JP2015214549A

JP2015214549A - ヒト抗ｐｄ−１、ｐｄ−ｌ１、及びｐｄ−ｌ２抗体とその用途

Info

Publication number: JP2015214549A
Application number: JP2015107525A
Authority: JP
Inventors: ゴードンジェイ．フリーマン，; J Freeman Gordon; ラフィアーメド，; Rafi Ahmed; ジョ; d jones Timothy; ティモシー，ディ．ジョーンズ，; J Carr Francis; フランシス，ジェイ．カー，; P Gregson James; ジェームス，ピー．グレグソン，
Original assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc; Emory University
Current assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc; Emory University
Priority date: 2008-09-26
Filing date: 2015-05-27
Publication date: 2015-12-03
Anticipated expiration: 2029-09-25
Also published as: WO2010036959A3; US20160137731A1; AU2016222431A1; US10011656B2; US10370448B2; CA2738252A1; EP3133086A1; AU2019246763B2; EP2342226A2; MX349463B; AU2018202800A1; EP3530672B1; KR20110079673A; JP6663653B2; IL265397B; IL211830A0; US9102727B2; CN102264762B; MX2011003195A; JP2020108376A

Abstract

【課題】ヒトＰＤ−１、ヒトＰＤ−Ｌ１、及びヒトＰＤ−Ｌ２に特異的に結合する新規な複合、ヒトモノクローナル抗体の産生及び単離、並びにそのような新規抗体の特徴付け及びＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及び／又はＰＤ−Ｌ２によって媒介される様々な症状の治療におけるその治療的価値の提供。【解決手段】新規なヒト抗ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及びＰＤ−Ｌ２抗体を使用して、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及び／又はＰＤ−Ｌ２活性の調節から利点を得る症状（例えば、持続感染疾患、自己免疫疾患、喘息、移植片拒絶、炎症性疾患及び腫瘍）を診断し、予後診断し、及び治療するための組成物及び方法。【選択図】なし

Description

関連出願
この出願は、その全体を出典明示によりここに援用する２００８年９月２６日出願の米国仮出願第６１／１００５３４号の優先権の利益を請求する。

Ｔ細胞が外来性ポリペプチドに応答するためには、少なくとも二つのシグナルが抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）によって休止Ｔリンパ球まで提供されなければならない(Jenkins, M. 及びSchwartz, R. (1987) J. Exp. Med. 165:302-319；Mueller, D. L.等(1990) J. Immunol. 144:3701-3709)。第一のシグナルは、免疫応答に特性を付与するが、主要組織適合抗原(MHC)と関連して提示される外来性抗原ペプチドの認識後にＴ細胞レセプター(TCR)を介して伝達される。同時刺激と称される第二のシグナルは、Ｔ細胞を誘導して増殖させ、機能的になるようにする(Lenschow等(1996) Annu. Rev. Immunol. 14:233)。同時刺激は抗原特異的でもＭＨＣ制限的でもなく、ＡＰＣｓによって発現される別個の細胞表面分子によってもたらされる(Jenkins, M. K.等(1988) J. Immunol. 140:3324-3330；Linsley, P. S.等(1991) J. Exp. Med 173:721-730；Gimmi, C. D.等(1991) Proc. Natl. Acad Sci. USA 88:6575-6579；Young, J. W.等(1992) J. Clin. Invest. 90:229-237；Koulova, L.等(1991) J. Exp. Med. 173:759-762；Reiser, H.等(1992) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:271-275；van-Seventer, G. A.等(1990) J. Immunol. 144:4579-4586；LaSalle, J. M.等(1991) J. Immunol. 147:774-80；Dustin, M. I.等(1989) J. Exp. Med. 169:503；Armitage, R. J.等(1992) Nature 357:80-82；Liu, Y.等(1992) J. Exp. Med 175:437-445)。

タンパク質Ｂ７−１（ＣＤ８０）及びＢ７−２（ＣＤ８６）は重要な同時刺激分子である(Freeman等(1991) J. Exp. Med. 174:625；Freeman等(1989) J. Immunol. 143:2714；Azuma等(1993) Nature 366:76；Freeman等(1993) Science 262:909)。Ｂ７−２は一次免疫応答中に主な役割を担う一方、Ｂ７−１は免疫応答中に後でアップレギュレートされ、一次Ｔ細胞応答を延長し、又は二次Ｔ細胞応答を同時刺激するのに重要でありうる(Bluestone (1995) Immunity 2:555)。

ＣＤ２８は、休止Ｔ細胞によって構成的に発現され、Ｔ細胞活性化後に発現が増加するＢ７−１及びＢ７−２双方のリガンドである。ＴＣＲシグナルとの関連でのＣＤ２８のライゲーションは、Ｔ細胞を誘導しＩＬ−２を増殖させ分泌する同時刺激シグナルの伝達を生じる(Linsley, P. S.等(1991) J. Exp. Med. 173:721-730；Gimmi, C. D.等(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:6575-6579；June, C. H.等(1990) Immunol. Today 11:211-6；Harding, F. A.等(1992) Nature 356:607-609)。第二のＢ７−１及びＢ７−２リガンドのＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）は、ＣＤ２８と相同であるが、休止Ｔ細胞によっては発現されない。ＣＴＬＡ４発現はＴ細胞活性化後に生じる(Brunet, J. F.等(1987) Nature 328:267-270)。ＣＴＬＡ４のライゲーションは、Ｔ細胞増殖及びサイトカイン分泌を防止する阻害シグナルの伝達を生じる。よって、ＣＴＬＡ４はＴ細胞応答の重要な負の制御因子である(Waterhouse等(1995) Science 270:985) (Allison 及びKrummel (1995) Science 270:932)。発見されるＣＤ２８ファミリーの第三のメンバーはICOSである (Hutloff等(1999) Nature 397:263；WO 98/38216)。そのリガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）によるＩＣＯＳのライゲーションは、高レベルのサイトカイン発現を生じるが、Ｔ細胞増殖は制限される(Riley J. L.等(2001) J. Immunol. 166:4943-48；Aicher A.等(2000) J. Immunol. 164:4689-96；Mages H. W.等(2000) Eur. J Immunol. 30:1040-7；Brodie D.等(2000) Curr. Biol. 10:333-6；Ling V.等(2000) J. Immunol. 164:1653-7；Yoshinaga S. K.等(1999) Nature 402:827-32)。Ｔ細胞が同時刺激シグナルの不在下でＴ細胞レセプターを通じて刺激される場合、それらは非応答性になり、アネルギー性になり、又は死滅する。

Ｂ７：ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４／ＩＣＯＳ同時刺激経路の重要性はインビトロ及び幾つかのインビボモデル系において証明されている。この同時刺激経路の遮断はマウス及びヒト系において抗原特異的寛容の発生を生じる(Harding, F. A.等(1992) Nature 356:607 609；Lenschow, D. J.等(1992) Science 257:789 792；Turka, L. A.等(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11102 11105；Gimmi, C. D.等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6586 6590；Boussiotis, V.等(1993) J. Exp. Med. 178:1753 1763)。逆に、Ｂ７陰性マウス腫瘍細胞によるＢ７の発現は、腫瘍拒絶及び腫瘍暴露に対する持続的保護が伴うＴ細胞媒介性特異的免疫を誘導する(Chen, L.等(1992) Cell 71:1093 1102；Townsend, S. E. 及びAllison, J. P. (1993) Science 259:368 370；Baskar, S.等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:5687 5690.)。従って、同時刺激経路の操作はヒトにおける免疫応答を刺激又は抑制する大きな可能性を提供する。

Ｂ７−１及びＣＤ２８ファミリーの更なるメンバーの発見は、Ｔ細胞に対して同時刺激及び阻害性の第二シグナルをもたらす更なる経路を明らかにした。より新しい経路の一つはｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｄｅａｔｈ１（ＰＤ−１；ＣＤ２７９としても知られている）レセプター及びそのリガンドＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１；ＣＤ２７４）及びＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ；ＣＤ２７３）によって表される。ＰＤ−１は、休止ではなく活性化されたＴ細胞に発現されるＣＤ２８／ＣＴＬＡ４ファミリーのメンバーである(Nishimura等(1996) Int. Immunol. 8:773)。そのリガンドによるＰＤ−１のライゲーションは、サイトカイン産生の減少及びＴ細胞生存の減少を生じる阻害シグナルを媒介する(Nishimura等(1999) Immunity 11:141；Nishimura等(2001) Science 291:319；Chemnitz等(2004) J. Immunol. 173:945)。

ＰＤ−Ｌ１は、ＡＰＣｓ及び活性化されたＴ細胞を含む多くの細胞型で発現されるＢ７ファミリーメンバーである(Yamazaki等(2002) J. Immunol. 169:5538)。ＰＤ−Ｌ１はＰＤ−１及びＢ７−１の双方に結合する。ＰＤ−Ｌ１によるＴ細胞発現Ｂ７−１の結合とＢ７−１によるＴ細胞発現ＰＤ−Ｌ１の結合の双方がＴ細胞阻害を生じる(Butte等(2007) Immunity 27:111)。他のＢ７ファミリーメンバーと同様に、ＰＤ−Ｌ１がまたＴ細胞に同時刺激シグナルを提供しうるという証拠がまた存在する(Subudhi等(2004) J. Clin. Invest. 113:694；Tamura等(2001) Blood 97:1809)。

ＰＤ−Ｌ２は、樹状細胞、マクロファージ及び骨髄由来マスト細胞を含む様々なＡＰＣｓで発現されるＢ７ファミリーメンバーである(Zhong等(2007) Eur. J. Immunol. 37:2405)。ＡＰＣ発現ＰＤ−Ｌ２は、ＰＤ−１のライゲーションによるＴ細胞活性化を阻害しかつＰＤ−１非依存性メカニズムによるＴ細胞活性化を同時刺激することができる(Shin等(2005) J. Exp. Med. 201:1531)。また、樹状細胞発現PD-L2 のライゲーションは、樹状細胞サイトカインの発現及び生存の亢進を生じる(Radhakrishnan等(2003) J. Immunol. 37:1827；Nguyen等(2002) J. Exp. Med. 196:1393)。Ｔ細胞活性化及び寛容（例えば治療的効果）の点でのＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及びＰＤ−Ｌ２の構造及び発現、並びにこれらの分子のシグナル伝達特性及び機能は、その全体が出典明示によりここに援用されるKier等(2008) Ann. Rev. Immunol. 26:677に更に詳細に概説されている。この及び他の同時刺激経路の操作はヒトにおける免疫応答を刺激するか又は抑制する大きな潜在性を提供し、そのような操作を実施するために有用な組成物及び方法の必要性が存在する。

本発明は、ヒトＰＤ−１、ヒトＰＤ−Ｌ１、及びヒトＰＤ−Ｌ２に特異的に結合する新規な複合、ヒトモノクローナル抗体の産生及び単離、並びにそのような新規抗体の特徴付け及びＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及び／又はＰＤ−Ｌ２によって媒介される様々な症状の治療におけるその治療的価値の証明に基づく。マウス抗体をヒト化するために使用される一般的な技術では、元のマウス抗体と比較して低減した抗原結合親和性を有するヒト化抗体が頻繁に製造される (Almagro 及びFransson (2008) Frontiers in Bioscience 13:1619-1633；Foote 及びWinter (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499；Hwang等(2005) Methods 36: 35-42)。驚いたことに、本発明の複合ヒト抗体は、マウス抗体のものに非常に近似する親和性をもってＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２に結合することが示されている。更に、一般的なヒト化技術では、幾らかのマウス配列を保持しているヒト化抗体が製造される。その結果、そのような抗体はヒトに投与される場合に免疫原性を保持している場合がある。例えば、ヒト化抗体ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）は患者の約５０％に免疫原性を誘発する。他方、本発明の複合ヒト抗体は、完全にヒト由来の配列から誘導されている。従って、それらは、ヒト患者に投与される場合、他の抗ヒトＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及び／又はＰＤ−Ｌ２抗体よりも免疫原性が有意に少なく、かつより治療的に効果的であり有用である可能性が高い。従って、本発明の複合ヒト抗体は、部分的にはその独特の特異性、親和性、構造、機能的活性及びそれらがヒト抗体配列から誘導されているという事実に起因して、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及び／又はＰＤ−Ｌ２によって媒介される疾患を治療し予防する改善された手段を提供する。本発明はまたここに記載された複合ヒト抗体を投与することによって、持続性感染疾患、喘息、炎症性疾患、及び癌の治療を含む新規な治療用途の発見に基づいている。

本発明の一実施態様は、ＰＤ−１タンパク質、ＰＤ−Ｌ１タンパク質、又はＰＤ−Ｌ２タンパク質（例えばヒトＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２タンパク質）に結合する単離された抗体、又はその抗原結合断片であり、ここで、単離された抗体、又はその抗原結合断片は、キメラ、ヒト化、複合、ヒト又はヒトであり、配列番号：７−２４からなる群から選択される１、２、３、４、５、又は６のＣＤＲ配列を含む。

本発明はまたＰＤ−１タンパク質（例えば配列番号：２のアミノ酸配列を含むＰＤ−１タンパク質）に結合する単離された抗体、又はその抗原結合断片を提供し、ここで、単離された抗体、又はその抗原結合断片はキメラ、ヒト化、複合、ヒト又はヒトであり、配列番号：７−９を含む重鎖可変領域配列（配列番号：７のＣＤＲ１配列、配列番号：８のＣＤＲ２配列、及び配列番号：９のＣＤＲ３配列）及び／又は配列番号：１０−１２を含む軽鎖可変領域配列（配列番号：１０のＣＤＲ１配列、配列番号：１１のＣＤＲ２配列、及び配列番号：１２のＣＤＲ３配列）を含む。

本発明はまたＰＤ−Ｌ１タンパク質（例えば配列番号：４のアミノ酸配列を含むＰＤ−Ｌ１タンパク質）に結合する単離された抗体、又はその抗原結合断片を提供し、ここで、単離された抗体、又はその抗原結合断片はキメラ、ヒト化、複合、ヒト又はヒトであり、配列番号：１３−１５（配列番号：１３のＣＤＲ１配列、配列番号：１４のＣＤＲ２配列、及び配列番号：１５のＣＤＲ３配列）を含む重鎖可変領域配列、及び／又は配列番号：１６−１８（配列番号：１６のＣＤＲ１配列、配列番号：１７のＣＤＲ２配列、及び配列番号：１８のＣＤＲ３配列）を含む軽鎖可変領域配列を含む。

本発明はまたＰＤ−Ｌ２タンパク質（例えば配列番号：６のアミノ酸配列を含むＰＤ−Ｌ２タンパク質）に結合する単離された抗体、又はその抗原結合断片を提供し、ここで、単離された抗体、又はその抗原結合断片はキメラ、ヒト化、複合、ヒト又はヒトであり、配列番号：１９−２１（配列番号：１９のＣＤＲ１配列、配列番号：２０のＣＤＲ２配列、及び配列番号：２１のＣＤＲ３配列）を含む重鎖可変領域配列、及び／又は配列番号：２２−２４（配列番号：２２のＣＤＲ１配列、配列番号：２３のＣＤＲ２配列、及び配列番号：２４のＣＤＲ３配列）を含む軽鎖可変領域配列を含む。

本発明はまたＰＤ−１タンパク質、ＰＤ−Ｌ１タンパク質、又はＰＤ−Ｌ２タンパク質（例えばヒトＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２タンパク質）に結合する単離された抗体、又はその抗原結合断片を提供し、ここで、単離された抗体、又はその抗原結合断片は、キメラ、ヒト化、複合、及び／又はヒトであり、配列番号：２５−２９、３４−３８、又は４３−４７からなる群から選択される重鎖配列、又は配列番号：２５−２９、３４−３８、又は４３−４７と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又はそれ以上の同一又は相同性の配列、及び／又は配列番号：３０−３３、３９−４２、又は４８−５１からなる群から選択される軽鎖配列、又は配列番号：３０−３３、３９−４２、又は４８−５１と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又はそれ以上の相同性を有する配列を含む。

本発明はまた配列番号：２のアミノ酸配列を含むＰＤ−１タンパク質に結合する単離された抗体、又はその抗原結合断片を提供し、ここで、単離された抗体、又はその抗原結合断片はキメラ、ヒト化、複合、又はヒトであり、配列番号：２５−２９からなる群から選択される重鎖配列、又は配列番号：２５−２９と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又はそれ以上同一又は相同の配列、及び／又は配列番号：３０−３３からなる群から選択される軽鎖配列、又は配列番号：３０−３３と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又はそれ以上同一又は相同の配列を含む。例えば、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号：２７又は２８の重鎖可変領域配列と、配列番号：３２又は３３の軽鎖可変領域配列を含む。幾つかの実施態様では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号：２８の重鎖可変領域配列と配列番号：３２の軽鎖可変領域配列を含む。

本発明はまた配列番号：４のアミノ酸配列を含むＰＤ−Ｌ１タンパク質に結合する単離された抗体、又はその抗原結合断片を提供し、ここで、単離された抗体、又はその抗原結合断片はキメラ、ヒト化、複合、又はヒトであり、配列番号：３４−３８からなる群から選択される重鎖配列、又は配列番号：３４−３８と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又はそれ以上同一又は相同の配列、及び／又は配列番号：３９−４２からなる群から選択される軽鎖配列、又は配列番号：３９−４２と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又はそれ以上同一又は相同の配列を含む。例えば、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号：３５又は３７の重鎖可変領域配列と、配列番号：３９、４０又は４２の軽鎖可変領域配列を含む。幾つかの実施態様では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号：３５の重鎖可変領域配列と、配列番号：４２の軽鎖可変領域配列を含む。

本発明はまた配列番号：６のアミノ酸配列を含むＰＤ−Ｌ２タンパク質に結合する単離された抗体、又はその抗原結合断片を提供し、ここで、単離された抗体、又はその抗原結合断片はキメラ、ヒト化、複合、又はヒトであり、配列番号：４３−４７からなる群から選択される重鎖配列、又は配列番号：４３−４７と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又はそれ以上同一又は相同の配列、及び／又は配列番号：４８−５１からなる群から選択される軽鎖配列、又は配列番号：４８−５１と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又はそれ以上同一又は相同の配列を含む。例えば、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号：４４又は４６の重鎖可変領域配列と配列番号：４９、５０又は５１の軽鎖可変領域配列を含む。幾つかの実施態様では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号：４６の重鎖可変領域配列と配列番号：５１の軽鎖可変領域配列を含む。

本発明の他の実施態様は、ＰＤ−１タンパク質に結合する単離された抗体、又はその抗原結合断片であり、ここで、単離された抗体は、競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいてビオチン化ＥＨ１２．２Ｈ７抗体のＦｃ−ＰＤ−１への結合を阻害する。他の実施態様は、ＰＤ−Ｌ１タンパク質に結合する単離された抗体、又はその抗原結合断片であり、ここで、単離された抗体は、競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいてビオチン化２９Ｅ２Ａ３抗体のＦｃ−ＰＤ−Ｌ１への結合を阻害する。他の実施態様は、ＰＤ−Ｌ２タンパク質に結合する単離された抗体、又はその抗原結合断片であり、ここで、単離された抗体は、競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいてビオチン化２４Ｆ．１０Ｃ１２抗体のＦｃ−ＰＤ−Ｌ２への結合を阻害する。

本発明の他の実施態様は、ＰＤ−１タンパク質に結合するここに記載の単離された抗体又はその抗原結合断片であり、ここで、単離された抗体はＰＤ−１媒介シグナルを阻害する。他の実施態様は、ＰＤ−Ｌ１タンパク質に結合するここに記載の単離された抗体又はその抗原結合断片であり、ここで、単離された抗体はＰＤ−Ｌ１媒介シグナルを阻害する。他の実施態様は、ＰＤ−Ｌ２タンパク質に結合するここに記載の単離された抗体又はその抗原結合断片であり、ここで、単離された抗体はＰＤ−Ｌ２媒介シグナルを阻害する。

特に、本発明の実施態様は、ポリペプチドをコードする単離された核酸であり、ここで、ポリペプチドは、配列番号：２５−５１からなる群から選択される配列、又は配列番号：２５−５１と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一又は相同の配列を含む。他の実施態様は、これらの核酸の一又は複数を含むベクター、宿主細胞又は動物である。他の態様は、配列番号：２５−５１からなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸又は配列番号：２５−５１と少なくとも約少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一又は相同性の配列の相補鎖と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸である。

本発明はまたここに記載の抗体の何れか又はその抗原結合断片の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域をコードする単離された核酸を提供する。幾つかの実施態様では、核酸はベクター、例えば発現ベクター中にある。本発明はまたここに記載された抗体又は抗原結合断片の重鎖及び／又は軽鎖をコードする一又は複数の核酸を含む宿主細胞を提供する。幾つかの実施態様では、宿主細胞は抗体又は抗原結合断片を生産する。本発明はまたここに記載の抗体又は抗原結合断片を生産する方法であって、該抗体又は抗原結合断片を生産する細胞を培養し、細胞培養物から抗体又は抗原結合断片を回収することを含む方法を提供する。

本発明は、ここに記載された単離された抗体又はその抗原結合断片、及び薬学的に許容可能な担体を含有する薬学的組成物を更に含む。

本発明は消耗したＴ細胞を再活性化する方法であって、ここに記載された抗体又はその抗原結合断片をインビトロ、エキソビボ、又はインビボの何れかで使用して、少なくとも幾らかの細胞がＰＤ−、ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２を発現するＴ細胞の集団に接触させることを含む方法を包含する。

本発明は、更にウイルス感染、細菌感染、蠕虫感染、又は原虫感染を含む持続感染に罹患している患者を治療する方法であって、ここに記載された単離された抗体又はその抗原結合断片の有効量を含む組成物を患者に投与することを含む方法に関する。

本発明は、ここに記載された単離された抗体又はその抗原結合断片の有効量を含有する組成物を患者に投与することを含む、癌の治療方法を更に包含し、ここで、単離された抗体は抗体媒介細胞傷害性を誘導するか又は抗体媒介細胞傷害性を誘導するように修飾されるか又は毒素と造影剤からなる群から選択される薬剤にコンジュゲートされる。幾つかの実施態様では、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体又は抗体結合断片が、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現する癌を有する患者に投与される。幾つかの実施態様では、ＰＤ−Ｌ２に結合する抗体又は抗体結合断片が、ＰＤ−Ｌ２を過剰発現する癌を有する患者に投与される。

本発明は更に喘息に罹患している患者を治療する方法であって、ここに記載されたＰＤ−Ｌ２タンパク質に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片の有効量を含有する組成物を患者に投与することを含む方法に関する。

本発明は炎症性疾患又は移植片拒絶に罹患している患者を治療する方法であって、ＰＤ−Ｌ１タンパク質又はＰＤ−Ｌ２タンパク質に結合するここに記載された単離された抗体又はその抗原結合断片の有効量を含有する組成物を患者に投与することを含む方法をまた包含する。

本発明はまたここに記載された方法の何れかで使用されるためのここに記載された抗体、抗原結合断片又はポリペプチドを包含する。本発明はまた医薬、例えば患者におけるここに記載された疾患の何れかを治療するための医薬の製造におけるここに記載された抗体、抗原結合断片又はポリペプチドの使用を包含する。

図１は本発明の構成されたヒト免疫グロブリン配列をクローニングするために使用される発現ベクターの概略図を示す。マウス抗ヒトＰＤ−１抗体、ＥＨ１２．２Ｈ７のものに対応するように設計された複合ヒト重鎖（図２Ａ、ＶＨ１）可変領域配列を示す。マウス抗ヒトＰＤ−１抗体、ＥＨ１２．２Ｈ７のものに対応するように設計された複合ヒト重鎖（図２Ｂ、ＶＨ２）可変領域配列を示す。マウス抗ヒトＰＤ−１抗体、ＥＨ１２．２Ｈ７のものに対応するように設計された複合ヒト重鎖（図２Ｃ、ＶＨ３）可変領域配列を示す。マウス抗ヒトＰＤ−１抗体、ＥＨ１２．２Ｈ７のものに対応するように設計された複合ヒト重鎖（図２Ｄ、ＶＨ４）可変領域配列を示す。マウス抗ヒトＰＤ−１抗体、ＥＨ１２．２Ｈ７のものに対応するように設計された複合ヒト重鎖（図２Ｅ、ＶＨ５）可変領域配列を示す。マウス抗ヒトＰＤ−１抗体、ＥＨ１２．２Ｈ７のものに対応するように設計された複合ヒト軽鎖（図３Ａ、Ｖκ１）可変領域配列を示す。マウス抗ヒトＰＤ−１抗体、ＥＨ１２．２Ｈ７のものに対応するように設計された複合ヒト軽鎖（図３Ｂ、Ｖκ２）可変領域配列を示す。マウス抗ヒトＰＤ−１抗体、ＥＨ１２．２Ｈ７のものに対応するように設計された複合ヒト軽鎖（図３Ｃ、Ｖκ３）可変領域配列を示す。マウス抗ヒトＰＤ−１抗体、ＥＨ１２．２Ｈ７のものに対応するように設計された複合ヒト軽鎖（図３Ｄ、Ｖκ４）可変領域配列を示す。マウス抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体、２９Ｅ．２Ａ３のものに対応するように設計された複合ヒト重鎖（図４Ａ、ＶＨ１）可変領域配列を示す。マウス抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体、２９Ｅ．２Ａ３のものに対応するように設計された複合ヒト重鎖（図４Ｂ、ＶＨ２）可変領域配列を示す。マウス抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体、２９Ｅ．２Ａ３のものに対応するように設計された複合ヒト重鎖（図４Ｃ、ＶＨ３）可変領域配列を示す。マウス抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体、２９Ｅ．２Ａ３のものに対応するように設計された複合ヒト重鎖（図４Ｄ、ＶＨ４）可変領域配列を示す。マウス抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体、２９Ｅ．２Ａ３のものに対応するように設計された複合ヒト重鎖（図４Ｅ、ＶＨ５）可変領域配列を示す。マウス抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体、２９Ｅ．２Ａ３のものに対応するように設計された複合ヒト軽鎖（図５Ａ、Ｖκ１）可変領域配列を示す。マウス抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体、２９Ｅ．２Ａ３のものに対応するように設計された複合ヒト軽鎖（図５Ｂ、Ｖκ２）可変領域配列を示す。マウス抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体、２９Ｅ．２Ａ３のものに対応するように設計された複合ヒト軽鎖（図５Ｃ、Ｖκ３）可変領域配列を示す。マウス抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体、２９Ｅ．２Ａ３のものに対応するように設計された複合ヒト軽鎖（図５Ｄ、Ｖκ４）可変領域配列を示す。マウス抗ヒトＰＤ−Ｌ２抗体、２４Ｆ．１０Ｃ１２のものに対応するように設計された複合ヒト重鎖（図６Ａ、ＶＨ１）可変領域配列を示す。マウス抗ヒトＰＤ−Ｌ２抗体、２４Ｆ．１０Ｃ１２のものに対応するように設計された複合ヒト重鎖（図６Ｂ、ＶＨ２）可変領域配列を示す。マウス抗ヒトＰＤ−Ｌ２抗体、２４Ｆ．１０Ｃ１２のものに対応するように設計された複合ヒト重鎖（図６Ｃ、ＶＨ３）可変領域配列を示す。マウス抗ヒトＰＤ−Ｌ２抗体、２４Ｆ．１０Ｃ１２のものに対応するように設計された複合ヒト重鎖（図６Ｄ、ＶＨ４）可変領域配列を示す。マウス抗ヒトＰＤ−Ｌ２抗体、２４Ｆ．１０Ｃ１２のものに対応するように設計された複合ヒト重鎖（図６Ｅ、ＶＨ５）可変領域配列を示す。マウス抗ヒトＰＤ−Ｌ２抗体、２４Ｆ．１０Ｃ１２のものに対応するように設計された複合ヒト軽鎖（図７Ａ、Ｖκ１）可変領域配列を示す。マウス抗ヒトＰＤ−Ｌ２抗体、２４Ｆ．１０Ｃ１２のものに対応するように設計された複合ヒト軽鎖（図７Ｂ、Ｖκ２）可変領域配列を示す。マウス抗ヒトＰＤ−Ｌ２抗体、２４Ｆ．１０Ｃ１２のものに対応するように設計された複合ヒト軽鎖（図７Ｃ、Ｖκ３）可変領域配列を示す。マウス抗ヒトＰＤ−Ｌ２抗体、２４Ｆ．１０Ｃ１２のものに対応するように設計された複合ヒト軽鎖（図７Ｄ、Ｖκ４）可変領域配列を示す。マウス抗ヒト抗体、ＥＨ１２．２Ｈ７に対応する１μｇの複合ヒト抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。マウス抗ヒト抗体、２９Ｅ．２Ａ３に対応する１μｇの複合ヒト抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。マウス抗ヒト抗体、２４Ｆ．１０Ｃ１２に対応する１μｇの複合ヒト抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。マウス抗ヒト抗体、ＥＨ１２．２Ｈ７に対するヒト抗体のＥＬＩＳＡ競合結果を示す。図９Ａでは、ヒトＰＤ−１への精製された抗体の結合を競合ＥＬＩＳＡによって試験した。変動濃度の各抗体（０．０６μｇ／ｍｌから８μｇ／ｍｌ）を固定濃度のビオチン化ＥＨ１２．２Ｈ７（４０ｎｇ／ｍｌ）と混合し、ＰＤ−１被覆イムロンマキシソルブプレートに結合させた。結合はストレプトアビジン−ＨＲＰ及びＯＰＤ基質を介して検出した。４９０ｎｍでの吸光度をプレートリーダーで測定し、これを試験抗体濃度に対してプロットした。マウス抗ヒト抗体、２９Ｅ．２Ａ３に対するヒト抗体のＥＬＩＳＡ競合結果を示す。図９Ｂでは、ヒトＰＤ−Ｌ１への精製された抗体の結合を競合ＥＬＩＳＡによって試験した。変動濃度の各抗体（０．０２μｇ／ｍｌから８μｇ／ｍｌ）を固定濃度のビオチン化２９Ｅ．２Ａ３（４０ｎｇ／ｍｌ）と混合し、ＰＤ−Ｌ１被覆イムロンマキシソルブプレートに結合させた。結合はストレプトアビジン−ＨＲＰ及びＯＰＤ基質を介して検出した。４９０ｎｍでの吸光度をプレートリーダーで測定し、これを試験抗体濃度に対してプロットした。マウス抗ヒト抗体、２４Ｆ．１０Ｃ１２に対するヒト抗体のＥＬＩＳＡ競合結果を示す。図９Ｃでは、ヒトＰＤ−Ｌ２への精製された抗体の結合を競合ＥＬＩＳＡによって試験した。変動濃度の各抗体（０．０２μｇ／ｍｌから８μｇ／ｍｌ）を固定濃度のビオチン化２４Ｆ．１０Ｃ１２（４０ｎｇ／ｍｌ）と混合し、ＰＤ−Ｌ２被覆イムロンマキシソルブプレートに結合させた。結合はストレプトアビジン−ＨＲＰ及びＯＰＤ基質を介して検出した。４９０ｎｍでの吸光度をプレートリーダーで測定し、これを試験抗体濃度に対してプロットした。それぞれマウス抗ヒト抗体、ＥＨ１２．２Ｈ７（図１０Ａ）、２９Ｅ．２Ａ３（図１０Ｂ）、２４Ｆ．１０Ｃ１２（図１０Ｃ）のものに対応するように設計された複合ヒト重鎖及び軽鎖の異なった組合せに従って形成された複合ヒト抗体のＥＬＩＳＡ競合分析から得られたＩＣ_５０結合データを示す。該アッセイは図３に記載されたようにして実施された。重鎖及び軽鎖の各組合せに対するＩＣ_５０はマウス抗体のＩＣ_５０に対して正規化されている。ＮＤ＝データなし。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２のアミノ酸配列を示す。ここに記載された複合ヒト抗体の幾らかのＣＤＲ領域のアミノ酸配列を示す。ここに記載された複合ヒト抗体の幾らかの可変領域のアミノ酸配列を示す。ここに記載された複合ヒト抗体の幾らかの可変領域のアミノ酸配列を示す。ここに記載された複合ヒト抗体の幾らかの可変領域のアミノ酸配列を示す。図１４Ａ及び１４Ｂは、インビトロでのＳＩＶＧａｇ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖能力についてのヒト化抗ＰＤ−１抗体及びヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体の効果を示す。各符号は個々のマカクを表す。括弧内の数は遮断Ａｂがない場合と比較して遮断Ａｂの存在下での増殖の倍数増加を表す。ＰＤ−Ｌ１遮断が肝内ＣＤ８Ｔ細胞の抗原駆動増殖を回復させることを示している（動物１５６４からの代表的なデータ）。

本発明はＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及び／又はＰＤ−Ｌ２によって媒介される様々な疾患（例えば、持続感染疾患、喘息、炎症性疾患、移植片拒絶及び腫瘍）を治療し、診断するための新規な抗体ベースの治療剤を提供する。

本発明がより容易に理解されうるために、所定の用語を最初に定義する。更なる定義を詳細な説明にわたって記載する。

ここで使用される場合、「ＰＤ−１」、「ＰＤ−Ｌ１」、及び「ＰＤ−Ｌ２」なる用語は、天然に細胞によって発現される任意の変異体又はアイソフォーム、及び／又は他の定義が明示的になされない限り、完全長ポリペプチドの少なくとも一つの生物学的活性を有するその断片を含む。また、「ＰＤ−１リガンド」なる用語は、ＰＤ−Ｌ１(Freeman等(2000) J. Exp. Med. 192:1027) 及びＰＤ−Ｌ２(Latchman等(2001) Nat. Immunol. 2:261)の何れか又は双方と、天然に細胞によって発現される任意の変異体又はアイソフォーム、及び／又は完全長ポリペプチドの少なくとも一つの生物学的活性を有するその断片を含む。例えば、ヒトを含む異なった種由来のＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及びPD-L2配列は当該分野でよく知られている(例えば、その全体が出典明示によりここに援用される、ヒト及びマウスPD-1配列を開示するHonjo等の米国特許第5,629,204号；ヒトＰＤ−１配列を開示するWood等の米国特許第7,105,328号；ヒト及びマウスPD-L1配列を開示するChen等の米国特許第6,803,192号；ヒトＰＤ−Ｌ１配列を開示するWood等の米国特許第7,105,328号；ヒト及びマウスＰＤ−Ｌ２配列を開示するFreeman等の米国特許出願公開第20020164600号を参照)。

ここで使用される場合、「抗体」なる用語は、全抗体及びその任意の抗原結合断片（つまり、「抗原結合部分」）又はその単鎖を含む。「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも二つの重（Ｈ）鎖及び二つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、又はその抗原結合部分を意味する。各重鎖は、重鎖可変領域（ここではＶ_Ｈと略）及び重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（ここではＶ_Ｌと略）及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は一つのドメインＣＬからなる。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域で散在させられた相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に更に細分されうる。各Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは次の順でアミノ末端からカルボキシ末端まで配された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。「不活性化抗体」は補体系を誘導しない抗体を意味する。

ここで使用される「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、配列において高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域を意味する。一般に、抗体は６つのＨＶＲを含む；つまり、ＶＨに３つ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)、ＶＬに３つ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)である。天然の抗体では、H3及び L3は６つのＨＶＲの殆どの多様性を示し、特にH3は抗体に微細な特異性を付与するのに独特の役割を果たすと考えられている。例えばXu等, Immunity 13:37-45 (2000)；Johnson及びWu, Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo編, Human Press, Totowa, NJ, 2003)を参照。確かに、重鎖のみからなる天然に生じるラクダ抗体は軽鎖の不存在下で機能的で安定である。例えば、Hamers-Casterman等, Nature 363:446-448 (1993)；Sheriff等, Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)を参照。

多数の高頻度可変領域の描写が使用され、ここに含まれる。カバット相補性決定領域(ＣＤＲ)は配列変化に基づいており、最も一般的に使用されている(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置に言及している(Chothia 及びLesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。カバット番号付け法を使用して番号付けしたときChothia CDR-H1ループの端部はループ長に応じてH32 及びH34 (以下参照)の間で変動する（これは、カバット番号付け法がH35A 及びH35Bに挿入を配し； 35Aの又は 35Bの何れも存在しない場合、ループは３２で終わり； 35Aのみが存在する場合、ループは３３で終わり；35A 及び35Bの双方が存在する場合、ループは３４で終わるためである）。ＡｂＭ高頻度可変領域は、カバットＣＤＲとChothia構造ループ間の妥協を表し、Oxford MolecularのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」ＨＶＲは、利用できる複合体結晶構造の分析に基づく。これらの高頻度可変領域のそれぞれからの残基を以下に示す。
ループカバットＡｂＭ Chothia 接触
−−− −−− −−− −−−− −−−−
L1 L24-L34 L24-L34 L24-L34 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L56 L46-L55

L3 L89-L97 L89-L97 L89-L97 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32,33又は34 H30-H35B (Kabat番号付)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Chothia番号付)
H2 H50-H65 H50-H58 H52-H56 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H95-H102 H93-H101

高頻度可変領域は次の通り「伸展高頻度可変領域」を含みうる：ＶＬ中において２４−３６又は２４−３４（Ｌ１）、４６−５６又は５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）と、ＶＨ中において２６−３５（Ｈ１）、５０−６５、４７−６５又は４９−６５（Ｈ２）及び９３−１０２、９４−１０２又は９５−１０２（Ｈ３）。これらの伸展高頻度可変領域は典型的にはカバット及びＣｈｏｔｈｉａ定義の併用であり、これは場合によっては接触の定義を使用して特定される残基を更に含みうる。これらの定義の各々に対して上掲のカバット等に従って、可変ドメイン残基は番号付けされる。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、ここで定義するＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。

「カバットの可変ドメイン残基番号付け」又は「カバットのアミノ酸位番号付け」なる用語及びその異なる言い回しは、上掲のＫａｂａｔ等の抗体の編集の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに用いられる番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを用いると、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又は高頻度可変領域内の短縮又は挿入に相当する２、３のアミノ酸又は付加的なアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインには、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えばカバットによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど）と、Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸の挿入（カバットによる残基５２ａ）を含んでもよい。残基のカバット番号は、「標準の」カバット番号付け配列によって抗体の配列の相同領域でアライメントすることによって与えられる抗体について決定してもよい。

ここでの「Ｆｃ領域」なる用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するかも知れないが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６の位置又はＰｒｏ２３０からの位置のアミノ酸残基からそのカルボキシル末端まで伸長すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ番号付けシステムによれば残基４４７）は、例えば、抗体の産生又は精製中に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組換え的に操作することによって取り除かれてもよい。従って、インタクト抗体の組成物は、全てのＫ４４７残基が除去された抗体群、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体群、及びＫ４４７残基を有する抗体と有さない抗体の混合を含む抗体群を含みうる。本発明の抗体に使用される適切な天然配列Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ）、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。

「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを表す。好ましいＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。更に、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(γレセプター)に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含むものであり、これらのレセプターの対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲＩＩレセプターは、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化レセプター」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害レセプター」）を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する。阻害レセプターＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース阻害モチーフ(ＩＴＩＭ)を有する(Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234(1997)参照)。ＦｃＲはRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994)；及びde Haas等, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)において概説されている。将来同定されるものも含む他のＦｃＲもここにおける「ＦｃＲ」なる用語によって包含される。

「ＣＤＲ」なる用語、及びその複数形「ＣＤＲｓ」は、その３つが軽鎖可変領域（ＣＤＲＬ１，ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）の結合特性を構成し、３つが重鎖可変領域（ＣＤＲＨ１，ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）の結合特性を構成する相補性決定領域（ＣＤＲ）を意味する。ＣＤＲｓは抗体分子の機能的活性に寄与し、スキャフォールド又はフレームワーク領域を含むアミノ酸配列によって分離される。正確な定義上のＣＤＲ境界及び長さは異なった分類及び番号付けを受ける。従って、ＣＤＲｓは、ここに記載される番号付けシステムを含むカバットＣｈｏｔｈｉａ、接触又は任意の多の境界の定義によって言及されうる。異なる境界にもかかわらず、これらのシステムの各々は、何が可変配列内にいわゆる「高頻度可変領域」を構成するかにおいてある度合いのオーバーラップがある。これらのシステムによるＣＤＲの定義は、従って隣接するフレームワーク領域に関して長さ及び境界面積が異なりうる。例えばカバット、Ｃｈｏｔｈｉａ、及び／又はＭａｃＣａｌｌｕｍ等（Kabat等, in “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5版, U.S. Department of Health 及びHuman Services, 1992；Chothia等, J. Mol. Biol., 1987, 196: 901；及びMacCallum等, J. Mol. Biol., 1996, 262: 732(これらの各々はその全体が出典明示によりここに援用される）を参照。

ここで使用される場合、抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）なる用語は、抗原（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及び／又はＰＤ−Ｌ２）に特異的に結合する能力を保持している抗体の一又は複数の断片を意味する。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実施されうることが分かっている。抗体の「抗原結合部分」なる用語内に含まれる結合断片の例は、（ｉ）Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｌ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域がジスルフィド架橋によって結合された２つの断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）_２断片；（ｉｉｉ）Ｖ_Ｈ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶ_Ｈ及びＶ_ＬドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）Ｖ_ＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward等, (1989) Nature 341:544 546)；及び（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）又は（ｖｉｉ）合成リンカーによって結合されていてもよい二以上の単離されたＣＤＲｓの組み合わせを含む。更に、Ｆｖ断片の二つのドメインのＶ_Ｈ及びＶ_Ｌは別個の遺伝子によってコードされているが、それらは、組換え法を使用し、それらをＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域が対となって一価分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Bird等(1988) Science 242:423 426；及びHuston等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879 5883を参照)を形成する単一タンパク質鎖として作製されるように合成リンカーによって一緒にすることができる。このような一本鎖抗体もまた抗体の「抗原結合部分」なる用語内に包含されることが意図される。これらの抗体断片は当業者に知られている一般的な技術を使用して得られ、インタクト抗体と同じようにして該断片の有用性がスクリーニングされる。

抗体はポリクローナル又はモノクローナル；異種、同種、又は同系；又はその修飾型（例えば、ヒト化、キメラ等）でありうる。抗体はまた完全にヒトであり得る。好ましくは、本発明の抗体は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２ポリペプチドに特異的に又は実質的に特異的に結合する。ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す抗体を意味する。従って、「ヒトモノクローナル抗体」なる用語は、単一の結合特異性を示し、ヒト生殖系列又は非生殖系列免疫グロブリン配列から誘導された可変及び定常領域を有する抗体を意味する。一実施態様では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合させたヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られるＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。

ここで使用される場合、「単離された抗体」なる用語は、異なった抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を意味するものである(例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２に特異的に結合する単離された抗体は、それぞれＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２に結合しない抗体を実質的に含まない)。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及び／又はＰＤ−Ｌ２のエピトープに特異的に結合する単離された抗体は、しかしながら、異なった種由来の他のＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及び／又はＰＤ−Ｌ２タンパク質と交差反応性を有している場合がある。また、単離された抗体は、典型的には他の細胞性物質及び／又は化学物質を実質的に含まない。本発明の一実施態様では、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及び／又はＰＤ−Ｌ２に対して異なった特異性を有する「単離された」モノクローナル抗体の組合せが良好に定まった組成物において組み合わされる。

ここで使用される場合、「ヒト化抗体」なる用語は、ヒト以外の哺乳動物から誘導された抗体のＣＤＲと、ヒト抗体のＦＲ領域及び定常領域からなる抗体を意味する。ヒト化抗体は、人体中におけるヒト化抗体の抗原性が低下させられるので、本発明に係る治療剤中の有効成分として有用である。

ここで使用される場合、「複合(composite)抗体」なる用語は、二以上の無関係の可変領域由来の生殖系列又は非生殖系列免疫グロブリン配列を含む可変領域を有する抗体を意味する。加えて、「複合ヒト抗体」なる用語は、ヒト生殖系列又は非生殖系列免疫グロブリン配列から誘導された定常領域と、二以上の無関係のヒト可変領域由来のヒト生殖系列又は非生殖系列免疫グロブリン配列を含む可変領域を有する抗体を意味する。複合ヒト抗体は、人体中における複合ヒト化抗体の抗原性が低下させられるので、本発明に係る治療剤中の有効成分として有用である。

ここで使用される場合、「組換えヒト抗体」なる用語は、組換え手段によって調製され、発現され、つくり出され又は単離される全てのヒト抗体、例えば（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニック又は導入染色体性である動物（例えば、マウス）又はそれかれ調製されるハイブリドーマから単離される抗体（以下のセクションＩに更に記載する）、（ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えばトランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、及び（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調製され、発現され、つくり出され又は単離される抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列及び／又は非生殖系列免疫グロブリン配列から誘導された可変及び定常領域を有している。しかしながら、ある実施態様では、そのような組換えヒト抗体にインビトロ変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニック動物が使用される場合は、インビボ体細胞変異誘発）を施すことができ、よって組換え抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列から誘導されまたそれに関連しているが、ヒト抗体生殖系列レパートリー内には天然には存在しない場合がある配列である。

ここで使用される場合、「異種抗体」なる用語は、そのような抗体を生産するトランスジェニック非ヒト生物との関連で定義される。この用語は、トランスジェニック非ヒト動物からならない生物に見出され、一般にトランスジェニック非ヒト動物のもの以外の種由来のものに対応するアミノ酸配列又はコード核酸配列を有する抗体を意味する。

ここで使用される場合、「Ｋ_Ｄ」なる用語は、特定の抗体抗原相互作用の解離平衡定数を意味するものである。

ここで使用される場合、「特異的結合」なる用語は、予め定まった抗原に結合する抗体を意味する。典型的には、抗体は、分析物として組換えヒトＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２を、リガンドとして抗体を使用してＢＩＡＣＯＲＥ３０００機器で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定した場合に例えばおよそ１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍ又は１０^−１０Ｍ未満、又は更に低いような、およそ１０^−７Ｍ未満の親和性（Ｋ_Ｄ）で結合し、予め定まった抗原又は密接に関連した抗原以外の非特異的抗原（例えばＢＳＡ、カゼイン）への結合に対するその親和性よりも少なくとも１．１−、１．２−、１．３−、１．４−、１．５−、１．６−、１．７−、１．８−、１．９−、２．０−、２．５−、３．０−、３．５−、４．０−、４．５−、５．０−、６．０−、７．０−、８．０−、９．０−、又は１０．０−倍以上である親和性で予め定まった抗原に結合する。「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」なる語句は、ここでは「抗原に特異的に結合する抗体」なる用語と交換可能に使用される。

ここで使用される場合、「アイソタイプ」なる用語は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えばＩｇＭ又はＩｇＧ１）を意味する。

ここで使用される場合、「グリコシル化パターン」なる用語は、タンパク質、より特定的には免疫グロブリンタンパク質に共有的に結合されている糖鎖単位のパターンとして定義される。異種抗体のグリコシル化パターンは、当業者が異種抗体のグリコシル化パターンを、導入遺伝子のＣＨ遺伝子が派生する種に対してよりも非ヒトトランスジェニック動物の種における上記グリコシル化パターンにより類似しているものと認識する場合、非ヒトトランスジェニック動物の種によって生産される抗体に天然に生じるグリコシル化パターンと実質的に同様であると特徴付けることができる。

ここで使用される場合、物について「天然に生じる」という用語は、物を天然に見出すことができるという事実を意味する。例えば、天然源から単離することができる（ウイルスを含む）生物に存在し、研究室において人間によって意図的に改変されていないポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は天然に生じている。

ここで使用される場合、「再編成された」なる用語は、Ｖセグメントがそれぞれ本質的に完全なＶ_Ｈ及びＶ_ＬドメインをコードするコンホメーションのＤ−Ｊ又はＪセグメントに直ぐ隣接して位置している重鎖又は軽鎖免疫グロブリン座の配置を意味する。再編成された免疫グロブリン遺伝子座は、生殖系列ＤＮＡとの比較によって同定されうる；再編成された遺伝子座は少なくとも一つの組換えされた７量体／九量体相同エレメントを有する。

ここで使用される場合、Ｖセグメントに関連して「再編成された」又は「生殖系列配置」なる用語は、ＶセグメントがＤ又はＪセグメントに直ぐに隣接するようには組換えられていない配置を意味する。

ここで使用される場合、「核酸分子」なる用語は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むものである。核酸分子は一本鎖又は二本鎖でありうるが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。

ここで使用される場合、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２に結合する抗体又は抗体部分（例えば、Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｌ、ＣＤＲ３）をコードする核酸に関連して、「単離された核酸分子」なる用語は、抗体又は抗体部分をコードするヌクレオチド配列が、それぞれＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２以外の抗原に結合し、他の配列がヒトゲノムＤＮＡ中の核酸に天然には隣接しうる抗体又は抗体部分をコードする他のヌクレオチド配列を含まない核酸分子を意味するものである。図２−７は、それぞれ本発明のヒト抗ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２抗体の重鎖（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖（Ｖ_Ｌ）可変領域を含むヌクレオチド及びアミノ酸配列に対応する。

本発明はまたヌクレオチド配列によってコードされ又はアミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意には影響せず又はこれを変更しないヌクレオチド及びアミノ酸配列修飾を含む、図（例えば図２−７）に示された配列の「保存的配列修飾」を包含する。このような保存的配列修飾は、ヌクレオチド及びアミノ酸置換、付加及び欠失を含む。修飾は、例えば部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介突然変異誘発のような当該分野で知られている標準的な技術によって図（例えば図２−７）に示された配列中に導入されうる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものを含む。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を持つアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を持つアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を持つアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を持つアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を持つアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を持つアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。よって、ヒト抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、又は抗ＰＤ−Ｌ２抗体中の予想される非必須アミノ酸残基が好ましくは同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基と置換される。

あるいは、他の実施態様では、例えば飽和変異誘発にによって、ヒト抗ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２抗体コード配列の全て又は一部に沿って無作為に変異を導入することができ、得られた修飾されたヒト抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、又は抗ＰＤ−Ｌ２抗体を結合活性についてスクリーニングできる。

従って、ここに開示の重鎖及び軽鎖可変領域ヌクレオチド配列及び／又はここに開示された重鎖及び軽鎖可変領域アミノ酸配列（例えば図２−７）によってコードされる抗体は、保存的に修飾されている類似の配列によってコードされ又は該類似の配列を含む実質的に類似した抗体を含む。かかる実質的に類似の抗体をここに開示された（例えば図２−７）配列（つまり、重鎖及び軽鎖可変領域）に基づいて如何に産生せしめ得るかについての更なる検討は以下に提供する。

加えて、特定のタンパク質のアミノ酸配列と遺伝コード（以下に示す）によって定義されるヌクレオチド配列の間に既知の明確な対応が存在する。同様に、遺伝コードによって定義されるように、特定の核酸のヌクレオチド配列と該核酸によってコードされるアミノ酸配列の間には既知の明確な対応が存在する。
遺伝コード
アラニン(Ala, A) GCA, GCC, GCG, GCT
アルギニン(Arg, R) AGA, ACG, CGA, CGC, CGG, CGT
アスパラギン(Asn, N) AAC, AAT
アスパラギン酸 (Asp, D) GAC, GAT
システイン(Cys, C) TGC, TGT
グルタミン酸(Glu, E) GAA, GAG
グルタミン(Gln, Q) CAA, CAG
グリシン(Gly, G) GGA, GGC, GGG, GGT
ヒスチジン(His, H) CAC, CAT
イソロイシン(Ile, I) ATA, ATC, ATT
ロイシン(Leu, L) CTA, CTC, CTG, CTT, TTA, TTG
リジン(Lys, K) AAA, AAG
メチオニン(Met, M) ATG
フェニルアラニン(Phe, F) TTC, TTT
プロリン(Pro, P) CCA, CCC, CCG, CCT
セリン(Ser, S) AGC, AGT, TCA, TCC, TCG, TCT
スレオニン(Thr, T) ACA, ACC, ACG, ACT
トリプトファン(Trp, W) TGG
チロシン(Tyr, Y) TAC, TAT
バリン(Val, V) GTA, GTC, GTG, GTT
終止シグナル(末端) TAA, TAG, TGA

遺伝コードの重要でよく知られた特徴は、タンパク質を作製するために使用されるアミノ酸の殆どに対して、一つを超えるコード化ヌクレオチドトリプレットが用いられ得る（上に例証）その重複性である。従って、多くの異なったヌクレオチド配列が与えられたアミノ酸配列をコードしうる。そのようなヌクレオチド配列は、それらが全ての生物において同じアミノ酸配列の生産を生じるので機能的に等価であると考えられる（但し、ある種の生物は他のものよりもより効率的に幾らかの配列を翻訳しうる）。更に、時折、プリン又はピリミジンのメチル化変異体が与えられたヌクレオチド配列に見出されうる。そのようなメチル化は、トリヌクレオチドコドンと対応するアミノ酸との間のコード化関係に影響を及ぼさない。

核酸の場合、「実質的な相同性」なる用語は、二つの核酸又はその指定された配列が、最適にアラインされて比較された場合に、適切なヌクレオチド挿入又は欠失を伴って、ヌクレオチドの少なくとも約８０％において、通常はヌクレオチドの少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、又はそれ以上で、より好ましくはヌクレオチドの少なくとも約９７％、９８％、９９％又はそれ以上で同一であることを示す。あるいは、実質的な相同性は、セグメントがストランドの相補鎖と選択的ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする場合に存在する。

二つの配列間の同一性パーセントは、二つの配列の最適なアラインメントに対して導入される必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮しての、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（つまり、同一性％＝同一の位置の＃／位置の全＃×１００）。二つの配列間の配列の比較及び同一性パーセントの決定は、以下の非限定的な実施例に記載されたようにして、数学的アルゴリズムを使用して達成されうる。

二つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス及び４０、５０、６０、７０、又は８０のギャップウエイト及び１、２、３、４、５、又は６の長さウエイトを使用して、（ＧＣＧ社ウェブのワールドワイドウェブで入手可能な）ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して決定することができる。二つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の同一性パーセントは、また、ＰＡＭ１２０ウエイト残基表、１２のギャップ長ペナルティ及び４のギャップペナルティを使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込んだE. Meyers 及びW. Miller (CABIOS, 4:11 17 (1989))のアルゴリズムを使用して決定することができる。また、二つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスの何れか、及び１６、１４、１２、１０、８、６、又は４のギャップウエイト及び１、２、３、４、５、又は６の長さウエイトを使用して、（ＧＣＧ社ウェブのワールドワイドウェブで入手可能な）ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込んだNeedleman 及びWunsch (J. Mol. Biol. (48):444 453 (1970))を使用して決定することができる。

本発明の核酸及びタンパク質配列は、更に、例えば関連配列を同定するために公的データベースに対して検索を実施する「クエリー配列」として使用することができる。そのような検索は、Altschul,等(1990) J. Mol. Biol. 215:403 10のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施することができる。比較目的に対してギャップを設けたアラインメントを得るために、ギャップＢＬＡＳＴをAltschul等, (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389 3402に記載されているようにして利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びギャップＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる（ＮＣＢＩウェブのワールドワイドウェブで入手可能）。

核酸は全細胞中に、ライセート中に、又は部分的に精製された又は実質的に純粋な形態で存在しうる。核酸は、アルカリ性／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動法及び当該分野でよく知られている他のものを含む標準的な技術によって、他の細胞性成分又は他の汚染物、例えば他の細胞性核酸又はタンパク質から精製されている場合、「単離されている」か又は「実質的に純粋にされている」。F. Ausubel等編 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing 及びWiley Interscience, New York (1987)を参照のこと。

ｃＤＮＡ、ゲノム又はその混合物からの、しばしば天然配列（修飾された制限部位等を除く）である、本発明の核酸組成物は、遺伝子配列を提供する標準的な技術に従って変異させることができる。コード配列では、これらの変異は、所望されるようにアミノ酸配列に影響を及ぼしうる。特に、ここに記載された天然Ｖ、Ｄ、Ｊ、定常、スイッチ及び他のそのような配列と実質的に相同な、又はそれから誘導されるＤＮＡ配列が考えられる（「誘導される」が、配列が他の配列と同一か又は修飾されていることを示す場合）。

核酸は、それが他の核酸配列と機能的な関係に配される場合、「作用可能に連結」されている。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響する場合、コード配列に作用可能に連結されている。転写調節配列に関しては、作用可能に連結するとは、連結されているＤＮＡ配列が近接し、二つのタンパク質コード領域を接合するのに必要な場合には、近接し読み枠にあることを意味する。スイッチ配列では、作用可能に連結するとは配列がスイッチ組換えを実施できることを示す。

ここで使用される場合、「ベクター」なる用語は、それが結合している他の核酸を輸送することができる核酸分子を意味するものである。ベクターの一つのタイプは、更なるＤＮＡセグメントがライゲートされうる円状の二本鎖ＤＮＡループを意味する「プラスミド」である。ベクターの他のタイプは、更なるＤＮＡセグメントがウイルスゲノム中にライゲートされうるウイルスベクターである。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律増殖可能である（例えば細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は宿主細胞中への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込むことができ、それによって宿主ゲノムに沿って複製される。更に、ある種のベクターは、それらが作用可能に連結される遺伝子の発現を行わしめうる。そのようなベクターはここでは「組換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術において利用されうる発現ベクターはしばしばプラスミドの形態である。本明細書では、「プラスミド」と「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるので交換可能に使用されうる。しかしながら、本発明は、均等な機能を呈する、例えばウイルスベクター（例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）のような発現ベクターのそのような他の形態を含むものである。

ここで使用される場合、「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）なる用語は、組換え発現ベクターが導入された細胞を意味するものである。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなくそのような細胞の子孫もまた意味するものであることが理解されなければならない。ある種の修飾は、突然変異又は環境的影響のために続く世代で生じうるので、そのような子孫は、実際は親細胞と同一ではない場合があるが、ここで使用される「宿主細胞」なる用語の範囲に尚も含まれる。

ここで使用される場合、「被験者」なる用語は任意のヒト又は非ヒト動物を含む。例えば、本発明の方法及び組成物は、炎症性疾患、例えば関節炎、例えば関節リウマチの被験者を治療するために使用することができる。「非ヒト動物」なる用語は、全ての脊椎動物、例えば哺乳動物及び非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類等を含む。

ここで使用される場合、「調節する」という用語は、アップレギュレーション及びダウンレギュレーション、例えば応答の亢進又は阻害を含む。

ここで使用される場合、「阻害する」という用語は、例えば特定の作用、機能又は相互作用の減少、制限又は遮断を含む。

ここで使用される場合、「免疫細胞」なる用語は、免疫応答にある役割を担っている細胞を意味する。免疫細胞は造血由来であり、リンパ球、例えばＢ細胞又はＴ細胞；ナチュラルキラー細胞；骨髄細胞、例えば単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、及び顆粒球を含む。

ここで使用される場合、「Ｔ細胞」なる用語は、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。Ｔ細胞なる用語は、またＴヘルパー１型Ｔ細胞、Ｔヘルパー２型Ｔ細胞、Ｔヘルパー１７型Ｔ細胞及び阻害性Ｔ細胞を含む。「抗原提示細胞」なる用語は、専門の抗原提示細胞（例えば、Ｂリンパ球、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞）並びに他の抗原提示細胞（例えばケラチノサイト、内皮細胞、アストロサイト、線維芽細胞、オリゴデンドロサイト）を含む。

ここで使用される場合、「免疫応答」なる用語は、Ｔ細胞同時刺激の調節によって影響を受けるＴ細胞媒介及び／又はＢ細胞媒介免疫応答を含む。例示的な免疫応答はＴ細胞応答、例えばサイトカイン生産、及び細胞性細胞傷害性を含む。また、免疫応答なる用語は、Ｔ細胞活性化によって間接的に影響を受ける免疫応答、例えば抗体生産（体液性応答）及びサイトカイン応答性細胞、例えばマクロファージの活性化を含む。

ここで使用される場合、活性化された免疫細胞との関連で使用される「同時刺激する」という用語は、増殖及び／又はエフェクター機能を誘導する第二の非活性化レセプター媒介シグナル（「同時刺激シグナル」）をもたらす同時刺激ポリペプチドの能力を含む。例えば、同時刺激シグナルは、サイトカイン分泌、例えばＴ細胞レセプター媒介シグナルを受けたＴ細胞においてサイトカイン分泌を生じうる。例えば活性化レセプターを介して細胞レセプター媒介シグナルを受けた免疫細胞は「活性化された免疫細胞」とここでは称される。

ここで使用される場合、「阻害性シグナル」なる用語は、免疫細胞上のポリペプチドに対する阻害性レセプター（例えば、ＣＴＬＡ４又はＰＤ−１）を介して伝達されるシグナルを意味する。そのようなシグナルは、活性化レセプターを介して（例えば、ＴＣＲ又はＣＤ３ポリペプチドを介して）シグナルをアンタゴナイズし、例えば、二次メッセンジャー生成の阻害；増殖の阻害；免疫細胞におけるエフェクター機能の阻害、例えば、減少したファーゴサイトーシス、減少した抗体生産、減少した細胞性細胞傷害性、免疫細胞のメディエータ（例えばサイトカイン（例えばＩＬ−２）及び／又はアレルギー性反応のメディエータ）の生産の失敗；又はアネルギーの発生などを生じうる。

ここで使用される場合、「無応答性」なる用語は、例えば活性化レセプター又はサイトカインを介した刺激のような刺激に対する免疫細胞の不応状態を含む。無応答性は、例えば免疫抑制剤への暴露又は高用量の抗原への暴露のために、生じうる。ここで使用される場合、「アネルギー」又は「寛容」なる用語は、レセプター媒介性刺激の活性化に対する不応状態を含む。そのような不応状態は一般に抗原特異的であり、寛容化抗原への暴露が終わった後も持続する。例えば、（無応答性とは異なり）Ｔ細胞におけるアネルギーは、例えばＩＬ−２のようなサイトカインの生産の欠如によって特徴付けられる。Ｔ細胞アネルギーは、Ｔ細胞が抗原に暴露され、第二のシグナル（同時刺激シグナル）の不存在下で第一のシグナル（Ｔ細胞レセプター又はＣＤ−３媒介シグナル）を受ける。これらの条件下で、同じ抗原への細胞の再暴露は（たとえ再暴露が同時刺激ポリペプチドの存在下で生じても）サイトカイン生産の失敗となり、よって増殖の失敗となる。しかしながら、アネルギー性Ｔ細胞は、サイトカイン（例えばＩＬ−２）と共に培養される場合は増殖しうる。例えば、Ｔ細胞アネルギーは、指標細胞株を使用する増殖アッセイによって又はＥＬＩＳＡにより測定したＴリンパ球によるＩＬ−２生産の欠如によってまた観察されうる。あるいは、レポーター遺伝子コンストラクトを使用することができる。例えば、アネルギーＴ細胞は、５’ＩＬ−２遺伝子エンハンサーの制御下で異種プロモーターによって、又はエンハンサー内に見出すことができるＡＰ１配列の多量体によって誘導されるＩＬ−２遺伝子転写の開始に失敗する（Kang等(1992) Science 257:1134）。

ここで使用される場合、ポリペプチド、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２ポリペプチドについて使用される場合、「活性」なる用語は、タンパク質の構造に固有の活性を含む。例えば、ＰＤ−１リガンドに関して、「活性」なる用語は、（例えば活性化された免疫細胞における同時刺激シグナルを調節することにより）免疫細胞同時刺激を調節し、又は（例えば免疫細胞上に天然レセプターを関与させることにより）免疫細胞において阻害性シグナルを調節することにより阻害を調節する能力を含む。当業者は、ＰＤ−１リガンドポリペプチドが同時刺激レセプターに結合すると、同時刺激シグナルが免疫細胞中において産生されうることを認識するであろう。ＰＤ−１リガンドポリペプチドが阻害レセプターに結合すると、阻害性シグナルが免疫細胞において産生される。また、ＰＤ−１リガンドがＢ７−１ポリペプチドに結合すると、阻害シグナルが生成されうる(Butte等(2007) Immunity 27:111)。

ＰＤ−１に関して、「活性」なる用語は、抗原提示細胞上に天然ＰＤ−１リガンドを関与させることにより、免疫細胞において阻害シグナルを調節するＰＤ−１ポリペプチドの能力を含む。ＰＤ−１は、ＣＴＬＡ４と同様な形で免疫細胞に阻害シグナルを伝達する。免疫細胞における阻害性シグナルの調節は、免疫細胞の増殖、及び／又は免疫細胞によるサイトカイン分泌の調節を生じる。よって、「ＰＤ−１活性」なる用語は、ＰＤ−１ポリペプチドのその天然リガンドに結合する能力、免疫細胞同時刺激又は阻害性シグナルを調節する能力、及び免疫応答を調節する能力を含む。

ここで使用される場合、二分子間の相互作用に言及する場合の「相互作用」なる用語は、分子の互いの物理的接触（例えば結合）を意味する。一般に、そのような相互作用は、上記分子の一方又は双方の（生物学的効果を生じる）活性を生じる。活性は分子の一方又は双方の直接の活性（例えばシグナル伝達）でありうる。あるいは、相互作用において一方又は双方の分子はリガンドへの結合が防止され得、よってリガンド結合活性（例えばそのリガンドに結合し、同時刺激を惹起又は阻害する）について不活性とされうる。そのような相互作用を阻害すると、相互作用に関与する一又は複数の分子の活性の破壊を生じる。そのような相互作用を亢進することは、上記物理的接触の可能性を延長又は増大させ、上記活性の可能性を延長又は増大させることである。

ここで使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は文脈が別の意味を明らかに指示していない限り、複数の指示対象を含む。
ここに記載された発明の態様及び実施態様は態様及び実施態様「からなる」及び／又は「から本質的になる」ことを含むものと理解される。
本発明の様々な態様を以下のサブセクションで更に詳細に記載する。

Ｉ．単離された核酸分子
本発明の一態様は、本発明のポリペプチド（例えば図２−７のもの）又はその生物学的に活性な部分をコードする単離された核酸分子、並びにこれらポリペプチドをコードする核酸分子を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとしての使用に十分な核酸断片及び核酸分子の増幅又は変異のためのＰＣＲプライマーとして使用するための断片に関する。ここで使用される場合、「核酸分子」なる用語は、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）及びヌクレオチドアナログを使用して生産されるＤＮＡ又はＲＮＡのアナログを含むものである。核酸分子は一本鎖又は二本鎖でありうるが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。

「単離された核酸分子」なる用語は、核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離される核酸分子を含む。例えば、ゲノムＤＮＡに関して、「単離された」なる用語は、ゲノムＤＮＡが天然に付随している染色体から分離される核酸分子を含む。好ましくは、「単離された」核酸分子は、核酸が誘導される生物のゲノムＤＮＡ中において核酸に天然に隣接する配列（つまり、核酸分子の５’及び３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、「単離された」核酸分子、例えばｃＤＮＡ分子は、組換え技術によって製造される場合は他の細胞性物質又は培養培地を実質的に含まず、又は化学的に合成される場合は化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まないものでありうる。

本発明の核酸分子（例えば図２−７のもの）又はその一部は、標準的な分子生物学技術及びここで提供される配列情報を使用して単離することができる。例えば、図２−７に示される配列の全て又は一部を包含する核酸分子は、図２−７に示される配列に基づいて設計される合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって単離することができる。

本発明の核酸分子は、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って鋳型及び適切なオリゴヌクレオチドプライマーとしてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又は別法ではゲノムＤＮＡを使用して増幅させることができる。このようにして増幅された核酸分子は適切なベクター中にクローニングし、ＤＮＡ配列解析によって特徴付けすることができる。更に、本発明の核酸配列に対応するオリゴヌクレオチドは、例えば自動化ＤＮＡ合成機を使用して、標準的な合成技術によって調製することができる。

他の実施態様では、本発明の単離された核酸分子は、本発明の核酸分子（例えば図２−７のもの）の相補鎖である核酸分子、又はその部分を含む。本発明の核酸分子（例えば図２−７のもの）に相補的である核酸分子、又はその部分は、図２−７に示される各ヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができ、よって安定な二本鎖を形成するように図２−７に示されるヌクレオチド配列に十分に相補的であるものである。

更に他の実施態様では、本発明の単離された核酸分子は、図２−７に示されたヌクレオチド配列の全長と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一であるヌクレオチド配列、又はこれらのヌクレオチド配列の何れかの一部を含む。

更に、本発明の核酸分子は、本発明の核酸分子の一部（例えば、図２−７のもの）、又はその一部、例えばプローブ又はプライマーとして使用されうる断片又は本発明のポリペプチド、例えば、図２−７のものの一部をコードする断片のみを含みうる。プローブ／プライマーは、典型的には実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、典型的には、本発明の核酸分子（例えば、図２−７のもの）；本発明の核酸分子（例えば、図２−７のもの）のアンチセンス配列；又は本発明の核酸分子（例えば、図２−７のもの）の変異体の少なくとも約１２又は１５、好ましくは約２０又は２５、より好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、又は７５の連続ヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。

本発明の核酸分子 (例えば、図２−７のもの)に基づくプローブは、同じ又は相同のポリペプチドをコードする転写物又はゲノム配列を検出するために使用することができる。一実施態様では、プローブは、それに結合される標識基を更に含み、例えば標識基は放射性同位体、蛍光化合物、酵素、又は酵素コファクターでありうる。

「本発明のポリペプチドの生物学的に活性な部分」をコードする核酸断片は、本発明のポリペプチドの生物学的活性（例えばその抗原標的に結合する能力）を有するポリペプチドをコードする本発明の核酸分子（例えば、図２−７のもの）の一部を単離し、本発明のポリペプチドのコード化部分を（例えばインビトロ組換え発現により）発現させ、本発明のポリペプチドのコード化部分の活性を評価することにより、調製されうる。

本発明は遺伝コードの縮重のために図２−７に示されるヌクレオチド配列とは異なる核酸分子を更に包含し、よって図２−７に示される各ヌクレオチド配列によってコードされるものと同じポリペプチドをコードする。他の実施態様では、本発明の単離された核酸分子は、本発明のポリペプチド（例えば、図２−７のもの）をコードするヌクレオチド配列を有する。

本発明の核酸分子(例えば、図２−７のもの)のホモログに対応する核酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での標準的なハイブリダイゼーションによるハイブリダイゼーションプローブとして、ここに開示されたｃＤＮＡｓ又はその部分を使用して、ここに開示された核酸とのその相同性に基づいて単離されうる。

従って、他の実施態様では、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも１５、２０、２５、３０又はそれ以上のヌクレオチド長であり、本発明の核酸分子（例えば、図２−７のもの）を含む核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。

ここで使用される場合、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」なる用語は、互いに有意に同一であるか相同であるヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズされたままとなるハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を記述するものである。好ましくは、条件は、互いに少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、更により好ましくは少なくとも約８５％又は９０％同一な配列が互いにハイブリダイズされたままとなるようなものである。そのようなストリンジェントな条件は当業者に知られており、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel等編, John Wiley & Sons, Inc. (1995), セクション２、４及び６に見出すことができる。更なるストリンジェントな条件は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook等, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)、７、９及び１１章に見出すことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、約６５−７０℃での４×又は６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーション（又は約４２−５０℃での４×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中のハイブリダイゼーション）と続く６５−７０℃での１×ＳＳＣ中の一又は複数回の洗浄を含む。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の更なる非限定的な例は、４５℃での６×ＳＳＣでのハイブリダイゼーションと続く６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での一又は複数回の洗浄を含む。高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、約６５−７０℃での１×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション（又は約４２−５０℃での１×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中のハイブリダイゼーション）と続く約６５−７０℃での０．３×ＳＳＣ中の一又は複数回の洗浄を含む。低いストリンジェンーのハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、約５０−６０℃での４×又は６×ＳＳＣ中のハイブリダイゼーション（又はあるいは約４０−４５℃での６×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中のハイブリダイゼーション）と続く約５０−６０℃での２×中の一又は複数回の洗浄を含む。上に記載の値に対して中間の範囲、例えば、６５−７０℃又は４２−５０℃もまた本発明によって包含されることが意図される。ハイブリダイゼーション及び洗浄バッファーにおいてＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、及び１．２５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）をＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌ及び１５ｍＭのクエン酸ナトリウム）に置換することができる；洗浄は各ハイブリダイゼーションの完了後に１５分間実施される。５０塩基対長より少ないことが予想されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔ_ｍ）よりも５−１０℃少ないべきであり、ここで、Ｔ_ｍは次の式に従って決定される。１８塩基対長よりも少ないハイブリッドでは、Ｔ_ｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の＃）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の＃）。１８から４９塩基対長のハイブリッドでは、Ｔ_ｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ_１０［Ｎａ^＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、ここで、Ｎはハイブリッド中の塩基の数、［Ｎａ^＋］はハイブリダイゼーションバッファー中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣに対する［Ｎａ^＋］＝０．１６５Ｍ）。限定しないが遮断薬（例えば、ＢＳＡ又はサケ又はニシン精子キャリアＤＮＡ）、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、Ｆｉｃｏｌｌ、ＰＶＰ等を含む更なる試薬を、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄バッファーに添加し、例えばニトロセルロース又はナイロン膜のような膜への核酸分子の非特異的なハイブリダイゼーションを減少させることができることを当業者はまた認識するであろう。特にナイロン膜を使用する場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の更なる非限定的な例は、約６５℃での０．２５−０．５ＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、７％のＳＤＳ中のハイブリダイゼーションと続く６５℃での０．０２ＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、１％のＳＤＳでの一又は複数回の洗浄である。例えば、Church 及びGilbert (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1991-1995（又は別法では０．２×ＳＳＣ，１％ＳＤＳ）を参照。

本発明の核酸分子（例えば、図２−７のもの）に変異によって変化を導入することができ、ポリペプチドの機能的能力を変更しないで、本発明のコードされたポリペプチドのアミノ酸配列に変化を生じさせることができることを当業者は更に理解するであろう。例えば、「非必須」アミノ酸残基におけるアミノ酸置換を生じるヌクレオチド置換を本発明の核酸分子（例えば、図２−７のもの）において行うことができる。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を変更することなく本発明の核酸分子（例えば、図２−７のもの）から変更させられうる残基である一方、「必須」アミノ酸残基は生物学的活性に必要とされる。例えば、本発明のポリペプチドの間で保存されるアミノ酸残基、例えばポリペプチドのその標的抗原への結合に必要とされるものは特に改変に受け入れられないことが予想される。

従って、本発明の他の態様は、活性のために必須ではないアミノ酸残基に変化を含む本発明のポリペプチドをコードする核酸分子(例えば、図２−７のもの)に関する。このようなポリペプチドは、図２−７のものとはアミノ酸配列が異なるが、尚も生物学的活性を保持している。一実施態様では、単離された核酸分子は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ポリペプチドは、図２−７のものと少なくとも約７１％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一のアミノ酸配列を含む。

図２−７のもののポリペプチドと同一のポリペプチドをコードする単離された核酸分子は、一又は複数のアミノ酸置換、付加又は欠失がコードされたポリペプチド中に導入されるように図２−７のもののヌクレオチド配列に一又は複数のヌクレオチド置換、付加又は欠失を導入することにより作製されうる。変異は、標準的な技術、例えば部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介突然変異誘発によって、本発明の核酸分子(例えば、図２−７のもの)中に導入することができる。一実施態様では、保存的アミノ酸置換は一又は複数の予想された非必須アミノ酸残基においてなされる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を持つアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を持つアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を持つアミノ酸（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を持つアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を持つアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を持つアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。よって、本発明のポリペプチド（例えば、図２−７のもの）中の予想される非必須アミノ酸残基は同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基と置換されうる。別法では、他の実施態様では、変異を、例えば飽和変異誘発により、本発明の核酸分子（例えば、図２−７のもの）の全て又は一部に沿って無作為に導入することができ、得られた変異体を、活性を保持している変異体を同定するために生物学的活性についてスクリーニングできる。本発明の核酸分子(例えば、図２−７のもの)の変異誘発後に、コードされたポリペプチドを組換え的に発現させることができ、ポリペプチドの活性を決定することができる。

一実施態様では、本発明の変異体ポリペプチドを、天然ＰＤ−１（例えば、ＰＤ−１リガンド）又はＰＤ−１リガンド対（例えば、ＰＤ−１及びＢ７−１）に結合し及び／又はその活性を調節し、Ｔリンパ球の細胞内又は細胞間シグナル伝達を調節し、その活性化を調節し、及び／又は生物の免疫応答を調節する能力についてアッセイすることができる。

本発明の更に他の態様は、融合タンパク質をコードする単離された核酸分子に関する。本発明のポリペプチド(例えば、図２−７のもの)をコードする第二のヌクレオチド配列に作用可能に連結された本発明のポリペプチド(例えば、図２−７のもの)をコードする少なくも第一のヌクレオチド配列を含むそのような核酸分子は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって調製することができる。

細胞株又は微生物内における本発明の核酸分子(例えば、図２−７のもの)の発現特性は、挿入された調節エレメントが本発明の核酸分子(例えば、図２−７のもの)に作用可能に連結されるように安定細胞株又はクローン化微生物のゲノム中に異種ＤＮＡ調節エレメントを挿入することにより変更されうる。例えば、異種調節エレメントは、当業者によく知られ、例えば、Chappelの米国特許第５２７２０７１号；１９９１年５月１６日公開のＰＣＴ公報国際公開第９１／０６６６７号に記載されているような、標的化相同組換えのような技術を使用して、本発明の核酸分子（例えば、図２−７のもの)に作用可能に連結されるように安定細胞株又はクローン化微生物中に挿入されうる。

ＩＩ．単離されたポリペプチド分子
本発明の一態様は、本発明の単離されたポリペプチド(ここに記載された抗体及びその抗原結合断片、及び図２−７のものを含む)、及びその生物学的に活性な部分に関する。一実施態様では、本発明のポリペプチド(例えば、図２−７のもの)、及びその生物学的に活性な部分は、標準的なタンパク質精製技術によって細胞又は組織源から単離することができる。他の実施態様では、本発明のポリペプチド (例えば、図２−７のもの)、及びその生物学的に活性な部分は組換えＤＮＡ技術によって生産される。別法では、本発明のポリペプチド (例えば、図２−７のもの)、及びその生物学的に活性な部分は標準的なペプチド合成技術を使用して化学的に合成することができる。

「単離された」又は「精製された」ポリペプチド又はその生物学的に活性な部分は、本発明のポリペプチド (例えば、図２−７のもの)が誘導される細胞又は組織源からの細胞性物質又は他の汚染タンパク質を実質的に含まないか、又は化学的に合成される場合は化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。「細胞性物質を実質的に含まない」という語句は、ポリペプチドがそれが単離され又は組換え的に生産される細胞の細胞性成分から分離される本発明のポリペプチド（例えば、図２−７のもの）、及びその生物学的に活性な部分の調製を含む。一実施態様では、「細胞性物質を実質的に含まない」という語句は、約３０％（乾燥重量）未満の本発明のものではないタンパク質（ここでは「汚染タンパク質」ともまた称される）、より好ましくは約２０％未満の本発明のものではないタンパク質、更により好ましくは約１０％未満の本発明のものではないタンパク質、及び最も好ましくは約５％未満の本発明のものではないタンパク質を有する本発明のポリペプチド（例えば、図２−７のもの）、及びその生物学的に活性な部分の調製を含む。本発明のポリペプチド（例えば、図２−７のもの）又はその生物学的に活性な部分が組換え的に製造される場合、それはまた好ましくは培養培地を実質的に含まず、つまり、培養培地がタンパク質調製物の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満の体積である。

「化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない」なる語句は、ポリペプチドが、ポリペプチドの合成に関与する化学的前駆体又は他の化学物質から分離されている本発明のポリペプチド(例えば、図２−７のもの) 又はその生物学的に活性な部分の調製を含む。一実施態様では、「化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない」なる語句は、約３０％（乾燥重量）未満の化学的前駆体又は発明のものではないタンパク質、より好ましくは約２０％未満の化学的前駆体又は本発明のものではないタンパク質、更により好ましくは約１０％未満の化学的前駆体又は本発明のものではないタンパク質、及び最も好ましくは約５％未満の化学的前駆体又は本発明のものではないタンパク質を有する本発明のポリペプチド（例えば、図２−７のもの）又はその生物学的に活性な部分の調製を含む。

ここで使用される場合、本発明のポリペプチド（例えば、図２−７のもの）の「生物学的に活性な部分」は、ＰＤ−１と非−ＰＤ−１分子、ＰＤ−Ｌ１と非−ＰＤ−Ｌ１分子、又はＰＤ−Ｌ２と非−ＰＤ−Ｌ２分子の間の相互作用に関与するポリペプチド、例えば、ＰＤ−１の天然リガンド、例えば、ＰＤ−１リガンド、又はＰＤ−１リガンドの天然リガンド、例えば、それぞれＰＤ−１又はＢ７−１を含む。本発明のポリペプチド（例えば、図２−７のもの）の生物学的に活性な部分は、本発明の各完全長ポリペプチド（例えば、図２−７のもの）よりもアミノ酸が少なく、本発明の各ポリペプチド（例えば、図２−７のもの）の少なくとも一つの活性を示す、本発明のポリペプチド（例えば、図２−７のもの）のアミノ酸配列と十分に同一であるか又はそれから誘導されたアミノ酸配列を含むペプチドを含む。一実施態様では、生物学的に活性な部分は、それが生成せしめられ又は結合するように設計された抗原に応じてＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１リガンドに特異的に結合する能力を有するドメイン又はモチーフを含む。本発明のポリペプチド（例えば、図２−７のもの）の生物学的に活性な部分は、例えば免疫細胞活性化又は抑制のようなＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２によって媒介される活性を調節する薬剤を開発するための標的として使用することができる。

他の実施態様では、本発明のポリペプチド（例えば、図２−７のもの）は、図２−７に示されるアミノ酸配列を有している。他の実施態様では、ポリペプチドは図２−７に示されるポリペプチドと実質的に同一であり、図２−７に示される各ポリペプチドの機能的活性を保持しているが、上記のサブセクションＩに詳細に記載されるように変異誘発のためにアミノ酸配列が異なる。従って、他の実施態様では、本発明のポリペプチドは図２−７に示されたポリペプチドと少なくとも約７１％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％又はそれ以上同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。

二つのアミノ酸配列又は二つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列を最適な比較目的のためにアラインさせる（例えば、最適なアラインメントのために第一及び第二アミノ酸又は核酸配列の一方又は双方にギャップを導入し、非同一配列を比較目的に対して無視することができる）。一実施態様では、比較目的に対してアラインされた参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％，好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、及び更により好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％である。対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドが次に比較される。第一の配列中の位置が第二配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められている場合、分子はその位置で同一である（ここで使用される場合、アミノ酸又は核酸「同一性」はアミノ酸又は核酸「相同性」と等価である）。二つの配列間の同一性パーセントは、二つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。

本発明はまたキメラ又は融合タンパク質を提供する。ここで使用される場合、「キメラタンパク質」又は「融合タンパク質」は、本発明のものではないポリペプチドに作用可能に連結した本発明のポリペプチド(例えば、図２−７のもの)を含む。「本発明のポリペプチド」は、図２−７に示されたポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する一方、「本発明のものではないポリペプチド」は、図２−７に示されたポリペプチドとは異なり、同じか又は異なった生物から誘導される図２−７に示されたポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有していないポリペプチドを意味する。融合タンパク質内において、「作用可能に連結される」なる用語は、本発明のポリペプチドと本発明のものではないポリペプチドが互いに読み枠を一致させて融合されていることを示すものである。本発明のものではないポリペプチドは、本発明のポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合させることができ、本発明のポリペプチドの溶解性、結合親和性、安定性、又は価数を変更する部分に対応する。

例えば、一実施態様では、融合タンパク質は、本発明のポリペプチドとのタンパク質のＧＳＴ融合タンパク質である。このような融合タンパク質は本発明の組換えポリペプチドの精製を容易にしうる。他の実施態様では、融合タンパク質はそのＮ末端に異種シグナル配列を含む。ある種の宿主細胞（例えば哺乳動物宿主細胞）では、本発明のポリペプチドの発現及び／又は分泌を異種シグナル配列の使用によって増大されることができる。

本発明のキメラ又は融合ポリペプチド(例えば、図２−７のもの) は標準的な組換えＤＮＡ技術によって生産することができる。例えば、異なったポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片を読み枠を一致させて一般的技術に従い、例えばライゲーションのための平滑末端又はねじれ末端、適切な終端をもたらす制限酵素消化、適当な付着末端の充填、望まれない接合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、及び酵素ライゲーションを用いて、ライゲートさせる。他の実施態様では、融合遺伝子は自動化ＤＮＡ合成機を含む一般的な技術によって合成することができる。別法では、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、続いてアニールされ再増幅されてキメラ遺伝子配列を精製しうる二つの連続遺伝子断片間に相補的オーバーハングを生じるアンカープライマーを使用して実施することができる（例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel等編, John Wiley & Sons: 1992を参照）。更に、（例えばＧＳＴポリペプチドのように）融合部分を既にコードしている多くの発現ベクターが市販されている。

ここで同定される本発明のポリペプチド(例えば、図２−７のもの)アミノ酸配列により、当業者は、本発明のポリペプチド(例えば、図２−７のもの)に対応するポリペプチドを製造することが可能になる。そのようなポリペプチドは、本発明のポリペプチド（例えば、図２−７のもの）をコードするポリヌクレオチドの発現により、原核生物又は真核生物宿主細胞において産生させることができる。別法では、そのようなペプチドは、化学的方法によって合成することができる。組換え宿主における異種ポリペプチドの発現方法、ポリペプチドの化学合成法、及びインビトロ翻訳は当該分野でよく知られており、更にManiatis等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2版, Cold Spring Harbor, N. Y.；Berger 及びKimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.；Merrifield, J. (1969) J. Am. Chem. Soc. 91:501；Chaiken I. M. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 11:255；Kaiser等(1989) Science 243:187；Merrifield, B. (1986) Science 232:342；Kent, S. B. H. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57:957；及びOfford, R. E. (1980) Semisynthetic Proteins, Wiley Publishing(これらは出典明示によりここに援用する)に記載されている。

ＩＩＩ．ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及び／又はＰＤ−Ｌ２に対する抗体
ここに記載されたＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２に対する抗体は、ここに記載され又は当該分野で知られている任意の方法によって産生させることができる。本発明のモノクローナル抗体 (例えば、ヒト抗体)は、様々な既知の技術、例えばKohler及びMilstein, Nature 256: 495 (1975)によって記載された標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を使用して産生させることができる。体細胞ハイブリダイゼーション法は原理的には好ましいが、モノクローナル抗体を産生させるための他の技術、例えば、Ｂリンパ球のウイルス又は癌化、ヒト抗体遺伝子のライブラリーを使用するファージディスプレイ技術を用いることができる。

本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを産生するための一方法はマウス系である。免疫化プロトコル及び免疫化された脾細胞を単離し融合させるための技術を含むマウスにおけるハイブリドーマの産生は、当該分野においてよく知られている。

ポリクローナル抗体は、被験体をポリペプチド免疫原で免役することによって上述のようにして調製されうる。免疫された被験体中のポリペプチド抗体力価は、例えば固定化したポリペプチドを使用する酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）のような標準的な技術によって経時的にモニターすることができる。所望されるならば、抗原に対して産生された抗体を哺乳動物から（例えば血液から）単離し、よく知られた方法、例えばプロテインＡクロマトグラフィーによって更に精製して、ＩｇＧ画分を得ることができる。免疫化後の適切なとき、例えば、抗体力価が最も高いときに、抗体産生細胞被験体から得て、標準的な技術、例えば元々はKohler 及びMilstein (1975) Nature 256:495-497) (see also Brown等(1981) J. Immunol. 127:539-46；Brown等(1980) J. Biol. Chem. 255:4980-83；Yeh等(1976) Proc. Natl. Acad. Sci. 76:2927-31；及びYeh等(1982) Int. J. Cancer 29:269-75)によって記載されたハイブリドーマ技術、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor等(1983) Immunol. Today 4:72)、ＥＢＶ-ハイブリドーマ技術(Cole等(1985) Monoclonal Antibodies 及びCancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)又はトリオーマ技術によってモノクローナル抗体を調製するために使用することができる。モノクローナル抗体ハイブリドーマを生産するための技術はよく知られている（一般には、Kenneth, R. H. in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980)；Lerner, E. A. (1981) Yale J. Biol. Med. 54:387-402；Gefter, M. L.等(1977) Somatic Cell Genet. 3:231-36を参照）。簡潔に述べると、不死細胞株（典型的には骨髄腫）を、上述のような免疫原で免疫化された哺乳動物由来のリンパ球（典型的には脾細胞）に融合させ、得られたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、ポリペプチド抗原に好ましくは特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。

リンパ球と不死化細胞株を融合させるために使用される多くのよく知られたプロトコルの任意のものを、抗ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２モノクローナル抗体を産生させる目的に対して適用することができる（例えば、Galfre, G.等(1977) Nature 266:55052；上掲のGefter等(1977)；上掲のLerner (1981)；上掲のKenneth (1980)を参照）。更に、当業者は、また有用なそのような方法の多くの変形例が存在することを理解しているであろう。典型的には, 不死細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）がリンパ球と同じ哺乳動物種から誘導される。例えば、マウスハイブリドーマは、本発明の免疫原性調製物で免疫化したマウス由来のリンパ球を不死化マウス細胞株に融合させることにより作製することができる。好ましい不死細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培養培地（「ＨＡＴ培地」）に対して感受性であるマウス骨髄腫細胞株である。多くの骨髄腫細胞株の任意のものを、例えば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３又はＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫株のような標準的な技術によって融合対として使用することができる。これらの骨髄腫株はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC), Rockville, Mdから入手できる。典型的には、HAT感受性マウス骨髄腫細胞が、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を使用してマウス脾細胞に融合させられる。ついで、融合体から得られるハイブリドーマ細胞を。未融合のまた非生産的に融合された骨髄腫細胞を死滅させるＨＡＴ培地を使用して選択する（未融合脾細胞は形質転換されないので数日後に死亡する）。本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的なＥＬＩＳＡアッセイを使用して、与えられたポリペプチドに結合する抗体に対してハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより検出される。

モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを調製するための代替法として、上述のポリペプチドの一つに対して特異的なモノクローナルを、適切なポリペプチドで組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングすることにより同定し、単離し、ポリペプチドに結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離することができる。ファージディスプレイライブラリーを作製しスクリーニングするためのキットは市販されている（例えば、Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, カタログ番号27-9400-01；及びStratagene SurfZAPTM Phage Display Kit, カタログ番号240612)。加えて、抗体ディスプレイライブラリーの作製とスクリーニングに使用されるのに特に受け入れられる方法及び試薬の例は、例えばLadner等の米国特許第5223409号；Kang等の国際公開第92/18619号；Dower等の国際公開第91/17271号；Winter等の国際公開第92/20791号；Markland等の国際公開第92/15679号；Breitling等の国際公開第93/01288号；McCafferty等の国際公開第92/01047号；Garrard等の国際公開第92/09690号；Ladner等の国際公開第90/02809号；Fuchs等(1991) Biotechnology (NY) 9:1369-1372；Hay等(1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85；Huse等(1989) Science 246:1275-1281；Griffiths等(1993) EMBO J. 12:725-734；Hawkins等(1992) J. Mol. Biol. 226:889-896；Clarkson等(1991) Nature 352:624-628；Gram等(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580；Garrard等(1991) Biotechnology (NY) 9:1373-1377；Hoogenboom等(1991) Nucleic Acids Res. 19:4133-4137；Barbas等(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982；及びMcCafferty等(1990) Nature 348:552-554に見出すことができる。

加えて、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して作製することができる組換え抗ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２抗体、例えばキメラ、複合、及びヒト化モノクローナル抗体を産生せしめることができる。そのようなキメラ、複合、及びヒト化モノクローナル抗体は、当該分野で知られている組換えＤＮＡ技術によって、例えばRobinson等の国際特許公開公報第PCT/US86/02269号；Akira等の欧州特許出願第184,187号；Taniguchiの欧州特許出願第171,496号;Morrison等の欧州特許出願第173494号；Neuberger等の国際公開第86/01533号；Cabilly等の米国特許第4816567号；Cabilly等の欧州特許出願第125,023号；Better等(1988) Science 240:1041-1043；Liu等(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443；Liu等(1987) J. Immunol. 139:3521-3526；Sun等(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:214-218；Nishimura等(1987) Cancer Res. 47:999-1005；Wood等(1985) Nature 314:446-449；及びShaw等(1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559)；Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207；Oi等(1986) Biotechniques 4:214；Winterの米国特許第5,225,539号；Jones等(1986) Nature 321:552-525；Verhoeyan等(1988) Science 239:1534；及びBeidler等(1988) J. Immunol. 141:4053-4060に記載された方法を使用して生産されうる。

また、ヒト化抗体は、米国特許第５５６５３３２号に開示されたもののような標準的なプロトコルに従って作製されうる。他の実施態様では、抗体鎖又は特異的結合対メンバーは、例えば、米国特許第５５６５３３２号、同第５８７１９０７号、又は同第５７３３７４３号に記載されたように、当該分野で知られている技術を使用して、特異的結合対メンバーのポリペプチド鎖と複製可能なジェネリックディスプレイパッケージの成分の融合体をコードする核酸分子を含むベクターと単一の結合対メンバーの第二ポリペプチド鎖をコードする核酸分子を含むベクターとの間の組換えによって製造されうる。細胞におけるタンパク質機能を阻害するための細胞内抗体の使用は、また当該分野で知られている（例えば、Carlson, J. R. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:2638-2646；Biocca, S.等(1990) EMBO J. 9:101-108；Werge, T. M.等(1990) FEBS Lett. 274:193-198；Carlson, J. R. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7427-7428；Marasco, W. A.等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893；Biocca, S.等(1994) Biotechnology (NY) 12:396-399；Chen, S-Y.等(1994) Hum. Gene Ther. 5:595-601；Duan, L等(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5075-5079；Chen, S-Y.等(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5932-5936；Beerli, R. R.等(1994) J. Biol. Chem. 269:23931-23936；Beerli, R. R.等(1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 204:666-672；Mhashilkar, A. M.等(1995) EMBO J. 14:1542-1551；Richardson, J. H.等(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3137-3141；Marasco等の国際公開第94/02610号；及びDuan等の国際公開第95/03832号を参照）。

他の実施態様では、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２に対するヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりもヒト免疫系の部分を担持するトランスジェニック又は導入染色体マウスを使用して産生させることができる。一実施態様では、「ＨｕＭＡｂマウス」とここでは称されるトランスジェニックマウスは、未再編成のヒト重鎖（μ及びγ）及びκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を、内在性μ及びκ鎖遺伝子座を不活性化する標的変異と共に含む (Lonberg, N.等(1994) Nature 368(6474): 856 859)。従って、マウスはマウスＩｇＭ又はκの減少した発現を示し, 免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖及び軽鎖導入遺伝子がクラススイッチ及び体細胞変異を受け、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナル抗体を生じる（上掲のLonberg, N.等(1994)；Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49 101に概説；Lonberg, N. 及びHuszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65 93, 及びHarding, F. 及びLonberg, N. (1995) Ann. N. Y Acad. Sci 764:536 546）。ＨｕＭａｂマウスの調製は、Taylor, L.等(1992) Nucleic Acids Research 20:6287 6295；Chen, J.等(1993) International Immunology 5: 647 656；Tuaillon等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:3720 3724；Choi等(1993) Nature Genetics 4:117 123；Chen, J.等(1993) EMBO J. 12: 821 830；Tuaillon等(1994) J. Immunol. 152:2912 2920；Lonberg等, (1994) Nature 368(6474): 856 859；Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49 101；Taylor, L.等(1994) International Immunology 6: 579 591；Lonberg, N. 及びHuszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65 93；Harding, F. 及びLonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536 546；Fishwild, D.等(1996) Nature Biotechnology 14: 845 851に記載されている。更に米国特許第5,545,806号;同第5,569,825号;同第5,625,126号;同第5,633,425号；同第5,789,650号；同第5,877,397号；同第5,661,016号;同第5,814,318号;同第5,874,299号；及び同第5,770,429号;全てLonberg 及びKay、及びGenPharm International；Surani等の米国特許第5,545,807号;1998年6月11日公開の国際公開第98/24884;1994年11月10日公開の国際公開第94/25585号;1993年6月24日公開の国際公開第93/1227号;1992年12月23日公開の国際公開第92/22645号;1992年3月19日公開の国際公開第92/03918号を参照のこと。

他の実施態様では、本発明で使用される抗体は二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、単一の抗体ポリペプチド内に二つの異なった抗原に対する結合部位を有している。抗原結合性は、同時又は逐次的でありうる。トリオーマ及びハイブリッドハイブリドーマは二重特異性抗体を分泌することができる細胞株の二つの例である。ハイブリッドハイブリドーマ又はトリオーマによって産生される二重特異性抗体の例は、米国特許第4474893号に記載されている。二重特異性抗体は、化学的手段(Staerz等(1985) Nature 314:628, 及びPerez等(1985) Nature 316:354) 及びハイブリドーマ技術(Staerz 及びBevan (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:1453, 及びStaerz 及びBevan (1986) Immunol. Today 7:241)によって構築されている。二重特異性抗体はまた米国特許第5,959,084号に記載されている。二重特異性抗体の断片は米国特許第5798229号に記載されている。二重特異性薬剤は、ハイブリドーマ又は異なった抗体を作製する他の細胞を融合させることによりヘテロハイブリドーマを作製し、ついで双方の抗体を生産し同時にアセンブリするクローンを同定することにより産生させることもできる。それらはまた完全な免疫グロブリン鎖又は例えばＦａｂ及びＦｖ配列のようなその部分の化学的又は遺伝子接合によって産生させることができる。抗体成分はＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及び／又はＰＤ−Ｌ２ポリペプチドに結合することができる。一実施態様では、二重特異性抗体はＰＤ−１リガンドとＰＤ−１ポリペプチドの双方に特異的に結合しうる。

本発明の更に他の態様は、それぞれ免疫原性ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２ポリペプチド又はその免疫原性部分で動物を免疫化し、ついでポリペプチドに特異的に結合する抗体を動物から単離することを含む方法によって得ることができる抗ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２ポリペプチド抗体に関する。

本発明の更に他の態様では、部分的又は既知の抗体配列を使用して新規抗体を産生し、及び／又は発現させることができる。抗体は、６つの重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲｓ）に位置するアミノ酸残基を主として通じて標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲｓ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲｓの外側の配列よりも個々の抗体間でより多様性がある。ＣＤＲ配列が殆どの抗体抗原相互作用の原因であるため、異なった性質を有する異なった抗体からのフレームワーク配列に特異的な天然に生じる抗体からのＣＤＲ配列がグラフトした発現ベクターを構築することによって、特異的な天然に生じる抗体の性質を模倣する組換え抗体を発現させることができる（例えば、Riechmann, L.等, 1998, Nature 332:323 327；Jones, P.等, 1986, Nature 321:522 525；及びQueen, C.等, 1989, Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029 10033を参照）。そのようなフレームワーク配列は、生殖系列又は非生殖系列抗体遺伝子配列を含む公的ＤＮＡデータベースから得ることができる。これらの生殖系列配列は、それらがＢ細胞成熟中にＶ（Ｄ）Ｊ接合によって形成される完全にアセンブルされた可変遺伝子を含んでいないので、成熟抗体遺伝子配列とは異なる。生殖系列遺伝子配列はまた可変領域に均等にわたって個々の高親和性二次レパートリー抗体の配列とは異なるであろう。例えば、体細胞変異はフレームワーク領域のアミノ末端部分においては相対的に希である。例えば、体細胞変異は、フレームワーク領域１のアミノ末端部分及びフレームワーク領域４のカルボキシ末端部分において相対的に希である。更に、多くの体細胞変異は抗体の結合特性を有意には改変しない。このため、元の抗体のものに類似した結合特性を有するインタクトな組換え抗体を再形成するために特定の抗体の全ＤＮＡ配列を得ることは必要ではない（1999年3月12日に出願されたPCT/US99/05535）。ＣＤＲ領域をスパンする部分的な重鎖及び軽鎖配列が典型的にはこの目的に十分である。部分的配列が、どの生殖系列及び／又は非生殖系列可変及び接合遺伝子セグメントが組換え抗体可変遺伝子に寄与したかを決定するために使用される。ついで、生殖系列及び／又は非生殖系列配列が使用されて可変領域の失われた部分が満たされる。重鎖及び軽鎖リーダー配列はタンパク質成熟中に切断され、最終の抗体の性質には寄与しない。失われた配列を付加するために、クローン化されたｃＤＮＡ配列が、ライゲーション又はＰＣＲ増幅によって合成オリゴヌクレオチドと組み合わせられうる。別法では、全可変領域は、短いオーバーラップオリゴヌクレオチドのセットとして合成され、完全に合成の可変領域クローンをつくり出すためにＰＣＲ増幅によって組み合わされうる。このプロセスをまた使用して、特定の制限部位の削除又は包含、又は特定のコドンの最適化のような所定の利点を有する。該プロセスはまた他の種（例えばマウス）中の既知の抗体配列由来の同族免疫グロブリンコード配列を設計するためにある種（例えばヒト）中の特定の免疫グロブリンコード配列のライブラリーをスクリーニングすることができる（例えば以下の実施例のセクションを参照）。

ハイブリドーマからの重鎖及び軽鎖転写物のヌクレオチド配列を使用して、天然配列と同一のアミノ酸コード化能を有する合成Ｖ配列をつくり出すために合成オリゴヌクレオチドのオーバーラップセットを設計する。合成重鎖及びκ鎖配列は３つの点で天然配列とは異なりうる：反復ヌクレオチド塩基のストリングを妨害してオリゴヌクレオチド合成及びＰＣＲ増幅を容易にする；最適な翻訳開始部位はＫｏｚａｋの規則(Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266L19867019870)に従って導入され；またＨｉｎｄＩＩＩ部位が翻訳開始部位の上流に操作される。

重鎖及び軽鎖可変領域の双方に対して、最適なされたコード化及び対応する非コード化ストランド配列が対応する非コードオリゴヌクレオチドのおよそ中間点で３０−５０のヌクレオチドに分解される。よって、各鎖に対して、オリゴヌクレオチドを、１５０−４００ヌクレオチドのセグメントをスパンするオーバラップ二本鎖セットに組み立てることができる。ついで、プールを鋳型として使用して、１５０−４００ヌクレオチドのＰＣＲ増幅産物をつくり出す。典型的には、単一の可変領域オリゴヌクレオチドセットを、二つのオーバラップするＰＣＲ産物を生成するために別個に増幅される二つのプールに分ける。ついで、これらのオーバーラップ産物をＰＣＲ増幅によって組み合わせて完全な可変領域を形成する。発現ベクターコンストラクト中に簡単にクローニングされうる断片を産生するために、ＰＣＲ増幅に重鎖又は軽鎖定常領域のオーバーラップ断片を含めることがまた望ましい場合がある。

再構築された重鎖及び軽鎖可変領域についでクローン化プロモーター、リーダー配列、翻訳開始、リーダー配列、定常領域、３’未翻訳、ポリアデニル化、及び転写終結配列と組み合わせて、発現ベクターコンストラクトを形成する。重鎖及び軽鎖発現コンストラクトを単一ベクターに組合せ、宿主細胞中に同時転写させ、連続的に転写させ、又は別個に転写させて、これをついで融合させて、双方の鎖を発現する宿主細胞を形成することができる。

この使用のためのプラスミドは、当該分野で知られており、以下の実施例セクションに提供されるプラスミドを含む。本発明の完全なヒト及びキメラ抗体はまたＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、及びＩｇＤ抗体を含む。同様のプラスミドが、他の重鎖アイソタイプの発現のため、又はλ軽鎖を含む抗体の発現のために構築されうる。

よって、本発明の他の態様では、既知の非ヒト又はヒト抗体（例えば、マウス抗ヒト抗ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２抗体、例えば抗体ＥＨ１２．２Ｈ７、２９Ｅ．２Ａ３、及び２４Ｆ．１０Ｃ１２それぞれ）の構造的特徴を用いて、例えばＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２への結合のような、本発明の抗体の少なくとも一つの機能的性質を保持する構造的に関連したヒト抗ヒトＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２抗体が作製される。他の機能的な性質は、競合ＥＬＩＳＡアッセイでの、ＰＤ−１へのＥＨ１２．２Ｈ７、又はＰＤ−Ｌ１への２９Ｅ．２Ａ３、又はＰＤ−Ｌ２への２４Ｆ．１０Ｃ１２の結合の阻害を含む。幾つかの実施態様では、構造的に関連した抗ヒトＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２抗体は、実施例２に記載されているようにＩＣ５０値によって測定して抗体ＥＨ１２．２Ｈ７、２９Ｅ．２Ａ３、又は２４Ｆ．１０Ｃ１２と比較して抗原に対して低い結合親和性を有する（例えば、マウス参照抗体の親和性は構造的に関連した抗体の３．０、２．０、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２又は１．１倍の何れか以下である）。幾つかの実施態様では、構造的に関連した抗ヒトＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２抗体は、実施例２に記載されているようにＩＣ５０値によって測定して抗体ＥＨ１２．２Ｈ７、２９Ｅ．２Ａ３、又は２４Ｆ．１０Ｃ１２と比較して抗原に対して高い親和性を有する（例えば、構造的に関連した抗体の親和性は参照抗体の少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、又は２．０倍である）。また、本発明の一又は複数のＣＤＲ又は可変領域（例えば、図２−７）は、本発明の更なる組換え的に操作されたヒト抗ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２抗体をつくり出すために既知のヒトフレームワーク領域及びＣＤＲｓと組換え的に組み合わせられうる。

抗体の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３ドメインが抗原に対する抗体の結合特異性／親和性における特に重要な役割を果たしていることがよく知られているので、上に記載されたようにして調製された本発明の組換え抗体は本発明の可変領域の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３ｓを好ましくは含む（例えば図２−７）。抗体は本発明の可変領域のＣＤＲ２ｓを含みうる（例えば図２−７）。抗体は更に本発明の可変領域のＣＤＲ１ｓを含みうる（例えば図２−７）。抗体は更にＣＤＲｓの任意の組合せを含みうる。

上述の操作された抗体のＣＤＲ１、２、及び／又は３領域は、ここに開示された本発明の可変領域（例えば図２−７）のものとして正確なアミノ酸配列を含みうる。しかしながら、当業者は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２に効果的に結合する抗体の能力を尚も保持しながら、正確なＣＤＲ配列からの幾らかの逸脱（例えば保存的配列修飾）が可能な場合があることを理解するであろう。従って、他の実施態様では、操作された抗体は、本発明の一又は複数のＣＤＲｓ（例えば図２−７）と例えば５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％同一である一又は複数のＣＤＲｓからなりうる。

単にＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２への結合に加えて、上述のもののような操作された抗体を、例えば
（１）ヒトＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２への結合；
（２）ＰＤ−１へのＥＨ１２．２Ｈ７の、ＰＤ−Ｌ１への２９Ｅ．２Ａ３の、又はＰＤ−Ｌ２への２４Ｆ．１０Ｃ１２の結合の阻害；
（３）ヒトＰＤ−１への結合と、結合したＰＤ−１のＰＤ−１リガンド（例えば、ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２）に結合する能力の阻害；
（４）ヒトＰＤ−Ｌ１への結合と、結合したＰＤ−Ｌ１のＰＤ−Ｌ１リガンド（例えば、ＰＤ−１及び／又はＢ７−１）に結合する能力の阻害；
（５）ヒトＰＤ−Ｌ２への結合と、結合したＰＤ−Ｌ２のＰＤ−Ｌ２リガンド（例えば、ＰＤ−１）に結合する能力の阻害
のような、本発明の抗体の他の機能的性質のその保持について選択することができる。

抗体ＥＨ１２．２Ｈ７、２９Ｅ．２Ａ３及び２４Ｆ．１０Ｃ１２の重鎖及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を以下に示す。
ＥＨ１２．２Ｈ７重鎖可変領域
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＫＰＧＡＳＶＱＭＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＳＳＷＩＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＹＰＳＴＧＦＴＥＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＷＲＤＳＳＧＹＨＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号：７６）
ＥＨ１２．２Ｈ７軽鎖可変領域
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＴＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＲＡＳＱＳＶＳＴＳＧＹＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＫＦＧＳＮＬＥＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＮＩＨＰＶＥＥＥＤＴＡＴＹＹＣＱＨＳＷＥＩＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号：７７）
２９Ｅ．２Ａ３重鎖可変領域
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＭＨＷＶＫＱＫＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＶＮＰＦＮＤＧＴＫＹＮＥＭＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＱＡＷＧＹＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号：７８）
２９Ｅ．２Ａ３軽鎖可変領域
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＲＡＴＥＳＶＥＹＹＧＴＳＬＶＱＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＶＤＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＳＬＴＩＨＰＶＥＥＤＤＩＡＭＹＦＣＱＱＳＲＲＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号：７９）
２４Ｆ．１０Ｃ１２重鎖可変領域
ＱＶＱＬＱＱＳＡＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＲＳＧＹＴＥＹＮＱＫＦＫＤＫＴＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＰＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号：８０）
２４Ｆ．１０Ｃ１２軽鎖可変領域
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＮＤＹＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ（配列番号：８１）

ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２のそのリガンドへの結合を阻害する抗体の活性は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２とそのリガンド間の結合を抗体がブロックする能力を試験することによって決定することができる。標識されたリガンドと抗体の存在下での競合ＥＬＩＳＡアッセイを使用することができる。例えば、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を抗ＰＤ−Ｌ１抗体がブロックするかどうかを決定するために、競合結合実験を実施する。ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞を抗ＰＤ−Ｌ１抗体と共にプレインキュベートし、ついでビオチン化ＰＤ−１−Ｉｇ融合タンパク質を加える。抗ＰＤ−Ｌ１抗体がＰＤ−１−Ｉｇの結合を用量依存的な形でかつ高結合活性でブロックする場合、抗−ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の間の相互作用の阻害に効果的であると考えられる。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２の相互作用を阻害するのに効果的である抗体を試験するために同様の試験を実施することができる。

ＩＶ．組換え発現ベクター及び宿主細胞
本発明の他の態様は、一又は複数の本発明のポリペプチド (例えば、図2-7) (又はその一部）をコードする一つ、二つ又はそれ以上の核酸分子を含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。ここで使用される場合、「ベクター」なる用語は、それが結合した他の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。ベクターの一つのタイプは、更なるＤＮＡセグメントがライゲートされうる円形の二本鎖ＤＮＡストランドＤＮＡループを意味する「プラスミド」である。ベクターの他のタイプは、更なるＤＮＡセグメントがウイルスゲノム中にライゲートされうるウイルスベクターである。ある種のベクターはそれらが導入される宿主細胞中において自律増殖可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）が宿主細胞中への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それによって宿主ゲノムに沿って複製される。更に、ある種のベクターは、それらが作用可能に結合した遺伝子の発現を指向しうる。そのようなベクターは「発現ベクター」とここでは称される。一般に、組換えＤＮＡ技術において利用できる発現ベクターはしばしばプラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」と「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるので、交換可能に使用されうる。しかしながら、本発明は、均等な機能を呈する、例えばウイルスベクター（例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）のような発現ベクターのそのような他の形態を含むものである。

本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した形態の発明の核酸を含み、これは、組換え発現ベクターが、発現される核酸に作用可能に連結され、発現に使用される宿主細胞を元にして選択される一又は複数の調節配列を含んでいることを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作用可能に連結する」とは、対象のヌクレオチド配列がヌクレオチド配列の発現を（例えば、インビトロ転写／翻訳系において又はベクターが宿主細胞に導入されるときに宿主細胞において）可能にする形で調節配列に連結されていることを意味する。「調節配列」なる用語は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現コントロールエレメント（例えばポリアデニル化シグナル）を含むものである。そのような調節配列は、例えばGoeddel (1990) Methods Enzymol. 185:3-7に記載されている。調節配列は、多くのタイプの宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの及びある種の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織特異的調節配列）を含む。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現量等のような因子に依存しうることが当業者には理解されるであろう。本発明の発現ベクターを宿主細胞中に導入し、それによって、ここに記載された核酸によってコードされる融合タンパク質又はペプチドを含むタンパク質又はペプチドを製造することができる。

本発明の組換え発現ベクターは、原核生物又は真核生物細胞において本発明のポリペプチド（例えば図２−７）を発現させるために設計されうる。例えば、ポリペプチドは、細菌細胞、例えば大腸菌、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞、又は哺乳動物細胞において発現させることができる。適切な宿主細胞は上掲のGoeddel (1990)において更に検討されている。あるいは、例えばＴ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを使用して、組換え発現ベクターを転写し、インビトロで翻訳される。

原核生物中のポリペプチドの発現は、融合又は非融合タンパク質の何れかの発現をせしめる構成的又は誘導性プロモーターを含むベクターを用いて大腸菌中で最もしばしば実施される。融合ベクターは、通常は組換えポリペプチドのアミノ末端に、そこにコードされたポリペプチドに多くのアミノ酸を付加する。そのような融合ベクターは、典型的には３つの目的を果たす：１）組換えポリペプチドの発現を増大させること；２）組換えポリペプチドの溶解性を増大させること；及び３）アフィニティ精製におけるリガンドとして作用することによって組換えポリペプチドの精製を補助すること。しばしば、融合発現ベクターにおいては、タンパク質切断部位を、融合部分と組換えポリペプチドの接合部に導入し、融合タンパク質の精製に続く融合部分から組換えポリペプチドの分離を可能にする。そのような酵素、及びその同族認識配列は、Ｘａ因子、トロンビン及びエンテロキナーゼを含む。典型的な融合発現ベクターは、標的組換えポリペプチドにグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、又はプロテインＡをそれぞれ融合させるｐＧＥＸ(Pharmacia Biotech Inc；Smith, D. B. 及びJohnson, K. S. (1988) Gene 67:31-40)、ｐＭＡＬ(New Engl及びBiolabs, Beverly, Mass.)及びｐＲＩＴ５(Pharmacia, Piscataway, NJ)を含む。

適切な誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例は、ｐＴｒｃ(Amann等(1988) Gene 69:301-315) 及びｐＥＴ１Ｉｄ(Studier等(1990) Methods Enzymol. 185:60-89)を含む。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ１１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、同時発現されるウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎ１）によって媒介されるＴ７ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下で常在プロファージを有するＴ７ｇｎ１遺伝子からの宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）又はＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって供給される。

大腸菌における組換えポリペプチド発現を最大にするための一つの方策は、組換えポリペプチドをタンパク分解的に切断する能力が損なわれた宿主細菌においてポリペプチドを発現させることである(Gottesman, S. (1990) Methods Enzymol. 185:119-128)。他の方策は、発現ベクター中に挿入される核酸の核酸配列を、各アミノ酸に対する個々のコドンが大腸菌において優先的に利用されるものであるように改変することである(Wada等(1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118)。本発明の核酸配列のそのような改変は、標準的なＤＮＡ合成技術によって実施することができる。

他の実施態様では、発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母出芽酵母（S. cerevisiae）中での発現のためのベクターの例は、ｐＹｅｐＳｅｃ１(Baldari等(1987) EMBO J. 6:229-234)、ｐＭＦａ(Kurjan 及びHerskowitz (1982) Cell 30:933-943)、ｐＪＲＹ８８ (Schultz等(1987) Gene 54:113-123)、ｐＹＥＳ２(Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.)、及びｐｉｃＺ(Invitrogen Corp, San Diego, Calif.)を含む。

別法では、本発明のポリペプチド（例えば、図２−７）は、バキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞において発現されうる。培養された昆虫細胞(例えば、Sf 9細胞)におけるポリペプチドの発現に利用可能なバキュロウイルスベクターは、ｐＡｃシリーズ(Smith等(1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) 及びｐＶＬシリーズ(Lucklow 及びSummers (1989) Virology 170:31-39)を含む。

更に他の実施態様では、本発明の核酸(例えば、図２−７）は、哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現ベクターの例は、ｐＣＤＭ８(Seed, B. (1987) Nature 329:840) 及びｐＭＴ２ＰＣ(Kaufman等(1987) EMBO J. 6:187-195)を含む。哺乳動物細胞において使用される場合、発現ベクターの制御機能はウイルス調節エレメントによってしばしばもたらされる。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス及びサルウイルス４０から誘導される。原核生物及び真核生物細胞双方のための他の適切な発現系に対しては、Sambrook, J.等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989の１６及び１７章を参照のこと。

他の実施態様では、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型において優先的に核酸の発現を指示することができる(例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現させる)。組織特異的調節エレメントは当該分野で知られている。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例は、アルブミンプロモーター(肝臓特異的；Pinkert等(1987) Genes Dev. 1:268-277)、リンパ系特異的プロモーター(Calame 及びEaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275)、Ｔ細胞レセプターの特定のプロモーター(Winoto 及びBaltimore (1989) EMBO J. 8:729-733)及び免疫グロブリン(Banerji等(1983) Cell 33:729-740；Queen 及びBaltimore (1983) Cell 33:741-748)、ニューロン特異的プロモーター(例えば、神経フィラメントプロモーター；Byrne 及びRuddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477)、膵臓特異的プロモーター(Edlund等(1985) Science 230:912-916), 及び乳腺特異的プロモーター(例えば、乳清プロモーター;米国特許第4,873,316号及び欧州特許出願公開第264,166号)を含む。発生的に調節されるプロモーターもまた包含され、例えばマウスhoxプロモーター(Kessel 及びGruss (1990) Science 249:374-379) 及びα-フェトプロテインプロモーター(Campes 及びTilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546)である。

本発明の他の態様は、本発明の核酸分子（例えば、図２−７）が組換え発現ベクター又は特異的部位に相同的に組み込まれるのを可能にする配列を含む核酸分子に導入される宿主細胞に関する。宿主細胞のゲノムの又は「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」なる用語はここでは交換可能に使用される。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫又は潜在的な子孫をも意味することが理解される。ある種の修飾は、突然変異又は環境的影響のために続く世代で生じうるので、そのような子孫は、実際は親細胞と同一ではない場合があるが、ここで使用される用語の範囲内に尚も含まれる。

宿主細胞は任意の原核生物又は真核生物細胞でありうる。例えば、本発明のポリペプチド（例えば、図２−７）は細菌細胞、例えば大腸菌、昆虫細胞、酵母又は哺乳動物細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はＣＯＳ細胞）において発現されうる。他の適切な宿主細胞は当業者に知られている。

ベクターＤＮＡは一般的な形質転換又は形質移入技術によって原核生物又は真核生物細胞中に導入することができる。ここで使用される場合、「形質転換」及び「形質移入」なる用語は、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ-デキストラン媒介形質移入、リポフェクション、又は電気穿孔法を含む、外来性核酸 (例えば、DNA) を宿主細胞に導入するための様々な当該分野で認められている技術を意味するものである。宿主細胞を形質転換し又は形質移入するための適切な方法は、Sambrook等(Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)、及び他の実験室マニュアルに見出すことができる。

哺乳動物細胞の安定な形質移入のためには、使用される発現ベクター及び形質移入技術に応じて、ほんの僅かの量の細胞が外来性ＤＮＡをそのゲノム中に組み込むことができることが知られている。これらの組込み体を同定し選択するためには、（例えば抗生物質に耐性のある）選択可能マーカーをコードする遺伝子が一般に対象の遺伝子に沿って宿主細胞中に導入される。好ましい選択可能マーカーは、薬剤に耐性を付与するもの、例えばＧ４１８、ハイグロマイシン及びメトトレキセートを含む。選択可能マーカーをコードする核酸は、ＰＤ−Ｌ２ポリペプチドをコードするものと同じベクター上の宿主細胞中に導入することができ、又は別個のベクターに導入することができる。導入された核酸で安定に形質移入された細胞を、薬剤選択によって同定することができる（例えば、選択可能マーカー遺伝子を導入した細胞は生存する一方、他の細胞は死滅する）。

本発明の宿主細胞、例えば培養中の原核生物又は真核生物宿主細胞を、本発明のポリペプチド（例えば図２−７）を製造する（つまり、発現させる）ために使用することができる。従って、本発明は、本発明の宿主細胞を使用して本発明のポリペプチド（例えば図２−７）を製造する方法を更に提供する。一実施態様では、該方法は、（本発明のポリペプチド（例えば図２−７）をコードする組換え発現ベクターが導入された）本発明の宿主細胞を適切な培地中で本発明のポリペプチド（例えば図２−７）が製造されるように培養することを含む。他の実施態様では、本発明は培地又は宿主細胞から本発明のポリペプチド（例えば図２−７）を単離することを更に含む。

本発明の宿主細胞をまた以下に記載のように使用して非ヒトトランスジェニック動物を生産することができる。

Ｖ．複合ヒトＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２抗体を産生するトランスジェニック及び導入染色体非ヒト動物の生産
更に他の態様では、本発明は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を発現することが可能な、トランスジェニック及び導入染色体非ヒト動物、例えばトランスジェニック又は導入染色体マウスを提供する。特定の実施態様では、本発明は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２抗原及び／又はＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２を発現する細胞で免疫化されたときにマウスがヒト抗ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２抗体を生産するように、ヒト重鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック又は導入染色体マウスを提供する。ヒト重鎖導入遺伝子は、当該分野でよく知られた方法に従って、トランスジェニックマウス、例えばＨｕＭＡｂの場合のように、マウスの染色体ＤＮＡ中に組み込むことができる。別法では、ヒト重鎖導入遺伝子は、国際公開第０２／４３４７８号に記載されているように導入染色体（例えばＫＭ）マウスの場合のように、染色体外に維持されうる。そのようなトランスジェニック及び導入染色体マウスは、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換え及びアイソタイプスイッチングを受けることによって、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２に対するヒトモノクローナル抗体の複数のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＥ）を製造することができる。アイソタイプスイッチングは、例えば古典的な又は非古典的なアイソタイプスイッチングによって生じうる。

異種抗体レパートリーでの外来性抗原刺激に応答するトランスジェニック又は導入染色体非ヒト動物の設計には、トランスジェニック動物内に含まれる異種免疫グロブリン導入遺伝子がＢ細胞発達の経路の全体を通して正確に機能することが必要とされる。これは、例えば、異種重鎖導入遺伝子のアイソタイプスイッチングを含む。従って、導入遺伝子はアイソタイプスイッチング及び抗体の次のものの一又は複数を生じるように構築される：（１）高レベル及び細胞型特異的発現、（２）機能的遺伝子再編成、（３）アレル排除の活性化及びそれへの応答、（４）十分な一次レパートリーの発現、（５）シグナル伝達、（６）体細胞高頻度変異、及び（７）免疫応答中の導入遺伝子抗体座の支配。

上記基準の必ずしも全てが合致される必要はない。例えば、トランスジェニック動物の内在性免疫グロブリン座が機能的に破壊される実施態様では、導入遺伝子はアレル排除を活性化させる必要はない。更に、導入遺伝子が機能的に再配置された重鎖及び／又は軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含む実施態様では、機能的遺伝子再編成の第二の基準は、少なくとも既に再配置されている導入遺伝子に対しては、不要である。分子免疫学についての背景には、Fundamental Immunology, 2版 (1989), Paul William E., ed. Raven Press, N.Yを参照のこと。

ある実施態様では、本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するために使用されるトランスジェニック又は導入染色体非ヒト動物は、トランスジェニック動物の生殖系列中に再編成、未再編成又は再編成及び未再編成の組合せの異種免疫グロブリン重鎖及び軽鎖導入遺伝子を含んでいる。重鎖導入遺伝子の各々は少なくとも一つのＣＨ遺伝子を含む。また、重鎖導入遺伝子は、トランスジェニック動物のＢ細胞において複数のＣＨ遺伝子をコードする異種導入遺伝子のアイソタイプスイッチングを支援可能である機能的アイソタイプスイッチ配列を含みうる。そのようなスイッチ配列は、導入遺伝子CH 遺伝子の供給源となる種由来の生殖系列免疫グロブリン遺伝子座に天然に生じるものでありうるか、又はそのようなスイッチ配列は導入遺伝子コンストラクトを受容する種（トランスジェニック動物）において生じるものから誘導されうる。例えば、トランスジェニックマウスを産生するために使用されるヒト導入遺伝子コンストラクトは、おそらくはマウススイッチ配列はリコンビナーゼ酵素系と共にマウススイッチ機能するように最適化される一方、ヒトスイッチ配列はそうではないので、それがマウス重鎖遺伝子座に天然に生じるものに類似したスイッチ配列を取り込むならば、より高い頻度のアイソタイプスイッチング事象を生じうる。スイッチ配列は一般的なクローニング法によって単離され、クローニングされうるか、又は免疫グロブリンスイッチ領域配列に関する刊行された配列情報を元にして設計されるオーバーラップ合成オリゴヌクレオチドから新規に合成されうる (Mills等, Nucl. Acids Res. 15:7305 7316 (1991)；Sideras等, Intl. Immunol. 1:631 642 (1989))。前記トランスジェニック動物の各々に対して、機能的に再編成された異種重鎖及び軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子がトランスジェニック動物のＢ細胞の有意な画分に見出され得る（少なくとも１０パーセント）。

本発明のトランスジェニック動物を産生するために使用される導入遺伝子は、少なくとも一つの可変遺伝子セグメント、一つの多様性遺伝子セグメント、一つの連結遺伝子セグメント及び少なくとも一つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含む重鎖導入遺伝子を含む。免疫グロブリン軽鎖導入遺伝子は、少なくとも一つの可変遺伝子セグメント、一つの連結遺伝子セグメント及び少なくとも一つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含む。軽鎖及び重鎖遺伝子セグメントをコードする遺伝子セグメントは、それらが、トランスジェニック非ヒト動物からならない種由来の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子セグメントをコードするＤＮＡから誘導され、又は同ＤＮＡに対応する点で、トランスジェニック非ヒト動物に対して異種性である。本発明の一態様では、導入遺伝子は、個々の遺伝子セグメントが再編成されない、つまり、機能的免疫グロブリン軽鎖又は重鎖をコードするように再編成されないように、構築される。そのような再編成されない導入遺伝子は、Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントの組換え（機能的再編成）を支援し、好ましくはＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２抗原に暴露されるときにトランスジェニック非ヒト動物内の生じた再編成された免疫グロブリン重鎖中にＤ領域遺伝子セグメントの全て又は一部の取り込みを支援する。

他の実施態様では、導入遺伝子は未編成「ミニ遺伝子座（mini-locus）」を含む。このような導入遺伝子は、典型的にはC, D, 及びJセグメントの実質的な部分並びにV 遺伝子セグメントのサブセットを含む。そのような導入遺伝子コンストラクトでは、様々な制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、クラススイッチ領域、ＲＮＡプロセシングのためのスプライスドナー及びスプライスアクセプター配列、組換えシグナル等が異種ＤＮＡから誘導された対応配列を含む。そのような制御配列は、本発明で使用される非ヒト動物の同じ又は関連した種由来の入遺伝子中に含められうる。例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、トランスジェニックマウスで使用される齧歯類免疫グロブリンエンハンサー配列と導入遺伝子中において組み合わせられうる。別法では、合成制御配列を導入遺伝子中に取り込むことができ、そのような合成制御配列は、哺乳動物のゲノム中に天然に生じることが知られている機能的ＤＮＡ配列と相同ではない。合成制御配列は、例えばスプライスアクセプター部位又はプロモーター／エンハンサーモチーフの許容可能な配列を特定するもののようなコンセンサス則に従って設計される。例えば、ミニ遺伝子座は、天然に生じる生殖系列Ｉｇ遺伝子座と比較して、非必須ＤＮＡ部分（例えば、介在配列;イントロン又はその一部）の少なくとも一つの内部（つまり、部分の末端ではない）欠質を有するゲノム免疫グロブリン遺伝子座の一部を含む。

本発明で用いられるトランスジェニック及び導入染色体マウスは、天然のマウスのものと理想的には実質的に同様の有意なレパートリーでの免疫グロブリン産生を示しうる。よって、例えば、内在性Ｉｇ遺伝子が不活性化されている実施態様では、全免疫グロブリンレベルは、約０．１から１０ｍｇ／ｍｌ血清、又は約０．５から５ｍｇ／ｍｌの範囲、又は少なくとも約１．０ｍｇ／ｍｌでありうる。ＩｇＭからＩｇＧへのスイッチをなすことができる導入遺伝子がトランスジェニックマウスに導入された場合、ＩｇＭに対する血清ＩｇＧ成体マウス比は約１０：１でありうる。ＩｇＭに対するＩｇＧの比は、未成熟マウスでは更に低いであろう。一般に、脾臓及びリンパ節Ｂ細胞の約１０％以上、好ましくは４０から８０％が専らヒトＩｇＧタンパク質を発現する。

レパートリーは天然マウスにおいて示されるものを理想的には近似し、通常は少なくとも約１０％高く、又は２５から５０％まで又はそれ以上である。一般に、少なくとも約千の異なった免疫グロブリン（理想的にはＩｇＧ）、例えば、好ましくは１０^４から１０^６まで又はそれ以上が、マウスゲノム中に導入される異なったＶ、Ｊ及びＤ領域の数に主に応じて、産生される。これらの免疫グロブリンは、典型的にはおよそ半分又はそれ以上の高度に抗原性のタンパク質、例えば、ブドウ球菌プロテインＡを認識する。典型的には、免疫グロブリンは、予め選択された抗原に対して１０^−７Ｍ以下、例えば１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍ又は１０^−１０Ｍ以下又は更に低い親和性（Ｋ_Ｄ）を示す。

幾つかの実施態様では、予め定まった抗原タイプに対する抗体応答で表されるＶ遺伝子の選択を制限するために予め定まったレパートリーのマウスを産生させることが好ましい場合がある。予め定まったレパートリーを有する重鎖導入遺伝子は、例えばヒトにおける予め定まった抗原に対する抗体応答で優先的に使用されるヒトV_H 遺伝子を含む。あるいは、あるV_H 遺伝子は、様々な理由から定まったレパートリーから除外されうる(例えば、予め定まった抗原に対して高親和性のＶ領域をコードする可能性が低い；体細胞変異及び親和性強化を受ける傾向が低い；又は所定のヒトに対して免疫原生である）。よって、様々な重鎖又は軽鎖遺伝子セグメントを含む導入遺伝子の再編成の前に、そのような遺伝子セグメントは、トランスジェニック動物以外の生物種由来であるので、例えばハイブリダイゼーション又はＤＮＡシークエンシングによって容易に同定されうる。

上述のトランスジェニック及び導入染色体マウスは、例えばＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２抗原の精製され又は濃縮された調製物及び／又はＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２を発現する細胞で免疫化することができる。別法では、トランスジェニックマウスを、ヒトＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２をコードするＤＮＡで免疫化することができる。ついで、マウスは、内部導入遺伝子スイッチ組換え（シス−スイッチング）を介してクラススイッチングを受け、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２と反応性の免疫グロブリンを発現するＢ細胞を産生する。免疫グロブリンはヒト抗体（また「ヒト配列抗体」と称される）であり得、ここで、重鎖及び軽鎖ポリペプチドはヒト導入遺伝子配列によってコードされ、これが体細胞変異によって誘導された配列及びＶ領域リコンビナトリアル連結、並びに生殖系列コード化配列を含み得；これらヒト抗体は、たとえ他の非生殖系列配列が体細胞変異及びディファレンシャルＶ−Ｊ及びＶ−Ｄ−Ｊ組換え連結の結果として存在しうるとしても、ヒトＶ_Ｌ又はＶ_Ｈ遺伝子セグメント及びヒトＪ_Ｌ又はＤ_Ｈ及びＪ_Ｈセグメントによってコードされるポリペプチド配列に実質的に同一であると言うことができる。各抗体鎖の可変領域は、典型的には少なくとも８０パーセントがヒト生殖系列Ｖ、Ｊ遺伝子セグメントによって、また重鎖の場合には、Ｄ遺伝子セグメントによってコードされ；しばしば少なくとも８５パーセントの可変領域が導入遺伝子上に存在するヒト生殖系列配列によってコードされ；しばしば９０又は９５パーセント又はそれ以上の可変領域配列が導入遺伝子上に存在するヒト生殖系列配列によってコードされる。しかしながら、非生殖系列配列は体細胞変異及びＶＪ及びＶＤＪ連結によって導入されるので、ヒト配列抗体は、しばしば、マウスの生殖系列中のヒト導入遺伝子に見出されるヒトＶ、Ｄ、又はＪ遺伝子セグメントによってコードされていない幾らかの可変領域配列（及び低い頻度で定常領域配列）を有する。典型的には、そのような非生殖系列配列（又は個々のヌクレオチド位置）はＣＤＲｓ内又はその近くに、又は体細胞変異がクラスター化することが知られている領域においてクラスター化する。

予め定まった抗原に結合するヒト抗体は、ヒト配列γ鎖（例えばγ１、γ２ａ、γ２Ｂ、又はγ３）及びヒト配列軽鎖（例えばκ）を含むヒト抗体が産生されるような、アイソタイプスイッチングから生じうる。そのようなアイソタイプスイッチングヒト抗体はしばしば、典型的には可変領域に、またしばしば親和性成熟と、特に二次（又は次の）抗原投与に続いての抗原によるＢ細胞の選択の結果としてＣＤＲ中又はその約１０残基以内に一又は複数の体細胞変異を含む。これらの高親和性ヒト抗体は１０^−７Ｍ以下、例えば１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍ、１０^−１０Ｍ、１０^−１０Ｍ以下もしくは更に低い結合親和性（Ｋ_Ｄ）を有しうる。

本発明の他の態様は、ここに記載されたトランスジェニック又は導入染色体マウスから誘導されたＢ細胞を含む。該Ｂ細胞は、ヒトＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２に対して高親和性（例えば、１０^−７Ｍより低い）でもって結合するヒトモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマを産生せしめるために使用されうる。

ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２に対する高親和性ヒトモノクローナル抗体の開発は、組み込まれたヒト免疫グロブリン導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスにおけるヒト可変領域遺伝子セグメントのレパートリーを拡大させるための方法によって容易にされ得、該方法は、上記組み込まれたヒト免疫グロブリン導入遺伝子には存在していないＶ領域遺伝子セグメントを含むＶ遺伝子導入遺伝子をゲノム中に導入することを含む。しばしば、Ｖ領域導入遺伝子は、ヒトゲノムに天然に生じ得、又は組換え法によって別に一緒にスプライシングされ得、順序がばらばらか省かれたＶ遺伝子セグメントを含みうるので、ヒトＶ_Ｈ又はＶ_Ｌ（Ｖ_Ｋ）遺伝子セグメントアレイの一部を含む酵母人工染色体である。しばしば、少なくとも５つ以上の機能的Ｖ遺伝子セグメントがＹＡＣに含まれる。このバリエーションでは、Ｖレパートリー拡大法によって産生されたトランスジェニックマウスを作製することが可能であり、そこでは、マウスがＶ領域導入遺伝子上に存在するＶ領域遺伝子セグメントによってコードされる可変領域配列及びヒトＩｇ導入遺伝子上にコードされるＣ領域を含む免疫グロブリン鎖を発現する。マウスは少なくとも約２４のＶ遺伝子又はそれ以上を含みうるので、Ｖレパートリー拡大法によって、少なくとも５つの区別できるＶ遺伝子を有するトランスジェニックマウスを産生させることができる。幾つかのＶ遺伝子セグメントは非機能性でありうる（例えば、偽遺伝子等）；これらのセグメントは、保持され得、又は所望されるならば当業者が利用できる組換え法によって選択的に欠失されうる。

ひとたびマウス生殖系列が、Ｊ及びＣ遺伝子セグメントを含むヒトＩｇ導入遺伝子に実質的には存在していない拡大されたＶセグメントレパートリーを有する機能的ＹＡＣを含むように操作されたならば、形質を増殖させて、拡大されたＶセグメントレパートリーを有する機能的ＹＡＣが異なったヒトＩｇ導入遺伝子を有するマウス生殖系列に交雑されるバックグラウンドを含む他の遺伝子的バックグラウンドに交雑される。拡大されたＶセグメントレパートリーを有する複数の機能的ＹＡＣｓを、生殖系列中に交雑させて、ヒト Ig 導入遺伝子(又は複数のヒト Ig 導入遺伝子)と共に作用させることができる。ここではYAC 導入遺伝子と称されるが、そのような導入遺伝子はゲノム中に組み込まれると、酵母中での自立複製に必要とされる配列のような酵母配列を実質的に欠く場合があり；そのような配列は、場合によっては、酵母中での複製がもはや必要でなくなった後に（つまり、マウスＥＳ細胞又はマウスプロザイゴート(prozygote)への導入前に）、遺伝子工学（例えば制限消化及びパルス場ゲル電気泳動又は他の適当な方法）によって除去されうる。ヒト配列免疫グロブリン発現の形質を増殖させる方法は、ヒトIg導入遺伝子を有し、場合によっては拡大されたＶセグメントレパートリーを有する機能的ＹＡＣをまた有するトランスジェニックマウスを飼育することを含む。 V_H 及びV_L 遺伝子セグメントの双方がＹＡＣ上に存在しうる。トランスジェニックマウスは、ヒトＩｇ導入遺伝子及び／又は他のヒトリンパ球タンパク質をコードする導入遺伝子を含む、他のヒト導入遺伝子を有するバックグラウンドを含む当業者によって望まれる任意のバックグラウンド中に交雑されうる。本発明はまた拡大されたＶ領域レパートリーＹＡＣ導入遺伝子を有するトランスジェニックマウスによって生産された高親和性ヒト配列免疫グロブリンを提供する。前記は本発明のトランスジェニック動物の好ましい実施態様を記載しているが、４つのカテゴリーに分類される他の実施態様も考えられる：
（１）未再編成の重鎖及び再編成の軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子を含むトランスジェニック動物；
（２）未再編成の重鎖及び未再編成の軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子を含むトランスジェニック動物；
（３）再編成の重鎖及び未再編成の軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子を含むトランスジェニック動物；及び
（４）再編成の重鎖及び再編成の軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子を含むトランスジェニック動物。

ＶＩ．抗体コンジュゲート／免疫毒素
他の態様では、本発明は、例えば細胞毒素、薬剤（例えば免疫抑制剤）又は放射性同位体などの療法用部分にコンジュゲートされたヒトＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２抗体を特徴とする。細胞毒素にコンジュゲートされると、これらの抗体コンジュゲートは、「免疫毒素」と称される。細胞毒素又は細胞傷害剤には、細胞に有害な（例えば細胞を死滅させる）あらゆる薬剤が含まれる。例には、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＢ、エチジウムブロミド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、並びにそのアナログ又はホモログが含まれる。治療剤には、限定されるものではないが、代謝拮抗剤（例えばメトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、デカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパ（thioepa）、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（cyclothosphamide）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）、シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（先のダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（先のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、及び有糸分裂阻害剤（例えばビンクリスチン及びビンブラスチン）が含まれる。本発明の抗体を、放射性同位体、例えば放射性ヨウ素にコンジュゲートして、関連疾患、例えば癌の治療のための細胞傷害性放射性薬剤を生成することも可能である。

コンジュゲートされたヒトＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２抗体は、例えば所定の治療レジメンの効果を決定するために、臨床試験手順の一部として組織中のポリペプチドレベルをモニターするために診断的に又は予後的に使用することができる。検出は、検出可能な基質に抗体をカップリング（すなわち、物理的に連結）させることによって容易になされうる。検出可能な物質の例は、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、及び放射性材料を含む。適切な酵素の例は、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、Ｐ−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを含み；適切な補欠分子族複合体の例はストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンを含み；適切な蛍光材料の例はウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル又はフィコエリトリンを含み；発光材料の例はルミノールを含み；生物発光材料の例はルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンを含み、及び適切な放射性材料の例は_１２５Ｉ、_１３１Ｉ、_３５Ｓ又は_３Ｈを含む。

本発明の抗体コンジュゲートを用いて、所定の生物学的反応を修飾することも可能である。治療用部分は、古典的な化学療法剤に限定されると解釈されてはならない。例えば、薬剤部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質又はポリペプチドでありうる。このようなタンパク質には、例えば、酵素的に活性な毒素、又はその活性断片、例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、又はジフテリア毒素；腫瘍壊死因子又はインターフェロン−γなどのタンパク質；あるいは生物学的反応修飾剤、例えばリンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、又は他のサイトカイン又は増殖因子が含まれうる。

このような治療用部分を抗体にコンジュゲートさせるための技術はよく知られており、例えば、Arnon等, “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld等編, pp. 243 56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)；Hellstrom等, “Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (2版), Robinson等編, pp. 623 53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)；Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies ‘84: Biological And Clinical Applications, Pinchera等編, pp. 475 506 (1985)；“Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin等編, pp. 303 16 (Academic Press 1985), 及びThorpe等, “The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev., 62:119 58 (1982)を参照のこと。

ＶＩＩ．薬学的組成物
他の態様では、本発明は、薬学的に許容可能な担体と共に処方されて、本発明のモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分（例えば抗原結合断片）の一又は組合せを含む組成物、例えば薬学的組成物を提供する。一実施態様では、組成物は、本発明の複数（例えば二以上）の単離されたヒト抗体の組合せを含む。好ましくは、組成物の抗体の各々は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及び／又はＰＤ−Ｌ２の区別される予め選択されたエピトープに結合する。

本発明の薬学的組成物は、また併用療法において投与されうる、つまり他の薬剤と組み合わされる。例えば、併用療法は、本発明の組成物を、少なくとも一又は複数の更なる治療剤、例えば抗炎症剤、ＤＭＡＲＤｓ（疾患修飾性抗リウマチ薬）、免疫抑制剤、化学療法剤ｍ及び乾癬剤と共に含みうる。本発明の薬学的組成物は、放射線療法との関連で投与することもできる。ＣＤ４特異的抗体及びＩＬ−２特異的抗体のような他の抗体との同時投与もまた本発明に包含される。

ここで使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」は、生理学的に適合性がある任意かつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張性及び吸収遅延剤等を含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋内、皮下、非経口、脊髄又は上皮投与（例えば注射又は注入による）に適している。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち抗体、二重特異性及び多重特異性分子を、物質で被服して、化合物を不活性化しうる酸の作用及び他の天然の条件から化合物を保護することも可能である。

「薬学的に許容可能な塩」は、親化合物の望ましい生物学的活性を保持し、如何なる望ましくない毒物学的効果も与えない塩を意味する（例えば、Berge, S. M.,等(1977) J. Pharm. Sci. 66:1 19を参照）。このような塩の例は、酸付加塩及び塩基付加塩を含む。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸等の非毒性無機酸に由来するもの、並びに脂肪族モノカルボン酸及びジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族スルホン酸等の非毒性有機酸に由来するものを含む。塩基付加塩は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属に由来するもの、並びにＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等の非毒性有機アミンに由来するものを含む。

本発明の組成物は当該分野で知られている様々な方法によって投与されうる。当業者によって理解されるように、投与の経路及び／又は形態は、所望される結果に応じて変わりうる。活性化合物は、迅速な放出、例えばインプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化デリバリー系を含む徐放性製剤に対して化合物を保護する担体と共に調製されうる。エチレンビニルアセテート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸のような生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤を調製するための多くの方法が特許にされ又は当業者に一般に知られている。例えば、Sustained 及びControlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson編, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照のこと。

ある投与経路によって本発明の化合物を投与するためには、化合物を、その不活性化を防止する物質で被覆し、又はその化合物をその物質と同時投与することが必要である場合がある。例えば、化合物は、適切な担体、例えばリポソーム又は希釈剤中に入れて被験者に投与することができる。薬学的に許容可能な希釈剤は、生理食塩水及びバッファー水溶液を含む。リポソームは、水中油中水ＣＧＦエマルジョン並びに一般的なリポソームを含む(Strejan等(1984) J. Neuroimmunol. 7:27)。

薬学的に許容可能な担体は、滅菌水溶液又は分散体及び滅菌された注射用溶液又は分散体を即時調製するための滅菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためにそのような媒体及び薬剤を使用することは当該分野で知られている。一般的な媒体又は薬剤が活性化合物と非適合性である場合を除いて、本発明の薬学的組成物におけるその使用が考えられる。補充の活性化合物もまた組成物に導入することができる。

治療用組成物は、典型的には製造及び貯蔵の条件下で滅菌で安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高薬剤濃度に適した他の整った構造として製剤化されうる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びその適切な混合物を含む溶媒又は分散媒でありうる。適切な流動性が、例えば、レシチンのようなコーティングを使用することによって、分散体の場合は要求される粒子サイズを維持することにより、また界面活性剤を使用することにより維持されうる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマニトール、ソービトール、又は塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の延長された吸収が、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩又はゼラチンを含めることによりもたらされうる。

滅菌した注射用溶液は、上記に列挙された成分の一つ又は組合わせと共に適切な溶媒中に必要とされる量の活性化合物を導入することによって調製され、ついで精密濾過滅菌されうる。一般に、分散体は、活性化合物を、塩基性分散媒と上に列挙されたものの中から必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中に導入することにより調製される。滅菌した注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、前もって滅菌フィルター処理した溶液から、活性成分と任意の追加的な所望成分との粉末を生じせしめる真空乾燥及びフリーズドライ（凍結乾燥）である。

投与レジメンが最適な所望の応答（例えば治療応答）をもたらすように調整される。例えば、単一のボーラスが投与され得、幾つかに分けた用量が経時的に投与され得、又は用量は治療状況の要求に示されるように比例して減少又は増加させられうる。例えば、本発明のヒト抗体は、皮下注射により毎週一回又は二回、あるいは皮下注射により毎月一回又は二回投与されうる。投与を容易にし投薬量の均一性のために投薬単位形態に非経口組成物を処方することが特に有利である。ここで使用される投薬単位形態は、治療される被験者のための単位投薬量として適した物理的に離散した単位を意味する；各単位は、必要とされる薬学的担体との組合せで所望の治療効果を生じるように計算された予め定まった量の活性化合物を含んでいる。本発明の投薬単位形態の仕様は、（ａ）活性化合物の独特の特性と達成されるべき特定の治療効果と、（ｂ）個人の感受性の処置に対するそのような活性化合物の配合技術に固有の制限とに支配され、直接的に依存する。

一実施態様では、本発明の薬剤は抗体である。ここで定義される場合、抗体の治療的に有効な量（すなわち、効果的な投薬量）は、約０．００１から３０ｍｇ／ｋｇ体重、又は約０．０１から２５ｍｇ／ｋｇ体重、又は約０．１から２０ｍｇ／ｋｇ体重、又は約１から１０ｍｇ／ｋｇ、２から９ｍｇ／ｋｇ、３から８ｍｇ／ｋｇ、４から７ｍｇ／ｋｇ、又は５から６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲でありうる。当業者は、ある種の要因が、限定されないが、疾患又は障害の重症度、既往治療、被験者の一般健康状態及び／又は年齢、及び存在する他の疾患を含めて、被験者を効果的に治療するのに必要とされる投与量に影響し得ることを理解するであろう。更に、抗体の治療的有効量での被験者の治療には、単一の治療が含まれ得るか、又は、好ましくは一連の治療が含まれうる。治療に用いられる抗体の有効投与量は、特定の治療の過程にわたって増加又は減少させてもよいこともまた理解されるであろう。投薬量の変化は診断アッセイの結果から生じうる。

薬学的に許容可能な抗酸化剤の例は、（１）水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等；（２）油溶性抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロール等；及び（３）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等を含む。

治療用組成物に対しては、本発明の製剤は、経口、経鼻、局所（舌下、舌下腺を含む）、直腸、膣、及び／又は、非経口投与に適したものを含む。該製剤は、単位投与形態で簡便には提供され得、薬学分野で知られている任意の方法によって調製されうる。単一の投薬形態を作製するために担体物質と組み合わされうる活性成分の量は、治療対象の被験者、及び特定の投与形態に応じて変わるであろう。単一投薬形態を作製するために担体物質に組み合わされうる活性成分の量は、一般には治療効果を生じる組成物の量となろう。一般には、１００パーセントのうち、この量は、活性成分が約０．００１パーセントから約９９パーセント、あるいは約０．００５パーセントから約７０パーセント、又はあるいは約０．０１パーセントから約３０パーセントの範囲であろう。

膣投与に適した本発明の製剤は、当該分野で適切であることが知られている担体を含むペッサリー、坐薬、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム又はスプレー製剤をまた含む。本発明の組成物の局所又は経皮投与のための投薬形態は、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤を含む。活性化合物は、薬学的に許容可能な担体と、また必要とされうる任意の保存料、バッファー、又は噴霧剤と滅菌条件下で混合されうる。

ここで使用される「非経口投与」及び「非経口的に投与される」なる語句は、経腸と局所投与以外の投与形態、通常は注射様式を意味し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、クモ膜下、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、上皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、髄腔内、硬膜外、胸骨内への注射及び注入を含む。

本発明の薬学的組成物に用いられうる適切な水性及び非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、及びその適切な混合物、植物油、例えばオリーブ油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルを含む。例えば、適切な流動性は、コーティング材、例えばレシチンの使用により、また分散体の場合は必要とされる粒径の維持により、また界面活性剤の使用によって、維持されうる。

これらの組成物は、アジュバント、例えば保存料、湿潤剤、乳化剤及び分散剤を含みうる。上記の滅菌手順と、様々な抗菌剤や抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等の添加の双方によって、微生物の存在を確実に防止できる。また、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウム等を組成物に添加することが望ましい場合がある。加えて、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含有せしめることにより、注射可能な薬学的形態の長期吸収がもたらされうる。

本発明の化合物をヒト及び動物に薬剤として投与する場合、それらは、単独で、又は例えば、薬学的に許容可能な担体との組合せで０．００１から９０％（例えば０．００５から７０％、例えば０．０１から３０％）の活性成分を含む薬学的組成物として、投与されうる。

選択される投与経路にかかわらず、適切な水和形態で使用されてもよい本発明の化合物、及び／又は本発明の薬学的組成物は、当業者に知られた一般的な方法により、薬学的に許容可能な投薬形態に製剤化される。

本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投薬量レベルは、患者に対して毒性とならないで、特定の患者、組成物、投与様式に対して、所望の治療応答を達成するのに効果的な活性成分量が得られるように変化させうる。選択される投薬量レベルは、使用される本発明の特定の組成物、又はそのエステル、塩、又はアミド、投与経路、投与時間、使用される特定化合物の排出率、治療期間、他の薬剤、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される化合物及び／又は材料、年齢、性別、体重、健康状態、治療中の患者の先の医療歴、及び医学分野でよく知られた要因等の様々な薬物動態学的因子に依存するであろう。通常の技量を有する医師又は獣医は、必要な薬学的組成物の有効量を直ちに決定し、処方できる。例えば、医師又は獣医は、薬学的組成物に使用される本発明の化合物を、所望の治療効果の達成に必要な投薬量より低いレベルの投薬量から開始して、所望の効果を得られるまで段階的に投薬量を増やしてもよい。一般に、本発明の組成物の適切な１日投薬量は、治療効果をもたらすのに効果的な最低用量である化合物の量である。このような効果的な用量は、一般に、上述した因子に依存するであろう。投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下に行われるのが好ましく、標的の部位に隣接して投与されることが好ましい。所望されるならば、治療組成物の効果的な毎日の用量は、一日を通して、適切な間隔で２、３、４、５、６、又はこれ以上に分割して、任意的には単位投与形態で、投与されうる。本発明の化合物は、単独で投与することもできるが、薬学的製剤（組成物）として化合物を投与することが好ましい。

治療用組成物は、当該分野で知られている医療機器で投与されうる。例えば、一実施態様では、本発明の治療用組成物は、米国特許第５３９９１６３号、第５３８３８５１号、第５３１２３３５号、第５０６４４１３号、第４９４１８８０号、第４７９０８２４号、又は第４５９６５５６号に開示された装置のような、無針の皮下注射装置で投与されうる。本発明において有用なよく知られたインプラント及びモジュールの例は、制御速度で医薬を分配するインプラント可能なマイクロインフュージョンポンプを開示している米国特許第４４８７６０３号、皮膚を通して医薬を投与する治療装置を開示している米国特許第４４８６１９４号、医薬を正確な注入速度で送達する医薬注入ポンプを開示している米国特許第４４４７２３３号、連続的薬物送達用の可変流量式インプラント可能注入装置を開示している米国特許第４４４７２２４号、複数チャンバー区画を有する浸透圧薬物送達システムを開示している米国特許第４４３９１９６号、浸透圧薬物送達システムを開示している米国特許第４４７５１９６号公報を含む。多くの他のそのようなインプラント、送達システム、及びモジュールが当業者に知られている。

ある実施態様では、本発明のヒトモノクローナル抗体は、インビボでの適切な分配を確保するように製剤化されうる。例えば、血液−脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高親水性化合物を排除する。本発明の治療用化合物が（所望ならば）ＢＢＢを横断することを確実にするため、例えば、リポソームに製剤化できる。リポソームの製造方法に関しては、米国特許第４５２２８１１号、同第５３７４５４８号、及び同第５３９９３３１号を参照のこと。リポソームは、特定の細胞又は器官に選択的に運ばれる一又は複数の部分を含んでいてもよく、これにより、標的とする薬物送達を亢進できる（例えば、V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照）。例示的なターゲット部分は、葉酸塩又はビオチン（Low等の米国特許第５４１６０１６号）；マンノシド（Umezawa等, (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）；抗体（P. G. Bloeman等(1995) FEBS Lett. 357:140；M. Owais等(1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180）；肺サーファクタントプロテインＡ受容体（Briscoe等(1995) Am. J. Physiol. 1233:134）、本発明の製剤を構成しうる異なる種、並びに発明された分子の成分：ｐｌ２０（Schreier等(1994) J. Biol. Chem. 269:9090）を含む。またK. Keinanen；M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123；J. J. Killion；I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照のこと。本発明の一実施態様では、本発明の治療用化合物は、リポソーム内に製剤化される；他の実施態様では、リポソームはターゲット部分を含む。更に他の実施態様では、リポソーム内の治療用化合物は、腫瘍又は感染に近接する部位にボーラス注射によって送達される。組成物は、容易に注射可能な状態となる程度に、流動性でなければならない。製造及び貯蔵の条件下で、安定し、細菌及び真菌のような微生物汚染作用から保存されなければならない。

組成物は、無菌で、組成物がシリンジにより送達可能な程度に流動的でなければならない。水に加えて、担体は、等張緩衝生理食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、及びその適切な混合物でありうる。適切な流動性が、例えば、レシチンのようなコーティングを使用することによって、分散体の場合は要求される粒子サイズを維持することにより、また界面活性剤を使用することにより維持されうる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマニトール又はソービトール、及び塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の延長された吸収が、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム又はゼラチンを含めることによりもたらされうる。

上記のように活性化合物が適切に保護される場合、該化合物は、例えば、不活性な希釈剤又は吸収可能な食用担体と共に、経口的に投与されうる。

ＶＩＩＩ．発明の使用及び方法
（抗体の誘導体及びコンジュゲートを含む）ここに記載の抗体及び抗体を含む組成物は、（例えば免疫応答の上方又は下方調節による）様々なインビトロ及びインビボ診断及び治療用途に使用することができる。例えば、ＰＤ−１又はＢ７−１に結合するＰＤ−１リガンドは阻害性シグナルを伝達する。よって、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンド間、又はＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用の調節が免疫応答の調節を生じる。ＰＤ−１リガンドはまたＴ細胞を同時刺激しうる。よって、一実施態様では、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１又はＢ７間の相互作用をブロックする抗体は、阻害性シグナルを防止しうる。一実施態様では、ＰＤ−１リガンドの同時刺激シグナルをブロックする抗体は、免疫細胞に対する同時刺激シグナルをブロックする。更に、ＰＤ−Ｌ２のライゲーションはサイトカイン分泌及び樹状細胞の生存を誘導しうる。よって、ＰＤ−Ｌ２ライゲーションをブロックする抗体は樹状細胞の生存を阻害し、樹状細胞によるサイトカイン発現を低減させ、これらのメカニズムを通じて免疫応答を阻害しうる。特に、ここに記載された抗体は、例えばKeir等(2008) Annu. Rev. Immunol. 26:677；Sharpe等, (2007) Nat. Immunol. 8:239；Freeman等(2007) J. Exp. Med. 10:2223（各々はその全体が出典明示によりここに援用される）において検討されているように、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及び／又はＰＤ−Ｌ２により媒介される特定の症状に関連した診断、予後、予防、及び治療応用に有用である。

一実施態様では、本発明の抗体及び抗原結合断片は、神経変性疾患（老年期痴呆、アルツハイマー病、ダウン症、パーキンソン病、クロイツフェルトヤコブ病、糖尿病性ニューロパシー、パーキンソン症候群、ハンチントン病、マシャドジェセフ病、筋萎縮性側索硬化症、糖尿病性ニューロパシー、及びクロイツフェルトヤコブ病）に関する診断、予後、予防、及び治療応用に有用である。

他の実施態様では、本発明の抗体及び抗原結合断片は、免疫反応が亢進することによる疾患、例えば、喘息、自己免疫疾患（糸球体腎炎、関節炎、拡張性心筋症様疾患、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、クローン病、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、乾鮮、アレルギー性接触性皮膚炎、多発性筋炎、強皮症、結節せい動脈周囲炎、リウマチ熱、尋常性白斑、インスリン依存性糖尿病、ベーチェット病、橋本病、アジソン病、皮膚筋炎、重症筋無力症、ライター症候群、グレーブス病、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、不妊症、慢性活動性肝炎、天疱瘡、自己免疫性血小板減少性紫斑病、及び自己免疫性溶血性貧血、活動性慢性肝炎、アジソン病、抗リン脂質症候群、アトピー性アレルギー、自己免疫萎縮性胃炎、無酸症自己免疫、セリアック病、クッシング症候群、皮膚筋炎、円板状エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、橋本甲状腺炎、突発性副腎萎縮症、突発性血小板減少症、インスリン依存性糖尿病、ランバート・イートン症候群、ルポイド肝炎、リンパ球減少症の幾つかの症例、混合性結合組織病、類天疱瘡、天疱瘡尋常性、悪性貧血、水晶体起因性ブドウ膜炎、結節性多発動脈炎、多腺性自己免疫症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、レイノー症候群、再発性多発性軟骨炎、シュミット症候群、限局型全身性強皮症（又はクレスト症候群）、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎、甲状腺中毒症、ｂ型インスリン抵抗性、潰瘍性大腸炎及びウェゲナー肉芽腫症）の診断、予後、予防、及び治療応用（例えば治療し、疾患の発症又は進行を遅延させる）に有用である。

更に他の実施態様では、本発明の抗体及び抗原結合断片は、持続性感染疾患（例えば、ウイルス感染疾患、例えばＨＰＶ、ＨＢＶ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、レトロウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２）、ヘルペスウイルス、例えばエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２、及びインフルエンザウイルス）に関する診断、予後、予防、及び治療応用（例えば治療し、疾患の発症又は進行を遅延させる）に有用である。ここに記載されたようにして利用することができる病原菌に付随する他の抗原は様々な寄生虫の抗原であり、マラリア、好ましくはＮＡＮＰの反復に基づくマラリアペプチドを含む。また、細菌、真菌及び他の病原体の疾患が含まれ、例えば、Aspergillus、Brugia、Candida、Chlamydia、Coccidia、Cryptococcus、Dirofilaria、Gonococcus、Histoplasma、Leishmania、Mycobacterium、Mycoplasma、Paramecium、Pertussis、Plasmodium、Pneumococcus、Pneumocystis、Rickettsia、Salmonella、Shigella、Staphylococcus、Streptococcus、Toxoplasma 及びVibriocholeraeである。例示的な種は、Neisseria gonorrhea、Mycobacterium tuberculosis、Candida albicans、Candida tropicalis、Trichomonas vaginalis、Haemophilus vaginalis、Group B Streptococcus sp.、Microplasma hominis、Hemophilus ducreyi、Granuloma inguinale、Lymphopathia venereum、Treponema pallidum、Brucella abortus、Brucella melitensis、Brucella suis、Brucella canis、Campylobacter fetus、Campylobacter fetus intestinalis、Leptospira pomona、Listeria monocytogenes、Brucella ovis、Chlamydia psittaci、Trichomonas foetus、Toxoplasma gondii、Escherichia coli、Actinobacillus equuli、Salmonella abortus ovis、Salmonella abortus equi、Pseudomonas aeruginosa、Corynebacterium equi、Corynebacterium pyogenes、Actinobaccilus seminis、Mycoplasma bovigenitalium、Aspergillus fumigatus、Absidia ramosa、Trypanosoma equiperdum、Babesia caballi、Clostridium tetani、Clostridium botulinum；又は真菌、例えば、Paracoccidioides brasiliensis；又は他の病原、例えば、Plasmodium falciparumである。また含まれるものはNational Institute of Allergy and Infectious Diseases（ＮＩＡＩＤ）の重点病原菌である。これらは、カテゴリーＡの病原体、例えば大痘瘡（天然痘）、Bacillus anthracis (炭疽菌)、Yersinia pestis (ペスト)、Clostridium botulinum毒素(ボツリヌス中毒)、Francisella tularensis (野兎病)、filoviruses (エボラ出血熱、マールブルグ出血熱)、アレナウイルス(ラッサ(ラッサ熱)、フニン(アルゼンチン出血熱) 及び関連ウイルス)；カテゴリーＢの病原体、例えばCoxiella burnetti (Ｑ熱)、Brucella species (ブルセラ症)、Burkholderia mallei (鼻疽)、アルファウイルス(ベネズエラ脳脊髄炎、東部・西部ウマ脳脊髄炎)、Ricinus communis 由来のリシン毒(トウゴマ)、Clostridium perfringens由来のイプシロン毒；Staphylococcus enterotoxin B、Salmonella種、Shigella dysenteriae、Escherichia coli株Ｏ１５７：Ｈ７、Vibrio cholerae、Cryptosporidium parvum；カテゴリーＣの病原体、例えばニパーウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、黄熱、及び多剤耐性結核；蠕虫、例えば住血吸虫及び条虫類；及び原虫、例えばLeishmania (例えば、L. mexicana)及びPlasmodiumを含む。

更に他の実施態様では、本発明の抗体及び抗原結合断片は、臓器移植片拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、アレルギー性疾患、及びＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及び／又はＰＤ−Ｌ２が関与する免疫反応の減弱により引き起こされる疾患、例えば癌及び感染疾患に関する診断、予後、予防、及び治療応用に有用である。

ここに記載の抗体又は抗原結合断片は、静脈内（例えばボーラスとして又は所定期間に対しての連続的注入による）、皮下、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、関節内、滑液内、クモ膜下腔内、又は吸入経路投与により被験者に投与される。

被験者は、望ましい臨床結果を含む一又は複数の有益な又は所望される結果が得られるならば治療される。この発明の目的に対して、有益な又は所望される結果は、限定されるものではないが、次のものの一又は複数を含む：疾患から生じる症状の一又は複数の減少、疾患に罹患している者の生活の質の増加、疾患を治療するために必要とされる他の医薬の用量の減少、疾患の進行の遅延化、及び／又は個体の生存の延長。

１．スクリーニング法
本発明の一態様は、（例えばＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２の機能を調節する抗体のような）同時刺激を調節することにより免疫応答を調節するための本発明の抗体の使用方法に関する。このような方法は、細胞ベース及び非細胞ベースのアッセイを含むスクリーニングアッセイを利用する。一実施態様では、アッセイは、ＰＤ−１リガンド及びＰＤ−１の相互作用を調節する抗体を同定するための方法を提供する。他の実施態様では、アッセイは、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチド間の相互作用を調節する抗体を同定するための方法を提供する。

一実施態様では、本発明は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２に結合し、又はその活性を調節する、例えばその同族結合対と相互作用（例えば結合）するポリペプチドの能力を調節する候補又は試験抗体をスクリーニングするためのアッセイに関する。一実施態様では、免疫応答を調節する抗体を同定するための方法は、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間の相互作用を調節する、例えば亢進又は阻害する抗体の能力を決定し、更にＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を調節する抗体の能力を決定することを伴う。一実施態様では、（例えばＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を調節しないで）ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を調節する抗体が選択される。他の実施態様では、（例えばＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を調節しないで）ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を調節する抗体が選択される。

他の実施態様では、免疫応答を減少させる抗体を同定する方法は、ＰＤ−１リガンド及びＢ７ポリペプチド間の相互作用を亢進する候補抗体の能力を決定し、ＰＤ−１リガンド及びＢ７ポリペプチド間の相互作用を阻害する抗体を選択することを伴う。他の実施態様では、免疫応答を減少させる抗体を同定する方法は、ＰＤ−１リガンド及びＰＤ−１間の相互作用を亢進する候補抗体の能力を決定し、ＰＤ−１リガンド及びＰＤ−１間の相互作用を阻害する抗体を選択することを伴う。

一実施態様では、アッセイは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２を発現する細胞を試験抗体と接触させ、ＰＤ−１又はＰＤ−１リガンド標的のその結合対への結合を調節する（例えば刺激又は阻害する）試験抗体の能力を決定することを含む細胞ベースのアッセイである。ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド又はＢ７ポリペプチドのその結合対への結合、又はそれとの相互作用の能力の決定は、例えば、直接の結合の測定又は免疫細胞活性化のパラメータの測定によって、達成される。

例えば、直接の結合アッセイでは、ＰＤ−１又はＰＤ−１リガンドタンパク質（又はその各標的ポリペプチド）に放射性同位体又は酵素標識をカップリングさせることができ、ＰＤ−１リガンドのＰＤ−１への又はＢ７ポリペプチドへの結合が、複合体中の標識されたタンパク質を検出することにより決定されうる。例えば、ＰＤ−１又はＰＤ−１を^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、又は^３Ｈで直接的又は間接的に標識でき、放射性同位体が放出放射能の直接の計数又はシンチレーションカウントにより検出される。別法では、ＰＤ−１又はＰＤ−１リガンドは、例えば西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はルシフェラーゼで酵素的に標識され得、酵素標識が適切な基質の製品への転化の決定によって検出される。

何れの相互作用体も標識しないで、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドとの間又はＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドとの間の相互作用を調節する化合物の能力を決定することもまた本発明の範囲にある。例えば、マイクロフィジオメーターを使用し、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、Ｂ７ポリペプチド、又は標的ポリペプチドの何れも標識しないで、その標的ポリペプチドとの、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドとの間、又はＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドとの間の相互作用を検出することができる(McConnell, H. M.等(1992) Science 257:1906-1912)。ここで使用される場合、「マイクロフィジオメーター」(例えば、Cytosensor)は、光アドレス可能な電位差測定センサー（ＬＡＰＳ）を使用してその環境を細胞が酸性化する速度を測定する分析機器である。酸性化速度の変化を化合物とレセプター間の相互作用の指標として使用することができる。

他の実施態様では、ポリペプチドの与えられたセット間の相互作用をアンタゴナイズする抗体の能力の決定は、ポリペプチドのセットの一又は複数のメンバーの活性を決定することによって達成されうる。例えば、ＰＤ−１又はＰＤ−１リガンドの活性は、細胞性二次メッセンジャーの誘導 (例えば、チロシンキナーゼ活性)を検出し、適切な基質の触媒／酵素活性を検出し、（例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのような検出可能なマーカーをコードする核酸に作用可能に連結された標的応答性調節エレメントを含む）レポーター遺伝子の誘導を検出し、又はＰＤ−１又はＰＤ−１リガンドによって調節される細胞性応答を検出することにより、決定されうる。上記ポリペプチドに結合し又は相互作用する抗体の能力を決定することは、例えば増殖アッセイにおいて免疫細胞同時刺激又は阻害を調節する化合物の能力を測定することによって、又は上記ポリペプチドのその一部を認識する抗体に結合する能力を妨害することによって、達成されうる。

同時刺激レセプターとのＰＤ−１リガンドの相互作用をブロックし又は阻害する抗体並びにＰＤ−１リガンド媒介阻害シグナルを促進する抗体を、免疫細胞増殖及び／又はエフェクター機能を阻害し、又はインビトロアッセイに添加したときにアネルギーを誘導するその能力によって同定することができる。例えば、細胞を、活性化レセプターを介してシグナル伝達を刺激する薬剤の存在下で培養することができる。細胞活性化の多くの認められた読取り値を用いて、活性化剤の存在下における細胞増殖又はエフェクター機能（例えば抗体生産、サイトカイン生産、ファーゴサイトーシス）を測定することができる。試験抗体のこの活性化をブロックする能力は、当該分野で知られている技術を使用して、測定されている増殖又はエフェクター機能における減少に影響を及ぼす抗体の能力を測定することによって容易に決定することができる。

例えば、本発明の抗体は、Freeman等(2000) J. Exp. Med. 192:1027 及びLatchman等(2001) Nat. Immunol. 2:261に記載されているようにして、Ｔ細胞アッセイにおいて同時刺激を阻害又は亢進する能力について試験することができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞をヒトＰＢＭＣｓから単離し、活性化抗ＣＤ３抗体で刺激することができる。Ｔ細胞の増殖は^３Ｈチミジン取り込みによって測定することができる。該アッセイではＣＤ２８同時刺激と共に又はこれを伴わないでアッセイを実施することができる。同様のアッセイはＰＢＭＣｓ由来のＰＨＡ−芽細胞及びＪｕｒｋａｔＴ細胞を用いて実施することができる。

更に他の実施態様では、本発明のアッセイは、ＰＤ−１又はＰＤ−１リガンド又はその生物学的に活性な部分が試験抗体と接触させられ、ポリペプチド又はその生物学的に活性な部分に試験抗体が結合する能力が決定される無細胞アッセイである。ＰＤ−１又はＰＤ−１リガンドポリペプチドへの試験抗体の結合は、上述のように直接的に又は間接的に決定されうる。更に他の実施態様では、アッセイは、ポリペプチド又はその生物学的に活性な部分を、その結合対と接触させてアッセイ混合物を形成し、アッセイ混合物を試験抗体と接触させ、アッセイ混合物中のポリペプチドと相互作用する試験抗体の能力を決定することを含み、ここで、ポリペプチドと相互作用する試験抗体の能力を決定することが、結合対と比較して、ポリペプチド又はその生物学的に活性な部分に優先的に結合する試験抗体の能力を決定することを含む。

例えば、ＰＤ−１リガンド及びＰＤ−１ポリペプチドを使用してアッセイ混合物を形成することができ、この相互作用をブロックする試験抗体の能力を、結合を決定するための上述した方法の一つによって、ＰＤ−１リガンドに結合するＰＤ−１の能力を決定し、ＰＤ−１ポリペプチドに結合するＰＤ−１リガンドの能力を決定することにより、試験することができる。ＰＤ−１リガンドに結合するＰＤ−１ポリペプチドの能力を決定し、Ｂ７ポリペプチドに結合するＰＤ−１リガンドの能力を決定することはまたリアルタイム生体分子間相互作用解析（ＢＩＡ）(Sjolander, S. 及びUrbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345 及びSzabo等(1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705)のような技術を使用して達成することもできる。ここで使用される場合、「ＢＩＡ」は何れの相互作用体の標識もしないでリアルタイムで生体分子特異的相互作用を研究するための技術である（例えば、ビアコア）。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象の変化を、生物学的ポリペプチド間のリアルタイム反応の指標として使用することができる。ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、及びＢ７ポリペプチドをビアコアチップに固定させることができ、抗体をＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、及びＢ７ポリペプチドへの結合について試験することができる。ＢＩＡ技術を使用する例は、Fitz等(1997) Oncogene 15:613に記載されている。

本発明の無細胞アッセイはタンパク質（例えば、ＰＤ−１リガンド又はＰＤ−１タンパク質又はその生物学的に活性な部分、又はＰＤ−１リガンド又はＰＤ−１が結合する結合対）の可溶型及び／又は膜結合型の使用に受け入れられる。膜結合型タンパク質（例えば、細胞表面ＰＤ−１リガンド又はＰＤ−１レセプター）が使用される無細胞アッセイの場合、タンパク質の膜結合型が溶液中に維持されるように可溶化剤を利用することが望ましい場合がある。そのような可溶化剤の例は、非イオン性洗浄剤、例えば、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、又はＮ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートを含む。

上述のアッセイ方法の一又は複数の実施態様では、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、及びＢ７ポリペプチド、又は適切な標的ポリペプチドの何れかを固定化して、タンパク質の一方又は双方の未複合化形態からの複合化形態の分離を容易にし、またアッセイの自動化に適応させることが望ましい場合がある。ＰＤ−１又はＰＤ−１リガンドへの試験抗体の結合は、反応体を含めるのに適した任意の容器において達成することができる。そのような容器の例は、マイクロタイタープレート、試験管、及び微量遠心管を含む。一実施態様では、基質にタンパク質の一方又は双方を結合させることを可能にするドメインを付加する融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、又はＢ７ポリペプチド融合タンパク質、又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, MO) 又はグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着させることができ、これをついで試験化合物と組み合わせ、混合物を、複合体形成を助ける条件下（例えば、塩及びｐＨについて生理学的条件）でインキュベートすることができる。インキュベーション後、ビーズ又はマイクロタイタープレートウェルを洗浄し、未結合成分、ビーズの場合は固定化された基質、直接的又は間接的に定量された複合体を、例えば上述のように、除去する。別法では、複合体を基質から解離させることができ、ＰＤ−１、ＰＤ−１リガンド、又はＢ７ポリペプチドの結合性又は活性のレベルを標準的な技術を使用して決定する。

別の実施態様では、ＰＤ−１又はＰＤ−１リガンドの活性を調節する試験化合物の能力を決定することは、ＰＤ−１又はＰＤ−１リガンドの下流で機能するポリペプチド、例えば、ＰＤ−１リガンドと相互作用するポリペプチド、又はＰＤ−１の下流で機能するポリペプチドの活性を、例えばＰＤ−１の細胞質ドメインとの相互作用によって、調節する試験抗体の能力を決定することによって達成されうる。例えば、二次メッセンジャーのレベルを決定することができ、適切な標的に対する相互作用物質ポリペプチドの活性を決定することができ、又は適切な標的への相互作用物質の結合を過去に記載されているようにして決定することができる。

本発明は上述のスクリーニングアッセイによって同定される新規抗体に更に関する。従って、適切な動物モデルにおいてここに記載されたようにして同定された抗体を更に使用することも本発明の範囲に入る。例えば、ここに記載されたようにして同定された抗体を動物モデルで使用して、効能、毒性、又はそのような抗体での治療の副作用を決定することができる。別法では、ここに記載されたようにして同定された抗体を動物モデルで使用して、そのような抗体の作用機序を決定することができる。更に、本発明はここに記載されたような上述のスクリーニングアッセイによって同定される新規抗体の使用に関する。

２．予防方法
一態様では、本発明は、望まれない又は所望の度合いが少ない免疫応答に関連した疾患又は症状を被験者において予防する方法に関する。本発明の抗体又は方法での治療から恩恵を受ける疾患に対してリスクがある被験者は、例えば当該分野で知られている診断又は予後アッセイの何れか又は組合せによって同定することができる。予防的抗体の投与は、望まれない又は所望の度合いが少ない免疫応答に関連した徴候の現れの前に起こりうる。治療に使用される適切な抗体は、臨床的適応に基づいて決定することができ、例えばここに記載されたスクリーニングアッセイを使用して、同定することができる。

３．治療方法
本発明の他の側面は、例えば、ＰＤ−１及びＰＤ−１リガンド及び／又はＰＤ−１リガンド及びＢ７ポリペプチドの間の相互作用を調節することにより、免疫応答を調節する治療方法に関する。例えば、ＰＤ−１及びＰＤ−１リガンド間、又はＰＤ−１リガンド及びＢ７ポリペプチド間の相互作用の調節は免疫応答の調節を生じる。よって、一実施態様では、ＰＤ−１及びＰＤ−１リガンド間の相互作用をブロックする抗体は、阻害性シグナル伝達を防止しうる。ＰＤ−１リガンドはまたＴ細胞中の同時刺激シグナルを亢進しうる。よって、他の実施態様では、ＰＤ−１リガンドが同時刺激シグナルをもたらすことを防止する抗体はＴ細胞同時刺激を阻害しうる。

これらの調節性抗体は、インビトロで（例えば細胞を抗体に接触させることにより）又は別法ではインビボで（例えば薬剤を被験者に投与することにより）投与されうる。しかして、本発明は、例えば、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１又はＢ７ポリペプチドとの間の相互作用の調節により、免疫応答の調節から恩恵を受ける疾病又は疾患に罹患した個体を治療する方法に関する。

４．免疫応答のダウンレギュレーション
ＰＤ−１リガンドの阻害機能をアップレギュレートするか、又は同時刺激をダウンレギュレートして免疫応答をダウンレギュレートするための本発明の多くの実施態様が存在する。ダウンレギュレーションは、既に進行している免疫応答を阻害するか又はブロックする形態であり得、あるいは免疫応答の誘導を妨害することを含みうる。活性化された免疫細胞の機能は、免疫細胞応答をダウンレギュレートするか、あるいは免疫細胞において特異的アネルギーを誘導するか、又はその双方によって阻害することができる。

例えば、免疫応答は、（例えばＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１の間の相互作用に影響を及ぼさず又は増加させないで）ＰＤ−１リガンドにより同時刺激をブロックするか、又は（例えばＰＤ−１リガンドにより同時刺激に影響を及ぼさないか又は阻害しないで）ＰＤ−１とのＰＤ−１リガンドの結合を促進する抗ＰＤ−１リガンド抗体を使用してダウンレギュレートされうる。

本発明の一実施態様では、ＰＤ−１リガンド同時刺激をブロックする抗体と共に抗原を同時投与することによって特異的抗原に対して寛容が誘発される。例えば、特異的タンパク質に寛容が誘発されうる。一実施態様では、アレルゲン、又は免疫応答が望ましくない外来性タンパク質に対する免疫応答を阻害することができる。例えば、第ＶＩＩＩ因子が投与される患者は、この血液凝固因子に対する抗体を産生する。ＰＤ−１リガンド媒介性同時刺激シグナルをブロックする抗体又はＰＤ−１媒介性阻害シグナルを刺激する抗体の組換え第ＶＩＩＩ因子との併用投与により（又は例えば架橋により、物理的に第ＶＩＩＩ因子に結合させることにより）、ダウンレギュレーションが生じうる。

一実施態様では、免疫応答を下方制御する２つの別個の薬剤を、被験者における免疫細胞媒介性免疫応答をより効果的にダウンレギュレートするために単一組成物として組み合わせるか又は別個に（同時又は逐次）投与されうる。更に、治療的有効量の一又は複数の被験者抗体を、他の下方制御試薬と併せて用いて、免疫応答に影響を及ぼすことができる。他の免疫調節試薬の例は、限定されるものではないが、同時刺激シグナルをブロックする抗体（例えば、ＣＤ２８又はＩＣＯＳに対するもの）、ＣＴＬＡ４のアゴニストとして作用する抗体、及び／又は他の免疫細胞マーカーに対する抗体（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ４リガンド又はサイトカインに対するもの）、融合タンパク質（例えば、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ）、及び免疫抑制剤（例えば、ラパマイシン、シクロスポリンＡ又はＦＫ５０６）を含む。

ＰＤ−１リガンド同時刺激のダウンレギュレーション又は妨害、あるいはＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の相互作用の促進は、例えば、組織、皮膚及び臓器移植の状況、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、又は炎症性疾患、例えば全身性エリテマトーデス、及び多発性硬化症における免疫応答をダウンレギュレートするのに有用である。例えば、免疫細胞機能の遮断は、組織移植における組織破壊の減少を生じる。典型的には、組織移植片において、移植片の拒絶は、免疫細胞によるその外来性との認識によって開始され、移植片を破壊する免疫反応が続く。移植前又は移植時での、ＰＤ−１リガンド同時刺激を阻害する抗体単独の又は別の下方制御剤との併用での投与は、阻害性シグナルの生成を促進しうる。更に、ＰＤ−１リガンド同時刺激シグナルの阻害、又はＰＤ−１リガンドもしくはＰＤ−１阻害性シグナルの促進は、免疫細胞をアネルギー化して、被験者に寛容を誘導するのに十分でありうる。ＰＤ−１リガンド媒介性同時刺激シグナルをブロックすることによる長期間の寛容の誘導により、これらの遮断薬の繰返し投与の必要性を回避しうる。

被験者において十分な免疫抑制又は寛容を達成するために、他のポリペプチドの同時刺激機能をブロックすることが望ましい場合もある。例えば、移植前又は移植時に、Ｂ７−１、Ｂ７−２、又はＢ７−１及びＢ７−２の機能を、これらの抗原の各々の活性を有するペプチドの組み合わせの可溶型、これらの抗原に対する遮断抗体又は遮断小分子を（別個に又は単一の組成物において一緒にして）投与することによってブロックすることが望ましい場合がある。別法では、ＰＤ−１リガンド又はＰＤ−１の阻害活性を促進し、Ｂ７−１及び／又はＢ７−２の同時刺激活性を阻害するのが望ましい場合がある。本発明の下方制御法との関連で使用されうる他の下方制御剤は、例えば、ＣＴＬＡ４を介して阻害シグナルを伝達する薬剤、ＣＴＬＡ４を介して阻害シグナルを活性化する抗体、他の免疫細胞マーカー又は他のレセプター・リガンド対の可溶型に対する遮断抗体（たとえば、ＣＤ４０とＣＤ４０リガンドの相互作用を妨害する薬剤（例えば、抗ＣＤ４０リガンド抗体））、サイトカインに対する抗体、又は免疫抑制剤を含む。

免疫応答のダウンレギュレーションは、自己免疫疾患の治療にも有用である。多くの自己免疫疾患は、自己組織に対して反応性であり、疾患の病理に関与するサイトカイン及び自己抗体の産生を促進する免疫細胞の不適切な活性化の結果である。自己反応性免疫細胞の活性化を防止することにより、疾患の症状を低減又は排除しうる。ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドの間の相互作用を調節しないで又はダウンレギュレートしながら、ＰＤ−１リガンドとＢ７ポリペプチドとの間の相互作用を破壊することにより、あるいはＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の間の相互作用を促進することにより、免疫細胞の同時刺激をブロックする試薬の投与は、免疫細胞活性化を阻害し、疾患過程に関与しうる自己抗体又はサイトカインの産生を妨害するのに有用である。加えて、ＰＤ−１リガンド又はＰＤ−１の阻害機能を促進する薬剤は、自己反応性免疫細胞の抗原特異的寛容を誘導することができ、これが疾患からの長期の救済を導くことができる。自己免疫疾患を予防し又は緩和する試薬の効力は、ヒト自己免疫疾患の十分に特徴付けられた多くの動物モデルを使用して決定することができる。例として、マウス実験的自己免疫脳炎、ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウス又はＮＺＢ雑種マウスにおける全身性エリテマトーデス、マウス自己免疫コラーゲン関節炎、ＮＯＤマウス及びＢＢラットにおける糖尿病、及びマウス実験的重症筋無力症が挙げられる（例えば、Paul編, Fundamental Immunology, Raven Press, New York, Third Edition 1993, 30章を参照）。

免疫細胞活性化の阻害は、例えば、ＩｇＥ産生の阻害によるアレルギー及びアレルギー反応の治療において治療的に有用である。ＰＤ−１リガンド又はＰＤ−１阻害機能を促進する抗体は、被験者における免疫細胞媒介性アレルギー反応を阻害するためにアレルギーの被験者に投与することができる。免疫細胞のＰＤ−１リガンド同時刺激の阻害あるいはＰＤ−リガンド又はＰＤ−１阻害経路の刺激は、適当なＭＨＣポリペプチドとの関連でアレルゲンへの暴露を伴いうる。アレルギー反応は、アレルゲンの侵入経路及びマスト細胞又は好塩基球上のＩｇＥの沈着のパターンに応じて、実際は全身性又は局所性である。よって、免疫細胞媒介性アレルギー反応は、ＰＤ−１リガンドの同時刺激レセプターとの相互作用を阻害する薬剤、あるいはＰＤ−１リガンド又はＰＤ−１の阻害機能を促進する抗体の阻害型の投与により、局所的に全身性に阻害される。

ＰＤ−１リガンド同時刺激の遮断又はＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の相互作用の促進による免疫細胞活性化の阻害がまた免疫細胞のウイルス感染において治療的に重要である場合もある。例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）において、ウイルス複製は免疫細胞活性化により刺激される。これらの相互作用の調節は、ウイルス複製の阻害が生じ、それによってＡＩＤＳの経過が改善される。これらの相互作用の調節は、妊娠の持続を促進するのにも有用である。ＰＤ−１リガンドは、通常、母親と胎児の間の接合部分を形成し、胎児の母性拒絶の防止において役割を果たすと考えられる細胞の層である胎盤栄養膜において高度に発現される。胚又は胎児の免疫拒絶のために自然流産の危険のある女性（例えば、以前に自然流産したことがある女性又は妊娠が困難である者）は、これらの相互作用を調節する薬剤で治療することができる。

ＰＤ−１リガンド同時刺激の調節によるか、あるいはＰＤ−１リガンド／ＰＤ−１結合の調節による免疫応答のダウンレギュレーションは、自家組織の自己免疫攻撃を治療するのにおいても有用である場合がある。例えば、ＰＤ−１リガンドは、通常、心臓において高度に発現され、心臓を自己免疫攻撃から保護しうる。これは、Ｂａｌｂ／ｃＰＤ−１ノックアウトマウスが、血栓症の心臓に対して重い自己免疫攻撃を示すという事実により証拠付けられる。よって、自己免疫攻撃により引き起こされるか又は悪化する症状（例えば、この例では、心臓病、心筋梗塞又はアテローム性動脈硬化症）は、これらの相互作用の調節によって緩和又は改善される。したがって、自己免疫疾患などの自己免疫攻撃によって悪化する症状（並びに心臓病、心筋梗塞、及びアテローム性動脈硬化症のような症状）を調節することは本発明の範囲内である。

５．免疫応答のアップレギュレーション
治療的にまた有用であるのは、免疫応答をアップレギュレートする手段としての、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１又はＢ７−１との相互作用の遮断である。免疫応答のアップレギュレーションは、存在する免疫応答の亢進又は最初の免疫応答の誘発の形態をとりうる。例えば、主題の組成物及び方法を使用する免疫応答の増強は、微生物（例えば、細菌、ウイルス、又は寄生虫）での感染の場合に有用である。一実施態様では、ＰＤ−１とのＰＤ−１リガンドの相互作用をブロックする抗体が免疫応答を亢進させるために使用される。そのような抗体（例えば、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合をブロックする非活性化抗体）は、抗体のアップレギュレーション及び細胞媒介性応答が有益である状況において治療的に有用である。例示的な疾患は、疱疹又は帯状疱疹などのウイルス性皮膚疾患を含み、その場合、そのような薬剤が皮膚に局所的に送達されうる。また、インフルエンザ、感冒及び脳炎のような全身性ウイルス性疾患は、このような薬剤の全身投与によって軽減されるかもしれない。

別法として、免疫応答は、エキソビボのアプローチ法、例えば、免疫細胞を患者から取り出し、免疫細胞をインビトロで、ＰＤ−１とのＰＤ−１リガンドの相互作用をブロックする抗体と接触させ、インビトロで刺激された免疫細胞を患者へ再導入することにより、感染した患者において高めることができる。

ある場合には、免疫応答を更に増強するために、免疫応答をアップレギュレートする他の厄災、例えば同時刺激レセプターを介してシグナルを伝達する他のＢ７ファミリーメンバーの形態を更に投与することが望ましい場合がある。

ＰＤ−１又はＢ７−１とのＰＤ−１リガンドの相互作用をブロックする抗体を、様々なポリペプチド（例えば病原体から派生するポリペプチド）に対するワクチンで予防的に使用することができる。病原体（たとえば、ウイルス）に対する免疫性は、適当なアジュバント中、ＰＤ１又はＢ７−１とのＰＤ−１リガンドの相互作用をブロックする抗体と共にウイルスタンパク質でワクチン予防接種することにより誘導することができる。

他の実施態様では、ここに記載された免疫応答機能のアップレギュレーション又は亢進は、腫瘍免疫の誘導に有用である。

他の実施態様では、先在している寛容に打ち勝つことができるように、免疫応答を、ここに記載の方法によって刺激することができる。例えば、被験者が有意な免疫応答を開始することができない抗原、例えば、腫瘍特異的抗原などの自己抗原に対する免疫応答は、ＰＤ−１リガンドとＰＤ−１の相互作用をブロックする抗体を投与することにより、誘導することができる。一実施態様では、腫瘍特異的抗原のような自己抗原を併用投与することができる。他の実施態様では、免疫応答を抗原（例えば、自己抗原）に対して刺激して、神経性疾患を治療することができる。別の実施態様では、主題薬剤をアジュバントとして使用して、活性な免疫化のプロセスにおいて外来性抗原への応答をブーストすることができる。

一実施態様では、免疫細胞を被験者から得て、エキソビボで、ここに記載の抗体の存在下で培養し、免疫細胞集団を増殖させるか、及び／又は免疫細胞活性化を亢進する。更なる実施態様では、ついで、免疫細胞を被験者へ投与する。免疫細胞は、例えば、免疫細胞へ一次活性化シグナル及び同時刺激シグナルを、当該分野で知られているようにして、提供することにより、インビトロで刺激されうる。様々な薬剤をまた使用して免疫細胞の増殖を同時刺激することもできる。一実施態様では、免疫細胞はＰＣＴ出願国際公開第９４／２９４３６号に記載の方法に従い、エキソビボで培養される。同時刺激ポリペプチドは可溶性であり、細胞膜へ結合され、又はビーズのような固体表面へ結合されうる。

本発明の他の実施態様を次の実施例に記載する。本発明は、更なる限定として解釈すべきではない次の実施例によって更に例証される。この出願を通して引用されている配列表、図面及び全ての文献、特許及び公開特許出願の内容を出典明示によりここに明示的に援用される。

以下の実施例は、ヒトＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２を標的とする治療目的に適したモノクローナル抗体の産生を記載する。複合ヒト抗ヒトＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２抗体を、それぞれマウス抗ヒトＥＨ１２．２Ｈ７、２９Ｅ．２Ａ３及び２４Ｆ．１０Ｃ１２抗体から生産した。ヒトＶ領域配列のセグメントは、関係していないヒト抗体（生殖系列及び非生殖系列）配列データベースを供給源とした。各選択配列セグメント（並びにセグメント間の接合部）を結合予測アルゴリズムを使用してＭＨＣクラスＩＩに結合する可能性について試験した。全ての最終の複合ヒト抗体配列変異体はＴ細胞エピトープを避けるように設計した。複合ヒト抗体Ｖ領域遺伝子を、ヒト配列セグメントの組合せをコードする合成オリゴヌクレオチドを使用して作製した。ついで、これらを、ヒト定常領域を含むベクター中にクローニングし、抗体を製造し、競合ＥＬＩＳＡによって標的抗原への結合を試験した。

実施例１：複合ヒト抗体可変領域配列の設計
マウスＥＨ１２．２Ｈ７、２９Ｅ．２Ａ３及び２４Ｆ．１０Ｃ１２Ｖ領域の構造モデルを、ＳｗｉｓｓＰｄｂを使用して製造し、抗体の結合特性に対して必須かもしれないマウスＶ領域中の重要な「制限」アミノ酸を同定するために分析した。カバット及びＣｈｏｔｈｉａ双方の定義で定義されるＣＤＲ残基を含む、ＣＤＲｓ内に含まれる残基のみが重要であると考えた。

上記の分析から、ＣＤＲｓの外側の配列には大きな自由度があるがＣＤＲ配列内の可能な代替残基には狭いメニューしかない形で、ＥＨ１２．２Ｈ７、２９Ｅ．２Ａ３及び２４Ｆ．１０Ｃ１２の複合ヒト型をつくり出すことができると考えられた。予備解析は、幾つかのヒト抗体由来の対応する配列セグメントを組み合わせてマウス配列中のものと同様の又は同一のＣＤＲｓをつくり出すことができることを示していた。ＣＤＲｓの外側又は隣接領域では、広い選択範囲のヒト配列セグメントが、新規な複合ヒト抗体可変領域の可能な成分として同定された。

上記の解析に基づいて、ＥＨ１２．２Ｈ７、２９Ｅ．２Ａ３及び２４Ｆ．１０Ｃ１２複合ヒト抗体変異体を作製するために使用できる配列セグメントの大きな予備セットを選択し、ＭＨＣクラスＩＩ結合予測アルゴリズムによって分析し、既知の抗体配列関連Ｔ細胞エピトープの私有データベースを通してＢＬＡＳＴ検索した。潜在的なＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドが同定され、又は既知のＴ細胞エピトープのデータベースに対して有意なヒットを記録した配列セグメントを捨てた。これによりセグメントのセットが減少し、これらの組合せを上述のようにして再び分析して、セグメント間の接合部が潜在的なＴ細胞エピトープを含んでいないことを担保した。ついで、選択されたセグメントを組み合わせて、合成のための重鎖及び軽鎖可変領域配列を作製した。３種全ての抗体に対して、次のように詳細に述べる配列を用いて、５つの重鎖と４つの軽鎖を構築した；
抗原複合ＶＨ配列複合ＶＫ配列
ＰＤ−１図２（Ａ−Ｅ）図３（Ａ−Ｄ）
ＰＤ−Ｌ１図４（Ａ−Ｅ）図５（Ａ−Ｄ）
ＰＤ−Ｌ２図６（Ａ−Ｅ）図７（Ａ−Ｄ）

これらの複合ヒト抗体配列を製造するために使用した配列セグメントは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２に対する抗体に対してそれぞれ表１、２、及び３に詳細に記載する。

実施例２：複合ヒト抗体の作製と試験
最初の変異体１複合ヒト抗体ＶＨ及びＶＫ領域遺伝子を、完全長合成Ｖ領域を得るためにアニールし、ライゲートさせ、ＰＣＲ増幅させた一連のオーバーラップするオリゴヌクレオチドを使用して、ＥＨ１２．２Ｈ７、２９Ｅ．２Ａ３及び２４Ｆ．１０Ｃ１２に対して合成した（図２Ａ、図３Ａ、図４Ａ、図５Ａ、図６Ａ及び図７Ａ）。各複合ヒト抗体に対して、最初の変異体１を鋳型として使用し、長いオーバーラップするオリゴヌクレオチド及びＰＣＲを使用して、次の配列変異体を構築した。ついで、その構築した変異体を発現ベクター中に直接クローニングし（図１）、その配列を確認した。

キメラ及び複合重鎖及び軽鎖の全ての組合せ（つまり、各抗体に対して全部で２０対）を、電気穿孔法によってＮＳ０細胞中に安定して形質移入し、２００ｎＭのメトトレキセートを含む培地（高グルコースＤＭＥＭで、Ｌ−グルタミン及びピルビン酸Ｎａ、５％の超低ＩｇＧＦＣＳ、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ−全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）において選択した。各コンストラクトに対して幾つかの薬剤耐性コロニーについて発現レベルを試験し、最も発現する株を選択し、液体窒素で凍結させた。

各組合せに対して最良の発現株からの上清を、ＩｇＧ１／κ標準と比較したＦｃ捕捉κ軽鎖検出ＥＬＩＳＡを使用して定量した。ついで、定量した上清をその標的抗原に対する結合について競合ＥＬＩＳＡで試験した。９６ウェルのＭａｘｉｓｏｒｂ^ＴＭプレート（Ｎｕｎｃ）に、ｐＨ９．６の炭酸塩バッファー中、１μｇ／ｍｌのヒトＦｃ−ＰＤ−１、Ｆｃ−ＰＤ−Ｌ１又はＦｃ−ＰＤ−Ｌ２（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）の５０μｌ／ウェルを４℃で一晩被覆した。重複滴定量のマウス参照抗体及び複合ヒト抗体試料を生成させ（０．００７８μｇ／ｍｌから８μｇ／ｍｌの範囲）、一定濃度（４０ｎｇ／ｍｌ）のＰＢＳｐＨ７．４／２％ＢＳＡ中のビオチン化マウス参照抗体と混合させた。滴定量１００μｌ／ウェルを、洗浄した（ＰＢＳｐＨ７．４／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて４×）アッセイプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを上記のようにして洗浄し、１００μｌ／ウェルのＰＢＳｐＨ７．４／２％ＢＳＡ中の１／１０００希釈率のストレプトアビジンＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）を加え、室温で更に１時間インキュベートした。更なる洗浄後、結合したビオチン化参照抗体を１００μｌ／ウェルのＯＰＤ基質で検出した。吸光度を４９０ｎｍで測定し、試験抗体の結合曲線をマウス参照標準と比較した。吸光度を試料濃度に対してプロットし、各データセットにわたって直線をフィットさせた。直線の式を使用して、５０％（ＩＣ_５０）までＰＤ−１へのビオチン−ＥＨ１２．２Ｈ７結合、ＰＤ−Ｌ１へのビオチン−２９Ｅ．２Ａ３結合及びヒトＰＤ−Ｌ２へのビオチン−２４Ｆ．１０Ｃ１２結合を阻害するのに必要とされる濃度を計算した。

最良のＩＣ_５０の抗体を選択し、ＥＨ１２．２Ｈ７、２９Ｅ．２Ａ３及び２４Ｆ．１０Ｃ１２抗体のこれら全ての変異体に対する細胞株を１００ｍｌまで嵩上げし、飽和まで増殖させた。抗体をプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーを介して各培養物から精製した。簡潔に述べると、０．１体積の１０×ＰＢＳｐＨ７．４を用いて上清のｐＨを調整し、１ｍｌのＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅプロテインＡカラム（GE Healthcare）を通過させた。カラムを１０体積のＰＢＳｐＨ７．４で洗浄した後、５０ｍＭのクエン酸塩バッファーｐＨ３．０で溶離させた。１ｍｌの画分を集め、０．１ｍｌの１ｍのＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ９．０で直ぐに中和させた。（２８０ｎｍの吸光度で判定して）タンパク質を含む画分をプール化し、ＰＢＳｐＨ７．４にバッファー交換し、精製した抗体を＋４℃で保存した。図８Ａ−Ｃは、クーマシーブルーで染色した１μｇの各抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。抗体の濃度は、ＥＨ１２．２Ｈ７に対して２８０ｎｍでのＥ_０．１％＝１．６１、２９Ｅ．２Ａ３に対して２８０ｎｍでのＥ_０．１％＝１．４６、２４Ｆ．１０Ｃ１２に対して２８０ｎｍのＥ_０．１％＝１．５７となるような計算されたモル吸光係数に基づいてＵＶ吸収によって計算した。

上述のように競合ＥＬＩＳＡによってヒトＦｃ−ＰＤ−１、Ｆｃ−ＰＤ−Ｌ１又はＦｃ−ＰＤ−Ｌ２に対する結合について精製した抗体を試験した。試験抗体の滴定を０．０６２５μｇ／ｍｌから８．０μｇ／ｍｌまで２組実施した。４９０ｎｍでの吸光度を測定し、これを試験抗体濃度に対してプロットした（図９Ａ−Ｃ、１０Ａ−Ｃ）。

表４は、抗ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２抗体のための複合ＶＨ及びＶＫ変異体配列の組合せの結果をまとめている。ＥＨ１２．２Ｈ７に対しては、全てのヒト化抗体が、マウス参照と比較して改善されているＩＣ５０を有しており、特に結合が２倍増加しているＶＨ４／ＶＫ３である。２９Ｅ．２Ａ３の場合、変異体ＶＨ２／ＶＫ１及びＶＨ２／ＶＫ４がマウス参照と等価な結合性を有する一方、変異体ＶＨ２／ＶＫ２及びＶＨ４／ＶＫ２はそれぞれ１．７５及び１．３６倍と減少した結合性を有している。２４Ｆ．１０Ｃ１２では、全ての選択された変異体はマウス参照と比較して同様の、しかし僅かに減少した結合性を有している（１．１３倍）。

これらの実験の結果として、ヒトＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２に対して特異的なヒト抗体が、非関連のヒト抗体可変領域から完全に誘導されたアミノ酸配列セグメントから構築された。複合ヒト抗体変異体における全てのＣＤＲ及びフレームワーク領域が一を越える非関連のヒト配列セグメント（ヒト配列データベースを供給源とする）を含んでおり、全ての複合ヒト抗体は特にＴ細胞エピトープを避けるように設計された。４種のリード候補が最初はヒトＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２への結合について選択され、次の解析の際に、マウス抗体の二倍以内の結合性を有していることが証明された。

実施例５：ＰＤ−１：ＰＤ−リガンド相互作用の阻害によるＴ細胞活性化の刺激亢進
ＰＤ−１シグナル伝達経路は中程度のＴＣＲ／ＣＤ２８同時刺激シグナルを阻害し、サイトカイン生産がＴ細胞増殖を減少させることなく低減された。ＴＣＲ／ＣＤ２８同時刺激シグナルが弱くされているので、ＰＤ−１経路が優勢であり、サイトカイン生産における大きな減少に増殖の減少が伴う。従って、本発明の複合ヒト抗体を使用するＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２との相互作用の阻害によるＰＤ−１経路の阻害がＴ細胞活性化を亢進させることを確認するために、混合リンパ球反応（ＭＬＲｓ）を実施する。

ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦ中で末梢血単球を培養することにより、未成熟骨髄性樹状細胞が単離される。ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、及びＰＧＥ_２の炎症性カクテルへの未成熟樹状細胞の暴露がＡＰＣｓとして機能する成熟樹状細胞の発達を誘発する。しかしながら、成熟段階中に与えられる炎症性サイトカインへのＩＬ−１０の添加は、また１／６から１／３だけ機能するＡＰＣｓを生じる。

Ｔ細胞活性化アッセイ（ＭＬＲｓ）を、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２に対する複合ヒト抗体、又はコントロール抗体の存在下で、ＡＰＣｓとしてＩＬ−１０処理樹状細胞を使用して、実施する。ＩＬ−１０処理樹状細胞プラス同種Ｔ細胞の培養物への抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２ｍＡｂの添加は、コントロールＩｇＧ処理培養物と比較して、Ｔ細胞増殖及びサイトカイン発現の増加を生じせしめることが予測される。抗ＰＤ−Ｌ１抗体，抗ＰＤ−Ｌ２抗体との抗ＰＤ−１抗体の組合せは、何れかの抗体単独で見られるものよりも大きい刺激の増加を生じうる。

実施例６：慢性的に感染させられたマウスにおけるＰＤ−１経路の阻害
リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の様々な株に感染したマウスを使用して、ＣＤ８Ｔ細胞機能に対する慢性的ウイルス感染の効果を研究する。ＬＣＭＶＡｒｍｓｔｒｏｎｇ株は、８日以内に除去され、後に高度に機能的な休止メモリーＣＤ８Ｔ細胞の長命の集団を残す急性感染を引き起こす。ＬＣＭＶＣｌ−１３株は、これに対して、３ヶ月まで続くウイルス血症によって特徴付けられる持続感染を宿主に樹立する。

ＰＤ−１シグナル伝達の遮断がＴ細胞機能を回復させ、慢性ＬＣＭＶ感染におけるウイルス制御を亢進させることを確認するために、本発明の複合ヒト抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び／又は抗ＰＤ−Ｌ２抗体を使用してＰＤ−１シグナル伝達が慢性ＬＣＭＶ感染中に破壊される。抗体は、ＬＣＭＶＣｌ−１３に感染させられたマウスに感染後２３日目から３７日目に三日毎に投与される。３７日目に未処理コントロールに対して処置マウスにおいて数倍多いＬＣＭＶ特異的ＣＤ８Ｔ細胞が存在することが予想される。増殖の誘導がＣＤ８Ｔ細胞に特異的であり、脾臓中のＣＤ４Ｔ細胞の数がおそらく処理マウスと未処理マウスの双方でほぼ同じであることがまた予想される。

ＣＤ８Ｔ細胞増殖の増加に加えて、ＰＤ−１シグナル伝達の阻害がウイルス特異的ＣＤ８Ｔ細胞中における抗ウイルスサイトカインの生産の増加を生じることが予想される。ＣＤ８Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの生産は、未処理のマウスと比較して処理マウスにおいて数倍高い可能性がある。ウイルス除去がまた促進されなければならず、減少したウイルス力価が処理マウスにおいて感染後３７日までに肺及び腎臓に観察される一方、未処理のマウスはこれらの組織全てにおいて有意なレベルのウイルスを示す可能性が高い。

ＣＤ４Ｔ細胞はＣＤ８Ｔ細胞応答の発生及び維持に重要な役割を担っている。この点に関して、ＣＤ４Ｔ細胞の不存在下で刺激されたＣＤ８Ｔ細胞は正常な免疫応答を開始することができず、よってしばしば「ヘルプレスＴ細胞」と称される。更に、慢性ＬＣＭＶ感染はＣＤ４Ｔ細胞の不存在下でより重篤である。従って、ＬＣＭＶ−Ｃｌ−１３感染中に産生されるヘルプレスＴ細胞は、ＣＤ４Ｔ細胞の存在下で産生されるＴ細胞よりも更により重度の機能的障害を示す。

ＣＤ４Ｔ細胞がＬＣＭＶ−Ｃｌ−１３感染の時に枯渇され、マウスは感染後４６日目から６０日目までに本発明の複合ヒト抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体で治療される。治療後、処置されたマウスは未処置のコントロールマウスよりもその脾臓に数倍多いＬＣＭＶ特異的ＣＤ８Ｔ細胞を持っている可能性が高い。処置されたマウスにおけるこのウイルス特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増加は、ＢｒｄＵ取り込みによって検出されるように、増殖の増加を生じるであろう。ＢｒｄＵ分析は、処置中に飲み水に１ｍｇ／ｍｌのＢｒｄＵを導入することによって実施され、染色は製造者のプロトコル（BD Biosciences, San Diego, Calif.）に従って実施される。

ＰＤ−１シグナルの阻害がヘルプレス消耗ウイルス特異的ＣＤ８Ｔ細胞の溶解活性を増大させることを確認するために、ウイルス特異的ＣＤ８Ｔ細胞のエキソビボ溶解活性を、^５１Ｃｒ放出アッセイ（Wherry等, 2003. J. Virol. 77:4911-27）を使用して治療後に検出する。ウイルス力価は未処置マウスに対して処置の２週間後に脾臓、肝臓、肺、及び血清中で数倍減少することが予想される。

実施例７：ＰＤ−１シグナル伝達の阻害剤を含むワクチンの投与
持続感染中のＴ細胞応答をブーストさせるための一つのアプローチ法は治療用ワクチン接種である。このアプローチ法の原理は、内在性抗原が慢性ウイルス感染中において最適な又は免疫原性の形で提示され得ないこと、またワクチンの形態で抗原を提供することによりウイルス特異的Ｔ及びＢ細胞に対してより効果的な刺激をもたらしうることである。慢性的ＬＣＭＶモデルを使用して、マウスに治療用ワクチン（ＶＶＧＰ３３）としてＬＣＭＶＧＰ３３エピトープを発現する組換えワクシニアウイルスを投与し、これが幾らかの慢性的に感染したマウスにおいてＣＤ８Ｔ細胞応答の中程度の亢進を生じる。この治療用ワクチン接種には、本発明の複合ヒト抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び／又は抗ＰＤ−Ｌ２抗体が組み合わされる。ＬＣＭＶ特異的Ｔ細胞応答が、何れかの治療だけの場合と比較してより大きなレベルまでブーストされ、併用治療の効果が相加的以上のものとなることが予想される。

実施例８：持続ＨＣＶ感染の免疫療法のモデルとしてのチンパンジー
チンパンジーは、ヒトにおけるＨＣＶ持続のモデルを提供する。長寿命のウイルス持続を生じるＴ細胞免疫の欠損は、ＨＣＶ特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞及び損なわれたか又は改変されたＣＤ８エフェクターＴ細胞活性の欠損の双方を含む。持続的に感染させられたチンパンジーを、本発明の複合ヒト抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び／又は抗ＰＤ−Ｌ２抗体で処置する。組換え構造的及び組換え非構造的ＨＣＶタンパク質を使用してワクチン接種と組み合わせた阻害性経路の遮断の効力、及びこのような方策がウイルス特異的メモリーＴ細胞の頻度及び寿命を向上させうるか否かが決定される。Ｔ細胞免疫の欠損は、持続的に感染したヒト及びチンパンジーにおいて専らＨＣＶ特異的である。ついで、抗ウイルス活性は、これらの分子によるシグナル伝達を遮断するヒト化モノクローナル抗体をチンパンジーに送達することによって回復されうる。

持続的に感染させられたチンパンジーを、本発明の複合ヒト抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び／又は抗ＰＤ−Ｌ２抗体によって処置する。抗体による処置後に、体液性及び細胞性免疫応答並びにＨＣＶＲＮＡ負荷量を決定する。試料を、１週目、２週目、３週目、５週目、及び８週目に、ついで１ヶ月間隔で収集する。試料は、１）トランスアミナーゼ、自己抗体、ＨＣＶに対する中和抗体、及びサイトカイン応答の分析のための血清、２）ウイルス量及びゲノム進化のための血漿、３）免疫、同時刺激／阻害性レセプター発現及び機能のインビトロ測定のためのＰＢＭＣ、４）肝内リンパ球及びＲＮＡの単離のための新鮮な（未固定）肝臓、及び５）組織学及び免疫組織化学的分析のための固定された（ホルマリン／パラフィン包埋）肝臓。局所のリンパ節もまた免疫組織化学技術及び分子技術によって同時阻害性分子及びスプライスバリアントの発現を評価するために２つ又は３つの時点で収集される。

ＨＣＶ抗原によるワクチン接種が抗体の治療効果を増強するか否かを決定するために、チンパンジーを、次のようにして処置する：１）０、４、及び２４週間での組換えエンベロープ糖タンパク質Ｅ１及びＥ２（ＭＦ５９アジュバント中）及び他のタンパク質（ＩＳＣＯＭＳと共に処方されたコア＋ＮＳ３、４、及び５）による筋肉内免疫化；２）ワクチンを用いるが、本発明の抗体の複合ヒト抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び／又は抗ＰＤ−Ｌ２抗体と同時投与される筋肉内免疫化。ＨＣＶ特異的Ｔ及びＢ細胞応答を、免疫化後に１年間にわたって１ヶ月間隔でモニタリングする。

この分析においてＨＣＶ四量体陽性及び全Ｔ細胞に対して調べられるマーカーは、分化マーカー（例えばＣＤ４５ＲＡ／ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、及びＣＤ２７）、活性化マーカー（例えばＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ３８、及びＨＬＡ−ＤＲ）、生存／増殖マーカー（例えばｂｃｌ−２及びＫｉ６７）、細胞傷害潜在性マーカー（例えば、グランザイム及びパーフォリン）、及びサイトカインレセプターマーカー（ＣＤ１２２及びＣＤ１２７）を含む。興味深い相互関係が、ケモカインＩＰ−１０の治療前のレベルとＰＥＧＩＦＮ−γ／リバビリンに対する応答との間に存在する。ＩＰ−１０レベルを、ネガティブな調節経路又はＨＣＶ特異的Ｔ細胞応答とＩＰ−１０レベルとの間の潜在的な相関関係を調べるために測定する。ＰＢＭＣでの阻害性レセプター及びリガンドの発現を、フローサイトメトリーによって実施する。

実施例９：ＰＤ−１遮断によるＳＩＶ特異的免疫のインビボでの増強
慢性サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）感染中におけるＰＤ−１の遮断の免疫回復の可能性をマカクにおいて試験した。ＳＩＶに感染した１４匹のインディアンアカゲザル（Macaca mulatta）を研究した。８匹のマカクを早期の慢性段階に使用し、ＳＩＶ２５１の２００の５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ_５０）で静脈内感染させた。６匹のマカクを後期慢性段階に使用し、３匹をＳＩＶ２５１で直腸内的に感染させ、３匹をＳＩＶ２３９で静脈内的に感染させた。ＲＤｂ１１を除いて、全てのマカクがＭａｍｕＢ０８及びＭａｍｕＢ１７アレルに対して陰性であった。ＲＤｂ１１はＭａｍｕＢ１７アレルに対して陽性であった。

インビボ抗体処置：マカクにヒト化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２−１５４０）（Dorfman等, Am. J. Surg. Pathol. 30:802-810, 2006）又はコントロール抗体（ＳＹＮＡＧＩＳ）の何れかを部分的に注入した。抗ＰＤ−１抗体は、ヒトＩｇＧ１に結合された（ＦｃＲ及び補体結合を低減させるために変異された）マウス可変重鎖ドメインとヒトκに結合したマウス可変軽鎖ドメインを有している。クローンＥＨ１２はマカクＰＤ−１に結合し、ＰＤ−１とそのリガンドとの間の相互作用をインビトロで遮断する。ＳＹＮＡＧＩＳは、呼吸器多核体ウイルスのＦタンパク質に特異的なヒト化マウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ１κ）である。抗体は０、３、７及び１０日目に３ｍｇｋｇ^−１体重で静脈内投与した。

免疫応答：血液からの末梢血単核細胞と直腸ピンチバイオプシーからのリンパ球を過去に記載されているようにして単離した（Velu等, J. Virol. 81:5819-5828, 2007）。四量体染色、細胞内サイトカイン生産、及び抗ＳＩＶＥｎｖ結合抗体の測定は過去に記載されているようにして実施した（Amara等, Science 292:69-74, 2001；Kannanganat等, J. Virol. 81:8468-8476, 2007；Lai等, Virology 369:153-167, 2007）。

ＰＤ−１遮断は慢性ＳＩＶ感染の初期（１０週目）並びに後期（約９０週）段階で実施した。９匹のマカク（初期段階に５匹と後期段階に４匹）に抗ＰＤ−１抗体を投与し、５匹のマカク（初期段階に３匹と後期段階に２匹）にアイソタイプコントロール抗体（シナジス、抗呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）特異的）を投与した。

慢性ＳＩＶ感染中におけるＰＤ−１遮断は、全てのマカクの血液中においてＳＩＶ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の迅速な増殖を生じた。ＧａｇＣＭ９（Allen等, J. Immunol. 160:6062-6071, 1998）及びＴａｔＳＬ８／ＴＬ８（Allen等, Nature 407:386-390, 2000）の二つの免疫優勢エピトープに対するＣＤ８Ｔ−細胞応答を、ＭａｍｕＡ^＊０１組織適合性分子を発現した抗ＰＤ−１抗体処置マカクの７匹及びコントロール抗体処置マカクの３匹において主要組織適合抗原（ＭＨＣ）Ｉ四量体複合体を使用して研究した。Ｇａｇ−ＣＭ９四量体特異的ＣＤ８Ｔ細胞の殆ど（＞９８％）が遮断前にＰＤ−１を発現した。ＰＤ−１遮断後、Ｇａｇ−ＣＭ９四量体特異的ＣＤ８Ｔ細胞は迅速に増殖し、７−２１日までにピークになった。ピーク応答では、これらのレベルは、０日目のその各レベル（Ｐ＝０．００７）よりも約２．５から１１倍高く、２８−４５日目まで高いままであった。同様の結果が、慢性ＳＩＶ感染の初期並びに後期段階における遮断で観察された。Ｇａｇ特異的インターフェロン（ＩＦＮ）−ｙ−陽性ＣＤ８Ｔ細胞の頻度の３−４倍の増加が２匹のＭａｍｕＡ^＊０１−陰性動物（ＲＴｄ１１及びＲＤｂ１１）における遮断後１４日までにまた観察され、ＰＤ−１遮断が、非ＭａｍｕＡ^＊０１アレルにより制限されるウイルス特異的ＣＤ８Ｔ細胞の頻度を亢進しうることを証明している。ＳＩＶ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖はコントロール抗体処置マカクでは観察されなかった。

ＰＤ−１遮断は、改善された機能的品質でインビボで活性な細胞分裂を受けていたウイルス特異的ＣＤ８Ｔ細胞の頻度に有意な増加がまた伴っていた。ＳＩＶ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の迅速な増殖と一致して、Ｋｉ６７（増殖細胞のマーカー）を同時発現したＧａｇ−ＣＭ９四量体特異的ＣＤ８細胞の頻度がまた遮断（Ｐ＝０．０１）から７日目までに早々に増加した。同様に、我々はパーフォリン及びグランザイムＢ（細胞溶解性ポテンシャル；それぞれＰ＝０．００１及びＰ＝０．０３）、ＣＤ２８（同時刺激ポテンシャル；Ｐ＝０．００１）、ＣＤ１２７（増殖性ポテンシャル；Ｐ＝０．０００３）及びＣＣＲ７（リンパ節ホーミングポテンシャル；０．００１）を同時発現するＧａｇ−ＣＭ９四量体特異的ＣＤ８Ｔ細胞の頻度の増加を観察した。遮断後の四量体陰性及びＫｉ６７陽性ＣＤ８Ｔ細胞の頻度の一過性の１．５から２倍の増加を観察した。これは、Ｇａｇ中の他のエピトープに特異的なＣＤ８Ｔ細胞並びにＳＩＶの他のタンパク質の増殖、及びこれらの動物中の他の慢性ウイルス感染によるものでありうる。３匹のコントロール抗体処置マカクにおいてはこれらのマーカーに対して有意な増強は観察されなかった。

遮断後Ｔａｔ−ＴＬ８特異的ＣＤ８Ｔ細胞に増殖は観察されなかった。これは、ＰＤ−１遮断が、それらがＴ細胞レセプターを通じてシグナルを同時に受ける場合にのみＴ細胞の増殖を生じることが知られているので、Ｔａｔ−ＴＬ８特異的ＣＤ８Ｔ細胞による認識をウイルスが免れるためであろう。この可能性を試験するために、ＳＩＶ２５１を感染させ、感染の初期段階において遮断抗体を投与された３匹全てのＭａｍｕＡ^＊０１−陽性マカクからの遮断開始の直前に血漿中に存在するウイルスゲノムを配列決定した。確かに、ＴａｔＴＬ８エピトープ領域に対応するウイルスゲノム中に変異が見出された。これらの変異の全てがＭａｍｕＡ^＊０１ＭＨＣ分子へのＴａｔＳＬ８／ＴＬ８ペプチドの結合を減少させ、Ｔａｔ−ＳＬ８／ＴＬ８特異的ＣＤ８Ｔ細胞による認識からのエスケープを生じることが示されるか又は予想された。これらの結果は、ＰＤ−１のインビボ遮断が、ウイルスエピトープのエスケープ変異体に特異的であるＴ細胞の増殖を生じないことを示唆している。

ＰＤ−１遮断はまたＳＩＶ／ＨＩＶ複製の優先的部位である結腸直腸粘膜組織（腸）においてＧａｇ−ＣＭ９特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖を生じた。増殖は７匹のマカクのうち２匹には観察されなかったが、血液ではその１匹で増殖が明らかであった。血液とは異なり、腸中での増殖は更に遅く４２日までにピークとなり、その各０日のレベル（Ｐ＝０．００３）と比較して２倍から３倍の範囲であった。血液と同様に、Ｋｉ６７（Ｐ＝０．０１）、パーフォリン（Ｐ＝０．０３）、グランザイムＢ（Ｐ＝０．０１）及びＣＤ２８（Ｐ＝０．０１）を同時発現したＧａｇ−ＣＭ９四量体特異的細胞もまた遮断後に腸において増加した。

より重要なことには、ＰＤ−１遮断は抗ウイルスＣＤ８Ｔ細胞の機能的品質をまた向上させ、サイトカインＩＦＮ−ｙ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α及びインターロイキン（ＩＬ）−２を同時生産可能な多機能細胞の産生を生じた。感染の後期慢性段階におけるＰＤ−１遮断の開始の日には、Ｇａｇ特異的ＩＦＮ−γ−陽性細胞の頻度は低く、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２の同時発現に失敗した。しかしながら、遮断後は、ＩＦＮ−γ−陽性細胞の頻度は４匹全てのＰＤ−１抗体処置マカクで増加し（Ｐ＝０．０３）、それらはＴＮＦ−α及びＩＬ−２を同時発現する能力を獲得した。ＩＦＮ−γ陽性細胞の増殖は１４−２１日目までにピークとなり、ピークレベルは各０日レベルよりも２−１０倍高かった。２１日目には、全Ｇａｇ特異的細胞の約１６％が３種全てのサイトカインを同時発現し、約３０％がＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを同時発現した。これは、全Ｇａｇ特異的細胞の＜１％が３種全てのサイトカインを同時発現し（Ｐ＝０．０１）、約１４％が０日目にＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを同時発現した（Ｐ＝０．０４）ものと対照的である。同様な結果が、感染の初期の慢性段階における遮断後にも観察された。

慢性免疫不全ウイルス感染中におけるＢ細胞機能の調節におけるＰＤ−１の役割を試験するために、ＳＩＶ感染マカクにおけるＰＤ−１遮断後のＢ細胞応答を特徴付けした。ＰＤ−１遮断前における異なったＢ細胞サブセットについてのＰＤ−１発現の分析は、天然Ｂ細胞（ＣＤ２０^＋ＣＤ２７⁻ＣＤ２１^＋；Ｐ＜０．００１）と比較したメモリーＢ細胞（ＣＤ２０^＋ＣＤ２７^＋ＣＤ２１⁻）によるＰＤ−１の優先的な発現を明らかにした。ＰＤ−１のインビボ遮断は、遮断の２８日後までの（Ｐ＜０．００１）ＳＩＶ特異的結合抗体の力価に２から８倍の増加を生じた。これを更に理解するために、抗ＰＤ−１抗体及び抗レトロウイルス治療法で同時に処置したＳＩＶ感染マカクにおいてメモリーＢ細胞の増殖について実験を実施し、Ｋｉ６７＋（増殖）メモリーには有意な増加が観察されたが、３日目と早いナイーブなＢ細胞では観察されなかった。これらの結果は、ＰＤ−１−ＰＤＬ経路が慢性ＳＩＶ感染中におけるＢ細胞機能障害を調節する役割を有しているであろうことを証明している。

中和アッセイは、容易に中和可能な実験室に適合させたＳＩＶ２５１に対して２倍の力価の増加を明らかにし、中和が難しい野生型ＳＩＶ２５１又はＳＩＶ２３９に対して力価の増加はなかった。抗ＰＤ−１抗体で処理した９匹の動物のうち２匹において、遮断後にＳＩＶ特異的抗体の増殖はほんの少しであった（＜２倍）。特に、これらの２匹の動物における全メモリーＢ細胞の頻度は、遮断前の残りの７匹の動物（全Ｂ細胞の６０−９０％）と比較して低く（−全Ｂ細胞の４０％）、遮断前のＳＩＶ特異的メモリーＢ細胞のレベルが遮断後のＳＩＶ特異的抗体の増殖のレベルを決定しうることを示している。

ＰＤ−１遮断は血漿ウイルス血症（Ｐ＝０．０３）において有意な減少を生じ、ＳＷ感染マカクの生存をまた延長した（Ｐ＝０．００１）。早期慢性相において抗ＰＤ−１抗体で処置した５匹のマカクのうち２匹において、ウイルス量は１０日目までに減少し、９０日目までこのレベル又はそれ以下に維持された。１匹のマカクでは、ウイルス量が一過性に減少し、残りの２匹のマカクでは、一過性に増加して遮断前のレベルに戻った。初期慢性相とは異なり、後期慢性相において抗ＰＤ−１抗体で処置された４匹全てのマカクは、７日目までウイルス血症の一過性の増加を示したが、２１日目までに、それぞれ０日目のレベル以下のレベルまで急速にウイルス量が減少した。しかしながら、ウイルス量は４３日目までに遮断前のレベルに戻った。予想の通り、コントロール抗体で処置された５匹のマカクの何れにおいても血漿中ウイルス量の有意な減少は観察されなかった。遮断後２１−２８日目までに、抗ＰＤ−１抗体で処置した動物におけるウイルスＲＮＡ量は、そのぞれぞれの０日目のレベルよりも２−１０倍低かった（Ｐ＝０．０３）。遮断後１５０日目までに、コントロール群の５匹のマカクのうち４匹を、ＡＩＤＳ関連症状（例えば食欲喪失、下痢、体重減少）のために殺したが、抗ＰＤ−１抗体処置群の９匹の動物全部は生存した（Ｐ＝０．００１）。

後期相処置動物の全て及び早期処置動物の幾らかにおける血漿ウイルス血症レベルの観察された初期の上昇は、活性化されたＣＤ４Ｔ細胞の頻度の増加のためであろう。これを決定するために、遮断後のＫｉ６７−陽性の全ＣＤ４Ｔ細胞の割合及び並びにＳＩＶＧａｇ特異的ＩＦＮ−ｙ産生ＣＤ４Ｔ細胞（「ウイルス複製の優先的な標的」）の頻度を測定した。これらの分析は、遮断後の７−１４日までのＫｉ６７陽性ＣＤ４Ｔ細胞の割合の一過性の増加を明らかにし（Ｐ＝０．００２）、この増加は、感染の初期相（Ｐ＝０．０１５）よりも後期相中に処置された動物においてより高かった。同様に、Ｇａｇ特異的ＣＤ４Ｔ細胞の頻度の増加が観察されたが、感染の後期相において処置された動物においてのみであった。コントロール抗体処置マカクでは、これらの活性化されたＣＤ４Ｔ細胞に対して有意な増加は観察されなかった。これらの結果は、活性化されたＣＤ４Ｔ細胞が遮断後の血漿ウイルス血症レベルの観察される初期の上昇に寄与していたことを示唆している。

ＰＤ−１遮断の開始前では、血漿中のセットポイントのウイルス量及び血液及び腸中の全ＣＤ４Ｔ細胞は、抗ＰＤ−１抗体処置群及びコントロール抗体処置群の間で同様であった。しかしながら、パーフォリン、グランザイムＢ又はＣＤ２８を同時発現するＧａｇＣＭ９＋細胞及びＧａｇＣＭ９＋細胞の頻度は、インビボ遮断の前では２つの処置群間で同様ではなかった。これは、これらの差がＰＤ−１遮断後のＧａｇＣＭ９＋細胞の増殖に寄与し得た可能性を生じる。遮断後のその増殖に対する遮断前のＧａｇＣＭ９＋細胞の頻度の影響を研究するために、抗ＰＤ−１抗体処置群を、一つの群が同様のレベルを有し、他の群がコントロール抗体処置群と比較して高いレベルのＧａｇＣＭ９＋細胞を有するように、遮断の開始前にＧａｇＣＭ９＋細胞の頻度に基づいて二つのサブグループに分割した。ついで、これらのサブグループを遮断後にＧａｇＣＭ９＋細胞の増殖について分析した。ＧａｇＣＭ９＋細胞の増殖は、それらが遮断前に低いレベルにあったか高いレベルにあったかにかかわらず、ＰＤ−１の遮断後に動物の双方のサブグループにおいて明らかであった。パーフォリン、グランザイムＢ、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７又はＣＤ２８のようなより良好なＴ細胞機能に関連する分子を同時発現するＧａｇＣＭ９＋細胞の頻度に基づくサブグループ解析によってもまた同様な結果が観察された。しかしながら、遮断前のＧａｇＣＭ９＋ＣＤ２８＋細胞の高いレベルの動物におおいてＧａｇＣＭ９＋ＣＤ２８＋細胞の良好な増殖の傾向が観察され、ＣＤ２８発現がインビボＰＤ−１遮断の結果を予測するためのバイオマーカーとなりうることを示唆している。

上に記載された実験は、ＰＤ−１に対する抗体を使用するＰＤ−１遮断により、改善された機能的品質を有するウイルス特異的ＣＤ８Ｔ細胞の迅速な増殖を生じることを証明している。この亢進されたＴ細胞免疫はＳＩＶ感染の主要な巣である血液及び腸においても見られた。ＰＤ−１遮断はまたメモリーＢ細胞の増殖を生じ、ＳＩＶ外被特異的抗体において増加する。これらの改善された免疫応答には、血漿中ウイルス量の有意な減少が伴い、ＳＩＶ感染マカクの生存をまた延長させた。遮断は重篤なリンパ球減少症の条件下でさえ慢性感染の早期（１０週目）並びに後期（〜９０週目）において効果的であった。これらの結果は、単一の阻害経路をブロックすることによる病原性免疫不全ウイルス感染中における細胞性及び体液性双方の免疫応答の亢進を証明し、ヒト免疫不全ウイルス感染のコントロールのための新規な治療的アプローチを同定する。

実施例１０：ヒト化ＰＤ−１抗体及びヒト化ＰＤ−Ｌ１抗体によるＰＤ−１：ＰＤＬ経路のインビトロ遮断後のＳＩＶ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖亢進
ＳＩＶＧａｇ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖能についての、ＥＨ−１２．２Ｈ７から誘導されたヒト化抗ＰＤ−１抗体及び２９Ｅ．２Ａ３から誘導されたヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体の効果をインビトロで試験した。ヒト化抗ＰＤ−１抗体は、配列番号：２８の重鎖可変領域配列と配列番号：３２の軽鎖可変領域配列を有している。ヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号：３５の重鎖可変領域配列と、配列番号：４２の軽鎖可変領域配列を有している。ヒト化抗体の重鎖定常領域は、抗体が二量体を形成するようにＳｅｒ２２８からＰｒｏへの変異（ＣＰＳＣＰからＣＰＰＣＰへ）を有するヒトＩｇＧ４由来であり、軽鎖定常領域はヒトκ軽鎖定常領域である。Ｓｅｒ２２８に対するアミノ酸番号付けはＥＵ番号付けシステムによる。Aalberse等, Immunology 105:9-19, 2002を参照のこと。ＳＩＶ感染マカク（感染後３ヶ月から１．５年）から得られたＰＢＭＣをカルボキシフルオセイン二酢酸スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）を染色し、遮断抗体の存在下又は不在下で６日間、ＳＩＶＧａｇペプチドプールか又は培養培地の何れかで刺激した。刺激の終わりに、細胞を表面ＣＤ３及びＣＤ８、及び細胞内Ｋｉ−６７に対して染色した。ついで、細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで獲得し、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアを使用して分析した。リンパ球を散乱に基づいて同定した後、ＣＤ８Ｔ細胞（ＣＤ３＋、ＣＤ８＋）をＫｉ−６７及びＣＦＳＥに対する同時染色に対して分析した。Ｋｉ−６７＋、ＣＦＳＥ低細胞を増殖細胞として同定した。

図１４Ａに示されるように、抗ＰＤ−１Ａｂを使用するＰＤ−１：ＰＤ−１リガンド経路のインビトロでの遮断により、ＳＩＶ特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答の増殖に有意な増加が生じている。抗ＰＤ−Ｌ１Ａｂを使用するインビトロ遮断によりＳＩＶ特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答の増殖に中程度の増加が生じている（図１４Ｂ）。

実施例１１：持続感染チンパンジーからの肝内単核細胞によるＨＣＶ特異的Ｔ細胞増殖の回復
ＣＦＳＥ標識肝内リンパ球（２×１０^６）を、１０年を越えてＨＣＶの遺伝子型１ａＨ７７株で慢性的に感染させられたチンパンジー１５６４から単離した。肝内リンパ球を、操作されないままか又は全ＨＣＶポリタンパク質をスパンするオーバーラップペプチドでパルスした（遺伝子型１ａＨ７７株）４×１０^６の照射された自己ＣＤ８枯渇ＰＢＭＣと共に６日間、共培養した。細胞を、抗ＰＤ−Ｌ１遮断抗体（１０μｇ／ｍｌ，０日目及び２日目に添加）を伴ってまた伴わないで、Ｌ−グルタミン及び１０％ＦＣＳが補填されたＲＰＭＩ培地で培養した。ヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号：３５の重鎖可変領域及び配列番号：４２の軽鎖可変領域配列を有する。ヒト化抗体の重鎖定常領域は、抗体が二量体を形成するようにＳｅｒ２２８からＰｒｏへの変異（ＣＰＳＣＰからＣＰＰＣＰへ）を有するヒトＩｇＧ４由来であり、軽鎖定常領域はヒトκ軽鎖定常領域である。Ｓｅｒ２２８に対するアミノ酸番号付けはＥＵ番号付けシステムによる。Aalberse等, Immunology 105:9-19, 2002を参照のこと。６日目に、細胞をＣＤ８−ＰｅｒＣＰ、Ａ０７０１／Ｐ７（７５８）−ＰＥ四量体、ＰＤ−１−Ａｌｅｘａ６４７、ＣＤ４−Ａｌｅｘａ７００、ＣＤ１４−Ａｌｅｘａ７００、ＣＤ１６−Ａｌｅｘａ７００、ＣＤ１９−Ａｌｅｘａ７００、及びライブ／デッドブルーで染色した。試料はＢＤＬＳＲＩＩフローサイトメーターで獲得し、データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して解析した。

図１５に示されるように、抗ＰＤ−Ｌ１抗体処理は、持続感染させられたチンパンジーからの肝内単核細胞によるＨＣＶ特異的Ｔ細胞増殖を回復させた。

出典明示による援用
ここに述べた全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許又は特許出願が出典明示により特にかつ個々に援用されるべきことが示されるように、出典明示によりその全体がここに援用される。矛盾する場合、ここでの定義を含む本出願が優先する。

その全体が出典明示によりまた援用されるものは、例えばワールドワイドウェブにThe Institute for Genomic Research(TIGR)及び／又はワールドワイドウェブにNational Center for Biotechnology Information(NCBI)によって維持されているもののような公的データベースにおけるエントリーに相関する受託番号を引用する任意のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列である。

均等物
当業者であれば、ここに記載された発明の特定の実施態様に対する多くの均等物を認識し又は常套的なものに過ぎない実験を使用して確認できるであろう。そのような均等物は次の特許請求の範囲によって包含されるものである。

Claims

ａ）配列番号：７−９からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ配列；又は
ｂ）配列番号：１０−１２からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ配列
を含む単離された抗体、又はその抗原結合断片であって、
ここで、単離された抗体、又はその抗原結合断片が、配列番号：２のアミノ酸配列を有するＰＤ−１タンパク質に結合し、かつ単離された抗体、又はその抗原結合断片が、キメラ、ヒト化、複合、又はヒトである単離された抗体又は抗原結合断片。
ａ）配列番号：７−９を含む重鎖可変領域配列；及び／又は
ｂ）配列番号：１０−１２を含む軽鎖可変領域配列
を含む、請求項１に記載の単離された抗体又は抗原結合断片。
単離された抗体が、
ａ）配列番号：２５−２９からなる群から選択される重鎖可変領域配列、又は配列番号：２５−２９からなる群から選択される重鎖配列と少なくとも約９５％の相同性を持つ配列；及び／又は
ｂ）配列番号：３０−３３からなる群から選択される軽鎖可変領域配列、又は配列番号：３０−３３からなる群から選択される軽鎖配列と少なくとも約９５％の相同性を持つ配列
を含む、請求項１に記載の単離された抗体又は抗原結合断片。
単離された抗体が、
ａ）配列番号：２７又は２８を含む重鎖可変領域配列、又は配列番号：２７又は２８を含む重鎖配列と少なくとも約９５％の相同性を持つ配列；及び
ｂ）配列番号：３２又は３３を含む軽鎖可変領域配列、又は配列番号：３２又は３３を含む軽鎖配列と少なくとも約９５％の相同性を持つ配列
を含む、請求項３に記載の単離された抗体又は抗原結合断片。
単離された抗体又は抗原結合断片がＥＨ１２．２Ｈ７抗体のＦｃ−ＰＤ−１への結合を阻害する、請求項１から４の何れか一項に記載の単離された抗体又は抗原結合断片。
単離された抗体又は抗原結合断片がＰＤ−１媒介シグナルを阻害する、請求項１から４の何れか一項に記載の単離された抗体又は抗原結合断片。
ａ）配列番号：１３−１５からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ配列；又は
ｂ）配列番号：１６−１８からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ配列
を含む単離された抗体、又はその抗原結合断片であって、
ここで、単離された抗体、又はその抗原結合断片が、配列番号：４のアミノ酸配列を有するＰＤ−Ｌ１タンパク質に結合し、かつ単離された抗体、又はその抗原結合断片が、キメラ、ヒト化、複合、又はヒトである単離された抗体又は抗原結合断片。
ａ）配列番号：１３−１５を含む重鎖可変領域配列；及び／又は
ｂ）配列番号：１６−１８を含む軽鎖可変領域配列
を含む、請求項７に記載の単離された抗体又は抗原結合断片。
単離された抗体が、
ａ）配列番号：３４−３８からなる群から選択される重鎖可変領域配列、又は配列番号：３４−３８からなる群から選択される重鎖配列と少なくとも約９５％の相同性を持つ配列；及び／又は
ｂ）配列番号：３９−４２からなる群から選択される軽鎖可変領域配列、又は配列番号：３９−４２からなる群から選択される軽鎖配列と少なくとも約９５％の相同性を持つ配列
を含む、請求項８に記載の単離された抗体又は抗原結合断片。
単離された抗体が、
ａ）配列番号：３５又は３７を含む重鎖可変領域配列、又は配列番号：３５又は３７を含む重鎖配列と少なくとも約９５％の相同性を持つ配列；及び
ｂ）配列番号：３９、４０又は４２を含む軽鎖可変領域配列、又は配列番号：３９、４０又は４２を含む軽鎖配列と少なくとも約９５％の相同性を持つ配列
を含む、請求項９に記載の単離された抗体又は抗原結合断片。
単離された抗体又は抗原結合断片が２９Ｅ２Ａ３抗体のＦｃ−ＰＤ−Ｌ１への結合を阻害する、請求項７から１０の何れか一項に記載の単離された抗体又は抗原結合断片。
単離された抗体又は抗原結合断片がＰＤ−Ｌ１媒介シグナルを阻害する、請求項７から１０の何れか一項に記載の単離された抗体又は抗原結合断片。
ａ）配列番号：１９−２１からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ配列；又は
ｂ）配列番号：２２−２４からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ配列
を含む単離された抗体、又はその抗原結合断片であって、
ここで、単離された抗体、又はその抗原結合断片が、配列番号：６のアミノ酸配列を有するＰＤ−Ｌ２タンパク質に結合し、かつ単離された抗体、又はその抗原結合断片が、キメラ、ヒト化、複合、又はヒトである単離された抗体又は抗原結合断片。
ａ）配列番号：１９−２１を含む重鎖可変領域配列；及び／又は
ｂ）配列番号：２２−２４を含む軽鎖可変領域配列
を含む、請求項１３に記載の単離された抗体又は抗原結合断片。
単離された抗体が、
ａ）配列番号：４３−４７からなる群から選択される重鎖可変領域配列、又は配列番号：４３−４７からなる群から選択される重鎖配列と少なくとも約９５％の相同性を持つ配列；及び／又は
ｂ）配列番号：４８−５１からなる群から選択される軽鎖可変領域配列、又は配列番号：４８−５１からなる群から選択される軽鎖配列と少なくとも約９５％の相同性を持つ配列
を含む、請求項１４に記載の単離された抗体又は抗原結合断片。
単離された抗体が、
ａ）配列番号：４４又は４６からなる群から選択される重鎖可変領域配列、又は配列番号：４４又は４６からなる群から選択される重鎖配列と少なくとも約９５％の相同性を持つ配列；及び／又は
ｂ）配列番号：４９−５１からなる群から選択される軽鎖可変領域配列、又は配列番号：４９−５１からなる群から選択される軽鎖配列と少なくとも約９５％の相同性を持つ配列
を含む、請求項１５に記載の単離された抗体又は抗原結合断片。
単離された抗体又は抗原結合断片が２４Ｆ．１０Ｃ１２抗体のＦｃ−ＰＤ−Ｌ２への結合を阻害する、請求項１３から１６の何れか一項に記載の単離された抗体又は抗原結合断片。
単離された抗体又は抗原結合断片がＰＤ−Ｌ２媒介シグナルを阻害する、請求項１３から１６の何れか一項に記載の単離された抗体又は抗原結合断片。
ポリペプチドをコードする単離された核酸であって、ポリペプチドが配列番号：２５−５１からなる群から選択される配列、又は配列番号：２５−５１からなる群から選択される配列と少なくとも約９５％の相同性を持つ配列を含む単離された核酸。
請求項１から１８の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片をコードする単離された核酸。
請求項１９又は２０に記載の単離された核酸を含むベクター。
請求項１９又は２０に記載の核酸を含む宿主細胞。
核酸によってコードされる抗体又は抗原結合断片を産生する請求項２２に記載の宿主細胞。
請求項１９又は２０に記載の核酸を含むトランスジェニック動物。
配列番号：２５−５１からなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸又は配列番号：２５−５１からなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸と少なくとも約９５％の相同性を有する核酸。
請求項１から１８の何れか一項に記載の単離された抗体又は抗原結合断片と薬学的に許容可能な担体を含有する薬学的組成物。
消耗したＴ細胞を再活性化させる方法において、少なくとも幾らかのＴ細胞がＰＤ−１を発現するＴ細胞集団を、請求項１から６の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含有する組成物の有効量に接触させることを含む方法。
消耗したＴ細胞を再活性化させる方法において、少なくとも幾らかのＴ細胞がＰＤ−Ｌ１を発現するＴ細胞集団を、請求項７から１２の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含有する組成物の有効量に接触させることを含む方法。
消耗したＴ細胞を再活性化させる方法において、少なくとも幾らかのＴ細胞がＰＤ−Ｌ２を発現するＴ細胞集団を、請求項１３から１８の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含有する組成物の有効量に接触させることを含む方法。
接触工程がインビトロで実施される請求項２７から２９の何れか一項に記載の方法。
接触工程がエキソビボで実施される請求項２７から２９の何れか一項に記載の方法。
接触工程がインビボで実施される請求項２７から２９の何れか一項に記載の方法。
持続感染に罹患している患者を治療する方法において、請求項１から１８の何れか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片を含有する組成物を患者に投与することを含む方法。
ウイルス感染に罹患している患者を治療する方法において、請求項１から１８の何れか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片を含有する組成物を患者に投与することを含む方法。
ウイルス感染が、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、呼吸器多核体ウイルス、及び／又はライノウイルスからなる群から選択される請求項３４に記載の方法。
細菌感染に罹患している患者を治療する方法において、請求項１から１８の何れか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片を含有する組成物を患者に投与することを含む方法。
細菌感染が、ヘリコバクター、マイコバクテリア、ポルフィロモナス、及びクラミジアからなる群から選択される請求項３６に記載の方法。
蠕虫感染に罹患している患者を治療する方法において、請求項１から１８の何れか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片の有効量を含有する組成物を患者に投与することを含む方法。
蠕虫が、住血吸虫及び条虫類からなる群から選択される請求項３８に記載の方法。
原虫感染に罹患している患者を治療する方法において、請求項１から１８の何れか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片の有効量を含有する組成物を患者に投与することを含む方法。
原虫感染が、メキシコリーシュマニア及びマラリア原虫からなる群から選択される請求項４０に記載の方法。
癌に罹患している患者を治療する方法において、請求項１から１８の何れか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片の有効量を含有する組成物を患者に投与することを含む方法。
癌が、固形腫瘍、血液癌、膀胱癌、脳癌、乳癌、結腸癌、胃(gastric)癌、神経膠腫、頭部癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、骨髄腫、頸部癌、卵巣癌、メラノーマ、膵臓癌、腎臓癌、唾液腺癌、胃(stomach)癌、胸腺上皮性癌、及び甲状腺癌.からなる群から選択される請求項４２に記載の方法。
ＰＤ−Ｌ１を過剰発現する癌に罹患している患者を治療する方法において、請求項７から１２の何れか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片の有効量を含有する組成物を患者に投与することを含む方法。
単離された抗体が抗体媒介性細胞傷害性を誘導する請求項４４に記載の方法。
抗体が抗体誘導細胞傷害性を増大させるように修飾されている請求項４５に記載の方法。
抗体が、毒素及び造影剤からなる群から選択される薬剤にコンジュゲートされている請求項４６に記載の方法。
ＰＤ−Ｌ２を過剰発現する癌に罹患している患者を治療する方法において、請求項１３から１８の何れか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片の有効量を含有する組成物を患者に投与することを含む方法。
単離された抗体が抗体媒介性細胞傷害性を誘導する請求項４８に記載の方法。
抗体が抗体誘導細胞傷害性を増大させるように修飾されている請求項４９に記載の方法。
抗体が、毒素及び造影剤からなる群から選択される薬剤にコンジュゲートされている請求項５０に記載の方法。
喘息に罹患している患者を治療する方法において、請求項１３から１８の何れか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片の有効量を含有する組成物を患者に投与することを含む方法。
炎症性疾患に罹患している患者を治療する方法において、請求項７から１８の何れか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片の有効量を含有する組成物を患者に投与することを含む方法。
炎症性疾患が、急性播種性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、関節炎、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、セリアック病、シャーガス病、クローン病、皮膚筋炎、１型糖尿病、グッドパスチャー症候群、移植片対宿主病、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、高ＩｇＥ症候群、特発性血小板減少性紫斑病、エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、シェーグレン症候群、側頭動脈炎、血管炎、及びウェゲナー肉芽腫症からなる群から選択される請求項５３に記載の方法。
移植片拒絶に罹患している患者を治療する方法において、請求項７から１８の何れか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片の有効量を含有する組成物を患者に投与することを含む方法。
移植片拒絶が、臓器拒絶反応、骨髄移植拒絶反応、及び／又は骨髄非破壊的骨髄移植拒絶反応からなる群から選択される請求項５５に記載の方法。
請求項１から１８の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片を製造する方法において、抗体又は抗原結合断片を産生する細胞を培養し、細胞培養物から抗体又は抗原結合断片を回収することを含む方法。