ES2547230T3

ES2547230T3 - Régimen dependiente de inmunoterapia en estado ApoE

Info

Publication number: ES2547230T3
Application number: ES08839961.3T
Authority: ES
Inventors: Ronald Black; Lars Ekman; Ivan Lieberburg; Michael Grundman; James Callaway; Keith M. Gregg; Jack Steven Jacobsen; Davinder Gill; Lioudmila Tchistiakova; Angela Widom
Original assignee: Janssen Sciences Ireland ULC; Wyeth LLC
Current assignee: Janssen Sciences Ireland ULC; Wyeth LLC
Priority date: 2007-10-17
Filing date: 2008-10-17
Publication date: 2015-10-02
Anticipated expiration: 2028-10-17
Also published as: EA201590833A1; JO3076B1; US9644025B2; DK2207565T3; JP2011501945A; SG10201607589XA; HK1217709A1; ZA201002544B; MY156454A; PA8800801A1; TWI581803B; US20090155256A1; US20100266505A1; EP2207565B1; JP2015145419A; PE20090971A1; CA2702617A1; CN101969988A; AR071732A1; EP2952524A1

Abstract

Una forma humanizada de un anticuerpo 3D6 que comprende una región constante de cadenas pesadas humanas con mutaciones L234A, L235A y G237A, donde las posiciones son enumeradas por el sistema de numeración EU, donde 3D6 es un anticuerpo producido por el acceso de ATCC número PTA- 5130.

Description

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inmunoglobulina o anticuerpo (o su fragmento que se vincula con un antígeno) se enlaza específicamente. Los epítopes pueden ser formados de aminoácidos contiguos o aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por el pliegue terciario de una proteína. Los epítopes formados de aminoácidos contiguos son retenidos comúnmente cuando se exponen a solventes desnaturalizantes donde los epítopes formados por un pliegue terciario se pierden típicamente en el tratamiento con solventes desnaturalizantes. Un epítope incluye típicamente por lo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos en una conformación espacial única. Métodos para determinar la conformación espacial de epítopes incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear de dos dimensiones. Refiérase, por ejemplo, a Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (Protocolos de Elaboración de Mapas de Epítopes en Métodos de Biología Molecular), Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996).

[0024] Los anticuerpos que reconocen el mismo epítope pueden identificarse en un inmuno ensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear el enlace de otro anticuerpo a un antígeno objetivo, es decir, un ensayo de enlace competitivo. Enlaces competitivos son determinados en un ensayo en el cual la inmunoglobulina que está siendo probada inhibe enlaces específicos de un anticuerpo referencial a un antígeno común, tal como Aβ. Muchos tipos de ensayos de enlaces competitivos son conocidos, por ejemplo: ensayos radioinmunológicos directos o indirectos de fase sólida (RIA -radioimmunoassay), ensayos inmunológicos enzimáticos directos o indirectos de fase sólida (EIA -enzyme immunoassay), ensayos competitivos tipo emparedado (refiérase a Stahli et al., Methods in Enzymology (Métodos en Enzimología) 9:242 (1983));EIA de biotina-avidina directo en fase sólida (refiérase a Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)); ensayo marcado directo de fase sólida, ensayo tipo emparedado marcado directo de fase sólida (refiérase a Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Anticuerpos: Un Manual de Laboratorio), Cold Spring Harbor Press (1988));RIA de marcación directa de fase sólida utilizando la marcación I-125 (refiérase a Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988));EIA de biotina-avidina directo de fase sólida (Cheung et al.,Virology (Virología) 176:546 (1990)); y RIA marcada directa (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990). Comúnmente, un ensayo como esos involucra la utilización de un antígeno purificado enlazado a una superficie sólida o células que tengan uno de estos, una inmunoglobulina de prueba no marcada y una inmunoglobulina referencial marcada. La inhibición competitiva es medida al determinar el monto de enlaces marcados a la superficie sólida o las células en la presencia de la inmunoglobulina de prueba. Usualmente la inmunoglobulina de prueba está presente en exceso. Usualmente, cuando un anticuerpo competitivo está presente en exceso, inhibirá enlaces específicos de un anticuerpo referencial a un antígeno común por al menos 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70% 70-75% o más.

[0025] Un epítope también es reconocido por células inmunológicas, por ejemplo, células B y/o T. El reconocimiento celular de un epítope puede determinarse por medio de ensayos in vitro que miden la proliferación dependiente de antígenos, tal como se determina por la incorporación de 3H-timidina, por medio de la secreción de citoquinas, por medio de la secreción de anticuerpos o por medio de la eliminación dependiente de antígenos (ensayo de linfocitos citotóxicos T).

[0026] Ejemplos de epítopes o determinantes antígenos pueden encontrarse dentro de la proteína precursora de amiloides humana (APP), pero se encuentra preferiblemente dentro del péptido Aβ de APP. Varias isoformas de APP existen, por ejemplo, APP695, APP751 y APP770. Aminoácidos dentro de APP son asignados números de acuerdo a la secuencia de la isoforma APP770 (refiérase a, por ejemplo, el Acceso del Banco Genético Número P05067). Las secuencias de péptidos de Aβ y su relación al precursor de APP se ilustran por medio de la figura 1 de Hardy et al., TINS 20, 155-158 (1997). Por ejemplo, Aβ42 tiene la secuencia:

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[0027] A menos que sea aparente lo contrario a partir del contexto, cualquier referencia a Aβ también incluye variaciones alélicas naturales de la secuencia que se acaba de mostrar, particularmente aquellas asociadas con enfermedades hereditarias, tales como la mutación ártica, numeración E693G, APP 770. Aβ41, Aβ40 y Aβ39 se diferencian de Aβ42 por la presencia de un residuo de treonina en la terminal C. Epítopes o determinantes antígenos preferidos, tal como se describen aquí, están ubicados dentro de la terminal N del péptido Aβ e incluyen residuos dentro de los aminoácidos 1-11 de Aβ, preferiblemente de los residuos 1-10, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 o 3-7 de Aβ42. Epítopes o determinantes antígenos preferidos adicionales incluyen a los residuos 2-4, 5, 6, 7 u 8 de Aβ, o a los residuos 3-5, 6, 7, 8 o 9 de Aβ, o a los residuos 4-7, 8, 9 o 10 de Aβ42. Otros epítopes preferidos ocurren dentro de las regiones central o de la terminal de C tal como se describe más adelante.

[0028] Un epítope o de la terminal N de Aβ significa un epítope con residuos 1 – 11. Un epítope dentro de una región de la terminal C significa un epítope dentro de los residuos 29-43, y un epítope dentro de una región central significa un epítope con los residuos 12-28.

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[0029] Aβ “soluble” o “disociado” se refiere a un polipéptido Aβ no aglutinado o desglosado.

[0030] Aβ “insoluble” se refiere a un polipéptido Aβ de aglutinamiento, por ejemplo, Aβ que se mantiene junto por enlaces no covalentes. Se cree que Aβ (por ejemplo, Aβ 42) aglutina, por lo menos en parte, debido a la presencia de residuos hidrofóbicos en la terminal C del péptido (parte del dominio de la transmembrana de la APP). Un método para preparar un Aβ soluble es disolver un péptido liofilizado en un DMSO ordenado con sonicación. La solución resultante es centrifugada para remover cualquier partícula insoluble.

[0031] El término “región Fc” se refiere a una región del terminal C en un anticuerpo IgG, en particular, la región de la terminal C de la cadena o cadenas pesadas de aquel anticuerpo IgG. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada IgG puede variar ligeramente, una región Fc es definida típicamente como que abarca desde cerca del residuo de aminoácidos Cys226 al terminal de carboxílicos de una cadena o cadenas pesadas de IgG.

[0032] El término “función ejecutora” se refiere a una actividad que reside en la región Fc de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo IgG) e incluye, por ejemplo, la habilidad del anticuerpo para enlazar moléculas ejecutoras tales como receptores complementarios y/o Fc, que pueden controlar varias funciones inmunológicas del anticuerpo tales como una actividad celular del ejecutor, la lisis, la actividad mediada por un complemento, el despeje de anticuerpos y la vida media del anticuerpo. La función ejecutora también puede ser influenciada por mutaciones de la región de la charnela.

[0033] El término “molécula ejecutora” se refiere a una molécula que es capaz de enlazarse a la región Fc de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo IgG) incluyendo una proteína complementaria de un receptor Fc.

[0034] El término “célula ejecutora” se refiere a una célula capaz de enlazarse a la porción Fc de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo IgG) comúnmente por medio de un receptor Fc en la superficie de la célula ejecutora incluyendo, pero sin limitarse a, linfocitos, por ejemplo, células que tienen antígenos y células T.

[0035] El término “numeración Kabat” a menos que se mencione de otra forma, se define como la numeración de residuos tal como se menciona en Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest-Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico, 5ta Ed. Public Health Service, National Institutes of Health (Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud),Bethesda, Md. (1991)).

[0036] El término “receptor Fc” o “FcR (Fc receptor)” se refiere a un receptor que se enlaza a la región Fc de un anticuerpo. Los receptores típicos Fc que se enlazan a una región Fc de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo IgG) incluyen, pero no se limitan a, receptores de las sub clases FcγRI, FcγRII, y FcγRIII, incluyendo variantes alélicas y formas divididas alternamente de estos receptores. Los receptores Fc son revisados en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods (Métodos inmunológicos) 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995).

[0037] El término “auxiliar” se refiere a un compuesto que cuando se administra en conjunto con un antígeno aumenta y/o redirecciona la respuesta inmunológica del antígeno, pero cuando se lo administra sólo no genera una respuesta inmunológica del antígeno. Los auxiliares pueden aumentar una respuesta inmunológica mediante algunos mecanismos que incluyen reclutamiento de linfocitos, estimulación de células B y/o T y la estimulación de macrófagos.

[0038] El área bajo la curva (AUC -area under the curve) es el área bajo la curva en un gráfico de la concentración de un medicamento en el plasma al paso del tiempo. En un paciente individual, el área bajo la curva representa la el área bajo la curva basándose en ese paciente. En una población de pacientes, el área bajo la curva representa el área bajo la curva media para el intervalo de tiempo comparable de pacientes diferentes en la población.

[0039] La concentración sérica media en un paciente individual representa la concentración media de un anticuerpo (o anticuerpos inducidos para reactivos) durante un período de tiempo. La concentración sérica media en una población de pacientes representa la media de las concentraciones séricas medias de los pacientes individuales durante períodos comparables de tiempo.

[0040] La concentración sérica máxima en un paciente individual representa la concentración máxima de un anticuerpo (o anticuerpos inducidos para un reactivo) durante el transcurso del tratamiento. La concentración sérica máxima en una población de individuos representa la media de las concentraciones máximas del anticuerpo o anticuerpos inducidos entre los individuos en la población.

[0041] Por brevedad, el terminó “portador ApoE4” es utilizado a veces para referirse a pacientes que tienen uno o dos alelos ApoE4 y “no portador de ApoE4”, “no-portador de ApoE4” o “portador no-ApoE4” para referirse a pacientes que tienen cero alelos ApoE4.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DEL INVENTO

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[0060] En otro ejemplo, pacientes con cero alelos E4 se les puede administrar una dosis de 0.015-0.2 miligramos/kilogramo de anticuerpos en forma subcutánea una vez a la semana y los pacientes con dos alelos E4 se les puede administrar la misma dosis cada dos semanas. Regímenes equivalentes a lo que se acaba de mencionar pueden ser ideados variando el monto, la frecuencia o la ruta de administración para entregar la misma área bajo la curva (es decir, la dosis media integrada con el tiempo) de anticuerpos al suero.

[0061] En algunos métodos, a los pacientes con uno o dos alelos E4 se les administra un reactivo para lograr concentraciones séricas con medias más bajas del anticuerpo a lo largo del tiempo que a los pacientes con cero alelos E4. La concentración sérica media más baja se mantiene durante un período de tiempo de por lo menos uno a tres meses, y usualmente tres meses a un año, o indefinidamente. La concentración sérica media de todos aquellos pacientes esta preferiblemente dentro del rango de 2-7 microgramos anticuerpos/mililitros del suero con aquella para los pacientes con uno o dos alelos E4 siendo más baja que aquella para los pacientes con cero alelos E4. Por ejemplo, pacientes con cero alelos E4 se les puede administrar para lograr una concentración sérica media de anticuerpos dentro de un rango de 4.5-7 microgramos de anticuerpo/mililitro y pacientes con uno o dos alelos E4 se les puede administrar un reactivo para alcanzar una concentración sérica media en el rango de 2-4.5 microgramos de anticuerpo/mililitro.

[0062] En aquellos métodos, los individuos dentro de cualquier sub población definida por la presencia de 2, 1 o cero alelos E4 se les administra usualmente el mismo régimen. Sin embargo, el régimen también puede ser personalizado para individuos dentro de una sub población. En este caso, la dosis media y/o frecuencia y/o concentración sérica promedio y/o concentración máxima de reactivos o anticuerpos inducidos por el reactivo en una sub concentración de individuos con dos alelos E4 es menor que aquella de individuos que tienen cero alelos E4.

[0063] En algunos métodos, un reactivo diferente es administrado a individuos con dos alelos E4 que a individuos con cero alelos E4. Los reactivos diferentes usualmente difieren en su capacidad para inducir una respuesta de despeje en contra de los depósitos de amiloides (es decir, los depósitos preexistentes). Tal capacidad puede ser probada, por ejemplo, mediante un ensayo de despeje ex vivo tal como se describe por US 6,750,324. En breve, un anticuerpo y células micro gliales son incubadas con un depósito de alelos y los de un paciente de Alzheimer fallecido o un modelo de ratón transgénico, y la reacción de despeje es monitoreada utilizando un anticuerpo marcado a Aβ. La capacidad de despeje de reactivos puede ser probada asimismo utilizando sueros inducidos por el reactivo como una fuente de anticuerpos para el ensayo. La capacidad de despeje de reactivos pasivos y activos también puede ser evaluada en un modelo de ratón transgénico tal como se describe en US 6,750,324 o en un paciente humano por medio de un monitoreo MRI. Opcionalmente, la respuesta de despeje es medida en un ensayo que distingue entre depósitos de amiloides compactos y difusos. Las diferencias en la capacidad de despeje de algunos anticuerpos es más evidente o es únicamente evidente cuando la comparación es hecha en referencia a la capacidad de despeje de depósitos de amiloides compactos. Opcionalmente, la respuesta de despeje es evaluada a partir de una reducción en el despeje de amiloides vasculares de un anticuerpo dado en relación a un anticuerpo emparejado que de otra forma sería idéntico con un isotipo. Un despeje de amiloides vasculares puede ser evaluado por medio de diferencias significativas estadísticas entre poblaciones de modelos animales o de pacientes humanos tratados con un anticuerpo mutado y un anticuerpo emparejado que de otra forma (sin las mutaciones) sería idéntico con un isotipo.

[0064] Adicionalmente o alternamente a los ensayos que miden una respuesta de despeje, algunos anticuerpos adecuados para su utilización en los métodos del invento pueden ser reconocidos por un enlace reducido a los receptores C1q y/o Fcγ. La capacidad de enlazar a los receptores C1q y/o Fcγ puede ser reducida por mutaciones cerca de la región de charnela de una cadena pesada tal como se menciona en mayor detalle más adelante. La capacidad reducida puede ser determinada, por ejemplo, al comparar un anticuerpo mutado con un anticuerpo que de otra forma sería idéntico con isotipos emparejados que no tienen las mutaciones presentes en el anticuerpo mutado (es decir, que tienen residuos de una región constante humana de tipo silvestre (por ejemplo, bapineuzumab vs. AAB-003), o al comparar anticuerpos que de otra forma serían idénticos que tienen isotipo diferentes (por ejemplo, IgG1 humana versus IgG4 humana).

[0065] Algunos anticuerpos que tienen una capacidad reducida para enlazar a los receptores C1q y/o Fcγ reducen micro-hemorragias en relación con controles de isotipos emparejados pero retienen por lo menos alguna actividad inhibidora del declive cognitivo y/o de despeje de los depósitos amiloides. En algunos anticuerpos, la capacidad reducida de despeje de amiloides está asociada principalmente con la capacidad reducida de despeje de depósitos de amiloides vasculares y/o compactos y no con depósitos de amiloides difusos. Aquellos anticuerpos ofrecen una eficacia potencialmente mejorada: perfil de efectos colaterales, particularmente para su uso en portadores ApoE4.

[0066] Los anticuerpos que tienen enlaces reducidos a los receptores C1q y/o Fcγ pueden ser utilizados en métodos diferenciales de tratamiento tal como se describió anteriormente. Por ejemplo, un anticuerpo con un enlace reducido a los receptores C1q y/o Fcγ pueden ser administrados a pacientes que tienen uno o dos alelos ApoE4 y un anticuerpo que de otra forma sería idéntico sin las mutaciones a los pacientes con cero alelos ApoE4. Alternamente, un anticuerpo con un enlace reducido a receptores C1q y/o Fcγ puede administrarse a pacientes sin importar el número de alelos ApoE4.

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plasma en el espacio intersticial. Una vez extravasado, el fluido es retenido afuera de la vasculatura, principalmente en la materia blanca del cerebro. Un edema vasogénico puede monitorearse por medio de tomas de imágenes cerebrales particularmente por medio de MRI, tomografía de emisión de positrones (toma de imágenes PET -Positron Emission Tomography) o imágenes secuenciales de Recuperación de Inversión Atenuada de Fluidos (FLAIR -Fluid Attenuated Inversion Recovery) (refiérase a Pediatric Neurology (Neurología Pediátrica), 20(3):241243; AJNR, 26:825-830; NEJM, 334(8):494-500; Pediatr Nephrol, 18:1161-1166; Internal Medicine Journal (Revista de Medicina Interna), 35:83-90; JNNP, 68:790-79 1; AJNR, 23:1038-1048; Pak JMed Sci, 21(2):149-154 y, AJNR, 21:1199-1209). El edema vasogénico presenta una intensidad de señal alta en la materia blanca. El edema vasogénico observado es a menudo asintomático pero también puede ser acompañado por dolores de cabeza, náuseas, vómitos, confusión, ataques epilépticos, anormalidades visuales, funcionamiento mental alterado, ataxia, síntomas frontales, síntomas parietales, estupor y señales neurológicas focales.

[0075] De acuerdo a estos métodos, los pacientes con dos alelos E4 pueden estar sujetos a tomas de imágenes del cerebro más frecuentemente que los pacientes que tienen cero alelos E4. Por ejemplo, los pacientes con dos copias de E4 se les puede tomar imágenes antes de empezar el tratamiento y después de eso trimestralmente, mientras que los pacientes con cero alelos E4 se les puede tomar imágenes antes del inicio de tratamiento y después de eso anualmente o cada dos años. Alternamente, las tomas de imágenes cerebrales pueden ser omitidas en pacientes que tienen cero alelos E4. A pacientes que tienen un alelo E4 se les puede tomar imágenes con una frecuencia intermedia entre los pacientes que tienen 0 y 2 alelos E4, o se los puede agrupar con pacientes que tienen cero o dos alelos E4. Después de eso los pacientes con un alelo E4 pueden ser monitoreados de una forma diferente (por ejemplo, más frecuentemente) que los pacientes con cero alelos E4 y pacientes con dos alelos E4 pueden ser monitoreados en forma diferente (por ejemplo, más frecuentemente) que los pacientes con un alelo E4.

[0076] En pacientes que desarrollan un edema vasogénico, el monitoreo puede ser continuado durante el edema vasogénico y por alrededor de un año después de que se resuelvan los síntomas. Después de eso, asumiendo que no hay hallazgos neurológicos, el monitoreo puede ser realizado opcionalmente cada seis meses o anualmente.

[0077] Los agentes pueden empacarse con marcaciones indicando los procedimientos de monitoreo diferenciales dependiendo del estado ApoE4 consistentes con cualquiera de los regímenes ya mencionados o sus combinaciones.

C. Tratamiento universal o regímenes de monitoreo

[0078] Aunque los portadores y los no portadores ApoE4 tienen respuestas diferentes al tratamiento tal como ya se mencionó, y algunos regímenes de tratamientos que son seguros y efectivos en los portadores de ApoE4 también son seguros y efectivos, aunque no necesariamente óptimos, en los no portadores de ApoE4 y pueden utilizarse en ambos tipos de pacientes sin importar su estado ApoE de los pacientes. En algunos regímenes, el reactivo es un anticuerpo que se enlaza a un epítope terminal N de Aβ que tienen mutaciones en su región constante que reducen los enlaces a un receptor Fcγ y/o C1q. AAB-003 es un ejemplo de uno de esos anticuerpos. En otros regímenes, la dosis y/o frecuencia y/o la concentración sérica máxima y/o la concentración sérica media de un anticuerpo administrado o inducido son restringidas dentro de sus límites tal como se describe en PCT/US2007/009499 y se resume aún más adelante para reducir el riesgo de un edema vasogénico.

IV.: Reactivos

A.: Anticuerpos

[0079] Una variedad de anticuerpos a Aβ han sido descritos en la literatura de patentes y científica para su uso en la inmunoterapia de la enfermedad de Alzheimer, alguna de la cual se refiere a ensayos clínicos (refiérase, por ejemplo, a US 6,750,324).). Aquellos anticuerpos pueden enlazarse específicamente a un epítope de la terminal N, un epítope medio (es decir, central) o un epítope de la terminal C tal como se definió anteriormente. Algunas secciones son específicas de la terminal N (es decir, aquellos anticuerpos que se enlazan específicamente a la terminal N de Aβ sin enlazarse a APP). Tal como ya se mencionó los anticuerpos que se enlazan a epítopes dentro de los residuos 1-10, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 o 3-7 de Aβ42 o dentro de los residuos 2-4, 5, 6, 7 u 8 de Aβ, o dentro de los residuos 3-5, 6, 7, 8 o 9 de Aβ, o dentro de los residuos 4-7, 8, 9 o 10 de Aβ42 pueden ser utilizados. Algunos anticuerpos específicos de la terminal C (es decir, se enlazan específicamente a una terminal C de Aβ sin enlazarse a los anticuerpos APP). Los anticuerpos pueden ser policlónicos o monoclónicos. Los sueros policlónicos contienen típicamente poblaciones mezcladas de anticuerpos que se enlazan específicamente a algunos epítopes a lo largo de la extensión de la APP. Sin embargo, sueros policlónicos puede ser específicos a un segmento particular de Aβ tal como Aβ1-11) sin enlazarse específicamente a otros segmentos de Aβ. Anticuerpos importantes son quiméricos, humanizados (incluyendo los anticuerpos chapeados) (refiérase a Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 86:10029-10033 (1989) y WO 90/07861, US 5,693,762, US 5,693,761, US 5,585,089, US 5,530,101 y Winter, US 5,225,539), o humanos (Lonberg et al., WO 93/12227 (1993); US 5,877,397, US 5,874,299, US 5,814,318, US 5,789,650, US 5,770,429, US 5,661,016, US 5,633,425, US 5,625,126, US 5,569,825, US 5,545,806, Nature (Naturaleza) 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology (Biotecnología Natural) 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991)) EP1481008, Bleck, Bioprocessing Journal 1 (Revista de Bioprocesamiento 1) (Sept/Oct. 2005), US 2004132066, US 2005008625, WO 04/072266, WO 05/065348, WO 05/069970, y WO 06/055778.

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[0080] El anticuerpo 3D6, 10D5 y sus variantes son ejemplos de anticuerpos que pueden ser utilizados. Ambos son descritos en US 20030165496, US 20040087777, WO 02/46237, y WO 04/080419, WO 02/088306 y WO 02/088307. Los anticuerpos 10D5 también son descritos en US 20050142131. Anticuerpos 3D6 adicionales son descritos en US

5 20060198851 y PCT/US05/45614. 3D6 es un anticuerpo monoclonal (mAb -monoclonal antibody) que se enlaza específicamente a un epítope de la terminal N ubicada en el péptido humano amiloide β, específicamente, en los residuos 1-5. Por comparación, 10D5 es un mAb que se enlaza específicamente a un epítope de la terminal N ubicado en el péptido humano de amiloide β, específicamente en los residuos 3-6. Una línea celular que produce el anticuerpo monoclonal 3D6 (RB96 3D6.32.2.4) fue depositado con la Colección Americana de Tipos de Cultivos (ATCC -American Type Culture Collection), Manassas, VA 20108, Estados Unidos el 8 de abril de 2003 bajo los términos del tratado de Budapest y se le asignó el número de acceso PTA-5130. Una línea celular que produce el anticuerpo monoclonal 10D5 (RB44 10D5.19.21) fue depositado con la ATCC el 8 de abril de 2003 bajo los términos del tratado de Budapest y se le asignó el número de acceso PTA-5129.

15 [0081] Bapineuzumab (nombre internacional sin propietario designado por la organización mundial de la salud) significa un anticuerpo 3D6 humanizado que comprende una cadena ligera que tiene una región variable maduraque tiene una secuencia de aminoácidos designada como IDENTIFICACIÓN SECUENCIAL NÚMERO: 2 y una cadena pesada que tiene una región variable madura que contiene a la secuencia de aminoácidos diseñada IDENTIFICACIÓN SECUENCIAL NÚMERO: 3 (las regiones constantes de cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo diseñado bapineuzumab por QUIENES son IgG1 humano y kappa humana respectivamente). Una cadena ligera humanizada que incluye regiones variables y constantes se la designa la IDENTIFICACIÓN SECUENCIAL NÚMERO: 48 más adelante, y una cadena pesada humanizada que incluye regiones variables y constantes fuedesignada como la IDENTIFICACIÓN SECUENCIAL NÚMERO 66 o 67 (la IDENTIFICACIÓN SECUENCIAL NÚMERO: 66 tiene una lisina adicional de la terminal C relacionada con la IDENTIFICACIÓN SECUENCIAL

25 NÚMERO: 67).

Región variable de cadena ligera de 3D6 humanizado

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45 Región variable de cadena pesada de 3D6 humanizado [0083]

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Cadena pesada 3D6 humanizada [0089]

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[0090] El anticuerpo adicional que puede ser utilizado de acuerdo al invento es una cuarta versión del 3D6

15 humanizado, tal como se presentó en US 7,318,923. Este anticuerpo se enlaza a la terminal N del péptido Aβ, tal como se explicó anteriormente. El 3D6 humanizado (versión cuatro) comprende la secuencia de la región variablede cadena ligera de la IDENTIFICACIÓN SECUENCIAL NÚMERO: 71 y la secuencia de la región variable de cadena pesada de la IDENTIFICACIÓN SECUENCIAL NÚMERO: 72.

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[0091] Cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos aquí descritos pueden ser diseñados o preparados utilizando métodos estándar, tal como se describe en, por ejemplo, US 20040038304, US 20070020685, US 200601660184, US 20060134098, US 20050255552, US 20050130266, US 2004025363, US 20040038317, US 20030157579, y US 7,335,478.

[0092] Cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente pueden ser producidos con isotipos diferentes o isotipos mutantes para controlar la magnitud de los enlaces a los diferentes receptores Fcγ. Los anticuerpos que no tienen la región Fc (por ejemplo, los fragmentos Fab) no tienen enlaces a los receptores Fcγ. La selección del isotipo

55 también afecta a los enlaces de los receptores Fcγ. Las afinidades respectivas de varios isotipos IgG humanos para los tres receptores Fcγ. FcγRI, FcγRII, y FcγRIII, han sido determinadas (refiérase a Ravetch & Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9, 457 (1991)). FcγRI es un receptor de alta afinidad que enlaza a los IgGs en una forma monomérica, y los dos posteriores son receptores de baja afinidad que se enlazan a IgGs solamente en una forma multimérica. En general, IgG1 e IgG3 tienen una actividad de enlaces significativa para todos los tres receptores, IgG4 a FcγRI, e IgG2 a sólo un tipo de FcγRII llamado IIaLR (refiérase a Parren et al., J. Immunol. 148, 695 (1992). Por lo tanto, el IgG1 de isotipo humano es seleccionado usualmente por sus enlaces más fuertes a los receptores Fcγ e IgG2 es seleccionado usualmente por sus enlaces más débiles.

[0093] Las mutaciones, adyacentes, o cercanas a los lugares en la región de vinculación de charnela (por ejemplo,

65 residuos de reemplazo 234, 235, 236 y/o 237 con otro residuo) en todos los isotipos reduce la afinidad para los receptores Fcγ, particularmente el receptor FcγRI (refiérase, por ejemplo, a US 6,624,821). Opcionalmente, las

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posiciones 234, 236 y/o 237 son sustituidas con alanina y la posición 235 con glutamina. (Refiérase, por ejemplo, a US 5,624,821). La posición 236 falta en el isotipo IgG2 humano. Ejemplos de segmentos de aminoácidos para las posiciones 234, 235 y 237 para IgG2 humano son Ala Gly, Val Ala, Ala, Val Glu Ala, y Ala Glu Ala. Una combinación preferida de mutaciones es L234A, L235A, y G237A para el IgG1 de isotipo humano. Un anticuerpo particular preferido es el bapineuzumab que tiene un IgG de isotipo humano y estas tres mutaciones de la región Fc. Otras sustituciones que reducen los enlaces a los receptores Fcγ son una mutación E233p (particularmente en IgG1 de ratón) y D265A (particularmente de IgG2a de ratón) otros ejemplos de mutaciones y combinaciones de mutaciones que reducen los enlaces a Fc y/o Clq se describen en los ejemplos (E318A/K320A/R322A (particularmente en IgG1 de ratón), L235A/E318A/K320A/K322A (particularmente en IgG2a de ratón). Asimismo, el residuo 241 (Ser) en IgG4 humano puede ser reemplazado, por ejemplo, con prolina para interrumpir los enlaces a Fc.

[0094] Mutaciones adicionales pueden ser hechas a la región constante para modular la actividad ejecutora. Por ejemplo, se puede realizar mutaciones a la región constante de IgG2a en A330S, P331S, o en ambas. En lo que se refiere a las mutaciones para IgG4 éstas se pueden realizar en E233P, F234V y L235A, con G236 eliminado, o cualquiera de sus combinaciones. IgG4 también puede tener una o ambas de las siguientes mutaciones S228P y L235E. El uso de secuencias de la región constante interrumpida para modular la función ejecutora se cubre en mayor detalle, por ejemplo, en WO 06/118,959 y WO 06/036291.

[0095] Mutaciones adicionales pueden ser hechas a la región constante del IgG humano para modular la actividad ejecutora (refiérase, por ejemplo, a WO 06/03291). Estos incluyen las siguientes sustituciones: (i) A327G, A330S, P331S; (ii) E233P, L234V, L235A, G236 eliminada; (iii) E233P, L234V, L235A; (iv) E233P, L234V, L235A, G236 eliminada, A327G, A330S, P331S; y (v) E233P, L234V, L235A, A327G, A330S, P331S a un IgG1 humano.

[0096] La afinidad de un anticuerpo con el FcR puede alterarse al mutar ciertos residuos de la región constante de la cadena pesada. Por ejemplo, la interrupción del lugar de glicosilación del IgG1 humano puede reducir los enlaces FcR, y por lo tanto la función ejecutora, del anticuerpo (refiérase, por ejemplo, a WO 06/036291). Las secuencias tripéptidas NXS, NXT, y NXC, donde X es cualquier aminoácido que no sea prolina, son los lugares de reconocimiento enzimático para la glicosilación del residuo N. La interrupción de cualquiera de los aminoácidos tripéptidos particularmente en la región CH2 de IgG1 evita la glicosilación en ese lugar. Por ejemplo, la mutación de N97 del IgG1 humano evíta la glicosilación y reduce los enlaces FcR al anticuerpo.

[0097] Las secuencias de algunos ejemplos de anticuerpos 3D6 humanizados y sus partes de los componentes se muestran más adelante. Las regiones constantes humanas muestran variaciones alotípicas y variaciones isoalotípicas entre individuos diferentes, eso es, las regiones constantes pueden diferir en diferentes individuos en una o más posiciones polimórficas. Isoalotipos se diferencian de los alotipos en que el reconocimiento sérico en un isoalotipo se enlaza a una región no polimórfica o a uno o más isotipos adicionales. El alotipo de la región constante de IgG1 que se muestra más adelante es 3D6 (AAB-001) que es Glmz que tiene a Glu en la posición 356 y Met en la posición de 158. El alotipo de la región constante de kappa que se muestra más adelante es Km3, que tiene un Ala en la posición 153 y a Val en la posición 191. Un alotipo diferente Km(1) tiene Val y Leu en las posiciones 153 y 191 respectivas. Las variantes alotípicas son revisadas por J Immunogen 3: 357-362 (1976) y Loghem,. Monogr Allergy

19: 40-51 (1986). Otras variantes alotípicas e isoalotípicas de las regiones constantes ilustradas son incluidas. También están incluidas las regiones constantes que tienen cualquier permutación de los residuos que ocupan posiciones polimórficas en alotipos naturales. Ejemplos de otros alotipos IgG1 de cadenas pesadas incluyen a: Glm(f), Glm(a) y Glm(x). Glm(f) se diferencia de Glm(z) en que tiene a Arg en vez de a un Lys en la posición 214. Glm(a) tiene aminoácidos Arg, Asp, Glu, Leu en las posiciones 355-358.

Cadena ligera de longitud completa de 3D6 humanizada (secuencia de señalización subrayada) (bapineuzumab y AAB-003)

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[0108] El residuo K de la terminal C puede estar ausente, tal como se indica más adelante.

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Cadena pesada de longitud completa de 3D6 humanizada (Isotipo IgG4, S241P), incluyendo la secuencia de señalización (subrayada)

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[0203] Para los anticuerpos derivados de 3D6 humanizados, las siguientes condiciones de ensayo fueron utilizadas. Biacore 3000 y el chip CM5 cubierto con el anticuerpo (Qiagen, número de catálogo 34660) penta-His (IDENTIFICACIÓN SECUENCIAL NÚMERO: 93) fue utilizado en combinación con dominios marcados con His de FcγRI, FcγRII, y FcγRIII humanos (R&D Systems, número de catálogo 1257-Fc, 1330-CD, 1597-Fc). Cada receptor fue capturado por separado en una célula de flujo del chip sensor por el anticuerpo penta-His (IDENTIFICACIÓN SECUENCIAL NÚMERO: 93). Una solución del anticuerpo que estaba siendo probado fue inyectada para permitir las medidas de las tasas de asociación y disociación para el receptor capturado. Después de que se realizaron las mediciones, los receptores y los anticuerpos experimentales fueron removidos por medio de la inyección de un amortiguador de pH: 2.5. La célula de flujo estaba lista entonces para el siguiente ciclo. Cada ciclo fue ejecutado por duplicado, y las mismas condiciones (por ejemplo, concentraciones, tasas de flujo y tiempos) fueron utilizadas para cada muestra.

[0204] Tal como se indicó por los valores en la tabla 11, el bapineuzumab (región Fc no modificada) se enlazó a todos los receptores FcγR humanos con una afinidad relativamente alta. KD para FcγRI estuvo en el rango de nm, mientras que el KD para FcγRII y III estuvieron en el rango de micrómetros. Para los dos posteriores, los sensogramas mostraron una cinética típica de rápida activación y desactivación. El isotipo IgG4 tuvo enlaces similares a FcγRI, pero no se enlazó con FcγRIII, tal como se esperaba. Los dos derivados IgG1, 2m y 3m de 3D6 de Hu, no mostraron enlaces detectables a FcγRI o FcγRIII.

[0205] Para los anticuerpos derivados de 3D6 de ratón, métodos similares fueron utilizados para determinar los enlaces a los FcγRI, II, y III de ratón. FcγRI y III son receptores de activación, mientras que FcγRII es considerado generalmente como inhibitorio. Los anticuerpos probados fueron IgG2a de 3D6, IgG1 de 3D6, y las mutaciones de IgG1, 1m, 3m y 4m de 3D6. Los resultados son expresados como un porcentaje relativo de los enlaces IgG2a de 3D6. Tal como se mostró en la tabla 11, el IgG2a de 3D6 fue el único anticuerpo con la capacidad detectable de enlaces FcγRI. El IgG1 de 3D6 y el IgG1 3m de 3D6 tuvo perfiles de enlaces similares a FcγRII y III.

TABLA 11

Habilidad de enlaces con el receptor Fc de los anticuerpos 3D6

Derivados de 3D6: Capacidad de enlaces relativa* (%)

FcγRI Humana**: FcγRII Humana ** FcγRIII Humana**

Control de Bapineuzumab: 100 100 100

1m de 3D6 Humanizado: 85-95 40-50 0

2m de 3D6 Humanizado: 0 40-50 0

3m de 3D6 Humanizado en AAB-003: 0 8-12 0

IgG2a de Control de 3D6: 100*** 100 100

IgG1a de Control de 3D6: 0 180 70

IgG1 de 1m de 3D6: 0 15 10

IgG1 de 3m de 3D6: 0 180 70

Derivados de 3D6: Capacidad de enlaces relativa* (%)

FcγRI Humana**: FcγRII Humana ** FcγRIII Humana**

IgG1 de 4m de 3D6: 0 25 15

*Definido como el monto de enlaces en (RU) relación a aquel del control de IgG2a en un estado continuo. **Los mFcγRI y mFcγRIII son receptores activadores, mFcγRII es un receptor inhibidor. Otro receptor activador potente, mFcγRIV, no es comercialmente disponible. ***Un enlace de estado continuo no fue obtenido. Un acoplamiento cinético conllevó a un estimado de KD en el rango nano molar.

[0206] Los resultados del cuadro anterior muestran que el anticuerpo 3m de 3D6 de Hu (AAB-003) tiene el enlace al receptor gama Fc más reducido de los tres que fueron probados. De aquellos probados, el anticuerpo mutante de ratón IgG1 de 1m de 3D fue el más similar a AAB-003, en que sus enlaces con FcγR fueron reducidos a hasta el 10% de lo normal.

Ejemplo 5: Estudios de ratones de anticuerpos derivados de 3D6

Diseño del estudio

[0207] Ratones PDAPP de un año de edad fueron expuestos a un paradigma de tratamiento de seis meses con control con los anticuerpos derivados de 3D6 descritos en la tabla 10. El control negativo fue un anticuerpo IgG2a de

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Claims

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