CN111655716B - 基于il-15的与il-7和il-21的融合体 - Google Patents

基于il-15的与il-7和il-21的融合体 Download PDF

Info

Publication number
CN111655716B
CN111655716B CN201880070462.7A CN201880070462A CN111655716B CN 111655716 B CN111655716 B CN 111655716B CN 201880070462 A CN201880070462 A CN 201880070462A CN 111655716 B CN111655716 B CN 111655716B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
cell
fusion protein
txm
domain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201880070462.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111655716A (zh
Inventor
H·C·王
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Alte Biotechnology
Original Assignee
Alte Biotechnology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alte Biotechnology filed Critical Alte Biotechnology
Publication of CN111655716A publication Critical patent/CN111655716A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111655716B publication Critical patent/CN111655716B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5443—IL-15
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT, e.g. PRESERVATION, OF FLOUR OR DOUGH, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS; PRESERVATION THEREOF
    • A21D8/00—Methods for preparing or baking dough
    • A21D8/02—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking
    • A21D8/04—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes
    • A21D8/047—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes with yeasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2086—IL-13 to IL-16
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5418—IL-7
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01002—Beta-amylase (3.2.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01033—Amylo-alpha-1,6-glucosidase (3.2.1.33)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/0106—Glucan 1,4-alpha-maltotetraohydrolase (3.2.1.60)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明提出多特异性融合蛋白复合体，其具有一个包含IL‑15或功能变体的结构域以及一个IL‑7或IL‑21特异性的结合结构域。

Description

基于IL-15的与IL-7和IL-21的融合体
相关申请的交叉引用
本申请主张2017年8月28日提交的美国临时专利申请62/551,218的权益，该临时专利申请的整体内容通过引用而整体并入本文。
技术领域
本发明大致涉及多体融合分子。
背景技术
在本文所述的发明之前，亟需研发新的策略，该策略以疾病位点的各种效应子分子为靶向，从而提供治疗有益效果而没有与非特异性免疫活性有关的副作用。
发明内容
本发明至少部分地基于下述令人惊奇的发现：基于多特异性白介素-15(IL-15)的蛋白复合体增强免疫细胞的刺激并且促进它们对抗疾病细胞的活性，从而导致疾病的减轻或预防。这些基于IL-15的蛋白复合体也能结合到疾病抗原和靶点抗原。本文提供包含IL-7结合结构域和IL-21结合结构域的基于多特异性IL-15的蛋白复合体(图1)。具体地，本文描述包含融合到IL-7结合结构域和IL-21结合结构域的IL-15N72D:IL-15RαSu-Ig Fc支架的蛋白复合体。如下文所详述，当使用人类免疫细胞表征时，这些复合体表现出对IL-15细胞因子、IL-7细胞因子和IL-21细胞因子中每一个的结合和生物学活性。此外，这些复合体诱导T细胞和天然杀手(NK)细胞两者的增殖和激活，提升IFN-γ的产生。令人惊奇的是，这些复合体能将免疫应答诱导至比在单独使用独立细胞因子或组合使用细胞因子时所观察到的更高的程度。
这样，作为单个分子的复合体结合至NK和T细胞上的多种细胞因子受体并经由这些受体传导信号，以提供先前仅在使用多种细胞因子的组合时观察到的应答。此外，这些复合体包含Ig分子的Fc区，这可形成二聚体以提供可溶性多种多肽复合体，结合蛋白A以用于纯化目的并与NK细胞和巨噬细胞上的Fcγ受体相互作用，从而向该复合体提供在独立细胞因子的组合中不存在的优势。本文中描述了适用于临床级别材料的大规模生产的基于哺乳动物细胞表达的用于制备这些复合体的方法。也提供了其它用于制备和使用NK细胞和T细胞的方法，其中所述细胞在通过本发明的蛋白复合体诱导后增殖。
据此，提供一种单离的可溶性融合蛋白复合体，怄气包含至少两两种可溶性蛋白。例如，第一蛋白包含IL-15多肽，例如，包含N72D突变的变体IL-15多肽(IL-15N72D)。第二蛋白包含可溶性IL-15受体αsushi结合结构域(IL-15RαSu)，其融合至免疫球蛋白Fc结构域(IL-15RαSu/Fc)。所述单离的可溶性融合蛋白复合体的第三组分包含IL-7的结合结构域，其中所述IL-7结合结构域融合至IL-15N72D或所述IL-15RαSu/Fc蛋白。所述单离的可溶性融合蛋白复合体的第四组分包含IL-21的结合结构域，其中所述IL-21结合结构域融合至IL-15N72D或所述IL-15RαSu/Fc蛋白。一些情况下，所述IL-7和/或IL-21结合结构域融合至IL-15N72D和IL-15RαSu/Fc蛋白两者。其它情况下，IL-7结合结构域或IL-21结合结构域融合至IL-15N72D或IL-15RαSu/Fc蛋白，并且另一结合结构域融合至另一蛋白。示例性的融合蛋白复合体包含共价链接至IL-15N72D的IL-7多肽和共价链接至IL-15RαSu/Fc融合蛋白的IL-21多肽(图1)。
示例性的第一蛋白包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4中详述的氨基酸序列。示例性的编码所述第一蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3中详述的序列。一方面，所述核酸序列还包含启动子、翻译起始信号、以及可操作地链接至编码所述融合蛋白的序列的前导序列。还提供包含本文所述核酸序列的DNA载体。例如，所述核酸序列位于用于复制、表达或两者的载体中。
还提供一种可溶性融合蛋白复合体，其包含共价链接至第二第二性融合蛋白复合体的第一可溶性融合蛋白复合体。例如，本发明的可溶性融合蛋白复合体是多体的，例如，二体的、三体的、或者多体的(例如，4复合体、5复合体等)。例如，所述多体是同源多体或异源多体。所述可溶性融合蛋白复合体通过共价键例如二硫键、化学交联剂接合。一些情况下，一个可溶性融合蛋白通过将第一可溶性蛋白的Fc结构域链接至第二可溶性蛋白的Fc结构域的二硫键而共价链接至另一个可溶性融合单体。
所述Fc结构域或其功能性片段包括选自以下所组成组的Fc结构域：IgG Fc结构域、人类IgG1 Fc结构域、人类IgG2 Fc结构域、人类IgG3 Fc结构域、人类IgG4 Fc结构域、IgA Fc结构域、IgD Fc结构域、IgE Fc结构域、IgM Fc结构域、小鼠IgG2A结构域、或其组合。任选地，所述Fc结构域包括氨基酸变化，该变化导致Fc结构域具有改变的补体或Fc受体结合特性或改变的二聚或糖基化特性。产生具有改变的补体或Fc受体结合特性或改变的二聚或糖基化特性的Fc结构域的氨基酸改变是该领域中已知的。例如，将IgG1 Ch2的位置234和235处(基于抗体共有序列编号)(即，…P E L L G G…)的亮氨酸残基替换为丙氨酸残基(即，…P E A AG G…)造成Fcγ受体结合的丢失，而将IgG1 CH2的位置322处(基于抗体共有序列编号)(即，…K C K S L…)的赖氨酸残基替换为丙氨酸残基(即，…K C AS L…)导致补体激活的丢失。一些示例中，此类突变是组合的。
在一些方面，所述IL-7或IL-21结合结构域通过多肽链接剂序列共价链接至IL-15多肽(或其功能性片段)。同样，所述IL-7或IL-21结合结构域通过多肽链接剂序列共价链接至IL-15Rα多肽(或其功能性片段)。任选地，所述IL-15Rα多肽(或其功能性片段)通过多肽链接剂序列共价链接至所述Fc结构域(或其功能性片段)。每个多肽链接剂序列可独立地选择。任选地，所述多肽链接剂序列是相同的。另选地，它们是不同的。
任选地，本发明的可溶性融合蛋白复合体提供为，其中至少一个可溶性融合蛋白包含一个或多个结合结构域或可检测的标记。此类结合结构域可包含抗体、可溶性T细胞受体、胚胎、可溶性受体结构域或其功能性片段。包含此类结合结构域的基于IL-15的融合蛋白复合体以往已经在通过引用并入本文的美国专利8,492,118中有所描述。可检测的标记包括但不限于，生物素、链霉亲和素、酶或其催化活性片段、放射性同位素、顺磁性金属离子、荧光素、磷光素、化学放光分子、或它们的任意组合。
本发明提供制备本发明的可溶性融合蛋白复合体的方法。所述方法包括以下步骤：a)将具有编码所述第一蛋白的适宜控制序列的DNA载体引入第一宿主细胞内；b)在培养基中在足以在所述细胞或培养基内表达所述第一蛋白的条件下培养所述第一宿主细胞；c)从所述宿主细胞或培养基中纯化所述第一蛋白；d)将具有编码所述第二蛋白的适宜控制序列的DNA载体引入第二宿主细胞内；e)在培养基中在足以在所述细胞或培养基内表达所述第二蛋白的条件下培养所述第一宿主细胞；f)从所述宿主细胞或培养基中纯化所述第二蛋白；以及g)将所述第一蛋白和所述第二蛋白在足以允许第一蛋白的IL-15结构域与第二蛋白的可溶性IL-15Rα结构域之间结合的条件下混合，以形成所述可溶性融合蛋白复合体。
在一些情况下，所述方法还包括将所述第一蛋白和所述第二蛋白在足以允许在从所述表达载体表达的多肽之间形成二硫键的条件下混合。
另选地，制备本发明的可溶性融合蛋白复合体的方法通过以下进行：a)将具有编码所述第一蛋白的适宜控制序列的DNA载体和具有编码所述第二蛋白的适宜控制序列的DNA载体引入宿主细胞内；b)在培养基中在足以在所述细胞和培养基内表达所述蛋白并且允许将第一蛋白的IL-15结构域与第二蛋白的可溶性IL-15Rα结构域关联以形成所述可溶性融合蛋白复合体的条件下培养所述宿主细胞；以及c)从所述宿主细胞或培养基纯化所述可溶性融合蛋白复合体。
一方面，所述方法还包括将所述第一蛋白和所述第二蛋白在足以允许在从所述表达载体表达的多肽之间形成二硫键的条件下混合。
还提供制备可溶性融合蛋白复合体的方法，包括：a)将具有编码所述第一蛋白和所述第二蛋白的适宜控制序列的DNA载体引入宿主细胞内；b)在培养基中在足以在所述细胞和培养基内表达所述蛋白并且允许将第一蛋白的IL-15结构域与第二蛋白的可溶性IL-15Rα结构域关联以形成所述可溶性融合蛋白复合体以及足以允许在所述多肽之间形成二硫键的条件下培养所述宿主细胞；以及c)从所述宿主细胞或培养基纯化所述可溶性融合蛋白复合体。
任选地，所述方法还包括将所述第一蛋白和所述第二蛋白在足以允许在从所述表达载体表达的多肽之间形成二硫键的条件下混合。
在一些情况下，所述方法还包括通过以下方法纯化所述复合体：蛋白A亲和色谱、体积排阻色谱、离子交换色谱和/或足以生成足够纯的适用于作为临床试剂或治疗剂使用的蛋白复合体的其它方法(包括病毒灭活和/或过滤)。
在本发明的可溶性融合蛋白复合体的某些方面。所述IL-15多肽是具有不同于天然IL-15多肽的氨基酸序列的IL-15变体。本文中，称为huIL-15、hIL-15、huIL15、hIL15、IL-15野生型(WT)及其变体的人类IL-15多肽是指使用天然氨基酸、其在成熟序列中的位置和变体氨基酸。例如，huIL15N72D是指包含位于位置72处的N替换为D的人类IL-15。一方面，所述IL-15变体用作IL-15激动剂，如例如通过对于IL-15RβγC受体的结合活性相对于天然IL-15多肽增加而证明。另选地，所述IL-15变体用作IL-15拮抗剂，如例如通过对于IL-15RβγC受体的结合活性相对于天然IL-15多肽降低而证明。
增强免疫功能的方法通过以下进行：a)令多个细胞与本发明的可溶性融合蛋白复合体接触，其中所述多个细胞还包括荷有被IL-15结构域识别的IL-15R链、被IL-7结构域识别的IL-7R链或被IL-21结构域识别的IL-21R链的免疫细胞；以及b)经由所述IL-15R、IL-7R或IL-21R的信号传导来诱导所述免疫细胞的增殖和激活。一方面，增强免疫功能的方法还包括通过所述可溶性融合蛋白复合体经由IL-15R、IL-7R和IL-21R中至少两者或全部的组合的信号传导来激活所述免疫细胞。示例性的增强免疫功能的方法包括通过所述可溶性融合蛋白复合体经由IL-15R、IL-12R和IL-18R的信号传导来诱导NK细胞和T细胞的增殖和激活。此类方法包括增殖和激活NK细胞和T细胞，导致干扰素γ(IFN-γ)的产生增加。
杀死靶点细胞的方法通过以下进行：a)令多个细胞与本发明的可溶性融合蛋白复合体接触，其中所述多个细胞还包括荷有被IL-15结构域识别的IL-15R链、被IL-7结构域识别的IL-7R链或被IL-21结构域识别的IL-21R链的免疫细胞和所述靶点疾病细胞；b)经由所述IL-15R、IL-7R或IL-21R的信号传导来诱导所述免疫细胞的增殖和激活；以及c)通过所述激活的免疫细胞杀死所述靶点疾病细胞。一方面，所述方法还包括通过所述可溶性融合蛋白复合体经由IL-15R、IL-7R和IL-21R中至少两者或全部的组合的信号传导来诱导所述免疫细胞的增殖和激活。示例性的方法包括通过所述可溶性融合蛋白复合体经由IL-15R、IL-7R和IL-21R的信号传导来诱导NK细胞和T细胞的增殖和激活。此类方法包括增殖和激活NK细胞和T细胞，导致IFN-γ的产生增加。
本发明还提供预防或治疗患者疾病的方法，所述方法包括以下步骤：a)将荷有IL-15R链或检查点或信号传导分子的免疫细胞与本发明的可溶性融合蛋白复合体接触；b)诱导所述免疫细胞的增殖和激活；c)将所述激活的免疫细胞给药(或过继转移)至所述患者；以及d)经由足以预防或治疗所述患者的所述疾病的所述激活的免疫细胞损害或杀死所述疾病细胞。一方面，所述方法还包括通过所述可溶性融合蛋白复合体经由IL-15R、IL-7R和IL-21R中至少两者或全部的组合的信号传导来增殖和激活所述免疫细胞。示例性的方法包括通过所述可溶性融合蛋白复合体经由IL-15R、IL-7R和IL-21R的信号传导来诱导NK细胞和T细胞的增殖和激活。所述方面的一些方面包括使用表达前核抗原受体的NK细胞和T细胞(CAR NK细胞和CAR T细胞)。本发明的一些实施方案中，所述患者经预治疗或预调理以促进所述过继转移的细胞的移植或存活。预调理的示例包括使用环磷酰胺和氟达拉滨(fludarabine)进行治疗。此外，可使用促进过继转移的细胞在细胞移植之前和/或之后的激活、存活或持续存在的试剂治疗患者。此类治疗的示例包括使用IL-2、IL-15、ALT-803(本文中也可互换地称为“N-803”)或其它免疫刺激剂。过继细胞疗法领域中已知的其它治疗途径(即，包括但不限于，基于同种异体细胞、自体细胞、单倍同一性细胞、DLI、干细胞、NK92的疗法和CAR NK疗法)也可用于本文的方法中。
也提供预防或治疗患者疾病的方法，所述方法包括以下步骤：a)向所述患者给药本发明的可溶性融合蛋白复合体；b)诱导所述免疫细胞在所述患者体内的增殖和或；以及c)经由足以预防或治疗所述患者的所述疾病的所述激活的免疫细胞损害或杀死所述疾病细胞。
本发明的融合蛋白复合体的给药诱导了受试者的免疫应答。例如，本发明的融合蛋白复合体的给药诱导了对抗与瘤形成、感染病、衰老细胞或年龄性格疾病、或自身免疫疾病相关的细胞的免疫应答。一方面，本发明的融合蛋白复合体增加免疫细胞增殖、激活标记物、对靶点细胞的细胞毒性、和/或促炎性细胞因子的产生。
本发明提供通过向哺乳动物给药有效量的本发明的可溶性融合蛋白复合体而刺激所述哺乳动物的免疫应答的方法。本发明也提供通过向哺乳动物给药有效量的本发明的任意可溶性融合蛋白复合体而压制所述哺乳动物的免疫应答的方法。
通过向受试者给药有效量的扩展并激活的免疫细胞或包含本文所述可溶性融合蛋白复合体的药物组合物，实施治疗受试者的瘤形成、感染病、衰老细胞或年龄相关疾病、或自身免疫疾病的方法。例如，通过向受试者给药有效量的NK细胞和T细胞、和/或通过本发明的可溶性融合蛋白复合体间接体内扩展的CAR NK细胞和CAR T细胞，实施治疗受试者的实体或血液系统恶性肿瘤的方法，从而治疗所述恶性肿瘤。示例性的可溶性融合蛋白复合体包含SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:4中详述的氨基酸序列。
适用于用本文所述方法治疗的瘤形成包括成胶质细胞瘤、前列腺癌、急性髓性白血病、B细胞肿瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、皮肤T细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、实体肿瘤、尿路上皮/膀胱癌、黑素瘤、肺癌、肾细胞癌、乳腺癌、胃癌和食道癌、头颈癌、前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、和头颈部鳞状细胞癌。
使用本文所述方法治疗的示例性感染包括人类免疫缺陷病毒(HIV)感染或巨细胞病毒(CMV)感染。本文所述的方法也可用于治疗细菌(例如，革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌)感染(见，例如，Oleksiewicz etal.2012.Arch Biochem Biophys.526:124-31，通过引用并入本文)。
本发明的细胞疗法包括给药有效量的扩展并激活的免疫细胞。例如，扩展并激活的NK细胞或T细胞的有效量为介于1x 104个细胞/kg和1x 1010个细胞/kg之间，例如，1x104、1x 105、1x 106、1x 107、1x 108、1x 109和1x 1010个细胞/kg，或者可通过白细胞除去法单离的量。另选地，扩展的免疫细胞被以固定剂量给药或基于身体表面积(即，每m2)给药。细胞可在间接体内扩展后给药，或可低温保藏并在融化(按需要洗涤)后给药。
以有效量给药包含融合蛋白复合体的药物组合物。例如，医药组合物的有效量为介于约1μg/kg和100μg/kg之间，例如，1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μg/kg。另选地，TxM复合体被以固定剂量给药或基于身体表面积(即，每m2)给药。
过继转移的免疫细胞或包含融合蛋白复合体的药物组合物每月至少给药依次，例如，每月两次、每周一次、每周两次、每天一次、每天两次、每8小时一次、每4小时一次、每2小时一次、或每小时一次。适用于过继转移的免疫细胞的给药模式包括全身性给药、静脉给药或局部给药。适用于医药组合物的给药模式包括全身性给药、静脉给药、局部给药、皮下给药、肌肉给药、肿瘤内给药、吸入、和腹腔给药。
一方面，本公开提供包含至少两种可溶性蛋白的单离的可溶性融合蛋白复合体，其中第一可溶性安白包含白介素-15(IL-15)多肽结构域，并且第二可溶性安白包含融合至免疫球蛋白Fc结构域的可溶性IL-15受体αsushi结合结构域(IL-15RαSu)，其中所述第一或第二可溶性蛋白中的一者包含IL-7结合结构域或其功能性片段，其中殴第一或第二可溶性蛋白中的一者还包含IL-21结合结构域或其功能性片段，并且其中所述第一可溶性蛋白的所述IL-15结构域结合至所述第二可溶性蛋白的所述IL-15RαSu结构域以形成可溶性融合蛋白复合体。
一个实施方案中，所述IL-15多肽是包含N72D突变的IL-15变体(IL-15N72D)。
一个实施方案中，第一可溶性蛋白包含SEQ ID NO:2中详述的氨基酸序列。
一个实施方案中，第二可溶性蛋白包含SEQ ID NO:4中详述的氨基酸序列。
一个实施方案中，第一可溶性融合蛋白复合体可共价链接至第二可溶性融合蛋白复合体。
一个实施方案中，通过将所述第一可溶性融合蛋白复合体的所述Fc结构域链接至所述第二可溶性融合蛋白复合体的所述Fc结构域的二硫键，所述第一可溶性融合蛋白复合体共价地链接至所述第二可溶性融合蛋白复合体。
一个实施方案中，所述第一或第二可溶性蛋白还包含识别疾病抗原的结合结构域。
一个实施方案中，所述第一或第二可溶性蛋白还包含识别免疫检查点或信号传导分子的结合结构域。
一个实施方案中，所述疾病抗原与瘤形成、感染病、或衰老细胞或年龄相关疾病有关。
一个实施方案中，第一可溶性蛋白由SEQ ID NO:1中详述的核酸序列编码。
一个实施方案中，所述核酸序列还包含启动子、翻译起始信号、以及可操作地链接至编码所述可溶性蛋白的序列的前导序列。
一个实施方案中，第二可溶性蛋白可由SEQ ID NO:3中详述的核酸序列编码。
一个实施方案中，所述核酸序列还包含启动子、翻译起始信号、以及可操作地链接至编码所述可溶性蛋白的序列的前导序列。
一个实施方案中，DNA载体可包含以上枚举的核酸序列中的任一个。
一个实施方案中，提供了增强免疫功能的方法，所述方法包括：a)令多个细胞与上述任一可溶性融合蛋白复合体接触，其中所述多个细胞还包含荷有被IL-15结构域识别的IL-15R链、被IL-7结构域识别的IL-7R链和/或被IL-21结构域识别的IL-21R链的免疫细胞；以及b)经由所述IL-15R、IL-7R和/或IL-21R的信号传导来诱导所述免疫细胞的增殖和激活。
一方面，本公开提供杀死靶点细胞的方法，包括：a)令多个细胞与上述任一可溶性融合蛋白复合体接触，其中所述多个细胞还包括荷有被IL-15结构域识别的IL-15R链、被IL-7结构域识别的IL-7R链和/或被IL-21结构域识别的IL-21R链的免疫细胞和所述靶点疾病细胞；b)经由所述IL-15R、IL-7R和/或IL-21R的信号传导来诱导所述免疫细胞的增殖和激活；以及c)通过所述扩展并激活的免疫细胞杀死所述靶点疾病细胞。
一个实施方案中，所述靶点细胞是肿瘤细胞或受感染细胞。
一方面，本公开提供增强受试者免疫应答的方法，包括：a)令多个细胞与上述任一可溶性融合蛋白复合体接触，其中所述多个细胞还包括荷有被IL-15结构域识别的IL-15R链、被IL-7结构域识别的IL-7R链和/或被IL-21结构域识别的IL-21R链的免疫细胞；b)经由所述IL-15R、IL-7R和/或IL-21R的信号传导来诱导所述免疫细胞的增殖和激活；c)将所述扩展并激活的免疫细胞给药(或过继转移)至所述患者；以及d)增强所述患者的免疫应答。
一方面，本公开提供预防或治疗患者体内疾病的方法，包括：a)令多个细胞与本文中体现的可溶性融合蛋白复合体接触，其中所述多个细胞还包括荷有被IL-15结构域识别的IL-15R链、被IL-7结构域识别的IL-7R链和/或被IL-21结构域识别的IL-21R链的免疫细胞；b)经由所述IL-15R、IL-7R和/或IL-21R的信号传导来诱导所述免疫细胞的增殖和激活；c)将有效量的所述扩展并激活的免疫细胞给药(或过继转移)至所述患者；以及d)经由足以预防或治疗所述患者体内所述疾病的所述扩展并激活的免疫细胞损害或杀死所述疾病细胞。
一些实施方案中，刺激受试者体内免疫应答的方法包括：单离免疫细胞；令所述免疫细胞与本文体现的可溶性融合蛋白复合体接触；将所述免疫细胞回输到所述受试者体内；从而刺激受试者体内的免疫应答。某些实施方案中，所述免疫细胞包含自体免疫细胞、单倍同一性免疫细胞、单倍型匹配的免疫细胞、或其组合。某些实施方案中，所述免疫细胞源自自体干细胞或同种异体干细胞。某些实施方案中，所述免疫细胞包含NK细胞、T细胞、干细胞记忆T细胞、激活的NK(aNK)细胞、嵌合抗原受体-NK(CAR-NK)细胞、嵌合抗原受体-T(CAR-T)细胞、或其组合。某些实施方案中，任选地将一种或多种佐剂与本文中体现的可溶性融合蛋白复合体一起给药。
一个实施方案中，所述疾病是瘤形成、感染病、或衰老细胞或年龄相关疾病。
一方面，本公开提供一种增强受试者免疫应答的方法，包括向所述受试者给药有效量的上述任一可溶性融合蛋白复合体。
一方面，本公开提供一种治疗有此需要的受试者体内的瘤形成、感染病、或衰老细胞或年龄相关疾病的方法，包括向所述受试者给药有效量的包含上述任一可溶性融合蛋白复合体的药物组合物，从而治疗所述瘤形成、感染病、或衰老细胞或年龄相关疾病。
在其它方面，治疗患有瘤形成、感染病、或衰老细胞或年龄相关疾病的受试者的方法，包括a)令免疫细胞与上述任一可溶性融合蛋白复合体接触，以诱导所述免疫细胞增殖和激活；b)将有效量的所述激活的免疫细胞给药(或过继转移)至所述受试者；以及c)经由足以预防或治疗所述受试者体内所述疾病的所述激活的免疫细胞损害或杀死所述疾病细胞。
一个实施方案中，所述瘤形成选自以下组成的组：成胶质细胞瘤、前列腺癌、血液学癌症、B细胞肿瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、皮肤T细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、实体肿瘤、尿路上皮/膀胱癌、黑素瘤、肺癌、肾细胞癌、乳腺癌、胃癌和食道癌、前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、和头颈部鳞状细胞癌。
另一实施方案中，所述衰老细胞或年龄该相关疾病选自以下组成的组：代谢病(肥胖、糖尿病)；神经系统疾病(阿尔兹海默症和帕金森症)；肌肉、骨和软骨相关疾病(少肌症、骨关节炎、驼背、椎间盘突出)；或组织功能障碍相关疾病(肺气肿、心血管和肾病、以及动脉粥样硬化)。
一个实施方案中，所述免疫细胞是NK细胞或细胞因子诱导记忆样(CIML)NK细胞。
另一实施方案中，所述免疫细胞是T细胞或T记忆干细胞(TSCM)。
一个实施方案中，所述扩展并激活的免疫细胞的有效量为介于1x104个细胞/kg和1x 1010个细胞/kg之间。
一个实施方案中，所述免疫细胞每周给药至少一次。
一个实施方案中，所述有效量为介于约1和100μg/kg的所述融合蛋白复合体。
一个实施方案中，所述融合蛋白复合体每周给药至少一次。
一个实施方案中，本发明的融合蛋白复合体增加免疫细胞增殖、激活标记物、对靶点细胞的细胞毒性、和/或包括IFN-γ在内的促炎性细胞因子的产生。
优选地，所述融合蛋白复合体增加干扰素γ(IFN-γ)的血清水平，和/或刺激CD4+和CD8+T细胞和NK细胞以杀死受试者体内的患病细胞或肿瘤细胞。
定义
除非另做定义，否则本文使用的全部科技术语均具有本发明所属领域技术人员通常理解的意义。本文使用术语仅用于描述具体实施方案的目的，而不试图限制本发明。
下述参考文献向技术人员提供很多本发明所用术语的一般定义：《微生物学和分子生物学词典(第二版)》(Singleton et al.,Dictionary ofMicrobiology andMolecular Biology(2nd ed.1994))；《剑桥科技词典》(heCambridge Dictionary ofScience and Technology(Walker ed.,1988))；《遗传性专业词典(第五版)》(TheGlossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger et al.(eds.),Springer Verlag(1991))；以及《哈珀·柯林斯生物学词典》(Hale&Marham,The Harper Collins Dictionary ofBiology(1991))。如本文中所用，除非明确指定，否则下列术语具有其下方所述意义。
如本文中所用，除非上下文明确另外指明，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该”旨在也包括复数形式。再者，在具体实施方式和/或权利要求书中使用术语“包括”(including)、“包括”(includes)、“具有”(having)、“具有”(has)、“具有”(with)或其变体的范围内，此类术语旨在以类似于术语“包含”(comprising)的方式包括在内。
如本文所用，除非具体指定或从上下文明显可见，否则术语“一”或“该”理解为单数或复数.如说明书及所附权利要求书中所用，术语“或”通常一起包括“和/或”在内的意义使用，除非内容明确另做指明。
如本文所用，除非具体指定或从上下文明显可见，否则术语“约”理解为处于该领域正常公差范围内，例如处于平均值的2个标准偏差内。“约”可理解为处于所指定值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非上下文明确排除，否则本文提供的所有数值均以术语“约”修饰。
“试剂”意为肽、核酸分子或小化合物。
“ALT-803”或“N-803”意为一种复合体，其包含非共价地与二聚体IL-15RαSu/Fc融合蛋白关联的IL-15N72D并且具有免疫刺激活性。这一复合体也称为IL-15SA。一个实施方案中，IL-15N72D和/或IL-15RαSu/Fc融合蛋白包含一个、两个、三个、四个或更多个相对于参考序列的氨基酸变异。
“TxM”意为一种复合体，其包含链接至结合结构域的IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc支架(图1)。示例性的TxM是包含融合至IL-7和IL-21细胞因子的融合体的IL-15N72D:IL-15RαSu复合体。
“缓解”意为减少、压制、衰减、消除、阻止疾病的发展或进展或令疾病的发展或进展稳定化。
“类似物”意为不相同但具有类似的功能或结构特征的分子。例如，多肽类似物保留相对应的天然出现多肽的生物学活性，同时具有某些生物化学修饰，这些修饰将所述类似物的功能相对于天然出现的多肽增强。此类生物化学修饰可增加所述类似物的耐蛋白酶性、膜渗透性或半衰期，而不改变例如配体结合。类似物可包括非天然氨基酸。关于核苷的“类似物”包括具有修饰的碱基部分和/或修饰的糖部分的合成核苷，例如在《核苷酸类似物》(Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley,New York,1980)；Freier&Altmann,Nucl.Acid.Res.,1997,25(22),4429-4443；Toulmé,J.J.,Nature Biotechnology 19:17-18(2001)；Manoharan M.,Biochemica et Biophysica Acta 1489:117-139(1999)；FreierS.M.,Nucleic Acid Research,25:4429-4443(1997)；Uhlman,E.,Drug Discovery&Development,3:203-213(2000)；Herdewin P.,Antisense&Nucleic Acid Drug Dev.,10:297-310(2000))中大致描述的；2'-O,3`-C-链接[3.2.0]双环阿拉伯糖核苷(见，例如，N.KChristiensen.,et al.,J.Am.Chem.Soc.,120:5458-5463(1998))。这些类似物包括设计为增强结合特性例如双链或三链稳定性、特异性等的合成核苷。
本发明包括抗体或此类抗体的片段，只要它们表现出所希望的生物学活性即可。本发明还包括嵌合抗体，例如人源化抗体。通常，人源化抗体具有从非人类来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。例如，使用该领域中描述的方法，通过用啮齿动物互补决定区的至少一部分替换相对应的人类抗体区域，可实施人源化。
术语“抗体”或“免疫球蛋白”旨在涵盖多克隆抗体和单克隆抗体两者。优选的抗体是可与所述抗原反应的单克隆抗体。术语“抗体”也旨在涵盖超过一种可与抗原反应的抗体的混合物(例如，不同类型的可与抗原反应的抗体的鸡尾酒混合物)。术语“抗体”还旨在涵盖整个抗体、其生物学功能性片段、单链抗体、和基因上改变的抗体，例如包含来自超过一个物种的部分的嵌合抗体、双功能抗体、抗体接合物、人源化抗体和人类抗体。也可使用生物学功能性抗体片段，它们是衍生自抗体的足以结合抗原的肽片段。如本文所用，“抗体”意为包括完整的抗体以及任何能结合表位、抗原或感兴趣的抗原性片段的抗体片段(例如，F(ab')2、Fab'、Fab、Fv)。
如本文中所用，当对两个或更多个部分使用术语“与...相关”、“接合”、“链接”、“附接”和“系扎”时，该术语意为这些部分彼此或直接地(例如，共价键合)或经由一个或多个用作链接剂的额外部分在物理上相关或连接，以形成足够稳定的结构使得这些部分在该结构所述会用的条件如生理学条件下保持相关。一些实施方案中，足够数量的较弱相互作用可向这些部分提供足够的稳定性，以在各种不同条件下保持在物理上相关。
“结合至”分子意为具有对于该分子的物理化学亲和性。
术语“结合结构域”旨在涵盖抗体、单链抗体、Fab、Fv、T细胞受体结合结构域、配体结合结构域、受体结合结构域、或该领域中已知的其它抗原特异性多肽。
如本文中所用，术语“生物学活性部分”或“效应子分子”意为核酸序列如蛋白质、多肽或肽；糖或多糖；脂质或糖脂质、糖蛋白、或脂蛋白，其能产生如本文中探讨的所希望的效果。效应子分子也包括化学试剂。也考虑的效应子分子是编码生物学活性的或效应子蛋白、多肽或肽的核酸。因此，适合的分子包括调控因子、酶、抗体或药物以及DNA、RNA和寡核苷酸。生物学活性多肽或效应子分子可能是天然出现的，或者可通过例如重组或化学合成从已知组分合成并且包括异源组分。生物学活性多肽或效应子分子通常介于约0.1至100KD之间或更高达约1000KD，优选介于约0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30和50KD之间，如通过标准分子大小测量技术例如离心或SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳所判定的。本发明的所希望效果包括但不限于，例如，形成具有增加的结合活性的本发明的融合蛋白复合体，在疾病的治疗或预防中杀死靶点细胞以例如诱导细胞增殖或死亡、启动免疫应答，或者作为检测分子用于诊断目的。对于此类检测，可使用试验，例如，包括以下依序步骤的试验；培养细胞以令其增殖，将所述细胞与本发明的融合复合体接触，然后评估所述融合复合体是否移植所述细胞的进一步发育。
根据本发明将效应子分子共价链接至本发明的融合蛋白复合体提供了大量显著的优势。本发明的融合蛋白复合体可制造为含有单个效应子分子，包括肽或已知的结构。此外，可在类似的DNA载体中制造多种效应子分子。换句话说，可将不同效应子分子的库与所述融合蛋白复合体关联，用于识别受感染细胞或患病细胞。再者，对于治疗性应用，不是将本发明的融合蛋白复合体给药至受试者，而是给药编码所述融合蛋白复合体的DNA表达载体进行所述融合蛋白复合体的体内表达。此类途径避免了典型与重组蛋白制备相关的高成本的纯化步骤，并且避免了与传统途径相关的抗原摄入和处理的复杂性。
注意，本文所公开的融合蛋白的组分，例如效应子分子诸如细胞因子、趋化因子、生长因子、蛋白毒素、免疫球蛋白结构域或其它生物活性分子及任何肽链接基，几乎可以任何方式组织，前提条件是所述融合蛋白具有想要的功能。特别多，若需要，所述融合蛋白的每种组分可通过至少一个适合的肽链接基序列与另一组分分隔。此外，所述融合蛋白可包括标签，例如，以便于所述融合蛋白的修饰、鉴别和/或纯化。更多具体的融合蛋白在下文的实施例章节中描述。
如本文中所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指抗原结合结构域，其融合至能激活或刺激免疫细胞的分子内信号传导结构域，并且在某些实施方案中，CAR也包含跨膜结构域。在某些实施方案中，CAR的细胞外抗原结合结构域由通过将销售或人源化单克隆抗体的可变重区域轻区融合而衍生的单链可变片段(scFv)。另选地，可使用衍生自Fab(不是衍生自抗体，例如，从Fab库获得)的scFv。多种实施方案中，scFv被融合至跨膜结构域并随后融合至细胞外信号传导结构域。“第一代”CAR包括在抗原结合时仅提供CD3ζ信号的那些，“第二代”CAR包括提供共刺激(例如，CD28或CD137)和激活(CD3ζ)的那些。“第三代”CAR包括提供多种共刺激(例如，CD28和CD137)和激活(CD3ζ)的那些。已经描述了第四代CAR，被重新引导用于杀死细胞因子的CART细胞(TRUCKS)，其中含有所述CAR构造体的载体具备细胞因子匣。当CAR被结扎时，CAR T细胞将促炎性细胞因子沉积到肿瘤病灶内。CAR-T细胞是表达嵌合抗原受体的T细胞。CAR-NK细胞是表达嵌合抗原受体的NK细胞。嵌合抗原受体(CAR)具有与细胞内结构域偶联的抗原特异性细胞外结构域，引导细胞在抗原结合至所述细胞外结构域时实施特异性的功能。本文中，术语“人工T细胞受体”、“嵌合T细胞受体”和“嵌合免疫受体”各自可与术语“嵌合抗原受体”互换使用。嵌合抗原受体与其它抗原结合剂的区别之处在于，它们结合不依赖MHC的抗原的能力和经由它们的细胞内结构域转导激活信号的能力。
“检测”是指鉴定待检测分析物的存在、不存在或量。
“疾病”意为损害或干扰细胞、组织或器官正常功能的任何病症或病变。疾病的示例包括瘤形成、自身免疫疾病、病毒感染、以及衰老细胞和年龄相关疾病。
术语“有效量”和“治疗有效量”的制剂或制剂组分意为足以提供所希望效果的量的单独或组合使用的所述制剂或组分。例如，“有效量”意为相对于未治疗的患者缓解疾病症状所需的单独使用或联合使用的化合物的量。用来实践本发明的用于对疾病进行治疗性处理的活性化合物的有效量一句给药方式以及受试者的年龄、体重和一般健康状况而变。最终，主治医师或兽医将决定适宜的量和剂量方案。此量称为“有效”量。
“片段”意为多肽或核酸分子的一部分。这一部分优选含有该参考核酸分子或多肽整个长度的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。例如，片段可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000个核苷酸或氨基酸。但是，本发明也包含多肽和核酸片段，只要它们分别表现出所希望的圈长度多肽和核酸的生物学活性即可。采用几乎任何长度的核酸片段。例如，总长度为约10,000、约5,000、约3,000、约2,000、约1,000、约500、约200、约100、约50个碱基对(包括所有中间长度)的例示性说明的多核苷酸链段包括在本发明的多种具体实施中。同样，采用几乎任何长度的多肽片段。例如，总长度为约5,000、约3,000、约2,000、约1,000、约5,000、约1,000、约500、约200、约100、或约50个氨基酸(包括所有中间长度)的例示性说明的多肽链段包括在本发明的多种具体实施中。
如本文中所用，术语“免疫细胞”通常包括白血球(白细胞)，其源自在骨髓中产生的造血干细胞(HSC)。“免疫细胞”包括，例如，淋巴细胞(T细胞、B细胞、天然杀手(NK)细胞)和源自骨髓的细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞)。
如本文中所用，术语“免疫效应子细胞”是指牵涉入免疫应答例如免疫效应子应答的提升中的细胞。免疫细胞的示例包括T细胞例如α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、天然杀手(NK)细胞、天然杀手T(NK-T)细胞、肥大细胞、和源自骨髓的吞噬细胞。如本文中所用，术语“免疫效应子功能或免疫效应子应答”是指例如免疫效应子细胞的功能或应答，其增强或促进对靶点细胞的免疫攻击。例如，免疫效应子功能或应答是指T细胞或NK细胞的促进杀死靶点细胞或抑制靶点细胞生长或增殖的特性。在T细胞的情况下，主要刺激和共刺激是免疫效应子功能或应答的示例。
术语“单离的”、“纯化的”或“生物学纯的”是指在不同程度上不含通常伴随它的成分(如在其原生状态下所见)的材料。“单离”表示与原始来源或周围物质分隔的程度。“纯化”表示高于单离的分割程度。
“纯化的”或“生物学纯的”蛋白质足够不含其它材料，使得任何杂质在材料层面不影响该蛋白质的生物学性质或造成其它负面后果。换句话说，当通过重组DNA技术生产时，如果本发明的核酸或肽实质上不含细胞材料、病毒材料或培养基，则它是纯化的；或者当化学合成时，如果不含化学前体或其它化学物质，则它是纯化的。典型使用分析化学技术例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱测定纯度及同质性。术语“纯化的”可表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生实质上的一个带。对于可进行修饰例如磷酸化或糖基化的蛋白质，不同的修饰可产生不同的单离蛋白质，这些蛋白质可独立纯化。
同样，“实质上纯的”意为已经与其天然伴随组分分隔的核苷酸或多肽。典型地，当所述核苷酸或多肽以重量计至少60％、70％、80％、90％、95％或甚至99％不含与它们天然相关的蛋白质和天然出现有机分子时，它们是实质上纯的。
“单离的核酸”意为一种核酸，其不含在核酸所来源的有机体的天然基因组中位于其侧翼的基因。该术语覆盖，例如：(a)DNA，其是天然出现的基因组DNA分子的一部分，但其侧翼不具有在其天然出现的有机体基因组中位于该分子部分的侧翼上的两个核酸序列；(b)核酸，以某种方式并入载体内或原核细胞核或真核细胞的基因组DNA内，使得所得分子与任何天然出现的载体或基因组DNA不一致；(c)单离的分子，例如cDNA、基因组片段、通过聚合酶链反应(PCR)产生的片段、或限制性酶切片段；以及(d)重组核苷酸序列，其是杂交基因即编码融合蛋白的基因的一部分。根据本发明的单离的核酸分子还包括合成产生的分子、以及任何已经在化学上改变的和/或具有修饰骨架的核酸。例如，单离的核酸是纯化的cDNA或RNA多核苷酸。单离的核酸也包括信使核糖核酸(mRNA)分子。
“单离的多肽”意为已经与其天然伴随组分分隔的本发明的多肽。典型地，当多肽不含至少60重量％的天然与其相关的蛋白质和天然有机分子。优选地，该制剂是至少75重量％、更优选至少90重量％、且最优选至少99重量％的本发明的多肽。本发明的单离多肽可以例如通过从天然来源萃取、通过表达编码此多肽的重组核酸、或通过化学合成该蛋白质而获得。可通过任何适宜的方法，例如柱色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析，来测量纯度。
“标记物”意为在表达水平或活性上具有与疾病或病变相关的改变的任何蛋白质或多核苷酸。
“瘤形成“意为以过量的增殖或减少的细胞凋亡为特征的疾病或病变。可对其使用本发明的例示性瘤形成包括但不限于，白血病(例如，急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性骨髓单核细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多、淋巴瘤(何杰金氏病、非何杰金氏病)、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom'smacroglobulinemia)、重链病、和实体瘤诸如肉瘤和癌(例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜肉瘤、间皮瘤、尤文氏瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞癌、胚胎性癌、肾母细胞瘤(Wilm's tumor)、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、和成视网膜细胞瘤)。具体实施方案中，所述瘤形成是多发性骨髓瘤、β细胞淋巴瘤、尿路上皮/膀胱癌或黑素瘤。如本文所用，“获得试剂”中的“获得”包括合成、购买或其它获取该试剂的途径。
如本文所用，术语“核酸序列”、“多核苷酸”和“基因”贯穿本说明通篇可互换使用，并且包括互补DNA(cDNA)、天然和/或改性单体或链接的线性或环状寡聚物或聚合物，包括脱氧核糖核苷、核糖核苷及其α端基异构形式、肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)、硫逐磷酸酯、甲基磷酸酯等。多核苷酸包括但不限于，通过该领域中可利用的任何手段(包括而不限于，重组手段)获得的核酸序列，即，使用常规克隆技术和PCRTM等从重组库或细胞基因组获得的核酸序列克隆物，以及通过合成手段获得的核酸序列。
核酸序列可以是“嵌合的”，换句话说，由不同的区构成。本发明的语境中，“嵌合的”化合物为寡核苷酸，其含有两个或更多个化学取，例如，DNA区、RNA区、PNA区等。每个化学区由至少一个单体单元即核苷酸构成。这些序列典型包含至少一个区，其中所述序列被修饰以表现出一种或多种所希望的特性。
可用于本发明方法中的核酸分子包括任何编码本发明多肽或其片段的核酸分子。此类核酸分子无需与内源性核酸序列100％一致，但典型将表现出基本一致性。具有与内源性序列的“基本一致性”的多核苷酸典型能与双链核酸分子的至少一条链杂交。可用于本发明方法中的核酸分子包括任何编码本发明多肽或其片段的核酸分子。此类核酸分子无需与内源性核酸序列100％一致，但典型将表现出基本一致性。具有与内源性序列的“基本一致性”的多核苷酸典型能与双链核酸分子的至少一条链杂交。“杂交”意为在各种严格条件下在互补多核苷酸序列(例如，本文所述的基因)或其片段之间配对以形成双链分子。(见，例如，Wahl,G.M.and S.L.Berger(1987)Methods Enzymol.152:399；Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507)。
例如，严格的盐浓度一般将低于约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠，优选低于500mMNaCl和50mM柠檬酸三钠，且更优选约250mM NaCl和25mM柠檬酸三钠。在有机溶剂例如甲酰胺的缺席下可获得低严格度杂交，而在至少约35％甲酰胺且更优选至少约50％甲酰胺的存在下可获得高严格度杂交。严格的温度条件一般将包括至少约30℃、更优选至少约37℃且最优选至少约42℃的温度。不同的其它参数例如杂交时间、表面活性剂例如十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度、以及载剂DNA的包含或不包含是该领域技术人员所熟知的。通过按需要将这些条件组合，实现各种水平的严格度。一个优选实施方案中，杂交将在30℃下在750mMNaCl、75mM柠檬酸三钠和1％SDS中发生。一个更优选的实施方案中，杂交将在37℃下在500mM NaCl、50mM柠檬酸三钠、1％SDS、35％甲酰胺和100μg/ml变性鲑鱼精DNA(ssDNA)中发生。一个最优选的实施方案中，杂交将在42℃下在250mM NaCl、25mM柠檬酸三钠、1％SDS、50％甲酰胺和200μg/ml ssDNA中发生。这些条件的可用改变对于该领域技术人员是显而易见的。
对于大多数应用，杂交后的洗涤步骤也将改变严格度。洗涤严格度条件可通过盐浓度并且通过温度界定。如上，可通过减低盐浓度或升高温度来增加洗涤严格度。例如，用于洗涤步骤的严格的盐浓度优选将低于约30mM NaCl和3mM柠檬酸三钠，且最优选约15mMNaCl和1.5mM柠檬酸三钠。用于洗涤步骤的严格的温度条件一般将包括至少约25℃、更优选至少约42℃、甚至更优选至少约68℃的温度。一个优选实施方案中，洗涤步骤将在25℃下在30mM NaCl、3mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中发生。一个更优选的实施方案中，洗涤步骤将在42℃下在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中发生。一个更优选的实施方案中，洗涤步骤将在68℃下在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中发生。这些条件的其它改变对于该领域技术人员是显而易见的。杂交技术是该领域技术人员所熟知的，并且在例如Benton and Davis(Science 196:180,1977)；Grunstein and Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 72:3961,1975)；《分子生物学现代方法》(Ausubel et al.(Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience,New York,2001))；《分子克隆技术指南》(Berger and Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques,1987,Academic Press,New York))；和《分子克隆：实验室手册》(Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NewYork)中有所描述。
如本文中所用，“核苷”包括天然核苷，包括2'-脱氧形式和2'-羟基形式，例如，如《DNA复制(第二版)》(Kornberg and Baker,DNAReplication,2nd Ed.(Freeman,SanFrancisco,1992))中所述。
“衰老细胞相关疾病”或“年龄相关疾病”意为选自以下组成的组的疾病或病变：代谢病(肥胖、糖尿病)；神经系统疾病(阿尔兹海默症和帕金森症)；肌肉、骨和软骨相关疾病(少肌症、骨关节炎、驼背、椎间盘突出)；或组织功能障碍相关疾病(肺气肿、心血管和肾病、以及动脉粥样硬化)。
“降低”意为至少10％、25％、50％、75％或100％的反向改变.
“参考”意为标准或对照条件。
“参考序列”是用作序列比对基础的定义序列。参考序列可以是特定序列的子集或整体，例如，全长度cDNA或基因序列的节段，或完整的cDNA或基因序列。对于多肽，参考多肽序列的长度通常将会是至少约16个氨基酸，优选至少约20个氨基酸，更优选至少约25个氨基酸，甚至更优选约35个氨基酸、约50个氨基酸、或约100个氨基酸。对于核酸，参考核酸序列的长度通常将会是至少约50个核苷酸，优选至少约60个核苷酸，更优选至少约75个核苷酸，甚至更优选约100个核苷酸或约300个核苷酸或其附近或期间任意整数个核苷酸。
“特异性地结合”意为化合物或抗体识别并结合本发明的多肽，但实质上不识别并结合天然地包括本发明多肽的样品如生物学样品中的其它分子。
“实质上一致”意为多肽或核酸分子表现出至少50％的与参考氨基酸序列(例如，本文所述氨基酸序列中的任何一个)或核酸分子(例如，本文所述核酸序列中的任何一个)的一致性。优选地，此序列在氨基酸水平上或核酸水平上具有与用于比对的序列的至少60％、更优选80％或85％、且更优选90％、95％或甚至99％的一致性。
典型使用序列分析软件(例如，Sequencher,Gene Codes Corporation,775Technology Drive,Ann Arbor,MI；Vector NTI,Life Technologies,3175 StaleyRd.Grand Island,NY)测量序列一致性。此类软件通过对不同的替换、删除和/或其它修饰指定同源性程度来匹配相同或相似的序列。保守替换典型包括系列各组的组内替换：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。在测定一致性程度的一个示例性方法中，可使用BLAST程序，e-3和e-100之间的概率评分指示密切相关的序列。
“受试者”意为哺乳动物，包括但不限于，人类和非人类哺乳动物，例如牛、马、犬、羊或猫。所述受试者优选需要此治疗的哺乳动物，例如，已经被诊断患有B细胞淋巴瘤或具有这一倾向的受试者。所述哺乳动物是任何哺乳动物，例如，人类、灵长动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马、以及家畜或供食用的动物如牛、绵羊、猪、鸡和山羊。一个优选的实施方案中，所述哺乳动物是人类。
本文提供的范围理解为是该范围内所有值的简写。例如，1至50的范围理解为包括来自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50所组成组的任何数字、数字组合或子范围。
如本文中所用，术语“治疗”(treating)和“治疗”(treatment)是指将试剂或制剂给药至苦于负面病症、病变或疾病的有临床症状的个体，以产生降低症状严重性和/或频率、消除症状和/或其底层肇因、和/或促使对损害的改善或补救。应理解，尽管没有排除，但治疗病变或病症并不需要完全消除该病变、病症或与之相关的症状。治疗中使用的试剂或制剂可包含细胞或组织。
对患有瘤形成的患者的治疗可包括以下任一项：辅助疗法(也称为辅助性疗法或佐助疗法)，其摧毁可能在通过初始疗法(例如，外科手术)去除已知肿瘤后存在的残留肿瘤细胞，从而预防可能的癌症复发；新辅助疗法，在外科手术过程之前给出以收缩癌症；诱导疗法，造成缓解，典型用于急性白血病；巩固疗法(也称为强化疗法)，一旦实现缓解就给出该疗法以令缓解持续；维持疗法，以较低频次或较少剂量给出以帮助缓解的时间延长；第一线疗法(也称为标准疗法)；第二(或第三、第四等)线疗法(也称为挽救疗法)，在第一线治疗后疾病没有应答或疾病复发时给出；以及姑息疗法(也称为支持疗法)，可实现症状管理但不预期显著减轻癌症。
术语“预防”和“防止”是指将试剂或组合物给药至易患或易感染负面病症、病变或疾病的有临床症状的个体，并且因此涉及防止症状及/或其底层肇因的出现。
当用于多核苷酸序列的语境中时，术语“变体”可涵盖相对于野生型基因的多核苷酸序列。这一定义也可包括，例如，“等位基因”变体、“剪接”变体、“物种”变体或“多态”变体。剪接变体可具有显著的与参考分子的一致性，但通常将具有由于在mRNA处理过程中改变外显子剪接造成的更大或更小数量的多核苷酸。相对应的多肽可具备额外的功能性结构域或缺失结构域。物种变体是在物种间彼此不同的多核苷酸序列。本发明中尤其可用的是野生型靶点基因产物的变体。变体可以是核酸序列中至少一个突变的结果，并且可能造成变异的mRNA或其结构或功能可能改变或不改变的多肽。任何给定的天然或重组基因可能没有等位基因形式，或可具有一种或多种等位基因形式。给出变体的常见突变改变通常归因于核苷酸的天然删除、添加或替换。这些类型的改变可各自单独出现，或与其它改变组合，在给定序列中出现一次或多次。所得多肽通常将具有显著的相对于彼此的氨基酸一致性。多态变体是给定物种的个体之间特定基因的多核苷酸序列的变异。多态变体也可涵盖“单核苷酸多态性”(SNP)，或其中多核苷酸序列变动一个碱基的单碱基突变。SNP的存在可能是例如某些具有疾病状态倾向性的群体的指示，是敏感性与抵抗性的对比。
如本文中所用，多肽的“变体”是指其一个或多个氨基酸残基被改变的氨基酸序列。变体可具有“保守”变化，其中被替换的氨基酸具有类似的结构或化学特性(例如，将亮氨酸替换为异亮氨酸)。更罕见地，变体可具有“非保守”变化(例如，将甘氨酸替换为色氨酸)。类似的最小变异也可包括氨基酸删除或插入或两者。可使用该领域中周知的计算机软件例如LASERGENE软件(DNASTAR)找到确定那些氨基酸残基可被替换、插入或删除而不废止生物学活性的指引。
本文中的任何变量定义中对一系列化学基团的叙述包括该变量作为任何单一基团或所列基团的组合的定义。本文中对于变量或方面的实施方案的叙述包括该实施方案作为任何单一实施方案或与其它实施方案或其部分组合。
本文所提供的任何组合物或方法可与本文所提供的任何其它组合物和方法中的一者或多者合用。
连接词“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，是包含的或开放的，并且不排除另外的未引用的元件或方法步骤。相比之下，连接短语“由...组成”排除权利要求中未具体指明的任何元件、步骤或成分。连接短语“基本上由...组成”将权利要求的范畴限制为具体指明的材料或步骤“以及其它不在材料上影响所主张的发明的基本特征和新颖特征的那些”。
本文公开的任何基因、基因名称、基因产品或肽旨在对应于来自可应用本文所公开的组合物和方法的任何物种的同族体。因此，该术语包括但不限于来自人类和小鼠的基因和基因产品。应理解，当来自特定物种的基因或基因产品被公开时，这一公开旨在仅做示例，而不视为限制，除非上下文中明显指出。因此，例如，对于本文公开的基因，其在一些实施方案中涉及哺乳动物核酸序列和氨基酸序列，旨在涵盖来自其它动物的同源基因和/或直系同源基因，所述其它动物包括但不限于其它哺乳动物、鱼类、两栖动物、爬行动物和鸟类。在优选的实施方案中，基因、核酸序列或肽是人类的。
本文所引的以登录号指示的Genbank和NCBI提交文件通过引用并入本文。本文所引的全部其它已出版参考文献、文档、手稿和科学演讲通过引用并入本文。在相互矛盾的情况下，以包括定义在内的本说明书为准。此外，所述材料、方法和实施例仅做例示性说明而非试图限制。
从下述对其优选实施方案的描述以及从权利要求书可明了本发明的其它特征和优势。除非另做定义，否则本文使用的全部科技术语均具有本发明所属领域技术人员通常理解者相同的意义。尽管与本文所述类似或等效的方法和材料可用于实践或测试本发明，但适合的方法和材料描述如下。本文所引的全部公布的外国专利和专利申请通过引用并入本文。
附图说明
图1是示意图，例示性说明包含融合至IL-7和IL-21结合结构域的IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc支架的TxM融合蛋白复合体(IL7-IL15N72D:IL21-IL15RαSuFc)。在一些情况下，二聚体IL-15RαSu/Fc融合复合体包含一个或两个IL-15N72D融合蛋白。
图2A是曲线图，显示含hIL7/IL21/TxM蛋白的细胞培养物上清液在蛋白A树脂上结合并洗脱之后的色谱图。图2B是曲线图，显示将蛋白A纯化的hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体在制备型体积排阻色谱上洗脱之后的色谱图。图2C是曲线图，显示将蛋白A/SEC纯化的hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体在分析型体积排阻猪上洗脱之后的色谱图，表明单体的多蛋白hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体与蛋白聚集体单离。
图3A显示以下的照片：1)检测含有人类IgG Fc结构域的带的蛋白质印迹(左图)和2)在二硫键还原之后对hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体的考马斯亮蓝染色十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(4％至12％)电泳(SDS-PAGE)分析(右图)。图3B显示以下的照片：1)检测含有人类IL-15结构域的带的蛋白质印迹(左图)和2)在二硫键还原之后对hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体的考马斯亮蓝-十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(4％至12％)电泳(SDS-PAGE)分析(右图)。对于每种类型的分析，第1道为Novex Sharp蛋白质标样，第2道和第3道是纯化的hIL7/IL21/TxM Lot 20170714，并且第4道是ALT-803(IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc复合体)对照物。
图4显示对于二硫键还原之后的ALT-803(对照)(第2道和第3道)和hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体(第4道和第5道)的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析的照片。第3道和第5道的蛋白质样品已经使用蛋白质脱糖基化混合液II(New England BioLabs)根据制造商的说明书进行脱糖基化。第1道是Novex Sharp蛋白质标样，第2道是ALT-803，第3道是脱糖基的ALT-803，第4道是hIL7/IL21/TxM Lot 20170714，第5道是脱糖基的hIL7/IL21/TxM Lot20170714，并且第6道是脱糖基化反应缓冲液(含有脱糖基酶)。
图5是折线图，显示hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体与对于人类IL-15和人类IgG为特异性的抗体的结合活性。
图6是一系列折线图，说明hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体与对于人类IgG GAH)(上左)、IL15(上右)、IL7和IL15(下左)、IL21和IL15(下中)、以及IL7和IL21(下右)为特异性的抗体的结合活性。
图7是折线图，示例性说明由hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体介导的IL-15依赖性32Dβ细胞增殖与由ALT-803介导的IL-15依赖性32Dβ细胞增殖的比较。
图8A是柱状图，显示通过流式细胞术在小鼠2E8细胞中测量Stat5的磷酸化测得的以下物质的IL-7生物活性：hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体；重组IL-7、IL-21和ALT-803的组合(IL-7+IL-21+ALT-803)；以及单独使用的重组IL-7。数据表示平均荧光强度(MFI)倍变。图8B是直方图，显示通过流式细胞术在小鼠2E8细胞中测量Stat5的磷酸化测得的以下物质与培养基对照物相比的IL-7生物活性：hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体；重组IL-7、IL-21和ALT-803的组合(IL-7+IL-21+ALT-803)；以及单独使用的重组IL-7。图8C是柱状图，显示通过流式细胞术在纯化的人类T细胞中测量Stat3的磷酸化测得的以下物质的IL-7生物活性：hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体；重组IL-7、IL-21和ALT-803的组合(IL-21+IL-21+ALT-803)；以及单独使用的重组IL-21。数据表示MFI倍变。图8D是直方图，显示通过流式细胞术在纯化的人类T细胞中测量Stat3的磷酸化测得的以下物质与培养基对照物相比的IL-7生物活性：hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体；重组IL-7、IL-21和ALT-803的组合(IL-21+IL-21+ALT-803)；以及单独使用的重组IL-21。图8E是柱状图，显示通过流式细胞术在32Dβ细胞中测量Stat5的磷酸化测得的以下物质的IL-7生物活性：hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体；重组IL-7、IL-21和ALT-803的组合(IL-15+IL-21+ALT-803)；以及单独使用的ALT-803。数据表示MFI倍变。图8F是直方图，显示通过流式细胞术在32Dβ细胞中测量Stat5的磷酸化测得的以下物质与培养基对照物相比的IL-7生物活性：hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体；重组IL-7、IL-21和ALT-803的组合(IL-15+IL-21+ALT-803)；以及单独使用的ALY-803。
图9是柱状图，显示在使用hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体刺激后与在使用重组IL-7、IL-21和ALT-803的组合(IL-7+IL-21+ALT-803)刺激后的通过纯化的人类天然T细胞进行的IFN-γ产生的比较。通过ELISA测量IFN-γ产生。
图10A和10B是柱状图，显示在使用hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体或重组IL-7、IL-21和ALT-803的组合(IL-7+IL-21+ALT-803)刺激各种时间后，来自两个供体(供体A，图10A；供体B，图10B)的纯化的人类天然T细胞增殖与使用培养基对照物刺激的比较。使用PrestoBlue检验测量增殖。图10C是柱状图，显示在72小时的时间点，图10A和10B中所示数据的平均人类T细胞增殖。
图11是点阵图，显示在使用hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体或重组IL-7、IL-21和ALT-803的组合(IL-7+IL-21+ALT-803)刺激后，纯化的CSFE标记的人类T细胞增殖与使用培养基对照物刺激的比较。通过在细胞分裂后的CFSE信号稀释评估增殖。
图12是柱状图，显示在含有hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体的培养基中培养后，纯化的人类CD8+T细胞扩张与使用IL-7+IL-21+ALT-803、单独的ALT-803或对照培养基培养后的比较。使用hIL7/IL21/TxM培养导致比在使用IL-7+IL-21+ALT-803组合处理时观察到的更高的CD8+T细胞扩张。
图13是密度图，显示在含有hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体的培养基中培养后，纯化的人类CD8+T细胞增殖和表型与使用IL-7+IL-21+ALT-803、单独的ALT-803或对照培养基培养后的比较。使用hIL7/IL21/TxM培养导致尤其比在使用IL-7+IL-21+ALT-803组合处理时观察到的更多的CD8+T细胞增殖。
图14是柱状图，显示在含有hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体的培养基中培养后，纯化的人类CD8+T细胞子集扩张与使用对照培养基(US)、IL-7+IL-21、IL-7+ALT-803、IL-21+ALT-803或IL-7+IL-21+ALT-803培养后的比较。使用hIL7/IL21/TxM培养导致天然、中枢记忆、效应子记忆和记忆干CD8+T细胞扩张比使用培养基对照物培养的更多，并且中枢记忆和效应子记忆CD8+T细胞子集的扩张比任何其它个体细胞因子的组合更好。
图15是曲线图(流式细胞术直方图)，显示在含有hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体的培养基中培养后，纯化的人类CD8+T细胞子集增殖与使用对照培养基(US)、IL-7+IL-21、IL-7+ALT-803、IL-21+ALT-803或IL-7+IL-21+ALT-803培养后的比较。使用hIL7/IL21/TxM培养导致比使用培养基对照物培养更高的天然、中枢记忆、效应子记忆和记忆干CD8+T细胞子集增殖。使用hIL7/IL21/TxM，见到中枢记忆和效应子记忆CD8+T细胞子集增殖高于任何其它个体细胞因子的组合。
图16是折线图，示例性说明由hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体介导的纯化的人类NK细胞增殖与由ALT-803介导的IL-15依赖性32Dβ细胞增殖的比较。线表示从不同供体单离的NK细胞。
图17是密度图，显示在含有hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体的培养基中培养后，纯化的人类CD8+T细胞表型与使用IL-7+IL-21+ALT-803、单独的ALT-803或含有hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体的培养基培养后的比较。
图18是柱状图，显示在含有hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体的培养基中培养后，由纯化的人类CD8+T细胞介导的K562靶点细胞杀死水平与使用IL-7+IL-21+ALT-803、单独的ALT-803或含有hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体的培养基培养后的比较。
图19是柱状图，显示对抗通过hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体引入的胰腺肿瘤细胞靶点的人类NK细胞细胞毒性和NK介导的抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)，与ALT-803或对照培养基比较。显示了来自2个不同供体的NK细胞的数据。
图20是柱状图，显示有人类NK细胞响应hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体而释放的IFNγ水平，与ALT-803或对照培养基比较。显示了来自2个不同供体的NK细胞的数据。
图21是柱状图，显示有人类NK细胞响应hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体而表达的颗粒酶B水平，与ALT-803或对照培养基比较。显示了来自2个不同供体的NK细胞的数据。
图22显示一系列折线图，演示对hIL7/IL21/TxM中IL-15、IL-7和IL-21组分的捕获和检测。
图23A至23C是一系列折线图，显示hIL7/IL21/TxM诱导IL-7受体(图23A)、IL-21受体(图23B)和IL-15受体(图23C)的特异性激活。图23A：使用hIL7/IL21/TxM或IL-7刺激IL-7依赖性2E8细胞(105个)2天，并且使用PrestoBlue评估细胞增殖。IL-7在hIL7/IL21/TxM中的EC50是14pM。n＝4，来自2个实验中。图23B：用hIL7/IL21/TxM或N-803刺激被激活的天然杀手(aNK)细胞aNK细胞(2×105个)40小时，并且通过ELISA测量IFNγ的产生。n＝2，来自1个实验。图23C：使用hIL7/IL21/TxM或N-803刺激IL-2/15依赖性32D-IL2/15Rβ细胞(104个)3天，并且使用PrestoBlue评估细胞增殖。IL-15在hIL7/IL21/TxM中的EC50是530pM。n＝4，来自2个实验中。
图24是柱状图，演示由hIL7/IL21/TxM诱导的人类NK细胞中颗粒酶B表达的提升。预激活的人类NK细胞中的颗粒酶B表达(16h，50nM，n＝2)。
图25A、25B是柱状图，演示hIL7/IL21/TxM激活的人类NK细胞对抗SW1990胰腺癌细胞的细胞毒性和ADCC活性。将新鲜的NK细胞与SW1990细胞以2:1的E:T混合。αTF＝0.1nM。N-803或hIL7/IL21/TxM＝50。图25A：NK细胞细胞毒性。图25B：NK细胞细胞毒性相关的IFNγ。
图26是柱状图，演示hIL7/IL21/TxM激活的人类NK细胞对抗Ramos淋巴瘤细胞的细胞毒性和ADCC活性。将新鲜的NK细胞与Ramos细胞以1:1的E:T混合。αCD20＝1nM。N-803或hIL7/IL21/TxM＝0.5nM。显示n＝2。
图27是用来演示hIL7/IL21/TxM在扩张纯化的NK细胞方面比个体细胞因子杰出的方法的实施方案的示意图(左图)。所得结果显示为折线图(右图)。
图28是一系列柱状图，演示hIL7/IL21/TxM在扩张来自人类共同的NK细胞方面比个体细胞因子杰出。
图29A至29C是一系列折线图，比较hIL7/IL21/TxM与其它间接体内NK扩张方法。图29A：辐射的EBV淋巴母细胞饲养细胞+IL-2NK扩张。图29B：具有膜结合的IL-21(mbIL21)的基于K562的激活抗原呈递细胞(aAPCs)。图29C：hIL7/IL21/TxM介导的NK细胞扩张。
图30是一系列密度图，显示在hIL7/IL21/TxM扩张后的NK细胞表型。
图31A至31C是折线图，演示hIL7/IL21/TxM在NK细胞中诱导IFNγ(图31A)、颗粒酶(图31B)和穿孔素(图31C)。通过独立的细胞因子或TxM将hIL7/IL21/TxM扩张的NK细胞刺激过夜。
图32是折线图，演示hIL7/IL21/TxM扩张的NK细胞在第9天的直接细胞毒性和抗体介导的细胞毒性。使用20nM hIL7/IL21/TxM将纯化的人类NK细胞(0.5×106个/ml)扩张9天，洗涤一次，与CellTrace Violet标记的CD20+Ramos Burkitt淋巴瘤细胞(105个)混合4小时，然后在7-AAD可行性试剂的存在下进行流式细胞术分析。
图33描绘一系列柱状图，演示分选的T细胞群在hIL7/IL21/TxM处理后的扩张。用CFSE标记分选的CD8+天然、中枢记忆、效应子记忆和干细胞记忆T细胞，并且在96孔平底板中在37℃和5％CO2下以总体积200ml的单独的培养基(US)或IL-7/IL-21(25ng)、IL-7/N-803(25ng/144ng)、IL-21/N-803(25ng/144ng)、IL-7/IL-21/N-803(25ng/25ng/144ng)、TxM(1.4mg)刺激。
图34描绘一系列柱状图，演示在简短暴露于αCD3/CD28珠之后，hIL7/IL21/TxM有效地扩张了分选的CD8+T细胞群。
图35是h2*IL21/TxM(IL15N72D:IL21-IL15RαSuFc)的示意图。
图36A和36B是折线图，演示h2*IL21/TxM诱导IL-21受体(图36A)和IL-15受体(图36B)的特异性激活。图36A：用h2*IL21/TxM或N-803刺激aNK细胞(2×105个)40小时，并且通过ELISA测量IFNγ的产生。n＝2，来自1个实验。图36B：使用h2*IL21/TxM或N-803刺激IL-2/15依赖性32D-IL2/15Rβ细胞(104个)3天，并且使用PrestoBlue评估细胞增殖。IL-15在h2*IL21/TxM中的EC50是56pM。n＝4，来自2个实验中。
图37是h2*IL7(IL15)/TxM(IL7-IL15N72D:IL15RαSuFc)的示意图。
图38A至38C是折线图，演示h2*IL7(IL15)/TxM诱导IL-7受体(图38A)和IL-15受体(图38C)的特异性激活。图38A：使用h2*IL7(IL15)/TxM或IL-7刺激IL-7依赖性2E8细胞(105个)2天，并且使用PrestoBlue评估细胞增殖。IL-7在h2*IL7(IL15)/TxM中的EC50是13.3pM。n＝4，来自2个实验中。图38B：用h2*IL7(IL15)/TxM或N-803刺激aNK细胞(2×105个)40小时，并且通过ELISA测量IFNγ的产生。n＝2，来自1个实验。图38C：使用h2*IL7(IL15)/TxM或N-803刺激IL-2/15依赖性32D-IL2/15Rβ细胞(104个)3天，并且使用PrestoBlue评估细胞增殖。IL-15在h2*IL7(IL15)/TxM中的EC50是81.3pM。n＝4，来自2个实验中。
图39是显示hIL7/IL21/TxM与h2*IL21/TxM与h2*IL7(IL15)/TxM的结构比较的示意图。
图40显示在还原条件(左图)和非还原条件(右图)下在凝胶上跑出的hIL7/IL21/TxM与h2*IL21/TxM与h2*IL7(IL15)/TxM。
图41是折线图，演示使用hIL7/IL21/TxM、h2*IL21/TxM、h2*IL7(IL15)/TxM刺激的NK细胞扩张的比较。用19.4nMhIL7/IL21/TxM或h2*IL21/TxM或hIL7(IL15)/TxM刺激纯化的人类NK细胞，并且将细胞数维持在介于0.5×106个/ml至2×106个/ml之间。使用Vi-CELL XR评估细胞数。n＝2，来自1个实验。
图42是柱状图，显示在(hIL7IL15//IL21/TxM融合蛋白复合体)的存在下提升的抗原特异性CD8 T细胞应答。T细胞选自非粘附PBMC，随后用TCR刺激因子(CD2/3/28激动剂抗体，2天)培养，洗除TCR刺激因子，然后使用IL-7/15/21superkine培养。在T细胞扩张后，将T细胞加入源自PBMC的粘附部分的自体树突细胞(DC)中。也向T/DC培养物中加入：无；不表达pp65的BL21大肠杆菌(来自CMV)；或表达pp65的BL21。将培养物刺激过夜，随后进行ELISPOT显影，以指示形成斑点(产生IFN-γ)的细胞的数目。
具体实施方式
由于天然杀手(NK)细胞和T细胞的杀死患病细胞并释放促炎性细胞因子的能力，采用这些细胞的疗法已经作为用于癌症和病毒感染的潜在治疗而出现(见，例如，FehnigerTA and Cooper MA.Trends Immunol.2016；37:877-888；和Cerwenka A and LanierLL.Nat Rev Immunol.201616:112-23)。尤其感兴趣的是被基因工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的过继转移，从而引入肿瘤特异性免疫应答。先前已经描述了细胞因子对于CAR T细胞表型的效果。使用IL-2、IL-7和IL-15刺激，导致比使用其它细胞因子或没有细胞因子存在下更好的CAR T细胞的间接体内扩张。(Nayar S.,et al.,OncoImmunology,2014；4:e1002720；Golubovskaya V.and Wu,L.Cancers 2016；8:236；Sabatino M.etal.Blood.2016；128:519-528；Xu Y,et al.Blood.2014:123:3750-3759；和Gomez-EerlandR,et al.Hum Gene Ther Methods.2014；25:277-287)。
近期的临床数据提示，较低分化的T细胞尤其是记忆干T细胞(TSCM)的过继转移，可触深刻且持久的肿瘤根除(见，例如，Klebanoff CA et al.PNAS.2005；102(27):9571-9576；和Sommermeyer D,et al.Leukemia.2016:30(2):492-500)。由于循环中的TSCM细胞数较小，单离和产生更大数目的用于过继细胞疗法的临床级别TSCM细胞具有挑战性(见，例如Gattinoni L,et al.Blood.2013；121(4):567-568)。新的报导已经显示，TSCM细胞的生成和扩张可使用CD3/CD28共刺激以及在贯穿整个培养过程中加入IL-7、IL-21和IL-15而以间接体内方式实现(见，例如，Alvarez-Fernabdez C,et al.J Trans Med.2016；14；214；和Sabatino M et al.Blood.2016；128(4):519-528)。IL-7显示在增加CAR TSCM细胞的增殖方面最为有效，IL-21支持具有更加干细胞样表型的CAR T细胞的扩张，而IL-2诱导更高分化的CAR T细胞。经IL-2和IL-15处理的CAR T细胞产生更多的促炎性细胞因子，并且表现出增加的体外抗肿瘤活性。此外，在体内用IL-15和IL-21治疗CAR T细胞增加了它们的肿瘤细胞裂解能力。
四螺旋共同γ链细胞因子的成员IL-7、IL-15和IL-21，在天然杀手(NK)细胞的分化、发育、成熟、增殖和激活中是关键(Waldman T Nature Rev.Immunology 2006；6:595-601；Leonard W.J.and Wan C.-K.F1000Research 2016；5:244；Lin J.et al.AnticancerResearch 2017；37:936-968)。NK细胞的过继转移是有前景的对抗癌症和感染剂的免疫疗法。NK细胞疗法中的主要挑战是需要大量的高细胞毒性NK细胞。因此，研发了间接体内NK细胞扩张途径，并且这些培养方案中大部分是基于饲养细胞或佐细胞的使用的，需要在最终NK细胞产品的临床应用之前去除这些饲养细胞或佐细胞(Tong A.A.etal.OncoImmunology 2017；6:e1303586；Denman CJ PLos One 7:e30264；Fujisaki H.etal.Cancer Research 2009；69:4010-4017)。最近，探索了在不存在饲养细胞的条件下使用共同γ链细胞因子尤其是IL-15和IL-21进行扩张和激活的途径(Wagner J.et al.,Frontier in Immunology 2017；8:676)。
在本文所述的发明之前，用于生成和扩张TSCM细胞的优化方法没有完全阐明。采用重组IL-7、人类IL-21和人类IL-15的方案，与哺乳动物细胞产生的细胞因子相比，其不同之处在于糖基化和潜在的其它转录后修饰。重组细胞因子也可具有不同的纯度和稳定性，并且一般不能作为临床级别的材料而获取。此外，预期每种细胞因子具有独特的受体结合、内化和循环特性。
据此，本文描述包含IL-7结合结构域和IL-21结合结构域的基于多特异性IL-15的蛋白复合体(图1)。具体地，本文描述包含融合到IL-7结合结构域和IL-21结合结构域的IL-15N72D:IL-15RαSu-Ig Fc支架的蛋白复合体。当使用人类免疫细胞表征时，这些复合体表现出对IL-15细胞因子、IL-7细胞因子和IL-21细胞因子中每一个的结合和生物学活性。此外，这些复合体用来诱导T细胞的增殖和激活，增加TSCM细胞标记物，并且提升IFN-γ的产生。这些复合体也以间接体内方式扩张NK细胞，并且所扩张的NK细胞表现出增大的细胞毒性。因此，作为单个分子的复合体结合至T和NK细胞上的多种细胞因子受体并经由这些受体传导信号，以提供先前仅在使用多种细胞因子的组合时观察到的协同应答。此外，这些复合体包含Ig分子的Fc区，这可形成二聚体以提供可溶性多种多肽复合体，结合蛋白A以用于纯化目的并与NK细胞和巨噬细胞上的Fcγ受体相互作用进行传输，因此向该复合体提供在独立细胞因子的组合中不存在的优势。基于哺乳动物细胞表达的方法产生作为糖基化蛋白的这些复合体，其可能具有更好的活性和/或稳定性。这些方法也适用于产生如本文所述的临床级别材料。其它用于诱导NK和T细胞的增殖和激活并且生成由本发明的蛋白复合体诱导的TSCM细胞和CIML NK细胞的方法。
白介素-15
白介素-15(IL-15)是用于效应子NK细胞和CD8+记忆T细胞的发育、增殖和激活的重要细胞因子。IL-15结合到IL-15受体α(IL-15Rα)，并且被以与IL-2/IL-15受体β-共同γ链(IL-15Rβγc)复合体相反的方式呈递在效应子细胞上。IL-15和IL-2共用结合到IL-15Rβγc，并且通过STAT3和STAT5通道传导信号。然而，不同于IL-2，IL-15不支持CD4+CD25+FoxP3+调节T(Treg)细胞的维持，不诱导被激活的CD8+T细胞的死亡，这些效果可能限制了IL-2对抗多发性骨髓瘤的治疗活性。此外，IL-15是唯一的已知向效应子CD8+T细胞提供抗凋亡信号传导的细胞因子。IL-15，或单独给药或作为与IL-15Rα的复合体，在实验动物模型中表现出潜在的对抗已经确立的实体肿瘤的抗肿瘤活性，并且因此已经被鉴别为可能具有治愈癌症潜力的最具前景的免疫治疗药物之一。
为了促进基于IL-15的癌症疗法的临床研发，鉴别了生物学活性高于IL-15的IL-15突变体(IL-15N72D)(Zhu et al.,J Immunol,183:3598-3607,2009)。这一IL-15超激动剂(IL-15N72D)的药代动力学和生物学活性通过IL-15N72D:IL-15Rα/Fc融合复合体(ALT-803)的创建而得以进一步改善，使得该超激动剂的活性是体内的天然细胞因子的至少25倍(Han et al.,Cytokine,56:804-810,2011)。
IL-15:IL-15Rα复合体
如上所述，IL-15:IL-15Rα融合蛋白复合体可以是指具有IL-15非共价地结合到天然IL-15Rα的可溶性IL-15Rα结构域的复合体。在一些情况下，可溶性IL-15Rα共价地链接到生物学活性多肽和/或IgG Fc结构域。IL-15可以是IL-15，或者是共价地链接到第二个生物学活性多肽的IL-15。IL-15:IL-15Rα复合体的晶体结构显示在通过引用并入本文的Chirifu et al.,2007Nat Immunol 8,1001-1007中。
在本文所列发明的上述方面和任何其它方面的多个实施方案中，IL-15Rα融合蛋白包含可溶性IL-15Rα，例如共价地链接到生物学活性多肽(例如，IgG的重链恒定结构域、IgG的重链恒定结构域的Fc结构域、或细胞因子)的IL-15Rα。在上述方面的本发明的其它实施方案中，IL-15包含IL-15，例如，共价地链接到第二个生物学活性多肽例如细胞因子的IL-15。在其它实施方案中，从宿主细胞或培养基中纯化IL-15:IL-15Rα复合体牵涉将IL-15:IL-15Rα复合体捕获在特异性结合IL-15:IL-15Rα融合蛋白复合体的亲和试剂上。在其它实施方案中，IL-15Rα融合蛋白含有IL-15Rα/Fc融合蛋白，并且亲和试剂特异性地结合Fc结构域。在其它实施方案中，亲和试剂是蛋白A或蛋白G。在其它实施方案中，亲和试剂是抗体。在其它实施方案中，从宿主细胞或培养基纯化IL-15:IL-15Rα复合体包括离子交换色谱。在其它实施方案中，从宿主细胞或培养基纯化IL-15:IL-15Rα复合体包括体积排阻色谱。
在其它实施方案中，IL-15Rα包含IL-15RαSushi(IL-15RαSu)。在其它实施方案中，IL-15是变种IL-15(例如，IL-15N72D)。在其它实施方案中，IL-15:IL-15Rα复合体的IL-15结合位点被完全占据。在其它实施方案中，IL-15:IL-15RαSu/Fc复合体的两个IL-15结合位点被完全占据。在其它实施方案中，基于复合体的电荷或体积特性纯化IL-15:IL-15Rα复合体。在其它实施方案中，基于复合体的电荷特性，通过阴离子交换色谱纯化被完全占据的IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc融合蛋白复合体。在其它实施方案中，使用基于季胺的树脂，在采用低例子强度中兴pH缓冲剂的结合条件和采用递增离子强度的缓冲液的洗脱条件下，纯化被完全占据的IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc融合蛋白复合体。
在本发明的可溶性融合蛋白复合体的某些实施方案中，IL-15多肽是具有不同于天然IL-15多肽的氨基酸序列的IL-15变体。本文中，称为huIL-15、hIL-15、huIL15、hIL15、IL-15野生型(WT)及其变体的人类IL-15多肽是指使用天然氨基酸、其在成熟序列中的位置和变体氨基酸。例如，huIL15N72D是指包含位于位置72处的N替换为D的人类IL-15。在某些实施方案中，IL-15变体用作IL-15激动剂，如例如通过对于IL-15RβγC受体的结合活性相对于天然IL-15多肽增加而证明。在某些实施方案中，IL-15变体用作IL-15拮抗剂，如例如通过对于IL-15RβγC受体的结合活性相对于天然IL-15多肽降低而证明。在某些实施方案中，与天然IL-15多肽相比，IL-15变体具有增加的对于IL-15RβγC受体的结合亲和性或降低的对于IL-15RβγC受体的结合活性。在某些实施方案中，与天然IL-15序列相比，IL-15变体的序列具有至少一个(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)氨基酸变化。氨基酸变化可包括位于IL-15的与IL-15Rβ和/或IL-15RγC相互作用的结构域中的一个或多个氨基酸替换或删除。在某些实施方案中，氨基酸变化是位于成熟IL-15序列的位置8、61、65、72、92、101、108或111处的一个或多个氨基酸替换或删除。例如，氨基酸变化是位于成熟的人类IL-15序列中位置8处的D替换为N或A、位置61处的D替换为A、位置65处的N替换为A、位置72处的N替换为R以及位置108处的Q替换为A，或这些替换的任意组合。在某些实施方案中，氨基酸变化是位于成熟的人类IL-15序列的位置72处的N替换为D。
ALT-803(N-803)
ALT-803包含IL-15突变体，其结合IL-2Rβγ的能力增加并且生物学活性提升(通过引用并入本文的美国专利8,507,222)。IL-15的这一超激动剂突变体在出版物中有所描述(Zu et al.,2009J Immunol,183:3598-3607，通过引用并入本文)。这一IL-15超激动剂与可溶性IL-15α受体融合蛋白(IL-15RαSu/Fc)组合，导致在体外和体内具有高强的IL-15活性的蛋白复合体(Han et al.,2011,Cytokine,56:804-810；Xu,et al.,2013CancerRes.73:3075-86；Wong,et al.,2013,OncoImmunology 2:e26442)。该IL-15超激动剂复合体(IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc)称为“ALT-803”。
药代动力学分析指出，该复合体在静脉给药到小鼠体内后具有25小时的半衰期。ALT-803在免疫活性小鼠的侵袭性实体肿瘤和血液肿瘤模型中表现出引人瞩目的抗肿瘤活性。其可作为使用每周两次或每周一次静脉给药方案的单一疗法或作为与抗体的联合疗法给药。ALT-803抗肿瘤应答也是持久性的。在ALT-803治疗后被治愈的荷瘤小鼠对于相同肿瘤细胞的再攻击也具有高抵抗力，表明ALT-803诱导对抗再次引入的肿瘤细胞的有效免疫记忆应答。
IL-7
IL-7是适应性免疫细胞发育、生存和增殖所必不可少的细胞因子。尽管IL-7主要由骨髓和胸腺中的基质分泌，但其它免疫细胞如树突细胞(DC)也产生IL-7。IL-7受体是由以下两个链组成的异质二聚体：与胸腺基质淋巴生成素(TSLP)共有的IL-7Rα(CD127)，以及与IL-2、IL-4、IL-9、IL-15和IL-21共有的共同γ链(CD132)。γ链被表达在所有类型的造血细胞上，而IL-7Rα大部分表达在淋巴细胞上。IL-7Rα也见于先天淋巴细胞(ILC)如NK细胞和源自gut相关淋巴组织(GALT)的LTi细胞中，这些细胞对于淋巴器官发育和对病原体的先天免疫应答至关重要。IL-7也可通过控制LTi细胞池来调节淋巴器官发生。另一类型的IL-7受体是可溶性IL-7R，其与细胞相关的IL-7R竞争以减少IL-7R表达造成的IL-7过度消耗，并且在该细胞因子受到限制时提升IL-7的生物活性(Gao J et al.Int J Mol Sci.2015；16(10267-10280))。
两种主要的信号传导途径对IL-7的作用负责：Jak-Stat和PI3K-Akt。IL-7Rα与蛋白酪氨酸激酶Janus激酶1(Jak1)相关，并且γ链的胞质尾部与Jak3相关。IL-7与其受体结合，导致细胞溶质中Jak的激活，将Stat蛋白磷酸化。接着，二聚体磷酸化的Stat蛋白迁移到细胞核内并诱导基因表达。经由Jak3-Stat5途径，IL-7激活抗凋亡基因Bcl-2和Mcl-1，并且压制促凋亡蛋白如Bax和Bak，这进而导致天然T细胞和记忆T细胞生存。这一功能是剂量依赖性的，使得较高浓度的IL-7诱导胸腺移行性T细胞增殖，而较低浓度维持细胞生存。通过激活PI3K-Akt途径，IL-7下调细胞循环抑制剂p27kip1以诱导周期蛋白D1的表达，促进细胞循环的进展。此外，其促进葡萄糖转运蛋白1表达、葡萄糖摄取和线粒体完整性，以正向调节细胞代谢和大小(Gao J et al.Int J Mol Sci.2015；16(10267-10280)；和Jatiani SS etal.Genes Cancer.2010；1(10):979-993)。
IL-21
IL-21是多效性细胞因子，其具有促炎活性和抗炎活性，并且主要由被激活的CD4+和NK T细胞产生。它属于共同γ链细胞因子家族，并且牵涉到淋巴细胞激活、增殖、分化和生存中。IL-21通过由特异性IL-21R和共同γ链受体组成的异质二聚体受体信号传导发挥作用。IL-21通过Jak-Stat、PI3K和MAPK通道传导信号。IL-21诱导强烈且持续的Stat3激活，这对于T细胞分化至关重要(Ouyang W,et al.Immunity.2012；28(4)454-467)。
IL-21与IL-15和IL-7一起促进抗原特异性CD8+T细胞数和它们的效应子功能的扩张，导致肿瘤消退。也已经显示，IL-21通过引入早期分化表型在天然T细胞和中枢记忆T细胞的发育和生存中扮演重要角色。重要的是，使用IL-21生成的T细胞在实验模型中显示杰出的抗肿瘤效应。
也已经显示，在NK细胞的生成中，IL-21与IL-2、IL-15和Flt-3L协同作用。最近，报道了虽然IL-15在扩张NK细胞中发挥作用，但IL-21通过增加脱粒作用和炎性细胞因子的分泌诱导细胞毒活性(Wagner J et al.Front Immunol.2017；8:676)。
抗原特异性结合结构域
抗原特异性结合结构域由特异性地结合到患病细胞上的靶点的多肽组成。另选地，这些结构域可结合位于其它支持患病状态的细胞上的靶点，例如位于支持肿瘤生长的基质细胞上的靶点或位于支持疾病介导的免疫抑制的免疫细胞上的靶点。抗原特异性结合结构域包括抗体、单链抗体、Fabs、Fv、T细胞受体结合结构域、配体结合结构域、受体结合结构域、结构域抗体、单结构域抗体、微抗体、纳米抗体、肽抗体、或该领域中已知的各种其它抗体模拟物(例如，亲和体(affimers)、亲和素(affitins)、α抗体(alphabodies)、atrimers、基于CTLA4的分子、adnectins,anticalins、基于Kunitz结构域的蛋白质、高亲和性多聚体(avimers)、knottins、fynomers、重复蛋白(darpins)、亲和抗体(affibodies)、affilins、单体(monobodies)和基于犰狳(armadillo)重复蛋白的蛋白质(Weidle,UH,etal.2013.Cancer Genomics&Proteomics 10:155-168))。
某些实施方案中，用于抗原特异性结合结构域的抗原包含细胞表面受体或配体。进一步的实施方案中，抗原包含CD抗原、细胞因子或趋化因子受体或配体、生长因子受体或配体、组织因子、细胞粘附分子、MHC/MHC样分子、Fc受体、Toll样受体、NK受体、TCR、BCR、正/负共刺激受体或配体、死亡受体或配体、肿瘤相关抗原、或编码病毒的抗原。
优选地，抗原特异性结合结构域能接合到肿瘤细胞上的抗原。肿瘤特异性结合结构域可衍生自获批用于治疗癌症患者的抗体，包括利妥昔单抗(rituximab)、奥法木单抗(ofatumumab)和奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)(抗CD抗体)；曲妥珠单抗(trastuzumab)和帕妥珠单抗(pertuzumab)(抗HER2抗体)；西妥昔单抗(cetuximab)和帕尼单抗(panitumumab)(抗EGFR抗体)；以及阿仑单抗(alemtuzumab)(抗CD52抗体)。同样，可使用来自获批的对于CD20(90Y标记的替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、131I标记的托西莫单抗(tositumomab))、HER2(ado曲妥珠单抗(ado-trastuzumab emtansine))、CD30(本妥昔单抗(brentuximab vedotin))和CD33(吉妥单抗(gemtuzumab ozogamicin))为特异性的抗体效应子分子结合物的结合结构域(Sliwkowski MX、Mellman I.2013Science 341:1192)。
此外，本发明的优选结合结构域可包括该领域中已知的各种其它肿瘤特异性抗体结构域。用于治疗癌症的抗体和它们各自的靶点包括但不限于，纳武单抗(nivolumab)(抗PD-1Ab)、TA99(抗gp75)、3F8(抗GD2)、8H9(抗B7-H3)、阿巴伏单抗(abagovomab)(抗CA-125(仿制))、阿德木单抗(adecatumumab)(抗EpCAM)、阿夫土珠单抗(afutuzumab)(抗CD20)、PEG化的阿拉西马单抗(alacizumab pegol)(抗VEGFR2)、喷替酸阿妥莫单抗(altumomabpentetate)(抗CEA)、阿马昔单抗(amatuximab)(抗间皮素)、AME-133(抗CD20)、马安莫单抗(anatumomab mafenatox)(抗TAG-72)、阿泊珠单抗(apolizumab)(抗HLA-DR)、阿西莫单抗(arcitumomab)(抗CEA)、巴维昔单抗(bavituximab)(抗磷脂酰丝氨酸)、贝妥莫单抗(bectumomab)(抗CD22)、贝利单抗(belimumab)(抗BAFF)、贝索单抗(besilesomab)(抗CEA相关抗原)、贝伐单抗(bevacizumab)(抗VEGF-A)、莫比瓦妥单抗(bivatuzumabmertansine)(抗CD44 v6)、博纳吐单抗(blinatumomab)(抗CD19)、BMS-663513(抗CD137)、本妥昔单抗(brentuximab vedotin)(抗CD30(TNFRSF8))、莫坎妥珠单抗(cantuzumabmertansine)(抗粘蛋白CanAg)、拉坎妥珠单抗(cantuzumab ravtansine)(抗MUCl)、卡罗单抗喷地肽(capromab pendetide)(抗前列腺癌细胞)、卡鲁单抗(carlumab)(抗MCP-1)、卡妥索单抗(catumaxomab)(抗EpCAM、CD3)、cBR96-多柔比星免疫偶联物(doxorubicinimmunoconjugate)(抗Lewis-Y抗原)、CC49(抗TAG-72)、西利珠单抗(cedelizumab)(抗CD4)、Ch.14.18(抗GD2)、ch-TNT(抗DNA相关抗原)、西他土珠单抗(citatuzumab bogatox)(抗EpCAM)、西妥木单抗(cixutumumab)(抗IGF-1受体)、泰坦-克利妥珠单抗(ivatuzumabtetraxetan)(抗MUCl)、康妥单抗(conatumumab)(抗TRAIL-R2)、CP-870893(抗CD40)、达塞珠单抗(dacetuzumab)(抗CD40)、达利珠单抗(daclizumab)(抗CD25)、达妥珠单抗(dalotuzumab)(抗胰岛素样生长因子I受体)、达雷木单抗(daratumumab)(抗CD38(环状ADP核糖水解酶))、登西珠单抗(demcizumab)(抗DLL4)、地莫单抗(detumomab)(抗B-淋巴瘤cell)、屈西他单抗(drozitumab)(抗DR5)、杜利他单抗(duligotumab)(抗HER3)、杜昔单抗(dusigitumab)(抗ILGF2)、依美昔单抗(ecromeximab)(抗GD3神经节苷脂)、依决洛单抗(edrecolomab)(抗EpCAM)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)(抗SLAMF7)、依法利珠单抗(elsilimomab)(抗IL-6)、恩伐珠单抗(enavatuzumab)(抗TWEAK受体)、依诺替单抗(enoticumab)(抗DLL4)、恩司昔单抗(ensituximab)(抗5AC)、恩皮莫单抗(epitumomabcituxetan)(抗episialin)、依帕珠单抗(epratuzumab)(抗CD22)、厄马索单抗(ertumaxomab)(抗HER2/neu、CD3)、伊瑞西珠单抗(etaracizumab)(抗整联蛋白av～3)、法拉莫单抗(faralimomab)(抗干扰素受体)、法鲁珠单抗(farletuzumab)(抗叶酸受体1)、FBTA05(抗CD20)、非卡妥珠单抗(ficlatuzumab)(抗HGF)、菲妥木单抗(figitumumab)(抗IGF-1受体)、弗兰单抗(flanvotumab)(抗TYRPl(糖蛋白75))、弗瑞索单抗(fresolimumab)(抗TGF～)、富图希单抗(futuximab)(抗EGFR)、加利昔单抗(galiximab)(抗CD80)、盖尼塔单抗(ganitumab)(抗IGF-1)、吉妥单抗(gemtuzumab ozogamicin)(抗CD33)、吉瑞昔单抗(girentuximab)(抗碳酸酐酶9(CA-IX))、戈姆妥姆单抗(glembatumumab vedotin)(抗GPNMB)、古塞奇尤单抗(guselkumab)(抗IL13)、伊巴利珠单抗(ibalizumab)(抗CD4)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)(抗CD20)、伊库克单抗(icrucumab)(抗VEGFR-1)、伊戈伏单抗(igovomab)(抗CA-125)、IMAB362(抗CLDN18.2)、IMC-CS4(抗CSFlR)、IMC-TRl(TGF～RII)、尹戈妥珠单抗(imgatuzumab)(抗EGFR)、尹卡单抗(inclacumab)(抗选择素P)、尹达西单抗(indatuximab ravtansine)(抗SDCl)、奥英妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin)(抗CD22)、英妥木单抗(intetumumab)(抗CD51)、伊匹单抗(ipilimumab)(抗CD152)、伊妥木单抗(iratumumab)(抗CD30(TNFRSF8))、KM3065(抗CD20)、KW-0761(抗CD194)、LY2875358(抗MET)、拉贝珠单抗(labetuzumab)(抗CEA)、帕博利珠单抗(lambrolizumab)(抗PDCDl)、来沙木单抗(lexatumumab)(抗TRAIL-R2)、林妥珠单抗(lintuzumab)(抗CD33)、利丽单抗(lirilumab)(抗KIR2D)、美登素洛妥珠单抗(lorvotuzumabmertansine)(抗CD56)、鲁卡木单抗(lucatumumab)(抗CD40)、鲁米利昔单抗(lumiliximab)(抗CD23(IgE受体))、马帕木单抗(mapatumumab)(抗TRAIL-Rl)、马妥昔单抗(margetuximab)(抗ch4D5)、马妥珠单抗(matuzumab)(抗EGFR)、马夫利列单抗(mavrilimumab)(抗GMCSF受体a-chain)、米拉珠单抗(milatuzumab)(抗CD74)、明瑞莫单抗(minretumomab)(抗TAG-72)、米妥莫单抗(mitumomab)(抗GD3神经节苷脂)、莫格利珠单抗(mogamulizumab)(抗CCR4)、帕克莫单抗(moxetumomab pasudotox)(抗CD22)、他那可单抗(nacolomab tafenatox)(抗C242抗原)、他那莫单抗(naptumomab estafenatox)(抗5T4)、那那珠单抗(narnatumab)(抗RON)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)(抗EGFR)、耐斯瓦库单抗(nesvacumab)(抗血管生成素2)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)(抗EGFR)、纳武单抗(nivolumab)(抗IgG4)、巯诺莫单抗(nofetumomabmerpentan)、奥克珠单抗(ocrelizumab)(抗CD20)、奥卡妥珠单抗(ocaratuzumab)(抗CD20)、奥拉单抗(olaratumab)(抗PDGF-Ra)、奥纳妥珠单抗(onartuzumab)(抗c-MET)、昂妥昔单抗(ontuxizumab)(抗TEMl)、莫奥帕珠单抗(oportuzumab monatox)(抗EpCAM)、奥瑞格单抗(oregovomab)(抗CA-125)、奥乐珠单抗(otlertuzumab)(抗CD37)、潘扣单抗(pankomab)(抗MU Cl的肿瘤特异性糖基化)、帕萨珠单抗(parsatuzumab)(抗EGFL7)、帕考珠单抗(pascolizumab)(抗IL-4)、帕曲土单抗(patritumab)(抗HER3)、佩涂莫单抗(pemtumomab)(抗MUCl)、帕妥珠单抗(pertuzumab)(抗HER2/neu)、皮地丽珠单抗(pidilizumab)(抗PD-1)、匹那株单抗(pinatuzumab vedotin)(抗CD22)、频妥莫单抗(pintumomab)(抗腺癌抗原)、泊拉珠单抗(polatuzumab vedotin)(抗CD79B)、普托木单抗(pritumumab)(抗波形蛋白)、PRO131921(抗CD20)、奎丽珠单抗(quilizumab)(抗IGHE)、雷妥莫单抗(racotumomab)(抗N-羟乙酰神经氨酸)、雷德珠单抗(radretumab)(抗纤连蛋白外结构域-B)、雷莫芦单抗(ramucirumab)(抗VEGFR2)、利落木单抗(rilotumumab)(抗HGF)、罗妥木单抗(robatumumab)(抗IGF-1受体)、罗勒度单抗(roledumab)(抗RHD)、罗维珠单抗(rovelizumab)(抗CD11&CD18)、奥马珠单抗(samalizumab)(抗CD200)、沙妥莫单抗(satumomabpendetide)(抗TAG-72)、塞里班单抗(seribantumab)(抗ERBB3)、SGN-CD19A(抗CD19)、SGN-CD33A(抗CD33)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)(抗PAP)、司妥昔单抗(siltuximab)(抗IL-6)、索里妥单抗(solitomab)(抗EpCAM)、索土珠单抗(sontuzumab)(抗episialin)、塔巴芦单抗(tabalumab)(抗BAFF)、替珠单抗(tacatuzumab tetraxetan)(抗α-胎蛋白)、帕他莫单抗(taplitumomab paptox)(抗CD19)、阿替莫单抗(telimomabaritox、tenatumomab)(抗腱生蛋白C)、替奈昔单抗(teneliximab)(抗CD40)、泰罗妥单抗(teprotumumab)(抗CD221)、TGN1412(抗CD28)、替西木单抗(ticilimumab)(抗CTLA-4)、替加珠单抗(tigatuzumab)(抗TRAIL-R2)、TNX-650(抗IL-13)、托西莫单抗(tositumomab)(抗CS20)、托为妥单抗(tovetumab)(抗CD140a)、TRBS07(抗GD2)、曲丽珠单抗(tregalizumab)(抗CD4)、曲丽木单抗(tremelimumab)(抗CTLA-4)、TRU-016(抗CD37)、西莫白介素单抗(tucotuzumab celmoleukin)(抗EpCAM)、乌妥昔单抗(ublituximab)(抗CD20)、乌雷木单抗(urelumab)(抗4-1BB)、凡提妥单抗(vantictumab)(抗卷曲受体)、伐利昔单抗(vapaliximab)(抗AOC3(VAP-1))、伐丽珠单抗(vatelizumab)(抗ITGA2)、维妥珠单抗(veltuzumab)(抗CD20)、维森库单抗(vesencumab)(抗NRPl)、维丽珠单抗(visilizumab)(抗CD3)、伏洛昔单抗(volociximab)(抗整联蛋白α5β1)、沃托珠单抗(vorsetuzumabmafodotin)(抗CD70)、伏妥莫单抗(votumumab)(抗肿瘤抗原CTAA16.88)、扎鲁木单抗(zalutumumab)(抗EGFR)、扎木单抗(zanolimumab)(抗CD4)、扎妥昔单抗(zatuximab)(抗HER1)、齐拉木单抗(ziralimumab)(抗CD147(基础免疫球蛋白))、RG7636(抗ETBR)、RG7458(抗MUC16)、RG7599(抗NaPi2b)、MPDL3280A(抗PD-Ll)、RG7450(抗STEAPl)、和GDC-0199(抗Bcl-2)。
其它可用于本发明的抗体结构域或肿瘤靶点结合蛋白(例如，TCR结构域)包括但不限于结合一下抗原的那些(注意，所标出的癌症指标表示非限制性示例)：氨基肽酶N(Cd13)、膜联蛋白Al、B7-H3(CD276、多种癌症)、CA125(卵巢癌)、CA15-3(癌)、CA19-9(癌)、L6(癌)、LewisY(癌)、Lewis X(癌)、α-胎蛋白(癌)、CA242(结直肠癌)、胎盘碱性磷酸酶(癌)、前列腺特异性抗原(前列腺癌)、前列腺酸性磷酸酶(前列腺癌)、表皮生长因子(癌)、CD2(何杰金氏病、NHL淋巴瘤、多发性骨髓瘤)、CD3ε(T细胞淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、自身免疫疾病、恶性腹水)、CD19(B细胞恶性肿瘤)、CD20(非何杰金氏淋巴瘤、B细胞赘生物、自身免疫疾病)、CD21(B-cell淋巴瘤)、CD22(白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、SLE)、CD30(何杰金氏淋巴瘤)、CD33(白血病、自身免疫疾病)、CD38(多发性骨髓瘤)、CD40(淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病(CLL))、CD51(转移性黑素瘤、肉瘤)、CD52(白血病)、CD56(小细胞肺癌、卵巢癌、Merkel细胞癌、和液体肿瘤多发性骨髓瘤)、CD66e(癌)、CD70(转移性肾细胞癌和非何杰金氏淋巴瘤)、CD74(多发性骨髓瘤)、CD80(淋巴瘤)、CD98(癌)、CD123(白血病)、黏蛋白(癌)、CD221(实体肿瘤)、CD227(乳腺癌、卵巢癌)、CD262(NSCLC和其它癌症)、CD309(卵巢癌)、CD326(实体肿瘤)、CEACAM3(结直肠癌、胃癌)、CEACAM5(CEA、CD66e)(乳腺癌、结直肠癌和肺癌)、DLL4(A-like-4)、EGFR(多种癌症)、CTLA4(黑素瘤)、CXCR4(CD 184、血红素肿瘤、实体肿瘤)、内皮素(CD 105、实体肿瘤)、EPCAM(上皮细胞粘附分子，膀胱癌、头部癌症、颈部癌症、结肠癌、NHL前列腺癌、和卵巢癌)、ERBB2(肺癌、乳腺癌、前列腺癌)、FCGRl(自身免疫疾病)、FOLR(叶酸受体，卵巢癌)、FGFR(癌)、GD2神经节苷脂(癌)、G-28(细胞表面抗原糖脂质，黑素瘤)、GD3个体基因型(癌)、热休克蛋白(癌)、HERl(肺癌、胃癌)、HER2(乳腺癌、肺癌和卵巢癌)、HLA-DRlO(NHL)、HLA-DRB(NHL、B细胞白血病)、人类体绒毛膜促性腺素(癌)、IGF1R(实体肿瘤、血癌)、IL-2受体(T细胞白血病和淋巴瘤)、IL-6R(多发性骨髓瘤、RA、Castleman病、IL6依赖性肿瘤)、整联蛋白(ανβ3、αβ51、α6β4、α11β3、α5β5、ανβ5，用于多种癌症)、MAGE-1(癌)、MAGE-2(癌)、MAGE-3(癌)、MAGE 4(癌)、抗转铁蛋白受体(癌)、p97(黑素瘤)、MS4Al(4个跨膜结构域子族A成员1，非何杰金氏B细胞淋巴瘤、白血病)、MUC1(乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、支气管癌和胃肠癌)、MUC16(CA125)(卵巢癌)、CEA(结直肠癌)、gp100(黑素瘤)、MARTI(黑素瘤)、MPG(黑素瘤)、MS4Al(4个跨膜结构域子族A，小细胞肺癌、NHL)、核仁蛋白、Neu致癌基因产物(癌)、P21(癌)、粘连蛋白-4(癌)、抗(N-羟乙酰神经氨酸，乳腺癌、黑素瘤)的抗体结合部位、PLAP样睾丸碱性磷酸酶(卵巢癌、睾丸癌)、PSMA(前列腺肿瘤)、PSA(前列腺癌)、ROB04、TAG 72(与糖蛋白72相关的肿瘤、AML、胃癌、结直肠癌、卵巢癌)、T细胞跨膜蛋白(癌症)、Tie(CD202b)、组织因子、TNFRSF10B(肿瘤坏死因子受体超家族成员10B，癌)、TNFRSF13B(肿瘤坏死因子受体超家族成员13B，多发性骨髓瘤、NHL、其它癌症、RA和SLE)、TPBG(滋养层糖蛋白，肾细胞癌)、TRAIL-Rl(肿瘤坏死凋亡引导配体受体1，淋巴瘤、NHL、结直肠癌、肺癌)、VCAM-1(CD106、黑素瘤)、VEGF、VEGF-A、VEGF-2(CD309)(多种癌症)。已经回顾了一些其它的肿瘤相关抗原靶点(Gerber,et al,mAbs 2009 1:247-253；Novellino etal,Cancer Immunol Immunother.2005 54:187-207；Franke,et al,Cancer BiotherRadiopharm.2000,15:459-76；Guo,et al.,Adv Cancer Res.2013；119:421-475；Parmianiet al.J Immunol.2007 178:1975-9)。这些抗原的示例包括分化抗原簇(CD4、CDS、CD6、CD7、CDS、CD9、CDlO、CDI la、CDI lb、CDI le、CD12w、CD14、CD15、CD16、CDwl7、CD18、CD21、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD31、CD32、CD34、CD35、CD36、CD37、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49b、CD49c、CD53、CD54、CD55、CD58、CD59、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD68、CD69、CD71、CD72、CD79、CD81、CD82、CD83、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD95、CD96、CD100、CD103、CD105、CD106、CD109、CD117、CD120、CD127、CD133、CD134、CD135、CD138、CD141、CD142、CD143、CD144、CD147、CD151、CD152、CD154、CD156、CD158、CD163,CD166、.CD168、CD184、CDwl86、CD195、CD202(a、b)、CD209、CD235a、CD271、CD303、CD304)、膜联蛋白Al、核仁蛋白、内皮素(CD105)、ROB04、氨基肽酶N样-4(DLL4)、VEGFR-2(CD309)、CXCR4(CD184)、Tie2、B7-H3、WT1、MUC1、LMP2、HPV E6 E7、EGFRvlll、HER-2/neu、个体基因型、MAGE A3、p53非突变体、NY-ESO-1、GD2、CEA、MelanA/MARTl、Ras突变体、gp100、p53突变体、蛋白酶3(PR1)、bcr-abl、酪氨酸酶、生存苏、hTERT、肉瘤易位断点、EphA2、PAP、ML-IAP、AFP、EpCAM、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、ALK、雄激素受体、细胞周期素B1、多唾液酸、MYCN、RhoC、TRP-2、GD3、岩藻糖基GMI、间皮素、PSCA、MAGE Al、sLe(a)、CYPIB I、PLACI、GM3、BORIS、Tn、GloboH、ETV6-AML、NY-BR-1、RGS5、SART3、STn、碳酸酐酶IX、PAX5、OY-TES1、精子蛋白17、LCK、HMWMAA、AKAP-4、SSX2、XAGE 1、B7H3、豆球蛋白、Tie 2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-1、FAP、PDGFR-β、MAD-CT-2、和Fas相关抗原1。
此外，本发明的优选结合结构域包括对于该领域中已知的与受感染细胞相关的抗原和表位靶点为特异性的那些。此类靶点包括但不限于衍生自下列感兴趣的感染剂的那些：HIV病毒(尤其是衍生自HIV包络峰和/或gp120和gp41表位的抗原)、人类乳头状瘤病毒(HPV)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、肺炎球菌(Pneumococcus)、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)、乙型流感病毒、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、莱姆(Lyme)病螺旋体、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、狂犬病病毒、流感病毒、巨细胞病毒、I型单纯疱疹病毒、II型单纯疱疹病毒、人类血清细小病毒、呼吸道合胞体病毒、水痘带状疱疹病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、麻疹病毒、腺病毒、人类T细胞白血病病毒、EB病毒、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、水疱性口炎病毒、辛德毕斯病毒(sindbisvirus)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、疣病毒、蓝舌病毒、仙台病毒、猫白血病病毒、逆转录病毒、脊髓灰质炎病毒、元猴病毒40、鼠乳腺肿瘤病毒、登革病毒、风疹病毒、西尼罗病毒、镰状疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、蓝氏锥虫(Trypanosoma rangeli)、克氏锥虫(Trypanosomacruzi)、罗得西亚锥虫(Trypanosoma rhodesiensei)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、曼氏裂体吸虫(Schistosoma mansoni)、日本裂体吸虫(Schistosomajaponicum)、牛巴贝斯原虫(Babesia bovis)、柔嫩艾美尔球虫(Elmeria tenella)、旋盘尾丝虫(Onchocercavolvulus)、热带利什曼原虫(Leishmania tropica)、旋毛虫(Trichinella spiralis)、小泰勒虫(Theileria parva)、胞状绦虫(Taenia hydatigena)、羊绦虫(Taenia ovis)、牛肉绦虫(Taenia saginata)、细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)、科氏中殖孔绦虫(Mesocestoides corti)、关节炎支原体(Mycoplasma arthritidis)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)、口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体(M arginini)、莱氏衣原体(Acholeplasma laidlawii)、唾液支原体(M.salivarium)和肺炎支原体(M.pneumoniae)。
免疫检查点抑制剂和免疫激动剂结构域
在其它实施方案中，结合结构域对于免疫检查点或信号传导分子或其配体是特异性的，并且作为免疫检查点压制活性的抑制剂或作为免疫刺激活性的激动剂而发挥作用。此类免疫检查点及信号传导分子和配体包括PD-1、PD-L1 PD-L2、CTLA-4、CD28、CD80、CD86、B7-H3、B7-H4、B7-H5、ICOS-L、ICOS、BTLA、CD137L、CD137、HVEM、KIR、4-1BB、OX40L、CD70、
CD27、CD47、CIS、OX40、GITR、IDO、TIM3、GAL9、VISTA、CD155、TIGIT、LIGHT、LAIR-1、Siglecs和A2aR(Pardall DM.2012.Nature Rev Cancer 12:252-264；Thaventhiran T,etal.2012.J Clin Cell Immunol S12:004)。此外，本发明的优选抗体结构域可包括伊匹单抗(ipilimumab)和/或曲丽木单抗(tremelimumab)(抗CTLA4)、纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、皮地丽珠单抗(pidilizumab)、TSR-042、ANB0ll、AMP-514和AMP-224(配体-Fe融合体)(抗PDl)、阿特珠单抗(atezolizumab)(MPDL3280A)、阿维单抗(avelumab)(MSB0010718C)、德瓦鲁单抗(durvalumab)(MEDI4736)、MEDI0680和BMS-9365569(抗PDLl)、MEDI6469(抗OX40激动剂),BMS-986016、IMP701、IMP731、IMP321(抗LAG3)和GITR配体。
T细胞受体(TCR)
T细胞是与其它免疫细胞类型(多形核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、B细胞、NK细胞)一起构成免疫系统细胞成分的细胞亚群。在生理条件下，T细胞具有免疫监督和外来抗原消除的功能。然而，有令人信服的证据表明，在病理状态下，T细胞在疾病的肇因和传播中扮演主要角色。在这些病变中，中枢或外周T细胞免疫耐受性的破坏是导致自身免疫疾病的基本过程。
TCR复合体由至少七个跨膜蛋白构成。二硫键链接(αβ或γδ)的异质二聚体形成单型抗原识别单元，而由ε链、γ链、δ链、ζ链和η链组成的CD3的不变链是配体偶联结合至信号传导途径的原因，而该偶联结合导致T细胞激活以及细胞免疫应答的细化。尽管TCR链具有基因多样性，但两个结构特征是全部已知亚基所共用的。首先，它们是具有单个跨膜结构域(可能是α螺旋)的跨膜蛋白。其次，全部TCR链均具有在预测的跨膜结构域内具备带电氨基酸的不寻常特征。不变链具有单个负电荷，在小鼠与人类之间保守，并且具有具备一个(TCR-β)或两个(TCR-α)正电荷的可变链。TCR-α的跨膜序列在大量物种中是保守的，并且因此可能在系统发育上扮演重要的功能性角色。在物种之间，含有亲水性氨基酸精氨酸和赖氨酸的八肽序列是一致的。
细胞应答通过抗原结合到TCRT而得以调节。一种类型的TCR是由α链和β链组成的膜结合异质二聚体，重新组装免疫球蛋白可变区(V)和恒定区(C)。TCRα链包括共价链接的V-α链和C-α链，而β链包括共价链接到C-β链的V-β链。在主要组织相容性复合体(MHC)(在人类体内称为HLA复合体)的情况下，V-α链和V-β链形成袋或裂，所述袋或裂可结合超抗原或抗原。见，Davis Ann.Rev.of Immunology 3:537(1985)；Fundamental Immunology 3rdEd.,W.Paul Ed.Rsen Press LTD.New York(1993)。
TCR链(αβ或γδ)的细胞外结构域也可经工程化为与异源跨膜结构域的融合体，以便表达在细胞表面上。此类TCR可包括与CD3、CD28、CD8、4-1BB和/或嵌合激活受体(CAR)跨膜结构域或激活结构域的融合体。TCR也可能是包含αβ链或γδ链的一个或多个抗原结合结构域的可溶性蛋白。此类TCR可包括TCR可变结构域或其具有或不具有TCR恒定结构域的功能片段。可溶性TCR可以是异质二聚体分子或单链分子。
Fc结构域
本发明的蛋白复合体可含有Fc结构域。例如，hIL7/IL21/TxM包含IL-7/IL-15N72D:IL-21/IL-15RαSu/huIgG1 Fc融合复合体。已经报道了将IgG的Fc结构域与另一蛋白例如细胞因子和可溶性受体的结构域组合的融合蛋白(见，例如，Capon et al.,Nature,337:525-531,1989；Chamow et al.,Trends Biotechnol.,14:52-60,1996)；美国专利5,116,964和5,541,087)。原型融合蛋白是同质二聚体蛋白，通过位于IgG Fc的铰链区中的半胱氨酸残基链接，导致不具重链可变CHl结构域和轻链的与IgG分子类似的分子。包含Fc结构域的融合蛋白的二聚体天性在提供与其它分子的高阶相互作用中可能更具优势(即，二价或双特异性结合)。由于结构同源性，Fc融合蛋白表现出与具有类似亚型的人类IgG相当的体内药代动力学类型。IgG类的免疫球蛋白是人类血液中丰度最高的蛋白之一，并且它们的循环半衰期可长达21天。为了延长IL-15或IL-15融合蛋白的循环半衰期和/或为了增加其生物学活性，本文描述了含有IL-15结构域非共价地链接到共价链接到人类重链EgG蛋白的Fc部分的IL-15Rα的融合蛋白复合体。
术语“Fc”是指片段可结晶区，其是抗体的恒定区，与被称为Fc受体的细胞表面受体和补体系统的一些蛋白质相互作用。此类“Fc”是二聚体形式。天然Fc的原始免疫球蛋白来源优选来自人类，并且可以是任何免疫球蛋白，但优选IgG1和IgG2。天然Fc由单体性多肽构成，该单体性多肽可通过共价(即，二硫键)和非共价关联而链接为二聚体或三聚体形式。天然Fc分子的单体性亚基间的分子间二硫键的数目在1至4范围内，取决于类别(例如，IgG、IgA、IgE)或子类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、IgGA2)。天然Fc的一个示例是由IgG的木瓜蛋白酶消化导致的以二硫键键合的二聚体(见，Ellison et al.(1982),Nucleic AcidsRes.10:4071-9)。如本文中所用，术语“天然Fc”是单体形式、二聚体形式和多聚体形式的通用术语。Fc结构域含有用于蛋白A、蛋白G、各种Fc受体和补体蛋白的结合位点。一些实施方案中，复合体的Fc结构域能与Fc受体相互作用，以介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。在其它应用中，复合体包含不能有效介导ADCC或ADCP的Fc结构域(例如，IgG4 Fc)。
一些实施方案中，术语“Fc变体”是指分子或序列，其从天然Fc修饰而得但仍包含用于援救受体FcRn的结合位点。国际专利申请WO 97/34631和WO 96/32478描述示例性的Fc变体，以及与援救受体的相互作用，并且通过引用并入本文。因此，术语“Fc变体”包含从非人类天然Fc人源化的分子或序列。此外，天然Fc包含可被移除的位点，因为这些位点提供结构特征或生物学活性但它们是本发明的融合分子所不需要的。因此，在优选实施方案中，术语“Fc变体”包含改变一个或多个天然Fc位点或残基的分子或序列，该位点或残基影响或牵涉入(1)二硫键的形成、(2)与所选择宿主细胞的不相容性、(3)在所选择宿主细胞内表达时的N端异质性、(4)糖基化、(5)与补体的相互作用、(6)结合到除援救受体之外的Fc受体、(7)抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或(8)抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。此类改变可增加或降低这些Fc特性中的任意一种或多种。Fc变体在后文中进一步详述。
术语“Fc结构域”涵盖天然Fc和上文定义的Fc变体分子或序列。与Fc变体和天然Fc一样，术语“Fc结构域”包括单体形式或多聚体形式的分子，无论是否从完整抗体消化而得或通过重组基因表达或通过其它手段生产。
链接基
在一些情况下，本发明的融合复合体也包括插在IL-15或IL-15Rα结构域与IL-12和/或IL-18结合结构域之间的挠性链接基序列。链接基序列应允许多肽相对于IL-15或IL-15Rα结构域的有效定位，以允许两种结构域的功能性活性。
在某些情况下，可溶性融合蛋白复合体具有链接基，其中第一多肽通过多肽链接基序列共价地链接到IL-15(或其功能性片段)。在其它方面，本文所述的可溶性融合蛋白复合体具有链接基，其中第二多肽通过多肽链接基序列共价地链接到IL-15Rα多肽(或其功能性片段)。
链接基序列优选由核苷酸序列编码，所得的肽可有效地定位TCR分子的用于识别呈递抗原的结合槽或抗体分子的用于识别抗原的结合结构域。如本文中所用，短语“有效地相对于IL-15或IL-15Rα定位生物学活性多肽”或其它类似的短语，旨在表示将被链接到IL-15或IL-15Rα结构域的所述生物学活性多肽定位，使得IL-15或IL-15Rα结构域能彼此相互作用以形成蛋白复合体。例如，IL-15或IL-15Rα结构域被有效地定位以允许与免疫细胞相互作用，从而启动或抑制免疫反应或者抑制或刺激细胞发育。
本发明的融合复合体优选也包括插在IL-15或IL-15Rα结构域与免疫球蛋白Fc结构域之间的挠性链接基序列。链接基序列应允许对Fc结构域、生物学活性多肽和IL-15或IL-15Rα结构域的有效定位，以允许每一个结构域的功能活性。例如，Fc结构域被有效地定位以允许形成适宜的融合蛋白复合体和/或与免疫细胞上的Fc受体或补体系统的蛋白质相互作用以刺激Fc介导的效应，包括肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的调理素作用、细胞裂解和脱颗粒，以及其它Fc受体依赖性过程；补体途径的激活；以及提升融合蛋白复合体的体内半衰期。
链接基序列也可用来链接两个或更多个生物学活性多肽的多肽，以生成具有所希望的功能活性的单链分子。
优选地，链接基序列包含约7至20个氨基酸，更优选约10至20个氨基酸。链接基序列优选是挠性的，以便不将生物学活性多肽或效应子分子保持在单一的不希望的构型中。链接基序列可用来例如将识别位点与融合分子隔开。具体地，肽链接基序列可定位在生物学活性多肽与效应子分子之间，以例如化学地交联它们并提供分子挠性。链接基优选地主要包含具有小侧链的氨基酸，诸如甘氨丙氨酸和丝氨酸，以提供挠性。优选地，约80％或90％或更多的链接基序列包含甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基，尤其是甘氨酸和丝氨酸残基。
可使用不同的链接基序列，包括任何数目的已经成功被用来将抗体可变区接合在一起的挠性链接基设计(见，Whitlow,M.et al.,(1991)Methods:A Companion to Methodsin Enzymology,2:97-105)。
过继细胞疗法
过继细胞疗法(ACT)(包括异体和自体造血干细胞移植(HSCT)疗法和重组细胞(即，CAR T)来疗法)是用于多种恶性病变的治疗选择(关于HSCT途径和过继细胞疗法途径的回顾，见，Rager&Porter,Ther Adv Hematol(2011)2(6)409-428；Roddie&Peggs,ExpertOpin.Biol.Ther.(2011)11(4):473-487；Wang et al.Int.J.Cancer:(2015)136,1751-1768；和Chang,Y.J.and X.J.Huang,Blood Rev,2013.27(1):55-62)。此类过继细胞疗法包括但不限于，异体和自体造血干细胞移植、供体白细胞(或淋巴细胞)输注(DLI)、肿瘤浸润淋巴细胞的过继转移、或者T细胞或NK细胞(包括重组细胞，即，CAR T、CAR NK)的过继转移。在源自供体的细胞在放疗和化疗之后重建造血的必要性之外，来自被转移细胞的免疫重建对于消除残留的肿瘤细胞非常重要。TACT作为恶性肿瘤的治愈性选项的功效收到多种因素的影响，包括供体细胞的起源、组成和表型(淋巴细胞子集、激活状态)；基础疾病；移植前调理方案和移植后免疫支持(即，IL-2疗法)；以及由移植物内的供体细胞介导的移植物抗肿瘤(GVT)效应。此外，这些因素必须与移植相关的死亡率平衡，所述死亡率通常是由调理方案和/或宿主体内的供体细胞的过度免疫活性(即，移植物抗宿主疾病、细胞因子释放综合征等)引起的。
使用过继NK细胞疗法的途径已经变得非常感兴趣。在接受自体HSCT的患者体内，血液NK细胞数在移植后很早恢复，并且NK细胞的水平与积极结果关联(Rueff et al.,2014,Biol.Blood Marrow Transplant.20,896-899)。尽管使用自体NK细胞转移的治疗策略已经由于多种因素而取得了有限的成功，但间接体内激活的异体(或单倍同一性)NK细胞的过继转移已经称为有前景的癌症免疫治疗策略(Guillerey et al.2016.NatureImmunol.17:1025-1036)。与自体NK细胞相比，这些细胞的活性被自身MHC分子压制的可能性较小。许多研究已经显示，使用单倍同一性NK细胞来探索对抗肿瘤的同种异体反应性的过继疗法是安全的，并且可在AML患者体内介导显著的临床活性。进一步考虑这些发现，近期研究聚焦在以下方面：优化NK细胞或NK前体(即，干细胞)的间接体内激活/扩张方法以及移植前调理测量和移植后免疫支持测量；NK细胞系或重组肿瘤靶向NK细胞的使用；与其它药剂例如治疗性抗体、免疫调节剂(lenalidomide)、以及抗KIR和检查点抗体的联合疗法的评估。在每种情况下，这些策略均可通过本发明的融合蛋白复合体补充，该复合体具有增强NK细胞增殖和激活的能力。如本文中所示，使用本发明的融合蛋白复合体对NK细胞进行间接体内培养，可诱导CIML NK细胞表现出提高的激活标记物、增加的对肿瘤细胞的细胞毒性以及提升的IFN-γ产生。此外，本发明的融合蛋白复合体能激活人类NK细胞系。而且，提供通过直接给药本发明的融合蛋白复合体或通过给药由本发明的融合蛋白复合体激活的免疫细胞来增强免疫应答并治疗赘生物和感染病的方法。
天然杀手细胞：一种主要类型的循环单核细胞是天然杀手或NK细胞(M.Manoussaka et al.,Journal of Immunology 158:112-119,1997)。最初基于其杀死某些肿瘤和病毒感染细胞的能力而定义的NK细胞是现在已知的早期先天免疫系统的成分之一。除了他们的细胞毒性能力之外，NK细胞也通过释放多种细胞因子而用作免疫应答的调节剂。此外，通过NK细胞经由表达在NK细胞上的各种表面分子与其它细胞直接相互作用，促使生成复杂的免疫应答。
NK细胞源自骨髓前体(O.Haller et al.,Journal of Experimental Medicine145:1411-1420,1977)。NK细胞似乎与T细胞密切相关，并且这两种细胞类型共享很多小表面标记物(M.Manoussaka et al.,1997)。如上所述，这些细胞表面标记物在NK细胞活性方面扮演重要角色。例如，鼠NK细胞在其表面上表达特异性抗原例如去唾液酸基GM1、NK1和NK2抗原(D.See et al.,Scand.J.Immunol.46:217-224,1997)，并且给药对抗这些抗原的抗体导致体内NK细胞的耗竭(Id.)。
与细胞毒性T淋巴细胞(CTL)相似，NK细胞通过裂解多种细胞类型而发挥细胞毒效果(Srivastava,S.,Lundqvist,A.&Childs,R.W.Natural killer cell immunotherapyfor cancer:a new hope.Cytotherapy 10,775–783；2008)。这些包括正常的干细胞、受感染的细胞、和转化的细胞。通过含有蛋白酶、核酸酶和穿孔素的细胞质颗粒的作用，发生细胞的裂解。缺乏I类MHC的细胞也易发生NK细胞介导的裂解(H.Reyburn et al.,Immunol.Rev.155:119-125,1997)。此外，NK细胞以非MHC限制模式发挥细胞毒性(E.Ciccione et al.,J.Exp.Med.172:47,1990；A.Moretta et al.,J.Exp.Med.172:1589,1990；和E.Ciccione et al.,J.Exp.Med.175:709)。NK细胞也通过抗体依赖性细胞毒性裂解细胞。
如上所述，NK细胞通过分泌细胞因子，例如干扰素γ(IFN-γ)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、白介素-3(IL-3)和IL-8，发挥它们的一些功能。NK细胞的细胞毒活性通过激活与抑制受体的平衡而得以调节，实现对细胞毒活性的微调控制，防止对健康细胞造成细胞毒性，同时维持对肿瘤细胞的有效细胞毒性能力。事实上，很多研究已经证明了过继NK细胞转移的安全性和临床抗癌效果，突出了NK细胞作为有效的癌症免疫疗法的潜力((Parkhurst,M.R.,et al.ClinCancer Res 17,6287–6297(2011)；Ruggeri,L.et al.Science 295,2097–2100,(2002)；Miller,J.S.et al.Blood 105,3051–3057,(2005)；Bachanova,V.et al.Blood 123,3855–3863,(2014)；Rubnitz,J.E.et al.J Clin Oncol 28,955–959,(2010))。例如，包括IL-2、IL-12、TNF-α和IL-1在内的细胞因子可诱导NK细胞以产生细胞因子。IFN-α和IL-2是NK细胞的细胞毒活性的强力诱导剂(G.Trinichieri et al.,Journal of ExperimentalMedicine 160:1147-1169,1984；G.Trinichieri and D.Santoli,Journal ofExperimental Medicine 147:1314-1333,1977)。IL-2的存在刺激并扩张NK细胞(K.Oshimi,International Journal of Hematology 63:279-290,1996)。已经显示，IL-12诱导细胞因子从T细胞和NK细胞产生，并且诱导增强的NK细胞介导的细胞毒性(M.Kobayashi et al.,Journal of Experimental Medicine 170:827-846,1989)。
NK细胞牵涉入对癌症扩散的抵抗和控制两者中。自癌症免疫监督概念出现以来，免疫细胞尤其是T细胞和天然杀手(NK)细胞的过继转移已经成为利用免疫系统对抗癌症的靶向方法(Kroemer,G.,Senovilla,L.,Galluzzi,L.,Andre,F.&Zitvogel,L.Natural andtherapy-induced immunosurveillance in breast cancer.Nat Med 21,1128–1138,(2015))。NK细胞作为一种有前景的用于治疗癌症的免疫治疗剂，引起了广泛关注。由于NK细胞对恶性肿瘤细胞的天然细胞毒性，它们对于身体对抗癌症的第一线防御至关重要(Srivastava,S.,et al.,Cytotherapy 10,775–783；2008)。
NK细胞已经从包括外周血和脐带血(CB)在内的多种来源扩张((Denman,C.J.etal.Membrane-bound IL-21promotes sustained ex vivo proliferation of humannatural killer cells.PLoS One 7,e30264,(2012)；Knorr,D.A.et al.Clinical-scalederivation of natural killer cells from human pluripotent stem cells forcancer therapy.Stem Cells Transl Med 2,274-283,(2013)；Shah,N.et al.Antigenpresenting cell-mediated expansion of human umbilical cord blood yields log-scale expansion of natural killer cells with anti-myeloma activity.PLoS One8,e76781,(2013)；Woll,P.S.et al.Human embryonic stem cells differentiate intoa homogeneous population of natural killer cells with potent in vivoantitumor activity.Blood 113,6094-6101,(2009))。已经使用细胞因子与作为饲养细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)的联合研发了间接体内NK细胞扩张方法((Denman,C.J.etal.PLoS One 7,e30264,(2012)；Berg,M.et al.Cytotherapy 11,341–355,(2009)；Gong,W.et al.Tissue Antigens 76,467–475,(2010)；Zhang,H.et al.,J Immunother 34,187–195,(2011))。
衰老细胞和年龄相关病理的基于细胞因子的疗法
受损的细胞经历凋亡或衰老。衰老细胞防止它们自我增殖并且分泌信号传导分子，这种现象称为衰老相关分泌表型(SASP)(Coppe J.P.et al.,2010Annu Rev Pathol 5:99-118)。据建议，SASP通过刺激受损较小的相邻细胞，以通过吸引免疫细胞而激励组织修复，从而恢复组织功能(Demaria M.,et al.,2014Dev.Cell 31:722-733)。这些免疫细胞消除衰老细胞以关闭SASP介导的信号。当受损超过修复能力或免疫细胞变为对于SASP的效果无应答时，发生衰老细胞的异常蓄积。结果，衰老细胞在老化器官和/或受损器官中蓄积，并加重组织功能障碍(Ovadya Y.and Krizhanovsky V.et al.,2014 Biogerontology 15:627-642)。在小鼠体内已经显示，消除衰老细胞增加了健康寿命并且降低了年龄相关疾病的严重性(Baar M.P.et al.,2017 Cell 169:132-147；Baker DJ 2016 530:184-189)。
因此，生理老化与衰老细胞的出现相关。有证据提示，衰老细胞危害组织内平衡和功能，并且衰老细胞的蓄积有助于年龄相关病状的发展(Baker DJ et al.,2008Nat CellBiol 10:825-836；Baker DJ et al.,2016,530:184-189)。除了缩短寿命之外，衰老细胞也与包括以下的病状相关：代谢病(肥胖、糖尿病)；神经系统疾病(阿尔兹海默症和帕金森症)；肌肉、骨和软骨相关疾病(少肌症、骨关节炎、驼背、椎间盘突出)；或组织功能障碍相关疾病(肺气肿、心血管和肾病、以及动脉粥样硬化)。研究已经显示，先天性和适应性免疫系统牵涉入对衰老细胞的识别和消除中(Soto-Gamez A.and Demaria M.,2017DrugDiscovery Today 22:786-795；Hazeldine J.and Lord,J.M.,2013Aging ResearchReviews 12:1069-1078)。例如，NK细胞被证实经由颗粒胞吐途径消除衰老细胞。因此，增强这些应答可增加衰老监督的天然机制并且减少衰老细胞相关病状。已经提示，穿孔素介导的NK细胞毒性的年龄相关性减退是老化组织中衰老细胞出现频率增加的部分原因(Rukavina D.et al.,Blood 92:2410-2420；Sagiv A.et al.2012Oncogene 1-7)。在肝纤维化中，在缺乏NKG2D受体(该受体是NK细胞的主要激活受体)的小鼠体内蓄积的衰老的激活肝星状细胞增加，导致肝纤维化增加(Sagiv A.et al.,2016Aging 8:328-344)。
已经证明，本发明的IL-7/IL-21/TxM复合体具有明显的提升包括NK细胞和T细胞在内的先天性和适应性免疫细胞的细胞毒性的活性。如本文所公开，预期IL-7/IL-21/TxM复合体激活和/或维持对于衰老细胞的免疫应答，并且具有作为抗老化治疗剂的潜在应用。如所指出的，IL-7/IL-21/TxM复合体在向NK细胞和T细胞提供更有效的免疫刺激方面比个体细胞因子更有优势。此外，通过IL-7/IL-21/TxM复合体间接体内刺激的免疫细胞将会被用于过继细胞转移中，用于治疗衰老细胞和/或年龄相关的疾病。此类疗法可能是过继NK或T细胞疗法。也可在过继细胞转移后执行IL-7/IL-21/TxM复合体的给药，以支持被转移细胞的增殖、激活和持续存在。
药物疗法
本发明提供包含作为治疗剂使用的融合蛋白复合体的药物组合物。一方面，本发明的融合蛋白复合体被全身给药，例如，配制在药学可接收的缓冲液例如生理盐水中。优选的给药途径包括，例如，滴注到膀胱内、皮下注射、静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、肿瘤内注射或皮内注射，这向患者体内提供连续、持续或有效的组合物水平。使用处于生理学可接收载剂内的治疗有效量的本文中鉴别的治疗剂进行对人类患者或其它动物的治疗。合适的载剂即其配方在例如E.W.Martin的《雷明顿药物科学》(Remington's PharmaceuticalSciences)中有所描述。待给药的治疗剂的量依据给药方式、患者的年龄和体重、以及赘生物的临床症状而变。通常，该量将会在其它用于治疗其它与赘生物、自身免疫疾病或感染病相关疾病的治疗中的剂所使用的范围内，但在某些情况下，因为该化合物的特异性增加，将会需要较低的量。化合物的给药剂量为：提升受试者免疫应答的量，或降低赘生物、受感染细胞、自身免疫细胞或衰老细胞的增殖、生存或侵袭性的量，通过该领域技术人员已知的方法确定。
药物组合物制剂
本发明的融合蛋白复合体用于治疗赘生物、感染病、衰老细胞或年龄相关疾病、或自身免疫疾病的给药时通过任何合适手段进行的，导致在缓解、减轻或稳定化所述赘生物、感染病、衰老细胞或年龄相关疾病、或自身免疫疾病中有效的该治疗剂(与其它成分组合)的浓度。本发明的融合蛋白复合体可以任何适宜的量包含在任何合适的载剂物质中，并且通常以按组合物的总重计1重量％至95重量％的量存在。组合物可提供为适用于胃肠外(例如，皮下、静脉内、肌肉内、血管内、肿瘤内或腹腔内)给药途径的剂型。例如，根据传统药学实践配制药物组合物(见，例如，《雷明顿：制药药物科学与实践(第二十版)》(Remington:The Science and Practice of Pharmacy(20th ed.),ed.A.R.Gennaro,LippincottWilliams&Wilkins,2000)和《制药技术百科全书》(Encyclopedia of PharmaceuticalTechnology,eds.J.Swarbrick and J.C.Boylan,1988-1999,Marcel Dekker,New York)).
通过从在小鼠或非人类灵长动物体内使用的化合物的量外推而初步确定人类体剂量，该领域技术人员应认识到，相较于动物模型而修正用于人类的剂量是该领域中的常规技术。例如，剂量可在1μgcompound/kg体重至约5000mg化合物/kg体重；或约5mg/kg体重至约4,000mg/kg；或约10mg/kg体重至约3,000mg/kg体重；或约50mg/kg体重至约2000mg/kg体重；或约100mg/kg体重至约1000mg/kg体重；或约150mg/kg体重至约500mg/kg体重之间改变。例如，剂量为约1、5、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200、1,250、1,300、1,350、1,400、1,450、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500或5,000mg/kg体重。另选地，剂量在约5mg化合物/Kg体重至约20mg化合物/kg体重的范围内。在另一示例中，剂量为约8、10、12、14、16或18mg/kg体重。优选地，以0.5mg/kg至约10mg/kg(例如，0.5、1、3、5、10mg/kg)给药融合蛋白复合体当然，这一剂量可如此类治疗方案常规进行的那样上调或下调，取决于初始临床试验的结果和特定患者的需求。
使用适宜的赋形剂将药物组合物配制为药物组合物，该药物组合物在给药时以受控的方式释放治疗剂。示例包括单个或多个单位片剂或胶囊组合物、油溶液、悬浮液、乳液、微胶囊、微球、分子复合物、纳米颗粒、贴剂和脂质体。优选地，融合蛋白复合体配制在适用于胃肠外给药的赋形剂中。
胃肠外组合物
通过以含有传统的、无毒的药学可接受的载剂和佐剂的剂型、制剂或经由合适的递送装置或移植物注射、滴注或移植来(皮下、静脉内、肌肉内、肿瘤内、血管内、腹腔内)给药包含本发明的融合蛋白复合体的药物组合物。此类组合物的制剂和制备是药物制剂领域技术人员所熟知的。制剂可见于前述《雷明顿：制药科学与实践》中。
包含本发明的融合蛋白复合体的用于胃肠外给药的组合物提供为单位剂型(例如，在单剂量安瓿中)。另选地，组合物提供在含有若干剂的小瓶中，其中可加入合适的防腐剂(见下文)。组合物的形式为溶液、悬浮液、乳液、输注装置、或用于移植的递送装置，或者它作为待使用水或另一合适的媒介物在使用前重建的干粉而存在。组合物除了包括减轻或缓解赘生物、感染病、衰老细胞或年龄相关疾病、或自身免疫疾病的活性剂之外，还包括合适的胃肠外制剂可接收的载剂和/或赋形剂。活性治疗剂可并入微球、微胶囊、纳米颗粒、脂质体中以备受控的释放。此外，组合物可包括悬浮剂、增溶剂、稳定剂、pH调节剂、张度调节剂和/或分散剂。
如上所示，包含本发明的融合蛋白复合体的药物组合物可以是适用于无菌注射的形式。为了制备这一组合物，将核实的活性治疗剂溶解或悬浮在胃肠外给药可接收的液体媒介物中。可采用的可接受的媒介物和溶剂是水；通过加入适宜量的盐酸、氢氧化钠或合适的缓冲剂调节至合适pH的水；1,3-丁二醇；林格溶液；以及等渗氯化钠溶液和葡萄糖溶液。水性制剂也可含有一种或多种防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯、乙酯或正丙酯)。在化合物之一只能少量地或微溶于水中的情况下，可加入溶解增强剂或增溶剂，或者溶剂可包括10％至60％w/w的丙二醇。
本发明提供治疗赘生物、感染病、衰老细胞或年龄相关疾病或其症状的方法，所述方法包括向受试者(例如，哺乳动物例如人类)给药治疗有效量的包含本文所述化合物的药物组合物。因此，一个实施方案是治疗苦于或易患赘生物、感染病、衰老细胞或年龄相关疾病、或其症状的受试者。所述方法包括向该哺乳动物给药治疗量的本文化合物的方法，在一定条件下，该量足以治疗该疾病或病变或其症状，使得疾病或病变得以治疗。
本文的方法包括向该受试者(包括被鉴别为需要此治疗的受试者)给药有效量的本文所述化合物、或本文所述组合物以产生此效果。鉴别需要此治疗的受试者可能出于受试者或医护专业人员的判断，并且可以是主观的(例如，观点)或客观的(例如，可通过测试或诊断方法测量)。
本发明的治疗方法(包括预防性治疗)通常包括向有此需要的受试者(例如，动物、人类，包括哺乳动物，尤其是人类)给药治疗有效量的化合物，例如本文所述的化合物。该治疗将会合适地给予苦于、具有、易患赘生物、感染病、衰老细胞或年龄相关的疾病、病变或其症状或处于其风险下的受试者尤其是人类。通过诊断性测试或受试者或医护从业人员的观点(例如，基因测试、酶或蛋白标记物、标记物(如本文中定义)、家族病史等)，可由任何主观或客观的决定确定那些“处于风险下的”受试者。本发明的融合蛋白复合体可用于治疗任何希望增加免疫应答的其它病变。
本发明也提供监控治疗进展的方法。所述方法包括确定苦于或易患与赘生物形成的病变或其症状的受试者体内的诊断标记物(标记物)(例如，任何由本文中化合物调节的本文述及的靶点、蛋白质或其指示物等)水平或诊断测量(例如，扫描、化验)，其中所述受试者已经给药治疗量的足以治疗该疾病或其症状的本文中化合物。可将所述方法中测得的标记物水平与健康正常对照物或另一患者的已知标记物水平比较，以确立该受试者的疾病状态。在一些情况下，在晚于测定第一水平的时间点测定该受试者体内标记物的第二水平，并比较两个水平以监控疾病或疗效的进程。在某些方面，在开始根据本发明治疗前测定该受试者体内标记物的治疗前水平；随后将这一治疗前水平与在治疗开始后该受试者体内标记物的水平比较，以确定治疗的功效。
联合疗法
任选地，本发明的融合蛋白复合体可与任何其它标准疗法联合给予；此类方法是熟练技师已知的，并且在E.W.Martin的《雷明顿药物科学》(Remington's PharmaceuticalSciences)中有所描述。若需要，将本发明的融合蛋白复合体与任何传统抗赘生物疗法联合给予，该疗法包括但不限于，免疫疗法、治疗性抗体、靶向疗法、外科手术、放疗或化疗。
试剂盒或药物系统
包含本发明的融合蛋白复合体的药物组合物可组装在试剂盒或药物系统中，用于缓解赘生物、感染病、或衰老细胞或年龄相关疾病。根据本发明这一方面的试剂盒或药物系统包含载剂单元，例如盒、纸板箱、管，其内部密封有一个或多个容器单元，例如小瓶、管、安瓿、瓶等。本发明的试剂盒或药物系统也可包含如何使用本发明的融合蛋白复合体的相关使用说明书。
重组蛋白表达
通常，本发明的融合蛋白复合体(例如，TxM复合体的组分)的制备可通过本文所公开的过程并且通过识别的重组DNA技术实现。
通常，通过用编码全部或部分多肽的核酸分子或其片段在合适的表达媒介物中进行合适宿主细胞的转化，来产生重组多肽。分子生物学领域技术人员将会理解，可使用多种表达系统中的任一种来提供重组蛋白。所使用的确切宿主细胞不是本发明的关键之处。几乎可以在任何真核宿主(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、昆虫细胞如Sf21细胞、或哺乳动物细胞如NIH 3T3、HeLa或优选COS细胞)中产生重组多肽。此类细胞可从多个来源(例如，美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection,Rockland,Md.)；也见，例如，《分子生物学现代方法》(Ausubel et al.,Current Protocol inMolecular Biology,New York:John Wiley and Sons,1997))获得。转染和选择表达媒介物的方法将取决于所选择的宿主系统。转化方法在例如Ausubel et al.(前述)中有所描述；表达媒介物可选自例如《克隆载体：实验室手册》(Cloning Vectors:A LaboratoryManual(P.H.Pouwels et al.,1985,Supp.1987))中提供的那些。
存在多种用于产生重组多肽的表达系统。可用于产生此类多肽的表达载体包括而不限于，染色体载体、游离体载体、和源自病毒的载体，例如，源自细菌质粒的载体、源自噬菌体的载体、源自转座子的载体、源自酵母游离体的载体、源自插入元件的载体、源自酵母染色体元件的载体、源自病毒(例如，杆状病毒、丘疹病毒如SV40、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病病毒和逆转录病毒)的载体、以及源自其组合的载体。
一旦重组多肽被表达，就使用亲和色谱将它单离。在一个示例中，可将针对所述多肽的抗体(例如，如本文所述产生的)附着在柱上，并用来单离所述重组多肽。可通过标准方面在亲和色谱之前实施荷多肽细胞的裂解和分段(见，例如，Ausubel et al.,supra)。单离后，若需要，通过例如高效液相色谱将重组蛋白进一步纯化(见，例如，《生物化学和分子生物学的实验室技术》(Fisher,Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology,eds.,Work and Burdon,Elsevier,1980))。
如本文中所用，本发明的生物学活性多肽或效应子分子可包括因子，例如细胞因子、趋化因子、生长因子、蛋白毒素、免疫球蛋白结构域或其它生物活性蛋白例如酶。而且，生物学活性多肽可包括与其它化合物例如非蛋白毒素、细胞毒性剂、化疗剂、可检测的标签、放射活性物质等的偶联物。
本发明的细胞因子通过任何有细胞产生的任何因子，其影响其它细胞并且是任何数量的多重细胞免疫效果的原因。细胞因子的示例包括但不限于，IL-2家族、干扰素(IFN)、IL-10、IL-12、IL-18、IL-1、IL-17、TGF和TNF细胞因子家族，以及IL-1至IL-35、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TGF-β,TNF-α和TNF-β。
在本发明的一个方面，第一蛋白包含共价链接至白介素-15(IL-15)结构域的第一生物学活性多肽或其功能性片段。IL-15是影响T细胞激活和增殖的细胞因子。Il-15影响免疫细胞激活和增殖的活性在某种程度上与IL-2类似，但基本差异已经得以很好地指出(Waldmann,T A,2006,Nature Rev.Immunol.6:595-601)。
在本发明的另一方面，第一蛋白包含白介素-15(IL-15)结构域，该结构域是IL-15变体(本文中也称为IL-15突变体)。IL-15变体优选地包含不同于天然(或野生型)IL-15蛋白的氨基酸序列。IL-15变体优选地结合IL-15Rα多肽并具有作为IL-15激动剂或拮抗剂的功能。优选地，具有激动剂活性的IL-15变体具有超激动剂活性。IL-15可具有IL-15激动剂或拮抗剂的功能，和其是否与IL-15Rα关联无关。通过与野生型IL-15相当或更高的生物学活性，示例性说明IL-15激动剂。通过比野生型IL-15降低的生物学活性或抑制IL-15介导的应答的能力，示例性说明IL-15拮抗剂。在一些示例中，IL-15变体具有增加或降低的与IL-15RβγC受体结合的活性。在一些情况下，与天然IL-15序列相比，IL-15变体的序列具有至少一个氨基酸变化，例如替换或删除，此类变化导致IL-15激动剂或拮抗剂活性。优选地，氨基酸替换/删除位于IL-15的与IL-15Rβ和/或γC相互作用的结构域内。更优选地，氨基酸替换/删除不影响与IL-15Rα多肽的结合或产生IL-15变体的能力。可基于假定的或已知的IL-15结构，将L-15与具有已知结构的同源分子例如IL-2比较，通过如本文中提供的合理或随机突变和功能试验或其它经验方法，鉴别适用于生成IL-15变体的氨基酸替换/删除。此外，合适的氨基酸替换可以是保守替换或非保守替换以及另一氨基酸的插入。优选地，本发明的IL-15变体含有位于成熟的人类IL-15序列的位置6、8、10、61、65、72、92、101、104、105、108、109、111或112处的一个或不止一个氨基酸替换/删除；具体地，D8N(“D8”是指该氨基酸和残基在天然成熟的人类IL-15序列中的位置，并且“N”是指在IL-15变体中该位置处所替换为的氨基酸残基)、I6S、D8A、D61A、N65A、N72R、V104P或Q108A替换导致具有拮抗剂活性的IL-15变体，而N72D替换导致具有激动剂活性的IL-15变体。
趋化因子类似于细胞因子，定义为当暴露于其它细胞时是多种细胞免疫的原因的任何化学因子或分子。合适的趋化因子可包括但不限于CXC、CC、C和CX3C趋化因子家族，以及CCL-1至CCL-28、CXC-1至CXC-17、XCL-1、XCL-2、CX3CL1、MIP-1b、IL-8、MCP-1和Rantes。
生长因子包含任何当暴露于特定细胞时诱导被影响的细胞增殖和/或分化的任何分子。生长因子包括蛋白和化学分子，其中的一些包括：GM-CSF、G-CSF、人类生长因子和干细胞生长因子。其它生长因子也可适用于本文所述用途中。
毒素或细胞毒性剂包括任何当暴露于细胞时具有致死效果或生长抑制效果的物质。更具体地，效应子分子可以是起源于例如植物或细菌的细胞毒素，例如，白喉毒素(DT)、至贺毒素、相思豆毒素、霍乱毒素、蓖麻毒素、皂草素、假单胞菌外毒素(PE)、商陆抗病毒蛋白、或白树毒素。此类毒素的生物学活性片段是该领域中熟知的，并且包括例如DT A链和蓖麻毒素A链。此外，毒素可以是在细胞表面具有活性的剂，例如磷脂酶(例如，磷脂酶C)。
再者，效应子分子可以是化疗药物，例如，长春地辛、长春新碱、长春花碱、氨甲喋呤、阿霉素、博来霉素或顺铂。
此外，效应子分子可以是适用于诊断或成像研究的可检测地标记的分子。此类标记包括生物素或链霉亲和素/亲和素、可检测的纳米颗粒或晶体、酶或其催化活性片段、荧光标记如绿色荧光蛋白、FITC、藻红蛋白、苏铁(cychome)、德克萨斯红或量子点；放射性核素，例如碘-131、钇-90、铼-188或铋-212；磷光或化学放光分子或可通过PET、超声或MRI检测的标记，例如Gd--或基于顺磁金属离子的造影剂。见，例如，Moskaug,etal.J.Biol.Chem.264,15709(1989)；Pastan,I.et al.Cell 47,641,1986；Pastan et al.,Recombinant Toxins as Novel Therapeutic Agents,Ann.Rev.Biochem.61,331,(1992)；“Chimeric Toxins”Olsnes and Phil,Pharmac.Ther.,25,355(1982)；PCT申请公布WO 94/29350；PCT申请公布WO 94/04689；PCT申请公布WO2005046449和每个专利5,620,939，涉及制备和使用包含效应子或标签的蛋白的公开。
本发明的IL-15和IL-15Rα多肽在氨基酸序列上合适地对应于天然出现的IL-15和IL-15Rα分子，例如，人类、小鼠或其它啮齿动物、或其它哺乳动物的IL-15和IL-15Rα分子。这些多肽和编码核酸的序列是文献中已知的，包括人类白介素15(IL15)mRNA-GenBank:U14407.1(通过引用并入本文)、小家鼠(Mus musculus)白介素15(IL15)mRNA-GenBank:U14332.1(通过引用并入本文)、人类白介素-15受体α链前体(IL15RA)mRNA-GenBank:U31628.1(通过引用并入本文)、小家鼠白介素15受体α链-GenBank:BC095982.1(通过引用并入本文)。
在一些设定中，它可用来制备本发明的多价蛋白融合或偶联复合体，以例如增加sc-抗体的价态。具体地，融合蛋白复合体的IL-15结构域与IL-15Rα结构域之间的相互作用提供生成多价复合体的手段。此外，通过使用例如标准生物素-链霉亲和素标记技术将一个和四个蛋白(相同或不同)之间共价或非共价地链接在一起，或通过偶联到合适的固体支持物如乳胶珠，可制备多价融合蛋白。化学交联的蛋白(例如，交联至树枝状大分子)也是合适的多价物质。例如，通过包括可被修饰的编码标签序列例如生物素化BirA标签的序列，或通过包括具有化学反应性侧链的氨基酸残基如Cys或His，可修饰该蛋白。此类氨基酸标签或化学反应性氨基酸可位于融合蛋白中的多个位置处，优选在生物活性多肽或效应子分子的活性位点的远端。例如，可溶性融合蛋白的C端可共价链接至标签或包括此(类)反应性氨基酸的其它融合蛋白。可包括合适的侧链以将两个或更多个融合蛋白化学交联至合适的树枝状大分子或其它纳米颗粒，以给出多价分子。树枝状大分子是合成的化学聚合物，其表面上可具有任意数目的不同官能团(D.Tomalia,Aldrichimica Acta,26:91:101(1993))。根据本发明使用的示例性树枝状大分子包括例如E9星爆型聚胺聚合物和E9燃烧型聚胺聚合物，其可连接半胱氨酸残基。示例性纳米颗粒包括脂质体、芯-壳颗粒或基于PLGA的颗粒。
在另一方面，融合蛋白复合体的一个或两个多肽包含免疫球蛋白结构域。另选地，蛋白结合结构域-IL-15融合蛋白可进一步链接至免疫球蛋白结构域。优选的免疫球蛋白结构域包含多个区，这些区允许与其它免疫球蛋白结构域相互作用以形成如上文提供的多链蛋白。例如，免疫球蛋白重链区，例如IgG1 CH2-CH3，能稳定地相互作用以创建Fc区。优选的包括Fc结构域的免疫球蛋白结构域也包含具有效应子功能(包括Fc受体或补体蛋白结合活性)的区和/或具有糖基化位点的区。在一些方面，融合蛋白复合体的免疫球蛋白结构域含有突变，该突变降低或增强Fc受体或补体结合活性或糖基化或二聚作用，从而影响所得蛋白的生物学活性。例如，含有降低Fc受体结合的突变的免疫球蛋白结构域可用来生成本发明的具有较低的荷Fc受体细胞结合活性的融合蛋白复合体，其在被设计用于识别或检测特异性抗原的试剂方法可能具有优势。
核酸和载体
本发明还提供核酸序列，尤其是编码本发明融合蛋白(例如，TxM的组分)的DNA序列。优选地，DNA序列由适用于染色体外复制的载体例如视具体、病毒、质粒、噬菌体中体、粘粒、YAC或附加体携带。具体地，编码所希望的融合蛋白的DNA载体可用来促进本文所述的制备型方法以及获得显著数量的融合蛋白。可将DNA序列插入适宜的表达载体中，即，含有感兴趣的蛋白编码序列转录和翻译所必需元件的载体。多种宿主-载体系统可用来表达蛋白编码序列。这些包括被病毒(例如，牛痘病毒、腺病毒等)感染的哺乳动物细胞；被病毒(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；含有微生物例如酵母的酵母载体；或使用噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌。依据所使用的宿主-载体系统，可使用大量合适的转录和翻译元件的任一者。见，前述Sambrook et al.和前述Ausubel et al.。
本发明包括制备可溶性融合蛋白复合体的方法，所述方法包括将编码第一蛋白和第二蛋白的本文所述序列的DNA载体引入宿主细胞内，在培养基中在足以在所述细胞和培养基内表达所述融合蛋白并且允许将第一蛋白的IL-15结构域与第二蛋白的可溶性IL-15Rα结构域关联以形成所述可溶性融合蛋白复合体的条件下培养所述宿主细胞，从所述宿主细胞或培养基纯化所述可溶性融合蛋白复合体。
通常，根据本发明的优选DNA载体包含通过磷酸二酯键链接的核苷酸序列，其包含，在5’至3’方向上的用于引入编码生物学活性多肽的第一核苷酸序列的第一克隆位点，其可操作地链接至编码效应子分子的序列。
由该DNA载体编码的融合蛋白组分可提供为盒带格式。术语“盒带“意为每种组分均可通过标准重组方法轻易地替换为另一组分。具体地，当所编码的融合复合体待用于对抗可能具有或不具有发展出血清型的能力的病原体时，尤其希望DNA载体被构造为盒带格式。
为了制备编码融合蛋白复合体的载体，使用合适的连接酶将编码生物学活性多肽的序列链接至编码效应子肽的序列。编码本发明肽的DNA可通过从天然来源例如从合适的细胞系单离DNA而获得，或通过已知的合成方法例如磷酸三酯方法获得。见，例如，《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis,IRL Press(M.J.Gait,ed.,1984))。合成的寡核苷酸也可使用可商购的自动寡核苷酸合成器制备。一旦单离，即可通过聚合酶链反应(PCR)或该领域中已知的其它手段扩增编码生物学活性多肽的基因。用来扩增生物学活性多肽基因的合适的PCR引物可将限制位点加入PCR产物中。PCR产物优选地包括用于效应子肽的间接位点和生物学活性多肽-效应子融合复合体的适宜表达和分泌所必需的前导序列。PCR产物也优选地包括编码链接基序列的序列，或用于连接词序列的限制酶。
本文所述的融合蛋白优选通过标准重组DNA技术产生。例如，一旦编码生物学活性多肽的DNA被单离，即可将序列连接至编码效应子多肽的另一DNA分子。编码生物学活性多肽的核苷酸序列可直接地接合至编码效应子肽的DNA序列，更典型地，编码如本文所讨论链接基的DNA序列可插到编码生物学活性多肽与编码效应子肽的序列之间并使用合适的连接酶接合。所得杂交DNA分子可表达在合适的宿主细胞中，以产生融合蛋白复合体。DNA分子以5'至3’取向彼此连接，使得在连接之后不改变所编码的多肽的翻译框(即，DNA分子在框内连接到彼此)。所得DNA分子编码框内融合蛋白。
其它核苷酸序列也可包括在基因构造体中。例如，控制编码融合至效应子肽的生物学活性多肽的序列表达的启动子序列，或者将融合蛋白引导至细胞表面或培养基的前导序列，可包括在该构造体内或存在于该构造体所插入的表达载体中。免疫球蛋白或CMV启动子是尤其优选地。
就获得变体生物学活性多肽、IL-15、IL-15Rα或Fc结构域编码序列而言，该领域技术人员应知道，可通过某些氨基酸替换、加入、删除和翻译后修饰来修饰多肽而不丢失或减少生物学活性。具体地，保守氨基酸替换，换言之，一个氨基酸替换为具有相似尺寸、电荷、极性和构型的另一氨基酸不大可能显著改变蛋白功能，是众所周知的。作为蛋白构件的20中标准氨基酸在广义上可分为以下四组保守氨基酸：非极性(疏水)组包括丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸；极性(不带电，中性)组包括天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；带正电(碱性)组含有精氨酸、组氨酸和赖氨酸；以及，带负电(酸性)组含有天冬氨酸和谷氨酸。蛋白中的一个氨基酸替换为同一组中的另一氨基酸不大可能对该蛋白的生物学活性产生负面作用。在其它例子中，可作出对氨基酸位置的修饰以降低或提升该蛋白的生物学活性。基于靶点残基的已知或假定的结构或功能特性，随机引入或经由位点特异性突变引入此类变化。在变体蛋白的表达之后，由于修饰造成的生物学活性变化可使用结合或功能试验轻易地评估。
核苷酸序列见的同源性可通过DNA杂交分析确定，其中双链DNA杂交体的稳定性取决于发生的碱基配对程度。高温和/或低盐含量的条件降低了杂交体的稳定性，并且可改变以防止具有低于所选同源性程度的序列的退火。例如，对于具有约55％G-C含量的序列，40至50℃、6x SSC(氯化钠/柠檬酸钠缓冲液)和0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)的杂交和洗涤条件指示约60％至70％的同源性，50至65℃、1x SSC和0.1％SDS的杂交和洗涤条件指示约82％至97％的同源性，以及，52℃、0.1x SSC和0.1％SDS的杂交和洗涤条件指示约99至100％的同源性。多种用于比较核苷酸和氨基酸序列(并且测量同源性的程度)的计算机程序也是可用的，并且一系列可商购软件和免费软件的供应源见于Ausubel et al.(1999)。可容易地获得的序列比对和多序列排比算法分别是R局部序列排比检索基本工具(BLAST)(Altschul et al.,1997和ClustalW程序。BLAST可在万维网的ncbi.nlm.nih.gov获得，而ClustalW的版本可在2.ebi.ac.uk获得。
融合蛋白的组分几乎可以任何次序识别，前提条件为各自能实施其预期功能。例如，在一个实施方案中，生物学活性多肽位于效应子分子的C端和N端末端。
本发明的优选效应子分子将具有对那些结构域的预期功能有益的尺寸。可通过包括熟知的化学交联方法在内的各种方法制备本发明的效应子分子并融合至生物学活性多肽。见，例如，Means,G.E.和Feeney,R.E.在1974年所著的《蛋白质的化学修饰》(ChemicalModification of Proteins,Holden-Day)。也见，S.S.Wong在1991年所著的《蛋白质偶联和交联化学》(Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking,CRC Press)。然而，通常优选使用重组操作来制备框内融合蛋白。
正如指出的那样，可通过若干途径识别根据本发明的融合分子或偶联分子。在示例性构象中，生物学活性多肽的C端可操作性地链接至效应子分子的N端。若需要，可通过重组方法实现该链接。然而，在另一构象中，生物学活性多肽的C端链接至效应子分子的N端。
另选地或此外，可按需要将一个或多个额外的效应子分子插入生物学活性多肽或偶联复合体中。
载体和表达
可采用多种策略表达本发明的融合蛋白复合体的组分(例如，TxM)。例如，可使用限制酶将编码本发明的融合蛋白复合体的一种或多种组分的构造体并入合适的载体中，以在载体中作出用于插入该构造体的切口并在之后连接。随后将含有基因构造体的载体引入合适的的宿主中进行融合蛋白的表达。通常见前述Sambrook et al.。可基于涉及克隆方案的因素而经验地作出对合适载体的选择。例如，载体应与所采用的宿主相容并具有适宜的用于该宿主的复制子。载体必须能容纳编码待表达的融合蛋白复合体的DNA序列。合适的宿主细胞包括真核细胞和原核细胞，优选可轻易地转化并在培养基中表现出快速生长的那些细胞。具体优选的宿主细胞包括原核生物例如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtillus)等的细胞，以及真核生物例如动物细胞和酵母株例如酿酒酵母(S.cerevisiae)。通常优选哺乳动物细胞，尤其是J558、NSO、SP2-O或CHO。其它合适的宿主包括，例如，昆虫细胞例如Sf9。采用传统培养条件。见，前述Sambrook。随后可选择稳定的被转化或转染细胞系。表达本发明的融合蛋白复合体的细胞可通过已知过程确定。例如，可通过对于链接的免疫球蛋白为特异性的ELISA和/或通过免疫印迹来确定对于链接到免疫球蛋白的融合蛋白复合体的表达。其它用于检测包含链接到IL-15或IL-15Rα结构域的生物学活性多肽的融合蛋白表达的方法在实施例中公开。
通常如上所述，宿主细胞可用于制备目的以传播编码所希望的融合蛋白的核酸。因此，宿主细胞可包括具体想要在其中产生融合蛋白的原核生物细胞或真核生物细胞。因此，宿主细胞具体地包括能传播编码该融合体的核酸的酵母、两翼昆虫、蠕虫、植物、蛙、哺乳动物细胞和器官。可使用的哺乳动物细胞系的非限制性示例包括CHO dhfr细胞(Urlauband Chasm,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980))、293细胞(Graham et al.,JGen.Virol.,36:59(1977))或骨髓瘤细胞如SP2或NSO(Galfre and Milstein,Meth.Enzymol.,73(B):3(1981))。
能传播编码所希望的融合蛋白复合体的核酸的宿主细胞也涵盖非哺乳动物真核生物细胞，包括昆虫(例如，草地贪夜蛾(Sp.Frugiperda))细胞、酵母(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)、裂殖酵母(S.pombe)、毕赤酵母(P.pastoris.)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、汉逊酵母(H.polymorpha)；如Fleer,R.,Current Opinion inBiotechnology,3(5):486496(1992)所全面回顾的)细胞、真菌细胞和植物细胞。还考虑了某些原核生物，例如大肠杆菌(E.coli)和芽孢杆菌(Bacillus)。
可通过用于转染细胞的标准技术将编码所希望的融合蛋白的核酸引入宿主细胞内。术语“转染”或“转染作用”旨在涵盖用于将核酸引入宿主细胞内的全部传统技术，包括磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染、电穿孔、显微注射、病毒转导和/或整合。适用于转染宿主细胞的方法可见于前述Sambrook et al.和其它实验室教材中。
根据本发明，可使用多种启动子(转录启动调节区)。适宜启动子的选择取决于所提议的表达宿主。可使用来自异源来源的启动子，只要它们在所选宿主内发挥功能即可。
启动子选择也取决于所希望的肽或蛋白产生效率和水平。可诱导型启动子例如tac常被用来急剧增加大肠杆菌(E.coli)中的蛋白质表达水平。蛋白的过表达可能对宿主细胞有害。因此，宿主细胞的生长可能受限。可诱导型启动子系统的使用允许在诱导基因表达之前将宿主细胞培养至可接受的密度，从而促成更高的产率。
根据本发明，可使用各种信号序列。可使用与生物学活性多肽编码序列同源的信号序列。另选地，也可使用已经被选择或设计用于在表达宿主内有效分泌和处理的信号序列。例如，合适的信号序列/宿主细胞对包括枯草芽孢杆菌(B.subtilis)分泌的枯草芽孢杆菌sacB信号序列和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)α-交配因子或毕赤酵母(P.pastoris)分泌的酸性磷酸酶phoI信号序列。信号序列可通过编码该信号肽酶裂解位点的序列直接接合到该蛋白编码序列，或通过由一般少于10个密码子组成的短多核苷酸桥接合，其中该桥确保下游TCR序列的正确阅读框。
已经鉴别了真核生物蛋白表达系统的用于提升转录和翻译的元件。例如，将花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子定位在异源启动子任一侧上1,000bp处，可将植物细胞中的转录水平提升10倍至400倍。表达构造体也应包括适宜的翻译启动序列。将表达构造体修饰为包括用于适宜翻译启动的Kozak共有序列，可将翻译水平增加10倍。
常采用选择性标记物，其可能是表达构造体的一部分或与表达构造体分开(例如，由表达载体携带)，使得标记物可整合在不同于感兴趣基因的位点处。示例包括具有耐抗生素性的标记物(例如，对于大肠杆菌宿主细胞，bla具有耐氨苄西林性；对于多种原核生物细胞和真核生物细胞，nptII具有耐卡那霉素性)或允许宿主在最少培养基上生长的标记物(例如，HIS4使得毕赤酵母或His-酿酒酵母在不存在组氨酸的情况下生长)。可选择的标记物具有其自己的转录和翻译起始和终止调节区，以允许该标记物的独立表达。如果采用耐抗生素性作为标记物，则用于选择的抗生素浓度将依据抗生素而变，通常在10至600μg抗生素/mL培养基范围内。
采用已知的重组DNA技术组装表达构造体(Sambrook et al.,1989；Ausubel etal.,1999)。限制酶消化和连接是用来接合两个DNA片段的基本步骤。可能需要在连接之前修饰DNA片段的末端，这可通过填充悬垂部分、用核酸酶(例如，ExoIII)删除该片段的末端部分、定点突变、或通过PCR加入新的碱基对来实现。可采用多接头和适配体来促成所选择片段的接合。表达构造体典型在大肠杆菌的限制性内切、连接和转化循环过程中分阶段组装。多种适用于构造表达构造体的克隆载体是该领域中已知的(λZAP和pBLUESCRIPT SK-1，Stratagene,La Jolla,CA,pET,Novagen Inc.,Madison,WI，引用在Ausubel et al.,1999中)，并且具体选择对于本发明并不重要。对克隆载体的选择将受到被选择用于将表达构造体引入宿主细胞内的基因转移系统的影响。在各阶段结束时，可通过限制分析、DNA序列分析、杂交作用分析和PCR分析来分析所得的构造体。
表达构造体可被转化为作为克隆载体构造体的或线性或环状的宿主，或可从克隆载体中移除并直接使用或引入递送载体上。递送载体促成表达构造体被引入并维持在所需的宿主细胞类型中。通过多种已知基因转移系统(例如，天然能力、化学介导的转化、原生质转化、电穿孔、基因枪转化(biolistic transformation)、转染、或偶联)中的任一种将表达构造体引入宿主细胞内(Ausubel et al.,1999；Sambrook et al.,1989)。依据所使用的宿主细胞和载体系统来选择基因转移系统。
例如，可通过原生质转化或电穿孔将表达构造体引入酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞中。酿酒酵母的电穿孔容易实现，并且获得与球形体转化相当的转化效率。
本发明还提供用于单离感兴趣融合蛋白的生产方法。在该方法中，已经将编码可操作性地链接到调节序列的感兴趣蛋白的核酸引入其中的宿主细胞(例如，酵母、真菌、昆虫、细菌或动物细胞)，在培养基中以生产规模生长以刺激该编码感兴趣融合蛋白的核苷酸序列的转录。然后，从收获的宿主细胞或从培养基单离感兴趣的融合蛋白。可使用标准蛋白纯化技术从培养基或从收获的细胞单离感兴趣的蛋白。具体而言，可使用纯化技术以大规模(即，至少毫克级的数量)从多种具体实施方式表达并纯化所希望的融合蛋白，这些实施方式包括滚动瓶、旋转烧瓶、组织培养板、生物反应器或发酵器。
可通过已知方法单离并纯化所表达的蛋白融合复合体。典型将培养基离心或过滤，随后通过亲和色谱或免疫亲和色谱(例如，蛋白A或蛋白G亲和色谱)或者包含使用接合所表达的融合复合体的单克隆抗体的免疫亲和方案来纯化上清液。可通过已知技术的适宜组合单离并纯化本发明的融合蛋白。这些方法包括，例如，使用溶解度的方法，例如盐沉淀和溶剂沉淀；使用分子量差异的方法，例如渗析、超滤、凝胶过滤和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；使用电荷差异的方法，例如离子交换柱色谱；使用特异亲和性的方法，例如亲和色谱；使用疏水性差异的方法，例如反向高效液相色谱；以及使用等电点差异的方法，例如等电点聚焦电泳、金属亲和柱例如Ni-NTA。关于这些方法的公开，通常见前述Sambrook et al.和Ausubel et al.。
优选地，本发明的融合蛋白是实质上纯的。换言之，融合蛋白已经与其天然伴随的细胞取代物单离，使得该融合蛋白优选以至少80％或90％至95％的同源性(w/w)存在。对于很多药物、临床和研究应用，具有至少98％至99％同源性(w/w)的融合蛋白是最优选的。当实质上被纯化时，融合蛋白应实质上不含对治疗应用是污染物的物质。当被部分纯化或纯化至实质纯度时，可溶性融合蛋白在治疗上可用，或可用于在体外或体内实施如本文所公开的试验。可通过多种标准技术例如色谱和凝胶电泳测定实质纯度。
本发明的融合蛋白复合体适用于在体外或体内与多种细胞一起使用，该细胞是癌细胞或被感染细胞或可变为被一种或多种疾病感染。
人类白介素-15(huIL-15)通过表达在抗原呈递细胞的人类IL-15受体α链(huIL-15Rα)被反向呈递至免疫效应子细胞。IL-15Rα主要通过细胞外sushi结构域(huIL-15RαSu)以高亲和性(38pM)结合huIL-15。如本文所述，huIL-15和huIL-15RαSu结构域可用作支架来构造多结构域融合复合体。
IgG结构域，尤其是Fc片段，已经成功地作为树枝状支架用于大量治疗性分子，这些分子包括获批的生物药物。例如，依那西普(etanercept)是链接到人类IgG1的Fc结构域的可溶性人类p75肿瘤坏死因子-α(TNF-α)受体(sTNFR)二聚体。这一二聚作用使得依那西普在抑制TNF-α活性方面比单体sTNFR强高达1,000倍，并且提供血清半衰期比单体形式长五倍的融合体。结果，依那西普在中和体内的TNF-α促炎活性中有效，并且在改善患者的多种不同自身免疫指标的结局方面有效。
除了其二聚体活性之外，Fc片段也通过补体激活和与显示在天然杀手(NK)细胞、嗜中性粒细胞、吞噬细胞和树突细胞上的Fcγ受体的相互作用而提供细胞毒性效应子功能。在抗癌治疗性抗体和其它抗体结构域-Fc融合蛋白的情形中，这些活性似乎在从肿瘤模型和癌症患者中观察到的功效中扮演重要角色。然而，在许多治疗性应用中，这些细胞毒性效应子应答可能是不足的。因此，人们对改善和扩张Fc结构域的效应器活性，以及开发通过靶向治疗分子将细胞溶解性免疫应答(包括T细胞活性)召集到疾病部位的其它方法有相当大的兴趣。IgG结构域已经用作支架来形成双特异性抗体，以改善通过传统杂种细胞融合技术生成的产物的质量和数量。尽管这些方法绕过了其它支架的缺点，它仍然难以在哺乳动物细胞中以足以支持临床研发和使用的水平生产双特异性抗体。
在研发源自人类的免疫刺激多聚体支架的尝试中，使用了人类IL-15(huIL-15)和IL-15受体结构域。huIL-15是与具有高亲和活性(平衡解离常数(KD)～10-11M)的huIL-15受体α-链(huIL-15Rα)相关的细胞因子的四α-螺旋束小家族的成员。随后将所得复合体转移呈递到显示在T细胞和NK细胞表面上的人类Il-2/15受体β/共用γ链(huIL-15RβγC)复合体。细胞因子/受体的这一相互作用导致效应子T细胞和NK细胞的扩张和激活，这在根除病毒感染的细胞和恶性病变细胞中扮演重要角色。正常情况下，在树突细胞中共同产生huIL-15和huIL-15Rα，以形成细胞内复合体，该复合体后来被分泌并作为异质二聚体分子显示在细胞表面上。因此，huIL-15与huIL-15Rα相互作用的特征提示，这些链间结合结构域将会用作人源免疫刺激支架，以使得可溶性二聚体分子能够靶点特异性地结合。
除非另外指定，否则本发明的实践采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的传统技术，这些技术完全在该领域技术人员的权限之内。此类技术在文献中有完整阐述，例如，《分子克隆：实验室手册(第二版)》(MolecularCloning:A Laboratory Manual,second edition(Sambrook,1989))；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis(Gait,1984))；《动物细胞培养》(Animal Cell Culture(Freshney,1987))；《酶学方法：实验免疫学手册》(Methods in Enzymology Handbook ofExperimental Immunology(Weir,1996))；《用于哺乳动物细胞的转基因载体》(GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells(Miller and Calos,1987))；《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel,1987))；《PCR：聚合酶链反应》(PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis,1994))；《免疫学现代方法》(CurrentProtocols in Immunology(Coligan,1991))。这些技术科用于生产本发明的多核苷酸和多肽，并因此可视为作出并实践本发明。尤其可用于具体实施方案的技术将在以下章节中讨论。
详述以下实施例以向该领域技术人员提供对如何制备和使用本发明的检验、筛选和治疗性方法的完全公开和说明，并且以下实施例不试图限制发明人类所认为的本发明的范畴。
[实施例]
实施例1：包含IL-15、IL-7和IL-21结构域的融合蛋白复合体的生成和表征
一种重要的用于治疗癌症或感染病的治疗途径依赖于增强免疫细胞对抗患病细胞的活性。这一策略包括间接体内刺激免疫细胞，之后进行过继转移到患者体内和/或直接增加患者体内的免疫细胞水平或活性。牵涉入这些途径中的免疫细胞可以是先天性免疫细胞(即，NK细胞)或过继免疫细胞(即，T细胞)。
一种用于增强免疫活性的途径是向免疫细胞提供免疫刺激细胞因子。此类细胞因子是该领域中已知的，并且可单独使用或与其它细胞因子或药剂组合使用。如下文详细描述的，生成了包含融合到IL-7结合结构域和IL-21结合结构域的IL-15N72D:IL-15RαSu-IgFc支架的融合蛋白复合体。这些融合蛋白复合体在结合到NK细胞和T细胞方面以及经由每种细胞因子受体进行细胞应答信号传导方面具有优势。Ig分子的Fc区可形成二聚体以提供可溶性多种多肽复合体，可结合蛋白A以用于纯化目的并可与NK细胞和巨噬细胞上的Fcγ受体相互作用，从而向该融合蛋白复合体提供在独立细胞因子的组合中不存在的优势。此外，IL-15N72D结构域与IL-15RαSu结构域间的相互作用提供将IL-15N72D、IL-7和IL-21(以及可能的其它蛋白结构域或药剂)链接到单个免疫刺激融合蛋白复合体内的手段。
具体而言，制造将IL-7和IL-21结构域链接到IL-15N72D和IL-15RαSu/Fc链的构造物。一些情况下，或IL-7或IL-21多肽被链接到IL-15N72D和/或IL-15RαSu/Fc链的N端。其它情况下，IL-7或IL-21多肽被链接到IL-15N72D和/或IL-15RαSu/Fc链的N端。下文描述了包含融合到IL-7结合结构域和IL-21结合结构域的IL-15N72D:IL-15RαSu-Ig Fc支架的具体融合蛋白复合体。
1)生成包含IL-21/IL-15RαSu/Fc融合蛋白和IL-7/IL-15N72D融合蛋白的融合蛋白复合体。从UniProt网站获得人类IL-7序列和人类IL-21序列，并且通过Genewiz合成这些序列的DNA。具体而言，通过重叠PCR，制造直接将合成的IL-21序列链接到IL-15RαSu/Fc的N端的构造体包含链接至IL-15RαSu/Fc的N端的IL-21的构造体的核酸和蛋白序列显示如下。
IL-21/IL-15RaSu/Fc构造体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO:1)：
(信号肽)
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
(人类IL-21)
cagggccaggacaggcacatgatccggatgaggcagctcatcgacatcgtcgaccagctgaagaactacgtgaacgacctggtgcccgagtttctgcctgcccccgaggacgtggagaccaactgcgagtggtccgccttctcctgctttcagaaggcccagctgaagtccgccaacaccggcaacaacgagcggatcatcaacgtgagcatcaagaagctgaagcggaagcctccctccacaaacgccggcaggaggcagaagcacaggctgacctgccccagctgtgactcctacgagaagaagccccccaaggagttcctggagaggttcaagtccctgctgcagaagatgatccatcagcacctgtcctccaggacccacggctccgaggactcc
(人类IL-15Rαsushi结构域)
atcacgtgtcctcctcctatgtccgtggaacacgcagacatctgggtcaagagctacagcttgtactccagggagcggtacatttgtaactctggtttcaagcgtaaagccggcacgtccagcctgacggagtgcgtgttgaacaaggccacgaatgtcgcccactggacaacccccagtctcaaatgcattaga
(人类IgG1 CH2-CH3(Fc)结构域)
gagccgaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctcctggtaaa
IL-21/IL-15RaSu/Fc构造体(包括信号肽序列)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:2)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人类IL-21)
QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
(人类IL-15Rαsushi结构域)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
(人类IgG1 CH2-CH3(Fc)结构域)
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
一些情况下，完整的多肽裂解前导肽以生成可溶解或被分泌的成熟形式。
也通过重叠PCR将合成的IL-7序列链接到IL-15N72D的N端编码区而制造构造体。包含链接至IL-15N72D的N端的IL-7的构造体的核酸和蛋白序列显示如下。
IL-7/IL-15N72D构造体(包括前导序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO:3)：
(信号肽)
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
(人类IL-7)
gattgcgacatcgagggcaaggacggcaagcagtacgagagcgtgctgatggtgtccatcgaccagctgctggacagcatgaaggagatcggctccaactgcctcaacaacgagttcaacttcttcaagcggcacatctgcgacgccaacaaggagggcatgttcctgttcagggccgccaggaaactgcggcagttcctgaagatgaactccaccggcgacttcgacctgcacctgctgaaggtgtccgagggcaccaccatcctgctgaactgcaccggacaggtgaagggccggaaacctgctgctctgggagaggcccaacccaccaagagcctggaggagaacaagtccctgaaggagcagaagaagctgaacgacctgtgcttcctgaagaggctgctgcaggagatcaagacctgctggaacaagatcctgatgggcaccaaggagcat
(人类IL-15N72D)
aactgggttaacgtaataagtgatttgaaaaaaattgaagatcttattcaatctatgcatattgatgctactttatatacggaaagtgatgttcaccccagttgcaaagtaacagcaatgaagtgctttctcttggagttacaagttatttcacttgagtccggagatgcaagtattcatgatacagtagaaaatctgatcatcctagcaaacgacagtttgtcttctaatgggaatgtaacagaatctggatgcaaagaatgtgaggaactggaggaaaaaaatattaaagaatttttgcagagttttgtacatattgtccaaatgttcatcaacacttct
成熟IL-7/IL-15N72D融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:4)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人类IL-7)
DCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH
(人类IL-15N72D)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
一些情况下，完整的多肽裂解前导肽以生成可溶解或被分泌的成熟形式。
如先前所述，将IL-21/IL-15RαSu/Fc和IL-7/IL-15N72D构造体克隆岛表达载体中(美国专利8,507,222的实施例1，通过引用并入本文)，并且将该表达载体转染到CHO细胞中。两种构造体在CHO细胞中的共表达允许形成并分泌可溶性IL-7/IL-15N72D:IL-21/IL-15RαSu/Fc融合蛋白复合体(称为hIL7/IL21/TxM)。通过蛋白A亲和色谱和体积排阻色谱，从CJO细胞培养上清液中纯化hIL7/IL21/TxM蛋白，得到由IL-21/IL-15RαSu/Fc二聚体和IL-7/IL-15N72D融合蛋白组成的可溶性(非聚集)融合蛋白复合体(图2)。
对经蛋白A纯化的IL-7/IL-15N72D:IL-21/IL-15RαSu/Fc融合蛋白复合体的还原SDS-PAGE分析和免疫印迹分析显示在图3中。对于免疫印迹分析，通过还原SDS-PAGE在4％至12％的Bis-Tris凝胶上单离纯化的蛋白。使用Invitrogen iBlot2系统将拆分的蛋白带从凝胶转移到膜上。该膜使用以下探针化：1)山羊抗hIgG Fc抗体(一级)和兔抗山羊IgG-AP(二级)，用于检测含有人类Fc结构域的蛋白带；和2)生物素化的小鼠抗hIL15抗体(一级)和链霉亲和素-HRP(二级)，用于检测含有人类IL-15结构域的蛋白带。在使用适宜的底物(NBT/BCIP或TMB)培养之后，使用Millipore SNAP i.d.2.0蛋白检测系统检测探针试剂。观察到，SDS-PA凝胶和免疫印迹分析中对应于可溶性IL-21/IL-15RaSu/Fc蛋白和IL-7/IL-15N72D蛋白的带分别迁移到约54kDa和-38-45kDa(图3A和图3B).
IL-21/IL-15RaSu/Fc蛋白和IL-7/IL-15N72D蛋白的分子质量计算值分别为约49kDa和30kDa。为了评估分子质量的计算值与观测值间的差异，使用蛋白脱糖基混合液II(New England BioLabs对纯化的蛋白复合体执行脱糖基化。简单地说，将100μg蛋白复合体在1x脱糖基化混合缓冲液2中在75℃变性10分钟。冷却到室温后，将5μl的蛋白脱糖基化混合液II加入蛋白混合物中。在室温培养30分钟后，将蛋白在37℃脱糖基过夜。在脱糖基化反应之后，样品准备在还原考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE上分析。也分析了作为对照物的ALT-803、没有脱糖基化的hIL7/IL21/TxM蛋白、和蛋白脱糖基化混合液(含有脱糖基酶)。结果表明，对应于脱糖基化的IL-21/IL-15RaSu/Fc蛋白和IL-7/IL-15N72D蛋白的带分别迁移到约51kDa和30kDa，与分子质量计算值一致(图4)。这些发现证实，不如细胞产生的hIL7/IL21/TxM复合体的蛋白被糖基化。基于ELISA的方法证实了hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体的形成。在图5中，使用huIgG1/IL15特异性ELISA，用捕获抗体、抗人类IL-15抗体(MAB647,R&DSystems)和检测抗体(辣根过氧化物酶偶联抗人类IgG抗体)检测来自被转染的CHO细胞的培养物上清液中的IL-7/IL-15N72D:IL-21/IL-15RaSu/Fc融合蛋白复合体。将其与已知浓度的相似细胞因子TxM融合蛋白复合体(hIL18/IL12/TxM)比较。将来自hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体的信号与hIL18/IL12/TxM对照物的信号比较，以估计该融合蛋白浓度。
使用针对人类IgG(GAH)和IL-15的捕获抗体和探针抗体以及IL7抗体和IL15抗体的组合、IL21抗体和IL15抗体的组合、IL7和IL21抗体的组合，对纯化的hIL7/IL21/TxM执行类似的ELISA(图6)。在这些试验中，使用hIL18/IL12/TxM和ALT-803作为对照物。这些试验的结果表明，可在CHO细胞中产生可溶性IL-7/IL-15N72D、IL-21/IL-15RaSu/Fc蛋白，并且可形成hIL7/IL21/TxM融合蛋白并将其分泌到培养基中。可纯化所分泌的蛋白，并且融合蛋白复合体保持完整。
实施例2：hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体活性的体外表征
为了表征hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体的IL-15免疫刺激活性，评估了IL-15依赖性32Dβ细胞(一种小鼠造血细胞系)的增殖。将递增水平的hIL7/IL21/TxM加入处于200μLIMDM:10％FBS培养基中的32Dβ细胞(104个细胞/孔)中，并将细胞在37℃培养3天。随后加入普雷斯托蓝细胞活力试剂(20μL/孔)。4小时后，测量在570nm的吸收(使用600nm参考波长进行归一化)以基于代谢活性细胞对普莱斯托蓝的还原(一种基于刃天青的解决方案)来测定细胞增殖。评估IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc复合体(ALT-803)的生物活性作为阳性对照。如图7中所示，hIL7/IL21/TxM能促进32Dβ细胞的细胞增殖，从而证明IL-15活性。hIL7/IL21/TxM的活性较之于ALT-803有所降低，可能是由于IL-7链接至IL-15N72D结构域。
为了演示每种细胞因子(IL-7、IL-21和IL-15)的个体活性，通过使用蛋白研发了基于流式细胞分析的分子内磷蛋白检验，其中所述蛋白质响应通过每种细胞因子进行的受体信号传导而得以独特地磷酸化(IL-7：Stat5，IL-21：Stat3，以及IL-15：Stat5)。为了测试IL-7活性，在具有4mM L-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氢钠、0.05mM 2-巯基乙醇、1ng/ml小鼠白介素-7和20％FBS埃斯科韦改良杜尔贝科培养基(Iscove's modified Dulbecco's medium(IMDM))中培养小鼠2E8细胞系。对于基于磷-流式细胞分析的Stat5检验，将细胞在IMDM中洗涤两次，并在37℃、5％CO2培养器中在不含IL-7的完全培养基中以0.5x 106个/ml培养过夜。次日，用IMDM洗涤细胞并计数。
通过用流式细胞术测量磷-Stat5在32Dβ细胞系中测量IL-15活性。将32Dβ细胞在具有2ng/ml人类IL-2和10％FBS的IMDM中培养。对于基于磷-流式细胞分析的Stat5检验，将细胞在IMDM中洗涤两次，并在37℃、5％CO2培养器中在不含IL-7的完全培养基中以0.5x 106个/ml培养过夜。次日，用IMDM洗涤细胞并计数。
通过用流式细胞术测量磷-Stat3(727)在纯合的人类T细胞中测量IL-21活性。从血库获得新鲜的人类白细胞，并且使用RosetteSep/人类CD3+T细胞试剂(StemCellTechnologies)单离CD3+T细胞。CD3+T细胞的纯度为>95％。在以2mM L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素和10％FBS补充的RPMI 1640中培养细胞。
将细胞(0.25x 106个/管)种植在FACS管中以测试每种细胞因子的活性。在37℃、5％CO2培养器中，用单独或组合使用的相同浓度的IL-7(100ng)、IL-21(100ng)和ALT-803(100ng)或用hIL7/IL21/TxM(1000-62.5ng/mL)刺激细胞15分钟。将培养基和细胞因子的最终体积调节至100μL。培养15分钟后，以1.6％的最终浓度加入多聚甲醛(Sigma)，将细胞在暗处在室温下再培养10分钟。随后，通过在室温下以1500rpm离心5分钟而用1mL的FACS缓冲液(PBS、0.5％BSA、0.1％NaN3)洗涤细胞。通过轻柔地涡旋将细胞团块重新悬浮在100μl的冷藏100％甲醇中。将细胞在4℃进一步培养30分钟，随后用1mL的FACS缓冲液洗涤。随后将细胞团块重新悬浮在含有用以测试IL-7和IL-15活性的磷-Stat5 Alexa-Fluro-488抗体(BD Bioscience)或用以测试IL-21活性的磷-Stat3 Alexa-Fluro-488抗体(BDBioscience)的50μl FAC缓冲液中。在室温下在暗处培养30分钟后，用1mL的FACS缓冲液洗涤细胞，重新悬浮在300μL的FACS缓冲液中，并通过流式细胞术分析。
使用1μg/mL(6.3nM)hIL7/IL21/TxM对小鼠2E8细胞或纯化的人类T细胞(>95％CD3+)或32Dβ细胞进行短期刺激之后，得到与使用重组IL-7(107ng/mL；6.3nM)、IL-21(112ng/mL；6.3nM)和ALT-803(15.12ng/mL；6.3nM)所见者类似的应答(图8A至8F)。这些结果表明，hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体的每一个细胞因子结构域保留其特异性免疫刺激生物学活性。
已知IL-7、IL-21和IL-15活性的组合在通过天然T细胞诱导IFN-γ产生方面比单独使用的这些细胞因子中的任一个都有效。为了评估hIL7/IL21/TxM复合体的组合细胞因子活性，用hIL7/IL21/TxM复合体(6.3nM)；IL-7(6.3nM)、IL-21(6.3nM)和ALT-803(6.3nM)的组合；或单独使用的每种细胞因子培养纯化的T细胞。3天后，通过ELISA方法测定培养物上清液中的IFN-γ水平。如图9中所示，在组合的个体细胞因子IL-7+IL-21+ALT-803的存在下，纯化的T细胞诱导了IFN-γ产生。然而，当在hIL7/IL21/TxM复合体的存在下偏移时，天然T细胞产生了高水平的IFN-γ。这些结果证实，hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体表现出预期的IL-7、IL-21和IL-15细胞因子组合的免疫刺激活性。
实施例3：纯化的天然T细胞、CD3+T细胞和CD8+T细胞在使用hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体刺激后的增殖
以往的研究已经显示，在IL-7、IL-15和IL-21的存在下，可有效诱导T细胞的增殖。为了评估hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体促进T细胞增殖的能力，使用RosetteSep人类天然CD8+T细胞试剂盒(STEMCELL Technology)从来自两位健康供体的血液中单离人类天然T细胞(1x105个细胞/ml)。将这些细胞(>85％CD3+)用hIL7/IL21/TxM或个体重组IL-7、IL-21和ALT-803的组合培养2至5天。通过普雷斯托蓝评估细胞因子刺激的天然T细胞的增殖，并通过流式细胞术分析。结果表明，hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体能以类似于或大于IL-7、IL-21和IL-15的组合的程度诱导纯化的天然T细胞增殖到(图10A和10B显示来自2位不同供体的结果，图10C显示72小时的时间点的平均结果)。因此，使用hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体刺激可诱导纯化的天然T细胞的增殖。
同样，通过使用IL-7、IL-15和IL-21刺激纯化的T细胞，可以间接体内方式诱导提高的T细胞增殖。为了评估hIL7/IL21/TxM促进T细胞增殖的能力，使用hIL7/IL21/TxM或独立重组IL-7、IL-21和ALT-803的组合将纯化的CFSE标记的人类T细胞(>90％CD3+，经由RosetteSepTM人类CD8+T细胞富集鸡尾酒混合物纯化)(1x105个细胞/ml)刺激7天，并通过流式细胞术评估细胞因子诱导的T细胞增殖。结果表明，hIL7/IL21/TxM复合体能以好于IL-7、IL-21和IL-15的组合的程度诱导纯化的T细胞的增殖(图11)。
在进一步的研究中，用hIL7/IL21/TxM或独立重组IL-7、IL-21和ALT-803的组合刺激CellTrace紫标记的人类CD8+T细胞(>90％CD8+，经由RosetteSepTM人类CD8+T细胞富集鸡尾酒混合物纯化)(2.5x105个细胞/ml)。7天后，收集细胞进行计数，并使用抗体染色以确定T细胞表型。与使用ALT-803(10nM)、IL-7(25ng/mL)和IL-21(25ng/mL)的混合物(3.9倍)或单独使用ALT-803(10nM)(2.5倍)相比，使用10nMhIL7/IL21/TxM刺激7天后，人类CD8+T细胞的扩张最大(4.6倍)(图12)。在单独使用培养基中生长的细胞未显示扩张。
使用流式细胞术评估经历细胞增殖的CD8 T细胞的表型，如通过CellTrace紫稀释而测定的(即，每个具有各分裂的细胞信号减少)(图13)。结果证实该倍数扩张数据，使得在使用hIL7/IL21/TxM培养的人类CD8+T细胞时所见的细胞增殖水平高于使用ALT-803、IL-7和IL-21的混合物培养的细胞或单独使用ALT-803培养的细胞。没有观察到在单独使用的培养基中生长的细胞的增殖。表达CD45RO、CCR7和CD95的CD8+T细胞在使用hIL7/IL21/TxM培养后显示显著的增殖。在具有低CCR7和CD62L的CD8+T细胞中也观察到增殖，而具有高CD45RA的细胞在使用hIL7/IL21/TxM激活后虽然增殖但增殖程度较低或转化为CD45RO表型。结果表明，CD8+中枢记忆T细胞以及CD8+效应子记忆T细胞的增殖由hIL7/IL21/TxM诱导，并且增殖水平大于使用ALT-803+IL-7+IL-21组合时所见。
实施例4：通过hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体进行不同的人类CD8+T细胞子集的体外扩张
为了评估不同的人类CD8+T细胞的体外扩张，从血库接收血沉棕黄层。使用RosetteSepTM人类CD8阴性选择试剂盒(STEMCELLTechnologies)单离总CD8 T细胞。富集CD8T细胞之后，使用以下标记物通过流式细胞术分选天然、中枢记忆、效应子记忆和记忆干CD8T细胞子集。天然CD8+T细胞表现为活体CD8+、CCR7+、CD45RO-和CD95-细胞。CD8+T效应子记忆细胞表现为活体CD8+、CCR7-和CD45RO+细胞。CD8+T中枢记忆细胞表现为活体CD8+、CCR7+和CD45RO+细胞。CD8+T记忆干细胞表现为活体CD8+、CCR7+、CD45RO-和CD95+细胞。检查所分选的细胞的纯度(即，如果>95％的细胞具有所希望的表型，则样品视为纯的)。
根据每个制造商的使用说明书，用CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯r)(MolecularProbes)标记所分选的不同细胞集落。在37℃和5％CO2下，在96孔平底板中，在200μL培养基中，用单独的培养基、IL-7+IL-21(各25ng)、IL7(25ng)+ALT-803(144ng)、IL21(25ng)+ALT-803(144ng)、IL7(25ng)+IL21(25ng)+ALT-803(144ng)、或hIL7/IL21/TxM(1.4μg)刺激CFSE标记的CD8+T细胞子集。7天后，通过用2％FBS-PBS洗涤每孔四次并将洗涤液收集在试管内，从各孔收获细胞。通过以1500RPM离心5分钟，使用2％FBS-PBS再洗涤所收获的细胞一次。将细胞重新悬浮在100μL的％FBS-PBS中，取10μL，使用0.4％台盼蓝以1:1稀释之后，通过血细胞计数器对细胞计数。在使用细胞因子或hIL7/IL21/TxM复合体培养7天后，测定细胞数以评估纯化的CD8+T细胞子集的扩张。结果表明，与单独使用培养基培养或使用两种所测试细胞因子的组合培养相比，使用hIL7/IL21/TxM融合蛋白处理能增加天然、中枢记忆、效应子记忆和记忆干CD8+T细胞子集的扩张。此外，体在CD8+T细胞中枢记忆子集和效应子记忆子集的集落扩张中，hIL7/IL21/TxM复合比IL-7、IL-21和ALT-803的组合更有效(图14)，与使用未分选的人类CD8+T细胞所见一致。
除了扩张之外，也通过流式细胞术基于CSFE稀释评估了人类CD8+T细胞子集的增殖。对于这一分析，剩余细胞使用1ml FACS缓冲液洗涤一次，并且使用抗CD45RO、CD95、CCR7和CD8抗体对细胞染色(对于2μL的每个样品，在FACS中处理30分钟)。在室温下在暗处放置30分钟后，细胞用1mL FACS缓冲液洗涤一次，重新悬浮在300μL FACS缓冲液中。通过流式细胞术门控分析不同子集的细胞集落。天然CD8+T细胞表现为活体CD8+、CCR7+、CD45RO-和CD95-细胞。CD8+T效应子记忆细胞表现为活体CD8+、CCR7-和CD45RO+细胞。CD8+T中枢记忆细胞表现为活体CD8+、CCR7+和CD45RO+细胞。CD8+T记忆干细胞表现为活体CD8+、CCR7+、CD45RO-和CD95+细胞。基于CSFEE稀释，评估每个集落的增殖。见图15。这一研究证实，hIL7/IL21/TxM诱导了每个人类CD8 T细胞子集的增殖，而在培养基对照细胞中观察到极少的增殖或没有增殖。与包括ALT-803+IL-7+IL-21组合在内的全部其它条件相比，最高水平的增殖见于使用hIL7/IL21/TxM培养后的CD8+T细胞中枢记忆子集和效应子记忆子集中。
实施例5：在使用hIL7/IL21/TxM融合蛋白复合体刺激后，纯化的NK细胞的增殖、细胞毒性和激活增加
也评估了hIL7/IL21/TxM影响人类NK细胞增殖和激活的能力。NK细胞是使用StemCell RosetteSepTM人类NK细胞富集鸡尾酒混合物纯化的人类白细胞。将纯化的NK细胞(>90％纯度)以2x 106个细胞/mL种植在24孔板中的含有50nM hIL7/IL21/TxM、50nMhIL18/IL12/TxM(对照物)或10nM ALT-803(对照物)的培养基中。3天后，计数细胞，并以0.5x 106个细胞/mL重新种植在含有10nM hIL7/IL21/TxM或10nM ALT-803(对照物)的培养基中。再3天后，再一次以0.5x 106个细胞/mL重新种植在含有10nM hIL7/IL21/TxM或10nMALT-803(对照物)的培养基中。10天后，收获细胞，评估其增殖和细胞表型，并且测试其对抗K562靶点细胞的细胞毒性。
这一研究的结果表明，无论用于最初刺激(第1至3天)的细胞因子是哪一种，hIL7/IL21/TxM向纯化的人类NK细胞扩张提供比ALT-803更好的细胞因子支持(第4至10天)，使得大多数NK细胞培养物在含有hIL7/IL21/TxM的培养基中生长4至10天后，在第10天显示大于10倍的扩张(图16)。基于使用NKp46和CD25抗体的流式细胞术染色，hIL7/IL21/TxM支持的NK细胞显示与在使用hIL18/IL12/TxM短期培养并随后进行ALT-803细胞因子支持后所观察到的细胞因子诱导的记忆样(CIMK)NK细胞相当的激活CD25+表型(图17)。
使用K562细胞，在4小时的杀死试验中评估这些细胞的细胞毒活性。简单地说，用Celltrace紫(CVT)标记K562靶点细胞，使用扩张的人类NK效应子细胞以2.5:1(效应子:靶点)比率共培养4小时。收获细胞，洗涤，重新悬浮在含有2μg/mL碘化丙啶的RPMI中。通过碘化丙啶和CTV的共染色测量肿瘤细胞裂解液。通过从未与NK细胞共培养的孔减去K562细胞的任何背景死亡来计算特异性杀死的百分比。与最初接受hIL18/IL12/TxM刺激并随后进行hIL7/IL21/TxM或ALT-803细胞因子支持的那些相比，最初用hIL7/IL21/TxM刺激3天并随后使用hIL7/IL21/TxM或ALT-803进行细胞因子支持的人类NK细胞显示更好的对抗K562细胞的细胞毒性(图18)。由于这些细胞的激活表型在CD25染色时看起来是相当的，因此这一结果令人惊奇。这些发现一起表明，hIL7/IL21/TxM在诱导人类NK细胞增殖方面非常有效，导致具有提高的细胞毒活性的激活表型。
执行其它研究，以进一步表征hIL7/IL21/TxM诱导NK细胞的对抗人类肿瘤细胞的细胞毒性的能力。将来自2位不同供体的纯化的新鲜人类NK细胞与CellTrace紫标记的人类TF阳性胰腺癌SW1990细胞以2:1的效应子：靶点(E:T)比率混合40小时。加入50nM的ALT-803或hIL7/IL21/TxM，以激活人类NK细胞，其中单独使用的培养基用作对照。在一些培养物中，加入0.1nM的人源化抗人类组织因子抗体IgG1(hOAT)以诱导ADCC。在培养期间结束时，通过使用碘化丙啶染色并随后进行流式细胞分析来测定死亡的紫色标记的SW1990细胞的百分比(图19)。单独使用hIL7/IL21/TxM刺激之后，人类NK细胞表现出比ALT-803或对照培养基显著的对SW1990肿瘤细胞的细胞毒性。这些结果与使用hIL7/IL21/TxM刺激的NK细胞对抗K562靶点所观察到的提升的细胞毒性一致。加入抗TF抗体导致TF阳性肿瘤细胞的NK介导的ADCC进一步提升，再一次地，使用hIL7/IL21/TxM刺激的NK细胞显示最高的细胞毒性。这些发现表明，hIL7/IL21/TxM提供人类NK细胞的强烈激活，导致其对抗肿瘤细胞的天然杀伤力和ADCC提升。
为了评估hIL7/IL21/TxM的可能作用机制，通过ELISA使用上述NK细胞/SW1990肿瘤细胞培养物的上清液测定IFNγ水平。在含有hIL7/IL21/TxM的NK cell/SW1990细胞培养物中发现升高的IFNγ水平，而在ALT-803或对照培养基的情况下极少或没有见到IFNγ(图20)。通过将抗TF抗体加入hIL7/IL21/TxM刺激的细胞中而进一步诱导IFNγ释放，但在ALT-803或对照培养基的情况下这一现象的程度低得多或根本没有。结果表明，hIL7/IL21/TxM在诱导NK细胞IFNγ产生方面非常有效，这可通过加入ADCC抗体进一步提高。
也评估了hIL7/IL21/TxM对于颗粒酶B的人类NK细胞表达的影响。在具有50nMhIL7/IL21/TxM、50nM ALT-803或对照培养基的RPMI-10培养基中，将来自2位不同供体的纯化的人类NK细胞(4x 106个细胞/孔)培养16小时。随后使用FITC偶联抗颗粒酶B抗体对NK细胞进行细胞内染色，并通过流式细胞术分析颗粒酶的水平(MFI：平均荧光强度)。在hIL7/IL21/TxM中培养导致了NK细胞中颗粒酶B的水平增加2.8至5.3倍，而在经ALT-803处理的NK细胞中仅观察到轻微增加(1.1至1.4倍)。见图21。这些发现进一步示例性说明了hIL7/IL21/TxM提升人类NK细胞的细胞毒潜力的能力。
实施例6：IL-7/IL-21/TxM复合体以及IL-7/IL-21/TxM刺激的免疫细胞的过继细胞转移对于衰老细胞以及衰老细胞和年龄相关病理的体外和体内活性
如上所示，衰老细胞在器官和组织中的蓄积与年龄相关疾病有关。已经研发了方法来评估用于在体外和体内减少衰老细胞及它们的相关病理的治疗策略。为了评估hIL7/IL21/TxM复合体的活性，通过该领域中已知的方法在体外生成衰老细胞。简单地说，使人类二倍体成纤维细胞IMR-90和WI38(ATCC,Manassas,VA,USA)、人类包皮生纤维细胞BJ(ATCC,Manassas,VA,USA)和原发性人类肝肌纤维母细胞(激活的肝星状(HS)细胞)在标准条件(即，以10％FCS、1％L-谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素补充并保持在37℃和7.5％CO2下的DMEM)下生长。通过用依托泊苷(Etoposide)(100μM，Sigma)处理正在生长的细胞48小时，生成DNA受损所致的衰老(DIS)细胞。在移除依托泊苷7天后的细胞视为衰老的。另选地，通过使用mCherry-H-Rasv12(或作为对照的mCherry)进行IMR-90细胞的逆转录病毒感染，实现致癌基因所致的衰老，并将感染结束7天后的细胞视为衰老的。也可通过用0.1μM阿霉素(Doxorubicin)处理两次将IMR-90细胞诱导为衰老，两次处理间隔2天，并在7天后分析a。此类细胞是化疗所致衰老的代表。衰老细胞表达升高水平的β-半乳糖苷酶，其可作为免疫组化(IHC)生物标记物检验，以检测体外和组织内的这些细胞(Dimri et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1995；92,9363-9367)。衰老细胞的其它可检测生物标记物包括p16ink4a、IL-1α(早期SASP因子)和IL-6(晚期SASP因子)(Baar et al.Cell.2017；169,132-47)。
人类NK细胞系(即，NK-92)和纯化的人类NK细胞对抗衰老细胞的的细胞毒活性将在体外评估。简单地说，将生长中的或DIS IMR-90靶点细胞(或生长中的或DIS WI38、BJ或HS细胞)以5x 105每孔植入12孔板中；后续将10x 105的NK-92或纯化的NK细胞加入每孔中。共培养2小时后，轻柔地洗涤非粘附性NK细胞，并基于根据制造商的使用说明书使用普雷斯托蓝(Presto Blue)(Life Technologies,CA,USA)(或PI或结晶紫染色)对剩余粘附性靶点细胞定量而测定细胞毒性。基于已出版的结果(见，例如，Sagiv,et al.Oncogene 2013；32,1971-1977)，预计DIS细胞对于E:T比率范围内的NK细胞介导的细胞毒性比生长中的细胞更为敏感。为了评估这一模型中hIL7/IL21/TxM复合体对于免疫细胞活性的效，使用各种浓度的hIL7/IL21/TxM复合体或单独或组合的IL-7、IL-21和ALT-803培养人类NK细胞系(即，NK-92)和纯化的人类NK细胞。随后，如上所述，使用生长中的或DIS靶点细胞以各种E:T比率共培养激活的NK细胞，并且确定NK介导的对抗DIS靶点的细胞毒性。预计用hIL7/IL21/TxM复合体激活的NK细胞将会表现出比未处理的NK细胞对照物更强的对抗DIS细胞的细胞毒性。也将评估hIL7/IL21/TxM处理的NK细胞对抗生长中的和DIS靶点的选择性。预计这些研究的结果表明，hIL7/IL21/TxM是有效的“促衰老”药剂(定义为可在对正常细胞损害最小的情况下降低衰老细胞水平的药剂)。此外，hIL7/IL21/TxM处理的NK细胞，包括过继转移的细胞，被预期表现出促衰老活性。使用T细胞进行相似的研究，以表明hIL7/IL21/TxM复合体刺激对抗DIS靶点细胞的免疫应答的活性。
在动物模型中，评估IL-7/IL-21/TxM复合体对于衰老细胞和年龄相关疾病的效果。先前已经显示，阿霉素治疗在小鼠体内诱导衰老，导致体重减轻、肝脏中衰老细胞的水平增加以及肝功能的下降，如通过天冬氨酸胺基转移酶(AST)的血浆水平上升所测(Baaret al.Cell.2017；169,132-47)。为了评估IL-7/IL-21/TxM复合体在这一模型中的效果，在第0天和第10天腹腔注射10mg/kg阿霉素治疗10至40周龄C57BL6小鼠，以诱导衰老和肝损伤。未治疗的小鼠用作对照。随后用各种剂量的IL-7/IL-21/TxM复合体(小鼠型或人类用型)或单独或组合使用的IL-7、IL-21或ALT-803治疗小鼠。PBS用作对照治疗。从第24天开始，通过静脉内或皮下途径每周进行一次或两次该治疗。体重测量贯穿整个治疗期间。在第38天，牺牲动物，并使用AST活性分析试剂盒(Sigma)评估血浆AST水平。也评估肝脏切片的组织学，并使用上述生物标记物通过IHC评估衰老细胞的存在。通过使用检测具体免疫细胞子集的抗体和激活/细胞毒性标记物的流式细胞术并通过使用血清细胞因子水平的方法，评估对于血液、脾脏和肝脏中的免疫细胞(即，NK细胞和T细胞以及子集)的治疗效果。使用上述方法，将确定经治疗刺激的免疫细胞(即，来自血液或脾脏)对抗衰老细胞的功能活性。与PBS对照组相比，预计IL-7/IL-21/TxM复合体的给药减少在使用阿霉素治疗后的小鼠中观察到的体重减轻。在用阿霉素治疗的小鼠中，预计通过IL-7/IL-21/TxM疗法也降低血浆AST水平以及肝脏中衰老细胞和病灶的发生率。通过IL-7/IL-21/TxM进行的免疫应答的相应激活将提供支持免疫介导的作用机制的证据。将IL-7/IL-21/TxM的治疗效果与单独或组合使用的IL-7、IL-21或ALT-803比较，预计将会表明IL-7/IL-21/TxM疗法的抗衰老活性更强。
除了评估IL-7/IL-21/TxM直接注射之外，也将在阿霉素治疗的C57BL6小鼠模型中评估过继转移的IL-7/IL-21/TxM刺激的NK或T细胞的抗衰老活性。在这一研究中，将如上所述使用阿霉素治疗小鼠，并且在第24天，将已经使用IL-7/IL-21/TxM复合体(小鼠型或人类用型)或单独或组合使用的IL-7、IL-21或ALT-803进行间接体内治疗的NK细胞或T细胞过继转移到小鼠体内。在一些组中使用IL-7/IL-21/TxM或细胞因子进一步治疗小鼠，以提供对于过继转移细胞的细胞因子支持。如上所述，评估对于免疫应答、体重、以及阿霉素所致肝脏衰老和损伤的治疗效果。预计IL-7/IL-21/TxM刺激的NK或T细胞的过继转移将向具有阿霉素所致衰老的小鼠提供显著的治疗有益效果。
在自然变老的小鼠体内，进行对IL-7/IL-21/TxM疗法和IL-7/IL-21/TxM刺激的NK或T细胞的过继细胞转移的进一步研究。如上所述，向115至130周龄(老年)或26周龄(青年)C57BL6小鼠进行长达4周的IL-7/IL-21/TxM复合体或单独或组合使用的IL-7、IL-21或ALT-803的给药。另选地，在如上所述的老年和青年小鼠体内评估过继转移的IL-7/IL-21/TxM刺激的NK或T细胞的活性。如先前所述，在整个治疗期间评估体重的变化、毛密度的变化和小鼠对于刺激的应答能力的变化(Baar et al.Cell.2017；169,132-47)。此外，分别使用QuantiChrom尿素检验试剂盒(Gentaur)和肌酸酐检验试剂盒(Sigma)测量在治疗之前和之后采集的样品中尿素和肌酸酐的血浆水平，作为对年龄相关的肾功能丧失的评估。如上所述，也评估肾脏切片中衰老细胞的存在。与PBS对照组相比，预计IL-7/IL-21/TxM复合体的给药将缓解老年小鼠的毛密度和活动度的年龄相关的下降。也预计使用IL-7/IL-21/TxM疗法将会减少老年小鼠的血浆尿素和肌酸酐水平以及肾脏中衰老细胞的发生率。预计在接受过继转移的IL-7/IL-21/TxM刺激的NK或T细胞的老年小鼠体内有类似的治疗有益效果。总体而言，预期这些研究的结果显示，使用IL-7/IL-21/TxM复合体和过继转移的IL-7/IL-21/TxM刺激的NK或T细胞治疗下体内外表现出促衰老活性并减轻衰老细胞和年龄相关的病理。
其它等效物
尽管本发明已经结合其详细说明书得以描述，但前述说明书旨在示例性说明而非限制本发明的范畴，所述范畴应由所附权利要求书的范畴界定。其它方面、优点和修饰处于所附权利要求书的范畴内。
本文中所指的专利和科学文献构成该领域技术人员可获得的知识。本文所引的全部美国专利和公布或未公布的美国专利通过引用并入本文。本文所引的全部公布的外国专利和专利申请通过引用并入本文。本文所引的以登录号指示的Genbank和NCBI提交文件通过引用并入本文。本文所引的全部其它已出版参考文献、文档、手稿和科学演讲通过引用并入本文。
尽管本发明已经参考其优选实施方案得以具体显示和描述，但该领域技术人员应理解，可对其作出各种形式和细节上的改变而不背离由所附权利要求书涵盖的范畴。

Claims (2)

1.一种单离的可溶性融合蛋白复合体，其由以下所组成：
至少两个可溶性蛋白，其由以下所组成：
a)第一可溶性蛋白，其包含白介素-15(IL-15)多肽结构域，其中所述第一可溶性蛋白由如SEQ ID NO:4的肽所组成，和
b)第二可溶性蛋白，其包含融合至免疫球蛋白Fc结构域的可溶性IL-15受体αsushi结合结构域(IL-15RαSu)，其中所述第二可溶性蛋白由如SEQ ID NO:2的肽所组成，以及
其中所述第一可溶性蛋白的所述IL-15结构域结合至所述第二可溶性蛋白的所述IL-15RαSu结构域以形成可溶性融合蛋白复合体。
2.根据权利要求1所述的可溶性融合蛋白复合体，其中通过将第一可溶性融合蛋白复合体的Fc结构域链接至第二可溶性融合蛋白复合体的Fc结构域的二硫键，所述第一可溶性融合蛋白复合体共价地链接至所述第二可溶性融合蛋白复合体以形成二体。
CN201880070462.7A 2017-08-28 2018-08-28 基于il-15的与il-7和il-21的融合体 Active CN111655716B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762551218P 2017-08-28 2017-08-28
US62/551,218 2017-08-28
PCT/US2018/048365 WO2019046313A1 (en) 2017-08-28 2018-08-28 IL-15 BASED FUSIONS WITH IL-7 AND IL-21

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111655716A CN111655716A (zh) 2020-09-11
CN111655716B true CN111655716B (zh) 2024-03-08

Family

ID=65526059

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880070462.7A Active CN111655716B (zh) 2017-08-28 2018-08-28 基于il-15的与il-7和il-21的融合体

Country Status (8)

Country Link
US (3) US11161890B2 (zh)
EP (1) EP3676289A4 (zh)
JP (1) JP2020533971A (zh)
KR (1) KR20200090742A (zh)
CN (1) CN111655716B (zh)
AU (1) AU2018323455B2 (zh)
CA (1) CA3074635A1 (zh)
WO (1) WO2019046313A1 (zh)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108948177B (zh) * 2007-05-11 2022-04-22 阿尔托生物科学有限公司 融合分子与il-15变异体
EP3572502B1 (en) * 2017-01-20 2023-01-11 Kyoto University Method for producing cd8alpha +beta + cytotoxic t cells
WO2019046313A1 (en) 2017-08-28 2019-03-07 Altor Bioscience Llc IL-15 BASED FUSIONS WITH IL-7 AND IL-21
AU2019328313A1 (en) 2018-08-30 2021-02-25 HCW Biologics, Inc. Single-chain chimeric polypeptides and uses thereof
CN112996805A (zh) 2018-08-30 2021-06-18 Hcw生物科技公司 多链嵌合多肽和其用途
WO2020047473A1 (en) 2018-08-30 2020-03-05 HCW Biologics, Inc. Single-chain and multi-chain chimeric polypeptides and uses thereof
CN111825770B (zh) * 2019-04-16 2023-06-09 成都医学院 长效白介素21-Fc融合蛋白及其用途
US11738052B2 (en) 2019-06-21 2023-08-29 HCW Biologics, Inc. Multi-chain chimeric polypeptides and uses thereof
GB201909144D0 (en) 2019-06-25 2019-08-07 Autolus Ltd Culture medium
EP4021928A4 (en) * 2019-08-29 2023-09-20 NantBio, Inc. MODIFIED N-810 AND ASSOCIATED METHODS
TW202136287A (zh) 2019-12-17 2021-10-01 法商Ｏｓｅ免疫治療公司 包含il-7變體之雙官能分子
IL298608A (en) * 2020-06-01 2023-01-01 Hcw Biologics Inc Methods for treating disorders related to aging
WO2021247003A1 (en) * 2020-06-01 2021-12-09 HCW Biologics, Inc. Methods of treating aging-related disorders
GB202008957D0 (en) 2020-06-12 2020-07-29 Autolus Ltd Culture medium
EP4351320A1 (en) 2021-06-09 2024-04-17 ImmunityBio, Inc. Methods and systems for producing a protein of interest in a plant
CN113549158B (zh) * 2021-07-19 2022-10-21 广州百暨基因科技有限公司 包含突变型il15以及嵌合抗原受体的融合蛋白
WO2023212056A2 (en) * 2022-04-27 2023-11-02 Asher Biotherapeutics, Inc. Combination of cytokine fusion proteins with cd8 antigen binding molecules
WO2024040132A2 (en) * 2022-08-16 2024-02-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Servic Synergistic interactions for improved cancer treatment
CN117050178B (zh) * 2023-10-13 2024-01-12 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 特异性检测il-7的抗体及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100303811A1 (en) * 2008-06-16 2010-12-02 Atsuo Ochi Recombinant multiple domain fusion protein mitogens and use thereof for inducing enhancement or repression of antigen-specific immunity.
US20140242025A1 (en) * 2010-09-21 2014-08-28 Altor Bioscience Corporation Multimeric il-15 soluble fusion molecules and methods of making and using same
CN104109200A (zh) * 2007-05-11 2014-10-22 阿尔托生物科学有限公司 融合分子与il-15变异体

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
WO1994004689A1 (en) 1992-08-14 1994-03-03 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Recombinant toxin with increased half-life
US5747654A (en) 1993-06-14 1998-05-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant disulfide-stabilized polypeptide fragments having binding specificity
US5541087A (en) 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US5534592A (en) 1995-09-22 1996-07-09 The Goodyear Tire & Rubber Company High performance blend for tire treads
WO1997034631A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
AU2004289316B2 (en) 2003-11-10 2011-03-31 Altor Bioscience Corporation Soluble TCR molecules and methods of use
US9724393B2 (en) * 2015-10-06 2017-08-08 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Method for treatment of metastatic and refractory cancers and tumors with an inducer that overcomes inhibition of T cell proliferation
AU2017345791B2 (en) 2016-10-21 2020-10-22 Altor Bioscience Corporation Multimeric IL-15-based molecules
WO2019046313A1 (en) 2017-08-28 2019-03-07 Altor Bioscience Llc IL-15 BASED FUSIONS WITH IL-7 AND IL-21

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104109200A (zh) * 2007-05-11 2014-10-22 阿尔托生物科学有限公司 融合分子与il-15变异体
US20100303811A1 (en) * 2008-06-16 2010-12-02 Atsuo Ochi Recombinant multiple domain fusion protein mitogens and use thereof for inducing enhancement or repression of antigen-specific immunity.
US20140242025A1 (en) * 2010-09-21 2014-08-28 Altor Bioscience Corporation Multimeric il-15 soluble fusion molecules and methods of making and using same
CN105017429A (zh) * 2010-09-21 2015-11-04 阿尔托生物科学有限公司 多聚体il-15可溶性融合分子与其制造与使用方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Interleukin (IL)-21 and IL-15 Genetic Transfer Synergistically Augments Therapeutic Antitumor Immunity and Promotes Regression of Metastatic Lymphoma";Tsunao Kishida et al.;《MOLECULAR THERAPY》;第8卷(第4期);第552-558页 *
"真核表达重组小鼠IL-15/Fc融合蛋白的制备和活性鉴定";孔祥丽等;《华西药学杂志》;第23卷(第6期);第639-642页 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2018323455B2 (en) 2022-02-03
WO2019046313A1 (en) 2019-03-07
US11161890B2 (en) 2021-11-02
CA3074635A1 (en) 2019-03-07
US20220033455A1 (en) 2022-02-03
US20240076340A1 (en) 2024-03-07
US11965007B2 (en) 2024-04-23
JP2020533971A (ja) 2020-11-26
CN111655716A (zh) 2020-09-11
EP3676289A1 (en) 2020-07-08
KR20200090742A (ko) 2020-07-29
EP3676289A4 (en) 2021-05-05
AU2018323455A1 (en) 2020-03-19
US20190300591A1 (en) 2019-10-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111655716B (zh) 基于il-15的与il-7和il-21的融合体
CN110785435B (zh) 与il-12和il-18的基于il-15的融合物
CN109496217B (zh) 具有cd3结合域的基于多聚体il-15的分子的构造和表征
JP2019533449A (ja) 多量体ｉｌ−１５に基づく分子

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant