CN112285352A - 一种抗pd-1单克隆抗体的生物活性测定方法 - Google Patents

一种抗pd-1单克隆抗体的生物活性测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种抗PD‑1单克隆抗体的生物活性测定方法，该方法包括封闭、洗板、孵育、读板和数据处理，通过考察抗PD‑1单克隆抗体抑制PD‑L1与表达PD‑1的CHO‑S细胞株的结合来检测其生物学活性。该方法操作简单，专属性强，精密度和准确度高，线性好，对于抗PD‑1单克隆抗体的质量控制和临床应用具有重要意义。

Description

一种抗PD-1单克隆抗体的生物活性测定方法
技术领域：
本发明涉及生物药物活性检测领域，具体涉及一种抗PD-1单克隆抗体的生物活性测定方 法。
背景技术：
程序性死亡受体-1(programmed death-1,PD-1)和程序性死亡配体-1(programmed death ligand-1,PD-L1)是一对免疫共抑制分子。PD-1/PD-L1信号通路与肿瘤和病毒的免疫逃逸密 切相关，以PD-1/PD-L1为靶点的药物重新激活了机体自身的抗肿瘤免疫并且在多种肿瘤中取 得了良好而持久的疗效，具有很好的应用前景。
PD-1是一种免疫共抑制分子，属于CD28家族成员，由268个氨基酸组成，属于Ⅰ型跨膜蛋白，包含1个IgV样区、1个IsC样区、1个跨膜疏水区和1个由30个氨基酸组成的胞 内区。PD-1主要表达在T细胞、B细胞、NK细胞及多种肿瘤细胞的膜表面。PD-1有2个配 体，即PD-L1和PD-L2，属于B7家族的跨膜分子。PD-L1是由290个氨基酸亚基组成的跨 膜蛋白，胞外段为两个免疫球蛋白恒定区(IgC)和IgV样结构域，主要表达于成熟的CD4+T 细胞、CD8+T细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞、树突状细胞等造血细胞，且在多种肿瘤 细胞均高表达PD-L1分子。PD-L2是由274个氨基酸残基组成的跨膜蛋白，与PD-L1有很高 的相似性，但两者也具有一定的差异，如PD-L2的体内组织分布具有局限性，只在巨噬细胞、 树突状细胞和一些B细胞亚类的膜表面表达。
PD-1/PD-L1信号通路在T细胞免疫过程中起重要作用。T细胞在静息状态下低表达PD-1， 而激活则引起PD-1的表达上调。PD-1作为一种抑制共受体，与PD-L1相互作用后能够抑制 T细胞的活性，使细胞阻滞在G0/G1期，从而抑制T细胞的增殖，阻碍其分化为浆细胞，并 诱导T细胞的凋亡。这样就避免了T细胞的无限增殖，使其维持动态平衡。这种PD-1/PD-L1 信号通路参与的T细胞负反馈调节作用对抗原的清除以及对维持机体的平衡起到至关重要 的作用。
PD-1/PD-L1作为负性共刺激分子，其高表达可见于多种肿瘤，如黑素瘤、非小细胞肺癌、 卵巢癌、肾细胞癌等。在肿瘤发生时，肿瘤细胞表面PD-L1与T细胞表面的PD-1受体相互 作用，能够抑制T细胞的免疫应答，发生肿瘤免疫逃逸。抗PD-1单克隆抗体通过与PD-1的结合，阻断PD-1/PD-L1信号通路，从而恢复T细胞功能。目前，在肿瘤治疗中，抗PD-1 或抗PD-L1单克隆抗体药物的研制已成为热点。由此可见，提供一种方法来检测抗PD-1、 PD-L1单克隆抗体的生物活性是非常必要的。
生产抗PD-1单克隆抗体，对其生物活性的检测则是一项必不可少的工作。因此，本发明 提供了一种抗PD-1单克隆抗体的生物活性测定方法，该方法是根据可溶性的PD-L1与细胞 表面的PD-1结合能产生电化学发光信号，而当抗PD-1单抗药物存在时，它能够通过与PD-1 的结合从而抑制PD-L1与表达PD-1的CHO-S细胞株的结合。在恒定量PD-L1存在的情况下， 抗PD-1单克隆抗体的浓度与产生的ECL(电化学发光免疫分析技术)信号成负相关。从而 通过考察抗PD-1单克隆抗体抑制PD-L1与表达PD-1的CHO-S细胞株的结合来检测其生物学活性。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种抗PD-1单克隆抗体的生物活性测定方法，该方法操作简单， 专属性强，精密度和准确度高，对于抗PD-1单克隆抗体的质量控制和临床应用具有重要意义。
本发明提供了一种抗PD-1单克隆抗体的生物活性测定方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)封闭、洗板：用封闭液将96孔MSD高结合板封闭1-3小时，PBS缓冲液洗板；
(2)孵育：依次加入PD-1/CHO-S细胞、PD-L1-mFc、SULFO标记的羊抗鼠lgG检测 抗体，以及系列梯度浓度的参考品和待测样品，室温中避光孵育1-1.5h；
所述的参考品和待测样品为抗PD-1单克隆抗体；
(3)读板：加入2×读板缓冲液，用MSD超敏多因子电化学发光仪读板；
(4)数据处理：分别对参考品和待测样品的量效关系进行四参数拟合，比较二者IC50 值，计算得到待测样品的生物学活性。
优选地，所述的PD-1/CHO-S细胞的接种密度为4.0-6.0×104个细胞/孔；进一步优选地， PD-1/CHO-S细胞的接种密度为5.0×104个细胞/孔。
优选地，所述的PD-L1-mFc的浓度为120-160ng/mL；进一步优选地，PD-L1-mFc的浓度为140ng/mL。
优选地，所述的SULFO标记的羊抗鼠lgG检测抗体浓度为0.8-1.2μg/mL；进一步优选 地，SULFO标记的羊抗鼠lgG检测抗体浓度为1.0μg/mL
优选地，所述的参考品和待测样品浓度为0-2000ng/mL。
优选地，所述的读板缓冲液为100μL/孔的PBS溶液。
具体地，一种抗PD-1单克隆抗体的生物活性测定方法包括以下步骤：
(1)封闭、洗板：用封闭液将96孔MSD高结合板封闭1-3小时，PBS缓冲液洗板；
(2)孵育：接种PD-1/CHO-S细胞，接种密度为4.0-6.0×104个细胞/孔，加入PD-L1-mFc 120-160ng/mL、SULFO标记的羊抗鼠lgG检测抗体0.8-1.2μg/mL，以及系列梯度浓度的参考 品和待测样品，室温中避光孵育1-1.5h；
所述的参考品和待测样品均为本公司生产的抗PD-1单克隆抗体，利用XH001培养基稀 释为0、5、10、25、50、150、250、500、1000、2000ng/mL的浓度梯度；XH001培养基购 买自北京陆桥技术股份有限公司
(3)读板：加入100μL/孔的2×读板缓冲液，用MSD超敏多因子电化学发光仪读板；
(4)数据处理：用抗PD-1单克隆抗体的浓度为横坐标，ECL信号为纵坐标，分别对参考品和待测样品的量效关系进行四参数拟合，比较二者IC50值，计算得到待测样品的生物学 活性。
本发明另一方面提供了上述的生物活性测定方法在抗PD-1单克隆抗体的质控中的应用。
本发明所述的PD-1包括但不限于下述专利申请：201610656318.4。
本发明的有益效果：
本发明提供了提供一种抗PD-1单克隆抗体的生物活性测定方法，该方法操作简单，专 属性强，精密度和准确度高，线性好，对于抗PD-1单克隆抗体的质量控制和临床应用具有重 要意义。
附图说明
图1为实施例1抗PD-1单克隆抗体的生物活性测定的拟合曲线；其中，Plot#1为参考品， Plot#2为待测样品。
图2为实施例2抗PD-1单克隆抗体的生物活性测定的拟合曲线；其中，Plot#1为参考品， Plot#2为待测样品。
图3为实施例3抗PD-1单克隆抗体的生物活性测定的拟合曲线；其中，Plot#1为参考品， Plot#2为待测样品。
图4为结合活性效价水平的理论值和真实值进行线性回归，线性拟合参数R2＞0.95。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具 体实施例进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施 方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属 于本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的细胞、 药品、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一种抗PD-1单克隆抗体的生物活性测定方法包括以下步骤：
(1)封闭、洗板：用封闭液将96孔MSD高结合板封闭1小时，PBS缓冲液洗板；
(2)孵育：接种PD-1/CHO-S细胞，接种密度为4.0×104个细胞/孔，加入PD-L1-mFc120ng/mL、SULFO标记的羊抗鼠lgG检测抗体0.8μg/mL，以及系列梯度浓度的参考品和待 测样品(2复孔)，室温中避光孵育1h；
所述的参考品和待测样品均为本公司生产的抗PD-1单克隆抗体，利用XH001培养基稀 释为0、5、10、25、50、150、250、500、1000、2000ng/mL的浓度梯度；
(3)读板：加入100μL/孔的2×读板缓冲液，用MSD超敏多因子电化学发光仪读板；
(4)数据处理：用抗PD-1单克隆抗体的浓度为横坐标，ECL信号为纵坐标，分别对参考品和待测样品的量效关系进行四参数拟合，比较二者IC50值，计算得到待测样品的生物学 活性。
检测结果如图1所示，待测样品的生物学活性为108％，相关系数R2范围是0.985-0.996， R2>0.95，该方法符合一般生物制品活性检测要求，说明本法对抗PD-1单克隆抗体生物活性 的检测是可行的。
实施例2
一种抗PD-1单克隆抗体的生物活性测定方法包括以下步骤：
(1)封闭、洗板：用封闭液将96孔MSD高结合板封闭3小时，PBS缓冲液洗板；
(2)孵育：接种PD-1/CHO-S细胞，接种密度为6.0×104个细胞/孔，加入PD-L1-mFc160ng/mL、SULFO标记的羊抗鼠lgG检测抗体1.2μg/mL，以及系列梯度浓度的参考品和待 测样品(2复孔)，室温中避光孵育1-1.5h；
所述的参考品和待测样品均为本公司生产的抗PD-1单克隆抗体，利用XH001培养基稀 释为0、5、10、25、50、150、250、500、1000、2000ng/mL的浓度梯度；
(3)读板：加入100μL/孔的2×读板缓冲液，用MSD超敏多因子电化学发光仪读板；
(4)数据处理：用抗PD-1单克隆抗体的浓度为横坐标，ECL信号为纵坐标，分别对参考品和待测样品的量效关系进行四参数拟合，比较二者IC50值，计算得到待测样品的生物学 活性。
检测结果如图2所示，待测样品的生物学活性为91％，相关系数R2范围是0.961-0.983， R2>0.95，该方法符合一般生物制品活性检测要求，说明本法对抗PD-1单克隆抗体生物活性 的检测是可行的。
实施例3
一种抗PD-1单克隆抗体的生物活性测定方法包括以下步骤：
(1)封闭、洗板：用封闭液将96孔MSD高结合板封闭2小时，PBS缓冲液洗板；
(2)孵育：接种PD-1/CHO-S细胞，接种密度为5.0×104个细胞/孔，加入PD-L1-mFc140ng/mL、SULFO标记的羊抗鼠lgG检测抗体1.0μg/mL，以及系列梯度浓度的参考品和待 测样品(2复孔)，室温中避光孵育1.2h；
所述的参考品和待测样品均为本公司生产的抗PD-1单克隆抗体，利用XH001培养基稀 释为0、5、10、25、50、150、250、500、1000、2000ng/mL的浓度梯度；
(3)读板：加入100μL/孔的2×读板缓冲液，用MSD超敏多因子电化学发光仪读板；
(4)数据处理：用抗PD-1单克隆抗体的浓度为横坐标，ECL信号为纵坐标，分别对参考品和待测样品的量效关系进行四参数拟合，比较二者IC50值，计算得到待测样品的生物学 活性。
检测结果如图3所示，待测样品的生物学活性为93％，相关系数R2范围是0.993-0.996， R2>0.95，该方法符合一般生物制品活性检测要求，说明本法对抗PD-1单克隆抗体生物活性 的检测是可行的。
实施例4
利用抗PD-1单克隆抗体，对本方法进行方法学验证：
除下述各项中的特殊说明外，实验材料、方法与实施例3中的操作基本相同。
4.1专属性
以不针对PD-1靶点的Remicade(Johnson公司产品)为待测样品，采用上述方法检测其与 PD-1/CHO-S细胞的结合活性。
检测结果表明，不针对PD-1靶点的单克隆抗体即使在与参考品相同稀释浓度条件下，与 PD-1/CHO-S细胞仍然没有结合，平均ECL信号强度接近于零。由此可见，本发明检测方法 能够特异性地进行针对PD-1靶点的单克隆抗体结合活性检测。
4.2线性和范围
以抗PD-1单克隆抗体参考品为材料，利用XH001培养基将其稀释成生物学活性分别为 60％，80％，100％，120％和140％作为待测样品，对这5个待测样品采用实施例3的方法 进行检测。
结果如图4，结合活性效价水平的理论值和真实值进行线性回归，线性拟合参数R2＞ 0.95，说明在效价水平为60％-140％范围内，本发明方法线性良好。
4.2精密度
由2名有资质的分析人员对5份抗PD-1单克隆抗体分别进行独立的生物活性检测，共计 10次结果，计算10个数据的生物学活性及其RSD，结果如表1所示。
表1：生物学活性和精密度结果
Figure BDA0002713973270000051
Figure BDA0002713973270000061
结果表明：5份样品所测得的生物学活性在88％-108％之间，RSD为6.6％，表明该方法 的精密度良好。
4.3准确度
用已知生物学活性为90％、95％和100％的抗PD-1单克隆抗体作为待测样品，按照实施 例3的方法，由3名分析人员各检测1次，统计实验结果，结果如表2所示。
表2：生物学活性和准确度结果
Figure BDA0002713973270000062
结果表明，每个待测样品的3次检测结果的RSD＜15％，说明本发明方法能够满足准确 度要求。
4.4耐用性
以本公司生产的抗PD-1单克隆抗体成品:GLS-010注射液-20150802为待测样品，分别于 0h、2h、5h、10h和20h检测其生物学活性，考察本发明方法的耐用性，结果如表3所示。
表3：生物学活性和耐用性结果
Figure BDA0002713973270000063
结果表明，每个待测样品的3次检测结果的RSD＜15％，说明在20h内该特异性结合是 稳定的，本方法能够达到耐用性对样品结合稳定性的要求。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未 脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等 同变化也应视为本发明的保护范围。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发 明的保护范围之内。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必 须是以本领域普通技术人员能够实现为基础；当技术方案的结合出现相互矛盾 或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护 范围之内。

Claims (7)

1.一种抗PD-1单克隆抗体的生物活性测定方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
(1)封闭、洗板：用封闭液将96孔MSD高结合板封闭1-3小时，PBS缓冲液洗板；
(2)孵育：依次加入PD-1/CHO-S细胞、PD-L1-mFc、SULFO标记的羊抗鼠lgG检测抗体，以及系列梯度浓度的参考品和待测样品，室温中避光孵育1-1.5h；
所述的参考品和待测样品为抗PD-1单克隆抗体；
(3)读板：加入2×读板缓冲液，用MSD超敏多因子电化学发光仪读板；
(4)数据处理：用抗PD-1单克隆抗体的浓度为横坐标，ECL信号为纵坐标，分别对参考品和待测样品的量效关系进行四参数拟合，比较二者IC50值，计算得到待测样品的生物学活性。
2.根据权利要求1所述的生物活性测定方法，其特征在于，所述的PD-1/CHO-S细胞的接种密度为4.0-6.0×104个细胞/孔。
3.根据权利要求1所述的生物活性测定方法，其特征在于，所述的PD-L1-mFc的浓度为120-160ng/mL。
4.根据权利要求1所述的生物活性测定方法，其特征在于，所述的SULFO标记的羊抗鼠lgG检测抗体浓度为0.8-1.2μg/mL。
5.根据权利要求1所述的生物活性测定方法，其特征在于，所述的参考品和待测样品浓度为0-2000ng/mL。
6.根据权利要求1所述的生物活性测定方法，其特征在于，所述的读板缓冲液为100μL/孔的PBS溶液。
7.权利要求1-6任意一项所述的生物活性测定方法在抗PD-1单克隆抗体的质控中的应用。
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