CN113507963A - 用于晚期实体瘤癌症的治疗性rna及抗pd1抗体 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及治疗性RNA的领域，该治疗性RNA用于治疗抗程序性细胞死亡因子1(PD‑1)或抗程序性细胞死亡因子1配体1(PD‑L1)疗法、包括先天性和获得性PD‑1和/或PD‑L1疗法已经失败或对其变得不耐受、有抗性或难治的受试者以及患有晚期、不可切除或转移性实体瘤癌症，无论是否抗程序性细胞死亡因子1(PD‑1)或抗程序性细胞死亡因子1配体1(PD‑L1)疗法失败或对其不耐受、有抗性或难治的受试者。

Description

用于晚期实体瘤癌症的治疗性RNA及抗PD1抗体
本申请要求2019年1月21日提交的美国临时申请案号62/794,896、2019年10月25日提交的美国临时申请案号62/926,379和2019年11月14日提交的欧洲专利申请案号19306471.4的优先权权益，出于所有目的，每项申请的内容通过引用以其全文并入本申请。
本申请涉及用于治疗实体瘤癌症的治疗性RNA领域，包括，例如，在抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)或抗程序性细胞死亡因子1配体(PD-L1)疗法失败或对其变得不耐受、有抗性或难治的受试者，包括对抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)或抗程序性细胞死亡因子1配体(PD-L1)疗法具有获得性或先天性抗性的受试者，以及患有晚期或转移性实体瘤的受试者中的治疗。
美国国家癌症研究所将实体瘤定义为通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤在身体上可以位于包括卵巢、乳房、结肠和其他组织在内的任何组织或器官中，并且包括黑色素瘤、皮肤鳞状上皮细胞癌(CSCC)、头颈部鳞状上皮细胞癌(HNSCC)、非小细胞肺癌、肾癌、头颈癌、甲状腺癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、乳癌。
免疫检查点阻断(诸如抗PD-1和抗PD-L1)疗法在临床上可引起抗癌反应，但是很大比例的患者无法从治疗中受益。已经明确了对检查点阻断的先天性和获得性抗性的几种机制，包括MHC I和IFNγ传讯通路的突变。参见，例如，Sade-Feldman等人(2017)NatureCommunications[自然通讯]8:1136；另参见Sharma等人(2017)Cell[细胞]168:707-723。
晚期实体瘤癌症特别难治。现有的治疗方法包括手术、放射疗法、免疫疗法和化学疗法。单独手术可能是小的局部肿瘤的合适治疗方法，但大的浸润性肿瘤可能无法通过手术切除。其他常见的治疗方法(诸如放射疗法和化学疗法)会带来不良的副作用以及对健康细胞的损害。
虽然外科手术和现有疗法有时能够杀死大部分实体瘤，但其他细胞(包括潜在的癌症干细胞)可能在治疗后存活下来。随着时间的流逝，所述细胞可能形成新肿瘤，导致癌症复发。尽管采取了多模式常规疗法，许多类型的实体瘤的无病生存率仍不到25％。对多模式治疗有抗性或在治疗后复发的实体瘤更难以治疗，长期生存率不到10％。特别是，对于免疫疗法，例如，使用针对抗程序性细胞死亡蛋白1或其配体的单株抗体进行之免疫疗法(抗PD-1或抗PD-L1疗法)失败的患者而言，存在高需求。
本申请公开了可以克服目前在实体瘤的治疗中存在的缺点的组合物、用途及方法，该实体瘤诸如晚期、不可切除或转移性实体瘤癌症，该实体瘤之治疗包括在抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)或抗程序性细胞死亡因子1配体(PD-L1)疗法已经失败或对其变得不耐受、有抗性或难治的受试者中的治疗。如本申请所披露的治疗性RNA的施用可以减小肿瘤大小，延长至疾病进展时间，和/或防止肿瘤的转移和/或复发，并最终延长生存时间。
【发明内容】
除其他内容外，本申请提供了治疗患有实体瘤癌症的受试者的方法，包括施用有效量的RNA，该RNA包括编码IL-12sc蛋白的RNA、编码IL-15 sushi蛋白的RNA、编码IFNα蛋白的RNA、和编码GM-CSF蛋白的RNA，以及施用有效量的抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)抗体，其中该受试者为抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)或抗程序性细胞死亡因子1配体(PD-L1)疗法已经失败或对其变得不耐受、有抗性或难治的受试者。
在一些实施方式中，提供了在抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)或抗程序性细胞死亡因子1配体(PD-L1)疗法已经失败或对其变得不耐受、有抗性或难治的受试者中治疗实体瘤癌症的方法，包括向抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)或抗程序性细胞死亡因子1配体(PD-L1)疗法已经失败或对其变得不耐受、有抗性或难治的受试者施用有效量的RNA，该RNA包括编码IL-12sc蛋白的RNA、编码IL-15 sushi蛋白的RNA、编码IFNα蛋白的RNA和编码GM-CSF蛋白的RNA，以及施用有效量的抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)抗体。
提供了治疗患有抗PD-1和/或抗PD-L1抗性实体瘤癌症的受试者的方法，包括向患有抗PD-1和/或抗PD-L1抗性实体瘤癌症的受试者施用有效量的RNA，该RNA包括编码IL-12sc蛋白的RNA、编码IL-15 sushi蛋白的RNA、编码IFNα蛋白的RNA和编码GM-CSF蛋白的RNA，以及施用有效量的抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)抗体。
本申请包括治疗对抗PD-1和/或抗PD-L1疗法具有获得性抗性的患有实体瘤癌症的受试者的方法，包括向对抗PD-1和/或抗PD-L1疗法具有获得性抗性的患有实体瘤癌症的受试者施用有效量的RNA，该RNA包括编码IL-12sc蛋白的RNA、编码IL-15 sushi蛋白的RNA、编码IFNα蛋白的RNA和编码GM-CSF蛋白的RNA，以及施用有效量的抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)抗体。
在一些实施方式中，提供了治疗对抗PD-1和/或抗PD-L1疗法具有先天性抗性的患有实体瘤癌症的受试者的方法，包括向对抗PD-1和/或抗PD-L1疗法具有先天性抗性的患有实体瘤癌症的受试者施用有效量的RNA，该RNA包括编码IL-12sc蛋白的RNA、编码IL-15sushi蛋白的RNA、编码IFNα蛋白的RNA和编码GM-CSF蛋白的RNA，以及施用有效量的抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)抗体。
本申请提供的实施方式不受与不耐受、抗性或难治性相关的任何科学理论的限制。
在一些实施方式中，对抗PD-1和/或抗PD-1疗法的不耐受性、抗性、难治性(包括获得性和先天性抗性)是由包含β-2-微球蛋白(B2M)功能的部分或全部损失的癌细胞引起的。在一些实施方式中，受试者具有包含β-2-微球蛋白(B2M)功能的部分或全部损失的癌细胞。在一些实施方式中，该癌细胞具有B2M功能的部分损失。在一些实施方式中，该癌细胞具有B2M功能的全部损失。在一些实施方式中，通过将癌细胞与来自同一受试者的非癌细胞进行比较来评估B2M功能的部分或全部损失，视需要其中非癌细胞来自癌细胞所源自的相同组织。在一些实施方式中，该癌细胞在实体瘤中，该实体瘤包含具有正常B2M功能的癌细胞。在一些实施方式中，该癌细胞在实体瘤中，其中25％或更多的癌细胞的B2M功能部分或全部损失。在一些实施方式中，该癌细胞在实体瘤中，其中50％或更多的癌细胞的B2M功能部分或全部损失。在一些实施方式中，该癌细胞在实体瘤中，其中75％或更多的癌细胞的B2M功能部分或全部损失。在一些实施方式中，该癌细胞在实体瘤中，其中95％或更多的癌细胞的B2M功能部分或全部损失。在一些实施方式中，与该实体瘤所源自的正常细胞或组织相比，该实体瘤整体上(例如，如在从该实体瘤进行的生检中所评估的)的B2M功能部分或全部损失。在一些实施方式中，该受试者具有B2M基因中的突变(例如，因其导致的功能的部分或全部损失)。该突变可能是取代、插入或缺失。在一些实施方式中，该B2M基因包含杂合性缺失(LOH)。
在一些实施方式中，该突变是移码突变。在一些实施方式中，该移码突变发生在B2M的外显子1中。在一些实施方式中，该移码突变包含p.Leu13fs和/或p.Ser14fs。在一些实施方式中，与没有发生B2M功能的部分或全部损失的受试者相比，该受试者具有降低的B2M蛋白水平。
在一些情况下，该实体瘤(例如，该实体瘤内的癌细胞)具有降低的细胞表面表现(在本申请中也称为「表面表现」)的主要组织兼容性复合物I类(MHC I)水平。在一些实施方式中，实体瘤样本(例如，包括该实体瘤的癌细胞的生检物)与对照相比具有降低的细胞表面表现的MHC I水平，视需要，其中该对照是来自同一受试者的相应的非癌样本。在一些实施方式中，该实体瘤中癌细胞表面表现的MHC I水平由于B2M基因的突变而降低。在一些实施方式中，受试者的癌细胞具有降低的表面表现的MHC I水平。在一些实施方式中，该癌细胞没有表面表现的MHC I。在一些实施方式中，该降低的表面表现的MHC I水平通过将癌细胞与来自同一受试者的非癌细胞进行比较来评估，视需要其中该非癌细胞来自该癌细胞所源自的相同组织。在一些实施方式中，该癌细胞在实体瘤中，该实体瘤包含表面表现MHC I水平正常的癌细胞。在一些实施方式中，该癌细胞在实体瘤中，其中25％或更多的癌细胞具有降低的表面表现的MHC I水平。在一些实施方式中，该癌细胞在实体瘤中，其中50％或更多的癌细胞具有降低的表面表现的MHC I水平。在一些实施方式中，该癌细胞在实体瘤中，其中75％或更多的癌细胞具有降低的表面表现的MHC I水平。在一些实施方式中，该癌细胞在实体瘤中，其中95％或更多的癌细胞具有降低的表面表现的MHC I水平。在一些实施方式中，该实体瘤整体上(例如，如在取自该实体瘤的生检中所评估的)与该实体瘤所源自的正常细胞或组织相比具有降低的表面表现的MHC I水平。
在一些实施方式中，提供了用于治疗患有晚期、不可切除或转移性实体瘤癌症的受试者的方法，包括施用有效量的RNA，该RNA包括编码IL-12sc蛋白的RNA、编码IL-15sushi蛋白的RNA、编码IFNα蛋白的RNA和编码GM-CSF蛋白的RNA，以及向患有晚期、不可切除或转移性实体瘤癌症的受试者施用有效量的抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)抗体。
在一些实施方式中，该受试者是抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)疗法已经失败或对其变得不耐受、有抗性或难治的。在一些实施方式中，该受试者是抗程序性细胞死亡因子1配体(PD-L1)疗法已经失败或对其变得不耐受、有抗性或难治的。
在一些实施方式中，该受试者的抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)疗法或抗程序性细胞死亡因子1配体(PD-L1)疗法已经失败。
在一些实施方式中，该受试者对抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)或抗程序性细胞死亡因子1配体(PD-L1)疗法已变得不耐受。
在一些实施方式中，该受试者已变得对抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)和/或抗程序性细胞死亡因子1配体(PD-L1)疗法具有抗性。
在一些实施方式中，该受试者对抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)或抗程序性细胞死亡因子1配体(PD-L1)疗法已变得难治。在一些实施方式中，该难治性或抗性癌症是对指定治疗无反应的癌症。在一些实施方式中，该难治性从治疗的最开始就发生。在一些实施方式中，该难治性在治疗期间发生。
在一些实施方式中，该癌症在治疗开始之前具有抗性。
在一些实施方式中，该受试者患有对抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)和/或抗程序性细胞死亡因子1配体(PD-L1)疗法无反应的癌症。在一些实施方式中，该受试者患有对指定治疗变得难治或有抗性的癌症。在一些实施方式中，该指定治疗是抗PD1疗法。在一些实施方式中，该指定治疗是抗PD-L1疗法。在一些实施方式中，自首次接受该疗法以来，该受试者对该疗法的反应减弱。在一些实施方式中，该受试者尚未接受该疗法，但是患有典型地对该疗法无反应的一种类型的癌症。
在一些实施方式中，该受试者是人类。
在一些实施方式中，该受试者先前未曾使用抗PD-1或抗PD-L1疗法治疗。在一些实施方式中，该实体瘤癌症是抗PD-1或抗PD-L1疗法不作为常规使用的一种癌症。
在一些实施方式中，该受试者患有转移性实体瘤。在一些实施方式中，该受试者患有非转移性实体瘤。在一些实施方式中，该受试者患有不可切除的实体瘤。在一些实施方式中，该受试者患有转移性且不可切除的实体瘤。在一些实施方式中，该受试者患有非转移性且不可切除的实体瘤。
在一些实施方式中，该实体瘤是上皮肿瘤、前列腺肿瘤、卵巢肿瘤、肾细胞肿瘤、胃肠道肿瘤、肝肿瘤、大肠直肠肿瘤、脉管系统肿瘤、间皮瘤、胰腺肿瘤、乳房肿瘤、肉瘤、肺肿瘤、结肠肿瘤、黑色素瘤、小细胞肺肿瘤、神经母细胞瘤、睾丸肿瘤、上皮癌肿瘤、腺癌肿瘤、精原细胞瘤、视网膜母细胞瘤、皮肤鳞状上皮细胞癌(CSCC)、头颈部鳞状上皮细胞癌(HNSCC)、头颈癌、骨肉瘤、皮肤鳞状细胞癌(CSCC)、非小细胞肺癌、肾肿瘤、甲状腺肿瘤、肝肿瘤或其他适于瘤内注射的实体瘤。
在一些实施方式中，该实体瘤是淋巴瘤，包括非何杰金氏淋巴瘤或何杰金氏淋巴瘤。
在一些实施方式中，该实体瘤癌症是黑色素瘤。在一些实施方式中，该黑色素瘤是葡萄膜黑色素瘤或粘膜黑色素瘤。在一些实施方式中，该实体瘤癌症是黑色素瘤，视需要葡萄膜黑色素瘤或粘膜黑色素瘤，并且包括适于瘤内注射的浅表、皮下和/或淋巴结转移。
在一些实施方式中，瘤内注射包括注射到在淋巴结内转移的实体瘤中。在一些实施方式中，瘤内注射包括注射到淋巴结内的淋巴瘤中。在一些实施方式中，瘤内注射包括注射到受试者皮肤表面10cm以内的原发性或继发性实体瘤中。在一些实施方式中，瘤内注射包括注射到受试者皮肤表面5cm以内的原发性或继发性实体瘤中。在一些实施方式中，瘤内注射包括注射到皮肤实体瘤中。在一些实施方式中，该皮肤实体瘤是转移瘤。在一些实施方式中，该皮肤实体瘤是皮肤癌。在一些实施方式中，该皮肤实体瘤不是皮肤癌。在一些实施方式中，瘤内注射包括注射入皮下实体瘤。在一些实施方式中，该皮下实体瘤是转移瘤。在一些实施方式中，该皮下实体瘤是皮肤癌。在一些实施方式中，该皮下实体瘤不是皮肤癌。
在一些实施方式中，该实体瘤是上皮肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是前列腺肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是卵巢肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是肾细胞肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是胃肠道肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是肝肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是大肠直肠肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是脉管系统肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是间皮瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是胰腺肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是乳房肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是肉瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是肺肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是结肠肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是黑色素瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是小细胞肺肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是非小细胞肺癌肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是神经母细胞瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是睾丸肿瘤。
在一些实施方式中，该实体瘤是上皮癌肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是腺癌肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是精原细胞瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是视网膜母细胞瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是皮肤鳞状上皮细胞癌(CSCC)。在一些实施方式中，该实体瘤是头颈部鳞状上皮细胞癌(HNSCC)。在一些实施方式中，该实体瘤是HNSCC。在一些实施方式中，该实体瘤是头颈癌。在一些实施方式中，该实体瘤是骨肉瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是肾癌。在一些实施方式中，该实体瘤是甲状腺癌。在一些实施方式中，该实体瘤是间变性甲状腺癌(ATC)。在一些实施方式中，该实体瘤是肝癌。在一些实施方式中，该实体瘤是结肠肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是以上任何两种。在一些实施方式中，该实体瘤是以上任何两种或更多种。
在一些实施方式中，该实体瘤是淋巴瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是非何杰金氏淋巴瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是何杰金氏淋巴瘤。在一些实施方式中，该实体瘤淋巴瘤不是中枢神经系统淋巴瘤。
在一些实施方式中，该实体瘤癌症是HNSCC。在一些实施方式中，该实体瘤癌症是仅在粘膜部位的粘膜黑色素瘤。在一些实施方式中，该实体瘤癌症是HNSCC和仅在粘膜部位的粘膜黑色素瘤。
在一些实施方式中，该实体瘤癌症是葡萄膜黑色素瘤或粘膜黑色素瘤。在一些实施方式中，该实体瘤癌症是乳癌。在一些实施方式中，该实体瘤癌症是乳腺肉瘤或三阴性乳癌。
在一些实施方式中，将所述RNA与抗PD-1抗体组合施用。
在一些实施方式中，该受试者患有多于一种实体瘤。在一些情况下，至少一种肿瘤对PD-1或PD-L1疗法有抗性、难治性或不耐受性。在一些实施方式中，至少一种肿瘤对PD-1或PD-L1疗法有抗性、难治性或不耐受性，并且至少一种肿瘤对PD-1或PD-L1疗法没有抗性、难治性或不耐受性。在一些实施方式中，当存在多于一种实体瘤时，成功地治疗了抗性和非抗性肿瘤(如果存在)。
在一些实施方式中，该实体瘤癌症是III期、III期子集、IV期或IV期子集。在一些实施方式中，该实体瘤癌症是IIIB期、IIIC期或IV期癌症。
在一些实施方式中，该实体瘤癌症是晚期的。在一些实施方式中，该实体瘤癌症是不可切除的。在一些实施方式中，该实体瘤癌症是晚期且不可切除的。
在一些实施方式中，该实体瘤已经从其起源扩散到受试者的另一个部位。
在一些实施方式中，该实体瘤癌症具有一处或多处皮肤或皮下病变。在一些实施方式中，该实体瘤癌症已经转移。在一些实施方式中，该实体瘤癌症已经转移，但是不是皮肤癌。
在一些实施方式中，该受试者没有其他治疗选择。
在一些实施方式中，该实体瘤癌症是常规使用抗PD1或抗PD-L1疗法但尚未用该疗法治疗的一种癌症。
在一些实施方式中，该实体瘤癌症是对抗PD-1或抗PD-L1疗法具有抗性和/或难治性的IIIB期、IIIC期或不可切除的IV期黑色素瘤。在一些实施方式中，该实体瘤癌症具有浅表或皮下病变和/或转移。
在一些实施方式中，该受试者患有可根据实体瘤反应评价标准(ResponseEvaluation Criteria in Solid Tumors，RECIST)1.1标准测量的疾病。在一些实施方式中，该受试者的预期寿命超过3个月。在一些实施方式中，该受试者为至少18岁。
在一些实施方式中，将所述RNA瘤内注射。
在一些实施方式中，仅在实体瘤癌症的粘膜部位将所述RNA瘤内注射。
在一些实施方式中，将所述RNA施用约5个月。在一些实施方式中，将所述RNA每周施用一次。在一些实施方式中，将所述RNA施用最多52周。
在一些实施方式中，该IFNα蛋白是IFNα2b蛋白。
在一些实施方式中，该编码IL-12sc蛋白的RNA包含SEQ ID NO:17或18的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:17或18的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或该IL-12sc蛋白包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列；和/或该编码IL-12sc蛋白的RNA包含与IL-12sc的p40部分(SEQID NO:17或18的核苷酸1-984)具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性以及与IL-12sc的p30部分(SEQ ID NO:17或18的核苷酸1027-1623)具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，并且进一步包含p40和p35部分之间编码连接头(linker)多肽的核苷酸。
在一些实施方式中，该编码IL-15 sushi蛋白的RNA包含SEQ ID NO:26的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:26的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或该IL-15 sushi蛋白包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列；和/或该编码IL-15 sushi蛋白的RNA包含与IL-15受体α的sushi结构域(SEQ ID NO:26的核苷酸1-321)具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性以及与成熟IL-15(SEQ ID NO:26的核苷酸382-729)具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，并且视需要进一步包含IL-15的sushi结构域和成熟IL-15之间编码连接头多肽的核苷酸。
在一些实施方式中，该编码IFNα蛋白的RNA包含SEQ ID NO:22或23的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:22或23的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，和/或该IFNα蛋白包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列或与SEQ IDNO:19的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，该编码GM-CSF蛋白的RNA包含SEQ ID NO:29的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:29的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，和/或该GM-CSF蛋白包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，至少一种RNA包含取代至少一个尿苷的经修饰的核苷。在一些实施方式中，至少一种RNA包含取代每个尿苷的经修饰的核苷。在一些实施方式中，每种RNA包含取代至少一个尿苷的经修饰的核苷。在一些实施方式中，每种RNA包含取代每个尿苷的经修饰的核苷。在一些实施方式中，该经修饰的核苷独立地选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方式中，至少一种RNA包含多于一种类型的经修饰的核苷，其中所述经修饰的核苷独立地选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。
在一些实施方式中，该经修饰的核苷是N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。
在一些实施方式中，至少一种RNA包含5'帽m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG(有时也称为m2 7 ,3`OG(5')ppp(5')m2'-OApG)。在一些实施方式中，每种RNA包含5'帽m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG(有时也称为m2 7,3`OG(5')ppp(5')m2'-OApG)。
在一些实施方式中，至少一种RNA包含5'UTR，该5'UTR包含选自由SEQ ID NO:4和6组成的组的核苷酸序列，或与选自由SEQ ID NO:4和6组成的组的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，每种RNA包含5'UTR，该5'UTR包含选自由SEQ ID NO:4和6组成的组的核苷酸序列，或与选自由SEQ ID NO:4和6组成的组的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方式中，至少一种RNA包含3'UTR，该3'UTR包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，每种RNA包含3'UTR，该3'UTR包含SEQ IDNO:8的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方式中，至少一种RNA包含聚A尾。在一些实施方式中，每种RNA包含聚A尾。在一些实施方式中，该聚A尾包含至少100个核苷酸。在一些实施方式中，该聚A尾包含SEQ ID NO:30所示的聚A尾或由其组成。
在一些实施方式中，一种或多种RNA包括：
i.5'帽，该5'帽包含m27,3'-OGppp(m12'-O)ApG或3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')G；
ii.5'UTR，该5'UTR包含(i)选自由SEQ ID NO:4和6组成的组的核苷酸序列，或(ii)与选自由SEQ ID NO:4和6组成的组的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；
iii.3'UTR，该3'UTR包含(i)SEQ ID NO:8的核苷酸序列，或(ii)与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；以及
iv.包含至少100个核苷酸的聚A尾。
在一些实施方式中，该聚A尾包含SEQ ID NO:30或由其组成。
在一些实施方式中，在受试者中治疗实体瘤包括减小肿瘤大小或预防癌症转移。
在一些实施方式中，所述RNA是同时施用的。在一些实施方式中，通过注射施用所述RNA。在一些实施方式中，在注射之前将所述RNA在液体溶液中混合在一起。
在一些实施方式中，该抗PD1抗体是西米单抗、派姆单抗、纳武单抗、MEDI0608、PDR001、PF-06801591、BGB-A317、皮地珠单抗、TSR-042、AGEN-2034、A-0001、BGB-108、BI-754091、CBT-501、ENUM-003、ENUM-388D4、IBI-308、JNJ-63723283、JS-001、JTX-4014、JY-034、CLA-134、STIA-1110、244C8或388D4。在一些实施方式中，该抗PD1抗体是西米单抗。
在一些实施方式中，该抗PD1抗体以约0.1-600mg的剂量施用。在一些实施方式中，该抗PD1抗体以200mg的剂量施用。在一些实施方式中，该抗PD1抗体以240mg的剂量施用。在一些实施方式中，该抗PD1抗体以350mg的剂量施用。在一些实施方式中，该抗PD1抗体通过注射施用。在一些实施方式中，该抗PD1抗体通过静脉内施用。在一些实施方式中，该抗PD-1抗体每三周施用一次。在一些实施方式中，所述RNA和抗PD-1抗体持续施用约8个月。
本申请的其他实施方式如下：
实施方式A 1.一种包含编码IL-12sc蛋白的RNA、编码IL-15 sushi蛋白的RNA、编码IFNα蛋白的RNA和编码GM-CSF蛋白的RNA的组合物，与抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)抗体组合用于治疗患有实体瘤癌症的受试者，其中该受试者是抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)或抗程序性细胞死亡因子1配体(PD-L1)疗法已经失败或对其变得不耐受、有抗性或难治的。
实施方式A 2.一种包含编码IL-12sc蛋白的RNA的组合物，与抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)抗体组合用于治疗抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)或抗程序性细胞死亡因子1配体(PD-L1)疗法已经失败或对其变得不耐受、有抗性或难治的受试者，其中将该RNA与编码IL-15 sushi的RNA、编码IFNα蛋白的RNA和编码GM-CSF蛋白的RNA联合施用。
实施方式A 3.一种包含编码IL-15 sushi蛋白的RNA的组合物，与抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)抗体组合用于治疗抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)或抗程序性细胞死亡因子1配体(PD-L1)疗法已经失败或对其变得不耐受、有抗性或难治的受试者，其中将该RNA与编码IL-12sc蛋白的RNA、编码IFNα蛋白的RNA和编码GM-CSF蛋白的RNA联合施用。
实施方式A 4.一种包含编码IFNα蛋白的RNA的组合物，与抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)抗体组合用于治疗抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)或抗程序性细胞死亡因子1配体(PD-L1)疗法已经失败或对其变得不耐受、有抗性或难治的受试者，其中将该RNA与编码IL-12sc蛋白的RNA、编码IL-15 sushi蛋白的RNA和编码GM-CSF蛋白的RNA联合施用。
实施方式A 5.一种包含编码GM-CSF蛋白的RNA的组合物，与抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)抗体组合用于治疗抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)或抗程序性细胞死亡因子1配体(PD-L1)疗法已经失败或对其变得不耐受、有抗性或难治的受试者，其中将该RNA与编码IL-12sc蛋白的RNA、编码IL-15 sushi蛋白的RNA和编码IFNα蛋白的RNA联合施用。
实施方式A 6.如实施方式A 1-5中任一项所述的组合物，其中该受试者是抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)疗法已经失败或对其变得不耐受、有抗性或难治的。
实施方式A 7.如实施方式A 1-6中任一项所述的组合物，其中该受试者是抗程序性细胞死亡因子1配体(PD-L1)疗法已经失败或对其变得不耐受、有抗性或难治的。
实施方式A 8.如实施方式A 1-7中任一项所述的组合物，其中该受试者抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)疗法或抗程序性细胞死亡因子1配体(PD-L1)疗法已经失败。
实施方式A 9.如实施方式A 1-8中任一项所述的组合物，其中该受试者对抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)或抗程序性细胞死亡因子1配体(PD-L1)疗法变得不耐受。
实施方式A 10.如实施方式A 1-9中任一项所述的组合物，其中该受试者对抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)或抗程序性细胞死亡因子1配体(PD-L1)疗法变得有抗性。
实施方式A 11.如实施方式A 1-10中任一项所述的组合物，其中该受试者对抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)或抗程序性细胞死亡因子1配体(PD-L1)疗法变得难治。
实施方式A 12.如实施方式A 1-11中任一项所述的组合物，其中该难治性或抗性癌症是对指定治疗无反应的一种癌症。
实施方式A 13.如实施方式A 1-12中任一项所述的组合物，其中该难治性从治疗的最开始发生。
实施方式A 14.如实施方式A 1-13中任一项所述的组合物，其中该难治性在治疗期间发生。
实施方式A 15.如实施方式A 1-14中任一项所述的组合物，其中该癌症在治疗开始之前有抗性。
实施方式A 16.如实施方式A 1-15中任一项所述的组合物，其中该受试者患有对抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)和/或抗程序性细胞死亡因子1配体(PD-L1)疗法无反应的癌症。
实施方式A 17.如实施方式A 1-16中任一项所述的组合物，其中该受试者患有对指定治疗变得难治或有抗性的癌症。
实施方式A 18.如实施方式A 17的组合物，其中该指定治疗是抗PD1或抗PD-L1疗法。
实施方式A 19.如实施方式A 1-18中任一项所述的组合物，其中该受试者自首次接受该疗法以来对该疗法的反应减弱。
实施方式A 20.如实施方式A 1-19中任一项所述的组合物，其中该受试者尚未接受该疗法，但是患有典型地对该疗法无反应的一种类型的癌症。
实施方式A 21.如实施方式A 1-20中任一项所述的组合物，其中该受试者患有抗PD-1和/或抗PD-L1抗性实体瘤癌症。
实施方式A 22.如实施方式A 1-21中任一项所述的组合物，其中该受试者患有对抗PD-1和/或抗PD-L1疗法具有获得性抗性的实体瘤癌症。
实施方式A 23.如实施方式A 1-22中任一项所述的组合物，其中该受试者患有对抗PD-1和/或抗PD-L1疗法具有先天性抗性的实体瘤癌症。
实施方式A 24.如实施方式A 1-23中任一项所述的组合物，其中该受试者患有晚期、不可切除的或转移性实体瘤癌症。
实施方式A 25.如实施方式A 1-24中任一项所述的组合物，进一步包括选择抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)或抗程序性细胞死亡因子1配体(PD-L1)疗法已经失败或对其变得不耐受、有抗性或难治的受试者的初始步骤。
实施方式A 26.如实施方式A 1-25中任一项所述的组合物，其中该受试者是人类。
实施方式A 27.如实施方式A 1-26中任一项所述的组合物，其中该受试者患有转移性实体瘤。
实施方式A 28.如实施方式A 1-27中任一项所述的组合物，其中该受试者患有不可切除的实体瘤。
实施方式A 29.如实施方式A 1-28中任一项所述的组合物，其中该受试者的癌细胞包含β2-微球蛋白(B2M)功能的部分或全部损失。
实施方式A 30.如实施方式A 29所述的组合物，其中该癌细胞具有B2M功能的部分损失。
实施方式A 31.如实施方式A 29所述的组合物，其中该癌细胞具有B2M功能的全部损失。
实施方式A 32.如实施方式A 1-31中任一项所述的组合物，其中通过将癌细胞与来自同一受试者的非癌细胞进行比较来评估B2M功能的部分或全部损失，视需要其中该非癌细胞来自该癌细胞所来自的相同组织。
实施方式A 33.如实施方式A 1-32中任一项所述的组合物，其中该受试者包含B2M基因中的突变。
实施方式A 34.如实施方式A 1-33中任一项所述的组合物，其中该突变是取代、插入或缺失。
实施方式A 35.如实施方式A 1-34中任一项所述的组合物，其中该B2M基因包含杂合性缺失(LOH)。
实施方式A 36.如实施方式A 1-35中任一项所述的组合物，其中该受试者包含移码突变。
实施方式A 37.如实施方式A 1-36中任一项所述的组合物，其中该受试者包含B2M的外显子1中的移码突变。
实施方式A 38.如实施方式1-37中任一项所述的组合物，其中该受试者包含移码突变，该移码突变包含p.Leu13fs和/或p.Ser14fs。
实施方式A 39.如实施方式A 1-38中任一项所述的组合物，其中与没有部分或全部B2M功能损失的受试者相比，该受试者具有降低的B2M蛋白水平。
实施方式A 40.如实施方式A 1-39中任一项所述的组合物，该受试者具有与对照相比降低的表面表现的主要组织兼容性复合物I类(MHC I)水平，视需要其中该对照是来自同一受试者的非癌症样本。
实施方式A 41.如实施方式A 1-40中任一项所述的组合物，其中该实体瘤癌症是上皮肿瘤、前列腺肿瘤、卵巢肿瘤、肾细胞肿瘤、胃肠道肿瘤、肝肿瘤、大肠直肠肿瘤、脉管系统肿瘤、间皮瘤、胰腺肿瘤、乳房肿瘤、肉瘤、肺肿瘤、结肠肿瘤、黑色素瘤、小细胞肺肿瘤、非小细胞肺癌、神经母细胞瘤、睾丸肿瘤、上皮癌肿瘤、腺癌肿瘤、精原细胞瘤、视网膜母细胞瘤、皮肤鳞状上皮细胞癌(CSCC)、头颈部鳞状上皮细胞癌(HNSCC)、头颈癌、骨肉瘤、肾脏肿瘤、甲状腺肿瘤、间变性甲状腺癌(ATC)、肝肿瘤、结肠肿瘤或其他适于瘤内注射的实体瘤。
实施方式A 42.如实施方式A 1-41中任一项所述的组合物，其中该实体瘤癌症是黑色素瘤。
实施方式A 43.如实施方式A 1-42中任一项所述的组合物，其中该实体瘤癌症不是黑色素瘤。
实施方式A 44.如实施方式A 1-42中任一项所述的组合物，其中该实体瘤癌症是黑色素瘤，并且其中该黑色素瘤是葡萄膜黑色素瘤或粘膜黑色素瘤。
实施方式A 45.如实施方式A 1-43中任一项所述的组合物，其中该实体瘤癌症是具有适于瘤内注射的浅表、皮下和/或淋巴结转移的黑色素瘤。
实施方式A 46.如实施方式15所述的组合物，其中该实体瘤癌症是仅在粘膜部位的HNSCC和/或粘膜黑色素瘤。
实施方式A 47.如实施方式A 1-46中任一项所述的组合物，其中所述RNA作为单一疗法施用。
实施方式A 48.如实施方式A 1-47中任一项所述的组合物，其中该受试者患有多于一种实体瘤。
实施方式A 49.如实施方式A 1-48中任一项所述的组合物，其中至少一种肿瘤对抗PD-1或抗PD-L1疗法具有抗性、难治性或不耐受性，并且至少一种肿瘤对抗PD-1或抗PD-L1疗法没有抗性、难治性或不耐受性。
实施方式A 50.如实施方式A 49所述的组合物，其中抗性和非抗性肿瘤均得到成功治疗。
实施方式A 51.如实施方式A 1-50中任一项所述的组合物，其中该实体瘤癌症是III期、III期子集、IV期或IV期子集。
实施方式A 52.如实施方式A 1-51中任一项所述的组合物，其中该实体瘤癌症是晚期且不可切除的。
实施方式A 53.如实施方式A 1-52中任一项所述的组合物，其中该实体瘤已经从其起源扩散到受试者的另一个部位。
实施方式A 54.如实施方式A 1-53中任一项所述的组合物，其中该实体瘤癌症具有一处或多处皮肤或皮下病变，视需要其中该癌症不是皮肤癌。
实施方式A 55.如实施方式A 1-54中任一项所述的组合物，其中该实体瘤癌症是IIIB期、IIIC期或IV期黑色素瘤。
实施方式A 56.如实施方式A 1-55中任一项所述的组合物，其中该受试者先前未曾接受抗PD-1或抗PD-L1疗法治疗。
实施方式A 57.如实施方式A 1-56中任一项所述的组合物，其中该实体瘤癌症是抗PD-1或抗PD-L1疗法不作为常规使用的一种癌症。
实施方式A 58.如实施方式A 1-57中任一项所述的组合物，其中该实体瘤癌症不是黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、头颈癌、乳癌或CSCC。
实施方式A 59.如实施方式A 1-58中任一项所述的组合物，其中该受试者没有其他治疗选择。
实施方式A 60.如实施方式A 1-59中任一项所述的组合物，其中
a.该实体瘤癌症不是黑色素瘤、CSCC或HNSCC；以及
b.抗PD-1或抗PD-L1疗法不是常规使用的；以及
c.没有其他合适的治疗选择。
实施方式A 61.如实施方式A 1-60中任一项所述的组合物，其中该实体瘤癌症是常规使用抗PD1或抗PD-L1疗法但尚未用该疗法治疗的一种癌症。
实施方式A 62.如实施方式A 1-61中任一项所述的组合物，其中该实体瘤癌症是对抗PD-1或抗PD-L1疗法有抗性和/或难治性的IIIB期、IIIC期或不可切除的IV期黑色素瘤。
实施方式A 63.如实施方式A 1-62中任一项所述的组合物，其中该实体瘤癌症具有浅表或皮下病变和/或转移。
实施方式A 64.如实施方式A 1-63中任一项所述的组合物，其中该受试者患有两个或三个肿瘤病变。
实施方式A 65.如实施方式A 1-64中任一项所述的组合物，其中该受试者患有可根据实体瘤反应评价标准(RECIST)1.1标准测量的疾病。
实施方式A 66.如实施方式A 1-65中任一项所述的组合物，其中该受试者的预期寿命超过3个月。
实施方式A 67.如实施方式A 1-66中任一项所述的组合物，其中该受试者为至少18岁。
实施方式A 68.如实施方式A 1-67中任一项所述的组合物，其中
a.该编码IL-12sc蛋白的RNA包含SEQ ID NO:17或18的核苷酸序列，或者与SEQ IDNO:17或18的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或
b.该IL-12sc蛋白包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列；和/或
c.该编码IL-12sc蛋白的RNA包含与IL-12sc的p40部分(SEQ ID NO:17或18的核苷酸1-984)具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性以及与IL-12sc的p30部分(SEQ ID NO:17或18的核苷酸1027-1623)具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，并且进一步包含p40和p35部分之间编码连接头多肽的核苷酸。
实施方式A 69.如实施方式A 1-68中任一项所述的组合物，其中
a.该编码IL-15 sushi蛋白的RNA包含SEQ ID NO:26的核苷酸序列，或与SEQ IDNO:26的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或
b.该IL-15 sushi蛋白包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列；和/或
c.该编码IL-15 sushi蛋白的RNA包含与IL-15受体α的sushi结构域(SEQ ID NO:26的核苷酸1-321)具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性以及与成熟IL-15(SEQ ID NO:26的核苷酸382-729)具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，并且视需要进一步包含IL-15的sushi结构域和成熟IL-15之间编码连接头多肽的核苷酸。
实施方式A 70.如实施方式A 1-69中任一项所述的组合物，其中
a.该编码IFNα蛋白的RNA包含SEQ ID NO:22或23的核苷酸序列，或者与SEQ IDNO:22或23的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，和/或
b.该IFNα蛋白包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。
实施方式A 71.如实施方式A 1-70中任一项所述的组合物，其中
a.该编码GM-CSF蛋白的RNA包含SEQ ID NO:29的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:29的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，和/或
b.该GM-CSF蛋白包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。
实施方式A 72.如实施方式A 1-71中任一项所述的组合物，其中至少一种RNA包含取代至少一个尿苷的经修饰的核苷。
实施方式A 73.如前述实施方式A 1-72中任一项所述的组合物，其中至少一种RNA包含取代每个尿苷的经修饰的核苷。
实施方式A 74.如实施方式A 1-73中任一项所述的组合物，其中每种RNA包含取代至少一个尿苷的经修饰的核苷。
实施方式A 75.如实施方式A 1-74中任一项所述的组合物，其中每种RNA包含取代每个尿苷的经修饰的核苷。
实施方式A 76.如实施方式72-75中任一项所述的组合物，其中该经修饰的核苷独立地选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。
实施方式A 77.如实施方式A 1-76中任一项所述的组合物，其中至少一种RNA包含多于一种类型的经修饰的核苷，其中所述经修饰的核苷独立地选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。
实施方式A 78.如实施方式A 77所述的组合物，其中该经修饰的核苷是N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。
实施方式A 79.如实施方式A 1-78中任一项所述的组合物，其中至少一种RNA包含5'帽m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG或3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')G。
实施方式A 80.如实施方式A 1-79中任一项所述的组合物，其中每种RNA包含5'帽m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG或3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')G。
实施方式A 81.如实施方式A 1-80中任一项所述的组合物，其中至少一种RNA包含5'UTR，该5'UTR包含选自由SEQ ID NO:4和6组成的组的核苷酸序列，或与选自由SEQ IDNO:4和6组成的组的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
实施方式A 82.如实施方式A 1-81中任一项所述的组合物，其中每种RNA包含5'UTR，该5'UTR包含选自由SEQ ID NO:4和6组成的组的核苷酸序列，或与选自由SEQ ID NO:4和6组成的组的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
实施方式A 83.如实施方式A 1-82中任一项所述的组合物，其中至少一种RNA包含3'UTR，该3'UTR包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
实施方式A 84.如实施方式A 1-83中任一项所述的组合物，其中每种RNA包含3'UTR，该3'UTR包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
实施方式A 85.如实施方式A 1-84中任一项所述的组合物，其中至少一种RNA包含聚A尾。
实施方式A 86.如实施方式A 1-85中任一项所述的组合物，其中每种RNA包含聚A尾。
实施方式A 87.如实施方式A 84或A 85所述的组合物，其中该聚A尾包含至少100个核苷酸。
实施方式A 88.如实施方式A 85-87中任一项所述的组合物，其中该聚A尾包含SEQID NO:30所示的聚A尾。
实施方式A 89.如实施方式A 1-88中任一项所述的组合物，其中一种或多种RNA包括：
a.5'帽，该5'帽包含m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG或3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')G；
b.5'UTR，该5'UTR包含(i)选自由SEQ ID NO:4和6组成的组的核苷酸序列，或(ii)与选自由SEQ ID NO:4和6组成的组的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；
c.3'UTR，该3'UTR包含(i)SEQ ID NO:8的核苷酸序列，或(ii)与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；以及
d.包含至少100个核苷酸的聚A尾。
实施方式A 90.如实施方式A 89所述的组合物，其中该聚A尾包含SEQ ID NO:30。
实施方式A 91.如实施方式A 1-90中任一项所述的组合物，其中该组合物用于治疗人的晚期、不可切除或转移性实体瘤癌症。
实施方式A 92.如实施方式A 1-91中任一项所述的组合物，其中在受试者中治疗实体瘤包括减小肿瘤大小或预防癌症转移。
实施方式A 93.如实施方式A 1-92中任一项所述的组合物，其中所述RNA同时施用。
实施方式A 94.如实施方式A 1-93中任一项所述的组合物，其中所述RNA通过注射施用。
实施方式A 95.如实施方式A 93或A 94所述的组合物，其中在注射之前将所述RNA在液体溶液中混合在一起。
实施方式A 96.如实施方式A1-A96中任一项所述的组合物，其中该实体瘤癌症包括淋巴瘤。
实施方式A 97.如实施方式A1-A96中任一项所述的组合物，其中该实体瘤癌症包括何杰金氏淋巴瘤。
实施方式A 98.如实施方式A1-A96中任一项所述的组合物，其中该实体瘤癌症包括非何杰金氏淋巴瘤。
本申请的其他实施方式如下：
实施方式B1.一种治疗晚期、不可切除的或转移性实体瘤癌症的方法，包括对患有晚期、不可切除的或转移性实体瘤癌症的受试者施用
i.编码IL-12sc蛋白的RNA、编码IL-15 sushi蛋白的RNA、编码IFNα蛋白的RNA和编码GM-CSF蛋白的RNA；以及
ii.抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)抗体，
从而治疗晚期、不可切除的或转移性实体瘤癌症。
实施方式B 2.如实施方式B1所述的方法，其中该实体瘤癌症是III期，III期子集，IV期或IV期子集。
实施方式B 3.如前述实施方式中任一所述的方法，其中该实体瘤癌症是晚期且不可切除的。
实施方式B 4.如前述实施方式中任一所述的方法，其中该实体瘤已经从其起源扩散到受试者的另一个部位。
实施方式B 5.如前述实施方式中任一所述的方法，其中该实体瘤癌症是III期、IIIB期、IIIC期或IV期癌症。
实施方式B 6.如实施方式B5的方法，其中该IV期癌症是不可切除的。
实施方式B 7.如前述实施方式中任一所述的方法，其中该实体瘤癌症是黑色素瘤、皮肤鳞状上皮细胞癌(CSCC)、头颈部鳞状上皮细胞癌(HNSCC)、非小细胞肺癌、肾癌、头颈癌、甲状腺癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、乳癌或其他适于瘤内注射的实体瘤。
实施方式B 8.如前述实施方式中任一所述的方法，其中该实体瘤癌症是黑色素瘤。
实施方式B 9.如前述实施方式中任一所述的方法，其中该实体瘤癌症是乳癌，例如，乳腺肉瘤、三阴性乳癌。
实施方式B 10.如前述实施方式中任一所述的方法，其中该实体瘤癌症是卵巢癌。
实施方式B 11.如实施方式B10所述的方法，其中该卵巢癌对基于铂的化学疗法具有抗性。
实施方式B 12.如前述实施方式中任一所述的方法，其中该实体瘤癌症是甲状腺癌。
实施方式B 13.如实施方式B12的方法，其中该甲状腺癌是间变性甲状腺癌(ATC)。
实施方式B 14.如前述实施方式中任一所述的方法，其中该实体瘤癌症具有一处或多处皮肤或皮下病变(例如，转移)，但不是皮肤癌。
实施方式B 15.如前述实施方式中任一所述的方法，其中该实体瘤癌症是IIIB期、IIIC期或IV期黑色素瘤。
实施方式B 16.如前述实施方式中任一所述的方法，其中该受试者是抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)或抗程序性细胞死亡因子1配体(PD-L1)疗法失败或对其变得不耐受、有抗性或难治的。
实施方式B 17.如前述实施方式中任一所述的方法，其中该实体瘤癌症是黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、头颈癌。
实施方式B 18.如前述实施方式中任一所述的方法，其中该受试者先前未曾接受抗PD-1或抗PD-L1疗法治疗。
实施方式B 19.如前述实施方式中任一所述的方法，其中该实体瘤癌症是抗PD-1或抗PD-L1疗法不作为常规使用的一种癌症。
实施方式B 20.如实施方式B19所述的方法，其中该实体瘤癌症不是黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、头颈癌、皮肤鳞状上皮细胞癌(CSCC)、头颈部鳞状上皮细胞癌(HNSCC)。
实施方式B 21.如前述实施方式中任一所述的方法，其中该受试者没有其他治疗选择。
实施方式B 22.如实施方式B1所述的方法，其中
a.该实体瘤癌症不是黑色素瘤、皮肤鳞状上皮细胞癌或头颈部鳞状上皮细胞癌；以及
b.抗PD-1或抗PD-L1疗法不是常规使用的；以及
c.没有其他合适的治疗选择。
实施方式B 23.如前述实施方式中任一所述的方法，其中该实体瘤癌症是常规使用抗PD1或抗PD-L1疗法但尚未用该疗法治疗的癌症(例如头颈癌、HNSCC或CSCC)。
实施方式B 24.如实施方式B1所述的方法，其中该实体瘤癌症是对抗PD-1或抗PD-L1疗法有抗性和/或难治性的IIIB期、IIIC期或不可切除的IV期黑色素瘤。
实施方式B 25.如实施方式B1所述的方法，其中该实体瘤癌症是对抗PD-1或抗PD-L1疗法有抗性和/或难治性的皮肤鳞状上皮细胞癌或头颈部鳞状上皮细胞癌的III期或不可切除的IV期。
实施方式B 26.如前述实施方式中任一所述的方法，其中该实体瘤癌症具有浅表或皮下病变和/或转移。
实施方式B 27.如前述实施方式中任一所述的方法，其中该实体瘤癌症是上皮肿瘤、前列腺肿瘤、卵巢肿瘤、肾细胞肿瘤、胃肠道肿瘤、肝肿瘤、大肠直肠肿瘤、脉管系统肿瘤、间皮瘤、胰腺肿瘤、乳房肿瘤、肉瘤、肺肿瘤、结肠肿瘤、黑色素瘤、小细胞肺肿瘤、神经母细胞瘤、睾丸肿瘤、上皮癌肿瘤、腺癌肿瘤、精原细胞瘤、视网膜母细胞瘤、皮肤鳞状上皮细胞癌(CSCC)、头颈部鳞状上皮细胞癌(HNSCC)、头颈癌或骨肉瘤。
实施方式B 28.如前述实施方式中任一所述的方法，其中该受试者患有两个或三个肿瘤病变。
实施方式B 29.如前述实施方式中任一所述的方法，其中该受试者患有可根据实体瘤反应评价标准(RECIST)1.1标准测量的疾病。
实施方式B 30.如前述实施方式中任一所述的方法，其中该受试者的预期寿命超过3个月。
实施方式B 31.如前述实施方式中任一所述的方法，其中该受试者为至少18岁。
实施方式B 32.一种治疗晚期黑色素瘤、皮肤鳞状上皮细胞癌或头颈部鳞状上皮细胞癌的方法，包括
对患有晚期黑色素瘤、皮肤鳞状上皮细胞癌或头颈部鳞状上皮细胞癌的受试者施用，
i.编码IL-12sc蛋白的RNA、编码IL-15 sushi蛋白的RNA、编码IFNα蛋白的RNA和编码GM-CSF蛋白的RNA；以及
ii.抗PD1抗体，
其中
a.该受试者为至少18岁；
b.该受试者先前的抗PD1或抗PD-L1疗法失败；
c.该受试者至少有2处病变；以及
d.该黑色素瘤包括适合于直接瘤内注射的肿瘤。
实施方式B 33.如实施方式B 32所述的方法，其中该受试者患有可根据实体瘤反应评价标准(RECIST)1.1标准测量的疾病。
实施方式B 34.如实施方式B 32所述的方法，其中该受试者的预期寿命超过3个月。
实施方式B 35.如前述实施方式中任一所述的方法，其中该抗PD1抗体是西米单抗、派姆单抗、纳武单抗、MEDI0608、PDR001、PF-06801591、BGB-A317、皮地珠单抗、TSR-042、AGEN-2034、A-0001、BGB-108、BI-754091、CBT-501、ENUM-003、ENUM-388D4、IBI-308、JNJ-63723283、JS-001、JTX-4014、JY-034、CLA-134、STIA-1110、244C8或388D4。
实施方式B 36.如前述实施方式中任一所述的方法，其中该抗PD1抗体是西米单抗。
实施方式B 37.如前述实施方式中任一所述的方法，其中该抗PD1抗体以约0.1-600mg的剂量施用。
实施方式B 38.如前述实施方式中任一所述的方法，其中该抗PD1抗体以200mg、240mg或350mg的剂量施用。
实施方式B 39.如前述实施方式中任一所述的方法，其中该抗PD1抗体通过注射施用。
实施方式B 40.如前述实施方式中任一所述的方法，其中该抗PD1抗体通过静脉内施用。
实施方式B 41.如前述实施方式中任一所述的方法，其中该抗PD-1抗体每三周施用一次。
实施方式B 42.如前述实施方式中任一所述的方法，其中所述RNA是瘤内注射的。
实施方式B 43.如前述实施方式中任一所述的方法，其中所述RNA和抗PD-1抗体持续施用约8个月。
实施方式B 44.如前述中任一所述的方法，其中所述RNA每周施用一次。
实施方式B 45.如前述实施方式中任一所述的方法，其中所述RNA持续施用最多52周。
实施方式B 46.如前述实施方式中任一所述的方法，其中该IFNα蛋白是IFNα2b蛋白。
实施方式B 47.如前述实施方式中任一所述的方法，其中
a.该编码IL-12sc蛋白的RNA包含SEQ ID NO:17或18的核苷酸序列，或者与SEQ IDNO:17或18的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或
b.该IL-12sc蛋白包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列；和/或
c.该编码IL-12sc蛋白的RNA包含与IL-12sc的p40部分(SEQ ID NO:17或18的核苷酸1-984)具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性以及与IL-12sc的p30部分(SEQ ID NO:17或18的核苷酸1027-1623)具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，并且进一步包含p40和p35部分之间编码连接头多肽的核苷酸。
实施方式B 48.如前述实施方式中任一所述的方法，其中
a.该编码IL-15 sushi蛋白的RNA包含SEQ ID NO:26的核苷酸序列，或与SEQ IDNO:26的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或
b.该IL-15 sushi蛋白包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列；和/或
c.该编码IL-15 sushi蛋白的RNA包含与IL-15受体α的sushi结构域(SEQ ID NO:26的核苷酸1-321)具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性以及与成熟IL-15(SEQ ID NO:26的核苷酸382-729)具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，并且视需要进一步包含IL-15的sushi结构域和成熟IL-15之间编码连接头多肽的核苷酸。
实施方式B 49.如前述实施方式中任一所述的方法，其中
a.该编码IFNα蛋白的RNA包含SEQ ID NO:22或23的核苷酸序列，或者与SEQ IDNO:22或23的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，和/或
b.该IFNα蛋白包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。
实施方式B 50.如前述实施方式中任一所述的方法，其中
a.该编码GM-CSF蛋白的RNA包含SEQ ID NO:29的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:29的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，和/或
b.该GM-CSF蛋白包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。
实施方式B 51.如前述实施方式中任一所述的方法，其中至少一种RNA包含取代至少一个尿苷的经修饰的核苷。
实施方式B 52.如前述实施方式中任一所述的方法，其中至少一种RNA包含取代每个尿苷的经修饰的核苷。
实施方式B 53.如前述实施方式中任一所述的方法，其中每种RNA包含取代至少一个尿苷的经修饰的核苷。
实施方式B 54.如前述实施方式中任一所述的方法，其中每种RNA包含取代每个尿苷的经修饰的核苷。
实施方式B 55.如实施方式B 51-54中任一所述的方法，其中该经修饰的核苷独立地选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。
实施方式B 56.如前述实施方式中任一所述的方法，其中至少一种RNA包含多于一种类型的经修饰的核苷，其中所述经修饰的核苷独立地选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。
实施方式B 57.如实施方式B 56所述的方法，其中该经修饰的核苷是N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。
实施方式B 58.如前述实施方式中任一所述的方法，其中至少一种RNA包含5'帽m27,3'-OGppp(m12'-O)ApG或3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')G。
实施方式B 59.如前述实施方式中任一所述的方法，其中每种RNA包含5'帽m27,3'-OGppp(m12'-O)ApG或3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')G。
实施方式B 60.如前述实施方式中任一所述的方法，其中至少一种RNA包含5'UTR，该5'UTR包含选自由SEQ ID NO:4和6组成的组的核苷酸序列，或与选自由SEQ ID NO:4和6组成的组的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
实施方式B 61.如前述实施方式中任一所述的方法，其中每种RNA包含5'UTR，该5'UTR包含选自由SEQ ID NO:4和6组成的组的核苷酸序列，或与选自由SEQ ID NO:4和6组成的组的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
实施方式B 62.如前述实施方式中任一所述的方法，其中至少一种RNA包含3'UTR，该3'UTR包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
实施方式B 63.如前述实施方式中任一所述的方法，其中每种RNA包含3'UTR，该3'UTR包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
实施方式B 64.如前述实施方式中任一所述的方法，其中至少一种RNA包含聚A尾。
实施方式B 65.如前述实施方式中任一所述的方法，其中每种RNA包含聚A尾。
实施方式B 66.如实施方式B 64或65所述的方法，其中该聚A尾包含至少100个核苷酸。
实施方式B 67.如实施方式B 64或65所述的方法，其中该聚A尾包括SEQ ID NO:30所示的聚A尾。
实施方式B 68.如前述实施方式中任一所述的方法，其中一种或多种RNA包括：
a.5'帽，该5'帽包含m27,3'-OGppp(m12'-O)ApG或3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')G；
b.5'UTR，该5'UTR包含(i)选自由SEQ ID NO:4和6组成的组的核苷酸序列，或(ii)与选自由SEQ ID NO:4和6组成的组的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；
c.3'UTR，该3'UTR包含(i)SEQ ID NO:8的核苷酸序列，或(ii)与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；以及
d.包含至少100个核苷酸的聚A尾。
实施方式B 69.如实施方式B 68所述的方法，其中该聚A尾包含SEQ ID NO:30。
实施方式B 70.如前述实施方式中任一所述的方法，其中该受试者是人类。
实施方式B 71.如前述实施方式中任一所述的方法，其中在受试者中治疗实体瘤包括减小肿瘤大小或预防癌症转移。
实施方式B 72.如前述实施方式中任一所述的方法，其中所述RNA同时施用。
实施方式B 73.如前述实施方式中任一所述的方法，其中所述RNA通过注射施用。
实施方式B 74.如实施方式B 72或73所述的方法，其中在注射之前将所述RNA在液体溶液中混合在一起。
【附图说明】
[图1A]示出了治疗的示例性总体设计。
[图1B]示出了作为单一疗法施用细胞介素RNA混合物的示例性治疗方案。
[图1C]示出了作为抗PD-1抗体的组合疗法施用细胞介素RNA混合物的示例性治疗方案。
[图2A-2I]示出了对抗PD-1疗法的获得性抗性的鼠模型的创建和表征。图2A-2B示出了PD-1抗性肿瘤是的产生。图2A系体内传代方法的示意图。简而言之，对携带MC38肿瘤的C57BL6小鼠用抗PD-1抗体(殖株RMP1-14)进行治疗，切除生长中的肿瘤，并在植入初试小鼠之前离体培养来自所述肿瘤的细胞。图2B示出了在用10mg/kg抗PD-1抗体治疗的C57BL6/J小鼠中植入的MC38和MC38抗性肿瘤细胞系的肿瘤生长曲线(n＝5/组)。如箭头所示施用抗体治疗。图2C-2E表明，MC38抗性细胞没有表现出PD-1抗性的已知分子机制。在体外培养MC38和MC38抗性细胞，并通过流式细胞分析技术测定不同蛋白质的表现。图2C是示出PD-L1、B2M以及IFNGR1和IFNGR2的表面表现的一系列图。线条，未染色；填充，染色的样本。图2D是示出体外IFNγ治疗后PD-L1表现的图。图2E是示出SIINFEKL-MHC I复合物在OVA转导的细胞中的表现的图。对细胞进行转导以表现卵清蛋白，并测定在MHCI中SIINFEKL的呈递。图2F-2I示出了切除并且通过RNA定序分析的皮下肿瘤。图2F示出了与亲本MC38(n＝16)相比，在抗性肿瘤(n＝13)中失调的许多基因的整体基因表现。图2G显示在MC38抗性肿瘤中IFNγ靶基因的表现降低。图2H示出了MCPCounter分析，该分析估计了相对免疫丰度，揭示了T、NK、B细胞谱系和单核细胞谱系细胞显著减少。*，p<0.05。图2I示出了通过流式细胞分析技术在CD8+T细胞(CD45+CD3+CD4-CD8+)、CD4+T细胞(CD45+CD3+CD4+CD8-)、巨噬细胞(CD45+CD11b+F4/80+)和天然杀伤细胞(CD45+CD3-CD49b+NK1.1+)中的免疫渗滤。结果代表两个独立的实验，每组n＝9。*表示p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。
[图3]显示MC38抗性细胞不表现PD-L2。在体外培养MC38和MC38抗性细胞，并通过流式细胞分析技术测定不同蛋白质的表现。示出了IFNγ治疗后的PD-L2表现。
[图4A-4B]显示通过免疫组织化学染色，抗性肿瘤中免疫细胞的频率降低。通过免疫组织化学染色分析了石蜡包埋的MC38和MC38抗性肿瘤对CD45+细胞(深色)之浸润。结果代表了两个独立的实验；每组n＝10个肿瘤。图4A示出了代表性图像。图4B示出了定量。
[图5A-5B]显示抗性肿瘤的免疫原性降低。细胞毒性T淋巴细胞(CTL)培养物系从携带亲本MC38肿瘤的5只个体C57BL6小鼠中产生的，所述小鼠表现出响应于PD-1阻断的完全消退。将CTL与MC38和抗性肿瘤细胞共培养，并测量杀伤(图4A)和IFNγ释放(图5B)。
[图6A-6D]显示，如通过肿瘤负荷所测量的，通过瘤内注射细胞介素RNA混合物成功治疗了携带皮下MC38或MC38抗性肿瘤的C57BL6/J小鼠(图6B和6D)。每四天(如箭头所示)以40μg总mRNA的剂量施用mRNA治疗。「Luc」(图6A和6C)表示荧光素酶对照mRNA。
[图7]显示，如通过总体存活率所测量的，通过瘤内注射细胞介素RNA混合物成功治疗了携带皮下MC38或MC38抗性肿瘤的C57BL6/J小鼠。每四天(如箭头所示)以40μg总mRNA的剂量施用mRNA治疗。「Luc」表示荧光素酶对照mRNA。
[图8A-8B]示出了MC38(图8A)和B2M缺失的MC38(图8B)中β-2微球蛋白(B2M)表面表现的流式细胞分析技术分析。
[图9A-9D]显示，细胞介素RNA混合物与抗PD-1抗体的组合提高了双侧B16F10癌症模型(图9A)和MC38肿瘤模型(图9B)的存活率。用细胞介素RNA混合物治疗的单侧MC38-B2M基因敲除(图9C)或带有MC38-B2M基因敲除/MC38-WT肿瘤的异源双侧模型(图9D)的总体存活率。
[图10]示出了在各种体内实体瘤癌症模型中，在细胞介素mRNA混合物、抗PD-1或者细胞介素mRNA混合物与抗PD-1疗法的组合治疗后肿瘤体积的变化。数值对应于相对于基线的肿瘤体积变化(ΔT/ΔC，％)。通过从所有对照小鼠都仍存活的最后一天的肿瘤体积中减去第一次治疗当天的肿瘤体积来计算每个治疗组(T)和媒介物对照组(C)的每只动物的肿瘤体积变化。计算治疗组之中位数ΔT，并计算媒介物对照组的中位数ΔC。计算比率ΔT/ΔC，并将其用百分比表示。
[图11]示出了「瘤周」(「peri-tumorally」或「peri-tumoral」)区域，该区域约2mm宽并且与肿瘤外围的浸润前沿相邻。瘤周区域包括宿主组织。
序列说明
[表1]提供了本申请引用的某些序列的列表。
Figure BDA0003173652780000311
Figure BDA0003173652780000321
Figure BDA0003173652780000331
Figure BDA0003173652780000341
Figure BDA0003173652780000351
Figure BDA0003173652780000361
Figure BDA0003173652780000371
Figure BDA0003173652780000381
Figure BDA0003173652780000391
Figure BDA0003173652780000401
Figure BDA0003173652780000411
Figure BDA0003173652780000421
【实施方式】
1.定义
如本申请所用，「细胞介素RNA混合物」，有时也称为「细胞介素mRNA混合物」、「mRNA细胞介素混合物」或「RNA细胞介素混合物」，包括编码IFNα的RNA、编码IL-15 sushi的RNA、编码IL-12sc的RNA和编码GM-CSF的RNA，如本申请所述。
「PD-1」也可以称为「程序性细胞死亡因子1」或「程序性细胞死亡-1」。「PD-L1」也可以称为「程序性细胞死亡因子1配体」、「程序性细胞死亡-1配体1」或「程序性细胞死亡-配体1」。
如本申请所用，「晚期实体瘤癌症」有时在本申请中称为「晚期实体瘤」或「晚期实体瘤癌」包括按已知的系统，例如美国癌症联合委员会(AJCC)开发的肿瘤、结节和转移(TNM)分期系统(参见AJCC Cancer Staging Manual[AJCC癌症分期手册],第8版)评估，其分期被鉴定为III期、III期子集、IV期或IV期子集的实体瘤癌症。在一些实施方式中，该TNM分期系统用于除黑色素瘤以外的实体瘤癌症。在一些实施方式中，该癌症是黑色素瘤或晚期黑色素瘤，包括按照AJCC黑色素瘤分期(2018年第8版)评估的IIIB期、IIIC期或V期。关于AJCC黑色素瘤分期的非限制性描述提供于Gershenwald JE,Scolyer RA,Hess KR等人Melanoma of the skin.[皮肤黑色素瘤]于:Amin MB编AJCC Cancer Staging Manual.[AJCC癌症分期手册],第8版,芝加哥,伊利诺斯州:AJCC-Springer[施普林格]；2017:563-585，其全部内容通过引用并入本申请。在一些实施方式中，该癌症是皮肤鳞状上皮细胞癌(CSCC)或头颈部鳞状上皮细胞癌(HNSCC)，两者都可能是晚期的。对于所有主要癌症都存在类似的分期系统，并且通常基于肿瘤的临床和/或病理学详情以及所述因子经显示如何影响生存率。
「肿瘤」在本申请中也可以称为「赘生物(neoplasm)」。例如，术语「实体瘤」和「实体赘生物」是可互换的。
「不可切除的」(例如，晚期不可切除的)癌症典型地是无法通过手术去除的。
RECIST(实体瘤(也称肿瘤)反应评价标准)提供了一种评价实体瘤中癌症治疗剂的活性和功效的方法。RECIST指南是由RECIST工作组创建的，包括来自欧洲癌症研究与治疗组织、美国国家癌症研究所和加拿大癌症试验组以及几家制药公司的代表，并且RECIST指南在Eisenhauer EA,Therasse P,Bogaerts J等人New response evaluation criteriain solid tumours:Revised RECIST guideline(version 1.1)[新实体瘤反应评价标准：修订的RECIST指南(1.1版)]Eur J Cancer.[欧洲癌症杂志]45(2009)228-247中发表，其全部内容通过引用并入本申请。该指南的第4.3.1节(Eisenhauer的第232-233页)提供了有关靶标病变评价的以下内容：
完全反应(CR)：所有靶标病变消失。任何病理性淋巴结(无论是靶标还是非靶标)的短轴都必须减小至<10mm。
部分反应(PR)：以基线总和直径为参考，靶标病变的直径总和至少减少30％。
疾病进展(PD)：在研究时以最小总和作为参考(如果研究中基线总和最小，则包括基线总和)，靶标病变直径总和至少增加20％。除了20％的相对增加外，该总和还必须显示至少5mm的绝对增加。(注意：一个或多个新病变的出现也被视为进展)。
疾病稳定(SD)：在研究时以最小直径总和作为参考，既没有足以评定PR的缩减，也没有足以评定PD的增加。
该指南的第4.3.3节(Eisenhauer的第233页)提供了有关非靶标病变评价的以下内容：
尽管一些非靶标病变实际上可以测量，但它们无需测量，而应仅在方案中指定的时间点进行定性评估。
完全反应(CR)：所有非靶标病变消失，肿瘤标志物水平正常化。所有淋巴结都必须是非病理性的大小(短轴<10mm)。
非CR/非PD：一个或多个非靶标病变的持续存在和/或肿瘤标志物水平维持在正常界线以上。
疾病进展(PD)：现有非靶标病变的明确进展。(注意：一个或多个新病变的出现也视为进展)。
对抗PD-1或抗PD-L1疗法具有「先天性」或「原发性」抗性的受试者最初不会对抗PD-1或抗PD-L1疗法产生反应。具有先天或原发性抗性的受试者从未表现出对PD-1/PD-L1阻断的临床反应。参见，例如，Sharma等人(2017)Cell[细胞]168:707-723第709页；另请参见，Hugo等人(2016)Cell[细胞]165(1)35-44；另请参见，Nowicki等人(2018)Cancer J.[癌症杂志]24(1):47-53，其全部内容通过引用并入本申请。在一些实施方式中，对抗PD-1或抗PD-L1疗法具有先天性抗性的受试者在用抗PD-1或抗PD-L1疗法(任何时间长度)治疗后的特征在于根据RECIST标准(1.1版)为疾病进展或疾病稳定。在一些实施方式中，对抗PD-1或抗PD-L1疗法具有先天性抗性的受试者在用抗PD-1或抗PD-L1疗法(任何时间长度)治疗后的特征在于包含存活癌细胞的非靶标病变的非CR/非PD。在一些实施方式中，对抗PD-1疗法具有先天性抗性的受试者在用抗PD-1疗法(任何时间长度)治疗后的特征在于根据RECIST标准(1.1版)为疾病进展。在一些实施方式中，对抗PD-L1疗法具有先天性抗性的受试者在用抗PD-L1疗法(任何时间长度)治疗后的特征在于根据RECIST标准(1.1版)为疾病进展。在一些实施方式中，对抗PD-1疗法具有先天性抗性的受试者在用抗PD-1疗法(任何时间长度)治疗后的特征在于根据RECIST标准(1.1版)为疾病稳定。在一些实施方式中，对抗PD-L1疗法具有先天性抗性的受试者在用抗PD-L1疗法(任何时间长度)治疗后的特征在于根据RECIST标准(1.1版)为疾病稳定。在一些实施方式中，对抗PD-1或抗PD-L1疗法具有先天性抗性的受试者在用抗PD-1或抗PD-L1疗法(任何时间长度)治疗后的特征在于实体瘤的最长直径增加至少20％和/或出现一个或多个新的实体瘤。在一些实施方式中，对抗PD-1具有先天性抗性的受试者在用抗PD-1疗法(任何时间长度)治疗后的特征在于实体瘤的最长直径增加至少20％和/或出现一个或多个新的实体瘤。在一些实施方式中，对抗PD-L1疗法具有先天性抗性的受试者在用抗PD-L1疗法(任何时间长度)治疗后的特征在于实体瘤的最长直径增加至少20％和/或出现一个或多个新的实体瘤。在一些实施方式中，该最长直径的增加为至少5mm的增加。在一些实施方式中，该时间长度为约6个月、约8个月或至少6或8个月。在一些实施方式中，该时间长度为2、3、6、12个月或更长。在一些实施方式中，该实体瘤是原发性肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是可注射肿瘤。在一些实施方式中，已向该实体瘤注射了细胞介素mRNA混合物。在一些实施方式中，已选择该实体瘤注射细胞介素mRNA混合物。在一些实施方式中，该实体瘤为最长直径≥0.5cm的皮下病变。在一些实施方式中，该实体瘤在一组融合的多个可注射合并病变中。在一些实施方式中，该实体瘤在一组融合的多个可注射合并病变中，该病变的最长直径(所有累及靶标病变的直径的总和)≥0.5cm。在一些实施方式中，该实体瘤没有出血或渗液。在一些实施方式中，该实体瘤的最长直径为至少10mm(例如，如通过计算机断层摄影(CT)扫描或卡尺测量的)。在一些实施方式中，该实体瘤在受试者的胸部中，并且该实体瘤的最长直径为至少20mm(例如，如通过胸部X射线测量的)。在一些实施方式中，该实体瘤在淋巴结中。在一些实施方式中，该淋巴结在短轴上至少为15mm(例如，当通过CT扫描评估时)。在一些实施方式中，该实体瘤是淋巴瘤。在一些实施方式中，对抗PD-1或抗PD-L1疗法具有先天性抗性的受试者在用抗PD-1或抗PD-L1疗法治疗(任何时间长度)后的特征在于根据卢加诺分类为无反应或疾病稳定。本申请所提到的卢加诺分类的版本描述于Cheson等人2014 J Clin Oncol.[临床肿瘤学杂志]32(27):3059-68，其全部内容通过引用并入本申请。在一些实施方式中，对抗PD-1或抗PD-L1疗法具有先天性抗性的受试者在用抗PD-1或抗PD-L1疗法治疗(任何时间长度)后的特征在于根据卢加诺分类为疾病进展。在一些实施方式中，对抗PD-1或抗PD-L1疗法具有先天性抗性的受试者在用抗PD-1或抗PD-L1疗法治疗(任何时间长度)后的特征在于根据卢加诺分类为淋巴结内的淋巴瘤。在一些实施方式中，对抗PD-1或抗PD-L1疗法具有先天性抗性的受试者在用抗PD-1或抗PD-L1疗法(任意时间长度)治疗后的特征在于患有淋巴结内的淋巴瘤，其中该淋巴结(i)大于1.5cm的最大直径，并且(ii)与最低点垂直直径(perpendicular diameter，PPD)的乘积相比增加至少50％。在一些实施方式中，该最长直径的增加为至少5mm的增加。在一些实施方式中，该时间长度为约6周、约8周或至少6或8周。在一些实施方式中，该时间长度为2、3、6、12个月或更长时间。
对抗PD-1或抗PD-L1疗法具有「获得性」或「适应性」抗性的受试者最初对治疗有反应(例如，任何水平的反应)，但是在一段时间后复发并进展。在一些实施方式中，根据RECIST标准(1.1版)评估对治疗的反应。在一些实施方式中，在尽管最初为完全反应或部分反应而治疗时最终进展(全部根据RECIST标准(1.1版))的受试者中观察到对抗PD-1或抗PD-L1疗法的获得性或适应性抗性。在一些实施方式中，在对重新启动抗PD-1或抗PD-L1疗法治疗无反应的受试者中观察到对抗PD-1或抗PD-L1疗法的获得性或适应性抗性。参见，Sharma等人(2017)Cell[细胞]168:707-723第708页；另请参见Nowicki等人(2018)CancerJ.[癌症杂志]24(1):47-53，其全部内容通过引用并入本申请。在一些实施方式中，对抗PD-1疗法具有适应性抗性的受试者包含实体瘤，其体积(i)在抗PD-1疗法开始后持续一段时间减小；并且然后(ii)在这段时间后增加，尽管继续进行抗PD-1疗法。在一些实施方式中，对抗PD-L1疗法具有适应性抗性的受试者包含实体瘤，其体积(i)在抗PD-L1疗法开始后持续一段时间减小；并且然后(ii)在这段时间后增加，尽管继续进行抗PD-L1疗法。在一些实施方式中，该适应性抗性与获得的抗性的潜在机制有关。在一些实施方式中，该适应性抗性与突变或表观遗传变化有关。在一些实施方式中，该适应性抗性与B2M基因在的突变有关。在一些实施方式中，该时间段为从6个月到12个月。在一些实施方式中，该时间段为从6个月到18个月。在一些实施方式中，该时间段为从6个月到36个月。在一些实施方式中，该时间段为从3个月到9个月。在一些实施方式中，该时间段为从3个月到24个月。在一些实施方式中，该时间段为从12个月到24个月。在一些实施方式中，该时间段为至少约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月、约13个月、约14个月、约15个月、约16个月、约17个月、约18个月、约19个月、约20个月、约21个月、约22个月、约23个月或约24个月。在一些实施方式中，该时间段为从至少约4个月。在一些实施方式中，该时间段为从至少约6个月。在一些实施方式中，该时间段为从至少约12个月。在一些实施方式中，该时间段为从至少约24个月。在一些实施方式中，该时间段为从至少约30个月。在一些实施方式中，该时间段为从至少约36个月。在一些实施方式中，对抗PD-1或抗PD-L1疗法具有适应性抗性的受试者在治疗期间的任何时间点的特征在于完全反应，并且此后(且在治疗期间)的特征在于疾病进展(全部根据RECIST标准(1.1版))。在一些实施方式中，对抗PD-1或抗PD-L1疗法具有适应性抗性的受试者在治疗期间的任何时间点的特征在于部分反应，并且此后(且在治疗期间)的特征在于疾病进展或疾病稳定(根据RECIST标准(1.1版))。在一些实施方式中，对抗PD-1或抗PD-L1疗法具有适应性抗性的受试者在治疗期间的任何时间点的特征在于部分反应，并且此后(且在治疗期间)的特征在于疾病进展(根据RECIST标准(1.1版))。在一些实施方式中，对抗PD-1或抗PD-L1疗法具有适应性抗性的受试者在治疗期间的任何时间点的特征在于部分反应，并且此后(且在治疗期间)的特征在于疾病稳定(根据RECIST标准(1.1版))。在一些实施方式中，受试者中肿瘤的最长直径在抗PD-1或抗PD-L1疗法开始后减小至少30％，且此后增加。在一些实施方式中，受试者中肿瘤的最长直径在抗PD-1或抗PD-L1疗法开始后减小至少30％，且之后增加至少20％。在一些实施方式中，受试者中肿瘤的最长直径在抗PD-1或抗PD-L1疗法开始后减小至少30％，且之后出现一个或多个新的实体瘤。在一些实施方式中，对抗PD-1或抗PD-L1疗法具有适应性抗性的时候在治疗期间任何时间点的特征在于实体瘤的最长直径减小至少30％，并且之后(且在治疗期间)的特征在于实体瘤的最长直径增加至少20％和/或出现一个或多个新的实体瘤。在一些实施方式中，最长直径的增加为至少5mm的增加。在一些实施方式中，对抗PD-1或抗PD-L1疗法具有适应性抗性的受试者在治疗期间任何时间点的特征在于实体瘤(例如，如果多于一个实体瘤存在，则为存在的每个实体瘤)的消失，并且之后(且在治疗期间)的特征在于实体瘤的重现(例如，在与消失的实体瘤相同的位置)。在一些实施方式中，该实体瘤是原发性肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是可注射肿瘤。在一些实施方式中，已向该肿瘤注射了细胞介素mRNA混合物。在一些实施方式中，已选择该肿瘤注射细胞介素mRNA混合物。在一些实施方式中，该实体瘤为最长直径≥0.5cm的皮下病变。在一些实施方式中，该实体瘤在一组融合的多个可注射合并病变中。在一些实施方式中，该实体瘤在一组融合的多个可注射合并病变中，该病变的最长直径(所有累及靶标病变的直径的总和)≥0.5cm。在一些实施方式中，该实体瘤没有出血或渗液。在一些实施方式中，该实体瘤的最长直径为至少10mm(例如，如通过计算机断层摄影(CT)扫描或卡尺测量的)。在一些实施方式中，该实体瘤在受试者的胸部中，并且该实体瘤的最长直径为至少20mm(例如，如通过胸部X射线测量的)。在一些实施方式中，该实体瘤在淋巴结中。在一些实施方式中，该淋巴结在短轴上至少为15mm(例如，当通过CT扫描评估时)。在一些实施方式中，该实体瘤是淋巴瘤。在一些实施方式中，对抗PD-1或抗PD-L1疗法具有适应性抗性的受试者在治疗期间的任何时间点的特征在于完全反应，并且此后(且在治疗期间)的特征在于疾病进展(根据卢加诺分类)。在一些实施方式中，对抗PD-1或抗PD-L1疗法具有适应性抗性的受试者在治疗期间的任何时间点的特征在于多个病变(例如，1、2、3、4、5或6个淋巴结或结外部位)垂直直径(PPD)乘积的总和至少降低50％，并且此后(且在治疗期间)的特征在于淋巴结内有淋巴瘤，其中该淋巴结具有(i)最长直径大于1.5cm，并且(ii)与最低点PPD相比增加至少50％。
「难治性」或「抗性」癌症是对指定治疗无反应的癌症。在一些实施方式中，难治性从治疗的最开始就发生。在一些实施方式中，难治性在治疗期间发生。在一些实施方式中，癌症在治疗开始之前具有抗性。在一些实施方式中，癌症对抗PD-1疗法具有难治性或抗性(即，该癌症对该疗法无反应)。在一些实施方式中，癌症对抗PD-L1疗法具有难治性或抗性(即，该癌症对该疗法无反应)。在一些实施方式中，受试者患有对指定治疗(诸如抗PD1或抗PD-L1疗法)变得难治或有抗性的癌症，例如，自首次接受该治疗以来，该受试者对治疗的反应减弱。在一些实施方式中，受试者尚未接受该治疗，但是患有典型地对该治疗无反应的癌症。
「浅表」(有时也称为「皮肤」)病变或转移系在皮肤内或在皮肤表面的病变或转移。在一些实施方式中，浅表病变或转移在表皮内。在一些实施方式中，浅表病变或转移在真皮内。在一些实施方式中，浅表病变或转移在上皮内。
「皮下」病变或转移在皮肤之下。在一些实施方式中，皮下病变或转移存在于皮下组织。
在一些实施方式中，并且在实体瘤癌症的情况下，「肿瘤病变」或「病变」系实体瘤，例如，原发性实体瘤或由另一个实体瘤的转移引起的实体瘤。
术语「鳞状细胞」是指在例如皮肤、眼睛、各种内部器官以及中空器官的内壁和一些腺体的导管中发现的任何薄的扁平细胞。
术语「皮肤鳞状上皮细胞癌」(或「CSCC」)是指始于形成上皮(皮肤外层)的细胞中的所有阶段和所有形式的癌症。术语「皮肤鳞状上皮细胞癌」与术语皮肤的「鳞状上皮细胞癌」可互换使用。
术语「头颈部的鳞状上皮细胞癌」(或「头颈部鳞状上皮细胞癌」或「HNSCC」或「头部和颈部鳞状上皮细胞癌」)是指始于鳞状细胞的所有阶段和所有形式的头部和颈部的癌症。头颈部鳞状上皮细胞癌包括(但不限于)鼻腔、鼻窦、嘴唇、口腔、唾液腺、咽喉和喉咙(音箱)的癌症。
术语「黑色素瘤」是指始于生黑色素细胞的所有阶段和所有形式的癌症。黑色素瘤典型地始于痣(皮肤黑色素瘤)，但也可能始于其他色素沈积组织，诸如眼睛或肠内。
「肿瘤累及的区域淋巴结」或「肿瘤累及的结节」是指含有转移的区域淋巴结。在一些实施方式中，肿瘤累及的区域淋巴结系临床上隐匿的肿瘤累及的区域淋巴结。在一些实施方式中，肿瘤累及的区域淋巴结系临床上可检测到的肿瘤累及的区域淋巴结。「临床上隐匿」的肿瘤累及的区域淋巴结在没有区域淋巴结转移的临床或影像学证据的情况下描述了显微镜下鉴定的区域结节转移。在一些实施方式中，通过前哨淋巴结(SLN)生检且在没有区域结节转移的临床或放射学证据的情况下检测临床上隐匿的肿瘤累及的区域淋巴结。在一些实施方式中，「临床上可检测到的」结节转移描述了具有区域结节转移的患者，该区域结节转移可通过临床、射线照相或超音波检查来鉴定，并且通常(但不是必须)通过生检来确认。
「非结节局部区域」是指由于淋巴管内或血管营养性肿瘤扩散而引起的转移，包括微卫星转移、卫星转移和在途转移。「卫星」转移是指在原发性黑色素瘤的2cm内发生的临床上明显的皮肤和/或皮下转移。
「微卫星」转移是指在对原发部位进行病理检查时发现的与原发黑色素瘤相邻或较深的显微可见的皮肤和/或皮下转移。在一些实施方式中，微卫星转移与原发性黑色素瘤完全不连续，而未受影响的基质占据了它们之间的空间。
「在途」转移是指在区域淋巴结的原发梯级和第一梯级之间的区域中距原发黑色素瘤超过2cm的距离处鉴定的临床上明显的皮肤和/或皮下转移。在一些实施方式中，卫星转移或在途转移可发生在原发性黑色素瘤的远程。
「粗糙结节」是指两个或多个结节通过转移性疾病的累及而彼此黏附。在一些实施方式中，粗糙结节系在病理实验室中宏观检查样本时鉴定出的。
「远处转移」是指已从原发性肿瘤扩散到远处器官或远处淋巴结的癌症。在一些实施方式中，该远处转移可在皮肤、皮下组织、肌肉或远处淋巴结中检测到。在一些实施方式中，该远处转移可在肺中检测到。在一些实施方式中，该远处转移可在中枢神经系统(CNS)中检测到。在一些实施方式中，该远处转移可在除CNS之外的任何其他内脏部位检测到，包括肺、心脏或消化、排泄、生殖或循环系统的器官。在一些实施方式中，远处转移存在于与含有原发性肿瘤的组织或器官不直接接触(例如，接触或直接连接)的组织或器官中。
在一些实施方式中，转移(例如，远处转移)存在于肝脏中(例如，可在其中检测到)。
「结节外延伸」(ENE)是指转移性细胞在结节转移过程中通过结节被膜向结节周围组织的延伸。向结节被膜延伸但不破坏结节被膜的囊性转移可归为ENE阴性。在一些实施方式中，该ENE阳性包括大的结外血管。在一些实施方式中，该ENE阳性从结节被膜延伸小于2mm。在一些实施方式中，该ENE阳性从淋巴结被膜延伸超过2mm或在解剖时肉眼可见。
「深度浸润」是指厚度大于6mm或浸润深度超过皮下脂肪。在一些实施方式中，浸润存在于比真皮更深的大于0.1mm的神经中。
「抑制」、「抑制性」等是指相互作用的全部或部分阻断，或生物学作用的降低。例如，抑制PD-1与PD-L1结合的抗PD1抗体可能会完全或部分阻断该相互作用。抑制T细胞活化的阻抑包括阻抑量的任何减少。抑制肿瘤的生长或转移包括减少或完全停止。
术语「有效量」是指提供期望的生物学、治疗和/或预防结果的试剂(诸如多种RNA的混合物)的量。该结果可以是疾病(诸如晚期实体瘤癌症)的一种或多种的体征、症状或病因的减少、改善、缓解、减轻、延迟、预防和/或缓和。在一些实施方式中，有效量包括足以引起实体瘤/病变缩小的量。在一些实施方式中，有效量是足以降低实体瘤的生长速率(诸如阻抑肿瘤生长)的量。在一些实施方式中，有效量是足以延迟肿瘤发展的量。在一些实施方式中，有效量是足以预防或延迟肿瘤复发的量。在一些实施方式中，有效量是足以增加受试者对肿瘤的免疫反应，从而减少、延迟、改善和/或预防肿瘤生长和/或大小和/或转移的量。有效量可以一次或分多次施用。在一些实施方式中，施用有效量(例如，包含多种mRNA的组合物)可以：(i)减少癌细胞的数量；(ii)缩小肿瘤大小；(iii)一定程度上抑制、推迟、减缓，并可以阻止癌细胞浸润到周围器官中；(iv)抑制(例如，一定程度上减缓和/或阻断或预防)转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤的发生和/或复发；和/或(vii)一定程度上缓解与癌症有关的一种或多种症状。
本申请所用的术语「联合施用」或「联合给药」等是指作为单一制剂的一部分或作为多种制剂通过相同或不同的途径施用，同时、同步或基本上同时施用两种或更多种药剂。如本申请所用，「基本上同时」是指彼此相隔约1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时或6小时以内。
在一些实施方式中，该RNA包含取代至少一个(例如，每个)尿苷的经修饰的核碱基。在一些实施方式中，该RNA包含该RNA的5'末端的Cap1结构。在一些实施方式中，该RNA包含取代至少一个(例如，每个)尿苷的经修饰的核碱基和该RNA的5'末端的Cap1结构。在一些实施方式中，该5'UTR包含SEQ ID NO:4或6。在一些实施方式中，该RNA已经经过处理以减少双股RNA(dsRNA)，例如，通过纤维素纯化(如实例中所述和本领域已知的)或通过高效液相层析法(HPLC)来处理。该「Cap1」结构可以在体外转录后通过酶促加帽或在体外转录(共转录加帽)期间生成。
在一些实施方式中，用于经修饰的RNA的构件帽如下，当共转录加帽时使用：
m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG(有时也称为m2 7,3`OG(5')ppp(5')m2'-OApG)，其结构如下：
Figure BDA0003173652780000521
以下是共转录加帽后的示例性Cap1 RNA，其中包含RNA和m2 7,3`OG(5')ppp(5')m2'- OApG：
Figure BDA0003173652780000531
以下是酶促加帽后的另一种示例性Cap1 RNA(无帽类似物)：
Figure BDA0003173652780000532
在一些实施方式中，该RNA是通过使用(在一个实施方式中)帽类似物防反转帽(ARCA帽(m2 7,3`OG(5')ppp(5')G))在体外转录(共转录加帽)过程中产生的「Cap0」结构修饰的，该帽类似物之结构如下：
Figure BDA0003173652780000533
以下是包含RNA和m2 7,3`OG(5')ppp(5')G的示例性Cap0 RNA：
Figure BDA0003173652780000541
在一些实施方式中，该「Cap0」结构系在体外转录(共转录加帽)过程中使用帽类似物β-S-ARCA(m2 7,2`OG(5')ppSp(5')G)产生的，该帽类似物之结构如下：
Figure BDA0003173652780000542
下面系包含β-S-ARCA(m2 7,2`OG(5')ppSp(5')G)和RNA的示例性Cap0 RNA。
Figure BDA0003173652780000543
如本申请所用，术语「尿嘧啶」描述可以在RNA的核酸中出现的核碱基之一。尿嘧啶之结构为：
Figure BDA0003173652780000551
如本申请所用，术语「尿苷」描述可以在RNA中存在的核苷之一。尿苷之结构为：
Figure BDA0003173652780000552
UTP(尿苷5'-三磷酸酯)具有以下结构：
Figure BDA0003173652780000553
假UTP(假尿苷5'-三磷酸酯)具有以下结构：
Figure BDA0003173652780000554
「假尿苷」系经修饰的核苷的一个实例，它系尿苷的一种异构物，其中尿嘧啶通过碳-碳键而不是氮-碳糖苷键连接至戊糖环。假尿苷的描述于，例如，Charette和Gray,Life[生命]；49:341-351(2000)。
另一个示例性的经修饰的核苷是N1-甲基-假尿苷(m1Ψ)，它具有以下结构：
Figure BDA0003173652780000561
N1-甲基-假-UTP具有以下结构：
Figure BDA0003173652780000562
另一个示例性的经修饰的核苷是5-甲基-尿苷(m5U)，它具有以下结构：
Figure BDA0003173652780000563
如本申请所用，术语「聚A尾」或「聚-A序列」是指腺苷酸残基的不间断或间断序列，所述序列典型地位于RNA分子的3'端。聚A尾或聚-A序列系本领域技术人员已知的，并且可以在本申请所述的所述RNA中出现在3'UTR之后。不间断的聚A尾的特征在于连续的腺苷酸残基。本质上，不间断的聚A尾系典型的。本申请披露的RNA可以具有在转录后通过模板非依赖性RNA聚合酶连接至RNA的游离3'末端的聚A尾，或者由DNA编码并由模板依赖性RNA聚合酶转录的聚A尾。
已经证明，约120个A核苷酸的聚A尾对转染的真核细胞中RNA的水平以及从该聚A尾的上游(5')存在的开放阅读框翻译的蛋白质的水平具有有益的影响(Holtkamp等人,2006,Blood[血液],第108卷,第4009-4017页)。
该聚A尾可以具有任何长度。在一些实施方式中，聚A尾包含，基本上由以下组成，或由以下组成：至少20、至少30、至少40、至少80或至少100且最多500、最多400、最多300、最多200个或最多150个A核苷酸，并且特别地大约120个A核苷酸。在本申请中，「基本上由……组成」是指该聚A尾中的大多数核苷酸，典型地按该聚A尾中的核苷酸的数量至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的核苷酸为A核苷酸，但允许其余核苷酸为除A核苷酸之外的其他核苷酸，例如U核苷酸(尿苷酸)、G核苷酸(鸟苷酸)或C核苷酸(胞苷酸)。在本申请中，「由……组成」是指该聚A尾中的所有核苷酸，即按该聚A尾中的核苷酸数量100％为A核苷酸。术语「核苷酸」或「A」是指腺苷酸。
在一些实施方式中，聚A尾是基于在与编码股互补的股中包含重复的dT核苷酸(脱氧胸苷酸)的DNA模板，在RNA转录的过程中，例如，在制备体外转录的RNA的过程中连接的。该编码聚A尾(编码股)的DNA序列称为聚(A)盒。
在一些实施方式中，存在于DNA的编码股中的该聚(A)盒基本上由dA核苷酸组成，但是由四个核苷酸(dA、dC、dG和dT)的随机序列中断。这种随机序列的长度可以是5至50、10至30或10至20个核苷酸。这种盒在WO 2016/005324 A1中披露，通过引用将其并入本申请。WO 2016/005324 A1中披露的任何聚(A)盒都可以用于本发明。基本上由dA核苷酸组成的，但是由具有平均分配的四个核苷酸(dA、dC、dG、dT)、长度为例如5至50个核苷酸的随机序列中断的聚(A)盒显示在DNA水平上大肠杆菌(E.coli)中质体DNA的持续增殖，且在RNA水平上仍与支持RNA稳定性方面的有益特性有关且包含了翻译效率。因此，在一些实施方式中，本申请所描述的RNA分子中包含的聚A尾基本上由A核苷酸组成，但是由四个核苷酸(A，C，G，U)的随机序列中断。这种随机序列的长度可以是5至50、10至30或10至20个核苷酸。
在一些实施方式中，除A核苷酸外，没有核苷酸在其3'端的侧翼系聚A尾，即，该聚A尾在其3'端没有被A以外的核苷酸掩蔽或跟随。
在一些实施方式中，聚A尾包含以下序列：AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAUAUGACUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO:30)，该序列也在表1中示出。
通常，「RNA」和「mRNA」可互换使用，除非上下文明确指出其中一个或另一个是适当的，诸如当「mRNA」适合用于与其他类型的RNA(rRNA或tRNA)区分以及当「RNA」适合于指在5'加帽形成mRNA之前的转录产物之结构时。
本申请中一般使用「IFNα」来描述任何干扰素αI型细胞介素，包括IFNα2b和IFNα4。
如本申请所用，术语「治疗」涵盖受试者中疾病治疗剂的任何施用或施用，并且包括抑制该疾病、阻止其发展、缓解疾病的一种或多种症状、治愈疾病或防止疾病复发。例如，实体瘤的治疗可包括减轻实体瘤的症状、减小实体瘤的大小、消除实体瘤、减少肿瘤的进一步生长，或减少或消除治疗后实体瘤的复发。治疗也可以作为有效性的生物标志物或成像或射线照相测量的变化进行测量。
如本申请所用，术语「单一疗法」是指使用一种类型的治疗的疗法，例如，单独的RNA疗法，单独的放射疗法或单独的手术，以治疗某种疾病或病症(诸如癌症)。在药物疗法中，单一疗法是指使用单一药物(该药物可以包括多种活性剂，例如，多种RNA的混合物)来治疗疾病或病症。在一些实施方式中，该单一疗法系为治疗癌症，在没有用于治疗该癌症的任何其他疗法的情况下而施用的疗法。在一些实施方式中，用于治疗癌症的单一疗法可以视需要与另一种用于减轻该癌症的症状但不能治疗癌症本身(例如，该治疗不是意在或预期会影响实体瘤的生长或大小)的治疗组合使用，但不得与任何其他针对该癌症的疗法(例如，化学治疗剂或放射疗法)组合使用。在这样的实施方式中，作为单一疗法施用多种RNA的混合物是指在没有例如放射疗法或任何化学治疗剂的情况下施用多种RNA的混合物。然而，在这样的实施方式中，作为单一疗法施用多种RNA的混合物并不排除与该多种RNA的混合物同时或同步施用不针对该癌症的药剂，例如，减轻疼痛的试剂。
如本申请所用，术语「预防」是指在被认为无癌症的受试者中抑制或阻止包括实体瘤在内的癌症的发展。
「转移」是指癌症从作为原发肿瘤最初起源的部位扩散到身体其他部位的过程。
本申请所用的术语「瘤内」(「intratumorally」或「intratumoral」)是指进入肿瘤内。例如，瘤内注射是指在接触肿瘤的任何位置注射治疗剂。
如本申请所用，「淋巴瘤」系源自淋巴细胞的实体瘤癌症。淋巴瘤包括何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤。淋巴瘤在淋巴结内形成实体瘤/赘生物，转移时也可在非淋巴结组织中发现。
如本申请所用，术语「瘤周」(「peri-tumorally」或「peri-tumoral」或「peritumoral」或「peritumorally」)系约2mm宽且与肿瘤外围的浸润前沿相邻的区域。瘤周区域包括宿主组织。参见，例如，图11。
「施用」是指向受试者提供药剂或组合物，并且包括但不限于由医学专业人员施用和自行施用。
本申请分别描述了与给定核酸序列或氨基酸序列(参考序列)具有一定程度同一性的核酸序列和氨基酸序列。
两个核酸序列之间的「序列同一性」表示序列之间相同的核苷酸的百分比。两个氨基酸序列之间的「序列同一性」表示序列之间相同的氨基酸的百分比。
术语「％相同的」、「％同一性」或类似术语特别地意在指要比较的序列之间在最佳比对中相同的核苷酸或氨基酸的百分比。所述百分比纯粹系统计上的，并且两个序列之间的差异可以是但不一定系随机分布在要比较的序列的整个长度上。两个序列的比较通常通过在最佳比对之后，相对于片段或「比较窗口」比较所述序列来进行，以鉴定相应序列的局部区域。用于比较的最佳比对可以手动进行，也可以借助Smith和Waterman,1981,AdsApp.Math.[应用数学进展]2,482的局部同源性算法，借助Neddleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48,443的局部同源性算法，借助Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]88,2444的相似性搜索算法，或借助使用所述算法的计算机程序(位于威斯康辛遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA，遗传学计算机集团(Genetics Computer GroupGenetics ComputerGroup)，威斯康星州麦迪逊科学路575号)。在一些实施方式中，使用BLASTN或BLASTP算法确定两个序列的同一性百分比，该算法可在美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站上获取(例如，blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PAGE_TYPE＝BlastSearch&BLAST_SPEC＝blast2seq&LINK_LOC＝align2seq)。在一些实施方式中，NCBI网站上用于BLASTN算法的算法参数包括：(i)预期阈值设为10；(ii)字长设为28；(iii)查询范围内的最大匹配数设为0；(iv)匹配/不匹配得分设为1,-2；(v)空位成本(Gap Cost)设为线性；以及(vi)所使用的低复杂度区域的过滤器。在一些实施方式中，在NCBI网站上用于BLASTP算法的算法参数包括：(i)期望阈值设为10；(ii)字长设为3；(iii)查询范围内的最大匹配数设为0；(iv)矩阵设为BLOSUM62；(v)空位成本设置为存在:11延伸:1；以及(vi)有条件的成分评分矩阵调整。
百分比同一性是通过确定要比较的序列对应的相同位置的数目，用该数目除以比较的位置数(例如，参考序列中的位置数)，然后将此结果乘以100得到的。
在一些实施方式中，一个区域给定的同一性程度系参考序列整个长度的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。例如，如果参考核酸序列由200个核苷酸组成，在一些实施方式中，在连续核苷酸中给出至少约100、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180或约200个核苷酸的同一性程度。在一些实施方式中，该同一性程度是对于参考序列的整个长度给出的。
分别与给定核酸序列或氨基酸序列具有特定同一性程度的核酸序列或氨基酸序列可以具有所述给定序列的至少一种功能特性，例如，在一些情况下，在功能上等同于所述给定序列。一个重要的特性包括充当细胞介素的能力，特别是当施用于受试者时。在一些实施方式中，与给定核酸序列或氨基酸序列具有特定同一性程度的核酸序列或氨基酸序列在功能上等同于该给定序列。
本申请使用的术语「抗体」涵盖各种抗体结构，包括单株抗体、多株抗体、多特异性抗体(例如，双特异性和三特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的活性即可。
术语抗体包括，能够结合抗原的片段，诸如Fv、单链Fv(scFv)、Fab、Fab'、二-scFv、sdAb(单结构域抗体)和(Fab')2(包括化学连接的F(ab')2)。术语抗体还包括嵌合抗体和人源化抗体，只要它们适合于向人施用即可。抗体片段还包括单链scFv的任一取向、串联二-scFv、双抗体、串联三-sdcFv、微型抗体等。抗体片段还包括纳米抗体(sdAb，具有单一单体结构域的抗体，诸如重链的一对可变结构域，没有轻链)。
术语「单株抗体」是指基本上同质的抗体群的抗体，即，除了可能以少量存在的可能的自然发生的突变以外，构成该抗体群的各个抗体是相同的。单株抗体针对单个抗原位点具有高度特异性。此外，对比于与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多株抗体制剂，每种单株抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，单株抗体样本可以结合抗原上的相同表位。修饰语「单株」指示获得自实质上均质的抗体群体的抗体的特征，并且不应理解为要求通过任何特定方法产生抗体。例如，所述单株抗体可以通过杂交瘤方法来制备，该方法最先由Kohler和Milstein,1975,Nature[自然]256:495描述，或者可以通过重组DNA方法来制备，诸如美国专利号4,816,567中描述的。所述单株抗体也可以从噬菌体库中分离，该噬菌体库使用例如McCafferty等人,1990,Nature[自然]348:552-554中描述的技术生成。
术语「CDR」表示通过本领域技术人员的至少一种鉴定方式确定的互补性决定区。抗体中的各种CDR可以通过其相应的数量和链类型来命名，包括但不限于：a)CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；b)CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2和CDRH3；c)LCDR-1、LCDR-2、LCDR-3、HCDR-1、HCDR-2和HCDR-3；或d)LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3；等。本申请使用的术语「CDR」还涵盖HVR或「超可变区」，包括高变环(例如，Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917(1987))。
如本申请所用，术语「重链可变区」是指包含至少三个重链CDR的区域。在一些实施方式中，该重链可变区包括三个CDR和至少FR2和FR3。在一些实施方式中，该重链可变区至少包括重链HCDR1、框架(FR)2、HCDR2、FR3和HCDR3。在一些实施方式中，重链可变区还包含FR1的至少一部分和/或FR4的至少一部分。
如本申请所用，术语「重链恒定区」是指包含至少三个重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的区域。当然，除非另外指定，否则所述结构域内不改变功能的缺失和改变涵盖在术语「重链恒定区」的范围内。非限制性示例性重链恒定区包括γ、δ和α。非限制性示例性重链恒定区还包括ε和μ。每个重恒定区对应于一个抗体同种型。例如，包含γ恒定区的抗体是IgG抗体，包含δ恒定区的抗体是IgD抗体，并且包含α恒定区的抗体是IgA抗体。此外，包含μ恒定区的抗体是IgM抗体，并且包含ε恒定区的抗体是IgE抗体。某些同种型可以进一步细分为多个亚类。例如，IgG抗体包括但不限于IgG1(包含γ1恒定区)、IgG2(包含γ2恒定区)、IgG3(包含γ3恒定区)和IgG4(包含γ4恒定区)抗体；IgA抗体包括但不限于IgA1(包含α1恒定区)和IgA2(包含α2恒定区)抗体；并且IgM抗体包括但不限于IgM1和IgM2。
如本申请所用，术语「重链」是指包含至少一个重链可变区，具有或不具有前导序列的多肽。在一些实施方式中，重链包含重链恒定区的至少一部分。如本申请所用，术语「全长重链」是指包含重链可变区和重链恒定区，具有或不具有前导序列的多肽。
如本申请所用，术语「轻链可变区」是指包含至少三个轻链CDR的区域。在一些实施方式中，该轻链可变区包括三个CDR和至少FR2和FR3。在一些实施方式中，该轻链可变区至少包括轻链LCDR1、框架(FR)2、LCDR2、FR3和LCDR3。例如，轻链可变区可包含轻链CDR1、框架(FR)2、CDR2、FR3和CDR3。在一些实施方式中，轻链可变区还包含FR1的至少一部分和/或FR4的至少一部分。
如本申请所用，术语「轻链恒定区」是指包含轻链恒定结构域CL的区域。非限制性示例性轻链恒定区包括λ和κ。当然，除非另外指定，否则所述结构域内不改变功能的缺失和改变涵盖在术语「轻链恒定区」的范围内。
如本申请所用，术语「轻链」是指包含至少一个轻链可变区，具有或不具有前导序列的多肽。在一些实施方式中，轻链包含轻链恒定区的至少一部分。如本申请所用，术语「全长轻链」是指包含轻链可变区和轻链恒定区，具有或不具有前导序列的多肽。
如本申请所用，术语「表位」是指靶分子上抗体结合的位点。表位通常包括分子例如氨基酸、多肽或糖侧链的化学活性表面分组，并且具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
除非在以上说明书中特别指出，否则说明书中列举「包括」各种组件的实施方式也被认为系「由所列举组件组成」或「基本上由所列举组件构成」；说明书中列举「由各种组件组成」的实施方式也被认为系「包括」或「基本上由所列举组件组成」；并且说明书中列举「基本上由各种组件组成」的实施方式也被认为系「由所列举组件组成」或「包括所列举组件」(这种互换性不适用于中的所述术语的使用)。如的条款中所使用的，过渡术语「包含」与「包括」、「含有」或「由……表征」同义，系包含性的或开放式的，并且不排除附加的、未列举的要素或方法步骤。如在的条款中所使用的，过渡短语「由……组成」排除了中未指定的任何要素、步骤或组件，过渡短语「基本上由……构成」将术语的范围限制为所列举的组件以及实质上不影响所要求保护的术语的基本和新颖特征的那些，正如从说明书中可以理解的。
2.施用的RNA
在一些实施方式中，包括了用于治疗晚期实体瘤癌症的方法，包括向患有晚期实体瘤癌症的受试者与抗PD-1抗体组合施用编码IL-12sc蛋白的RNA、编码IL-15 sushi蛋白的RNA、编码IFNα蛋白的RNA以及编码GM-CSF蛋白的RNA。施用的RNA的详细信息如下。
在一些实施方式中，施用RNA包括施用编码IFNα的RNA、编码IL-15 sushi的RNA、编码IL-12sc的RNA和编码GM-CSF的RNA，它们视需要经修饰以具有代替每个尿苷的经修饰的核碱基和该RNA的5'末端的Cap1结构。
在一些实施方式中，施用RNA包括施用编码IL-12sc的RNA，并且进一步包括施用编码IFNα、IL-15 sushi和GM-CSF的RNA。
在一些实施方式中，施用RNA包括施用编码IFNα的RNA，并且进一步包括施用编码IL-12sc、IL-15 sushi和GM-CSF的RNA。
在一些实施方式中，施用RNA包括施用编码IL-15 sushi的RNA，并且进一步包括施用编码IL-12sc、IFNα和GM-CSF的RNA。
在一些实施方式中，施用RNA包括施用编码GM-CSF sushi的RNA，并且进一步包括施用编码IL-12sc、IFNα和IL-15 sushi的RNA。
在一些实施方式中，该细胞介素RNA混合物中的IFNα蛋白是IFNα2b蛋白，并且该方法包括施用编码IFNα2b蛋白的RNA。
在一些实施方式中，(i)该编码IL-12sc蛋白的RNA包含SEQ ID NO:17或18的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:17或18的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，和/或(ii)该IL-12sc蛋白包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，(i)该编码IL-15 sushi蛋白的RNA包含SEQ ID NO:26的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:26的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，和/或(ii)该IL-15 sushi蛋白包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，(i)该编码IFNα蛋白的RNA包含SEQ ID NO:22或23的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:22或23的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，和/或(ii)该IFNα蛋白包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列或与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，(i)该编码GM-CSF蛋白的RNA包含SEQ ID NO:29的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:29的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，和/或(ii)该GM-CSF蛋白包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。
A.白介素-12单链(IL-12sc)
在一些实施方式中，提供了编码白介素12单链(IL-12sc)的RNA。在一些实施方式中，该白介素-12单链(IL-12sc)RNA由编码白介素-12单链(IL-12sc)的DNA序列编码(例如，SEQ ID NO:14)编码，该序列包含IL-12p40(有时称为IL-12B；由SEQ ID NO:15的核苷酸1-984编码)、连接头(诸如GS连接头)和IL-12p35(有时称为IL-12A；由SEQ ID NO:15的核苷酸1027-1623编码)。在一些实施方式中，该IL-12p40、连接头和IL-12p35系连续的，没有介于中间的核苷酸。SEQ ID NO:15提供了示例性的编码IL-12sc的DNA序列。在一些实施方式中，该白介素-12单链(IL-12sc)RNA在SEQ ID NO:17或18处提供了，两者均编码SEQ ID NO:14的蛋白质。IL-12p40的RNA序列显示在SEQ ID NO:17或18的核苷酸1-984处，并且IL-12p35的RNA序列显示在SEQ ID NO:17或18的核苷酸1027-1623处。
在一些实施方式中，该IL-12sc RNA由编码IL-12sc的密码子优化的DNA序列编码。在一些实施方式中，该IL-12sc RNA由编码IL-12p40的密码子优化的DNA序列编码。在一些实施方式中，该IL-12sc RNA由编码IL-12p35的密码子优化的DNA序列编码。在一些实施方式中，该密码子优化的DNA序列包含SEQ ID NO:16或由其组成。在一些实施方式中，该DNA序列包含与SEQ ID NO:16具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的密码子优化的DNA序列。在一些实施方式中，编码IL-12p40的密码子优化的DNA序列包含编码IL-12sc-p40的核苷酸(SEQ ID NO:16的核苷酸1-984)。在一些实施方式中，编码IL-12p35的密码子优化的DNA序列包含编码IL-12sc-p35的核苷酸(SEQ ID NO:16的核苷酸1027-1623)。在一些实施方式中，编码IL-12sc的密码子优化的DNA序列包含编码SEQ IDNO:16的IL-12sc-p40(SEQ ID NO:16的核苷酸1-984)和-p35(SEQ ID NO:16的核苷酸1027-1623)部分的核苷酸，并且进一步包含p40和p35部分之间的核苷酸(例如，SEQ ID NO:16的核苷酸985-1026)，该p40和p35部分之间的核苷酸编码连接p40和p35部分的连接头多肽。可以使用本领域技术人员已知的任何连接头。该p40部分可能是p35部分的5'或3'。
在一些实施方式中，该IL-12sc RNA包含，例如，从编码IL-12sc的DNA序列转录的RNA序列。该RNA也可以重组产生。在一些实施方式中，该RNA序列从包含SEQ ID NO:15或16的核苷酸序列转录。在一些实施方式中，该RNA序列包含SEQ ID NO:17或18或由其组成。在一些实施方式中，该RNA序列包含与SEQ ID NO:17或18具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的RNA序列或由其组成。在一些实施方式中，该RNA序列包含编码SEQ ID NO:17或18的IL-12sc-p40(SEQ ID NO:17或18的核苷酸1-984)和-p35(SEQ ID NO:17或18的核苷酸1027-1623)部分的核苷酸。在一些实施方式中，编码IL-12sc的密码子优化的RNA序列包含编码SEQ ID NO:18的IL-12sc-p40(SEQ ID NO:18的核苷酸1-984)和-p35(SEQ ID NO:18的核苷酸1027-1623)部分的核苷酸，并且进一步包含p40和p35部分之间的核苷酸，该p40和p35部分之间的核苷酸编码连接p40和p35部分的连接头多肽。可以使用本领域技术人员已知的任何连接头。
在一些实施方式中，该IL-12sc RNA中的一个或多个尿苷被本申请所述的经修饰的核苷替代。在一些实施方式中，该替代尿苷的经修饰的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方式中，该RNA包含取代每个尿苷的经修饰的核苷。在一些实施方式中，该经修饰的核苷是N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。
在一些实施方式中，该IL-12sc RNA包含5'末端的修饰的核苷。在一些实施方式中，该RNA包含5'帽。可以使用本领域已知的任何5'帽。在一些实施方式中，该5'帽包含5'-5'三磷酸键。在一些实施方式中，该5'帽包含包括硫代磷酸酯修饰的5'-5'三磷酸键，。在一些实施方式中，该5'帽包含2'-O或3'-O-核糖-甲基化的核苷酸。在一些实施方式中，该5'帽包含经修饰的鸟苷核苷酸或经修饰的腺苷核苷酸。在一些实施方式中，该5'帽包含7-甲基鸟苷酸酯。在一些实施方式中，该5'帽是Cap0或Cap1。示例性帽结构包括m7G(5')ppp(5')G、m7,2`O-mG(5')ppsp(5')G、m7G(5')ppp(5')2`O-mG和m7,3`O-mG(5')ppp(5')2`O-mA。
在一些实施方式中，该IL-12sc RNA包含5'非翻译区(UTR)。在一些实施方式中，该5'UTR在起始密码子的上游。在一些实施方式中，该5'UTR调节该RNA的翻译。在一些实施方式中，该5'UTR是稳定序列。在一些实施方式中，该5'UTR增加了RNA的半衰期。可以使用本领域已知的任何5'UTR。在一些实施方式中，该5'UTR RNA序列从SEQ ID NO:3或5转录。在一些实施方式中，该5'UTR RNA序列包含SEQ ID NO:4或6或由其组成。在一些实施方式中，该5'UTR RNA序列与SEQ ID NO:4或6至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在一些实施方式中，该IL-12sc RNA包含3'UTR。在一些实施方式中，该3'UTR跟在翻译终止密码子之后。在一些实施方式中，该3'UTR调节该RNA的聚腺苷酸化、翻译效率、定位或稳定性。在一些实施方式中，该3'UTR RNA序列从SEQ ID NO:7转录。在一些实施方式中，该3'UTR RNA序列包含SEQ ID NO:8或由其组成。在一些实施方式中，该3'UTR RNA序列与SEQ ID NO:8至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在一些实施方式中，该IL-12sc RNA既包含5'UTR又包含3'UTR。在一些实施方式中，该IL-12sc RNA仅包含5'UTR。在一些实施方式中，该IL-12sc RNA仅包含3'UTR。
在一些实施方式中，该IL-12sc RNA包含聚A尾。在一些实施方式中，该RNA包含至少约25、至少约30、至少约50个核苷酸、至少约70个核苷酸或至少约100个核苷酸的聚A尾。在一些实施方式中，该聚A尾包含200个或更多个核苷酸。在一些实施方式中，该聚A尾包含SEQ ID NO:30或由其组成。
在一些实施方式中，该RNA依次包含5'帽、5'UTR、编码IL-12sc的核酸、3'UTR和聚A尾。
在一些实施方式中，该IL-12sc RNA由DNA序列编码，该DNA序列包含与SEQ ID NO:15或16至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且与SEQ ID NO:3或5至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列或由其组成。
在一些实施方式中，该IL-12sc RNA包含，例如，从DNA序列转录的RNA序列，该DNA序列包含与SEQ ID NO:15或16至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且与SEQ ID NO:3或5至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列或由其组成。该RNA也可以重组产生。在一些实施方式中，该IL-12sc RNA中的一个或多个尿苷被本申请所述的经修饰的核苷替代。在一些实施方式中，该替代尿苷的经修饰的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方式中，该RNA包含取代每个尿苷的经修饰的核苷。在一些实施方式中，该经修饰的核苷是N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。
在一些实施方式中，该IL-12sc RNA由DNA序列编码，该DNA序列包含与SEQ ID NO:15或16至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且与SEQ ID NO:7至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列或由其组成。
在一些实施方式中，该IL-12sc RNA包含，例如，从DNA序列转录的RNA序列，该DNA序列包含与SEQ ID NO:15或16至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且与SEQ ID NO:7至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列或由其组成。该RNA也可以重组产生。在一些实施方式中，该IL-12sc RNA中的一个或多个尿苷被本申请所述的经修饰的核苷替代。在一些实施方式中，该替代尿苷的经修饰的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方式中，该RNA包含取代每个尿苷的经修饰的核苷。在一些实施方式中，该经修饰的核苷是N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。
在一些实施方式中，该IL-12sc RNA由DNA序列编码，该DNA序列包含与SEQ ID NO:15或16至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；与SEQID NO:3或5至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；且与SEQ ID NO:7至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列或由其组成。
在一些实施方式中，该IL-12sc RNA包含，例如，从DNA序列转录的RNA序列，该DNA序列包含如下的核酸序列或由其组成，该核酸序列与SEQ ID NO:15或16至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；与SEQ ID NO:3或5至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；并且与SEQ ID NO:7至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。该RNA也可以重组产生。在一些实施方式中，该IL-12sc RNA中的一个或多个尿苷被本申请所述的经修饰的核苷替代。在一些实施方式中，该替代尿苷的经修饰的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方式中，该RNA包含取代每个尿苷的经修饰的核苷。在一些实施方式中，该经修饰的核苷是N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。
在一些实施方式中，该IL-12sc RNA包含RNA序列，该RNA序列包含与SEQ ID NO:17或18至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列或由其组成；与SEQ ID NO:4或6至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；并且与SEQ ID NO:8至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方式中，该IL-12sc RNA中的一个或多个尿苷被本申请所述的经修饰的核苷替代。在一些实施方式中，该替代尿苷的经修饰的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。
B.干扰素α(IFNα)
在一些实施方式中，该干扰素α(IFNα)RNA由编码干扰素α(IFNα)的DNA序列(例如，SEQ ID NO:19)编码。SEQ ID NO:20中提供了编码该IFNα的示例性DNA序列。
在一些实施方式中，该IFNαRNA由编码IFNα的密码子优化的DNA序列编码。在一些实施方式中，该密码子优化的DNA序列包含SEQ ID NO:21的核苷酸或由其组成。在一些实施方式中，该DNA序列包含与SEQ ID NO:21具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的密码子优化的DNA序列或由其组成。
在一些实施方式中，该IFNαRNA包含，例如，从编码IFNα的DNA序列转录的RNA序列。该RNA也可以重组产生。在一些实施方式中，该RNA序列从包含SEQ ID NO:20或21的核苷酸序列转录。在一些实施方式中，该RNA序列包含SEQ ID NO:22或23或由其组成。在一些实施方式中，该RNA序列包含与SEQ ID NO:22或23具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的RNA序列或由其组成。
在一些实施方式中，该IFNαRNA中的一个或多个尿苷被本申请所述的经修饰的核苷替代。在一些实施方式中，该替代尿苷的经修饰的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方式中，该RNA中的每个尿苷都是经修饰的。在一些实施方式中，该RNA中的每个尿苷都是经N1-甲基-假尿苷(m1ψ)修饰的。
在一些实施方式中，该IFNαRNA包含5'末端的改变的核苷酸。在一些实施方式中，该IFNαRNA包含5'帽。可以使用本领域已知的任何5'帽。在一些实施方式中，该5'帽包含5'-5'三磷酸键。在一些实施方式中，该5'帽包含包括硫代磷酸酯修饰的5'-5'三磷酸键，。在一些实施方式中，该5'帽包含2'-O或3'-O-核糖-甲基化的核苷酸。在一些实施方式中，该5'帽包含经修饰的鸟苷核苷酸或经修饰的腺苷核苷酸。在一些实施方式中，该5'帽包含7-甲基鸟苷酸酯。在一些实施方式中，该5'帽是Cap0或Cap1。示例性帽结构包括m7G(5')ppp(5')G、m7,2`O-mG(5')ppsp(5')G、m7G(5')ppp(5')2`O-mG和m7,3`O-mG(5’)ppp(5’)2`O-mA。
在一些实施方式中，该IFNαRNA包含5'非翻译区(UTR)。在一些实施方式中，该5'UTR在起始密码子的上游。在一些实施方式中，该5'UTR调节该RNA的翻译。在一些实施方式中，该5'UTR是稳定序列。在一些实施方式中，该5'UTR增加了RNA的半衰期。可以使用本领域已知的任何5'UTR。在一些实施方式中，该5'UTR RNA序列从包含SEQ ID NO:3或5的核苷酸序列转录。在一些实施方式中，该5'UTR RNA序列包含SEQ ID NO:4或6或由其组成。在一些实施方式中，该5'UTR RNA序列与SEQ ID NO:4或6至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在一些实施方式中，该IFNαRNA包含3'UTR。在一些实施方式中，该3'UTR跟在翻译终止密码子之后。在一些实施方式中，该3'UTR调节该RNA的聚腺苷酸化、翻译效率、定位或稳定性。在一些实施方式中，该3'UTR RNA序列从包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列转录。在一些实施方式中，该3'UTR RNA序列包含SEQ ID NO:8或由其组成。在一些实施方式中，该3'UTR RNA序列与SEQ ID NO:8至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在一些实施方式中，该IFNαRNA既包含5'UTR又包含3'UTR。在一些实施方式中，该组合物仅包含5'UTR。在一些实施方式中，该组合物仅包含3'UTR。
在一些实施方式中，该IFNαRNA包含聚A尾。在一些实施方式中，该IFNαRNA包含至少约25、至少约30、至少约50个核苷酸、至少约70个核苷酸或至少约100个核苷酸的聚A尾。在一些实施方式中，该聚A尾包含200个或更多个核苷酸。在一些实施方式中，该聚A尾包含SEQ ID NO:30或由其组成。
在一些实施方式中，该RNA依次包含5'帽、5'UTR、编码IFNα的核酸、3'UTR和聚A尾。
在一些实施方式中，该IFNαRNA由DNA序列编码，该DNA序列包含与SEQ ID NO:20或21至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且与SEQID NO:3或5至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列或由其组成。
在一些实施方式中，该IFNαRNA包含，例如，从DNA序列转录的RNA序列，该DNA序列包含与SEQ ID NO:20或21至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且与SEQ ID NO:3或5至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列或由其组成。该RNA也可以重组产生。在一些实施方式中，该IFNαRNA中的一个或多个尿苷被本申请所述的经修饰的核苷替代。在一些实施方式中，该替代尿苷的经修饰的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方式中，该RNA包含取代每个尿苷的经修饰的核苷。在一些实施方式中，该经修饰的核苷是N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。
在一些实施方式中，该IFNαRNA由DNA序列编码，该DNA序列包含与SEQ ID NO:20或21至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且与SEQID NO:7至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列或由其组成。
在一些实施方式中，该IFNαRNA包含，例如，从DNA序列转录的RNA序列，该DNA序列包含与SEQ ID NO:20或21至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且与SEQ ID NO:7至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列或由其组成。在一些实施方式中，该IFNαRNA中的一个或多个尿苷被本申请所述的经修饰的核苷替代。在一些实施方式中，该替代尿苷的经修饰的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方式中，该RNA包含取代每个尿苷的经修饰的核苷。在一些实施方式中，该经修饰的核苷是N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。
在一些实施方式中，该IFNαRNA由DNA序列编码，该DNA序列包含如下的核酸序列或由其组成，该核酸序列与SEQ ID NO:20或21至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；与SEQ ID NO:3或5至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；并且与SEQ ID NO:7至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在一些实施方式中，该IFNαRNA包含，例如，从DNA序列转录的RNA序列，该DNA序列包含如下的核酸序列或由其组成，该核酸序列与SEQ ID NO:20或21至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；与SEQ ID NO:3或5至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；并且与SEQ ID NO:7至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。该RNA也可以重组产生。在一些实施方式中，该IFNαRNA中的一个或多个尿苷被本申请所述的经修饰的核苷替代。在一些实施方式中，该替代尿苷的经修饰的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方式中，该RNA包含取代每个尿苷的经修饰的核苷。在一些实施方式中，该经修饰的核苷是N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方式中，该组合物包含RNA序列，该RNA序列包含与SEQ ID NO:22或23至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列或由其组成；与SEQ ID NO:4或6至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；并且与SEQ ID NO:8至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方式中，该IFNαRNA中的一个或多个尿苷被本申请所述的经修饰的核苷替代。在一些实施方式中，该替代尿苷的经修饰的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。
C.白介素15(IL-15)sushi
在一些实施方式中，施用编码白介素15(IL-15)sushi的RNA。如本申请所用，术语「IL-15 sushi」描述了包含作为融合蛋白的可溶性白介素15(IL-15)受体αsushi结构域和成熟白介素α(IL-15)的构建体。在一些实施方式中，该IL-15 sushi RNA由编码IL-15 sushi的DNA序列(SEQ ID NO:24)编码，该DNA序列包含可溶性IL-15受体α链(sushi)，后面接的是甘胺酸-丝胺酸(GS)连接头，随后是IL-15的成熟序列。SEQ ID NO:25中提供了编码该IL-15sushi的DNA序列。
在一些实施方式中，该IL-15 sushi RNA是，例如，从编码IL-15 sushi的DNA序列转录的RNA序列。该RNA也可以重组产生。在一些实施方式中，该RNA序列系从包含SEQ IDNO:25的核苷酸序列转录的。在一些实施方式中，该编码连接头的核苷酸可以完全不存在，或被编码合适连接头的任何核苷酸部分或全部替代。在一些实施方式中，该RNA序列包含SEQ ID NO:26或由其组成。在一些实施方式中，该RNA序列包含与SEQ ID NO:26具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的RNA序列。在一些实施方式中，编码IL-15 sushi的DNA或RNA序列包含编码IL-15受体α的sushi结构域(例如，SEQ IDNO:25或26的核苷酸1-321)和成熟的IL-15(例如，SEQ ID NO:25或26的核苷酸382-729)的核苷酸。在一些实施方式中，编码IL-15 sushi的DNA或RNA序列包含编码IL-15受体α的sushi结构域(例如，SEQ ID NO:25或26的核苷酸1-321)和成熟的IL-15(例如，SEQ ID NO:25或26的核苷酸382-729)的核苷酸，并且进一步包含所述部分之间编码连接所述部分的连接头多肽的核苷酸。在一些实施方式中，该连接头包含SEQ ID NO:25或26的核苷酸322-381。可以使用本领域技术人员已知的任何连接头。
在一些实施方式中，该IL-15 sushi RNA中的一个或多个尿苷被本申请所述的经修饰的核苷替代。在一些实施方式中，该替代尿苷的经修饰的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方式中，该RNA包含取代每个尿苷的经修饰的核苷。在一些实施方式中，该经修饰的核苷是N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。
在一些实施方式中，该IL-15 sushi RNA包含5'末端的改变的核苷酸。在一些实施方式中，该IL-15 sushi RNA包含5'帽。可以使用本领域已知的任何5'帽。在一些实施方式中，该5'帽包含5'-5'三磷酸键。在一些实施方式中，该5'帽包含包括硫代磷酸酯修饰的5'-5'三磷酸键，。在一些实施方式中，该5'帽包含2'-O或3'-O-核糖-甲基化的核苷酸。在一些实施方式中，该5'帽包含经修饰的鸟苷核苷酸或经修饰的腺苷核苷酸。在一些实施方式中，该5'帽包含7-甲基鸟苷酸酯。在一些实施方式中，该5'帽是Cap0或Cap1。示例性帽结构包括m7G(5')ppp(5')G、m7,2`O-mG(5')ppsp(5')G、m7G(5')ppp(5')2`O-mG和m7,3`O-mG(5’)ppp(5’)2`O-mA。
在一些实施方式中，该IL-15 sushi RNA包含5'非翻译区(UTR)。在一些实施方式中，该5'UTR在起始密码子的上游。在一些实施方式中，该5'UTR调节该RNA的翻译。在一些实施方式中，该5'UTR是稳定序列。在一些实施方式中，该5'UTR增加了RNA的半衰期。可以使用本领域已知的任何5'UTR。在一些实施方式中，该5'UTR RNA序列从SEQ ID NO:3或5转录。在一些实施方式中，该5'UTR RNA序列包含SEQ ID NO:4或6或由其组成。在一些实施方式中，该5'UTR RNA序列与SEQ ID NO:4或6至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在一些实施方式中，该IL-15 sushi RNA包含3'UTR。在一些实施方式中，该3'UTR跟在翻译终止密码子之后。在一些实施方式中，该3'UTR调节该RNA的聚腺苷酸化、翻译效率、定位或稳定性。在一些实施方式中，该3'UTR RNA序列从SEQ ID NO:7转录。在一些实施方式中，该3'UTR RNA序列包含SEQ ID NO:8或由其组成。在一些实施方式中，该3'UTR RNA序列与SEQ ID NO:8至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在一些实施方式中，该IL-15 sushi RNA既包含5'UTR又包含3'UTR。在一些实施方式中，该IL-15 sushi RNA仅包含5'UTR。在一些实施方式中，该IL-15sushi RNA仅包含3'UTR。
在一些实施方式中，该IL-15 sushi RNA包含聚A尾。在一些实施方式中，该RNA包含至少约25、至少约30、至少约50个核苷酸、至少约70个核苷酸或至少约100个核苷酸的聚A尾。在一些实施方式中，该聚A尾包含200个或更多个核苷酸。在一些实施方式中，该聚A尾包含SEQ ID NO:30或由其组成。
在一些实施方式中，该RNA依次包含5'帽、5'UTR、编码IL-15 sushi的核酸、3'UTR和聚A尾。
在一些实施方式中，该IL-15 sushi RNA由DNA序列编码，该DNA序列包含与SEQ IDNO:25至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且与SEQ ID NO:3或5至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列或由其组成。
在一些实施方式中，该IL-15 sushi RNA包含，例如，从DNA序列转录的RNA序列，该DNA序列包含与SEQ ID NO:25至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且与SEQ ID NO:3或5至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列或由其组成。该RNA也可以重组产生。在一些实施方式中，该IFNαRNA中的一个或多个尿苷被本申请所述的经修饰的核苷替代。在一些实施方式中，该替代尿苷的经修饰的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方式中，该RNA包含取代每个尿苷的经修饰的核苷。在一些实施方式中，该经修饰的核苷是N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。
在一些实施方式中，该IL-15 sushi RNA包含DNA序列，该DNA序列包含与SEQ IDNO:25至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且与SEQ ID NO:7至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列或由其组成。
在一些实施方式中，该IL-15 sushi RNA包含，例如，从DNA序列转录的RNA序列，该DNA序列包含与SEQ ID NO:25至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且与SEQ ID NO:7至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列或由其组成。该RNA也可以重组产生。在一些实施方式中，该IFNαRNA中的一个或多个尿苷被本申请所述的经修饰的核苷替代。在一些实施方式中，该替代尿苷的经修饰的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方式中，该RNA包含取代每个尿苷的经修饰的核苷。在一些实施方式中，该经修饰的核苷是N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。
在一些实施方式中，该IL-15 sushi RNA包含DNA序列，该DNA序列包含如下的核酸序列或由其组成，该核酸序列与SEQ ID NO:25至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；与SEQ ID NO:3或5至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；并且与SEQ ID NO:7至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在一些实施方式中，该IL-15 sushi RNA包含，例如，从DNA序列转录的RNA序列，该DNA序列包含如下的核酸序列或由其组成，该核酸序列与SEQ ID NO:25至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；与SEQ ID NO:3或5至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；并且与SEQ ID NO:7至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方式中，该IFNαRNA中的一个或多个尿苷被本申请所述的经修饰的核苷替代。在一些实施方式中，该替代尿苷的经修饰的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方式中，该RNA包含取代每个尿苷的经修饰的核苷。在一些实施方式中，该经修饰的核苷是N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。
在一些实施方式中，该IL-15 sushi RNA包含RNA序列，该RNA序列包含如下的核酸序列或由其组成，该核酸序列与SEQ ID NO:26至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；与SEQ ID NO:4或6至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；并且与SEQ ID NO:8至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方式中，该IFNαRNA中的一个或多个尿苷被本申请所述的经修饰的核苷替代。在一些实施方式中，该替代尿苷的经修饰的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。
D.粒细胞-巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)
在一些实施方式中，施用编码粒细胞-巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)的RNA。在一些实施方式中，该GM-CSF RNA由编码粒细胞-巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)的DNA序列(例如，SEQ ID NO:27)编码。在一些实施方式中，该编码GM-CSF的DNA序列在SEQ ID NO:28中提供。
在一些实施方式中，该GM-CSF RNA包含，例如，从编码GM-CSF的DNA序列转录的RNA序列。在一些实施方式中，该RNA序列系从SEQ ID NO:28转录的。该RNA也可以重组产生。在一些实施方式中，该RNA序列包含SEQ ID NO:29或由其组成。在一些实施方式中，该RNA序列包含与SEQ ID NO:29具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的RNA序列。
在一些实施方式中，该GM-CSF RNA中的一个或多个尿苷被本申请所述的经修饰的核苷替代。在一些实施方式中，该替代尿苷的经修饰的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方式中，该RNA包含取代每个尿苷的经修饰的核苷。在一些实施方式中，该经修饰的核苷是N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方式中，该GM-CSF RNA包含5'末端的修饰的核苷。在一些实施方式中，该RNA包含5'帽。可以使用本领域已知的任何5'帽。在一些实施方式中，该5'帽包含5'-5'三磷酸键。在一些实施方式中，该5'帽包含包括硫代磷酸酯修饰的5'-5'三磷酸键，。在一些实施方式中，该5'帽包含2'-O或3'-O-核糖-甲基化的核苷酸。在一些实施方式中，该5'帽包含经修饰的鸟苷核苷酸或经修饰的腺苷核苷酸。在一些实施方式中，该5'帽包含7-甲基鸟苷酸酯。在一些实施方式中，该5'帽是Cap0或Cap1。示例性帽结构包括m7G(5')ppp(5')G、m7,2`O-mG(5')ppsp(5')G、m7G(5')ppp(5')2`O-mG和m7,3`O-mG(5’)ppp(5’)2`O-mA。
在一些实施方式中，该GM-CSF RNA包含5'非翻译区(UTR)。在一些实施方式中，该5'UTR在起始密码子的上游。在一些实施方式中，该5'UTR调节该RNA的翻译。在一些实施方式中，该5'UTR是稳定序列。在一些实施方式中，该5'UTR增加了RNA的半衰期。可以使用本领域已知的任何5'UTR。在一些实施方式中，该5'UTR RNA序列从SEQ ID NO:3或5转录。在一些实施方式中，该5'UTR RNA序列包含SEQ ID NO:4或6或由其组成。在一些实施方式中，该5'UTR RNA序列与SEQ ID NO:4或6至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在一些实施方式中，该GM-CSF RNA包含3'UTR。在一些实施方式中，该3'UTR跟在翻译终止密码子之后。在一些实施方式中，该3'UTR调节该RNA的聚腺苷酸化、翻译效率、定位或稳定性。在一些实施方式中，该3'UTR RNA序列从SEQ ID NO:7转录。在一些实施方式中，该3'UTR RNA序列包含SEQ ID NO:8或由其组成。在一些实施方式中，该3'UTR RNA序列与SEQ ID NO:8至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在一些实施方式中，该GM-CSF RNA既包含5'UTR又包含3'UTR。在一些实施方式中，该RNA仅包含5'UTR。在一些实施方式中，该组合物仅包含3'UTR。
在一些实施方式中，该GM-CSF RNA包含聚A尾。在一些实施方式中，该RNA包含至少约25、至少约30、至少约50个核苷酸、至少约70个核苷酸或至少约100个核苷酸的聚A尾。在一些实施方式中，该聚A尾包含200个或更多个核苷酸。在一些实施方式中，该聚A尾包含SEQID NO:30或由其组成。
在一些实施方式中，该GM-CSF RNA依次包含5'帽、5'UTR、编码GM-CSF的核苷酸、3'UTR和聚A尾。
在一些实施方式中，该GM-CSF RNA由DNA序列编码，该DNA序列包含与SEQ ID NO:28至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且与SEQID NO:3或5至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列或由其组成。
在一些实施方式中，该GM-CSF RNA包含，例如，从DNA序列转录的RNA序列，该DNA序列包含与SEQ ID NO:28至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且与SEQ ID NO:3或5至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列或由其组成。该RNA也可以重组产生。在一些实施方式中，该GM-CSF RNA中的一个或多个尿苷被本申请所述的经修饰的核苷替代。在一些实施方式中，该替代尿苷的经修饰的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方式中，该RNA包含取代每个尿苷的经修饰的核苷。在一些实施方式中，该经修饰的核苷是N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。
在一些实施方式中，该GM-CSF RNA由DNA序列编码，该DNA序列包含与SEQ ID NO:28至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且与SEQID NO:7至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列或由其组成。
在一些实施方式中，该GM-CSF RNA包含，例如，从DNA序列转录的RNA序列，该DNA序列包含与SEQ ID NO:28至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且与SEQ ID NO:7至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列或由其组成。该RNA也可以重组产生。在一些实施方式中，该GM-CSF RNA中的一个或多个尿苷被本申请所述的经修饰的核苷替代。在一些实施方式中，该替代尿苷的经修饰的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方式中，该RNA包含取代每个尿苷的经修饰的核苷。在一些实施方式中，该经修饰的核苷是N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。
在一些实施方式中，该GM-CSF RNA包含DNA序列，该DNA序列包含如下的核酸序列或由其组成，该核酸序列与SEQ ID NO:28至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；与SEQ ID NO:3或5至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；并且与SEQ ID NO:7至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在一些实施方式中，该GM-CSF RNA包含，例如，从DNA序列转录的RNA序列，该DNA序列包含如下的核酸序列或由其组成，该核酸序列与SEQ ID NO:28至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；与SEQ ID NO:3或5至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；并且与SEQ ID NO:7至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。该RNA也可以重组产生。在一些实施方式中，该GM-CSF RNA中的一个或多个尿苷被本申请所述的经修饰的核苷替代。在一些实施方式中，该替代尿苷的经修饰的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方式中，该RNA包含取代每个尿苷的经修饰的核苷。在一些实施方式中，该经修饰的核苷是N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。
在一些实施方式中，该GM-CSF RNA包含RNA序列，该RNA序列包含如下的核酸序列或由其组成，该核酸序列与SEQ ID NO:29至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；与SEQ ID NO:4或6至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；并且与SEQ ID NO:8至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方式中，该GM-CSF RNA中的一个或多个尿苷被本申请所述的经修饰的核苷替代。在一些实施方式中，该替代尿苷的经修饰的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。
E.修饰
本申请描述的所述RNA中每一种都可以以本领域技术人员已知的任何方式修饰。在一些实施方式中，每种RNA如下修饰：
·取代每个尿苷的经修饰的核碱基；
·该RNA的5'末端的Cap1结构。
在一些实施方式中，该5'UTR包含SEQ ID NO:4或6。在一些实施方式中，该RNA已经经过处理以还原如上所述的双股RNA(dsRNA)。该「Cap1」结构可以在体外转录后通过酶促加帽或在体外转录(共转录加帽)过程中生成。
在一些实施方式中，该RNA中的一个或多个尿苷被经修饰的核苷替代。在一些实施方式中，该经修饰的核苷是经修饰的尿苷。
在一些实施方式中，该替代尿苷的经修饰的尿苷为假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。
在一些实施方式中，该RNA中的一个或多个胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤由一个或多个经修饰的核碱基替代。在一个实施方式中，替代胞嘧啶的经修饰的核苷为5-甲基胞嘧啶(m5C)。在另一个实施方式中，替代腺嘌呤的经修饰的核苷为N6-甲基腺嘌呤(m6A)。在另一个实施方式中，可以使用本领域已知的用于降低分子的免疫原性的任何其他经修饰的核碱基。
在一些实施方式中，替代该RNA中的一个或多个尿苷的经修饰的核苷可以是以下中的任何一种或多种：3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2U)、4-硫代-尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5U)、5-胺基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘代-尿苷或5-溴代-尿苷)、尿苷5-氧乙酸(cmo5U)、尿苷5-氧乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧甲基-尿苷(cm5U)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羟基甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羟基甲基-尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2U)、5-胺甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2U)、5-甲基胺甲基-尿苷(mnm5U)、1-乙基-假尿苷、5-甲基胺甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基胺甲基-2-硒基-尿苷(mnm5se2U)、5-胺甲酰基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧甲基胺甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧甲基胺甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-胺基-3-羧丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-胺基-3-羧丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基胺甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基胺甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2U)、α-硫代-尿苷、2'-O-甲基-尿苷(Um)、5,2'-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2'-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2'-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰甲基-2'-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-胺甲酰基甲基-2'-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧甲基胺甲基-2'-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2'-O-二甲基-尿苷(m3Um)、5-(异戊烯基胺甲基)-2'-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2'-F-阿拉伯糖-尿苷、2'-F-尿苷、2'-OH-阿拉伯糖-尿苷、5-(2-羰基甲氧基乙烯基)尿苷、5-[3-(1-E-丙烯基胺基)尿苷，或本领域已知的任何其他修饰的尿苷。
在一些实施方式中，至少一种RNA包含取代至少一个尿苷的经修饰的核苷。在一些实施方式中，至少一种RNA包含取代每个尿苷的经修饰的核苷。在一些实施方式中，每种RNA包含取代至少一个尿苷的经修饰的核苷。在一些实施方式中，每种RNA包含取代每个尿苷的经修饰的核苷。
在一些实施方式中，该经修饰的核苷独立地选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方式中，该经修饰的核苷包含假尿苷(ψ)。在一些实施方式中，该经修饰的核苷包含N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方式中，该经修饰的核苷包含5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方式中，至少一种RNA可包含多于一种类型的经修饰的核苷，并且所述经修饰的核苷独立地选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方式中，所述经修饰的核苷包含假尿苷(ψ)和N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方式中，所述经修饰的核苷包含假尿苷(ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方式中，所述经修饰的核苷包含N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方式中，所述经修饰的核苷包含假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。
在一些实施方式中，该方法中使用的至少一种RNA包含5'帽m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG或3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')G。在一些实施方式中，该方法中使用的每种RNA包含5'帽m2 7,3'- OGppp(m1 2'-O)ApG或3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')G。在一些实施方式中，该方法中使用的每种RNA包含5'帽m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG。在一些实施方式中，该方法中使用的每种RNA包含3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G。在一些实施方式中，该方法中使用的每种RNA均包含5'帽m2 7,3'- OGppp(m1 2'-O)ApG和3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')G。
在一些实施方式中，至少一种RNA包含5'UTR，该5'UTR包含选自由SEQ ID NO:4和6组成的组的核苷酸序列，或与选自由SEQ ID NO:4和6组成的组的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，每种RNA包含5'UTR，该5'UTR包含选自由SEQ ID NO:4和6组成的组的核苷酸序列，或与选自由SEQ ID NO:4和6组成的组的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方式中，至少一种RNA包含3'UTR，该3'UTR包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，每种RNA包含3'UTR，该3'UTR包含SEQ IDNO:8的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方式中，至少一种RNA包含聚A尾。在一些实施方式中，每种RNA包含聚A尾。在一些实施方式中，该聚A尾可包含至少20、至少30、至少40、至少80或至少100且最多500、最多400、最多300、最多200或最多150个核苷酸。在一些实施方式中，该聚A尾可基本上由至少20、至少30、至少40、至少80或至少100且最多500、最多400、最多300、最多200或最多150个A核苷酸组成。在一些实施方式中，该聚A尾可由至少20、至少30、至少40、至少80或至少100且最多500、最多400、最多300、最多200或最多150个核苷酸组成。在一些实施方式中，该聚A尾可包含SEQ ID NO:30中所示的聚A尾。在一些实施方式中，该聚A尾包含至少100个核苷酸。在一些实施方式中，该聚A尾包含约150个核苷酸。在一些实施方式中，该聚A尾包含约120个核苷酸。
在一些实施方式中，一种或多种RNA包括：(1)包含m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG或3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G的5'帽；(2)5'UTR，该5'UTR包含(i)选自由SEQ ID NO:4和6组成的组的核苷酸序列，或(ii)与选自由SEQ ID NO:4和6组成的组的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；(3)3'UTR，该3'UTR包含(i)SEQ ID NO:8的核苷酸序列，或(ii)与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；(4)包含至少100个核苷酸的聚A尾。
3.施用的抗PD-1抗体
癌细胞利用多种机制逃避抗肿瘤宿主免疫反应，包括程序性细胞死亡因子1配体1(PD-L1)的表现，该配体为程序性细胞死亡因子1受体(PD-1)的主要配体，在活化的B淋巴细胞和T淋巴细胞以及髓样细胞上表现。PD-L1与PD-1的相互作用导致免疫反应降低，并有助于肿瘤逃避。抗PD-1抗体是与PD-1结合并抑制PD-1与PD-L1的相互作用的抗体。在施用于受试者时，抗PD-1抗体可以结合PD-1，抑制其与PD-L1的结合，并阻止其下游传讯途径的活化，包括T细胞的活化。在一些实施方式中，该细胞介素RNA混合物与抗PD1抗体组合施用。
本申请包括抗PD1抗体，该抗PD1抗体抑制PD-1与PD-L1的相互作用，并抑制当PD-1与PD-L1相互作用时触发的免疫应答的阻抑。
在一些实施方式中，抗PD1抗体是否抑制免疫应答的阻抑系通过测量T细胞活化(有时也称为T细胞增殖)来评估的。这种策略可以在体内(例如，在向人类受试者施用抗PD1抗体之后)或在体外(例如，在基于细胞之测定中)评估。在一些实施方式中，根据Burova等人,(2017)Mol.Cancer[分子癌症]16(5)；861-70的方法，使用工程化的T细胞系或原代人T细胞在基于细胞之测定中确定抗PD1抗体抑制免疫应答阻抑的能力。例如，人PD-1蛋白和报导分子在T细胞中表现，并且所述T细胞由，例如，抗CD3x抗CD20双特异性抗体活化。产生抗原呈递细胞(APC)，诸如HEK293细胞，以表现人CD20和人PD-L1。施用连续稀释的测试抗PD1抗体并分析报导分子的表现。
在一些实施方式中，该抗PD1抗体可抑制当PD-1与PD-L1相互作用时触发的免疫应答的阻抑，且与在西米单抗中观察到的抑制作用相比，抑制至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些实施方式中，通过测量如本申请所述的T细胞活化来评估抗体是否抑制当PD-1与PD-L1相互作用时触发的免疫应答的阻抑，且与在西米单抗中观察到的抑制作用相比，抑制至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。
在一些实施方式中，该抗PD1抗体是嵌合、人源化或人抗体。在一些实施方式中，该抗PD-1抗体是分离的和/或重组的抗体。在一些实施方式中，该抗PD1抗体是多特异性抗体，例如，三特异性或双特异性抗体。
抗PD-1抗体的非限制性实例包括西米单抗(参见，例如，美国专利号9,987,500B2，也称为REGN2810，参见例如CAS号1801342-60-8，以及Falchook等人,J ImmunotherCancer.[癌症免疫疗法杂志]2016年11月；4:70)，纳武单抗(参见，例如，美国专利号8,008,449)，派姆单抗(参见，例如，美国专利号8,354,509)，MEDI0608(以前的AMP-514；参见，例如，美国专利号8,609,089和美国专利号9,205,148)，斯帕塔利单抗(也称为PDR001，参见，例如，WO 2015/112900)，PF-06801591(参见，例如，WO 2016/092419)，以及替雷利珠单抗(也称为BGB-A317，参见，例如，WO 2015/035606)，卡瑞利珠单抗(也称为SHR-1210；参见，例如，WO 2015/085847)，多斯塔利单抗(也称为TSR-042；参见，例如，WO 2014/179664)，信迪利单抗(也称为IBI308；参见，例如，WO 2017/025016)，JS001(参见，例如，WO 2014/206107)，MGA012(参见，例如，WO 2017/019846)，AGEN2034(参见，例如，WO 2017/040790)，以及JNJ-63723283(参见，例如，WO 2017/079112)。术语西米单抗包括西米单抗-rwlc。
在一些实施方式中，该抗PD-1抗体是WO 2015/112800中披露的那些之一(诸如该PCT公开的表1中称为H1M7789N、H1M7799N、H1M7800N、H2M7780N、H2M7788N、H2M7790N、H2M7791N、H2M7794N、H2M7795N、H2M7796N、H2M7798N、H4H9019P、H4xH9034P2、H4xH9035P2、H4xH9037P2、H4xH9045P2、H4xH9048P2、H4H9057P2、H4H9068P2、H4xH9119P2、H4xH9120P2、H4xH9128P2、H4xH9135P2、H4xH9145P2、H4xH8992P、H4xH8999P和H4xH9008P的那些，以及该PCT公开的表3中称为H4H7798N、H4H7795N2、H4H9008P和H4H9048P2的那些)。WO 2015/112800的披露内容通过引用以其全文并入本申请。例如，WO 2015/112800中披露的抗体和相关抗体，包括具有CDR、VH和VL序列或该PCT公开中披露的重链和轻链序列的抗体和抗原结合片段，以及与该PCT公开中披露的所述抗体结合相同的PD-1表位的抗体和抗原结合片段，可以与该RNA细胞介素混合物一起用于治疗和/或预防癌症。
在一些实施方式中，该抗PD-1抗体包含皮地珠单抗(也称为CT-011)(Berger等人,2008.Clin Cancer Res.[临床癌症研究]14(10):3044-51)、PF-06801591(ClinicalTrials.gov识别号：NCT02573259)、mDX-400(默克公司(Merck&Co))、MEDI0680(也称为AMP-514)(ClinicalTrials.gov识别号：NCT02013804)、PDR001(ClinicalTrials.gov识别号：NCT02678260)、斯帕塔利单抗(诺华公司(Novartis AG)，CAS号1935694-88-4)、SHR-1210(因塞特医疗公司(Incyte Corp)，江苏恒瑞医药有限公司(Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd)，ClinicalTrials.gov识别号：NCT02742935)、TSR-042(ClinicalTrials.gov识别号：NCT02715284)、ANA011(阿娜普蒂斯生物有限公司(AnaptysBio,Inc.))、AGEN-2034(艾吉纳斯公司(Agenus,Inc.))、AM-0001(ARMO生物科学公司)、BGB-108(百济神州公司(BeiGene))、AK-104和AK-105(康方生物医药公司(AkesoBiopharma))、ABBV-181(艾伯维公司(AbbVie))、BAT-1306(百奥泰公司(Bio-TheraSolutions))、AMP-224(米迪缪尼公司(Medlmmune))、LZM-009(丽珠医药集团(LivzonPharmaceutical Group))、GLS-010(艾库斯生物科技(Arcus Biosciences))、多斯塔利单抗(特萨罗公司(Tesaro Inc)，CAS号2022215-59-2)、MGA-012(因赛特公司)、替雷利珠单抗(BGB-A317，百济神州公司，CAS号1858168-59-8)、BI-754091(勃林格殷格翰公司(Boehringer Ingelheim))、CBT-501(CBT制药公司)、ENUM-003(Enumeral生物医学控股公司)、ENUM-388D4(Enumeral生物医学控股公司)、ENUM-244C8(Enumeral生物医学控股公司)、IBI-308(礼来信达生物制药有限公司(Eli Lilly Innovent Biologics,Inc.))、JNJ-63723283(强森研发有限公司，ClinicalTrials.gov识别号NCT02908906)、CS-1003(CStone制药公司)、Sym-016和Sym-021(Symphogen生物技术公司)、JS-001(上海君实生物医药科技股份有限公司(Shanghai Junshi Bioscience Co.,Ltd.)，ClinicalTrials.gov识别号NCT02857166)、JTX-4014(Jounce治疗公司)、JY-034(北京东方百泰生物科技有限公司(Beijing Eastern Biotech Co))、SSI-361(Lyvgen生物制药有限公司)、YBL-006(Y-Biologics)、AK-103(康方生物医药公司(Akeso Biopharma Inc))、MCLA-134(梅鲁斯公司(Merus))、HAB-21(苏州思坦维生物技术有限公司(Suzhou Stainwei Biotech Inc))、CX-188(CytomX治疗公司)、PF-06801591(辉瑞公司，ClinicalTrials.gov识别号NCI-2016-00704)、HEISCOIII-003(四川海思科制药有限公司)、XmAb-20717(Xencor公司，双特异性，可识别CTLA-4和PD1)、XmAb-23104(Xencor公司)、MGD-019(宏基因公司(MacroGenicsInc,)，双特异性，识别CTLA4和PD1)、AK-112(康方生物医药公司，双特异性)、AT-16201(AIMM治疗有限公司)、BCD-100(生物卡)、TSR-075(特萨罗公司(Tesaro Inc)，双特异性，识别LAG3和PD1)、MGD-013(宏基因公司；双特异性，识别PD-1和LAG-3)、BH-2922(北京韩美药品有限公司(Beijing Hanmi Pharmaceutical Co)，双特异性，识别EGFR和PD1)、BH-2941(北京韩美药品有限公司，双特异性，识别PDL1和PD1)、BH-2950(北京韩美药品有限公司，双特异性，识别Her2和PD1)、BH-2954(北京韩美药品有限公司，双特异性)、STIA-1110(索伦托医疗公司实验室(Les Laboratoires Servier SAS Sorrento Therapeutics))、244C8和388D4(参见Scheuplein F等人[摘要],Proc 107th Ann Meet Am Ass Cane Res[美国癌症研究协会第107届年会会议记录]；2016年4月16-20；New Orleans,LA.Philadelphia(PA):AACR；Cancer Res[癌症研究]2016；76(增刊14):摘要nr 4871)。
在一些实施方式中，该抗PD-1抗体包含以下分别如SEQ ID NO:31和32所示的重链和轻链氨基酸序列；SEQ ID NO:39和40中的VH和VL序列(以斜体显示)，或SEQ ID NO:31和32中的一个或多个(例如，全部六个)CDR(以粗体方框显示)。在一些实施方式中，包括包含以下CDR的抗体：
HCDR1＝GFTFSNFG(SEQ ID NO:33)
HCDR2＝ISGGGRDT(SEQ ID NO:34)
HCDR3＝VKWGNIYFDY(SEQ ID NO:35)
LCDR1＝LSINTF(SEQ ID NO:36)
LCDR2＝AAS(SEQ ID NO:37)
LCDR3＝QQSSNTPFT(SEQ ID NO:38)。
在一些实施方式中，该抗PD-1抗体包含HCDR3(SEQ ID NO:35)。在一些实施方式中，该抗PD-1抗体包含LCDR3(SEQ ID NO:38)。在一些实施方式中，该抗PD-1抗体包含HCDR3(SEQ ID NO:35)和LCDR3(SEQ ID NO:38)。
在一些实施方式中，该抗PD1抗体包含HCDR3(SEQ ID NO:35)和/或LCDR3(SEQ IDNO:38)，并且抑制PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方式中，该抗PD1抗体包含HCDR3(SEQ ID NO:35)和/或LCDR3(SEQ ID NO:38)，并且抑制当PD-1与PD-L1相互作用时触发的免疫应答的阻抑。在一些实施方式中，该抗PD1抗体包含HCDR3(SEQ ID NO:35)和/或LCDR3(SEQ ID NO:38)，并且抑制PD-1与PD-L1的相互作用，以及抑制当PD-1与PD-L1相互作用时触发的免疫应答的阻抑。
示例性的抗PD-1Mab重链
EVQLLESGGV LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NFGMTWVRQA PGKGLEWVSG ISGGGRDTYFADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLKGED TAVYYCVKWG NIYFDYWGQG TLVTVSSAST KGPSVFPLAPCSRSTSESTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTKTYTCNVDHKPSNTK VDKRVESKYG PPCPPCPAPE FLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSQEDPEVQFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQFNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGQPREPQVYTLPP SQEEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSRLTVDKSRWQEGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SLGK(SEQ ID NO:31)
HCDR1＝GFTFSNFG(SEQ ID NO:33)
HCDR2＝ISGGGRDT(SEQ ID NO:34)
HCDR3＝VKWGNIYFDY(SEQ ID NO:35)
示例性的抗PD-1Mab轻链
DIQMTQSPSS LSASVGDSIT ITCRASLSIN TFLNWYQQKP GKAPNLLIYA ASSLHGGVPSRFSGSGSGTD FTLTIRTLQP EDFATYYCQQ SSNTPFTFGP GTVVDFRRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC(SEQ ID NO:32)
LCDR1＝LSINTF(SEQ ID NO:36)
LCDR2＝AAS(SEQ ID NO:37)
LCDR3＝QQ SSNTPFT(SEQ ID NO:38)
在一些实施方式中，该抗PD1抗体是西米单抗。在一些实施方式中，该抗PD1抗体是与西米单抗结合相同表位的抗体。在一些实施方式中，该抗PD1抗体与西米单抗竞争PD-1结合。在一些实施方式中，根据本领域技术人员已知的方法，例如，Burova等人(2017)Mol.Cancer[分子癌症]16(5)；861-70中的方法，通过ELISA确定抗体是否与西米单抗竞争PD-1结合。简而言之，将测试抗体、西米单抗和阴性同种型对照抗体与PD-1一起孵育，并转移至包被PD-L1的ELISA板的孔中。适当清洗并施用标记的二抗后检测到结合的抗体。
在一些实施方式中，该抗PD1抗体可抑制PD-1与PD-L1的相互作用，且与在西米单抗中观察到的抑制水平相比，抑制至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些实施方式中，通过如本申请所述的ELISA评估抗体是否可抑制PD-1与PD-L1的相互作用，且与在西米单抗中观察到的抑制水平相比，抑制至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。
目前正在对西米单抗进行作为单一疗法以及与其他抗癌疗法相结合的1期临床研究，以及在晚期皮肤鳞状上皮细胞癌、基底细胞癌、非小细胞肺癌患者、宫颈癌和其他实体瘤的2期和3期临床研究中进行研究。在每2周(Q2W)施用1mg/kg的剂量和3mg/kg Q2W的剂量下，观察几种肿瘤类型(包括非小细胞肺癌)中的初步疗效。
截至2018年3月27日，757名患者通过招募并接受西米单抗作为单一疗法以及与放射疗法和/或不同剂量水平(1、3或10mg/kg或200mg Q2W；以及3mg/kg，250mg或350mg Q3W)的其他癌症疗法组合。西米单抗对晚期CSCC的疗效已在2期研究中明确记录，并且在2018年9月28日，西米单抗在美国获得批准用于治疗不适合治愈性手术或治愈性放射的转移性CSCC或局部晚期CSCC的患者。2019年6月28日，西米单抗在欧洲也获得批准用于相同的适应症。
西米单抗的安全性概况与其他PD-1抑制剂相似。在10％或更多的患者中发生的最常见的治疗中出现的不良事件(TEAE)系疲劳、恶心、贫血、食欲下降、关节痛、便秘、咳嗽、呕吐和腹痛。
使用和制备西米单抗的组合物和方法在，例如，已公开的美国专利申请案号2015/0203579中披露，其内容出于任何目的通过引用以其全文并入本申请。
该抗PD-1抗体可以用合适的载体、赋形剂和提供合适的转移、递送、耐受性等的其他试剂配制。在所有药剂化学师已知的配方中可以找到许多合适的制剂：Remington'sPharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],Mack Publishing Company[马克出版公司],伊斯顿,宾夕法尼亚州。所述制剂包括，例如，粉剂、糊剂、软膏剂、凝胶剂、蜡、油、脂质、含囊泡的脂质(阳离子或阴离子)、DNA轭合物(conjugate)、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)乳剂、半固体凝胶和含碳蜡的半固态混合物。参见Powell等人「Compendium of excipients for parenteral formulations」[肠胃外制剂用辅料目录]PDA(1998)J Pharm Sci Technol[药物科学与技术杂志]52:238-311。
4.治疗方法
本申请提供的细胞介素RNA混合物可以与抗PD-1抗体组合用于方法中，例如，治疗方法。在一些实施方式中，包括了用于治疗晚期、不可切除的或转移性实体瘤癌症的方法，包括施用该细胞介素RNA混合物和抗PD-1抗体，其中该晚期实体瘤癌症包括上皮肿瘤、前列腺肿瘤、卵巢肿瘤、肾细胞肿瘤、胃肠道肿瘤、肝肿瘤、大肠直肠肿瘤、脉管系统肿瘤、间皮瘤、胰腺肿瘤、乳房肿瘤、肉瘤、肺肿瘤、结肠肿瘤、黑色素瘤、小细胞肺肿瘤、神经母细胞瘤、睾丸肿瘤、上皮癌肿瘤、腺癌肿瘤、精原细胞瘤、视网膜母细胞瘤、皮肤鳞状上皮细胞癌(CSCC)、淋巴瘤(包括非何杰金氏淋巴瘤和何杰金氏淋巴瘤)、头颈部鳞状上皮细胞癌(HNSCC)、头颈部癌、骨肉瘤、非小细胞肺癌、肾肿瘤、甲状腺肿瘤、肝肿瘤、其他适于瘤内注射的实体瘤或其组合。
在一些实施方式中，该晚期实体瘤癌症包括上皮肿瘤、前列腺肿瘤、卵巢肿瘤、肾细胞肿瘤、胃肠道肿瘤、肝肿瘤、大肠直肠肿瘤、脉管系统肿瘤、间皮瘤、胰腺肿瘤、乳房肿瘤、肉瘤、肺肿瘤、结肠肿瘤、黑色素瘤、小细胞肺肿瘤、神经母细胞瘤、睾丸肿瘤、上皮癌肿瘤、腺癌肿瘤、精原细胞瘤、视网膜母细胞瘤、皮肤鳞状上皮细胞癌(CSCC)、头颈部鳞状上皮细胞癌(HNSCC)、头颈癌、骨肉瘤、非小细胞肺癌、肾肿瘤、甲状腺肿瘤、肝肿瘤或其他适于瘤内注射的实体瘤或其组合。
在一些实施方式中，该晚期实体瘤癌症包括淋巴瘤，诸如非何杰金氏淋巴瘤或何杰金氏淋巴瘤。
在一些实施方式中，该实体瘤癌症是黑色素瘤。在一些实施方式中，该黑色素瘤是葡萄膜黑色素瘤或粘膜黑色素瘤。在一些实施方式中，该实体瘤癌症是黑色素瘤，视需要葡萄膜黑色素瘤或粘膜黑色素瘤，并且包括适于瘤内注射的浅表、皮下和/或淋巴结转移。
在一些实施方式中，瘤内注射包括注射到在淋巴结内转移的实体瘤中。在一些实施方式中，瘤内注射包括注射到淋巴结内的淋巴瘤中。在一些实施方式中，瘤内注射包括注射到受试者皮肤表面10cm以内的原发性或继发性实体瘤中。在一些实施方式中，瘤内注射包括注射到受试者皮肤表面5cm以内的原发性或继发性实体瘤中。在一些实施方式中，瘤内注射包括注射到皮肤实体瘤中。在一些实施方式中，该皮肤实体瘤是转移瘤。在一些实施方式中，该皮肤实体瘤是皮肤癌。在一些实施方式中，该皮肤实体瘤不是皮肤癌。在一些实施方式中，瘤内注射包括注射入皮下实体瘤。在一些实施方式中，该皮下实体瘤是转移瘤。在一些实施方式中，该皮下实体瘤是皮肤癌。在一些实施方式中，该皮下实体瘤不是皮肤癌。
在一些实施方式中，该实体瘤是上皮肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是前列腺肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是卵巢肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是肾细胞肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是胃肠道肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是肝肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是大肠直肠肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是脉管系统肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是间皮瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是胰腺肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是乳房肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是肉瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是肺肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是结肠肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是黑色素瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是小细胞肺肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是非小细胞肺癌肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是神经母细胞瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是睾丸肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是上皮癌肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是腺癌肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是精原细胞瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是视网膜母细胞瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是皮肤鳞状上皮细胞癌(CSCC)。在一些实施方式中，该实体瘤是头颈部鳞状上皮细胞癌(HNSCC)。在一些实施方式中，该实体瘤是HNSCC。在一些实施方式中，该实体瘤是头颈癌。在一些实施方式中，该实体瘤是骨肉瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是肾癌。在一些实施方式中，该实体瘤是甲状腺癌。在一些实施方式中，该实体瘤是间变性甲状腺癌(ATC)。在一些实施方式中，该实体瘤是肝癌。在一些实施方式中，该实体瘤是结肠肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是以上任何两种。在一些实施方式中，该实体瘤是以上任何两种或更多种。
在一些实施方式中，该实体瘤是淋巴瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是非何杰金氏淋巴瘤。在一些实施方式中，该实体瘤是何杰金氏淋巴瘤。
在一些实施方式中，该方法包括与抗PD-1抗体组合使用细胞介素RNA混合物，该细胞介素RNA混合物包含编码IFNα的RNA、编码IL-15 sushi的RNA、编码IL-12sc的RNA和编码GM-CSF的RNA，该RNA视需要经修饰以具有取代每个尿苷的经修饰的核碱基和该RNA的5'末端的Cap1结构。
在一些实施方式中，提供了用于治疗晚期、不可切除的或转移性实体瘤癌症的方法，该方法包括向患有晚期、不可切除的或转移性实体瘤癌症的受试者与抗PD-1抗体组合施用编码IL-12sc蛋白的RNA、编码IL-15 sushi蛋白的RNA，编码IFNα蛋白的RNA和编码GM-CSF蛋白的RNA。
在一些实施方式中，包括了用于治疗晚期、不可切除的或转移性实体瘤癌症的方法，该方法包括向患有晚期实体瘤癌症的受试者施用治疗有效量的RNA，该RNA包含编码IL-12sc蛋白的RNA、编码IL-15 sushi蛋白的RNA、编码IFNα蛋白的RNA和编码GM-CSF蛋白的RNA，以及治疗有效量的抗PD-1抗体。
在一些实施方式中，包括了用于治疗晚期、不可切除的或转移性实体瘤癌症的方法，该方法包括施用编码IL-12sc的RNA，并进一步施用编码IFNα、IL-15 sushi和GM-CSF的RNA，以及进一步施用抗PD-1抗体。
在一些实施方式中，包括了用于治疗晚期、不可切除的或转移性实体瘤癌症的方法，该方法包括施用编码IFNα的RNA，并进一步施用编码IL-12sc、IL-15 sushi和GM-CSF的RNA，以及进一步施用抗PD-1抗体。
在一些实施方式中，包括了用于治疗晚期、不可切除的或转移性实体瘤癌症的方法，该方法包括施用编码IL-15 sushi的RNA，并进一步施用编码IL-12sc、IFNα和GM-CSF的RNA，以及进一步施用抗PD-1抗体。
在一些实施方式中，包括了用于治疗晚期、不可切除的或转移性实体瘤癌症的方法，该方法包括施用编码GM-CSF的RNA，并进一步施用编码IL-12sc、IFNα和IL-15 sushi的RNA，以及进一步施用抗PD-1抗体。
在一些实施方式中，包括了用于治疗晚期、不可切除的或转移性实体瘤癌症的方法，该方法包括向患有晚期实体瘤癌症的受试者施用治疗有效量的1)RNA，该RNA包含编码IL-12sc蛋白的RNA、编码IL-15 sushi蛋白的RNA、编码IFNα蛋白的RNA和编码GM-CSF蛋白的RNA，和2)抗PD-1抗体。
如本申请所用，「一种/所述RNA/抗PD-1抗体组合」是指与抗PD1抗体组合施用RNA细胞介素混合物。
在一些实施方式中，所述RNA和该一种抗PD-1抗体的联合施用导致以下一个或多个结果：与未经治疗的受试者或施用所述RNA或该抗PD-1抗体作为单一疗法的受试者相比，(a)癌症症状的严重程度降低或持续时间缩短；(b)肿瘤生长的抑制或肿瘤坏死的增加、肿瘤缩小和/或肿瘤消失；(c)肿瘤生长和/或发展的延迟；(d)肿瘤转移受抑制或阻止或停止；(e)肿瘤生长复发的预防或延迟；(f)受试者的存活率上升；和/或(g)常规抗癌疗法的使用或需求减少(例如，减少或免除了化学疗法或细胞毒性剂的使用)。
本领域已知的用于治疗实体瘤的任何其他治疗选择可以与本申请披露的方法组合使用。在一些情况下，将该细胞介素RNA混合物和抗PD-1抗体与一种或多种其他治疗选择(例如，化学治疗剂，包括另一种免疫刺激剂，免疫疗法，或检查点调节剂；或放射治疗)组合施用。
A.施用路径和时间
在一些实施方式中，所述RNA或该细胞介素RNA混合物通过注射入肿瘤内(例如，瘤内)或肿瘤附近(瘤周)而递送，并且该抗PD1抗体以相同的方式递送或全身递送，例如，静脉内、肠内或肠胃外，包括通过注射、输注和植入递送。所述RNA和抗体可以联合施用，例如，同时、同步或顺序施用。如果系施用，则可以本领域技术人员已知的任何顺序和任何适当的时间间隔进行施用。
在一些实施方式中，将所述RNA瘤内或瘤周注射并且将该抗PD-1抗体静脉内施用。在一些实施方式中，将所述RNA肿瘤注射并且将该抗PD-1抗体静脉内施用。
在一些实施方式中，以3或4周的周期每周一次(即，每21天3剂或每28天4剂)将该细胞介素RNA混合物瘤内施用，并且在这21天或28天的周期中仅一次，可以选择在治疗的第一天，将该抗PD1抗体全身施用(例如，静脉内施用)。在一些实施方式中，该细胞介素RNA混合物每周一次瘤内或瘤周施用，抗PD1抗体在3周周期的第1天静脉内施用(即，每21天三剂该细胞介素RNA混合物和一剂抗PD1抗体)。在一些实施方式中，该细胞介素RNA混合物每周一次瘤内或瘤周施用，抗PD1抗体在4周周期的第1天静脉内施用(即，每28天四剂该细胞介素RNA混合物和一剂抗PD1抗体)。在一些实施方式中，瘤内注射每周一次持续进行，直到第二次肿瘤评估，此时可以将该细胞介素RNA混合物的剂量间隔改为每三周一次。在一些实施方式中，以相同的给药频率(例如，在相同天一起或分开给药)施用所述RNA和该抗PD-1抗体。在一些实施方式中，以不同的给药频率(例如，在不同天)施用所述RNA和该抗PD-1抗体。在一些实施方式中，所述RNA每周施用一次，并且该抗PD-1抗体每三周施用一次。
在一些实施方式中，以3周或4周的周期共同施用该细胞介素RNA混合物和抗PD1，其中该细胞介素RNA混合物每周施用一次，并且该抗PD1抗体仅施用一次。
在一些实施方式中，以3周或4周的周期共同施用该细胞介素RNA混合物和抗PD1，其中该细胞介素RNA混合物每2周施用一次，并且该抗PD1抗体仅施用一次。在一些实施方式中，以3周或4周的周期共同施用该细胞介素RNA混合物和抗PD1，其中该细胞介素RNA混合物每3周施用一次，并且该抗PD1抗体仅施用一次。
在一些实施方式中，以3周或4周的周期共同施用该细胞介素RNA混合物和抗PD1，其中该细胞介素RNA混合物每4周施用一次，并且该抗PD1抗体仅施用一次。
在一些实施方式中，基于等RNA质量(即，1％:1％:1％:1％(重量/重量/重量/重量))以1:1:1:1的比例施用RNA的组合。
在一些实施方式中，本申请所述的所述RNA/抗PD-1抗体组合施用约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。在一些实施方式中，所述RNA/抗PD-1抗体组合施用约8个月。在一些实施方式中，所述RNA/抗PD-1抗体组合施用最多52周。
在一些实施方式中，该抗PD1抗体通过注射施用。在一些实施方式中，该抗PD1抗体通过静脉内施用。在一些实施方式中，该抗PD-1抗体静脉内施用每三周一次，并且该细胞介素RNA混合物瘤内或瘤周施用每周一次。
在一些实施方式中，该抗PD-1抗体每三周一次静脉内施用，并且该细胞介素RNA混合物每周一次瘤内或瘤周施用。
在一些实施方式中，将所述RNA以治疗有效量施用。在一些实施方式中，将该抗PD-1抗体以治疗有效量施用。在一些实施方式中，该治疗有效量是与作为单一疗法的每种组分的治疗有效量不同的量。
在一些实施方式中，以约0.05mg至约600mg的剂量施用该抗PD1抗体，例如约0.05mg、约0.1mg、约1.0mg、约1.5mg、约2.0mg、约10mg、约20mg、约30mg、约40mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约110mg、约120mg、约130mg、约140mg、约150mg、约160mg、约170mg、约180mg、约190mg、约200mg、约210mg、约220mg、约230mg、约240mg、约250mg、约260mg、约270mg、约280mg、约290mg、约300mg、约310mg、约320mg、约330mg、约340mg、约350mg、约360mg、约370mg、约380mg、约390mg、约400mg、约410mg、约420mg、约430mg、约440mg、约450mg、约460mg、约470mg、约480mg、约490mg、约500mg、约510mg、约520mg、约530mg、约540mg、约550mg、约560mg、约570mg、约580mg、约590mg、或约600mg。
在一些实施方式中，施用200mg的抗PD-1抗体。在一些实施方式中，施用240mg的抗PD-1抗体。在一些实施方式中，施用350mg的抗PD-1抗体。在一些实施方式中，该抗PD-1抗体是西米单抗，并且施用350mg的西米单抗。
包含在所述单独的剂量内的抗PD-1抗体的量可以以每千克受试者体重抗体的毫克数来表示(即，mg/kg)。在某些实施方式中，本申请所述方法中使用的抗PD-1抗体可以约0.0001至约100mg/kg受试者体重的剂量施用于受试者。例如，抗PD-1抗体可以以约0.1mg/kg至约20mg/kg患者体重的剂量施用。
在一些实施方式中，该抗PD-1抗体是西米单抗，并且以约3mg/kg患者体重的剂量施用。
在一些实施方式中，可以在限定的时间过程中向受试者施用多个剂量的抗PD-1。在一些实施方式中，一种方法包括向受试者顺序施用一个或多个剂量的抗PD-1抗体。如本申请所用，「顺序施用」是指在不同的时间点，例如，在以预定间隔(例如，小时，天，周或月)分开的不同天，向受试者施用每个剂量的抗体。在一些实施方式中，所述方法包括向患者顺序施用单次初始剂量的抗PD-1抗体，随后是一个或多个第二剂量的抗PD-1抗体，并且视需要系随后是一个或多个第三剂量的抗PD-1抗体。
术语「初始剂量」、「第二剂量」和「第三剂量」是指施用的时间顺序。因此，「初始剂量」系在治疗方案开始时施用的剂量(也称为「基线剂量」)；「第二剂量」系在初始剂量之后施用的剂量；「第三剂量」系在第二剂量之后施用的剂量。初始、第二和第三剂量都可以包含相同量的该抗体(抗PD-1抗体)。然而，在某些实施方式中，初始、第二和/或第三剂量中所含的量在治疗过程中彼此不同(例如，适当地上调或下调)。在某些实施方式中，在治疗方案开始时以「负荷剂量」施用一个或多个(例如1、2、3、4或5个)剂量，随后以较低频率(例如，「维持剂量」)施用后续剂量。例如，可以将抗PD-1抗体以约1-3mg/kg患者体重的负荷剂量施用于患者，随后以约0.1至约20mg/kg患者体重的一个或多个维持剂量施用。
在一些实施方式中，每个第二和/或第三剂量在紧接的前一个剂量之后1/2至14(例如，1/2、1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2或更多)周施用。如本申请所用，短语「紧接的前一个剂量」是指在多次施用的顺序中，在施用该顺序的下一个剂量之前向患者施用的抗PD-1抗体的剂量，其间无中间剂量。
在一些实施方式中，所述方法可以包括向患者施用任何数量的第二剂量和/或第三剂量的抗PD-1抗体。例如，在一些实施方式中，仅向患者施用单个第二剂量。在其他实施方式中，向患者施用两个或更多个(例如2、3、4、5、6、7、8或更多个)第二剂量。同样，在某些实施方式中，仅向患者施用单个第三剂量。在其他实施方式中，向患者施用两个或更多个(例如2、3、4、5、6、7、8或更多个)第三剂量。
在一些涉及多个第二剂量的实施方式中，每个第二剂量可以与其他第二剂量相同的频率施用。例如，每个第二剂量可以在紧接的前一个剂量后1至2周施用于患者。类似地，在一些涉及多个第三剂量的实施方式中，每个第三剂量可以与其他第三剂量相同的频率施用。例如，每个第三剂量可以在紧接的前一个剂量后2至4周施用于患者。备选地，向患者施用第二和/或第三剂量的频率可以在治疗方案的过程中变化。在治疗过程中，还可以由医师在临床检查后根据个体患者的需要来调整施用的频率。
在一些实施方式中，在治疗方案开始时以更频繁地(一周两次、一周一次或2周一次)作为「诱导剂量」施用一个或多个剂量的抗PD-1抗体，随后以更低的频率(例如，每4-12周一次)施用后续剂量(「合并剂量」或「维持剂量」)。
在一些实施方式中，所述RNA在新辅助疗法环境中施用。「新辅助疗法环境」是指其中在原始/确定性疗法之前(例如，在肿瘤的手术切除之前)进行该方法的临床环境。
抗PD-1抗体给药
在一些实施方式中，以约0.05mg至约600mg的剂量施用该抗PD-1抗体，例如约0.05mg、约0.1mg、约1.0mg、约1.5mg、约2.0mg、约10mg、约20mg、约30mg、约40mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约110mg、约120mg、约130mg、约140mg、约150mg、约160mg、约170mg、约180mg、约190mg、约200mg、约210mg、约220mg、约230mg、约240mg、约250mg、约260mg、约270mg、约280mg、约290mg、约300mg、约310mg、约320mg、约330mg、约340mg、约350mg、约360mg、约370mg、约380mg、约390mg、约400mg、约410mg、约420mg、约430mg、约440mg、约450mg、约460mg、约470mg、约480mg、约490mg、约500mg、约510mg、约520mg、约530mg、约540mg、约550mg、约560mg、约570mg、约580mg、约590mg、或约600mg。
在一些实施方式中，施用200mg的抗PD-1抗体。在一些实施方式中，施用240mg的抗PD-1抗体。在一些实施方式中，施用350mg的抗PD-1抗体。在一些实施方式中，该抗PD-1抗体是西米单抗，并且施用350mg的西米单抗。
包含在所述单独的剂量内的抗PD-1抗体的量可以以每千克受试者体重抗体的毫克数来表示(即，mg/kg)。在某些实施方式中，本申请所述方法中使用的抗PD-1抗体可以约0.0001至约100mg/kg受试者体重的剂量施用于受试者。例如，抗PD-1抗体可以以约0.1mg/kg至约20mg/kg患者体重的剂量施用。
在一些实施方式中，该抗PD-1抗体是西米单抗，并且以约3mg/kg患者体重的剂量施用。
在一些实施方式中，可以在限定的时间过程中向受试者施用多个剂量的抗PD-1。在一些实施方式中，一种方法包括向受试者顺序施用一个或多个剂量的抗PD-1抗体。如本申请所用，「顺序施用」是指在不同的时间点，例如，在以预定间隔(例如，小时，天，周或月)分开的不同天，向受试者施用每个剂量的抗体。在一些实施方式中，所述方法包括向患者顺序施用单次初始剂量的抗PD-1抗体，随后是一个或多个第二剂量的抗PD-1抗体，并且视需要系随后是一个或多个第三剂量的抗PD-1抗体。
术语「初始剂量」、「第二剂量」和「第三剂量」是指施用的时间顺序。因此，「初始剂量」系在治疗方案开始时施用的剂量(也称为「基线剂量」)；「第二剂量」系在初始剂量之后施用的剂量；「第三剂量」系在第二剂量之后施用的剂量。初始、第二和第三剂量都可以包含相同量的该抗体(抗PD-1抗体)。然而，在某些实施方式中，初始、第二和/或第三剂量中所含的量在治疗过程中彼此不同(例如，适当地上调或下调)。在某些实施方式中，在治疗方案开始时以「负荷剂量」施用一个或多个(例如1、2、3、4或5个)剂量，随后以较低频率(例如，「维持剂量」)施用后续剂量。例如，可以将抗PD-1抗体以约1-3mg/kg患者体重的负荷剂量施用于患者，随后以约0.1至约20mg/kg患者体重的一个或多个维持剂量施用。
在一些实施方式中，每个第二和/或第三剂量在紧接的前一个剂量之后1/2至14(例如，1/2、1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2或更多)周施用。如本申请所用，短语「紧接的前一个剂量」是指在多次施用的顺序中，在施用该顺序的下一个剂量之前向患者施用的抗PD-1抗体的剂量，其间无中间剂量。
在一些实施方式中，所述方法可以包括向患者施用任何数量的第二剂量和/或第三剂量的抗PD-1抗体。例如，在一些实施方式中，仅向患者施用单个第二剂量。在其他实施方式中，向患者施用两个或更多个(例如2、3、4、5、6、7、8或更多个)第二剂量。同样，在某些实施方式中，仅向患者施用单个第三剂量。在其他实施方式中，向患者施用两个或更多个(例如2、3、4、5、6、7、8或更多个)第三剂量。
在一些涉及多个第二剂量的实施方式中，每个第二剂量可以与其他第二剂量相同的频率施用。例如，每个第二剂量可以在紧接的前一个剂量后1至2周施用于患者。类似地，在一些涉及多个第三剂量的实施方式中，每个第三剂量可以与其他第三剂量相同的频率施用。例如，每个第三剂量可以在紧接的前一个剂量后2至4周施用于患者。备选地，向患者施用第二和/或第三剂量的频率可以在治疗方案的过程中变化。在治疗过程中，还可以由医师在临床检查后根据个体患者的需要来调整施用的频率。
在一些实施方式中，在治疗方案开始时以更频繁地(一周两次、一周一次或2周一次)作为「诱导剂量」施用一个或多个剂量的抗PD-1抗体，随后以更低的频率(例如，每4-12周一次)施用后续剂量(「合并剂量」或「维持剂量」)。
B.适应症和患者群体
在一些实施方式中，本申请提供的RNA/抗PD-1抗体组合用于治疗患有实体瘤的受试者的方法。在一些实施方式中，该受试者：
i.抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)或抗程序性细胞死亡因子1配体(PD-L1)疗法已经失败，或对其变得不耐受、有抗性或难治；和/或
ii.患有PD-1和/或PD-L1抗性实体瘤；和/或
iii.对抗PD-1和/或抗PD-L1疗法具有获得性抗性；和/或
iv.对抗PD-1和/或抗PD-L1疗法具有先天性抗性。
在一些实施方式中，本申请提供的RNA/抗PD-1抗体组合用于在抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)或抗程序性细胞死亡因子1配体(PD-L1)疗法已经失败的受试者中治疗实体瘤的方法。
在一些实施方式中，本申请提供的RNA/抗PD-1抗体组合用于在对抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)或抗程序性细胞死亡因子1配体(PD-L1)疗法不耐受的受试者中治疗实体瘤的方法。
在一些实施方式中，本申请提供的RNA/抗PD-1抗体组合用于在对抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)或抗程序性细胞死亡因子1配体(PD-L1)疗法有抗性的受试者中治疗实体瘤的方法。
在一些实施方式中，本申请提供的RNA/抗PD-1抗体组合用于在对抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)或抗程序性细胞死亡因子1配体(PD-L1)疗法不耐受的受试者中治疗实体瘤的方法。
在一些实施方式中，本申请提供的RNA/抗PD-1抗体组合用于在患有PD-1和/或PD-L1抗性实体瘤的受试者中治疗实体瘤的方法。
在一些实施方式中，本申请提供的RNA/抗PD-1抗体组合用于在受试者中治疗实体瘤的方法，其中该受试者对抗PD-1和/或抗PD-L1疗法具有获得性抗性。
在一些实施方式中，本申请提供的RNA/抗PD-1抗体组合用于在受试者中治疗实体瘤的方法，其中该受试者对抗PD-1和/或抗PD-L1疗法具有先天性抗性。
在一些实施方式中，该受试者患有转移性实体瘤。在一些实施方式中，该受试者患有不可切除的实体瘤。在一些实施方式中，该受试者患有晚期实体瘤。在一些实施方式中，该受试者患有转移性实体瘤癌症。在一些实施方式中，该受试者患有晚期、不可切除且有转移性的实体瘤。在一些实施方式中，该受试者患有晚期且不可切除的实体瘤。在一些实施方式中，该受试者患有晚期且有转移性的实体瘤。在一些实施方式中，该受试者患有不可切除的且有转移性的实体瘤。
在一些实施方式中，该受试者的癌细胞包含β2-微球蛋白(B2M)功能的部分或全部损失。在一些实施方式中，该受试者的癌细胞具有B2M功能的部分损失。在一些实施方式中，该受试者的癌细胞具有B2M功能的全部损失。在一些实施方式中，通过将癌细胞与来自同一受试者的非癌细胞进行比较来评估B2M功能的部分或全部损失，其中非癌细胞来自癌细胞所源自的相同组织。在一些实施方式中，通过将癌细胞与来自同一受试者的非癌细胞进行比较来评估B2M功能的部分或全部损失，其中非癌细胞并非来自癌细胞所源自的相同组织。在一些实施方式中，通过比较癌细胞与来自不同受试者的非癌细胞来评估B2M功能的部分或全部损失。在一些实施方式中，通过比较癌细胞与非癌细胞对照来评估B2M功能的部分或全部损失。
在一些实施方式中，该癌细胞在实体瘤中，该实体瘤包含具有正常B2M功能的癌细胞。在一些实施方式中，该癌细胞在实体瘤中，其中25％或更多的癌细胞的B2M功能部分或全部损失。在一些实施方式中，该癌细胞在实体瘤中，其中50％或更多的癌细胞的B2M功能部分或全部损失。在一些实施方式中，该癌细胞在实体瘤中，其中75％或更多的癌细胞的B2M功能部分或全部损失。在一些实施方式中，该癌细胞在实体瘤中，其中95％或更多的癌细胞的B2M功能部分或全部损失。
在一些实施方式中，该受试者包含含有B2M基因突变的细胞。
在一些实施方式中，该突变是取代、插入或缺失。在一些实施方式中，该B2M基因包含杂合性缺失(LOH)。在一些实施方式中，该突变是移码突变。在一些实施方式中，该突变是缺失突变。在一些实施方式中，该移码突变发生在B2M的外显子1中。在一些实施方式中，该移码突变导致B2M的截短。在一些实施方式中，该突变是B2M的全部或部分缺失(例如，截短)。在一些实施方式中，缺失突变在B2M的外显子1中。在一些实施方式中，该移码突变包含p.Leu13fs和/或p.Ser14fs。在一些实施方式中，根据Middha等人(2019)JCO PrecisOncol.[临床肿瘤学杂志·精密肿瘤学](doi:10.1200/PO.18.00321)，该移码突变包含V69Wfs*34、L15fs*41、L13P、L15fs*41和/或p.S31*。在一些实施方式中，该突变包括JAK1和/或JAK2的激酶结构域上游的移码和/或缺失(例如，截短)突变。
在一些实施方式中，与没有发生B2M功能的部分或全部损失的受试者相比，该受试者具有降低的B2M蛋白水平。
在一些实施方式中，该受试者具有β-2-微球蛋白(B2M)功能的部分或全部损失。在一些实施方式中，该受试者具有B2M功能的部分损失。在一些实施方式中，该受试者具有B2M功能的全部损失。B2M功能的部分或全部损失可通过与来自同一受试者的组织样本进行比较来评估。B2M功能的部分或全部损失可以通过比较来自肿瘤的组织样本与来自肿瘤样本所源自的相同组织的组织样本来评估。
在一些实施方式中，与该实体瘤所源自的正常细胞或组织相比，该实体瘤整体上(例如，如在从该实体瘤进行的生检中所评估的)的B2M功能部分或全部损失。在一些实施方式中，该受试者具有B2M基因中的突变(例如，因其导致的功能的部分或全部损失)。
在一些实施方式中，肿瘤内的某些细胞具有B2M功能损失。在一些实施方式中，肿瘤内的某些细胞具有B2M功能的部分或全部损失，而肿瘤内的其他细胞则没有。
在一些实施方式中，该受试者具有与对照相比降低的表面表现的主要组织兼容性复合物I类(MHC I)水平，视需要其中该对照是来自同一受试者的非癌症样本。在一些实施方式中，受试者的癌细胞具有降低的表面表现的MHC I水平。在一些实施方式中，该癌细胞没有表面表现的MHC I。在一些实施方式中，该降低的表面表现的MHC I水平通过将癌细胞与来自同一受试者的非癌细胞进行比较来评估，视需要其中该非癌细胞来自该癌细胞所源自的相同组织。在一些实施方式中，该癌细胞在实体瘤中，该实体瘤包含表面表现MHC I水平正常的癌细胞。在一些实施方式中，该癌细胞在实体瘤中，其中25％或更多的癌细胞具有降低的表面表现的MHC I水平。在一些实施方式中，该癌细胞在实体瘤中，其中50％或更多的癌细胞具有降低的表面表现的MHC I水平。在一些实施方式中，该癌细胞在实体瘤中，其中75％或更多的癌细胞具有降低的表面表现的MHC I水平。在一些实施方式中，该癌细胞在实体瘤中，其中95％或更多的癌细胞具有降低的表面表现的MHC I水平。
在一些实施方式中，该实体瘤整体上(例如，如在取自该实体瘤的生检中所评估的)与该实体瘤所源自的正常细胞或组织相比具有降低的表面表现的MHC I水平。
在一些实施方式中，本申请提供的RNA/抗PD-1抗体组合用于治疗晚期实体瘤癌症的方法。
在一些实施方式中，本申请提供的RNA/抗PD-1抗体组合用于治疗不可切除的实体瘤癌症的方法。
在一些实施方式中，本申请提供的RNA/抗PD-1抗体组合用于治疗转移性实体瘤癌症的方法。
在一些实施方式中，将该细胞介素RNA混合物注射入淋巴结内的一个或多个实体瘤癌症中。
在一些实施方式中，该晚期实体瘤癌症包括适合于直接瘤内注射的肿瘤。在一些实施方式中，该晚期实体瘤癌症是III期、III期子集、IV期或IV期子集。在一些实施方式中，该癌症是黑色素瘤。在一些实施方式中，该黑色素瘤是IIIB期、IIIC期或IV期。在一些实施方式中，该癌症是皮肤鳞状上皮细胞癌(CSCC)。在一些实施方式中，该癌症是头颈部鳞状上皮细胞癌(HNSCC)。在一些实施方式中，该CSCC或HNSCC系III期或IV期。在一些实施方式中，该实体瘤癌症是黑色素瘤，视需要其中该黑色素瘤是葡萄膜黑色素瘤或粘膜黑色素瘤；并且包括适于瘤内注射的浅表、皮下和/或淋巴结转移。在一些实施方式中，该实体瘤癌症是HNSCC和/或仅在粘膜部位的粘膜黑色素瘤。在一些实施方式中，该实体瘤癌症是HNSCC。在一些实施方式中，该实体瘤癌症是葡萄膜黑色素瘤或粘膜黑色素瘤。在一些实施方式中，该实体瘤癌症是葡萄膜黑色素瘤。在一些实施方式中，该实体瘤癌症是粘膜黑色素瘤。在一些实施方式中，仅在该实体瘤癌的粘膜部位瘤内注射所述RNA，其中该实体瘤癌症是HNSCC或粘膜黑色素瘤。
在一些实施方式中，该受试者先前抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)或抗程序性细胞死亡因子1配体(PD-L1)疗法已经失败。在其他实施方式中，该受试者先前未曾接受抗PD-1或抗PD-L1疗法治疗。在一些实施方式中，该受试者没有其他治疗选择。
在一些实施方式中，该方法可以包括在受试者中减小肿瘤大小或预防癌症转移。
在一些实施方式中，该受试者患有至少两个肿瘤病变或至少三个肿瘤病变。在一些实施方式中，该受试者患有两个肿瘤病变。在一些实施方式中，该受试者患有三个肿瘤病变。
在一些实施方式中，该受试者患有的疾病可根据如本申请所述的实体瘤反应评价标准(RECIST)1.1标准测量。
在一些实施方式中，该受试者患有适合于直接瘤内注射的肿瘤。在一些实施方式中，肿瘤是否适合直接瘤内注射可以基于剂量体积确定。在一些实施方式中，如果肿瘤包括适合于注射(即，不出血或渗液)的最长直径≥0.5cm的一处皮肤或皮下病变或变为融合且最长直径(所有累及靶标病变直径的总和)≥0.5cm的多处皮肤或皮下病变，则适合于直接瘤内注射细胞介素RNA混合物。在一些实施方式中，适合于超音波检查(USG)引导的瘤内注射并被确认为转移性疾病的≥1.5cm的淋巴结也是合适的。在一些实施方式中，该肿瘤是葡萄膜黑色素瘤或粘膜黑色素瘤。在一些实施方式中，该肿瘤是葡萄膜黑色素瘤或粘膜黑色素瘤；并且包括适于瘤内注射的浅表、皮下和/或淋巴结转移。
在一些实施方式中，该受试者是人类。在一些实施方式中，该受试者可具有超过3个月、4个月、5个月或6个月的预期寿命。在一些实施方式中，该受试者的预期寿命超过3个月。在一些实施方式中，该受试者为至少18岁。
在一些实施方式中，提供了用于治疗晚期黑色素瘤、皮肤鳞状上皮细胞癌(CSCC)或头颈部鳞状上皮细胞癌(HNSCC)的方法，该方法包括向患有晚期黑色素瘤的受试者施用编码IL-12sc蛋白的RNA、编码IL-15 sushi蛋白的RNA、编码IFNα蛋白的RNA和编码GM-CSF蛋白的RNA以及抗PD-1抗体。在一些实施方式中，(a)该受试者为至少18岁；(b)该受试者先前的抗PD1或抗PD-L1疗法已经失败；(c)该受试者至少有2处病变；(d)该黑色素瘤、CSCC或HNSCC包含适合直接瘤内注射的肿瘤。
在一些实施方式中，该受试者患有可根据实体瘤反应评价标准(RECIST)1.1标准测量的疾病。在一些实施方式中，该受试者的预期寿命超过3个月。
在一些实施方式中，该实体瘤是上皮肿瘤、前列腺肿瘤、卵巢肿瘤、肾细胞肿瘤、胃肠道肿瘤、肝肿瘤、大肠直肠肿瘤、脉管系统肿瘤、间皮瘤、胰腺肿瘤、乳房肿瘤、肉瘤、肺肿瘤、结肠肿瘤、黑色素瘤、小细胞肺肿瘤、神经母细胞瘤、睾丸肿瘤、上皮癌肿瘤、腺癌肿瘤、精原细胞瘤、视网膜母细胞瘤、皮肤鳞状上皮细胞癌(CSCC)、头颈部鳞状上皮细胞癌(HNSCC)、头颈癌或骨肉瘤。
在一些实施方式中，该实体瘤包括任何大小的原发性肿瘤。在一些实施方式中，报告的肿瘤厚度测量值四舍五入到最接近的0.1mm。在一些实施方式中，该实体瘤包含厚度≤1.0mm的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤包含厚度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0mm的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤包含厚度<0.8mm(或小于0.8mm)的无溃疡的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤包含厚度<0.8mm(或小于0.8mm)的有溃疡的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤包含厚度为0.8至1.0mm的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤包含厚度为0.8、0.9或1.0mm的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤包含厚度为0.8至1.0mm的无溃疡或有溃疡的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤包含厚度>1.0-2.0mm的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤包含厚度为1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0mm的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤包含厚度>1.0-2.0mm的无溃疡或有溃疡的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤包含厚度>2.0-4.0mm的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤包含厚度3.0-4.0mm的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤包含厚度为2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4.0mm的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤包含厚度>2.0-4.0mm的无溃疡或有溃疡的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤包含厚度>4.0mm的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤包含厚度为4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、7.0、8.0、9.0或10.0mm的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该实体瘤包含厚度>4.0mm的无溃疡或有溃疡的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该厚度为肿瘤的最厚(即，最大)的尺寸。在一些实施方式中，该肿瘤是皮肤癌肿瘤，并且厚度系从皮肤表面到肿瘤的最深部分(例如，厚度不是肿瘤的侧向扩展)。在一些实施方式中，该肿瘤是除皮肤癌以外的癌症的皮肤转移，并且肿瘤的厚度系从皮肤表面到肿瘤的最深部分(例如，厚度不是肿瘤的侧向扩展)。
在一些实施方式中，该实体瘤是黑色素瘤实体瘤。在一些实施方式中，该黑色素瘤包含任何大小的原发性肿瘤。在一些实施方式中，报告的肿瘤厚度测量值四舍五入到最接近的0.1mm。在一些实施方式中，该黑色素瘤包含厚度≤1.0mm的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该黑色素瘤包含厚度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0mm的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该黑色素瘤包含厚度<0.8mm(或小于0.8mm)的无溃疡的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该黑色素瘤包含厚度<0.8mm(或小于0.8mm)的有溃疡的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该黑色素瘤包含厚度为0.8至1.0mm的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该黑色素瘤包含厚度为0.8、0.9或1.0mm的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该黑色素瘤包含厚度为0.8至1.0mm的无溃疡或有溃疡的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该黑色素瘤包含厚度>1.0-2.0mm的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该黑色素瘤包含厚度为1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0mm的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该黑色素瘤包含厚度>1.0-2.0mm的无溃疡或有溃疡的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该黑色素瘤包含厚度>2.0-4.0mm的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该黑色素瘤包含厚度为3.0-4.0mm的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该黑色素瘤包含厚度为2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4.0mm的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该黑色素瘤包含厚度>2.0-4.0mm的无溃疡或有溃疡的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该黑色素瘤包含厚度>4.0mm的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该黑色素瘤包含厚度为4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、7.0、8.0、9.0或10.0mm的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该黑色素瘤包含厚度>4.0mm的无溃疡或有溃疡的原发性肿瘤。在一些实施方式中，该厚度系从皮肤表面到肿瘤的最深部分(厚度不是肿瘤的侧向扩展)。
在一些实施方式中，该黑色素瘤包含一个肿瘤累及的区域淋巴结或，或包含任何数量的在途、卫星和/或微卫星转移而无肿瘤累及的淋巴结。在一些实施方式中，该黑色素瘤包含一个临床上隐匿的肿瘤累及的区域淋巴结。在一些实施方式中，该黑色素瘤包含一个临床上可检测到的肿瘤累及的区域淋巴结。在一些实施方式中，该黑色素瘤包含任何数量的在途、卫星和/或微卫星转移，无肿瘤累及的淋巴结。在一些实施方式中，该黑色素瘤包含两个或三个肿瘤累及的区域淋巴结，或包含任何数量的在途、卫星和/或微卫星转移而无肿瘤累及的淋巴结。在一些实施方式中，该黑色素瘤包含两个或三个临床上隐匿的肿瘤累及的区域淋巴结。在一些实施方式中，该黑色素瘤包含两个或三个肿瘤累及的区域淋巴结，其中至少一个系临床上可检测到的。在一些实施方式中，该黑色素瘤包含两个或三个肿瘤累及的区域淋巴结，其中一个系临床上隐匿的或临床上可检测到的，并且存在转移、卫星和/或微卫星转移。在一些实施方式中，该黑色素瘤包含任何数量的在途、卫星和/或微卫星转移，有一个肿瘤累及的淋巴结。在一些实施方式中，该黑色素瘤包含四个或更多个肿瘤累及的区域淋巴结，或任意数量的在途、卫星和/或微卫星转移且具有两个或更多个肿瘤累及的淋巴结，或任何数量的粗糙结节且不存在或存在在途、卫星和/或微卫星转移。在一些实施方式中，该黑色素瘤包含四个或更多个临床上隐匿的肿瘤累及的区域淋巴结。在一些实施方式中，该黑色素瘤包含四个或更多个临床上隐匿的肿瘤累及的区域淋巴结，其中至少一个系临床上可检测到的或存在任何数量的粗糙结节。在一些实施方式中，该黑色素瘤包含两个或三个肿瘤累及的区域淋巴结，其中一个系临床上隐匿的或临床上可检测到的。在一些实施方式中，该黑色素瘤包含四个或更多个临床上隐匿的肿瘤累及的区域淋巴结，其中两个或更多个系临床上隐匿的或临床上可检测到的和/或在存在任何数量的粗糙结节，并且存在在途、卫星和/或微卫星转移。
在一些实施方式中，该黑色素瘤
a.包含任何大小的原发性肿瘤；
b.包含一个或多个肿瘤累及的区域淋巴结；或在途、卫星和/或微卫星转移，无肿瘤累及的区域淋巴结；以及
c.不包含可检测到的远处转移。
在一些实施方式中，该黑色素瘤具有可检测到的远处转移。
在一些实施方式中，该黑色素瘤
a.包含厚度<0.8mm的无溃疡的原发性肿瘤；或厚度为0.8至1.0mm的原发性肿瘤和厚度小于0.8mm并有溃疡的原发性肿瘤；或厚度>1.0-2.0mm且无溃疡的原发性肿瘤；
b.包含一或两个或三个临床上隐匿的肿瘤累及的局部淋巴结；以及
c.不包含可检测到的远处转移。
在一些实施方式中，该黑色素瘤
a.包含厚度<0.8mm的无溃疡的原发性肿瘤；或厚度为0.8至1.0mm的原发性肿瘤和厚度小于0.8mm并有溃疡的原发性肿瘤；或厚度>1.0-2.0mm且无溃疡的原发性肿瘤；
b.包含一个临床上可检测到的肿瘤累及的区域淋巴结；或没有肿瘤累及的区域淋巴结，存在在途、卫星和/或微卫星转移；或两个或三个肿瘤累及的区域淋巴结，其中至少一个系临床上可检测到的；以及
c.不包含可检测到的远处转移。
在一些实施方式中，该黑色素瘤
a.包含厚度>1.0-2.0mm的有溃疡的原发性肿瘤；或厚度>2.0-4.0mm且无溃疡的原发性肿瘤；
b.包含一个临床上可检测到的或临床上隐匿的肿瘤累及的区域淋巴结；或没有或一个肿瘤累及的区域淋巴结，存在在途、卫星和/或微卫星转移；以及
c.不包含可检测到的远处转移。
在一些实施方式中，该黑色素瘤
a.包含一个临床上可检测到的肿瘤累及的区域淋巴结；或没有肿瘤累及的区域淋巴结，存在在途、卫星和/或微卫星转移；以及
b.不包含可检测到的远处转移。
在一些实施方式中，该黑色素瘤没有可检测到的远处转移；并且包含
a.两个或三个肿瘤累及的区域淋巴结，其中至少一个系临床上可检测到的；
b.一个临床上隐匿的或可检测到的肿瘤累及的区域淋巴结，存在在途、卫星和/或微卫星转移；
c.四个或更多个肿瘤累及的区域淋巴结，其中至少一个系临床上可检测到的，或存在一个或多个粗糙结节；或者
d.两个或更多个临床上隐匿的或临床上可检测到的肿瘤累及的区域淋巴结和/或存在一个或多个粗糙结节且存在在途、卫星和/或微卫星转移。
在一些实施方式中，该黑色素瘤包含厚度<0.8mm或>1.0-2.0mm或>2.0-4.0mm的无溃疡的原发性肿瘤；不包含可检测到的远处转移；并且包含：
a.一个临床上隐匿的或临床上可检测到的肿瘤累及的区域淋巴结，存在在途、卫星和/或微卫星转移；或者
b.四个或更多个肿瘤累及的区域淋巴结；或一处或多处在途、卫星和/或微卫星转移，有两个或更多个肿瘤累及的结节；或一个或多个粗糙结节，存在或不存在在途、卫星和/或微卫星转移。
在一些实施方式中，该黑色素瘤
a.包含厚度>2.0-4.0mm的有溃疡的原发性肿瘤或厚度>4.0mm的无溃疡的原发性肿瘤；
b.包含一个或多个肿瘤累及的区域淋巴结；或一处或多处在途、卫星和/或微卫星转移，可选地有一个或多个肿瘤累及的区域淋巴结；或一个或多个粗糙结节，存在或不存在在途、卫星和/或微卫星转移；以及
c.不包含可检测到的远处转移。
在一些实施方式中，该黑色素瘤
a.包含厚度>4.0mm的无溃疡的原发性肿瘤；
b.包含一或两个或三个肿瘤累及的区域淋巴结；或一处或多处在途、卫星和/或微卫星转移，没有或有一个肿瘤累及的区域淋巴结；以及
c.不包含可检测到的远处转移。
在一些实施方式中，该黑色素瘤
a.包含厚度>4.0mm的有溃疡的原发性肿瘤；
b.包含四个或更多格肿瘤累及的区域淋巴结；或一处或多处在途、卫星和/或微卫星转移，具有两个或更多个肿瘤累及的区域淋巴结，或一个或多个粗糙结节，存在或不存在在途、卫星和/或微卫星转移；以及
c.不包含可检测到的远处转移。
在一些实施方式中，该皮肤鳞状上皮细胞癌(CSCC)或头颈部鳞状上皮细胞癌(HNSCC)包含任何大小的肿瘤。在一些实施方式中，该CSCC或HNSCC不包含已鉴定的肿瘤。在一些实施方式中，该CSCC或HNSCC包含最大尺寸为2cm或更小的肿瘤。在一些实施方式中，该CSCC或HNSCC包含最大尺寸大于2cm但不大于4cm的肿瘤。在一些实施方式中，该CSCC或HNSCC包含最大尺寸大于4cm或具有最小的骨侵蚀或神经周围浸润或深度浸润的肿瘤。在一些实施方式中，该CSCC或HNSCC包含具有大范围的皮质或髓质骨累及或颅底浸润或颅底孔浸润的肿瘤。
在一些实施方式中，该皮肤鳞状上皮细胞癌(CSCC)或头颈部鳞状上皮细胞癌(HNSCC)不包含区域淋巴结转移。在一些实施方式中，该CSCC或HNSCC包含单个同侧淋巴结转移，最大尺寸为3cm或更小，并且呈ENE阴性。在一些实施方式中，该CSCC或HNSCC包含最大尺寸大于3cm但不大于6cm并且呈ENE阴性的单个同侧淋巴结转移。在一些实施方式中，该CSCC或HNSCC包含多个同侧淋巴结转移，该淋巴结最大尺寸不大于6cm并且呈ENE阴性。在一些实施方式中，该CSCC或HNSCC包含双侧或对侧淋巴结转移，该淋巴结最大尺寸不大于6cm并且呈ENE阴性。在一些实施方式中，该CSCC或HNSCC包含最大尺寸大于6cm的淋巴结转移，并且呈ENE阴性；或任何淋巴结转移并且呈ENE阴性。在一些实施方式中，该皮肤鳞状上皮细胞癌(CSCC)或头颈部鳞状上皮细胞癌(HNSCC)：
a.包含最大尺寸大于4cm或具有最小的骨侵蚀或神经周围浸润或深度浸润的肿瘤；以及
b.包含
i.无区域淋巴结转移；或者
ii.单个同侧淋巴结转移，最大尺寸为3cm或更小，并且呈ENE阴性；以及
c.不包含可检测到的远处转移。
在一些实施方式中，该皮肤鳞状上皮细胞癌(CSCC)或头颈部鳞状上皮细胞癌(HNSCC)包含：
a.最大尺寸为2cm或更小的肿瘤；
b.单个同侧淋巴结转移，最大尺寸为3cm或更小，并且呈ENE阴性；以及
c.无可检测到的远处转移。
在一些实施方式中，该皮肤鳞状上皮细胞癌(CSCC)或头颈部鳞状上皮细胞癌(HNSCC)包含：
a.最大尺寸大于2cm但不大于4cm的肿瘤；
b.单个同侧淋巴结转移，最大尺寸为3cm或更小，并且呈ENE阴性；以及
c.无可检测到的远处转移。
在一些实施方式中，该皮肤鳞状上皮细胞癌(CSCC)或头颈部鳞状上皮细胞癌(HNSCC)
a.包含：
i.最大尺寸为2cm或更小的肿瘤；或者
ii.最大尺寸大于2cm但不大于4cm的肿瘤；或者
iii.最大尺寸大于4cm或最小的骨侵蚀或神经周围浸润或深度浸润的肿瘤；以及
b.包含
i.最大尺寸大于3cm但不大于6cm的同侧淋巴结转移，并且呈结外扩展(ENE)阴性；或者
ii.多个同侧淋巴结转移，最大尺寸不大于6cm，并且呈ENE阴性；或者
iii.双侧或对侧淋巴结转移，最大尺寸不大于6cm，并且呈ENE阴性；以及
c.不包含可检测到的远处转移。
在一些实施方式中，该皮肤鳞状上皮细胞癌(CSCC)或头颈部鳞状上皮细胞癌(HNSCC)
a.包含
i.最大尺寸为2cm或更小的肿瘤；或者
ii.最大尺寸大于2cm但不大于4cm的肿瘤；或者
iii.最大尺寸大于4cm或最小的骨侵蚀或神经周围浸润或深度浸润的肿瘤；或者
iv.具有大范围的皮质或髓质骨累及或颅底浸润或颅底孔浸润的肿瘤；以及
b.包含最大尺寸大于6cm的淋巴结转移，并且呈ENE阴性；或在任何淋巴结中转移，并且呈ENE阴性；以及
c.不包含可检测到的远处转移。
在一些实施方式中，该皮肤鳞状上皮细胞癌(CSCC)或头颈部鳞状上皮细胞癌(HNSCC)
a.包含具有大范围的皮质或髓质骨累及或颅底浸润或颅底孔浸润的肿瘤；
b.包含
i.无区域淋巴结转移；或者
ii.单个同侧淋巴结转移，最大尺寸为3cm或更小，并且呈ENE阴性；或者
iii.最大尺寸大于3cm但不大于6cm的同侧淋巴结转移，并且呈ENE阴性；或多个同侧淋巴结转移，最大尺寸不大于6cm，并且呈ENE阴性；或双侧或对侧淋巴结转移，最大尺寸不大于6cm，并且呈ENE阴性；或者
iv.最大尺寸大于6cm的淋巴结转移，并且呈ENE阴性；或任何淋巴结转移并且呈ENE阴性，并且
c.不包含可检测到的远处转移。
在一些实施方式中，该皮肤鳞状上皮细胞癌(CSCC)或头颈部鳞状上皮细胞癌(HNSCC)
a.包含具有大范围的皮质或髓质骨累及或颅底浸润或颅底孔浸润的肿瘤；以及
b.不包含可检测到的远处转移。
在一些实施方式中，该皮肤鳞状上皮细胞癌(CSCC)或头颈部鳞状上皮细胞癌(HNSCC)
a.包含
i.最大尺寸为2cm或更小的肿瘤；或者
ii.最大尺寸大于2cm但不大于4cm的肿瘤；或者
iii.最大尺寸大于4cm或最小的骨侵蚀或神经周围浸润或深度浸润的肿瘤；或者
iv.具有大范围的皮质或髓质骨累及或颅底浸润或颅底孔浸润的肿瘤；
b.包含
i.无区域淋巴结转移；或者
ii.单个同侧淋巴结转移，最大尺寸为3cm或更小，并且呈ENE阴性；或者
iii.最大尺寸大于3cm但不大于6cm的同侧淋巴结转移，并且呈ENE阴性；或多个同侧淋巴结转移，最大尺寸不大于6cm，并且呈ENE阴性；或双侧或对侧淋巴结转移，最大尺寸不大于6cm，并且呈ENE阴性；
iv.最大尺寸大于6cm的淋巴结转移，并且呈ENE阴性；或任何淋巴结转移并且呈ENE阴性；以及
c.包含可检测到的远处转移。
在一些实施方式中，该皮肤鳞状上皮细胞癌(CSCC)或头颈部鳞状上皮细胞癌(HNSCC)不包含可检测到的远处转移。
在一些实施方式中，所述RNA的治疗有效量导致以下一种或多种结果：视需要与未经治疗的受试者或仅施用该RNA混合物中所述RNA的1、2或3种的受试者相比，(a)癌症症状的严重程度降低或持续时间缩短；(b)肿瘤生长的抑制或肿瘤坏死的增加、肿瘤缩小和/或肿瘤消失；(c)肿瘤生长和/或发展的延迟；(d)肿瘤转移受抑制或阻止或停止；(e)肿瘤生长复发的预防或延迟；(f)受试者的存活率上升；和/或(g)常规抗癌疗法的使用或需求减少(例如，减少或免除了化学疗法或细胞毒性剂的使用)。
* * *
本说明书和示例性实施方式不应被视为限制性的。为了本说明书和所附的目的，除非另外指出，否则在所有情况下，应将表示数量、百分比或比例的所有数字以及在说明书和中使用的其他数值理解为由术语「约」来修饰(只要所述数字和数值没有如此修饰)。「约」表示基本上不影响所描述主题的性质的差异程度，例如，在10％、5％、2％或1％之内。因此，除非相反地指出，否则以下说明书和所附中列出的数字参数系可以根据试图获得的期望特性而有所差异的近似值。至少，并且不试图将等同原则的应用限制于的范围，每个数字参数应至少根据所报告的有效数字的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。
值得注意的是，如在本说明书和所附中所使用的，单数形式「一个」、「一种」和「该」以及任何词的任何单数使用，均包括多个指称，除非特意地并且明确地限于一个指称。如本申请中所使用的，术语「包括」及其语法变体意在指非限制性的，使得列表中的项目的列举不排除可以替换或添加到所列项目的其他类似项目。
实施例
提供以下实施例以举例说明某些披露的实施方式，并且不应以任何方式解释为限制本申请的范围。在以下讨论的实施例中，如上文所定义的该细胞介素RNA混合物也可以互换地称为「该混合物」、「该细胞介素混合物」、「该组合物」或「该药物」。
实施例1-细胞介素RNA混合物作为单一疗法和与西米单抗组合的剂量递增和剂量扩展
总体设计：进行一项人类中首次开放标签、剂量递增和扩展研究，以评价肿瘤内作为单一药物和与西米单抗组合瘤内施用的细胞介素RNA混合物的最大耐受和施用剂量、安全性、耐受性、药物动力学、药效动力学和抗肿瘤活性。
参与者的数量：当该细胞介素RNA混合物作为单一药物施用时，计划招募最多72名参与者，取决于递增期研究的剂量水平。当该细胞介素RNA混合物与西米单抗组合施用时，计划最多招募192名参与者，取决于递增期研究的剂量水平和扩展期每个队列的完成阶段。合计总共招募最多264名参与者。
剂量递增期(单一疗法)：剂量递增期中没有正式的样本量计算。将该细胞介素RNA混合物施用于先前基于抗PD-1或抗PD-L1的疗法已经失败的晚期实体瘤患者，和/或对抗PD-1不作为常规使用的所述适应症无其他治疗选择的患者。剂量递增期招募最多38位可评价剂量限制性毒性(DLT)的参与者，预期评估约8个剂量水平。实际样本量取决于观察到的DLT和实际探索的剂量水平的数量。
剂量扩展期(单一疗法)：在扩展期使用了Simon二阶段设计，招募了大约34名患有晚期黑色素瘤的参与者，所述参与者先前的抗PD-1/抗PD-L1疗法失败。在第一批16名接受治疗的参与者之后，进行一项期中分析，如果在至少2名参与者中观察到反应，则应计人数继续到34名参与者的全样本量。
剂量递增期(组合疗法)：与西米单抗组合的细胞介素RNA混合物的剂量递增中的实际样本量因观察到的DLT和实际探索的剂量水平的数量而异(大约18至36名可评价DLT的参与者)。
剂量扩展期(组合疗法)：与西米单抗组合的细胞介素RNA混合物的扩展期使用Simon二阶段设计，并且招募大约156名患有晚期黑色素瘤、CSCC或HNSCC的参与者进入四个队列。在Simon二阶段设计的第1阶段结束时，对每个队列进行期中分析(队列A的26名患者，队列B的14名患者，队列C的10名患者，队列D的26名患者)。所有队列(A、B、C和D)的招募并行进行。
干预组和持续时间：参与者的研究的持续时间包括长达28天的筛选期。成功通过筛选后，参与者可以接受研究干预，直到疾病进展、不可接受的AE、参与者决定停止治疗为止，或者如果没有发生疾病进展，则持续最长1年。对于那些显然继续以安全的方式与合理的毒性继续获得临床益处的参与者，研究委员会将逐个病例地考虑1年后继续使用作为单一药物以及与西米单抗组合的细胞介素RNA混合物。在中止研究干预后，参与者在上一次IMP施用后大约30天或在参与者接受另一种抗癌疗法之前(以较早者为准)返回研究中心进行治疗结束评估。如果参与者由于进展以外的其他原因而中止研究干预，则每3个月进行一次随访，直至疾病进展、开始另一种抗癌治疗或死亡(以最先发生者为准)。
受益于该细胞介素RNA混合物和/或西米单抗的参与者的预期治疗持续时间可能会根据进展日期而有所不同；但每位参与者的预期研究持续时间中位数估计为9个月(筛选1个月、治疗5个月、治疗结束后随访3个月)，组合疗法中为12个月(筛选1个月、治疗8个月、治疗结束随访3个月)。
在单一疗法中，以4周的周期每周一次瘤内施用该细胞介素RNA混合物(即，每28天四剂)。在组合疗法中，每周一次瘤内施用该细胞介素RNA混合物，并在3周的周期的第1天静脉内施用西米单抗(即，每21天三剂该细胞介素RNA混合物和一剂西米单抗)。瘤内注射应每周一次继续，直到进行第二次肿瘤评估，此时可考虑将该细胞介素RNA混合物的剂量间隔改为每月两次或一次(在单一疗法中)或每三周一次(在组合疗法中)；还可以根据可获得的数据考虑该细胞介素RNA混合物施用的更灵活的剂量间隔。
在单一疗法和组合疗法的递增期中基于毒性升至更高的剂量水平；也可以考虑中间剂量。在单一疗法中，一旦在宣布为安全的剂量水平观察到早期疗效讯号，则可以进行扩展以确认疗效。
在整个研究过程中可能会出现剂量遗漏或剂量延迟；剂量限制性毒性(DLT)的出现决定了对所述修饰的需求。经历DLT的参与者将停止治疗(在单一疗法或组合疗法中)，并接受随访，直至消退至≤1级或基线状态。如果在DLT观察期内观察到DLT，则将确定地中止研究干预。如果AE符合DLT标准并且发生在DLT观察期之后，则将逐个病例进行受益-风险评估，以决定是否继续疗法。从不超过两周的细胞介素RNA混合物的剂量遗漏(即，2次剂量遗漏)恢复后，该参与者可以以相同或更低剂量水平以新的治疗周期重新开始疗法；此类以更低的剂量水平重新给药的参与者不允许再次剂量递增。如果参与者经历相同的AE导致2周内第二次剂量遗漏(即，2次剂量遗漏)，则该参与者可能会永久中止研究治疗。接受西米单抗治疗的参与者在整个研究治疗期间均保持分配的剂量(350mg Q3W)，如果不认为系出于安全性概况考虑的强制性要求，则不允许对西米单抗进行剂量修改；但是，如果出于毒性考虑而需要，可以允许延迟治疗周期或西米单抗剂量遗漏。如果参与者发生西米单抗输注相关的过敏性药物反应，导致西米单抗治疗终止，则该参与者可以继续以指定的剂量水平接受作为单一疗法的细胞介素RNA混合物治疗。
研究药品：细胞介素RNA混合物
·施用路径：瘤内注射
·剂量方案：每周一次以指定的剂量水平施用细胞介素RNA混合物，在28天的周期内进行4次注射。
研究药品：西米单抗
·配制物：西米单抗药物产品以浓缩溶液(50mg/mL)呈现，该浓缩溶液含有10mM组胺酸、5％(重量/体积)蔗糖、1.5％(重量/体积)L-脯胺酸和0.2％(重量/体积)聚山梨酯80，pH为6.0，并且装在10mL一次性使用小瓶中，填充至两种不同的可抽取量之一中：
-5.0mL可抽取(相当于250mg/小瓶)
-7.0mL可抽取(相当于350mg/小瓶)
·施用路径：静脉输注的解决方案。
·剂量方案：Q3W，每次施用在30分钟内静脉输注350mg。
对于组合队列，西米单抗以350mg Q3W的固定推荐剂量静脉内施用，随后每周一次瘤内施用该细胞介素RNA混合物。在同时用西米单抗和该细胞介素RNA混合物治疗的天数中，先施用西米单抗，随后再施用该细胞介素RNA混合物(同一天)。
非研究药品：没有施用预定义的前驱用药。
试验后获得用药的机会：本研究招募的所有参与者均接受治疗1年或直至疾病进展，以二者最早的为准。
统计考虑：单一疗法和组合疗法的数据将分别进行分析。在剂量扩展期间对组合疗法中的每个队列进行单独的分析。
a.主要分析：
剂量递增(单一疗法和组合疗法)：在剂量递增期，按剂量水平总结DLT。DLT的详细信息由参与者提供。使用剂量水平的描述性统计数据总结治疗期间的治疗中出现的AE/SAE和实验室异常。
剂量扩展(单一疗法和组合疗法)：根据RECIST 1.1的客观反应率(ORR)用描述性统计进行了总结。使用Clopper-Pearson方法计算90％的双向置信区间。统计推断基于样本量计算部分中定义的假设和α水平。
b.次要终点分析：
剂量递增(单一疗法和组合疗法)：在评估PK的周期中，用描述性统计总结了由该细胞介素RNA混合物编码的所述细胞介素的和西米单抗的浓度和PK参数。描述性地总结了针对由该细胞介素RNA混合物编码的所述细胞介素的抗药物抗体(ADA)和针对西米单抗的ADA。
剂量扩展(单一疗法和组合疗法)：使用描述性统计总结了治疗期间的治疗中出现的AE/SAE和实验室异常。使用Kaplan-Meier方法总结了根据RECIST 1.1和iRECIST的DoR和PFS。针对根据RECIST 1.1和iRECIST的DCR，以及根据iRECIST的ORR，提供了与根据RECIST1.1的ORR类似的分析。在评估PK的周期中，用描述性统计总结了由该细胞介素混合物编码的所述细胞介素和西米单抗的PK浓度和参数。描述性地总结了针对由细胞介素RNA混合物编码的细胞介素的ADA和针对西米单抗的ADA。
图1A显示了治疗的总体设计图示(上图：单一疗法；下图：组合疗法)，图1B和1C分别示出了用于单一疗法和用于组合疗法的治疗计划的图示。
单一疗法中的剂量递增期旨在确定作为单一疗法每周施用的该细胞介素RNA混合物的MTD或MAD。(图1A，「a」)。每周施用一次的固定剂量的MTD/MAD在扩展期进行进一步测试。抗PD-1或抗PD-L1失败后的IIIB-C期或IV期黑色素瘤符合条件。如果在前16名接受治疗的参与者中至少观察到两例反应，则纳入的参与者的数量为最多34名参与者。(图1A，「b」)。在加速递增期中，对每个队列的一名参与者评估在周期1中观察到的毒性的发生。(图1A，「c」)。在加速递增DL中的任何一个发生相关的≥2级的AE或DLT(DL1或2，以最先发生者为准)之后，或从DL3开始，将通过对每个队列至少3名参与者的评价来启动有超剂量控制的贝叶斯递增。(图1A，「d」)。当剂量递增期结束时，基于安全性确定在递增期评价的MTD/MAD。(图1A，「e」)。
组合疗法中的剂量递增期旨在确定与每三周一次静脉内施用的西米单抗组合每周施用一次细胞介素RNA混合物的MTD或MAD。一旦已证明单一疗法的一个剂量水平安全且可耐受(基于28天的DLT观察期)；一旦显示PK、PDy和/或临床反应(全身和/或局部)的体征，则在进行中的单一疗法剂量递增期间，开始与西米单抗组合的细胞介素RNA混合物的剂量递增。在开始组合递增期之后，组合探索的DL与单一疗法相同。如果该中心同时参与了两个剂量递增期(即，研究的单一疗法和组合疗法部分中的剂量递增)，则优先考虑本研究单一疗法部分中的剂量递增期。(图1A，「f」)。在组合研究部分的扩展期，一旦达到MTD，就会启动以下队列。队列A：抗PD-1/PD-L1失败后的黑色素瘤，队列B：未接受过抗PD-1/PD L1的黑色素瘤，队列C：未接受过抗PD-1/PD L1的CSCC，队列D：未接受过抗PD-1/PD L1的HNSCC。(图1A，「g」)。
表2和3示出了单一疗法的活动时间表(SOA)，表2示出了治疗流程图，表3示出了剂量递增和扩展期的PK和PDy流程图。表4和表5示出了组合疗法的活动时间表(SOA)，表4示出了治疗流程图，表5示出了剂量递增和扩展期的PK和PDy流程图。
Figure BDA0003173652780001161
Figure BDA0003173652780001171
Figure BDA0003173652780001181
Figure BDA0003173652780001191
Figure BDA0003173652780001201
小时检查一次生命体征，同时对参与者进行监测以评估急性毒性。
g体格检查包括：检查主要的身体系统，包括心血管系统、消化系统、中枢神经系统、呼吸系统和造血系统(肝肿大、脾肿大、淋巴结病)和皮肤。只有在首次IMP施用时仍存在的体征和症状才在eCRF中报告为AE。
h假设在DL3之后预期会发生中等程度的药理作用(例如，注入细胞介素RNA混合物的肿瘤病变部位发红、浮肿或变平)，则彩色数码照片必须从单一递增的DL4开始，从组合递增中的第一个DL和扩展期期间开始。在细胞介素RNA混合物的首个剂量之前进行筛选时，以及在从表层和/或可见皮下注射病变进行放射线照相肿瘤评估时，必须拍摄数码照片，以记录总体疾病状况并记录反应。另外，必须在筛选和肿瘤评估窗口之间拍摄临时彩色数码照片，以捕获其他细胞介素RNA混合物可能诱导的变化，例如皮肤发红和/或浮肿。根据研究参考手册，临床中心收集的所有数据必须与申办方系统地共享，以供审查。
i对有生育潜力的女性进行血清妊娠检测。基线评估可以接受七天的窗口。
j血液学：血红蛋白、血细胞比容、白血球分类计数(包括绝对中性粒细胞计数[ANC])、血小板计数。所述测试系在每次IMP施用之前进行的(可接受-1天的窗口)。如果系4级中性粒细胞减少症，则每2-3天评估一次ANC，直到ANC≥0.5x109/L，然后每周一次直至恢复。如果基线异常，则在IMP施用后2天内进行周期1第1天评估。
k凝血：活化部分凝血活酶时间(aPTT)、PT、国际标准化比值(INR)、纤维蛋白原(以及筛选时D-二聚体)。如果基线异常，则在IMP施用后2天内进行周期1第1天评估。
l血清化学：肝功能检查：AST、ALT、总胆红素、直接胆红素、碱性磷酸酶(ALP)。肾功能检查：尿素或BUN和肌酐，以及在需要时确定估计的CrCL(如果肌酐在1.0至1.5 x ULN之间)。电解质：钠、钾、总钙、磷、氯、镁和碳酸氢盐。其他：葡萄糖、乳酸脱氢酶(LDH)、白蛋白、总蛋白和淀粉酶。除非临床指示外，否则在IMP施用之前(可接受-1天的窗口)进行肝功能检查、肾功能检查、电解质、葡萄糖、LDH、白蛋白和总蛋白。在肝功能检查≥3级异常时，每2-3天重复进行附加的检查，直至恢复到基线值。如果基线异常，则在IMP施用后2天内进行周期1第1天血清化学评估。
m在指定的时间点并在发生CRS≥2级症状时，收集血清C反应蛋白(CRP)、铁蛋白和次级血浆细胞介素(包括白介素-6和干扰素-α)。在周期1(第1-4周每周)和周期3第1周的每次研究干预之前(D1)和24小时(D2)收集血清CRP和铁蛋白样本。在其他研究干预日，仅收集给药前的样本；只要出现CRS≥2级症状，就应抽取附加的样本。次级血浆细胞介素的常规采样仅在周期1和3以及EOT时进行。收集样本：在给药前和在周期1第1周和第2周以及周期3第1周该细胞介素RNA混合物施用后6小时和24小时；EOT时；以及当出现≥2级的CRS症状时。
n 12导联ECG：在周期1第1天、周期3第1天、周期7第1天和EOT进行筛选和预处理时以及当临床指示时。
o骨髓抽吸：仅用于淋巴瘤患者。
p FDG-PET-CT/CT：FDG PET仅适用于根据卢加诺分类的淋巴瘤患者，应在IMP施用后28天内(-7天)并且大约每12周(±7天)进行一次，以确认CR和PD，以及根据临床指示进行。
q尿液分析：在基线时以及每次IMP施用之前和EOT时，通过量油计在早上进行的量油计(定性)测试。在基线、不均匀的周期、治疗结束时以及在量油计测试(定性)中出现异常的情况下，对晨尿中的白血球和红血球进行定量尿液分析。在蛋白尿≥++(量油计)时，通过蛋白尿/24小时尿液收集进行蛋白尿定量。
r尿液生物标志物：在周期1第1天(可接受的前7天内)给药前、首次IMP施用后24小时、首次IMP施用后第8天给药前评估肾脏损伤分子1(KIM-1)、尿微量白蛋白和尿肌酐(点尿中)。
s包括席尔梅尔氏试验在内的眼科检查在基线时以及在疗法期间出现眼部症状时进行。在每个周期的第1天评估眼部和视觉症状。
t不良事件评估：收集不良事件的观察期从知情同意书(ICF)的签字开始，一直到研究药物最后一次施用后的30天为止。如方案中该评估和报告严重不良事件。EOT访视后，将对正在进行的SAE和AESI、相关AE和新的相关AE进行随访，直至稳定、恢复或开始进一步疗法。
u伴随用药评估：从研究药物初始剂量之前的14天到最后一次研究药物施用后30天，正在进行的研究药物相关不良事件消退或接受另一种抗癌疗法时记录伴随用药。
v研究药物施用：参与者可以接受本申请指定的一种或多种前驱用药。在周期1和第1天的每个新剂量水平，都要在医院中对参与者进行至少24小时的监测，以评估急性毒性。在后续的施用中，参与者接受4-6小时的观察，研究者可自行决定是否选择住院至24小时。可以在周期1期间的+/-1天的窗口和从周期2开始+/-3天的窗口施用细胞介素RNA混合物。
w肿瘤评估：在基线时(IMP施用28天+/-7天内)、IMP施用后每8周(-/+7天)直到第24周、然后每12周(-/+7天)以及研究干预结束时进行CT扫描或磁共振成像(MRI)以及临床上指示的任何其他检查，以评估疾病状态，除非已在上一个周期完成。每12周对没有疾病进展而中止研究干预的患者进行一次随访，直到有记录的疾病进展为止。重复进行肿瘤评估以确认部分或完全反应以及疾病进展(最初记录的反应后至少4周)。对于没有内脏/深度淋巴结病变的参与者，如果没有疾病转移的临床体征，则在24周时进行腹部和胸部的放射肿瘤评估；如果在上一个周期尚未进行过，则在EOT时进行。在出现临床体征或实验室异常时，可以考虑进行间歇性超音波检查(USG)或临床上指示的评估，主要是肝功能检查，以排除潜在的疾病转移。
x治疗结束(上一次治疗后30±5天)：如果在研究的最后一周未进行评估，则获取治疗结束评估。
y对疾病状况的研究后随访：对在治疗访视结束时无疾病进展记录且尚未开始使用另一种抗癌疗法治疗的参与者进行3个月的随访，直到开始另一种抗癌疗法、疾病进展、死亡或研究截止日期(以最先发生者为准)。
Figure BDA0003173652780001241
Figure BDA0003173652780001251
Figure BDA0003173652780001261
Figure BDA0003173652780001271
d仅在周期3第1周中，针对免疫评估和循环因子，重复周期1第1周的采样时间表。在周期3之后，PDy采样将在每个奇数周期的第1周的第0和第6小时进行。在本研究的单一疗法期间，在偶数周期内没有采集用于PDy细胞介素的血样。
e将用于遗传分析的血液用于建立种系DNA序列和HLA分型。
f在周期1第1周给药前、周期2第2周(即，周期1给药后5周)给药前和EOT时收集血样(白血球去除或80mL血液)，以分析抗原特异性T细胞。仅对单一疗法递增期的黑色素瘤参与者和单一疗法扩展期的所有参与者(黑色素瘤)进行此分析。
g用于免疫评估的肿瘤生检：在筛选期间(周期1第1天IMP施用之前)，第5周和第8周之间，第6周或疾病进展时(以最先发生者为准)收集生检样本，以评估免疫调节。肿瘤转录组学(RNA定序)、基因组学、新抗原和TIL分离(仅在黑色素瘤患者中扩展)也可以根据可获得的样本进行(参见本申请)。仅对于黑色素瘤患者，在第5-8周之间进行的单一肿瘤核心生检专用于TIL的分离。这仅适用于有限数量的所选黑色素瘤患者(针对成功分离TIL的不超过10名患者)(单一疗法的扩展，并且仅在组合疗法扩展的队列A中)。这将不是附加的生检，而是将专用于基因组评估的样本用于TIL的分离(在特殊条件下处理-未福尔马林固定)。这类样本和测试应用于治疗研究者所确定的对治疗有临床反应体征(肿瘤缩小和/或肿瘤部位发红)的患者。
h在周期1、3、6、9、12的第1天给药前和/或EOT以及FU时(上一次IMP施用后第90天)收集血浆样本，以监测针对该细胞介素RNA混合物编码的细胞介素的抗体的产生。如果参与者继续进行研究的随访，则超出所述时间点的其他收集将每3个月进行一次。在第二个研究截止日期后未收集ADA样本(参见本申请)。
Figure BDA0003173652780001291
Figure BDA0003173652780001301
Figure BDA0003173652780001311
Figure BDA0003173652780001321
Figure BDA0003173652780001331
c人口统计学：包括年龄、性别和种族。医疗/手术史：包括先前病理和手术的相关历史记录。疾病史：包括诊断时和研究开始时的阶段，以及先前的抗肿瘤疗法(类型、持续时间、中止原因和对该疗法的反应)。另外，取决于肿瘤类型的特定的突变。
d在每个周期的第一天的治疗之前测量体重。
e身高仅在基线期间测量。
f生命体征包括：温度、血压、心率、呼吸频率。另外，在研究的组合疗法部分中，评估参与者的基线脉搏血氧测定。在C1D1期间，每住院24小时期间，每个新剂量水平下每6小时检查一次生命体征，同时对参与者进行监测以评估急性毒性。24小时住院期间无需进行脉搏血氧测定。
g体格检查包括：检查主要的身体系统，包括心血管系统、消化系统、中枢神经系统、呼吸系统、造血系统(肝肿大、脾肿大、淋巴结病)和皮肤。只有在首次IMP施用时仍存在的体征和症状才在eCRF中报告为AE。
h假设在DL3之后预期会发生中等程度的药理作用(例如，注入细胞介素RNA混合物的肿瘤病变部位发红、浮肿或变平)，则彩色数码照片必须从单一递增的DL4开始，从组合递增中的第一个DL和扩展期期间开始。在细胞介素RNA混合物的首个剂量之前进行筛选时，以及在从表层和/或可见皮下注射病变进行放射线照相肿瘤评估时，必须拍摄数码照片，以记录总体疾病状况并记录反应。另外，在筛选和肿瘤评估窗口之间拍摄临时彩色数码照片，以捕获其他细胞介素RNA混合物可能诱导的变化，例如皮肤发红和/或浮肿。根据研究参考手册，临床中心收集的所有数据与申办方系统地共享，以供审查。
i对有生育潜力的女性进行血清妊娠检测。基线评估可以接受七天的窗口。
j血液学：血红蛋白、血细胞比容、白血球分类计数(包括绝对中性粒细胞计数[ANC])、血小板计数。所述测试系在每次IMP施用之前进行的(可接受-1天的窗口)。如果系4级中性粒细胞减少症，则每2-3天评估一次ANC，直到ANC≥0.5x109/L，然后每周一次直至恢复。如果基线异常，则在IMP施用后2天内进行周期1第1天评估。
k凝血(可接受-1天的窗口)：活化部分凝血活酶时间(aPTT)、PT、国际标准化比值(INR)、纤维蛋白原(以及筛选时D-二聚体)。如果基线异常，则在IMP施用后2天内进行周期1第1天评估。
l血清化学(可接受-1天的窗口)：肝功能检查：AST、ALT、总胆红素、直接胆红素、碱性磷酸酶(ALP)。肾功能检查：尿素或BUN和肌酐，以及在需要时确定估计的CrCL(如果肌酐在1.0至1.5 x ULN之间)。电解质：钠、钾、总钙、磷、氯、镁、碳酸氢盐和尿酸。其他：葡萄糖、乳酸脱氢酶(LDH)、白蛋白、总蛋白和淀粉酶。除非临床指示外，否则在IMP施用之前(可接受-1天的窗口)进行肝功能检查、肾功能检查、电解质、葡萄糖、LDH、白蛋白和总蛋白。在肝功能检查≥3级异常时，每2-3天重复进行附加的检查，直至恢复到基线值。如果基线异常，则在IMP施用后2天内进行周期1第1天血清化学评估。
m评估西米单抗施用时的促甲状腺激素(TSH)、游离甲状腺素(游离T4)抗核抗体(ANA)和类风湿因子(RF)的安全性。
n仅在研究的组合疗法部分中评估参与者基线时的肿瘤突变负荷(TMB)。
o血清C反应蛋白(CRP)、铁蛋白和次级血浆细胞介素(包括白介素-6和干扰素-γ；参见本申请)在指定的时间点以及发生≥2级的CRS症状时收集。在周期1(第1-3周每周)和周期3第1周的每次研究干预之前(D1)和24小时(D2)收集血清CRP和铁蛋白样本。在其他研究干预日，仅收集给药前的样本；只要出现CRS≥2级症状，就抽取附加的样本。次级血浆细胞介素的常规采样仅在周期1和3以及EOT时进行。收集样本：在给药前和在周期1第1周和第2周以及周期3第1周该细胞介素RNA混合物施用后6小时和24小时；EOT时；以及当出现≥2级的CRS症状时。
p 12导联ECG：在周期1第1天、周期3第1天、周期7第1天和EOT进行筛选和预处理时以及当临床指示时。超音波心动图或MUGA扫描仅在筛选时进行。
q基线时对先前用博来霉素治疗过的淋巴瘤参与者进行肺一氧化碳弥散量(DLCO)测定。
r骨髓抽吸：仅用于淋巴瘤患者
s FDG-PET-CT/CT：FDG PET仅适用于根据卢加诺分类的淋巴瘤患者，应在IMP施用后28天内(-7天)并且大约每12周(±7天)进行一次，以确认CR和PD，以及根据临床指示进行。
t尿液分析：在基线时以及每次IMP施用之前和EOT时，通过量油计在早上进行的量油计(定性)测试。在基线、不均匀的周期、治疗结束时以及在量油计测试(定性)中出现异常的情况下，对晨尿中的白血球和红血球进行定量尿液分析。在蛋白尿≥++(量油计)时，通过蛋白尿/24小时尿液收集进行蛋白尿定量。
u尿液生物标志物：在周期1第1天(可接受的前7天内)给药前、首次IMP施用后24小时、首次IMP施用后第8天给药前评估肾脏损伤分子1(KIM-1)、尿微量白蛋白和尿肌酐(点尿中)。
v包括席尔梅尔氏试验在内的眼科检查在基线时以及在疗法期间出现眼部症状时进行。在每个周期的第1天评估眼部和视觉症状。
w不良事件评估：收集不良事件的观察期从知情同意书(ICF)的签字开始，一直到研究药物最后一次施用后的30天为止。如方案中该评估和报告严重不良事件。EOT访视后，将对正在进行的SAE和AESI、相关AE和新的相关AE进行随访，直至稳定、恢复或开始进一步疗法。在用该细胞介素RNA混合物+西米单抗治疗结束(EOT)后，尚未进入另一种IMP的后续临床试验或已接受任何其他护理标准的试验参与者每2周通过以下研究程序进行一次连续的肾脏损害监测：在定性量油计测试出现异常时进行肾功能检查[尿素或BUN和肌酐，并在必要时确定估计的Cr CL(如果肌酐在1.0至1.5 x ULN之间)]，尿液分析(晨尿中白血球和红血球的定量尿液分析)。在蛋白尿≥++(量油计)时，通过蛋白尿/24小时尿液收集进行蛋白尿定量，并在首次IMP施用后的第8天给药前测试之后进行尿液生物标志物(肾损伤分子1(KIM-1)，尿白蛋白与肌酐比值)测试。
x伴随用药评估：从研究药物初始剂量之前的14天到最后一次研究药物施用后30天，正在进行的研究药物相关不良事件消退或接受另一种抗癌疗法时记录伴随用药。
y细胞介素RNA混合物的施用：参与者可以接受研究方案中指定的前驱用药。在周期1和第1天的每个新剂量水平，都要在医院中对参与者进行至少24小时的监测，以评估急性毒性。在后续的施用中，参与者接受4-6小时的观察，研究者可自行决定是否选择住院至24小时。在联合施用的天数中，在完成西米单抗施用后，施用该细胞介素RNA混合物。该细胞介素RNA混合物可在周期1的±1天的窗口以及从周期2开始的±3天的窗口施用。
z在研究的组合疗法部分中，在3周周期中，西米单抗与该细胞介素RNA混合物组合给药。如脚注y所述，西米单抗应在该细胞介素RNA混合物之前施用。
aa肿瘤评估：进行CT扫描或磁共振成像(MRI)以及临床上指示的任何其他检查，以评估基线时的疾病状态(在IMP施用28天-7天内)、IMP施用后每9周(±7天)直到第24周、然后每12周(±7天)以及研究干预结束时进行CT扫描或磁共振成像(MRI)以及临床上指示的任何其他检查，以评估疾病状态，除非已在上一个周期完成。每12周对没有疾病进展而中止研究干预的患者进行一次随访，直到有记录的疾病进展为止。重复进行肿瘤评估以确认部分或完全反应以及疾病进展(最初记录的反应后至少4周)。对于没有内脏/深度淋巴结病变的参与者，如果没有疾病转移的临床体征，则在24周时进行腹部和胸部的放射肿瘤评估；如果在上一个周期尚未进行过，则在EOT时进行。在出现临床体征或实验室异常时，可以考虑进行间歇性超音波检查(USG)或临床上指示的评估，主要是肝功能检查，以排除潜在的疾病转移。
bb治疗结束(上一次治疗后30±5天)：如果在研究的最后一周未进行评估，则获取治疗结束评估。
cc对疾病状况的研究后随访：对在治疗访视结束时无疾病进展记录且尚未开始用另一种抗癌疗法治疗的参与者进行3个月的随访，直到开始另一种抗癌疗法、疾病进展、死亡或研究截止日期(以最先发生者为准)。
Figure BDA0003173652780001401
Figure BDA0003173652780001411
Figure BDA0003173652780001421
Figure BDA0003173652780001431
Figure BDA0003173652780001441
Figure BDA0003173652780001451
a该细胞介素RNA混合物以3周周期每周施用一次。在研究的组合疗法部分中，在3周周期中，西米单抗与细胞介素RNA混合物组合施用(即，西米单抗的施用天数为周期1第1天、周期2第1天及后续)。在联合施用的天数中，首先要静脉内施用西米单抗，随后是瘤内施用该细胞介素RNA混合物。
b对于细胞介素RNA混合物PK，在组合疗法递增期，所有参与者均进行密集采样。在扩展期队列A、B、C和D中，每个队列的仅前10名参与者进行了密集采样(参见本申请)(扩展期的其余参与者进行了稀疏采样)。在周期3之后，PK采样将在每个奇数周期的第1周的第0和第6小时进行；并且在第一次施用后的第5周到第8周之间，以及在周期6，在肿瘤生检之前进行PK采样。在其他周期内没有进行采样。在EOT和首次随访时也要收集样本。更多信息在研究实验室手册中详细描述。在第二个研究截止日期之后未收集PK样本。
c对于细胞介素RNA混合物PK，只有在组合疗法扩展期队列A、B、C和D中跟随前10名参与者之后的参与者才进行稀疏采样。在周期3之后，PK采样将在每个奇数周期的第1周的第0和第6小时进行；并且在第一次施用后的第5周到第8周之间，以及在周期6，在肿瘤生检之前进行PK采样。在其他周期内没有进行采样。在EOT和首次随访时也要收集样本。在第二个研究截止日期之后未收集PK样本。
d如果参与者在密集采样PK子集中，则遵循密集采样的时间表；如果参与者不是密集采样子集的一部分，则遵循稀疏采样的时间表。在周期1第1周、周期2第1周以及所有后续的奇数周期中测量组合疗法研究部分中的西米单抗的PK。在周期3中，仅在SOI和EOI时收集用于西米单抗的血液。对于所有SOI样本，严格在开始西米单抗输注之前(15分钟之内)收集西米单抗的PK样本。对于所有EOI样本，应在西米单抗实际输注结束之前(5分钟之内)收集用于西米单抗的血液。
e在患者在周期1结束时退出研究的情况下，即使未施用第二次西米单抗输注，也收集周期2第1天输注前血液用于西米单抗样本(0H)。
f用于免疫评估和循环因子的血样：在给药前、周期1第1周和第2周的第6和24小时，EOT和FU时在所有参与者中收集血样，以评估全身免疫调节，包括IFNγ和IP10。更多信息在研究实验室手册中详细描述。
g仅在周期3第1周中，针对免疫评估和循环因子，重复周期1第1周的采样时间表。在周期3之后，PDy采样将在每个奇数周期的第1周的第0和第6小时进行。在周期2或任何偶数周期中未收集用于PDy细胞介素样本的血液。
h将用于遗传分析的血液用于建立种系DNA序列和HLA分型。
i用于免疫评估的肿瘤生检：在筛选期间(周期1第1天IMP施用之前)，第5周和第8周之间，第6周或疾病进展时(以最先发生者为准)收集配对肿瘤生检样本，以评估免疫调节。肿瘤转录组学(RNA定序)、基因组学、新抗原和TIL分离也可以根据可获得的样本进行。仅对于黑色素瘤患者，在第5-8周之间进行的单一肿瘤核心生检专用于TIL分离。这仅适用于有限数量的所选黑色素瘤患者(针对成功分离TIL的不超过10名患者)。这不是附加的生检，而是将专用于基因组评估的样本用于TIL的分离(在特殊条件下处理-未福尔马林固定)。这类样本和测试应用于治疗研究者所确定的对治疗有临床反应体征(肿瘤缩小和/或肿瘤部位发红)的患者。对所有参与者进行强制性肿瘤生检，取决于肿瘤可获得性和医疗可行性。研究手册中提供了更多信息。
j仅在扩展期周期1第1周给药前、周期2第3周给药前、周期1第1周施用后5周和EOT时，在队列A(PD-1/PD-L1难治性黑色素瘤)中收集血样(白血球去除或80mL血液)，用于分析抗原特异性T细胞。
k用于RNAseq的血液采样：使用外周血提取RNA进行测试。
l在周期1、5、9、13、17的输注前和/或EOT以及上一次IMP施用后第90天收集样本，以监测针对该细胞介素RNA混合物编码的细胞介素的ADA的产生。如果参与者继续进行研究的随访，则超出所述时间点的其他收集将每3个月进行一次。在第二个研究截止日期后未收集ADA样本(参见本申请)。
m在周期1(基线)的输注前和周期5、9、13、17、EOT和FU的输注前收集用于监测西米单抗抗体产生的样本。ADA样本已存储，研究结束时可以进行分析。如果参与者中发生免疫相关不良事件、需要立即治疗的超敏反应、和/或过敏症，则在可能的情况下，于事件发生或接近事件发生时和结束时收集血样，以分析血清中的功能性西米单抗浓度和进行西米单抗的ADA评估。
表6示出了治疗的目标和终点。
[表6]：目标和终点
Figure BDA0003173652780001491
Figure BDA0003173652780001501
Figure BDA0003173652780001511
Figure BDA0003173652780001521
实施例1.2-递增期和扩展期中细胞介素RNA混合物的剂量递增和剂量扩展
基于临床、药物动力学[PK]、药效动力学[PDy]和生物标志物评价，在递增期的晚期实体瘤患者和扩张阶段的晚期黑色素瘤患者中进行该细胞介素RNA混合物的剂量递增和剂量扩展研究，以评估作为单一疗法和与西米单抗组合瘤内施用时细胞介素RNA混合物的安全性和初步活性，并确定作为单一药剂和与西米单抗组合时的最佳药物剂量。
在参与者接受其第一剂的细胞介素RNA混合物之前，进行长达28天的筛选，并且在4周周期的第1、8、15和22天，以及在3周周期中每周一次与西米单抗组合(西米单抗每3周施用一次)，按瘤内药物施用的时间表进行评价。在单一疗法和组合中，治疗一直继续到疾病进展或导致永久中止的AE，否则，将继续至1年的治疗(单一疗法为13个周期，组合疗法为17个周期)。在组合疗法递增和扩展期，西米单抗以350mg Q3W固定推荐剂量静脉内施用，与以预定义剂量每周一次瘤内施用的细胞介素RNA混合物组合。在组合疗法中，该细胞介素RNA混合物将在西米单抗输注结束时施用。在单一疗法递增期，在递增期使用前两个剂量水平(DL)的单参与者剂量递增，随后使用合理设计将其递增到更高剂量。
实施例1.2A.剂量递增期
在单一疗法和与西米单抗组合的剂量递增过程中，招募了适于瘤内注射的晚期实体瘤参与者，该参与者先前基于抗PD-1/PD-L1的疗法失败。根据研究者的判断，对于抗PD-1/PD-L1疗法不作为常规使用的实体瘤(黑色素瘤除外)如果没有其他合适的治疗选择的参与者也符合条件。参与者通过每周瘤内注射作为单一疗法或与西米单抗组合施用的细胞介素RNA混合物进行治疗。
在单一疗法中，起始剂量水平(DL1)系根据各种临床前研究之结果以及使用建模和模拟从小鼠到人的异速生长成比例缩放确定的，该临床前研究检查人类异种移植模型中由该细胞介素RNA混合物编码的细胞介素的PK。
实验包括针对前两个DL(DL1和DL2)的加速剂量递增设计，其中一名参与者接受DL治疗，并应用两个剂量水平之间的递增，直到观察到任何与IMP相关的≥2级AE或剂量限制性毒性(DLT)。如果在前两个DL的任何一个观察到与IMP相关的≥2级AE，则以相同的DL治疗另外两名参与者，并且采用适应性合理设计开始进行剂量递增。如果在前两个DL中没有发生与IMP相关的≥2级AE或DLT，则从DL3开始适应性剂量递增。进行后续队列(DL3-DL8)的剂量递增。在至少三名接受前一次DL治疗的参与者进行了至少1个周期(即，28天)的随访之后，在没有DLT的情况下，才能招募入下一个DL，并且可以针对DLT评估进行评价。不允许参与者内剂量递增。
一旦在宣布为安全的DL观察到早期疗效讯号，则可以进一步扩展以确认疗效。剂量递增与较低水平的剂量扩展并行进行。
在组合疗法中，该细胞介素混合物与西米单抗的剂量递增与正在进行的单药剂量递增并行开始，前提系与西米单抗组合的细胞介素混合物的预期起始剂量已进行DLT评价，并且在细胞介素混合物单一疗法中的DLT观察期后清除。当细胞介素混合物单一疗法的DL被清除(单一疗法的DLT观察期[28天]已完成)，并且观察到单一疗法的PK、PDy和/或临床反应(全身或局部)的体征时，选择与西米单抗组合的细胞介素混合物的起始剂量。
与西米单抗组合的细胞介素混合物的起始剂量比单一疗法中施用的该细胞介素混合物的MTD或最大施用剂量(MAD)低1剂量，或为单一疗法中清除DL。通过根据RECIST 1.1评价抗肿瘤反应信息，通过测量在单一疗法中瘤内施用的该细胞介素混合物的客观反应率来评估全身临床反应。通过RECIST 1.1标准测量局部临床反应，以及局部反应的其他体征，包括病变变平和炎症体征。将该细胞介素混合物与西米单抗组合以350mg Q3W的固定推荐剂量静脉内施用。
与西米单抗组合的剂量递增以适应性剂量递增进行。在单一疗法中首先清除该剂量，之后在组合疗法中以相同的DL招募。
与西米单抗组合的剂量递增以适应性剂量递增进行。在单一疗法中首先清除该剂量，之后在组合疗法中以相同的DL招募。在至少三名接受前一次DL治疗的参与者进行了组合中至少28天的随访之后，在没有DLT的情况下，方可招募入下一个DL，并且可以针对DLT评估进行评价。与西米单抗组合的细胞介素混合物的剂量递增中的实际样本量可能因观察到的DLT和实际探索的剂量水平的数量而异(大约18至36名可评价DLT的参与者)。
在相同剂量水平下治疗的第一名和第二名参与者之间至少有一个星期的间隔。
实施例1.2B.待注射的病变
所有剂量水平(DL1-DL8)均遵循表5中提供的关于病变大小的指导。根据实体瘤反应评价标准(RECIST 1.1)标准，参与者将最少一个可测量的病变作为靶标病变(参见纳入标准I 05)，以及将最少一个或多个皮肤/皮下病变用于注射和肿瘤生检。根据肿瘤病变的大小选择参与者，肿瘤的大小必须足以达到给定剂量水平的注射量(表5)，并考虑在基线以及第一次病变的第5周至第8周之间对一个病变进行生检作为治疗评估。
仅在递增期，如果非靶标病变允许反应评估的讯号，则在与研究委员会达成协议的情况下，可以逐个病例对没有可测量病变的参与者进行评价。仅在用细胞介素RNA混合物时没有观察到浅表、皮下和/或淋巴结转移的明显炎症的剂量水平下招募仅有粘膜部位用于注射的患者，以最小化气道阻塞的风险。
实施例1.2C.治疗
对于第一种治疗，在3个最小病变中，一个可测量的病变(皮肤、内脏或淋巴结)完好无损，以根据RECIST 1.1标准进行测量，并将一个病变用于生检。如果要注射的病变足够大以用于生检，而对计划剂量水平的剂量施用没有影响，则两个病变就足以符合条件。最少要对一个病变(应根据参与者的条件符合性来评估每种剂量水平的一个或多个病变的大小)施用该细胞介素RNA混合物。首先用该细胞介素RNA混合物注射最大的一个或多个病变。对于剩余的一个或多个病变，注射顺序取决于病变的大小，直到使用最大注射量为止(参见下表7)。
[表7]-注射量
Figure BDA0003173652780001551
对于所有后续治疗(每周一次)，将根据病变的大小对病变的注射进行排序，直到使用最大注射量或所有可注射的病变均得到治疗为止。
要注射的量取决于病变的大小，每次治疗访视的最大注射量不应超过为所有合并的注射病变分配给该DL的量。DL8允许的最大注射量为4mL。
如果病变聚集在一起，则根据上述表和指南将它们作为单一病变注射。
根据表5中量和病变大小的比例，每次治疗较佳的是只注射一个病变。如果不可能仅注射一个病变，则将量/剂量分为多个病变。每次访视时，将根据大小从大到小依次优先考虑注射的病变。根据病变大小和剂量水平，以最大注射量注射最大的病变。如果未全部使用该量，则以病变大小允许的最大注射量施用于下一个病变。施用从最大到最小继续进行，直到已施用整个剂量。
如果在每次治疗访视时或整个治疗期间均无法注射所有病变，则在后续的治疗访视中注射先前注射和/或未注射的一个或多个病变。每个病变的细胞介素混合物施用的详细信息在电子病例报告表(eCRF)中收集。
实施例1.2D.剂量递增决定
递增的决定应考虑临床安全性之结果。DLT观察期为治疗的前4周(周期1)。如果参与者第一个治疗周期(即，DLT期)中接受了他/她的队列中至少70％的计划的细胞介素混合物剂量(单一疗法)或至少70％的计划的细胞介素混合物剂量和至少70％的计划的西米单抗剂量(组合疗法)并评价1个周期，或者如果DLT更早出现，则被认为可评价以进行DLT评估。在剂量递增期无法评价以进行DLT评估的参与者(例如，周期1第28天之前的早期疾病进展；任何缺少的DLT评估参数)都将被替换。
单一疗法：对于前两个DL的递增，第二个DL在第一个参与者的DLT观察期结束后开始，且没有IMP相关的≥2级的AE或DLT。如果在前两个DL的任何一个观察到与IMP相关的≥2级的AE或任何DLT，则以相同的DL治疗另外两名参与者，并采用适应性设计开始进行剂量递增。如果在前两个DL中没有发生与IMP相关的≥2级的AE，则适应性贝叶斯EWOC从DL3开始。直到DL1或DL2招募的患者已随访28天并且可以进行AE评估的评价，且没有出现与IMP相关的2级AE，方可继续本研究的单一疗法部分的DL2或DL3的招募。
确定MTD后，立即停止剂量递增。如果未确定MTD，则剂量递增将继续直至达到MAD。
西米单抗组合疗法：没有执行初始的加速剂量递增步骤。使用与单一疗法相同的适应性合理设计。
实施例1.2E.剂量扩展期
单一疗法：根据MTD/MAD、总体安全性、活性和PK/PDy数据，确定扩展期的推荐剂量。
在MAD或MTD中招募了多达34名先前基于抗PD-1/PD-L1疗法失败的晚期黑色素瘤参与者，以进一步评估安全性(尤其是任何累积毒性)、抗肿瘤活性、PDy和PK活性。
西米单抗组合疗法：基于来自组合疗法剂量递增期的安全性数据以及可用的PK和/或PDy数据，确定与西米单抗一起用于扩展期施用的该细胞介素RNA混合物的组合剂量。组合中的剂量扩展包括以下所列的最多4个队列(包括黑色素瘤、CSCC和HNSCC肿瘤患者)；所有队列(A、B、C和D)的招募都是并行进行的。
组合疗法扩展期的队列包括：
·队列A(先前抗PD-1或抗PD-L1疗法失败的晚期黑色素瘤患者)：此队列最多可招募40名参与者。
·队列B(先前未接受过抗PD-1或抗PD-L1疗法[未接受过抗PD-1/PD-L1]治疗的黑色素瘤患者)：此队列最多可招募28名参与者。
·队列C(先前未接受过抗PD-1或抗PD-L1疗法[未接受过抗PD-1/PD-L1]治疗的CSCC患者)：此队列最多可招募29名参与者。
·队列D(先前未接受过抗PD-1或抗PD-L1疗法[未接受过抗PD-1/PD-L1]治疗的HNSCC患者)：预计此队列最多将招募59位参与者。
实施例1.2F.研究期持续时间
每个参与者的持续时间包括最多28天的筛选期。单一疗法周期持续时间为28天，组合疗法为21天。在第一个周期完成后，如果认为这种给药方案系安全的，并且参与者正在取得临床受益，则参与者可以每周继续以相同的DL剂量接受该细胞介素RNA混合物的附加施用。受益于作为单一疗法或与西米单抗组合的细胞介素RNA混合物的参与者的预期治疗时间可能会根据进展日期而有所不同。
中止干预后，参与者在上一次IMP施用后30天(用于治疗结束[EOT]评估)和90天(用于ADA样本)或开始另一种抗癌疗法之前(以较早者为准)返回。
在EOT访视之后，可能需要进行额外的随访，以监测所有正在进行的相关的和新的相关AE，直到消退或稳定为止(即，持续进行至少3个月无任何变化的事件)。EOT之后，在安全性随访期间，要报告、监测和跟踪直到消退或稳定的事件如下：所有正在进行的AE、SAE或具有特殊意义的事件，无论是否存在关系，以及所有新的AE、SAE或视为相关的具有特殊意义的事件，包括因相关事件导致的死亡。
另外，如果参与者由于进展以外的其他原因而中止干预，则每3个月进行一次随访，直到进展或开始另一种抗肿瘤治疗或死亡(以最先发生者为准)以记录疾病进展。
总的估计招募时间中位数为大约24个月。受益于该细胞介素RNA混合物的参与者的预期治疗持续时间可能会根据进展日期而有所不同；但每位参与者的预期治疗持续时间中位数估计为单一疗法9个月(筛选1个月、治疗5个月、EOT和首次随访3个月)，组合疗法中为12个月(筛选1个月、治疗8个月、治疗结束随访3个月)。
停止规则：在疗法30天内有任何死亡(与疾病进展(PD)相关的死亡除外)时，或在一定剂量水平下所招募患者中有超过三分之一的患者(例如3名患者中有2名)发生4级TEAE时，将暂停参与试验，直到研究委员会对死亡和毒性原因进行合适的评价并制定出纠正计划为止。
实施例1.2G.起始剂量选择
细胞介素RNA混合物：通常根据啮齿类动物和非啮齿类动物物种的毒理学研究结果确定抗癌化合物的起始剂量。通过瘤内注射施用该细胞介素RNA混合物，且该细胞介素RNA混合物的生物活性取决于所施用的mRNA的摄取和翻译。临床前毒理学研究系在非患肿瘤的啮齿类和非啮齿类动物中进行的，并且替代的施用路径可能无法准确反映瘤内施用路径。其结果系，确定首次在人类中的起始剂量的常规程序基于国际协调委员会(ICH)关于啮齿类动物中10％的动物的严重毒性剂量(STD 10)的1/10的S9建议，且对于局部施用的瘤内mRNA药物，没有观察到不良作用水平(NOAEL)的相关性。
为了确定人类的起始剂量，在携带人A375黑色素瘤异种移植物的免疫受损的小鼠中进行体内实验。在A375异种移植物中瘤内施用该细胞介素RNA混合物导致该细胞介素RNA混合物的每个细胞介素组分的翻译。当该细胞介素混合物在肿瘤内局部表现时，编码的细胞介素分泌出来并进入循环，导致所述细胞介素的全身暴露。评估由该细胞介素RNA混合物编码的所述细胞介素的PK参数。该A375异种移植物中细胞介素RNA混合物编码的细胞介素的血清PK参数显示出剂量依赖性表现关系。
假设小鼠和人类之间的细胞介素RNA混合物编码的细胞介素具有可比的肿瘤表现潜力，则使用异速生长测定法将小鼠的单个PK模型缩放至人类，并进行模拟以预测在该细胞介素RNA混合物的不同剂量水平下人类细胞介素全身暴露。由于人与动物中药理活性的不确定性以及与细胞介素有关的种间差异，因此应用了较宽的安全系数，并选择了人用剂量。
西米单抗：根据再生元公司(Regeneron)先前的临床试验选择350mg Q3W给药方案。选择了Q3W给药间隔。
实施例1.2H-研究结束定义
如果参与者完成了所有研究干预期直至最长1年(包括治疗结束)，或者由于其他原因终止了治疗，并且参与者完成了随访直至疾病进展，则认为他/她已完成研究。
本研究有两个截止日期：
单一疗法或组合疗法的首次试验的截止日期系在相应的剂量递增期治疗的最后一名参与者的周期1结束时，以便使所有参与者都具有可评价的DLT数据以确定MTD/MAD。
第二个截止日期系在扩展期接受治疗的最后一位参与者进行两次基线后肿瘤评估或治疗结束评估时(以最先发生者为准)，以评估肿瘤反应。
如果在剂量递增期或扩展期接受治疗的参与者在第二次研究截止后继续受益于治疗，则该参与者可以继续接受研究干预(长达1年的治疗)并对其评估IMP相关的AE、任何SAE和血样的免疫原性测定(如果适用)。
研究结束的定义为研究中最后一位参与者的最后一次访视的日期。
实施例1.3-研究群体
实施例1.3A-纳入标准
只有适用如表8所示的以下所有标准，参与者才符合纳入研究的条件。
[表8]-纳入标准
Figure BDA0003173652780001591
Figure BDA0003173652780001601
Figure BDA0003173652780001611
Figure BDA0003173652780001621
Figure BDA0003173652780001631
实施例1.3B-排除标准
如果适用表9中所示的任何以下标准，则将参与者排除在研究之外。
[表9]-排除标准
Figure BDA0003173652780001632
Figure BDA0003173652780001641
Figure BDA0003173652780001651
Figure BDA0003173652780001661
Figure BDA0003173652780001671
实施例1.4-研究干预
研究干预的定义为根据研究方案意在对研究参与者施用的任何一种或多种研究干预措施、一种或多种已上市产品、安慰剂或一种或多种医疗器械。
实施例1.4A-施用的一种或多种研究干预
[表10]-施用的研究干预概览
Figure BDA0003173652780001672
Figure BDA0003173652780001681
a没有对所有参与者施用预定义的前驱用药，但对于一些参与者可能推荐进行次级前驱用药。
该细胞介素RNA混合物系研究药品，它系重量比为1:1:1:1的合成的经化学修饰的mRNA，该mRNA编码人细胞介素IL-15 sushi、IL-12sc、GM-CSF和IFNα2b。
以4周的周期每周一次瘤内施用该细胞介素RNA混合物(即，每28天四剂)。在每个治疗周期后，瘤内注射的频率每周一次继续。但是，在研究开展过程中，基于肿瘤负荷的减少，剂量施用频率可能会降低至更低频率的施用，这可能会干扰预期剂量的施用。
由于施用路径系瘤内注射，预计不会出现急性过敏反应，因此没有对所有参与者施用预定义的前驱用药；但是，对于一些参与者，可能推荐使用前驱用药。所有用作前驱用药的药物都会输入到伴随用药页面。
实施例1.4A1-潜在肿瘤溶解综合症(TLS)的管理指南
对于TLS的情况，应坚持研究治疗(细胞介素mRNA混合物)，直到所有血清化学物质均已消失。为了确保正常的水合作用，应纠正实验室异常、液体过多、电解质或酸碱偏差。必须根据当地中心指南进行管理。允许使用抑制剂(例如，别嘌呤醇)或尿酸氧化酶(例如，拉布立酶)。应监测包括肾脏功能在内的TLS并发症，消退后可以全剂量重新制订研究治疗。
表11列出了通常与TLS有关的实验室异常以及可能与TLS有关的可能的临床表现。
[表11]-可能与TLS一致的实验室和临床异常
Figure BDA0003173652780001682
Figure BDA0003173652780001691
a校正钙水平(以毫克每分升为单位)＝测得的钙水平(以克/分升计)+0.8x(4-白蛋白(以克/分升计))
实施例1.4B-伴随疗法
受试者招募时正在接受的或研究期间接受的任何药物(包括非处方药或处方药、维生素和/或草药补品)必须记录使用原因以及施用日期(包括开始和结束日期)。
从研究药物初始剂量之前的14天到最后一次研究药物施用后30天，正在进行的研究药物相关不良事件消退或接受另一种抗癌疗法时在eCRF中记录伴随用药。
根据以下指南，可以逐个病例考虑使用伴随用药：
·全身性类固醇和TNF-α拮抗剂可能会减弱IMP的潜在益处，但是在紧急情况下，允许治疗研究者使用所述药物。尽管如此，应尽快将其通报申办方，并共同决定参与者是否以及如何继续参加研究。
·如果可行，应始终考虑皮质类固醇的替代品。与申办方协商后，允许皮质类固醇或替代类固醇的生理剂量。允许使用吸入性类固醇和口服盐皮质激素(例如，直立性低血压或肾上腺皮质功能不全的参与者使用氟可的松)。
-参与者可能会紧急接受皮质类固醇激素以应对紧急情况、过敏反应或类似情况；在研究期间，参与者可能不会接受泼尼松龙>7.5mg/天(PO或IV)或等效物的维持疗法。允许给予用于肾上腺皮质功能不全的相等的生理剂量的皮质类固醇。
·在治疗期间以及治疗开始前3周或5个半衰期(以较短者为准)，所有参与者禁止使用骨髓抑制化学疗法的伴随治疗。
·允许使用退热剂的伴随治疗(例如，当参与者发烧≥38.5℃时，使用1g对乙酰胺基酚/扑热息痛)。
·姑息性放射疗法可用于缓解目的的疼痛控制。如果正在考虑姑息性放射疗法，则应在治疗前以及在重新开始研究疗法前通知申办方以获得事先批准。在任何给定的三周时间内，受照射的区域应尽可能小，并且不得超过骨髓的20％。在所有此类情况下，应通过对肿瘤的物理和放射学评估排除肿瘤进展的可能性。如果仅对可评价的病变进行照射，则参与者将停止研究干预。照射面积不能用作反应评估的参数。
·表现为呼吸困难、低血压、喘息、支气管痉挛、心动过速、血氧饱和度降低或呼吸窘迫的严重事件，应按临床指示使用支持性疗法(例如补充供氧和β2肾上腺素能促效剂)进行管理。
·允许参与者接受的针对癌症以外的其他伴随疾病采取的任何背景疗法(例如，激素替代疗法、他汀类药物、抗高血压药疗法)以稳定剂量继续。
·所选的参与者可能需要前驱用药。
实施例1.4C-先前疗法
参与者在本研究开始之前接受的任何先前抗癌疗法(药物和疗法，包括放射疗法)都应输入eCRF中。
任何先前治疗都应系按照以下时间线完成的：
·任何先前的抗癌疗法，无论是试验性的还是已获批准的，包括化学疗法、激素疗法和/或放射疗法，都必须在开始研究干预之前至少3周结束。
·如果参与者在进入本研究之前已经接受过研究疗法，则应经过至少3周或5个半衰期方可进入本研究。
·任何草药疗法应在IMP施用前至少1周结束。
·允许使用细胞介素的先前治疗，条件系在计划的首次IMP施用和最后一次剂量之间已经经过了至少4周或5个该药物的半衰期(以较短者为准)。
·允许使用免疫检查点抑制剂、免疫调节性单株抗体(mAb)和/或mAb衍生的疗法的先前治疗，前提系到该疗法开始已经经过4周或5个半衰期(以较短者为准)。
如果参与者接受糖皮质激素维持疗法，则只有在首次施用IMP之前2周内剂量可以逐渐减少至<7.5mg/天时该参与者才符合条件，并且该参与者在整个研究期间不应有增加剂量的风险。
实施例1.4D-前驱用药
由于施用路径系瘤内注射，预计不会出现急性过敏反应，因此没有对所有参与者施用预定义的前驱用药；但是，西米单抗静脉施用的重要的已鉴定风险包括免疫相关反应和输注相关的超敏反应。根据参与者在第一次施用后是否经历了炎性反应，可以推荐在第二个周期及之后进行前驱用药。
如果参与者先前曾经历过药物诱导的相关过敏反应(即，IMP施用后24小时内出现轻度瘙痒到中度症状)，可以在施用该细胞介素RNA混合物给药前考虑使用组胺H1拮抗剂(口服苯海拉明50mg或等效物[例如，右旋氯苯吡胺]，在该细胞介素RNA混合物施用前大约30-60分钟给予)。如果参与者发生2级事件，包括超敏反应或CRS，则前驱用药可能还包括口服类固醇(地塞米松20mg或等效物)，以供将来施用。皮质类固醇激素的使用应仅限于治疗严重的药物诱导过敏反应或危及生命的病症。
对于首次施用IMP后出现发烧和颤抖等炎性症状的参与者允许使用退热剂进行前驱用药。可以基于要注射的一处或多处病变的位置使用局部麻醉剂。
实施例1.4E-禁止的疗法
在研究过程中禁止使用以下疗法：
·在试验期间，除姑息性放射疗法外，不允许使用意在治疗癌症的伴随疗法(例如，化学疗法或免疫疗法)。
-如果参与者在其他方面获益，则可以考虑采用放射疗法以减轻症状(例如，治疗疼痛的骨转移、阻塞性肺部病变)。
·在开始研究干预之前的4周内、治疗期间以及最后一个剂量的IMP后3个月内，禁止使用减毒活疫苗。如果所有其他疫苗都不是参与者的病症的最佳解决方案，则应避免使用它们。
·参加研究期间，所有参与者均禁止使用IFN的伴随治疗。
·在开始干预之前和干预期间，应在4周或5个药物半衰期(以较长者为准)内禁止使用全身免疫刺激药物(包括但不限于IFN和IL-2)，因为不能排除相互作用，并且可能会导致参与者的风险上升。
·免疫抑制药物，包括但不限于环磷酰胺、硫唑嘌呤、胺甲喋呤和沙利度胺。所述药物可能会改变活性。
·禁止使用泼尼松龙>7.5mg/天(PO或IV)或等效物的维持疗法。
·全身性粒细胞群落刺激因子(例如，粒细胞群落刺激因子、GM-CSF和/或聚乙二醇非格司亭)，因为这可能会改变IMP的活性。
·不允许本研究的参与者伴随地接受任何其他IMP。
实施例1.4F-剂量修改
细胞介素RNA混合物的剂量修改
如有必要或在发生与IMP相关的≥2级的AE时，该细胞介素RNA混合物的启用可以在任何一周的预期治疗日期之后延迟不超过3天，并且将2或3天的延迟视为剂量延迟。应在最后一个剂量后7天计划下一个剂量，以确保两个剂量之间的间隔为7天。
如果该细胞介素RNA混合物剂量需要在每周剂量的预期治疗日期之后延迟≥4天，则需要跳过该剂量并因此将该剂量视为剂量遗漏。如果与IMP相关的≥2级AE已在可接受的时间内消退为≤1级(或如果用替代疗法控制，则为2级)，则该参与者可以重新开始接受细胞介素RNA混合物。在连续两次遗漏剂量时，如果该AE不会危及生命，并且认为继续治疗对于患者的病症系最好的，则可以重新用细胞介素RNA混合物治疗该患者。在连续两次剂量遗漏时，该细胞介素RNA混合物将被确定地终止。
在本研究的单一疗法剂量递增部分经历DLT的参与者，将停止研究干预，并将跟踪其随访直至毒性消退。
·如果该DLT发生在自开始使用该细胞介素RNA混合物起的前28天内(递增期的DLT观察期)，则该细胞介素RNA混合物将被确定地终止。
·如果在自开始使用该细胞介素RNA混合物起28天(DLT观察期)后发生符合DLT定义的AE，则可在与申办方讨论并获得研究委员会的潜在认可，确保符合以下各项标准后，重新开始使用该细胞介素RNA混合物：
o AE已消退至≤1级(或如果采用替代疗法控制，则为2级)
o研究者认为，重新开始研究干预符合患者的最佳利益
仅适用于剂量递增(不适用于扩展期)，基于与申办方达成的协议，参与者将以与预防性治疗(如果可用)相同剂量的细胞介素RNA混合物或更低剂量水平以新的治疗周期重新开始疗法。不允许剂量再次递增。
若发生归因于该细胞介素RNA混合物的DLT且其再次发生并不一定会威胁生命(即，与CRS不相关的皮疹，甲状腺功能减退、发烧、疲劳、关节痛、头痛等内分泌病)并恢复至CTCAE≤1级或基线值迅速出现，将逐个病例评价该情况，并确定在相同剂量水平或较低剂量水平下重新开始疗法是否安全，以及是否符合参与者的效益/风险平衡。相反，如果DLT的复发可能会危及生命(即细胞介素释放综合症、肺炎)，则将参与者从进一步治疗中移除，并且不会被替换。
西米单抗的剂量修改
如本申请所述，西米单抗的输注应因如上该不良事件而中断、撤销或永久中止(针对不良反应的西米单抗推荐剂量修改)。可以在皮质类固醇减量后完全或部分消退(0至1级)的患者中重新开始使用西米单抗。
如果在接受细胞介素RNA混合物的受试者中由于特定的AE(例如，药物诱导的与输注相关的过敏反应)而永久中止西米单抗，则受试者将继续接受该细胞介素RNA混合物直至达到该细胞介素RNA混合物的永久性研究治疗中止的确定标准。
无论该细胞介素RNA混合物是否在任何一周的预期治疗日后最多延迟3天，西米单抗都应与该细胞介素RNA混合物在同一天施用。
西米单抗的治疗施用窗口为±3天。如有西米单抗被保留，西米单抗的启用可以在任何一周的预期治疗日期之后延迟不超过3天，并且将2或3天的延迟视为剂量延迟。应在最后一个剂量后21天计划下一个剂量的西米单抗，以确保两个剂量之间的间隔为21天。
如果需要将西米单抗的剂量推迟到预期的治疗日期后≥4天，则需要跳过该剂量并因此将该剂量视为剂量遗漏，在下一个计划的日期施用该细胞介素RNA混合物。如果在推荐的糖皮质激素减量后毒性已完全或部分消退(0至1级)，则该参与者可以重新开始使用西米单抗。在发生连续两次剂量遗漏时，如果该AE不会危及生命，并且认为继续治疗对于患者的病症系最好的，则可以重新用西米单抗治疗该患者。在发生连续两次以上剂量遗漏时，西米单抗将无限期终止。
在研究的组合剂量递增部分中经历DLT的参与者，将停止给予该细胞介素RNA混合物和西米单抗，并将跟踪随访该患者直至毒性消退。
·如果该DLT在开始使用该细胞介素RNA混合物加西米单抗后的前28天内发生(DLT观察期)，则该细胞介素RNA混合物和西米单抗都将停止。在与申办方讨论并获得研究委员会的潜在认可，确保符合以下各项标准后，仅可重新开始使用西米单抗：
-DLT仅与西米单抗单药明确相关，与细胞介素mRNA混合物无关
-根据附录14，AE已迅速消退至≤1级(如果由替代疗法控制，则为2级)
-研究者认为，重新开始研究干预符合患者的最佳利益
·如果该DLT发生在自开始使用该细胞介素RNA混合物加西米单抗起28天(DLT观察期)后，则可在与申办方讨论并获得研究委员会的潜在认可，确保符合以下各项标准后，重新开始使用该细胞介素RNA混合物以及西米单抗：
-AE已消退至≤1级(或如果采用替代疗法控制，则为2级)
-研究者认为，重新开始研究干预符合患者的最佳利益
仅适用于剂量递增(不适用于扩展期)，基于与申办方达成的协议，参与者将以与预防性治疗(如果可用)相同剂量的细胞介素RNA混合物和固定剂量的西米单抗(350mg)或更低剂量水平以新的治疗周期重新开始疗法。不允许该细胞介素RNA混合物剂量重新递增。
如果确定与西米单抗相关的DLT发生在还正在接受该细胞介素RNA混合物的参与者中并导致西米单抗无限期中止，则该参与者可以继续接受该细胞介素RNA混合物，直至达到该细胞介素RNA混合物的永久性研究治疗中止的确定标准。
接受西米单抗治疗的参与者在整个研究治疗期间均保持分配的剂量(350mgQ3W)，并且不允许对该IMP进行剂量修改。在正在发生的AE干扰研究干预时，治疗周期可能会延迟或西米单抗可以省略。
西米单抗治疗期间可能发生与输注相关的过敏反应。用于治疗所述潜在的不良事件的紧急设备和药物(例如，抗组胺药、支气管扩张药、静脉注射盐水、皮质类固醇、对乙酰胺基酚和/或肾上腺素)可供立即使用。
如果观察到以下任何一种AE，则中断西米单抗输注：咳嗽、寒颤/发冷、皮疹、瘙痒、荨麻疹(例如，荨麻疹、红肿或红肿伤痕)、发汗(出汗)、低血压、呼吸困难(呼吸急促)、呕吐或潮红。所述反应需要对症治疗，可以以原始速率的50％重新开始输注。
如果在西米单抗输注期间或之后立即发生严重程度≥3级的输注反应，则中止给药，该患者将永久中止西米单抗治疗。对生命体征进行密切监测。
如果参与者发生西米单抗输注相关的药物过敏反应，导致终止西米单抗治疗，如果基于逐个病例的评估认为继续疗法系对该参与者最佳的选择，则该参与者可以继续以指定的剂量水平接受作为单一疗法的该细胞介素混合物治疗。
实施例1.4G-研究干预的中止和参与者
中止/退出。如果IMP中止，则确定该中止是否系暂时的(即，剂量遗漏或周期延迟)；除非达到1年治疗期结束，否则在疾病进展之前永久中止IMP系最后的选择。任何IMP中止都必须在eCRF中完整记录。在任何情况下，参与者都应保留在研究中，直到记录到疾病进展为止。
研究干预的明确中止：永久性干预中止是指与研究者在研究期间任何时间不将参与者再次暴露于IMP的最终决定或与参与者无论何种原因均不得再次暴露于IMP的最终决定有关的任何干预中止。
如果研究者认为，继续进行研究干预有损于参与者的福祉，则可以中止研究干预，诸如以下任何一种情况：
1.不可接受的不良事件。
2.确认的疾病进展。
3.对研究方案的依从性差。
4.1年治疗期完成。
5.其他情况(诸如并发疾病)会阻止对研究干预措施的进一步施用。
如果参与者临床稳定，并且从毒性最小的疗法中获得临床益处，他们将一直接受治疗直至疾病进展或1年的最长治疗时间(以最先发生者为准)。如果在接受了组合疗法的受试者中，所述IMP中只有一种因特定的一例或多例AE(例如，药物诱导的与输液相关的过敏反应)而永久中止，则该受试者继续接受另一种IMP，直到达到永久性研究治疗中止的确定标准。
当该增加与基础疾病无关，并且研究者认为符合参与者安全的最大利益时，研究者考虑中止肝功能异常的研究干预。
如果参与者决定退出IMP治疗，可在任何时间以无论任何原因退出，或者可以由研究者决定是否退出。在以下任何一种情况下，应中止使用IMP进行治疗：应参与者的要求，在任何时间以无论任何原因(撤回同意)，或应其合法授权代表的要求。
「合法授权代表」被认为系根据适用法律授权可以代表潜在参与者同意该参与者参与研究涉及的一个或多个程序的个人或司法机构或其他机构。治疗同意的撤回与随访访视同意的撤回和非参与者接触随访(例如病历检查)同意的撤回不同。
要求退出的参与者被告知，撤回同意随访可能会损害本研究的公共卫生价值。向退出的参与者明确询问可能的AE对他们退出同意的决定的影响，并记录所引起的任何AE信息。较佳的是参与者撤回书面同意，并且如果该参与者或该参与者的代表拒绝或无法联系到，则该中心记录并签署该参与者未能撤回书面同意的原因。
根据本方案中指定的研究程序对参与者进行随访，直至计划的研究完成日期，或直至本方案中规定的要跟踪的任何AE的恢复或稳定，以最晚发生者为准。
如果可能，并且在永久中止干预之后，使用通常计划在最后给药日进行的程序对参与者进行评估，并酌情使用包括药物动力学样本的IMP。
所有永久性干预中止的病例在被认为系确认的情况下，由研究者记录在eCRF的适当页面中。
实施例1.4H-失访
如果参与者多次未能返回参加计划的访视，并且研究中心无法与其取得联系，则视为失访。
如果参与者未能返回诊所进行必要的研究访视，则会采取以下措施：
·本中心尝试联系该参与者并尽快重新安排错过的访视，并就保持分配的访视时间表的重要性向参与者提供咨询，并确定参与者是否希望和/或应该继续参与研究。
·在该参与者被认为失访之前，研究者或指定人员尽一切努力重新与参与者取得联系(可能的话，拨打电话3次，并在必要时给参与者的最后已知的通讯地址发出挂号信或采取当地等效的方法)。所述联系尝试记录在参与者的病历中。
·仍然无法联系到的参与者视为已退出研究。
实施例1.4I-研究评估和程序
作为参与者常规临床管理一部分(例如，血细胞计数)进行并且在签署ICF之前获得的程序，可用于筛选或基线目的，前提系所述程序符合方案规定的标准，并在SoA中规定的时间范围内执行。
出于安全原因或与样本有关的技术问题，可能会进行重复或计划外取样。
实施例1.5-疗效评估
在递增期，如果基于RECIST 1.1存在可测量的完整病变，则基于RECIST 1.1获得客观反应信息。
在扩展期，评估对该细胞介素RNA混合物的反应系主要目标。在扩展期接受治疗的所有参与者都必须至少具有一个可测量的完整病变才能纳入研究(参见上述纳入标准I05)。以固定的时间间隔按表2和3中的活动时间表(SOA)该进行肿瘤评估，并且评估窗口不受剂量延迟或剂量遗漏的影响。
所有肿瘤评估数据均基于RECIST 1.1标准记录在相关的eCRF页面。根据RECIST1.1标准的要求，必须在至少相隔4周的第二次检查中确认部分或全部反应，以便记录为确认的对疗法的反应。基于RECIST之免疫疗法(iRECIST)，在没有临床疾病进展时，还应在间隔至少4周的第二次检查中确认疾病进展，以排除假性进展。
遵循RECIST 1.1标准进行肿瘤反应的评估，并遵循iRECIST标准报告反应标准作为次要/探索性终点。如果在第二次评估中确认疾病进展，则基于初始评估记录进展日期。如果未确认疾病进展，则参与者继续治疗，并记录未确认的疾病进展(iUPD)。
测量所有可测量的病变(甚至低于基于RECIST 1.1的可测量性阈值的那些病变)，以优化研究干预。探索性分析作为ORR方面疗效评估的一部分，系通过评估总肿瘤体积并考虑非靶标病变的大小来进行的，而对注射与非注射病变的分析将作为该探索性评估的一部分。测量程序和eCRF记录在SRM中进行了详细说明，而统计分析计划在SAP中进行了详细说明。
次要疗效变量包括疾病控制率、反应持续时间和无进展生存期。所有所述参数在SAP中都有详细说明。
实施例1.5A-淋巴瘤患者的FDG-PET-CT和/或造影增强CT
ORR的定义系根据2014年卢加诺分类法使用五分量表评估的反应得出的CR和PR参与者的比例(Cheson BD等人(2014)J Clin Onc[临床肿瘤学杂志]32(27):3059-68)。
肿瘤评估包括嗜FDG淋巴瘤的FDG-PET-CT扫描和非嗜FDG淋巴瘤的造影增强CT。如SoA中所述，以固定的间隔进行肿瘤评估，并且评估窗口不受剂量延迟或剂量遗漏的影响。
如果筛选时的CT和/或PET扫描显示颈部疾病受累为阴性，则后续的CT扫描可以不包括颈部区域。如果筛选时的PET和/或CT扫描显示颈部疾病受累为阳性，则后续的CT扫描必须包括颈部区域。肿瘤反应评估应在筛选时进行(第一次IMP之前28天[-7天]内)，此后每12周(±7天)进行一次。成像时间应遵循日历天，并且不应因周期延迟而进行调整。对于因PD以外的其他原因中止的参与者，评估应继续进行，直到参与者记录了PD或开始新的抗癌疗法。如果研究者认为参与者发生临床进展，可以早于12周进行首次评估。
如果参与者有PR或CR，则需要每隔4周进行一次重复扫描以确认，并且患者应继续进行每12周评估一次的时间表。在参与者临床稳定但影像显示第12周出现PD的情况下，由研究者决定可继续使用研究药物，直到下一次疾病反应评估。但是，如果临床上怀疑有进展，则应随时进行成像。
每次疾病反应评估都应评估B淋巴瘤症状。
对于在第12周有PD，并在第12周后继续研究疗法的参与者，在治疗中止时进行放射学评估。如果先前的扫描系在中止治疗日期之前的4周内获得的，则在治疗中止时不必强制性进行重复扫描。
实施例1.5B-淋巴瘤患者的骨髓生检和抽吸
根据卢加诺2014的标准(Cheson BD等人(2014))，所有参与者可按照临床指示进行骨髓生检/抽吸。FDG-PET-CT足以确定骨髓受累，并且可以认为对骨髓受累具有高度暗示性。如果在基线时有必要，可以考虑进行骨髓生检确认(如果FDG PET-CT在骨髓部位呈阴性，则需要进行生检/抽吸以鉴定受累情况)。后续的骨髓评估仅对基线时有骨髓累及的参与者进行。
实施例1.5C-安全性评估
本FIH研究的主要目的是基于DLT建立每周一次瘤内注射施用时该细胞介素RNA混合物的生物学最佳剂量。因此，安全性系主要的研究终点，并且会持续进行评估。安全性概况评估系根据体格检查(最好由同一位医师进行)之结果和实验室测试来评估的，并基于发生率、严重程度(根据NCI CTCAE版本5.0分级)和AE的累积性质。SOA中提供了所有安全性评估的计划时间点。
实施例1.5D-体格检查
完整的体格检查最少应包括对中枢神经系统以及心血管、呼吸系统、胃肠道、造血系统(肝肿大、脾肿大、淋巴结病)和皮肤病学系统的评估。测量身高(仅在基线时)和体重(在每个周期的给药前)并记录在eCRF中。
在每次IMP施用前都要评估ECOG的状态，并记录在eCRF中。研究者要注意与先前严重疾病有关的临床体征以及皮肤病变的进展。任何新发现或先前发现的恶化都报告为新的不良事件。SOA中描述了体格检查的时间表。
实施例1.5E-生命体征
在治疗期，在就要开始输注IMP之前和注射结束时监测生命体征。还根据临床指示进行监测。评估体温、脉搏率、呼吸频率和血压。参与者在进行血压和脉搏测量之前应在安静、无干扰(例如电视、手机)的环境下至少休息5分钟。
实施例1.5F-心电图、超音波心动图和MUGA扫描
如SOA中所概述，获得单12导联ECG。应将签署ICF后发生的临床上明显的异常报告为AE。先存病症应记录在参与者的病史中。对于本研究的组合部分中的患者而言，仅在筛选时才按照SoA(参见本申请)所概述获得超音波心动图或MUGA扫描。
实施例1.5G-肺功能检查
对先前用博来霉素治疗过的淋巴瘤参与者而言，DLCO在基线时进行。仅在与西米单抗的组合递增组中的患者中，才需要进行肺功能检查。
实施例1.5H-临床安全性实验室评估
研究者审查实验室报告并记录此审查。所述实验室报告与原始文件一起归档。实验室异常仅在以下事件中报告为AE，所述事件：
-导致研究药品中止、治疗或剂量修改。
-满足严重或有特别意义的AE(AESI)定义(注意：其余的实验室测试在eCRF实验室页面中报告)。
-先前的mRNA和白介素触发试验已经显示血液学参数存在瞬时变化；作为作用方式的一部分的所述瞬时变化预设情况下不应登记为AE。但是，由临床研究者决定在特定情况下实验室变化是否应报告为具有临床意义和/或AE。
-在参加研究期间或在最后一次研究干预(即EOT评估)后30天内，将所有具有认为系临床上明显异常值的实验室测试重复进行，直到所述值恢复正常或基线，或研究者或医学监察员不再认为具有临床意义。
-如果在研究者认为合理的时间段内，所述值未恢复到正常/基线，则应确定病因，并通知申办方。
方案要求的所有实验室评估均根据实验室手册和SoA进行。
如果在机构的本地实验室进行的非方案指定实验室评估中得出的实验室值需要更改参与者管理或经研究者认为具有临床意义(例如SAE或AE或剂量修改)，则将结果记录在eCRF中。eCRF中报告了为安全性随访或为AE的进一步研究而进行的所有计划外实验室测试。
实施例1.5I-剂量限制性毒性(DLT)
DLT被定义为以下AE中任一项，所述AE在没有明确相反证据的情况下与IMP相关，经研究委员会确认，并且与使用NCI CTCAE版本5.0的疾病进展分级不相关。对于因治疗相关的AE而延迟启动周期2的参与者而言，DLT观察期的持续时间更长，必须评估该持续时间以确定该事件是否为DLT。使用NCI CTCAE版本5.0评估AE的严重程度。
血液学毒性：
·≥3级发热性中性粒细胞减少症或≥3级中性粒细胞减少症，并有感染记录。
·≥3级血液学毒性持续>72小时。
·4级血小板减少症或3级，有出血或需要输血。
非血液学毒性：
·除3级皮肤反应外，任何≥3级免疫相关的AE。
·irAE可能在第一剂后不久或最后一剂治疗后数月出现。评估与药物暴露相关的病因不明的所有AE，以确定可能的免疫病因。如果怀疑系irAE，则在将AE标记为irAE之前，努力排除瘤性、感染性、代谢性、毒素或其他病因。任何其他≥3级非血液学毒性：
-排除3级恶心、呕吐和腹泻，如果使用适当的抗腹泻疗法得到控制并在48小时内消退至≤1级。
-如果招募的有已知肝转移的参与者在基线时有2级AST或ALT异常，则仅当AST或ALT的增加大于基线的3倍并且在≥5天后确认升高时才将AST或ALT的上升视为DLT。
-如果招募的患有捷倍耳氏症候群的参与者在基线时患有2级胆红素异常，则仅当胆红素的增加大于基线的3倍并且在≥5天后确认升高时才将胆红素的上升视为DLT。
·≥2级眼色素层炎。
其他「不可分级」毒性：
·研究委员会认为治疗中出现的不良事件具有潜在的临床意义，因此进一步的剂量递增将使参与者面临无法接受的风险。
·与IMP有关的毒性导致超过1剂的剂量遗漏，无法恢复至基线或≤1级(脱发、白斑病、疲劳和甲状腺功能减退除外)。
使用在递增期的前28天治疗期间DLT的发生来定义MTD或MAD。在周期1及后续周期中，DLT的出现决定了是否需要剂量遗漏或减少(如果DLT在DLT观察期内发生，则确定地终止研究干预；超出DLT观察期)。
经历DLT的参与者将停止该细胞介素RNA混合物的疗法，并将继续进行跟踪，直到毒性消退至CTCAE≤1级或该参与者的基线值(如果更高)为止。从所讨论的毒性恢复后，最多可有2次剂量遗漏，并征得研究委员会的同意，并且如果研究者认为重新开始该细胞介素RNA混合物的疗法符合受试者的最佳利益，则基于与申办方达成的协议，参与者可以以相同剂量水平或更低的剂量水平以新的治疗周期重新开始疗法。此类重新给药的参与者不允许再次剂量递增。
实施例1.5J-全身性反应
超敏反应和过敏反应的管理，以及相关的剂量修改，将在下面详述。
全身性炎性反应
伴随该细胞介素RNA混合物的施用可能会出现由炎性反应引起的全身性反应。抗原特异性T淋巴细胞应答、TLR介导的传讯和促炎性细胞介素的瞬时释放可能引起全身性炎性反应。全身性炎性反应的典型临床症状可能包括心动过速、血压降低、呼吸困难、颤抖、呕吐、头晕和发烧。
在发生全身性炎性反应时，可以采取的措施有：
·评估重要功能(血压、心率、呼吸、体温)
·用扑热息痛和/或非甾体类抗炎药(NSAID)治疗
·收集用于以下项的血样：IL-6、IFNγ、TNFα、IL-2；GM-CSF、IL-10、IL-8、IL-5、CRP和铁蛋白；除了所述，还将对接受组合疗法的参与者收集用于促甲状腺激素(TSH)、游离甲状腺素(T4)、抗核抗体(ANA)和类风湿因子(RF)的血样
·根据研究者酌情决定可能需要住院治疗直到康复为止，伴随着例如：
·密切监测生命机能(血压、心率、呼吸、体温)
·NSAID的施用
·单次大剂量静脉内注射可的松
·单剂量的托珠单抗8mg/kg输注(如果没有恢复)
细胞介素释放综合症
细胞介素相关的毒性，也称为CRS，系非抗原特异性毒性，是由于强效的免疫活化而发生的。当大量淋巴细胞(B细胞、T细胞和/或NK细胞)和/或骨髓细胞(巨噬细胞、树突状细胞和单核细胞)经活化并释放出炎性细胞介素时，CRS就会在临床上显现出来。传统上，CRS与治疗性单株抗体输注有关，在所述情况下，症状发作通典型地发生在输注开始后的几分钟到几小时内。尽管预计在瘤内注射该细胞介素RNA混合物后血清细胞介素水平将接近直接注射重组细胞介素后参与者体内观察到的水平，但在持续的瘤内细胞介素水平提供临床益处的过程中，参与者可能具有持续水平的全身细胞介素水平，其可能引起不良反应。因此，要密切监测接受瘤内注射细胞介素RNA混合物的参与者的细胞介素相关毒性体征。如果参与者出现CRS的2级或以上的症状和体征，则他/她需要住院。如果CRS≥2级，应持续进行生命体征监测。如果参与者出现血液动力学或呼吸系统损伤，应将其转移到重症监护病房(ICU)。该ICU应配备具有治疗CRS的经验的重症监护医师。此外，该ICU必须具备开始对CRS≥2级的参与者进行实时治疗和监测所必要的设备才能将他/她收治到ICU。
有关CRS的临床体征和症状，请参见下文。
症状发作的时机和CRS的严重程度取决于诱导剂和免疫细胞活化的量级。当患者的肿瘤负荷较大时，该综合症的发生率和严重程度也会更高，大概系因为这会导致更高水平的T细胞活化。与单株抗体疗法相关的CRS一样，与过继性T细胞疗法相关的CRS也与IFNγ、IL-6和TNFα水平升高有关联；还已经报导了IL-2、GM-CSF、IL-10、IL-8、IL-5和不规则趋化因子(fracktalkine)的上升。新兴证据暗示IL-6系CRS毒性的中心介导物；IL-6系一种具有抗炎和促炎特性的多效细胞介素。但是，当前对多种细胞介素的实时分析不会显著影响当前患有CRS的个体患者的治疗，并且治疗决策典型地基于临床参数。
进行血清C反应蛋白(CRP)和铁蛋白之测定。仅在出现≥2级CRS症状时，收集并回顾性分析血浆中包括IL-6和IFNγ在内的细胞介素水平。在初始剂量后和每次增加剂量后进行采样，以评估CRS的体征，并且在出现CRS≥2级症状的情况下进行采样。CRP系肝脏产生的急性期反应物，主要是对IL-6的反应。血清CRP水平可作为IL-6生物活性增加的替代。在CRS期间，血清CRP水平可能会有几个对数的增加。血清CRP测定快速、便宜，并且在大多数医院中都可容易获得。在一些系列中，CRP峰值水平和CRP倍数变化已鉴定患者有严重CRS的风险。然而，重要的是强调，在感染过程中CRP水平也会升高，不能用于区分感染引起的炎症和与CRS相关的炎症。嵌合抗原受体(CAR)T细胞输注后，在许多患有CRS的患者中观察到血清铁蛋白的极端升高，这支持了CRS与巨噬细胞活化综合症/嗜血淋巴细胞组织细胞增生症(HLH)之间的相似之处。
为了评估个体参与者的CRS严重程度，使用了基于2014NCI共识指南的CRS分级系统和缓解策略。对该分级系统进行了修改，以定义轻度、中度、重度和危及生命的CRS(无论引发剂)，并指导使用皮质类固醇和/或抗人IL-6单株抗体(如托珠单抗)的治疗推荐。
实施例1.6-不良事件和严重不良事件
具有特别意义的不良事件
AESI系特定于申办方产品或程序的科学和医学方面的AE(严重或非严重)，要求研究者持续监测并立即告知申办方。此类事件可能需要进一步调查以表征和理解它们。在研究过程中，可以通过方案修正来添加、修改或清除具有特别意义的不良事件。
·进入研究的女性受试者的妊娠，以及进入IMP研究的男性受试者的女性伴侣的妊娠，只有符合严重性标准(见下文)中的一条时，才被评定为SAE。
-如果女性参与者怀孕，则IMP中止。在结果得到确定之前，对女性参与者或男性参与者的女性伴侣强制性进行妊娠随访。
·IMP/非研究药品(NIMP)的症状性超剂量(严重或非严重)
-IMP/NIMP的超剂量(偶然或故意)系研究者怀疑或参与者自发告知的事件，定义为比预期施用剂量高至少30％。
-值得注意的是，无症状超剂量报告为标准AE。
·其他项目特定的AESI
-所有方案定义的潜在或与IMP相关的DLT均视为AESI，无论发生的周期为多长(即，在递增和扩展期治疗的前28天之后)
-细胞介素释放综合症(任何等级)
-在研究的组合疗法部分中≥2级的输注相关反应
-任何≥2级的自体免疫反应
AE由参与者(或在适当情况下，由看护人、代理人或参与者的合法授权代表)报告。
研究者和任何有资格的指定人有责任检测、记录和记载符合AE或SAE定义的事件，并负责跟进严重的、被认为与研究干预或研究程序有关的或导致参与者中止使用细胞介素RNA混合物的AE。
不良事件(AE)
AE系在参与者或临床研究参与者中发生的任何不幸医疗事件，与研究干预的使用在时间上相关，无论是否与研究干预有关。因此，AE可能是与研究干预的使用在时间上相关的任何不利和意外的体征(包括异常的实验室检查结果)、症状或疾病(新的或加剧的)。
严重不良事件(SAE)
SAE系任何剂量下造成以下结果的任何不幸医疗事件：
-导致死亡，
-威胁生命(注：术语「威胁生命」是指参与者在事件/反应发生时有死亡风险的事件/反应；它不是指假设如果更严重则可能导致死亡的事件/反应)，
-需要住院治疗或导致现有住院时间延长，
-导致持续或严重的残疾/丧失工作能力，执行正常生命机能的能力的永久或重大(如果系暂时的)且严重的破坏。残疾不意欲包括相对较轻微的经历，诸如头痛、恶心、呕吐或意外的轻微创伤
-系先天性异常/出生缺陷、胎儿异常或导致流产的任何异常
-系医学上重要的事件或反应。在决定是否应将其他情况视为严重情况时，应进行医学和科学判断，所述情况诸如可能不会立即危及生命或导致死亡或住院，但可能危及参与者或可能需要干预以防止上述定义中列出的其他结果之一的重要医疗事件。研究者负责将医学上重要的AE评估为严重AE(SAE)。实施例：在急诊室或家中对过敏性支气管痉挛进行强化治疗；没有住院的血质不调；没有住院的无症状ALT上升超过10x ULN)
治疗中出现的不良事件(TEAE)定义为在最后一剂研究干预后长达30天的治疗期期间报告的AE。
相关不良事件：根据研究者申办的研究(ISS)，存在该产品可能造成此事件的合理可能性。SAE的因果关系(即，它与研究干预的关系)将由完成CRF的医师评估。出于监管报告目的，如果关系未知或未阐明，则符合药物不良反应的定义(可疑关联-ADR)。
免疫相关不良事件(ir-AE)：与治疗有关的不良事件的一个子集，被定义为与基于免疫的疗法(例如，免疫检查点抑制剂暴露)相关、病因未知且与免疫介导的机制一致的任何器官的有临床意义的不良事件。
有特殊意义的不良事件(AESI)：特定于申办方产品或程序的科学和医学方面的不良事件(严重或非严重)，为此研究者进行持续的监测和与申办方快速沟通可能是适当的。此类事件可能需要进一步调查以表征和理解它们。在研究过程中，可以通过方案修正来添加或移除AESI。
新的安全性发现：除应报告的个体病例安全性报告(ICSR)或安全问题以外的任何可能影响已知风险-效益平衡或产品安全性概况的发现。
预期的AE/SAE：根据当地卷标(如果可用)或欧盟产品特征概要(SmPC)确定产品在批准的适应症和治疗方案下的预期性。当产品以任何未经批准的组合/方案施用，或针对未经批准的适应症/群体或用于未经批准的给药时，对预期性的确定应基于IB(基于研究方案中定义的参考文件，考虑组合中每个特定上市药物的标签)。
怀疑的非预期严重不良反应(SUSAR)：因果关系、严重性和预期性系独立的标准。它系一个组合，定义了向卫生部门的加快报告。
符合AE定义的事件：
·任何异常的实验室测试结果(例如，血液学、临床化学或尿液分析)或其他安全性评估(例如，ECG、放射扫描、生命体征测量)，包括那些从基线开始恶化的，根据研究者的医学和科学判断认为具有临床意义之结果(即，与潜在疾病的进展无关)。
·慢性或间歇性先存病症的恶化，包括疾病频率和/或强度的增加。
·在研究干预施用后检测或诊断出的新病症，即使可能在研究开始之前就已经存在。
·可疑的药物相互作用的体征、症状或临床后遗症。
·怀疑超剂量的研究干预或伴随用药的体征、症状或临床后遗症。
不符合AE定义的事件：
·所研究的疾病/障碍或预期的研究疾病/障碍的进展、体征或症状，除非超过参与者的病症的预期严重程度。
·医疗或外科手术(例如，内视镜检查，阑尾切除术)：导致该手术的病症系该AE。
·没有发生不幸医疗事件的情况(社交和/或入院便利性)。
·在研究开始时存在或检测到的且没有恶化的一种或多种先存疾病或病症的预期每日波动
如果事件不是上述定义中的AE，那么即使满足严重病症(例如，因所研究疾病的体征/症状住院、由于疾病进展而死亡)，也不能将其视为SAE。
AE和/或SAE的记录和随访
AE和SAE记录
发生AE/SAE时，将审核与该事件相关的所有文件(例如，医院进展记录、实验室报告和诊断报告)，并在eCRF中记录所有相关AE/SAE信息。申办方可能会要求某些病例的医疗记录副本。在这种情况下，除参与者编号外，所有参与者识别符都将在病历副本上删除，之后再提交给申办方。研究者尝试根据体征、症状和/或其他临床信息确定该事件的诊断。只要有可能，诊断(而非个体体征/症状)都按AE/SAE记录。
强度评估
根据NCI CTCAE 5.0版评估AE/SAE的强度。
因果关系评估
研究者有义务评估研究干预与每个AE/SAE的每次发生之间的关系。关系的「合理可能性」表示存在事实、证据和/或论据暗示因果关系，而不是不能排除关系。研究者使用临床判断来确定这种关系。将考虑和调查替代原因，诸如潜在疾病、伴随疗法和其他风险因子，以及事件与研究干预施用之间的时间关系。研究者在评估时还可以针对已上市产品查阅研究者手册(IB)和/或产品信息。
对于每个AE/SAE，研究者必须在医疗记录中说明他/她已经审查了该AE/SAE并提供了因果关系评估。可能存在发生SAE的情况，研究者掌握的信息极少，无法包含在给申办方的初始报告中。但是，非常重要的是，研究者总要在将SAE数据首次传输给申办方之前，评估每个事件的因果关系。研究者可以根据随访信息改变其对因果关系的看法，并发送带有更新的因果关系评估的SAE随访报告。
AE和SAE的随访
研究者有义务按照医学指示或监测组代表的要求执行或安排进行补充测量和/或评价，以尽可能充分地阐明AE或SAE的性质和/或因果关系。这可能包括其他实验室检查或调查、组织病理学检查或向其他卫生保健专业人员咨询。新的或更新的信息将记录在最初完成的eCRF中。
SAE报告
通过电子数据收集工具向申办方报告SAE。向申办方报告SAE的主要机制系电子数据收集工具。如果电子系统超过24小时不可用，则本中心将使用纸质SAE数据收集工具(参见下一节)。本中心将在电子系统可用后立即将SAE数据登录电子系统。在给定中心完成研究后，将电子数据收集工具脱机以防止输入新数据或更改现有数据。如果某个中心从研究参与者处收到有关新SAE的报告，或者在脱机电子数据收集工具后收到先前报告的SAE的更新数据，则本中心可以在纸质SAE表格上报告此信息(参见下一节)或传真给申办方或代表。
通过纸质CRF向申办方报告SAE
传真发送SAE纸质CRF系将此信息发送给申办方或代表的首选方法。在极少数情况下，在没有传真设备的情况下，可以通过电话通知，并通过隔夜送达邮件或快递服务发送SAE数据收集工具的副本。通过电话进行的初始通知并不能代替研究者在指定的报告时间范围内完成并签署SAE CRF页面的要求。
实施例1.6A-收集AE和SAE信息的时间段和频率
在SOA中指定的时间点，从ICF的签署直到EOT，收集所有AE(包括SAE)。在EOT之后，仅报告与IMP有关的事件或非预期事件(包括与IMP关系不明确的那些事件)。
记录所有SAE和AESI，并在24小时内报告给申办方或指定人，如下所示。研究者将在获得任何更新的SAE数据的24小时内将其提交给申办方。
研究参与结束后，研究者没有义务主动寻找AE或SAE。但是，如果研究者在参与者退出研究后的任何时间得知任何SAE(包括死亡)，并且他/她认为该事件与研究干预或研究参与有合理关系，则研究者必须及时通知申办方。
以下提供了记录、评价和评估AE和SAE因果关系的方法，以及完成和传送SAE报告的程序。
实施例1.6B-检测AE和SAE的方法
在检测AE和/或SAE时要小心不要引入偏差。对参与者进行开放式和无主导的口头提问系询问AE事件的首选方法。
实施例1.6C-AE和SAE的随访
在最初的AE/SAE报告之后，研究者需要在后续的访视中主动跟踪每个参与者。EOT之后，在安全性随访期间，要报告、监测和跟踪直到消退或稳定的事件如下：
·所有正在进行的AE、SAE或具有特殊意义的事件，无论是否有关系
·所有被认为相关的新AE、SAE或具有特殊意义的事件，包括因相关事件导致的死亡
以下提供了有关随访程序的更多信息。
实施例1.6D-未评定为AE或SAE的与疾病相关的事件和/或与疾病相关之结果
以下疾病相关事件(DRE)在患有癌症的参与者中很常见，并且可能会严重/危及生命：
·基础疾病的进展，因为这系研究的终点。
·由于基础疾病的进展而导致的死亡(如果在上一次IMP施用后30天发生)。在上一次研究干预的30天内发生的所有死亡均应报告为SAE。
由于所述事件典型地与所研究的疾病有关，因此即使事件可能符合SAE的定义，也不会按照加快SAE报告的标准程序来报告所述事件。所述事件会在适当的时间范围内记录在参与者的eCRF的相应页面上。
但是，如果满足以下任一条件，则必须记录该事件并将其报告为SAE(而不是DRE)：研究者认为，该事件的强度、频率或持续时间大于对个体参与者的预期；或研究者认为该事件很可能与研究干预有关。
妊娠：
在开始研究干预后以及最后一次研究干预后至少6个月，将收集女性参与者以及男性参与者的女性伴侣(如果有)中所有妊娠的详细信息。
如果报告妊娠，研究者会在得知妊娠后24小时内通知申办方。异常妊娠结果(例如，自然流产、胎儿死亡、死产、先天性异常、异位妊娠)视为SAE。妊娠随访描述了妊娠之结果，包括任何故意或自发终止、出生详细情况、是否存在任何先天性异常、出生缺陷、母体或新生儿并发症及其与研究药物的推测关系。
实施例1.7-药物动力学
实施例1.7A-采样时间
定义以下血液收集时间点以测量血浆中该细胞介素RNA混合物编码的细胞介素浓度并进行PK分析：
血液收集的采样时间可以在PK/PDy流程图中找到(表3)。在指定的时间并按照规范收集所有血样系至关重要的。
记录因任何原因遗失或丢失的样本。实际血液收集时间记录在eCRF中。采样和给药的日期和时间也精确记录。
组合疗法的采样子集
对于组合疗法扩展期的A、B、C和D组，密集采样子集由每个队列中最少10名参与者组成，所述参与者在周期1第1周和周期3第1周中进行了密集采样(表4和表5)。组合疗法递增期的所有参与者都将进行稀疏采样。
实施例1.7B-生物分析方法
生物分析方法总结于表9中。简而言之，在每个参与者队列中，回顾性监测血浆中从该细胞介素RNA混合物翻译的四种靶细胞介素(IL-12sc、IL-15 sushi、GM-CSF和IFNα2b)的全身水平。根据检测灵敏度的需要，在MSD或Quanterix SIMOA平台上执行所述细胞介素测定(IL-12sc、GM-CSF、IFNα和IL-15 sushi)。对于接受组合疗法的参与者，使用再生元公司开发和验证的免疫分析方法根据PK/PDy流程图(表5)监测血清中西米单抗的浓度。
[表12]-用于细胞介素RNA混合物所编码的细胞介素和西米单抗的PK分析之生物分析方法
Figure BDA0003173652780001901
实施例1.7C-PK参数
药物动力学参数系使用PKDMS软件(Pharsight)，使用非区室方法，从细胞介素RNA混合物编码的细胞介素的大量采样血浆浓度和西米单抗的大量采样血清浓度中计算得出的。
细胞介素RNA混合物编码的细胞介素的PK参数包括但不限于表13中列出的参数。
[表13]-药物动力学参数清单和定义
Figure BDA0003173652780001911
群体PK方法可用于由细胞介素RNA混合物编码的细胞介素。完成后，将在一份或多份独立报告中报告生成的数据。
西米单抗的PK参数包括但不限于表14中列出的参数。
[表14]-药物动力学参数清单和定义-西米单抗
Figure BDA0003173652780001912
Figure BDA0003173652780001921
实施方式1.8-药效动力学
该细胞介素RNA混合物和西米单抗的靶标结合、PDy和安全性生物标志物对于剂量递增和PoC试验成功至关重要。定量或半定量生物标志物可说明建立剂量水平与靶标表现、PDy和PK参数之间的相关性，并有助于确定MTD/MAD。细胞介素RNA混合物单一疗法和细胞介素RNA混合物/西米单抗组合疗法程序的生物标志物可大致分为循环靶标表现，PDy/安全标志物和组织衍生的PDy标志物。
在可能的情况下，PDy样本收集与计划的PK采样一致。
实施例1.8A-循环靶标结合和安全性生物标志物监测计划
在每个参与者队列中回顾性监测血浆中从该细胞介素RNA混合物翻译的四种靶细胞介素(IL-12sc、IL-15sushi、GM-CSF和IFNα2b)及其下游PDy靶标(IFNγ和IFNγ诱导的蛋白10[IP10])和西米单抗的全身水平。
安全性生物标志物CRP和铁蛋白与临床参数(例如发烧、恶心、疲劳、头痛、肌痛、不适、低氧、低血压)一起使用可帮助鉴定临床AE。收集样本以监测继发性CRS。仅在发生≥2级CRS症状时，才在研究开展过程中回顾性评估一组6种细胞介素(IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10和TNFα)。针对组合疗法收集样本以监测潜在的自体免疫性；对于研究的组合疗法部分，对ANA、RF、TSH和游离T4进行回顾性评估。
实施例1.8B-用于免疫评估的肿瘤生检
在首次IMP施用之前、第5周至第8周之间以及周期6或疾病进展时(以最先发生者为准)收集强制性肿瘤生检。对于治疗中的生检样本(即第5-8周的一个，周期6或疾病进展时的另一个)，需要从注射和未注射的病变中获取生检样本。较佳的是，在治疗中要进行生检的病变之一应该系在基线已经进行过生检的病变。如果这不可行，则可以考虑来自另一个注射病变的组织样本。如果要进行生检的病变有限，那么如果之前已经从同一个部位收集了另一个样本，则只能考虑对未注射的病变进行生检，或者可以在下一个采样时间点收集。.
所有参与者的生检组织均经过苏木精和曙红染色以及CD3、CD8的标准ICH，并且肿瘤细胞将通过所研究的肿瘤类型相关的SOX10标志物(对于黑色素瘤)或广谱细胞角蛋白(对于上皮性肿瘤HNSCC和CSCC的患者为[CK])和淋巴瘤标志物来确定；该标准IHC还包括CD68和PD-L1用于组合疗法队列。一个子集的参与者生检组织(来自反应者和非反应者)经历了12种标志物的多重IHC。对于本研究的单一疗法部分，该多重检组由CD3、CD4、CD8、CD38、CD45、CD45RO、CD56、CD68、FoxP3、PD-1、PD-L1和SOX10或PanCK或淋巴瘤标志物组成。对于本研究的组合疗法部分，该多重组由CD3、CD4、CD8、CD38、CD56、CD68、粒酶B(GZMB)、群落刺激因子1受体(CSF-1R)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、PD-1、PD-L1以及SOX10(对于黑色素瘤)或PanCK(对于上皮肿瘤HNSCC和CSCC的患者)或淋巴瘤标志物组成。收集治疗前和治疗后生检组织的IHC并用于评估肿瘤微环境的变化，特别是评估肿瘤和基质中浸润性T细胞的频率和密度。生检前后的T细胞增加系阳性免疫相关因子，用于帮助定义机制的证据。
仅对于在单一疗法和组合疗法的扩展期间的黑色素瘤患者，在5-8周之间进行的单一肿瘤核心生检将专用于TIL分离。这将适用于有限数量(例如，成功完成TIL分离的不超过十名患者)的所选黑色素瘤患者。这将不是附加的生检，而是将专用于基因组评估的样本用于TIL分离(在特殊条件下处理-未福尔马林固定)。这类样本和测试应用于治疗研究者所确定的对治疗有临床反应体征(肿瘤缩小和/或肿瘤部位发红)的患者。
肿瘤转录组学(RNA定序)基因组学和新抗原也基于样本的可获得性进行分析。
实施例1.9-基因组学
进行了多种分析以分析治疗背景下的基因组学，包括体细胞突变和PBMC上的HLA分型；肿瘤RNA定序(RNAseq)；血液RNAseq(仅用于组合疗法)。肿瘤转录组学和基因组分析也可以根据样本的可获得性进行。需要肿瘤RNAseq数据(也计划作为生物标志物分析的一部分)来确定基因特征、肿瘤中的新抗原、TMB和TCR多样性。HLA分型将对血液进行。如果有足够的样本材料可用，则参加所述分析系强制性的。
对于本研究的单一疗法部分，仅在黑色素瘤参与者中评估新抗原。对于本研究的组合疗法部分，仅在队列A(PD-1/PD-L1难治性)参与者的扩展期评估新抗原。
如果DNA或RNA提取失败，则要求参与者提供替换样本(肿瘤或血液)。除非原始同意书中包含知情同意书，否则需要签署知情同意书才能获得替换样本。在样本处理和运输存在可行性限制时，将不对来自相关临床中心的样本进行所述(或其中一些)分析的评估。
实施例1.9A-免疫原性评估
在单一疗法和组合疗法中均评估了针对该细胞介素RNA混合物编码的细胞介素的抗体，而在组合疗法组中则评估了针对西米单抗的抗体。
根据SOA在从所有参与者收集的血浆样本中评估针对细胞介素RNA混合物编码的细胞介素的抗体。此外，在最终访视时还将从中止研究干预或退出研究的参与者处收集血浆样本。所述样本由申办方或申办方指定人员进行测试。在血清样本中评估针对西米单抗的抗体。测试样本中针对西米单抗的ADA。
在血浆样本中筛选与从该细胞介素RNA混合物表现的四种细胞介素中的每一种结合的抗体，并报告已确认阳性样本的滴定度。进行其他分析以进一步表征该细胞介素RNA混合物的免疫原性。
对细胞介素RNA混合物的抗体的检测和表征系通过经验证的方法由申办方监督或在申办方的监督下进行的。进一步表征和/或评价抗体中和研究干预活性的能力。在最后一位参与者的最后一次研究访视之后，样本在申办方选择的设施处保存最多5年(或根据当地法规)，从而可以进一步分析对该细胞介素RNA混合物和/或西米单抗的免疫反应。
实施例1.9B-RNA转录组研究
使用微数组和/或替代性等效技术进行探索性转录组研究，这有助于同时测量数千种RNA种类的相对丰度，从而为每种组织生检样本提供转录组谱。IHC后残留的肿瘤组织需要进行RNA定序分析，以评估肿瘤环境内总体基因表现的变化，特别是寻找促炎性和/或IFNγ基因签名的发展。这使得能够评价转录组谱的变化，所述变化与涉及该细胞介素RNA混合物和/或西米单抗的作用的适应性免疫应答相关。
相同的样本还用于通过应用替代性技术来确认发现。
在本研究的组合疗法期间，对血样进行了相同的RNAseq分析。
实施例1.10-统计考虑
实施例1.10A-统计假设
剂量递增
在本研究的剂量递增期中没有正式的统计假设。本研究旨在根据观察到的DLT建立该细胞介素RNA混合物的MTD或MAD。使用前两个DL的单参与者剂量递增进行剂量递增，随后进行合理设计。
对于与西米单抗的组合疗法，本研究旨在根据观察到的DLT建立与西米单抗组合的细胞介素RNA混合物的MTD或MAD。使用合理的设计进行剂量递增。
剂量扩展
对于单一疗法，无效假设系根据RECIST 1.1的真实ORR≤10％，替代性假设系根据RECIST 1.1的真实ORR≥26％。
对于组合疗法：
·队列A：零假设系根据RECIST 1.1的真实ORR≤10％，替代性假设系根据RECIST1.1的真实ORR≥26％。
·队列B：零假设系根据RECIST 1.1的真实ORR≤30％，替代性假设系根据RECIST1.1的真实ORR≥55％。
·队列C：零假设系根据RECIST 1.1的真实ORR≤45％，替代性假设系根据RECIST1.1的真实ORR≥70％。
·队列D：零假设系根据RECIST 1.1的真实ORR≤15％，替代性假设系根据RECIST1.1的真实ORR≥30％。
实施例1.10B-样本量确定
当该细胞介素RNA混合物作为单一药物施用时，共计招募最多72名参与者，取决于递增期研究的剂量水平。当将该细胞介素RNA混合物与西米单抗组合施用时，共计招募最多192名参与者，取决于递增期研究的剂量水平和扩展期每个队列的完成阶段。本研究招募的患者最大数量预计达到264名，如以下各节中进一步详细介绍的。
剂量递增期
没有正式的单一疗法剂量递增期样本量计算。剂量递增期招募了大约38位可评价DLT的参与者，评估了约8个DL。实际样本量取决于观察到的DLT和实际探索的剂量水平的数量。
对于组合疗法，与西米单抗组合的细胞介素RNA混合物的剂量递增中的实际样本量因观察到的DLT和实际探索的剂量水平的数量而异(大约18至36名可评价DLT的参与者)。
剂量扩展期
在单一疗法剂量扩展期使用合理的设计。针对单侧替换检验了真实反应率为10％的零假设。在第一阶段，累计了16名参与者。如果根据RECIST 1.1标准，在这16名参与者中，有1例或更少的反应，则停止研究。否则，将增加18名参与者，总计34名。如果在34名晚期黑色素瘤参与者中，先前抗PD-1或抗PD-L1疗法失败后观察到7例或更多反应，则该无效假设将被否定。当真实反应率为26％时，这种设计产生的单侧I型错误率为5％，效力为80％。
组合疗法扩展期的样本量系根据合理的设计计算得出的，其中单侧α水平为5％，效力为85％；预计将招募约156名患有晚期实体瘤的参与者。表15提供了ORR的假设、所需的样本量以及每个阶段所需的反应者数量：[表15]-样本量的确定
Figure BDA0003173652780001961
Figure BDA0003173652780001971
缩略语：CSCC＝皮肤鳞状上皮细胞癌；HNSCC＝头颈部鳞状上皮细胞癌
注意：基于客观反应的数量和在第1阶段的治疗队列中观察到的数据总数，可以决定治疗队列进入第2阶段。
实施例1.10C-用于分析的群体
为了进行分析，定义了以下群体，如表16所示：
[表16]-分析群体
Figure BDA0003173652780001972
Figure BDA0003173652780001981
实施例1.10D-统计分析
疗效分析
使用描述性统计总结了基于预选病变(包括注射和未注射的病变)根据RECIST1.1的客观反应率(ORR)。使用Clopper-Pearson方法计算90％的双向置信区间。统计推断基于样本量计算部分中定义的假设和α水平。针对根据RECIST 1.1和iRECIST的DCR和根据iRECIST的ORR提供了类似的分析。另外，分别为注射和未注射的病变提供了肿瘤负荷变化的总结作为支持性分析。使用Kaplan-Meier方法总结了DoR和PFS。
[表17]-疗效分析
Figure BDA0003173652780001982
安全性分析
所有安全性分析都将针对所有治疗的群体进行。
[表18]-安全性分析
Figure BDA0003173652780001991
剂量限制性毒性
在剂量递增期(单一疗法和组合疗法)中，按照单一疗法和组合疗法以及剂量水平来总结DLT。DLT的详细信息由参与者提供。如上所述，DLT系使用NCI CTCAE版本5.0定义的。
不良事件分析
观察期分为3个部分：筛选、TEAE和治疗后。筛选期定义为知情同意书签署到开始第一个剂量的研究干预之前的时间。治疗中出现的不良事件(TEAE)期间定义为从研究干预的第一个剂量到研究干预的最后一个剂量后30天之间的时间。治疗后期间定义为从最后一个剂量的研究干预后31天起到研究结束或死亡的时间，以最先发生者为准。
治疗前AE定义为筛选期的任何不良事件。治疗中出现的不良事件定义为在TEAE期间出现、恶化(根据研究者的意见)或变得严重的不良事件。治疗后不良事件定义为在治疗后期间报告的不良事件。AE报告的主要重点系TEAE。分别对治疗前和治疗后的不良事件进行了描述。
所述TEAE根据Medical Dictionary for Regulatory Activities[监管活动医学词典](MedDRA)进行编码。AE根据NCI CTCAE 5.0版进行分级。总结中考虑了等级。对于多次出现相同较佳项(PT)的参与者，将使用最高等级。
提供了TEAE的总体总结。提供了经历以下任何情况的参与者的数量和百分比：
·TEAE。
·≥3级的TEAE。
·3或4级的TEAE。
·5级的TEAE(在治疗期间有致命结果的任何TEAE)。
·严重的TEAE。
·与治疗相关的严重TEAE。
·导致治疗中止的TEAE。
·AESI。
·与治疗相关的TEAE。
·与治疗相关的≥3级的TEAE。
通过NCI CTCAE等级(所有等级以及≥3级)总结了按主系统器官分类(SOC)和PT统计的经历TEAE的参与者的数量和百分比。对于与治疗相关的TEAE、AESI、导致治疗中止的TEAE、导致剂量修改的TEAE、严重的TEAE、具有致命结果的TEAE和在治疗后给药期间发生的AE/SAE，制作了类似的表格。作为研究干预后的治疗相关的不良事件的子集，分别总结了本研究的单一疗法和组合疗法的免疫相关AE(irAE)。
临床实验室评价
如果适用，根据NCI CTCAE 5.0版对临床实验室结果进行分级。提供了所有治疗的群体中在TEAE期间具有使用最差等级的实验室异常(即所有等级以及≥3级)参与者的数量(％)。
如上所述，并非所有基于作用方式的实验室值的瞬时变化都记录为TEAE；研究者评价实验室变化是否系临床相关的，以便将其记录为TEAE。
当NCI CTCAE 5.0版量表不适用时，显示实验室异常值超出正常实验室范围值的参与者的数量。
实施例1.11-临床实验室测试
进行表19和20中详述的测试，并将结果输入eCRF。方案中详细介绍了纳入或排除参与者的方案特定要求。根据研究者的需要或当地法规的要求，可以在研究期间的任何时间进行其他测试。研究者必须记录对每份实验室安全性报告的审查。
[表19]-方案要求的安全性实验室评估
Figure BDA0003173652780002011
Figure BDA0003173652780002021
注意：
a下文给出了肝化学停止标准、肝停止或监测事件后所需采取的措施以及随访评估的详细信息。ALT≥3×正常上限(ULN)和胆红素≥2×ULN(>35％直接胆红素)或ALT≥3×ULN和国际标准化比值(INR)>1.5的所有事件，如果测量的INR可能指示严重肝损伤(可能的海氏定律)，则必须报告为SAE。
[表20]-方案要求的评估
Figure BDA0003173652780002022
Figure BDA0003173652780002031
a对于组合疗法，将仅在队列A(抗PD-1/PD L1疗法已经失败的黑色素瘤参与者)中进行所述评估。
b在本研究的组合疗法部分将评估TMB。对于进行单一疗法的患者，可以考虑对剩余样本进行此分析。
c有关在研究的单一疗法和组合疗法部分中要评估的单一和多重IHC组的描述，参见实施例1.8B。
d SOX10系检测黑色素瘤肿瘤细胞的标志物；对于上皮肿瘤(HNSCC和CSCC)，它将由广谱细胞角蛋白(CK)替代。
实施例1.12-避孕指导和妊娠信息收集
有生育潜力的女性(WOCBP)：有生育潜力的女性系有以下情况的女性：
1.在某个时间点已达到了初潮，
2.未接受过子宫切除术或双侧卵巢切除术，或
3.未自然绝经(癌症疗法后闭经不排除生育潜力)至少连续24个月(即，在过去24个月内的任何时候有过月经)。
避孕指导
·男性参与者
o如果男性参与者与有生育潜力的女性伴侣同意在干预期间和最后一次研究干预后的6个月内满足以下中的一项，则符合参加的条件：
■戒除阴茎-阴道性交作为惯常和偏爱的生活方式(长期和持续性地戒除)，并同意保持禁欲
■与目前未怀孕的有生育潜力的女性进行阴茎-阴道性交时，同意使用男用避孕套加如下所述的每年失败率<1％的伴侣用避孕方法
o此外，男性参与者必须在研究期间和最后一个剂量的研究干预后的6个月内不捐献精子
o在干预期间和最后一个剂量的研究干预后的6个月内，每次有阴茎插入的情况下，有怀孕或母乳喂养伴侣的男性参与者必须同意不进行阴茎阴道性交或者使用男性避孕套。有妊娠期或哺乳期伴侣的男性参与者必须同意戒除阴茎阴道性交或在每次阴茎插入期间保持使用男用避孕套。
·女性参与者
o有生育潜力的女性参与者如果同意始终正确地使用如下所述的一种高效的避孕方法，则符合参加的条件：
使用者依赖性的高效避孕方法：如果始终正确使用，每年的失败率<1％。
i)与排卵抑制有关的组合(含雌激素和孕激素)激素避孕：口服，阴道内或透皮
ii)与排卵抑制有关的仅孕激素的激素避孕：口服或注射
非使用者依赖性的高效方法：
iii)与排卵抑制有关的仅植入孕激素的激素避孕：宫内节育器(IUD)、宫内激素释放系统(IUS)或双侧输卵管阻塞
伴侣输精管切除：伴侣输精管切除系一种高效的避孕方法，只要该伴侣系WOCBP的唯一男性性伴侣，并且已经确认没有精子。如果不是，则使用另一种高效的避孕方法。
性节制：只有将性节制定义为在与研究干预有关的风险存在的整个期间避免异性性交，才认为性节制系一种高效的方法。根据研究的持续时间以及参与者的偏爱和惯常生活方式来评估性节制的可靠性。
注意：典型的使用失败率可能与始终正确使用时的失败率不同。使用应符合当地有关参加临床研究的参与者使用避孕方法的规定。激素避孕可能容易与研究干预相互作用，这可能会降低避孕方法的有效性。在这种情况下，在干预期间以及最后一个剂量的研究干预后至少6个月内，采用两种高效的避孕方法。口服激素避孕可能容易与研究干预相互作用，这可能会降低避孕方法的有效性。在这种情况下，如果口服避孕药不能用另一种不同施用路径的高效避孕方法代替，则在干预期间和最后一剂的研究干预后至少6个月内，必须以男性避孕套(供伴侣用)补充激素避孕方法。
妊娠测试：仅在确定月经期和高敏血清妊娠测试阴性后才纳入WOCBP。在干预期间的每个治疗周期开始时和EOT进行附加的妊娠测试。每当错过月经周期或怀疑怀孕时，都会进行妊娠测试。根据当地的实验室程序进行妊娠测试。在参加研究时怀孕的任何女性参与者都应中止研究干预，并退出研究。
妊娠信息的收集：
伴侣已怀孕的男性参与者-研究者尝试收集任何男性参与者的女性伴侣在该男性参与者参加本研究期间怀孕的妊娠信息。这仅适用于接受细胞介素RNA混合物的男性参与者。在直接从怀孕的女性伴侣处获得必要的签字的知情同意书后，研究者会在适当的表格上记录妊娠信息，并在得知该伴侣的妊娠信息后24小时内将其提交给申办方。还要随访该女性伴侣以确定妊娠结果。有关母婴状态的信息将转发给申办方。通常，随访时间不超过估计的分娩日期后的6至8周。对于任何妊娠终止，不论胎儿状况(有无异常)或是否指示需要手术，都将进行报告。
怀孕的女性参与者-研究者收集在参加本研究期间怀孕的任何女性参与者的妊娠信息。信息记录在适当的表格上，并在得知参与者妊娠信息后的24小时内提交给申办方。随访该参与者以确定妊娠结果。研究者将收集有关参与者和新生儿的随访信息，并将所述信息转发给申办方。通常，随访时间不需要超过估计的分娩日期后的6至8周。对于任何妊娠终止，不论胎儿状况(有无异常)或是否指示需要手术，都进行报告。任何妊娠并发症或选择性终止妊娠均报告为AE或SAE。自发流产通常认为系SAE并将按此报告。研究者认为与研究干预合理相关的任何研究后妊娠相关的SAE均应报告给申办方。尽管研究者没有义务在以前的研究参与者中主动寻求该信息，但他或她可能会通过自发报告了解到SAE。
任何女性参与者在参加研究期间怀孕都会中止研究干预，并退出研究。
实施例1.13-针对药物相关不良事件的推荐支持性护理或剂量修改指南
[表21]-基于CTCAE v.5.0的超敏反应分级系统和缓解策略
Figure BDA0003173652780002051
Figure BDA0003173652780002061
Figure BDA0003173652780002071
CRS的症状、分级和管理
与CRS相关的临床体征和症状
·心血管：心动过速、脉压增宽、低血压、心输出量增加(早期)、心输出量潜在减少(晚期)
·凝血：D-二聚体升高、低纤维蛋白原血症±出血
·胃肠道：恶心、呕吐、腹泻
·一般：发烧±寒颤、心神不安、疲劳、厌食、肌痛、关节痛、头痛
·肝：转胺酶、高胆红素血症
·神经病学：头痛、精神状态改变、意识错乱、谵妄、唤词困难或坦率失语、幻觉、震颤、辨距不良、步态改变、癫痫发作
·肾脏：氮血症
·呼吸：呼吸急促、低氧血症
·皮肤：皮疹
表22提供了CRS的分级和管理。
[表22]-基于2014NCI共识指南的CRS分级系统和缓解策略
Figure BDA0003173652780002081
Figure BDA0003173652780002091
其他不良事件指南
表23提供了眼色素层炎管理的指南；请注意，已尽一切努力排除其他原因，例如转移性疾病、感染或其他眼部疾病(例如青光眼或白内障)。
表24为归因于该细胞介素RNA混合物的不良事件提供了指导和支持性护理策略。
此外，特别是对于本研究的组合部分，如果报告的不良事件被认为与一种IMP有关，根据本研究的单一疗法部分可获得的数据，并且如果基于当前的逐个病例的效益-风险评估认为继续使用该IMP系对该参与者最佳的选择，则停止相关的IMP并继续使用另一种IMP进行研究干预。对于可能被认为与西米单抗相关的irAE的管理，遵循了西米单抗IB和美国国家综合癌症网络(NCCN)关于「免疫疗法相关毒性(免疫检查点抑制剂相关毒性)的管理」的指南(可在www.nccn.org获取)。
对于发生在48-72小时内对类固醇无反应的严重irAE的参与者，应与相关医学专家协商，以确保及早(即，72小时内)开始抗TNFα疗法。
[表23]-眼科(眼色素层炎)AE管理
Figure BDA0003173652780002092
Figure BDA0003173652780002101
尽一切努力排除其他原因，例如转移性疾病、感染或其他眼部疾病(例如青光眼或白内障)。
[表24]：不良事件和剂量修改的支持性护理指导
Figure BDA0003173652780002102
Figure BDA0003173652780002111
Figure BDA0003173652780002121
Figure BDA0003173652780002131
Figure BDA0003173652780002141
Figure BDA0003173652780002151
实施例1.14-实体瘤反应评价标准1.1版
在Eisenhauer EA,Therasse P,Bogaerts J,Schwartz LH,Sargent D,Ford R等人New response evaluation criteria in solid tumours:revised RECIST guideline(version 1.1).[新实体瘤反应评价标准：RECIST指南修订版(1.1版)]Eur J Cancer.[欧洲癌症杂志]2009年1月；45(2):228-47中提供了详细信息。
基线时肿瘤的可测量性
在基线，将肿瘤病变/淋巴结分类为可测量或不可测量，如下所述。
在最少1个维度(要记录的测量平面中的最大直径)上准确测量可测量的病变，最小尺寸为：
·通过CT扫描测量的10mm(CT扫描切片厚度不大于5mm)。
·通过临床检查卡尺测量10mm(使用卡尺无法准确测量的病变应记录为不可测量的)。
·通过胸部X光检查测量的20mm。
恶性淋巴结：淋巴结通过CT扫描评估的短轴长度必须≥15mm(推荐CT扫描的切片厚度不大于5mm)方可认为系病理上可扩大的和可测量的。在基线时和随访中，仅测量和跟踪短轴。
不可测量的病变系所有其他病变，包括小病变(最长直径<10mm或短轴长度≥10至<15mm的病理淋巴结)以及不可测量的病变。被认为不可测量的病变包括：皮膜脑病、腹水、胸膜或心包积液、炎性乳腺疾病、皮肤或肺部的淋巴管性受累、通过物理检查鉴定的无法通过可再现的成像技术测量的腹部肿块/腹部器官肿大。
有关病变可测量性的特殊注意事项：
骨病变：
·骨扫描、正电子发射断层扫描或平片不认为系测量骨病变的适当成像技术。但是，所述技术可用于确认骨病变的存在或消失。
·如果软组织成分符合上述可测量性的定义，则可以通过CT或MRI等横截面成像技术评价的具有可鉴定软组织成分的溶骨性病变或混合溶骨-增生性病变可视为可测量的病变。
·增生性骨病系不可测量的。
囊性病变：
·符合放射学定义的简单囊肿标准的病变不被认为系恶性病变(既不是可测量的也不是不可测量的)，因为从定义上讲它们系简单囊肿。
·如果代表囊性转移的「囊性病变」符合上述可测量性的定义，则可以认为系可测量的病变。但是，如果同一患者中存在非囊性病变，则较佳的是将所述作为靶标病变。
先前接受过局部治疗的病变：
·除非已证实病变进展，否则位于先前受过照射的区域或接受其他局部疗法的区域的肿瘤病变通常被认为系无法测量的。
评估方法
所有测量均以度量符记录，并且如果临床评估，则使用卡尺。所有基线评估均应在距治疗开始时尽可能近的时间进行，并且切勿在治疗开始前超过4周进行。
在基线时和随访期间，使用相同的评估方法和相同的技术来表征每个已鉴定和报告的病变。始终执行基于影像的评估而不是临床检查，除非所跟踪的病变无法成像但可以通过临床检查评估。
临床病变：只有使用卡尺评估的临床病变系浅表的且直径≥10mm时才被认为系可测量的。对于皮肤病变，建议通过彩色摄影记录，包括标尺，以估计病变的大小。如上所述，当病变既可以通过临床检查又可以通过影像学评估时，可以进行影像学评估，因为它更加客观，并且可以在研究结束时进行复查。
胸部X光片：胸部CT优于胸部X射线，特别是在进展系重要的终点时，因为CT比X射线更敏感，特别是在鉴定新病变方面。但是，如果胸部X线的病变清晰界定并被充气的肺包围，则认为系可测量的。
CT、MRI：CT系用于测量选择用于反应评估的病变的现有最好的且可再现的方法。CT扫描上病变的可测量性基于CT切片厚度为5mm或更小的假设。当CT扫描的切片厚度大于5mm时，可测量病变的最小尺寸应为切片厚度的两倍。
超音波检查：超音波在评估病变大小方面没有用，因此不应用作测量方法。如果在研究过程中通过超音波发现了新的病变，则建议通过CT或MRI进行确认。
内视镜、腹腔镜：不建议将所述技术用于客观肿瘤评估。
肿瘤标志物：单独的肿瘤标志物不能用于评估客观的肿瘤反应。
细胞学、组织学：如果方案要求，在极少数情况下，可以使用所述技术来区分PR和CR。
FDG PET-CT/CT扫描：大约每12周在淋巴瘤患者中进行一次，以确认CR或PD。
「靶标」和「非靶标」病变的基线记录
当基线时存在超过1个可测量的病变时，代表所有累及器官的共计最多5个病变(每个器官最多2个病变)的所有病变应被鉴定为靶标病变，并将在基线进行记录和测量。
根据靶标病变的大小(直径最长的病变)选择靶标病变，代表所有累及器官，并使其可再现重复测量。
淋巴结值得特别提到系因为它们系正常的解剖结构，即使没有肿瘤累及也可以通过成像看到。定义为可测量的并可能被鉴定为靶标病变的病理结节必须满足CT扫描短轴≥15mm的标准。仅所述结节的短轴构成基线和。所有其他病理结节(短轴≥10mm但<15mm的结节)均不应视为非靶标病变。短轴<10mm的结节被认为系非病理性的，不应记录或跟踪。
计算所有靶标病变的直径总和(非结节病变最长轴，淋巴结短轴)，并将其报告为基线直径和。基线直径和用作参考，以进一步表征疾病可测量范围内的任何客观肿瘤消退。
包括病理性淋巴结在内的所有其他病变(或疾病部位)均被鉴定为非靶标病变，并且也在基线时记录。不需要进行测量，所述病变以「存在」、「不存在」或「明确进展」进行跟踪。另外，有可能将与同一器官相关的多个非靶标病变记录为病例中的单一项目(例如，「多个盆腔淋巴结肿大」或「多个肝转移」)。
反应标准在表25中进行了描述。
[表25]-反应标准
Figure BDA0003173652780002181
缩略语：CR＝完全反应；PD＝疾病进展；PR＝部分反应；SD＝疾病稳定。
关于靶标病变评估的特别说明
识别为靶标病变的淋巴结始终记录实际的短轴测量值，并且在与基线检查相同的解剖平面中进行测量，即使在研究中所述淋巴结退化到10mm以下也是如此。这意味着当淋巴结被作为靶标病变时，即使满足CR标准，病变的「和」也可能不会为零，因为正常淋巴结的定义为短轴<10mm。对于PR、SD和PD，所述结节的实际短轴测量应包括在靶标病变的总和中。
变得「太小而无法测量」的靶标病变：在基线处记录的所有病变(淋巴结和非淋巴结)都应在每次后续评估中记录其实际测量值，即使很小(例如2mm)。但是，有时在基线CT扫描时被记录为靶标病变的病变或淋巴结变得非常微弱，以至于放射科医生可能不愿意分配精确的测量值，并且可能会将它们报告为「太小而无法测量」。发生这种情况时，在CRF上记录一个值很重要。如果放射科医生认为病变可能已经消失，则将测量记录为0mm。如果认为该病变存在并且隐约可见，但是太小而无法测量，则将分配5mm的默认值。
当非淋巴结病变「碎片化」时，将碎片部分的最长直径加在一起以计算靶标病变总和。类似地，当病变合并时，在它们之间保持一个平面，该平面将有助于获得每个单个病变的最大直径测量值。如果病变已真正合并，以致它们不再可分离，则在这种情况下，最长直径的向量就是「合并病变」的最大最长直径。
非靶标病变的评价
虽然一些非靶标病变可能是可测量的，但无需测量它们，而仅在方案中指定的时间点进行定性评估。
CR：所有非靶标病变消失，肿瘤标志物水平正常化。所有淋巴结都必须是非病理性的大小(短轴<10mm)。
非CR/非PD：1个或多个非靶标病变的持续存在和/或肿瘤标志物水平维持在正常范围以上。
疾病进展：现有非靶标病变的明确进展。(注意：出现1个或多个新病变也被视为进展)。
非靶标疾病进展的概念需要以下补充说明：
当参与者也有可测量的疾病时；在这种情况下，要达到基于非靶标疾病的「明确进展」，非靶标疾病的总体水平必须显著恶化，以使即使在靶标疾病中存在SD或PR的情况下，整体肿瘤负荷已经增加到需要中止疗法的水平。1个或多个非靶标病变的大小适度的「增加」通常不足以评定其明确的进展状态。
当参与者只有不可测量的疾病时；为了实现基于非靶标疾病的「明确进展」，必须使总体水平显著恶化，以使总体肿瘤负荷增加到需要中止疗法的水平。1个或多个非靶标病变的大小适度的「增加」通常不足以评定其明确的进展状态。由于非靶标疾病的恶化无法轻易量化(通过定义：如果所有病变都确实不可测量)，在评估患者的明确进展时可以应用的有用测试系考虑基于不可测量疾病的总体疾病负荷的增加在数量级上与宣布可测量疾病的PD所需的增加是否相当：也就是说，肿瘤负荷的增加表示「体积」增加了73％(相当于可测量病变的直径增加了20％)。实施例包括胸腔积液从「痕量」增加到「大量」，淋巴管疾病从局部增加到大范围，或者在方案中被描述为「足以要求疗法改变」。如果观察到「明确的进展」，则认为该患者当时总体PD。
新病变
新出现的恶性病变表示疾病进展。新病变的发现应系明确的：即，并非归因于扫描技术的差异，成像方式的变化或被认为代表肿瘤以外的其他病变的发现(例如，一些「新」骨病变可能只系愈合或原有病变的恶化)。当参与者的基线病变显示PR或CR时，这一点特别重要。例如，肝脏病变坏死可能在CT扫描报告中报告为「新的」囊性病变，而它并不是。
在随访研究中在基线时未扫描的解剖位置发现的病变被认为系新病变，表明疾病进展。这样的一个实施例系患者在基线时患有内脏疾病，并且在研究期间已安排了大脑CT或MRI，显示发生转移。即使参与者在基线时没有进行脑部影像学检查，也被认为构成PD。
如果一个新的病变系可疑的(例如由于其较小)，则继续疗法和后续评估可明确其是否代表新疾病。如果重复扫描确认存在新病变，则使用初始扫描的日期宣布进展。
尽管氟脱氧葡萄糖-正电子发射断层扫描(FDG-PET)反应评估需要进一步研究，但有时在评估进展(特别是可能的「新」疾病)时，结合FDG-PET扫描来补充CT扫描系合理的。根据以下算法鉴定基于FDG-PET成像的新病变：
A.基线时FDG-PET阴性，而随访时FDG-PET阳性是基于新病变的PD的体征。
B.基线时无FDG-PET，随访时FDG-PET呈阳性：
如果随访时FDG-PET阳性对应于通过CT确认的新疾病部位，则为PD。
如果在随访中未将阳性的FDG-PET在CT上确认为新病变，则需要进行附加随访CT扫描以确定该部位是否确实发生进展(如果系，则PD的日期将是首次异常FDG-PET扫描的日期)。如果在随访时FDG-PET阳性对应于CT上先存疾病部位，其根据解剖学影像尚未进展，则不是PD。
最佳总体反应的评价
时间点反应：应在方案指定的每个时间点进行反应评估。表26总结了基线时患有可测量疾病的患者在每个时间点的总体反应状态计算。
[表26]-靶标疾病患者的反应
Figure BDA0003173652780002201
Figure BDA0003173652780002211
缩略语：CR＝完全反应；PD＝疾病进展；PR＝部分反应；SD＝疾病稳定。
当患者仅具有不可测量的(因此为非靶标)疾病时，将使用表27。
[表27]-仅有非-靶标疾病的患者的反应
非靶标病变 新病变 总体反应
CR 否 CR
非CR/非PD 否 非CR/非PD
未全部评价 否 不可评价
明确的PD 是或否 PD
任何 是 PD
缩略语：CR＝完全反应；PD＝疾病进展；PR＝部分反应；SD＝疾病稳定。
缺少评估和不可评价的标定：如果在特定时间点根本不进行任何成像/测量，则该时间点的患者不可评价(NE)。
如果在评估时仅进行一个子集的病变测量，通常在该时间点也将这种情况视为NE，除非可以令人信服地论证这一个或多个单个缺失病变的贡献不会改变分配的时间点反应。对于PD，这种情况最有可能发生。如果在特定时间点根本不进行任何成像/测量，则该时间点的患者为NE。
如果在评估时仅进行一个子集的病变测量，通常在该时间点也将这种情况视为NE，除非可以令人信服地论证这一个或多个单个缺失病变的贡献不会改变分配的时间点反应。对于PD，这种情况最有可能发生。
关于反应评估的特别说明
当靶标病变的总和中包括结节病并且所述结节缩小至「正常」大小(<10mm)时，可能仍会在扫描中报告测量结果。即使结节系正常的，也要记录该测量结果，以免过分夸大进展(如果它是基于结节大小的增加)。如前所述，这意味着CR的患者在CRF上的总和可能不会为「零」。
在需要确认反应的试验中，重复的「NE」时间点评估可能会使最佳反应的确定更加复杂。该试验的分析计划必须解决在确定反应和进展时如何解决缺失的数据/评估。例如，在大多数试验中，将具有PR-NE-PR时间点反应的患者视为确认反应系合理的。
健康状况全面恶化而需要中止治疗而当时无疾病进展的客观证据的患者报告为「症状恶化」。即使中止治疗，也应尽一切努力记录客观进展。有症状的恶化不是客观反应的描述语：它系停止研究疗法的原因。
通过评价靶标疾病和非靶标疾病来确定此类患者的客观反应状态。对于进展的可疑的发现(例如，非常小的和不确定的新病变；囊性变化或现有病变的坏死)，治疗可能会继续到下一次计划的评估。如果在下一次计划的评估中确认进展，则进展日期系怀疑进展的较早日期。
反应持续时间
从首次满足CR/PR的测量标准(以最先记录的为准)到客观记录复发或PD的第一个日期(在研究时将记录的最小测量值作为PD的参考)的时间，测量总体反应的持续时间。
从首次满足CR的测量标准直到客观记录疾病复发的第一个日期，一直测量总CR的持续时间。
从治疗开始到达到进展标准为止，测量疾病稳定，在研究时将最小和作为参考(如果基线和最小，则这系计算PD的参考)。
与RECIST指南有关的非限制性描述参见Eisenhauer EA,Therasse P,Bogaerts J等人New response evaluation criteria in solid tumours:Revised RECISTguideline(version 1.1).[新实体瘤反应评价标准：修订的RECIST指南(1.1版)]Eur JCancer.[欧洲癌症杂志]2009；45:228-47，其全部内容通过引用并入本申请。
实施例1.15-实体瘤中基于免疫的治疗的改良的反应评价标准
详细信息参见Seymour L,Bogaerts J,Perrone A,Ford R,Schwartz LH,Mandrekar S等人iRECIST:guidelines for response criteria for use in trialstesting immunotherapeutics.[iRECIST:测试免疫治疗的试验中反应标准指南]LancetOncol.[柳叶刀肿瘤学]2017年3月；18(3):e143-52。
[表28]-实体瘤反应评价标准(RECIST)1.1与改良的基于免疫的疗法中实体瘤反应评估标准(iRECIST)的比较
Figure BDA0003173652780002231
Figure BDA0003173652780002241
「i」表示使用iRECIST分配的免疫反应。
缩略语：iCPD＝确认进展；iCR＝完全反应；iPR＝部分反应；iSD＝疾病稳定；iUPD＝未确认的进展；RECIST＝实体瘤反应评价标准
[表29]-使用改良的基于免疫的疗法中实体瘤反应评价标准(iRECIST)对时间点反应的评估
Figure BDA0003173652780002242
Figure BDA0003173652780002251
a先前在此时间点之前的评估中确定。
「i」表示使用根据RECIST 1.1原则定义的iRECIST靶标病变、非靶标病变和新病变分配的免疫反应；如果未发生伪进展，则完全反应、部分反应和疾病稳定的RECIST 1.1和iRECIST类别将相同。
缩略语：iCPD＝确认进展；iCR＝完全反应；iPR＝部分反应；iSD＝疾病稳定；iUPD＝未确认的进展；非iCR/非iUPD＝CR和PD标准均未满足；RECIST＝实体瘤反应评价标准。
[表30]-东部肿瘤协作组体能状态量表
Figure BDA0003173652780002252
Figure BDA0003173652780002261
由东部肿瘤协作组开发，Robert L.Comis，医学博士，协作组主席。
[表31]-皮肤黑色素瘤TNM分期(AJCC癌症分期第8版)
Figure BDA0003173652780002262
Figure BDA0003173652780002271
a前哨或选择性淋巴结清扫术后被诊断为临床上隐匿性。
b临床上检测到的定义为经治疗性淋巴结清扫术确认的或当淋巴结转移表现出明显的囊外扩张时临床上可检测到的淋巴结转移。
来源：改编自Gershenwald JE,Scolyer RA,Hess KR等人Melanoma of the skin.[皮肤黑色素瘤]于:Amin MB编AJCC[美国癌症联合委员会]Cancer Staging Manual.[癌症分期手册],第8版,芝加哥,伊利诺斯州:AJCC-Springer[施普林格]；2017:563-585。
[表32]-黑色素瘤分期/预后组-IIIB期及以上
Figure BDA0003173652780002272
Figure BDA0003173652780002281
来源：改编自Gershenwald JE,Scolyer RA,Hess KR等人Melanoma of the skin.[皮肤黑色素瘤]于:Amin MB编AJCC[美国癌症联合委员会]Cancer Staging Manual.[癌症分期手册],第8版,芝加哥,伊利诺斯州:AJCC-Springer[施普林格]；2017:563-585。
Figure DA00031736527840572094
疾病反应将使用卢加诺分类2014(Cheson BD等人(2014)J.Clinical Oncology[临床肿瘤学杂志]32(27)3059-3068)进行评估。在筛选时和每12周(±7天)进行一次反应评估。
[表33]-疾病评估与卢加诺分类
Figure BDA0003173652780002282
Figure BDA0003173652780002291
Figure BDA0003173652780002301
Figure BDA0003173652780002311
Figure BDA0003173652780002321
成像时间应遵循日历天，并且不应因周期延迟而进行调整。对于因PD以外的其他原因中止治疗的参与者，评估应继续进行，直到参与者记录了PD。如果研究者认为参与者发生临床进展，可以早于12周进行首次评估。
[表34]-缩写
Figure BDA0003173652780002322
Figure BDA0003173652780002331
实施例2-患有获得性抗PD1抗性肿瘤的小鼠中的抗肿瘤活性
获得性抗PD1疗法抗性的小鼠模型
对抗PD-1抗体治疗显示出获得性抗性的小鼠肿瘤模型主要如下产生。另请参见，Dunn等人(2002)Nature Immunology[自然免疫学]3:991-998；和Wang X等人.(2017)Cancer Res[癌症研究]77(4):839-850。对携带MC38肿瘤的雌性C57BL6/J小鼠(杰克逊实验室(Jackson Laboratory)，美国缅因州冷泉港)用抗PD-1抗体(殖株RMP1-14；在Yamazaki等人(2005)JImmunol[免疫学杂志]175(3):1586-1592方法中首次描述)治疗，切除生长中的肿瘤，用添加10％FBS的含L-麸酰胺酸(生命技术公司(Life Technologies))的RPMI-1640离体培养细胞。将6至8周大的雌性C57BL6/J小鼠饲养在温度受控的环境中，光照周期为12小时，可以自由获取食物和无菌水。实验前，使所有小鼠适应环境至少3天。如果测量，则体重和肿瘤体积每周测量两次，直到实验终点。肿瘤体积用以下公式表示为垂直直径的乘积：a2*b/2，其中a<b。
对于图2A-3，将一百万个MC38或MC38抗性细胞悬浮在200μlDPBS中，并皮下注射到每只小鼠的右胁腹中。
体内药物施用
从肿瘤达到60mm3的平均值开始，每四天(Q4D)每个肿瘤以50μl中40μg瘤内(IT)注射施用四个剂量的小鼠细胞介素mRNA混合物或对照的编码荧光素酶的mRNA(Luc mRNA)。每周两次测量小鼠体重和肿瘤体积直至实验终点。使用以下公式将肿瘤体积表示为垂直直径的乘积：a2*b/2，其中a<b。所有程序均由机构动物护理和使用委员会批准，并按照NIHGuide for the Care and Use of Laboratory Animals[NIH实验动物的护理和使用指南]进行。
mRNA的制备
将编码目的基因的合成DNA片段选殖到一个共同的起始载体中，该起始载体包含5'非翻译区(UTR)和3'UTR，3'UTR和总共110个核苷酸的多聚A尾。质体DNA的线性化系在聚(dA:dT)下游用IIS类限制性内切酶生成模板进行的，该模板没有超过聚(dA:dT)的额外核苷酸(参见，例如，Holtkamp等人(2006)Blood[血液]12月15日；108(13):4009-17)。将线性化的质体DNA通过T7 RNA聚合酶(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)进行体外转录，按Grudzien-Nogalska等人(2013)Methods Mol Bio.[分子生物学方法]969:55-72所述，在存在7.5mM的ATP、CTP、GTP和N1-甲基-伪尿苷三磷酸的情况下进行。利用磁性粒子纯化RNA(Berensmeier S.(2006)Applied Microbiology andBiotechnology[应用微生物学与生物技术]73(3):495-504)，随后使用痘苗加帽是统(新英格兰生物实验室(New England Biolabs)，伊普斯维奇，马萨诸塞州，美国)和mRNA帽的2'-O-甲基化引入Cap1结构。利用基于纤维素的层析法进一步纯化该RNA以去除双股RNA(dsRNA)杂质(参见Day PR等人(1977)Phytopathology[植物病理学]67:1393；Morris TJ等人(1979)Phytopathology[植物病理学]69:854-858；以及Castillo A等人(2011)Virol J.[病毒学杂志]8:38)。用分光亮度法和毛细管电泳系统测定RNA浓度和质量。用dsRNA特异性J2单株抗体(英语与科技咨询公司(English&Scientific Consulting)，KFt.Szirák，匈牙利)在西北斑点杂交测定中评估dsRNA的存在，如Karikó等人(2011)Nucleic Acids Res.[核酸研究]11月；39(21):e142所述。
结果
已经确定了对检查点阻断的先天性和获得性抗性的几种机制，包括MHC I和IFNγ传讯通路的突变。参见，例如，Sharma等人(2017)Cell[细胞]168(4):707-723；Sade-Feldman M等人(2017)Nat Commun[自然通讯]8(1):1136；Zaretsky JM等人(2016)N EnglJ Med[新英格兰医学杂志]375(9):819-29；Gettinger S.等人(2017)7(12):1420-1435；Rodig SJ等人(2018)Sci Transl Med[科学·转化医学]10(450)。但是，此类突变发生在患者的频率较低，因此尚需确定其他机制。为了更好地了解对检查点阻断的获得性抗性，我们生成了小鼠肿瘤模型，该模型对抗PD-1抗体治疗表现出体内抗性。体内连续传代后，MC38肿瘤获得了对PD-1阻断的抗性(图2A、B)。对PD-1阻断缺乏敏感性并非归因于PD-L1或B2M表现的失调，因为两者在亲本和抗性细胞中均以相似的水平表现(图2C)。类似地，IFNγ传讯与抗原加工和呈递途径在亲本和抗性细胞系中均起作用(图2D、2E)。使用无偏基因表现分析进一步表征潜在的抗性机制。RNA定序揭示，PD-1抗性肿瘤的总体基因表现存在显著差异，展示相对于亲本MC38肿瘤，免疫相关基因的表现显著降低(图2F、2G)。实际上，PD-1抗性肿瘤在包括T细胞和NK细胞在内的多种细胞类型中均表现出降低的免疫浸润(图2H、2I)。
对该模型进行了进一步的验证，结果显示于图3-5中。简而言之，MC38抗性细胞经证明不表现PD-L2，并且在IFNγ治疗后未诱导表现(图3)。免疫组织化学染色显示抗性肿瘤中免疫细胞的频率降低(图4A)。通过免疫组织化学染色分析了石蜡包埋的MC38和MC38抗性肿瘤对CD45+细胞(深色)的浸润。结果代表了两个独立的实验；n＝10个肿瘤/组。图4A示出了代表性图像。图4B示出了定量。图5A-5B显示抗性肿瘤的免疫原性降低。简而言之，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)培养物系从携带亲本MC38肿瘤的5只个体C57BL6小鼠中产生的，所述小鼠表现出对PD-1阻断的反应完全消退。将CTL与MC38和抗性肿瘤细胞共培养，并测量杀伤(图5A)和IFNγ释放(图5B)。
使用该经过验证的模型，将细胞介素RNA混合物作为单一疗法进行瘤内施用。与对照相比，鼠细胞介素RNA混合物的单一疗法抑制了MC38和MC38抗性肿瘤的生长。参见图6A-6D。鼠细胞介素RNA混合物的单一疗法还显著延长了患有MC38和MC38抗性肿瘤的小鼠的生存期。参见图7。八只中的五只(62.5％)患有MC38肿瘤的小鼠(图6B)和八只中的三只(37.5％)患有MC38抗性肿瘤的小鼠(图6D)在实验结束时肿瘤完全缓解且无肿瘤。另请参见图7。
实施例3-患有抗PD1抗性肿瘤的小鼠中的抗肿瘤活性
抗PD1疗法抗性的小鼠模型
将S.A.Rosenberg博士(美国国立卫生研究院，美国马里兰州贝塞斯达)赠予的MC38细胞在含有10％FBS的L-麸酰胺酸(生命技术公司)的RPMI-1640中培养。通常，对于单侧腹肿瘤模型，将MC38细胞悬浮在DPBS中，并将200μl的1x106个细胞SC植入C57BL/6J小鼠的右胁腹中。通常，对于双侧腹肿瘤MC38模型，在第0天SC右侧植入1x106个细胞且左侧植入0.5x106个细胞。
为了生成抗PD-1疗法抗性的体内肿瘤模型，使用sgRNA5'-GGCGTATGTATCAGTCTCAG-3'(SEQ ID NO:41)，通过CRISPR产生了MC38-B2M-敲除细胞。根据制造商的说明，将MC38细胞用预先复合的Cas9和sgRNA(GeneArtTMPlatinumTMCas9核酸酶V.2；赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))进行瞬时转染(LipofectamineTMCRISPRMAXTM；赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)。使用MACS技术(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec)，德国贝尔吉施格拉德巴赫)富集B2M-/-细胞，然后分离单细胞集落并通过流式细胞分析技术确认敲除。
体内药物施用
通过瘤内注射施用细胞介素RNA混合物。除非另有详细说明，否则每4天用异氟烷麻醉小鼠，并将盐水溶液中50μl mRNA中80μg瘤内(IT)注射到右侧肿瘤，共注射4剂。除非另有说明，否则从BioXCell(美国新罕布什尔州西莱巴嫩)获得抗体，并通过IP注射施用。对照(MOPC-21)和抗PD-1(RMP1-14)以5mg/kg的剂量每三天(Q3D)施用一次。
结果
为了研究细胞介素mRNA治疗在检查点抗性环境中的治疗效果，在MC38细胞中将B2M基因缺失(图8)，这导致了对抗PD-1治疗的体内抗性(图9C)，而携带亲本肿瘤的小鼠仍然对抗PD-1疗法有部分反应(图9B)。单独使用细胞介素RNA混合物治疗可以使携带B2M基因敲除肿瘤的动物的生存期延长，而通过将细胞介素mRNA与抗PD-1检查点阻断相组合，未观察到生存率的进一步提高(图9C)。
为了模拟通常在人类恶性肿瘤中观察到的肿瘤间异质性，建立了双侧环境，一侧为MC38-B2M敲除肿瘤，对侧为MC38-WT肿瘤(图9D)。向MC38-B2M基因敲除肿瘤注射细胞介素RNA混合物，而对侧MC38-WT肿瘤则不予治疗。单独使用抗PD-1疗法进行的治疗对携带肿瘤的小鼠的存活没有影响，而单独使用细胞介素RNA混合物可以延长生存期，尽管所有小鼠最终都死于了肿瘤负荷(图9D)。在这种环境下，组合疗法可进一步提高总体生存率，这表明即使由于缺乏MHC I表现而使所治疗的病变对T细胞介导的杀伤具有抗性，用细胞介素RNA混合物和抗PD-1抗体组合治疗具有远位效应(图9D)。
实施例4-在另外的鼠模型中的抗肿瘤活性。
材料和方法
在37℃下空气中含5％CO2的大气中，用不同的培养基(如下所示)在体外维持了十二个同系细胞系。肿瘤细胞将常规每周两次传代培养。收获处于指数生长期的细胞，并对肿瘤接种量计数。用0.1mL PBS中的肿瘤细胞皮下接种每只小鼠以使肿瘤发展。接种肿瘤细胞后，每天检查动物的发病率和死亡率。在常规监测期间，检查动物的肿瘤生长和治疗对行为的影响，诸如活动性、食物和水的消耗、体重增加/减少(体重在随机分组后每周两次进行测量)、眼/毛发脱落和任何其他异常。详细记录个体动物的死亡率和观察到的临床体征。随机分组后，每周两次用卡尺测量二维肿瘤体积，体积用mm3表示，公式如下：V＝(L x W x W)/2，其中V系肿瘤体积，L系肿瘤长度(最长的肿瘤尺寸)，W系肿瘤宽度(垂直于L的最长肿瘤尺寸)。在层流柜中进行给药以及肿瘤和体重的测量。使用StudyDirectorTM软件(版本3.1.399.19)测量体重和肿瘤体积。
[表35].培养基和细胞系信息
Figure BDA0003173652780002381
[表36].研究设计
Figure BDA0003173652780002391
结果
为了进一步了解肿瘤异质性的影响，测试了十二个小鼠模型对细胞介素mRNA混合物或与抗PD-1抗体组合治疗的敏感性。与单独的抗PD1抗体相比，大多数肿瘤类型对单药mRNA疗法具有敏感性。此外，所有模型均显示出在用细胞介素mRNA与抗PD1组合治疗后肿瘤生长减速(图10)，进一步突显了编码细胞介素的局部mRNA疗法的多功能性。
序列表
<110> 赛诺菲公司（SANOFI）
<120> 用于晚期实体瘤癌症的治疗性RNA及抗PD1抗体
<130> 01183-0031-00PCT
<150> US 62/794,896
<151> 2019-01-21
<150> US 62/926,379
<151> 2019-10-25
<150> EP 19306471.4
<151> 2019-11-14
<160> 41
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<400> 1
000
<210> 2
<400> 2
000
<210> 3
<211> 145
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：5 UTR (DNA)
<400> 3
ggaataaact agtctcaaca caacatatac aaaacaaacg aatctcaagc aatcaagcat 60
tctacttcta ttgcagcaat ttaaatcatt tcttttaaag caaaagcaat tttctgaaaa 120
ttttcaccat ttacgaacga tagcc 145
<210> 4
<211> 145
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：5 UTR (RNA)
<400> 4
ggaauaaacu agucucaaca caacauauac aaaacaaacg aaucucaagc aaucaagcau 60
ucuacuucua uugcagcaau uuaaaucauu ucuuuuaaag caaaagcaau uuucugaaaa 120
uuuucaccau uuacgaacga uagcc 145
<210> 5
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：替代性的Mod 5 UTR (DNA)
<400> 5
agacgaacta gtattcttct ggtccccaca gactcagaga gaacccgcca cc 52
<210> 6
<211> 52
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：替代性的Mod 5 UTR (RNA)
<400> 6
agacgaacua guauucuucu gguccccaca gacucagaga gaacccgcca cc 52
<210> 7
<211> 317
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：3 UTR (DNA)
<400> 7
ctcgagctgg tactgcatgc acgcaatgct agctgcccct ttcccgtcct gggtaccccg 60
agtctccccc gacctcgggt cccaggtatg ctcccacctc cacctgcccc actcaccacc 120
tctgctagtt ccagacacct cccaagcacg cagcaatgca gctcaaaacg cttagcctag 180
ccacaccccc acgggaaaca gcagtgatta acctttagca ataaacgaaa gtttaactaa 240
gctatactaa ccccagggtt ggtcaatttc gtgccagcca caccgagacc tggtccagag 300
tcgctagccg cgtcgct 317
<210> 8
<211> 317
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：3 UTR (RNA)
<400> 8
cucgagcugg uacugcaugc acgcaaugcu agcugccccu uucccguccu ggguaccccg 60
agucuccccc gaccucgggu cccagguaug cucccaccuc caccugcccc acucaccacc 120
ucugcuaguu ccagacaccu cccaagcacg cagcaaugca gcucaaaacg cuuagccuag 180
ccacaccccc acgggaaaca gcagugauua accuuuagca auaaacgaaa guuuaacuaa 240
gcuauacuaa ccccaggguu ggucaauuuc gugccagcca caccgagacc ugguccagag 300
ucgcuagccg cgucgcu 317
<210> 9
<400> 9
000
<210> 10
<400> 10
000
<210> 11
<400> 11
000
<210> 12
<400> 12
000
<210> 13
<400> 13
000
<210> 14
<211> 539
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(539)
<223> 人IL-12sc（氨基酸）
<400> 14
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
325 330 335
Pro Gly Gly Gly Ser Ser Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro
340 345 350
Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val
355 360 365
Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys
370 375 380
Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser
385 390 395 400
Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys
405 410 415
Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala
420 425 430
Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr
435 440 445
Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys
450 455 460
Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu
465 470 475 480
Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr
485 490 495
Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys
500 505 510
Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr
515 520 525
Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser
530 535
<210> 15
<211> 1623
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1623)
<223> 人未优化的IL-12sc (CDS DNA)
<400> 15
atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60
gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120
gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180
accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240
gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300
ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360
aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420
acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480
gggtcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540
agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600
gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660
gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac 720
ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780
acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840
agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900
cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc 960
gaatgggcat ctgtgccctg cagtggctct agcggagggg gaggctctcc tggcggggga 1020
tctagcagaa acctccccgt ggccactcca gacccaggaa tgttcccatg ccttcaccac 1080
tcccaaaacc tgctgagggc cgtcagcaac atgctccaga aggccagaca aactctagaa 1140
ttttaccctt gcacttctga ggaaattgat catgaagata tcacaaaaga taaaaccagc 1200
acagtggagg cctgtttacc attggaatta accaagaatg agagttgcct aaattccaga 1260
gagacctctt tcataactaa tgggagttgc ctggcctcca gaaagacctc ttttatgatg 1320
gccctgtgcc ttagtagtat ttatgaagac ttgaagatgt accaggtgga gttcaagacc 1380
atgaatgcaa agcttctgat ggatcctaag aggcagatct ttctagatca aaacatgctg 1440
gcagttattg atgagctgat gcaggccctg aatttcaaca gtgagactgt gccacaaaaa 1500
tcctcccttg aagaaccgga tttttataaa actaaaatca agctctgcat acttcttcat 1560
gctttcagaa ttcgggcagt gactattgat agagtgatga gctatctgaa tgcttcctga 1620
tga 1623
<210> 16
<211> 1623
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1623)
<223> 人优化的IL-12sc (CDS DNA)
<400> 16
atgtgtcacc agcagctggt gatctcatgg ttctccctgg tatttctggc atctcctctt 60
gtcgcaatct gggaactgaa gaaagacgtg tatgtcgttg agctcgactg gtatccggat 120
gcgcctggcg agatggtggt gctgacctgt gacaccccag aggaggatgg gatcacttgg 180
acccttgatc aatcctccga agtgctcggg tctggcaaga ctctgaccat acaagtgaaa 240
gagtttggcg atgccgggca gtacacttgc cataagggcg gagaagttct gtcccactca 300
ctgctgctgc tgcacaagaa agaggacgga atttggagta ccgatatcct gaaagatcag 360
aaagagccca agaacaaaac cttcttgcgg tgcgaagcca agaactactc agggagattt 420
acttgttggt ggctgacgac gatcagcacc gatctgactt tctccgtgaa atcaagtagg 480
ggatcatctg accctcaagg agtcacatgt ggagcggcta ctctgagcgc tgaacgcgta 540
agaggggaca ataaggagta cgagtatagc gttgagtgcc aagaggatag cgcatgcccc 600
gccgccgaag aatcattgcc cattgaagtg atggtggatg ctgtacacaa gctgaagtat 660
gagaactaca caagctcctt cttcatccgt gacatcatca aaccagatcc tcctaagaac 720
ctccagctta aacctctgaa gaactctaga caggtggaag tgtcttggga gtatcccgac 780
acctggtcta caccacattc ctacttcagt ctcacattct gcgttcaggt acagggcaag 840
tccaaaaggg agaagaagga tcgggtcttt acagataaaa caagtgccac cgttatatgc 900
cggaagaatg cctctatttc tgtgcgtgcg caggacagat actatagcag ctcttggagt 960
gaatgggcca gtgtcccatg ttcagggtca tccggtggtg gcggcagccc cggaggcggt 1020
agctccagaa atctccctgt ggctacacct gatccaggca tgtttccctg tttgcaccat 1080
agccaaaacc tcctgagagc agtcagcaac atgctccaga aagctagaca aacactggaa 1140
ttctacccat gcacctccga ggaaatagat cacgaggata tcactaagga caaaacaagc 1200
actgtcgaag catgccttcc cttggaactg acaaagaacg agagttgcct taattcaaga 1260
gaaacatctt tcattacaaa cggtagctgc ttggcaagca gaaaaacatc ttttatgatg 1320
gccctttgtc tgagcagtat ttatgaggat ctcaaaatgt accaggtgga gtttaagacc 1380
atgaatgcca agctgctgat ggacccaaag agacagattt tcctcgatca gaatatgctg 1440
gctgtgattg atgaactgat gcaggccttg aatttcaaca gcgaaaccgt tccccagaaa 1500
agcagtcttg aagaacctga cttttataag accaagatca aactgtgtat tctcctgcat 1560
gcctttagaa tcagagcagt cactatagat agagtgatgt cctacctgaa tgcttcctga 1620
tga 1623
<210> 17
<211> 1623
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1623)
<223> 人未优化的IL-12sc（编码CDS的RNA）
<400> 17
augugucacc agcaguuggu caucucuugg uuuucccugg uuuuucuggc aucuccccuc 60
guggccauau gggaacugaa gaaagauguu uaugucguag aauuggauug guauccggau 120
gccccuggag aaaugguggu ccucaccugu gacaccccug aagaagaugg uaucaccugg 180
accuuggacc agagcaguga ggucuuaggc ucuggcaaaa cccugaccau ccaagucaaa 240
gaguuuggag augcuggcca guacaccugu cacaaaggag gcgagguucu aagccauucg 300
cuccugcugc uucacaaaaa ggaagaugga auuuggucca cugauauuuu aaaggaccag 360
aaagaaccca aaaauaagac cuuucuaaga ugcgaggcca agaauuauuc uggacguuuc 420
accugcuggu ggcugacgac aaucaguacu gauuugacau ucagugucaa aagcagcaga 480
gggucuucug acccccaagg ggugacgugc ggagcugcua cacucucugc agagagaguc 540
agaggggaca acaaggagua ugaguacuca guggagugcc aggaggacag ugccugccca 600
gcugcugagg agagucugcc cauugagguc augguggaug ccguucacaa gcucaaguau 660
gaaaacuaca ccagcagcuu cuucaucagg gacaucauca aaccugaccc acccaagaac 720
uugcagcuga agccauuaaa gaauucucgg cagguggagg ucagcuggga guacccugac 780
accuggagua cuccacauuc cuacuucucc cugacauucu gcguucaggu ccagggcaag 840
agcaagagag aaaagaaaga uagagucuuc acggacaaga ccucagccac ggucaucugc 900
cgcaaaaaug ccagcauuag cgugcgggcc caggaccgcu acuauagcuc aucuuggagc 960
gaaugggcau cugugcccug caguggcucu agcggagggg gaggcucucc uggcggggga 1020
ucuagcagaa accuccccgu ggccacucca gacccaggaa uguucccaug ccuucaccac 1080
ucccaaaacc ugcugagggc cgucagcaac augcuccaga aggccagaca aacucuagaa 1140
uuuuacccuu gcacuucuga ggaaauugau caugaagaua ucacaaaaga uaaaaccagc 1200
acaguggagg ccuguuuacc auuggaauua accaagaaug agaguugccu aaauuccaga 1260
gagaccucuu ucauaacuaa ugggaguugc cuggccucca gaaagaccuc uuuuaugaug 1320
gcccugugcc uuaguaguau uuaugaagac uugaagaugu accaggugga guucaagacc 1380
augaaugcaa agcuucugau ggauccuaag aggcagaucu uucuagauca aaacaugcug 1440
gcaguuauug augagcugau gcaggcccug aauuucaaca gugagacugu gccacaaaaa 1500
uccucccuug aagaaccgga uuuuuauaaa acuaaaauca agcucugcau acuucuucau 1560
gcuuucagaa uucgggcagu gacuauugau agagugauga gcuaucugaa ugcuuccuga 1620
uga 1623
<210> 18
<211> 1623
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1623)
<223> 人优化的IL-12sc（编码CDS的RNA）
<400> 18
augugucacc agcagcuggu gaucucaugg uucucccugg uauuucuggc aucuccucuu 60
gucgcaaucu gggaacugaa gaaagacgug uaugucguug agcucgacug guauccggau 120
gcgccuggcg agaugguggu gcugaccugu gacaccccag aggaggaugg gaucacuugg 180
acccuugauc aauccuccga agugcucggg ucuggcaaga cucugaccau acaagugaaa 240
gaguuuggcg augccgggca guacacuugc cauaagggcg gagaaguucu gucccacuca 300
cugcugcugc ugcacaagaa agaggacgga auuuggagua ccgauauccu gaaagaucag 360
aaagagccca agaacaaaac cuucuugcgg ugcgaagcca agaacuacuc agggagauuu 420
acuuguuggu ggcugacgac gaucagcacc gaucugacuu ucuccgugaa aucaaguagg 480
ggaucaucug acccucaagg agucacaugu ggagcggcua cucugagcgc ugaacgcgua 540
agaggggaca auaaggagua cgaguauagc guugagugcc aagaggauag cgcaugcccc 600
gccgccgaag aaucauugcc cauugaagug augguggaug cuguacacaa gcugaaguau 660
gagaacuaca caagcuccuu cuucauccgu gacaucauca aaccagaucc uccuaagaac 720
cuccagcuua aaccucugaa gaacucuaga cagguggaag ugucuuggga guaucccgac 780
accuggucua caccacauuc cuacuucagu cucacauucu gcguucaggu acagggcaag 840
uccaaaaggg agaagaagga ucgggucuuu acagauaaaa caagugccac cguuauaugc 900
cggaagaaug ccucuauuuc ugugcgugcg caggacagau acuauagcag cucuuggagu 960
gaaugggcca gugucccaug uucaggguca uccgguggug gcggcagccc cggaggcggu 1020
agcuccagaa aucucccugu ggcuacaccu gauccaggca uguuucccug uuugcaccau 1080
agccaaaacc uccugagagc agucagcaac augcuccaga aagcuagaca aacacuggaa 1140
uucuacccau gcaccuccga ggaaauagau cacgaggaua ucacuaagga caaaacaagc 1200
acugucgaag caugccuucc cuuggaacug acaaagaacg agaguugccu uaauucaaga 1260
gaaacaucuu ucauuacaaa cgguagcugc uuggcaagca gaaaaacauc uuuuaugaug 1320
gcccuuuguc ugagcaguau uuaugaggau cucaaaaugu accaggugga guuuaagacc 1380
augaaugcca agcugcugau ggacccaaag agacagauuu uccucgauca gaauaugcug 1440
gcugugauug augaacugau gcaggccuug aauuucaaca gcgaaaccgu uccccagaaa 1500
agcagucuug aagaaccuga cuuuuauaag accaagauca aacuguguau ucuccugcau 1560
gccuuuagaa ucagagcagu cacuauagau agagugaugu ccuaccugaa ugcuuccuga 1620
uga 1623
<210> 19
<211> 188
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(188)
<223> 人IFN-α-2b（氨基酸）
<400> 19
Met Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Ala Leu Leu Val Leu Ser Cys
1 5 10 15
Lys Ser Ser Cys Ser Val Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu
20 25 30
Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser
35 40 45
Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu
50 55 60
Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His
65 70 75 80
Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser
85 90 95
Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr
100 105 110
Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val
115 120 125
Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys
130 135 140
Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro
145 150 155 160
Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu
165 170 175
Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu
180 185
<210> 20
<211> 570
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(570)
<223> 人未优化的IFN-α-2b (CDS DNA)
<400> 20
atggccttga cctttgcttt actggtggcc ctcctggtgc tcagctgcaa gtcaagctgc 60
tctgtgggct gtgatctgcc tcaaacccac agcctgggta gcaggaggac cttgatgctc 120
ctggcacaga tgaggagaat ctctcttttc tcctgcttga aggacagaca tgactttgga 180
tttccccagg aggagtttgg caaccagttc caaaaggctg aaaccatccc tgtcctccat 240
gagatgatcc agcagatctt caaccttttc agcacaaagg actcatctgc tgcttgggat 300
gagaccctcc tagacaaatt ctacactgaa ctctaccagc agctgaatga cctggaagcc 360
tgtgtgatac agggggtggg ggtgacagag actcccctga tgaaggagga ctccattctg 420
gctgtgagga aatacttcca aagaatcact ctctatctga aagagaagaa atacagccct 480
tgtgcctggg aggttgtcag agcagaaatc atgagatctt tttctttgtc aacaaacttg 540
caagaaagtt taagaagtaa ggaatgatga 570
<210> 21
<211> 570
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(570)
<223> 人优化的IFN-α-2b (CDS DNA)
<400> 21
atggccctga cttttgccct tctcgtggct ttgttggtgc tgagttgcaa atcttcctgt 60
agtgtcggat gtgatctgcc tcaaacccac agtctgggat ctaggagaac actgatgctg 120
ttggcacaga tgaggagaat tagcctcttt tcctgcctga aggatagaca tgacttcggc 180
tttccccaag aggagtttgg caatcagttc cagaaagcgg aaacgattcc cgttctgcac 240
gagatgatcc agcagatctt caacctcttt tcaaccaaag acagctcagc agcctgggat 300
gagacactgc tggacaaatt ctacacagaa ctgtatcagc agcttaacga tctggaggca 360
tgcgtgatcc aaggggttgg tgtgactgaa actccgctta tgaaggagga ctccattctg 420
gctgtacgga agtacttcca gagaataacc ctctatctga aggagaagaa gtactcacca 480
tgtgcttggg aagtcgtgag agccgaaatc atgagatcct tcagccttag caccaatctc 540
caggaatctc tgagaagcaa agagtgatga 570
<210> 22
<211> 570
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(570)
<223> 人未优化的IFN-α-2b（编码CDS的RNA）
<400> 22
auggccuuga ccuuugcuuu acugguggcc cuccuggugc ucagcugcaa gucaagcugc 60
ucugugggcu gugaucugcc ucaaacccac agccugggua gcaggaggac cuugaugcuc 120
cuggcacaga ugaggagaau cucucuuuuc uccugcuuga aggacagaca ugacuuugga 180
uuuccccagg aggaguuugg caaccaguuc caaaaggcug aaaccauccc uguccuccau 240
gagaugaucc agcagaucuu caaccuuuuc agcacaaagg acucaucugc ugcuugggau 300
gagacccucc uagacaaauu cuacacugaa cucuaccagc agcugaauga ccuggaagcc 360
ugugugauac aggggguggg ggugacagag acuccccuga ugaaggagga cuccauucug 420
gcugugagga aauacuucca aagaaucacu cucuaucuga aagagaagaa auacagcccu 480
ugugccuggg agguugucag agcagaaauc augagaucuu uuucuuuguc aacaaacuug 540
caagaaaguu uaagaaguaa ggaaugauga 570
<210> 23
<211> 570
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(570)
<223> 人优化的IFN-α-2b（编码CDS的RNA）
<400> 23
auggcccuga cuuuugcccu ucucguggcu uuguuggugc ugaguugcaa aucuuccugu 60
agugucggau gugaucugcc ucaaacccac agucugggau cuaggagaac acugaugcug 120
uuggcacaga ugaggagaau uagccucuuu uccugccuga aggauagaca ugacuucggc 180
uuuccccaag aggaguuugg caaucaguuc cagaaagcgg aaacgauucc cguucugcac 240
gagaugaucc agcagaucuu caaccucuuu ucaaccaaag acagcucagc agccugggau 300
gagacacugc uggacaaauu cuacacagaa cuguaucagc agcuuaacga ucuggaggca 360
ugcgugaucc aagggguugg ugugacugaa acuccgcuua ugaaggagga cuccauucug 420
gcuguacgga aguacuucca gagaauaacc cucuaucuga aggagaagaa guacucacca 480
ugugcuuggg aagucgugag agccgaaauc augagauccu ucagccuuag caccaaucuc 540
caggaaucuc ugagaagcaa agagugauga 570
<210> 24
<211> 241
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(241)
<223> 人IL-15 sushi（氨基酸）
<400> 24
Met Ala Pro Arg Arg Ala Arg Gly Cys Arg Thr Leu Gly Leu Pro Ala
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Pro Pro Ala Thr Arg Gly Ile Thr
20 25 30
Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser
35 40 45
Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys
50 55 60
Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala
65 70 75 80
Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp
85 90 95
Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Gln Asn
115 120 125
Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln
130 135 140
Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro
145 150 155 160
Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val
165 170 175
Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn
180 185 190
Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr
195 200 205
Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys
210 215 220
Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr
225 230 235 240
Ser
<210> 25
<211> 729
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(729)
<223> 人IL-15 sushi (CDS DNA)
<400> 25
atggccccgc ggcgggcgcg cggctgccgg accctcggtc tcccggcgct gctactgctg 60
ctgctgctcc ggccgccggc gacgcggggc atcacgtgcc ctccccccat gtccgtggaa 120
cacgcagaca tctgggtcaa gagctacagc ttgtactcca gggagcggta catttgtaac 180
tctggtttca agcgtaaagc cggcacgtcc agcctgacgg agtgcgtgtt gaacaaggcc 240
acgaatgtcg cccactggac aacccccagt ctcaaatgca ttagagaccc tgccctggtt 300
caccaaaggc cagcgccacc cgggggagga tctggcggcg gtgggtctgg cgggggatct 360
ggcggaggag gaagcttaca gaactgggtg aatgtaataa gtgatttgaa aaaaattgaa 420
gatcttattc aatctatgca tattgatgct actttatata cggaaagtga tgttcacccc 480
agttgcaaag taacagcaat gaagtgcttt ctcttggagt tacaagttat ttcacttgag 540
tccggagatg caagtattca tgatacagta gaaaatctga tcatcctagc aaacaacagt 600
ttgtcttcta atgggaatgt aacagaatct ggatgcaaag aatgtgagga actggaggaa 660
aaaaatatta aagaattttt gcagagtttt gtacatattg tccaaatgtt catcaacact 720
tcttgatga 729
<210> 26
<211> 729
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(729)
<223> 人IL-15 sushi（编码CDS的RNA）
<400> 26
auggccccgc ggcgggcgcg cggcugccgg acccucgguc ucccggcgcu gcuacugcug 60
cugcugcucc ggccgccggc gacgcggggc aucacgugcc cuccccccau guccguggaa 120
cacgcagaca ucugggucaa gagcuacagc uuguacucca gggagcggua cauuuguaac 180
ucugguuuca agcguaaagc cggcacgucc agccugacgg agugcguguu gaacaaggcc 240
acgaaugucg cccacuggac aacccccagu cucaaaugca uuagagaccc ugcccugguu 300
caccaaaggc cagcgccacc cgggggagga ucuggcggcg gugggucugg cgggggaucu 360
ggcggaggag gaagcuuaca gaacugggug aauguaauaa gugauuugaa aaaaauugaa 420
gaucuuauuc aaucuaugca uauugaugcu acuuuauaua cggaaaguga uguucacccc 480
aguugcaaag uaacagcaau gaagugcuuu cucuuggagu uacaaguuau uucacuugag 540
uccggagaug caaguauuca ugauacagua gaaaaucuga ucauccuagc aaacaacagu 600
uugucuucua augggaaugu aacagaaucu ggaugcaaag aaugugagga acuggaggaa 660
aaaaauauua aagaauuuuu gcagaguuuu guacauauug uccaaauguu caucaacacu 720
ucuugauga 729
<210> 27
<211> 144
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(144)
<223> 人GM-CSF（氨基酸）
<400> 27
Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile
1 5 10 15
Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His
20 25 30
Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp
35 40 45
Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe
50 55 60
Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys
65 70 75 80
Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met
85 90 95
Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser
100 105 110
Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys
115 120 125
Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu
130 135 140
<210> 28
<211> 438
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(438)
<223> 人GM-CSF (CDS DNA)
<400> 28
atgtggctcc agagcctgct gctcttgggc actgtggcct gctccatctc tgcacccgcc 60
cgctcgccca gccccagcac gcagccctgg gagcatgtga atgccatcca ggaggcccgg 120
cgtctgctga acctgagtag agacactgct gctgagatga atgaaacagt agaagtcatc 180
tcagaaatgt ttgacctcca ggagccgacc tgcctacaga cccgcctgga gctgtacaag 240
cagggcctgc ggggcagcct caccaagctc aagggcccct tgaccatgat ggccagccac 300
tacaagcagc actgccctcc aaccccggaa acttcctgtg caacccagat tatcaccttt 360
gaaagtttca aagagaacct gaaggacttt ctgcttgtca tcccctttga ctgctgggag 420
ccagtccagg agtgatga 438
<210> 29
<211> 438
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(438)
<223> 人GM-CSF（编码CDS的RNA）
<400> 29
auguggcucc agagccugcu gcucuugggc acuguggccu gcuccaucuc ugcacccgcc 60
cgcucgccca gccccagcac gcagcccugg gagcauguga augccaucca ggaggcccgg 120
cgucugcuga accugaguag agacacugcu gcugagauga augaaacagu agaagucauc 180
ucagaaaugu uugaccucca ggagccgacc ugccuacaga cccgccugga gcuguacaag 240
cagggccugc ggggcagccu caccaagcuc aagggccccu ugaccaugau ggccagccac 300
uacaagcagc acugcccucc aaccccggaa acuuccugug caacccagau uaucaccuuu 360
gaaaguuuca aagagaaccu gaaggacuuu cugcuuguca uccccuuuga cugcugggag 420
ccaguccagg agugauga 438
<210> 30
<211> 110
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：示例性聚A
<400> 30
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gcauaugacu aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 110
<210> 31
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：抗PD1 Mab重链
<400> 31
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe
20 25 30
Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Gly Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Lys Trp Gly Asn Ile Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
340 345 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 32
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：抗PD1 Mab轻链
<400> 32
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Ser Ile Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Leu Ser Ile Asn Thr Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu His Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Thr Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Val Val Asp Phe Arg Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：HCDR1
<400> 33
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe Gly
1 5
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：HCDR2
<400> 34
Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr
1 5
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：HCDR3
<400> 35
Val Lys Trp Gly Asn Ile Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 36
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：LCDR1
<400> 36
Leu Ser Ile Asn Thr Phe
1 5
<210> 37
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：LCDR2
<400> 37
Ala Ala Ser
1
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：LCDR3
<400> 38
Gln Gln Ser Ser Asn Thr Pro Phe Thr
1 5
<210> 39
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：抗PD1 Mab VH
<400> 39
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe
20 25 30
Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Gly Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Lys Trp Gly Asn Ile Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 40
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：抗PD1 Mab VL
<400> 40
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Ser Ile Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Leu Ser Ile Asn Thr Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu His Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Thr Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Val Val Asp Phe Arg
100 105
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：sgRNA
<400> 41
ggcgtatgta tcagtctcag 20

Claims (103)

1.一种治疗患有实体瘤癌症的受试者的方法，该方法包括施用有效量的RNA以及抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)抗体，该RNA包括编码IL-12sc蛋白的RNA、编码IL-15sushi蛋白的RNA、编码IFNα蛋白的RNA、和编码GM-CSF蛋白的RNA，其中该受试者是抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)或抗程序性细胞死亡因子1配体1(PD-L1)疗法已经失败或对其变得不耐受、有抗性或难治的。
2.根据权利要求1所述的方法，其中该受试者是抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)疗法已经失败或对其变得不耐受、有抗性或难治的。
3.根据权利要求1所述的方法，其中该受试者是抗程序性细胞死亡因子1配体1(PD-L1)疗法已经失败或对其变得不耐受、有抗性或难治的。
4.根据权利要求1所述的方法，其中该受试者的抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)疗法或抗程序性细胞死亡因子1配体1(PD-L1)疗法已经失败。
5.根据权利要求1所述的方法，其中该受试者对抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)或抗程序性细胞死亡因子1配体1(PD-L1)疗法已变得不耐受。
6.根据权利要求1所述的方法，其中该受试者对抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)或抗程序性细胞死亡因子1配体1(PD-L1)疗法已变得有抗性。
7.根据权利要求1所述的方法，其中该受试者对抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)或抗程序性细胞死亡因子1配体1(PD-L1)疗法已变得难治。
8.根据权利要求1所述的方法，其中该受试者患有抗PD-1和/或抗PD-L1抗性实体瘤癌症。
9.根据权利要求1所述的方法，其中该受试者患有对抗PD-1和/或抗PD-L1疗法具有获得性抗性的实体瘤癌症。
10.根据权利要求1所述的方法，其中该受试者患有对抗PD-1和/或抗PD-L1疗法具有先天性抗性的实体瘤癌症。
11.根据权利要求1所述的方法，其中该受试者患有晚期、不可切除或转移性实体瘤癌症。
12.根据权利要求1所述的方法，其中该难治性或抗性癌症是对指定治疗无反应的一种癌症。
13.根据权利要求1所述的方法，其中该难治性从治疗的最开始就发生。
14.根据权利要求1所述的方法，其中该难治性发生在治疗期间。
15.根据权利要求1所述的方法，其中该癌症在治疗开始之前具有抗性。
16.根据权利要求1所述的方法，其中该受试者患有对该抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)和/或抗程序性细胞死亡因子1配体1(PD-L1)疗法无反应的癌症。
17.根据权利要求1所述的方法，其中该受试者患有对指定治疗变得难治或有抗性的癌症。
18.根据权利要求17所述的方法，其中该指定治疗是抗PD1或抗PD-L1疗法。
19.根据权利要求1所述的方法，其中自首次接受该疗法以来，该受试者对该疗法的反应减弱。
20.根据权利要求1所述的方法，其中该受试者尚未接受该疗法，但是患有典型地对该疗法无反应的类型的癌症。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括选择抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)或抗程序性细胞死亡因子1配体1(PD-L1)疗法已经失败或对其变得不耐受、有抗性或难治的受试者。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中该受试者是人类。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中该受试者患有转移性实体瘤。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中该受试者患有不可切除的实体瘤。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中该受试者有癌细胞，该癌细胞包含β2-微球蛋白(B2M)功能的部分或全部损失。
26.根据权利要求25所述的方法，其中该癌细胞具有B2M功能的部分损失。
27.根据权利要求25所述的方法，其中该癌细胞具有B2M功能的全部损失。
28.根据权利要求25-27中任一项所述的方法，其中通过将癌细胞与来自同一受试者的非癌细胞进行比较来评估该B2M功能的部分或全部损失，视需要其中该非癌细胞来自该癌细胞所源自的相同组织。
29.根据权利要求25-28中任一项所述的方法，其中该受试者包含含有B2M基因突变的细胞。
30.根据权利要求29所述的方法，其中该突变是取代、插入或缺失。
31.根据权利要求25-30中任一项所述的方法，其中该B2M基因包含杂合性缺失(LOH)。
32.根据权利要求29或30所述的方法，其中该突变是移码突变。
33.根据权利要求32所述的方法，其中该移码突变在B2M的外显子1中。
34.根据权利要求32或33所述的方法，其中该移码突变包含p.Leu13fs和/或p.Ser14fs。
35.根据权利要求25-34中任一项所述的方法，其中与没有发生B2M功能的部分或全部损失的受试者相比，该受试者具有降低的B2M蛋白水平。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中该受试者具有与对照相比降低的表面表现的主要组织兼容性复合物I类(MHC I)水平，视需要其中该对照是来自同一受试者的非癌症样本。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中该实体瘤癌症是上皮肿瘤、前列腺肿瘤、卵巢肿瘤、肾细胞肿瘤、胃肠道肿瘤、肝肿瘤、大肠直肠肿瘤、脉管系统肿瘤、间皮瘤、胰腺肿瘤、乳房肿瘤、肉瘤、肺肿瘤、结肠肿瘤、黑色素瘤、小细胞肺肿瘤、非小细胞肺癌、神经母细胞瘤、睾丸肿瘤、上皮癌肿瘤、腺癌肿瘤、精原细胞瘤、视网膜母细胞瘤、皮肤鳞状上皮细胞癌(CSCC)、头颈部鳞状上皮细胞癌(HNSCC)、头颈癌、骨肉瘤、肾脏肿瘤、甲状腺肿瘤、间变性甲状腺癌(ATC)、肝肿瘤、结肠肿瘤或其他适于瘤内注射的实体瘤。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中该实体瘤癌症是淋巴瘤。
39.根据权利要求38所述的方法，其中该淋巴瘤是非何杰金氏淋巴瘤。
40.根据权利要求38所述的方法，其中该实体瘤癌症是何杰金氏淋巴瘤。
41.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中该实体瘤癌症是黑色素瘤。
42.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中该实体瘤癌症是黑色素瘤，并且其中该黑色素瘤是葡萄膜黑色素瘤或粘膜黑色素瘤。
43.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中该实体瘤癌症是黑色素瘤，该黑色素瘤包括适于瘤内注射的浅表、皮下和/或淋巴结转移。
44.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中该实体瘤癌症是HNSCC和/或仅在粘膜部位的粘膜黑色素瘤。
45.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中该实体瘤癌症是黑色素瘤。
46.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中该实体瘤癌症不是黑色素瘤。
47.根据权利要求1-46中任一项所述的方法，其中该受试者患有多于一种实体瘤。
48.根据权利要求47所述的方法，其中至少一种肿瘤对抗PD-1或抗PD-L1疗法具有抗性、难治性或不耐受性，并且至少一种肿瘤对抗PD-1或抗PD-L1疗法没有抗性、难治性或不耐受性。
49.根据权利要求48所述的方法，其中抗性和非抗性肿瘤均可被成功治疗。
50.根据权利要求1-49中任一项所述的方法，其中该实体瘤癌症是III期、III期子集、IV期或IV期子集。
51.根据权利要求1-50中任一项所述的方法，其中该实体瘤癌症是晚期且不可切除的。
52.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中该实体瘤癌症已经从其起源扩散到该受试者的另一个部位。
53.根据权利要求1-52中任一项所述的方法，其中该实体瘤癌症具有一处或多处皮肤或皮下病变，视需要其中该癌症不是皮肤癌。
54.根据权利要求1-45和47-53中任一项所述的方法，其中该实体瘤癌症是IIIB期、IIIC期或IV期黑色素瘤。
55.根据权利要求1-54中任一项所述的方法，其中该受试者先前未曾接受过抗PD-1或抗PD-L1疗法治疗。
56.根据权利要求1-55中任一项所述的方法，其中该实体瘤癌症是其中抗PD-1或抗PD-L1疗法不常规使用的一种癌症。
57.根据权利要求56所述的方法，其中该实体瘤癌症不是黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、头颈癌、乳癌或CSCC。
58.根据权利要求1-57中任一项所述的方法，其中该受试者没有其他治疗选择。
59.根据权利要求1-40、46-53和55-58中任一项所述的方法，其中
i.该实体瘤癌症不是黑色素瘤、CSCC或HNSCC；以及
ii.抗PD-1或抗PD-L1疗法不是常规使用的；以及
iii.没有其他合适的治疗选择。
60.根据权利要求1-59中任一项所述的方法，其中该实体瘤癌症是常规使用抗PD1或抗PD-L1疗法但尚未用该疗法治疗的一种癌症。
61.根据权利要求1-60中任一项所述的方法，其中该实体瘤癌症是对抗PD-1或抗PD-L1疗法具有抗性和/或难治性的IIIB期、IIIC期或不可切除的IV期黑色素瘤。
62.根据权利要求1-61中任一项所述的方法，其中该实体瘤癌症具有浅表或皮下病变和/或转移。
63.根据权利要求1-62中任一项所述的方法，其中该受试者患有两处或三处肿瘤病变。
64.根据权利要求1-63中任一项所述的方法，其中该受试者患有可根据实体瘤反应评价标准(RECIST)1.1标准测量的疾病。
65.根据权利要求1-64中任一项所述的方法，其中该受试者的预期寿命超过3个月。
66.根据权利要求1-65中任一项所述的方法，其中该受试者为至少18岁。
67.一种用于治疗晚期黑色素瘤的方法，该方法包括向患有晚期黑色素瘤的受试者施用有效量的RNA以及抗程序性细胞死亡因子1(PD-1)抗体，该RNA包括编码IL-12sc蛋白的RNA、编码IL-15sushi蛋白的RNA、编码IFNα蛋白的RNA和编码GM-CSF蛋白的RNA，其中
i.该受试者为至少18岁；
ii.该受试者先前的抗PD1或抗PD-L1疗法失败；
iii.该受试者至少有2处病变；以及
iv.该黑色素瘤包括适合于直接瘤内注射的肿瘤。
68.根据权利要求1-67中任一项所述的方法，其中
i.该编码IL-12sc蛋白的RNA包含SEQ ID NO:17或18的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:17或18的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或
ii.该IL-12sc蛋白包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列；和/或
iii.该编码IL-12sc蛋白的RNA包含与IL-12sc的p40部分(SEQ ID NO:17或18的核苷酸1-984)具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性以及与IL-12sc的p30部分(SEQ ID NO:17或18的核苷酸1027-1623)具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，并且进一步包含p40和p35部分之间编码连接头多肽的核苷酸。
69.根据权利要求1-68中任一项所述的方法，其中
i.该编码IL-15sushi蛋白的RNA包含SEQ ID NO:26的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:26的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或
ii.该IL-15sushi蛋白包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列；和/或
iii.该编码IL-15sushi蛋白的RNA包含与IL-15受体α的sushi结构域(SEQ ID NO:26的核苷酸1-321)具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性以及与成熟IL-15(SEQ ID NO:26的核苷酸382-729)具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，并且视需要进一步包含IL-15的sushi结构域和成熟IL-15之间编码连接头多肽的核苷酸。
70.根据权利要求1-69中任一项所述的方法，其中
i.该编码IFNα蛋白的RNA包含SEQ ID NO:22或23的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:22或23的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，和/或
ii.该IFNα蛋白包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。
71.根据权利要求1-70中任一项所述的方法，其中
i.该编码GM-CSF蛋白的RNA包含SEQ ID NO:29的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:29的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，和/或
ii.该GM-CSF蛋白包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。
72.根据权利要求1-71中任一项所述的方法，其中至少一种RNA包含代替至少一个尿苷的经修饰的核苷。
73.根据权利要求1-72中任一项所述的方法，其中至少一种RNA包含代替每个尿苷的经修饰的核苷。
74.根据权利要求1-73中任一项所述的方法，其中每种RNA包含代替至少一个尿苷的经修饰的核苷。
75.根据权利要求1-74中任一项所述的方法，其中每种RNA包含代替每个尿苷的经修饰的核苷。
76.根据权利要求72-75中任一项所述的方法，其中该经修饰的核苷独立地选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。
77.根据权利要求1-76中任一项所述的方法，其中至少一种RNA包含多于一种类型的经修饰的核苷，其中所述经修饰的核苷独立地选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。
78.根据权利要求77所述的方法，其中该经修饰的核苷为N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。
79.根据权利要求1-78中任一项所述的方法，其中至少一种RNA包含5'帽m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG或3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')G。
80.根据权利要求1-79中任一项所述的方法，其中每种RNA包含5'帽m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG或3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')G。
81.根据权利要求1-80中任一项所述的方法，其中至少一种RNA包含5'UTR，该5'UTR包含选自由SEQ ID NO:4和6组成的组的核苷酸序列，或与选自由SEQ ID NO:4和6组成的组的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
82.根据权利要求1-81中任一项所述的方法，其中每种RNA包含5'UTR，该5'UTR包含选自由SEQ ID NO:4和6组成的组的核苷酸序列，或与选自由SEQ ID NO:4和6组成的组的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
83.根据权利要求1-82中任一项所述的方法，其中至少一种RNA包含3'UTR，该3'UTR包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
84.根据权利要求1-83中任一项所述的方法，其中每种RNA包含3'UTR，该3'UTR包含SEQID NO:8的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
85.根据权利要求1-84中任一项所述的方法，其中至少一种RNA包含聚A尾。
86.根据权利要求1-85中任一项所述的方法，其中每种RNA均包含聚A尾。
87.根据权利要求85或86所述的方法，其中该聚A尾包含至少100个核苷酸。
88.根据权利要求85-87中任一项所述的方法，其中该聚A尾包含SEQ ID NO:30所示的聚A尾或由其组成。
89.根据权利要求1-88中任一项所述的方法，其中一种或多种RNA包括：
i.5'帽，该5'帽包含m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG或3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')G；
ii.5'UTR，该5'UTR包含(i)选自由SEQ ID NO:4和6组成的组的核苷酸序列，或(ii)与选自由SEQ ID NO:4和6组成的组的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；
iii.3'UTR，该3'UTR包含(i)SEQ ID NO:8的核苷酸序列，或(ii)与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；以及
iv.包含至少100个核苷酸的聚A尾。
90.根据权利要求89所述的方法，其中该聚A尾包含SEQ ID NO:30或由其组成。
91.根据权利要求1-90中任一项所述的方法，其中在受试者中治疗实体瘤癌症包括减小肿瘤大小或预防癌症转移。
92.根据权利要求1-91中任一项所述的方法，其中所述RNA是同时施用的。
93.根据权利要求1-92中任一项所述的方法，其中所述RNA是通过注射施用的。
94.根据权利要求92或93所述的方法，其中在注射之前将所述RNA在液体溶液中混合在一起。
95.根据权利要求1-94中任一项所述的方法，其中该抗PD1抗体是西米单抗、派姆单抗、纳武单抗、MEDI0608、PDR001、PF-06801591、BGB-A317、皮地珠单抗、TSR-042、AGEN-2034、A-0001、BGB-108、BI-754091、CBT-501、ENUM-003、ENUM-388D4、IBI-308、JNJ-63723283、JS-001、JTX-4014、JY-034、CLA-134、STIA-1110、244C8或388D4。
96.根据权利要求1-95中任一项所述的方法，其中该抗PD1抗体是西米单抗。
97.根据权利要求1-96中任一项所述的方法，其中该抗PD1抗体以约0.1-600mg的剂量施用。
98.根据权利要求1-97中任一项所述的方法，其中该抗PD1抗体以200mg、240mg或350mg的剂量施用。
99.根据权利要求1-98中任一项所述的方法，其中该抗PD1抗体通过注射施用。
100.根据权利要求1-99中任一项所述的方法，其中该抗PD1抗体通过静脉内施用。
101.根据权利要求1-100中任一项所述的方法，其中该抗PD-1抗体每三周施用一次。
102.根据权利要求1-101中任一项所述的方法，其中所述RNA和该抗PD-1抗体持续施用约8个月。
103.根据权利要求1-102中任一项所述的方法，其中所述RNA在新辅助疗法环境中施用。
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