NO326296B1 - Polypeptid-variant samt anvendelse og fremstilling derav, og nukleinsyre, replikerbar vektor og vertscelle. - Google Patents

Polypeptid-variant samt anvendelse og fremstilling derav, og nukleinsyre, replikerbar vektor og vertscelle. Download PDF

Info

Publication number
NO326296B1
NO326296B1 NO19974739A NO974739A NO326296B1 NO 326296 B1 NO326296 B1 NO 326296B1 NO 19974739 A NO19974739 A NO 19974739A NO 974739 A NO974739 A NO 974739A NO 326296 B1 NO326296 B1 NO 326296B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
polypeptide
domain
variant
interest
sequence
Prior art date
Application number
NO19974739A
Other languages
English (en)
Other versions
NO974739L (no
NO974739D0 (no
Inventor
Leonard G Presta
Bradley R Snedecor
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of NO974739D0 publication Critical patent/NO974739D0/no
Publication of NO974739L publication Critical patent/NO974739L/no
Publication of NO326296B1 publication Critical patent/NO326296B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C07K16/2845—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta2-subunit-containing molecules, e.g. CD11, CD18
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/48—Nerve growth factor [NGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/624—Disulfide-stabilized antibody (dsFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører polypeptid-variant samt anvendelse og fremstilling derav, og nukleinsyre, replikerbar vektor og vertscelle.
TEKNISK OMRÅDE
Foreliggende oppfinnelse angår polypeptider som er muterte for å omfatte en salvage-reseptor bindingsepitope.
BESKRIVELSE AV RELATERT LITTERATUR
Det ble i 1964 foreslått at en spesifikk reseptor eksisterer i rask likevekt med det intravaskulære rommet som beskytter IgG-molekyler fra degradering. Brambell et al., Nature, 203: 1352-1355 (1964). Se også Brambell, The Lancet, 1087-1093 (1965). Nyrene er vist å være det viktigste setet for katabolisme av immunoglobulin-fragmenter, noe som teller for omtrent 90% av deres endogene katabolisme. Wochner et al., J. Exp. Med., 126: 207 (1967). Eksistensen av en reseptor impliserer at Ig-molekylet har spesifikke sekvenser eller konformasjons-determinanter som må binde en slik reseptor. Siden Fc-regionen av IgG som er produsert ved proteolyse har den samme in vivø-halveringstiden som det intakte IgG-molekylet, og Fab-fragmenter raskt blir degradert (Spiegelberg and Wiegle., J. Exp. Med., 121: 323-338 [1965]; Waldmann and Ghetie. "Catabolism of Immunoglobulins, "Progress in Immunol., 1:1187-1191 [Academic Press, New York:1971]; Spiegelberg, i Advances in Immunol, Vol 19, F.J. Dixon and H.G. Kinkel., red [Academic Press, NY: 1974],
s. 259-294; og en historisk gjennomgang av Zuckier et al., Semin. Nucl. Med., 19: 166-186
[1989]), er det antatt at de relevante sekvensene fra mus IgG2b var i CH2- eller CH3-domenet, og at delesjon av det ene eller det andre domenet ville gi en rask degradering. Faktisk vil CH2-domene-fragmentet av human IgG som er produsert ved trypsin-spaltning av Fc-fragmentet være i sirkulasjonen hos kaniner like lenge som Fc-fragmentet eller IgG-molekylet; i motsetning er CH3-domene- (pFc<N>) fragmentet av human IgG, som også blir produsert ved trypsin-spaltning av Fc-fragmentet, raskt eliminert, noe som indikerer at det katabolske setet i IgG er lokalisert i CH2-domenet. Ellerson et al., J. Immunol., 116: 510
(1976); Yasmeen et al., J. Immunol., 116: 518 (1976). Andre studier har vist at sekvenser i CH3-domenet er viktige ved bestemmelse av de ulike intravaskulære-halveringstidene for IgG2bT- og IgG2ah-antistoffene fra mus. Pollock et al., Eur. J. Immunol., 20: 2021-2027
(1990).
De katabolske hastighetene for IgG-varianter som ikke binder høy-affinitets Fc-reseptoren FcRI eller Clq er ikke til å skille fra hastigheten på rensing av forløper-villtype-antistoffet, noe som indikerer at det katabolske setet er forskjellig fra setene som er involvert i FcRI- eller Clq-binding. Wawrzynczak et al., Molec. Immunol., 29:221 (1992). Fjerning av karbohydrat-enheter fra IgG-molekylet eller Fc-fragmentet har enten en mindre rolle ved, eller ingen effekt på, in vivo halveringstid, og graden av denne effekten avhenger av isotypen av
IgG-molekylet. Nose and Wigzell., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 80: 6632 (1983); Tao and Morrison, J. Immunol., 143: 2595 (1989); Wawrzynczak et al., Mol. Immunol., 29:213
(1992).
Staphylococcal protein A-IgG-komplekser er funnet å renses raskere fra serumet enn ikke-kompleks-IgG-molekyler. Dima et al., Eur. J. Immunol., 13: 605 (1983). For å bestemme om enheter nær Fc-SpA-interfasen er involvert i IgG-rensing utførte Kim et al., Eur. J. Immunol., 24: 542-548 (1994) sete-dirigert mutagenese for å endre aminosyre-enheter i et rekombinant Fc-hengsels-fragment som er avledet fra det murine immunoglobulin-Gl-molekylet, og bestemme effektene av disse mutasjonene på farmakokinetikken for Fc-hengselsfragmentet. Forfatterene viste at setet for IgG 1-molekylet som kontrollerer den katabolske raten (det "katabolske setet") er lokalisert ved CH2-CH3-domene-interfasen og overlapper med iSto^/jy/ococcaZ-protein-A-bindingssetet. Se også WO 93/22332, publisert 11. November 1993. Konsentrasjon-katabolisme-fenomenet er også studert i Zuckier et al., Cancer; 73: 794-799 (1994). IgG-katabolisme er også beskrevet av Masson,
J. Autoimmunity, 6: 683-689 (1993).
WO 94/04689 omhandler et protein med et cytotoksisk domene, et ligand-bindende domene og et peptid som kobler disse to domene som omfatter et IgG-konstant region-domene som har egenskapen å kunne øke-halveringstiden av proteinet i pattedyr-serum.
Batra et al., Mol. Immunol. 30(4):379-86 (1993) og WO 94/04689 Al beskriver fusjonsproteiner omfattende bindings-domenen av CD4 og PE40 som er en mutant form av pseudomonas endotoksin A som mangler en cellebindende domene hvor CD4 og PE40 domenene er separert med en eller flere fullengde Ch2, Ch3, ChI- Ch2 eller Ch2- Ch3 domener fra human IgGi.
En stereo-tegning av et humant Fc-fragment og dets kompleks med fragment B fra protein A fra Staphylococcus aureus er tilveiebragt av Deisenhofer, Biochemistry, 20: 2364
(1981).
Det er vist at rensing blir sterkt redusert når den effektive molekyl-størrelsen overstiger 70 kDa, den glomerulære cut-off-størrelsen. Knauf et al., "Relationship of effective molecular size to systemic clearance in rats of recombinant interleukin-2 chemically modified with water-soluble polymers", J. Biochem, 263:15064-15070 (1988).
SAMMENDRAG AV OPPFINNELSEN
I samsvar med dette tilveiebringer en utførelsesform av oppfinnelsen en polypeptid-variant av polypeptid av interesse hvor polypeptidet av interesse er renset fra nyrene, og ikke inneholder en Fc-region av et IgG, hvor varianten omfatter en salvage-reseptor-bindingsepitop fra en Fc-region av et IgG, og hvor varianten har en lengre in vivo-halverings-tid enn polypeptidet av interesse.
Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig polypeptid-variant av et polypeptid av interesse hvor polypeptidet av interesse er renset fra nyrene, og ikke inneholder en Fc-region av et IgG hvor polypeptid-varianten inneholder et Ig-domene eller Ig-lignende domene som ikke er et CH2-domene, kjennetegnet ved at Ig-domenet eller det Ig-lignende domenet omfatter en salvage-reseptor bindingsepitop tatt fra et CH2-domene av en Fc-region av et IgG, hvor epitopen omfatter en aminosyresekvens metionin, isoleucin, serin (MIS) med en treonin (T)-rest etter en aminosyre C-terminal til MIS-sekvensen, og hvor varianten har en lengre in vivo- halveringstid enn polypeptidet av interesse.
Ved et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen nukleinsyrer som koder for polypeptid-varianten, en replikerbar vektor som omfatter nukleinsyren, en vertscelle som omfatter nukleinsyren og en metode for å produsere en polypeptid-variant som omfatter å dyrke vertscellene i kulturmedium og å gjenvinne polypeptid-varianten fra vertscelle-kulturen. Nukleinsyre-molekylet kan være merket eller ikke-merket med en detekterbar enhet.
Ved et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et polypeptid, hvor polypeptidet omfatter én eller flere av de følgende sekvensene (5' til 3'): HQNLSDGK (SEKV. ID. NR.: 1), HQNISDGK (SEKV. ID. NR.: 2) eller VISSHLGQ (SEKV. ID. NR.: 31) og hvor polypeptidet også omfatter sekvensen: PKNSSMISNTP (SEKV. ID. NR.: 3).
Ved nok et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en metode for å fremstille en polypeptid-variant av et peptid av interesse, hvor polypeptidet av interesse, som er renset fra nyrene og ikke inneholder en Fc-region av et IgG, hvor polypeptid-varianten inneholder et Ig-domene eller Ig-lignende domene som ikke er et CH2-domene som omfatter å endre Ig-domenet eller det Ig-lignende domene til å omfatte en salvage-reseptor bindingsepitop tatt fra et CH2-domene av en Fc-region av et IgG, hvor epitopen omfatter en aminosyresekvens MIS (MIS) med en treonin (T)-rest etter en aminosyre C-terminal til MIS-sekvensen til å ha en øket in vivo-halveringstid.
Ved nok en ytterligere utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen en metode for å fremstille en polypeptid-variant som har en økt in vivo-halveringstid omfattende: (1) identifisere sekvensen og konformasjonen til en salvage-reseptor bindingsepitop på en Fc-region fra et IgG-molekyl; (2) endre sekvensen til et polypeptid av interesse, hvilket polypeptid av interesse er renset fra nyrene og ikke inneholder en Fc-region av et IgG hvor polypeptid-varianten inneholder et Ig-domene eller Ig-lignende domene, som ikke er et CH2-domene av en Fc-region av et IgG, ved å endre Ig-domenet eller det Ig-lignende domenet til å omfatte en salvage-reseptor bindingsepitop tatt fra et CH2-domene og hvor epitopen omfatter en aminosyresekvens MIS (MIS) med en treonin (T)-rest etter en aminosyre C-terminal til MIS-sekvensen; (3) teste det endrete polypeptidet ifølge trinn (2) for lengre in vivo-halveringstid enn den til polypeptidet av interesse; og (4) hvis polypeptidet ikke har en lengre in vivo-halveringstid, videre endre Ig-domenet eller det Ig-lignende domenet til å omfatte sekvensen og konformasjonen til den identifiserte bindingsepitopen og teste for lengre
in vivo-halveringstid, inntil lengre in vivo-halveringstid er oppnådd.
Foreliggende oppfinnelse er videre kjennetegnet ved at polypeptidet av interesse er et Fab, et F(ab')2. en "diabody", et Fv-fragment, et enkeltkjede Fv-fragment eller en reseptor.
Polypeptidet av interesse er videre en LFA-1 -antagonist.
Polypeptidet av interesse ifølge foreliggende oppfinnelse er videre et Fab eller et F(ab')2 av et anti-LFA-1-antistoff eller et anti~CD18-Fab eller anti-CD18-F(ab')2.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre anvendelse av varianten ifølge et hvilket som helst av kravene 10-13 for fremstilling av en farmasøytisk blanding for å behandle en LFA-1-mediert lidelse.
Fc-regionen er lokalisert (transplantert) til en region av polypeptidet av interesse som ikke vil endre dens konformasjon slik at den taper biologisk aktivitet, og er lokalisert slik at den ikke vil påvirke polypeptidets evne til å binde en ligand eller et antigen for å beholde biologisk aktivitet.
KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE
Figurene IA og IB viser serum-farmakokinetikken for fem Fab- eller (Fab02-konstrukter hos mus etter enkle intravenøse doser på 2 mg/kg. I fig. IA er Fab vlB-varianten betegnet ved fylte firkanter, Fab-kontrollen er indikert ved fylte romber, Fab v2-varianten er indikert med fylte trekanter, Fab vl-varianten er indikert ved fylte sirkler og den doble disulfid F(ab')2 er indikert ved åpne sirkler. I fig. IB er Fab-kontrollen betegnet ved fylte triangler, varianten Fab v2 er indikert ved åpne sirkler; varianten Fab vi er betegnet ved åpne firkanter; varianten Fab vlB er betegnet ved fylte sirkler og den doble disulfid F(ab')2 er indikert ved fylte firkanter. Molekylene er beskrevet mer detaljert i tabellene her. Figur 2 viser en sammenligning av de relevante delene av konsensus aminosyre-sekvensene til det humane IgGl CHl-domenet (SEKV. ID. NR.: 4); det humane IgG2 CH1-domenet (SEKV. ID. NR.: 5); det humane IgG3 CHl-domenet (SEKV. ID. NR.: 6); det humane IgG4 CHl-domenet (SEKV. ID. NR.: 7); det humane kappa CL-domenet (SEKV. ID. NR.: 8) og det humane lambda CL-domenet (SEKV. ID. NR.: 9), ved sammenligning med Fab vlb-varianten avledet fra anti-CD18-antistoffet (SEKV. ID. NR.: 10), som er beskrevet i eksempel 1. I denne figuren er aminosyre-enheter og/eller posisjoner som er interessante og mest viktige for denne oppfinnelsen innen sekvensen til Fab vlb (dvs. SEKV. ID. NR.: 3 og 1) betegnet ved hhv. understrekning og stjerner.
DETALJERT BESKRIVELSE AV DE FORETRUKNE UTFØRELSESFORMENE
Definisjoner
Som anvendt her refererer polypeptidet av interesse eller det interessante polypeptidet til et polypeptid som har en biologisk aktivitet, er renset av nyrene, og ikke inneholder en Fc-region fra et IgG. En "Fc-region fra et IgG" refererer til Fc-delen av et immunogobulin av isotype IgG, som er vel kjent for fagfolk innen feltet antistoff-teknologi. Eksempler på slike polypeptider er peptider og proteiner, enten fra eukaryote kilder, så som f. eks. gjær, fugler, planter, insekter eller pattedyr, eller fra bakterie-kilder så som f. eks E. coli. Det interessante polypeptidet kan bli isolert fra naturlige kilder eller laget syntetisk eller rekombinant. Ved en foretrukket utførelsesform omfatter polypeptidet av interesse et Ig-domene eller et Ig-lignende domene, f. eks et antigen-bindingsdomene.
Rensing av det interessante polypeptidet av nyrene avhenger i det minste delvis av molekylvekten til polypeptidet. Polypeptider med for stor molekylvekt vil ikke renses av nyrene til et pattedyr. Et eksempel på en test for å bestemme om det interessante polypeptidet
(eller varianten) renses av nyrene er en klinisk studie hvor polypeptidet av interesse eller varianten er merket med en detekterbar markør og administrert til den samme typen pattedyr som vil bli behandlet, ved å anvende det samme behandlingsregimet som ville blitt brukt ved den aktuelle behandlingen. Deretter blir en klinisk prøve av urinen til pattedyret tatt og analysert for å bestemme om merket kan detekteres der. Hvis merket blir detektert blir det interessante polypeptidet eller varianten renset fra nyrene.
Som en generell regel har polypeptider som renses av nyrene en molekylvekt i området omtrent 5.000-10.000 dalton, selv om molekyler med en noe høyere eller lavere molekylvekt også fyller kriteriene ifølge foreliggende oppfinnelse dersom de kan passere nyre-rense-testen som beskrevet ovenfor.
Det interessante polypeptidet er biologisk aktivt dersom det har en in vivo effektor eller antigen funksjon eller aktivitet som er direkte eller indirekte forårsaket eller utført av polypeptidet (enten det er i dets native eller denaturerte konformasjon) eller et fragment derav. Effektor-funksjoner omfatter reseptor-binding og hvilken som helst bærer-bindingsaktivitet, agonisme eller antagonisme av det interessante polypeptidet, spesielt transduksjon av et proliferativt signal omfattende replikering, DNA-reguleringsfunksjoner, modulering av den biologiske aktiviteten til ulike vekstfaktorer, reseptor-aktivering, deaktivering, opp- eller ned-regulering, cellevekst eller differensiering og lignende. Biologisk aktivitet omfatter besittelse av en epitope eller et antigenisk sete som kan kryss-reagere med antistoffer som er rettet mot det interessante polypeptidet eller mammalske ekvivalenter derav.
Eksempler på interessante pattedyr-polypeptider omfatter molekyler så som f. eks. renin, et veksthormon, omfattende humant veksthormon, bovint veksthormon, veksthormon-frigjørende-faktor; parathyroideahormon, thyroideastimulerende hormon; lipoproteiner; al-antitrypsin; insulin A-kjede; insulin-B-kjede; proinsulin; trombopoietin; follikkelstimulerende hormon; kalsitonin; luteiniserende hormon; glukagon; koagulasjonsfaktorer så som faktor VinC, faktor DC, vevsfaktor og von Willebrands faktor; anti-koagulerende faktorer så som protein C; "atrial naturietic" faktor; lunge-surfaktant; en plasminogenaktivator, så som urokinase eller human urin- eller vevstype-plasminogen aktivator (t-PA); bombesin; trombin; hemopoietisk vekstfaktor; tumornekrosefaktor -alfa og -beta; enkefalinase; et serumalbumin så som humant serumalbumin; mullerian-inhiberende substans; relaksin A-kjede, relaksin B-kjede; prorelaksin; mus gonadotropin-assosiert peptid; et mikrobielt protein, så som beta-laktamase; DNase; inhibin; aktivin; vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF); reseptorer for hormoner eller vekstfaktorer; integrin; protein A eller D; revmatoide faktorer; en neurotropisk faktor så som hjerne-avledet neurotrop faktor (BDNF); neurotropin-3, -4, -5 eller -6 (NT-3, NT-4, NT-5 eller NT-6) eller en nerve- vekstfaktor så som NGF-P: kardiotrofiner (kardio hypertrofifaktor) så som kardiotrofin-1 (CT-1); blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF); fibroblast vekstfaktor så som aFGF og bFGF; epidermal vekstfaktor (EGF); transformerende vekstfaktor (TGF) så som TGF-alfa og TGF-beta, inklusive TGF-pi, TGF-p2, TGF-|33, TGF-p4 eller TGF-P5; insulin-lignende vekstfaktor-I og -II (IGF-1 og IGF-II); des (l-3)-IGF-I (hjerne IGF-I), insulin-lignende vekstfaktor bindende proteiner; CD-proteiner så som CD-3, CD-4, CD-8 og CD-19; erytropoietin; osteoinduserende faktorer; immunotoksiner; et ben-morfogenetisk protein (BMP); et interferon så som interferon-alfa, -beta og -gamma; koloni stimulerende faktorer (CSFer), f. eks. M-CSF, GM-CSF og G-CSF; interleukiner (ILer) f. eks IL-1 til IL-10; et anti-HER-2-antistoff uten en nativ Fc-region fra et IgG; superoksyd-dismutase; T-celle-reseptorer; overflate-membranproteiner; nedbrytnings akselererende faktor; viralt antigen så som f. eks. en del av AIDS-hylse; transport-proteiner; "homing"-reseptorer; "addressiner"; regulatoriske proteiner; antistoffer uten en nativ Fc-region fra et IgG og fragmenter av hvilke som helst av de ovenfor nevnte polypeptidene.
De foretrukne interessante polypeptidene er mammalske polypeptider. Eksempler på slike mammalske polypeptider omfatter antistoff-fragmenter så som Fv, Fab, (Fab')2 og et anti-HER-2-fragment uten IgG-Fc-domenet, t-PA, gpl20, DNase, IGF-I, IGF-II, hjerne-IGF-I, veksthormon, relaksin-kjeder, veksthormon-frigjørende faktor, insulin-kjeder eller pro-insulin, urokinase, immunotoksiner, neurotrofiner og antigener. Mer foretrukket er polypeptidet et Fab, et (Fab')2, en "diabody", et Fv-fragment, et enkelkjede Fv-fragment eller en reseptor. Enda mer foretrukket er polypeptidet et anti-IgE, anti-HER2 eller anti-CD18 Fab eller (Fab')2, og er fortrinnsvis humane eller humaniserte.
Som anvendt her refererer "polypeptid-variant" seg til en aminosyre-sekvens-variant av det interessante polypeptidet, omfattende varianter med en eller flere aminosyre-substitusjoner, insersjoner og/eller delesjoner. Slike varianter er biologisk aktive som definert ovenfor, og har nødvendigvis mindre enn 100% sekvensidentitet med polypeptidet av interesse. Ved en foretrukket utførelsesform har den biologisk aktive polypeptid-varianten en aminosyre-sekvens som deler i det minste omtrent 70% aminosyresekvensidentitet med polypeptidet av interesse, foretrukket i det minste omtrent 75%, mer foretrukket i det minste omtrent 80%, enda mer foretrukket i det minste omtrent 85%, og enda mer foretrukket i det minste omtrent 90% og fortrinnsvis i det minste omtrent 95%.
" In vivo-halveringstid" er halveringstiden for det interessante polypeptidet eller polypeptid-varianten som sirkulerer i blodet til et gitt pattedyr.
Som anvendt her refererer begrepet salvage-reseptor bindingsepitop til en epitop av Fc-regionen fra et IgG-molekyl (f. eks. IgGl, IgG2, IgG3 og IgG4) som er ansvarlig for å øke in vivo-serumhalveringstiden for IgG-molekylet. Som et eksempel viser fig. 2 representative epitoper ved understreking, og viktige enheter ved stjerner. IgGl-, IgG2- og IgG4-isotypene er foretrukket for å bestemme salvage-reseptorbindingsepitopen.
"Polymerasekjedereaksjon" eller "PCR" refererer til en prosedyre eller teknikk hvor små mengder av en spesiell bit av nukleinsyre, RNA og/eller DNA, er amplifisert som beskrevet i US patent nr. 4.683.195, innlevert 28. juli 1987. Generelt må sekvensinformasjon fra endene av den interessante regionen eller utover være tilgjengelig, slik at oligonukleotid-primere kan designes; disse primerene vil være identiske eller lignende med sekvens fra de motsatte tråder i templatet som skal amplifiseres. De 5-terminale nukleotidene for de to primerene kan samsvare med endene i det amplifiserte materialet. PCR kan bli anvendt for å amplifisere spesifikke RNA-sekvenser, spesifikke DNA-sekvenser fra total genomisk DNA og cDNA som er transkribert fra totalt cellulært RNA, bakteriofag eller plasmid-sekvenser osv.
Se generelt Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263 (1987); Erlich, red., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989). Som anvendt her er PCR ansett å være et, men ikke det eneste; eksemplet på en nukleinsyre-polymerase-reaksjonsmetode for å amplifisere en nukleinsyre-prøve som omfatter anvendelsen av en kjent nukleinsyre som en primer og en
nukleinsyre-polymerase for å amplifisere eller generere en spesifikk bit nukleinsyre.
"Antistoffer" (Ab) og "immunoglobuliner" (lg) er glykoproteiner med de samme strukturelle karakteristikaene. Mens antistoffer utviser bindingsspesifisitet for et spesielt antigen omfatter immunoglobuliner både antistoffer og andre antistoff-lignende molekyler som mangler antigen-spesifisitet. Polypeptider av den siste typen blir f. eks. produsert i lave nivåer av lymfesystemet, og i økte nivåer av myelomer.
"Native antistoffer" og "native immunoglobuliner" er vanligvis heterotetramere glykoproteiner på omtrent 150.000 Dalton, sammensatt av to identiske lett- (L) kjeder og to identiske tung- (H) kjeder. Hver lettkjede er koblet til en tungkjede ved et kovalent disulfid-binding, mens antallet disulfid-bindinger varierer blant tungkjedene fra ulike immunoglobulin-isotyper. Hver tung- og lett-kjede har også med jevne mellomrom intra-kjede disulfid-broer. Hver tungkjede har i ene enden et variabelt domene (Vh), fulgt av et antall konstante domener. Hver lettkjede har et variabelt domene i den ene enden (Vl), og et
konstant domene i den andre enden; det konstante domenet i lettkjeden er oppstilt etter det første konstante domenet til tungkjeden, og lettkjede variable domenet er oppstilt etter det variable domenet til tungkjeden. Spesielle aminosyre-enheter er antatt å danne en grenseflate mellom lett- og tung-kjede variable domenene (Clothia et al., J. Mol. Biol., 186: 651-663
[1985]; Novotny and Haber, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82:4592-4596 [1985]).
Begrepet "variable" refererer til det faktum at visse deler av de variable domenene i stor grad har forskjellig sekvens mellom antistoffer, og er anvendt ved binding og spesifisitet av hvert enkelt spesielle antistoff for dets spesielle antigen. Variabiliteten er imidlertid ikke jevnt fordelt gjennom de variable domene til antistoffer. Den er konsentrert i tre segmenter kalt komplementaritets-bestemmende regioner (CDR) eller hypervariable regioner både i de lettkjede og de tungkjede variable domenene. De mer høyt konserverte delene av variable domener er kalt rammeverk (FR). De variable domenene til native tung- og lett-kjeder omfatter hver fire FR-regioner, i stor grad i en P-plate-konfigurasjon, bundet sammen ved tre CDRer, som danner løkker som binder sammen, og i noen tilfeller danner en del av P-plate-strukturen. CDRene i hver kjede er holdt sammen i tett nærhet ved FR-regionene og, sammen med CDRene fra den andre kjeden, bidrar til dannelsen av antigen-bindingssetet til antistoffer (se Kabat et al., supra). De konstante domenene er ikke direkte involvert i binding av antistoff til antigen, men utviser ulike effektor-funksjoner, så som deltagelse av antistoffet i antistoff-avhengig cellulær toksisitet.
Papain-kutting av antistoffer produserer to identiske antigen-bindende fragmenter, kalt "Fab "-fragmenter, hver med et enkelt antigen-bindingssete, og et rest "Fc"-fragment, hvis navn reflekterer dets evne til enkelt å krystallisere. Pepsin-behandling gir et F(ab')2-fragment som har to antigen-kombinerende seter og som fremdeles kan kryss-koble antigen.
"Fv" er det minste antistoff-fragmentet som omfatter et komplett antigen-gjenkjennings- og -bindingssete. Denne regionen består av en dimer av et tung- og et lett-kjede variabelt domene i tett, ikke-kovalent assosiasjon. Det er i denne konfigurasjonen at tre CDRer fra hvert variable domene interagerer for å definere et antigen-bindingssete på overflaten av Vn-VL-dimeren. Kollektivt utgjør de seks CDRene antigen-bindingsspesifisitet for antistoffet. Men til og med et enkelt varibelt domene (eller halvparten av et Fv som omfatter bare tre CDRer som er spesifikke for antigenet) har imidlertid evnen til å gjenkjenne og binde antigen, selv om det skjer ved en lavere affinitet enn for hele bindingssetet.
Fab-fragmentet omfatter også det konstante domenet fra lettkjeden og det første konstante domenet (CH1) fra tungkjeden. Fab-fragmenter skiller seg fra Fab-fragmenter ved tilsetning av noen få enheter i den karboksy-terminale enden av tungkjede CHl-domenet, omfattende ett eller flere cysteiner fra antistoff-hengselsregionen. Fab'-SH er betegnelsen brukt her for Fab' hvor cystein-enheten(e) fra de konstante domenene bærer en fri tiol-gruppe. F(ab')2-antistoff-fragmenter ble opprinnelig produsert som par av Fab-fragmenter som har hengsel-cysteiner mellom dem. Andre kjemiske koblinger av antistoff-fragmenter er også kjent.
"Enkel-kjede Fv" eller "sFv" antistoff-fragmenter omfatter VH- og VL-domenene fra antistoff, hvor disse domenene er tilstede i en enkelt polypeptid-kjede. Fv-polypeptidet omfatter videre en polypeptid-linker mellom Vh- og VL-domenene som sikrer at sFVene kan danne den ønskede struktur for antigen-binding. For en oversikt over sFv, se Pluckthun, A. i The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore, red. Springer-Verlag, New York, s. 269-315 (1994).
"Lett-kjedene" fra antistoffene (immunoglobuliner) fra hvilke som helst vertebrat-arter kan tilordnes en av to klart distinkte typer, kalt kappa (k) og lambda ( k), basert på aminosyre-sekvensene til deres konstante domener.
Avhengig av aminosyre-sekvensen til det konstante domenet til deres tungkjeder kan immunoglobuliner bli tilordnet ulike klasser. Det er fem hoved-klasser av immunoglobuliner : IgA, IgD, IgE, IgG og IgM, og flere av disse kan bli videre delt inn i subklasser (isotyper), f. eks. IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA og IgA2. De tungkjede konstante domenene som korresponderer med de ulike klassene av immunoglobuliner kalles hhv. a, 8, e, y og u, Subenhet-strukturene og de tredimensjonale konfigurasjonene for ulike immunoglobulin-klasser er godt kjent.
Begrepet "antistoff er anvendt med den bredeste meningen, og dekker spesifikt enkle monoklonale antistoffer (inklusive agonist- og antagonist-antistoffer), antistoff-komposisjoner med poly-epitopisk spesifisitet, bi-spesifikke antistoffer, "diabody" og enkelt-kjede molekyler, så vel som antistoff-fragmenter (f. eks. Fab, F(ab')2 og Fv) så lenge de utviser den ønskede biologiske aktiviteten.
Begrepet "monoklonalt antistoff" som anvendt her refererer til et antistoff som er oppnådd fra en populasjon av hovedsakelig homogene antistoffer, dvs. de individuelle antistoffene som utgjør populasjonen er identiske, bortsett fra mulige naturlig forekommende mutasjoner som kan være tilstede i små mengder. Monoklonale antistoffer er meget spesifikke, idet de er rettet mot et enkelt antigenisk sete. Videre, i motsetning til konvensjonelle (polyklonale) antistoff-preparater som typisk omfatter ulike antistoffer som er rettet mot ulike determinanter (epitoper), er hvert monoklonale antistoff rettet mot en enkelt determinant på antigenet. I tillegg til deres spesifisitet er de monoklonale antistoffene fordelaktige ved at de er syntetisert ved hybridom-kultur, ikke kontaminert av andre immunoglobuliner. Det modifiserende "monoklonalet" indikerer at karakteren av antistoffet som blir anskaffet fra en hovedsakelig homogen populasjon av antistoffer, og skal ikke forstås slik at produksjon av antistoffet krever noen spesiell metode. F. eks. kan de monoklonale antistoffene som skal bli anvendt i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen bli laget ved hybridoma-metoden som først ble beskrevet av Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975), eller bli laget ved rekombinante DNA-teknikker (se f. eks. US Patent nr. 4.816.567 [Cabilly et al.]. De "monoklonale antistoffene" kan også bli isolert fra fag-antistoff-biblioteker ved å anvende teknikkene som er beskrevet i f. eks. Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) og Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991).
De foreliggende monoklonale antistoffene omfatter spesifikt "kimære" antistoffer (immunoglobuliner) hvor en del av tung- og/eller lett-kjeden er identisk med eller homolog med korresponderende sekvenser i antistoffer avledet fra en spesiell art, eller som tilhører en spesiell antistoff-klasse eller- subklasse, mens resten av kjeden(e) er identisk(e) med eller homolog(e) med korresponderende sekvenser i antistoffer som er avledet fra andre arter eller som tilhører en annen antistoff-klasse eller -subklasse, så vel som fragmenter av slike antistoffer, så lenge de utviser den ønskede biologiske aktiviteten (Cabilly et al., supra; Morrison et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81: 6851-6855 [1984]).
"Humaniserte" former av ikke-humane (f. eks. murine) antistoffer er kimære immunoglobuliner, immunoglobulin-kjeder eller fragmenter derav (slik som Fv, Fab, Fab', F(ab')2 eller andre antigen-bindende subsekvenser av antistoffer) som omfatter en minimal sekvens som er avledet fra ikke-humant immunoglobulin. I hovedsak er humaniserte antistoffer humane immunoglobuliner (mottager-antistoff) hvor enheter fra en komplementaritets-bestemmende region (CDR) fra mottageren er erstattet med enheter fra en CDR fra en ikke-human art (donor-antistoff) slik som mus, rotte eller kanin som har den ønskede spesifisiteten, affiniteten og kapasiteten. I noen tilfeller er Fv-rammeverk-enheter fra det humane immunoglobulinet erstattet med korresponderende ikke-human enheter. Videre kan humaniserte antistoffer omfatte enheter som ikke er funnet i hverken mottager-antistoffet eller i de importerte CDR- eller rammeverk-sekvensene. Disse modifiseringene er gjort for å ytterligere forbedre og optimalisere antistoffets ytelse. Generelt vil det humaniserte antistoffet omfatte hovedsakelig i det minste ett, og typisk to, variable domener, hvor alle eller de aller
fleste CDR-regionene korresponderer med de fra et ikke-humant immunoglobulin, og alle eller de aller fleste FR-regionene er de fra en human immunoglobulin-sekvens. Det humaniserte antistoffet vil også kunne omfatte i det minste en del av en immunoglobulin konstant region (Fc), typisk den fra et humant immunoglobulin. For ytterligere detaljer se Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988) og Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992). Det humaniserte antistoffet omfatter et primatisert™ antistoff hvor antigen-bindingsregionen av antistoffet er avledet fra et antistoff som er produsert ved immunisering av macaque-aper med det interessante antigenet.
"Ikke-immunogenisk hos et menneske" betyr at etter å kontakte det interessante polypeptidet eller polypeptid-varianten i en farmasøytisk aksepterbar bærer og i en terapeutisk effektiv mengde med det egnede vevet fra et menneske, kan ingen grad av sensitivitet eller motstand mot det interessante polypeptidet eller varianten demonstreres etter den andre administreringen av det interessante polypeptidet eller varianten etter en egnet latens-periode (f. eks. 8 til 14 dager).
Betegnelsen "diabodies" refererer til små antistoff-fragmenter med to antigen-bindingsseter, hvor fragmentene omfatter et tungkjede variabelt domene (Vh) koblet med en lettkjede variabel region (Vl) på den samme polypeptid-kjeden (VH - Vl). Ved å anvende en linker som er for kort til å tillate parring mellom de to domenene på den samme kjeden blir domenene tvunget til å danne par med de komplementære domenene fra en annen kjede, og skape to antigen-bindingsseter. "Diabodies" er beskrevet mer detaljert i f. eks. EP 404.097: WO 93/11161 og Holliger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90: 6444-6448 (1993).
Begrepet "LPA-I -medierte forstyrrelser" refererer til patologiske tilstander som er forårsaket av celle-adherens-interaksjoner som involverer LFA-1-reseptoren på lymfocytter. Eksempler på slike sykdommer omfatter T-celle inflammatoriske responser så som inflammatoriske hud-sykdommer omfattende psoriasis; responser som er assosiert med inflammatoriske tarmsykdommer (så som Crohns sykdom og uleerøs kolitt); voksen respiratorisk distress syndrome; dermatitt; meningitt; encefalitt; uveitt; allergiske tilstander så som eksem og astma og andre tilstander som involverer infiltrering av T-celler og kroniske inflammatoriske responser; hud-hypersensitive reaksjoner (omfattende gift-sumak og gift-eik); aterosklerose; leukocytt adhesjons-svikt; autoimmune sykdommer så som revmatiod artritt, systemisk lupus erythematosus (SLE), diabetes mellitus, multippel sklerose, Reynauds syndrom, autonom thyreoiditt, eksperimentell autoimmun encefalomyelitt, Sjøgrens syndrom, juvenil igangsatt diabetes og immunresponser som er assosiert med forsinket hypersensitivitet mediert ved cytokiner og T-lymfocytter som typisk finnes ved tuberkolose, sarkoidose, polymyositt, granulomatose og vaskulitt; pernisiøs anemi; sykdommer som involverer leukocytt diapedese; CNS inflammatoriske forstyrrelser, multi-organ-skadesyndrom etter sepsis eller trauma; autoimmun hemolyttisk anemi; myasthenia gravis; antigen-antistoff kompleks medierte sykdommer; alle typer transplantasjoner, omfattende graft-versus-host-eller host-versus-graft-sykdommer; hemorragisk sjokk; pulmonell oksygen-toksisitet; pulmonell fibrose; sår-heling; B-celle lymfomer osv.
De foretrukne indikasjonene for antistoffer mot CD1 la eller CD1 lb er psoriasis, transplantat-rejeksjon, astma, sår-heling og pulmonell fibrose; de foretrukne indikasjonene for antistoffer mot CD18 er hemorragisk sjokk, meningitt, encefalitt, multippel sklerose, astma og pulmonell oksygen-toksisitet og de foretrukne indikasjonene for antistoffer mot CD20 er B-celle lymfom.
"Behandling" refererer til både terapeutisk behandling og profylaktiske eller forebyggende mål. De som trenger behandling omfatter de som allerede har lidelsen, så vel som de som er disponert for lidelsen, eller de hvor lidelsen skal forhindres.
"Mammalsk" som behandlingsmål refererer til hvilket som helst dyr som er klassifisert som et pattedyr, omfattende mennesker, hus- og gårdsdyr, og dyr i zoologiske haver, sports-eller kjæledyr, så som hunder, hester, katter, sauer, griser, kuer, osv. Fortrinnsvis er pattedyret her et menneske.
Begrepet "LFA-1 -antagonist" refererer generelt til et antistoff rettet mot enten CD1 la eller CD18, eller begge, men omfatter også løselige former av ICAM-1 (f. eks. det ICAM-1-ekstracellulære domenet), antistoffer mot ICAM-1 og fragmenter derav, eller andre molekyler som kan hindre interaksjon mellom LFA-1 og ICAM-1.
Begrepet "anti-LFA-1-antistoff" eller "anti-LFA-1 MAb" referer til et antistoff som er rettet mot enten CD1 la eller CD18, eller begge. Anti-CDl la-antistoffene omfatter f.eks. MHM24 (Hildreth et al., Eur. J. Immunol., 13: 202-208 [1983], R3.1 (IgGl; Rothlein, Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc., Ridgefield, CT), 25-3 (eller 25,3; et IgGl som er tilgjengelig fra Immunotech, Frankrike; se Olive et al., i Feldmann, red. Human T Cell Clones. A new Approach to Immune Regulation, Clifton, NJ, Humana, [1986] s. 173), KB A (IgG2a; Nishimura et al., Cell. Immunol., 107: 32 [1987]; Nishimura et al., Cell. Immunol., 94:122 [1985]), M7/15 (IgG2b: Springer et al., Immunol. Rev., 68:171 [1982], IOT16 (Vermot Desroches et al., Scand. J. Immunol., 33: 277-286 [1991]), SPVL7 (Vermot Desroches et al., supra) og M17 (IgG2a; tilgjengelig fra ATCC, som er rotte-anti-murine CDlla-antistoffer).
Eksempler på anti-CD18-antistoffer omfatter MHM23 (Hildreth et al., supra), Ml8/2 (IgG2a; Sanches-Madrid et al., J. Exp. Med., 158: 586 [1983], H52 (Fekete et al., J. Clin. Lab Immunol, 31:145-149 [1990], Masl91c (Vermot Deroches et al., supra), IOT18 (Vermot Desroches et al., supra), 60,3 (Taylor et al., Clin. Exp. Immunol., 71: 324-328 [1988]), og 60.1 (Campana et al., Eur. J. Immunol., 16: 537-542 [1986]).
Andre eksempler på egnede LFA-1-antagonister, omfattende antistoffer, er beskrevet i Hutchings et al., Nature, 348: 639 (1990), WO 91/18011, publisert 11/28/91, WO 91/16928, publisert 11/14/91, WO 91/16927, publisert 11/14/91, Can. Patentsøknd nr. 2.008.368, publisert 6/13/91, WO 90/15076, publisert 12/13/90, WO 90/10652, publisert 9/20/90, EP 387.668 publisert 9/19/90, EP 379.904 publisert 8/1/90, EP 346.078 publisert 12/13/89, US patent nr. 5.071.964, US patent nr.5.002.869, Australia patensøknad 8815518 publisert 11/10/88, EP 289.949 publisert 11/9/88 og EP 303.692 publisert 2/22/89.
Utførelsesformer av oppfinnelsen
1. Generell beskrivelse av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse angår inkorporering av en salvage-reseptor-bindingsepitop fra Fc-regionen av et IgG i et interessant polypeptid, for slik å øke dens sirkulatoriske halveringstid, men slik at den ikke mister den biologiske aktiviteten. Dette kan skje på hvilke som helst måter, slik som ved mutering av den egnede regionen i polypeptidet av interesse for å etterligne Fc-regionen, eller ved å inkorporere epitopen i en peptid-tag som så blir fusert med det interessante polypeptidet ved hvilken som helst ende, eller i midten, eller ved DNA-eller peptid-syntese.
En systematisk metode for å fremstille en slik polypeptid-variant som har en økt in vivø-halveringstid omfatter flere trinn. Det første involverer identifiseringen av sekvensen og konformasjonen til en salvage-reseptorbindingsepitope på en Fc-region fra et IgG-molekyl. Når denne epitopen er identifisert blir sekvensen i det interessante polypeptidet modifisert til å omfatte sekvensen og konformasjonen til den identifiserte bindingsepitopen. Etter at sekvensen er mutert blir polypeptid-varianten testet for å se om den har en lengre in vivo halveringstid enn den til det originale polypeptidet, dvs. det interessante polypeptidet. Hvis polypeptid-varianten ikke har en lenger in vivo halveringstid ved testing blir dens sekvens videre endret for å omfatte sekvensen og konformasjonen til den identifiserte bindingsepitopen. Det endrede polypeptidet blir testet for lengre in vivo halveringstid, og denne prosessen fortsettes til det er oppnådd et molekyl som utviser en lengre in vivo-halveringstid.
Salvage-reseptor-bindingsepitopen som således blir inkorporert i det interessante polypeptidet er hvilken som helst egnet slik epitope som definert ovenfor, og dens natur vil f. eks. avhenge av typen polypeptid som blir modifisert. Overføringen er gjort slik at den biologiske aktiviteten til det interessante polypeptidet opprettholdes, dvs. at den overførte delen ikke uheldig påvirker konformasjonen til det interessante polypeptidet eller påvirker dens binding til ligander, som gir dens biologiske aktivitet. F. eks. hvis det interessante polypeptidet er et antistoff blir ikke spytt-reseptor bindingsepitopen plassert slik at det påvirker et antigen-bindingssete i antistoffet.
Det er foretrukket at det interessante polypeptidet omfatter et Ig-domene eller et Ig-lignende domene, og at befrielse-reseptor-bindingsepitopen er plassert slik at den er lokalisert innen dens Ig-domene eller det Ig-lignende domenet. Mer foretrukket utgjør epitopen en region hvor hvilken som helst av eller flere aminosyre-enheter fra en eller to løkker fra Fc-domenet er overført til en analog posisjon i Ig-domenet eller det Ig-lignende domenet i det interessante polypeptidet. Enda mer foretrukket er tre eller flere enheter fra en eller to løkker fra Fc-domenet overført. Mer foretrukket er epitopen tatt fra CH2-domenet fra Fc-regionen (f. eks. fra et IgG) og overført til CH1-, CH3- eller Vn-regionen, eller mer enn én slik region, til et lg- eller til et Ig-lignende domene. Alternativt er epitopen tatt fra CH2-domenet fra Fc-regionen, og overført til CL-regionen eller VL-regionen, eller begge, av et lg- eller til et Ig-lignende domene fra det interessante polypeptidet.
For f. eks. å diskutere varianter hvor det interessante polypeptidet er anti-CD18, henvises til figur 2, som illustrerer de relevante konsensus primære strukturene fra ulike Iger, dvs. human IgGl CHl-domenet, human IgG2 CHl-domenet, human IgG3 CHl-domenet, human IgG4 CHl-domenet, human kappa CL-domenet og human lambda CL-domenet, så vel som de spesifikke sekvensene for Fab v lb, en foretrukket anti-CD18 Fab-variant her. Videre indikerer Fig. 2 de enhetene i Fab v lb som er interessante og viktige. Ved en foretrukket utførelsesform er de viktige enhetene de som er merket med en stjerne i fig. 2, dvs. i en løkke fra Fab v lb, MIS med en T-enhet en aminosyre C-terminalt for MIS, og i en annen løkke fra Fab v lb, HQN med en D-enhet to aminosyrer C-terminalt for HQN og en K-enhet en aminosyre C-terminalt for D-enheten.
Ved en mer foretrukket utførelsesform omfatter salvage-reseptor-bindingsepitopen sekvensen (5' til 3'):
PKNSSMISNTP (SEKV ID NR.: 3),
og kan videre omfatte en sekvens som er valgt fra gruppen bestående av HQSLGTQ (SEKV ID NR.: 11), HQNLSDGK (SEKV ID NR.: 1), HQNISDGK (SEKV ID NR.: 2) eller VISSHLGQ (SEKV ID NR.: 31), spesielt hvor det interessante polypeptidet er et Fab eller (Fab')2.
Ved en annen mer foretrukket utførelsesform er spytt-reseptor-bindingsepitopen et
polypeptid som ikke er et Fc som inneholder sekvensen(e) (5' til 3'): HQNLSDGK (SEKV ID NR.: 1), HQNISDGK (SEKV ID NR.: 2) eller VISSHLGQ (SEKV ID NR.: 31) og sekvensen: PKNSSMISNTP (SEKV ID NR.: 3). Denne epitopen er passende fusert med det interessante polypeptidet, og ved et foretrukket aspekt beholdt på et peptid som er fusert med det interessante polypeptidet. Eksempler på interessante polypeptider som er egnet for dette målet omfatter de som vil ha en endret sekundær eller tertiær struktur, med negative konsekvenser, hvis sekvensen der er mutert, slik som vekst-hormon eller nerve-vekst-faktor.
Ved en utførelsesform kan variantene bli fremstilt ved rekombinante midler. Nukleinsyre som koder for varianten er således fremstilt, plassert i en replikerbar vektor, og vektoren er anvendt for å transfektere eller transformere egnede vertsceller for ekspresjon. Polypeptid-varianten er produsert ved å dyrke vertscellene i et kulturmedium og gjenvinne polypeptid-varianten fra vertscelle-kulturen.
Hvis polypeptid-varianten sekreteres blir den gjenvunnet fra kultur-mediumet. Ved en annen utførelsesform er polypeptid-varianten fremstilt ved å endre et interessant polypeptid som er renset av nyrene, og som ikke inneholder en Fc-region fra et IgG slik at det omfatter en befrielse-reseptor-bindingsepitope fra en Fc-region fra et IgG og som har en økt in vivo-halveringstid. Dette endrende trinnet utføres fortrinnsvis ved Kunkel-, sete-dirigert-, kassett-eller PCR-mutagenese. Kunkel-mutagenese er beskrevet f. eks. av Kunkel, Proe. Nati. Acad. Sei. USA., 82:488-492 (1985).
2. Fremstilling av interessante pol<y>peptider og deres varianter.
Mesteparten av diskusjonen nedenfor angår produksjon av det interessante polypeptidet eller polypeptid-varianten ved å dyrke celler som er transformert med en vektor som inneholder nukleinsyren som koder for det interessante polypeptidet eller polypeptid-varianten, og gjenvinning av det interessante polypeptidet eller varianten fra cellekulturen. Det er videre antatt at det interessante polypeptidet kan produseres ved homolog rekombinasjon, som gitt i WO 91/06667, publisert 16. mai 1991. Denne metoden omfatter transformering av primære pattedyrceller som inneholder det endogene polypeptidet (f. eks. humane celler hvis det ønskede polypeptidet er fra menneske) med et konstrukt (dvs. vektor) som omfatter et amplifiserbart gen (så som dihydrofolat reduktase [DHFR] eller andre som beskrevet nedenfor) og i det minste en flankerende region som er minst omtrent 150 bp lang som er homolog med en DNA-sekvens ved lokuset av den kodende regionen fra genet av det interessante polypeptidet, for å tilveiebringe amplifisering av genet som koder for det interessante polypeptidet. Det amplifiserbare genet må være i et sete som ikke påvirker uttrykket av genet som koder for det interessante polypeptidet. Transformasjonen er utført slik at konstruktet blir homologt integrert i genomet til de primære cellene for slik å definere en amplifiserbar region.
Primære celler som omfatter konstruktet blir så selektert for ved help av det amplifiserbare genet, eller andre markører som er tilstede i konstruktet. Tilstedeværelsen av markørgenet etablerer tilstedeværelsen og integreringen av konstruktet i verts-genomet. Ingen videre seleksjon av de primære cellene trengs, siden seleksjon vil bli gjort i den andre verten. Dersom det er ønsket kan forekomsten av den homologe rekombinasjons-begivenheten bli bestemt ved å anvende PCR, og enten sekvensere den resulterende amplifiserte DNA-sekvensen eller å bestemme den ønskede lengden av PCR-fragmentet når DNA fra korrekte homologe integreringer er tilstede, og ekspandere bare de celler som inneholder slike fragmenter. Hvis det er ønskelig kan altså de selekterte cellene bli amplifisert ved dette punktet ved å stresse cellene med det egnede amplifiserende agenset (så som metotreksat hvis det amplifiserbare genet er DHFR), slik at flere kopier av mål-genet oppnås. Det er imidlertid foretrukket at amplifiseringstrinnet ikke blir utført før etter den andre transformasjonen som er beskrevet nedenfor.
Etter seleksjonstrinnet blir DNA-deler av genomet, som er tilstrekkelig store til å omfatte hele den amplifiserbare regionen, isolert fra de selekterte primære cellene. Sekundære mammalske ekspresjons-vertsceller blir så transformert med disse genomiske DNA-delene og klonet, og klonene som innholder den amplifiserbare regionen blir selektert. Den amplifiserbare regionen blir så amplifisert ved help av et amplifiserende agens, hvis den ikke allerede ble amplifisert i de primære cellene. Til slutt blir de sekundære ekspresjons-vertscellene som nå omfatter flere kopier av den amplifiserbare regionen som inneholder det
interessante polypeptidet dyrket for slik å uttrykke genet og produsere polypeptidet.
A. Isolering av DNA som koder for et polypeptid av interesse
DNA som koder for det interessante polypeptidet kan bli anskaffet fra hvilket som helst cDNA-bibliotek som er fremstilt fra vev som er antatt å ha mRNA som koder for det interessante polypeptidet, og å uttrykke det ved et detekterbart nivå. Genet som koder for det interessante polypeptidet kan også oppnås fra et genomisk bibliotek eller ved in vitro oligonukleotid-syntese, gitt at den komplette nukleotid- eller aminosyre-sekvensen er kjent.
Biblioteker blir undersøkt med prober som er laget for å identifisere det interessante genet eller proteinet som er kodet av det. For cDNA-ekspresjonsbiblioteker omfatter egnede prober monoklonale eller polyklonale antistoffer som gjenkjenner og spesifikt binder det interessante polypeptidet; oligonukleotider som er omtrent 20-80 baser lange som koder for kjente eller forventede deler av cDNAet som koder for det interessante polypeptidet fra den samme eller andre arter; og/eller komplementære eller homologe cDNAer eller fragmenter derav som koder for det samme eller et lignende gen. Egnede prober for å undersøke genomiske DNA-biblioteker omfatter, men er ikke begrenset til, oligonukleotider, cDNAer eller fragmenter derav som koder for det samme eller et lignende gen, og/eller homologe genomiske DNAer eller fragmenter derav. Undersøkelse av cDNA- eller genomisk bibliotek med den valgte proben kan bli utført ved å anvende standard prosedyrer som beskrevet i kap. 10-12 i Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
En alternativ metode for å isolere genet som koder for det interessante polypeptidet er å anvende PCR-teknologi som beskrevet i seksjon 14 i Sambrook et al., supra. Denne metoden krever anvendelse av oligonukleotid-prober som vil hybridisere med det interessante polypeptidet. Strategier for seleksjon av oligonukleotider er beskrevet nedenfor.
En foretrukket metode for å utføre foreliggende oppfinnelse er å anvende nøye utvalgte oligonukleotid-sekvenser for å undersøke cDNA-biblioteker fra ulike vev.
Oligonukleotid-sekvensene som er valgt som prober bør ha en tilstrekkelig lengde og være tilstrekkelig utvetydig slik at falske positiver er minimalisert. Den (de) aktuelle nukleotidsekvensen(e) er vanligvis basert på konserverte eller meget homologe nukleotid-sekvenser. Oligonukleotidene kan være degenererte ved en eller flere posisjoner. Anvendelsen av degenererte oligonukleotider kan være spesielt viktig når det undersøkes et bibliotek fra en art hvor den foretrukne kodon-bruken ikke er kjent.
Oligonukleotidet må merkes slik at det kan bli detektert ved hybridisering med DNA i biblioteket som skal undersøkes. Den foretrukne metoden for merking er å anvende P-merket ATP med polynukleotid-kinase, som er velkjent innen feltet, for å radiomerke oligonukleotidet. Andre metoder kan imidlertid bli anvendt for å merke oligonukleotidet, omfattende, men ikke begrenset til, biotinylering eller enzym-merking.
Av spesiell interesse er nukleinsyren som koder for det interessante polypeptidet som koder for et full-lengde polypeptid. Ved noen foretrukne utførelsesformer omfatter nukleinsyre-sekvensen det interessante polypeptidets signalsekvens. Nukleinsyre med hele den protein-kodende sekvensen er oppnådd ved å undersøke valgte cDNA- eller genomiske biblioteker ved å anvende den deduserte aminosyre-sekvensen gitt her for første gang, og hvis nødvendig, ved å anvende konvensjonelle primer-ekstensjons-prosedyrer som beskrevet i seksjon 7,79 i Sambrook et al., supra, for å bestemme forløpere og prosesserings-intermediater av mRNA som kanskje ikke er blitt revers-transkribert til cDNA.
B. Fremstilling av varianter av det interessante pol<y>peptidet
Variantene av det interessante polypeptidet blir passende fremstilt ved å introdusere egnede nukleotid-endringer som angitt ovenfor i Fc-regionen i DNAet som koder for det interessante polypeptidet, eller ved in vitro syntese av den ønskede polypeptid-varianten. Slike varianter omfatter f. eks. delesjoner av, eller insersjoner eller substitusjoner av enheter innen aminosyre-sekvensen til det interessante polypeptidet slik at det omfatter den egnede epitopen, og har en lenger halveringstid i serum. Hvilken som helst kombinasjon av delesjon, insersjon og substitusjon er gjort for å nå det endelige konstruktet, gitt at det endelige konstruktet utviser de ønskede egenskapene. Aminosyre-endringene kan også endre post-translasjonelle prosesser av det interessante polypeptidet, slik som endring av antall eller posisjon av glykosyleringsseter. Som for de fleste mammalske gener kan det interessante polypeptidet være kodet av fler-ekson-gener.
For designet av aminosyre-sekvensvarianter av det interessante polypeptidet vil lokaliseringen av det muterte setet og naturen av mutasjonen bli bestemt av det spesifikke interessante polypeptidet som blir modifisert. F. eks. vil et immunoglobulin eller irnmunoglobulin-lignede domene bli initielt modifisert ved å lokalisere løkker som er strukturelt like med de to løkkene i IgG CH2 som omfatter spytt-reseptor-epitopen. Setene for mutasjon kan bli modifisert individuelt eller i serier, f. eks. ved (1) å erstatte først med konservative aminosyre-valg og så med mer radikale valg, avhengig av resultatene som oppnås, (2) å deletere mål-enheten eller (3) å sette inn enheter fra den samme eller en forskjellig klasse ved siden av det lokaliserte setet, eller kombinasjoner av mulighetene 1-3.
En nyttig metode for identifisering av visse enheter eller regioner i det interessante polypeptidet som er foretrukne lokaliseringer for mutagenese er kalt "alanin-undersøkelses-mutagenese", som beskrevet av Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989). Her blir en enhet eller en gruppe mål-enheter identifisert (f. eks. ladde enheter så som arg, asp, his, lys og glu) og erstattet av en nøytral eller negativt ladet aminosyre (fortrinnsvis alanin eller polyalanin) for å påvirke interaksjonen av aminosyrene med det omkringliggende vandige miljøet i eller utenfor cellen. De domenene som viser funksjonell sensitivitet for substitusjonene blir så forbedret ved å introdusere ytterligere eller andre varianter ved eller for setene for substitusjon. Mens setet for å introdusere en aminosyre-sekvens-variasjon er forhåndsbestemt trenger ikke naturen av mutasjonen per se å være forhåndsbestemt. F. eks. for å optimalisere utførelsen av en mutasjon et gitt sted blir alanin-undersøkelse eller tilfeldig mutagenese utført på mål-kodonet eller regionen, og variantene som blir produsert undersøkt for økt sirkulatorisk halveringstid.
Aminosyresekvens-delesjoner rekker generelt omtrent fra 1 til 30 enheter, mer foretrukket omtrent 1 til 10 enheter, og er vanligvis tilgrensende. Tilgrensende delesjoner blir vanligvis gjort i et likt antall av enheter, men enkle eller ulike antall av delesjoner er innenfor rammen her. Som et eksempel kan delesjoner gjøres i regioner med lav homologi mellom LFA-1-antistoffer som deler den største sekvenslikheten med aminosyre-sekvensen til det interessante polypeptidet for å modifisere halveringstiden til polypeptidet. Delesjoner fra det interessante polypeptidet i områder med utstrakt homologi med ett av bindingssetene til andre ligander vil mer sannsynlig modifisere den biologiske aktiviteten til det interessante polypeptidet mer signifikant. Antallet påfølgende delesjoner vil bli valgt for å bevare den tertiære strukturen av det interessante polypeptidet i det affiserte domenet, f. eks. beta-foldete-ark eller alfa-heliks.
Aminosyresekvens-insersjoner omfatter amino- og/eller karboksyl-terminale fusjoner som rekker i lengde fra en enhet til polypeptider som omfatter hundre eller flere enheter, så vel som intra-sekvens-insersjoner av enkle eller flere aminosyre-enheter. Intrasekvens-insersjoner (dvs. insersjoner innen den modne polypeptid-sekvensen) kan rekke generelt fra omtrent 1 til 10 enheter, mer foretrukket 1 til 5 og mest foretrukket 1 til 3. Insersjoner blir fortrinnsvis gjort i likt antall enheter, men dette er ikke nødvendig. Eksempler på insersjoner omfatter insersjoner i den interne delen av det interessante polypeptidet, så vel som N- eller C-terminale fusjoner med proteiner eller peptider som omfatter den ønskede epitopen som, etter fusjonen, vil resultere i øket halveringstid.
En tredje gruppe varianter er aminosyre-substitusjonsvarianter. Disse variantene har i det minste én aminosyre-enhet i polypeptid-molekylet fjernet og en annen enhet satt inn på dens plass. Setene av størst interesse for substitusjons-mutagenese omfatter én eller to løkker i antistoffer. Andre interessante seter er de hvor spesielle enheter i polypeptidet, som er oppnådd fra ulike arter, er identiske blandt alle dyre-arter av det interessante polypeptidet, denne graden av konservering antyder betydningen av å oppnå biologisk aktivitet som er felles for disse molekylene. Disse setene, spesielt de som ligger i en sekvens med i det minste tre andre identisk konserverte seter, er erstattet på en relativt konservativ måte. Slike konservative substitusjoner er vist i tabell 1 under overskriften foretrukne substitusjoner. Hvis slike substitusjoner resulterer i en endring av biologisk aktivitet blir så mer grunnleggende endringer, betegnet eksempel-substitusjoner i tabell 1, eller som videre beskrevet nedenfor med referanse til aminosyre-klassen, introdusert og produktene undersøkt.
Grunnleggende modifikasjoner i funksjonen til det interessante polypeptidet er utført ved å velge substitusjoner som skiller seg betydelig i deres effekt på opprettholdelse av (a) strukturen av polypeptidets ryggrad i området for substitusjonen, f. eks. som en plate- eller en heliks-konformasjon, (b) ladningen eller hydrofobisiteten av molekylet ved målsetet, eller (c) omfanget av sidekjeden. Naturlig forekommende enheter er delt i grupper basert på vanlige sidekjede-egenskaper: (1) hydrofobe: norleucin, met, ala, val, leu, ile; (2) nøytrale hydrofile: cys, ser, thr; (3) sure: asp, glu; (4) basiske: asn, gin, his, lys, arg;
(5) enheter som påvirker kjede-orientering: gly, pro; og
(6) aromatiske: trp, tyr, phe.
Ikke-konservative substitusjoner omfatter utbytting av et medlem av en av disse klassene med en annen klasse. Slike erstattede enheter kan også bli introdusert i de konservative substitusjons-setene, eller fortrinnsvis i de gjenværende (ikke-konserverte) setene.
Det kan være ønskelig å inaktivere en eller flere proteinase-spaltningsseter som er tilstede i molekylet. Disse setene er identifisert ved inspeksjon av den kodede aminosyre-sekvensen, i tilfellet med trypsin, f eks. for en arginyl- eller lysinyl-enhet. Når protease-spaltningsseter er identifiserte blir de gjort inaktive mot proteolytisk spaltning ved å erstatte mål-enheten med en annen enhet, fortrinnsvis en basisk enhet så som glutamin eller en hydrofil enhet så som serin; ved å deletere enheten; eller ved å sette inn en prolyl-enhet rett etter enheten.
Ved en annen utførelsesform blir alle metionyl-enheter bortsett fra den startende metionyl-enheten i signalsekvensen, eller hvilken som helst enhet lokalisert innen omtrent tre enheter N- eller C-terminalt for hver slik metionyl-enhet, erstattet med en annen enhet (fortrinnsvis i samsvar med tabell 1) eller deletert. Alternativt blir omtrent 1-3 enheter satt inn ved siden av slike seter.
Alle cystein-enheter som ikke er involvert i å opprettholde den riktige konformasjonen av det interessante polypeptidet kan også bli erstattet, generelt med serin, for å forbedre den oksydative stabiliteten til molekylet og forhindre avvikende kryss-kobling.
Ved den første utførelsesformen blir nukleinsyre-molekyler som koder for aminosyre-sekvens-varianter av det interessante polypeptidet fremstilt ved en rekke metoder som er kjent innen feltet. Disse metodene omfatter, men er ikke begrenset til, fremstilling av oligonukleotid-mediert- (eller sete-dirigert) mutagenese, PCR-mutagense og kassett-mutagenese av en tidligere fremstilt variant eller en ikke-variant-versjon av polypeptidet på hvilket varianten her er basert ("det interessante polypeptidet").
Oligonukleotid-mediert mutagenese er en foretrukket metode for å fremstille substitusjons-, delesjons- og insersjons-polypeptid-varianter gitt her. Denne teknikken er velkjent innen feltet som beskrevet av Adelman et al., DNA, 2: 183 (1983). DNA er endret ved å hybridisere et oligonukleotid som koder for den ønskede mutasjonen til et DNA-templat, hvor templatet er den enkelttrådete formen av et plasmid eller en bakteriofag som omfatter den uendrete eller native DNA-sekvensen til polypeptidet som skal endres. Etter hybridisering blir en DNA-polymerase anvendt for å syntetisere en hel andre komplementær tråd av templatet, som således vil omfatte oligonukleotid-primeren og som vil kode for den valgte endringen i DNA.
Generelt blir oligonukleotider som er minst 25 nukleotider lange anvendt. En optimal oligonukleotid vil ha 12 til 15 nukleotider som er fullstendig komplementære med templatet på hvilken som helst av sidene av nukleotidet(nukleotidene) som koder for mutasjonen. Dette sikrer at oligonukleotidet vil hybridisere riktig med det enkelttrådete DNA-templat-molekylet. Oligonukleotidene blir lett syntetisert ved å anvende teknikker som er kjent innen feltet, som den beskrevet av Crea et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 75: 5765 (1978).
DNA-templatet kan bli generert ved de vektorer som enten er avledet fra bakteriofag M13-vektorer (den kommersielt tilgjengelige M13mpl8- og M13mpl9-vektorene er egnede), eller de vektorer som omfatter en enkelttråd-fagorigo for replikasjon som beskrevet av Viera et al., Meth. Enzymol., 153: 3 (1987). DNAet som skal muteres kan således bli satt inn i en av disse vektorene for å generere enkelttrådet templat. Produksjon av det enkelttrådete templatet er beskrevet i seksjon 4.21-4.41 i Sambrook et al., supra.
Alternativt kan enkelttrådet DNA-templat bli generert ved å denaturere dobbelttrådet plasmid (eller annet) DNA ved å anvende standard teknikker.
For endring av den originale DNA-sekvensen for å fremstille polypeptid-variantene ifølge denne oppfinnelsen blir oligonukleotidet hybridisert med det enkelttrådete templatet under passende hybridiseringsbetingelser. Et DNA-polymeriseringsenzym, normalt kalt Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I, blir så satt til for å syntetisere den komplementære tråden av templatet ved å anvende oligonukleotidet som en primer for syntese. Et heteroduplekst molekyl blir så dannet slik at en tråd av DNA koder for den muterte formen av polypeptidet, og den andre tråden (det originale templatet) koder for den originale, ikke-endrete sekvensen av polypeptidet. Dette heterodupleks-molekylet blir så transformert i en egnet vertscelle, vanligvis en prokaryot så som E. coli JM101. Etter at cellene er dyrket blir de platet ut på agarose-plater og undersøkt ved å anvende oligonukleotid-primer som er radiomerket med <32>P for å identifisere de bakterielle koloniene som omfatter det muterte DNA. Den muterte regionen blir så fjernet og plassert i en passende vektor for protein-produksjon, vanligvis en ekspresjonsvektor av typen som ofte er anvendt for transformasjon av en egnet vert.
Metoden beskrevet umiddelbart ovenfor kan bli modifisert slik at et homoduplekst molekyl skapes hvor begge trådene av plasmidet omfatter mutasjonen(e). Modifiseringene er som følger: Det enkelttrådete oligonukleotidet blir annealet med det enkelttrådete templatet som beskrevet ovenfor. En blanding av tre deoksyribonukleotider, deoksyriboadenosin (dATP), deoksyriboguanosin (dGTP) og deoksyribotymidin (dTTP), blir kombinert med en modifisert tio-deoksyribocytosin kalt dCTP- (otS) (som kan anskaffes fra the Amersham Corporation). Denne blandingen settes til templat-oligonukleotid-komplekset. Etter tilsetning av DNA-polymerase til denne blandingen blir en DNA-tråd som er identisk med templatet, bortsett fra de muterte basene, generert. I tillegg vil denne nye DNA-tråden inneholde dCTP-(otS) istedenfor dCTP, som vil beskytte den fra restriksjons-endonuklease-kutting.
Etter at templat-tråden i den dobbelttrådete heterodupleksen er "nicket" med et egnet restriksjons-enzym kan templat-tråden brytes ned med Æroffi-nuklease eller andre egnede nukleaser over regionen som omfatter setet(setene) som skal mutageniseres. Reaksjonen stoppes så for å etterlate et molekyl som bare er delvis enkelttrådet. En komplett dobbelttrådet DNA-homodupleks blir så dannet ved å anvende DNA-polymerase i nærvær av alle fire deoksyribonuklcotid-trifosfatcne, ATP og DNA-ligase. Dette homodupleks-molekylet kan så bli transformert i en egnet vertscelle så som E. coli JM101, som beskrevet ovenfor.
DNA som koder for polypeptid-mutanter med mer enn én aminosyre som skal erstattes, kan bli generert på en av flere måter. Hvis aminosyrene er lokalisert tett sammen i polypeptid-kjeden kan de muteres samtidig ved å anvende et oligonukleotid som koder for alle de ønskede aminosyre-substitusj onene. Hvis aminosyrene er lokalisert litt vekk fra hverandre (separert ved mer enn omtrent ti aminosyrer) er det imidlertid vanskeligere å generere et enkelt oligonukleotid som koder for alle de ønskede endringene. Istedenfor kan en av to alternative metoder anvendes.
Ved den første metoden blir et separat oligonukleotid generert for hver aminosyre som skal bli erstattet. Oligonukleotidene blir så annealet med det enkelttrådete DNA-templatet samtidig, og den andre DNA-tråden som blir syntetisert fra templatet vil kode for alle de ønskede aminosyre-substitusjonene.
Den alternative metoden omfatter to eller flere runder med mutagenese for å produsere den ønskede mutanten. Den første runden er som beskrevet for enkelt-mutantene; villtype-DNA er anvendt som templat, et oligonukleotid som koder for den første ønskede aminosyre-substitusjonene) er annealet med dette templatet, og heterodupleks DNA-molekylet blir så generert. Den andre runden med mutagenese anvender det muterte DNA som ble produsert i den første runden med mutagenese som templatet. Dette templatet inneholder således allerede én eller flere mutasjoner. Oligonukleotidet som koder for den(de) ytterligere ønskede aminosyre-substitusjonen(e) blir så annealet med dette templatet, og den resulterende DNA-tråden koder nå for mutasjoner fra både den første og den andre runden med mutagenese. Dette resulterende DNA kan bli anvendt som et templat i en tredje runde med mutagenese osv.
PCR-mutagenese er også egnet for å lage aminosyre-varianter ifølge denne oppfinnelsen. Mens den følgende diskusjonen refererer til DNA, er det forstått at denne teknikken også kan anvendes med RNA. PCR-teknikken refererer generelt til den følgende prosedyren, (se Erlich, supra, kapittelet av R. Higuchi, s. 61-70): Når små mengder templat-DNA anvendes som startmateriale i en PCR kan primere som skiller seg noe i sekvens fra den korresponderende regionen i templat-DNAet bli anvendt for å generere relativt store mengder av et spesifikt DNA-fragment som skiller seg fra templat-sekvensen bare ved posisjoner hvor primeren skiller seg fra templatet. For introduksjon av en mutasjon i et plasmid-DNA, blir en av primerene designet for å overlappe posisjonen for mutasjonen, og omfatte mutasjonen: sekvensen av den andre primeren må være identisk med en bit av sekvensen fra den motsatte tråden av plasmidet, men denne sekvensen kan være lokalisert hvor som helst langs plasmid-DNAet. Det er imidlertid foretrukket at sekvensen av den andre primeren er lokalisert innen 200 nukleotider fra den første, slik at hele den amplifiserte regionen av DNA bundet av primerene til slutt lett kan sekvenseres. PCR-amplifisering ved å anvende et primerpar likt med det som akkurat er beskrevet, resulterer i en populasjon av DNA-fragmenter som adskiller seg ved posisjonen for mutasjonen som er spesifisert av primeren, og muligens ved andre posisjoner, ettersom templat-kopiering har en viss feilrate.
Hvis forholdet templat til produktmateriale er ekstremt lavt har de aller fleste produkt DNA-fragmentene inkorporert den(de) ønskede mutasjonen(e). Dette produkt-materialet blir anvendt for å erstatte den korresponderende regionen i plasmidet som fungerte som PCR-templat ved å anvende standard DNA-teknologi. Mutasjoner ved separate posisjoner kan bli introdusert samtidig ved enten å anvende en andre mutant primer, eller ved å utføre en andre PCR med ulike muterte primere, og ligere de to resulterende PCR-fragmentene samtidig med vektor-fragmentet i en tre- (eller flere) parts ligering.
Ved et spesifikt eksempel på PCR-mutagenese blir templat plasmid-DNA (1 ug) linearisert ved å kutte med en restriksjons-endonuklease som har et unikt gjenkjenningssete i plasmid-DNAet utenfor regionen som skal bli amplifisert. Av dette materialet blir 100 ng satt til en PCR-blanding som inneholder PCR-buffer, som omfatter de fire deoksynukleotid-trifosfåtene, og er inkludert i GeneAmpO-settet (anskaffet fra Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT and Emeryville, CA) og 25 pmol av hver oligonukleotid-primer, til et endelig volum på 50 ul. Reaksjonsblandingen får et lag av 35 ul mineralolje over seg. Reaksjonsblandingen blir denaturert i fem minutter ved 100°C, plassert kort på is og så tilsatt 1 ul Thermus aquaticus ( Taq) DNA-polymerase (5 enheter/ul, anskaffet fra Perkin-Elmer Cetus) under mineralolje-laget. Reaksjonsblandingen blir så satt inn i en DNA Thermal Cycler (anskaffet fra Perkin_Elmer Cetus) som er programmert som følger:
2 min 55°C
30 sek. 72°C, så 19 sykler med det følgende:
30 sek. 94°C
30 sek. 55°C, og
30 sek. 72°C.
Ved slutten av programmet blir reaksjonsrøret fjernet fra varme-sykleren og den vandige fasen overført til et nytt rør, ekstrahert med fenol/kloroform (50:50 vol) og etanol-utfelt og DNA blir gjenvunnet ved standard prosedyrer. Dette materialet blir deretter gitt de egnede behandlinger for å settes inn i en vektor.
En annen metode for å fremstille varianter, kassett-mutagenese, er basert på teknikken beskrevet av Wells et al., Gene, 34: 315 (1985). Start-materialet er plasmidet (eller annen vektor) som omfatter DNAet som skal muteres. Kodonet(kodonene) i DNAet som skal muteres identifiseres. Det må være et unikt restriksjonsendonuklease-sete på hver side av det(de) identifiserte mutasjons-setet(setene). Hvis det ikke er noen slike restriksjonsseter kan de bli generert ved å anvende den ovenfor beskrevne oligonukleotid-medierte mutagenese-metoden for å introdusere dem ved egnede lokalisasjoner i DNAet. Etter at restriksjonssetene er introdusert i plasmidet, blir plasmidet kuttet ved disse setene for å linearisere det. Et dobbelttrådet oligonukleotid som koder for sekvensen av DNAet mellom restriksjonssetene, men som omfatter den(de) ønskede mutasjonen(e) blir syntetisert ved å anvende standard prosedyrer. De to trådene er syntetisert separat og så hybridisert sammen ved standard teknikker. Dette dobbelttrådete oligonukleotidet er referert til som kassetten. Denne kassetten er designet for å ha 3'- og 5'-ender som er kompatible med endene til det lineariserte plasmidet, slik at det kan bli direkte ligert i plasmidet. Dette plasmidet inneholder nå den muterte DNA-sekvensen.
C. Insersion av nukleins<y>re i replikerbar vektor
Nukleinsyren (f. eks. cDNA eller genomisk DNA) som koder for polypeptid-varianten er satt inn i en replikerbar vektor for videre kloning (amplifisering av DNAet) eller for
ekspresjon. Mange vektorer er tilgjengelige, og valget av den passende vektoren vil avhenge av 1) om den skal bli anvendt for DNA-amplifisering eller for DNA-ekspresjon, 2) størrelsen på nukleinsyren som skal settes inn i vektoren og 3) vertscellen som skal bli transformert med vektoren. Hver vektor omfatter ulike komponenter avhengig av dens funksjon (amplifikasjon av DNA eller ekspresjon av DNA) og vertscellen som den er kompatibel med. Vektor-komponentene omfatter generelt, men er ikke begrenset til, én eller flere av følgende: en signalsekvens, et replikasjonsorigo, ett eller flere markørgener, ett enhancer-element, en promoter og en transkripsjons-termineringssekvens.
(i) Signalsekvens-komponent
Polypeptid-variantene ifølge foreliggende oppfinnelse kan ikke produseres bare direkte, men også som en fusjon med et heterologt polypeptid, fortrinnsvis en signalsekvens eller annet polypeptid som har et spesifikt spaltningssete ved N-terminalen i den modne polypeptid-varianten. Generelt kan signalsekvensen være en komponent av vektoren, eller den kan være en del av DNAet som settes inn i vektoren. Den heterologe signalsekvensen som velges bør være en som blir gjenkjent og prosessert (dvs. spaltet av en signal-peptidase) hos vertscellen. For prokaryote vertsceller som ikke gjenkjenner og prosesserer den interessante polypeptid-signalsekvensen er signalsekvensen erstattet med en prokaryot signalsekvens, som f. eks. er valgt fra gruppen bestående av alkalisk fosfatase, penicillinase, lpp eller varmestabil enterotoksin U-leadere. For sekresjon i gjær kan den originale eller villtype signalsekvensen bli erstattet med f. eks. gjær invertase-leader, gjær alfafaktor-leader (omfattende Saccharomyces og Kluyveromyces oc-faktor-leadere, den siste beskrevet i US. patent nr. 5.010.182, bevilget 23. April 1991), gjær sur-fosfatase-leader, mus spytt-amylase-leader, karboksypeptidase-leader, gjær BARl-leader, Humincola languinosa lipase-leader, C. albicans glukoamylase-leader (EP 362.179, publisert 4. april 1900) eller signalsekvensen beskrevet i WO 90/13646, publisert 15 november 1990. Ved mammalsk celle-ekspresjon er den originale humane signalsekvensen (dvs. polypeptidets presekvens som normalt styrer sekresjonen av det native, interessante polypeptidet hvorfra den interessante varianten er avledet fra humane celler in vivo) tilfredsstillende, selv om andre mammalske signalsekvenser kan være egnet, så som signalsekvenser fra andre animalske polypeptider og signalsekvenser fra sekreterte polypeptider fra den samme eller relaterte arter, så vel som virale sekretoriske leadere, f. eks. herpes simpleks gD-signalet.
DNAet for slike forløper-regioner er ligert i leseramme med DNA som koder for den modne polypeptid-varianten.
( ii) Replikasionsorigo- komponent
Både ekspresjons- og kloningsvektorer omfatter en nukleinsyre-sekvens som sikrer at vektoren replikerer i en eller flere valgte vertsceller. Generelt for kloningsvektorer er denne sekvensen en som sikrer at vektoren replikerer uavhengig av vertens kromosomale DNA, og omfatter replikasjonsorigo eller autonome replikerende sekvenser. Slike sekvenser er velkjent for en rekke bakterier, gjær og virus. Replikasjonsorigo fra plasmidet pBR322 (ATCC 37.017) eller fra andre kommersielt tilgjengelige bakterie-vektorer, så som f. eks. pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige) og pGEMl (Promega Biotech, Madison, Wis.) er egnet for de fleste Gram-negative bakterier, det 2|i-plasmidorigoet er egnet for gjær og ulike virale origo (SV40, polyoma, adenovirus, VSV eller BPV) er nyttige for kloningsvektorer i mammalske celler. Generelt er ikke replikasjonsorigo-komponenten nødvendig for mammalske ekspresjonsvektorer (SV40-origo kan vanligvis bare bli benyttet fordi det inneholder en tidlig promoter).
De fleste ekspresjonsvektorer er shuttle-vektorer, dvs. de kan replikere i minst én klasse organismer, men kan bli transfektert inn i en annen organisme for ekspresjon. F. eks. blir en vektor klonet i E. coli og så blir den samme vektoren transfektert i gjær eller mammalske celler for ekspresjon, selv om den antas ikke å kunne replikere uavhengig av vertscellens kromosom.
DNA kan også bli amplifisert ved å sette den inn i verts-genomet. Dette er enkelt å utføre ved å anvende Bacillus- arter som verter, f. eks. ved å inkludere i vektoren en DNA-sekvens som er komplementær med en sekvens funnet i 5aci7/w.s-genomisk DNA. Transfeksjon av Bacillus med denne vektoren resulterer i homolog rekombinasjon med genomet, og insersjon av DNAet. Gjenvinningen av genomisk DNA som koder for polypeptid-varianten er imidlertid mer kompleks enn den for en eksogent replikert vektor fordi restriksjonsenzym-kutting er nødvendig for å eksisere DNAet.
( iii) Seleksjon av gen- komponent
Ekspresjons- og kloningsvektorer bør omfatte et seleksjonsgen, også kalt en selekterbar markør. Dette genet koder for et protein som er nødvendig for overlevelsen eller veksten av transformerte vertsceller dyrket i et selektivt kulturmedium. Vertsceller som ikke er transformert med vektoren som inneholder seleksjonsgenet vil ikke overleve i kulturmediet. Typiske seleksjonsgener koder for proteiner som (a) gir resistens mot antibiotika eller andre toksiner, f. eks. ampicillin, neomycin, metotreksat eller tetracyklin, (b) komplementerer autotrofe mangler, eller (c) tilfører kritiske næringsmidler som ikke er tilstede i komplekse medier, f. eks. genet som koder for D-alanin-racemase fra Bacilli.
Ett eksempel på et seleksjonsskjema anvender et medikament for å stanse vekst av en vertscelle. De cellene som er vellykket transfomert med et homologt gen produserer et protein som gir medikament-resistens og overlever således seleksjonsregimet. Eksempler på slik dominant seleksjon anvender medikamentet neomycin (Southern et al., J. Molec. Appl. Genet., 1: 327 [1982]), mycofenolsyre (Mulligan et al., Science, 209:1422 [1980]) eller hygromycin (Sugden et al., Mol. Cell. Biol., 5: 410-413 [1985]). De tre eksemplene gitt ovenfor anvender bakterielle gener under eukaryot kontroll for å gi resistens mot det aktuelle medikamentet, G418 eller neomycin (genetiticin), hhv. xgpt (mycofenolsyre) eller hygromycin.
Et annet eksempel på egnede selekterbare markører for mammalske celler er de som sikrer identifiseringen av celler som er kompetente til å ta opp nukleinsyren, så som DHFR eller tymidin kinase. De mammalske celle-transformantene blir plassert under seleksjonstrykk som bare transformantene unikt er tilpasset å overleve ved at de har tatt opp markøren. Seleksjonstrykket er gitt ved å dyrke transformantene under betingelser hvor konsentrasjonen av seleksjonsagenset i mediet endres suksessivt, og derved fører til amplifisering av både seleksjonsgenet og DNAet som koder for polypeptid-varianten. Amplifisering er prosessen hvor gener det er et større behov for, for produksjon av et protein som er kritisk for vekst, blir gjentattt i tandem innen kromosomene fra påfølgende generasjoner av rekombinante celler. Økte mengder av polypeptid-varianten blir syntetisert fra det amplifiserte DNAet. Andre eksempler på amplifiserbare gener omfatter metallotionein-I og -II, fortrinnsvis primat metallotionein-gener, adenosin-deaminase, ornitin-dekarboksylase, osv.
F. eks. blir celler som er transformert med DHFR-seleksjonsgenet først identifisert ved å dyrke alle transformantene i dyrkningsmedium som omfatter metotreksat (Mtx), en kompetitiv antagonist for DHFR. En egnet vertscelle når villtype-DHFR blir anvendt, er Chinese hamster ovarie- (CHO) cellelinje som er defekt i DHFR-aktivitet, preparert og oppformert som beskrevet av Urlaub and Chasin, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77: 4216
(1980). De transformerte cellene blir så eksponert for økende nivåer av metotreksat. Dette fører til syntesen av flere kopier av DHFR-genet, og samtidig flere kopier av annet DNA som omfatter ekspresjonsvektorer, så som DNAet som koder for polypeptid-varianten. Denne amplifiseringsteknikken kan bli anvendt med alle egnede vertsceller, f. eks. ATCC nr. CCL61 CHO-K1, til tross for tilstedeværelsen av endogen DHFR, hvis f. eks et mutert DHFR-gen som er meget resistent for Mtx blir anvendt (EP 117.060).
Alternativt kan vertsceller (spesielt villtype-verter som omfatter endogen DHFR) som er transformert eller ko-transformert med DNA-sekvenser som koder for polypeptid-varianten, villtype-DHFR-proteinet og en annen selekterbar markør så som aminoglykosidase 3-fosfotransferase (APH) bli selektert ved cellevekst i medium som inneholder et seleksjonsagens for den selekterbare markøren, så som et aminoglykosid- antibiotikum, f. eks. kanamycin, neomycin eller G418. Se US patent nr. 4.965.199.
Et passende seleksjonsgen for anvendelse i gjær er trpl-genet som er tilstede i gjærplasmidet YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 [1979]; Kingsman et al., Gene, 7: 141 [1979] eller Tschemper et al., Gene, 10: 157 [1980]). f/pl-genet tilveiebringer en seleksjonsmarkør for en mutant stamme gjær som mangler evnen til å vokse i tryptofan, f. eks. ATCC nr. 44076 eller PEP4-1 (Jones, Genetics, 85: 12 [1977]). Tilstedeværelsen av trpl-skaden i gjær-vertscellens genom tilveiebringer således et effektivt miljø for å detektere transformasjon med vekst ved fravær av tryptofan. På lignende vis er Lei/2-defekte gjærstammer (ATCC nr. 20.622 eller 38.626) komplementert av kjente plasmider som bærer Lew2-genet.
I tillegg kan vektorer som er avledet fra det 1,6 um sirkulære plasmidet pKDl bli anvendt for transformasjon av Kluyvermyces- gjæv. Bianchi et al., Curr. Genet., 12:185
(1987). Nylig er et ekspresjonssystem for stor-skala produksjon av rekombinant kalve-chymosin rapportert for K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). Stabile multi-kopi ekspresjonsvektorer for sekresjon av modent rekombinant human serumalbumin av industrielle stammer av Kluyveromyces er også beskrevet. Fleer et al., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991).
( iv) Promoter- komponent
Ekspresjons- og kloningsvektorer omfatter normalt en promoter som blir gjenkjent av vertsorganismen, og som er operabelt koblet med nukleinsyren. Promotere er utranslaterte sekvenser som er lokalisert opptrøms (5') for start-kodonet av et strukturelt gen (generelt
innen omtrent 100 til 1000bp) som kontrollerer transkripsjonen og translasjonen av en spesiell nukleinsyre-sekvens, så som nukleinsyre-sekvensen av polypeptid-variantene her, med hvilke de er operabelt koblet. Slike promotere faller typisk i to klasser, induserbare og konstituitive. Induserbare promotere er promotere som initierer økte transkripsjonsnivåer fra DNA som er under deres kontroll, som en respons på noen endringer i dyrkningsbetingelser, f. eks. tilstedeværelse eller fravær av et næringsstoff eller en endring i temperatur. I dag er et stort antall promotere som er gjenkjent av en rekke potensielle vertsceller velkjent. Disse promoterene er operabelt koblet med DNAet som koder for polypeptid-varianten ved å fjerne promoteren fra kilde-DNAet ved restriksjonsenzym-kutting og sette inn den isolerte promoter-sekvensen i vektoren. Promoteren for det interessante polypeptidet og mange heterologe promotere kan bli anvendt for å styre amplifisering og/eller ekspresjon av DNAet. Heterologe promotere er imidlertid foretrukket, ettersom de generelt tillater høyere transkripsjon og
høyere utbytter av rekombinant produsert polypeptid-variant sammenlignet med promoteren av det interessante polypeptidet.
Promotere som er egnet for anvendelse med prokaryote verter omfatter (3-laktamase og laktose-promoter-systemer (Chang et al., Nature, 275: 615 [1978]; og Goeddel et al., Nature, 281: 544 [1979], alkalisk fosfatase, et tryptofan (trp) promotersystem (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 [1980] og EP 36.776) og hybride promotere så som tac-promoteren (deBoer et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80: 21-25 [1983]). Andre kjente bakterielle promotere er imidlertid egnede. Deres nukleotid-sekvenser er publisert, og derved kan fagfolk operabelt ligere dem til DNA som koder for polypeptid-varianten (Siebenlist et al., Cell, 20: 269 [1980]) ved å anvende linkere eller adaptere for å tilføre hvilke som helst nødvendige restriksjonsseter. Promotere for anvendelse i bakterielle systemer vil også omfatte en Shine-Dalgarno- (S.D.) sekvens som er operabelt koblet med DNAet som koder for polypeptid-varianten.
Promoter-sekvenser er kjent for eukaryoter. Nesten alle eukaryote gener har en AT-rik region lokalisert omtrent 25 til 30 baser oppstrøms for setet hvor transkripsjonen initieres. En annen sekvens som er funnet 70-80 baser oppstrøms for starten for transkripsjonen av mange gener, er en CXCAAT-region hvor X kan være hvilket som helst nukleotid. Ved 3-enden for de fleste eukaryote gener er en AATAAA-sekvens som kan være signalet for tilsetning av poly-A-halen til 3'-enden av den kodende sekvensen. Alle disse sekvensene blir hensiktsmessig satt inn i eukaryote ekspresjonsvektorer.
Eksempler på egnede promoter-sekvenser for anvendelse i gjær-verter omfatter promoteren for 3-fosfoglycerat-kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 2073 [1980] eller andre glykolytiske enzymer (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 [1968]) og Holland, Biochemitry, 17: 4900 [1978]), så som enolase, glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase, heksokinase, pyruvat-dekarboksylase, fosfofruktokinase, glukose-6-fosfat-isomerase, 3-fosfoglycerat-mutase, pyruvat-kinase, triosefosfat- isomerase, fosfoglukose-isomerase og glukokinase.
Andre gjær-promotere, som er induserbare promotere som har den ytterligere fordelen at transkripsjonen er kontrollert av vekst-betingelser, er promoter-regionene for alkohol-dehydrogenase 2, isocytokrom C, sur fosfatase, degraderende enzymer assosiert med nitrogen-metabolisme, metallotionein, glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase og enzymer som er ansvarlige for maltose- og galaktose-anvendelse. Egnede vektorer og promotere for anvendelse ved gjær-ekspresjon er videre beskrevet av Hitzeman et al., EP 73.657. Gjær-enhancere kan også med fordel bli anvendt med gjær-promotere.
Transkripsjon av polypeptid-varianten fra vektorer i mammalske vertsceller er kontrollert av f. eks. promotere som er oppnådd fra virus-genom, så som polyoma virus, difterivirus (UK 2.211.504, publisert 5. juli 1989), adenovirus (så som adenovirus 2), bovint papilloma virus, avian sarcoma virus, cytomegalovirus, et retrovirus, hepatitt-B-virus og fortrinnsvis Simian Virus 40 (SV40) fra heterologe mammalske promotere, f. eks. aktin-promoteren eller en immunoglobulin-promoter, fra varmesjokk-promotere og fra promoteren som normalt er assosiert med polypeptid-variant-sekvensen, forutsatt at slike promotere er kompatible med vertscelle-systemene.
De tidlige og sene promoterene fra SV40-viruset blir konvensjonelt anskaffet som et SV40-restriksjonsfragment som også omfatter SV40-virus replikasjons-origoet. Fiers et al., Nature, 273:113 (1978); Mulligan and Berg, Science, 209: 1422-1427 (1980); Pavlakis et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78: 7398-7402 (1981). Den umiddelbart til-tidlige promoteren fra cytomegaloviruset blir konvensjonelt anskaffet som et HindLTJ. E-restriksjonsfragment. Greenaway et al., Gene, 18: 355-360 (1982). Et system for å uttrykke DNA i mammalske verter ved å anvende bovint papilloma-virus som en vektor er beskrevet i US. patent nr. 4.419.446. En modifikasjon av dette systemet er beskrevet i US. patent nr. 4.601.978. Se også Gray et al., Nature, 295: 503-508 (1982) om ekspresjon av cDNA som koder for immun-interferon i apeceller; Reyes et al., Nature, 279: 598-601 (1982) om ekspresjon av human interferon cDNA i museceller under kontroll av en tymidin-kinase-promoter fra herpes simpleks virus; Canaani and Berg, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 79: 5166-5170 (1982) om ekspresjon av human interferon pi-genet i dyrkede muse- og kaninceller; og Gorman et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 79: 6777-6781 (1982) om ekspresjon av bakteriell CAT-sekvenser i CV-1 ape-nyreceller, kylling embryo-fibroblaster, Chinese hamster ovarie-celler, HeLa-celler og mus NIH-3T3-celler ved å anvende Rous sarcoma virus lang terminal repeat som en promoter.
( v) Enhancer element- komponent
Transkripsjon av et DNA som koder for polypeptid-varianten ifølge denne oppfinnelsen av høyere eukaryoter blir ofte øket ved å sette inn en enhancer-sekvens i vektoren. Enhancere er cis-virkende elementer av DNA, vanligvis fra omtrent 10 til 300 bp, som påvirker en promoter til å øke dens ekspresjon. Enhancere er relativt orienterings- og posisjons-uavhengige, idet de er funnet 5' (Laimins et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78: 993
[1981]) og 3' (Lusky et al., Mol. Cell. Bio., 3: 1108 [1983]) for transkripsjonsenheten, innen et intron (Banerji et al., Cell, 33: 729 [1983]), så vel som i den kodende sekvensen selv (Osborne et al., Mol. Cell Bio., 4:1293 [1984]). Mange enhancer-sekvenser er nå kjent fra mammalske gener (globin, elastase, albumin, a-fetoprotein og insulin). Man vil vanligvis imidlertid anvende en enhancer fra et virus for eukaryote celler. Eksempler omfatter SV40-enhanceren på den sene siden av replikasjonsorigoet (bp 100-270), cytomegalovirus tidlig-promoter enhanceren, polyoma-enhanceren på den sene siden av replikasjonsorigoet og adenovirus-enhancere. Se også Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982) om enhancer-elementer for aktivering av eukaryote promotere. Enhanceren kan bli spleiset inn i vektoren i posisjon 5' eller 3' av den polypeptid-variant-kodende sekvensen, men er fortrinnsvis lokalisert ved et sete 5' for promoteren.
( vi) Transkripsions- terminerings- komponent
Ekspresjonsvektorer anvendt i eukaryote vertsceller (gjær, sopp, insekter, planter, dyr, humane eller nukleerte celler fra andre multi-cellulære organismer) vil også omfatte sekvenser som er nødvendige for termineringen av transkripsjonen, og for å stabilisere mRNAet. Slike sekvenser er vanligvis tilgjengelige fra 5'- og av og til 3'-, utranslaterte regioner av eukaryot eller viralt DNA eller cDNA. Disse regionene omfatter nukleotid-segmenter som er transkribert som polyadenylerte fragmenter i den ikke-translaterte delen av mRNAet som koder for polypeptid-varianten.
( vii) Konstruksjon og analyse av vektorer
Konstruksjon av egnede vektorer omfattende én eller flere av de ovenfor nevnte komponentene anvender standard ligeringsteknikker. Isolerte plasmider eller DNA-fragmenter blir spaltet, tilpasset og re-ligert i den ønskede formen for å generere de nødvendige plasmidene.
Som analyse for å bekrefte korrekte sekvenser i konstruerte plasmider blir ligeringsblandinger anvendt for å transformere E. coli K12-stamme 294 (ATCC 31.446), og vellykkede transformanter blir selektert ved ampicillin- eller tetracyklin-resistens hvor dette er passende. Plasmider fra transformantene blir fremstilt, analysert ved restriksjons-endonuklease-kutting og/eller sekvensert ved metoden til Messing et al., Nucleic Acids Res., 9: 309 (1981) eller ved metoden til Maxam et al., Methods in Enzymology, 65:499 (1980).
( viii) Transiente ekspresjonsvektorer
Spesielt nyttige ved utførelsen av denne oppfinnelsen er ekspresjonsvektorer som frembringer transient ekspresjon hos mammalske celler av DNA som koder for polypeptid-varianten. Generelt involverer transient ekspresjon anvendelsen av en ekspresjonsvektor som har evnen til å replikere effektivt i en vertscelle, slik at vertscellen akkumulerer mange kopier av ekspresjonsvektoren, og deretter syntetiserer høye nivåer av et ønsket polypeptid som er kodet av ekspresjonsvektoren. Sambrook et al., supra, s. 16.17 -16.22. Transiente ekspresjonssystemer, som omfatter en egnet ekspresjonsvektor og en vertscelle, tillater konvensjonell positiv identifikasjon av polypeptid-varianter som er kodet av klonede DNAer, så vel som rask undersøkelse av slike polypeptider etter ønskede biologiske eller fysiologiske egenskaper. Transiente ekspresjonssystemer er således spesielt nyttige for oppfinnelsen med hensyn på identifisering av polypeptid-varianter som er biologisk aktive.
( ix) Eksempler på egnede vertebrat- celle- vektorer
Andre metoder, vektorer og vertsceller som er nyttige ved tilpasning av syntesen av polypeptid-varianten i rekombinant cellekultur fra en vertebrat er beskrevet i Gething et al., Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281: 40-46 (1979); EP 117.060 og EP 117.058. Et spesielt nyttig plasmid for mammalsk cellekultur-produksjon av polypeptid-varianten er pRK5 (EP 307.247) eller pSV16B (WO 91/08291, publisert 13. juni 1991). Den pRK5-deriverte pRK5B (Holmes et al., Science, 253:1278-1280 [1991]) er spesielt egnet for slik ekspresjon.
D. Seleksjon og transformasjon av vertsceller
Egnede vertsceller for kloning eller ekspresjon, av vektorene her er prokaryote, gjær eller høyere eukaryote celler som beskrevet ovenfor. Egnede prokaryoter for dette formålet omfatter eubakterier, så som Gram-negative eller Gram-positive organismer, f. eks. Enterobacteriaceae så som Escherichia, f. eks. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, f.eks. Salmonella typhimurium, Serratia, f. eks. Serratia marcescans, og Shigella, så vel som Bacilli så som B. subtilis og B. licheniformis ( f. eks. B. licheniformis 41P beskrevet i DD 266.710, publisert 12. april 1989), Pseudomonas så som P. aeruginosa og Streptomyces. En foretrukket E. coli kloningsvert er E. coli 294 (ATCC 31.446), selv om andre stammer, så som E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537), E. coli DH5oc og E. coli W3110 (ATCC 27.325) er egnet. Disse eksemplene er illustrerende, og ikke begrensende. Stamme W3110 er en spesielt foretrukket vert eller foreldre-vert fordi den er en vanlig vertsstamme for rekombinante DNA-produkt-fermenteringer. Fortrinnsvis utskiller vertscellene minimale mengder av proteolytiske enzymer. F. eks. kan stamme W3110 bli modifisert for å bevirke genetisk mutasjon av genene som koder for endogene proteiner for verten, med eksempler som omfatter E. coli W3110-stamme 1A2, som har den komplette genotypen tonAA; E. coli W3110-stamme 9E4, som har den komplette genotypen tonAA ptr3; E. coli W3110-stamme 27C7 (ATCC 55.244) som har den komplette genotypen tonA ptr3 phoAAElS A ( argF- lac) 169 Adeg AompTkan R; E. coli W3110-stamme 37D6 som har den komplette genotypen tonA ptr3 phoAAE15 A ( argF- lac) 169 AdegP AompT Arbs7 ilvG kan D ; E. coli- stamme W3110-stamme 40B4, som er stamme 37D6 med en ikke-kanamycin resistent degP-delesjonsmutasjon; og en E. coli- stamme som har mutant periplasmisk protease beskrevet i US. paten nr. 4.946.783, bevilget 7. august 1990. Alternative in vifrø-metoder for kloning, f. eks. PCR eller andre nukleinsyre-polymerase-reaksjoner, er egnede.
I tillegg til prokaryoter er eukaryote mikrober så som filamentøs sopp eller gjær egnede klonings- eller ekspresjons verter for polypeptid-variant-kodende vektorer. Saccharamyces cerevisiae, eller vanlig bake-gjær, er den mest vanlig brukte blant lavere eukaryote vertsorganismer. Et antall andre rekker, arter og stammer er imidlertid vanlig tilgjengelig og nyttige her, så som Schizosaccharomycespombe (Beach and Nurse, Nature, 290:140 [1981]; EP 139.383 publisert 2. mai 1985); Kluyveromyces- vener (US patent nr. 4.943.529; Fleer et al., supra) så som/ eks. K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 [1983], K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., supra), K. thermotolerans og K. marxianus, yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28: 265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crossa (Case er al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76: 5259-5263 [1979]), Schwanniomyces, så som Schwanniomyces occidentali (EP 394.538, publisert 31. oktober 1990) og en filamentøs sopp så som Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357, publisert 10. januar 1991) og Aspergillus-verter så som A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81: 1470-1474
[1984] og A. niger (Kelly and Hynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]).
Egnede vertsceller for produksjonen av polypeptid-varianten er avledet fra multicellulære organismer. Slike vertsceller har evnen til komplekse prosesserende og glykosylerende aktiviteter. I prinsippet er hvilke som helst høyere eukaryote celler anvendbare, om de er fra vertebrat- eller invertebrat-kultur. Eksempler på invertebrat-celler omfatter plante- og insektsceller. Mange baculovirus-stammer og -varianter og korresponderende permissive insekts-vertsceller fra verter så som Spodopterafrugiperda (sommerfugllarve), Åedes aegypti (moskito), Åedes albopictus (moskito), Drosophila melanogaster (bananflue) og Bombyx mori er identifisert. Se f. eks. Lucklow et al., Bio/Technology, 6:47-55 (1988); Miller et al., i Genetic Engineering, Setlow, J. K. et al., red. vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), s. 277-279; og Maeda et al., Nature, 315: 592-594 (1985). En rekke virale stammer for transfeksjon er offentlig tilgjengelige, f. eks. L-l-varianten av Autographa califomica NPV, og Bm-5-stammen av Bombyx mori NPV og slike virus kan bli anvendt her ifølge foreliggende oppfinnelse, spesielt for transfeksjon av Spodoptera frugiperda- celler.
Plante-cellekulturer fra bomull, mais, potet, sojabønne, petunia, tomat og tobakk kan bli anvendt som verter. Planteceller blir typisk transfektert ved inkubering med visse stammer av bakterien Agrobacterium tumefaciens, som tidligere er manipulert for å inneholde DNAet. Under inkubering av plantecelle-kulturen med A. tumefaciens, er DNAet som koder for polypeptid-varianten overført til plante-vertscellen slik at den er transfektert, og under egnede betingelser, vil uttrykke DNAet. I tillegg er regulatoriske- og signal-sekvenser som er kompatible med planteceller tilgjengelig, slik som nopalin syntase-promoteren og polyadenylering-signalsekvenser. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen., 1: 561(1982). I tillegg har DNA-segmenter som er isolert fra oppstrømsregionen av T-DNA 780-genet evnen til å aktivere eller øke transkripsjonsnivåer fra plante-uttrykte gener i rekombinant, DNA-inneholdende, plantevev. EP 321.196, publisert 21. juni 1989.
Interessen har imidlertid vært størst for vertebrat-celler, og oppformering av vertebrat-celler i kultur (vevskultur) er blitt en rutine-prosedyre de siste årene (Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, red. [1973]). Eksempler på nyttige mammalske vertscellelinjer er apenyre CVl-linje transformert med SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); human embryonisk nyrelinje (293- eller 293-celler som er subklonet for vekst i suspensjonskultur, Graham et al., J. Gen Virol., 36: 59 [1977]); baby hamster nyreceller (BHK, ATCC CCL 10); Chinese hamster ovariecellerADHFR (CHO, Urlab and Chasin, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77:4216 [1980]), mus sertoliceller (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 [1980]); ape nyreceller (CV1 ATCC CCL 70); Afrikansk grønnape nyreceller (VERO-76, ATCC CRL-1587); human hals-karsinomceller (HELA, ATCC CCL 2); hunde-nyreceller (MDCK, ATCC CCL 34); buffalorotte leverceller (BRL 3A, ATCC CRL 1442); humane lungeceller (W138, ATCC CCL 75); humane leverceller (Hep G2, HB 8065); mus brysttumorceller (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI-celler (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sei., 383: 44-68 [1982]); MRC 5-celler; FS4-celler og en human hepatoma-linje (Hep G2).
Vertsceller blir transfektert og fortrinnsvis transformert med de ovenfor beskrevne ekspresjons- eller kloningsvektorene ifølge denne oppfinnelsen, og dyrket i konvensjonelt næringsmedium som er modifisert som det passer for indusering av promotere, seleksjon av transformanter eller amplifisering av genene som koder for de ønskede sekvensene. Transfeksjon referer til at vertscellen tar opp en ekspresjonsvektor, uansett om noen kodende sekvens faktisk blir uttrykt. Mange metoder for transfeksjon er kjent for fagfolk innen feltet, f. eks. CaP04 og elektroporering. Vellykkede transfeksjoner kjennes generelt igjen når en indikasjon på at denne vektoren virker i vertscellen forekommer.
Transformasjonsmidler introduserer DNA i en organisme slik at DNAet er replikerbart, enten som et ekstrakromosomalt element eller ved kromosomal integrering. Avhengig av de anvendte vertscellene blir transformasjon gjort ved å anvende standard teknikker som er egnet for slike celler. Kalsium-behandlingen som anvender kalsium-klorid, som beskrevet i seksjon 1.82 i Sambrook et al., supra, eller elektroporering blir vanligvis anvendt for prokaryoter eller andre celler som inneholder en del cellevegg-barrierer. Infeksjon med Agrobacterium tumefaciens blir anvendt for transformasjon av visse planteceller, som beskrevet av Shaw et al., Gene, 23: 315 (1983) og WO 89/05859, publisert 29. juni 1989. I tillegg kan planter bli transfektert ved å anvende ultralyd-behandling som beskrevet i WO 91/00358 publisert 10. januar 1991.
For mammalske celler uten slike cellevegger er kalsiumfosfat-presipiteringsmetoden til Graham and van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978) foretrukket. Generelle aspekter ved mammalske vertscelle-system-transformasjoner er beskrevet av Axel i US patent nr. 4.399.216, bevilget 16. august 1983. Transformasjon i gjær vil vanligvis bli utført i samsvar med metoden til Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 (1977) og Hsiao et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76: 3829 (1979). Andre metoder for å introdusere DNA i celler, så som nukleær mikroinjeksjon, elektroporering, bakterie-protoplast fusjon med intakte celler, eller polykationer, f. eks. polybren, polyornitin osv. kan imidlertid også bli anvendt. For ulike teknikker for transformasjon av mammalske celler, se Keown et al., Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990) og Mansour et al., Nature, 336: 348-352 (1988).
E. Dyrking av vertscellene
Prokaryote celler anvendt for å produsere polypeptid-varianten ifølge denne oppfinnelsen blir dyrket i egnet medium som beskrevet generelt i Sambrook et al., supra.
Mammalske vertsceller anvendt for å produsere polypeptid-varianten ifølge denne oppfinnelsen kan bli dyrket i en rekke medier. Kommersielt tilgjengelige media så som Ham's F-10 (Sigma), F-12 (Sigma), Minimal Essential medium ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma), Dulbecco's modifiserte Eagle's medium ([D-MEM], Sigma) og D-MEM/F-12 (Gibco BRL) er egnet for dyrking av vertscellene. I tillegg kan hvilke som helst av mediene beskrevet f. eks. i Ham and Wallace, Methods in Enzymology, 58: 44 (1979); Barnes and Sato, Anal. Biochem, 102: 255 (1980); US patent nr. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 5.122.469 eller 4.560.655; US patentsøknad Re. 30.985; WO 90/03430 eller WO 87/00195 bli anvendt som kultur-medium for vertscellene. Alle disse mediene kan bli supplert om nødvendig med hormoner og/eller andre vekstfaktorer (så som insulin, transferrin, aprotinin og/eller epidermal vekstfaktor [EGF]), salter (så som natriumklorid, kalsium, magnesium og fosfat), buffere (så som HEPES), nukleosider (så som adenosin og tymidin), antibiotika (så som Gentamycin ™-medikament), spor-elementer (definert som uorganiske forbindelser som vanligvis er tilstede ved endelig konsentrasjon i mikromolar-området) og glukose eller en ekvivalent energi-kilde. Alle andre nødvendige tilsetninger kan også bli inkludert i passende konsentrasjoner, som vil være kjent for fagfolk innen feltet. Dyrkningsbetingelsene, så som temperatur, pH og lignende er som de anvendt tidligere med vertscellen valgt for ekspresjon, og vil være klar for fagfolk innen feltet.
Generelt kan prinsipper, protokoller og praktiske teknikker for å maksimere produksjonen av in vitro mammalske cellekulturer bli funnet i Mammalian Cell Biotechnology; a Practical Approach, M. Butler, red. (IRL Press, 1991).
Vertscellene referert i denne beskrivelsen omfatter celler i in vifro-kultur så vel som celler som er i et vertsdyr.
F. Detektere gen- amplifiseirng/ ekspresjon
Gen-amplifisering og/eller ekspresjon kan bli målt i en prøve direkte, f. eks. ved konvensjonell Southern-blotting, Northern-blotting for å kvantifisere transkripsjonen av mRNA (Thomas, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77: 5201-5205 [1980]), dot-blott (DNA-analyse), eller in sifw-hybridisering, ved å anvende en passende merket probe, basert på sekvensen gitt her. Ulike merker kan bli anvendt, mest vanlig er radioisotoper, spesielt <32>P. Andre teknikker kan imidlertid også bli anvendt, så som anvendelse av biotin-modifiserte nukleotider for introduksjon i et polynukleotid. Biotinen fungerer som setet for binding til avidin eller antistoffer, som kan være merket med en rekke merker, så som radionuklider, flourescerende merker, enzymer eller lignende. Alternativt kan antistoffer bli anvendt som kan gjenkjenne spesifikke duplekser, omfattende DNA-duplekser, RNA-duplekser og DNA-RNA-hybride duplekser eller DNA-protein-duplekser. Antistoffene kan igjen bli merket, og testen kan bli utført hvor dupleksen er bundet til en overflate, slik at ved dannelsen av dupleksen på overflaten kan tilstedeværelsen av antistoff bundet til dupleksen bli detektert.
Genekspresjon kan alternativt bli målt ved immunologiske metoder, så som immunohistokjemisk farging av vevssnitt og tester av cellekultur eller kroppsvæsker, for å kvantifisere direkte ekspresjonen av genproduktet. Ved immunohistokjemiske fargings-teknikker blir en celleprøve preparert, typisk ved dehydrering og fiksering, fulgt av reaksjon med merkede antistoffer som er spesifikke for det koblede genproduktet, hvor merkene vanligvis er visuelt detekterbare, så som enzymatiske merker, flourescerende merker, luminiscerende merker og lignende. En spesielt sensitiv fargingsteknikk som er egnet for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse er beskrevet av Hsu et al., Am. J. Clin. Path., 75: 734-738 (1980).
Antistoffer som er nyttige ved immunohistokjemisk farging og/eller test av prøve-væsker kan være enten monoklonale eller polyklonale, og kan fremstilles fra hvilket som helst pattedyr. Vanligvis kan antistoffene bli fremstilt mot en polypeptid-variant som ytterligere beskrevet i seksjon 4 nedenfor.
G. Rensing av polypeptid
Hvis varianten er produsert intracellulært blir det spesielle avfallet, enten vertsceller eller lyserte fragmenter, som et første trinn fjernet, f. eks. ved sentrifugering eller ultrafiltrering; eventuelt kan proteinet bli konsentrert fra andre urenheter med et kommersielt tilgjengelig protein-konsentrerende filter, etterfulgt av separering av polypeptid-varianten fra andre urenheter ved ett eller flere trinn valgt fra immuno-affinitets-kromatografi, ione-utbyttings-kolonne-fraksjonering (f. eks. dietylaminoetyl (DEAE) eller matriser som omfatter karboksymetyl- eller sulfopropyl-grupper), kromatografi på blå-sepharose, CM blå-sepharose, MONO-Q, MONO-S-lentil-lektin-sepharose, WGA-sepharose, Con A-sepharose, eter-toyopearl, butyl-toyopearl, fenyl-toyopearl eller protein A-sepharose, SDS-PAGE-kromatografi, silika-kromatografi, kromatofokusering, revers fase HPLC (f. eks. silikagel med vedhengende alifatiske grupper), gel-filtrering, f. eks. sephadeks molekyl-sil eller størrelses-ekskluderende kromatografi, kromatografi på kolonner som selektivt binder polypeptidet, og etanol- eller ammoniumsulfat-presipitering.
Rekombinant polypeptid-variant produsert i bakteriekultur kan vanligvis bli isolert ved initiell ekstraksjon fra cellepelleter, fulgt av en eller flere konsentreringer, utsalting, vandig ione-utbytting, eller størrelses-eksklusjons-kromatografi-trinn. I tillegg kan den rekombinante polypeptid-varianten bli renset ved affinitets-kromatografi. Endelig kan HPLC bli anvendt som de siste rense-trinnene. Mikrobielle celler anvendt ved ekspresjon av nukleinsyre som koder for polypeptid-varianten kan bli ødelagt ved alle konvensjonelle metoder, omfattende fryse-tine-sykler, sonikering, mekanisk ødeleggelse eller gjennom bruk av lyserende agens.
En protease-inhibitor så som metylsulfonylfluorid (PMSF) kan bli inkludert i hvilke som helst av de foregående trinnene for å hindre proteolyse, og antibiotika kan bli inkludert for å hindre veksten av ytterligere forurensninger.
Ved en annen utførelsesform blir supernatanter fra systemer som utskiller rekombinant polypeptid-variant i dyrkningsmediet først konsentrert ved å anvende et kommersielt tilgjengelig protein-konsentrerende filter, f. eks. en Amicon eller Millipore Pellicon ultrafiltrerings-enhet. Etter konsentreirngstrinnet kan konsentratet bli applisert på en egnet rense-matriks. F. eks. kan en egnet affinitets-matriks omfatte en ligand for proteinet, et lektin eller antistoff-molekyl bundet til en passende bærer. Alternativt kan en anion-utbyttings-harpiks bli anvendt, f. eks. en matriks eller et substrat som har hengende DEAE-grupper. Egnende matriser omfatter akrylamid, agarose, dekstran, cellulose eller andre typer vanlig anvendt ved protein-rensing. Alternativt kan et kation-utbyttings-trinn bli anvendt. Passende kation-utbyttere omfatter ulike uløselige matriser inneholdende sulfopropyl- eller karboksymetyl-grupper. Sylfopropylgrupper foretrekkes vanligvis.
Til slutt kan ett eller flere RP-HPLC-trinn som anvender hydrofobe RP-HPLC-media, f. eks. silikagel som har vedhengende metyl- eller andre alifatiske grupper, bli anvendt for videre å rense et polypeptid-variant-preparat. Noen eller alle de foregående rensetrinnene, i ulike kombinasjoner, kan også bli anvendt for å tilveiebringe en homogen rekombinant polypeptid-variant.
Fermentering av gjær som produserer polypeptid-varianten som et utskilt polypeptid forenkler rensing. Utskilt rekombinant polypeptid-variant som resulterer fra en stor-skala fermentering kan bli renset ved metoder som er analoge med de beskrevet av Urdal et al., J. Chromatog., 296: 171 (1984). Denne referansen beskriver to sekvensielle RP-HPLC-trinn for rensing av rekombinant human IL-2 på en preparativ HPLC-kolonne. Alternativt kan teknikker så som affinitets-kromatografi bli anvendt for å rense polypeptid-varianten.
Mammalsk polypeptid-variant som er syntetisert i rekombinant kultur er karakterisert ved tilstedeværelsen av ikke-humane celle-komponenter, inklusive proteiner, i mengder og av en karakter som avhenger av rense-trinnene som er utført for å gjenvinne polypeptid-varianten fra kulturen. Disse komponentene vil vanligvis være av gjær, prokaryot eller ikke-human høyere eukaryot opprinnelse, og er fortrinnsvis tilstede i uskadelig forurensende mengder, i størrelsesområdet mindre enn omtrent 1% av vekten.
H. Kovalente modifiseringer av polypeptid- varianter
Kovalente modifiseringer av polypeptid-varianter er inkludert innenfor rammen av denne oppfinnelsen. De kan lages ved kjemisk syntese eller ved enzymatisk- eller kjemisk spalting av polypeptid-varianten, hvis dette er passende. Andre typer kovalente modifikasjoner av polypeptid-varianten blir introdusert i molekylet ved å reagere målrettede aminosyre-enheter i polypeptid-varianten med et organisk derivatiserende agens som kan reagere med valgte sidekjeder, eller N- eller C-terminale enheter.
Cysteinyl-enheter blir mest vanlig reagert med ot-halogenacetater (og tilsvarende aminer), så som kloreddiksyre eller kloracetamid, for å gi karboksymetyl- eller karboksy-amidometyl-derivater. Cysteinyl-enheter blir også derivatisert ved reaksjon med brom-trifluoraceton, a-bromo-P-(5-imidozoyl)propionsyre, kloroacetyl-fosfat, N-alkylmaleimider, 3-nitro-2-pyridyl-disulfid, metyl-2-pyridyl-disulfid, p-klormerkuribenzoat, 2-klormerkuri-4-nitrofenol eller klor-7-nitrobenzo-2-oksa-l,3-diazol.
Histidyl-enheter blir derivatisert ved reaksjon med dietylpyrokarbonat ved pH 5,5-7,0 fordi dette reagenset er relativt spesifikt for histidyl-sidekjeden. Para-bromfenacyl-bromid er også nyttig; idet denne reaksjonen fortrinnsvis blir utført i 0,1 M natrium-kacodylat ved pH 6,0.
Lysinyl- og aminoterminale enheter blir reagert med rav- eller andre karboksylsyre-anhydrider. Derivatisering med disse agensene har den effekt at ladningen på lysinyl-enheter reverseres. Andre egnede reageser for derivatisering av a-amino-inneholdende rester omfatter imidoestere så som metyl-pikolinimidat, pyridoksal-fosfat, pyridoksal, klorborhydrid, trinitrobenzensulfonsyre, O-metylisourea, 2,4-pentandion og transaminase-katalysert reaksjon med glyoksylat.
Arginyl-enheter blir modifisert ved reaksjon med ett eller flere konvensjonelle reagenser, blant dem fenylglyoksal, 2,3-butandion, 1,2-cykloheksandion og ninhydrin. Derivatisering av arginin-enheter krever at reaksjonen kan utføres under alkaliske betingelser på grunn av den høye pK» for den guanidin-funksjonelle gruppen. Videre kan disse reagensene reagere med lysin-gruppene så vel som arginin epsilon-aminogruppen.
Den spesifikke modifiseringen av tyrosyl-enheter kan gjøres, med spesiell intresse for å introdusere spektrale merker i tyrosyl-enheter, ved reaksjon med aromatiske diazonium-forbindelser eller tetranitrometan. Mest vanlig blir N-acetylimidizol og tetranitrometan anvedt for å danne hhv. O-acetyl-tyrosyl-arter og 3-nitro-derivater. Tyrosyl-enheter blir jodert ved å anvende 1<25>I eller <131>I for å fremstille merkede proteiner for anvendelse i radioimmuntester, hvor kloramin-T-metoden beskrevet ovenfor er egnet.
Karboksyl-sidegrupper (aspartyl eller glutamyl) blir selektivt modifisert ved reaksjon med karbodiimider (R-N=C=N-R'), hvor R og R1 er ulike alkylgrupper, så som 1-cykloheksyl-3 -(2-morfolinyl-4-etyl)-karbodiimid eller 1 -etyl-3 -(4-azonia-4,4-dimetylpentyl)-karbodiimid. Videre blir aspartyl- og glutamyl-enheter konvertert til asparaginyl- og glutaminyl-enheter ved reaksjon med ammonium-ioner.
Glutaminyl- og asparaginyl-enheter blir ofte deamidert til de korresponderende hhv. glutamyl- og aspartyl-enhetene. Disse restene blir deamidert under nøytrale eller basiske betingelser. De deamiderte formene av disse enhetene faller innenfor rammen av denne oppfinnelsen.
Andre modifikasjoner omfatter hydroksylering av prolin og lysin, fosforylering av hydroksyl-grupper i seryl- eller treonyl-enheter, metylering av a-aminogrupper i lysin-, arginin- og histidin-sidekjeder (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, s. 79-86 [1983]), acetylering av det N-terminale aminet og amidering av alle C-terminale karboksyl-grupper.
En annen type kovalent modifisering av polypeptid-varianten som er innenfor rammen av denne oppfinnelsen, omfatter å endre det originale glykosyleringsmønsteret av polypeptid-varianten. Ved å endre menes å deletere én eller flere karbohydrat-enheter i polypeptid-varianten, og/eller sette til ett eller flere glykosyleringsseter som ikke er tilstede i polypeptid-varianten.
Glykosylering av polypeptid-varianten er typisk N-koblet eller O-koblet. N-koblet referer til binding av karbohydrat-enheten til sidekjeden på en asparagin-enhet. Tripeptid-sekvensene asparagin-X-serin og asparagin-X-treonin, hvor X er en hvilken som helst aminosyre, unntatt prolin, er gjenkjennings-sekvensene for enzymatisk påsetting av karbohydrat-enheten til asparagin-sidekjeden. Tilstedeværelsen av en av disse tripeptid-sekvensene i et polypeptid danner således et potensielt glykosyleringssete. O-koblet glykosylering refererer til binding av en av sukkerene N-acetylgalaktosamin, galaktose eller xylose til en hydroksy-aminosyre, mest vanlig serin eller treonin, selv om også 5-hydroksyprolin eller 5-hydroksylysin kan anvendes.
Tilsetning av glykosyleringsseter til polypeptid-varianten blir vanligvis utført ved å endre aminosyre-sekvensen slik at den omfatter én eller flere av de ovenfor beskrevne tripeptid-sekvensene (for N-koblede glykosyleirngsseter). Denne endringen kan også bestå av tilsetning av, eller substitusjon av, én eller flere serin- eller treonin-enheter i sekvensen til den originale polypeptid-varianten (for O-koblede glykosyleringsseter). For enkelhets skyld blir polypeptid-variant-aminosyresekvensen fortrinnsvis endret gjennom endringer på DNA-nivå, spesielt ved å mutere DNAet som koder for polypeptid-varianten ved forhåndsbestemte baser slik at kodoner blir generert som vil translateres til de ønskede aminosyrene. DNA-mutasjonen(e) kan bli laget ved å anvende metoder beskrevet ovenfor.
En annen metode for å øke antallet karbohydrat-enheter i polypeptid-varianten er ved kjemisk eller enzymatisk kobling av glykosider til polypeptid-varianten. Disse prosedyrene er fordelaktige fordi de ikke krever produksjon av polypeptid-varianten i en vertscelle som har glykosylerings-evner for N- eller O-koblet glykosylering. Avhengig av koblingsmetoden som anvendes kan sukkeret(sukkerene) bli festet til (a) arginin og histidin, (b) frie karboksylgrupper, (c) frie sulfhydryl-grupper så som de fra cystein, (d) frie hydroksyl-grupper så som de i serin, treonin eller hydroksyprolin, (e) aromatiske enheter så som de i fenylalanin, tyrosin eller tryptofan eller (f) amid-gruppen i glutamin. Disse metodene er beskrevet i WO 87/05330, publisert 11. september 1987, og i Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., s. 259-306 (1981).
Fjerning av hvilke som helst av karbohydrat-enhetene som er tilstede i polypeptid-varianten kan bli utført kjemisk eller enzymatisk. Kjemisk deglykosylering krever eksponering av polypeptid-varianten for forbindelsen trifuormetansulfonsyre eller en ekvivalent forbindelse. Denne behandlingen resulterer i spaltningen av de fleste eller alle sukkere bortsett fra det koblende sukkeret (N-acetylglukosamin eller N-acetylgalaktosamin), mens den etterlater polypeptid-varianten intakt. Kjemisk deglykosylering er beskrevet av Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 (1987) og av Edge et al., Anal. Biochem., 118: 131 (1981). Enzymatisk spaltning av karbohydrat-enheter fra polypeptid-varianter kan oppnås ved anvendelse av en rekke endo- og ekso-glykosidaser som beskrevet av Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138: 350 (1987).
Glykosylering ved potensielle glykosyleringsseter kan bli forhindret ved anvendelse av forbindelsen tunicamycin som beskrevet av Duskin et al., J. Biol. Chem., 257: 3105 (1982). Tunicamycin hindrer dannelsen av protein-N-glykosid-koblinger.
En annen type kovalent modifisering av polypeptid-varianten omfatter kobling av polypeptid-varianten til en av en rekke ikke-protein-polymerer, f. eks. polyetylenglykol, polypropylen glykol eller polyoksyalkylener, som beskrevet i US. patent nr. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 eller 4.179.337.
3. Terapeutiske preparater; administrering av variant
Anvendelse av anti-CD 18-varianter omfatter anti-Macl/anti-neutrofil så vel som anti-LFA-1-anvendelser. Hvis polypeptid-varianten virker som et antistoff kan det eventuelt bli
kondensert med et andre polypeptid, og antistoffet eller fusjonen med dette kan bli anvendt for å isolere og rense protein det binder fra en kilde så som CD11- eller CD18-antigenet. Ved en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen en metode for å detektere CD1 la eller CD 18 in vitro eller in vivo som omfatter å kontakte anti-CD lia- eller -CD-18-antistoff-varianten her med en prøve, spesielt en serumprøve, som antas å inneholde CDlla eller CD18, og detektere om binding har forekommet.
Polypeptid-varianten her er også egnet for kvantitative diagnostiske tester som en standard eller kontroll mot hvilken prøver som omfatter ukjente mengder av polypeptid-varianten kan bli preparert.
Terapeutiske preparater med polypeptid-varianten for dens spesielle indikasjon blir fremstilt for lagring ved å blande polypeptid-varianten med den ønskede graden av renhet med valgfrie fysiologisk aksepterbare bærere eller stabilisatorer (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. utg. Oslo, A., red. [1980]), i form av en lyofilisert kake eller vandig løsning. Aksepterbare bærere, tilsetningsstoffer eller stabilisatorer er ikke-toksiske for mottagere ved de doser og konsentrasjoner som blir anvendt, og omfatter buffere så som fosfat, citrat, og andre organiske syrer, antioksydanter omfattende askorbinsyre; lav-molekylvekt (mindre enn omtrent 10 enheter) polypeptider; proteiner, så som serum albumin, gelatin eller immunoglobuliner; hydrofile polymerer så som polyvinylpyrrolidon; aminosyrer så som glycin, glutamin, asparagin, arginin eller lysin; monosakkarider, disakkarider og andre karbohydrater omfattende glukose, mannose eller dekstriner; chelateringsmidler så som EDTA; sukker-alkoholer så som mannitol eller sorbitol; salt-dannende mot-ioner så som natrium; og/eller ikke-ioniske surfaktanter så som Tween, Pluronics eller polyetylen-glykol (PEG).
Polypeptid-varianten anvendt ved denne metoden ifølge denne oppfinnelsen blir typisk formulert ved å blande den ved omgivelsestemperatur med den passende pH, og med den ønskede graden av renhet, med fysiologisk aksepterbare bærere, dvs. bærere som er ikke-toksiske for mottageren ved de doser og konsentrasjoner som anvendes. pH av preparatet avhenger hovedsakelig av den spesielle anvendelsen og konsentrasjonen av varianten, men er fortrinnsvis i området fra omtrent 3 til omtrent 8. Formulering med en buffer med pH på omtrent 5-8 er en egnet utførelsesform.
Polypeptid-varianten for anvendelse her er fortrinnsvis steril. Sterilitet blir enkelt oppnådd ved steril-filtrering gjennom (0,2 mikron) membraner. Polypeptid-varianten vil vanligvis bli lagret som en vandig løsning, selv om lyofiliserte preparater for rekonstitusjon er aksepterbare.
Variant-preparatet vil bli formulert, dosert og administrert på en måte som er konsistent med god medisinsk praksis. Faktorer å ta hensyn til i denne sammenhengen omfatter den spesielle sykdommen som skal behandles, det spesielle pattedyret som skal behandles, den kliniske tilstanden til den individuelle pasienten, sykdomsårsaken, avleveringssetet for agenset, administreringsmetoden, administreringsskjemaet og andre faktorer som er kjent for medisinere. "Terapeutisk effektiv mengde" av polypeptid-varianten som skal administreres vil styres av slike overveielser, og er for en LFA-1-antagonist-variant, det minimale nivået som er nødvendig for å forhindre, forbedre eller behandle LFA-1 - medierte sykdommer, omfattende behandling av revmatoid artritt, reduksjon av inflammatoriske responser, fremkalling av toleranse for immunostimulanter, forhindring av en immunrespons som vil resultere i frastøtning av en graft-versus-vert, eller vice-versa, eller forlenging av overlevelse av et transplantert graft. Mengden av varianten er fortrinnsvis under mengden som er toksisk for verten, eller som gjør verten betydelig mer mottagelig for infeksjoner.
Som et generelt forslag vil den farmasøytisk effektive mengden av LFA-1-antagonist-varianten som blir administrert parenteralt per dose være i området på omtrent 0,1 til 20 mg/kg av pasientens kroppsvekt per dag, hvor det typiske initielle området av LFA-1 - antagonist-varianten anvendt er omtrent 0,3 til 15 mg/kg/dag.
Som nevnt ovenfor er imidlertid disse foreslåtte mengdene av LFA-1-antagonist-varianten underlagt en stor grad av terapeutisk vurdering. Nøkkelfaktor ved valg av en passende dose og skjema er det oppnådde resultatet, som indikert ovenfor. F. eks. kan relativt høyere doser være nødvendig initielt for behandling av pågående og akutt graft-avstøtning, eller ved et senere stadium for behandling av akutt avstøtning, som er karakterisert ved en plutselig nedgang i graft-funksjon.
Når den påfølgende dosen er mindre enn 100% av den initielle dosen blir den kalkulert på basis av daglig dosering. F. eks. hvis dose-regimet består av daglige injeksjoner på 2 mg/kg/dag i to uker fulgt av en to-ukentlig dose på 0,5 mg/kg/dag i 99 dager, vil dette være ensbetydende med en påfølgende dose på omtrent 1,8% av den initielle dosen, beregnet på en daglig basis (dvs. 2/dag/100%= 0,5/14dager/x%, x=~l,8%). Fortrinnsvis er den påfølgende dosen mindre enn omtrent 50%, mer foretrukket mindre enn omtrent 25%, mer foretrukket mindre enn omtrent 10%, og mer foretrukket mindre enn omtrent 5% og mest foretrukket mindre enn omtrent 2% av den initielle dosen med LFA-1-antagonist-varianten.
For å oppnå de mest effektive resultatene for LFA-1-antagonist-varianten, avhengig av sykdommen, blir den initielle dosen gitt så tett opp til det første tegnet, diagnosen, tilsynekomsten eller forekomsten av sykdommen som mulig, eller under remisjonen av autoimmune forstyrrelser. Fortrinnsvis begynner den initielle dosen før eksponering for antigen, som i tilfellet med transplanterte grafter. Videre når den initielle dosen er før eller hovedsakelig samtidig med eksponering for antigenet, er det foretrukket at den påfølgende dosering blir utført i en lengre tidsperiode enn den initielle doseringen, spesielt for transplantater, og at den kan være en kontinuerlig, periodisk tilbakevendende opprettholdende dose som ikke trenger å være kontinuerlig hele pasientens liv.
Det foretrukne skjemaet for LFA-1-antagonist-varianten er at den initielle doseringen (dvs. administrering før eller ved tiden for den uønskede immunresponsen i en dose som blir administrert mer ikke sjeldnere enn daglig, opp til og innbefattende kontinuerlig ved infusjon) og den påfølgende doseringen er en dose administrert periodisk ikke mer enn omtrent en gang i uken. Mer foretrukket, avhengig av den spesifikke lidelsen, og spesielt for transplantasjon blir den initielle daglige dosen administrert i det minste i omtrent en uke, fortrinnsvis i det minste i to uker, etter eksponeringen for antigen, f. eks. graft, eller initieringen av en akutt immunrespons (som en autoimmun sykdom) og den påfølgende doseringen blir administrert ikke mer enn én gang annenhver uke (fortrinnsvis en gang annenhver uke) i det minste i omtrent 5 uker, foretrukket i det minste i 10 uker etter at den initielle doseringen er avsluttet.
Ved en annen foretrukket utførelsesform, spesielt hvis antagonist-varianten er et Fab eller (Fab')2 av anti-CD 11 a- eller anti-CD 18-antistoff er, vil den initielle doseringen avsluttes fra omtrent 1 dag til 4 uker etter at transplantasjonen har skjedd, mer foretrukket fra omtrent 1 uke til 3 uker, mer foretrukket fra omtrent 2 uker til 3 uker, og starter fra omtrent 1 uke før transplantasjonen skjer og fremtil omtrent samtidig med transplantasjonen.
Polypeptid-varianten blir administrert ved alle egnede metoder, omfattende parenteral, subkutan, intraperitonal, intrapulmonær og intranasal, og hvis ønskelig for lokal immunosuppresiv behandling, intralesjonal administrering (omfattende perfusjon eller på annen måte å kontakte transplantatet med antagonisten før transplantasjon). Parenterale infusjoner omfatter intramuskulær, intravenøs, intraarteriell, intraperitonal eller subkutan administrering. I tillegg blir LFA-1-antagonist-varianten passende administrert ved puls-infusjon, spesielt med synkende doser av LFA-1-antagonist-varianten. Fortrinnsvis blir dosen av en slik variant gitt ved injeksjoner, mer foretrukket intravenøse eller subkutane injeksjoner, delvis avhengig av hvorvidt administreringen er kort eller kronisk.
Polypeptid-varianten her trenger ikke å være, men kan valgfritt være formulert med ett eller flere midler som i dag anvendes for å forhindre eller behandle den aktuelle sykdommen. F. eks. ved revmatoid artritt, kan en LFA-1-antagonist-variant gis sammen med et glukokortikosteroid. I tillegg er T-celle-reseptor peptid-terapi egnet som supplerende terapi for å forebygge kliniske symptomer på autoimmun encefalomyelitt. Offner et al., Science, 251:430-432 (1991). For transplantater kan LFA-1-antagonist-varianten bli administrert samtidig med eller separat fra et immunosuppresivt agens som definert ovenfor, f. eks. cyklosporin A, for å modulere den immunosuppressive effekten. Den effektive mengden av slike andre midler avhenger av mengden av LFA-1-antagonist-varianten som er tilstede i preparatet, typen lidelse eller behandling, og andre faktorer som beskrevet ovenfor. Disse er generelt anvendt med de samme doser og administrerings-ruter som anvendt her tidligere, eller omtrent fra 1 til 99% av de hittil anvendte dosene.
De ulike autoimmune sykdommene beskrevet ovenfor blir behandlet med LFA-1 - antagonist-varianter på en slik måte at de fremkaller immunologisk toleranse for selvantigenet under angrep som er resultat av sykdommen. På denne måten ligner autoimmune sykdommer vert-versus-graft-avstøtning, og blir behandlet med LFA-1-antagonist-varianter på en analog måte. Ved disse sykdommene har imidlertid pasienten allerede en stigende immunrespons mot mål-antigenet, hvilket ikke er tilfellet ved transplantater før grafting. Det er således ønskelig å først indusere og opprettholde et transient stadium av immunsuppresjon ved konvensjonelle metoder hos slike pasienter, f. eks. ved den konvensjonelle anvendelsen av cyklosporin A eller andre konvensjonelle immunosuppresive midler (alene eller sammen med LFA-l-antagonist-variant), eller å overvåke pasienten inntil det forekommer en periode med tilbakegang (et fravær eller en vesentlig senking av patologiske eller funksjonelle indisier på autoimmunresponsen).
Fortrinnsvis blir transient immunosuppresjon indusert ved T-celle-nedgang ved å anvende konvensjonell terapi. Dette blir så fulgt av administrering av LFA-1-antagonist-varianten for å forhindre tilbakefall når det immunosuppressiv-induserende agenset blir fjernet, eller når remisjon på en annen måte motvirkes. Alternativt blir pasientens tilstand ved remisjon nøye overvåket etter signaler på oppblussing, og umiddelbart etter den initielle funksjonelle eller biokjemiske tilsynekomsten av oppblussing blir det initielle dose-regimet startet, og fortsatt inntil oppblussingen avtar. LFA-1-antagonistvariant-administrering under denne perioden utgjør den initielle dosen beskrevet andre steder.
I tilfellet med autoimmune sykdommer vil den initielle dosen vare fra omtrent 1 uke til 16 uker. Deretter blir det lavere dose opprettholdelses-regimet for LFA-1-antagonist-varianten administrert på hovedsakelig samme måte som angitt her for forbedring av graft-eller verts-avstøtning, selv om det i noen tilfeller er ønskelig å utvide den påfølgende eller opprettholdende dosen for lengre perioder enn med grafter. Hvis et antigen eller et preparat som omfatter antigenet er kjent for å være ansvarlig for autoimmunresponsen blir antigenet administrert til pasienten (valgfritt med IL-1 og/eller gamma-interferon) etter den initielle LFA-1 -antagonist-variant-dosen og antagonist-variantdosen blir deretter opprettholdt for å undertrykke regenereringen av en auto-immunrespons mot antigenet mens det minimalt immunoundertrykker pasientens respons på andre antigener.
Pasienten blir helst isolert, fortrinnsvis i et aseptisk miljø slik det idag gjøres ved transplantasjoner, ved tiden for den initielle behandlingen med LFA-1-antagonist-varianten. Pasienten må være fri for alle infeksjoner. Det er ikke nødvendig å opprettholde disse betingelsene under opprettholdelses-dosen, og dette er faktisk en av fordelene ved denne oppfinnelsen, dvs. at pasienten kan ha en hovedsakelig normal immunrespons for omkringværende antigener (andre enn transplantatet eller selvantigenet) under behandlingen med den opprettholdende dosen.
Oppfinnelsen er spesielt nyttig for å forlenge overlevelse og øke toleranse for transplanterte transplantater. Transplantatene blir eventuelt funksjonelt overvåket systematisk under den kritiske post-operative perioden (de første tre månedene) ved å anvende hvilken som helst egnet prosedyre. En slik prosedyre er radionuklid intravenøs angiografi ved å anvende 99Tcm-pertechnetat, som beskrevet av Thomsen et al., Acta Radiol., 29:138-140
(1988). I tillegg er metoden her nyttig for simultane multippel-organ-dynkinger og transplantasjoner. Toledo-Pereyra and MacKenzie, Am. Surg., 46: 161-164 (1980).
I noen tilfeller er det ønskelig å modifisere overflaten av transplantatet for slik å fremskaffe positivt eller negativt ladde grupper, som ved å anvende en egnet aminosyre eller polymer eller ved å feste en fysiologisk aksepterbar kilde av ladde funksjonelle grupper. F. eks. er en negativt ladd overflate passende for blodkar for å minske blod-propp. Det er også ønskelig i noen tilfeller å gjøre overflaten hydrofob eller hydrofil ved å koble, f. eks. fenylalanin, serin eller lysin, til overflaten. Et immunosuppresivt agens som er spesielt effektivt for disse overflate-modifikasjonene er glutaraldehyd.
Som nevnt ovenfor blir det eventuelt før transplantasjonen administrert en effektiv mengde av LFA-1-antagonist-varianten for å indusere toleranse for transplantatet. Den samme dosen og skjemaet som er anvendt for initiell post-transplantasjon kan bli anvendt. Videre, før transplantasjonen blir transplantatet eventuelt bragt i kontakt med et TGF-|3-preparat som beskrevet i US patent nr. 5.135.915, hvilket herved er tatt med i sin helhet som referanse. Kontakten involverer hensiktsmessig inkubering eller perfusjon av transplantatet med preparatet eller påføring av preparatet på én eller flere overflater av transplantatet. Behandlingen finner generelt sted i minst ett minutt, og foretrukket fra 1 minutt til 72 timer, og mer foretrukket fra 2 minutter til 24 timer, avhengig av slike faktorer som konsentrasjonen av TGF-P i preparatet, transplantatet som skal behandles og den spesielle formula-typen. Også som bemerket blir transplantatet samtidig eller separat perfusert med LFA-1-antagonist-varianten. Perfusjonen er utført ved hvilken som helst passende prosedyre. F. eks. kan et organ bli perfusert via en anordning som fremskaffer et konstant trykk av perfusat som har en trykk-regulator og overfyller plassert mellom en pumpe og organet, som beskrevet i DD 213.134 publisert 5. september 1984. Alternativt blir organet plassert i et hyperbarisk rom via en forseglende dør og perfusatet avlevert til rommet ved en pumpe som trekker fluidiumet fra reservoiret, mens brukt perfusat returneres til reservoaret av en ventil, som beskrevet i EP 125.847 publisert 21. november 1984.
Etter at transplantatet er behandlet blir det passende lagret i forlengede tidsperioder, eller anvendt med en gang i transplanterings-prosedyren. Lagringstid kan økes som beskrevet ovenfor ved å anvende et blod-substitutt i formuleringen (f. eks. perfluorkjemisk emulsjon) eller ved å perfusere transplantatet med en formulering av TGF-P som inneholder avkjølet isotonisk agens og antikoagulant fulgt av glycerol for å tillate frysing av fjernede organer uten destruksjon av cellene, som beskrevet i JP 60061501, publisert 9. april 1985. I tillegg kan organene preserveres med kjente perfusjons-fluider (omfattende TGF-P og/eller LFA-antagonist som bemerket), mens organene blir kjølt ned til frysetemperaturer, for å bevare organet semi-permanent uten celle-nekrocytose som beskrevet i US. patent nr. 4.462.215 og 4.494.385.
Med hensyn spesielt på hjerte-transplantater rapporterer Parent et al., Cryobiology, 18: 571-576 (1981) at kald koronar-perfusjon før transplantasjon ved 5°C øker beskyttelse av homotransplantatet under den initielle perioden av implanteringen. Alle disse prosedyrene, eller andre, er innenfor rammen av denne oppfinnelsen hvis det er nødvendig for transplantat-bevaring.
Før transplantasjon blir transplantatet fortrinnsvis vasket fritt for TGF-P-preparatet, ved å skylle det i en fysiologisk salt-løsning, eller ved andre midler som er egnet for dette formålet. Det er ikke ønskelig å fjerne LFA-1-antagonist-varianten før transplantasjon.
Før transplantasjonen blir verten også valgfritt gitt en eller flere donor-spesifikke blod-overføringer for å hjelpe transplantat-overlevelse. En alternativ prosedyre er å la verten gjennomgå en total lymfoid bestråling før eller etter transplantasjons-operasjonen. Hvilke som helst andre pre-transplanterings-prosedyrer som vil være av det gode for den spesielle transplantat-mottageren kan bli utført som en del av metoden ifølge denne oppfinnelsen.
4. Antistoff- fremstilling ( hvor varianten er antistoff- avledet)
( i) Start- materialer og metoder
Immunoglobuliner (lg) og visse varianter av disse er kjent og mange er fremstilt i rekombinant cellekultur. F. eks. se US patent nr. 4.475.055; EP 256.654; EP 120.694; EP 125.023; EP 255.694; EP 266.663; WO 88/03559; Faulkner et al., Nature, 298: 286 (1982); Morrison, J. Immun., 123: 793 (1979); Koehler et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA., 77: 2197
(1980); Raso et al., Cancer Res., 41: 2073 (1981); Morrison et al., Ann. Rev. Immunol., 2: 239 (1984); Morrison, Science, 229: 1202 (1985) og Morrison et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81: 6851 (1984). Reassorterte immunoglobulinkjeder er også kjent. Se f. eks. US patent nr. 4.444.878; WO 88/03565 og EP 68.763 og referanser der. Immunoglobulin-enheten i polypeptid-variantene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anskaffes fra IgG-1-, IgG-2-, IgG-3- eller IgG-4-subtyper, IgA, IgE, IgD eller IgM, men fortrinnsvis fra IgG-1 eller IgG-3.
( ii) Polvklonale antistoffer
Polyklonale antistoffer blir generelt laget i dyr ved multiple subkutane (sc) eller intraperitonale (ip) injeksjoner av det relevante antigenet og en adjuvans. Det kan være nyttig å konjugere det relevante antigenet til et protein som er immunogent i artene som skal immuniseres, f. eks. keyhole limpet hemacyanin, serum-albumin, bovin thyroglobulin eller sojabønne trypsin-inhibitor ved å anvende et bifunksjonelt eller derivatiserende agens, f. eks. maleimidobenzoyl-sulfonsuccinimid-ester (konjugasjon gjennom cystein-enheter), N-hydroksysuccinimid (gjennom lysin-enheter), glutaraldehyd, ravsyre-anhydrid, SOCI2 eller R<1>N=C=NR, hvor R og R<1> er ulike alkyl-grupper.
Dyr blir immunisert mot antigenet, immunogene konjugater eller derivater ved å kombinere 1 mg eller 1 ug av peptidet eller konjugatet (for hhv. kaniner eller mus) med tre volumer Freunds komplette adjuvans, og injisere løsningen intradermalt ved flere steder. En måned senere blir dyrene forsterket med 1/5 til 1/10 av den originale mengden av peptidet eller konjugatet i Freunds komplette adjuvans ved subkutan injeksjon på flere steder. Syv til 14 dager senere tas blod fra dyrene, og serumet testes for antistoff-titer. Dyr blir forsterket til titeret flater ut. Fortrinnsvis blir dyrene forsterket med konjugatet av det samme antigenet, men konjugert til et annet protein og/eller gjennom et annet krysskoblings-reagens. Konjugater kan også lages i rekombinante cellekulturer som fusjonsproteiner. Aggregerende agens så som alun blir hensiktsmesig brukt for å øke immunresponsen.
( iii) Monoklonale antistoffer
Monoklonale antistoffer blir anskaffet fra en populasjon av hovedsakelig homogene antistoffer, dvs. de individuelle antistoffene som omfatter populasjonen er identiske bortsett fra mulige naturlig forekommende mutasjoner som kan være tilstede i mindre mengder. Det modifiserte "monoklonalet" indikerer således den karakteren ved antistoffet at det ikke er en blanding av ulike antistoffer.
F. eks. kan de monoklonale antistoffene lages ved å anvende hybridoma-teknikken først beskrevet av Kohler and Milstein, Nature, 256: 495 (1975) eller lages ved rekombinante DNA-teknikker (Cabilly et al., supra).
Ved hybridoma-metoden blir en mus eller et annet passende vertsdyr, så som en hamster, immunisert som ovenfor beskrevet for å frigjøre lymfocytter som produserer eller som kan produsere antistoffer som vil spesifikt binde proteinet som er anvendt for immunisering. Alternativt kan lymfocytter bli immunisert in vitro. Lymfocytter blir så fusert med myelomaceller ved å anvende et passende fusjonsagens, så som polyetylen-glykol, for å danne en hybridom-celle (Goding, Monoclonal Anitbodies: Principles and Practice, s. 59-103 [Acadamic Press, 1968]).
Hybridoma-cellene preparert slik sås ut og dyrkes i passende dyrkningsmedium som fortrinnsvis omfatter én eller flere substanser som inhiberer veksten av eller overlevelsen av ikke-fuserte, foreldre-myeloma-celler. F. eks. hvis foreldre-myeloma-cellehe mangler enzymet hypoxantin-guanin-fosforibosyl-transferase (HGPRT eller HPRT) vil dyrkningsmediet for hybridomene typisk inneholde hypoxantin, aminopterin, og tymidin (HAT-medium), hvilke substanser hemmer veksten av HGPRT-defekte celler.
Foretrukne myelomaceller er de som fuserer effektivt, støtter stabil høy-nivå produksjon av antistoff fra de valgte antistoff-produserende cellene, og er sensitive for et medium så som HAT-medium. Blandt disse foretrukne myelomacellelinjene er murine myelom-cellelinjer, så som de avledet fra MOPC-21 og MPC-11 mus-tumorer som er tilgjengelige fra Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA, og SP-2-celler som er tilgjengelig fra American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA. Humane myelom- og mus-human heteromyelom-cellelinjer er også beskrevet for produksjon av humane monoklonale antistoffer (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 [1984]; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, s. 51-63 [Marcel Deker, Inc., New York, 1987]).
Kultur-medium hvor hybridoma-celler dyrkes undersøkes for produksjon av monoklonale antistoffer rettet mot antigenet. Fortrinnsvis blir bindingsspesifisiteten av monoklonale antistoffer som er produsert av hybridoma-celler bestemt ved immunopresipitering eller ved in vifrø-bindingstester, så som radioimmunassay (RIA) eller enzym-koblet immunoabsorbent assay (ELISA).
Bindingsaffiniteten for det monoklonale antistoffet kan f. eks. bli bestemt ved Scatchard-analysen av Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980).
Etter at hybridoma-celler er identifisert som produserer antistoffer med den ønskede spesifisiteten, affiniteten og/eller aktiviteten kan klonene bli subklonet ved begrenset fortynnings-prosedyrer og dyrket ved standard metoder (Goding, supra). Passende kultur-media for dette formålet omfatter f. eks. D-MEM eller RPMI-1640-mediumet. I tillegg kan hybridoma-cellene dyrkes in vivo som ascites-tumorer hos et dyr.
De monoklonale antistoffene som blir utskilt av subklonene blir hensiktsmessig separert fra kultur-mediet, ascites-væsken eller serum ved konvensjonelle immunoglobulin-renseprosedyrer så som f. eks. protein A-sepharose, hydroksyapatitt-kromatografi, gelelektroforese, dialyse eller affinitets-kromatografi.
DNA som koder for de monoklonale antistoffene blir lett isolert og sekvensert ved konvensjonelle teknikker (f. eks. ved å anvende oligonukleotid-prober som kan spesifikt binde gener som koder for de tunge og lette kjedene av murine antistoffer). Hybridoma-cellene fungerer som en foretrukket kilde for slikt DNA. Når det er isolert kan DNAet bli plassert i ekspresjonsvektorer, som så blir transfektert i vertsceller slik som E. co/i-celler, simian COS-celler, Chinese hamster ovarie- (CHO) celler eller myeloma-celler som ikke på annen måte produserer immunoglobulin-protein for å oppnå syntesen av monoklonale antistoffer i de rekombinante vertscellene. Oversiktsartikler om rekombinant ekspresjon i bakterier av DNA som koder for antistoffet omfatter Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) og Pluckthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992).
Ved en ytterligere utførelsesform kan antistoffer eller antistoff-fragmenter bli isolert fra antistoff-fagbiblioteker som er generert ved bruk av teknikken beskrevet av McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990), ved å anvende det ønskede antigenet så som CD1 la, CD18, IgE eller HER-2 for å selektere for et passende antistoff eller antistoff-fragment. Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) og Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) beskriver isolering av hhv. murine og humane antistoffer ved å anvende fag-biblioteker. Følgede publikasjoner beskriver produksjon av høy-affinitet (nM-området) humane antistoffer ved kjede-shuffling (Mark et al., Bio/Technology, 10: 779-783 [1992]), så vel som kombinatorisk infeksjon og in vivo rekombinasjon som en strategi for å konstruere veldig store fag-biblioteker (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 [993]). Disse teknikkene er således levedyktige alternativer til tradisjonelle monoklonal-antistoff-hybridomateknikker for å isolere "monoklonale" antistoffer.
DNAet kan også bli modifisert ved f. eks. å substituere den kodende sekvensen for human tung- og lettkjede konstante domener for de homologe murine sekvensene (Cabilly et al., supra, Morrison et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA., 81: 6851 [1984], eller ved kovalent å koble den immunoglobulin kodende sekvensen med hele eller deler av den kodende sekvensen fra et ikke-immunoglobulin-polypeptid.
Slike ikke-immunoglobulinpolypeptider erstatter vanligvis de konstante domenene til et antistoff, eller de variable domenene til et antigen-forbindelsessetet fra et antistoff for å skape et kimært bivalent antistoff som omfatter ett antigen-forbindelsessete med spesifisitet for et antigen og et annet antigen-forbindelsessete som har spesifisitet for et annet antigen.
Kimære eller hybride antistoffer kan også fremstilles in vitro ved å anvende kjente metoder innen syntetisk protein-kjemi, omfattende de som involverer krysskoblende agens. F. eks. kan immunotoksiner bli konstruert ved å anvende en disulfid-utbyttingsreaksjon eller ved å danne en tioeter-binding. Eksempler på passende reagenser for dette formål omfatter iminotiolat og metyl-4-merkaptobutyrimidat.
For diagnositiske anvendelser kan variantene her som er avledet fra antistoffer typisk bli merket med en detekterbar enhet. Den detekterbare enheten kan være hvilken som helst som kan produsere, enten direkte eller indirekte, et detekterbart signal. Den detekterbare enheten kan f. eks. være en radioisoptop, så som JH, C, 3iP, " S eller <125>I; en fluorescerende eller kjemilluminiscerende forbindelse, så som fluorescein-isotiocyanat, rodamin eller luciferin: radioaktive isotop-merker, så som f. eks. <1>251, <32>P, <14>C eller 3H eller et enzym så som alkalisk fosfatase, beta-galaktosidase eller pepperrot-peroksidase.
Alle kjente metoder innen feltet for separat å konjugere polypeptid-varianten til den detekterbare enheten kan anvendes, omfattende metodene beskrevet av Hunter et al., Nature, 144: 945 (1962); David et al., Biochemistry, 13: 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol: Meth., 40: 219 (1981); og Nygren, J., Histochem. and Cytochem., 30: 407 (1982).
( iv) Humaniserte og humane antistoffer
Metoder for å humanisere ikke-humane antistoffer er godt kjent innen feltet. Generelt har et humanisert antistoff en eller flere aminosyre-enheter introdusert fra en kilde som er ikke-human. Disse ikke-humane aminosyre-enhetene refereres ofte til som "import"-enheter, som er typisk tatt fra et "import"-variabelt domene. Humanisering kan i hovedsak bli utført ved å følge metoden til Winter og medarbeidere (Jones et al., Nature, 321: 522-525 [1986]; Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 [1988]; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536
[1988]), ved å erstatte gnager CDRer eller CDR-sekvenser for de korresponderende sekvensene fra et humant antistoff. I samsvar med dette er slike "humaniserte" antistoffer, kimære antistoffer (Cabilly et al., supra), hvor betydelig mindre enn et intakt humant variabelt domene er erstattet med den korresponderende sekvensen fra en ikke-human art. I praksis er humaniserte antistoffer typisk humane antistoffer hvor noen CDR-enheter og muligens noen FR-sekvenser er erstattet med enheter fra analoge setet i gnager-antistoffer.
Valget av humane variable domener, både lette og tunge, som skal bli anvendt for å lage de humaniserte antistoffene er veldig viktig for å redusere antigenisiteten. Ifølge den såkalte "best tilpassede"-metoden blir sekvensen av det variable domenet fra et gnager-antistoff undersøkt mot hele biblioteket av kjente humane variable-domene sekvenser. Den humane sekvensen som er nærmest den fra gnageren blir så akseptert som det humane rammeverket (FR) for det humaniserte antistoffet (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 [1993]; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901 [1987]). En annen metode anvender et spesielt rammeverk avledet fra konsensussekvensen av alle humane antistoffer av en spesiell subgruppe av lett- eller tung-kjeder. Det samme rammeverket kan bli anvnedt for flere ulike humaniserte antistoffer (Carter et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA., 89: 4285 [1992]; Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 [1993].
Det er videre viktig at antistoffer som blir humanisert beholder den høye affiniteten for antigenet og andre ønskelige biologiske egenskaper. For å oppnå dette målet, blir i samsvar med den foretrukne metoden, humaniserte antistoffer produsert ved en analyseprosess av foreldre-sekvensene og ulike konseptuelle humaniserte produkter, ved å anvende tre-dimensjonale modeller for foreldre- og humaniserte sekvenser. Tre-dimensjonale immunoglobulin-modeller er vanlig tilgjengelige, og er kjent for fagfolk innen feltet. Dataprogrammer er tilgjengelig som illustrerer og viser sannsynlig tre-dimensjonal konformasjonsstruktur av valgte kandidat-immunoglobulin-sekvenser. Inspeksjon av disse visningene tillater analyse av den sannsynlige rollen for enhetene ved funksjonen av kandidat-immunoglobulinsekvensen, dvs. analysen av enheter som påvirker evnen kandidat-immunoglobulinet har til å binde dets antigen. På denne måten kan FR-enheter bli valgt og kombinert fra konsensus- og import- sekvenser, slik at de ønskede antistoff-karakteristikkene, så som økt affinitet for mål-antigenet(antigenene) oppnås. Generelt er CDR-enhetene direkte, og i stor grad, involvert i påvirkning av antigen-binding.
Alternativt er det nå mulig å produsere transgene dyr (f. eks. mus) som kan, ved immunsering, produsere et fullt repertoir av humane antistoffer ved fravær av endogen immunoglobulin-produksjon. F. eks. er det beskrevet at den homozygote delesjonen av antistoff tungkjede-hengselsregion- (Jh) genet i kimære og kimcelle-linje mutante mus resulterer i komplett inhibering av endogent antistoff-produksjon. Overføring av det humane kimcelle-linje immunoglobulin-genområdet i slike kimcelle- mutante mus vil resultere i produksjon av humane antistoffer ved antigen-utfordring. Se f. eks. Jakobovits et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90: 2551-255 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol, 7: 33 (1993). Humane antistoffer kan også bli produsert ved fag-display-biblioteker (Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381
[1991]; Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 [1991].
( v) Bispesifikke antistoffer
Bispesifikke antistoffer (BsAber) er antistoffer som har bindingsspesifisitet for i det minste to ulike antigener. Bispesifikke antistoffer kan bli avledet fra full-lengde antistoffer eller antistoff-fragmenter (f. eks. F(ab')2-bispesifikke antistoffer).
Metoder for å lage bispesifikke antistoffer er kjent innen feltet. Tradisjonell produksjon av full-lengde bispesifikke antistoffer er basert på ko-ekspresjonen av to immunoglobulin tungkjede-lettkjede-par, hvor de to kjedene har ulike spesifisiteter (Millstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 [1983]). På grunn av tilfeldig utvalg av immunoglobulin tung- og lettkjeder, produserer disse hybridomene (kvadromer) en potensiell blanding av 10 ulike antistoff-molekyler, av hvilke bare ett har den korrekte bispesifikke strukturen. Rensing av det korrekte molekylet, som vanligvis blit utført ved affinitets-kromatografitrinn, er heller tungvint, og produktutbyttet er lavt. Lignende prosedyrer er beskrevet i WO 93/08829, publisert 13. mai 1993, og i Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).
Ifølge en annen og mer foretrukket fremgangmåte blir antistoff-variable domener med de ønskede bindingsspesifisitetene (antistoff-antigen kominasjonsseter) kondensert med immunoglobulin konstant domene-sekvenser. Fusjonen er fortrinnsvis med et immunoglobulin tungkjede-konstant domene, omfattende i det minste en del av hengsels-, CH2- og CH3-regionene. Det er foretrukket å ha den første tungkjede- konstante regionen (CH1) som omfatter setet som er nødvendig for lettkjede-binding, tilstede i det minste i en av fusjonene. DNA som koder for irnmunoglobulin-tungkjede-fusjoner, og hvis ønskelig, immunoglobulin-lettkjeden blir satt inn i separate ekspresjonsvektorer, og blir kotransfektert i en egnet vertsorganisme. Dette gir stor fleksibilitet for å tilpasse de gjensidige proporsjonene av de tre polypeptid-fragmentene ved utførelsesformer når ulike mengder av de tre polypeptid-kjedene er anvendt ved konstruksjonen tilveiebringer de optimale utbyttene. Det er imidlertid mulig å sette inn de kodende sekvensene for to eller eller tre polypeptid-kjeder i én ekspresjonsvektor når ekspresjonen av i det minste to polypeptid-kjeder i likt forhold gir høye utbytter, eller når forholdene ikke er av noen spesiell betydning.
Ved en foretrukket utførelsesform av denne fremgangsmåten blir bispesifikke antistoffer sammensatt av en hybrid immunoglobulin-tungkjede med en første bindingsspesifisitet på en arm, og et hybrid immunoglobulin-tungkjede-lettkjede-par (som tilveiebringer en andre bindingsspesifisitet) på den andre armen. Det ble funnet at denne asymmetriske strukturen forenklet separeringen av den ønskede bispesifikke forbindelsen fra uønskede immunoglobulin-kjede-kombinasjoner, ettersom tilstedeværelsen av en immunoglobulm-lettkjede i bare en halvdel av det bispesifikke molekylet gir en enkel måte for separering. Denne fremgangsmåten er beskrevet i WO 94/04690, publisert 3. mars 1994. For ytterligere detaljer om genererinng av bispesifikke antistoffer, se f. eks. Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).
Bispesifikke antistoffer omfatter krysskoblede eller "heterokonjugerte" antistoffer.
F. eks. kan et av antistoffene i heterokonjugatet bli koblet til avidin og det andre til biotin. Slike antistoffer er f. eks. foreslått for å målrette immunsystemceller mot uønskede celler (US patent nr. 4.676.980) og for behandling av HIV-infeksjon (WO 91/00360, WO 92/200373 og EP 03089). Heterokonjugerte antistoffer kan lages ved å anvende alle konvensjonelle kryss-koblingsmetoder. Slike krysskoblende midler er velkjent innen feltet, og er beskrevet i US patent nr. 4.676.980, sammen med en rekke krysskoblings-teknikker.
Teknikker for å generere bispesifikke antistoffer fra antistoff-fragmenter er også beskrevet i litteraturen. F. eks. kan bispesifikke antistoffer bli fremstilt ved å anvende kjemisk kobling. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) beskriver en prosedyre hvor intakte antistoffer er proteolytisk spaltet for å generere F(ab')2-fragmenter. Disse fragmentene blir redusert i nærvær av det ditiol-komplekserende-agenset natrium-arsenitt for å stabilisere tilstøtende ditioler, og forhindre intermolekylær disulfid-dannelse. De genererte Fab'-fragmentene blir så konvertert til tionitrobenzoat- (TNB) derivater. Ett av Fab'-TNB-derivatene blir så rekonvertert til Fab-tiol ved reduksjon med merkaptoetylamin, og blir blandet med en ekvimolar mengde av det andre Fab'-TNB-derivatet for å danne BsAb. BsAb som er produsert kan bli anvendt for den selektive immobiliseringen av enzymer.
Ny utvikling har forenklet den direkte gjenvinningen av Fab'-SH-fragmenter fra E. coli, som kan bli kjemisk koblet for å danne bispesifikke antistoffer. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) beskriver produksjonen av et helt humanisert BsAb-F(abV molekyl. Hvert Fab'-fragment ble separat sekretert fra E. coli og underlagt direkte kjemisk kobling in vitro for å danne BsAb. BsAb som ble dannet slik hadde evnen til å binde celler som overuttrykker HER2-reseptoren, og normale humane T-celler, så vel som å utløse den lytiske aktiviteten av humane cytotoksiske lymfocytter mot humane bryst-tumor-mål. Se også Rodrigues et al., Int. J. Cancers, (Suppl.) 7:45-50 (1992).
Ulike teknikker for å lage og isolere BsAb-fragmenter direkte fra rekombinant cellekultur er også beskrevet. F. eks. blir bispesifikke F(ab')2-heterodimerer produsert ved å anvende leucin-zippere. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992). Leucin-zipper-peptidene fra Fos- og Jun-proteinene ble koblet til Fab'-andeler fra to ulike antistoffer ved genfusjon. Antistoff-homodimerene ble redusert ved hengselsregionen for å danne monomerer, og så re-oksydert for å danne antistoff-heterodimerene. "Diabody"-teknologien beskrevet av Hollinger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90: 6444-6448 (1993) har fremskaffet en alternativ mekanisme for å lage BsAb-fragmenter. Fragmentene omfatter et tungkjede-variabel-domene (Vh) koblet sammen med et lettkjede variabelt domene (Vl) med en linker som er for kort til å tillate parring mellom de to domene på den samme kjeden. I samsvar med dette blir Vh- og VL-domenene fra et fragment tvunget til å parres med de komplementære Vl- og Vn-domenene fra et annet fragment, og derved danne to antigen-bindingsseter. En annen strategi for å lage BsAb-fragmenter ved anvendelse av enkelkjede Fv- (sFv) dimere er også rapportert. Se Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994). Disse forskerene designet et antistoff som omfattet Vh- og VL-domenene fra et første antistoff koblet , ved en 25-aminosyre-enhet-linker til Vh- og VL-domenene fra et andre antistoff. Det refoldete molekylet binder til fluorescein og T-celle-reseptoren, og redirigerer lysen av humane tumor-celler som har fluorescein kovalent koblet til overflaten.
5. Anvendelser av antistoff- varianter
Variant-antistoffer er nyttige ved diagnostiske tester for et interessant antigen, f. eks. dets produksjon i spesifikke celler, vev eller serum. Variant-antistoffer blir merket på samme måten som beskrevet ovenfor og/eller blir immobilisert på en uløselig matriks. Ved en utførelsesform av antigen-bindingstesten blir et antistoff-preparat som binder til antigenet, immobilisert på en uløselig matriks, testprøven blir brragt i kontakt med det immobiliserte variant-antistoff-preparatet for å adsorbere antignet, og det imobiliserte antigenet blir så bragt i kontakt med variant-antistoffer som er spesifikke for antigenet, som bestemt ved unike merker så som diskrete fluoroforer eller lignende. Ved å bestemme tilstedeværelsen og/eller mengden av hvert unike merke kan den relative andelen, og mengden, av antigenet bli bestemt.
Variant-antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse er også nyttige ved passiv immunisering av pasienteter.
Variant-antistoffene er også nyttige ved affinitets-rensing av et interessant antigen fra rekombinant cellekultur eller naturlige kilder.
Egnede diagnostiske tester for et antigen og dets variant-antistoffer er velkjent per se.
I tillegg til biotestene beskrevet i eksemplene nedenfor hvor kandidat-varianten er testet for å se om den har passende biologisk aktivitet og økt halverigstid, er kompetitiv-sandwich- og sterisk-inhiberingsimmimotest-teknikker nyttige. Kompetitiv- og sandwich-metodene anvender et fase-separeringstrinn som en integrert del av metoden, mens steriske inhiberings-tester blir utført i en enkelt reaksjons-blanding. De samme prosedyrene blir anvendt for testen av antigenet og for substanser som binder antigenet, til tross for at visse metoder vil favoriseres avhengig av molekylvekten til substansen som blir testet. Substansen som skal testes refereres derfor til som en analyt, uavhengig av dens status på annet vis som et antigen eller variant-antistoff, og proteiner som binder analyten er betegnet bindingspartnere, enten de er antistoffer, celleoverflate-reseptorer eller antigener.
Analytiske metoder for antigenet eller deres variant-antistoffer vil alle anvende én eller flere av de følgende reagensene: merket analyt-analog, immobilisert analyt-analog, merket bindingspartner, immobilisert bindingspartner og steriske konjugater. De merkete reagensene er også kjent som "sporstoff".
Immobilisering av reagenser er nødvendig for visse testmetoder. Immoblisering
medfører separering av bindingspartneren fra eventuell analyt som gjenstår fri i løsning. Dette blir passende utført ved enten å gjøre bindingspartneren eller analyt-analogen uoppløselig før testprosedyren, som ved adsorbsjon til en vann-uløselig matriks eller overflate (Bennich et al., US patent nr. 3.720.760) ved kovalent kobling (f. eks. ved å anvende glutaraldehyd-krysskobling) eller ved å gjøre partneren eller analogen uløselig etterpå, f. eks. ved immunopresipitering.
Andre testmetoder, kjent som kompetitive- eller sandwich-tester er godt kjent og vidt anvendt i den kommersielle diagnostiske industrien.
Kompetitive tester bygger på evnen en sporstoff-analog har til å konkurrere med testprøve-analyten om et begrenset antall bindingsseter på en felles bindingspartner. Bindingspartneren blir generelt insolubilisert før eller etter konkurreringen, og så blir sporstoffet og analyten som er bundet til bindingspartneren separert fra ikke-bundet sporstoff og analyt. Denne separeringen blir utført ved dekantering (hvor bindingspartneren var forhånds-insolubilisert) eller ved sentrifugering (hvor bindingspartneren ble presipitert etter den kompetitive reaksjonen). Mengden av testprøve-analyt er omvendt proporsjonal med mengden av bundet sporstoff som målt ved mengden av markør-substans. Dose-respons-kurver med kjente mengder analyt blir fremstilt og sammenlignet med testresultatene for kvantitativt å bestemme mengden av analyten som er tilstede i testprøven. Disse testene kalles ELISA-systemer når enzymer er anvendt som de detekterbare markørene.
En annen type kompetitiv test, kalt "homogen"-test, trenger ikke en fase-separasjon. Et konjugat av et enzym med analyten blir fremstilt og anvendt slik at når anti-analyten binder til analyten modifiserer tilstedeværelse av anti-analyt enzymaktiviteten. I dette tilfellet blir antigenet eller dets immunologisk aktive fragmenter konjugert med en bifunksjonell organisk bro til et enzym så som peroksidase. Konjugater er valgt for anvendelse med anti-polypeptidet slik at binding av anit-polypeptidet hindrer eller potensierer enzymaktiviteten av merket. Denne metoden per se er vidt anvendt under navnet EMIT.
Steriske konjugater er anvendt ved steriske hindringsmetoder for homogene tester. Disse konjugatene blir syntetisert ved kovalent å koble et lavmolekylvekt-hapten til en liten analyt slik at antistoff til hapten i hovedsak ikke har evnen til å binde konjugatet ved samme tid som anti-analyten. Under denne test-prosedyren vil test-analytet tilstede i testprøven binde anti-analyten, og derved tillate anti-haptenet å binde konjugatet, noe som resulterer i en endring av karakteren av konjugat-haptenet, f. eks. en endring i fluorescens når haptenet er et fluorofor.
Sandwich-tester er spesielt nyttige ved bestemmelse av polypeptid-varianter eller polypeptid-variant-antistoffer. Ved sekvensielle sandwich-tester blir en immobilisert bindingspartner anvendt for å adsorbere testprøve-analyten, testprøven fjernes ved vasking, den bundete analyten anvendes for å adsorbere merket bindingspartner og bundet materiale blir så separert fra rest-sporstoff. Mengden bundet sporstoff er direkte proporsjonal med testprøve-analyten. Ved "samtidige"-sandwich-tester blir testprøven ikke separert før tilsetning av merket bindingspartner. En sekvensiell sandwich-test som anvender et monoklonalt antistoff som et antistoff og et polyklonalt antistoff som det andre, er nyttig ved testing av prøver for antigen aktivitet.
De følgende eksemplene er gitt som illustrasjon.
EKSEMPEL 1
METODER
Plasmidkonstruksjoner
Templat-plasmidet, pH52, anvendt for å konstruere Fabene (heretter referert til som Fab) anvendt i dette eksemplet var avledet fra plasmidet pB0475, beskrevet av Cunningham et al., Science, 243: 1330-1336 (1989). To flomHI-seter som flankerer Fl-origoet ble fjernet fra pB0475, og DNA som koder for anti-CD 18 Fab H52, versjon OZ (Eigenbrot et al., Proteiner, 18: 49-62 [1994]) ble anvendt istedenfor DNA som koder for humant vekst-faktor-hormon ved å anvende EcoRV- og Sphl- setene. pH52 omfatter DNA som koder for anti-CD 18 Fab H52 (versjon OZ), STU-signalpeptidene fra lett- og tungkjeden, alkalisk fosfatase-promoter-regionen, en M13-hjelpefag-region og ampicillin-resistens. Fab-varianter ble konstruert ved Kunkel-mutagenese (Kunkel et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA., 82:488-492 [1985]) fra pH52 ved å anvende de følgende oligonukleotidene: oligo VIA 5' GTGACCGTGCCTCACCAGAGCTTGGGCAC3' (SEKV. ID. NR.: 12) endrer Serl95-Serl96 til Hisl95-Glnl96
oligo V1B 5'TGGCACCCTCCCCTAAGAACTCGAGCATGATCAGC-AACACACCGGCCCTGGGC3' (SEKV. ID. NR.: 13)
endrer Serl27-Ser-Lys-Ser-Thr-Ser-Gly-Gly-Thr-Ala-Alal39 (SEKV. ID. NR.: 14)
til Serl27-Pro-Lys-Asn-Ser-Ser-Met-Ile-Ser-Asn-Thr-Pro-Alal39 (SEKV. ID. NR.: 15)
oligo V1C 5TGGCACCCTCCAAATCGAGCATCACAGCGGCCCT3' (SEKV. ID. NR.: 16) endrer Serl27-Ser-Lys-Ser-Thr-Ser-Gly-Gly-Thrl37 (SEKV. ID. NR.: 17)
til Serl27-Lys-Ser-Ser-Ile-Thrl37 (SEKV. ID. NR.: 18)
oligo V2 5TGGTGACCGTGATCTCGAGCCACTTGGGCCAGCAGACCTACATC3'
(SEKV. ID. NR.: 19)
endrer Vall93-Pro-Ser-Ser-Ser-Leu-Gly-Thr-Gln203 (SEKY. ID. NR.: 20)
til Vall93-Ile-Ser-Ser-His-Leu-Gly-Gln-Gln203 (SEKV. ID. NR.: 21)
Aminosyrerestnummere er i samsvar med nummersystemet beskrevet i Kabat et al., supra, NIH Publ. nr. 91-3242, Vol. I, s. 647-669 (1991).
Fab vl inkorporerte oligoene VIA og V1C; Fab vlb inkorporerte oligoene VIA og V1B; Fab v2 inkorporerte oligo V2. Plasmider som koder for Fab vl, Fab vlb og Fab v2 ble valgt, og DNA-sekvensene ble sjekket ved å anvende dideoksynukleotid-sekvensering (Sequenase™ protokoll, United States Biochemical), F(ab')2-konstrukter ble laget ved å sette inn DNA som koder for IgGl-hengselsregionen fulgt av en "leucin-zipper" ved C-terminalen av H52 tung-konstant-domenet. Den innsatte aminosyre-sekvensen var:
CPPCPAPEIXGGRMKQLEDKVEEOIXSKNYHLENEVARLKKLVGER (SEKV. ID. NR.:
22).
Et annet sett av Fab-versjoner er basert på Fab vlb, dvs. varianten som viste lengre halveringstid, ved anvendelse av de følgende oligonukleotidene:
endrer Asnl36 til Argl36 endrer Serl97 til Asnl97 og Gln203 til Lys203
Fab v3 inkorporerer oligo VID; Fab v4 inkorporerer oligo VIE; Fab v5 inkorporerer oligo V1F; Fab v6 inkorporerer oligo VIG.
Ekspresjon av DNA som koder for variantene
For hver variant ble plasmid-DNA transformert i E. coli. Transformantene ble så
platet ut på Luria broth (LB)-plater som omfatter 5 Ug/mL karbenicillin og inkubert ved 37°C natten over. En enkelt koloni ble inokulert i 5 mL [LB + 5 Ug/mL karbenicillin] og dyrket i 6-7 timer ved 37°C. 5-mL kulturen ble så satt til 500 mL AP5-minimalt medium i en 2 L flaske og dyrket i 16 timer ved 37°C.
AP5-minimalmedium er laget som følger: Per 1 liter tilsettes 1,5 g glukose (Sigma™ G-7021), 2,2 g casaminosyrer teknisk (Difco™ 0231-01-0), 0,3 g sertifisert gjær-ekstrakt (Difco™ 0127-01-7), 0,19 g MgS04, vannfri eller 0,394 g MgS04.7H20 (Sigma™ M2773), 1,07 g ammonium-klorid (Sigma™ A9434), 0,075 g KC1 (Sigma™ P5405), 4.09 g NaCl (Sigma™ S3014), 120,0 mL IM trietanolamin pH 7,4, qs til 1,0 L med Super-Q™ vann, så vel som 1 M trietanolamin pH 7,4, bestående av 133,21 mL trietanolamin, Liquid (Sigma T1377) og 950 mL Super-Q™ vann, pH til 7,4 med HC1 (Mallinckrodt™ 2612), qs til 1 L med Super-Q™ vann. Dette blir filtrert gjennom et 0,1 um Sealkleen™-filter og lagret ved 2-8°C. Holdbarheten er 6 månder.
Cellene ble spunnet i en lL-sentrifugeflaske ved 3000 rpm i 30 minutter, supernatanten ble dekantert, og de pelleterte cellene frosset i en time. Pelleten ble resuspendert i 10 mL kald TE-buffer (10 mM TRIS, 1 mM EDTA, pH 7,6) med 100 ul 0,1 M benzamidin (Sigma) tilsatt. Den resuspenderte pelleten ble ristet på is i en time, spunnet ved 18.000 rpm i 15 minutter, og supernatanten dekantert og holdt på is.
Supernatanten ble så sendt over en protein-G-Sepharose™ FastFlow (Pharmacia) kolonne [0,5 mL skikt volum] som tidligere var ekvilibrert ved å sende 10 mL TE-buffer gjennom kolonnen. Kolonnen ble så vasket med 10 mL TE-buffer, og Fab ble eluert med 2,5 mL 100 mM eddiksyre, pH 2,8 i et rør som inneholder 0,5 mL TRIS pH 8,0. Eluatet ble konsentrert i en Centricon-30™- (Amicon) sentrifuge til 0,5 mL, 2 mL fosfatbufret saltoppløsning ble satt til det konsentrerte eluatet, og den resulterende blandingen ble igjen konsentrert til 0,5 mL. SDS-PAGE-geler ble kjørt for å bekrefte at protein var produsert.
Analytiske metoder anvendt under renseprosedvren for anti- CD 11/ CD18 Fab- varianter og F( ab') 2- antistoff- fragment.
SDS-polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) og to ulike høy-utførelses-væske-kromatografi (HPLC) metoder ble anvendt for å analysere produktene som ble oppnådd i hvert trinn av renseprosessen. HPLC-metodene anvendt omfatter revers fase kromatografi og kation-utbyttings-kromatografi, som ble utført på et WATERS™ HPLC-system.
Revers-fase kromatografi ble utført på en revers-fase PLRP-S™ 4,6 x 50 mm kolonne, 8 mm partikkelstørrelse (Polymer Laboratories, Shropshire, UK), holdt ved 50°C. Proteinene ble eluert ved å anvende en økende lineær gradient fra 31%B til 41%B. Buffer A omfattet 0,1% trifluoreddiksyre i deionisert vann, og buffer B omfattet 0,1% trifloreddiksyre i HPLC-kvalitets-acetonitril. Strøningshastigheten ble holdt på 2 mL/min, og protein-profilen ble avlest ved 214 nm.
Analyse ved kation-utbyttingskromatografi ble utført på en Bakerbond karboksy-sulfon (CSX)™ 50 x 4,6 mm kolonne (J. T. Baker Phillipsburg, NJ) holdt ved 55°C. Proteinene ble eluert ved å anvende en økende lineær gradient fra pH 6,0 til pH 8,0 med en srømingshastighet på 2 mL/min ved å anvende en deteksjonsbølgelengde på 280 nm. Buffer A omfattet 16 mM hver av HEPES/PIPES/MES, pH 6,0 og buffer B omfattet 16 mM hver av HEPES/PIPES/MES, pH 8,0. For separeringen av de ulike Fab-variantene ble en lineær gradient kjørt i 22 min. fra 25% til 56% B. For separeringen av Zipper-F(ab')2 og F(ab')2-antistoff-fragmenter ble den lineære gradienten kjørt fra 40% til 100%B på 22 min.
SDS-PAGE-analyse ble utført på forhåndsstøpte Novex™-geler (Novex, San Diego, CA). Proteinene ble farget ved å anvende Morrissey sølvfargingsmetoden. Morrissey, Anal. Biochem., 117: 307-310 (1981).
Rensing av anti- CD 11/ CD18 Fab- antistoff- fragment og Fab- varianter
Anti-CD 11/CD18 Fab-antistoff-fragment og de ulike Fab-variantene ble isolert ved å anvende det samme ekstraksjons- og rense-skjemaet.
Ekstraksion
Frosne cellepelleter (100g) ble resuspendert ved romtemperatur i 120 mM MES-buffer, pH 6,0, omfattende 5 mM EDTA (5 ml buffer per g. cellepellet), og fullstendig ødelagt ved tre gjennomganger gjennom en mikrofluidizer (Microfluidics Corporation, Newton, MA). Homogenatet ble justert til 0,25% (volum/volum) polyetylenimin (PEI), og det faste avfallet ble fjernet ved sentrifugering (7280 x g, 30 min., 4°C).
ABX kromatografi
Supernatanten som inneholder antistoff-fragmentet ble fortynnet til en ledningsevne på 2,5 millisiemens med renset vann, filtrert gjennom et 0,22-mikron filter (Suporcap-50™, Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan), og så satt på en 1,6 x 9,5 cm Bakebond ABX-kolonne (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) ekvilibrert i 50 mM MES/5 mM dinatrium EDTA, pH 6,0 (buffer A). Effluenten ble UV-undersøkt ved 280 nm. Etter påføring ble kolonnen vasket med buffer A inntil UV-sporet returnerte til basallinjen. Antistoff-fragmenter ble eluert med en 20-kolonnevolums-gradient fra 0 til 100 mM ammoniumsulfat i buffer A. Fraksjoner ble analysert på en kation-utbyttingskolonne som beskrevet i analytisk metode-seksjonen ovenfor, og slått sammen i henhold til det.
SP Sepharose høv- utførelses ( SPHP) kromatografi
ABX-bassenget ble fortynnet med vann for injeksjon (WFI) til en ledningsevne på mindre enn 4 mS og applisert på en SPHP 1,6 x 9,2 cm kolonne (Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ), ekvilibrert med 25 mM MOPS-buffer, pH 6,9. Separering ble oppnådd ved en 20-kolonnevolums lineær gradient fra 0 til 200 mM natriumacetat i 25 mM MOPS-buffer, pH 6,9. Fraksjoner ble analysert ved CSX HPLC og SDS-PAGE som beskrevet i analytisk metode-seksjonen ovenfor, og slått sammen i henhold til den.
Formulering
SPHP-bassengene som inneholdt antistoff-fragmentene ble konsentrert til 5 mg/mL ved å anvende Amicon røreceller og YMlO-membranfiltere (Amicon, Inc. Beverly, MA). De rensede og konsentrerte antistoff-prøvene ble buffer-utbyttet i fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) ved gel-permeabel-kromatografi på en Sephadex™ G25- (Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ) kolonne.
Endotoksin- bestemmelser
Endotoksin-bestemmelser ble utført med Limulus amøbocytt-lysat-test (Associates of Cape Cod Inc., Woods Hole, MA). Prøver som inneholder mindre enn 2 endotoksin-enheter (Eu) per mg protein ble anvendt i farmakokinetikk-studiene.
Rensing av anti- CD 11/ CD18 F( abVantistoff- fragment
F(ab')2-fragmentet ble opprinnelig renset ved ABX-kromatografi som en leucin-zipper (FabVvariant [zipper-F(ab')2]. Dette konstruktet ble satt sammen ved å sette til et leucin-zipper-domene etter hengselsregionen fra H52-tungkjeden. Etter rensing ble leucin-zipper-domenet spaltet fra ved pepsin-spaltning etter at F(ab')2 var renset ved SPHP- og Phenyl Toyopearl™-kromatografi som beskrevet nedenfor.
Ekstraksjon og ABX- kromatografi av zipper- F( ab')^- antistoff- fragment
Ekstraksjon og ABX-kromatografi av zipper-F(ab')2-antistoff-fragmentet ble utført som beskrevet ovenfor for Fab-antistoff-fragment-variantene
Pepsin- spaltning av zipper- F( ab') ?- antistoff- fragment
Det ABX-rensede zipper-F(ab')2 ble behandlet med pepsin for å fjerne leucin-zipper-delen av molekylet for å gi F(ab')2-antistoff-fragmentet. Den ABX-rensede prøven ble konsentrert på Amicon røreceller til 5 mg/mL, og så fortynnet 1:3,5 med 100 mM natrium-citratbuffer, pH 3,5. Til denne løsningen ble pepsin (1 mg/mL) løst i 100 mM natrium-citratbuffer, pH 3,5, satt til i et pepsin-til-protein-forhold på 1:12. Etter 4 timer ved romtemperatur ble blandingens pH økt til pH 6,4 med 10% NaOH.
SPHP- kromatografi av pepsin- behandlet zipper- F( ab') ?- antistoff- fragment
Rensing av F(ab')2-antistoff-fragmentet fra leucin-zipper-domenet og uønskede antistoff-fragmenter ble utført ved SPHP kromatografi som beskrevet ovenfor for Fab-antistoff-fragment-varianter.
Phenvl Tovopearl™- kromatografi av SPHP- renset F( ab Vantistoff- fragment
Det SPHP-rensete F(ab')2-lageret ble gjort 1,5 M i ammonium-sulfat ved å sette til fast ammoniumsulfat. Det kondisjonerte lageret ble så applisert på en Phenyl Toyopearl™ 650M (Tosohaas, Montomeryville, PA) 1,6 x 10 cm kolonne som var ekvilibrert med 1,5 M ammoniumsulfat, 50 mM natriumacetat, pH 5,4 (buffer A). En 20 kolonne-volums gradient ble kjørt fra 70% buffer A til 100% 0,15 M ammoniumsulfat i 50 mM natriumacetat, pH 5,4 (buffer B). Fraksjonene ble analysert ved revers-fase og CSX HPLC og SDS-PAGE som beskrevet i den analytiske metode-seksjonen ovenfor.
Formulering av F( ab')^- antistoff- fragment og endotoksin- målinger
Formulering av det rensede F(ab,)2-antistoff-fragmentet ble utført som beskrevet ovenfor for Fab-antistoff-fragment-variantene. Etter endotoksin-bestemmelse ble prøver som inneholdt mindre enn 2 Eu per mg protein anvendt ved farmakokinetikk-studiene som er satt frem nedenfor.
Farmakokinetikk- studie av anti- CD ll/ CD18- konstrukter hos mus etter intravenøs administrering
Meningen med dette enkelt-dose farmakokinetikk-studiet av fem humaniserte huH52 anti-CD 18-antistoff-fragmenter (konstrukter) hos mus var å bestemme om ikke-spesifikk rensing av antistoff-fragmenter blir påvirket av endringer av aminosyrer i det konstante domenet. Serum-prøver ble samlet inn fra hann- CD 1-mus over en 24 timers periode, og human anti-CD 18-serumkonsentrasjoner ble målt ved ELISA
Anti-CD 18-antistoff-fragmenter som ble undersøkt var avledet fra E. cø/i-produserte rekombinante humaniserte monoklonale Fab-antistoff-fragmenter som beskrevet ovenfor. Fab-fragmentet og konstruktet hvor to Fab'-subenheter var koblet sammen ved to disulfid-bindinger ble undersøkt. Endelig ble tre nye versjoner av det originale Fabet konstruert ved å endre aminosyrer i det konstante domenet. Se studie-design-tabellen nedenfor for ytterligere beskrivelse av konstruktene.
Konstruksjons-antigenbindingssetene er rettet mot CD18-subenheten av CD11/CD18-glykoprotein-komplekset på overflaten av leukocytter. Disse antistoff-fragmentene er sjimpanse- og human-spesifikke; serum-farmakokinetikk-informasjonen oppnådd fra mus gir derfor en beskrivelse av den ikke-spesifikke rensingen av fragmentene.
Fordi lineær farmakokinetikk var forventet i dette studiet ble et enkelt-dose-nivå på 2 mg/kg valgt istedenfor fler-dose-nivåer.
Farmakokinetikken av fem antistoff-konstrukter ble studert hos hann-Crl:CD-l® (ICR)BR VAF/Plus-mus (omtrent 20-30 g). Fem grupper, hver bestående av tyve mus mottok en intravenøs bolus dose på 2 mg/kg via hale-venen. Blodprøver ble samlet ved 5 og 30 miutter, 1,2,4, 8,12,16,20 og 24 timer etter dosen. Serum ble høstet og konsentrasjoner av antistoff-fragmenter ble bestemt ved en MAC-1 fange-ELISA som følger: 96-brønners mikrotiter-plater ble kledd natten over med murint anti-CD 18 monoklonalt antistoff. Etter overnatts-inkubering ved 4°C ble platene vasket tre ganger med ELIS A-vaskebuffer og blokkert i en time med ELIS A-fortynner. ELIS A-vaskebuffer er fosfat-bufret saltoppløsning (PBS)/0,05% Polysorbate™ 20. Denne bufferen er fremstilt per liter som 50 mL 20 x PBS/1% Polysorbate™ 20 (en blanding oppnådd ved å løse 160 g NaCl, 4,0 g KC1,22,6 g Na2HP04 og 4,0 g KH2P04 i glass-destillert eller deionisert vann, sette til 10,0 mL Polysorbat™ 20 [Sigma™ P-1379 eller lignende], qs til lOOOmL, og sterilfiltrere ved å anvende et 0,22 um eller mindre filter) og qs til 1,0 L med destillert eller deionisert vann, lagret ved romtemperatur. Holdbarheten er 2 uker etter fremstillingsdatoen.
ELISA-tynneren var PBS/0,5% BSA/0,05% Polysorbate ™ 20/0,01 Thimerosal™/l mM CaCl2/l mM MgCl2. Denne tynneren ble fremstilt per liter som 5,0 g bovint serumalbumin (Armour™N0068 eller lignende), 50 mL 20 x PBS/1% Polysorbat™ 20/0,2% Thimerosal™ (en blanding oppnådd ved å løse 160 g NaCl, 4,0 g KC1,22,6 g Na2HP04 og 4,0 g KH2P04 i glass-destillert eller deionisert vann, og tilsatt 10,0 mL Polysorbat™ 20 [Sigma P-1379 eller lignende] og 2,0 g Thimerosal™ [Sigma T.5125 eller lignende], qs til 1000 mL), 0,1% (volum/voulm) 1 M CaCl2 (Genentech™ A3165), 0,1% 1 M MgCl2 (Genentech™ A3167), qs til 1,0 L med destillert eller deionisert vann, og lagret ved 2-8°C, med holdbarhetstid på en måned etter fremstilling.
Etter blokkering ble platene vasket igjen tre ganger med ELISA-vaskebuffer. Løselig MAC1 (CDllb/CD18 som beskrevet av Berman et al., J. Cell. Biochem., 52: 183-195 [1993]) ble så fanget ut fra et konsentrert medium, kondisjonert med CHO-celler som uttrykker den avkortede CD 1 lb/CD 18-heterodimeren. Etter to timer inkuberingstid ble platene vasket seks ganger med ELISA-vaskebuffer, og 100 uL av mus serum-prøver som skal testes eller standaren som omfatter det homologe rekombinante humane anti-CD 18 Fabet ble satt til. Muse-serumprøver ble først fortynnet 1/10 i ELISA-tynner og så videre en 1/4 i prøve-tynner; 100 uL ble tatt fra denne initielle 1/40-fortynningen. Serum-tynner er 10% Swiss Webster mus-serum i ELISA-tynner. Etter en andre to-timers inkubering ble platene igjen vasket seks ganger med ELISA-vaskebuffer og 100 uL pepperrot-peroksidase-konjugert F(ab')2 rettet mot et humant Fab satt til. Etter en times imkubering ved romtemperatur ble platene vasket med ELISA-vaskebuffer som beskrevet ovenfor, og 100 uL fosfat-bufret-saltoppløsning, pH 7,2, omfattende 2,2 mmol/L ortofenylen-diamin (OPD) og 0,012 % (volum/volum) hydrogen-peroksyd (H2O2) ble satt til hver brønn. Når fargen var fullt utviklet ble reaksjonen stoppet med 100 uL per brønn av 4,5 mol/L svovelsyre. Absorbansen i brønn-innholdet ble målt ved 492 nM minus 405nm bakgrunnsabsorbans ved å anvende en automatisk plateleser fra SLT-Labinstrumenter. Data ble redusert ved å anvende et fire-parameter, kurve-tilpasset program basert på en algoritme for minste-kvadrat-estimering av ikke-lineære parametere.
Seram-konsentrasjoner versus tidsdata ble analysert ved å anvende et ikke-lineært kurve-tilpassende program og etterfølgende farmakokinetikk-parametere ble estimert. D'Argenio and Schumitzky, AD APT II brukermanual, Biomedical, Simulations Resource, University of Southern California, Los Angeles, utg. 2,1990.
En to-avdelingsmodell ble anvendt for å karakterisere serum-konsentrasjonen mot tidsdata for de fem gruppene. Se tabell 2 for primære modell-parametere og beregnede farmakokinetikk-parametere. To-avdelingsmodellen er lagt over dataene og vist i figurene IA og IB. En dataliste er gitt i tabell 3. Volumet av den sentrale avdelingen er tilnærmet plasmavolumet for alle grupper
RESULTATER
Dataene er vist i figurene IA og IB, hvor Fig. IA viser farmakokinetikkene for alle fem konstruktene over en tidsperiode på 0 til 5 timer, og fig. IB viser farmakokinetikkene for alle fem konstruktene over en tidsperiode på 0 til 25 timer. De initielle (eller a-fase) halveringstidene varierte, som også de terminale (P-fase) halveringstidene gjorde. Fab vlB-varianten hadde en rensing på 80 mL/t/kg, som er omtrent tre ganger høyere enn den for det doble-disulfid (Fab')2. Fab vl, Fab og Fab v2 hadde omtrent 3 ganger høyere rensing enn Fab vlB, og omtrent 6 ganger høyere rensingen enn dobbel-disulfid (Fab')2 (hhv. 173,189 og 190 mL/t/kg).
Den effektive molekylvekten av det originale Fab var 49 kD, og dens rensing var 189 mL/t/kg.
Fab-versjonene 1, IB og 2 hadde alle lignende molekylvekt med den for det originale Fab, til tross for at versjon IB ble renset fra serumet 2 ganger senere. Endringer i aminosyre-sekvensen fra det Fab-konstante domenet påvirker dermed rensingen. Effekten sett fra beta-fase-halveringstiden viser at med de to minst suksessfulle variantene 1 og 2 var det en detekterbar effekt som ikke var tilstrekkelig for å øke generell permanens-tid.

Claims (29)

1. Polypeptid-variant av et polypeptid av interesse hvor polypeptidet av interesse er renset fra nyrene, og ikke inneholder en Fc-region av et IgG hvor polypeptid-varianten inneholder et Ig-domene eller Ig-lignende domene som ikke er et CH2-domene, karakterisert ved at Ig-domenet eller det Ig-lignende domenet omfatter en salvage-reseptor bindingsepitop tatt fra et CH2-domene av en Fc-region av et IgG, hvor epitopen omfatter en aminosyresekvens metionin, isoleucin, serin (MIS) med en treonin (T)-rest etter en aminosyre C-terminal til MIS-sekvensen, og hvor varianten har en lengre in vivo- halveringstid enn polypeptidet av interesse.
2. Variant ifølge krav 1, karakterisert ved at Ig-domenet eller et Ig-lignende domene omfatter et CH1-domene.
3. Variant ifølge krav 1, karakterisert ved at epitopen er tatt fra én eller to løkker av CH2-domenet av Fc-regionen og er overført til Ig-domenet eller i et Ig-lignende domenet.
4. Variant ifølge krav 3, karakterisert ved at epitopen er tatt fra én eller to løkker av CH2-domenet av Fc-regionen og er overført til et lg- eller Ig-lignende domene valgt fra gruppen bestående av en CH1, CH3 og Vn-region.
5. Variant ifølge krav 3, karakterisert ved at epitopen er tatt fra én eller to løkker av CH2-domenet fra Fc-regionen og er overført til en CL-region eller en VL-region.
6. Variant ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5, karakterisert ved at epitopen er lokalisert mellom aminosyrerester analoge med aminosyrene 127 og 139 av et CHl-domene som vist i figur 2.
7. Variant ifølge krav 6, karakterisert ved at epitopen ytterligere omfatter en aminosyresekvens histidin, glutamin, asparagin (HQN) med en asparaginsyrerest (D) etter to aminosyrer C-terminal til HQN-sekvensen og en lysin (K)-rest etter en aminosyre C-terminal til D-resten.
8. Variant ifølge krav 7, karakterisert ved at epitopen er lokalisert mellom aminosyrerester analoge til posisjoner 195 og 203 av et CH1-domene som vist i figur 2.
9. Variant ifølge et hvilket som helst av kravene 1-8, karakterisert ved at polypeptidet av interesse er et Fab, et F(ab')2, en "diabody", et Fv-fragment, et enkeltkjede Fv-fragment eller en reseptor.
10. Variant ifølge krav 9, karakterisert ved at polypeptidet av interesse er en LFA-1-antagonist.
11 Variant ifølge krav 10, karakterisert ved at polypeptidet av interesse er et Fab eller et F(ab')2 av et anti-LFA-1-antistoff.
12. Variant ifølge krav 11, karakterisert ved at polypeptidet av interesse er et anti-CD 18-Fab eller anti-CD 18-F(ab')2
13. Variant ifølge krav 11, karakterisert ved at det er humant eller humanisert.
14. Variant ifølge et hvilket somhelst av kravene 1-13, karakterisert ved at epitopen omfatter sekvensen PKNSSMISNTP (SEKV ID NR.: 3).
15. Variant ifølge krav 14, karakterisert ved at den ytterligere omfatter sekvensen HQSLGTQ (SEKV ID NR.: 11), sekvensen HQNLSDGK (SEKV ID NR.: 1), sekvensen HQNISDGK (SEKV ID NR.: 2) eller sekvensen VISSHLGQ (SEKV ID NR.: 31).
16. Variant ifølge et hvilket som helst av kravene 1-15, karakterisert ved at den omfatter sekvensen, HQNLSDGK (SEKV ID NR.: 1) , HQNISDGK (SEKV ID NR.: 2) HQSLGTQ (SEKV ID NR.: 11) eller VISSHLGQ (SEKV ID NR.: 31) og PKNSSMISNTP (SEKV ID NR.: 3).
17. Variant ifølge et hvilket som helst av kravene 1-16, karakterisert ved at epitopen er kondensert med polypeptidet av interesse.
18. Variant ifølge krav 17, karakterisert ved at det polypeptidet av interesse er et veksthormon eller nerve-vekstfaktor.
19. Nukleinsyre, karakterisert ved at den koder for varianten ifølge et hvilket som helst av kravene 1-18.
20. Replikerbar vektor, karakterisert ved at den omfatter nukleinsyren ifølge krav 19.
21. Vertscelle, karakterisert ved at den omfatter nukleinsyren ifølge krav 19.
22. Metode for å produsere en polypeptid-variant, karakterisert ved at den omfatter å dyrke vertscellene ifølge krav 21 i et dyrkningsmedium, og gjenvinne varianten fra vertscellekulturen.
23. Metode ifølge krav 22, karakterisert ved at varianten er gjenvunnet fra kulturmediet.
24. Variant-polypeptid som ikke er et Fc, karakterisert ved at det omfatter sekvensene HQNLSDGK (SEKV ID NR.: 1), HQNISDGK (SEKV ID NR.: 2) eller VISSKLGQ (SEKV ID NR.: 31) og PKNSSMISNTP (SEKV ID NR.: 3).
25. Metode for å fremstille en polypeptid-variant av et peptid av interesse, hvor polypeptidet av interesse, som er renset fra nyrene og ikke inneholder en Fc-region av et IgG, hvor polypeptid-varianten inneholder et Ig-domene eller Ig-lignende domene som ikke er et CH2-domene som omfatter å endre Ig-domenet eller det Ig-lignende domene til å omfatte en salvage-reseptor bindingsepitop tatt fra et CH2-domene av en Fc-region av et IgG, hvor epitopen omfatter en aminosyresekvens MIS (MIS) med en treonin (T)-rest etter en aminosyre C-terminal til MIS-sekvensen til å ha en øket in vivo-halveringstid.
26. Metode ifølge krav 25, karakterisert ved at endringstrinnet er utført ved setedirigert-, kassett- eller PCR-mutagenese.
27. Metode for å fremstille en polypeptid-variant ifølge krav 1 som har en øket in vivo- halveringstid, karakterisert ved at den omfatter å:
(1) identifisere sekvensen og konformasjonen til en salvage-reseptor bindingsepitop på en Fc-region fra et IgG-molekyl;
(2) endre sekvensen til et polypeptid av interesse, hvilket polypeptid av interesse er renset fra nyrene og ikke inneholder en Fc-region av et IgG hvor polypeptid-varianten inneholder et Ig-domene eller Ig-lignende domene, som ikke er et CH2-domene av en Fc-region av et IgG, ved å endre Ig-domenet eller det Ig-lignende domenet til å omfatte en salvage-reseptor bindingsepitop tatt fra et CH2-domene og hvor epitopen omfatter en aminosyresekvens MIS (MIS) med en treonin (T)-rest etter en aminosyre C-terminal til MIS-sekvensen;
(3) teste det endrete polypeptidet ifølge trinn (2) for lengre in vivo-halveringstid enn den til polypeptidet av interesse; og
(4) hvis polypeptidet ikke har en lengre in vivo-halveringstid, videre endre Ig-domenet eller det Ig-lignende domenet til å omfatte sekvensen og konformasjonen til den identifiserte bindingsepitopen og teste for lengre in vivo-halveringstid, inntil lengre in vivo-halveringstid er oppnådd.
28. Anvendelse av varianten ifølge et hvilket som helst av kravene 10-13 for fremstilling av en farmasøytisk blanding for å behandle en LFA-1-mediert lidelse.
29. Anvendelse av varianten ifølge krav 13 for fremstilling av en farmasøytisk blanding for behandling av en LFA-1-mediert lidelse.
NO19974739A 1995-04-14 1997-10-13 Polypeptid-variant samt anvendelse og fremstilling derav, og nukleinsyre, replikerbar vektor og vertscelle. NO326296B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/422,093 US6096871A (en) 1995-04-14 1995-04-14 Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
PCT/US1996/004316 WO1996032478A1 (en) 1995-04-14 1996-03-28 Altered polypeptides with increased half-life

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO974739D0 NO974739D0 (no) 1997-10-13
NO974739L NO974739L (no) 1997-12-12
NO326296B1 true NO326296B1 (no) 2008-11-03

Family

ID=23673357

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO19974739A NO326296B1 (no) 1995-04-14 1997-10-13 Polypeptid-variant samt anvendelse og fremstilling derav, og nukleinsyre, replikerbar vektor og vertscelle.

Country Status (17)

Country Link
US (1) US6096871A (no)
EP (1) EP0821732B1 (no)
JP (2) JPH11504509A (no)
CN (1) CN100390279C (no)
AT (1) ATE415474T1 (no)
AU (1) AU721155B2 (no)
BR (1) BR9604955A (no)
CA (1) CA2217871C (no)
DE (1) DE69637761D1 (no)
ES (1) ES2317645T3 (no)
IL (1) IL117850A0 (no)
MX (1) MX9707877A (no)
NO (1) NO326296B1 (no)
NZ (1) NZ306170A (no)
RU (2) RU2224764C2 (no)
WO (1) WO1996032478A1 (no)
ZA (1) ZA962489B (no)

Families Citing this family (540)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6121022A (en) * 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5914112A (en) * 1996-01-23 1999-06-22 Genentech, Inc. Anti-CD18 antibodies in stroke
US20020081294A1 (en) 1996-01-23 2002-06-27 Genentech, Inc. Co-administration of a thrombolytic and an anti-CD18 antibody in stroke
US6136311A (en) 1996-05-06 2000-10-24 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of cancer
US6037454A (en) 1996-11-27 2000-03-14 Genentech, Inc. Humanized anti-CD11a antibodies
DK0941344T3 (da) * 1996-11-27 2004-09-27 Genentech Inc Humaniserede anti-CD11a-antistoffer
SI1787999T1 (sl) 1997-04-07 2010-12-31 Genentech Inc Anti-VEGF protitelesa
WO1998045331A2 (en) 1997-04-07 1998-10-15 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
US6727077B1 (en) * 1997-06-17 2004-04-27 Human Genome Sciences, Inc. Heregulin-like factor
US7049409B2 (en) * 1997-06-17 2006-05-23 Human Genome Sciences, Inc. Heregulin-like factor antibodies
IL137649A (en) * 1998-02-18 2004-08-31 Genentech Inc Method of adsorption chromatography
EP1105427A2 (en) * 1998-08-17 2001-06-13 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
TWI250988B (en) 1998-10-23 2006-03-11 Kirin Amgen Inc Thrombopoietic compounds
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US7488590B2 (en) 1998-10-23 2009-02-10 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6867203B2 (en) 1998-12-29 2005-03-15 Abbott Laboratories Cell adhesion-inhibiting antiinflammatory and immune-suppressive compounds
US7459540B1 (en) 1999-09-07 2008-12-02 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
US6808902B1 (en) 1999-11-12 2004-10-26 Amgen Inc. Process for correction of a disulfide misfold in IL-1Ra Fc fusion molecules
US20040002068A1 (en) 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
EP1290013B1 (en) 2000-04-21 2006-03-08 Amgen Inc. Apo-ai/aii peptide derivatives
EP1961425B1 (en) 2000-04-21 2017-07-19 Amgen Inc. Methods and erythropoeitin analogs for the prevention and treatment of anemia
US6667300B2 (en) 2000-04-25 2003-12-23 Icos Corporation Inhibitors of human phosphatidylinositol 3-kinase delta
US6677136B2 (en) 2000-05-03 2004-01-13 Amgen Inc. Glucagon antagonists
US20020086018A1 (en) 2000-05-12 2002-07-04 Theill Lars Eyde Methods and compositions of matter concerning APRIL/G70, BCMA, BLYS/AGP-3, and TACI
BR0112969A (pt) 2000-08-04 2004-06-22 Dmi Biosciences Inc Método de utilização de dicetopiperazinas e composições contendo-as
US7160541B2 (en) 2000-09-01 2007-01-09 The Center For Blood Research, Inc. Modified polypeptides stabilized in a desired conformation and methods for producing same
US6992234B2 (en) 2000-11-06 2006-01-31 The Jackson Laboratory FcRn-based therapeutics for the treatment of auto-immune disorders
US7658921B2 (en) 2000-12-12 2010-02-09 Medimmune, Llc Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
ES2727425T3 (es) 2000-12-12 2019-10-16 Medimmune Llc Moléculas con semividas prolongadas, composiciones y usos de las mismas
US7087726B2 (en) 2001-02-22 2006-08-08 Genentech, Inc. Anti-interferon-α antibodies
EP2292655B1 (en) 2001-05-11 2012-03-14 Amgen SF, LLC Peptides and related molecules that bind to tall-1
CN1684708A (zh) 2001-05-30 2005-10-19 基因技术股份有限公司 抗ngf抗体用于治疗各种疾病
US7138370B2 (en) 2001-10-11 2006-11-21 Amgen Inc. Specific binding agents of human angiopoietin-2
US7332474B2 (en) 2001-10-11 2008-02-19 Amgen Inc. Peptides and related compounds having thrombopoietic activity
EP2075256A2 (en) 2002-01-14 2009-07-01 William Herman Multispecific binding molecules
US7425618B2 (en) 2002-06-14 2008-09-16 Medimmune, Inc. Stabilized anti-respiratory syncytial virus (RSV) antibody formulations
US7132100B2 (en) 2002-06-14 2006-11-07 Medimmune, Inc. Stabilized liquid anti-RSV antibody formulations
KR20120068769A (ko) 2002-07-15 2012-06-27 더 보드 오브 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 음이온성 인지질 및 아미노인지질에 결합하는 선택된 항체 및 치료하는데 있어서 이의 용도
PL376536A1 (pl) 2002-08-28 2006-01-09 Immunex Corporation Kompozycje i sposoby leczenia chorób układu sercowo-naczyniowego
US6919426B2 (en) 2002-09-19 2005-07-19 Amgen Inc. Peptides and related molecules that modulate nerve growth factor activity
US9701754B1 (en) 2002-10-23 2017-07-11 City Of Hope Covalent disulfide-linked diabodies and uses thereof
US20060034845A1 (en) 2002-11-08 2006-02-16 Karen Silence Single domain antibodies directed against tumor necrosis factor alpha and uses therefor
CA2505316C (en) 2002-11-08 2014-08-05 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against tumour necrosis factor-alpha and uses therefor
US9320792B2 (en) 2002-11-08 2016-04-26 Ablynx N.V. Pulmonary administration of immunoglobulin single variable domains and constructs thereof
EP1558647B1 (en) * 2002-11-08 2015-06-10 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against tumour necrosis factor-alpha and uses therefor
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
ES2361036T3 (es) 2003-05-06 2011-06-13 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Proteínas quiméricas vii-fc del factor de coagulación para el tratamiento de un trastorno hemostático.
KR20120091266A (ko) 2003-05-15 2012-08-17 디엠아이 바이오사이언시스, 인크 Ｔ-세포 매개성 질환의 치료 방법
MXPA06000974A (es) 2003-07-25 2006-08-31 Amgen Inc Antagonistas y agonistas de ldcam y metodos para su uso.
EP1684791A4 (en) 2003-10-27 2009-07-01 Amgen Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATION OF IMMUNE REACTION TO AN IMMUNOGENIC THERAPEUTIC AGENT
WO2005063815A2 (en) * 2003-11-12 2005-07-14 Biogen Idec Ma Inc. Fcϝ receptor-binding polypeptide variants and methods related thereto
KR101135244B1 (ko) 2007-11-29 2012-04-24 한미사이언스 주식회사 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 비만 관련질환 치료용 조성물
DK2256134T3 (en) 2003-11-13 2014-02-24 Hanmi Science Co Ltd IgG Fc fragment to a drug carrier and process for preparation thereof
US20050250185A1 (en) * 2003-12-12 2005-11-10 Murphy Andrew J OGH fusion polypeptides and therapeutic uses thereof
PL1704166T3 (pl) 2004-01-07 2015-10-30 Novartis Vaccines & Diagnostics Inc Przeciwciała monoklonalne swoiste względem M-CSF i ich zastosowania
US7601516B2 (en) 2004-01-28 2009-10-13 Syntomix Pharmaceuticals, Inc. Heterodimeric follicle stimulating hormone-Fc (FSH-Fc) fusion proteins for the treatment of infertility
US7794713B2 (en) 2004-04-07 2010-09-14 Lpath, Inc. Compositions and methods for the treatment and prevention of hyperproliferative diseases
LT2612862T (lt) 2004-05-13 2017-01-25 Icos Corporation Chinazolinonai kaip žmogaus fosfatidilinozitol-3-kinazės delta inhibitoriai
KR20070034512A (ko) 2004-06-18 2007-03-28 암브룩스, 인코포레이티드 신규 항원-결합 폴리펩티드 및 이의 용도
WO2006010057A2 (en) 2004-07-08 2006-01-26 Amgen Inc. Therapeutic peptides
US8802820B2 (en) * 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
KR100754667B1 (ko) 2005-04-08 2007-09-03 한미약품 주식회사 비펩타이드성 중합체로 개질된 면역글로불린 Ｆｃ 단편 및이를 포함하는 약제학적 조성물
US7833979B2 (en) 2005-04-22 2010-11-16 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
CA2606378A1 (en) * 2005-04-29 2006-11-09 The Jackson Laboratory Fcrn antibodies and uses thereof
KR101502920B1 (ko) 2005-06-21 2015-03-17 조마 (유에스) 엘엘씨 ＩＬ-１β 결합성 항체 및 그의 단편
JP5457671B2 (ja) 2005-07-28 2014-04-02 ノバルティス アーゲー Ｍ−ｃｓｆ特異的モノクローナル抗体およびその使用
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
EP1933873A4 (en) 2005-10-13 2009-12-02 Human Genome Sciences Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF PATIENTS WITH POSITIVE DISEASES FOR SELF-ANTIBODIES
AR056142A1 (es) 2005-10-21 2007-09-19 Amgen Inc Metodos para generar el anticuerpo igg monovalente
RS54111B1 (en) 2005-11-18 2015-12-31 Glenmark Pharmaceuticals S.A. ANTI-ALPHA 2 INTEGRIN ANTIBODIES AND THEIR USES
WO2007102946A2 (en) 2006-01-23 2007-09-13 Amgen Inc. Crystalline polypeptides
US7625564B2 (en) * 2006-01-27 2009-12-01 Novagen Holding Corporation Recombinant human EPO-Fc fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo
ES2363891T3 (es) 2006-03-20 2011-08-18 The Regents Of The University Of California Anticuerpos contra el antígeno de células troncales de la próstata (psca) modificados genéticamente para el direccionamiento al cáncer.
JP2009529915A (ja) 2006-03-20 2009-08-27 ゾーマ テクノロジー リミテッド ガストリン物質に対して特異的なヒト抗体および方法
JO3324B1 (ar) 2006-04-21 2019-03-13 Amgen Inc مركبات علاجية مجففة بالتبريد تتعلق بالعصارة الهضمية
TWI395754B (zh) 2006-04-24 2013-05-11 Amgen Inc 人類化之ｃ-ｋｉｔ抗體
US7862812B2 (en) 2006-05-31 2011-01-04 Lpath, Inc. Methods for decreasing immune response and treating immune conditions
US7981425B2 (en) 2006-06-19 2011-07-19 Amgen Inc. Thrombopoietic compounds
CA2787343C (en) 2006-06-26 2016-08-02 Amgen Inc. Compositions comprising modified lcat and uses thereof
WO2008019326A2 (en) 2006-08-04 2008-02-14 Novartis Ag Ephb3-specific antibody and uses thereof
EP2423231A3 (en) 2006-08-18 2012-05-30 Novartis AG PRLR-specific antibody and uses thereof
US7803769B2 (en) 2006-10-25 2010-09-28 Amgen Inc. OSK1 peptide analogs and pharmaceutical compositions
WO2008055072A2 (en) 2006-10-27 2008-05-08 Lpath, Inc. Compositions and methods for treating ocular diseases and conditions
RU2460541C2 (ru) 2006-10-27 2012-09-10 Лпат, Инк. Композиции и способы связывания сфингозин-1-фосфата
CA2672120A1 (en) 2006-12-07 2008-06-12 Novartis Ag Antagonistic antibodies against ephb3
RU2554747C9 (ru) 2006-12-20 2015-10-20 Ксома (Сша) Ллс Способы лечения il-1бета-зависимых заболеваний
JP2008169195A (ja) 2007-01-05 2008-07-24 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd キャリア物質を用いたインスリン分泌ペプチド薬物結合体
DK2104682T3 (en) 2007-01-11 2017-01-16 Michael Bacher DIAGNOSIS AND TREATMENT OF ALZHEIMER'S AND OTHER DEMENTIA DISEASES
US8492118B2 (en) 2007-05-11 2013-07-23 Altor Bioscience Corporation Fusion molecules and IL-15 variants
AU2008262490B2 (en) 2007-05-22 2011-11-17 Amgen Inc. Compositions and methods for producing bioactive fusion proteins
US9163091B2 (en) 2007-05-30 2015-10-20 Lpath, Inc. Compositions and methods for binding lysophosphatidic acid
JP5989299B2 (ja) 2007-05-30 2016-09-07 エルパス・インコーポレイテッドＬｐａｔｈ， Ｉｎｃ． リゾホスファチジン酸結合のための組成物と方法
WO2009012600A1 (en) * 2007-07-26 2009-01-29 Novagen Holding Corporation Fusion proteins
EP2522721B1 (en) 2007-07-26 2016-05-04 Amgen, Inc Modified lecithin-cholesterol acyltransferase enzymes
US7960336B2 (en) * 2007-08-03 2011-06-14 Pharmain Corporation Composition for long-acting peptide analogs
WO2009032949A2 (en) 2007-09-04 2009-03-12 The Regents Of The University Of California High affinity anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting and detection
US8361465B2 (en) * 2007-10-26 2013-01-29 Lpath, Inc. Use of anti-sphingosine-1-phosphate antibodies in combination with chemotherapeutic agents
JP5809415B2 (ja) 2007-11-09 2015-11-10 ペレグリン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド 抗ｖｅｇｆ抗体の組成物および方法
EP2391650B1 (en) 2007-12-20 2014-10-15 Xoma (Us) Llc Methods for the treatment of gout
EP2261254A3 (en) 2007-12-21 2011-04-13 Amgen, Inc Anti-amyloid antibodies and uses thereof
PL2808343T3 (pl) * 2007-12-26 2019-11-29 Xencor Inc Warianty Fc ze zmienionym wiązaniem do FcRn
WO2009092011A1 (en) 2008-01-18 2009-07-23 Medimmune, Llc Cysteine engineered antibodies for site-specific conjugation
EP2300011A4 (en) 2008-05-27 2012-06-20 Dmi Life Sciences Inc METHODS AND THERAPEUTIC COMPOUNDS
JOP20190083A1 (ar) 2008-06-04 2017-06-16 Amgen Inc بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها
WO2009158432A2 (en) 2008-06-27 2009-12-30 Amgen Inc. Ang-2 inhibition to treat multiple sclerosis
NZ592009A (en) 2008-10-10 2012-11-30 Amgen Inc Fgf21 mutants and uses thereof
CN110317272A (zh) 2008-10-14 2019-10-11 霍夫曼-拉罗奇有限公司 免疫球蛋白变体及其用途
US8871202B2 (en) 2008-10-24 2014-10-28 Lpath, Inc. Prevention and treatment of pain using antibodies to sphingosine-1-phosphate
MX2011004696A (es) 2008-11-06 2011-10-14 Glenmark Pharmaceuticals Sa Tratamiento con anticuerpos anti-integrina alfa2.
CN104042618B (zh) 2008-11-13 2018-02-16 吉利德卡利斯托加公司 恶性血液病的治疗
US9492449B2 (en) 2008-11-13 2016-11-15 Gilead Calistoga Llc Therapies for hematologic malignancies
US8401799B2 (en) * 2008-12-05 2013-03-19 Lpath, Inc. Antibody design using anti-lipid antibody crystal structures
CA2745436A1 (en) * 2008-12-05 2010-06-10 Lpath, Inc. Antibody design using anti-lipid antibody crystal structures
WO2010068722A1 (en) 2008-12-12 2010-06-17 Medimmune, Llc Crystals and structure of a human igg fc variant with enhanced fcrn binding
CN102341411A (zh) 2008-12-31 2012-02-01 比奥根艾迪克Ma公司 抗-淋巴细胞毒素抗体
US10517969B2 (en) 2009-02-17 2019-12-31 Cornell University Methods and kits for diagnosis of cancer and prediction of therapeutic value
JP2012521197A (ja) 2009-03-20 2012-09-13 アムジエン・インコーポレーテツド 担体免疫グロブリンおよびその使用
EP2233500A1 (en) 2009-03-20 2010-09-29 LFB Biotechnologies Optimized Fc variants
NZ595307A (en) 2009-03-24 2013-11-29 Gilead Calistoga Llc Atropisomers of 2-purinyl-3-tolyl-quinazolinone derivatives and methods of use
WO2010121093A2 (en) 2009-04-17 2010-10-21 Lpath, Inc. Humanized antibody compositions and methods for binding lysophosphatidic acid
MX2011011036A (es) 2009-04-20 2012-01-20 Gilead Calistoga Llc Metodos de tratamiento para tumores solidos.
SI3248610T1 (sl) 2009-05-05 2024-03-29 Amgen Inc., Mutanti fgf21 in njihove uporabe
AU2010246038A1 (en) 2009-05-05 2011-12-01 Amgen Inc. FGF21 mutants and uses thereof
ES2548030T3 (es) 2009-06-01 2015-10-13 Medimmune, Llc Moléculas con semividas prolongadas y usos de las mismas
KR20120046163A (ko) 2009-06-15 2012-05-09 바이오카인 테라퓨틱스 리미티드 자가면역, 염증 및 암의 과정을 저해할 수 있는 신규한 케모카인 결합 폴리펩타이드류
BRPI1014942A2 (pt) 2009-06-19 2019-09-24 Medimmune Llc "polipeptídeo, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, método para produzir um polipeptídeo, composição farmacêutica, e método para tratar uma doença"
BRPI1015234A2 (pt) 2009-06-22 2018-02-20 Medimmune Llc regiões fc projetadas para conjugação sítio específica.
WO2011011550A1 (en) 2009-07-21 2011-01-27 Calistoga Pharmaceuticals Inc. Treatment of liver disorders with pi3k inhibitors
US8221753B2 (en) 2009-09-30 2012-07-17 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Endoglin antibodies
WO2011028229A1 (en) 2009-08-24 2011-03-10 Amunix Operating Inc. Coagulation factor ix compositions and methods of making and using same
US8926976B2 (en) 2009-09-25 2015-01-06 Xoma Technology Ltd. Modulators
CA2772945A1 (en) 2009-09-25 2011-03-31 Xoma Technology Ltd. Screening methods
CN106399276B (zh) 2009-11-02 2021-08-10 华盛顿大学 治疗性核酸酶组合物和方法
EP3037435B1 (en) 2009-11-17 2019-08-07 MUSC Foundation for Research Development Human monoclonal antibodies to human nucleolin
AU2010321832B2 (en) 2009-11-20 2014-08-14 Amgen Inc. Anti-Orai1 antigen binding proteins and uses thereof
US8772459B2 (en) 2009-12-02 2014-07-08 Imaginab, Inc. J591 minibodies and Cys-diabodies for targeting human prostate specific membrane antigen (PSMA) and methods for their use
UA109888C2 (uk) 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
KR101312829B1 (ko) 2009-12-30 2013-09-27 한화엘앤씨 주식회사 ＨＯ-1 유전자 및 ＴＮＦＲ1-Ｆｃ 유전자를 동시에 발현하는 형질전환 돼지 및 그의 제조 방법
US8551715B2 (en) 2010-02-12 2013-10-08 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for identifying and isolating cells expressing a polypeptide
WO2011106723A2 (en) * 2010-02-26 2011-09-01 Lpath, Inc. Anti-paf antibodies
UA107827C2 (en) 2010-03-31 2015-02-25 Boehringer Ingelheim Int Antibody cd40
AR081755A1 (es) 2010-04-02 2012-10-17 Hanmi Holdings Co Ltd Formulacion de accion prolongada de la hormona estimuladora de los foliculos donde se usa un fragmento de inmunoglobulina, metodo de preparacion y metodo para tratar a un sujeto que sufre un trastorno reproductivo
AR080993A1 (es) 2010-04-02 2012-05-30 Hanmi Holdings Co Ltd Formulacion de accion prolongada de interferon beta donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
AR081066A1 (es) 2010-04-02 2012-06-06 Hanmi Holdings Co Ltd Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
EP3670534A3 (en) 2010-04-15 2020-09-09 Amgen Inc. Human fgf receptor and beta-klotho binding proteins
CA2804280A1 (en) 2010-07-09 2012-01-12 Biogen Idec Hemophilia Inc. Chimeric clotting factors
KR101382593B1 (ko) 2010-07-21 2014-04-10 한미사이언스 주식회사 신규한 지속형 글루카곤 결합체 및 이를 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물
WO2012033792A2 (en) 2010-09-07 2012-03-15 Dmi Acquisition Corp. Treatment of diseases
US11053299B2 (en) 2010-09-21 2021-07-06 Immunity Bio, Inc. Superkine
EP4385570A2 (en) 2010-09-21 2024-06-19 Altor BioScience, LLC Multimeric il-15 soluble fusion molecules and methods of making and using same
KR20130110169A (ko) 2010-09-22 2013-10-08 암젠 인크 담체 면역글로뷸린 및 이것의 용도
NZ610592A (en) 2010-11-04 2015-03-27 Boehringer Ingelheim Int Anti-il-23 antibodies
US9023791B2 (en) 2010-11-19 2015-05-05 Novartis Ag Fibroblast growth factor 21 mutations
SG10201500388PA (en) 2010-11-23 2015-03-30 Glaxo Group Ltd Antigen binding proteins to oncostatin m (osm)
MX2013005847A (es) 2010-11-24 2013-12-12 Glaxo Group Ltd Proteinas de union a antigeno multiespecificas que eligen como blanco a hgf.
BR112013016235B1 (pt) 2010-12-22 2020-03-31 Cephalon Australia Pty Ltd Anticorpo isolado, uso de um anticorpo, ácido nucleico, célula transformada e composição farmacêutica
WO2012092539A2 (en) 2010-12-31 2012-07-05 Takeda Pharmaceutical Company Limited Antibodies to dll4 and uses thereof
KR101276801B1 (ko) 2011-01-21 2013-06-19 한화엘앤씨 주식회사 ｓＴＮＦＲ1-Ｆｃ 유전자를 발현하는 형질전환 돼지 및 이의 용도
EA201391331A1 (ru) 2011-03-16 2014-02-28 Эмджен Инк. Активные и селективные ингибиторы nav1.3 и nav1.7
CN103476795B (zh) 2011-03-29 2016-07-06 罗切格利卡特公司 抗体Fc变体
ES2876421T3 (es) 2011-04-13 2021-11-12 Bristol Myers Squibb Co Proteínas de fusión Fc que comprenden enlazadores o disposiciones nuevos
EP2704737B1 (en) 2011-04-29 2018-01-10 University of Washington Therapeutic nuclease compositions and methods
UA113626C2 (xx) 2011-06-02 2017-02-27 Композиція для лікування діабету, що містить кон'югат інсуліну тривалої дії та кон'югат інсулінотропного пептиду тривалої дії
KR102577578B1 (ko) 2011-06-03 2023-09-11 조마 테크놀로지 리미티드 Tgf-베타에 특이적인 항체
KR101502299B1 (ko) 2011-06-10 2015-03-11 한미사이언스 주식회사 신규한 옥신토모듈린 유도체 및 이를 포함하는 비만 치료용 조성물
AU2012267484B2 (en) 2011-06-10 2017-03-23 Bioverativ Therapeutics Inc. Pro-coagulant compounds and methods of use thereof
MY164680A (en) 2011-06-17 2018-01-30 Hanmi Science Co Ltd A conjugate comprising oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment, and use thereof
US9738707B2 (en) 2011-07-15 2017-08-22 Biogen Ma Inc. Heterodimeric Fc regions, binding molecules comprising same, and methods relating thereto
CA2842323A1 (en) 2011-07-18 2013-01-24 Arts Biologics A/S Long acting biologically active luteinizing hormone (lh) compound
US9499612B2 (en) 2011-07-27 2016-11-22 Glaxo Group Limited Antigen binding constructs
AU2012305062B2 (en) 2011-09-05 2017-06-22 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. A pharmaceutical composition for treating cancer, comprising interferon alpha conjugate
UY34317A (es) 2011-09-12 2013-02-28 Genzyme Corp Anticuerpo antireceptor de célula T (alfa)/ß
WO2013039954A1 (en) 2011-09-14 2013-03-21 Sanofi Anti-gitr antibodies
UY34347A (es) 2011-09-26 2013-04-30 Novartis Ag Proteínas de función dual para tratar trastornos metabólicos
US9006400B2 (en) 2011-09-26 2015-04-14 Novartis Ag Fibroblast growth factor-21-Fc fusion proteins
BR112014007487A2 (pt) 2011-09-30 2017-04-04 Dana Farber Cancer Inst Inc peptídeos terapêuticos
JP6203734B2 (ja) 2011-10-10 2017-09-27 アンピオ ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド 変形性関節疾患の治療
BR112014007657A2 (pt) 2011-10-10 2017-04-11 Ampio Pharmaceuticals Inc dispositivos médicos implantáveis com tolerância imune aperfeiçoada e métodos para produção e implantação
SI2771022T1 (sl) 2011-10-11 2020-12-31 Viela Bio, Inc. CD40L-specifična ogrodja pridobljena iz TN3 in postopki njihove uporabe
EA201490737A1 (ru) 2011-10-28 2014-09-30 Ампио Фармасьютикалз, Инк. Лечение ринита
KR20130049671A (ko) 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
DK2780373T3 (da) 2011-11-16 2019-11-04 Boehringer Ingelheim Int Anti-IL-36R-antistoffer
AU2012347972B2 (en) 2011-12-05 2018-05-10 X-Body, Inc. PDGF receptor beta binding polypeptides
EP3050900A1 (en) 2011-12-19 2016-08-03 Xoma (Us) Llc Methods for treating acne
ES2721882T3 (es) 2011-12-23 2019-08-06 Pfizer Regiones constantes de anticuerpo modificadas por ingeniería genética para conjugación específica de sitio y procedimientos y usos de las mismas
KR101895047B1 (ko) 2011-12-30 2018-09-06 한미사이언스 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 위치 특이적 글루카곤 유사 펩타이드-2 약물 결합체
WO2013106485A2 (en) 2012-01-09 2013-07-18 The Scripps Research Institute Ultralong complementarity determining regions and uses thereof
CA2862979A1 (en) 2012-01-09 2013-07-18 The Scripps Research Institute Humanized antibodies with ultralong cdr3s
PL2804623T3 (pl) 2012-01-12 2020-03-31 Bioverativ Therapeutics Inc. Chimeryczne polipeptydy czynnika viii i ich zastosowania
EP2814587B1 (en) 2012-02-15 2018-05-02 F.Hoffmann-La Roche Ag Fc-receptor based affinity chromatography
CA2864904C (en) 2012-02-15 2023-04-25 Amunix Operating Inc. Factor viii compositions and methods of making and using same
EP3549953A1 (en) 2012-02-15 2019-10-09 Bioverativ Therapeutics Inc. Recombinant factor viii proteins
CN106146506A (zh) 2012-03-05 2016-11-23 吉利德卡利斯托加公司 (s)‑2‑(1‑(9h‑嘌呤‑6‑基氨基)丙基)‑5‑氟‑3‑苯基喹唑啉‑4(3h)‑酮的多晶型物
AR090281A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hanmi Science Co Ltd Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo
KR101665009B1 (ko) 2012-03-09 2016-10-11 한미사이언스 주식회사 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
TWI605060B (zh) 2012-03-28 2017-11-11 賽諾菲公司 抗緩激肽ｂ１受體配位體之抗體
US10064951B2 (en) 2012-03-30 2018-09-04 Hanmi Science Co., Ltd. Liquid formulation of highly concentrated long-acting human growth hormone conjugate
KR102124758B1 (ko) 2012-05-03 2020-06-19 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 항-ｉｌ-23ｐ19 항체
SG11201407209YA (en) 2012-05-07 2014-12-30 Sanofi Sa Methods for preventing biofilm formation
EP2846822A2 (en) 2012-05-11 2015-03-18 Prorec Bio AB Method for diagnosis and treatment of prolactin associated disorders
WO2013175276A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Argen-X B.V Il-6 binding molecules
CA2875247A1 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Biogen Idec Ma Inc. Chimeric clotting factors
EP2858659B1 (en) 2012-06-08 2019-12-25 Bioverativ Therapeutics Inc. Procoagulant compounds
US10023628B2 (en) 2012-07-06 2018-07-17 Bioverativ Therapeutics Inc. Cell line expressing single chain factor VIII polypeptides and uses thereof
KR102329315B1 (ko) 2012-07-11 2021-11-19 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. Xten 및 폰 빌레브란트 인자 단백질과의 viii 인자 복합체 및 이의 용도
EA032192B1 (ru) 2012-07-13 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Биспецифическое антитело к vegf/ang-2, нуклеиновая кислота, кодирующая это антитело, вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, клетка-хозяин, способ получения биспецифического антитела и содержащая его фармацевтическая композиция
KR101968344B1 (ko) 2012-07-25 2019-04-12 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 고지혈증 치료용 조성물
AR091902A1 (es) 2012-07-25 2015-03-11 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulacion liquida de un conjugado de insulina de accion prolongada
AR092862A1 (es) 2012-07-25 2015-05-06 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulacion liquida de insulina de accion prolongada y un peptido insulinotropico y metodo de preparacion
WO2014029752A1 (en) 2012-08-22 2014-02-27 Glaxo Group Limited Anti lrp6 antibodies
UA115789C2 (uk) 2012-09-05 2017-12-26 Трейкон Фармасутікалз, Інк. Композиція антитіла до cd105 та її застосування
US9790268B2 (en) 2012-09-12 2017-10-17 Genzyme Corporation Fc containing polypeptides with altered glycosylation and reduced effector function
PL3366705T3 (pl) 2012-09-12 2023-09-18 Genzyme Corporation FC zawierające polipeptydy o zmienionej glikozylacji i zmniejszonej funkcji efektorowej
KR101993393B1 (ko) 2012-11-06 2019-10-01 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 당뇨병 또는 비만성 당뇨병 치료용 조성물
AU2013342321B2 (en) 2012-11-06 2017-09-28 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Liquid formulation of protein conjugate comprising the oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment
UY35144A (es) 2012-11-20 2014-06-30 Novartis Ag Miméticos lineales sintéticos de apelina para el tratamiento de insuficiencia cardiaca
KR102073748B1 (ko) 2013-01-31 2020-02-05 한미약품 주식회사 재조합 효모 형질전환체 및 이를 이용하여 면역글로불린 단편을 생산하는 방법
EP3299378B1 (en) 2013-02-12 2019-07-31 Bristol-Myers Squibb Company High ph protein refolding methods
WO2014126871A1 (en) 2013-02-12 2014-08-21 Bristol-Myers Squibb Company Tangential flow filtration based protein refolding methods
SI3889173T1 (sl) 2013-02-15 2023-11-30 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimiran gen dejavnika VIII
SG11201506095TA (en) 2013-02-26 2015-09-29 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Novel insulin analog and use thereof
MX361083B (es) 2013-02-26 2018-11-27 Hanmi Pharma Co Ltd Conjugado de insulina específico de sitio.
SG11201506937RA (en) 2013-03-05 2015-10-29 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Improved preparation method for high-yield production of physiologically active polypeptide conjugate
CA2902727C (en) 2013-03-06 2020-08-18 Protalix Ltd. Use of plant cells expressing a tnfalpha polypeptide inhibitor in therapy
BR112015021708A2 (pt) 2013-03-06 2017-08-29 Protalix Ltd Inibidor de polipetídeo do tnfa, polinucleotídeo isolado, estrutura de expressão de ácido nucleico, célula de planta, composição farmacêutica e método de produção de um inibidor de polipeptídeo do tnfa
KR102494631B1 (ko) 2013-03-11 2023-02-06 젠자임 코포레이션 당조작을 통한 부위-특이적 항체-약물 접합
WO2014165277A2 (en) 2013-03-12 2014-10-09 Amgen Inc. POTENT AND SELECTIVE INHIBITORS OF Nav1.7
EP3431592A1 (en) 2013-03-14 2019-01-23 Translate Bio, Inc. Mrna therapeutic compositions and use to treat diseases and disorders
CN105209494B (zh) 2013-03-15 2019-04-09 葛兰素史克知识产权开发有限公司 抗lag-3结合蛋白
EA037906B1 (ru) 2013-03-15 2021-06-04 Биовератив Терапьютикс Инк. Препараты полипептида фактора ix
AU2014228502A1 (en) 2013-03-15 2015-08-20 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Therapeutic peptides
WO2014145729A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Ampio Pharmaceuticals, Inc. Compositions for the mobilization, homing, expansion and differentiation of stem cells and methods of using the same
BR112015022123B1 (pt) 2013-03-15 2022-08-09 Intrinsic Lifesciences, Llc Anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente à hepcidina ou um peptídeo de hepcidina, uso, meio contentor e kit
KR101895634B1 (ko) 2013-05-31 2018-09-05 한미약품 주식회사 변이된 힌지 영역을 포함하는 IgG4 Fc 단편
AR096891A1 (es) 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugado de monómero polipéptido biológicamente activo y conjugado de fragmento fc de inmunoglobulina, que muestra aclaramiento mediado por receptor reducido, y el método para la preparación del mismo
AR096890A1 (es) 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugando fc de inmunoglobulina, que mantiene la afinidad de unión del fragmento fc de la inmunoglobulina a fcrn
US20160168231A1 (en) 2013-07-18 2016-06-16 Fabrus, Inc. Antibodies with ultralong complementarity determining regions
EP3022221B1 (en) 2013-07-18 2021-09-15 Taurus Biosciences, LLC Humanized antibodies with ultralong complementarity determining regions
EA201690278A1 (ru) 2013-07-25 2016-06-30 Новартис Аг Циклические полипептиды для лечения сердечной недостаточности
SG11201600208RA (en) 2013-07-25 2016-02-26 Novartis Ag Bioconjugates of synthetic apelin polypeptides
CA2919477A1 (en) 2013-07-31 2015-02-05 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for modulating thermogenesis using pth-related and egf-related molecules
WO2015021423A2 (en) 2013-08-08 2015-02-12 Biogen Idec Ma Inc. Purification of chimeric fviii molecules
TW201722994A (zh) 2013-08-13 2017-07-01 賽諾菲公司 胞漿素原活化素抑制劑-１（ｐａｉ-１）之抗體及其用途
KR20160035077A (ko) 2013-08-13 2016-03-30 사노피 플라스미노겐 활성인자 저해제-1(pai-1)에 대한 항체 및 그의 용도
US10548953B2 (en) 2013-08-14 2020-02-04 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor VIII-XTEN fusions and uses thereof
US10611794B2 (en) 2013-09-25 2020-04-07 Bioverativ Therapeutics Inc. On-column viral inactivation methods
RU2683823C2 (ru) 2013-09-27 2019-04-02 Ханми Фарм. Ко., Лтд. Препарат гормона роста человека длительного типа
US20160235810A1 (en) 2013-10-18 2016-08-18 Novartis Ag Methods of treating diabetes and related disorders
PL3063275T3 (pl) 2013-10-31 2020-03-31 Resolve Therapeutics, Llc Terapeutyczne fuzje nukleaza-albumina i sposoby
US10584147B2 (en) 2013-11-08 2020-03-10 Biovertiv Therapeutics Inc. Procoagulant fusion compound
CA2932767A1 (en) 2013-12-06 2015-06-11 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Therapeutic peptides
CA2934531C (en) 2013-12-20 2020-02-25 Gilead Calistoga Llc Process methods for phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors
AU2014364414A1 (en) 2013-12-20 2016-06-30 Gilead Calistoga Llc Polymorphic forms of a hydrochloride salt of (S) -2-(1-(9H-purin-6-ylamino) propyl) -5-fluoro-3-phenylquinazolin-4 (3H) -one
CN106456718A (zh) 2014-01-10 2017-02-22 比奥根Ma公司 因子viii嵌合蛋白及其用途
PE20161153A1 (es) 2014-01-20 2016-10-27 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Insulina de accion prolongada y uso de la misma
KR20160113715A (ko) 2014-01-31 2016-09-30 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 신규한 항-ｂａｆｆ 항체
CN106456728A (zh) 2014-03-14 2017-02-22 达纳－法伯癌症研究所公司 恢复对抗癌症的nkg2d通路功能的疫苗组合物和方法
ES2940903T3 (es) 2014-03-19 2023-05-12 Genzyme Corp Glucomanipulación específica del sitio de restos orientadores
JP6640181B2 (ja) 2014-03-21 2020-02-05 エックス−ボディ インコーポレイテッド 二重特異性抗原結合ポリペプチド
AU2015242657B2 (en) 2014-03-31 2020-05-21 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Method for improving solubility of protein and peptide by using immunoglobulin Fc fragment linkage
EP3888690A3 (en) 2014-05-16 2021-10-20 MedImmune, LLC Molecules with altered neonate fc receptor binding having enhanced therapeutic and diagnostic properties
AR100639A1 (es) 2014-05-29 2016-10-19 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Composición para tratar diabetes que comprende conjugados de análogos de insulina de acción prolongada y conjugados de péptidos insulinotrópicos de acción prolongada
TWI684458B (zh) 2014-05-30 2020-02-11 南韓商韓美藥品股份有限公司 包含胰島素及ｇｌｐ-１/昇糖素雙重促效劑之治療糖尿病之組成物
KR20150140177A (ko) 2014-06-05 2015-12-15 한미약품 주식회사 단백질 및 펩타이드의 면역원성을 감소시키는 방법
EP3610924B1 (en) 2014-06-06 2021-11-03 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (gitr) and uses thereof
JP6803236B2 (ja) 2014-06-10 2020-12-23 アムジェン インコーポレイテッド アペリンポリペプチド
AU2015274696B2 (en) 2014-06-13 2018-09-27 Gilead Sciences, Inc. Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors
JP6655074B2 (ja) 2014-06-20 2020-02-26 ジェネンテック， インコーポレイテッド シャガシンに基づく足場組成物、方法及び使用
EP3157942B1 (en) 2014-06-23 2020-06-17 Novartis AG Site specific protein modifications
EP3912637A1 (en) 2014-06-30 2021-11-24 Altor BioScience Corporation Il-15-based molecules and methods of use thereof
EP3160478A4 (en) 2014-06-30 2018-05-16 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimized factor ix gene
RU2020136589A (ru) 2014-08-18 2020-12-24 Ампио Фармасьютикалз, Инк. Лечение дегенеративных заболеваний суставов
MX2017003247A (es) 2014-09-15 2017-11-30 Amgen Inc Proteina de union a antigenos, bi-especificos del receptor anti-cgrp/receptor pac1 y usos de las mismas.
TWI772252B (zh) 2014-09-16 2022-08-01 南韓商韓美藥品股份有限公司 長效glp-1/高血糖素受體雙促效劑治療非酒精性脂肝疾病之用途
CA2961917A1 (en) 2014-09-22 2016-03-31 Intrinsic Lifesciences Llc Humanized anti-hepcidin antibodies and uses thereof
KR20170062490A (ko) 2014-09-26 2017-06-07 바이엘 파마 악티엔게젤샤프트 안정화된 아드레노메둘린 유도체 및 그의 용도
EP3204425B1 (en) 2014-10-09 2020-09-16 Genzyme Corporation Glycoengineered antibody drug conjugates
PL3207130T3 (pl) 2014-10-14 2020-02-28 Halozyme, Inc. Kompozycje deaminazy adenozyny 2 (ada2), jej warianty i sposoby ich zastosowania
EP3611188B1 (en) * 2014-11-06 2022-05-04 F. Hoffmann-La Roche AG Fc-region variants with modified fcrn-binding and methods of use
AU2015346444A1 (en) 2014-11-12 2017-05-04 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Anti-endoglin antibodies and uses thereof
US9926375B2 (en) 2014-11-12 2018-03-27 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Anti-endoglin antibodies and uses thereof
KR102418477B1 (ko) 2014-12-30 2022-07-08 한미약품 주식회사 글루카곤 유도체
UA126960C2 (uk) 2014-12-30 2023-03-01 Ханмі Фарм. Ко., Лтд. Похідна глюкагону
WO2016133372A2 (ko) 2015-02-17 2016-08-25 한미약품 주식회사 지속형 인슐린 또는 이의 아날로그 결합체
US10711067B2 (en) 2015-03-03 2020-07-14 Xoma (Us) Llc Treatment of post-prandial hyperinsulinemia and hypoglycemia after bariatric surgery
WO2016209969A1 (en) 2015-06-22 2016-12-29 Ampio Pharmaceuticals, Inc. Use of low molecular weight fractions of human serum albumin in treating diseases
CN108025041A (zh) 2015-06-30 2018-05-11 韩美药品株式会社 胰高血糖素衍生物和包含其长效缀合物的组合物
WO2017024060A1 (en) 2015-08-03 2017-02-09 Biogen Ma Inc. Factor ix fusion proteins and methods of making and using same
WO2017024114A1 (en) 2015-08-06 2017-02-09 President And Fellows Of Harvard College Improved microbe-binding molecules and uses thereof
AU2016304588A1 (en) 2015-08-06 2018-02-15 Xoma (Us) Llc Antibody fragments against the insulin receptor and uses thereof to treat hypoglycemia
US11254744B2 (en) 2015-08-07 2022-02-22 Imaginab, Inc. Antigen binding constructs to target molecules
UY36870A (es) 2015-08-28 2017-03-31 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Análogos de insulina novedosos
EP3344654B1 (en) 2015-09-02 2020-10-21 Immutep S.A.S. Anti-lag-3 antibodies
AU2016323440B2 (en) 2015-09-15 2023-07-13 Amgen Inc. Tetravalent bispecific and tetraspecific antigen binding proteins and uses thereof
TWI799366B (zh) 2015-09-15 2023-04-21 美商建南德克公司 胱胺酸結骨架平臺
WO2017046746A1 (en) 2015-09-15 2017-03-23 Acerta Pharma B.V. Therapeutic combinations of a btk inhibitor and a gitr binding molecule, a 4-1bb agonist, or an ox40 agonist
CN108136276B (zh) 2015-09-24 2023-02-28 韩美药品株式会社 通过使用免疫球蛋白片段的特异性位点进行连接的蛋白质复合物
AU2016332062A1 (en) 2015-10-01 2018-04-26 Amgen Inc. Treatment of bile acid disorders
SG11201803211TA (en) 2015-11-03 2018-05-30 Ambrx Inc Anti-cd3-folate conjugates and their uses
US11213586B2 (en) 2015-11-19 2022-01-04 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (GITR)
WO2017096262A1 (en) 2015-12-04 2017-06-08 Jomoco, Corp. Compositions and methods to mitigate or prevent an immune response to an immunogenic therapeutic molecule in non-human primates
MA43567A (fr) 2015-12-15 2018-11-14 Amgen Inc Anticorps pacap et leurs utilisations
CR20180365A (es) 2015-12-16 2018-09-28 Amgen Inc PROTEÍNAS DE UNIÓN AL ANTÍGENO BISPECÍFICO DE ANTI-TL1A/ANTI-TNF-a Y SUS USOS
AU2016382394B2 (en) 2015-12-31 2019-07-04 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Long-acting conjugate of triple glucagon/GLP-1/GIP receptor agonist
AR107483A1 (es) 2016-01-29 2018-05-02 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugado de enzimas terapéuticas
PL3411478T3 (pl) 2016-02-01 2022-10-03 Bioverativ Therapeutics Inc. Geny zoptymalizowanego czynnika VIII
JP6937773B2 (ja) 2016-03-07 2021-09-22 ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド ポリエチレングリコール誘導体及びその用途
EP3426691A4 (en) 2016-03-07 2019-09-25 Charlestonpharma, LLC ANTI-NUCLEOLIN ANTIBODIES
MX2018011219A (es) 2016-03-16 2019-01-10 Merrimack Pharmaceuticals Inc Trail diseñado por ingenieria para terapia de cancer.
AU2017271593B2 (en) * 2016-05-27 2021-04-22 Altor Bioscience Corporation Construction and characterization of multimeric IL-15-based molecules with CD3 binding domains
WO2017207694A1 (en) 2016-06-02 2017-12-07 Kohlmann Angelica Antibodies that bind to human anti-müllerian hormone (amh) and their uses
MA45404A (fr) 2016-06-16 2019-04-24 Univ Leland Stanford Junior Anticorps monoclonaux humanisés et chimériques dirigés contre cd81
KR20230129583A (ko) 2016-06-21 2023-09-08 테네오바이오, 인코포레이티드 Cd3 결합 항체
KR102005457B1 (ko) 2016-06-29 2019-07-30 한미약품 주식회사 글루카곤 유도체, 이의 결합체, 및 이를 포함하는 조성물, 및 이의 치료적 용도
CA3029627A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Resolve Therapeutics, Llc Optimized binuclease fusions and methods
SG10201911972QA (en) 2016-07-14 2020-02-27 Bristol Myers Squibb Co Antibodies against tim3 and uses thereof
WO2018044970A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 University Of Rochester Human monoclonal antibodies to human endogenous retrovirus k envelope (herv-k) and uses thereof
CN110198729A (zh) 2016-09-09 2019-09-03 豪夫迈·罗氏有限公司 卷曲蛋白的选择性肽抑制剂
CN109843325B (zh) 2016-09-14 2023-10-03 特尼奥生物股份有限公司 Cd3结合抗体
EP3517544A4 (en) 2016-09-23 2020-06-03 Hanmi Pharm. Co., Ltd. INSULIN ANALOG HAVING REDUCED INSULIN RECEPTOR BINDING FORCE AND USE THEREOF
CA3041310C (en) 2016-10-21 2023-09-05 Altor Bioscience Corporation Multimeric il-15-based molecules
TWI788307B (zh) 2016-10-31 2023-01-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之工程化人造抗原呈現細胞
MA46753A (fr) 2016-11-14 2019-09-18 Amgen Inc Protéines de liaison à l'antigène bispécifiques ou biparatopiques et utilisations de celles-ci
MX2019005772A (es) 2016-11-23 2019-10-02 Bioverativ Therapeutics Inc Anticuerpos mono y biespecíficos que se unen al factor de coagulación ix y al factor de coagulación x.
KR20190090827A (ko) 2016-12-02 2019-08-02 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 키메라 응고 인자를 사용해 혈우병성 관절증을 치료하는 방법
AU2017368328A1 (en) 2016-12-02 2019-07-18 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of inducing immune tolerance to clotting factors
CN110291103A (zh) 2016-12-05 2019-09-27 韩美药品株式会社 具有弱化的免疫应答的缀合物
CN110312532A (zh) 2016-12-19 2019-10-08 韩美药品株式会社 脑靶向长效蛋白质缀合物
TW201837168A (zh) 2017-01-06 2018-10-16 美商艾歐凡斯生物治療公司 以腫瘤壞死因子受體超家族（ｔｎｆｒｓｆ）促效劑使腫瘤浸潤淋巴球（ｔｉｌ）擴增及ｔｉｌ與ｔｎｆｒｓｆ促效劑的治療組合
CA3049165A1 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes with potassium channel agonists and therapeutic uses thereof
TW201833140A (zh) 2017-01-09 2018-09-16 美商莫瑞麥克製藥公司 抗fgfr抗體及使用方法
JP2020506932A (ja) 2017-02-03 2020-03-05 ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド 持続性が増加した生理活性物質の結合体及びその用途
US11925691B2 (en) 2017-02-07 2024-03-12 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Non-peptidic polymeric linker compound, conjugate comprising same linker compound, and methods for preparing same linker compound and conjugate
US11266745B2 (en) 2017-02-08 2022-03-08 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
EA201991720A1 (ru) 2017-02-17 2020-01-20 Бристол-Маерс Сквибб Компани Антитела к альфа-синуклеину и их применения
CA3055318A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Altor Bioscience Corporation Il-15-based fusions to il-12 and il-18
KR101941975B1 (ko) 2017-03-17 2019-01-25 고려대학교 산학협력단 Atpif1을 함유하는 당뇨 치료용 약학조성물
AR111341A1 (es) 2017-03-23 2019-07-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Un conjugado del análogo de insulina con afinidad reducida para el receptor de insulina y uso del mismo
WO2018183173A1 (en) 2017-03-27 2018-10-04 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti il-36r antibodies combination therapy
US20190048055A1 (en) 2017-03-31 2019-02-14 Altor Bioscience Corporation Alt-803 in combination with anti-cd38 antibody for cancer therapies
EP3606560A2 (en) 2017-04-05 2020-02-12 Novo Nordisk A/S Oligomer extended insulin-fc conjugates
US20200224161A1 (en) 2017-05-10 2020-07-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes from liquid tumors and therapeutic uses thereof
US11168129B2 (en) 2017-05-15 2021-11-09 University Of Rochester Broadly neutralizing anti-influenza human monoclonal antibody and uses thereof
US10793634B2 (en) 2017-06-09 2020-10-06 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-TrkB antibodies
EP3642236A1 (en) 2017-06-20 2020-04-29 TeneoOne, Inc. Anti-bcma heavy chain-only antibodies
CN117866097A (zh) 2017-06-20 2024-04-12 特尼奥生物股份有限公司 仅有重链的抗bcma抗体
CN111094559A (zh) 2017-07-07 2020-05-01 韩美药品株式会社 新型治疗酶融合蛋白及其用途
KR20200035130A (ko) 2017-08-09 2020-04-01 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 핵산 분자 및 이의 용도
US10947295B2 (en) 2017-08-22 2021-03-16 Sanabio, Llc Heterodimers of soluble interferon receptors and uses thereof
CN111655716B (zh) 2017-08-28 2024-03-08 艾尔特生物科技公司 基于il-15的与il-7和il-21的融合体
EP3681908A1 (en) 2017-09-13 2020-07-22 Teneobio, Inc. Heavy chain antibodies binding to ectoenzymes
CN111433221A (zh) 2017-09-28 2020-07-17 韩美药品株式会社 胰高血糖素样肽-2(glp-2)衍生物的长效缀合物
KR20190036956A (ko) 2017-09-28 2019-04-05 한미약품 주식회사 지속형 단쇄 인슐린 아날로그 및 이의 결합체
US11357861B2 (en) 2017-09-29 2022-06-14 Hanmi Pharm. Co., Ltd Protein complex comprising non-peptidyl polymer-coupled fatty acid derivative compound as linker and preparation method therefor
WO2019066603A1 (ko) 2017-09-29 2019-04-04 한미약품 주식회사 효력이 향상된 지속성 단백질 결합체
WO2019075090A1 (en) 2017-10-10 2019-04-18 Tilos Therapeutics, Inc. ANTI-LAP ANTIBODIES AND USES THEREOF
JP2021503885A (ja) 2017-11-22 2021-02-15 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 末梢血からの末梢血リンパ球（ｐｂｌ）の拡大培養
US20210369775A1 (en) 2017-12-15 2021-12-02 Iovance Biotherapeutics, Inc. Systems and methods for determining the beneficial administration of tumor infiltrating lymphocytes, and methods of use thereof and beneficial administration of tumor infiltrating lymphocytes, and methods of use thereof
JP7486421B2 (ja) 2017-12-22 2024-05-17 テネオバイオ， インコーポレイテッド Ｃｄ２２に結合する重鎖抗体
AU2018388331A1 (en) 2017-12-22 2020-07-02 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Therapeutic enzyme fusion protein having a novel structure and use thereof
CN111601613A (zh) 2017-12-22 2020-08-28 诺华股份有限公司 用fgf21变体治疗代谢障碍的方法
JP2021508479A (ja) * 2017-12-27 2021-03-11 テネオバイオ， インコーポレイテッド ヘテロ二量体特異的抗体上のｃｄ３デルタ及びｃｄ３イプシロン
EP3737700A1 (en) 2018-01-12 2020-11-18 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against tim3 and uses thereof
US10738110B2 (en) 2018-01-12 2020-08-11 Amgen Inc. PAC1 antibodies and uses thereof
SG11202007114VA (en) 2018-02-01 2020-08-28 Bioverativ Therapeutics Inc Use of lentiviral vectors expressing factor viii
EP3752600A1 (en) 2018-02-13 2020-12-23 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes (tils) with adenosine a2a receptor antagonists and therapeutic combinations of tils and adenosine a2a receptor antagonists
JP7351845B2 (ja) 2018-03-23 2023-09-27 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｍｉｃａおよび／またはｍｉｃｂに対する抗体ならびにそれらの使用
US11168138B2 (en) 2018-03-26 2021-11-09 Altor Bioscience, Llc Anti-PDL1, IL-15 and TGF-beta receptor combination molecules
CA3094112A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Bristol-Myers Squibb Company Interleukin-2/interleukin-2 receptor alpha fusion proteins and methods of use
KR20190114907A (ko) 2018-03-30 2019-10-10 한미약품 주식회사 뇌 표적 지속성 단백질 결합체, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 조성물
MX2020010204A (es) 2018-04-02 2021-01-29 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos anti-trem-1 y usos de los mismos.
EP3774916A2 (en) 2018-04-06 2021-02-17 Biolegend, Inc. Anti-tetraspanin 33 agents and compositions and methods for making and using the same
EP3792276A4 (en) 2018-04-26 2022-02-16 Good T Cells, Inc. NOVEL FUSION PROTEIN AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION TO PREVENT OR TREAT CANCER THEREOF
US11958895B2 (en) 2018-05-03 2024-04-16 University Of Rochester Anti-influenza neuraminidase monoclonal antibodies and uses thereof
EP3790904A1 (en) 2018-05-08 2021-03-17 Amgen Inc. Bispecific antibodies with cleavable c-terminal charge-paired tags
EP3793588A1 (en) 2018-05-18 2021-03-24 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of treating hemophilia a
US20210238289A1 (en) 2018-06-04 2021-08-05 Biogen Ma Inc. Anti-vla-4 antibodies having reduced effector function
KR20210027436A (ko) 2018-06-29 2021-03-10 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 자가면역 질환을 치료하는데 사용하기 위한 항-cd40 항체
MX2021000016A (es) 2018-07-03 2021-03-09 Bristol Myers Squibb Co Formulaciones de factor de crecimiento de fibroblastos (fgf-21).
SG11202011597RA (en) 2018-07-20 2020-12-30 Teneobio Inc Heavy chain antibodies binding to cd19
CN112543644A (zh) 2018-07-24 2021-03-23 古德T细胞有限公司 一种预防和治疗免疫相关疾病的组合物
AU2019319984A1 (en) 2018-08-09 2021-03-04 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acid molecules and uses thereof for non-viral gene therapy
TW202031273A (zh) 2018-08-31 2020-09-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 抗ｐｄ－１抗體難治療性之非小細胞肺癌（ｎｓｃｌｃ）病患的治療
SG11202102713TA (en) 2018-09-21 2021-04-29 Teneobio Inc Methods for purifying heterodimeric, multispecific antibodies
EP3856343A1 (en) 2018-09-25 2021-08-04 Biolegend, Inc. Anti-tlr9 agents and compositions and methods for making and using the same
CN110964116A (zh) 2018-09-26 2020-04-07 北京辅仁瑞辉生物医药研究院有限公司 GLP1-Fc融合蛋白及其缀合物
WO2020071865A1 (ko) 2018-10-04 2020-04-09 한미약품 주식회사 글루카곤 및 이를 포함하는 조합물의 치료학적 용도
EP3863680A1 (en) 2018-10-10 2021-08-18 Novo Nordisk A/S Oligomer extended insulin-fc conjugates and their medical use
EP3863722A2 (en) 2018-10-10 2021-08-18 Tilos Theapeutics, Inc. Anti-lap antibody variants and uses thereof
CA3100232A1 (en) 2018-10-26 2020-04-30 Teneobio, Inc. Heavy chain antibodies binding to cd38
PE20211867A1 (es) 2018-11-01 2021-09-21 Shandong New Time Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos biespecificos y su uso
SG11202104663PA (en) 2018-11-05 2021-06-29 Iovance Biotherapeutics Inc Treatment of nsclc patients refractory for anti-pd-1 antibody
CN113365651A (zh) 2018-12-21 2021-09-07 韩美药品株式会社 包含胰岛素和胰高血糖素的药物组合物
JP2022515229A (ja) 2018-12-21 2022-02-17 ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド グルカゴン、ｇｌｐ－１及びｇｉｐ受容体の全てに活性を有する三重活性体と、インスリンとを含む薬学組成物
US20220089786A1 (en) 2019-01-04 2022-03-24 Resolve Therapeutics, Llc Treatment of sjogren's disease with nuclease fusion proteins
JP7285936B2 (ja) 2019-01-22 2023-06-02 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｉｌ－７ｒアルファサブユニットに対する抗体及びその使用
JP2022522473A (ja) 2019-03-01 2022-04-19 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 液性腫瘍からの腫瘍浸潤リンパ球の拡大培養及びその治療的使用
AU2020253455A1 (en) 2019-04-03 2021-11-04 Genzyme Corporation Anti-alpha beta TCR binding polypeptides with reduced fragmentation
AU2020252556A1 (en) 2019-04-05 2021-10-21 Teneobio, Inc. Heavy chain antibodies binding to PSMA
KR102524577B1 (ko) 2019-04-22 2023-04-21 전남대학교산학협력단 플라젤린 융합 단백질 및 이의 용도
AU2020267874A1 (en) 2019-05-09 2021-10-28 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-Sema3A antibodies and their uses for treating eye or ocular diseases
WO2020243477A2 (en) 2019-05-30 2020-12-03 Amgen Inc. Engineering the hinge region to drive antibody dimerization
JOP20210323A1 (ar) 2019-06-14 2023-01-30 Teneobio Inc ارتباط أجسام مضادة ثقيلة السلسلة ومتعددة النوعية بـ cd22 وcd3
WO2020254197A1 (en) 2019-06-18 2020-12-24 Bayer Aktiengesellschaft Adrenomedullin-analogues for long-term stabilization and their use
TW202115112A (zh) 2019-06-27 2021-04-16 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 抗-angpt2抗體
PT3936142T (pt) 2019-06-28 2024-03-19 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd Agonista triplo com atividade em relação a todos os recetores de glucagon, glp-1 e gip para tratamento de doenças hepáticas
WO2020264384A1 (en) 2019-06-28 2020-12-30 Amgen Inc. Anti-cgrp receptor/anti-pac1 receptor bispecific antigen binding proteins
JP2022540674A (ja) 2019-07-15 2022-09-16 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 抗ｔｒｅｍ－１抗体およびその使用
EP3999541A1 (en) 2019-07-15 2022-05-25 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against human trem-1 and uses thereof
KR102334315B1 (ko) 2019-07-18 2021-12-06 한미약품 주식회사 신규 중간체 제조를 통한 지속형 약물 결합체의 제조 방법
JP2022542431A (ja) 2019-07-30 2022-10-03 キューエルエスエフ バイオセラピューティクス， インコーポレイテッド 二重特異性抗ｌｒｒｃ１５及びｃｄ３イプシロン抗体
MX2022001626A (es) 2019-08-06 2022-03-02 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Composiciones biofarmaceuticas y procedimientos conexos.
TW202126685A (zh) 2019-09-24 2021-07-16 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 抗nrp1a抗體及其用於治療眼或眼部疾病之用途
KR20220097891A (ko) 2019-09-30 2022-07-08 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 렌티바이러스 벡터 제형
JP2022551282A (ja) 2019-10-04 2022-12-08 ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド グルカゴン、及びｇｌｐ－１受容体及びｇｉｐ受容体二重アゴニストを含む組成物及びその治療学的使用
AU2020371784A1 (en) 2019-10-24 2022-06-02 Minotaur Therapeutics, Inc. Chimeric cytokine modified antibodies and methods of use thereof
MX2022005566A (es) 2019-11-08 2022-07-19 Amgen Inc Genomanipulación de mutaciones de par de carga para el emparejamiento de moléculas hetero-lgg.
AU2020386005A1 (en) 2019-11-19 2022-05-26 Amgen Inc. Novel multispecific antibody format
IL293751A (en) 2019-12-18 2022-08-01 Teneofour Inc Heavy chain antibodies that bind to cd38
MX2022007688A (es) 2019-12-20 2022-07-19 Amgen Inc Constructos de anticuerpo multiespecificos agonistas de cd40 dirigidos a mesotelina para el tratamiento de tumores solidos.
EP4082561A4 (en) 2019-12-24 2024-02-07 Hanmi Pharm. Co., Ltd. PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING METABOLIC BONE DISEASES, CONTAINING GLP-2 OR A CONJUGATE THEREOF
KR20210091032A (ko) 2020-01-13 2021-07-21 한미약품 주식회사 글루카곤, glp-1 및 gip 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중 활성체의 지속형 결합체의 폐질환의 치료 용도
EP4090681A1 (en) 2020-01-17 2022-11-23 Biolegend, Inc. Anti-tlr7 agents and compositions and methods for making and using the same
EP4100426A1 (en) 2020-02-06 2022-12-14 Bristol-Myers Squibb Company Il-10 and uses thereof
BR112022016999A2 (pt) 2020-02-28 2022-10-25 Genzyme Corp Polipeptídeos de ligação modificados para conjugação de fármacos otimizada
KR20210121585A (ko) 2020-03-30 2021-10-08 한국세라믹기술원 반응성 및 안정성 그리고 항체회수가 향상된 z-도메인 및 칼시퀘스트린 융합단백질 및 이를 이용한 항체의 분리 및 정제 방법
JP2023519930A (ja) 2020-04-01 2023-05-15 ユニバーシティ オブ ロチェスター インフルエンザｈ３ｎ２ウイルスのヘマグルチニン（ｈａ）およびノイラミニダーゼ（ｎａ）に対するモノクローナル抗体
CA3173353A1 (en) 2020-04-03 2021-10-07 Jin Bong Lee Pharmaceutical composition for preventing or treating mucositis induced by radiotherapy, chemotherapy, or combination thereof, comprising glp-2 derivatives or long-acting conjugate of same
US20230272056A1 (en) 2020-04-09 2023-08-31 Merck Sharp & Dohme Llc Affinity matured anti-lap antibodies and uses thereof
CN115916238A (zh) 2020-04-20 2023-04-04 韩美药品株式会社 包含胰高血糖素/GLP-l/GIP受体三重激动剂或其缀合物的高血脂症预防或治疗组合物及其使用方法
MX2021015024A (es) 2020-04-28 2022-01-18 Univ Rockefeller Anticuerpos anti-sars-cov-2 ampliamente neutralizantes y métodos de uso de los mismos.
UY39191A (es) 2020-04-29 2021-11-30 Teneobio Inc Anticuerpos de cadena pesada multiespecíficos con regiones constantes de cadena pesada modificadas
CR20230149A (es) 2020-04-29 2023-05-25 Teneobio Inc Anticuerpos de cadena pesada multiespecíficos con regiones constantes de cadena pesada modificadas (divisional exp no 2022-539)
WO2021222616A1 (en) 2020-04-29 2021-11-04 Teneobio, Inc. Methods of treating multiple myeloma
WO2021235915A1 (ko) 2020-05-22 2021-11-25 한미약품 주식회사 액상 제제
EP4154869A1 (en) 2020-05-22 2023-03-29 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Liquid formulation of long-acting conjugate of glp-2
CA3179603A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Liquid formulation of long-acting conjugate of glucagon derivative
US20230285583A1 (en) 2020-05-22 2023-09-14 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Liquid formulation of long-acting conjugate of glucagon, glp-1, and gip trigonal agonist
CN115956087A (zh) 2020-05-26 2023-04-11 勃林格殷格翰国际有限公司 抗-pd-1抗体
UY39298A (es) 2020-06-26 2022-01-31 Amgen Inc Muteínas de il-10 y proteínas de fusión de las mismas
WO2022006153A1 (en) 2020-06-29 2022-01-06 Resolve Therapeutics, Llc Treatment of sjogren's syndrome with nuclease fusion proteins
CN116472049A (zh) 2020-06-30 2023-07-21 特尼奥生物股份有限公司 与bcma结合的多特异性抗体
AU2021308828A1 (en) 2020-07-15 2023-02-23 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Therapeutic use of glucagon derivative or conjugate thereof for liver disease
CA3186416A1 (en) 2020-07-17 2022-01-20 John A. Barrett Methods of treating chemotherapy induced neutropenia using fixed doses of g-csf protein complex
CN116209475A (zh) 2020-07-17 2023-06-02 韩美药品株式会社 包括三重激动长效缀合物或三重激动剂的组合的治疗用途
CA3189527A1 (en) 2020-07-24 2022-01-27 Jiangsu Gensciences Inc. Insulin-fc fusion protein and application thereof
EP4197550A1 (en) 2020-08-14 2023-06-21 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Hypotensive pharmaceutical composition comprising triple activator having activity for all of glucagon, glp-1, and gip receptors
MX2023001599A (es) 2020-08-14 2023-03-07 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd Composicion farmaceutica que comprende un conjugado de accion prolongada del triple agonista del receptor de glucagon/glp-1/gip.
EP4200338A1 (en) 2020-08-20 2023-06-28 Amgen Inc. Antigen binding proteins with non-canonical disulfide in fab region
CN116437967A (zh) 2020-09-25 2023-07-14 韩美药品株式会社 包括对胰高血糖素、glp-1和glp受体全部具有活性的三重激动剂或其缀合物的用于预防或治疗骨病的药物组合物
KR20220041764A (ko) 2020-09-25 2022-04-01 한미약품 주식회사 글루카곤, glp-1 및 gip 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중 활성체 또는 이의 결합체의 신경퇴행성 질환의 치료 용도
JP2023543043A (ja) 2020-09-25 2023-10-12 ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド グルカゴン、ｇｌｐ－１及びｇｉｐ受容体の全てに対して活性を有する三重活性体の持続型結合体の多発性硬化症の治療用途
WO2022076606A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
CA3195019A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Maria Fardis Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
MX2023004088A (es) 2020-10-07 2023-04-27 Amgen Inc Seleccion racional de bloques de construccion para el ensamblaje de anticuerpos multiespecificos.
US20230381331A1 (en) 2020-10-16 2023-11-30 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Gip derivative, long-acting conjugate thereof, and pharmaceutical composition comprising same
EP4230219A1 (en) 2020-10-16 2023-08-23 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising glucagon/glp-1/gip triple agonist or long-acting conjugate thereof for preventing or treating lupus-related diseases
EP4230217A1 (en) 2020-10-16 2023-08-23 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Pharmaceutical composition for preventing or treating lupus-related diseases comprising gip derivative or long-acting conjugate thereof
CN116419765A (zh) 2020-10-16 2023-07-11 韩美药品株式会社 Glp-1/gip双重激动剂、其长效缀合物，以及包括其的药物组合物
EP4229094A1 (en) 2020-10-16 2023-08-23 QLSF Biotherapeutics, Inc. Multispecific binding compounds that bind to pd-l1
KR20220050824A (ko) 2020-10-16 2022-04-25 한미약품 주식회사 글루카곤, glp-1 및 gip 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중 활성체의 호흡기 감염 질환의 후유증의 치료 용도
EP4230218A1 (en) 2020-10-16 2023-08-23 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising glucagon/glp-1/gip triple agonist or long-acting conjugate thereof for preventing or treating vasculitis
US20220127344A1 (en) 2020-10-23 2022-04-28 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-sema3a antibodies and their uses for treating a thrombotic disease of the retina
WO2022093641A1 (en) 2020-10-30 2022-05-05 BioLegend, Inc. Anti-nkg2a agents and compositions and methods for making and using the same
WO2022093640A1 (en) 2020-10-30 2022-05-05 BioLegend, Inc. Anti-nkg2c agents and compositions and methods for making and using the same
JP2023548878A (ja) 2020-11-04 2023-11-21 ザ ロックフェラー ユニバーシティー 中和抗ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２抗体
CA3200603A1 (en) 2020-11-10 2022-05-19 Amgen Inc. Novel linkers of multispecific antigen binding domains
MX2023005580A (es) 2020-11-13 2023-05-29 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd Uso de una proteina de fusion enzimatica terapeutica en la prevencion y el tratamiento de enfermedades renales provocadas por o acompa?adas de la enfermedad de fabry.
WO2022103220A1 (ko) 2020-11-13 2022-05-19 한미약품 주식회사 치료학적 효소 융합단백질의 파브리병에 기인하거나 동반되는 신경병증 예방 및 치료 용도
TW202233684A (zh) 2020-11-18 2022-09-01 美商泰尼歐生物公司 結合於葉酸受體α之重鏈抗體
WO2022125941A1 (en) 2020-12-11 2022-06-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with braf inhibitors and/or mek inhibitors
KR20220086522A (ko) 2020-12-16 2022-06-23 주식회사 굳티셀 Taci 단백질의 용도
WO2022133140A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with ctla-4 and pd-1 inhibitors
WO2022133149A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancers with tumor infiltrating lymphocytes
TW202247856A (zh) 2020-12-24 2022-12-16 南韓商韓美藥品股份有限公司 新穎之三重升糖素／ｇｌｐ－１／ｇｉｐ受體促效劑及其用途
KR20220092446A (ko) 2020-12-24 2022-07-01 한미약품 주식회사 단장증후군의 예방 또는 치료를 위한 인슐린 분비 펩타이드 및 glp-2의 병용 요법
US20240110152A1 (en) 2020-12-31 2024-04-04 Iovance Biotherapeutics, Inc. Devices and processes for automated production of tumor infiltrating lymphocytes
WO2022155324A1 (en) 2021-01-15 2022-07-21 The Rockefeller University Neutralizing anti-sars-cov-2 antibodies
KR20220110117A (ko) 2021-01-29 2022-08-05 한미약품 주식회사 Gip 유도체 또는 이의 지속형 결합체를 포함하는 폐질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2022165260A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of making modified tumor infiltrating lymphocytes and their use in adoptive cell therapy
EP4288457A2 (en) 2021-02-05 2023-12-13 Boehringer Ingelheim International GmbH Anti-il1rap antibodies
KR20230148828A (ko) 2021-02-25 2023-10-25 테네오바이오, 인코포레이티드 항-psma 항체 및 car-t 구조
CN116917327A (zh) 2021-02-26 2023-10-20 特尼奥生物股份有限公司 抗muc1-c抗体及car-t结构
CA3210755A1 (en) 2021-03-05 2022-09-09 Kenneth ONIMUS Tumor storage and cell culture compositions
WO2022198141A1 (en) 2021-03-19 2022-09-22 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods for tumor infiltrating lymphocyte (til) expansion related to cd39/cd69 selection and gene knockout in tils
CN118019546A (zh) 2021-03-23 2024-05-10 艾欧凡斯生物治疗公司 肿瘤浸润淋巴细胞的cish基因编辑及其在免疫疗法中的用途
CA3213163A1 (en) 2021-03-25 2022-09-29 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for t-cell coculture potency assays and use with cell therapy products
EP4316528A1 (en) 2021-03-31 2024-02-07 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Novel immunoactive interleukin 2 analog conjugate and method for preparing same
WO2022212876A1 (en) 2021-04-02 2022-10-06 The Regents Of The University Of California Antibodies against cleaved cdcp1 and uses thereof
TW202304994A (zh) 2021-04-02 2023-02-01 美商泰尼歐生物公司 促效性抗ｉｌ－２ｒ抗體及使用方法
WO2022216864A1 (en) 2021-04-06 2022-10-13 Teneobio, Inc. Anti-cd19 antibodies and car-t structures
KR20220140443A (ko) 2021-04-09 2022-10-18 한미약품 주식회사 글루카곤 유도체를 포함하는 만성 신장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물
WO2022221698A1 (en) 2021-04-16 2022-10-20 Teneobio, Inc. Anti-cd20 antibodies and car-t structures
US20240207318A1 (en) 2021-04-19 2024-06-27 Yongliang Zhang Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
WO2022225921A1 (en) 2021-04-20 2022-10-27 Amgen Inc. Balanced charge distribution in electrostatic steering of chain pairing in multi-specific and monovalent igg molecule assembly
AU2022264339A1 (en) 2021-04-28 2023-11-09 Minotaur Therapeutics, Inc. Humanized chimeric bovine antibodies and methods of use
WO2022235867A2 (en) 2021-05-06 2022-11-10 The Rockefeller University Neutralizing anti-sars- cov-2 antibodies and methods of use thereof
JP2024519029A (ja) 2021-05-17 2024-05-08 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド Ｐｄ－１遺伝子編集された腫瘍浸潤リンパ球及び免疫療法におけるその使用
EP4347656A1 (en) 2021-05-28 2024-04-10 GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited Combination therapies for treating cancer
US11572412B2 (en) 2021-06-04 2023-02-07 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-SIRP-alpha antibodies
WO2022271987A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 TeneoFour, Inc. Anti-cd38 antibodies and epitopes of same
CA3224001A1 (en) 2021-06-25 2022-12-29 Amgen Inc. Treatment of cardiovascular disease with trem-1 antigen binding proteins
KR20230004135A (ko) 2021-06-30 2023-01-06 한미약품 주식회사 글루카곤, glp-1 및 gip 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중 활성체를 포함하는 조합물의 치료학적 용도
EP4373270A2 (en) 2021-07-22 2024-05-29 Iovance Biotherapeutics, Inc. Method for cryopreservation of solid tumor fragments
WO2023004197A1 (en) 2021-07-23 2023-01-26 Teneoten, Inc. Heavy chain antibodies binding to hepatitis b surface antigen
EP4377446A1 (en) 2021-07-28 2024-06-05 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with kras inhibitors
IL310392A (en) 2021-08-03 2024-03-01 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Biopharmaceutical preparations and a peptide mapping method for stable isotope labeling
IL311333A (en) 2021-09-09 2024-05-01 Iovance Biotherapeutics Inc Processes for the production of TIL products using a strong PD-1 TALEN
WO2023049862A1 (en) 2021-09-24 2023-03-30 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion processes and agents for tumor infiltrating lymphocytes
WO2023057893A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination therapies for treating cancer
CA3234966A1 (en) 2021-10-14 2023-04-20 Teneobio, Inc. Mesothelin binding proteins and uses thereof
US20230187042A1 (en) 2021-10-27 2023-06-15 Iovance Biotherapeutics, Inc. Systems and methods for coordinating manufacturing of cells for patient-specific immunotherapy
WO2023086803A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expansion treatment utilizing cd8 tumor infiltrating lymphocytes
WO2023114951A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Viiv Healthcare Company Combination therapies for hiv infections and uses thereof
US20230257455A1 (en) 2021-12-22 2023-08-17 Cdr-Life Ag Anti-c3 antibodies and antigen-binding fragments thereof and their uses for treating eye or ocular diseases
WO2023147399A1 (en) 2022-01-27 2023-08-03 The Rockefeller University Broadly neutralizing anti-sars-cov-2 antibodies targeting the n-terminal domain of the spike protein and methods of use thereof
WO2023147488A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. Cytokine associated tumor infiltrating lymphocytes compositions and methods
WO2023147486A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. Tumor infiltrating lymphocytes engineered to express payloads
WO2023173084A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 University Of Rochester Cyclopeptibodies and uses thereof
WO2023196877A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
WO2023201369A1 (en) 2022-04-15 2023-10-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Til expansion processes using specific cytokine combinations and/or akti treatment
WO2023212304A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 23Andme, Inc. Antigen binding proteins
WO2023220608A1 (en) 2022-05-10 2023-11-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with an il-15r agonist
WO2024003376A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Alk-Abelló A/S Displacers of ige-fceri
WO2024011114A1 (en) 2022-07-06 2024-01-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Devices and processes for automated production of tumor infiltrating lymphocytes
WO2024020051A1 (en) 2022-07-19 2024-01-25 BioLegend, Inc. Anti-cd157 antibodies, antigen-binding fragments thereof and compositions and methods for making and using the same
WO2024026358A1 (en) 2022-07-27 2024-02-01 Teneobio, Inc. Mesothelin binding proteins and uses thereof
WO2024030758A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Iovance Biotherapeutics, Inc. Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
WO2024036139A2 (en) 2022-08-09 2024-02-15 Qlsf Biotherapeutics, Inc. Antibodies binding to clec12a
WO2024040114A2 (en) 2022-08-18 2024-02-22 BioLegend, Inc. Anti-axl antibodies, antigen-binding fragments thereof and methods for making and using the same
WO2024042112A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Antigen binding proteins and uses thereof
US20240101691A1 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Sanofi Biotechnology Humanized anti-il-1r3 antibody and methods of use
WO2024077044A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Amgen Inc. Combination therapies comprising t-cell redirecting therapies and agonistic anti-il-2r antibodies or fragments thereof
WO2024083945A1 (en) 2022-10-20 2024-04-25 Glaxosmithkline Intellectual Property (No.3) Limited Antigen binding proteins
WO2024089609A1 (en) 2022-10-25 2024-05-02 Ablynx N.V. Glycoengineered fc variant polypeptides with enhanced effector function
US20240166728A1 (en) 2022-11-02 2024-05-23 VIIV Healthcare UK (No.5) Limited Antigen binding proteins
WO2024098027A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods for tumor infiltrating lymphocyte (til) expansion related to cd39/cd103 selection
WO2024098024A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes from liquid tumors and therapeutic uses thereof
WO2024112711A2 (en) 2022-11-21 2024-05-30 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods for assessing proliferation potency of gene-edited t cells
WO2024112571A2 (en) 2022-11-21 2024-05-30 Iovance Biotherapeutics, Inc. Two-dimensional processes for the expansion of tumor infiltrating lymphocytes and therapies therefrom

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8607679D0 (en) * 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5489533A (en) * 1987-05-04 1996-02-06 Dana Farber Cancer Institute Isolated nucleic acid molecules encoding ICAM-2
US5284931A (en) * 1987-05-04 1994-02-08 Dana Farber Cancer Institute Intercellular adhesion molecules, and their binding ligands
AU4116793A (en) * 1992-04-24 1993-11-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
AU5098393A (en) * 1992-08-14 1994-03-15 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Recombinant toxin with increased half-life

Also Published As

Publication number Publication date
NO974739L (no) 1997-12-12
DE69637761D1 (de) 2009-01-08
AU721155B2 (en) 2000-06-22
CA2217871C (en) 2010-08-31
CA2217871A1 (en) 1996-10-17
JP4324610B2 (ja) 2009-09-02
RU2224764C2 (ru) 2004-02-27
JPH11504509A (ja) 1999-04-27
CN100390279C (zh) 2008-05-28
IL117850A0 (en) 1996-08-04
JP2007143552A (ja) 2007-06-14
CN1186517A (zh) 1998-07-01
US6096871A (en) 2000-08-01
EP0821732A1 (en) 1998-02-04
EP0821732B1 (en) 2008-11-26
RU2003131869A (ru) 2005-04-10
NZ306170A (en) 2001-06-29
ATE415474T1 (de) 2008-12-15
MX9707877A (es) 1997-11-29
AU5435996A (en) 1996-10-30
BR9604955A (pt) 1998-06-09
NO974739D0 (no) 1997-10-13
ES2317645T3 (es) 2009-04-16
ZA962489B (en) 1997-09-29
WO1996032478A1 (en) 1996-10-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5739277A (en) Altered polypeptides with increased half-life
US5747035A (en) Polypeptides with increased half-life for use in treating disorders involving the LFA-1 receptor
US6121022A (en) Altered polypeptides with increased half-life
NO326296B1 (no) Polypeptid-variant samt anvendelse og fremstilling derav, og nukleinsyre, replikerbar vektor og vertscelle.
US5869046A (en) Altered polypeptides with increased half-life
US6703018B2 (en) Method of treatment using humanized anti-CD11a antibodies
DK2279412T3 (en) PRESENT UNKNOWN COMPOSITIONS AND PROCEDURES FOR TREATING IMMUNRATED DISEASES
AU631481B2 (en) Cd4 specific recombinant antibody
DE69729209T2 (de) Humanisierte anti-koerper gegen cd11a
KR102483016B1 (ko) ＦｃＲｎ 항체 및 이의 사용 방법
JP2020018298A (ja) Ｃｌｄｎ１８．２及びｃｄ３に対する抗体コンストラクト
US20160237156A1 (en) Immunoglobulin fusion proteins and compositions thereof
NO316223B1 (no) Blanding omfattende et B7-bindende molekyl og et IL4-bindende molekyl, samtanvendelse derav
CA2246768A1 (en) Uses of gdnf and gdnf receptor
CN105936648A (zh) Cd28结合为单价的组合物及使用方法
US20220056133A1 (en) Monoclonal antibodies that bind specifically to human trbv9
JP4504200B2 (ja) 抗体（“１１ｃ７”）抗ｎｏｇｏａおよびその薬学的使用
TW202233687A (zh) 貓抗體恆定區中之突變
US20220363753A1 (en) Anti-tirc7 antigen binding proteins
US20040146507A1 (en) Antibody mutants
EP0946727B1 (en) Antibody mutants
US20030229207A1 (en) Modified antibody variable domains
CN117285628A (zh) 抗vista抗体及其应用
MXPA99004795A (en) HUMANIZED ANTI-CD11a ANTIBODIES

Legal Events

Date Code Title Description
MK1K Patent expired