高于基准熔解温度的温度下的荧光强度之差

-表示基准熔解温度的特征量

-表示熔解曲线的形状的特征量

使用的检体溶液没有特别限定，只要是包含检测对象的DNA的试样即可，可以例示生物体试样(动植物的体液、组织、细胞、排泄物等)或土壤样本(包含真菌、细菌等)等。

作为体液，能够例示血液、唾液、髓液等。血液中包含无细胞DNA(cf DNA)和血中循环肿瘤DNA(ct DNA)等。作为组织，能够例示通过外科手术、活检法得到的疾病的患部(例如乳房、肝脏等癌组织)。组织可以是已经固定的组织，例如可以是福尔马林固定石蜡包埋组织切片(FFPE)。作为细胞，可以例示通过活检法采集的细胞(患部或其附近的细胞)、在血液中循环的血中循环肿瘤细胞等。

这些检体的前处理没有特别限定，可以直接使用从生物体、环境等采集后添加到悬浮液中进行匀浆、或者用溶解液溶解而得到的物质，但优选使用提取或精制它们中所含的核酸而得到的物质。

优选在PCR反应液的上表面添加油，以使分割成孔的PCR反应液在PCR和熔解曲线分析的测量中不蒸发。油优选在PCR反应液中为不溶性或难溶性的化学惰性的物质，另外，优选PCR那样的相对于高温下的温度变化稳定的物质。可以使用氟系油、硅系油、烃系油等。

作为氟类油，例如可举出全氟化碳(Perfluorocarbon)、氢氟醚(Hydrofluoroether)等。氟系油的碳链长时挥发性低，因此优选。作为硅系油，例如可举出聚苯甲基硅氧烷(Polyphenylmethylsiloxane)、三甲基硅氧基硅酸盐(Trimethylsiloxysilicate)等。作为烃类油，例如可列举出矿物油、液体石蜡、十六烷等。

油可以添加表面活性剂来使用。在此，表面活性剂的种类没有特别限定，可以应用Tween20、Tween80、Span80、TritonX-100等。

(5)显示结果

图11是显示于监视器的测定结果的一例。该例子表示将癌相关基因A和B这2种作为目标基因进行测定的结果。在该示例中，检测到相同数量的癌相关基因A和B。

可以如图11A所示，按照癌相关基因的种类和变异的种类，显示检体溶液中包含的计数的DNA的数量，也可以如图11B所示，按照癌相关基因的种类和变异的种类，显示检体溶液中包含的计数的DNA的比例。在图11B的例子中，显示目标基因中的变异型基因的比例。

如图11A所示，可以显示癌相关基因的总基因数(在该示例中，检测到相同数量的癌相关基因A和B)。总基因数可以是由目标基因的野生型和变异型的合计计算出的值，也可以是将该值用目标基因的假基因的测定结果补正后的值，还可以是根据目标基因的数量或假基因的数量计算出的值。若进行这样的显示，则装置的使用者能够容易地掌握检体溶液的内容。

显示于监视器的结果可以是图11那样的检体溶液DNA的数量或比例，也可以是图1那样的用荧光标记探针的荧光强度和测定熔解温度这2轴绘制检体溶液的计测值而得到的图表，也可以包含双方。另外，也可以包含绘制了相对于荧光标记探针的荧光强度或测定熔解温度的检体溶液的DNA的数量的直方图。

关于对DNA的数量进行计数时使用的荧光标记探针的荧光强度的范围可以由用户任意变更。另外，关于对DNA的数量进行计数时使用的基准熔解温度的范围也可以由用户任意变更。DNA检测系统也可以接受用于变更它们的操作，变更相应范围。这样，用户观察测定结果的图表、直方图，改变荧光强度和/或基准熔解温度的范围，能够再次计数处于新的范围内的检体溶液的DNA的数量。

除了目标基因的数量或比例以外，还可以显示假基因的计数数量。另外，DNA检测装置也可以对目标基因的计数数量与假基因的计数数量的对应关系是否匹配进行判定，并将结果显示于监视器406。例如，也可以是，判定假基因的计数数量相对于目标基因的计数数量之比是否匹配数据库404中保存的值(或范围)，在匹配的情况下，将表示这些计数数量匹配的信息(例如表示正常进行了测定的消息)显示于监视器406，在不匹配的情况下，将表示这些计数数量不匹配的信息(例如表示发生了测定错误的消息)显示于监视器406。

另外，如上所述，将检体溶液作为孔或微滴中的溶液来处理，因此也可以代替检体溶液的DNA的数量而表示为孔数或微滴数。

(6)程序

本发明的另一实施方式是用于使DNA检测装置进行DNA检测方法的程序。在此，DNA检测装置例如可以是实施方式1的DNA检测装置，使用上述部分(2)中详述的装置，作为DNA检测方法，执行上述部分(1)中详述的方法。

另外，本发明的又一实施方式是存储上述程序的记录介质。

[实施例]

在本实施例中，示出了使用荧光标记探针测定孔内的DNA的熔解温度，判别BRAF基因及其假基因的结果。

已知BRAF基因存在于作为常染色体的7号染色体上，作为其假基因的BRAFP1存在于X染色体上。本实施例中使用的检体是作为人大肠癌来源细胞株的HCT116的基因组DNA，这是男性的基因组DNA，因此BRAF基因的假基因的拷贝数应该是野生型和变异型的拷贝数的合计的一半。

首先，对于BRAF基因，准备野生型和V600E变异型的基因组DNA(最终浓度133分子/μL)。向其中加入PCR所需的正向引物(forward primer)(最终浓度0.25μM)、反向引物(reverse primer)(最终浓度2.0μM)、与野生型对应的荧光标记探针(最终浓度0.5μM)和1x主混合物(包括DNA聚合酶、dNTP)，调制PCR反应液。此时，以荧光标记探针的互补DNA链过度扩增的方式，以引物对的浓度成为非对称的方式添加。

引物和探针的序列如下。此外，荧光标记探针均在两端附近具有互补的序列，它们被设计成在分子内形成双链。另外，在5’末端结合有作为荧光色素的CAL荧光红610，在3’末端结合有作为淬火剂的BHQ-2。

正向引物：5’-CATGAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTGAT-3’(序列号1)

反向引物：5’-TGGGACCCACTCCATCGA-3’(序列号2)

与BRAF基因野生型对应的荧光标记探针：5’-GGTCTAGCTACAGTGAAATC-3’(序列号3)

然后，对于各孔，为了使BRAF基因的野生型的DNA进入1个、或V600E变异型的DNA进入1个、或使其都不进入，加入15μL的PCR反应液，通过PCR扩增DNA。

PCR的反应在96℃下处理10分钟后，使循环(60℃、2分钟后为98℃、30秒)进行59循环，最后在60℃下处理2分钟。反应后，一边将设有孔的芯片在调温台上从85℃冷却至50℃，一边观察各孔的荧光强度变化，进行熔解曲线的测定及解析。

将结果示于图12。此外，在使用2色以上的荧光色素的情况下，对于各色素可得到图12那样的结果。

图12A是以50℃的荧光强度相对于85℃的荧光强度的比为横轴、以测定熔解温度为纵轴，对测定包含BRAF基因的野生型和其假基因的检体时的结果进行绘制而得到的图。根据测定熔解温度的不同而分为2个分布，在65℃附近具有分布的集团1201(例如64℃～66℃的范围内)是包含BRAF基因的野生型的孔，在61℃附近具有分布的集团1203(例如60℃～62℃的范围内)是包含BRAF基因的假基因的孔。

图12B是测定包含BRAF基因的野生型、V600E变异型和假基因的检体的结果。根据测定熔解温度的不同而分为3个分布，在65℃附近具有分布的集团1201(例如64℃～66℃的范围内)是包含BRAF基因的野生型的孔，在61℃附近具有分布的集团1203(例如60℃～62℃的范围内)是包含BRAF基因的假基因的孔，在58℃附近具有分布的集团1202(例如57℃～59℃的范围内)是包含BRAF基因的V600E变异型的孔。

比较图12的各个集团的计数数量，在图12A中，BRAF基因的假基因的计数数量为BRAF基因的野生型的计数数量的一半，在图12B中，BRAF基因的假基因的计数数量为BRAF基因的野生型和V600E的计数数量的合计的一半。

这样，在数字PCR中的基因型的判别中使用测定熔解温度来分别判别目标基因和假基因，进行计数，确认与预先根据染色体上的位置求出的拷贝数的对应关系一致，由此能够保证测定精度。

符号说明

301、302、311…微滴(分区)

303…微流路

304…光源

305…荧光滤光器

306…光电万用表(拍摄装置)

307…CCD照相机(拍摄装置)

308…透镜

309…分色镜

310…微滴检测用盒

312…调温台(温度调整部)

313…盒

314，315…孔(分区)

401…荧光测定部

402…计算机

403…解析部

404…数据库

405…存储器(熔解温度存储器)

406…监视器

601…DNA

602…荧光标记探针

603…荧光色素

604…淬火剂

605…熔解温度

1201…含有野生型的孔

1202…包含变异型的孔

1203…包含假基因的孔。

Claims (12)

1.一种DNA检测方法，其特征在于，包括如下工序：

配置DNA溶液的工序，是在多个分区分别配置DNA溶液的工序，所述DNA溶液能够含有包含第一基因及其假基因的多种DNA，所述DNA溶液含有荧光标记探针或DNA嵌入剂；

在各所述分区进行核酸扩增反应的工序；

在所述核酸扩增反应中或在所述核酸扩增反应后，使各所述分区温度变化，并且对各所述分区测定随着所述温度变化而变化的荧光强度的工序；

基于随着所述温度变化的所述荧光强度的变化，针对各所述分区，计算出配置于该分区的DNA的双链的熔解温度的工序；

基于所述熔解温度对各所述分区判别DNA的种类，并且对所述DNA的各种类计数分区的数量的工序；

输出对所述DNA的各种类计数的分区的数量的工序；以及

根据所述熔解温度和所述计数的分区的数量来判别所述第一基因和所述假基因的工序分区。

2.根据权利要求1所述的DNA检测方法，其特征在于，

所述荧光标记探针包含具有与所述第一基因对应的序列的第一荧光标记探针。

3.根据权利要求2所述的DNA检测方法，其特征在于，

所述荧光标记探针包含具有与所述假基因对应的序列的第二荧光标记探针。

4.根据权利要求1所述的DNA检测方法，其特征在于，

所述方法包括如下工序：判断配置有所述假基因的分区的数量相对于配置有所述第一基因的分区的数量的比是与1对应的范围内的值、还是与1/2对应的范围内的值、还是与2对应的范围内的值、还是与0对应的范围内的值、或者是不在这些范围内的值。

5.根据权利要求1所述的DNA检测方法，其特征在于，

所述方法包括如下工序：显示所述第一基因的数量、或显示所述第一基因中的变异型基因的比例、或显示根据所述第一基因的数量或所述假基因的数量计算出的总基因数。

6.根据权利要求1所述的DNA检测方法，其特征在于，

配置于各所述分区的所述DNA溶液被极限稀释。

7.根据权利要求1所述的DNA检测方法，其特征在于，

基于所述熔解温度对各所述分区判别DNA的种类，并且对所述DNA的各种类计数分区的数量的所述工序还基于表示预定的基准熔解温度的信息来进行。

8.根据权利要求1所述的DNA检测方法，其特征在于，

所述分区构成为分散在排列成阵列状的孔或油中的微滴。

9.根据权利要求1所述的DNA检测方法，其中，

所述熔解温度被计算为所述荧光强度的拐点。

10.一种DNA检测系统，其特征在于，具备：

拍摄装置，其对能够在多个分区分别配置DNA溶液的设备的图像进行拍摄，所述DNA溶液能够含有包含第一基因及其假基因的多种DNA，所述DNA溶液含有荧光标记探针或DNA嵌入剂；

温度调整部，其为了在各所述分区进行核酸扩增反应而使各所述分区的温度变化；

数据库，其针对所述第一基因和所述假基因分别存储表示基准熔解温度的信息；

拍摄控制部，其为了针对各所述分区取得随着温度变化而变化的荧光强度，使所述拍摄装置拍摄图像；

熔解温度存储器，其针对各所述分区存储表示配置于该分区的所述DNA的双链的熔解温度的信息，所述熔解温度是基于由所述拍摄装置拍摄到的图像中的随着温度变化的荧光强度的变化而得到的；以及

解析部，其使用所述数据库和所述熔解温度存储器，对配置有所述第一基因的所述分区的数量和配置有所述假基因的分区的数量进行计数，所述解析部输出对所述DNA的各种类进行计数而得到的分区的数量，根据所述熔解温度和所述计数而得到的分区的数量来判别所述第一基因和所述假基因分区。

11.根据权利要求10所述的DNA检测系统，其特征在于，

所述解析部判断配置有所述假基因的分区的数量相对于配置有所述第一基因的分区的数量的比是与1对应的范围内的值、还是与1/2对应的范围内的值、还是与2对应的范围内的值、还是与0对应的范围内的值或者是不在这些范围内的值。

12.根据权利要求10所述的DNA检测系统，其特征在于，

表示所述基准熔解温度的信息是表示温度范围的阈值的信息。

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