UA119659C2 - Антитіло до pd-1, його антигензв'язуючий фрагмент та їхнє медичне застосування - Google Patents

Abstract

Винахід стосується антитіла до PD-1, або його антигензв'язуючого фрагмента, фармацевтичної композиції, що містить таке антитіло, та його застосування в отриманні лікарського засобу для лікування захворювань або розладів, опосередкованих PD-1.

Description

ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ

Цей винахід відноситься до антитіла до РО-1, антигензв'язуючого фрагмента РО-1, химерного антитіла і гуманізованих антитіл, які містять СОК антитіла до РО-1, а також до фармацевтичної композиції, яка містить антитіло до РО-1 і його антигензв'язуючий фрагмент, а також до їхнього використання в якості протиракового лікарського засобу.

РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

Протипухлинна імунотерапія на протязі довгого часу є «гарячою точкою» в області терапії пухлин, причому основним її видом є імунотерапія раку, пов'язана із Т-клітинами.

Протипухлинна імунотерапія впливає на пухлини за допомоги повного використання і мобілізації цитотоксичних Т-лімфоцитів у пацієнтів з пухлинами; вона може бути найбільш ефективним і безпечним способом лікування раку. В той же час, величезною перешкодою, з якою стикаються при імунотерапії пухлин, є вихід пухлини, в якій ракові клітини через їхню інгібуючю дію на імунну систему сприяють швидкому росту пухлини.

Існують дуже складні відносини між утіканням пухлини від імунної відповіді та імунною відповіддю організму на пухлини. При імунотерапії пухлин на ранній стадії пухлиноспецифічні Т- клітини кілери є біологічно активними, але на пізній стадії росту пухлини втрачають функцію знищення. Таким чином, імунотерапія пухлин головним чином призначена для посилення відповіді власної імунної системи пацієнта на пухлину. Основним в імунотерапії пухлин є не тільки активація існуючої відповіді імунної системи, але й підтримка тривалості та інтенсивності відповіді імунної системи.

Активація Т-клітин людини іп мімо реалізується за допомогою системи двохсигнального шляху, для якого існує необхідність не тільки в представленні антигенного пептиду ГКГ (головний комплекс гістосумісності) Т-клітинам за допомогою антиген-презентуючих клітин, щоб забезпечити перший сигнал, але також потребується ряд костимулюючих молекул для забезпечення другого сигналу, після чого Т-клітини виявляють нормальну імунну відповідь. Ця система двійної сигналізації грає життєво важливу роль в балансі імунної системи і строго регулює різноманітні імунні відповіді, які стимулюються ендогенними і екзогенними антигенами.

Відсутність другого сигналу, який забезпечується костимулюючими молекулами, призводить до відсутності відповіді або до сповільненої імунної відповіді специфічних Т-клітин, що призводить в результаті до стійкості. Таким чином, другий сигнальний шлях грає ключову регуляторну роль у всьому процесі імунної відповіді.

Білок програмованої смерті-1 (РО-1), який було виявлено в 1992 р., являє собою білковий рецептор, який експресується на поверхні Т-клітин і приймає участь в апоптозі клітин. Білок РО- 1 належить до родини СО28, має 23 95 гомології амінокислотної послідовності з антигеном 4 цитотоксичних Т-лімфоцитів (СТІ А-4), але в основному експресується в активованих Т-клітинах,

В-клітинах і мієлоідних клітинах, і відрізняється від СТІ А. РО-1 має два ліганди, РО-11 і РО-І2, відповідно. РО-І 1 в основному експресується в Т-клітинах, В-клітинах, макрофагах і дендритних клітинах (ДК), і експресія підвищуючи регулюється в активованих клітинах. Експресія РО-І2 в основному обмежується антиген-презентуючими клітинами, такими як активовані макрофаги і дендритні клітини.

В нових дослідженнях було виявлено високий рівень експресії білюу РО-Ї1 в тканинах пухлин людини, таких як рак молочної залози, рак легенів, рак шлунка, рак кишківника, рак нирки, меланома та інших, і при цьому рівні експресії РО-І1 1 тісно зв'язані з клінічним станом і прогнозом для пацієнтів. Що торкається РО-1 1, він інгібує проліферацію Т-клітин за допомогою другого сигнального шляху, причому блокування зв'язування РО-І1/РО-1 стає досить перспективною мішенню в галузі протипухлинної імунотерапії.

В цей час існує декілька транснаціональних фармацевтичних компаній, які займаються використанням моноклональних антитіл до РО-1, які максимізують власну імунну відповідь пацієнтів проти пухлини, блокуючи зв'язування РО-І 1/РО-1, і, згодом, досягають цілі знищення клітин пухлини, як описано в УМО2009114335. В результатах клінічних досліджень моноклональних антитіл до РО-1 компаній ВМ5 та МегсК певний рівень відповіді спостерігався при немілкоклітинному раку легені, меланомі і раку нирки, і при цьому рівень відповіді демонструє помітно високу релевантність з експресією РО-Ї1 в пухлинах, що означає, що антитіло до РО-1 чинить позитивну дію на пухлини.

В цьому винаході запропоновано антитіло до РО-1 з високою афінністю, високою селективністю та високою біологічною активністю.

СУТЬ ВИНАХОДУ

В цьому винаході запропоновано антитіло до РО-1 або його антигензв'язуючий фрагмент, який містить: 60 варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить щонайменше одну І СОК, яка була обрана з тих послідовностей, що показані в: ЗЕО ІЮ МО: 6, ЗЕО ІЮО МО: 7 або 5ЕО ІЮО МО: 8; і варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить щонайменше одну НСОЕ, яка була обрана з тих послідовностей, що показані в: ЗЕО ІЮ МО: 3, ЗЕО ІЮ МО: 4 або 5ЕО ІО МО: 5.

В найкращому варіанті реалізації цього винаходу запропоновано антитіло до РО-1 або його антигензв'язуючий фрагмент, в якому варіабельна ділянка легкого ланцюга містить Ї/СОКІ1, як показано в 5ЕО ІЮ МО: 6.

В найкращому варіанті реалізації цього винаходу запропоновано антитіло до РО-1 або його антигензв'язуючий фрагмент, в якому варіабельна ділянка легкого ланцюга містить ЇСОМ2, як показано в 5ЕО ІЮ МО: 7.

В найкращому варіанті реалізації цього винаходу запропоновано антитіло до РО-1 або його антигензв'язуючий фрагмент, в якому варіабельна ділянка легкого ланцюга містить Ї/СОМЗ, як показано в 5ЕО ІЮ МО: 8.

В найкращому варіанті реалізації цього винаходу запропоновано антитіло до РО-1 або його антигензв'язуючий фрагмент, в якому варіабельна ділянка важкого ланцюга містить НСОКІ, як показано в 5ЕО ІЮ МО: 3.

В найкращому варіанті реалізації цього винаходу запропоновано антитіло до РО-1 або його антигензв'язуючий фрагмент, в якому варіабельна ділянка важкого ланцюга містить НСОК2, як показано в 5ЕО ІЮ МО: 4.

В найкращому варіанті реалізації цього винаходу запропоновано антитіло до РО-1 або його антигензв'язуючий фрагмент, в якому варіабельна ділянка важкого ланцюга містить НСОКЗ, як показано в 5ЕО ІЮ МО: 5.

В найкращому варіанті реалізації цього винаходу запропоновано антитіло до РО-1 або його антигензв'язуючий фрагмент, в якому варіабельна ділянка легкого ланцюга містить І СОК1,

ІСОК2 і СОм3, як показано в 5ЕО ІЮО МО: 6, ЗЕО ІЮ МО: 7 і ЗЕО ІО МО: 8, відповідно.

В найкращому варіанті реалізації цього винаходу запропоновано антитіло до РО-1 або його антигензв'язуючий фрагмент, в якому варіабельна ділянка важкого ланцюга містить НСОКІ1,

НСОК2 і НСОКЗ, як показано в ЗЕО ІЮО МО: 3, 5ЕО ІЮО МО: 4 і ЗЕО ІЮ МО: 5 відповідно.

В найкращому варіанті реалізації цього винаходу запропоновано антитіло до РО-1 або його антигензв'язуючий фрагмент, в якому варіабельна ділянка легкого ланцюга містить І СОК1,

ГСОК2 і ГГ СОКЗ, як показано в 5ЕО ІЮ МО: 6, 5ЕО ІЮО МО: 7 і 5ЕО ІЮ МО: 8, відповідно; і при цьому варіабельна ділянка важкого ланцюга містить НСОКІ, НСОК2 і НСОКЗ, як показано в

ЗЕО ІЮО МО: 3, 5ЕО ІЮО МО: 4 і 5ЕО ІЮО МО: 5 відповідно.

В найкращому варіанті реалізації цього винаходу, відповідно до запропонованого в цьому документі антитіла до РО-1 або його антигензв'язуючого фрагмента, вказане антитіло являє собою мишаче антитіло або його фрагмент.

В найкращому варіанті реалізації цього винаходу, відповідно до запропонованого в цьому документі мишачого антитіла або його фрагмента, варіабельна ділянка легкого ланцюга додатково містить каркасну ділянку (ЕК) легкого ланцюга мишачого к-, А-ланцюга або її варіант.

В найкращому варіанті реалізації цього винаходу мишаче антитіло або його фрагмент, запропоновані в цьому документі, додатково містять константну ділянку легкого ланцюга мишачого к-, А- ланцюга або її варіант.

В найкращому варіанті реалізації цього винаходу, відповідно до запропонованого в цьому документі мишачого антитіла або його фрагмента, варіабельна ділянка важкого ланцюга додатково містить ЕЕ важкого ланцюга мишачих Ідс1, Ідса2, дез, Ід або її варіант.

В найкращому варіанті реалізації цього винаходу, мишаче антитіло або його фрагмент, які запропоновано в цьому документі, додатково містять константну ділянку важкого ланцюга мишачих Ідс1, Ідс2, ІдоЗ, Ід4 або її варіант.

В найкращому варіанті реалізації цього винаходу, відповідно до запропонованого в цьому документі антитіла до РО-1 або антигенів'язуючого фрагмента, вказане антитіло являє собою химерне антитіло або його фрагмент.

В найкращому варіанті реалізації цього винаходу, відповідно до запропонованого в цьому документі химерного антитіла до РО-1 або його фрагмента, послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга химерного антитіла являє собою 5ЕО ІЮ МО: 10.

В найкращому варіанті реалізації цього винаходу, відповідно до запропонованого в цьому документі химерного антитіла до РО-1 або його фрагмента, послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга химерного антитіла являє собою 5ЕО ІЮ МО: 9.

В найкращому варіанті реалізації цього винаходу химерне антитіло до РО-1 або його фрагмент, запропоновані в цьому документі, додатково містять константну ділянку легкого ланцюга людського к-, А-ланцюга або його варіанта. 60 В найкращому варіанті реалізації цього винаходу химерне антитіло до РО-1 або його фрагмент, запропоновані в цьому документі, також містять константну ділянку важкого ланцюга людських ІДС, Ідс2, ІдеЗ або Ідса4 або їхніх варіантів, переважно містять константну ділянку важкого ланцюга людських ІдсС2 або Ідсб4, або ІдсС1, яка не має АОСС (антитілозалежної клітинно-опосередкованої цитотоксичності) після амінокислотної мутації.

В найкращому варіанті реалізації цього винаходу, відповідно до запропонованого в цьому документі антитіла до РО-1 або антигенів'язуючого фрагмента, вказане антитіло являє собою гуманізоване антитіло або його фрагмент.

В найкращому варіанті реалізації цього винаходу, відповідно до запропонованого в цьому документі гуманізованого антитіла до РО-1 або його фрагмента, варіабельна ділянка легкого ланцюга гуманізованого антитіла також містить ЕК легкого ланцюга людського к-, А-ланцюга або його варіант.

В найкращому варіанті реалізації цього винаходу, відповідно до запропонованого в цьому документі гуманізованого антитіла до РО-1 або його фрагмента, послідовність ЕК легкого ланцюга варіабельної ділянки легкого ланцюга гуманізованого антитіла отримана із комбінації послідовності легких ланцюгів зародкової лінії людини ІКМ1-39 і УК4, як показано в 5ЕО ІЮО МО: 14, що містить ЕК, ЕК2 і ЕКЗ ІСКМ 1-39 і ЕКА4 КА.

В найкращому варіанті реалізації цього винаходу, відповідно до запропонованого в цьому документі гуманізованого антитіла до РО-1 або його фрагмента, послідовність легкого ланцюга гуманізованого антитіла показана в 5ЕО ІО МО: 12 або її варіанті.

В найкращому варіанті реалізації цього винаходу, відповідно до запропонованого в цьому документі гуманізованого антитіла до РО-1 або його фрагмента, варіант варіабельної ділянки легкого ланцюга гуманізованого антитіла містить амінокислотну мутацію 0-10 у варіабельній ділянці легкого ланцюга, переважно А435.

В найкращому варіанті реалізації цього винаходу гуманізоване антитіло до РО-1 або його фрагмент, запропонований в цьому документі, додатково містить константну ділянку легкого ланцюга людського к-, А-ланцюга або її варіант.

В найкращому варіанті реалізації цього винаходу, відповідно до запропонованого в цьому документі гуманізованого антитіла до РО-1 або його фрагмента, варіабельна ділянка важкого ланцюга додатково містить ЕЕ важкого ланцюга людських Ідс1, Ідс2, ІдсеЗ, Ідс4 або його варіантів.

В найкращому варіанті реалізації цього винаходу, відповідно до запропонованого в цьому документі гуманізованого антитіла до РО-1 або його фрагмента, послідовність ЕК важкого ланцюга варіабельної ділянки важкого ланцюга гуманізованого антитіла отримана із комбінації послідовності важких ланцюгів зародкової лінії людини ІДНМЗ3-7 і УНб, як показано в 5ЕО ІЮ МО: 13, що містить ЕК, ЕКЗ і РКЗ ІЧНМ3-7 і ЕК4 уНб.

В найкращому варіанті реалізації цього винаходу, відповідно до запропонованого в цьому документі гуманізованого антитіла до РО-1 або його фрагмента, послідовність важкого ланцюга гуманізованого антитіла показана в ЗЕО ІЮ МО: 11 або її варіанті; причому варіант переважно містить амінокислотну мутацію 0-10 у варіабельній ділянці важкого ланцюга, більш бажано а44АВ.

В найкращому варіанті реалізації цього винаходу гуманізоване антитіло до РО-1 або його фрагмент, запропоновані в цьому документі, додатково містять константну ділянку важкого ланцюга людських ІДдС1, Ідс2, ІдЗ або Ідс4, або її варіант, і переважно містять константну ділянку важкого ланцюга людського Ідса2 або Ідс4, яка не має АОСС, або такий Ідс1, який не має АОСС (антитілозалежної клітинно-опосередкованої цитотоксичності) після амінокислотної мутації. Варіант переважно являє собою мутацію константної ділянки важкого ланцюга, яка викликає ослаблення або недостатність АОСС, і, більш бажано, М297А, І 234А, І 235А в ІдС1, химері Іде2/4 і Е235Е або І 234А/Е2З5А в Ідс4.

В найкращому варіанті реалізації цього винаходу, відповідно до запропонованого в цьому документі антитіла до РО-1 або антигенів'язуючого фрагмента, антигензв'язуючий фрагмент являє собою Раб, Ем, 5Ем або К(аб)».

В цьому винаході додатково запропоновано молекулу ДНК, яка кодує антитіло до РО-1 або антигензв'язуючий Фрагмент, які описані вище.

В цьому винаході додатково запропоновано експресуючий вектор, який містить молекулу

ДНК, як описано вище.

В цьому винаході додатково запропоновано клітину-хазяїна, трансформовану експресуючим вектором, як описано вище.

В найкращому варіанті реалізації цього винаходу, відповідно до запропонованої в цьому документі клітини-хазяїна, вказана клітина-хазяїн являє собою бактерію, бажано Е. сої). 60 В найкращому варіанті реалізації цього винаходу, запропонована в цьому документі клітина-

хазяїн являє собою дріжджі, бажано Ріспіа равіогів.

В цьому винаході додатково запропоновано фармацевтичну композицію, що містить антитіло до РО-1 або його антигензв'язуючий фрагмент, як описано в цьому документі, і фармацевтично прийнятний наповнювач, розріджувач або носій.

В цьому винаході додатково запропоновано використання описаного вище антитіла до РО-1 або антигензв'язуючого фрагмента, або фармацевтичної композиції, яка їх містить, в отриманні лікарського засобу для лікування захворювання або розладу, опосередкованого РО-1; причому вказане захворювання переважно являє собою рак, більш бажано рак, що експресує РО-11; і рак переважно являє собою рак молочної залози, рак легені, рак шлунка, рак кишківника, рак нирки, меланому і найбільш бажано немілкоклітинний рак легені, меланому та рак нирки.

В цьому винаході додатково запропоновано спосіб лікування і попереджання захворювання або розладу, опосередкованого РО-1, який включає введення суб'єкту, який потребує цього, терапевтично ефективної кількості антитіла до РО-1 або його антигенів'язуючого фрагмента згідно цього винаходу, або фармацевтичної композиції, яка їх містить; причому вказане захворювання переважно являє собою рак, більш бажано рак, що експресує РО-11; рак переважно являє собою рак молочної залози, рак легені, рак шлунка, рак кишківника, рак нирки, меланому, немілкоклітинний рак легені, і найбільш бажано, немілкоклітинний рак легені, меланому та рак нирки.

КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ

Фігура 1. Аналіз проліферації мононуклеарних клітин периферичної крові людини.

Результати демонструють, що антитіло тАбБО05 до РО-1, яке тестується, може ефективно стимулювати проліферацію мононуклеарних клітин периферичної крові людини зі значенням

ЕС50 83 нг/мл.

Фігура 2. Аналіз секреції цитокіну ІФН-у мононуклеарними клітинами периферичної крові людини. Результати демонструють, що антитіло тАБОО5 до РО-1, яке тестується, може стимулювати проліферацію МКПК і в той же час ефективно стимулювати секрецію цитокіну ІФН- у зі значенням ЕС5О 13 нг/мл.

Фігура 3. Інгібуючий вплив антитіла до РО-1 НООБ-1 на ріст клітин гліоми.

Фігура 4. Діаграма, яка демонструє зміну об'єму пухлини після лікування.

Фігура 5. Діаграма, яка демонструє зміну маси тіла мишей після лікування.

ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС СУТІ ВИНАХОДУ

1. Визначення

Для спрощення розуміння цього винаходу деякі технічні та наукові терміни спеціально визначено нижче. Якщо в інших місцях цього документу конкретно не вказане інше, всі технічні та наукові терміни, які використовуються в цьому документі, мають таке ж значення, яке звичайно зрозуміло спеціалісту в тій галузі техніки, до якої відноситься цей винахід.

Однобуквений код та трьохбуквений код амінокислот, які використовуються в цьому документі, описані в «). БіоїЇ. спет, 243, (1968) р 3558.

Термін «антитіло», який використовується в цьому документі, відноситься до імуноглобуліну, структура ланцюга якого складається з чотирьох пептидів, з'єднаних разом дисульфідними зв'язками між двома ідентичними важкими ланцюгами і двома ідентичними легкими ланцюгами.

Різноманітні константні ділянки важкого ланцюга імуноглобулінів демонструють різні амінокислотні склади і впорядкованість, таким чином представляючи різні види антигенності.

Відповідно, імуноглобуліни можна розділити на п'ять категорій, або так званих ізотипів імуноглобулінів, а саме ІОМ, дО, Іде, ІдА ії ІДЕ, їхні важкі ланцюги являють собою н-ланцюг, б- ланцюг, у-ланцюг с-ланцюг і є-ланцюг, відповідно. Відповідно до амінокислотного складу шарнірної ділянки та числа і розташування дисульфідних зв'язків у важкому ланцюгу, один і той же тип Ід можна розділити на різні підкатегорії, наприклад, до можна розділити на Ідс1, Ідса2,

ІЧОЗ і Ідс4. З урахуванням різних константних ділянок легкий ланцюг можна розділити на к- або

А- ланцюг. Кожний з п'яти Ід може мати к- або А- ланцюг.

В цьому винаході варіабельна ділянка легкого ланцюга антитіла, яка згадується в цьому документі, додатково містить константну ділянку легкого ланцюга, яка містить к-, А-ланцюг людини або миші або їхній варіант.

В цьому винаході варіабельна ділянка важкого ланцюга антитіла, яка згадується в цьому документі, додатково містить константну ділянку важкого ланцюга, яка містить Ідс1, 2, 3, 4 людини або миші або їхній варіант.

Послідовність важких ланцюгів та легких ланцюгів антитіла біля М-кінця, яка складається з близько 110 амінокислот, яка в значному ступені варіюється, відома як варіабельна ділянка (М- ділянка); залишок амінокислотної послідовності біля С-кінця, який є відносно стабільним, 60 відомий як константна ділянка (С-ділянка). Варіабельна ділянка містить три гіперваріабельні ділянки (НМК) та чотири відносно консервативні послідовності каркасної ділянки (ЕК). Ці три гіперваріабельні ділянки визначають специфічність антитіла, і також відомі як ділянки, що визначають компліментарність (СОК). Кожна варіабельна ділянка легкого ланцюга (СУК) та кожна варіабельна ділянка важкого ланцюга (НСУК) складається з трьох СОК і чотирьох ЕЕ, із наступним послідовним порядком від амінокінця до карбоксикінця: ЕК1, СОКІ1, ЕК2, СОК2, ЕКЗ,

СО і ЕК4. Три СОК легкого ланцюга називають СОКІ1, ГСОК2 і ГСОКЗ; три СОК важкого ланцюга називають НСОКІ, НСОМК2 і НСОКЗ. Кількість та розташування амінокислотних залишків СОК у СУК і НСУЕ антитіла або антигензв'язуючого фрагмента в цьому документі відповідають відомим критеріям нумерації за Кара (1 СОК1-3, НСОЕ2-3) або відповідають критеріям нумерації за Кабаї і Споїпіа (НСОКТ).

Термін «мишаче антитіло» в цьому винаході відноситься до моноклонального антитіла до

РО-1 людини, яке отримано відповідно до знань та досвіду в цій галузі техніки. Під час підготування, досліджуваному об'єкту вводили ін'єкцію антигену РО-1, а потім виділяли гібридому, яка експресує антитіло, що має необхідну послідовність або функціональні характеристики. В найкращому варіанті реалізації цього винаходу мишаче антитіло до РО-1 або його антигензв'язуючий фрагмент додатково містять константну ділянку легкого ланцюга мишачого к-, А- ланцюга або її варіант, або додатково містять константну ділянку важкого ланцюга мишачого ІдсС1, Ідс2, ІдеЗ або Ідея, або її варіант.

Термін «химерне антитіло» являє собою антитіло, яке утворилось шляхом злиття варіабельної ділянки мишачого антитіла з константною ділянкою людського антитіла, причому вказане химерне антитіло може полегшувати імунну відповідь, що індукована мишачим антитілом. Для створення химерного антитіла спочатку створюють гібридому, яка секретує специфічне мишаче моноклональне антитіло, із клітин мишачої гібридоми клонують ген варіабельної ділянки, потім за бажанням клонують ген константної ділянки людського антитіла, мишачий ген варіабельної ділянки легують з людським геном константної ділянки з утворенням химерного гена, який можна уставити в людський вектор, і, нарешті, молекулу химерного антитіла експресують у еукаріотичній або прокаріотичній промисловій системі. В найкращому варіанті реалізації цього винаходу, варіабельна ділянка легкого ланцюга химерного антитіла до

РО-1 додатково містить РК легкого ланцюга мишачого к-, А-ланцюга або її варіант, а послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга показана в 5ЕО ІЮ МО: 10. Варіабельна ділянка важкого ланцюга химерного антитіла до РО-1 додатково містить ЕК важкого ланцюга мишачих ІДС1, Ідс2, ІдОЗ, Ідс4 або її варіант, а послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга показана в 5ЕО ІЮО МО: 10. Константну ділянку людського антитіла обирають із константної ділянки важкого ланцюга людських Ідс1, Ідс2, ІдсЗ або Ідс4 або її варіанта, переважно вона містить константну ділянку важкого ланцюга людського Ідсе2 або Ідс4, або таку

ІДО1, яка не має АОСС (антитілозалежної клітинно-опосередкованої цитотоксичності) після амінокислотної мутації.

Термін «гуманізоване антитіло», також відомий як «СОК-прищеплене антитіло», відноситься до антитіла, яке створюється за допомогою прищеплення мишачих послідовностей СОК в каркас варіабельної ділянки людського антитіла, а саме, в послідовність іншого типу каркаса людського антитіла ембріонального типу. Гуманізоване антитіло переборює недоліки сильної імунної відповіді, яка індукована химерним антитілом, яке несе в собі велику кількість мишачих білкових компонентів. Такі каркасні послідовності можуть бути отримані з громадської бази даних ДНК, яка включає в себе послідовності генів антитіл ембріонального типу, або опублікованих посилань. Наприклад, послідовності ДНК зародкової лінії людських генів варіабельної ділянки важкого і легсого ланцюга можна знайти в базі даних послідовностей зародкової лінії людини МВазе (доступна на веб-сайті м/млу.тиссре.сот.ас.ик//базе), а також можна знайти в публікації Кабаї, ЕА, еї аїЇ, 1991 бедшиепсез ої Ргоїєїп5 ої Іттипо|одісаї Іпіегеві,

Б єЕЯЙ. В найкращому варіанті реалізації цього винаходу мишачі послідовності СО гуманізованого антитіла до РО-1 обирають із БЕО ІЮ МО: 3, 4, 5, 6, 7, 8. Каркаси варіабельної ділянки людського антитіла були розроблені та обрані таким чином, щоб послідовність ЕК легкого ланцюга варіабельної ділянки легкого ланцюга антитіла була отримана з комбінації послідовності легких ланцюгів зародкової лінії людини ЗКМ1-39 і КА: 5ЕБЕО ІО МО: 14, яка містить ЕКТ, ЕК2 і ЕКЗ ІСКМ 1-39 і ЕК4 дК4; послідовність ЕК важкого ланцюга варіабельної ділянки важкого ланцюга антитіла отримана з комбінації послідовності важких ланцюгів зародкової лінії людини ІЧНМЗ3-7 і УНЄ: ЗЕО ІО МО: 13, яка містить ЕК, ЕК2 і ЕКЗ І9НМ3-7 і ЕК4

УНб. Для того, щоб уникнути зниження активності під час зменшення імуногенності, варіабельну ділянку людського антитіла піддають мінімальній зворотній мутації для підтримання активності.

Термін «антигензв'язуючий фрагмент», який використовується цьому документі, відноситься 60 до фрагмента Раб, фрагмента Раб", фрагмента К(аб)2 з антигензв'язуючою активністю, а також до фрагмента Ем, фрагмента 5Ем, який зв'язується з людським РО-1; що містить одну або більше ділянок СОК антитіл, які описані в цьому винаході, які були обрані з групи, що складається з

ЗЕО ІЮО МО: З до 5ЕО ІЮ МО: 8. Ем-фрагмент являє собою мінімальний фрагмент антитіла, який містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, варіабельну ділянку легкого ланцюга та всі антигензв'язуючі сайти без константної ділянки. Звичайно антитіло Ем додатково містить поліпептидний лінкер між доменами МН і Мі, та здатне утворювати структуру, необхідну для зв'язування антигену. Крім того, різні лінкери можуть бути використані для з'єднання варіабельних ділянок двох антитіл з утворенням поліпептиду, який називається одноланцюговим антитілом або одноланцюговим Ем (5Ем). Термін «зв'язування з РО-1», який використовується цьому документі, значить взаємодію з людським РО-1. Термін «антигенна детермінанта», який використовується цьому документі по цьому винаходу відноситься до розривних тримірних сайтів на антигені, які розпізнаються антитілом або його антигенів'язуючим фрагментом по цьому винаходу.

Термін «АОСС», який використовується цьому документі, тобто «антитілозалежна клітинно- опосередкована цитотоксичність», відноситься до клітин, що експресують Ес-рецептори, які безпосередньо знищують клітини-мішені, вкриті антитілом, за допомогою розпізнавання Ес- сегменту антитіла. АОСС-ефекторна функція антитіла може бути зменшена або усунена через модифікацію сегмента Ес в дб. Модифікація відноситься до мутацій константної ділянки важкого ланцюга антитіла, таким як мутації, обрані з М297А, І 234А, І 235А в Ідс1; химер ІдСс2/4;

Е235Е або мутацій І 234А/Е2З5А в ІдО4.

Термін «гібридний білок», який використовується цьому документі, який описано в цьому винаході, являє собою білковий продукт, отриманий коекспресією двох генів за допомогою технології рекомбінантної ДНК. Рекомбінантний гібридний білок, що складається (із зовнішньоклітинного домену РО-1 та Ес, отримано коекспресією зовнішньоклітинного домену

РО-1 та фрагменту Ес антитіла людини за допомогою технології рекомбінантної ДНК.

Зовнішньоклітиний домен РО-1 відноситься до фрагмента РО-1 за межами цитомембрани, послідовність якого є ділянкою скрайбування 5ЕО ІО МО: 1, яку представлено нижче.

Способи отримання і очищення антитіл та антигензв'язуючих фрагментів, які добре відомі в цій галузі, можна знайти, наприклад, в книзі Апібоду Ехрегітепіа! Тесппоїоду Ссиціде ої Соїа

Зргіпд Нагбог, глава 5-8 і 15. Наприклад, миші можуть бути імунізовані людським РО-1 або його фрагментами, а отримані антитіла можуть бути ренатуровані, очищені та секвеновані з використанням звичайних способів, добре відомих в цій галузі техніки. Антигензв'язуючі фрагменти можуть бути також отримані звичайними способами. Антитіло або антигензв'язуючий фрагмент по цьому винаходу генетично модифікують, щоб ввести один або більше людських каркасних ділянок (ЕК) в СОК, отриманих не від людини. Послідовності ЕК зародкової лінії людини можна отримати з бази даних ІтМипоСепетТіс5 (ІМОСТ) через їх вебсайт пер://Літдї.сіпев її, або із книги Тпе Іттиподіориїйп Расі5ВоокК, 2001І58М012441351. Зокрема, ЕВ легкого ланцюга зародкової лінії для використання в антитілі або антигензв'язуючому фрагменті по цьому винаходу включає АЗ і 02. Зокрема, ЕК важкого ланцюга зародкової лінії для використання в антитілі або антигензв'язуючому фрагменті по цьому винаходу включає УНЗ-21 і

УНЗ-23.

Сконструйоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент по цьому винаходу можуть бути отримані та очищені з використанням звичайних способів. Наприклад, послідовності кКДНК, які кодують важкий ланцюг (5ЕО ІЮО МО: 11) і легкий ланцюг (5ЕО ІЮ МО: 12), можна клонувати і рекомбінувати в експресуючий вектор (55. Експресуючим вектором рекомбінантного імуноглобуліну можна потім стабільно трансфектувати клітини СНО. Як більш рекомендований спосіб, добре відомий в цій галузі техніки, експресія антитіл в клітинах ссавців призводить до гликозилювання, як правило, у висококонсервативному М-кінці ділянки ЕС. Стабільні клони можуть бути отримані шляхом експресії антитіла, яке специфічно зв'язується з людським

РОБКУ. Позитивні клони можна вирощувати в культуральному середовищі, яке не містить сироватку, для продукування антитіл в біореакторах. Культуральне середовище, в якому було секретовано антитіло, можна очищувати звичайними методиками. Наприклад, середовище можна легко вводити в колонку бЗерпагозе ЕЕ, яка заповнена білком А або білком о, врівноважена сумісним буфером. Колонку промивають для видалення компонентів неспецифічного зв'язування. Зв'язане антитіло елюірують градієнтом рнН, і фрагменти антитіл виявляють за допомогою ДСН-ПААГ, а потім об'єднують. Антитіло можна фільтрувати та концентрувати з використанням звичайних методик. Розчинний агрегат та мультимери можна ефективно видаляти з використанням звичайних методик, включаючи гель-фільтрацію або іонний обмін. Отриманий продукт може бути негайно заморожено, наприклад при -70 "С, або він 60 може бути ліофілізований.

Антитіло за цим винаходом являє собою моноклональне антитіло. Моноклональне антитіло або тАБ, при використанні в цьому документі, відноситься до антитіла, яке отримано з одного клону, включаючи, без обмеження, будь-який еукаріотичний, прокаріотичний або фаговий клон.

Моноклональні антитіла та їхні антигензв'язуючі фрагменти можна рекомбінувати, наприклад, за допомогою методик гібридоми, методик рекомбінації, методик фагового дисплею, синтетичних методик (наприклад, СОК-прищеплення) або інших методик, які відомі в цій галузі техніки.

Терміни «введення» та «обробка» по відношенню до тварини, людини, суб'єкта дослідження, клітини, тканини, органу або біологічної рідини відноситься до контактування екзогенного фармацевтичного, терапевтичного, діагностичного засобу або композиції з твариною, людиною, суб'єктом, клітиною, тканиною, органом або біологічною рідиною. Терміни «введення» та «обробка» можуть відноситися, наприклад, до терапевтичних, фармакокінетичних, діагностичних, дослідницьких та експериментальних способів. Обробка клітини включає контактування реагенту з клітиною, а також контактування реагенту з рідиною, причому рідина знаходиться в контакті з клітиною. Терміни «введення» та «обробка» також значить обробку іп міго і ех мімо, наприклад, клітини, за допомогою реагенту, діагностичної, зв'язувальної сполуки або іншою клітиною. «Лікування» по відношенню до людини, ветеринарного або дослідного суб'єкту відноситься до терапевтичного лікування, профілактичним або превентивним заходам для дослідницьких і діагностичних видів використання. «Лікувати» означає вводити терапевтичний засіб, такий як композиція, що містить будь-яку зі зв'язувальних сполук по цьому винаходу, внутрішнє або зовнішнє пацієнту, який має один або більше симптомів захворювання, по відношенню до якого засіб має відому терапевтичну активність. Як правило, засіб вводять в кількості, що ефективна для полегшення одного або більше симптомів захворювання у пацієнта або популяції, яка підлягає лікуванню, або за допомогою індукування регресії або інгібування прогресування такого (-их) симптому (-ів) до будь-якого клінічно вимірюваного ступеню. Кількість терапевтичного засобу, яке є ефективним для полегшення будь-якого конкретного симптому захворювання (яке також називається «терапевтично ефективною кількістю»), може змінюватись в залежності від таких факторів, як стан захворювання, вік і маса тіла пацієнта, а також здатності препарату викликати бажану відповідь у пацієнта. Чи виникає полегшення симптому захворювання можна оцінити за допомогою будь-якого клінічного вимірювання, яке звичайно використовується лікарями або іншими кваліфікованими постачальниками медичних послуг для оцінки ступеня важкості або прогресування цього симптому. Хоча варіант виконання цього винаходу (наприклад, спосіб лікування або виріб) може не бути ефективним для полегшення симптому (-ів) захворювання, яке представляє (-ють) інтерес, у кожного пацієнта, він має полегшувати симптом (-и) цільового захворювання, яке представляє інтерес, у статистично значущої кількості пацієнтів, як визначено будь-яким статистичним тестом, відомим в цій галузі техніки, таким як критерій

Стюденту, критерій хі-квадрат, О-критерій Манна та Уіїтні, критерій Краскела-Уолліса (Н- критерій), критерій Джонкхієра- Герпстра і критерій Вілкоксона. «Консервативні модифікації» або «консервативне заміщення або заміна» відносяться до замін амінокислот в білку на інші амінокислоти з аналогічними характеристиками (наприклад, заряд, розмір бокового ланцюга, гідрофобність/гідрофільність, конформація остову, жорсткість і т. д-) так, що зміни часто можуть бути зроблені без впливу на біологічну активність білку.

Спеціалістам в цій галузі техніки буде зрозуміло, що, в цілому, одиночні амінокислотні заміни в несуттєвих ділянках поліпептиду по суті не змінюють біологічну активність (див., наприклад,

Маїзоп еї а. (1987) Моїіесшаг Віоіоду ої Ше Сепе, Те Вепіатіп/Ситтіпдв Рир. Со., р. 224 (4

Е4Я.)). Крім того, заміщення структурно або функціонально схожими амінокислотами з меншою вірогідністю порушують біологічну активність.

Термін «який складається по суті з» або його варіація при використанні в описі та пунктах формули винаходу вказує на включення будь-яких перерахованих елементів або групи елементів, і необов'язкове включення інших елементів схожої або іншої природи, ніж перераховані елементи, які фактично не змінюють основних або нових властивостей вказаного режиму дозування, способу або композиції. В якості не обмежуючого прикладу, зв'язувальна сполука, яка по суті складається зі згаданої амінокислотної послідовності, може також включати в себе одну або більше амінокислот, які фактично не чинять впливу на властивості зв'язувальної сполуки. «Ефективна кількість» включає в себе кількість, достатню для послаблення або запобігання симптому або ознаки медичного стану. Ефективна кількість також означає кількість, достатню 60 для забезпечення або полегшення поставлення діагнозу. Ефективна кількість для конкретного пацієнта або ветеринарного суб'єкту може змінюватись в залежності від таких факторів, як стан, що піддається лікуванню, загальний стан здоров'я пацієнта, спосіб і доза введення і важкість побічних ефектів. Ефективна кількість може представляти собою максимальну дозу або протокол дозування, що дозволяє уникнути значних побічних ефектів або токсичних ефектів.

Термін «екзогенні» відноситься до речовин, які, в залежності від контексту, виробляються поза організму, клітини або тіла людини. Термін «ендогенні» відноситься до речовин, які, в залежності від контексту, виробляються всередині клітини, організму або тіла людини.

Термін «гомологія» відноситься до схожості послідовностей між двома полінуклеотидними послідовностями або між двома поліпептидами. Коли положення в обох із двох послідовностей, які порівнюються, зайнято однією й тією ж мономерною субодиницею основи або амінокислоти, наприклад, якщо положення в кожній з двох молекул ДНК зайнято аденіном, в такому випадку молекули є гомологічними по цьому положенню. Відсоток гомології між двома послідовностями

Є функцією числа збігающихся або гомологічних положень, спільних для вказаних двох послідовностей, поділених на число положень порівняно із х100. Наприклад, якщо при оптимальному вирівнюванні послідовностей б із 10 положень в двох послідовностях співпадають або є гомологічними, тоді вказані послідовності є на 60 95 гомологічними. Звичайно порівняння проводять в тих випадках, коли дві послідовності при вирівнюванні мають максимальний відсоток гомології.

Вирази «клітина», «клітинна лінія» і «клітинна культура», які використовуються в цьому документі, використовуються взаємозаміно, і всі такі позначення включають потомство. Таким чином, слова «трансформанти» і «трансформовані клітини» включають первинну клітину суб'єкта і отримані з неї культури без урахування кількості переносів. Також слід розуміти, що все потомство може бути не точно ідентично за ДНК, що міститься, внаслідок навмисних або випадкових мутацій. Також включено мутантне потомство, яке має таку ж функцію або біологічну активність, по якій проводили скринінг початкової трансформованої клітини. Із контексту буде ясно, де потрібні чіткі визначення.

Як використовується в цьому документі, «полімеразна ланцюгова реакція» або «ПЦР» відносяться до процедури або способу, в якому мала кількість специфічного фрагменту нуклеїнової кислоти, РНК і/або ДНК ампліфікують, як описано, наприклад, в патенті США Мо 4683195. В цілому, інформація про послідовності від кінців ділянки, яка представляє інтерес, або за її межами, має бути доступною, щоб можна було сконструювати олігонуклеотидні праймери; ці праймери мають бути ідентичними або схожими за послідовностями з відповідним ланцюгам матриці, яка підлягає ампліфікації. 5' кінцеві нуклеотиди двох праймерів можуть бути ідентичними з кінцями речовини, що ампліфікується. ПЦР можна використовувати для ампліфікації специфічних послідовностей РНК, специфічних послідовностей ДНК з повною геномною ДНК, та кДНК, транскрибованою із загальної клітинної РНК, послідовності бактеріофагу або плазміди і т. д. Загальні відомості див. у Миїїйї5 еї аї. (1987) Соїдй бргіпд Нагрог

Зутр. Оцапі. Віої. 51:263; Епісп, ед., (19893 РСК ТЕСНМОГ ОС (5іосКіоп Ргев55, М.М). Як використовується в цьому документі, ПЦР розглядають в якості одного, але не єдиного приклада способу полімеразної реакції нуклеїнової кислоти для ампліфікації тестуємого зразка нуклеїнової кислоти, який включає застосування відомої нуклеїнової кислоти в якості праймеру і полімерази нуклеїнової кислоти для ампліфікації або створення специфічного фрагменту нуклеїнової кислоти.

Терміни «необов'язковий» або «не обов'язково» значать, що наступна подія або ситуація може відбуватись, але не обов'язково, і опис включає в себе випадки, в яких подія або обставина відбувається або не відбувається. Наприклад, «не обов'язково містить 1-3 варіабельні ділянки важкого ланцюга антитіла» значить, що варіабельна ділянка важкого ланцюга антитіла із специфічною послідовністю може бути присутня, але присутня не обов'язково.

Термін «фармацевтична композиція» відноситься до композиції, яка містить суміш одної або більше сполук згідно цього винаходу або їхню фізіологічно/фармацевтично прийнятну сіль, або проліки з іншими хімічними компонентами, а також додаткові компоненти, такі як фізіологічно/фармацевтично прийнятні носії та наповнювачі. Фармацевтична композиція спрямована на сприянню введення в організм, полегшенню абсорбції активного інгредієнту і, таким чином, надання біологічного ефекту.

ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС СУТІ ВИНАХОДУ

Далі цей винахід описано із посиланням на приклади; тим не менш, об'єм цього винаходу не обмежується ними. В прикладах цього винаходу, в яких конкретні умови не описано, експерименти, як правило, проводять в звичайних умовах, як описано в роботі Апііроду 60 Тесппооду І абогаїогу Мапиаї апа Месшіаг СіІопіпд Мапиаї ої Соїд Зргіпд Нагрог або в умовах, які запропоновано виробниками матеріалів або виробів. Якщо джерело реагентів конкретно не вказано, значить реагенти є комерційно доступними поширеними реагентами.

Приклад 1. Отримання антитіла

Було створено мишачі моноклональні антитіла до РО-1 людини. Очищений рекомбінантний гібридний білок, який складається із зовнішньоклітинного домену РО-1 і Ес (РО-1 Ес) (ЗЕОІЮ

МО: 1); або клітини СНО, трансфектовані РО-1 (ЗЕО ІЮ МО: 2) використовували в якості антигену для імунізації мишей лінії ВаІр/С та мишей лінії 5). Людський антиген РО-1 купували в компанії ОКІСЕМЕ, номер за каталогом 53117011, еталонна послідовність МСВІ: ММ 005018.1.

РО-1 Ес, рекомбінантний гібридний білок, який складається із зовнішньоклітинного домену

РО-1 ї с (ЗЕО ІЮО МО: 1): мМОМеУРАО ЕЛ ТАКО СРСВУВІ ОЗРОВ РУ МЕВТЕБРА У УТ ЕСОМАТЕ

Те5Е5МТ5ЕЗЕУї МА Ук МЗРаКО ТОКІ ААБРЕОВЗОРСОПСВЕВУТО РУСІВ

НМ5УУВАКЕУЮО ТУ СССАІЗСАРКАОТКОЗСВАБСВУ СЕК АВУРІАНРУРУРЕ

ВАСОБОТТ УДК ТНТСРАСВАРЕЇ Л.ОСІРЗУТІ ЕРРКРКОТІ МІ5КТРЕУТСУУ УВУ «НЕПРЕУКЕМА КУОСУЕУНМАКТКРЕЕВС Мет УК УВУ У НОТА МОКЕ

УКСКУБМКАЇРАМЕКТІВКАКООРКЕРОМУ ПРЕ ЕСМТКМСУ М ТССУКОВЕ

УВО АУЕЖ ВОМУ КРИВО ЗК УКВ оООоСсМ УС

УМНЕАКНУНУТОКЯ ЗІЗ РОК,

РО-1, клітини, трансфектовані антигеном РО-1 (5ЕО ІО МО: 2):

МОТРОАРУРА КУКА САУ КРОКВ ОЗЕР КЕР ТЕЗРАЦ У У ТЕСОМАТЕЕ

СВЕЗМТБЕЗКУТ МАУ ТЕМУРОМО ТОК А АЕРЕОКЗОРСООСКЕКУ ТОЇ РМОКОЕН

МЗУУКАКАМОВО ПСИ АРКАСКСККАВСЕЕУТЕКВАЄУРТАНРаЯРьРЕР

АСОРТІ У Ус а В МАЖКУАУЮЗКАААВТСАКАТООНАКОНВАХ

ВУЗУ ОЕМ КЕКТРЕВРУ СУТ АПУ МОТ55РАКВОЗАВОР

ЕЗАОРІКРЕПОНСВУ РІ.

Імунізація гібридним білком, який складається із зовнішньоклітинного домену РО-1 ї Ес, ділиться на високу дозу (50 мкг) та низьку дозу (10 мкг) очищеного антигену, для імунізації клітинами СНО, які трансфектовані РО-1, використовують 0,5-1х107 клітин. Імунізацію проводили з повним ад'ювантом Фрейнду на 0, 14 і 35-й день, відповідно; для моніторингу імунної відповіді зразки крові відбирали в ретро-орбітальній ділянці. Мишей з титром імуноглобуліну людини до РО-1 отримували шляхом скринінгу плазми з використанням аналізу

ІФА. На 56-й день мишей з найвищим титром імуноглобуліну людини до РО-1 піддавали бустер- імунізації Через З дні мишей умертвляли і видаляли селезінку для виконання злиття.

Проводили скринінг злиття гібридом та отримували мишаче моноклональне антитіло тАБОО5.

Послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга і послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга мишачого моноклонального антитіла тАБрОО5 є наступними: тАБЮЗнНСУК

БУМІЛ ЕВ У КРОС КСЕСААНИ ТЕЗА ММА УКОТРЕКК ЦЕ УА

ОСАМТУУРОБУКОКЕПАКОМАКУТЕУ ТОМУ К5ЕОТАК У САКОСУУВПО КУ

СНУ ЗзЕСНО МО: 5 пВАрОЗІСУВ

ПюЮМТОБРАВОВАВСЕО У ПТССАЗОПОС ГУ А ОО КРОКОРОССЕТАТе А

ПОС УРУКРБОВСВОС ПЕК САС ГУСТІ ТЕО КО ЕК

ЕС МО;

Послідовності СОК є наступними:

Приклад 2: Скринінг антитіл

Аналіз ІФА зв'язування іп міго антитіла до РО-1:

Антитіло до РО-1 блокує шлях сигналізації РО-1 і його ліганду за допомогою зв'язування із зовнішньоклітиним доменом РО-1. Аналіз ІФА іп мійго використовують для визначення властивостей зв'язування антитіла до РО-1. Ямки 96б-ямкових планшетів покривають біотинільованим гібридним білком, який складається із зовнішньоклітинного домену РО-1 і Ес (РО-1 ЕС), за допомогою зв'язування з нейтралізуючим авідином. Інтенсивність сигналу після додавання антитіла використовують для визначення властивості зв'язування антитіла і РО-1.

Нейтралізуючий авідин (зв'язування з біотином) розводять буфером РВ5 до 1 мкл/мл, додаючи піпеткою в 96-ямковий планшет в кількості 100 мкл/ямка, та залишають на 16 годин - 20 годин при температурі 4 "С. Після видалення буферу РВ5 96- ямковий планшет промивають один раз РВ5Т (рН 7,4, РВ5, який містить 0,05 95 Твін 20), після чого планшет інкубують і блокують на протязі 1 г при кімнатній температурі додаванням 120 мкл/ямка РВЗТ/1 95 молоко.

Після видалення блокуючого розчину планшет промивають буфером РВ5Т з наступним додаванням 1 мкг/мл міченого біотином антитіла РО1-ЕС, яке розводили в РВ5Т/1 95 молоко, та інкубують на протязі 1 г при кімнатній температурі. Після видалення блокуючого розчину планшет З рази промивають буфером РВОТ з наступним додаванням антитіла до РО-1, що досліджується, яке розводили до підходящої концентрації в РВ5Т/1 95 молоко, та інкубують на протязі 1,5 г при кімнатній температурі. Після видалення реакційної системи планшет З рази промивають буфером РВ5Т з наступним додаванням 100 мкл/ямка міченого НЕР. вторинного антимишачого антитіла (Те Часкбзоп ІГарогаїогу), яке розводили в РВ5ЗТ/1 95 молоко, та інкубують на протязі 1 г при кімнатній температурі. Після трьохкратного промивання РВ5 в планшет додають 100 мкл/ямка ТМВ та інкубують на протязі 5-10 хв. при кімнатній температурі.

Потім реакцію припиняють додаванням 100 мкл/ямка 1 М На25О». Значення оптичної щільності при 450 нм зчитують на планшет-рідері МОУОЗІаг; розраховують значення ЕсСозо зв'язування ІФА.

Антитіло, що РО-1 досліджується РО-1 яванського людини макака

Результати продемонстрували, що антитіло тАрО05 показувало надзвичайну активність зв'язування з РО-17с людини (РО-1 людини) і РО-1с яванського макака (РО-1 яванського макака).

Аналіз блокування зв'язування антитіла до РО-1 і ліганду РО-1 іп міо:

На поверхні клітин пухлини РО-І 1 демонструє супресорну дію на проліферацію Т-клітин за допомогою зв'язування з РО-1 на поверхні Т-клітини. Антитіло до РО-1 блокує шлях сигналізації

РО-І1/РО-1 за допомогою зв'язування з РО-1 так, щоб стимулювати проліферацію Т-клітин.

Аналіз блокування зв'язування РО-1/РО-11 використовують для виявлення блокуючої активності антитіла до РО-1 по відношенню до сигнального шляху.

В цьому експерименті 9б-ямочний планшет вкривають білком РО-1 із зовнішньоклітиним доменом, що злитий із ЕС (РО-1-ЕС), та інкубують із досліджуваним антитілом до РО-1; пізніше для інкубування додають мічений біотином РО-І1. Після промивання планшету визначають кількість зв'язаного РО-11, міченого біотином; розраховують значення ІСхо блокування зв'язування антитіла РО-1 і ліганду РО-І 1.

РО-1-ЕС розводять до 1 мкг/мл буфером СВ з рН 9,6 (1,59 г МагСОз і 2,93 г МансСоз розчиняють в 1 л дистильованої води), додають піпеткою в 96-ямковий планшет 100 мкл/ямка і залишають на 16 годин - 20 годин при температурі 4 "С. Після видалення буферу РВ5 96- ямковий планшет промивають один раз РВ5Т (рН 7,4, РВ5, який містить 0,05 95 Твін 20), після чого планшет інкубують і блокують на протязі 1 г. при кімнатній температурі з 120 мкл/ямка

РВЗТ/ 95 молоко. Після видалення блокуючого розчину, планшет промивають один раз буфером РВ5Т з наступним додаванням 90 мкл досліджуваного антитіла до РО-1, яке розводили до підходящої концентрації зразковими розріджувачами (рН 7,4 РВ5, який містить 5 о БСА, 0,05 95 Твін 20), і інкубують на протязі 1 г. при 4 "С. Потім в планшет додають 10-кратні концентрації міченого біотином РО-І11 (Веїййпд 5іпо Віоіодіса! Іпс.) (10 мкг/мл) в кількості 10 мкл/ямка, піддають дії вібрації та змішують за допомогою вібруючої мішалки, і інкубують при 37 "Сб на протязі 1 г. Після видалення реакційної системи планшет 6 разів промивають буфером

РВЗТ 3 наступним додаванням 100 мкл/ямка полімеру стрептавідину-пероксидази, який розводили РВ5Т у співвідношенні 1:400, і інкубують при впливі вібрації 50 хв. при кімнатній температурі. Після промивання РВЗТ 6 разів, в планшет додають 100 мкл/ямка ТМВ і інкубують на протязі 5-10 хв. при кімнатній температурі. Потім реакцію припиняють додаванням 100 мкл/ямка 1 М Не5О». Значення оптичної щільності при 450 нм зчитують на планшет-рідері

Мом зіаг; розраховують значення ІСзо блокування зв'язування РО-1 і ліганду РО-І 1.

Антитіло, що досліджується

Результати продемонстрували, що антитіло тАБбО05 дуже ефективно блокує зв'язування РО- 1 із РО-1.

Приклад 3: Аналіз селективності зв'язування антитіла до РО-1 іп міт

Для визначення специфічної активності зв'язування антитіла до РО-1 з іншими білками родини РО-1, використовують СТІ А4 людини і СО28 людини для аналізів зв'язування. В той же час для аналізів зв'язування також використовували РО-1 миші, щоб визначити різноманітність форм антитіла до РО-1 для різних видів, що відрізняються від людини/мавпи.

Селективно-зв'язуючі білки: РО-1 людини, ЇСО5 людини, СТІ А4 людини, СО28 людини і РО- 1 миші (Веїййпуд 5іпо Віоіодіса! Іпс.), відповідно, розводять до концентрації 1 мкг/мл буфером

РВ5, додають піпеткою в 96-ямковий планшет 100 мкл/ямка та залишають на 16 годин - 20 годин при температурі 4 "С. Після видалення буферу РВ5 96-ямковий планшет промивають один раз РВ5Т (рН 7,4, РВ5, який містить 0,05 95 Твін 20), після чого планшет інкубують і блокують на протязі 1 г. при кімнатній температурі з використанням 120 мкл/'ямка РВЗТ/1 95 молоко. Після видалення блокуючого розчину планшет З рази промивають буфером РВ5Т з наступним додаванням досліджуваного антитіла до РО-1, і інкубують на протязі 1,5 г. при кімнатній температурі. Після видалення реакційної системи планшет З рази промивають РВ5Т з наступним додаванням 100 мкл/ямка міченого НКР вторинного антимишачого антитіла (Те

Уаскзоп І арогайогу), яке розводили в РВ5ОТ/1 95 молоко, і інкубували на протязі 1 г. при кімнатній температурі. Планшет З рази промивають РВ5Т з наступним додаванням 100 мкл/ямка ТМВ і інкубують на протязі 5-10 хв. при кімнатній температурі. Потім реакцію припиняють додаванням 100 мкл/ямка 1 М Не50»х. Значення оптичної щільності при 450 нм зчитують на планшет-рідері

МОМОаг. досліджується людини миші людини людини людини

Результати показали, що антитіло тАБОО5 не демонструє специфічної активності зв'язування с іншими білками родини РО-1. В той же час тАБр не має видової перехресної реактивності проти мишачого РО-1.

Приклад 4: Клітинний аналіз зв'язування антитіла до РО-1 іп міо

ЕАСЗ (клітинний сортувальник з активацією флуоресценції) являє собою спосіб тестування для виявлення взаємодії білків і клітин. Аналіз використовують для виявлення активності зв'язування антитіла до РО-1 з нативним РО-1, що експресується на поверхні клітини. Клітини, які використовуються в аналізі, являли собою клітини СНО з високим рівнем експресії РО-1 (див. Приклад 1, клітини СНО, трансфектовані РО-1 (ЗЕО ІО МО: 2)).

Клітини СНО з високим рівнем експресії експресії РО-1 центрифугують зі швидкістю 1000 об/хв на протязі 5 хвилин, і осад збирають, та суспендують з 10-15 мл попередньо охолодженого проточного буферу для підрахунку клітин. Клітини центрифугують зі швидкістю 1000 об/хв в центрифужних пробірках об'ємом 50 мл на протязі 5 хвилин та збирають. Після видалення надосадової рідини, осад повторно суспендують із попередньо охолодженим блокуючим буфером, із щільністю 0,5-1,0х107 клітин/мл. Після інкубації при 4 "С на протязі 30 хвилин, повторно отриману суспензію додають піпеткою в 96-ямковий планшет в кількості 100 мкл/ямка. 9б-ямковий планшет центрифугують при 1500 об/хв на протязі 5 хвилин, супернатант утилізують. В кожну ямку додають 100 мкл первинного антитіла; клітини ресуспендують та інкубують в темноті на протязі 60 хвилин при 4 "С. Після центрифугування та утилізації супернатанту додають 100 мкл РІТС-міченого вторинного антитіла (ВО Віозсієепсебв), розведеного у співвідношенні 1:400. Клітини ресуспендують та інкубують в темноті на протязі 60 хвилин при 4 "С. Клітини двічі промивають проточним буфером, ресуспендують і фіксують 1 95 параформальдегідом для аналізу проточної цитометрії.

Результати демонструють, що антитіло тАбБО05 також може зв'язуватись з РО-1 на клітинній поверхні.

Приклад 5: Аналіз афінності та кінетики зв'язування іп міїго

Метод Віасоге є визнаним аналізом, який об'єктивно визначає афінність і кінетику взаємодії білків. Автори винаходу проаналізували охарактеризовані афінність та кінетику зв'язування досліджуваного антитіла до РО-1 по цьому винаходу за допомогою аналізу Віасоге (СЕ).

Відповідно до інструкції до набору, яку представлено Віасоге, досліджуване антитіло до РО-1 по цьому винаходу було ковалентно зв'язано з чипом СМ5 (СЕ) з використанням стандартного способу амінного зв'язування. Потім в кожний цикл послідовно загружали ряд градієнтних концентрацій білку РО-1-Ніх (Веїйіпд 5іпо Віоіодіса! Іпс.), який розводили в тому ж буфері. Після цього зразки відновлювали за допомогою відновлюваючого реагенту з набору. Кінетику зв'язування антиген-антитіло відстежували на протязі З хвилин, а кінетику дисоціації відстежували на протязі 10 хвилин. Отримані дані аналізували за допомогою програмного забезпечення ВіАемаінайоп від СЕ з використанням моделі зв'язування 1:1 (Ленгмюра).

Значення Ка (Коп), ка (кої) і КО, визначені за допомогою аналізу, представлено в таблиці нижче. досліджується

Результати показали, що значення Ка зв'язування антитіла тАбОО5 с РО-1 досягло 3,57 НМ.

Приклад 6. Цитологічний аналіз іп міго

На аналіз проліферації свіжих мононуклеарних клітин периферичної крові людини (МКПК) впливає на антитіло, що використовується для виявлення активності антитіла тАроО05 по відношенню до клітин.

Щільність свіжих МКПК доводили до 2х105/мл, висівали в б-ямковий планшет в кількості 2 мл/ямка та інкубували на протязі б годин при 37 "С, 5 95 СО». Після того, як були утилізовані зважені клітин, кожну ямку з адгезивними клітинами змішували з 2 мл середовища КРМІ1640, яке містить 100 нг/мл ЗМ-С5Е (гранулоцитарний колонієстимулюючий біологічний фактор) і 100 нг/мл ІЛ-4, та після інкубації на протязі 2 днів додавали ще 1 мл середовища КРМІ1640, яке містить 100 нг/мл ЗМ-С5Е і 100 нг/мл ІЛ-4, потім клітини безперервно культивували на протязі 2 днів з наступним додаванням в кожну ямку 100 нг/мл ФНІП-«а (фактор некрозу пухлини-о), і культивували на протязі ще 2 днів, щоб отримати зрілі дендритні клітини. Дендритні клітини та алогенні Т-клітини, відповідно, центрифугували та ресуспендували в концентрації 1 х105/мл і 1х105/мл, додавали піпеткою в 9б-ямковий планшет в кількості 100 мкл/ямка з наступним додаванням 20 мкл/ямка антитіл, які розводили РВЗ до різних градієнтів концентрації, і клітини культивували в термостаті при температурі 37 "С, 5 95 СО» на протязі 5 днів. Після цього, відбирали 100 мкл клітинної культури, щоб виявити проліферацію клітин за допомогою люмінесцентного набору для визначення життєздатності клітин СеїЇТПег-СІоФ. Результати, продемонстровані на Фігурі 1, вказують, що тестуєме антитіло до РО-1, тАБрО0О5, може ефективно стимулювати проліферацію мононуклеарних клітин периферичної крові людини зі значенням ЕС50 83 нг/мл. В зразку, що залишився, проводили виявлення секреції цитокіну ІФН- у. Результати, продемонстровані на Фігурі 2, демонструють, що тестуєме антитіло до РО-1, тАрОО5, може стимулювати проліферацію МКІК і в той же час ефективно стимулювати секрецію цитокіну ІФН-у зі значенням ЕС5О 13 нг/мл.

Приклад 7: Гуманізація мишачого антитіла

Із посиланням на послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга (тАбБО05 І СУК, 5ЕО

ІЮО МО: 10) і варіабельної ділянки важкого ланцюга (тАБбБО05 НСМК, 5ЕО ІО МО: 9) антитіла тАБОО5, в базі даних зародкової лінії було обрано гуманізовані матриці, які найкращим чином відповідають їхнім ділянками, що не є СОК. Матриця важкого ланцюга антитіла являє собою

ІзНМ3-7/УНб, яка була обрана для ЕКІ, ЕК2, ЕКЗ легкого ланцюга зародкової лінії людини

ІСКМ1-39 і ЕК4 КА з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 13; матриця важкого ланцюга антитіла являє собою ІОКМ1- 39/)К4, яка була обрана для ЕК1, ЕК2, ЕКЗ легкого ланцюга зародкової лінії людини ІОКМ1-39 і ЕР4 УКаА з послідовністю 5ЗЕО ІЮО МО: 14.

Матриця важкого ланцюга зародкової лінії людини (5ЕО ІЮ МО: 13):

ЕКО МЕЗО ОРОС КГ БСААСВ ТУ КМ Ма М УКОАРОКСЯ ВМ МАМІ

ОЗ УП КСВ КОКАКМЯМА СОМ КАВОТАУ САВАН М

ТБ;

Матриця легкого ланцюга зародкової лінії людини (5ЕО ІЮ МО: 14):

ТОМТОР5К ЗАВУООКУТТСКАО ВУ МАУ ООКРОКАРКІЇ ТУА А В

ОБУ ВЗКЕОоВОаО ІЛ ОРЕБКАТУ УСС К УВІ,

СОК мишачого антитіла прищеплювали до обраної матриці гуманізації, заміщуючи СОК матриці людини, після чого здійснювали рекомбінацію з константною ділянкою 954 з отриманням гуманізованого антитіла НОО5-1. Потім на основі тримірної структури мишачого антитіла, укорінені залишки, залишки безпосередньо взаємодіючі із СОК та залишки, які суттєво впливають на конформацію МІ ї МН, піддавали зворотній мутації для отримання наступних послідовностей гуманізованих антитіл НООБ5-2, НООБ-3 ії НООБ-4.

Експресія антитіл попа не

ЕЕ УОРОИСВ КІ БАС ТБ У ММК УКОАРОКОГБЕЛУ ТАТО

ОССАМТУУРрУУКОСКЕПОКОМАКМЕ М ОМ КАБ ТАУУУСАКО М КО

ОТ ТУТУЗБАЗТКОРЕУЕРІ АРСЗАВТЗЕВТААСОСТІУКОУБРЕРУТУВА МЕ

САБО УНТЕРАМ ОЗ Оаг А вББАУУТУуваа ТК ТУ ТОМУ СНКРеаМТКУТКИ.

УВК УСРРСРРСРАРЕА АСКІРЗУКЕРРКРЕПТІ МІБЕТРЕУТСУ УМО УЗОВОРЕ таке УраУВУНМАКТКРКЕВОВМАТУВУ Б УСТУ НОВА СМОКЕУ ККУ

ЗеУКОГРОУМЧЕКТІВКАКСОРКЕРОУ УТ РРУОБЕМІКМОУ ВТС УКОСУ РУТНАУ

ЕжЕЗКООРЕММ КРУГОЗОРУ ОВО УЗ УМНВЕА,

МН ТОК ОК.

ЗО МО: нос

ПЮМТОБРУБ БАЗУ ЖУ ПТС АЗОТОМ УЗ ОСКРОКАРКІЛЛУТАТВ А

ОСУРЗКЕКИВОВОТОЕТЛІЗЗСОРЕВЕАТ У СООМУЯЧРАТЕОСОСТКУВІККТ УА

АРУУКЕРРЗОВО КОТА ВУ УСІ ЛУК РЕАК УСТА КУВКАГСОВОМВОСВУТЕ

ОВК ПЛІАКАВУВКАНКУХАСЕУ ПОСТ ВРУ ТКЕМКОКС

ЧНІ МО; 12

Послідовність НС гуманізованого антитіла с НООб5-1 з прищепленим мишачим СОК являє собою (5ЕОЇІЮО МО: 11), послідовність І С гуманізованого антитіла являє собою (5ЕО ІЮ МО: 12).

Сайти, які можуть впливати на активність антитіл, піддавали точковим мутаціям, послідовності є наступними: нн пиши шили тили

НоООБ-1 ЗЕОІЮО МО : 11 ЗЕОІЮ МО : 12 ноОБ-2 ЗЕОІЮО МО : 11, 448 ЗЕОІЮ МО : 12 ноООБ-3 ЗЕОІЮО МО : 11 ЗЕОІЮО МО : 12, А435 ноОБ-4 ЗЕОІЮО МО : 11, 448 ЗЕОІЮО МО : 12, А435

КДНК синтезували відповідно до амінокислотних послідовностей легкого ланцюга і важкого ланцюга кожного гуманізованого антитіла (ЗЕО МО 11, 5ЕО МО 12 та їхні варіанти). Після розщеплення кКДНК за допомогою ХпоЇ і Ватні, отримані фрагменти кКДНК вбудовували в експресуючі вектори рсОМАЗ.1 (ІШе Тесппоодіеєє номер за каталогом М790-20) на сайтах рестрикції ВатнНі/Хпої. Експресуючі вектори і реагент для трансфекції РЕЇ (Роїузсіепсев, Іпс. номер за каталогом 23966) використовували для трансфекції клітин НЕК293 (Пе Тесппоїодіе5 номер за каталогом Мо 11625019) у співвідношенні 1:2, і трансфектовані клітини інкубували в термостаті з СО: на протязі 4-5 діб. Експресовані антитіла виділяли центрифугуванням і очищували відповідно до загальноприйнятого способу з отриманням гуманізованих антитіл за цим винаходом.

Приклад 8: Дані об активності гуманізованих антитіл

Гуманізовані антитіла піддавали іп мійго ІФА аналізу зв'язування (спосіб відповідає описаному в Прикладі 2), аналізу блокування зв'язування ліганду (спосіб відповідає описаному в

Прикладі 2) та експерименту з кінетики афінності (спосіб відповідає описаному в Прикладі 5).

Результати приведено в наступній таблиці:

Результати продемонстрували, що гуманізовані антитіла НОО5-1, НООБ5-2, НООБ-3 ї НОО5-4 зберігали активність зв'язування з РО-1, з показниками кінетики афінності КО 2,79, 2,98, 2,45 і 3,89 нМ, відповідно. Одночасно з цим всі гуманізовані антитіла демонстрували ефективність блокуючої активності по відношенню до шляху РО-Ї 1/РО-1.

Приклад 9: Інгібування росту клітин пухлини антитілом до РО-1 1. Матеріали експерименту:

Клітини О87МО (клітини гліоми): купували в банку клітин Китайської академії наук, номер за каталогом ТСНи138;

МКПК (мононуклеарні клітини периферичної крові людини) купували в центрі крові в Шанхаї (Зпапогаї Віоса Сепіег);

СО3: купували в компанії Мінсепуї Віоїес, номер за каталогом 130-093-387;

СО28: купували в компанії Мінепуї Віоїес, номер за каталогом 130-093-375;

Набір для підрахунку клітин Се Соипійпо Кій-8 окупували в компанії ОЛМроО

ГАВОКАТОКІЕЗ5, номер за каталогомСКОо4; тідо (негативний контроль) купували в компанії ЗАМТА СКО2, номер за каталогом 5с6-2025; доза, яка використовується 1660 нг/мл. 2. Способи експерименту: 1) Клітини О87МО культивували в середовищі ЕМЕМ, яке містило 10 95 ЕВ5 і 1 95 Р/5, інкубували в 96-ямковому планшеті в кількості 1х102 клітин на ямку. 2) Антитіло НООБ-1 розводили до різних градієнтів концентрації (як показано на осі абсциси

Фіг 3) з використанням РВ5, додавали в 9б-ямковий планшет в кількості 10 мкл/ямка та інкубували в термостаті при 37"С, 5 95 СО» на протязі 4 годин.

З) Після адгезії клітин в кожну ямку додавали 80 мкл суспензії клітин МКПК зі щільністю клітин 2х107 клітин/ямка і в кожну ямку додавали 10 мкл антитіла СОЗ і антитіла СО28, кінцеві концентрації обох антитіл СОЗ і 028 склали 500 нг/мл. 4) Після 72 годин інкубації в термостаті при 37"С, 5 95 СО» в кожну ямку для розвитку додавали 10 мкл ССК8. Через 2 години визначали 00450. 3. Результати:

Результат продемонстровано на Фігурі 3; порівняно із тідс (негативний контроль) різні концентрації антитіла до РО-1 (НО0Б-1) виявляли значну інгібуючю дію на ріст клітин О87МЄ, і ступінь інгібування за найвищої концентрації складала близько 30 95.

Приклад 10: Активність НОО5-1 у відношенні проліферації стимульованих туберкуліном

МКК

Визначали активність гуманізованого антитіла НОО5-1 по відношенню до проліферації стимульованих туберкуліном МКПК /л уйго.

До 15 мл свіжих МКПК, близько 3х10" клітин, додавали 20 мкл туберкуліну (Зпапопаї ВімМои

Віотесппоіоду, номер за каталогом 97-8800), і суміш інкубували в термостаті на протязі 5 днів при температурі 37 "С, 5 95 СО». На 6-й день культивовані клітини центрифугували та ресуспендували в свіжому середовищі та доводили щільність до 5х105 клітин/мл. 190 мкл ресуспендованих клітин висівали в кожну ямку 96-ямкового планшету. Гуманізоване антитіло

НООБ-1 додавали у відповідні ямки 9б-ямкового планшету в кількості 10 мкл/ямка. До контрольної групи та пустої групи додавали 10 мкл РВ5. Планшет для культивування клітин інкубували в термостаті при 37 "С, 5 95 СО», а через 72 годин визначали проліферацію МКПК (Рготеда, номер за каталогом 57571) та секрецію ІФН-у (Мео Віозсіепсе, номер за каталогом

ЕНС1029). Отримали наступні результати:

Активуючий вплив досліджуваного зразка на проліферацію стимульованих туберкуліном

МКПК та секрецію ІФН-у

Примітка: п - 4

Результати експерименту продемонстрували, що гуманізоване антитіло НО0О5-1 добре активує стимульовану екзогенним туберкуліном проліферацію МКПК і секрецію ІФН-у.

Приклад 11: Інгібування підшкірно прищепленої пухлини О-87МО антитілом НООБ-1 100 мкл клітин 087 (5х105 клітин) прищеплювали підшкірно в правому підребер'ї мишам лінії

ЗСІО-Веїде. Після того як через 7-10 днів пухлина виростала до 80-100 мм", мишей лінії БСІЮ-

Веїде за виключенням тих, які мали занадто велику або занадто малу масу тіла або пухлини, випадковим чином розподілювали в групу, якій вводили НООБ5Б-1 в дозі 10 мг/кг, і в групу, якій вводили дО людини в дозі 10 мг/кг в залежності від об'єму пухлини, причому кожна група складалась із семі мишей (00). Два типа МКПК, стимульованих антитілом до СОЗ на протязі З діб, змішували у співвідношенні 1:11, і вводили за допомогою ін'єкції в тканини пухлини в концентрації 5х105 клітин/бО мкл, в той же час підшкірно вводили ін'єкцію досліджуваного антитіла, один раз в 7 днів, всього З дози. Два рази на тиждень у мишей вимірювали об'єм пухлини і зважували їх. Дані реєстрували. Об'єм пухлини (М) розраховували як: М - 1/2ха х Б2, де а і б відповідно являють собою довжину та ширину.

Результати, продемонстровані на Фігурі 4: зміна об'єму пухлини після лікування, і на Фігурі 5: змінення маси тіла мишей після лікування, вказують, що антитіло НОО5-1 добре інгібує ріст пухлини О87МО і не впливає на масу тіла мишей.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«110» ШАНХАЙ ХЕНЖУЙ ФАРМАСЬЮТІКАЛ ОКО., ЛІД, цЦЗяЯНСУ ХЕНЖУЙ МЕДСІН КО., ТД. «-Т80з АНТИТІЛО ДО вх, його ВНТИГЕНЗВ'ЯЗУЮЧИЙ ФРАГМЕНТ тА їЇХНЕ МЕДИЧНЕ викКОоРИСТАННЯ «і130»5 740033сВст «50» вест/счоо14и5 050 «1515 5014-11-14 тах М 01310681 942.6 «1515 2013-19-14 «ів» 14 «170з Басепств усві 3.3 «гі» 1 «211 359 «гір» Білок «95132 Штучна послідовність «ех «ві» рекомбінантний химерний білок, Який складається із зовнішньоклітиннего домену 2П-Н1 1 Ес «ай її

Меї дДяр Мек Ага Чаї ко А1а біп Гей Бей біу Бей беч Пвш Бей Тго 1 З 10 15

Рпе Бо біу зех Ах був Рхо біу Тур Рпе цей АврозЗех Рко АзроАгу о 28 з

Ркс Тер Авй РЕо Рко ТЕ Рбе бек рхто Аза їм цей) Уві Майї тах сів о 45 ку Ар Авгп о Аза Тв вве Так о Сух бек Ре бек дзп о ТВ Беж сій БЕ 5О У ва ввесовь пе вот Тр Тук дго Меє дежш Руо Бех Ази обі ТВ АвороБув 85 хо: 75 во тез Аза Аїд Бпе о бго сто АБр ока бегозів рео біу с1із Азов Сув АКа я 96 5

Бе душ аї Тахо бів Бех Рхго Аяп сіу Ака4 Азр оре Ні Мес беж баї 159 ща 110 7аї Вжц вів Акш Ака Ап о Азробес спіу Так Тук Бей Сув б1іу Ава Т18

115 129 125

Бек їв о АТа РІО Пув Аза біп Т1іє пув біц Бек Бех Ач Аза ЗБи Бец 139: 135 ай дкч уві Тве бів Аку дк Аїа біло оуаї Рсо Те о віа Нівз Бо Бех вго

Бо 155 160 ек Ркго Дка Ро Аіа сі бій виє біб Тбк опе Уві Аве пу Твпх НІВ 165 170 ї75

ТУ Суз Ркосрго Сув Рко діа Рхо бій реп пе бі біу Бро Бек уві 180 185 ї950 вле їви Ва рго Рго Туз Рго ув АвротТнх Бей Мехї тї1іе бек ро ТЕ 195 205 205 ' рго сів Маї ТВу Суз Мді уаї Ууді вро Уді бЗех Нів білі Азрорко б10 хай 215 220

Уаї цув Рбе АзпоТтр Тук Уаї Авр б1іу Уаю бій Уаї Нів Авподіз Був иа 230 238 "40

Твж цуз ро ака Сів бір біп Тук Аво ЯекотвЕ Тук Ага Ма1ї Маї бек 245 250 255 уаї Без Твг Уаі Тео Нів бів АвроТкро оба Авпобіу Був бій Тук був 250 265 270 суа був Уві дех а8й Пуз дів цей ке Ата вКкОо тів Бін пуб Твх їТ4е 278 2850 2я5

Зех Пуз АтТа Ту Бім біп Бгто Аке біз Рко бій уаї Тут Теж Тє) ро 390. 295 зов

Бус бек Ага Сі бій Мес ТВ опув Авп обіп уаї бех пе ТвгоСув їез : 305 ЗІ0 315 за

Уаї Пуз 5іУ Бпе тТук Рхо Беж Аво Ті Аза Уві бій Тв Бій Бек Авп

ЗЕ 339 335 атТУу сСіп ро бім Ав одер Тукоцув ТвВр о Твю Бо ко Ма Пец Авр Бех зЗ80 зау ав

Ав піу Бет Ре Бе їеац отух чех Му це Тв Уві Авропує Бех АТО 355 З5о 365 ткр бів Сіп сСіу Азп оУаї пе бег о Суз Зак Маї Межє Нів піп АТа Бей вто 375 зо

Нів АБпоНів ТтТук Твх бій був бЗеї цей бек пес Зек Рко сіу Був з85 зо 395 «210х 2 «-1ї2» 288 «І» Білою «5135 Ното зарьепе «00 :

Меб сів 11е Его сій Аза Рхо ТКроРго Уві Уаї Ттр о Аїа Уаії рей біп ї 5 18 15 пез біу Тхр Ах Рхо сРТу Тер вле Бе АБр Бех рго Ар АКЯ Рго тТкр о 29 30 дей Рко Рто ТБжЖ Впе Бек Ркбо Аїа Без Пец Уві уаї тих біз С1у Авр

Авповіа тТвж о бпе Трк Суз Бетг Рпе Зек Авп Ту Бех ЗІ Бек Рбе Уві бо

Бао о Аєп Тер отТух Ак Меб бек Рго беж Ап СІЙ Ток АввоБув Бей Аа.

БО о 7ї 80 діа Бпе бко 510 Авр о Ако бер біп Рко біу бів Авр Суб Ак Рбе Ах 85 зо 3 чаї тах бій цей Руб Авп о біу Ахп Аве о РНе нів Меб Зех Уві Уа! дкФ 10о 105 110 дів Акч Аха Аза оАвр обег Сіу Тв Тух бе Сув сіу Аїз її бек їв 115 120 Би

Аїа вко був Аїа бів їїфе був с) бек ей о Агу Діа бі) пей дз Уві їза 135 140

Тве біз Ага дгч4 Ат о Зійх Уді Рко Тих АБа Ні реко Бех Ркб бах РКО лах 155 155 149 йкЧ о Рхо Аїв біу біп вВре біп ТАЄ їм Ууяї Уа) біу Уаї Маї біу щу 1855 ї7а 175 цем їй 51у бек цев Уді їецй Пец уаї ТЕр Уві Пес Аза Уаї Т1їе Сузв 150 185 180

Зеї Акху Аза Аза Акз сіу Тах 116 бБіу Аза Аж АХУ ТвЕ с1іу сів Вго 155 205 205 їей груз бій двр ро бек А1а Уві Ркго Ха) Впе бет Узі Дер Тук 51у 210 215 га

О5ів беч дер овне бІв Тер Агу біб був ТВх о бто біз Бро вро Маї во 225 230 235 тла

Су Уві Рхб сі бій Тв Обі Ту Аза ах Іе уві Ре Бко Вехг сіх 245 250 258 меє біу Тнг беж лег Его Аїз аку Ако сіу Бех Аїа АБробіу Ро АФ 255 270 ес вів бій Рхо Пе Ака РКО біб Авв сту нія Сув бек ТкЕр Рхо цей 275 280 285 «шій» З «11» У «рї2з Білок «ІЗ Ми шивсчдмаз НС «4005 з

Зек Тук Меб Мек Бег

І З

«210» 4 «95115 17 «8125 Білок кРІ13» Мив шивсиїов НСОВО «00» 4

Тих Те век сі1іу біу сіу Аїа Авт Тбх Тут Тук Рго Аврозет Уаї Дух ї З 19 15 щу «вій» 5 «81їЇ7 7 «2122 Білок «2135 Моб авіа НОВО «А0О» 5 сій без отТух Лур Бре Авротух 1 Е, і З «05 б «вії» 1ї «1 Білок «913» Мов тичсцпійв БСОВІ «4005. 6

Бей Атїа бак осів тн ї1е бі ТВх Тр опеч Те 1 5 16 «іх 7 «211 7 «її» відоє «215» Ми «пивопіча Ср «00 7

Те Аза Те бегоїво Атїа Аво 1 З «вій» 8 «211 З «вії» Білок «2135 Ми шовсаїцв БОВАЗ «Аз 8 сіп бБіп чаї Ту Бет г1е Рхо Ткротнх ї В «2105 8 «11» 116 «812» Білов «і3З» Мив вжовсит ав. ун «-400х 8 ста уві Мебє рез хаї сі ее сіу біу біу Бей уаі був о рго бБіу 61у

Її 5 Бо 15

Бет Бей уз цем Бек Суз дів Аїа бехг біу Рне Фпк Рів бек Вер Тук

Ме Меб нех ТЕр чаї дхоа Бій Ттпх РКО біз Був Аєд пев Зі Тхр хмаї

Аіа Тк Тіє Бех сіу Су бі Авфа АвпотТвАК Тук ТУКХ РКО Ав» Зех Уді

БО 58 60

Був бі Ах Рпе Твх т1е бек Ака4 Авр Ап АТа Був Ави ТВе Пец Тух

55 То 7 бо

Тен бБіп Мес бек бЗех Меп Ака Бек біч Ар ТПх Аїа Гей Тух Тук Су ва а З5

Аїа дк біп Бей Тук о тТук Ре Авр отут Тур 01у бів б1у Тс ТБ о Гцец ї0о 125 110 тах чаї бБеї Вех 115 «ві0» 10 «рі1ї2 107 «12» БіножК «5135 Ми ящвсиіся У «або» та

Аврог1їе біп Мес Тпх біп дес Ркго біз бек б3)п бек Аза бек ївєц б1у 1 5 10 15 біз ссьу чаї тТвжх ті твЕ Суз без Ата Зек ої ТВкЕ Тіз біу ТАК ТЕр 80 85 зо їви ТВк Тжр Тук бід біп пуз Рго б1у був бек Рко біп Гей цец І1е

Тук рик Аїа Тк бек їі діа Авросту Уаі Рео бек АК Ре бек біх ви

Бех бі Бех Чд1У Тих Гуз Рпе беє Ре Був Ті бек Бек Сей біп Аїд шза То 75 по сів Авю Ре Маії Так Тук Тук Сув біп біл уві тує век ІТ Еко тЕр 85 ЗО ЗВ

Тк ЕБе о біу пі СіуУ ТЕ Пув Бецозьи Тів Був 750 То5 «20 1 «21ї» 443 чса122 Білок «ФІ Швучна посдідовність «ЗИ» «рога» послідовність важкого ланцюга гуманізованого антитіла нОайБ-1 «дп» 11 сія таї біп рец уві січ Зак біу 01у піу пецй уві біп ро сту СБУ ке З То 15

Зех ви дя Без Зек о Сув Аїа діа бек Б1у Рре ТІ Бпесзек бек Тук 28 25 30

Меє Мес бет ТкЕр уаї дго біп Аза рко біу пуз б1у ем бів ЖТЖБ Чаї

Аіїа с тнк їїе Бек обі» б1іу сту Аїа Ави тп Туг Тук Бо АвроЗет Уаї 0

Був'сі»» Ак Ре ТрБж Ті ак Аку Акр о дяй Аїа пу Азпобек бен Тук 63 70 75 о пе осів Меї Авзп овес йо Ага Аїа сі двротвс діа Уаі тує Тук Сув 85 чо 5 віз Ак бів бей тТук Тує Пе Авр Тук ТЕР бі бій біху ТЕ тах Маї 100 105 ТЕЗ

ТВх Уаї Бех Бек діа бек Тк Був сіу Рко вк оуаї Ре Рко ев Аа 115 120 тая

Рко Сув Зек АДЕЧ бєт Тк бех біо бек ТЕ Аіа Аїа Бей зт Суб Гей 136 135 їі

Уаї зу во тук Рпя вжо бі вко тах тик уві Бех ТтТкр Ав вах Ту

ХАВ дво ї55 ії60

Аїа їйео Твху Зетх бі Уві Нів Так бле Бо Віз баї Беб зіп беб бек 155 170 175 зіУу цей тує бек Бей Зех беї Уаії ба! Тк Маї Рго Бер бер Бек гей 189 185 1585 бі тик цу тТВЇї Ту тТвпгосСув Ав УаІ Аво нів Бу о рРко Бех АщА ТвхЕ 155 200 ща

Був Уаї Ар ув Акт чаї 1 Бек Буз Тух біу Ро Рко Сув бго Рго 21 2 У ве

Сув вго Аіа Ро бій діа Аа бі1у б1іу Ро Бех Ууаї ВВе пбем рРбЄ вхо 225 хо 235 240

Бкго Був Вго Бу Авю Тпс пе Меї Ті беє дку ТпЕх Рто біб Уві ТЕ 545 250 258

Сув Уві Уаї Мазі Авр Уві Бех біп біз авр РІО бра Уві біб Рпе Авт ай 268 р!

Тхр Тук Маї Авр біу Уві ЗІ Уаї Нів Авп АтТа Пув ТБ Був РКО Аг 2-15 28о 285 сі бі іп ре Ав баг Тр Тук Ако Уаї баї бек т7аї о Тец твг Уві я 235 жю пес нія біп АвротТкЕр бе) Авпобіу пуб с10 Ту Був бує Пуз Уді ех 305 Зо 315 зга

Азпопуз бьу цей ро бек бЗеу ті СР Був Тахо тів баб Був Аїва Буя

БЕ 330 335

Сі сів Рхо Аку бра рго біп Уаїі Тух ТЕ Бей вхо Рко Бех біг со 340 за5 350 сі) мес тт пу Аза бтй Ууаї Бек Бей ТБЕ був Пей уаї руз боту ра 355 369 365

Тук Ржхо Бек Аво» Іїе Аза Уді січ Тур и сів бех Авл сіу їв вго біс 375 50

Ави Авпотук Був так ТЕ РЕб БКо Уві Бей Авр о бех Авр біу Бек РНе 385 380 395 405 вце їец Туг бек дха Без ТВху Уа1ї Азр о Був дес Аку Ттр о біп бін бі 495 40 415

Ази маї Ре бесг Суб Зек Уаі Мес Нів БО Аїа Бей Нів Азпонів Ту «20 Аг азо

ТЕ Біп Гув Бех Іец; бек Пец Бех пеп зву Був 435 40 «210 19 «вїї» 914 «812» БІЛОК «іЗ» «Штучна послідовність «вах «215 послідовність легкоро ланцюга гуманізованого антитіла Н005-1 «Я09» її?

АБр о І1іє біп Меб ТВі сій бек орРхо бек Зеж тей баб Азїа беї Уаі сі ї 5 ї0 15 Ввр Акф Маї Тпх Ії1їе ТБх Сув Ге діа бек біп ТВ т11є біу ТЕ Тер о 25 Зо їв; Тахо Тор отТую біп бів був рко б1іу в АХМа рРЕо Пув Бей цей ІЩЕ з5 40 45

Тух так Аїа Тк Бек йео Аза АвроБіу Уві Еко бег АдкЯ пе бек п1у ви веж віУ Зек б5іУу ТНЖ Авр Ре ТНК Пей ТНЕ Тїє Бес деї Гей біп РКО 5 76 75 о біш Авр Ре Аїа Тих Тух Тук Суб Бій сій МЗаї Тує бек Іі РКО тТЕр 85 | Зо З5

Тк овпе о стіу біу біу Тржх Пув Маії З2й тів Пує ка Тс Уві Аїз АтТа 100 105 19

Бко Бек Чаї Бпе Ті Ррпе Рко Рко бек соАвро бій біп Гей пув Бек СТУ 115 129 128

ТЕ Аїа Зет Уаї Заї Сув Бей рей Авп Депо Рпе Тук рос АЖжа біль АТа 130 135 4 був уа1ї біп тер уз Уві Ар одяп діа без сій бак обіу деп бек ій 145 | 159 155 160 сі Бек Уві Тих бій 0105 Ар бек пу дБр о Зес Тік туї Бек ем бех 155 179 175

Беї ТВх ПОви ТЕ Беп обЗех Був Аіа Ар отТУК Сію Був Ні Був Уві тує тво 85 ї90

Аза Сув СОТ маї Тих ніз 5Бійп біУ БПеюв бек Зак Рро Уаії Тк Пув век 195 за 295

Епе дви Агу бі біб сСув 210 «210з 13 «2112 105 «17 Бідок «її» Штучна послідовність «а»

«гав послідовність каркаснеї ділянки важкого ланцюга руманізованога антитіна «8ПОох ІЗ іп ві біз рей Уві бЗіц пек сіу сЗвфу ві пес Мі 5іп о рко біу б15 1 5 10 15 пек бен АкЯа цей бех Суя АтТа АтТа дек біу Ре тТБр Ре бек беу тує 20 25 30

Тур Мек Зеж Тер Маї Аку сій Аіз Рто су Був б1у ем сі Тхо хУаї 35 45 45 кіз Азп о їіїе пуб сбіп Авросі1у Век БК Пув Тух Тук уаї дер бек Уві за за о пув віу АкЯа Бе ТК тТіє 5ет Аку Авб Аюєп Вів ув Ап обех Бей тТук т7а т8 ва

Пец Бій Мег Ава бек Тен АкУ Аїа СІ Азр о Твх Аза баї Тук Тук Сув 85 0 95

Аіа дка Тур обіу бій бЕу Тпх тп Уаі ткит о уа)ї Бек Бех 100 105 «вій» 14 «511» 95 «219 Білок «2і3» Штучна послідовність «220 кагаж паслідовність каркасної ділянки легкого планцюта гуманізованого автитіла «00» 14

Азр їіе сбіп мес тп біз бек рко бек Бек Пец обеж Аїа бЗех Уві сіу ї 5 10 15

Авр Ага чаї ТИпжх ї1е ТП Сув с йхе Аза обБет біп Зек тів бек Баб жує 2 25 30 пцец Ав Тер отТук сів зій Пув Бго 01у цу Ата го був Пей Шец ГТ 35 40 45

Тух А1а Віа бек Ве їец біз бех бі баї Рко Зех Агу Ре бек 51У 5О 55 Ге: пек біу Бек піу ТВ о АвроРпе Ту Бей ТП Т16 беж беж цей біп вка І

Ба 7о 75 о

Сім дз вве діа ТВЕ Вук Тук Сув Рпе сіу сіу біу ТВх йув Уаї ста 5 за

ТТ рух

М

Claims (18)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Антитіло до РО-1, або його антигензв'язуючий фрагмент, яке містить: варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить І СОВА, І СОВ2 та І СОВЗ, які представлені в: ЗЕОІЮ МО: 6, 5ЕО ІО МО: 7 і 5ЕО ІО МО: 8, відповідно; і варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить НСОВІ, НСОВ2 та НСОНЗ, які представлені в: БЕОІЮ МО: 3, 5ЕО ІО МО: 4 ії 5ЕО ІО МО: 5, відповідно.

2. Антитіло до РО-1, або його антигензв'язуючий фрагмент, за п. 1, яке відрізняється тим, що вказане антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, являє собою мишаче антитіло або його фрагмент.

3. Антитіло до РО-1, або його антигензв'язуючий фрагмент, за п. 1, яке відрізняється тим, що вказане антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, являє собою химерне антитіло або його фрагмент.

4. Антитіло до РО-1, або його антигензв'язуючий фрагмент, за п. 3, яке відрізняється тим, що послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга химерного антитіла являє собою 5ЕО ІЮ МО: 10.

5. Антитіло до РО-1, або його антигензв'язуючий фрагмент, за п. 3, яке відрізняється тим, що послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга химерного антитіла являє собою 5ЕО ІЮ МО: 9.

6. Антитіло до РО-1, або його антигензв'язуючий фрагмент, за п. 1, яке відрізняється тим, що вказане антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, являє собою гуманізоване антитіло або його фрагмент.

7. Антитіло до РО-1, або його антигензв'язуючий фрагмент, за п. 6, яке відрізняється, що послідовність РЕАК легкого ланцюга варіабельної ділянки легкого ланцюга гуманізованого антитіла була отримана із комбінації послідовності легких ланцюгів зародкової лінії людини ІСКМ1-39 ї УК4, які представлено в 5ЕО ІЮО МО: 14, які містять ЕН, ЕН2 і ЕВЗ ІСКМ 1-39 і ЕВН4 ка.

8. Антитіло до РО-1, або його антигензв'язуючий фрагмент, за п. 6, яке відрізняється тим, що послідовність легкого ланцюга гуманізованого антитіла являє собою послідовність, яку представлено в 5ЕО ІЮО МО: 12, або її варіант; причому вказаний варіант переважно містить амінокислотну мутацію 0-10 у варіабельній ділянці легкого ланцюга, більш переважно А435.

9. Антитіло до РО-1, або його антигензв'язуючий фрагмент, за п. 6, яке відрізняється тим, що варіабельна ділянка важкого ланцюга гуманізованого антитіла додатково містить ЕК важкого ланцюга людських Іда1, дае, ІдаЗ або Ідс4, або їхній варіант, переважно ЕВ важкого ланцюга людського Іда2 або Ідаа.

10. Антитіло до РО-1, або його антигензв'язуючий Фрагмент, за п. 6, яке відрізняється тим, що послідовність ЕВ важкого ланцюга варіабельної ділянки важкого ланцюга гуманізованого антитіла отримана із комбінації послідовності важких ланцюгів зародкової лінії людини ІДНМЗ-7 і УНВб, які представлено в 5ЕО ІО МО: 13, які містять ЕВ, ЕВ2 ії ЕВЗ ІаНМЗ3-7 і ЕНА УНб.

11. Антитіло до РО-1, або його антигензв'язуючий фрагмент, за п. 6, яке відрізняється тим, що послідовність важкого ланцюга гуманізованого антитіла являє собою послідовність, яку представлено в 5ЕО ІО МО: 11, або її варіант; причому вказаний варіант переважно містить амінокислотну мутацію 0-10 у варіабельній ділянці важкого ланцюга, більш переважно с44В.

12. Молекула ДНК, яка кодує антитіло за будь-яким з пп. 1-11.

13. Експресуючий вектор, який містить молекулу ДНК за п. 12.

14. Клітина-хазяїн, яку трансформовано експресуючим вектором за п. 13.

15. Клітина-хазяїн за п. 14, яка відрізняється тим, що клітина-хазяїн являє собою бактерію, переважно Е. соїї.

16. Клітина-хазяїн за п. 14, яка відрізняється тим, що клітина-хазяїн являє собою дріжджі, переважно Ріспіа разіюогів.

17. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло до РО-1, або антигензв'язуючий фрагмент, за будь-яким із пп. 1-11 і фармацевтично прийнятний наповнювач, розріджувач або носій.

18. Застосування антитіла до РО-1, або антигензв'язуючого фрагмента, за будь-яким із пп. 1-11 і фармацевтичної композиції за п. 17 при отриманні лікарського засобу для лікування захворювання або розладу, опосередкованого РО-1, причому вказане захворювання або розлад переважно являє собою рак, більш переважно рак, який експресує РО-І11, найбільш переважно рак молочної залози, рак легені, рак шлунка, рак кишечнику, рак нирки, меланому і недрібноклітинний рак легені, і найбільш переважно недрібноклітинний рак легені, меланому і рак нирки. - 500000

2 в. -- 450000 7 го) і ш Ж 000004 т т / З зво я - 4 - 0 2 4 6 ІодгтАводєунгімл Фіг, 1 тАвОО5 ж МО КО і Е 750 Зх то 500 . і Ї а С 0" 0 «8 «а 0 и. 4 б ІодітаАвоюєунгіми

Фіг. 2

. жу.

Ї ї АД і: проліферації ОВ МО ' АН: че І. ми мк сеямт яка» ї ти в аж Ж шк ч рижях на.

Й аа реайжию как От вве З " "или реч чке й вемта Ес єхне Й " Дня жан Ж зей веж "ЖД вища ї Ех риких я зв витна ин ке й -мкни зктжсж В пк кий Й коти ДИН "зак жиккт ж х Й Ї. с я иа "з дк я я ї у зн й рози є ГУ 5 - З : соя вою - мальли и яогжх жене зи В Ки» З жокюою в ами ей . и В скл якіх в Кл кК ук й с кйки гак сах гкачи у затв я мають в ша милих ще РЕ і хх м ВА хай ит ЗИНИХ юки ти Е ЖИЛА 1 хати якій сівктє чий какхиу пе , п й УМ. кл Шетияч й хви ких. лили "зни інь жк жав Й сяк й повсютюм жила пктля ів» я якіх ши, Май. вевви й вки жа зожне й Я Ще лає І-БЕ Що точ ме ік Шегині Жахи» "ва: СОДИ ак и ШИ ей і дя житя рт ї син я повені БЕ ЯУ І А В. ук жсвассж печі 0 башт Е сла ек Я, І аз й и ; г ду й ой са я Фе Фе х к Бхя пк А і о (нг/мл) Фі й ГУ

БО "КО ЦДТ я МПК Я НОО5 - 110. може КУ з 500 КТ ЯМКЛ МОЄ жі в 400 / але / 0 ле ії г 2 і / о ; 5 /й ч Я ре0,0524 порівняно із наповнювачем Ф НЕ І ? Те! Ї. два серій о 0 то 20 Ку Час (день)

Фіг. 4 Зо

-- ЦБ? Я МИКИ НОВО мкг о 04 я ОТ МОКЛ еВ 0 мое їз й ве Ше. ї с о м т а Ше 18 ши -- ' о і 20 чо Час (день)

Фіг. 5