FI119514B - Menetelmä lipolyyttisen entsyymin muunnoksen valmistamiseksi - Google Patents

Menetelmä lipolyyttisen entsyymin muunnoksen valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI119514B
FI119514B FI963266A FI963266A FI119514B FI 119514 B FI119514 B FI 119514B FI 963266 A FI963266 A FI 963266A FI 963266 A FI963266 A FI 963266A FI 119514 B FI119514 B FI 119514B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
lipase
enzyme
lipolytic
bacillus
cell
Prior art date
Application number
FI963266A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI963266A (fi
FI963266A0 (fi
Inventor
Allan Svendsen
Ib Groth Clausen
Marianne Thellersen
Jens Sigurd Okkels
Original Assignee
Novozymes As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novozymes As filed Critical Novozymes As
Publication of FI963266A publication Critical patent/FI963266A/fi
Publication of FI963266A0 publication Critical patent/FI963266A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI119514B publication Critical patent/FI119514B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38627—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38663—Stabilised liquid enzyme compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/832—Bacillus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/848—Escherichia
    • Y10S435/849—Escherichia coli
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/874—Pseudomonas
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886—Streptomyces
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi
    • Y10S435/913—Aspergillus

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)

Description

1 119514
Menetelmä lipolyyttisen entsyymin muunnoksen valmistamiseksi - Förfarande för framställning av en variant av en lipolytisk enzym 5 Keksinnön ala
Esillä oleva keksintö koskee menetelmää erään lipolyyttisen lähtöentsyymin muunnoksen valmistamiseksi ja menetelmällä valmistettuja muunnoksia. Lisäksi keksintö koskee DNA-rakennetta, joka koodaa keksinnön mukaista muunnosta, ilmentämis-vektoria ja isäntäsolua, jotka sisältävät DNA-rakenteen, ja pesuaineen lisäainetta tai 10 pesuainekoostumusta, jotka sisältävät muunnoksen.
Keksinnön tausta
Lipolyyttisiä entsyymejä on käytetty muutamia vuosia pesuaineiden entsyymeinä, toisin sanoen poistamaan lipidejä tai rasvaista likaa vaatteista ja muista tekstiileistä. 15
Esimerkiksi erilaisia mikrobiperäisiä lipaaseja on ehdotettu pesuaine-entsyymeiksi. Esimerkkejä sellaisista lipaaseista ovat Humicola lanuginosa -lipaasi, jota kuvataan esimerkiksi julkaisuissa EP 258 068 ja EP 305 216, Rhizomucor miehet -lipaasi, jollaista kuvataan esimerkiksi julkaisussa EP 238 023, jokin Candica-lipaasi, kuten 20 C. antarctica -lipaasi, esimerkiksi C. antarctica -lipaasi A tai B, joita kuvataan julkaisussa EP 214 761, jokin Pseudomonas-lipaasi, kuten P. alcaligenes ja P. pseu-doalcaligenes -lipaasi, esimerkiksi kuten julkaisussa EP 218 272 kuvataan, P. cepacia -lipaasi, esimerkiksi kuten julkaisussa EP 331 376 kuvataan, Bacillus-lipaasi, esimerkiksi B. subtilis -lipaasi (Dartois et ai., 1993), B. stearothermophilus -lipaasi 25 (JP 64/744992) ja B. pumilus -lipaasi (EP 91 00664).
* · 4 > • · · ··· :. *.:' Lisäksi on kuvattu muutamia kloonattuja lipaaseja, mukaanluettuina Penicillium ca- membertii -lipaasi, jota ovat kuvanneet Yamaguchi S. et ai., 1991, Geotricum candi- :*·]: dum -lipaasi (Schimada, Y. et ai., 1989) ja erilaisia Rhizopus-\ipaase)a, kuten R. de- : 30 lemar -lipaasi (Hass, MJ. et ai, 1991), R. niveus -lipaasi (Kugimiya, W., 1992) ja »·· R. oryzae -lipaasi.
. ... Toisentyyppisiä lipolyyttisiä entsyymejä, joita on ehdotettu pesuaineiden entsyy- • · · .7. meiksi, ovat kutinaasit, esimerkiksi Pseudomonas mendocinasta johdettu, jollaista • φ · \ 35 kuvataan julkaisussa WO 88/09367, tai eräs kutinaasi, joka on johdettu Fusarium m « solani pisistä (kuvataan esimerkiksi julkaisussa WO 90/09446).
* · • « • « * * · t • ψ • · • φ · • · · • · 2 119514
Viime vuosina on yritetty valmistaa lipaasimuunnoksia, joilla on parempia ominaisuuksia pesuainetarkoituksiin. Esimerkiksi WO 92/05249 kuvaa lipaasimuunnoksia, joilla on parempia ominaisuuksia ja joissa eräitä villityypin lipaasientsyymien ominaisuuksia on muutettu muuntamalla spesifisesti, s.o. suunnatusti niiden aminohap-5 posekvenssejä. Tarkemmin sanottuna kuvataan lipaasimuunnoksia, joissa lähtöli-paasin niinkutsutun lipidikosketusalueen yksi tai useampia aminohappotähteitä on muunnettu.
PCT/DK93/00225 kuvaa ominaisuuksiltaan parannettuja lipaasimuunnoksia, joissa 10 lipaasin eräs kriittisessä asemassa sijaitseva aminohappotähde on muunnettu.
EP 407 225 kuvaa lipaasimuunnoksia, jotka kestävät paremmin proteolyyttisiä entsyymejä ja jotka on valmistettu spesifisti määritellyillä aminohappomuutoksilla.
15 EP 260 105 kuvaa hydrolaaseja, joissa yksi aminohappotähde 15 Ä:n etäisyydellä aktiivikohdasta on substituoitu.
Kaikki edellä mainitut lipaasimuunnokset on rakennettu käyttämällä paikkaspesifistä mutageneesia, jolloin tuloksena on spesifisten aminohappotähteiden Jotka on valittu 20 niiden tyypin perusteella tai niiden sijainnin perusteella lähtolipaasin sekundaarisessa tai tertiaarisessa rakenteessa, muuntuminen.
Eräs vaihtoehtoinen lähestymistapa jonkin annetun proteiinin mutanttien tai muunnoksien valmistamiseksi on perustunut satunnaismutageneesiin. Esimerkiksi julkai-25 suissa US 4 898 331 ja WO 93/01285 selitetään sellaisia menetelmiä.
* f t • · · «*» : ^: Uusista lipolyyttisistä entsyymeistä, joilla on parempia pesu- ja/tai astianpesuominai- ·'·.· suuksia, on tarvetta ja esillä olevan keksinnön tarkoituksena onkin valmistaa sellaisia • · entsyymejä.
; .·. 30 * » ·!*, Lvhvt selostus keksinnöstä ϊ · · Tämän keksinnön tekijät ovat nyt kehittäneet uuden menetelmän lipolyyttisten ent- . syymien muunnosten, joilla on parempia pesu- ja/tai astianpesuominaisuuksia kuin • * · ’“·/ niiden lähtöentsyymeillä, valmistamiseksi. Menetelmä perustuu lipolyyttistä entsyy- *·* * 35 miä koodaavien DNA-sekvenssien satunnais-tai paikkaspesifiseen satunnaismutage- :Y: neesiin.
t · » · · * · * · ··· * . Tarkemmin sanottuna ensimmäisen aspektinsa mukaan keksintö koskee jonkin lipo- • · • t » · t 4 ·· • · 3 119514 lyyttisen lähtöentsyymin muunnoksen valmistusmenetelmää, jossa (a) lipolyyttistä lähtöentsyymiä koodaavalle DNA-sekvenssille suoritetaan satun-naismutageneesi, (b) vaiheessa (a) saatu mutatoitu DNA-sekvenssi ilmennetään jossakin isäntäsolus-5 saja (b) seulotaan esille isäntäsoluja, jotka ilmentävät mutatoitua lipolyyttistä entsyymiä, joka on vähemmän riippuvainen kalsiumista ja/tai joka sietää paremmin pesuainetta tai yhtä tai useampaa pesuainekomponenttia lipolyyttiseen lähtöentsyymiin verrattuna.
10 Tässä yhteydessä termillä "lipolyyttinen entsyymi" tarkoitetaan entsyymiä, jolla on lipidien hajottamiskyky, kuten kyky hajottaa triglyseridejä tai fosfolipidejä. Lipolyyttinen entsyymi voi esimerkiksi olla jokin lipaasi, fosfolipaasi, esteraasi tai kutinaasi.
15 Termi "satunnaismutageneesi" on tarkoitettu ymmärrettäväksi konventionaalisella tavalla, s.o. tarkoittamaan yhden tai useamman mutaation viemistä lähtöentsyymin satunnaisiin asemiin (s.o. vastakohtana paikkaspesifiselle mutageneesille). Satun-naismutaatiot tehdään yleensä altistamalla suuri määrä muunnettavan DNA-sekvens-sin kopioita jollekin mutageenille ja sitten seulomalla läsnäolevat muunnokset. So-20 pivia menetelmiä satunnaismutaatioiden toteuttamiseksi käsitellään yksityiskohtaisesti tuonnempana.
Vaiheen c) seulontakriteerien katsotaan olevan erityisen hyödyllisiä identifioitaessa lipolyyttisen lähtöentsyymin muunnoksia, joilla on parempia pesu-ja/tai astianpe-25 suominaisuuksia verrattuna niiden lähtöentsyymeihin.
** · * p * · * ·« ; } ’: Tässä yhteydessä termin "vähäisempi riippuvuus kalsiumista" on määrä tarkoittaa, * ’», j että mutatoitu lipolyyttinen entsyymi tarvitsee pienempiä määriä kalsiumia osoittaak- P 9 . V. seen samanasteista aktiivisuutta kuin lähtöentsyymi, kun niitä testataan samoissa . 30 olosuhteissa. Edullisesti keksinnön mukainen mutatoitu lipolyyttinen entsyymi on j·, olennaisesti riippumaton kalsiumin läsnäolosta osoittaakseen entsymaattista aktiivi- *. * 9 suutta.
4 f * · ;;;* Termin "parempi pesuaineen tai pesuainekomponentin sieto" on määrä tarkoittaa, * t · 35 että mutatoitu lipolyyttinen entsyymi on aktiivinen suuremmissa pesuaine- tai pesu-! V: ainekomponenttipitoisuuksissa kuin lipolyyttinen lähtöentsyymi.
9 » t y *
* 9 * V
' , Tässä yhteydessä termin "pesuaine" on määrä tarkoittaa pesuaineen aineosien seosta, • · 9 9 * · f *9 9 9 119514 4 jolloista normaalisti käytetään pesuun tai astianpesuun. Analogisesti "pesuainekom-ponentin" on määrä tarkoittaa jotakin komponenttia tai aineosaa, joka normaalisti esiintyy pesuaine- tai astianpesuainekoostumuksissa, joista esimerkkejä esitetään seuraavassa selityksessä.
5
On selvää, että keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetulla muunnoksella sen lisäksi, että se on vähemmän riippuvainen kalsiumista ja/tai se sietää paremmin pesuainetta tai yhtä tai useampaa pesuainekomponenttia, on lipolyyttinen aktiivisuus, joka on edullisesti suuruusluokkaa, joka on verrattavissa lipolyyttisen lähtöentsyymin 10 aktiivisuuteen tai ylittää sen, kun niitä testataan pesu- ja/tai astianpesuolosuhteissa.
Keksinnön mukaisen menetelmän vaiheessa (c) määritellyt seulontakriteerit voidaan määrittää millä tahansa alan tuntemalla menetelmällä. Erästä sopivaa erityismääritys-tä tähän tarkoitukseen kuvataan tuonnempana kappaleessa Materiaaleja ja menetel-15 miä.
Erään toisen aspektinsa mukaan keksintö koskee DNA-rakennetta, joka käsittää mutatoidun DNA-sekvenssin, joka koodaa lipolyyttisen entsyymin muunnosta, joka on vähemmän riippuvainen kalsiumista ja/tai joka sietää paremmin pesuainetta tai 20 pesuainekomponenttia lipolyyttiseen lähtöentsyymiin verrattuna, ja joka DNA-sek-venssi on eristetty keksinnön mukaisen menetelmän vaiheessa (c) seulotusta isän-täsolusta.
• · · • · · • · · : Vielä erään aspektinsa mukaan keksintö koskee rekombinantti-ilmentämisvektoria, : * ·. I 25 joka kantaa DNA-rakennetta, solua, joka on transformoitu DNA-rakenteella tai vek- . *. *. torilla, sekä menetelmää lipolyyttisen lähtöentsyymin muunnoksen valmistamiseksi . ·. viljelemällä mainittua solua olosuhteissa, jotka johtavat muunnoksen tuotantoon, .•I*. minkä jälkeen muunnos otetaan talteen viljelystä.
• · · . 30 Lopuksi vielä keksintö koskee lipolyyttisen entsyymin muunnosta ja mainitun muun- • · · *”·/ noksen käyttöä pesuaineen, erityisesti pyykinpesua tai astianpesua varten tarkoitetun • t · • · | * pesuaineen entsyyminä, ja pesuaineen lisäainetta ja pesuainekoostumusta, jotka sisäl- :Y: tävät muunnoksen.
• · • · · • * • m 99* ] . 35 Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus ’ . Lipolyyttistä lähtöentsyymiä koodaavan DNA-sekvenssin kloonaus • * · ’ · *1 DNA-sekvenssi, joka koodaa jotakin lipolyyttistä lähtöentsyymiä ja jolle on tarkoitus tehdä satunnaismutageneesi esillä olevan keksinnön mukaisesti, voidaan eristää 5 119514 mistä tahansa solusta tai mikro-organismista, joka tuottaa kysymyksessä olevaa lähtöentsyymiä, alalla tunnetuilla menetelmillä.
DNA-sekvenssi voidaan esimerkiksi eristää muodostamalla cDNA tai genominen 5 kirjasto organismista, jonka odotetaan sisältävän sekvenssin, ja seulomalla positiivisia klooneja konventionaalisilla menettelytavoilla. Esimerkkejä sellaisista menettelytavoista ovat hybridisaatio oligonukleotidikoettimiin, jotka on valmistettu lähtöent-syymin (mikäli sekvenssi-informaatio on saatavissa) tai jonkin sitä läheisesti muistuttavan entsyymin (mikäli lähtöentsyymin sekvenssi-informaatio ei ole saatavissa) 10 aminohappo- tai DNA-sekvenssin perusteella standardimenetelmillä (vrt. Sambrook et ai., 1989), ja/tai seulomalla klooneja, joilla on lipolyyttistä aktiivisuutta, kuten li-paasiaktiivisuutta, ja/tai seulomalla klooneja, jotka tuottavat proteiinia, joka reagoi lipolyyttistä lähtöentsyymiä vastaan tuotetun vasta-aineen kanssa.
15 Eräs edullinen menetelmä keksinnön mukaisesti muunnettavan DNA-sekvenssin, joka koodaa lipolyyttistä lähtöentsyymiä, eristämiseksi cDNArsta tai genomikiijastos-ta on käyttää polymeraasiketjureaktiota (PCR) käyttämällä degeneroituja oligonuk-leotidikoettimia, jotka on valmistettu lähtöentsyymin DNA- tai aminohapposekvenssin perusteella. PCR voidaan toteuttaa esimerkiksi käyttämällä menetelmiä, joita on 20 kuvattu US-patentissa n:o 4 683 202 tai joita ovat kuvanneet R.K. Saiki et ai. (1988).
Vaihtoehtoisesti lähtöentsyymiä koodaava DNA-sekvenssi voidaan valmistaa syn-Lj’: teettisesti vakiintuneilla standardimenetelmillä, esimerkiksi fosfoamidiittimenetel- : mällä, jonka ovat kuvanneet Beaucage ja Caruthers (1981), tai menetelmällä, jota 25 ovat kuvanneet Matthes et ai. (1984). Fosfoamidiittimenetelmän mukaan oligonu- • * . v. kleotidit syntetisoidaan, esimerkiksi automaattisessa DNA-syntetisaattorissa, puhdis- • ♦ . . ♦. tetaan, lämpökäsitellään, ligoidaan ja kloonataan sopivissa vektoreissa.
»·· • « · • · ·
Lopuksi vielä lähtöentsyymiä koodaava DNA-sekvenssi voidaan valmistaa DNA:sta, . 30 joka on sekä genomista että synteettistä alkuperää, sekä synteettistä että cDNA-alku- • * · * 111 * perää tai sekä genomista että cDNA-alkuperää ja valmistettu ligoimalla palasia syn- * · · *·* * teettisestä, genomisesta tai cDNA-lähteestä (kuten kulloinkin on tarkoituksenmukais- : V: ta), palasten vastatessa kokonaisen, lähtöentsyymiä koodaa van DNA-sekvenssin eri : *": osia, standardinmukaisilla menetelmillä.
• · · 35 • · . , Satunnaismutageneesi • * · ’· ’*· Lipolyyttistä lähtöentsyymiä koodaavan DNA-sekvenssin satunnaismutageneesi, joka on määrä suorittaa keksinnön mukaisen menetelmän vaiheen a) mukaisesti, voidaan 6 119514 kätevästi toteuttaa käyttämällä mitä tahansa alalla tunnettua menetelmää.
Satunnaismutageneesi voidaan esimerkiksi suorittaa käyttämällä jotakin sopivaa fysikaalista tai kemiallista mutageenia, käyttämällä jotakin sopivaa oligonukleotidia tai 5 altistamalla DNA-sekvenssi PRC:n synnyttämälle mutageneesille. Lisäksi satunnais-mutageneesi voidaan toteuttaa käyttämällä näiden mutageenien minkälaista tahansa yhdistelmää.
Mutageeni voi olla esimerkiksi sellainen, joka aikaansaa transitioita, transversioita, 10 inversioita, ryömintää, deleetioita ja/tai insertioita.
Esimerkkejä fysikaalisista tai kemiallisista mutageeneista, jotka ovat sopivia esillä olevaan tarkoitukseen, ovat ultravioletti(UV)säteilytys, hydroksyyliamiini, N-metyy-li-N'-nitro-N-nitrosoguanidiini (MNNG), O-metyylihydroksyyliamiini, typpihapoke, 15 etyylimetaanisulfonaatti (EMS), natriumbisulfiitti, muurahaishappo ja nukleotidiana-logit.
Kun sellaisia aineita käytetään, mutageneesi toteutetaan inkuboimalla mutatoitavaa lähtöentsyymiä koodaavaa DNA-sekvenssiä valitun mutageenin läsnäollessa sopivis-20 sa olosuhteissa, jotta mutageneesi tapahtuu, ja seulomalla mutatoitu DNA, jolla on halutut ominaisuudet.
Kun mutageneesi suoritetaan käyttämällä jotakin oligonukleotidia, oligonukleotidiin : voidaan istuttaa tai naulata kolme ei-lähtönukleotidia oligonukleotidin synteesin ai- :' ·.: 25 kana kohtiin, joita halutaan muuttaa. Istuttaminen tai naulaaminen voidaan toteuttaa . *. *. siten, että vältetään ei-haluttuja aminohappoja koodaavia kodoneita. Istutettu tai • · . .·. naulattu oligonukleotidi voidaan sisällyttää lipolyyttistä entsyymiä koodaavaan DNA:han millä tahansa julkaistulla menetelmällä käyttäen esimerkiksi PCR:ä, LCR:ä • · tai mitä tahansa DNA-polymeraasia tai ligaasia.
. 30 * · ·
Kun käytetään PCR:llä tuotettua mutageneesia, joko jokin kemiallisesti käsitelty tai • · · *·) * käsittelemätön geeni, joka koodaa lipolyyttistä lähtöentsyymiä, altistetaan PCR.ile : V: olosuhteissa, jotka lisäävät nukleotidien asettumista vääriin kohtiin (Deshler 1992, «’**: Leung et ai, 1989).
··* 35 , . Lipolyyttistä entsyymiä koodaavan DNA:n satunnaismutageneesiin voidaan käyttää *· **· jotakin E. colin (Fowler et ai. 1974), S. cerevisiaen tai minkä tahansa muun mikro- biorganismin mutaattorikantaa, esimerkiksi transformoimalla lähtöentsyymin sisältä- 7 119514 vä plasmidi mutaattorikantaan, kasvattamalla mutaattorikantaa plasmidin kanssa ja eristämällä mutatoitu plasmidi mutaattorikannasta. Mutatoitu plasmidi voidaan sen jälkeen transformoida ilmentämisorganismiin.
5 Mutatoitava DNA-sekvenssi voi kätevästi olla läsnä genomi- tai cDNA-kirjastossa, joka on valmistettu jostakin lipolyyttistä lähtöentsyymiä ilmentävästä organismista. Vaihtoehtoisesti DNA-sekvenssi voi olla läsnä jollakin sopivalla vektorilla, kuten plasmidilla tai bakteriofagilla, jota voidaan sellaisenaan inkuboida mutageenin kanssa tai muulla tavoin altistaa se sille. Mutatoitava DNA voi olla myös jossakin isän-10 täsolussa joko niin, että se on integroitu mainitun solun genomiin tai se on läsnä soluun ankkuroidussa vektorissa. Lopuksi vielä mutatoitava DNA voi olla eristetyssä muodossa. On selvää, että satunnaismutageneesille altistettava DNA-sekvenssi on edullisesti jokin cDNA- tai genomi-DNA-sekvenssi.
15 Joissakin tapauksissa saattaa olla kätevää monistaa mutatoitu DNA-sekvenssi ennen suoritettavaa ilmentämisvaihetta (b) tai seulontavaihetta (c). Sellainen monistaminen voidaan suorittaa alalla tunnettujen menetelmien mukaan, tässä keksinnössä edullisimman muodon ollessa PCR:n avulla toteutettu monistaminen käyttämällä oligonu-kleotidialukkeita, jotka on valmistettu lähtöentsyymin DNA- tai aminohapposek-20 venssin perusteella.
Mutageenin kanssa inkuboinnin tai sille muuten altistuksen jälkeen mutatoitu DNA
: · i ·: ilmennetään viljelemällä jotakin sopivaa, DNA-sekvenssiä kantavaa isäntäsolua olo- :: suhteissa, jotka sallivat ilmentymisen tapahtuvan. Tähän tarkoitukseen käytetty » · *·,’·: 25 isäntäsolu voi olla sellainen, joka on transformoitu mutatoidulla DNA-sekvenssillä ja :**[.* on valinnaisesti läsnä jollakin vektorilla, tai sellainen, joka kantoi lähtöentsyymiä i koodaavaa DNA-sekvenssiä mutageneesikäsittelyn aikana. Esimerkkejä sopivista ·***: isäntäsoluista annetaan tuonnempana. Mutatoitu DNA-sekvenssi voi lisäksi käsittää DNA-sekvenssin, joka koodaa funktioita, jotka tekevät mutatoidun DNA-sekvenssin . 30 ilmentymisen mahdolliseksi.
• · · • · • t · • i i
On selvää, että edellä vaiheessa (c) mainitut seulontakriteerit on valittu huolellisesti.
::: Niinpä rajoittumatta mihinkään teoriaan, seulonnan vähäisemmän kalsiumista riip- • · · 1...: puvaisuuden suhteen uskotaan tuottavan tulokseksi muunnoksia, joilla on kaiken •35 kaikkiaan parempi suorituskyky sikäli, että kalsiumin vaatimusta voidaan pitää rajoit- . ·. : tavana tekijänä optimiaktiivisuuden kannalta, erityisesti olosuhteissa, joissa on läsnä • · * vain pieniä määriä vapaata kalsiumia. Pesuainelipaasien yhteydessä vaaditut vapaat kalsiumionit saadaan tavallisesti pesuvedestä ja siten lipolyyttinen aktiivisuus riippuu 8 119514 veden kalsiumpitoisuudesta.
Pesuaine tai pesuainekomponentti, jota muunnos paremmin sietää, voi olla mitä tahansa tyyppiä, esimerkiksi kuten tuonnempana kuvataan. Edullisesti pesuainekom-5 ponentti on ioniton, anioninen, kationinen, kahtaisioninen tai amfoteerinen pinta-aktiivinen aine. Esimerkkejä ionittomista pinta-aktiivisista aineista ovat alkoholie-toksylaatti, esimerkkejä anionisista pinta-aktiivisista aineista ovat LAS, alkyylisul-faatti, alkoholietoksisulfaatti ja vastaavat.
10 Erityisesti ajatellaan, että parantunut sieto erästä ionitonta pinta-aktiivista alkoholi-etoksylaattia, josta eräs kaupallisesti saatavilla oleva esimerkki on Dobanol®, kohtaan saattaa olla osoitus paremmasta pesukyvystä.
Vaiheen (c) seulonta suoritetaan kätevästi käyttämällä suodatinmääritystä, joka pe-15 rustuu seuraavan periaatteeseen: mikro-organismia, joka kykenee ilmentämään kysymyksessä olevaa mutatoitua lipo-lyyttistä entsyymiä, inkuboidaan jollakin sopivalla kasvatusalustalla ja sopivissa olosuhteissa, jotta entsyymiä erittyy, kasvatusalustan ollessa varustettu kaksoissuodatti-mella, joka käsittää ensimmäisen proteiineja sitovan suodattimen ja sen päällä toisen 20 suodattimen, jolla on heikko proteiinien sitomiskyky. Mikro-organismi sijaitsee toisella suodattimella. Inkuboinnin jälkeen ensimmäinen suodatin, joka käsittää mikro-organismista erittyneen entsyymin, erotetaan toisesta suodattimesta, joka sisältää :: mikro-organismin. Ensimmäinen suodatin seulotaan halutun entsymaattisen aktiivi- *·.: ’ · suuden suhteen ja vastaavat toisella suodattimella olevat mikrobipesäkkeet identifi- 25 oidaan.
• · • · • · · * · * · , . Suodatin, jota käytetään entsymaattisen aktiivisuuden sitomiseen, voi olla mikä ta- »Il t’ y. hansa sitova suodatin, esimerkiksi nylon- tai nitroselluloosasuodatin. Yläsuodatin, joka kantaa ilmentämisorganismin pesäkkeitä, voi olla mikä tahansa suodatin, jolla ei ^ ^ 30 ole lainkaan tai vain vähän affiniteettia proteiinien sitomiseen, esimerkiksi selluloo- » I · sa-asetaatti- tai Durapore™-suodatin. Suodatin voidaan esikäsitellä mihin tahansa • t · olosuhteista, joita seulontaan käytetään, tai se voidaan käsitellä entsymaattisen ak- : X: tii visuuden detektoinnin aikana.
* 1 1 I : • 1 .. , · 35 Entsymaattinen aktiivisuus voidaan osoittaa jollakin väriaineella, fluoresenssilla, sa- • · . . ostamalla, pH-indikaattorilla, IR-absorbanssilla tai millä tahansa muulla tunnetulla i · j r ’ 1 entsymaattisen aktiivisuuden havaitsemismenetelmällä.
9 119514
Detektointiyhdiste voidaan immobilisoida millä tahansa immobilisointiaineella, esimerkiksi agaroosilla, agarilla, gelatiinilla, polyakryyliamidilla, tärkkelyksellä, suodatinpaperilla, kankaalla, tai millä tahansa immobilisointiaineiden yhdistelmällä.
5 Lipaasiaktiivisuus voidaan ilmaista kiiltovihreän, rodamiini B:n tai sudanimustan avulla yhdistettynä johonkin lipidiin, esimerkiksi oliiviöljyyn tai sianihraan. Seulon-takriteerejä lipolyyttisten lähtöentsyymien muunnosten, joilla on parempi pesukyky, tunnistamiseksi voivat olla esimerkiksi EGTA, EDTA, ionittomat tai anioniset ten-sidit, alkalinen pH tai mikä tahansa pesuainekoostumus yhdessä yhden tai useamman 10 edellä mainitun entsymaattisen aktiivisuuden ilmaisimen kanssa.
On selvää, että seulontakriteerit, joita käytetään keksinnön mukaisessa suodatinmää-rityksessä, voidaan valita siten, että ne sopivat seulottavien entsyymien haluttuihin ominaisuuksiin tai käyttöihin. Esimerkiksi seulottaessa lipaaseja, jotka ovat tarkoite-15 tut erityisesti käytettäviksi paperinvalmistusteollisuudessa, saattaa olla asianmukaista seuloa hapanta lipaasia, jolla on parempi lämmönkestävyys. Tämä voidaan suorittaa käyttämällä jotakin puskuria, jonka pH on hapan (esimerkiksi pH 4) ja/tai inkuboi-malla korkeassa lämpötilassa ennen koetta tai sen aikana.
20 Vaiheessa (c) tuotetuille isäntäsoluille voidaan suorittaa useampia edellä vaiheissa (a) - (c) kuvattuja mutageneesikierroksia, sopivasti käyttämällä tiukempia seulonta-kriteerejä kuin mitä edellisessä mutatointikäsittelyssä käytettiin.
• · · • · · • · · : Vaiheeseen (c) valittuja isäntäsoluja voidaan käyttää suoraan lipolyyttisen entsyymin ··· . ·. : 25 muunnoksen tuottamiseen. Vaihtoehtoisesti muunnosta koodaava DNA voidaan • it • · . v. eristää isäntäsolusta ja insertoida se johonkin toiseen sopivaan isäntäsoluun, käte- • £ , ,·. västi käyttämällä alla kappaleessa, joka on otsikoitu "Keksinnön mukaisen muunnok- sen ilmentäminen" ja jossa on myös lueteltu sopivia isäntäsoluja, kuvattua menette- f · « lyä.
30 • · *
Paikallinen satunnaismutageneesi : Keksinnön mukaisesti satunnaismutageneesi voidaan edullisesti paikallistaa johon- : V: kin kysymyksessä olevan lipolyyttisen lähtöentsyymin osaan. Tämä saattaa esimer- i' ''; kiksi olla edullista, kun entsyymin jonkin tietyn alueen on tunnistettu olevan erityisen »·* ' . 35 tärkeä entsyymin jonkin annetun ominaisuuden kannalta ja kun tämän alueen muut- ’ *, tumisen odotetaan tuottavan tulokseksi muunnoksen, jolla on paremmat ominaisuu- • t * *· det. Sellainen alue voidaan tavallisesti identifioida, kun lähtöentsyymin tertiaarinen rakenne on selvitettyjä liitetty entsyymin toimintaan.
5 10 119514
Paikallistettu satunnaismutageneesi suoritetaan sopivasti käyttämällä PCR:n avulla tapahtuvaa mutageneesimenetelmää tai mitä tahansa muuta sopivaa alalla tunnettua menetelmää.
Vaihtoehtoisesti muunnettavaa DNA-sekvenssin osaa koodaava DNA-sekvenssi voidaan eristää esimerkiksi sijoittamalla se johonkin sopivaan vektoriin, ja mainitulle osalle voidaan sitten suorittaa mutageneesi käyttämällä mitä tahansa edellä käsitellyistä mutageneesimenetelmistä.
10
Lipolyyttinen lähtöentsyymi
Keksinnön mukaisesti muunnettava lipolyyttinen lähtöentsyymi voi olla mikä tahansa entsyymi, jolla on edellä kuvattua lipolyyttistä aktiivisuutta. Esimerkkejä lipolyyttisis-tä entsyymeistä ovat lipaasi, esteraasi, kutinaasi tai fosfolipidi.
15
Edullisesti lipolyyttinen lähtöentsyymi muunnetaan paikallisella satunnaismutage-neesilla, joka suoritetaan osaan lipidikosketusaluetta tai jotakin mainitun alueen osaa koodaavan DNA-sekvenssin osaan.
20 Kaikilla tähän mennessä kiteytetyillä lipaaseilla on todettu olevan vähintään yksi pintasilmukkarakenne (kutsutaan myös termillä kansi tai läppä), joka peittää aktiivisen kohdan, kun lipaasi on inaktiivisessa muodossa (erästä esimerkkiä sellaisesta !.·,ί lipaasista kuvaavat Brady et ai., 1990). Kun lipaasi aktivoituu, silmukkarakenne : s[: siirtyy paljastaen aktiivisen kohdan tähteet, ja muodostuu hydrofobinen pinta, joka j * ·. * 25 ympäröi aktiivisen kohdan Seriä, jonka pinnan hydrofobisuus on lisääntynyt ja joka . *. *. on vuorovaikutuksessa lipidisubstraatin kanssa hydrolyysin alkaessa tai sen aikana.
• · j .·. Tätä aktivoitumista kutsutaan termillä rajapintojen aktivoituminen ja sitä käsittelevät enemmän Tilbeurgh et ai. (1993).
^ 30 Esillä olevassa tarkoituksessa aktivoitumisen jälkeen muodostunutta pintaa kutsutaan "f termillä "lipidikosketusalue", jonka on määrä kattaa aminohappotähteet, jotka ovat • · · ’·’ ' tämän pinnan sisällä tai muodostavat osan siitä, mahdollisesti silmukkarakenteiden muodossa. Nämä tähteet voivat osallistua lipaasin vuorovaikutukseen substraatin i" *: kanssa hydrolyysin alkaessa tai sen aikana, jolloin lipaasi hydrolysoi triglyseridejä 35 lipidifaasista, kun se on aktivoitunut koskettaessaan lipidipintaa.
• * * Φ · ’ *Lipidikosketusalue sisältää lipidisubstraatin sitomisalueen, joka on se osa lipidikosketusaluetta, johon yksittäinen lipidisubstraattimolekyyli sitoutuu ennen hydrolyysiä.
,, 119514 Tämä sitomisalue vuorostaan sisältää asyyliä sitovan hydrofobisen halkeaman ja niin kutsutun hydrolyysitaskun, joka sijaitsee aktiivikohdan Serin ympärillä ja jossa lipi-disubstraatin hydrolyysin uskotaan tapahtuvan. Kaikissa tällä hetkellä tunnetuissa lipaaseissa lipidikosketusalue tunnistetaan helposti, esimerkiksi lipaasin kolmiulot-5 teisestä rakenteesta, joka luodaan sopivilla tietokoneohjelmilla. Epäaktiivisen ja ak tiivisen lipaasin konformaatio on vastaavassa järjestyksessä esitetty julkaisun WO 92/05249 kuvioissa 1 ja 2.
Humicola lanuginosa -lipaasin lipidikosketusaluetta, jota esillä olevassa patenttiha-10 kemuksessa käsitellään yksityiskohtaisesti, rajaavat aminohappotähteet 21 -25, 36-38, 56-62, 81-98,110-116, 144-147,172-174, 199-213 ja 248-269. Nämä tähteet on identifioitu lipaasin ja lipidisubstraatin vuorovaikutuksen tietokonemallisimulointien perusteella.
15 Muiden lipolyyttisten entsyymien lipidikosketusalue määritetään a) laskemalla 3-D molekyylirakenteen hydrofobinen vektori, b) katkaisemalla kohtisuoraan vektoriin nähden lineaarisessa sekvenssissä aktiivi-kohdan seriinin jälkeisen toisen aminohappotähteen Ca-atomin kohdalta, ja c) ottamalla mukaan kaikki tähteet ja vähintään yhden atomin katkaisun sillä puo- 20 lella, johon vektori osoittaa, ja d) valitsemalla näistä tähteistä ne, joissa on vähintään yksi atomi proteiinin pinnan 5 ängströmin suuruisen alueen sisällä (kysymyksen ollessa lipaasista joko sen avoi- :.ί.: messa tai suljetussa muodossa).
* I I * • · ·
»M
* * !.’·· 25 Hydrofobinen vektori lasketaan proteiinirakenteesta, kysymyksen ollessa lipaasista : · joko sen avoimessa tai suljetussa muodossa, laskemalla yhteen kaikki tähdevektorit i s": tähteille, joiden pinnasta vähintään 10 % on tavoitettavissa (Lee, B. ja Richards, iT: F.M., 1971, Mol. Biol. 55:379-400). Tähdevektorin alkamiskohdaksi määritellään tähteen Ca-atomi ja sen suunta kulkee sivuketjun massakeskuksen kautta. Kunkin . 30 tähdevektorin suuruus määritellään tähteen suhteellisena siirtovapaana energiana.
··· ···
• I I
• » · [·< Kunkin tähteen pinnan tavoitettavuus lasketaan käyttämällä Connollyn ohjelmaa.
♦ · * • · · • · ···
Edullisesti paikallinen satunnaismutageneesi toteutetaan DNA-sekvenssin osaan, ····: 35 joka koodaa lähtöentsyymin kansialuetta ja/tai hydrofobista halkeamaa tai mainitun kansialueen ja/tai hydrofobisen halkeaman osaa.
• ·
Keksinnön mukaisesti muunnettavan lipolyyttisen lähtöentsyymin alkuperä voi olla 12 119514 mikä tahansa. Entsyymi vois siis olla peräisin nisäkkäästä, kasvista, selkärankaisesta tai miltä tahansa muulta alueelta. Tässä on kuitenkin edullista, että entsyymi on peräisin mikrobeista siinä mielessä, että muutamien mikrobikantojen on todettu tuottavan entsyymejä, joita voidaan käyttää erityisesti pesuainetarkoituksiin.
5
Tarkemmin sanottuna DNA-sekvenssin iipolyyttinen lähtöentsyymi voi olla peräisin jostakin sienestä, s.o. jostakin hiivasta tai rihmasienestä. DNA-sekvenssi voi esimerkiksi olla sellainen, joka on johdettavissa jostakin Humicola sp. -kannasta, esimerkiksi H. lanuginosa -kannasta, jostakin Rhizomucor sp. -kannasta, esimerkiksi 10 R. miehei -kannasta, jostakin Rhizopus sp. -kannasta, jostakin Candida sp. -kannasta, jostakin Fusarium sp., esim. F. solanipisi -kannasta, jostakin Venturia spp. -kannasta, esimerkiksi V. inaequalis -kannasta, jostakin Colletotrichum spp. -kannasta, esimerkiksi C. gloeosporioides -kannasta tai C. lagenarium -kannasta, tai jostakin Pe-nicillium spp. -kannasta, esimerkiksi P. spinulosum- tai P. camembertii -kannasta.
15 Tässä yhteydessä sanonnan "on johdettavissa" ei ole määrä tarkoittaa ainoastaan entsyymiä, joka on tuotettu jostakin kysymyksessä olevan organismin kannasta, vaan myös entsyymiä, jota sellaisesta kannasta eristetty DNA-sekvenssi koodaaja joka on tuotettu jossakin isäntäorganismissa, joka on transformoitu mainitulla DNA-sekvens-20 sillä. Lisäksi termin on määrä tarkoittaa entsyymiä, jota koodaa synteettistä ja/tai cDNA-alkuperää oleva DNA-sekvenssi ja jolla on kysymyksessä olevan entsyymin identifiointitunnusmerkit.
• · 1 • · · ***
Erityisen mielenkiintoinen lipolyyttisenä lähtöentsyyminä on lipaasi, joka on johdet-25 tavissa jostakin H. lanuginosa -kannasta, esimerkiksi H. lanuginosa -kannasta DSM
• · s V 4109, tai jostakin mainitun lipaasin analogista, jostakin Rh. mucor -kannasta tai jos- :1: takin C. antarctica -kannasta.
• o 9Ψ· f · · • » » Tässä yhteydessä termin "analogi" on määrä tarkoittaa polypeptidiä, joka käsittää . 30 aminohapposekvenssin, joka eroaa H. lanuginosa -lipaasin aminohapposekvenssistä j·;·. yhden tai useamman aminohappotähteen osalta ja joka on vähintään 70-prosenttisesti ]· a homologinen mainitun lipaasin aminohapposekvenssin kanssa (määritettynä näiden *.v kahden sekvenssin identtisyysasteena), kuten vähintään 75-prosenttisesti, 80-pro- senttisesti, 90-prosenttisesti tai 95-prosenttisesti homologinen, on immunologisesti 35 ristireagoiva mainitun lipaasin kanssa ja/tai jota koodaa DNA-sekvenssi, joka hybri- : disoituu oligonukleotidikoettimen kanssa, joka on valmistettu mainitun lipaasin ami- • · nohapposekvenssin tai mainittua lipaasia koodaavan DNA-sekvenssin perusteella.
13 119514
Analogi voi olla jokin H. lanuginosa -lipaasin johdos, joka on esimerkiksi valmistettu muuntamalla lipaasia koodaavaa DNA-sekvenssiä siten, että tuloksena on yhden tai useamman aminohappotähteen additio lipaasin joko N- tai C-terminaaliseen päähän tai molempiin, yhden tai useamman aminohappotähteen substituutio aminohap-5 posekvenssin yhdessä tai useammassa kohdassa, yhden tai useamman aminohappotähteen deleetio lipaasin toisessa tai toisessa tai molemmissa päissä tai aminohappo-sekvenssin yhdessä tai useammassa kohdassa, tai yhden tai useamman aminohappotähteen insertio yhdessä tai useammassa kohdassa aminohapposekvenssiä. DNA-sekvenssin muuntaminen voidaan suorittaa paikkaspesifisellä tai satunnaismutage-10 neesilla tai näiden menetelmien yhdistelmällä hyvin tunnettujen menettelytapojen mukaisesti.
Lisäksi analogi voi olla jokin polypeptidi, joka on johdettu jostakin muusta organismista, kuten jostakin edellä kappaleessa "Keksinnön tausta" mainituista.
15 DNA-sekvenssin, joka koodaa H. lanuginosa -lähtölipaasin analogia, hybridisoimi-nen asianmukaiseen oligonukleotidikoettimeen (-koettimiin) voidaan toteuttaa missä tahansa sopivissa olosuhteissa, jotka sallivat DNA-sekvenssien hybridisoitua. Sellaisia olosuhteita ovat esimerkiksi hybridisaatio spesifeissä olosuhteissa, esimerkiksi 20 sellaisissa, joihin kuuluu esiliotus 5xSSC:ssä ja esihybridisointi 1 tunnin ajan -40 °C:ssa liuoksessa, joka sisältää 20 % formamidia, 5 x Denhardtin liuosta, 50 mM natriumfosfaattia, pH 6,8, ja 50 pg denaturoitua sonikoitua vasikan kateen- • t · korvan DNA:ta, ja sen jälkeen hybridisointi samassa liuoksessa, johon on lisätty 100 μΜ ATP:tä, 18 tuntia -40 °C:ssa, tai muilla menetelmillä, joita ovat kuvanneet :.**i 25 esimerkiksi Sambrook et ai, 1989.
• · • · · » · * * H. lanuginosa -lipaasin analogin immunologista ristireaktiivisuutta voidaan tutkia iT: käyttämällä vasta-ainetta, joka on tuotettu puhdistetun lipaasin vähintään yhtä epi- tooppia vastaan tai joka reagoi sen kanssa. Vasta-aine, joka voi olla joko monoklo- . .·. 30 naalinen tai polyklonaalinen, voidaan tuottaa alalla tunnetuilla menetelmillä, esim.
kuten Hudson et ai. ovat kuvanneet, 1989. Immunologinen ristireaktiivisuus voidaan ’·. määrittää käyttämällä alalla tunnettuja kokeita, joista esimerkkejä ovat Western blot- • · · '·*·* ting -menetelmä tai radiaali-immunodiffuusiomenetelmä, jollaista ovat kuvanneet esimerkiksi Hudson et ai, 1989.
35
Kun lipolyyttinen lähtöentsyymi on H. lanuginosa -lipaasi, joka voidaan johtaa kan- • · nasta DSM 4109, tai jokin sen analogi, on eduksi, että satunnaismutagemsoitava DNA-sekvenssi käsittää osan tai muodostaa osan DNA-sekvenssistä, joka koodaa 14 119514 vähintään yhtä mainitun lipaasin aminohappotähteiden 21-27, 56-64, 81-99, 83-100, 108-116,145-147, 174,202-213, kuten esimerkiksi 205-211,226-227,246-259 tai 263-269, rajaamista alueista. Mainitun lipaasin DNA-ja aminohapposekvenssit käyvät selville SEQ ID -numeroista 1 ja 2, vastaavassa järjestyksessä.
5
Paikallistettu satunnaismutageneesi voidaan suorittaa yhdellä tai useammalla näistä alueista ja edullisesti se suoritetaan vähintään kahdella näistä alueista.
Tämän keksinnön mukaisesti muunnettava lipolyyttinen lähtöentsyymi voi olla joh-10 dettavissa jostakin bakteerista. Lipolyyttistä lähtöentsyymiä koodaava DNA-sekvens- si voi esimerkiksi olla johdettavissa jostakin Pseudomonas spp. -kannasta, kuten esimerkiksi P. cepacia-, P. alcaligenes-, P. pseudoalcaligens-, P. mendocina-(esiintyy myös nimellä P. putida), P. syringae-, P. aeroginosa- tai P.fragi -kannasta, jostakin Bacillus spp. -kannasta, esimerkiksi B. suhtilis- tai pumilus -kannasta, tai 15 jostakin Streptomyces sp. -kannasta, esimerkiksi S. scabies -kannasta.
Lipolyyttinen lähtöentsyymi voi olla lipaasi, joka on johdettu mistä tahansa edellä mainitusta lajista, esimerkiksi Pseudomonas-lipaasi, kuten kuvataan julkaisuissa EP 218 272, EP 331 376 ja EP 407 225, tai jokin kutinaasi, esimerkiksi kuten kuva-20 taan julkaisussa WO 88/09367.
Keksinnön mukaisia muunnoksia
Jotta viittaaminen keksinnön mukaisiin eri muunnoksiin olisi helpompaa, ne kuva- v.,: taan käyttämällä seuraavaa nimistöä: * * _ _ : *.s 25 • « S*·]: Alkuperäinen aminohappo (-hapot):asema(t):substituoitu aminohappo (-hapot) * · · • · « * · t ,'ϊ*. Tämän nimistön mukaan esimerkiksi valiinin korvaaminen asparagiinihapolla ase massa 96 esitetään:
30 Asp 96 Vai tai D96V
• * · asparagiinihapon deleetio samasta asemasta esitetään: \ Asp 96 * tai D96* m · :.v ja jonkin lisäaminohappotähteen, kuten esimerkiksi lysiinin, insertio esitetään:
Asp 96 ValLys tai D96VK
35 useat mutaatiot erotetaan+-merkeillä, toisin sanoen:
Asp 96 Vai + Glu 87 Lys taiD96V+E87K
* *· * * mikä tarkoittaa mutaatioita asemissa 96 ja 87 korvaamalla asparagiinihappo ja glu- tamiinihappo valimilla ja lysiinillä, vastaavassa järjestyksessä.
15 119514
Kun yksi tai useampi vaihtoehtoinen aminohappotähde insertoidaan johonkin annettuun asemaan, se osoitetaan seuraavasti:
D96V, N tai 5 D96V tai D96N
Lisäksi kun tässä identifioidaan jokin muuntamiseen sopiva asema ehdottamatta mitään spesifistä muunnosta, se tulee käsittää niin, että asemassa oleva aminohappotähde voidaan korvata millä tahansa aminohappotähteellä. Niinpä esimerkiksi kun 10 mainitaan asparagiinihapon muuntaminen asemassa 96, mutta sitä ei tarkenneta, se tulee ymmärtää niin, että asparagiinihappo voidaan poistaa tai korvata millä tahansa muulla aminohapolla, s.o. millä tahansa aminohapoista R, N, A, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V, tai jokin lisäaminohappotähde voidaan insertoida tähän asemaan.
15
Lopuksi vielä kun tässä identifioidaan jokin H. lanuginosa -lähtölipaasin mutaatio, se on tarkoitettu ymmärrettäväksi niin, että se käsittää myös mainitun lipaasin jonkin analogin (kuten edellä kuvattiin) samanlaisen mutaation.
20 Erään toisen aspektinsa mukaan keksintö koskee muunnosta, joka on rakennettu edellä kuvatulla keksinnön mukaisella menetelmällä.
Kun lipolyyttinen lähtöentsyymi on H. lanuginosa -lipaasi, joka on johdettavissa \kannasta DSM 4109, tai jokin sen analogi, kuten edellä kuvattiin, on eduksi, että V·· 25 muunnos käsittää mutaation vähintään yhdessä seuraavista asemista: S58, T64, S83, f 7 N94, K98,1100, A121, E129, D167, R205, K237,1252, P256 tai G263. On selvää, * i*i että kun kysymyksessä on korvaus, mikä tahansa muu aminohappotähde kuin villi- ΓΓ: tyypin aminohappotähde voidaan insertoida, kuten esimerkiksi jokin seuraavista aminohappotähteistä R, N, A, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V, D.
, 30
Sikäli kuin tämän keksinnön tekijät tietävät, näissä asemissa ei ole aikaisemmin ku- • · * vattu spesifejä mutaatioita.
* · « « v • I) *..,: Lisäksi keksintö koskee kannasta DSM 4109 johdettavissa olevan H. lanuginosa * 35 -lipaasin tai jonkin mainitun lipaasin analogin muunnosta, jossa aminohappotähde . ·, i L264 on korvattu jollakin aminohapolla, joka ei ole leusiini, s.o. millä tahansa ami- ' 1 nohapoista R, N, A, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V, D.
,Ä 119514 16
Edullisesti keksinnön mukainen muunnos käsittää vähintään yhden seuraavista mutaatioista K46R, E57G, G61S, S83T, S58F, D62C, T64R, I90F, G91A, N92H, N94I, N94K, L97M, K98I, I100V, D102K, A121V, E129K, D167G, R205K, E210W, K237M, N259W, I252L, D254W, P256T, G263A, L264Q tai T267W.
5 Näiden asemien on todettu olevan tärkeitä tai niiden ajatellaan olevan tärkeitä ent-symaattisen aktiivisuuden ja/tai detergentinsiedon kannalta. Aminohappotähteiden numerointi viittaa kypsän lipaasin aminohapposekvenssiin.
10 Edullisesti keksinnön tämän aspektin mukainen muunnos käsittää vähintään yhden seuraavista mutaatioista S83T, N94K, AI2IV, D167G, R205K.
On selvää, että esillä oleva keksintö kattaa H. lanuginosa -lähtölipaasin muunnokset, joissa on jokin kahden tai useamman tässä määritellyn mutaation yhdistelmä tai jokin 15 yhden tai useamman tässä määritellyn mutaation yhdistelmä jonkin julkaisujen WO 92/05249, WO 94/25577 ja WO 94/01541 mukaisen mutaation kanssa.
Vielä erään aspektinsa mukaan esillä oleva keksintö koskee H. lanuginosa -lähtölipaasin, joka on johdettavissa DSM 4109:stä, tai jonkin sen analogin muunnosta, 20 joka käsittää vähintään yhden seuraavista mutaatioista:
. ... N94K+D96A
"f S83T+N94K+D96N
-* · ·
'*.8\ E87K+D96V
*; / E87K+G91A+D96A
* *·5 N94K+F95L+D96H
*
AX21V+R2 05K+E210Q *.8 S F95C+D96N
G91S+L93V+F95C
* ϊ’ϊ E87K+G91A+D96R+I100V
f··
!*:’i E87K+G91A
»
S83T+E87K+Q249R S8 3T+E8 7K+W8 9G+G91A+N94K+D9 6V *·:·* N73D+S85T+E87K+G91A+N94K+D94A
'!**: E87K+G91A+L9 31+N94K+D9 6A
D167G+E210V
* «
N73D+E87K+G91A+N94I+D96G S83T+E87K+G91A+N92H+N9 4K+D9 6M
17 119514
E210W
E5 6T+D5 7L+19 0F+D9 6L+E99K E56R+D57L+V60M+D62N+S83T+D96P+D102E 5 D57G+N94K+K96L+L97M
E87K+G91A+D9 6R+110 0V+E12 9Κ+Κ237M+I252L+P256T+G2 63A+L2 64Q E56R+D57G+S58F+D62C+T64R+E87G+G91A+F95L+D96P+K98I+K237M K46R+E56R+G61S D102K 10 D167G
N73D+E87K+G91Α+Ν94I+D9 6G
E210V
E210W
Ν2 51W+D2 54W+T2 67W 15 S83T+E87K+G91A+N92H+N94K+D96M
Ε5 6R+I9 0F+D96L+E9 9Κ D57G+N94K+D96L+L97M
Näiden muunnosten on todettu olevan vähemmän riippuvaisia kalsiumista ja/tai sie- 20 tävän paremmin pesuainekomponentteja, kuten esimerkiksi ionitonta pinta-aktiivista alkoholietoksylaattia, ja niiden katsotaan sen vuoksi olevan erityisen käyttökelpoisia , pesuaine- tai astianpesuainetarkoituksiin. Muunnokset on rakennettu keksinnön mu- * · · ***.4 kaisella menetelmällä ja niille ovat sen vuoksi tunnusomaisia tehdyt mutaatiot ja niitä *;**. kuvataan enemmän tuonnempana olevissa esimerkeissä. On selvää, että vaihtoehtoi- 25 nen menetelmä näiden muunnoksien rakentamiseksi perustuisi suunnattuun mutage- * · * : ·* neesiin, jossa käytetään sopivia oligonukleotidikoettimia. Tämä menetelmä on esitet- **.:.* ty esimerkeissä 3-6.
• · * • · · • · * .
•
Keksinnön mukaisen muunnoksen ilmentäminen : #f: 30 Keksinnön mukaan mutatoitu SNA-sekvenssi, joka koodaa lipolyyttisen entsyymin :T: muunnosta, joka on valmistettu edellä kuvatuilla menetelmillä tai millä thansa alalla .Λ. tunnetulla vaihtoehtoisella menetelmällä, voidaan ilmentää entsyymin muodossa • · · käyttämällä jotakin ilmentämisvektoria, joka yleensä sisältää säätelysekvenssejä, jot-T* ka koodaavat jotakin promoottoria, operaattoria, ribosomisitomiskohtaa, translaation 35 aloitussignaalia ja mahdollisesti jotakin repressorigeeniä tai erilaisia aktivaattorigee-nejä.
Yhdistelmä-ekspressiovektori, joka kantaa keksinnön mukaista muunnosta koodaa- 18 119514 vaa DNA-sekvenssiä, voi olla mikä tahansa vektori, jolle voidaan kätevästi suorittaa yhdistemä-DNA-menetelmiä, ja vektorin valinta riippuu usein isäntäsolusta, johon se on määrä viedä. Niinpä vektori voi olla jokin itsenäisesti replikoituva vektori, s.o, vektori, joka esiintyy kromosominulkoisena yksikkönä ja jonka replikoituminen on 5 riippumatonta kromosomin replikoitumisesta, esimerkiksi plasmidi, bakteriofagi tai jokin kromosominulkoinen osa, minikromosomi tai keinotekoinen kromosomi. Vaihtoehtoisesti vektori voi olla sellainen, joka isäntäsoluun vietynä integroituu isäntäsolun genomiin ja replikoinut yhdessä kromosomi(e)n kanssa, johon (joihin) se on integroitunut.
10
Vektorissa DNA-sekvenssin tulisi olla operatiivisesti liittynyt johonkin sopivaan promoottorisekvenssiin. Promoottori voi olla mikä tahansa DNA-sekvenssi, jolla on transskriptionaalinen aktiivisuus valitussa isäntäsolussa ja joka voidaan johtaa geeneistä, jotka koodaavat proteiineja, jotka ovat joko homologisia tai heterologisia 1S isäntäsolun kanssa. Esimerkkejä sopivista promoottoreista keksinnön mukaista muunnosta koodaavan DNA-sekvenssin transskription ohjaamiseksi, erityisesti bakteeri-isännässä, ovat E. colin /ac-operonipromoottori, Streptomyces licheniformisik-sen a-amylaasigeeni(amyL)promoottorit, esimerkiksi kuten kuvataan julkaisussa WO 93/10249, Bacillus stearothermophilus maltogeeninen amylaasigeeni(amyM)-20 promoottorit, Bacillus amyloquefaciens a-amylaasi(amyQ)promoottorit, Bacillus subtilis xylA-ja xylB-geenipromoottorit jne. Esimerkkejä käyttökelpoisista promoot-. . toreista transkriptioon sieni-isännässä ovat sellaiset, jotka on johdettu geenistä, joka koodaa A. oryzae -Taka-amylaasia, Rhizomucor miehei -aspartiiniproteinaasia, • · * /.'*. A. niger -neutraalia α-amylaasia, A. niger -hapanta stabiilia α-amylaasia, A. niger * * · * *. .* 25 -glukoamylaasia, Rhizomucor miehei -lipaasia, A. oryzae -alkalista proteaasia, : : A. oryzae -trioosifosfaattiisomeraasia tai A. nidulans -asetamidaasia.
• · * • · · 1*1 • ·· • * * *·* ‘ Keksinnön mukainen ekspressiovektori voi myös käsittää jonkin sopivan transskrip tion lopettajan ja eukaryooteissa polyadenylaatiosekvenssejä, jotka ovat toiminnalli-v..: 30 sesti liittyneet keksinnön mukaista muunnosta koodaavaan DNA-sekvenssiin. Lope- • tl ·.· · tus- ja polyadenylaatiosekvenssit voivat sopivasti olla johdetut samoista lähteistä kuin promoottori.
♦ · ··· • · • · * * * Vektori voi lisäksi käsittää DNA-sekvenssin, joka tekee vektorin kykeneväksi repli- *: 35 koitumaan kysymyksessä olevassa isäntäsolussa. Esimerkkejä sellaisista sekvensseis- *\*l tä ovat plasmidien pUC19, pACYC177, pUBl 10, pE194, pAMBl ja pIJ702 repli- kaation aloituskohdat.
19 119514
Vektori voi myös käsittää jonkin seulottavan markkerin, esimerkiksi geenin, jonka tuote täydentää jonkin puutteen isäntäsolussa, kuten esimerkiksi dal-geenit, jotka on johdettu B. subtilisista tai B. licheniformiksesta, tai sellainen, joka antaa antibioottista resistenssiä, kuten ampisilliini-, kanamysiini-, kloramfenikoli- tai tetrasykliiniresis-5 tenssiä. Lisäksi vektori voi käsittää Aspergillus -seulontamarkkereita, kuten amdS, argB, niaD ja sC, markkeri, joka synnyttää hygromysiiniresistenssiä, tai seulonta voidaan suorittaa rinnakkaistransformaation avulla, esimerkiksi kuten kuvataan julkaisussa WO 91/17243.
10 Vaikka solunsisäinen ilmentäminen saattaa olla joissakin suhteissa edullista, yleensä parempana pidetään solunulkoista ekspressiota. Lipolyyttinen lähtöentsyymi voi itse sisältää esialueen, joka mahdollistaa ekspressoidun entsyymin erittymisen viljelyalus-taan. Haluttaessa tämä esialue voidaan korvata jollakin erilaisella esialueella tai sig-naalisekvenssillä, mikä tapahtuu kätevästi substituoimalla kysymyksessä olevia esi-15 alueita koodaavat DNA-sekvenssit.
Menettelytavat, joita käytetään keksinnön mukaisen DNA-rakenteen, joka koodaa jonkin lipolyyttisen lähtöentsyymin muunnosta, promoottorin, terminaattorin ja muiden osien, vastaavassa järjestyksessä, ligoimiseksi ja niiden insertoimiseksi sopiviin 20 vektoreihin, jotka sisältävät replikaatioon tarvittavan informaation, ovat alaan perehtyneiden hyvin tuntemia (vrt. esimerkiksi, Sambrook et ai, 1989).
• · · • · ·
Keksinnön mukaista solua, joka käsittää joko keksinnön mukaisen DNA-rakenteen • · · . tai ilmentämisvektorin, kuten edellä kuvattiin, käytetään edullisesti isäntäsoluna *; / 25 jonkin lipolyyttisen lähtöentsyymin keksinnön mukaisen muunnoksen tuottamiseen ♦ · * : ·/ yhdistelmätekniikalla. Solu voidaan transformoida keksinnön mukaisella DNA- « · « *···* rakenteella, kätevästi integroimalla DNA-rakenne isäntäkromosomiin. Tällainen in- ··· v : tegroiminen katsotaan yleensä edulliseksi, koska DNA-sekvenssi säilyy tällöin to dennäköisemmin stabiilina solussa. DNA-rakenteiden integroiminen isäntäkromo-*·.·*/ 30 somiin voidaan suorittaa konventionaalisilla menetelmillä, esimerkiksi homologisen :*: tai heterologisen rekombinaation avulla. Vaihtoehtoisesti solu voidaan transformoida jollakin ekspressiovektorilla, kuten tuonnempana erityyppisten isäntäsolujen yhtey- i * * M dessä kuvataan.
• * • * o» 35 Keksinnön mukainen solu voi olla jonkin korkeamman organismin, kuten nisäkkään :*·· j tai hyönteisen, solu, mutta edullisesti se on jokin mikrobisolu, esimerkiksi bakteeri- tai sienisolu (hiivat mukaanlukien).
20 119514
Esimerkkejä sopivista bakteereista ovat grampositiiviset bakteerit, kuten Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearother-mophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis tai 5 Streptomyces lividans tai Streptomyces murinus, tai gramnegatiiviset bakteerit kuten E. coli. Bakteerien transformaatio voidaan toteuttaa esimerkiksi protoplastitransfor-maatiolla tai käyttämällä kompetentteja soluja jollakin sinänsä tunnetulla tavalla.
Hiivaorganismiksi on suotuisaa valita jokin Saccharomyces- tai Schizosaccharo-10 myces-laji, esimerkiksi Saccharomyces cerevisiae. Rihmasieni voi edullisesti kuulua johonkin AspergillusAajiin, esimerkkeinä Arpergillus oryzae, Aspergillus niger tai Aspergillus nidulans. Sienisoluja voidaan transformoida menetelmällä, johon kuuluu protoplastin muodostaminen ja protoplastien transformoiminen ja sen jälkeen solu-seinän regeneroiminen sinänsä tunnetulla tavalla. Erästä sopivaa menettelytapaa As-15 perg/7/tts-isäntäsolujen transformoimiseksi kuvataan julkaisussa EP 238 023.
Vielä erään aspektinsa mukaan tämä keksintö koskee menetelmää jonkin lipolyytti-sen lähtöentsyymin keksinnön mukaisen muunnoksen tuottamiseksi, jossa menetelmässä viljellään jotakin isäntäsolua, kuten edellä kuvattiin, olosuhteissa, jotka johta-20 vat muunnoksen tuottamiseen, ja muunnos otetaan talteen soluista ja/tai viljelyalus-tasta.
• · · • · *
Viljelyalusta solujen viljelemiseksi voi olla mikä tahansa konventionaalinen alusta, . joka sopii kysymyksessä olevan isäntäsolun kasvattamiseen ja keksinnön mukaisen * *·· 25 lipolyyttisen lähtöentsyymin muunnoksen ilmentämiseen. Sopivia kasvatusalustoja • · · : · * on saatavissa kaupallisilta toimittajilta tai niitä voidaan valmistaa julkaistujen resepti · * tien mukaan (esimerkiksi American Type Culture Collectionin katalogeissa).
M» * · · • · · •
Keksinnön mukainen muunnos, joka on erittynyt isäntäsoluista, voidaan ottaa käteis*: 30 västi talteen viljelyalustasta tunnetuilla menettelytavoilla, mukaanlukien solujen : *: *: erottaminen alustasta sentrifiigoimalla tai suodattamalla ja viljelyalustan proteiinipi- a. * · ( toisten komponenttien säestäminen jonkin suolan, kuten ammoniumsulfaatin, avulla * · *.' ja sen jälkeen kromatograafisilla menetelmillä, kuten ioninvaihtokromatografialla, * I ' affiniteettikromatografialla tai vastaavilla.
·:·*: 35 :/·: Pesuaineen lisäaine ja koostumus astianpesua ja pyykinpesua varten
Keksinnön mukaisen muunnoksen vähäisemmän kalsiumriippuvuuden ja/tai paremman pesuaineiden tai pesuainekomponenttien siedon vuoksi se soveltuu erityisen 21 119514 hyvin käytettäväksi pesuainekoostumuksissa, esimerkiksi pesuainekoostumuksissa, jotka ovat tarkoitetut käytettäviksi pH-alueella 7-13, erityisesti pH-alueella 8-11.
Pesuainekoostumuksia 5 Keksinnön mukaisesti keksinnön mukainen lipaasimuunnos voi tyypillisesti olla jonkin pesuainekoostumuksen komponenttina. Sellaisena se voidaan sisällyttää pe-suainekoostumukseen pölyämättömänä granulaattina, stabiloituna nesteenä tai suojattuna entsyyminä. Pölyämättömiä granulaatteja voidaan valmistaa esimerkiksi kuten kuvataan US-patenteissa 4 106 991 ja 4 661 452 (molemmat Novo Industri 10 A/S:n) ja ne voidaan haluttaessa päällystää alalla tunnetuilla menetelmillä. Esimerk kejä vahamaisista päällystysaineista ovat polyeteenioksidi-tuotteet (polyeteeniglykoli, PEG), joiden keskimääräinen moolimassa on 1 000 - 20 000; etoksyloidut nonyylife-nolit, joissa on 16 - 50 eteenioksidiyksikköä; etoksyloidut rasva-alkoholit, joissa alkoholi sisältää 12-20 hiiliatomia ja joissa on 15 - 80 eteenioksidiyksikköä; rasva-15 alkoholit; rasvahapot; ja rasvahappojen mono- ja di- ja triglyseridit. Esimerkkejä kal voa muodostavista päällystysaineista, jotka sopivat leijupetimenetelmiin, annetaan GB-patentissa 1483591. Nestemäisiä entsyymi valmisteita voidaan esimerkiksi stabiloida lisäämällä jotakin polyolia, kuten esimerkiksi propeeniglykolia, jotakin sokeria tai sokerialkoholia, maitohappoa tai boorihappoa, vakiintuneilla menetelmillä. Alalla 20 tunnetaan muitakin entsyymien stabilaattoreita. Suojattuja entsyymejä voidaan valmistaa menetelmällä, jota kuvataan julkaisussa EP 238 216.
• I f • · 1 ' 1! p Keksinnön mukainen pesuainekoostumus voi olla missä tahansa sopivassa muodos- sa, esimerkiksi jauheena, granulaattina, pastana tai nesteenä. Nestemäinen pesuaine • · · *; / 25 voi olla vesipitoinen, sisältäen tyypillisesti enintään 70 % vettä ja 0 - 30 % orgaanista • 1 · ! ·1 liuotetta, tai vedetön.
* 1 · · • · · • ·· ,, 119514 kaisussa WO 92/06154).
Pesuainekoostumus voi lisäksi sisältää yhtä tai useampaa muuta entsyymiä, kuten jotakin amylaasia, pullulanaasia, kutinaasia, proteaasia, sellulaasia, peroksidaasia, 5 oksidaasia (esimerkiksi lakkaasia) ja/tai muuta lipaasia.
Pesuaine voi sisältää 1 - 65 % jotakin pesutehostetta tai kompleksointiainetta, kuten zeoliittia, difosfaattia, trifosfaattia, fosfonaattia, sitraattia, nitriloetikkahappoa (NTA) eteenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA), dieteenitriamiinipentaetikkahappoa 10 (DTMPA), alkyyli- tai alkenyylimeripihkahappoa, liukoisia silikaatteja tai kerrossili- kaatteja (esim. SKS-6 Hoechstiltä). Pesuaine voi myös olla tehostamaton, s.o. olennaisesti pesutehosteeton.
Pesuaine voi sisältää yhtä tai useampaa polymeeriä. Esimerkkejä ovat karboksime-15 tyyliselluloosa (CMC), polyvinyylipyrrolidoni (PVP), polyeteeniglykoli (PEG), po- lyvinyylialkoholi (PV A), polykarboksylaatteja, kuten polyakrylaatteja, maleiinihap-po/akryylihappokopolymeerejä ja lauryylimetakrylaatti/akryylihappokopolymeerejä.
Pesuaine voi sisältää jonkin valkaisusysteeminjoka voi käsittää jonkin H202-läh-20 teen, kuten perboraatin tai perkarbonaatin, johon voi olla yhdistettynä jokin perhap-poa muodostava valkaisun aktivaattori, kuten tetra-asetyylieteenidiamiini (TAED) tai . nonanyylioksibentseenisulfonaatti (NOBS). Vaihtoehtoisesti valkaisu-systeemi voi käsittää peroksihappoja, esimerkiksi amidi-, imidi- tai sulfonityyppistä.
• · ·
»M
• t
• *tJ
25 Keksinnön mukaisen pesuainekoostumuksen entsyymit voidaan stabiloida käyttä- • · * ! */ mällä konventionaalisia stabilointiaineita, esimerkiksi jotakin polyolia, kuten pro- · * *peeniglykolia tai glyserolia, jotakin sokeria tai sokerialkoholia, maitohappoa, boori- • ·: ! happoa tai jotakin boorihapon johdosta, kuten esimerkiksi jotakin aromaattista bo- raattiesteriä, ja koostumus voidaan formuloida kuten kuvataan esimerkiksi julkai- s 30 suissa WO 92/19709 ja WO 92/19708.
··· • · ! • · · . Pesuaine voi myös sisältää muita konventionaalisia pesuaineen aineosia, kuten esi- • « · merkiksi kankaiden hoitoaineita, savet mukaanlukien, vaahtoamisen tehosteita, saip- t · * t * puavaahdon estoaineita, korroosionestoaineita, lian suspendointiaineita, aineita, jot- *:**; 35 ka estävät likaa kerrostumasta takaisin vaatteisiin, väriaineita, bakteereja tuhoavia • · *·.*·: aineita, optisia kirkasteita tai hajustetta.
pH (mitattuna vesiliuoksessa käyttöpitoisuudella) on tavallisesti neutraali tai alkali- 23 1 1 951 4 nen, esimerkiksi alueella pH 7 - 11.
Keksinnön alaan sisältyvien pesuainekoostumusten erityismuotoja ovat: 5 (1) Granulaatiksi formuloitu pesuainekoostumus, jonka irtotiheys on vähintään 600 g/1 ja joka käsittää: -----1
Lineaarinen alkyylibentseenisulfonaatti 7 -12 % (happona laskettuna) __
Alkoholietoksisulfaatti (esim. C^g-alkoholi, 1-2 1 - 4 % EO) tai alkyylisulfaatti (esim. Cje-ie) _
Alkoholietoksylaatti(esim. Cu-is-alkoholi,7EO) _5-9%__
Natriumkarbonaatti (Na2C03:na) 14 - 20 %_
Liukoinen silikaatti (Na20,2Si02:na) 2 -6 %__
Zeoliitti (NaAlSi04:na) 15-22%
Natriumsulfaatti (NaiS04:na) 0-6% _
Natriumsitraatti/sitruunahappo 0-15% *·.:/ (C6H5Na307/C6H807:na) • · ' ' * *·· I/, Natriumperboraatti (NaB03.H20:na) 11-18%_ • · .1...1..
• Φ \i*.: TAED 2 - 6 % • «· »' —...
ϊ j :
Karboksimetyyliselluloosa 0-2%_ • 9 t
Polymeerejä (esim. maleiinihappo/akryylihappo- 0 - 3 % V : kopolymeeri, PVP, PEG) • --- .. _ — .. —-- • · • t · *t/. Entsyymejä (puhtaana entsyymiproteiinina lasket- 0,0001-0,1% | · ;·* tuna) *·*·♦ • * : Vähäisempiä aineosia (esim. saippuavaahdon vai- 0 - 5 % • ·· mentaj ia, hajustetta, optista kirkastetta, valovalkai- suaineita) __ 24 119514 (2) Granulaatiksi formuloitu pesuainekoostumus, jonka irtotiheys on vähintään 600 g/1 ja joka käsittää:
Lineaarinen alkyylibentseenisulfonaatti 6 - 11 % (happona laskettuna)
Alkoholietoksisulfaatti (esim. Ci2-i8-alkoholi, 1-2 1 - 3 % EO tai alkyylisulfaatti (esim. Ci6.i8)
Alkoholietoksylaatti(esim. Ci4_i5-alkoholi,7EO) 5-9% I
Natriumkarbonaatti (Na2C03:na) 15-21 %
Liukoinen silikaatti (Na20,2Si02:na) 1 - 4 %
Zeoliitti (NaAlSi04:na) 24 - 34 %
Natriumsulfaatti (Na2S04:na) 4 -10 %
Natriumsitraatti/sitruunahappo 0 -15 % (C6H5Na307/C6H807:na)__
Karboksimetyyliselluloosa 0 - 2 % • · · ' ......... , , , 1 ------' • · · ··· : Polymeerejä (esim. maleiinihappo/akryylihappo- 1 - 6 % kopolymeeri, PVP, PEG) • · - . . ......... . -......- -------- • 1 • · 1 ** ; Entsyymejä (puhtaana entsyymiproteiinina lasket- 0,0001-0,1 % « · · *;» tuna) -- • Vähäisempiä aineosia (esim. saippuavaahdon vai- 0-5% . ·1· mentimia, hajustetta) ·· · • · · • · 1 · • · · • · · * · V·· t : • · * • 1 « • · · • ·· • · 25 1 1 951 4 (3) Granulaatiksi formuloitu pesuainekoostumus, jonka irtotiheys on vähintään 600 g/1 ja joka käsittää:
Lineaarinen alkyylibentseenisulfonaatti 5 - 9 % (happona laskettuna)
Alkoholietoksylaatti (esim. Cu-is-alkoholi, 7 EO) 7 -14 %
Saippua rasvahappona (esim. C16.22-rasvahappo) 1 - 3 %
Natriumkarbonaatti (Na2C03:na) 10 -17 %
Liukoinen silikaatti (Na20,2Si02:na) 3 - 9 %
Zeoliitti (NaAlSi04:na) 23 - 33 %
Natriumsulfaatti (Na2S04:na) 0 - 4 %
Natriumperboraatti (NaB03.H20:na) 8 -16 % TAED 2 - 8 %
Fosfonaatti (esim. EDTMPA) 0 -1 %
Karboksimetyyliselluloosa 0-2% • ...................
’**. Polymeerejä (esim. maleiinihappo/akryylihappo- 0 - 3 % **..1 kopolymeeri, PVP, PEG) • · —" ------------------ • · *·,·,'1 Entsyymejä (puhtaana entsyymiproteiinina lasket- 0,0001 -0,1 % tuna)
Pienempiä aineosia (esim. saippuavaahdon vai- 0 - 5 % mentajia, hajustetta, optisia kirkasteita) 9 • f • 1 · 9 91 9 · • · t : • · 1 • · • « · • 1· • · (4) Granulaatiksi formuloitu pesuainekoostumus, jonka irtotiheys on vähintään 600 g/1 ja joka käsittää: 26 1 1 95 1 4
I-^ I
Lineaarinen alkyylibentseenisulfonaatti 8 - 12 % (happona laskettuna)
Alkoholietoksylaatti (esim. C[4_i5-alkoholi, 7 EO) 10 - 25 %
Natriumkarbonaatti (Na2C03:na) 14 - 22 %
Liukoinen silikaatti (Na20,2Si02:na) 1 - 5 %
Zeoliitti (NaAlSi04:na) 25 - 35 %
Natriumsulfaatti (Na2S04:na) 0 -10 %
Karboksimetyyliselluloosa 0 - 2 %
Polymeerejä (esim. maleiinihappo/akryylihappo- 0 - 3 % kopolymeeri, PVP, PEG)
Entsyymejä (puhtaana entsyymiproteiinina lasket- 0,0001 - 0,1 % tuna) _ • · 1 I i.l .................. ....... .11·« —Il -
«M
* Vähäisempiä aineosia (esim. saippuavaahdon vai- 0-5% m t *·.1·: mentaj ia, hajustetta) • · 1^·^—^— • · 1 * · • * 1 · * 1 · • ® · tn· • · · « · « *
• 1 J
• » · ··· ·1· » 1 1 • · 1 • 1 * · ! • · 1 • · t : ··· · • · · • «· • (5) Vesipitoinen nestemäinen pesuainekoostumus, joka käsittää 27 1 1 95 1 4
Lineaarinen alkyylibentseenisulfonaatti 15-21% | (happona laskettuna)
Alkoholietoksylaatti (esim. Cl2.i5-alkoholi, 7 EO 12 -18 % tai Cn.is-alkoholi, 5 EO)
Saippua rasvahappona (esim. oleiinihappo) 3 -13 %
Alkenyylimeripihkahappo (C12-i4) 0 -13 %
Aminoetanoli 8 -18 %
Sitruunahappo 2 - 8 %
Fosfonaatti 0 - 3 %
Polymeerejä (esim. PVP, PEG) 0 - 3 %
Boraatti (B407:na) 0 - 2 %
Etanoli 0 - 3 % • · 1 ........ 1 --
• · 1 R
• V · . ·1· Propeeniglykoli 8 -14 % ·1· - • i • · · *; / Entsyymejä (puhtaana entsyymiproteiinina lasket- 0,0001 -0,1 % : ; tuna) 5 -- ··· i13": Vähäisempiä aineosia (esim. dispergointiaineita, 0-5%
Isaippuavaahdon valmentajia, hajustetta, optista kirkastetta)
Ml • 1 5 • 1 · • · I · · • · · « · M· : :
• M
• 1 I · · • ·· • · 119514 (6) Vesipitoinen strukturoitu nestemäinen pesuainekoostumus, joka käsittää 28 | Lineaarinen alkyylibentseenisulfonaatti 15 - 21 % (happona laskettuna)
Alkoholietoksylaatti (esim. Ci2-i5-alkoholi, 7 EO 3 - 9 % tai Ci2-i5-alkoholi, 5 EO)
Saippua rasvahappona (esim. oleiinihappo) 3 -10 %
Zeoliitti (NaAlSi04:na) 14-22 %
Kaliumsitraatti 9 -18 %
Boraatti (B407:na) 0-2%
Karboksimetyyliselluloosa 0 - 2 %
Polymeerejä (esim. PVP, PEG) 0 - 3 %
Ankkurointipolymeerejä, kuten esim. lauryylime- 0 - 3 % takrylaatti/akryylihappokopolymeeri; moolisuhde 25:1; MW 3800 • * » 7 * · ♦ " 1 " 1 *·*
Glyseroli 0-5% • * — .1 I 1 111 1 -- » * t * *·
Entsyymejä (puhtaana entsyymiproteiinina lasket- 0,0001 -0,1% * · tuna)
t * · — I -I ... — —II. I. .1 I
«·· • f» 1 I Vähäisempiä aineosia (esim. dispergointiaineita, 0 - 5 % i saippuavaahdon valmentajia, hajustetta, optisia [kirkasteita) ··« k™*™:................ .......... - f f * • · · • · · 1 * ··· f : ··* » • · » » • · · « i* * · 29 119514 (7) Granulaatiksi formuloitu pesuainekoostumus, jonka irtotiheys on vähintään 600 g/1 ja joka käsittää: --
Rasva-alkoholisulfaatti 5 -10 %
Etoksyloitu rasvahappomonoetanoliamidi 3 - 9 %
Saippua rasvahappona 0 - 3 %
Natriumkarbonaatti (Na2C03:na) 5 -10 %
Liukoinen silikaatti (Na20,2Si02:na) 1 - 4 %
Zeoliitti (NaAlSi04:na) 20 - 40 %
Natriumsulfaatti (Na2S04:na) 2 1 8 %
Natriumperboraatti (NaB03.H20:na) 12-18% TAED 2 - 7 %
Polymeerejä (esim. maleiinihappo/akryylihappo- 0 - 5 % kopolymeeri, PVP, PEG) 9
• · J
’ 1:; Entsyymejä (puhtaana entsyymiproteiinina lasket- 0,0001 -0,1% *·1··1 tuna) :-- • · ·' 2: Vähäisempiä aineosia (esim. optista kirkastetta, 0 - 5 % , ·,1· saippuavaahdon valmentajia, hajustetta) ··» f 1 1 » « · *· · • · «ti 9 · « « * I « . 1 1 9 9 · • · 991 f ; »«« * 9 |«M • « I • · · 2
* M
(8) Granulaatiksi formuloitu pesuainekoostumus, joka käsittää: 30 1 1 95 1 4
Lineaarinen alkyylibentseenisulfonaatti 8 -14 % (happona laskettuna)
Etoksyloitu rasvahappomonoetanoliamidi 5 -11 %
Saippua rasvahappona 0 - 3 %
Natriumkarbonaatti (Na2C03:na) 4 -10 %
Liukoinen silikaatti (Na20,2Si02:na) 1 - 4 %
Zeoliitti (NaAlSi04:na) 30 - 50 %
Natriumsulfaatti (Na2S04:na) 3 -11 %
Natriumsitraatti (CeHsNasOyina) 5-12%
Polymeerejä (esim. PVP, maleiinihappo/akryyli- 1 - 5 % happokopolymeeri, PEG)
Entsyymejä (puhtaana entsyymiproteiinina lasket- 0,0001 - 0,1 % tuna) * ,j · · t · · ’/*. Vähäisempiä aineosia (esim. saippuavaahdon vai- 0 - 5 % '* mentajia, hajustetta)
« V · L—^^KM
* « • · · f 4 « ··· I» · m · f • * * • V ·
Ml M* • · · • PV f
V
•V.
• v * • ·
«M
% : w* v •
V
% I 4 f · 4 M V * 3i 119514 (9) Granulaatiksi formuloitu pesuainekoostumus, joka käsittää:
Lineaarinen alkyylibentseenisulfonaatti 6 -12 % I
(happona laskettuna) I
Ioniton pinta-aktiivinen aine 1 - 4 %
Saippua rasvahappona 2 - 6 %
Natriumkarbonaatti (Na2C03:na) 14-22%
Zeoliitti (NaAlSi04:na) 18 - 32 %
Natriumsulfaatti (Na2S04:na) 5 - 20 %
Natriumsitraatti (C6H5Na307:na) 3 - 8 %
Natriumperboraatti (NaB03.H20) 4 - 9 %
Valkaisun aktivaation (esim. NOBS tai TAED) 1 - 5 %
Karboksimetyyliselluloosa 0 - 2 %
Polymeerejä (esim. polykarboksylaatti tai PEG) 1 - 5 % | • I ' I II · I I I Β·ΙΙΙΙ·. ... ... fl
* · 1 B
* · · I
, Entsyymejä (puhtaana entsyymiproteiinina lasket- 0,0001 -0,1 % 1
.1·!1: tuna) I
Φ · · — 1 1 ................ " ' — - I - - J
• 1 I
• 1 I
: V Vähäisempiä aineosia (esim. optista kirkastetta, 0 - 5 % I
* I
hajustetta) I
• · 1 • · · * • 1 # • · · ··1 • · 1 • · 1
I f I
« « · * « · • · · • 1 * · · • 1 • · * 1 · · • · • · · • · · • · 32 1 1 95 1 4 (10) Vesipitoinen nestemäinen pesuainekoostumus, joka käsittää
Lineaarinen alkyylibentseenisulfonaatti 15 - 23 % (happona laskettuna)
Alkoholietoksisulfaatti (esim. C^-is-alkoholi, 2-3 8 -15 % EO)
Alkoholietoksylaatti (esim. Ci2-i5-alkoholi, 7 EO 3 - 9 % tai Ci2.i5-alkoholi, 5 EO)
Saippua rasvahappona (esim. lauriinihappo) 0 - 3 %
Aminoetanoli 1 - 5 %
Natriumsitraatti 5 -10 %
Hydrotrooppinen aine (esim. natriumtolueenisul- 2 - 6 % fonaatti)
Boraatti (B407:na) 0 - 2 %
Karboksimetyyliselluloosa 0 -1 % *
Etanoli 1 - 3 % • ® · “ ............
• · · : 1 ·.: Propeeniglykoli 2 - 5 % • · - . — • · · · : ; Entsyymejä (puhtaana entsyymiproteiinina lasket- 0,0001 -0,1 % • 1 1 tuna) • 1 · 1 1 1 " 1 1 1 — 1 ........... ' ' .,,1 III— ..... ' * · 1 Vähäisempiä aineosia (esim. polymeerejä, disper- 0 - 5 % ; gointiaineita, hajustetta, optisia kirkasteita) ··· t · » • f · • · • « · • i » • · • · · i : • · · • · « t • · 1 • · 1 • · (11) Vesipitoinen nestemäinen pesuainekoostumus, joka käsittää 33 119514
Lineaarinen alkyylibentseenisulfonaatti 20 - 32 % (happona laskettuna) j
Alkoholietoksylaatti (esim. Cu-is-alkoholi, 7 EO 6 -12 % I
Itai Cu-is-alkoholi, 5 EO)
Aminoetanoli 2 - 6 %
Sitruunahappo 8 -14 %
Boraatti (B407:na) 0 - 3 %
Polymeerejä (esim. maleiinihappo/akryylihappo- 0 - 3 % kopolymeeri, ankkurointipolymeeri, kuten esim. lauryylimetakrylaatti/akryylihappokopolymeeri)
Glyseroli 3 - 8 %
Entsyymejä (puhtaana entsyymiproteiinina lasket- 0,0001 - 0,1 % tuna) . Vähäisempiä aineosia (esim. hydrotrooppisia ainei- 0-5% • · · . ta, dispergointiaineita, hajustetta, optisia kirkastei- __ • · • 1 * · · • · • · • 1 · · · * ·· • ·· • · t • ♦ · • 1 · • · · * · · ··♦ • · · • 1 · * • · m 1 · • · · • · • · · t : * 1 1 · • · • · · • · ♦ • · 34 1 1 95 1 4 (12) Granulaatiksi formuloitu pesuainekoostumus, jonka irtotiheys on vähintään 600 g/1 ja joka käsittää: I-:-^-1
Anioninen pinta-aktiivinen aine (lineaarista alkyy- 25 - 40 % j libentseenisulfonaattia, alkyylisulfaattia, alfa-ole-fiinisulfaattia, alfa-sulforasvahappometyyli-estereitä, alkaanisulfonaatteja, saippuaa)
Ioniton pinta-aktiivinen aine (esim. alkoholietoksy- 1 -10 % laattia)
Natriumkarbonaatti (Na2C03:na) 8 - 25 %
Liukoisia silikaatteja (Na2C03:na) 5 -15 %
Natriumsulfaatti (Na2S04:na) 0 - 5 %
Zeoliitti (NaAlSi04:na) 15 - 28 %
Natriumperboraatti (NaB03.H20) 0 - 20 %
Valkaisun aktivaattori (esim. NOBS tai TAED) 0 - 5 % . .·. Entsyymejä (puhtaana entsyymiproteiinina lasket- 0,0001 -0,1 % . tuna)_ * · · -- ,,, --------- - • · · • · Vähäisempiä aineosia (esim. hajustetta, optisia 0 - 3 % • · : kirkasteita) * 1 1 * « · • · · • · t · · • · · * 1 · • 1 · ♦ ·· • · · * · 1 « t « • 1 * 1 1 • 1 · • · • · · t : · · · * · * · · • · · • 1 35 119514 (13) Kohdissa (1)-(12) kuvattuja pesuaineformulaatioita, joissa koko lineaarinen alkyylibentseenisulfonaatti tai osa siitä on korvattu (Ci2-Ci8)-alkyylisulfaatilla.
(14) Granulaatiksi formuloitu pesuainekoostumus, jonka irtotiheys on vähintään 5 600 g/1 ja joka käsittää: (Ci21Ci8)-alkyylisulfaatti 9 -15 %
Alkoholietoksylaatti 3 - 6 %
Polyhydroksialkyylirasvahappoamidi 1 - 5 %
Zeoliitti (NaAlSi04:na) 10 - 20 %
Kerrostettu disilikaatti (esim. SK56 Hoechstiltä) 10 - 20 %
Natriumkarbonaatti (Na2CC>3:na) 3 -12 %
Liukoisia silikaatteja (Na2C(>3:na) 0 - 6 %
Natriumsitraatti 4 - 8 % —
Natriumperkarbonaatti 13 - 22 % « · · TAED 3-8% • # · * · · 11 ’ ··· • · *·,'·: Polymeerejä (esim. polykarboksylaatteja ja PVP) 0 - 5 % • · _ .. .
• · · • · .2, Entsyymejä (puhtaana entsyymiproteiinina lasket- 0,0001 -0,1 % ',Y, tuna) • · » __ _ « · · ............ " “ f .............. 11 Vähäisempiä aineosia (esim. optista kirkastetta, 0 - 5 % vj valovalkaisuainetta, hajustetta, saippuavaahdon valmentajia) • ♦ • « · • · · • · * · · i : • · · · 2 • t • · · • · · • 1 36 1 1 951 4 (15) Granulaatiksi formuloitu pesuainekoostumus, jonka irtotiheys on vähintään 600 g/1 ja joka käsittää (Cl2-Ci8)-alkyylisulfaatti 4 - 8 %
Alkoholietoksylaatti 11 -15 %
Saippua 1 - 4 %
Zeoliitti MAP tai zeoliitti A 35 - 45 %
Natriumkarbonaatti (Na2C03:na) 2 - 8 %
Liukoinen silikaatti (Na2C03:na) 0 - 4 %
Natriumperkarbonaatti 13 - 22 % TAED 1 - 8 %_
Karboksimetyyliselluloosa 0 - 3 % 1 Polymeerejä (esim, polykarboksylaatteja ja PVP) 0 - 3 %
Entsyymejä (puhtaana entsyymiproteiinina lasket- 0,0001 - 0,1 % ·*,:/ tuna) • -------------- -------------- -----.......... ' s.:.: ,*** · Vähäisempiä aineosia (esim. optista kirkastetta, 0 - 3 % * · · fosfonaattia, hajustetta) * · • * · • « · • ·· M» v : 5 (16) Kohdissa (1)-(15) kuvattuja pesuainekoostumuksia, jotka sisältävät jotakin stabiloitua tai kapseloitua perhappoa, joko lisäkomponenttina tai korvaamassa jo i.:> spesifioituja valkaisusysteeraejä.
·· • ® · • · * (17) Kohdissa (1), (3), (7), (9) ja (12) kuvattuja pesuainekoostumuksia, joissa per-*:’.*,* 10 boraatti on korvattu perkarbonaatilla.
i : • · · *:**: (18) Kohdissa (1), (3), (7), (9), (12), (14) ja (15) kuvattuja pesuainekoostumuksia, : * ·.: jotka lisäksi sisältävät jotakin mangaanikatalyyttiä. Mangaanikatalyytti voi esimer kiksi olla jokin yhdisteistä, joita kuvataan artikkelissa "Efficient manganese catalysts 37 1 1 95 1 4 for low-temperature bleaching", Nature 369.1994, ss. 637-639.
(19) Pesuainekoostumus, joka on formuloitu vettä sisältämättömäksi pesunesteeksi, joka sisältää jotakin nestemäistä ionitonta pinta-aktiivista ainetta, kuten esimerkiksi 5 lineaarista alkoksyloitua primaarista alkoholia, jonkin tehostesysteemin (esimerkiksi fosfaattia), entsyymiä ja alkalia. Pesuaine voi sisältää myös anionista pinta-aktiivista ainetta ja/tai jonkin valkaisusysteemin.
Jokin keksinnön mukainen lipaasimuunnos voidaan sisällyttää pitoisuuksina, joita 10 konventionaalisesti käytetään pesuaineissa. Tällä hetkellä ajatellaan, että keksinnön mukaiseen pesuainekoostumukseen keksinnön mukaista lipaasimuunnosta voidaan lisätä määränä, joka vastaa 0,00001 -1 mg (puhtaana entsyymiproteiinina laskettuna) lipaasimuunnosta/litra pesunestettä.
15 Astianpesuainekoostumuksia
Astianpesuainekoostumus käsittää jonkin pinta-aktiivisen aineen, joka voi olla anioniton, ioniton, kationinen, amfoteerinen tai jokin näiden tyyppien seos. Pesuaine sisältää 0 - 90 % ionitonta pinta-aktiivista ainetta, kuten matalavaahtoisia tai vaahto-amattomia etoksyloituja propoksyloituja suoraketjuisia alkoholeja.
20
Pesuainekoostumus voi sisältää pesuaineen tehostesuoloja, jotka tyypiltään ovat epäorgaanisia ja/tai orgaanisia. Pesuaineiden tehosteet voidaan jakaa fosforia sisältäviin :,:]·* ja fosforittomiin tyyppeihin. Pesuainekoostumus sisältää tavallisesti 1 - 90 % pesuai- ϊ neen tehosteita.
• · ·* i 25 • · . v. Esimerkkejä fosforia sisältävistä epäorgaanisista emäksisistä pesutehosteista, kun • · . niitä on läsnä, ovat vesiliukoiset suolat, erityisesti alkalimetallipyrofosfaatit, -orto- ,···, fosfaatit, polyfosfaatit ja fosfonaatit. Esimerkkejä fosforittomista epäorgaanisista te- » i t hosteista, kun niitä on läsnä, ovat vesiliukoiset alkalimetallikarbonaatit, -boraatit ja . 30 -silikaatit samoin kuin erityyppiset vesiliukoiset kiteiset tai amorfiset alumiinisili- f;;1 kaatit, joista silikaatit ovat tunnetuimpia edustajia.
• · « • · i *
Esimerkkejä sopivista orgaanisista tehostesuoloista ovat alkalimetalli-, ammonium- i' * *: ja substituoidut ammoniumsitraatit, -sukkinaatit, -malonaatit, rasvahapposulfonaatit, • · ' , 35 karboksimetoksisukkinaatit, ammoniumpolyasetaatit, karboksylaatit, polykarboksy- *. laatit, aminopolykarboksylaatit, polyasetyylikarboksylaatitjapolyhydroksisulfonaatit.
• · · t ·· • ·
Muita sopivia orgaanisia tehosteita ovat moolimassaltaan suuremmat polymeerit ja kopolymeerit, joilla tiedetään olevan tehostavia ominaisuuksia, esimerkiksi sopivat polyakryylihappo-, polymaleiinihappo-ja akryylihappo/polymaleiinihappokopoly- meerit ja niiden suolat.
38 119514 5 Astianpesuainekoostumus voi sisältää kloriini/bromiinityyppisiä tai happityyppisiä valkaisuaineita. Esimerkkejä epäorgaanisista kloriini/bromiinityyppisistä valkaisuaineista ovat litium-, natrium- tai kalsiumhypokloriitti ja -hypobromiitti sekä kloorattu trinatriumfosfaatti. Esimerkkejä orgaanisista kloriini/bromiinityyppisistä valkaisuaineista ovat heterosykliset N-bromi-ja N-kloori-imidit, kuten trikloori-isosyanuuri-10 happo, tribromi-isosyanuurihappo, dibromi-isosyanuurihappo ja dikloori-isosyanuu-rihappo ja niiden suolat vesiliukoisten kationien, kuten kaliumin ja natriumin, kanssa. Hydantoiiniyhdisteet ovat nekin sopivia.
Happivalkaisuaineet ovat edullisia, esimerkiksi jonkin epäorgaanisen persuolan 15 muodossa, edullisesti jonkin valkaisuaineen prekursorin kanssa tai peroksihappoyh-disteenä. Tyypillisiä esimerkkejä peroksivalkaisuaineista ovat alkalimetalliperbo-raatit, sekä tetrahydraatit että monohydraatit, alkalimetalliperkarbonaatit, -persili-kaatit ja -perfosfaatit. Parhaiksi katsottuja aktivaattoriaineita ovat TAED ja glyserolitriasetaatti.
20
Keksinnön mukainen astianpesuainekoostumus voidaan stabiloida käyttämällä konventionaalisia entsyym(e)ille tarkoitettuja stabilaattoreita, esimerkiksi jotakin polyo- • :*: lia, kuten esimerkiksi propeeniglykolia, jotakin sokeria tai sokerialkoholia, maito- ·· · . . *. happoa, boorihappoa tai jotakin boorihapon johdosta, esimerkiksi jotakin aromaattis- 25 ta boraattiesteriä.
• ·* • · • · • ♦ · * 9 * ' Astianpesuainekoostumus voi sisältää myös muita entsyymejä, erityisesti jotakin *;amylaasia, proteaasia ja/tai sellulaasia.
* · · • i i 30 Keksinnön mukainen astianpesuainekoostumus voi sisältää myös muita konventio- :: naalisia pesuaineen lisäaineita, esimerkiksi flokkulaationestoaineita, täyteaineita, :T; vaahdonestoaineita, korroosionestoaineita, lian suspendointiaineita, sekvestrausainei- ,·*·, ta, aineita, jotka estävät likaa kerrostumasta takaisin astioihin, vedenpoistoaineita, • · · väriaineita, bakteereja tuhoavia aineita, fluoresoivia aineita, sakeutusaineita ja hajus- *;·* 35 teitä.
* ···· 9 · : \: Lopuksi vielä keksinnön mukaista muunnosta voidaan käyttää konventionaalisissa astianpesuaineissa, esimerkiksi missä tahansa pesuaineista, joita kuvataan missä tahansa seuraavista julkaisuista: EP 551670, EP533239, WO 9303129, EP 507404, 119514 39 US 5141664, GB 2247025, EP 414285, GB 2234980, EP 408278, GB 2228945, GB 2228944, EP 387063, EP 385521, EP 373851, EP 364260, EP 349314, EP331370, EP318279, EP 318204, GB 2204319, EP 266904, US 5213706, EP 530870, CA 2006687, EP 481547, EP 337760, WO 93/14183, US 5223179, 5 WO 93/06202, WO 93/05132, WO 92/19707, WO 92/09680, WO 92/08777, WO 92/06161, WO 92/06157, WO 92/06156, WO 91/13959, EP 399752, US 4941988, US 4908148.
Lisäksi keksinnön mukaisia lipaasimuuimoksia voidaan käyttää pehmennyskoostu-10 mukeissa:
Lipaasimuunnosta voidaan käyttää kankaiden pehmennysaineissa, esimerkiksi sellaisissa, joita kuvataan julkaisussa Surfactant and Consumer Products, toim. J. Falbe, 1987, ss. 295-296; Tenside Surfactants Detergents, 30, (1993), 6, ss. 394-399; 15 JAOCS, Voi. 61 (1984), 2, ss. 367-376; EP 517 762; EP 123 400; WO 92/19714; WO 93/19147; US 5 082 578; EP 494 769; EP 544 493; EP 543 562; US 5 235 082; EP 568 297; EP 570 237.
Keksintöä kuvataan edelleen liitteenä olevissa piirustuksissa, joissa 20 kuvio 1 on pYESHL:n restriktiokartta, kuvio 2 on plasmidin pAOl restriktiokartta, : ·*: kuvio 3 on plasmidin pAHL restriktiokartta ja . . *. kuviot 4 ja 5 kuvaavat keksinnön mukaista muunnosta koodaavien geenien rakenta- .·.: 25 mistä.
• ·· * · • · • · · • · ’ Keksintöä kuvataan edelleen seuraavissa esimerkeissä, joita ei ole tarkoitettu rajoit- tamaan millään tavoin patenttivaatimuksissa esitetyn keksinnön suoja-alaa.
: ;: 30 Materiaaleja ja menetelmiä
Humicola lanuginosa DSM 4109, joka on saatavissa laitoksesta Deutsche Sammlung · von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroderweg lb, D-3300, ,·*·. Braunschweig, Saksan liittotasavalta.
f · · • · ··· t : " * 35 pYESHL on hiiva/E. coli -sukkulavektori, joka ilmentää ja erittää vähän H. lanugi- • _ _ nosa -lipaasia hiivassa. Tarkemmin määriteltynä pYESHL on johdos pYES2:sta (ostettu Invitrogen Corp.ilta, UK), josta GALl-promoottori katkaistiin pois ja
Humicola lanuginosa -lipaasigeeni ja TPI (trioosifosfaatti-isomeraasi)-promoottori S. cerevisiaesta (Alber, T. ja Kawasaki, G., J. Mol. Appln. Genet. 1, 419-434, 1982) 119514 40 kloonattiin Sphl- ja Xbal-kohtien väliin. pYESHL:n restriktiokartta on esitetty kuviossa 1.
Matalakalsiumsuodatinmenetelmä 5 Menettelytapa 1) Varustetaan SC Ura replikointimaljoja (käyttökelpoisia ekspressiovektoiia kantavien kantojen seulomiseen) ensimmäisellä proteiinia sitovalla suodattimena (nylon-kalvoa) ja toisella heikosti proteiinia sitovalla suodattimella (selluloosa-asetaattia) päällimmäiseksi.
10 2) Levitetään hiivasoluja, jotka sisältävät lähtölipaasigeenin tai mutagenisoidun lipaasigeenin, kaksoissuodattimelle ja inkuboidaan 2 tai 3 vuorokautta 30 °C:ssa.
3) Pesäkkeet pidetään ylemmällä suodattimella siirtämällä yläsuodatin uudelle 15 maljalle.
4) Siirretään proteiinia sitova suodatin tyhjälle petrimaljalle.
5) Kaadetaan agaroosiliuos, joka sisältää oliiviöljyemulsion (2 % P.V.A. Oliiviöljy
20 = 3:1), kiiltovihreää (indikaattori, 0,004 %), 100 mM tris-puskuria pH 9 ja EGTA
(lopullinen konsentraatio 5 mM) alasuodattimelle pesäkkeiden, jotka ilmentävät lipaasiaktiivisuutta sinivihreinä pilkkuina, identifioimiseksi.
* • * · i i t «· , 6) Identifioidaan vaiheessa 5) todetut pesäkkeet, joilla on vähäisempi riippuvuus .·"· 25 kalsiumista lähtölipaasiin verrattuna.
« it • · • · * · · : ’ Dobanol™25-7 -suodatinmenetelmä: | * · \\\ Seulonta paremman pesuainekomponentin siedon suhteen suoritetaan käyttämällä :' suodatinkoetta, joka vastaa edellä kuvattua lukuunottamatta sitä seikkaa, että kohdas- 30 sa 5) määritelty liuos sisältää lisäksi 0,02 % Dobanol™25-7.
• · · • · · «·« jT: Satunnaismutagenisoitujen kirjastojen rakentaminen .*.t a) Kokonaista lipaasia koodaavan geenin käyttö
Plasmidia pYESHL käsitellään 12 M muurahaishapolla 20 minuuttia huoneenläm-*:** 35 pötilassa. Saatu lipaasia koodaava geeni monistetaan muurahaishapolla käsitellystä *:*’· plasmidista käyttämällä PCR:ä mutageenisissa olosuhteissa (0,5 mM MnCl2 ja 1/5 ATP:n normaalista määrästä, katso esim. Leung et ai., 1989.
Tämän käsittelyn odotetaan tuottavan laajan valikoiman mutaatioita, koska muura- 4i 119514 haishappo tuottaa pääasiassa transversioita ja PCR:n avulla synnytetyt mutaatiot pääasiassa transitioita.
Saadut PCR-firagmentit kloonataan joko kaksoisrekombinaation avulla (Muhlrad et 5 ai., 1992) in vivo sukkulavektoriin tai digeroidaan ja ligoidaan sukkulavektoriin ja transformoidaan E. coli.
Kahdeksan satunnaisesti poimittua kloonia sekvensoitiin ja niiden todettiin sisältävän keskimäärin 2-3 mutaatiota - sekä transversioita että transitioita.
10 Tätä menetelmää käyttäen tehtiin seitsemän kirjastoa, jotka sisälsivät 10 000 -140 000 kloonia.
b) Paikallisen satunnaismutageneesin suorittaminen 15 Syntetisoidaan mutageeninen aluke (oligonukleotidi), joka vastaa DNA-sekvenssin mutagenisoitavaa osaa lukuunottamatta nukleotidia (nukleotideja), joka vastaa mu-tagenisoitavaa aminohappokodonia (jotka vastaavat mutagenisoitavia amino-happo-kodoneja).
20 Sen jälkeen saatua mutageenista aluketta käytetään PCR-reaktiossa sopivan vastin-alukkeen kanssa. Saatu PCR-fragmentti puhdistetaan ja digeroidaan ja kloonataan sukkulavektoriin. Vaihtoehtoisesti ja mikäli on tarpeen, saatua PCR-fragmenttia • ·*: käytetään toisessa PCR-reaktiossa alukkeena toisen sopivan vastinalukkeen kanssa ·« · , ,·. mutagenisoidun alueen digestion ja kloonauksen mahdollistamiseksi sukkulavekto- ,**’j 25 riin. PCR-reaktiot toteutetaan normaaleissa olosuhteissa.
• «· * · • * * ♦ * • · ^ DNA-sekvensointi suoritettiin käyttämällä Applied Biosystems ABI:n DNA- sekvens-simallia 373A ABI Dye Terminator Cycle Sequencing -pakkauksen ohjeiden *·' ' mukaisesti.
30 *.:/ Esimerkit ΓΓ: Esimerkki 1 * ........... ' ,·/, Satunnaislipaasimuunnosten rakentaminen « « ·
Koko H. lanuginosa -lipaasigeenin ja sen aminohappojen (aa) 91-97 ja 206-211 *;' 35 satunnaismutagenisoituja kirjastoja valmistettiin, kuten edellä kappaleessa Materiaa- lejaja menetelmiä kuvattiin.
• · » « · • »* • *
Aminohappoalueet 91-97 ja 206-211 valittiin paikallisen mutageneesin ensimmäiseen kierrokseen, koska näiden alueiden on todettu olevan tärkeitä pesukyvyn kan- 42 1 1 951 4 naita. Alue 91-97 on osa lipaasin kansialuetta ja alue 206-211 muodostaa osan li-paasin hydrofobista halkeamaa.
Kumpaakin aluetta kohti syntetisoitiin yksi oligonukleotidi, joka käsitti 93 % villi-5 tyypin nukleotideja ja 2,33 % kutakin kolmesta muusta nukleotidista aminohappoko- doneissa, jotka haluttiin mutagenisoida. Kolmas nukleotidi (huojuva emäs) kodo-neissa syntetisoitiin käyttäen 50%G/50%C, milloin se oli mahdollista aminohappoa muuttamatta, jotta saatiin suurempi todennäköisyys aminohappomuutoksiin yhdessä tai kahdessa kodonissa. Alueen 91-97 mutageenisen nukleotidin koostumus on esitet-10 ty taulukossa 1.
Käyttämällä tätä oligonukleotidia kirjastoon saadaan noin 65 - 70 %:n laskettu mu-taatiofrekvenssi yhtä lähtölipaasiin tehtyä aminohappomuutosta kohti. Mutaatio-frekvenssi kahta tai useampaa tehtyä aminohappomuutosta kohti on alle 35 %. Tämä 15 pieni mutaatiofrekvenssi valitaan sen takaamiseksi, että havaitut aminohappomuu-tokset positiivisissa klooneissa ovat mukana parantamassa entsyymiä eivätkä ole vain "neutraaleja" muutoksia, jotka johtuvat tiheästä mutaatiofrekvenssistä.
Mutageenista aluketta käytettiin PCR-reaktiossa sopivan vastinalukkeen kanssa.
20 Saatu PCR-fragmentti puhdistettiin ja kysymyksen ollessa alueesta 206-211 dige-roitiin ja kloonattiin sukkulavektoriin. Kun kysymyksessä oli alue 91-97, saatua PCR-fragmenttia käytettiin toiseen PCR-reaktioon alukkeena toisen sopivan vastin- • .*· alukkeen kanssa. Tämä vaihe oli tarpeen, jotta mutagenisoitu alue voitiin digeroida «« · . ja kloonata sukkulavektoriin.
;*. 25 • « ·
Valmistettiin alueen 91-97 ja alueen 206-211 kiijastoja, jotka sisälsivät 10 000 - ! \ 80 000 kloonia/kiijasto. Useimmat pesäkkeet olivat positiivisia (yli 90 %), kun ne | · · "f tarkastettiin olosuhteissa, joissa lähtölipaasi on positiivinen, s.o. osoittaa lipaasiak- *·* * tiivisuutta. Positiivinen reaktio määritettiin suodatinkokeessa käyttäen 2,5 mM Ca (5 30 mM EGTA:a asemesta).
t «·· tT: Eri kirjastoista seulottiin 450 000 pesäkettä käyttämällä edellä kappaleessa Materiaa- leja ja menetelmiä kuvattuja Dobanol™25-7-ja matalakalsiumkokeita. aa 91-97 - t · · ίkirjastosta (kansialue) enstettiin 25 matalakalsiumpositiivista ja kokogeenikiijastois-·"’ 35 ta eristettiin 12 Dobanol™25-7 -positiivista. Matalakalsiumpositiivisista, jotka olivat :·*: aa 91-97 -mutageneesista, sekvensoitiin 14 kappaletta.
• · * ♦ · • ·· • ·
Kolme muuta mutaatiota (kodoneissa 83, 103, 145), mutagenisoidun alueen ulkopuolella, voidaan selittää PCR:ssä tapahtuneella liittämisvirheellä, vaikka S83T- 43 119514 mutaatio onkin transversio, joka on melko epätavallinen PCR-virheliitynnöissä.
Taulukko 1 5
Sekvenssi:
5’ 5 C G
T 5 C 3’
T 7 A
10 A 8 G PuUo5: 93% A; 2,33% C; 2,33% G ja 2,33% T
T 8 T
T A/CT T 5 C
C 7 T
15 T 5 C Pullo 6: 93% C: 2.33% A: 2.33% G ja 2.33% T
T 8 T
T 8 A
6 C/GT
5 6 G Pullo 7: 93% G: 2.33%A: 2.33% C ja 2.33% T
20 5 6 G
7 G A
8 A A
6 T C Pullo_8i 93% T; 2,33% A; 2,33% C ja 2,33% G
. 7 • · ♦ • · · ·*: 25 • · ·
Taulukko 1: Nukleotidien, joita käytettiin H. lanuginosen lipaasia aminohappojen • · I; 91-97 paikalliseen satunnaismutageneesiin, rakenteen kuvaus. Sekvenssissä : : esiintyvät numerot viittaavat pulloihin, joiden koostumus näkyy sekvenssin oikealla ί,·.: puolella.
··» • · · « # · * • · • « · • · · • * • · · • · • * • · · • · • · · • · · ««· ··· • m • m ··· «·· • · · • · · * * · 44 119514
Taulukko 2
Kannan Muunnos-5 numero tyyppi
59 I G91A N94K D96A
60 II S83T N94K D96M
61 II S83T N94K D96N
10 62 III E87K D96V
63 IV E87K 69 IA D96V
64 II S83T N94K D96N
65 III E87K D96V
67 V N94K F95L D96H
15 69 V N94K F95L D96H
71 III E87K D96V
72 II S83T N94K D96N
20
Taulukko 2: Kannan numero viittaa alunperin poimittuihin klooneihin, jotka kloonattiin Aspergillus-ekspressiovektoriin pAHL. Muunnostyyppi viittaa saman- . laisiin klooneihin, jotka luultavasti ovat muodostuneet satunnaismutagenisoidun • · · kiijaston monistuksen aikana. Muunnostyypit I ja II ovat aktiivisia 0,01 % Doba-25 nol™25-7:ssä, kun sen sijaan muut ovat inaktiivisia kuten villityyppi.
• 1 · · • · · • · • · » » » • ♦ · φ · · • · · • · · • #· • « 1 • · · • » · • · ·
tM
• · · • t · * • · • · · • # · • 1 • · · * · • · • · · • · · 1 1 • · · • « · • ·· ♦ · 119514 45
Taulukko 3
Kannan Muunnos- DNA-sekvenssi numero tyyppi (Aminohapon numero sekvenssin yläpuolella) 5 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92
Wt GGC TCT CGT TCC ATA GAG AAC TGG ATC GGG AAT
59 I C
60 II A C
61 II A C
1Λ 62 III A C
63 IV A C
64 II A C
65 III A C
67 V C
52/68 Wt 53 Wt
69 V C
15 71 III A C
72 II A C
73 VI
93 94 95 96 97 98 99 100 -103 -145
Wt CTT AAC TTC GAC TTG AAA GAA ATA -ATT -CAT
λλ 59 I G G C
U 60 II G G A
61 II G G A
62 III T
63 IV C CC
. 64 II G G A
65 III G T
. 67 V A C A C
25 52/68 vrfc 53 Wt
69 V A C A C
: V 71 III G T
! 72 II GAA
73 VI A ? • · · • · « « 30 * · · * * · ··· : ’i*: Taulukko 3: Villityypin (wt) sekvenssi on esitetty ylärivillä. Muunnossekvenssei- hin on kiijoitettu ainoastaan nukleotidit, jotka eroavat villityypistä. Kodonin 91 ja 93 * · · l.l emäkseen lisättiin 1:1 C/T ja T/G, vastaavassa järjestyksessä. Muutoin nukleotidit 35 kodonissa 91-97 seostettiin käyttämällä 93 % villityyppiä ja 2,33 % kolmea muuta * ""·* nukleotidia.
• · • · · • ·· • · 46 1 1 951 4
Esimerkki 2
Samanlaisella menetelmällä kuin esimerkissä 1 kuvattiin rakennettiin seuraavat muunnokset satunnaismutageneesin avulla. Alla kuvataan myös seulontakriteerit, joita tässä käytettiin joidenkin muunnosten valikoimiseen.
5
D167G+E210V
5ΙΠΜ EGTA.0.01% Dobanol^S-?.0.006% LAS E87K+G91A+L93I+N94K+D96A
10
5mM EGTA,0.02% Dobanol^25-7 N73D+S85T+E87K+G91A+N94K+D96A S83T+E87K+W89G+G91A+N94K+D9 6V E87K+G91A+D96R+I100V 15 S83T+E87K+Q249R
E87K+G91A
Esimerkki 3
Humicola lanuginosa -lipaasin Ilmentäminen Aspergillus oryzaessa 20 Humicola lanuginosa -lipaasin kloonausta kuvataan julkaisussa EP 305 216. Siinä kuvataan myös lipaasin ilmentämistä ja karakterisointia Aspergillus oryzaessa. Käytetyn ekspressioplasmidin nimi on p960.
• • · · Tässä hakemuksessa käytetty ekspressioplasmidi on samanlainen kuin p960 lukuun- • · · *·/[ 25 ottamatta vähäisiä muutoksia ainoastaan 3'-päästä Iipaasia koodaavalle alueelle.
*· |! Muutokset tehtiin seuraavalla tavalla: p960 digeroitiin NruI-ja BamHI-restriktio- : V entsyymeillä. Näiden kahden kohdan väliin kloonattiin BamHl/Nhel-palanen plas- *.:.: midista pBR322, jossa Nhel-fragmentti oli täytetty Klenowin polymeraasin avulla, ·*. · ·* jolloin muodostui plasmidi pAO 1 (kuvio 2), joka sisältää uniikit BamHI- ja Nhel- 30 kohdat. Näiden kahden uniikin kohdan väliin kloonattiin BamHI/Xbal-palaset : p960:stäJolloin saatiin pAHL (kuvio 3).
* * · • « · • « ·
Lipaasigeenin ohjattu in vitro -mutageneesi
Ratkaisumalli, jota käytettiin mutaatioiden tekemiseksi lipaasigeeniin, on kuvattu *·"* 35 teoksessa Nelson & Long, Analytical Biochemistry, 180,147-151 (1989). Siinä *:·*: muodostetaan kolmessa vaiheessa PCR(polymeraasiketjureaktio)fragmentti, joka sisältää halutun mutaation, joka tehdään käyttämällä kemiallisesti syntetisoitua DNA-säiettä yhtenä alukkeena PCR-reaktioissa. PCR:stä syntynyt fragmentti, DNA- fragmentti, joka kantaa mutaatiota, voidaan eristää pilkkomalla restriktioentsyymeillä ja insertoida uudelleen ekspressioplasmidiin. Tämä menetelmä kuvataan perusteelli sesti esimerkissä 5. Menetelmää hahmotellaan vielä kuvioissa 4 ja 5.
47 1 1 95 1 4 5 Plasmidin, joka ekspressoi Humicola lanuginosa -lipaasin N94K/D96A-analogia, rakentaminen Plasmidi pAHL:n linearisointi
Rengasmainen plasmidi pAHL linearisoidaan restriktioentsyymillä Sphl 50 piissä seuraavaa reaktioseosta: 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,9,10 mM MgCl2, 10 1 mM ditiotreitolia, 1 pg plasmidia ja 2 yksikköä Sphlitä. Digestio suoritetaan 2 tunnissa 37 °C:ssa. Reaktioseos uutetaan fenolilla (tasapainotettu Tris-HCl:llä, pH 7,5) ja saostetaan lisäämällä 2 tilavuutta jääkylmää 96% etanolia. Sentrifiigoinnin ja pelletin kuivaamisen jälkeen linearisoitu DNA liuotettiin 50 pilaan H20 ja kon-sentraatio määritettiin agaroosigeelillä.
15 3-vaiheinen PCR-mutageneesi
Kuten kuviossa 5 on esitetty, 3-vaiheisessa mutagenisoinnissa käytetään neljää alu-ketta: 20 Mutagenisointialuke (=A): 5 ’ -TATTTCTTTCAAAGCGAACTTAAGATTC- CCGAT-3’ PCR-auttaja 1 (=B): 5 ’ -GGTCATCCAGTCACTGAGACCCTCTACCTATTAA- *·”* ATCGGC-3 ’ *···! 25 • · PCR-auttaja 2 (=C): 5 ’-CCATGGCTTTCACGGTGTCT-3 ’ • · · • • * : :*· PCR-kahva (=D) 5' -ggtcatccagtcactgagac-3 ’ • ·· • · · • · 30 Auttaja 1 ja auttaja 2 ovat komplementaarisia koodaavan alueen sekvensseille ja niitä : ;*: voidaan siten käyttää yhdessä minkä tahansa mutagenisointialukkeen kanssa muun- t·· . * ϊ'. nossekvenssin rakentamisessa.
♦ · • · '·];* Kaikki 3 vaihetta suoritetaan seuraavassa puskurissa, joka sisältää: 10 mM Tris-HCl,
35 pH 8,3, 50 mM KC1,1,5 mM MgCl2,0,001% gelatiinia, 0,2 mM dATP, 0,2 mM
*;··: dCTP, 0,2 mM dGTP, 0,2 mM TTP, 2,5 yksikköä Taq-polymeraasia.
« · • · · • · · • ·
Vaiheessa 1 100 pmol aluketta A, 100 pmol aluketta B ja 1 fmol linearisoitua plas- 4g 119514 midia lisätään kaikkiaan 100 pl:aan reaktioseosta ja suoritetaan 15 sykliä, jotka muodostuvat 2 minuutista 95 °C:ssa, 2 minuutista 37 °C:ssa ja 3 minuutista 72 °C:ssa.
5 PCR-tuotteen konsentraatio määritetään agaroosigeelillä. Sitten suoritetaan vaihe 2. 0,6 pmol vaiheen 1 tuotetta ja 1 fmol linearisoitua plasmidia sisällytetään kaikkiaan 100 pl:aan edellä mainittua puskuria ja suoritetaan 1 sykli, joka muodostuu 5 minuutista 95 °C:ssa, 2 minuutista 37 °C:ssa ja 10 minuutista 72 °C:ssa.
10 Vaiheen 2 reaktioseokseen lisätään 100 pmol aluketta C ja 100 pmol aluketta D (1 μΐ kutakin) ja suoritetaan 20 sykliä, jotka muodostuvat 2 minuutista 95 °C:ssa, 2 minuutista 37 °C:ssa ja 3 minuutista 72 °C:ssa. Tämä muokkaaminen käsitti 3 vaihetta mutagenisointiprosessissa.
15 Mutagenisoidun restriktiofragmentin eristäminen
Vaiheesta 3 saatu tuote erotetaan agaroosigeelistä ja liuotetaan uudelleen 20 pl:aan H2O. Sitten sitä digeroidaan restriktioentsyymeillä BamHI ja BstXI kaikkiaan 50 pl:ssa seuraavaa koostumusta: 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,9,10 mM MgCl2, 1 mM DDT, 10 yksikköä BamHI ja 10 yksikköä BstXI. Inkuboidaan 2 tuntia 20 37 °C:ssa. 733 emäsparin BamHI/BstXI-fragmentti eristetään agaroosigeelistä.
Ligaatio ekspressiovektoriin pAHL
^^ Ekspressioplasmidi pAHL pilkotaan BamHI:llä ja BstXIillä edellä mainituissa olo- suhteissa ja suuri fragmentti eristetään agaroosigeelistä. Tähän vektoriin ligoidaan • · * *;··[ 25 edellä eristetty mutagenisoitu fragmentti ja ligaatioseosta käytetään E. colin trans- « · · * * “· formoimiseen. Fragmentin läsnäolo ja orientaatio todennetaan pilkkomalla jokin : *.: plasmidivalmiste transformantista restriktioentsyymeillä. Sekvenssianalyysi suorite- *.:.: taan kaksisäikeisellä plasmidilla käyttäen DyeDeoxy™ Terminater Cycle Sequencing ·* Kit:iä (Applied Biosystems) ABI DNA-sekvenaattorilla, malli 373A. Plasmidi nime- 30 tään pAHLG91 A/N94K/D96A:ksi ja se on identtinen pAHL:n kanssa substituoituja : kodoneja lukuunottamatta.
• · • · · • · « • · « .·, Esimerkki 4 • φ ·
Muita Humicola-lipaasin muunnoksia ilmentävien plasmidien rakentaminen ··/ 35 Rakennetaan seuraavat muunnokset käyttäen samaa menetelmää, jota kuvattiin esi- • :·*: merkissä 3. Plasmidin nimi ja muuntamiseen käytetty aluke luetellaan alla.
• • * • · * • # 119514 49
Plasmidin nimi Aluke A: n sekvenssi PAHLS83T/N94K/D96A 5 ' -ATTTCTTTCAAAGCGAACTTAAGATTCCCGA- TCCAGTTCTCTATGGAACGAGTGCCACGGAAAGA-3 ’ pAHLE8 7K/D96V 5 -TATTTCTTT C AAAACGAAGTT AAG ATT C C CGAT C C - AGTTCTTTATGGAACGAGA-3’ PAHLE87K/G91A/D96A 5' -TATTTCTTTCAAAGCGAAGTTAAGATTAGCGATC- CAGTTCTTTATGGAACGAGA-3’ pAHLN94K/F95L/D96H 5 * -TATTTCTTTCAAGTGCAACTTAAGATTCCCGAT-3 ’ PAHLF95C/D96N 5 ’ -TATTTCTTTCAAGTTACAGTTAAGATTCCC-3 ’ pAHLG91S/L93V/F95C 5 ' -TATTTCTTTCAAGTCACAGTTAACATTAGAGATCC-' AGTTCTC-3*
pAHLE87K/G91A/L93I/N94K/D96A
5 ' -TATTTCTTTCAAAGCGAACTTAATATTAG CGATC -CAGTTCTTTATGGAACGAGA-3’ pAHLD167G 5 *-ATATGAAAACACACCGATATCATACCC-3 * pAHLA12IV 5’-CCTTAACGTATCAACTACAGACCTCCA-3’ pAHLR205K/E210Q 5’-GCTGTAACCGAATTGGCGCGGCGGGAGCTTAGGG- ACAATATC-3’
pAHLN73D/S85T/E87K/G91A/N94K/D96A
5’-TATTTCTTTCAAAGCGAACTTAAGATTAGCGATC- . CAGTTCTTTATAGTACGAGAGCCACGGAA- • « · ’·”* AGAGAGGACGATCAATTTGTCCGTGTTGTCGAG-3 *
pAHLS83T/E87K/W89G/G91A/N94K/D96V
• ♦ :. : 5 *-TATTTCTTTCAAAACGAACTTAAGATTAGCGATA- ; ·*.·* CCGTTCTTTATGGAACGAGTG CCACGGAAAGA- 3 ’
j;*: pAHLE87K/G91A/D96R/I100V
5 ’ -GCÄAATGTCATTAACTTCTTTCAATCTGAAGTTAA-GATTAGCGATCCAGTTCTTTATGGAACGAGA-3’ , .·. pAHLS83T/E87K 5’-CCCGATCCAGTTCTTTATGGAACGAGTGCCACGG- • « * AAAGA-3 ’ • · · PAHLE87K/G91A 5 * -GAAGTTAAGATTAGCGATCCAGTTCTTTATGGAA- CGAGA-3 ’ pAHLS83T/E87K 5 *-CCCGATCCAGTTCTTTATGGAACGAGTGCCACGG- ./..: AAAGA-3’ ... . pAHLQ249R 5’-CGGAATGTTAGGTCTGTTATTGCCGCC-3’ • *♦ • · so 119514
Esimerkki 5
Humicola-Vma&sin yhdistelmäanalogeja ilmentävien plasmidien rakentaminen Plasmidit pAHLD167G/E210V
PAHLA121V/R2 05K/E210Q 5 ja PAHLS83T/E87K/Q249R
rakennetaan suorittamalla kaksi peräkkäistä mutagenisointivaihetta sopivia alukkeita käyttäen.
Esimerkki 6 10 Lipaasianalogien ilmentäminen Aspergilluksessa Aspergillus oryzaen transformointi (yleismenettely) 100 ml:aan YPD:tä (Sherman et ai., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) siirrostetaan A, oryzaen itiöitä ja inkuboidaan ravistellen noin 24 tuntia. Myseeli kootaan suodattamalla mirakudoksen läpi ja pestään 200 milliä 15 0,6 M MgS04. Myseeli lietetään 15 mliaan 1,2 M MgS04,10 mMiiin NaH2P04, pH = 5,8. Suspensio jäähdytetään jäällä ja siihen lisätään 1 ml puskuria, joka sisältää 120 mg Novozym*234, erä 1687. 5 minuutin kuluttua lisätään 1 ml 12 mg/ml BSA (Sigma tyyppi H25) ja inkubointi jatketaan varovasti sekoittaen 1,5 - 2,5 tuntia 37 °C:ssa, kunnes suuri määrä protoplasteja on havaittavissa mikroskoopilla tutkitus-20 sa näytteessä.
Suspensio suodatetaan mirakudoksen läpi, suodos siirretään steriiliin putkeen ja sen päälle pannaan 5 ml 0,6 M sorbitolia, 100 mM Tris-HCl, pH = 7,0. Sentrifugoidaan :.i’: 15 minuuttia kiihtyvyydellä 1 000 g ja protoplastit kerätään talteen MgS04-patjan
25 päältä. Protoplastisuspensioon lisätään 2 tilavuutta STCitä (1,2 M sorbitolia, 10 mM
* · \'*5 Tris-HCl, pH = 7,5,10 mM CaCl2) ja seosta sentrifugoidaan 5 minuuttia kiihtyvyy- J*\i dellä 1 000 g. Protoplastipelletti lietetään takaisin 3 mliaan STCitä ja pelletoidaan i f: uudelleen. Tämä toistetaan. Lopuksi protoplastit lietetään takaisin 0,2 -1 mliaan •T; STCitä.
30 , ,*, 100 pilaan protoplastisuspensiota sekoitetaan 5 - 25 pg p3SR2:ta (A. nidulans - geeni, joka kantaa plasmidia, jota kuvaavat Hynes et ai, Mol. and Cel. Biol., Voi. 3, No. 8, 1430-1439, elokuu 1983) 10 pissa STCitä. Seoksen annetaan olla huoneen-:.v lämpötilassa 25 minuuttia. Siihen lisätään 0,2 ml 60% PEG 4000 (BDH 29576), 10 i»« *,35 mM CaCl2 ja 10 mM Tris-HCl, pH = 7,6, ja sekoitetaan huolellisesti (kaksi kertaa) ja lopuksi lisätään 0,85 ml samaa liuosta ja sekoitetaan huolellisesti. Seoksen annetaan : olla huoneenlämpötilassa 25 minuuttia, lingotaan kiihtyvyydellä 2 500 g 15 minuut tia ja pelletti lietetään takaisin 2 mliaan 1,2 M sorbitolia. Vielä yhden sedimentaation 51 119514 jälkeen protoplastit levitetään minimaljoille [Cove, Biochem. Biophys. Acta 113 (1966) 51-66], jotka sisältävät 1,0 M sukroosia, pH = 7,0,10 mM asetamidia typen lähteenä ja 20 mM CsCl taustakasvun estämiseksi. 4-7 vuorokauden 37 °C:ssa in-kuboinnin jälkeen itiöt poimitaan, lietetään steriiliin veteen ja levitetään yksittäisiksi 5 pesäkkeiksi. Tämä menettely toistetaan ja yhden pesäkkeen itiöt toisen uudelleeneris-tämisen jälkeen varastoidaan määriteltynä transformanttina.
Lipaasianalogien ilmentäminen A. oryzaessa
Edellä kuvatut plasmidit transformoidaan A oryzae IFO 4177:ään keratransformaaa-10 tiolla p3 SR2 :n kanssa, joka sisältää amdS-geenin A. nidulansista, kuten edellä olevassa esimerkissä kuvattiin. Kuvatulla tavalla valmistettuja protoplasteja inkuboi-daan seoksen kanssa, jossa on yhtä suuret määrät ilmentämisplasmidia ja p3SR2:ta, kutakin käytetään noin 5 pg. Transformantit, jotka pystyivät käyttämään asetamidia ainoana typen lähteenä, eristetään uudelleen kahdesti. YPD:llä kolmen vuorokauden 15 kasvatuksen jälkeen viljelyn supematantit analysoidaan käyttäen lipaasiaktiivisuus-koetta. Paras transformantti valitaan lisätutkimuksiin ja sitä kasvatetaan 1 litran ra-vistelupullossa 200 ml:ssa FG4-kasvatusliuosta (3 % soijajauhoa, 3 % meltodekst-riiniä, 1 % peptonia, pH säädetty 7,0:aan 4 M NaOHilla) 4 vuorokautta 30 °C:ssa.
20 Esimerkki 7
Keksinnön mukaisten lipaasimuunnosten puhdistaminen
Lipaasiaktiivisuuskoe: , Valmistettiin substraatti lipaasia varten emulgoimalla glyseriinitributyraattia k I · (MERCK) käyttäen arabikumia emulgaattorina.
• » t ^ 25 f a :.**i Lipaasiaktiivisuus tutkittiin pH 7:ssä käyttäen pH stat -menetelmää. Yksi yksikkö * t ί V lipaasiaktiivisuutta (LU/mg) määriteltiin määräksi, joka tarvitaan vapauttamaan yksi 119514 52 visuus lineaarisella suolagradientilla samassa puskurissa (0 - 0,5 M NaCl) käyttäen viittä pylvääntilavuutta. Kootaan fraktiot, jotka sisältävät entsymaattista aktiivisuutta.
Vaihe 3: Hydrofobinen kromatografia. Entsymaattista aktiivisuutta sisältävän poo-5 Iin molaarisuus säädetään arvoon 0,8 M lisäämällä kiinteää ammoniumasetaattia. Entsyymi pannaan TSK gel Butyl-Toyopearl 650 C -pylvääseen (saatavissa Tosoh Corporationilta, Japani), joka on edeltäkäsin tasapainotettu 0,8 M ammoniumase-taatilla. Sitoutumaton materiaali pestään 0,8 M ammoniumasetaatilla ja sitoutunut materiaali eluoidaan tislatulla vedellä.
10
Vaihe 4: Lipaasiaktiivisuutta sisältävä pooli laimennetaan vedellä johtokyvyn säätämiseksi arvoon 2 mS ja pH 7:ään. Pooli pannaan High performance Q Sepharose (Pharmacia) -pylvääseen, joka on etukäteen tasapainotettu 50 mM:lla tris-asetaatti-puskuria pH 7. Sitoutunut entsyymi eluoidaan lineaarisella suolagradientilla.
15
Esimerkki 8
Keksinnön mukaisten lipaasimuunnosten pesukyky
Keksinnön mukaisten Humicola lanuginosa -lipaasimuunnosten pesukyky määritettiin käyttäen perusteena proteiinin entsyymiannosta mg:ina per litra OD2go n mukaan 20 verrattuna villityypin H. lanuginosa -lipaasiin.
Pesukokeita suoritettiin 150 ml:n keittolaseissa, jotka asetettiin lämmönsäätelyllä varustettuun vesihauteeseen. Keittopulloja sekoitettiin kolmion muotoisilla magneet- :..v tisauvoilla.
*.:!* 25 • · ‘ # * · j Koeolosuhteet olivat seuraavat: :*·*: Menetelmä: 3 jaksoa ja kunkin jakson välillä yön yli kuivaus : Pesuliuos: 100 ml/keittolasi ··*
Tilkut: 6 tilkkua (3,5 x 3,5 cm)/keittolasi 30 Kangas: 100% puuvilla, Test Fabrics style #400 . .·. Tahra: Sudanipunaisella värjätty sianihra (0,75 mg väriä/g sianihraa). 6 μΐ sian- • · · I".' ihraa, joka oli kuumennettu 70 °C:seen, levitettiin kunkin tilkun keskelle. Tahran • · · tekemisen jälkeen tilkkuja kuumennettiin uunissa 75 C:ssa 30 minuuttia. Sitten tilk- • * ::: kuja pidettiin yön yli huoneenlämpötilassa ennen ensimmäistä pesua.
I...: 35 Pesuaine: LAS(Nansa 1169/P, 30%a.m.) 1,17 g/1 AEO (Dobanol™25-7) 0,15 g/1 .·. : Natriumtrifosfaatti 1,25 g/1
Natriumsulfaatti 1,00 g/1 53 1 1 951 4
Natriumkarbonaatti 0,45 g/1
Natriumsilikaatti 0,15 g/1 pH: 10,2
Lipaasipit.: 0,075,0,188,0,375,0,75 ja 2,5 mg lipaasiproteiinia/litra 5 Aika: 20 minuuttia
Lämpötila: 30 °C
Huuhtelu: 15 minuuttia juoksevalla vesijohtovedellä
Kuivaus: yön yli huoneenlämpötilassa (~20 °C, 30-50 % RH)
Arvostelu: 3. pesun jälkeen mitattiin heijastuskyky 460 nm:ssä.
10
Tulokset
Verrattiin lipaasimuunnosten ja natiivin H. lanuginosa -lipaasin annosvastekäyriä. Annosvastekäyrät laskettiin sovittamalla mitatut tulokset seuraavaan yhtälöön: 15 C0’5 ÄR = AR /j\ max " \v K + C0’5 jossa AR on teho ilmaistuna heijastusyksikköinä, C on entsyymikonsentraatio (mg/1), 20 ARfflax on vakio, joka ilmaisee maksimitehon, K on vakio; K2 ilmaisee entsyymikon-sentraation, jolla saadaan puolet maksimitehosta.
Kunkin lipaasimuunnoksen sekä villityypin lipaasin karakterististen vakioiden AR,,** * 1; ja K perusteella lasketaan paranemiskerroin. Paranemiskerroin, joka määritellään * · · ’·1·1 25 seuraavasti t t * · φ • · •:1V fparan = CvT/C (Π) • · ·
* · I
• · · V · ilmaisee lipaasimuunnosproteiinimäärän, joka tarvitaan aikaansaamaan sama vaiku- 30 tus kuin mikä saadaan 0,25 mg:lla/l verrokkina olevaa villityypin proteiinia (Cvt)· * · · • · · • · ·
Menettelytapa paranemiskertoimen laskemiseksi oli siis seuraava: 1) villityypin proteiinin vaikutus konsentraatiolla 0,25 mg/1 (AR^n^pj) laskettiin *:): yhtälön (I) avulla f · ♦;** 35 2) lipaasimuunnoksen konsentraatio, joka johti samaan vaikutukseen kuin villi- ·:·1: tyyppi pitoisuudella 0,25 mg/1, laskettiin seuraavan yhtälön avulla: • · • · 1 • · 1 • · 54 119514 (ARvillityyppi) c = (K(analogi) - )2 (III) ARmax(analogi) " (ARvillityyppi) 5 3) paranemiskerroin laskettiin yhtälön (II) avulla.
Tulokset esitetään alla olevassa taulukossa 1.
* • · · • · · • · · • · • φ · • · · v • · · • · · • t · • · · * · * • · · • · · • · · • · s : : * * · · • i · ··· * · · • · · • · · • · • I · • · · • · • · · i ; • · · 1 · • · * · · • ·· • · 119514 55
Taulukko 1 IMuunnos Paranemis- __kerroin E87K+D96V__1,2 S83T+N94K+D96N__2,3 N94K+D96A__2,7 E87K+G91A+D96 A 2,6 N94K+F95L+D96H__3,3 D167G+E210V__5,0 E87K+G91A+L931+N94K+D96A__1,3 E87K+G91A+D96R+1100 V 5,2 E87K+G91A__5,0 N73D+E87K+G91A+N94I+D96G__1,3 S83T+E87K+G91A+N92H+N94K+D96M 3,8 K46R+E56R+G61S__1,9 D102K 0,2 • · * ------------------- I ,|„ .....'....... .............
• · · • · · : D167G 1 • · · ......- * N73D+E87K+G91A+N941+D96G 1,3 · —...... .£_ • · · • · .* Λ E210R 2,7 • · · _£_ il* *?'· E210K__5,5 E210W 1 • · · g .....-...........................-......
• * · I
• M | N251W+D254W+T267W 0,8
• I—--- I J
• H
S83T+E87K+G91A+N92H+N94K+P96M 3,8 • * * | *·:·* [ E56R+I90F+D96L+E99K 4,8 * f* 1 ’ 1 ID57G+N94K+D96L+L97M 1,9 « · „ 119514 56
Hakemuksessa mainitut viitteet
Muhrad et ai., 1992, Yeast, Voi. 8,79-82 5 Shimada, Y. et ai., (1989). cDNA Molecular Cloning of Geotrichum candidum Lipase. J. Biol. Chem., 106,383-388.
Yamaguchi, S. et al., (1991). Cloning and structure of the mono- and diglycerol lipase-encoding gene from Penicillium camembertii U-150. Gene 103,61-67.
10
Hass, M.J. et al. (1991). Cloning, expression and characterization of a cDNA encoding a lipase from Rhizopus delemar. Gene 109,107-113.
Kugimiya, W. et al. (1992). Cloning and Sequences Analysis of DNA encoding Rhi-15 zopus niveus Lipase. Biosci. Biotech. Biochem. 56,716-719.
Dartois, V. et al., (1993). Cloning, nucleotide sequence and expression in Escherichia coli of a lipase gene from Bacillus subtilis 168. Biochemica et Biophysica acta 1131,253-260.
20
Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. painos, Cold Spring Harbor, 1989.
R.K. Saiki et al., Science 239, ss. 487-491,1988.
25 V·: Beaucage ja Caruthers, Tetrahedron Letters 22, ss. 1859-1869,1981.
• · • ♦ · • · • · j Matthes et al., The EMBO J. 3, ss. 801 -805, 1984.
··· • ·· • ♦ · * ♦ « « 30 J.O. Deshler, (1992). A simple method for randomly mutating cloned DNA frag-. ments by using chemical mutagens and the polymerase chain reaction. GATA 9(4): 103-106.
• · · • · * * • « v.: Leung et al., Technique, Voi. 1, n:o 1, ss. 11-15,1989.
• ·· i : 35 ....: Fowler et al., Molec. gen. Genet., 133. ss. 179-191,1974.
• · • · • · · • ·· ’ ’ Brady et al., "A Serine Protease Triad Forms the Catalytic Centre of a Triacylglyce- 57 1 1 95 1 4 rol Lipase", Nature 343,1990, ss. 767-770,1990.
Tilbeyrgh, H. van, Egloff, M.-P., Martinez, C, Rugani, N., Verger, R. ja Cambillau (1993), Nature 362, s. 814-820. Interfacial activation of the lipase-prolipase complex 5 by mixed micelles revealed by X-ray crystallography.
Hudson et al., Practical Immunology, Third Edition, Blackwell Scientific Publications, 1989.
10 Alber, T. ja Kawasaki, G., J. Mol. Appi. Genet 1,419-434 (1982).
• · ·
« · I
··· • · · 4 I · 99f • 9 • 9 9 • ll • · • · • · · • 1 • · J · 1
I I
• 9« • 9· I I I * · 1 9 • • 9 9 9 9 9 999 99 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 • 9 9 9 9 9 9 · 999 t : • 99 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 99 9 9 58 1 1 95 1 4
Sekvenssiluettelo (1) YLEISINFORMAATIO: (i) HAKUA: Novo Nordisk A/S 5 (ii) KEKSINNÖN NIMI: Menetelmä lipolyyttisen entsyymin muunnoksen valmistamiseksi (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 2 10 (iv) POSTIOSOITE:
(A) VASTAANOTTAJA: Novo Nordisk A/S
(B) KATUOSOITE: Novo Alle (C) KAUPUNKI: Bagsvaerd 15 (E) MAA: Tanska (F) ZIP: 2880 (v) TIETOKONEELLA LUETTAVA MUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Levyke 20 (B) TIETOKONE: IBM PC yhteensopiva
(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS
(D) OHJELMISTO: Patentin Release #1.0, Version #1.25 :.: j: (vi) ASIAMIESTÄ KOSKEVAT TIEDOT: : 25 (A) NIMI: Sarensen, Lise Abildgaard
(C) VIITE/ASIAKIRJAN NUMERO: 4153.204-WO
• · * · • · · « · j Λ (ix) TELEKOMMUNIKAATIOTIEDOT: (A) PUHELIN: +45 4444 8888 30 (B) TELEFAX: +45 4449 3256 (C) TELEX: 37304 • i · » · t »·· *·· V : (2) SEQ ID NO: 1 :tä KOSKEVAT TIEDOT: * · • · · • · · 35 (i) SEKVENSSITUNNUSMERKIT: t * . (A) PITUUS: 918 emäsparia *!": (B) TYYPPI: nukleiinihappo :(C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen 59 1 1 951 4 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
5 (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISMI: Humicola lanuginosa (ix) TUNNUSMERKIT: (A) NIMI/AVAIN: CDS 10 (B) SIJAINTI: 1..873 (C) NIMI/AVAIN: mat_peptidi (D) SIJAINTI: 67..873 (xi) SEKVENSSIKUVAUS: SEQ ID NO: 1: ATG AGG AGC TCC CTT GTG CTG TTC TTT GTC TCT GCG TGG ACG GCC TTG 48
Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Val Ser Ala Trp Thr Ala Leu -20 -15 -10 GCC AGT CCT ATT CGT CGA GAG GTC TCG CAG GAT CTG TTT AAC CAG TTC 96
Ala Ser Pro lie Arg Arg Glu Val Ser Gin Asp Leu Phe Aen Gin Phe -5 15 10 AAT CTC TTT GCA CAG TAT TCT GCA GCC GCA TAC TGC GGA AAA AAC AAT 144
Aen Leu Phe Ala Gin Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lye Aen Aen 15 20 25 GAT GCC CCA GCT GGT ACA AAC ATT ACG TGC ACG GGA AAT GCC TGC CCC 192 . Asp Ala Pro Ala Gly Thr Asn lie Thr Cye Thr Gly Aen Ala cys Pro ί : ί 30 35 40 «· e ; GAG gta GAG AAG GCG GAT GCA ACG TTT CTC TAC TCG TTT GAA GAC TCT 240 I", Glu Val Glu Lye Ala Aep Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Aap Ser : 45 50 55 • · GGA GTG GGC GAT GTC ACC GGC TTC CTT GCT CTC GAC AAC ACG AAC AAA -288
I Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn LyB
t : : 60 65 70 »«» *t**: TTG ATC GTC CTC TCT TTC CGT GGC TCT CGT TCC ATA GAG AAC TGG ATC 336
Leu lie Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser lie Glu Asn Trp lie 75 50 85 90 • GGG AAT CTT AAC TTC GAC TTG AAA GAA ATA AAT GAC ATT TGC TCC GGC 384
Gly Asn Leu Aen Phe Asp Leu Lys Glu lie Aen Asp lie Cys Ser Gly L: ! 95 100 105 • TGC AGG GGA CAT GAC GGC TTC ACT TCG TCC TGG AGG TCT GTA GCC GAT 432 *·*·’ Cys Arg Gly Hie Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp I*". 110 115 120 ♦ ♦·* ACG TTA AGG CAG AAG GTG GAG GAT GCT GTG AGG GAG CAT CCC GAC TAT 480 * . Thr Leu Arg Gin Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr *:**: 125 130 135 CGC GTG GTG TTT ACC GGA CAT AGC TTG GGT GGT GCA TTG GCA ACT GTT 528
Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val 140 145 150 60 1 1 951 4 GCC GGA GCA GAC CTG CGT GGA AAT GGG TAT GAT ATC GAC GTG TTT TCA 576
Ala Gly Ala Asp Leu Arg Gly Aon Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe ser 155 160 165 170 5 TAT GGC GCC CCC CGA GTC GGA AAC AGG GCT TTT GCA GAA TTC CTG ACC 624 Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr 175 180 185 GTA CAG ACC GGC GGA ACA CTC TAC CGC ATT ACC CAC ACC AAT GAT ATT 672
Val Gin Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg lie Thr His Thr Asn Asp lie 190 195 200 GTC CCT AGA CTC CCG CCG CGC GAA TTC GGT TAC AGC CAT TCT AGC CCA 720 val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro 205 210 215 GAG TAC TGG ATC AAA TCT GGA ACC CTT GTC CCC GTC ACC CGA AAC GAT 768
Glu Tyr Trp He Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp 220 225 230 ATC GTG AAG ATA GAA GGC ATC GAT GCC ACC GGC GGC AAT AAC CAG CCT 816 t . He Val Lys He Glu Gly He Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gin Pro ^ 235 240 245 250 AAC ATT CCG GAT ATC CCT GCG CAC CTA TGG TAC TTC GGG TTA ATT GGG 864
Asn He Pro Asp He Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu He Gly 255 260 265
Of) ACA TGT CTT TAGTGGCCGG CGCGGCTGGG TCCGACTCTA GCGAGCTCGA GATCT 918 Thr Cys Leu (2) SEQ ID NO:2:ta KOSKEVAT TIEDOT: \ϊ 25 V*! (i) SEKVENSSITUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 291 aminohappoa ; ;* (B) TYYPPI: aminohappo **··* (D) TOPOLOGIA: lineaarinen s e e * 30 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini • > I f f e ·
»M
i ji (xi) SEKVENSSIKUVAUS: SEQ ID NO:2: ♦ * ♦ J * « • V Met Arg Ser Ser Leu Vai Leu Phe Phe Vai Ser Ala Trp Thr Ala Leu -20 -15 -10 m» ’ , Ala Ser Pro He Arg Arg Glu Vai Ser Gin Asp Leu Phe Asn Gin Phe *:·*: -sis 10 e ·
Asn Leu Phe Ala Gin Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn 15 20 25
Asp Ala Pro Ala Gly Thr Asn He Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro 30 35 40 61 119514
Glu Vai Glu Ly a Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr ser Phe Glu Asp Ser 45 50 55
Gly Vai Gly Asp Vai Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys 60 65 70
Leu Ile Vai Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile 75 80 85 90
Gly Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly 95 100 105
Cys Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Vai Ala Asp 110 115 120
Thr Leu Arg Gin Lys Vai Glu Asp Ala Vai Arg Glu His Pro Asp Tyr 125 130 135
Arg Vai Vai Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Vai 140 145 150
Ala Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Vai Phe Ser 155 160 165 170
Tyr Gly Ala Pro Arg Vai Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr 175 180 185
Vai Gin Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile 190 195 200
Vai Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser ser Pro 205 210 215
Glu Tyr Trp Ile Lys ser Gly Thr Leu Vai Pro Vai Thr Arg Asn Asp 220 225 230
Ile Vai Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gin Pro ; ;'· 235 240 245 250 «e ; ·1 2. Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly ···" 255 260 265 • · • ’ 1 Thr Cys Leu
IV
• ϊ'ϊ *: Ϊ i « 1 *· m *»« tee « I » • # e e e * « * e a f 9 1 * «
* S
M» 9 **e1t • 4 1 i · · 2 e e

Claims (42)

119514
1. Menetelmä jonkin lipolyyttisen lähtöentsyymin muunnoksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että (a) lipolyyttistä lähtöentsyymiä koodaavalle DNA-sekvenssille suoritetaan satun-5 naismutageneesi, (b) vaiheessa (a) saatu mutagenisoitu DNA-sekvenssi ilmennetään jossakin isän-täsolussaja (c) seulotaan isäntäsolut, jotka ilmentävät mutagenisoidun lipolyyttisen entsyymin, joka on vähemmän riippuvainen kalsiumista. 10
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaihe (c) käsittää myös seulonnan paremman pesuaineen- tai pesuainekomponentinsietoky-vyn suhteen lipolyyttiseen lähtöentsyymiin verrattuna.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sa- tunnaismutageneesi suoritetaan käyttämällä jotakin fysikaalista tai kemiallista mu-tageenia, käyttämällä jotakin oligonukleotidia tai käyttämällä PCR:n avulla suoritettua mutageneesia.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mutageeni valitaan muurahaishapon, UV-säteilytyksen, hydroksyyliamiinin, N-metyyli-N'- * · · ’·!·* nitro-N-nitrosoguanidiinin (MNNG), O-metyylihydroksyyliamiinin, typpihapok- :.:.: keen, etyylimetaanisulfonaatin (EMS), natriumbisulfiitin ja nukleotidianalogien • · joukosta. • * : V 25 : 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että muta- toidun DNA-sekvenssin ilmentäminen suoritetaan transformoimalla jokin sopiva isäntäsolu mutatoidulla DNA-sekvenssillä, mutatoidun DNA-sekvenssin käsittäessä mahdollisesti lisäksi DNA-sekvenssin, joka koodaa toimintoja, jotka mahdollistavat .♦··. 30 mutatoidun DNA-sekvenssin ilmentämisen, ja viljelemällä vaiheessa (b) saatua [·[ isäntäsolua sopivissa olosuhteissa mutatoidun DNA-sekvenssin ilmentämiseksi. • * · • * * ···
5 S83T, G91A, I100V, D167G, ja joka valinnaisesti lisäksi käsittää yhden tai useamman aminohapon lisäyksen lipaasin joko toiseen tai molempiin N-ja C-terminaalisiin päihin, yhden tai useamman aminohapon substituution yhdessä tai useammassa paikassa aminohapposekvenssissä, yhden tai useamman aminohapon deleetion joko toisessa tai molemmis-10 sa lipaasin päissä tai yhdessä tai useammassa aminohapposekvenssin kohdassa, tai yhden tai useamman aminohapon insertion yhdessä tai useammassa aminohapposekvenssin kohdassa, sillä edellytyksellä, että muunnos säilyttää lipaasiaktiivisuuden.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n n e 11 u siitä, että mutageni- ·*. soidun DNA-sekvenssin ilmentämiseen käytetty isäntäsolu on jokin mikrobisolu. ···* .···. 35 * ·
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäsolu on jostakin sienikannasta tai bakteerikannasta peräisin oleva solu. 119514
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäsolu on jostakin Aspergillus-snvusta, kuten A. nigeristä,A. oryzaestci ja A nidulansista peräisin oleva solu tai jokin Saccharomyces-suvusta, esimerkiksi S. cereviciaesta, 5 peräisin oleva solu.
9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäsolu on jokin gramposiitivisen bakteerikannan solu, esimerkiksi Bacillus-su\un solu, kuten Bacillus subtilis-, Bacillus licheniformis-, Bacillus lentus-, Bacillus brevis-,
10. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että muta- genisoitu lipolyyttinen entsyymi kestää paremmin ionitonta, anionista, kationista, kahtais-ionista tai amfoteerista pinta-aktiivista ainetta.
10 Bacillus stearothermophilus-, Bacillus alkalophilus-, Bacillus amyloliquefaciens-, Bacillus coagulans-, Bacillus circulans-, Bacillus lautus-, Bacillus thuringiensis- tai Streptomyces lividans- tai Streptomyces murinus -solu tai jonkin gramnegatiivisen bakteerikannan solu, kuten E. coli -solu.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ioniton 20 pinta-aktiivinen aine on jokin alkoholietoksylaatti ja/tai anioninen pinta-aktiivinen aine on LAS tai jokin alkyylisulfaatti.
« • · · • » « *" 12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa t t · 7 7 • · · (c) seulotuille isäntäsoluille suoritetaan toinen mutageneesikäsittely, uudelleenseu- .1 / 25 lonta, uudelleeneristäminen ja/tai uudelleenkloonaus. • · · • φ • * • · · *·ί·*
13. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1 - 12 mukainen menetelmä, t u n n e 11 : u siitä, että satunnaismutageneesi paikannetaan siihen osaan DNA-sekvenssiä, joka koodaa lipolyyttistä lähtöentsyymiä. iV: 30
14. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-13 mukainen menetelmä, t u n n e 11 ,···, u siitä, että lipolyyttinen lähtöentsyymi on jokin lipaasi, esteraasi, kutinaasi tai fos- • · · folipaasi. ····♦·· ...... ......... ···
15. Patenttivaatimuksen 13 tai 14 mukainen menetelmä, tu n n e ttu siitä, että lipolyyttinen lähtöentsyymi on jokin lipaasi ja paikannettu satunnaismutageneesi suoritetaan DNA-sekvenssin siihen osaan, joka koodaa lähtölipaasin lipidikosketus-aluetta tai osaa siitä. 119514
16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että paikannettu satunnaismutageneesi suoritetaan DNA-sekvenssin siihen osaan, joka koodaa lähtölipaasin kansialuetta ja/tai hydrofobista halkeamaa tai osaa mainitusta kansi- 5 alueesta ja/tai hydrofobisesta sitovasta halkeamasta.
17. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-16 mukainen menetelmä, tunnett u siitä, että lipolyyttinen lähtöentsyymi on johdettavissa jostakin mikro-organismista. 10
18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lipolyyttinen lähtöentsyymi on johdettavissa jostakin sienestä.
19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA- 15 sekvenssi, joka koodaa lipolyyttistä lähtöentsyymiä, on johdettavissa jostakin Humi- cola sp.-, Rhizomucor sp.-, Rhizopus sp.-, Candida sp. -kannasta.
20 E87K+G91A+D96A N94K+F95L+D96H a F95C+D96N \:V E87K+G91A+D96R+1100 V V·! E87K+G91A f*.’: 25 S83T+E87K+Q249R S83T+E87K+W89G+G91A+N94K+D96V :T: N73D+S85T+E87K+G91A+N94K+D94A E87K+G91A+L93I+N94K+D96A 8y. D167G+E210V .···! 30 N73D+E87K+G91A+N94I+D96G V S83T+E87K+G91A+N92H+N94K+D96M :X: E56R+D57L+V60M+D62N+S83T+D96P+D102E C: D57G+N94K+D96L+L97M E87K+G91A+D96R+1100V+E129K+K237M+I252L+P256T+G263A+L26 i"": 35 4Q E56R+D57G+S58F+D62C+T64R+E87G+G91A+F95L+D96P+K98I+K23 7M 119514 D167G N73D+E87K+G91A+N94I+D96G S83T+E87K+G91A+N92H+N94K+D96M G91A+N94K+D96A, 5 ja joka valinnaisesti lisäksi käsittää yhden tai useamman aminohapon lisäyksen li-paasin joko toiseen tai molempiin N-ja C-terminaalisiin päihin, yhden tai useamman aminohapon substituution yhdessä tai useammassa paikassa aminohapposekvenssissä, yhden tai useamman aminohapon deleetion joko toisessa tai molemmissa lipaasin päissä tai yhdessä tai useammassa aminohapposekvenssin kohdassa, tai 10 yhden tai useamman aminohapon insertion yhdessä tai useammassa aminohapposekvenssin kohdassa, sillä edellytyksellä, että muunnos säilyttää lipaasiaktiivisuuden.
20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lipolyyttinen lähtöentsyymi on jokin lipaasi ja DNA-sekvenssi, joka koodaa lähtölipaasia, 20 on johdettavissa jostakin H. lanuginosa -kannasta, esimerkiksi H. lanuginosa -kannasta DSM 4109, jostakin Rh. mucor -kannasta tai jostakin C. antarctica -kan- . nasta.
• · · ♦ « ♦ • · · .·**. 21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että satun- • · · 7 7 * ·· 25 naismutageneesille altistettu DNA-sekvenssi koodaa vähintään yhtä H. lanuginosa * ** -lipaasia, joka on johdettavissa DSM 4109:stä, aminohappotähteiden 21-27,56-64, :;·;Σ 81-99,108-116, 145-147, 174,202-213, 226-227, 246-259 tai 263-269 rajaamista « « · alueista. • · :.V 30
22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että paikan- ♦ ·· nettu satunnaismutageneesi suoritetaan vähintään kahdella mainituista alueista.
• « « • · · .···. 23. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lipolyyt- • · ..... .... *** tinen lähtöentsyymi on johdettavissa jostakin bakteerista. ...T 35 ··«
24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lipolyyttistä lähtöentsyymiä koodaava DNA-sekvenssi on johdettavissa jostakin Pseudomonas spp. -kannasta, kuten P. cepacia- P. alcaligenes-, P. pseudoalcaligenes- tai 119514 P. fragi -kannasta tai jostakin Bacillus-kann&sta.
25. H. lanuginosa -lipaasin muunnos, joka on saatavissa DSM 4109:stä:, joka käsittää mutaation vähintään yhdessä seuraavista asemista:
26. Kannasta DSM 4109 saatavan H. lanuginosa -lipaasin tai mainitun lipaasin 15 jonkin analogin muunnos, tunnettu siitä, se käsittää vähintään yhden seuraavista mutaatioista: N94K+D96A S83T+N94K+D96N E87K+D96V
27. DNA-rakenne, tunnettu siitä, että se koodaa minkä tahansa patenttivaatimuksista 25 tai 26 mukaista H. lanuginosa -lipaasin muunnosta.
28. Vektori, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 27 mukaisen DNA-rakenteen.
29. Patenttivaatimuksen 28 mukainen vektori, tunnettu siitä, että se on jokin plasmidi tai bakteriofagi. 20
: :*: 30. Patenttivaatimuksen 28 tai 29 mukainen vektori, tunnettu siitä, että se on ··· • :*: jokin ilmentämis vektori, joka käsittää lisäksi DNA-sekvenssejä, jotka mahdollista- ·· .·. i vat lipolyyttisen lähtöentsyymin muunnoksen ilmentämisen. • · ** · • t * • · .* s, 25
31. Isäntäsolu, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 27 mukai- • · · sen DNA-rakenteen tai minkä tahansa patenttivaatimuksista 28 - 30 mukaisen vek- * torin. • · • · · *;V
32. Patenttivaatimuksen 31 mukainen solu, tunnettu siitä, että se on jokin 30 mikrobisolu. ··· • t · • · · ;***.
33. Patenttivaatimuksen 32 mukainen solu, tunnettu siitä, että se on johonkin ··· ·. sieni- tai bakteerikantaan kuuluva solu. ·♦·
34. Patenttivaatimuksen 33 mukainen solu, tunnettu siitä, että se on jokin • · ’·*·' 35 Aspergillus -suvun solu, kuten A. niger-, A. oryzae- tai A. nidulans -solu tai jokin Saccharomyces-suvun solu, esimerkiksi S. cereviciae -solu. 119514
35. Patenttivaatimuksen 33 mukainen solu, tunnettu siitä, että se on jonkin grampositiivisen bakteerikannan solu, esimerkiksi Bacillus-suvun solu, kuten Bacillus subtilis-, Bacillus licheniformis-, Bacillus lentus-, Bacillus brevis-, Bacillus 5 stearothermophilus-, Bacillus alkalophilus-, Bacillus amyloliquefaciens-, Bacillus coagulans-, Bacillus circulans-, Bacillus lautus-, Bacillus thuringiensis- tai Strepto-myces lividans- tai Streptomyces murinus -solu tai jonkin gramnegatiivisen bakteerikannan solu, kuten E. coli -solu.
36. Menetelmä jonkin lipolyyttisen lähtöentsyymin muunnoksen, joka on vähem män riippuvainen kalsiumista ja joka sietää paremmin jotakin pesuainetta tai pesu-ainekomponenttia lipolyyttiseen lähtöentsyymiin verrattuna, valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmässä valmistetaan lipolyyttinen entsyymimuunnos minkä tahansa patenttivaatimuksista 1 - 24 mukaisella menetelmällä ja lipolyyttinen 15 entsyymimuunnos otetaan talteen vaiheessa (c) seulotusta isäntäsolusta.
37. Menetelmä jonkin lipolyyttisen lähtöentsyymin muunnoksen, joka on vähemmän riippuvainen kalsiumista ja joka valinnaisesti sietää paremmin jotakin pesuainetta tai pesuainekomponenttia lipolyyttiseen lähtöentsyymiin verrattuna, valmis-20 tamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmässä viljellään jotakin minkä tahansa patenttivaa- . timuksista 31-35 mukaista isäntäsolua sopivissa olosuhteissa, jotta se ilmentää • # · ,*"4 muunnoksen, ja ilmennetty muunnos otetaan talteen viljelystä. • · · ··· • · t · · h / 25
38. Pesuaineen lisäaine, tunnettu siitä, että se käsittää minkä tahansa patentti- • t · : ;* vaatimuksista 25 tai 26 mukaisen lipolyyttisen entsyymin muunnoksen, valinnaises- *···* ti pölyämättömän granulaatin, stabiloidun liuoksen tai suojatun entsyymin muodos- • ·*· v · sa. ί,ϊ,ϊ 30
39. Patenttivaatimuksen 38 mukainen pesuaineen lisäaine, t u n n e tt u siitä, että : se sisältää 0,02 - 200 mg entsyymiproteiinia/g lisäainetta. ·*· • · · • t
40. Patenttivaatimuksen 38 tai 39 mukainen pesuaineen lisäaine, tunnettu "** siitä, että se käsittää lisäksi jonkin toisen entsyymin, kuten jonkin proteaasin, amy- ..*·* 35 laasin, peroksidaasin, kutinaasin ja/tai sellulaasin. ··· • · • · * «
41. Pesuainekoostumus, tunnettu siitä, että se käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksista 25 tai 26 mukaisen lipolyyttisen entsyymin muunnoksen. 119514
42. Patenttivaatimuksen 41 mukainen pesuainekoostumus, tunnettu siitä, että se käsittää lisäksi jonkin toisen entsyymin, kuten jonkin proteaasin, amylaasin, per-oksidaasin, kutinaasin ja/tai sellulaasin. 5
FI963266A 1994-02-22 1996-08-21 Menetelmä lipolyyttisen entsyymin muunnoksen valmistamiseksi FI119514B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK21794 1994-02-22
DK21794 1994-02-22
DK9500079 1995-02-22
PCT/DK1995/000079 WO1995022615A1 (en) 1994-02-22 1995-02-22 A method of preparing a variant of a lipolytic enzyme

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI963266A FI963266A (fi) 1996-08-21
FI963266A0 FI963266A0 (fi) 1996-08-21
FI119514B true FI119514B (fi) 2008-12-15

Family

ID=8091063

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI963266A FI119514B (fi) 1994-02-22 1996-08-21 Menetelmä lipolyyttisen entsyymin muunnoksen valmistamiseksi

Country Status (13)

Country Link
US (1) US5976855A (fi)
EP (1) EP0746618B1 (fi)
JP (1) JP3553958B2 (fi)
KR (1) KR970701264A (fi)
CN (1) CN1077598C (fi)
AT (1) ATE222604T1 (fi)
AU (1) AU1806795A (fi)
BR (1) BR9506861A (fi)
CA (1) CA2183431A1 (fi)
DE (1) DE69527835T2 (fi)
FI (1) FI119514B (fi)
MX (1) MX9603542A (fi)
WO (1) WO1995022615A1 (fi)

Families Citing this family (637)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6936289B2 (en) 1995-06-07 2005-08-30 Danisco A/S Method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products
US6406723B1 (en) 1997-04-09 2002-06-18 Danisco A/S Method for preparing flour doughs and products made from such doughs using glycerol oxidase and lipase
US6495357B1 (en) * 1995-07-14 2002-12-17 Novozyme A/S Lipolytic enzymes
ATE239799T1 (de) 1995-09-07 2003-05-15 Novozymes As Nachweis der aktivität von enzymen für detergenzien durch phagen.
BE1009650A5 (fr) * 1995-10-12 1997-06-03 Genencor Int Systeme d'expression, vecteur et cellule transformee par ce vecteur.
AU5862196A (en) * 1996-05-15 1997-12-05 Procter & Gamble Company, The Detergent compositions comprising specific lipolytic enzyme and zeolite map
JPH11511780A (ja) * 1996-05-15 1999-10-12 ザ、プロクター、エンド、ギャンブル、カンパニー 特定の脂肪分解酵素と石炭石鹸分散剤とを含んでなる洗剤組成物
EP0954569A1 (en) * 1996-08-27 1999-11-10 Novo Nordisk A/S Novel lipolytic enzymes
DE948609T1 (de) * 1996-12-06 2000-03-09 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals, Inc. Von humanem lipase-ähnlichem gen kodierte polypeptide, sowie zusammensetzungen und methoden
US7008776B1 (en) * 1996-12-06 2006-03-07 Aventis Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for effecting the levels of high density lipoprotein (HDL) cholesterol and apolipoprotein AI very low density lipoprotein (VLDL) cholesterol and low density lipoprotein (LDL) cholesterol
DE19701348A1 (de) * 1997-01-16 1998-07-23 Roehm Gmbh Protein mit Phospholipaseaktivität
GB9701425D0 (en) 1997-01-24 1997-03-12 Bioinvent Int Ab A method for in vitro molecular evolution of protein function
US5990266A (en) * 1997-12-04 1999-11-23 University Of Nebraska Degradable polyesters, a mixed culture of microorganisms for degrading these polyesters, and methods for making these substances
WO1999034011A2 (en) † 1997-12-24 1999-07-08 Genencor International, Inc. Method of assaying for a preferred enzyme and/or detergent
AU3247699A (en) 1998-02-17 1999-09-06 Novo Nordisk A/S Lipase variant
US6156552A (en) * 1998-02-18 2000-12-05 Novo Nordisk A/S Lipase variants
EP0943678A3 (en) * 1998-02-18 2000-05-10 Novo Nordisk A/S Lipase variants
ES2188190T5 (es) 1998-07-21 2007-11-16 Danisco A/S Producto alimentario.
TR200101497T2 (tr) * 1998-11-27 2001-11-21 Novozymes A/S Lipolitik enzim varyantları
US7312062B2 (en) 1998-11-27 2007-12-25 Novozymes A/S Lipolytic enzyme variants
ATE504651T1 (de) 1998-12-18 2011-04-15 Novozymes As Subtilase enzyme der i-s1- und i-s2-untergruppen mit einem zusätzlichen aminosäurerest in einer aktiven schleifenregion
JP2000245468A (ja) * 1999-02-26 2000-09-12 Meiji Seika Kaisha Ltd 脱色活性を有する新規酵素及びこれを用いた染料の脱色方法
AU3420100A (en) 1999-03-31 2000-10-23 Novozymes A/S Lipase variant
ES2322426T3 (es) 1999-03-31 2009-06-22 Novozymes A/S Polipeptidos con actividad alfa-amilasa y acidos nucleicos que codifican a los mismos.
CN100455663C (zh) * 1999-03-31 2009-01-28 诺维信公司 脂肪酶变体
WO2000060060A2 (en) 1999-03-31 2000-10-12 Novozymes A/S Polypeptides having alkaline alpha-amylase activity and nucleic acids encoding same
ATE408679T1 (de) 1999-05-20 2008-10-15 Novozymes As Subtilase enzyme der i-s1 und i-s2 untergruppen mit mindestens einer zusätzlichen aminosäure zwischen position 127 und 128
DE60040284D1 (de) 1999-05-20 2008-10-30 Novozymes As Subtilase enzyme der i-s1 und i-s2 untergruppen mit mindestens einer zusätzlichen aminosäure zwischen position 129 und 130
EP1183340B1 (en) 1999-05-20 2008-09-03 Novozymes A/S Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additional amino acid residue between positions 126 and 127
WO2000071690A1 (en) 1999-05-20 2000-11-30 Novozymes A/S Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additional amino acid residue between positions 128 and 129
ATE402996T1 (de) 1999-05-20 2008-08-15 Novozymes As Subtilase-enzyme der i-s1 und i-s2 untergruppen mit wenigstens einem zusätzlichen aminosäurerest zwischen positionen 125 und 126
DE60040282D1 (de) 1999-05-20 2008-10-30 Novozymes As SUBTILASE ENZYME DER I-S1 UND I-S2 UNTERGRUPPEN MIT MINDESTENS EINER ZUSäTZLICHEN AMINOSäURE ZWISCHEN POSITION 132 UND 133
EP1214426A2 (en) 1999-08-31 2002-06-19 Novozymes A/S Novel proteases and variants thereof
CA2419896C (en) 2000-08-21 2014-12-09 Novozymes A/S Subtilase enzymes
EP2333055A1 (en) 2000-10-13 2011-06-15 Novozymes A/S Subtilase variants
US20040091994A1 (en) 2000-10-13 2004-05-13 Carsten Andersen Alpha-amylase variant with altered properties
DE60231700D1 (de) 2001-01-10 2009-05-07 Novozymes As Variante eines lipolytischen enzyms
EP1360278B1 (en) * 2001-02-07 2009-09-23 Novozymes A/S Lipase variants
CN1526013A (zh) 2001-02-23 2004-09-01 诺维信公司 脂解酶基因
EP2159279A3 (en) 2001-05-15 2010-05-12 Novozymes A/S Alpha-amylase variant with altered properties
MXPA03010511A (es) 2001-05-18 2004-03-02 Danisco Metodo para preparar una masa con una enzima.
ES2438146T3 (es) 2001-06-26 2014-01-16 Novozymes A/S Polipéptidos que tienen actividad de celobiohirolasa I y polinucleótidos que codifican los mismos
DK200101090A (da) 2001-07-12 2001-08-16 Novozymes As Subtilase variants
CN100386434C (zh) 2002-03-27 2008-05-07 诺和酶股份有限公司 具有丝状包衣的颗粒
DE60325731D1 (en) 2002-07-01 2009-02-26 Novozymes As Monopropylenglykol als fermentationszusatz
ATE494368T1 (de) 2002-10-01 2011-01-15 Novozymes As Polypeptide der gh-61-familie
AU2003275473A1 (en) 2002-10-08 2004-05-04 Genencor International, Inc. Phenolic binding peptides
TWI319007B (en) 2002-11-06 2010-01-01 Novozymes As Subtilase variants
DK1578964T4 (da) 2002-12-20 2013-12-02 Novozymes As Polypeptider med cellobiohydrolase II-aktivitet og polynukleotider, der koder for samme
MXPA05007653A (es) 2003-01-17 2005-09-30 Danisco Metodo.
US20050196766A1 (en) 2003-12-24 2005-09-08 Soe Jorn B. Proteins
US7955814B2 (en) 2003-01-17 2011-06-07 Danisco A/S Method
JP2006517990A (ja) 2003-01-27 2006-08-03 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 粒体の安定化
JP2006517989A (ja) 2003-02-18 2006-08-03 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 洗剤組成物
US7413888B2 (en) 2003-05-02 2008-08-19 Novozymes, Inc. Variants of beta-glucosidases
US20060251763A1 (en) * 2003-06-19 2006-11-09 Patkar Shamkant A Phospholipase variants
ES2346654T3 (es) 2003-06-19 2010-10-19 Novozymes A/S Proteasas.
AU2004252572B2 (en) 2003-06-25 2011-09-08 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polypeptides encoding same
ES2424346T3 (es) 2003-08-25 2013-10-01 Novozymes Inc. Variantes de glucósido hidrolasas
EP2308966A1 (en) 2003-10-10 2011-04-13 Novozymes A/S Protease variants
CN1871344A (zh) 2003-10-23 2006-11-29 诺和酶股份有限公司 在洗涤剂中具有改善稳定性的蛋白酶
WO2005047499A1 (en) 2003-10-28 2005-05-26 Novozymes Inc. Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same
US7906307B2 (en) 2003-12-24 2011-03-15 Danisco A/S Variant lipid acyltransferases and methods of making
US7718408B2 (en) 2003-12-24 2010-05-18 Danisco A/S Method
GB0716126D0 (en) 2007-08-17 2007-09-26 Danisco Process
EP1709165B1 (en) 2004-01-06 2014-04-23 Novozymes A/S Polypeptides of alicyclobacillus
EP2305702B1 (en) 2004-01-30 2014-03-19 Novozymes Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
WO2005078074A2 (en) 2004-02-13 2005-08-25 Novozymes A/S Protease variants
GB0405637D0 (en) 2004-03-12 2004-04-21 Danisco Protein
US7148404B2 (en) 2004-05-04 2006-12-12 Novozymes A/S Antimicrobial polypeptides
WO2005123911A2 (en) 2004-06-21 2005-12-29 Novozymes A/S Proteases
WO2006002643A2 (en) 2004-07-05 2006-01-12 Novozymes A/S Alpha-amylase variants with altered properties
PL1791933T3 (pl) 2004-07-16 2011-12-30 Dupont Nutrition Biosci Aps Sposób enzymatycznego odgumowania oleju
ATE554163T1 (de) 2004-09-21 2012-05-15 Novozymes As Subtilasen
US7811979B2 (en) 2004-09-21 2010-10-12 Novozymes A/S Subtilases
US7741095B2 (en) 2004-09-21 2010-06-22 Novozymes A/S Subtilases
CN101084307B (zh) 2004-09-30 2011-06-01 诺维信股份有限公司 具有脂肪酶活性的多肽和编码其的多核苷酸
EP2886658A1 (en) 2005-03-10 2015-06-24 BASF Enzymes LLC Lyase enzymes, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US7824884B2 (en) 2005-04-27 2010-11-02 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
EP2290061A3 (en) 2005-07-08 2011-07-06 Novozymes A/S Subtilase variants
CN101243182B (zh) 2005-08-16 2014-08-06 诺维信公司 枯草蛋白酶
US8119387B2 (en) 2005-08-16 2012-02-21 Novozymes A/S Polypeptides of strain Bacillus sp. P203
PL1754781T3 (pl) 2005-08-19 2013-09-30 Procter & Gamble Stała kompozycja detergentowa do prania zawierająca anionowy środek powierzchniowo czynny i technologię wspomagania wapniem
US9303256B2 (en) 2005-09-30 2016-04-05 Novozymes A/S Immobilization of enzymes
EP1941023B1 (en) 2005-09-30 2017-04-05 Novozymes Inc. Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material
US7790666B2 (en) 2006-01-23 2010-09-07 The Procter & Gamble Company Detergent compositions
WO2007087508A2 (en) 2006-01-23 2007-08-02 Novozymes A/S Lipase variants
CN101370921B (zh) 2006-01-23 2014-08-13 宝洁公司 包含脂肪酶和漂白催化剂的组合物
EP1994130A1 (en) 2006-03-02 2008-11-26 Novozymes A/S High capacity encapsulation process
US7883711B2 (en) 2006-03-22 2011-02-08 Novozymes A/S Use of polypeptides having antimicrobial activity
EP2383330A1 (en) 2006-03-31 2011-11-02 Novozymes A/S A stabilized liquid enzyme composition
PT2007942E (pt) 2006-04-14 2014-10-07 Danisco Us Inc Tratamento de têxteis num passo
CN103451164A (zh) 2006-07-14 2013-12-18 诺维信股份有限公司 用于产生具有生物学活性的分泌型多肽的方法
EP2044188B1 (en) 2006-07-14 2015-09-09 Novozymes A/S Polypeptides having lipase activity and polynucleotides encoding same
CA2658610A1 (en) 2006-07-21 2008-05-15 Novozymes, Inc. Methods of increasing secretion of polypeptides having biological activity
EP2066785B1 (en) 2006-08-11 2023-02-01 Novozymes Biologicals, Inc. Bacteria cultures and compositions comprising bacteria cultures
DK2074205T4 (en) 2006-10-06 2017-02-06 Novozymes As CELLULOTIC ENZYME COMPOSITIONS AND APPLICATIONS THEREOF
JP2010512787A (ja) 2006-12-21 2010-04-30 ダニスコ・ユーエス・インク、ジェネンコー・ディビジョン バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種１９５のアルファ‐アミラーゼポリペプチドの組成物と使用。
MX2009006597A (es) 2006-12-21 2009-07-02 Novozymes As Variantes de lipasa para uso farmaceutico.
MX2009008021A (es) 2007-01-25 2009-08-07 Danisco Produccion de una aciltransferasa de lipido de celulas de bacillus licheniformis transformadas.
DK2851424T3 (en) 2007-03-09 2017-01-16 Novozymes As asparaginases
CA2680158A1 (en) 2007-03-09 2008-09-18 Danisco Us Inc. Alkaliphilic bacillus species .alpha.-amylase variants, compositions comprising .alpha.-amylase variants, and methods of use
WO2008118749A2 (en) 2007-03-23 2008-10-02 Novozymes Biologicals, Inc. Preventing and reducing biofilm formation and planktonic proliferation
DE102007016139A1 (de) 2007-03-30 2008-10-02 Jenabios Gmbh Verfahren zur regioselektiven Oxygenierung von N-Heterozyklen
BRPI0819184B1 (pt) 2007-11-05 2022-05-10 Danisco Us Inc Variantes de alfa-amilase com propriedades alteradas, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, composição, kit, bem como métodos para tratamento de um caldo de amido, para produção de um substrato fermentável, e para tratamento de um material contendo amido
DK2215202T3 (da) 2007-11-05 2017-11-27 Danisco Us Inc VARIANTER AF BACILLUS sp. TS-23 ALPHA-AMYLASE MED ÆNDREDE EGENSKABER
WO2009100102A2 (en) 2008-02-04 2009-08-13 Danisco Us Inc., Genencor Division Ts23 alpha-amylase variants with altered properties
CN101960007A (zh) * 2008-02-29 2011-01-26 宝洁公司 包含脂肪酶的洗涤剂组合物
US20090217464A1 (en) * 2008-02-29 2009-09-03 Philip Frank Souter Detergent composition comprising lipase
CN102016044B (zh) 2008-04-30 2014-11-26 丹尼斯科美国公司 新型嵌合α-淀粉酶变体
EP2300605A2 (en) 2008-06-06 2011-03-30 Danisco US Inc. Geobacillus stearothermophilus alpha-amylase (amys) variants with improved properties
JP5599113B2 (ja) 2008-06-06 2014-10-01 ダニスコ・ユーエス・インク 糖化酵素組成物及びその糖化方法
WO2009149271A2 (en) 2008-06-06 2009-12-10 Danisco Us Inc. Production of glucose from starch using alpha-amylases from bacillus subtilis
CA2726803A1 (en) 2008-06-06 2009-12-10 Danisco Us Inc. Variant alpha-amylases from bacillus subtilis and methods of use, thereof
GB0810881D0 (en) 2008-06-16 2008-07-23 Unilever Plc Improvements relating to fabric cleaning
EP2149786A1 (en) 2008-08-01 2010-02-03 Unilever PLC Improvements relating to detergent analysis
ES1076140Y (es) 2008-09-12 2012-05-08 Unilever Nv Dispensador y pretratador para liquidos viscosos
CN102224234B (zh) 2008-09-25 2014-04-16 丹尼斯科美国公司 α-淀粉酶混合物和使用所述混合物的方法
WO2010059413A2 (en) 2008-11-20 2010-05-27 Novozymes, Inc. Polypeptides having amylolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
CA2744987C (en) 2008-12-02 2018-01-16 Chiralgen, Ltd. Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids
BRPI0922773B1 (pt) 2008-12-04 2018-10-09 Novozymes As célula microbiana hospedeira transgênica, métodos para produzir um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica e para degradar ou converter um material celulósico, construção de ácido nucleico, vetor de expressão, e, composição detergente.
EP2376527A1 (en) 2008-12-12 2011-10-19 Novozymes Inc. Polypeptides having lipase activity and polynucleotides encoding same
EP2202290A1 (en) 2008-12-23 2010-06-30 Unilever PLC A flowable laundry composition and packaging therefor
EP2213723A1 (en) 2009-01-30 2010-08-04 Novozymes A/S Isomaltose for fungus fermentation
US20110306139A1 (en) 2009-02-27 2011-12-15 Novozymes A/S Mutant Cells Suitable For Recombinant Polypeptide Production
WO2010104675A1 (en) 2009-03-10 2010-09-16 Danisco Us Inc. Bacillus megaterium strain dsm90-related alpha-amylases, and methods of use, thereof
US8153574B2 (en) 2009-03-18 2012-04-10 The Procter & Gamble Company Structured fluid detergent compositions comprising dibenzylidene polyol acetal derivatives and detersive enzymes
US8293697B2 (en) 2009-03-18 2012-10-23 The Procter & Gamble Company Structured fluid detergent compositions comprising dibenzylidene sorbitol acetal derivatives
CA2757343A1 (en) 2009-04-01 2010-10-07 Danisco Us Inc. Compositions and methods comprising alpha-amylase variants with altered properties
WO2010117511A1 (en) 2009-04-08 2010-10-14 Danisco Us Inc. Halomonas strain wdg195-related alpha-amylases, and methods of use, thereof
BRPI1011411A2 (pt) 2009-05-05 2016-03-15 Unilever Nv composição de tratamento para lavagem de tecidos, e, método doméstico de tratamento de tecidos
WO2011000924A1 (en) 2009-07-03 2011-01-06 Abbott Products Gmbh Spray-dried amylase, pharmaceutical preparations comprising the same and use
CA2767253A1 (en) 2009-07-06 2011-01-13 Ontorii, Inc. Novel nucleic acid prodrugs and methods of use thereof
DK3269804T3 (da) 2009-09-17 2020-11-23 Novozymes Inc Polypeptider med cellulolyseforbedrende aktivitet og polynukleotider, som koder for dem
US20120252106A1 (en) 2009-09-25 2012-10-04 Novozymes A/S Use of Protease Variants
RU2651525C2 (ru) 2009-09-25 2018-04-19 Новозимс А/С Варианты субтилаз
CA2775358A1 (en) 2009-09-29 2011-04-07 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
DK2483296T3 (en) 2009-09-30 2015-11-02 Novozymes Inc Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding them
CN102666846A (zh) 2009-09-30 2012-09-12 诺维信公司 具有纤维素分解增强活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
US8673024B2 (en) 2009-10-08 2014-03-18 Conopco Inc. Shading composition
ES2532473T3 (es) 2009-10-13 2015-03-27 Unilever N.V. Polímeros colorantes
BR112012009143A2 (pt) 2009-10-21 2015-09-15 Novozymes As método para tratamento de óleo que contém ácidos solúveis em água, e, partículas de sílica amorfa porosa que contêm base
WO2011047987A1 (en) 2009-10-23 2011-04-28 Unilever Plc Dye polymers
BR112012009659A2 (pt) 2009-10-23 2015-09-15 Danisco Us Inc métodos para redução de sacarídeo azul.
WO2011080267A2 (en) 2009-12-29 2011-07-07 Novozymes A/S Polypetides having detergency enhancing effect
WO2011082889A1 (en) 2010-01-07 2011-07-14 Unilever Plc Natural shading agents
AU2011208429B2 (en) 2010-01-22 2014-05-22 Dupont Nutrition Biosciences Aps Methods for producing amino-substituted glycolipid compounds
ES2477518T3 (es) 2010-02-09 2014-07-17 Unilever Nv Polímeros colorantes
EP2534237B1 (en) 2010-02-12 2014-11-12 Unilever PLC Laundry treatment composition comprising bis-azo shading dyes
US8859259B2 (en) 2010-02-14 2014-10-14 Ls9, Inc. Surfactant and cleaning compositions comprising microbially produced branched fatty alcohols
CN102782126A (zh) 2010-02-18 2012-11-14 丹尼斯科美国公司 得自涅斯捷连科氏菌(Nesterenkonia)的淀粉酶及其使用方法
JP5833576B2 (ja) 2010-02-25 2015-12-16 ノボザイムス アクティーゼルスカブ リゾチームの変異体及びそれをコードするポリヌクレオチド
CN102892875A (zh) 2010-04-29 2013-01-23 荷兰联合利华有限公司 双杂环偶氮染料
CN103052704A (zh) 2010-07-22 2013-04-17 荷兰联合利华有限公司 用于提高清洁的鼠李糖脂和酶的组合物
CN103154263A (zh) 2010-08-19 2013-06-12 诺维信公司 诱导的孢子形成筛选方法
EP2611898A1 (en) 2010-08-30 2013-07-10 Novozymes A/S A concentrated soak wash
WO2012028482A1 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Novozymes A/S A two-soak wash
WO2012035103A1 (en) 2010-09-16 2012-03-22 Novozymes A/S Lysozymes
GB201015672D0 (en) 2010-09-20 2010-10-27 Unilever Plc Improvements relating to fabric treatment compositions comprising targeted benefit agents
EP2620428B1 (en) 2010-09-24 2019-05-22 Wave Life Sciences Ltd. Asymmetric auxiliary group
WO2012044836A1 (en) 2010-09-30 2012-04-05 Novozymes, Inc. Variants of polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
DK2622068T3 (en) 2010-09-30 2016-10-17 Novozymes Inc Variants of polypeptides having cellulolytic enhancing ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING THEM
EP2441820A1 (en) 2010-10-14 2012-04-18 Unilever Plc, A Company Registered In England And Wales under company no. 41424 of Unilever House Laundry detergent particles
EP2627753B1 (en) 2010-10-14 2016-11-02 Unilever PLC Laundry detergent particle
WO2012049034A1 (en) 2010-10-14 2012-04-19 Unilever Plc Packaging and dispensing of detergent compositions
EP2441822A1 (en) 2010-10-14 2012-04-18 Unilever Plc, A Company Registered In England And Wales under company no. 41424 of Unilever House Laundry detergent particles
CN103180222B (zh) 2010-10-14 2016-01-20 荷兰联合利华有限公司 包装的浓缩颗粒洗涤剂组合物
US9062281B2 (en) 2010-10-14 2015-06-23 Conopco, Inc. Particulate detergent compositions comprising fluorescer
BR112013009129B1 (pt) 2010-10-14 2020-10-13 Unilever N.V. partícula de detergente revestida
AU2011316077B2 (en) 2010-10-14 2014-01-23 Unilever Plc Packaged particulate detergent composition
CN103282477B (zh) 2010-10-14 2015-04-01 荷兰联合利华有限公司 顶部装载洗衣容器的方法
CN103153812B (zh) 2010-10-14 2016-04-06 荷兰联合利华有限公司 洗涤剂组合物的透明包装
ES2602176T3 (es) 2010-10-14 2017-02-17 Unilever N.V. Partículas de detergente para lavado de ropa
ES2617553T3 (es) 2010-10-14 2017-06-19 Unilever N.V. Partículas de detergente para lavado de ropa
US8883702B2 (en) 2010-10-14 2014-11-11 Conopco, Inc. Packaged particulate detergent composition
CN103153813B (zh) 2010-10-14 2015-08-19 荷兰联合利华有限公司 包含洗衣组合物的包装、所述包装的分配器和利用所述分配器和所述包装进行洗涤的方法
ES2644555T3 (es) 2010-10-14 2017-11-29 Unilever N.V. Embalaje y distribución de composiciones detergentes
ES2613702T3 (es) 2010-10-14 2017-05-25 Unilever N.V. Partículas de detergente para lavado de ropa
WO2012049032A1 (en) 2010-10-14 2012-04-19 Unilever Plc Refill and refillable packages of concentrated particulate detergent compositions
CA2813793C (en) 2010-10-14 2019-05-07 Unilever Plc Laundry detergent particles
EP2441825A1 (en) 2010-10-14 2012-04-18 Unilever Plc, A Company Registered In England And Wales under company no. 41424 of Unilever House Process for preparing laundry detergent particles
WO2012052306A1 (en) 2010-10-22 2012-04-26 Unilever Plc Externally structured aqueous detergent liquid
EP2635666B1 (en) 2010-11-01 2014-07-23 Unilever N.V. A detergent composition having shading dyes and lipase
DK2640833T3 (en) 2010-11-18 2016-11-28 Novozymes Inc Chimeric polypeptides having cellulolytic enhancing ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING THEM
WO2012098046A1 (en) 2011-01-17 2012-07-26 Unilever Plc Dye polymer for laundry treatment
BR112013017319A2 (pt) 2011-01-21 2019-09-24 Novozymes As processo para produção de alquil ésteres de ácidos graxos
ES2656049T3 (es) 2011-01-31 2018-02-22 Novozymes A/S Uso de glucosa tostada para la producción fermentativa de taxtomina
MY163351A (en) 2011-01-31 2017-09-15 Unilever Plc Alkaline liquid detergent compositions
US9422584B2 (en) 2011-02-04 2016-08-23 Novozymes A/S Fatty acid esterification process
PL2675891T3 (pl) 2011-02-15 2019-03-29 Novozymes Biologicals, Inc. Łagodzenie zapachu w maszynach czyszczących i procesach czyszczenia
MX2013009178A (es) 2011-02-16 2013-08-29 Novozymes As Composiciones detergentes que comprenden metaloproteasas.
JP2014511409A (ja) 2011-02-16 2014-05-15 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 金属プロテアーゼを含む洗剤組成物
WO2012110564A1 (en) 2011-02-16 2012-08-23 Novozymes A/S Detergent compositions comprising m7 or m35 metalloproteases
MX2013007997A (es) 2011-02-23 2013-08-21 Novozymes Inc Polipeptidos que tienen actividad de incremento celulolitico y polinucleotidos que codifican para los mismos.
VN36510A1 (en) 2011-03-10 2014-01-27 Unilever Plc No 41424 Dye polymer
WO2012130492A1 (en) 2011-03-25 2012-10-04 Unilever Plc Dye polymer
US20140017741A1 (en) 2011-03-30 2014-01-16 Novozymes A/S Esterification Process
US9410136B2 (en) 2011-03-31 2016-08-09 Novozymes, Inc. Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material
EP2476743B1 (en) 2011-04-04 2013-04-24 Unilever Plc, A Company Registered In England And Wales under company no. 41424 of Unilever House Method of laundering fabric
KR101303113B1 (ko) * 2011-04-06 2013-09-06 서울대학교산학협력단 활성이 증진된 칸디다 안타르크티카 지질분해효소 ｂ 및 그 유전자
WO2012149344A1 (en) 2011-04-29 2012-11-01 Novozymes, Inc. Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material
EP2522715A1 (en) 2011-05-13 2012-11-14 Unilever Plc, A Company Registered In England And Wales under company no. 41424 of Unilever House Aqueous concentrated laundry detergent compositions
EP2522714A1 (en) 2011-05-13 2012-11-14 Unilever Plc, A Company Registered In England And Wales under company no. 41424 of Unilever House Aqueous concentrated laundry detergent compositions
WO2012159778A1 (en) 2011-05-26 2012-11-29 Unilever Plc Liquid laundry composition
WO2012163871A1 (en) 2011-06-01 2012-12-06 Unilever Plc Liquid detergent composition containing dye polymer
CN103620029B (zh) 2011-06-24 2017-06-09 诺维信公司 具有蛋白酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸
MX351850B (es) 2011-06-30 2017-10-31 Novozymes As Metodo para el cribado de alfa-amilasas.
CN109097347A (zh) 2011-06-30 2018-12-28 诺维信公司 α-淀粉酶变体
CN103649292B (zh) 2011-07-01 2017-11-28 诺维信公司 稳定化的枯草杆菌蛋白酶组合物
WO2013004635A1 (en) 2011-07-01 2013-01-10 Novozymes A/S Liquid detergent composition
EP2732018B1 (en) 2011-07-12 2017-01-04 Novozymes A/S Storage-stable enzyme granules
EP3248982A1 (en) 2011-07-19 2017-11-29 Wave Life Sciences Ltd. Thiosulfonate reagents for the synthesis of functionalized nucleic acids
EP2734610B1 (en) 2011-07-21 2015-09-09 Unilever PLC Liquid laundry composition
WO2013024021A1 (en) 2011-08-15 2013-02-21 Novozymes A/S Polypeptides having cellulase activity and polynucleotides encoding same
CN103764822B (zh) 2011-08-19 2016-11-23 诺维信公司 具有蛋白酶活性的多肽
US20140227738A1 (en) 2011-09-22 2014-08-14 Novozymes A/S Polypeptides Having Protease Activity and Polynucleotides Encoding Same
AU2012328562A1 (en) 2011-10-28 2014-03-13 Danisco Us Inc. Variant maltohexaose-forming alpha-amylase variants
WO2013073760A1 (ko) * 2011-11-18 2013-05-23 한국생명공학연구원 갯벌 메타게놈 유래 신규 유전자 및 이로부터 얻어지는 포스포리파제 및 리파제 동시 활성을 보이는 신규 단백질
EP3597736A1 (en) 2011-11-21 2020-01-22 Novozymes A/S Gh61 polypeptide variants and polynucleotides encoding same
CN103957929B (zh) 2011-11-25 2017-06-30 诺维信公司 具有溶菌酶活性的多肽和编码所述多肽的多核苷酸
WO2013076269A1 (en) 2011-11-25 2013-05-30 Novozymes A/S Subtilase variants and polynucleotides encoding same
WO2013087027A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Novozymes, Inc. Polypeptides having laccase activity and polynucleotides encoding same
EP2607468A1 (en) 2011-12-20 2013-06-26 Henkel AG & Co. KGaA Detergent compositions comprising subtilase variants
CN103998593B (zh) 2011-12-20 2017-05-03 荷兰联合利华有限公司 包含脂肪酶和漂白催化剂的液体洗涤剂
CN107267489A (zh) 2011-12-20 2017-10-20 诺维信公司 枯草杆菌酶变体和编码它们的多核苷酸
EP2794832B1 (en) 2011-12-20 2016-05-25 Unilever Plc. Isotropic liquid detergents comprising soil release polymer
EP2794866A1 (en) 2011-12-22 2014-10-29 Danisco US Inc. Compositions and methods comprising a lipolytic enzyme variant
IN2014DN03298A (fi) 2011-12-22 2015-06-26 Danisco Us Inc
US10174301B2 (en) 2011-12-28 2019-01-08 Novozymes A/S Methods for improving the nutritional value of the animal feed using a protease
CN104024393A (zh) 2011-12-29 2014-09-03 诺维信公司 具有脂肪酶变体的洗涤剂组合物
CN104350149A (zh) 2012-01-26 2015-02-11 诺维信公司 具有蛋白酶活性的多肽在动物饲料和洗涤剂中的用途
RU2612215C2 (ru) * 2012-02-03 2017-03-03 Дзе Проктер Энд Гэмбл Компани Композиции, содержащие липазы, и способы обработки поверхности
MX350713B (es) 2012-02-17 2017-09-14 Novozymes As Variantes de subtilisina y polinucleotidos que las codifican.
EP2628785B1 (en) 2012-02-17 2016-05-18 Henkel AG & Co. KGaA Detergent compositions comprising subtilase variants
WO2013131964A1 (en) 2012-03-07 2013-09-12 Novozymes A/S Detergent composition and substitution of optical brighteners in detergent compositions
EP2639291A1 (en) 2012-03-13 2013-09-18 Unilever PLC Packaged particulate detergent composition
US10087401B2 (en) 2012-03-16 2018-10-02 Monosol, Llc Water soluble compositions incorporating enzymes, and method of making same
WO2013139702A1 (en) 2012-03-21 2013-09-26 Unilever Plc Laundry detergent particles
EP2831215B1 (en) 2012-03-29 2018-08-08 Novozymes A/S Use of enzymes for preparing water soluble films
CN104204198B (zh) 2012-04-02 2018-09-25 诺维信公司 脂肪酶变体以及编码其的多核苷酸
CN104220582B (zh) 2012-04-03 2017-12-22 荷兰联合利华有限公司 洗衣洗涤剂颗粒
WO2013149755A1 (en) 2012-04-03 2013-10-10 Unilever Plc Laundry detergent particles
US20150038393A1 (en) 2012-04-03 2015-02-05 Conopco, Inc., D/B/A Unilever Laundry detergent particles
MX2014011547A (es) 2012-04-03 2014-11-14 Unilever Nv Particulas de detergente para lavado de ropa.
US9394092B2 (en) 2012-04-16 2016-07-19 Monosol, Llc Powdered pouch and method of making same
CN104379716A (zh) 2012-04-23 2015-02-25 荷兰联合利华有限公司 结构化的水性液体洗涤剂
EP2841567B1 (en) 2012-04-27 2017-07-26 Novozymes, Inc. Gh61 polypeptide variants and polynucleotides encoding same
ES2643216T3 (es) 2012-05-07 2017-11-21 Novozymes A/S Polipéptidos con actividad de degradación de xantano y polinucleótidos que codifican la misma
CA2870830A1 (en) 2012-05-11 2013-11-14 Danisco Us Inc. Use of alpha-amylase from aspergillus clavatus for saccharification
US20150132831A1 (en) 2012-05-16 2015-05-14 Novozymes A/S Compositions Comprising Lipase and Methods of Use Thereof
DK2825643T3 (da) 2012-06-08 2021-11-08 Danisco Us Inc Variant-alfa-amylaser med forbedret aktivitet over for stivelsespolymerer
EP2861749A1 (en) 2012-06-19 2015-04-22 Novozymes Bioag A/S Enzymatic reduction of hydroperoxides
BR112014031882A2 (pt) 2012-06-20 2017-08-01 Novozymes As uso de um polipeptídeo isolado, polipeptídeo, composição, polinucleotídeo isolado, construto de ácido nucleico ou vetor de expressão, célula hospedeira de expressão recombinante, métodos para produção de um polipeptídeo, para melhoria do valor nutricional de uma ração animal, e para o tratamento de proteínas, uso de pelo menos um polipeptídeo, aditivo de ração animal, ração animal, e, composição detergente
WO2014010718A1 (ja) 2012-07-13 2014-01-16 株式会社新日本科学 キラル核酸アジュバント
EP4219516A3 (en) 2012-07-13 2024-01-10 Wave Life Sciences Ltd. Chiral control
SG11201500239VA (en) 2012-07-13 2015-03-30 Wave Life Sciences Japan Asymmetric auxiliary group
US9663804B2 (en) 2012-07-18 2017-05-30 Novozymes A/S Method of treating polyester textile
US20150218606A1 (en) 2012-08-16 2015-08-06 Danisco Us Inc. Method of using alpha-amylase from aspergillus clavatus and pullulanase for saccharification
WO2014026630A1 (en) 2012-08-16 2014-02-20 Novozymes A/S Method for treating textile with endoglucanase
BR112015003726A2 (pt) 2012-08-22 2019-09-24 Novozymes As composição detergente, uso de uma composição e de um polipeptídeo, e, método para remoção de uma nódoa de uma superfície.
CN104603266B (zh) 2012-08-22 2017-11-10 诺维信公司 来自脂环酸芽孢杆菌属的金属蛋白酶
MX2015002211A (es) 2012-08-22 2015-05-08 Novozymes As Metaloproteasa de exiguobacterium.
US9688948B2 (en) 2012-09-25 2017-06-27 Conopco, Inc. Laundry detergent particles
US20150291656A1 (en) 2012-11-01 2015-10-15 Novozymes A/S Method for removal of dna
WO2014081622A1 (en) 2012-11-20 2014-05-30 Danisco Us Inc. Amylase with maltogenic properties
EP2929004B1 (en) 2012-12-07 2019-05-15 Novozymes A/S Preventing adhesion of bacteria
JP6499081B2 (ja) 2012-12-11 2019-04-10 ダニスコ・ユーエス・インク アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）由来のグルコアミラーゼを発現するトリコデルマ・レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）宿主細胞、及びその使用方法
WO2014090940A1 (en) 2012-12-14 2014-06-19 Novozymes A/S Removal of skin-derived body soils
CA2894513A1 (en) 2012-12-14 2014-06-19 Danisco Us Inc. Method of using alpha-amylase from aspergillus fumigatus and isoamylase for saccharification
EP2904105A1 (en) 2012-12-20 2015-08-12 Danisco US Inc. Method of using alpha-amylase from aspergillus terreus and pullulanase for saccharification
WO2014099525A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Danisco Us Inc. Paenibacillus curdlanolyticus amylase, and methods of use, thereof
CN104869841A (zh) 2012-12-21 2015-08-26 诺维信公司 具有蛋白酶活性的多肽和编码它的多核苷酸
US20160053243A1 (en) 2012-12-21 2016-02-25 Danisco Us Inc. Alpha-amylase variants
WO2014106593A1 (en) 2013-01-03 2014-07-10 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
HUE039341T2 (hu) 2013-03-11 2018-12-28 Danisco Us Inc Alfa-amiláz kombinatorikus variációi
US20160024440A1 (en) 2013-03-14 2016-01-28 Novozymes A/S Enzyme and Inhibitor Containing Water-Soluble Films
WO2014147127A1 (en) 2013-03-21 2014-09-25 Novozymes A/S Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same
EP3569611A1 (en) 2013-04-23 2019-11-20 Novozymes A/S Liquid automatic dish washing detergent compositions with stabilised subtilisin
EP2992076B1 (en) 2013-05-03 2018-10-24 Novozymes A/S Microencapsulation of detergent enzymes
AR096270A1 (es) 2013-05-14 2015-12-16 Novozymes As Composiciones detergentes
US20160083703A1 (en) 2013-05-17 2016-03-24 Novozymes A/S Polypeptides having alpha amylase activity
EP3786269A1 (en) 2013-06-06 2021-03-03 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
WO2014198840A1 (en) 2013-06-12 2014-12-18 Earth Alive Clean Technologies Inc. Dust suppressant
WO2014200657A1 (en) 2013-06-13 2014-12-18 Danisco Us Inc. Alpha-amylase from streptomyces xiamenensis
WO2014200658A1 (en) 2013-06-13 2014-12-18 Danisco Us Inc. Alpha-amylase from promicromonospora vindobonensis
WO2014200656A1 (en) 2013-06-13 2014-12-18 Danisco Us Inc. Alpha-amylase from streptomyces umbrinus
US20160130571A1 (en) 2013-06-17 2016-05-12 Danisco Us Inc. Alpha-Amylase from Bacillaceae Family Member
US20160145596A1 (en) 2013-06-27 2016-05-26 Novozymes A/S Subtilase Variants and Polynucleotides Encoding Same
US10378001B2 (en) 2013-06-27 2019-08-13 Novozymes A/S Subtilase variants and compositions comprising same
KR20160029080A (ko) 2013-07-04 2016-03-14 노보자임스 에이/에스 재오염 방지 효과를 가지는 잔탄 분해효소 활성을 가지는 폴리펩티드들 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드들
WO2015004102A1 (en) 2013-07-09 2015-01-15 Novozymes A/S Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same
MX371497B (es) 2013-07-19 2020-01-31 Danisco Us Inc Composiciones y metodos que comprenden una variante de enzima lipolitica.
EP3613853A1 (en) 2013-07-29 2020-02-26 Novozymes A/S Protease variants and polynucleotides encoding same
CN117904081A (zh) 2013-07-29 2024-04-19 诺维信公司 蛋白酶变体以及对其进行编码的多核苷酸
EP2832853A1 (en) 2013-07-29 2015-02-04 Henkel AG&Co. KGAA Detergent composition comprising protease variants
EP3052622B1 (en) 2013-10-03 2018-09-19 Danisco US Inc. Alpha-amylases from a subset of exiguobacterium, and methods of use, thereof
WO2015049370A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Novozymes A/S Detergent composition and use of detergent composition
US20160160199A1 (en) 2013-10-03 2016-06-09 Danisco Us Inc. Alpha-amylases from exiguobacterium, and methods of use, thereof
MX2016006489A (es) 2013-11-20 2016-08-03 Danisco Us Inc Alfa-amilasas variantes que tienen susceptibilidad reducida a la escision por proteasas y metodos de uso.
US9951299B2 (en) 2013-12-11 2018-04-24 Novozymes A/S Cutinase variants and polynucleotides encoding same
EP4163305B1 (en) 2013-12-16 2024-07-10 Nutrition & Biosciences USA 4, Inc. Use of poly alpha-1,3-glucan ethers as viscosity modifiers
AU2014364772B2 (en) 2013-12-18 2018-07-26 Nutrition & Biosciences USA 4, Inc. Cationic poly alpha-1,3-glucan ethers
WO2015094809A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Danisco Us Inc. Chimeric fungal alpha-amylases comprising carbohydrate binding module and the use thereof
CN105814200A (zh) 2013-12-20 2016-07-27 诺维信公司 具有蛋白酶活性的多肽以及编码它们的多核苷酸
WO2015108046A1 (ja) 2014-01-15 2015-07-23 株式会社新日本科学 抗アレルギー作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗アレルギー剤
US10144933B2 (en) 2014-01-15 2018-12-04 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having immunity induction activity, and immunity induction activator
JPWO2015108048A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤
RU2016133035A (ru) 2014-01-16 2018-02-21 Уэйв Лайф Сайенсес Лтд. Хиральный дизайн
WO2015109972A1 (en) 2014-01-22 2015-07-30 Novozymes A/S Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same
CN105992796A (zh) 2014-02-14 2016-10-05 纳幕尔杜邦公司 用于粘度调节的聚-α-1,3-1,6-葡聚糖
CN106062270A (zh) 2014-03-05 2016-10-26 诺维信公司 使用木葡聚糖内糖基转移酶改进非纤维素纺织材料的性质的组合物和方法
WO2015134737A1 (en) 2014-03-05 2015-09-11 Novozymes A/S Compositions and methods for improving properties of cellulosic textile materials with xyloglucan endotransglycosylase
EP3116914B8 (en) 2014-03-11 2021-04-21 E. I. du Pont de Nemours and Company Oxidized poly alpha-1,3-glucan as detergent builder
CN103789245A (zh) * 2014-03-11 2014-05-14 河北圣雪大成制药有限责任公司 一种土霉素高产菌株及其高通量筛选方法
EP3521434A1 (en) 2014-03-12 2019-08-07 Novozymes A/S Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same
WO2015150457A1 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Novozymes A/S Polypeptides having alpha amylase activity
CN112899086A (zh) 2014-04-11 2021-06-04 诺维信公司 洗涤剂组合物
US10030215B2 (en) 2014-04-15 2018-07-24 Novozymes A/S Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same
WO2015181119A2 (en) 2014-05-27 2015-12-03 Novozymes A/S Lipase variants and polynucleotides encoding same
CN106459937B (zh) 2014-05-27 2024-09-10 诺维信公司 用于产生脂肪酶的方法
CN106414729A (zh) 2014-06-12 2017-02-15 诺维信公司 α‑淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸
EP3919599A1 (en) 2014-06-19 2021-12-08 Nutrition & Biosciences USA 4, Inc. Compositions containing one or more poly alpha-1,3-glucan ether compounds
US9714403B2 (en) 2014-06-19 2017-07-25 E I Du Pont De Nemours And Company Compositions containing one or more poly alpha-1,3-glucan ether compounds
US20170121646A1 (en) 2014-07-03 2017-05-04 Novozymes A/S Improved Stabilization of Non-Protease Enzyme
EP3327122B1 (en) 2014-07-04 2021-02-17 Novozymes A/S Subtilase variants and polynucleotides encoding same
US10626388B2 (en) 2014-07-04 2020-04-21 Novozymes A/S Subtilase variants and polynucleotides encoding same
CN107207999B (zh) 2014-09-18 2019-09-27 荷兰联合利华有限公司 增白组合物
WO2016079110A2 (en) 2014-11-19 2016-05-26 Novozymes A/S Use of enzyme for cleaning
CN107075489A (zh) 2014-11-20 2017-08-18 诺维信公司 脂环酸芽孢杆菌变体以及编码它们的多核苷酸
CA2963331A1 (en) 2014-12-04 2016-06-09 Novozymes A/S Subtilase variants and polynucleotides encoding same
CN107002054A (zh) 2014-12-05 2017-08-01 诺维信公司 脂肪酶变体以及编码它们的多核苷酸
ES2763235T3 (es) 2014-12-15 2020-05-27 Henkel Ag & Co Kgaa Composición detergente que comprende variantes de subtilasa
WO2016096996A1 (en) 2014-12-16 2016-06-23 Novozymes A/S Polypeptides having n-acetyl glucosamine oxidase activity
EP3741848A3 (en) 2014-12-19 2021-02-17 Novozymes A/S Protease variants and polynucleotides encoding same
WO2016097350A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Novozymes A/S Protease variants and polynucleotides encoding same
AU2015369965B2 (en) 2014-12-23 2020-01-30 Nutrition & Biosciences USA 4, Inc. Enzymatically produced cellulose
CN107406805A (zh) 2015-01-08 2017-11-28 斯泰潘公司 冷水衣物洗涤剂
WO2016110378A1 (en) 2015-01-09 2016-07-14 Unilever Plc Laundry treatment composition comprising a dye
CN107207998B (zh) 2015-02-13 2020-04-10 荷兰联合利华有限公司 液体洗衣组合物
WO2016133734A1 (en) 2015-02-18 2016-08-25 E. I. Du Pont De Nemours And Company Soy polysaccharide ethers
WO2016160407A1 (en) 2015-03-31 2016-10-06 Stepan Company Detergents based on alpha-sulfonated fatty ester surfactants
WO2016155993A1 (en) 2015-04-02 2016-10-06 Unilever Plc Composition
EP3280818A2 (en) 2015-04-07 2018-02-14 Novozymes A/S Methods for selecting enzymes having lipase activity
WO2016162558A1 (en) 2015-04-10 2016-10-13 Novozymes A/S Detergent composition
WO2016162556A1 (en) 2015-04-10 2016-10-13 Novozymes A/S Laundry method, use of dnase and detergent composition
EP3298121B1 (en) 2015-05-19 2019-03-20 Novozymes A/S Odor reduction
EP3287513A1 (en) 2015-06-04 2018-02-28 The Procter & Gamble Company Hand dishwashing liquid detergent composition
ES2712459T3 (es) 2015-06-04 2019-05-13 Procter & Gamble Composición detergente líquida para lavado de vajillas a mano
WO2016202739A1 (en) 2015-06-16 2016-12-22 Novozymes A/S Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same
WO2016202785A1 (en) 2015-06-17 2016-12-22 Novozymes A/S Container
EP3106508B1 (en) 2015-06-18 2019-11-20 Henkel AG & Co. KGaA Detergent composition comprising subtilase variants
EP3310912B1 (en) 2015-06-18 2021-01-27 Novozymes A/S Subtilase variants and polynucleotides encoding same
EP3317388B1 (en) 2015-06-30 2019-11-13 Novozymes A/S Laundry detergent composition, method for washing and use of composition
CN107922930A (zh) 2015-07-01 2018-04-17 诺维信公司 减少气味的方法
EP3950939A3 (en) 2015-07-06 2022-06-08 Novozymes A/S Lipase variants and polynucleotides encoding same
CN108026487B (zh) 2015-09-17 2021-04-30 汉高股份有限及两合公司 包含具有黄原胶降解活性的多肽的洗涤剂组合物
WO2017046260A1 (en) 2015-09-17 2017-03-23 Novozymes A/S Polypeptides having xanthan degrading activity and polynucleotides encoding same
CN116064474A (zh) 2015-10-07 2023-05-05 诺维信公司 多肽
CN108138203B (zh) 2015-10-09 2022-07-26 诺维信公司 酶或非酶生物柴油精制方法
BR112018007474A2 (pt) 2015-10-14 2018-10-30 Novozymes A/S ?limpeza de membranas de filtração de água?
EP3362556B1 (en) 2015-10-14 2024-07-10 Novozymes A/S Polypeptide variants
EP3362558A1 (en) 2015-10-14 2018-08-22 Novozymes A/S Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
MX2018004683A (es) 2015-10-28 2018-07-06 Novozymes As Composicion detergente que comprende variantes de amilasa y proteasa.
JP2019504932A (ja) 2015-11-13 2019-02-21 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニーＥ．Ｉ．Ｄｕ Ｐｏｎｔ Ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ 洗濯ケアおよび織物ケアにおいて使用するためのグルカン繊維組成物
JP6997706B2 (ja) 2015-11-13 2022-01-18 ニュートリション・アンド・バイオサイエンシーズ・ユーエスエー・フォー，インコーポレイテッド 洗濯ケアおよび織物ケアにおいて使用するためのグルカン繊維組成物
WO2017083228A1 (en) 2015-11-13 2017-05-18 E. I. Du Pont De Nemours And Company Glucan fiber compositions for use in laundry care and fabric care
WO2017089366A1 (en) 2015-11-24 2017-06-01 Novozymes A/S Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
US10870838B2 (en) 2015-12-01 2020-12-22 Novozymes A/S Methods for producing lipases
WO2017097866A1 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucanase activity, polynucleotides encoding same and uses thereof in cleaning and detergent compositions
EP4218992A3 (en) 2015-12-09 2023-08-09 Basf Se Method of purifying a protein from fermentation solids under desorbing conditions
DK3387124T3 (da) 2015-12-09 2021-08-23 William Cuevas Kombinatoriske alfa-amylasevarianter
EP3397061A1 (en) 2015-12-28 2018-11-07 Novozymes BioAG A/S Heat priming of bacterial spores
CN108603185B (zh) 2015-12-30 2022-05-17 诺维信公司 酶变体以及编码它们的多核苷酸
EP3190167B1 (en) 2016-01-07 2018-06-06 Unilever PLC Bitter pill
BR112018014327A2 (pt) 2016-01-15 2018-12-11 Unilever Nv composição de tratamento para lavagem e método doméstico de tratamento de um tecido
CA3007148A1 (en) 2016-01-29 2017-08-03 Novozymes A/S Beta-glucanase variants and polynucleotides encoding same
WO2017133879A1 (en) 2016-02-04 2017-08-10 Unilever Plc Detergent liquid
EP3417040B1 (en) 2016-02-17 2019-09-04 Unilever PLC Whitening composition
WO2017140391A1 (en) 2016-02-17 2017-08-24 Unilever Plc Whitening composition
EP3219722B1 (en) * 2016-03-14 2019-03-27 Hung Guang Biotech Co. Ltd. Modified colostrum protein and application thereof
WO2017162378A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Unilever Plc Laundry detergent composition
US20190048291A1 (en) 2016-03-23 2019-02-14 Novozymes A/S Use of Polypeptide Having DNase Activity for Treating Fabrics
WO2017173190A2 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Danisco Us Inc. Alpha-amylases, compositions & methods
WO2017173324A2 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Danisco Us Inc. Alpha-amylases, compositions & methods
CN109312270B (zh) 2016-04-08 2022-01-28 诺维信公司 洗涤剂组合物及其用途
WO2017174251A1 (en) 2016-04-08 2017-10-12 Unilever Plc Laundry detergent composition
WO2017186943A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Novozymes A/S Detergent compositions and uses thereof
EP3452497B1 (en) 2016-05-03 2021-02-17 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding the same
EP3455352A1 (en) 2016-05-09 2019-03-20 Novozymes A/S Variant polypeptides with improved performance and use of the same
WO2017210188A1 (en) 2016-05-31 2017-12-07 Novozymes A/S Stabilized liquid peroxide compositions
WO2017207762A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Novozymes A/S Subtilase variants and polynucleotides encoding same
WO2017211697A1 (en) 2016-06-09 2017-12-14 Unilever Plc Laundry products
US11001787B2 (en) 2016-06-23 2021-05-11 Novozymes A/S Use of enzymes, composition and method for removing soil
CN117721095A (zh) 2016-06-30 2024-03-19 诺维信公司 脂肪酶变体及包含表面活性剂和脂肪酶变体的组合物
WO2018002261A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Novozymes A/S Detergent compositions
WO2018007573A1 (en) 2016-07-08 2018-01-11 Novozymes A/S Detergent compositions with galactanase
CN109642222A (zh) 2016-07-13 2019-04-16 诺维信公司 食物芽孢杆菌dna酶变体
WO2018011242A1 (en) 2016-07-14 2018-01-18 Basf Se Fermentation medium comprising chelating agent
US11326152B2 (en) 2016-07-18 2022-05-10 Novozymes A/S Lipase variants, polynucleotides encoding same and the use thereof
EP3284805B1 (en) 2016-08-17 2020-02-19 The Procter & Gamble Company Cleaning composition comprising enzymes
KR102507692B1 (ko) 2016-08-24 2023-03-09 헨켈 아게 운트 코. 카게아아 Gh9 엔도글루카나제 변이체 i을 포함하는 세제 조성물
CN109844110B (zh) 2016-08-24 2023-06-06 诺维信公司 黄原胶裂解酶变体以及编码它们的多核苷酸
WO2018037062A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 Novozymes A/S Gh9 endoglucanase variants and polynucleotides encoding same
AU2017317563B8 (en) 2016-08-24 2023-03-23 Henkel Ag & Co. Kgaa Detergent compositions comprising xanthan lyase variants I
CN109996859B (zh) 2016-09-29 2021-11-30 诺维信公司 含孢子的颗粒
WO2018060216A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 Novozymes A/S Use of enzyme for washing, method for washing and warewashing composition
BR112019007851B1 (pt) 2016-10-18 2022-10-18 Unilever Ip Holdings B.V. Composição detergente para lavagem de roupas e método doméstico de tratamento de um tecido
WO2018077938A1 (en) 2016-10-25 2018-05-03 Novozymes A/S Detergent compositions
US11753605B2 (en) 2016-11-01 2023-09-12 Novozymes A/S Multi-core granules
WO2018099762A1 (en) 2016-12-01 2018-06-07 Basf Se Stabilization of enzymes in compositions
WO2018108865A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Novozymes A/S Use of polypeptides
EP3555255B1 (en) 2016-12-15 2020-06-24 Unilever PLC Laundry detergent composition
JP2020515269A (ja) 2017-03-31 2020-05-28 ダニスコ・ユーエス・インク α−アミラーゼ組み合わせ変異体
EP3601550A1 (en) 2017-03-31 2020-02-05 Novozymes A/S Polypeptides having dnase activity
US11053483B2 (en) 2017-03-31 2021-07-06 Novozymes A/S Polypeptides having DNase activity
US11149233B2 (en) 2017-03-31 2021-10-19 Novozymes A/S Polypeptides having RNase activity
CN110651029B (zh) 2017-04-04 2022-02-15 诺维信公司 糖基水解酶
EP3607040A1 (en) 2017-04-04 2020-02-12 Novozymes A/S Polypeptide compositions and uses thereof
WO2018185150A1 (en) 2017-04-04 2018-10-11 Novozymes A/S Polypeptides
EP3385362A1 (en) 2017-04-05 2018-10-10 Henkel AG & Co. KGaA Detergent compositions comprising fungal mannanases
DK3385361T3 (da) 2017-04-05 2019-06-03 Ab Enzymes Gmbh Detergentsammensætninger omfattende bakterielle mannanaser
WO2018185267A1 (en) 2017-04-06 2018-10-11 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
EP3967756A1 (en) 2017-04-06 2022-03-16 Novozymes A/S Detergent compositions and uses thereof
EP3607038A1 (en) 2017-04-06 2020-02-12 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
WO2018185269A1 (en) 2017-04-06 2018-10-11 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
EP3607037A1 (en) 2017-04-06 2020-02-12 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
WO2018185285A1 (en) 2017-04-06 2018-10-11 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
WO2018184818A1 (en) 2017-04-06 2018-10-11 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
WO2018185280A1 (en) 2017-04-06 2018-10-11 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
WO2018202846A1 (en) 2017-05-05 2018-11-08 Novozymes A/S Compositions comprising lipase and sulfite
CN110662837B (zh) 2017-05-08 2024-04-12 诺维信公司 甘露聚糖酶变体和对其编码的多核苷酸
EP3401385A1 (en) 2017-05-08 2018-11-14 Henkel AG & Co. KGaA Detergent composition comprising polypeptide comprising carbohydrate-binding domain
WO2018206302A1 (en) 2017-05-08 2018-11-15 Novozymes A/S Mannanase variants and polynucleotides encoding same
WO2018206535A1 (en) 2017-05-08 2018-11-15 Novozymes A/S Carbohydrate-binding domain and polynucleotides encoding the same
WO2018224544A1 (en) 2017-06-08 2018-12-13 Novozymes A/S Compositions comprising polypeptides having cellulase activity and amylase activity, and uses thereof in cleaning and detergent compositions
EP3642319B1 (en) 2017-06-20 2020-12-30 Unilever N.V. Particulate detergent composition comprising perfume
WO2018234003A1 (en) 2017-06-21 2018-12-27 Unilever Plc PACKAGING AND DISTRIBUTION OF DETERGENT COMPOSITIONS
EP3645692A1 (en) 2017-06-30 2020-05-06 Novozymes A/S Enzyme slurry composition
CN110869480B (zh) 2017-07-07 2021-08-13 联合利华知识产权控股有限公司 增白组合物
CN110892053A (zh) 2017-07-07 2020-03-17 荷兰联合利华有限公司 洗衣清洁组合物
EP3665267A1 (en) 2017-08-07 2020-06-17 Novozymes A/S Use of fca control based on ph
US11441139B2 (en) 2017-08-18 2022-09-13 Danisco Us Inc (157111) α-Amylase variants
WO2019038187A1 (en) 2017-08-24 2019-02-28 Unilever Plc IMPROVEMENTS RELATING TO THE CLEANING OF FABRICS
EP3673060A1 (en) 2017-08-24 2020-07-01 Henkel AG & Co. KGaA Detergent composition comprising xanthan lyase variants ii
WO2019038059A1 (en) 2017-08-24 2019-02-28 Henkel Ag & Co. Kgaa DETERGENT COMPOSITIONS COMPRISING GH9 ENDOGLUCANASE VARIANTS II
CA3071078A1 (en) 2017-08-24 2019-02-28 Novozymes A/S Xanthan lyase variants and polynucleotides encoding same
CA3070749A1 (en) 2017-08-24 2019-02-28 Novozymes A/S Gh9 endoglucanase variants and polynucleotides encoding same
WO2019038186A1 (en) 2017-08-24 2019-02-28 Unilever Plc IMPROVEMENTS RELATING TO THE CLEANING OF FABRICS
US20200277553A1 (en) 2017-09-20 2020-09-03 Novozymes A/S Use of Enzymes for Improving Water Absorption And/Or Whiteness
US11414814B2 (en) 2017-09-22 2022-08-16 Novozymes A/S Polypeptides
US11332725B2 (en) 2017-09-27 2022-05-17 Novozymes A/S Lipase variants and microcapsule compositions comprising such lipase variants
MX2020003779A (es) 2017-09-27 2020-08-03 Procter & Gamble Composiciones detergentes que comprenden lipasas.
CN111417725A (zh) 2017-10-02 2020-07-14 诺维信公司 具有甘露聚糖酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸
EP3692148A1 (en) 2017-10-02 2020-08-12 Novozymes A/S Polypeptides having mannanase activity and polynucleotides encoding same
WO2019076834A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Novozymes A/S PELLETS WITH LOW DUST CONTENT
US20230193162A1 (en) 2017-10-16 2023-06-22 Novozymes A/S Low dusting granules
WO2019076800A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Novozymes A/S CLEANING COMPOSITIONS AND USES THEREOF
EP3701001A1 (en) 2017-10-24 2020-09-02 Novozymes A/S Compositions comprising polypeptides having mannanase activity
CN111542604A (zh) 2017-10-27 2020-08-14 诺维信公司 Dna酶变体
HUE057471T2 (hu) 2017-10-27 2022-05-28 Procter & Gamble Polipeptid-variánsokat tartalmazó mosószerkészítmények
DE102017125558A1 (de) 2017-11-01 2019-05-02 Henkel Ag & Co. Kgaa Reinigungszusammensetzungen, die dispersine i enthalten
US11505767B2 (en) 2017-11-01 2022-11-22 Novozymes A/S Methods for cleansing medical devices
US20200291330A1 (en) 2017-11-01 2020-09-17 Novozymes A/S Polypeptides and Compositions Comprising Such Polypeptides
BR112020008737A2 (pt) 2017-11-01 2020-10-13 Novozymes A/S polipeptídeos e composições que compreendam tais polipeptídeos
DE102017125560A1 (de) 2017-11-01 2019-05-02 Henkel Ag & Co. Kgaa Reinigungszusammensetzungen, die dispersine iii enthalten
DE102017125559A1 (de) 2017-11-01 2019-05-02 Henkel Ag & Co. Kgaa Reinigungszusammensetzungen, die dispersine ii enthalten
EP3707255A1 (en) 2017-11-09 2020-09-16 Basf Se Coatings of enzyme particles comprising organic white pigments
WO2019101951A1 (en) 2017-11-24 2019-05-31 Novozymes A/S Small enzyme particles for interesterification
WO2019105780A1 (en) 2017-11-29 2019-06-06 Basf Se Compositions, their manufacture and use
EP3717616B1 (en) 2017-11-30 2021-10-13 Unilever IP Holdings B.V. Detergent composition comprising protease
WO2019110462A1 (en) 2017-12-04 2019-06-13 Novozymes A/S Lipase variants and polynucleotides encoding same
WO2019121057A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Basf Se Laundry formulation for removing fatty compounds having a melting temperature>30°c deposited on textiles
CN111757930A (zh) 2018-02-08 2020-10-09 诺维信公司 脂肪酶变体及其组合物
US20210123033A1 (en) 2018-02-08 2021-04-29 Novozymes A/S Lipases, Lipase Variants and Compositions Thereof
WO2019162000A1 (en) 2018-02-23 2019-08-29 Henkel Ag & Co. Kgaa Detergent composition comprising xanthan lyase and endoglucanase variants
US20210002588A1 (en) 2018-03-13 2021-01-07 Novozymes A/S Microencapsulation Using Amino Sugar Oligomers
EP3768835A1 (en) 2018-03-23 2021-01-27 Novozymes A/S Subtilase variants and compositions comprising same
US11535837B2 (en) 2018-03-29 2022-12-27 Novozymes A/S Mannanase variants and polynucleotides encoding same
US20210009927A1 (en) 2018-04-17 2021-01-14 Novozymes A/S Polypeptides Comprising Carbohydrate Binding Activity in Detergent Compositions And Their use in Reducing Wrinkles in Textile or Fabrics
CN111989389A (zh) 2018-04-19 2020-11-24 巴斯夫欧洲公司 组合物以及可用于该组合物的聚合物
EP3781679A1 (en) 2018-04-19 2021-02-24 Novozymes A/S Stabilized cellulase variants
WO2019201785A1 (en) 2018-04-19 2019-10-24 Novozymes A/S Stabilized cellulase variants
BR112020023123A2 (pt) 2018-05-17 2021-02-02 Unilever N.V. composição de limpeza e método doméstico para tratar um tecido
CN112119147B (zh) 2018-05-17 2023-09-29 联合利华知识产权控股有限公司 清洁组合物
WO2019238761A1 (en) 2018-06-15 2019-12-19 Basf Se Water soluble multilayer films containing wash active chemicals and enzymes
EP3814472A1 (en) 2018-06-28 2021-05-05 Novozymes A/S Detergent compositions and uses thereof
EP3814489A1 (en) 2018-06-29 2021-05-05 Novozymes A/S Subtilase variants and compositions comprising same
US20210071116A1 (en) 2018-06-29 2021-03-11 Novozymes A/S Detergent Compositions and Uses Thereof
CN112352039B (zh) 2018-07-02 2022-11-15 诺维信公司 清洁组合物及其用途
US20210301223A1 (en) 2018-07-03 2021-09-30 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
WO2020008024A1 (en) 2018-07-06 2020-01-09 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
WO2020008043A1 (en) 2018-07-06 2020-01-09 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
EP3824057B1 (en) 2018-07-17 2023-10-18 Unilever Global IP Limited Use of a rhamnolipid in a surfactant system
EP3775137A1 (en) 2018-07-27 2021-02-17 Unilever N.V. Laundry detergent
CA3108284A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Danisco Us Inc Variant alpha-amylases having amino acid substitutions that lower the pka of the general acid
WO2020030623A1 (en) 2018-08-10 2020-02-13 Basf Se Packaging unit comprising a detergent composition containing an enzyme and at least one chelating agent
US20210340466A1 (en) 2018-10-01 2021-11-04 Novozymes A/S Detergent compositions and uses thereof
WO2020070014A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Novozymes A/S Cleaning composition comprising anionic surfactant and a polypeptide having rnase activity
WO2020070209A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Novozymes A/S Cleaning composition
EP3861094A1 (en) 2018-10-02 2021-08-11 Novozymes A/S Cleaning composition
WO2020070249A1 (en) 2018-10-03 2020-04-09 Novozymes A/S Cleaning compositions
CN113056476A (zh) 2018-10-03 2021-06-29 诺维信公司 具有α-甘露聚糖降解活性的多肽以及编码它们的多核苷酸
BR112021005954A2 (pt) 2018-10-05 2021-06-29 Basf Se preparação enzimática, processo para produzir uma preparação enzimática estável, métodos para reduzir perda de atividade lipolítica de pelo menos uma lipase, para preparar uma formulação de detergente, para remover manchas e para aumentar a estabilidade de armazenagem de uma formulação de detergente líquido, usos de um composto e da preparação enzimática, e, formulação de detergente.
EP3677676A1 (en) 2019-01-03 2020-07-08 Basf Se Compounds stabilizing amylases in liquids
CN112840021A (zh) 2018-10-05 2021-05-25 巴斯夫欧洲公司 在液体中稳定水解酶的化合物
MX2021003931A (es) 2018-10-05 2021-06-04 Basf Se Compuestos estabilizadores de amilasas en liquidos.
US20220033739A1 (en) 2018-10-11 2022-02-03 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
CN113166745A (zh) 2018-10-12 2021-07-23 丹尼斯科美国公司 在螯合剂存在下具有可增强稳定性的突变的α-淀粉酶
ES2981999T3 (es) 2018-10-31 2024-10-14 Henkel Ag & Co Kgaa Composiciones limpiadoras que contienen dispersinas V
EP3647397A1 (en) 2018-10-31 2020-05-06 Henkel AG & Co. KGaA Cleaning compositions containing dispersins iv
WO2020104231A1 (en) 2018-11-19 2020-05-28 Basf Se Powders and granules containing a chelating agent and an enzyme
WO2020104157A1 (en) 2018-11-20 2020-05-28 Unilever Plc Detergent composition
CN113056549B (zh) 2018-11-20 2023-03-10 联合利华知识产权控股有限公司 洗涤剂组合物
EP3884023B1 (en) 2018-11-20 2024-07-17 Unilever Global Ip Limited Detergent composition
CN113056550B (zh) 2018-11-20 2022-10-28 联合利华知识产权控股有限公司 洗涤剂组合物
EP3891277A1 (en) 2018-12-03 2021-10-13 Novozymes A/S Powder detergent compositions
WO2020114965A1 (en) 2018-12-03 2020-06-11 Novozymes A/S LOW pH POWDER DETERGENT COMPOSITION
EP3898962A2 (en) 2018-12-21 2021-10-27 Novozymes A/S Polypeptides having peptidoglycan degrading activity and polynucleotides encoding same
WO2020127775A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Novozymes A/S Detergent pouch comprising metalloproteases
BR112021014336A2 (pt) 2019-01-22 2021-09-21 Unilever Ip Holdings B.V. Composição detergente de lavanderia, método doméstico para tratar um tecido e corante tonalizante não leuco azul ou violeta
BR112021014332A2 (pt) 2019-01-22 2021-09-28 Unilever Ip Holdings B.V. Composição detergente de lavanderia, método doméstico para tratar um tecido e corante tonalizante não leuco azul ou violeta
EP3702452A1 (en) 2019-03-01 2020-09-02 Novozymes A/S Detergent compositions comprising two proteases
US20220177808A1 (en) 2019-03-08 2022-06-09 Basf Se Cationic surfactant and its use in laundry detergent compositions
WO2020188095A1 (en) 2019-03-21 2020-09-24 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
CN113785039B (zh) 2019-04-03 2024-06-18 诺维信公司 具有β-葡聚糖酶活性的多肽、编码其的多核苷酸及其在清洁和洗涤剂组合物中的用途
EP3953462A1 (en) 2019-04-10 2022-02-16 Novozymes A/S Polypeptide variants
US20220186151A1 (en) 2019-04-12 2022-06-16 Novozymes A/S Stabilized glycoside hydrolase variants
WO2020229480A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 Basf Se Compounds stabilizing hydrolases in liquids
CN113825829A (zh) 2019-05-16 2021-12-21 联合利华知识产权控股有限公司 洗衣组合物
EP3744838A1 (en) 2019-05-29 2020-12-02 Novozymes A/S Lipolytic polymer particles for esterification and interesterification
WO2020260006A1 (en) 2019-06-28 2020-12-30 Unilever Plc Detergent compositions
US20220372400A1 (en) 2019-06-28 2022-11-24 Conopco, Inc., D/B/A Unilever Detergent composition
BR112021025261A2 (pt) 2019-06-28 2022-04-26 Unilever Ip Holdings B V Composição detergente e método doméstico para tratar um tecido
US20220364020A1 (en) 2019-06-28 2022-11-17 Conopco, Inc., D/B/A Unilever Detergent composition
EP3990604B1 (en) 2019-06-28 2022-12-14 Unilever Global IP Limited Detergent composition
WO2021001244A1 (en) 2019-07-01 2021-01-07 Basf Se Peptide acetals for stabilising enzymes
EP3994255A1 (en) 2019-07-02 2022-05-11 Novozymes A/S Lipase variants and compositions thereof
US20220403298A1 (en) 2019-07-12 2022-12-22 Novozymes A/S Enzymatic emulsions for detergents
US20240294852A1 (en) 2019-08-27 2024-09-05 Novozymes A/S Composition comprising a lipase
WO2021037895A1 (en) 2019-08-27 2021-03-04 Novozymes A/S Detergent composition
BR112022003050A2 (pt) 2019-09-02 2022-05-17 Unilever Ip Holdings B V Composição detergente de lavagem de roupas aquosa e método doméstico para tratar um tecido
CN114616312A (zh) 2019-09-19 2022-06-10 诺维信公司 洗涤剂组合物
EP4038170A1 (en) 2019-10-03 2022-08-10 Novozymes A/S Polypeptides comprising at least two carbohydrate binding domains
AR120142A1 (es) 2019-10-07 2022-02-02 Unilever Nv Composición detergente
EP4045625A1 (en) 2019-10-18 2022-08-24 Basf Se Storage-stable hydrolase containing liquids
BR112022007697A2 (pt) 2019-10-24 2022-07-12 Danisco Us Inc Alfa-amilase variante que forma maltopentaose/maltohexaose
WO2021105336A1 (en) 2019-11-29 2021-06-03 Basf Se Compositions comprising polymer and enzyme
WO2021115912A1 (en) 2019-12-09 2021-06-17 Basf Se Formulations comprising a hydrophobically modified polyethyleneimine and one or more enzymes
US20230048546A1 (en) 2019-12-20 2023-02-16 Henkel Ag & Co. Kgaa Cleaning compositions comprising dispersins vi
AU2020405786A1 (en) 2019-12-20 2022-08-11 Henkel Ag & Co. Kgaa Cleaning compositions comprising dispersins IX
WO2021121394A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Novozymes A/S Stabilized liquid boron-free enzyme compositions
US20220411773A1 (en) 2019-12-20 2022-12-29 Novozymes A/S Polypeptides having proteolytic activity and use thereof
CN114846128A (zh) 2019-12-20 2022-08-02 汉高股份有限及两合公司 包含分散蛋白viii的清洁组合物
KR20220121235A (ko) 2019-12-20 2022-08-31 헨켈 아게 운트 코. 카게아아 디스페르신 및 카르보히드라제를 포함하는 세정 조성물
EP4097226A1 (en) 2020-01-31 2022-12-07 Novozymes A/S Mannanase variants and polynucleotides encoding same
JP2023511739A (ja) 2020-01-31 2023-03-22 ノボザイムス アクティーゼルスカブ マンナナーゼバリアント及びそれをコードするポリヌクレオチド
EP3892708A1 (en) 2020-04-06 2021-10-13 Henkel AG & Co. KGaA Cleaning compositions comprising dispersin variants
WO2021204838A1 (en) 2020-04-08 2021-10-14 Novozymes A/S Carbohydrate binding module variants
US20230167384A1 (en) 2020-04-21 2023-06-01 Novozymes A/S Cleaning compositions comprising polypeptides having fructan degrading activity
EP3907271A1 (en) 2020-05-07 2021-11-10 Novozymes A/S Cleaning composition, use and method of cleaning
US20230212548A1 (en) 2020-05-26 2023-07-06 Novozymes A/S Subtilase variants and compositions comprising same
CN115698246A (zh) 2020-06-08 2023-02-03 联合利华知识产权控股有限公司 提高蛋白酶活性的方法
CN115516072A (zh) 2020-06-18 2022-12-23 巴斯夫欧洲公司 组合物及其用途
WO2021259099A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Novozymes A/S Use of cellulases for removing dust mite from textile
EP3936593A1 (en) 2020-07-08 2022-01-12 Henkel AG & Co. KGaA Cleaning compositions and uses thereof
BR112023000148A2 (pt) 2020-07-09 2023-01-31 Basf Se Composição, uso de uma composição, polímero, processo para fazer polímeros, e, método para melhorar o desempenho de limpeza de uma composição detergente líquida
WO2022008732A1 (en) 2020-07-10 2022-01-13 Basf Se Enhancing the activity of antimicrobial preservatives
CN116057158A (zh) 2020-07-27 2023-05-02 联合利华知识产权控股有限公司 酶和表面活性剂用于抑制微生物的用途
JP2023538740A (ja) 2020-08-25 2023-09-11 ノボザイムス アクティーゼルスカブ ファミリー４４キシログルカナーゼの変異体
US20230323330A1 (en) 2020-08-28 2023-10-12 Novozymes A/S Polyester degrading protease variants
BR112023003008A2 (pt) 2020-08-28 2023-04-04 Unilever Ip Holdings B V Tensoativo de sulfonato de alcano secundário (sas), composição detergente e método de tratamento de um artigo têxtil
WO2022043042A1 (en) 2020-08-28 2022-03-03 Unilever Ip Holdings B.V. Detergent composition
BR112023002979A2 (pt) 2020-08-28 2023-04-04 Unilever Ip Holdings B V Composição detergente e método de tratamento de um artigo têxtil
BR112023001773A2 (pt) 2020-08-28 2023-03-28 Unilever Ip Holdings B V Composição detergente e método
BR112023002833A2 (pt) 2020-08-28 2023-03-14 Unilever Ip Holdings B V Composição detergente e método de tratamento de um artigo têxtil
CN116096731A (zh) 2020-09-22 2023-05-09 巴斯夫欧洲公司 蛋白酶和蛋白酶抑制剂与第二酶的改进的组合
EP4225905A2 (en) 2020-10-07 2023-08-16 Novozymes A/S Alpha-amylase variants
WO2022083949A1 (en) 2020-10-20 2022-04-28 Basf Se Compositions and their use
WO2022084303A2 (en) 2020-10-20 2022-04-28 Novozymes A/S Use of polypeptides having dnase activity
WO2022090320A1 (en) 2020-10-28 2022-05-05 Novozymes A/S Use of lipoxygenase
BR112023008326A2 (pt) 2020-10-29 2023-12-12 Novozymes As Variantes de lipase e composições compreendendo tais variantes de lipase
WO2022103725A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Novozymes A/S Detergent composition comprising a lipase
WO2022106404A1 (en) 2020-11-18 2022-05-27 Novozymes A/S Combination of proteases
WO2022106400A1 (en) 2020-11-18 2022-05-27 Novozymes A/S Combination of immunochemically different proteases
US20240002751A1 (en) 2020-12-17 2024-01-04 Conopco, Inc., D/B/A Unilever Cleaning composition
WO2022128786A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Unilever Ip Holdings B.V. Use and cleaning composition
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections
EP4032966A1 (en) 2021-01-22 2022-07-27 Novozymes A/S Liquid enzyme composition with sulfite scavenger
EP4284905A1 (en) 2021-01-28 2023-12-06 Novozymes A/S Lipase with low malodor generation
EP4039806A1 (en) 2021-02-04 2022-08-10 Henkel AG & Co. KGaA Detergent composition comprising xanthan lyase and endoglucanase variants with im-proved stability
CN116829709A (zh) 2021-02-12 2023-09-29 诺维信公司 α-淀粉酶变体
CN117015592A (zh) 2021-02-12 2023-11-07 诺维信公司 稳定的生物洗涤剂
EP4047088A1 (en) 2021-02-22 2022-08-24 Basf Se Amylase variants
KR20230147071A (ko) 2021-02-22 2023-10-20 헨켈 아게 운트 코. 카게아아 아밀라제 변이체
EP4305146A1 (en) 2021-03-12 2024-01-17 Novozymes A/S Polypeptide variants
US20240060061A1 (en) 2021-03-15 2024-02-22 Novozymes A/S Dnase variants
EP4060036A1 (en) 2021-03-15 2022-09-21 Novozymes A/S Polypeptide variants
US20240218300A1 (en) 2021-03-26 2024-07-04 Novozymes A/S Detergent composition with reduced polymer content
BR112023022967A2 (pt) 2021-05-04 2024-01-23 Novozymes As Tratamento enzimático de matéria-prima para produção de óleo vegetal hidrotratado (hvo)
WO2022268885A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Novozymes A/S Alpha-amylase polypeptides
EP4405450A1 (en) 2021-09-20 2024-07-31 Unilever IP Holdings B.V. Detergent composition
CN118202030A (zh) 2021-10-13 2024-06-14 巴斯夫欧洲公司 包含聚合物的组合物、聚合物及其用途
WO2023088777A1 (en) 2021-11-22 2023-05-25 Basf Se Compositions comprising polymers, polymers, and their use
CN118647716A (zh) 2021-12-16 2024-09-13 丹尼斯科美国公司 成麦芽五糖/麦芽六糖变体α-淀粉酶
CN118871559A (zh) 2021-12-21 2024-10-29 诺维信公司 包含脂肪酶和加强剂的组合物
WO2023117992A1 (en) 2021-12-21 2023-06-29 Basf Se Environmental attributes for aqueous polymeric composition
EP4206309A1 (en) 2021-12-30 2023-07-05 Novozymes A/S Protein particles with improved whiteness
EP4234664A1 (en) 2022-02-24 2023-08-30 Evonik Operations GmbH Composition comprising glucolipids and enzymes
WO2023165507A1 (en) 2022-03-02 2023-09-07 Novozymes A/S Use of xyloglucanase for improvement of sustainability of detergents
WO2023165950A1 (en) 2022-03-04 2023-09-07 Novozymes A/S Dnase variants and compositions
AU2023250091A1 (en) 2022-04-08 2024-10-03 Novozymes A/S Hexosaminidase variants and compositions
AU2023256853A1 (en) 2022-04-20 2024-08-22 Novozymes A/S Process for producing free fatty acids
DE102022205593A1 (de) 2022-06-01 2023-12-07 Henkel Ag & Co. Kgaa Wasch- und reinigungsmittel mit verbesserter enzymstabilität
DE102022205588A1 (de) 2022-06-01 2023-12-07 Henkel Ag & Co. Kgaa Wasch- und reinigungsmittel mit verbesserter enzymstabilität
DE102022205591A1 (de) 2022-06-01 2023-12-07 Henkel Ag & Co. Kgaa Wasch- und reinigungsmittel mit verbesserter enzymstabilität
WO2023247348A1 (en) 2022-06-21 2023-12-28 Novozymes A/S Mannanase variants and polynucleotides encoding same
WO2023247664A2 (en) 2022-06-24 2023-12-28 Novozymes A/S Lipase variants and compositions comprising such lipase variants
WO2024033133A2 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Basf Se Enzyme compositions comprising an amylase
WO2024033136A1 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Basf Se Amylase variants
WO2024033134A1 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Basf Se Enzyme compositions comprising protease, mannanase, and/or cellulase
WO2024033135A2 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Basf Se Amylase variants
EP4324900A1 (en) 2022-08-17 2024-02-21 Henkel AG & Co. KGaA Detergent composition comprising enzymes
WO2024079301A1 (en) 2022-10-14 2024-04-18 Novozymes A/S Process for selective hydrolysis of diglycerides in an oil/fat with aid of candida antarctica lipase b
WO2024083589A1 (en) 2022-10-18 2024-04-25 Basf Se Detergent compositions, polymers and methods of manufacturing the same
WO2024094733A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Basf Se Polypeptides having protease activity for use in detergent compositions
WO2024094732A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Basf Se Polypeptides having protease activity for use in detergent compositions
WO2024094735A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Basf Se Polypeptides having protease activity for use in detergent compositions
DE102022131732A1 (de) 2022-11-30 2024-06-06 Henkel Ag & Co. Kgaa Verbesserte Waschleistung durch den Einsatz einer Protease fusioniert mit speziellem Adhäsionsvermittlerpeptid
WO2024121058A1 (en) 2022-12-05 2024-06-13 Novozymes A/S A composition comprising a lipase and a peptide
WO2024121070A1 (en) 2022-12-05 2024-06-13 Novozymes A/S Protease variants and polynucleotides encoding same
WO2024126483A1 (en) 2022-12-14 2024-06-20 Novozymes A/S Improved lipase (gcl1) variants
EP4389864A1 (en) 2022-12-20 2024-06-26 Basf Se Cutinases
WO2024131880A2 (en) 2022-12-23 2024-06-27 Novozymes A/S Detergent composition comprising catalase and amylase
WO2024156628A1 (en) 2023-01-23 2024-08-02 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
WO2024183958A1 (en) 2023-03-09 2024-09-12 Norfalk Aps Use of mono-ester glycolipids in laundry detergents
WO2024194245A1 (en) 2023-03-21 2024-09-26 Novozymes A/S Detergent compositions based on biosurfactants
WO2024213513A1 (en) 2023-04-12 2024-10-17 Novozymes A/S Compositions comprising polypeptides having alkaline phosphatase activity

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4600693A (en) * 1984-02-13 1986-07-15 Corning Glass Works Thermostable alpha amylase having a low requirement for calcium ions, derived from a bacillus microorganism
AU657278B2 (en) * 1990-09-13 1995-03-09 Novo Nordisk A/S Lipase variants
DE4224125A1 (de) * 1991-07-27 1993-01-28 Solvay Enzymes Gmbh & Co Kg Verfahren zur verbesserung der stabilitaet von enzymen und stabilisierte enzyme
PL309403A1 (en) * 1992-12-23 1995-10-02 Unilever Nv Modified cutinases, dna, vector and host
JP3618748B2 (ja) * 1993-04-27 2005-02-09 ジェネンコー インターナショナル インコーポレイテッド 洗剤に使用する新しいリパーゼ変異体

Also Published As

Publication number Publication date
FI963266A (fi) 1996-08-21
MX9603542A (es) 1997-03-29
BR9506861A (pt) 1997-09-23
ATE222604T1 (de) 2002-09-15
DE69527835D1 (de) 2002-09-26
KR970701264A (ko) 1997-03-17
FI963266A0 (fi) 1996-08-21
JP3553958B2 (ja) 2004-08-11
WO1995022615A1 (en) 1995-08-24
CN1147836A (zh) 1997-04-16
JPH09509058A (ja) 1997-09-16
AU1806795A (en) 1995-09-04
CN1077598C (zh) 2002-01-09
CA2183431A1 (en) 1995-08-24
DE69527835T2 (de) 2003-04-10
EP0746618B1 (en) 2002-08-21
EP0746618A1 (en) 1996-12-11
US5976855A (en) 1999-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI119514B (fi) Menetelmä lipolyyttisen entsyymin muunnoksen valmistamiseksi
US5869438A (en) Lipase variants
US5892013A (en) Lipase variants
US10865398B2 (en) Compositions and methods comprising a lipolytic enzyme variant
EP0548228B1 (en) Lipase variants
EP0851913B1 (en) Novel lipolytic enzymes
JP4307549B2 (ja) 脂肪分解活性を有する修飾された酵素
US7157262B2 (en) Lipolytic enzymes
US6350604B1 (en) Alkaline lipolytic enzyme
EP0695348A1 (en) Lipase variants
WO1994025578A1 (en) New lipase variants for use in detergent applications
US6156552A (en) Lipase variants
EP0943678A2 (en) Lipase variants

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 119514

Country of ref document: FI

MA Patent expired