PT2867258T - Otimização de anticorpos humanos que se ligam ao gene de ativação de linfócito-3 (lag-3), e utilizações dos mesmos - Google Patents

Otimização de anticorpos humanos que se ligam ao gene de ativação de linfócito-3 (lag-3), e utilizações dos mesmos Download PDF

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Description

DESCRIÇÃO
OTIMIZAÇÃO DE ANTICORPOS HUMANOS QUE SE LIGAM AO GENE DE ATIVAÇÃO DE LINFÓCITO-3 (LAG-3), E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS
Antecedentes da Invenção
Os anticorpos terapêuticos são um dos segmentos que crescem mais rápido da indústria farmacêutica. Para manter a potência (isto é, atividade) e minimizar a imunogenicidade, anticorpos e outros fármacos de proteína devem ser protegidos da degradação física e química durante o fabrico e armazenamento. De facto, uma das principais dificuldades no desenvolvimento da terapêutica de anticorpo é a resposta imunogénica potencial quando administrada a um indivíduo, o que pode levar à rápida depuração ou até mesmo induzir a efeitos secundários potencialmente letais, o que inclui choque anafilãtico. Vários fatores influenciam a imunogenicidade de um anticorpo, tais como suas propriedades físico-químicas (por exemplo, pureza, estabilidade ou solubilidade), fatores clínicos (por exemplo, dose, via de administração, heterogeneidade da doença, ou características do paciente) e o tratamento concomitante com outros agentes (Swann et al. (2 008) Curr
Opinion Immuol 20:493 a 499). A imunogenicidade de anticorpos e/ou perda de atividade de anticorpo ocorre frequentemente devido à desamidação. A desamidação é um processo químico degradativo que ocorre espontaneamente em proteínas (por exemplo, anticorpos). A desamidação remove um grupo funcional amida de um resíduo de aminoácido, tal como asparagina e glutamina, o que danifica suas cadeias laterais que contêm amida. Isso, por sua vez, causa alterações estruturais e biológicas por toda a proteína, o que cria formas heterogéneas do anticorpo. A desamidação é uma das modificações pós-translacionais mais comuns que ocorre em anticorpos terapêuticos recombinantemente produzidos.
Por exemplo, a heterogeneidade na cadeia pesada do anticorpo monoclonal hlB4 (um anticorpo anti-CD18 humanizado) devido à desamidação durante o cultivo celular foi relatada por Tsai et al. (Pharm Res 10(11):1.580 (1993)). Adicionalmente, a redução/perda de atividade biológica devido à desamidação tem sido um problema reconhecido. Por exemplo, Kroon et al. Distinguiu diversos locais de desamidação no anticorpo terapêutico 0KT3, e relatou que amostras de perdas de produção de 0KT3 (com 14 meses a 3 anos de idade) tiveram diminuição de 75% em atividade (Pharm Res 9(11):1.386 (1992), página 1.389, segunda coluna). Adicionalmente, as amostras de 0KT3 que mostram grandes quantidades dos péptidos oxidados em seus mapas tiveram atividade significativamente reduzida no ensaio de potência de ligação de antigénio (página 1.390, primeira coluna). Os autores concluíram que locais específicos de modificação química que ocorrem no armazenamento de 0KT3 foram identificados por mapeamento de péptido e correlacionaram-se com mudanças observadas em análises químicas e ensaios biológicos (página 1.392, primeira coluna). A perda de atividade biológica também foi relatada para uma diversidade de outras proteínas terapêuticas desamidadas, o que inclui DNAse humana recombinante (Cacia et al. (1993) J. Chromatogr. 634:229 a 239) e CD4 solúvel recombinante (Teshima et al. (1991) Biochemistry 30:3.916 a 3.922).
Sobretudo, a desamidação causa um problema significativo e imprevisível para a indústria farmacêutica. Esforços associados à monitorização da variabilidade causada pela desamidação na terapêutica de anticorpo, em particular, assim como preocupações da FDA associadas a essa variabilidade, aumenta os custos e atrasa testes clínicos. Além disso, as modificações para atender a essa questão, o que inclui condições de alternância (por exemplo, temperatura, pH e tipo de célula) associadas à produção recombinante e/ou alteração de aminoãcidos que são suscetíveis à desamidação (por exemplo, mutagénese direcionada a local) podem ter impacto negativo na estabilidade e atividade, especialmente quando as mudanças são feitas dentro das regiões de determinação de complementaridade (CDRs) do anticorpo. Consequentemente, existe a necessidade de versões mais estáveis de anticorpos terapêuticos.
Sumário A presente invenção fornece anticorpos monoclonais isolados (por exemplo, anticorpos monoclonais humanos) e porções de ligação de antigénio dos mesmos que se ligam um LAG-3 humano conforme definido nas reivindicações. Os anticorpos monoclonais da invenção têm estabilidade física otimizada em comparação com anticorpos anti-LAG-3 anteriormente descritos. Em particular, a invenção refere-se a uma forma modificada do anticorpo 25F7 (US 2011/0150892 Al) que exibe estabilidade térmica e química significativamente aprimoradas em comparação com o anticorpo não modificado. Especificamente, ao alterar a região de ligação crítica do domínio CDR2 de cadeia pesada do anticorpo 25F7, foi mostrado que o anticorpo modificado exibiu estabilidade física e térmica significativamente superiores, desamidação reduzida, reversibilidade térmica superior e agregação inferior. Ao mesmo tempo, foi inesperadamente observado que o anticorpo modificado reteve a mesma afinidade de ligação alta com LAG-3 humano e atividade funcional do anticorpo não modificado, o que inclui a habilidade para inibir a ligação de LAG-3 a moléculas de classe II de histocompatibilidade principal (MHC) e estimular respostas de célula T específica de antigénio. 0 aumento substancial combinado 11a estabilidade e retenção de ligação/atividade biológica do anticorpo modificado foi inesperado, Particularmente, em vista da criticalidade das regiões de CDRs para o funcionamento de anticorpo.
Os anticorpos da invenção podem ser utilizados para uma diversidade de aplicações, o que inclui a deteção de proteína de LAG-3 e estímulo de respostas de célula T específica de antigénio em indivíduos portadores de tumor ou vírus.
As regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada do anticorpo ou porção de ligação de antigénio do mesmo da invenção compreendem as sequências de aminoãcidos de SEQ ID NOs: 15, 16 e 17, respetivamente. As regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve do anticorpo ou porção de ligação de antigénio do mesmo da invenção compreendem as sequências de aminoãcidos de SEQ ID NOs: 18, 19 e 20, respetivamente. Numa forma de realização, o anticorpo monoclonal isolado (por exemplo, um anticorpo humano) ou uma porção de ligação de antigénio do mesmo da invenção tem uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoãcidos de SEQ ID NO: 12. Em outra forma de realização, o anticorpo inclui adicionalmente uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoãcidos de SEQ ID NO: 14.
Numa forma de realização preferencial, o anticorpo exibe propriedades físicas aumentadas (isto é, Estabilidade térmica e química) em comparação com anticorpo 25F7, ao mesmo tempo que ainda mantém pelo menos a mesma afinidade de ligação com LAG-3 humano que 25F7. Por exemplo, o anticorpo exibe variabilidade de sequência diminuída na região de CDR2 de cadeia pesada devido à desamidação, em comparação com o anticorpo 25F7, por exemplo, aproximadamente 2,5% ou menos modificação da sequência de aminoãcidos depois de 12 semanas a 4 °C (isto é, em estudos de estabilidade Ãem tempo realà conforme descrito no presente documento) e/ou aproximadamente 12,0% ou menos de modificação da sequência de aminoãcidos depois de 12 semanas a 40 °C (isto é, em condições de tensão aceleradas, conforme descrito no presente documento), ao mesmo tempo que ainda mantém uma afinidade de ligação com LAG-3 humano de cerca de pelo menos KD de 1 x 10"' M ou menos (mais preferencialmente, uma KD de 1 x 10“8 M ou menos, uma KD de 5 x 1Q~9 M ou menos, Ou uma KD de 1 x 1Q"9 M ou menos) . Em outra forma de realização, o anticorpo exibe reversibilidade térmica de pelo menos cerca de 40% em PBS a pH 8,0.
Em outra forma de realização, o anticorpo tem uma temperatura de fusão superior (o que indica estabilidade geral superior in vivo), em comparação com o anticorpo não modificado (Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361 a 371) . Numa forma de realização, o anticorpo exibe uma TMi (a temperatura de desdobramento inicial) maior que 60 °C, por exemplo, maior que 65 °C ou maior que 70 °C. 0 ponto de fusão de um anticorpo pode ser medido ao utilizar calorimetria de varrimento diferenciado (Chen et al (2 003) Pharm Res 20: 1.952 a 1.960; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47 a 52) ou dicroísmo circular (Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sei 40:343 a 349|_.
Em outra forma de realização, o anticorpo é distinguido pela sua resistência à rápida degradação. A degradação de um anticorpo pode ser medida ao utilizar eletroforese capilar (CE) e MALDI-MS (Alexander AJ e Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3.626 a 3.632).
Em outra forma de realização, o anticorpo exibe efeitos de agregação mínimos, por exemplo, agregação de 25% ou menos, tal como 2 0% ou menos, 15% ou menos, 10% ou menos, 5% ou menos ou 4% ou menos. A agregação pode causar o acionamento de uma resposta imunitária indesejada e/ou propriedades farmacocinéticas alteradas ou desfavoráveis, A agregação pode ser medida por diversas técnicas, o que inclui coluna de exclusão de tamanho (SEC), cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e dispersão de luz.
Em outra forma de realização, o anticorpo exibe adicionalmente pelo menos uma das seguintes propriedades: (a) ligação a LAG-3 de macaco; (b) ausência de ligação a LAG-3 de murganho; (c) inibição de ligação de LAG-3 a moléculas de classe II de histocompatibilidade principal (MHC); e (d) estímulo de respostas imunolõgicas, particularmente, respostas de célula T específica de antigénio. Preferencialmente, o anticorpo exibe pelo menos duas das propriedades (a), (b), (c) e (d). Mais preferencialmente, o anticorpo exibe pelo menos três das propriedades (a) , (b), (c) e (d). Ainda mais preferencialmente, o anticorpo exibe todas as quatro propriedades (a), (b), (c) e (d).
Em outra forma de realização, o anticorpo estimula uma resposta de célula T específica de antigénio, tal como a produção de interleucina-2 (IL- 2) numa resposta de célula T específica de antigénio. Em outras formas de realização, o anticorpo estimula uma resposta imunitária, tal como uma resposta antitumoral (por exemplo, inibição de crescimento tumoral num modelo de enxerto tumoral in vivo) ou uma resposta autoimune (por exemplo, desenvolvimento de diabetes em ratos NOD).
Em outra forma de realização, o anticorpo se liga a um epítopo de LAG-3 humano que compreende a sequência de aminoácidos PGHPLAPG (SEQ ID NO: 21} . Em outra forma de realização, o anticorpo se liga a um epítopo de LAG-3 humano que compreende a sequência de aminoácidos HPAAPSSW (SEQ ID NO: 22) ou PAAPSSWG (SEQ ID NO: 23) .
Em outras formas de realização, o anticorpo mancha tecido pituitário por imunohistoquímica, ou não mancha o tecido pituitário por imunohistoquímica.
Os anticorpos da invenção podem ser anticorpos de comprimento completo, por exemplo, de um isotipo IgGl, IgG2 ou IgG4, opcionalmente, com uma serina para mutação prolina na região de articulação de região constante de cadeia pesada (a uma posição que corresponde à posição 241 conforme descrito em Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30:105 a 108), de modo que a inter-heterogeneidade de ponte de dissulfeto de cadeia pesada seja reduzida ou abolida. Num aspeto, o isotipo de região constante é IgG4 com uma mutação em resíduos de aminoãcido 228, por exemplo, S228P. Alternativamente, os anticorpos podem ser fragmentos de anticorpo, tal como os fragmentos Fab, Fab' ou Fab'2 ou anticorpos de cadeia única.
Em outro aspeto da invenção, o anticorpo (ou porção de ligação de antigénio do mesmo) é parte de um imunoconjugado que inclui um agente terapêutico, por exemplo, uma citotoxina ou um isótopo radioativo, unido ao anticorpo. Em outro aspeto, o anticorpo é parte de uma molécula biespecífica que inclui uma segunda porção química funcional (por exemplo, um segundo anticorpo) que tem uma especificidade de ligação diferente daquela do referido anticorpo ou porção de ligação de antigénio do mesmo.
As composições que compreendem anticorpos ou porções de ligação de antigénio dos mesmos, imunoconjugados ou moléculas biespecíficas da invenção, opcionalmente, formuladas num transportador farmaceuticamente aceitável também são fornecidas.
As moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos ou porções de ligação de antigénio (por exemplo, regiões variáveis e/ou CDRs) dos mesmos da invenção também são fornecidas, assim como vetores de expressão que compreendem tais ácidos nucleicos e células hospedeiras que compreendem tais vetores de expressão. Os métodos para preparar anticorpos anti-LAG-3 utilizando as células hospedeiras que compreendem tais vetores de expressão são fornecidos também e podem incluir as etapas de (i) expressar o anticorpo na célula hospedeira e (ii) isolar o anticorpo da célula hospedeira.
Em outro aspeto, a invenção fornece anticorpos anti- LAG-3 da invenção para a utilização em métodos para estimular respostas imunológicas. Numa forma de realização, o método envolve estimular uma resposta de célula T específica de antigénio colocando-se as células T em contato com um anticorpo da invenção, de modo que uma resposta de célula T específica de antigénio seja estimulada. Numa forma de realização preferencial, a produção de interleucina-2 pela célula T específica de antigénio é estimulada. Em outra forma de realização, o indivíduo é um indivíduo portador de tumor e uma resposta imunitária contra o tumor é estimulada. Em outra forma de realização, o indivíduo é um indivíduo portador de vírus e uma resposta imunitária contra o vírus é estimulada.
Em ainda outra forma de realização, a invenção fornece um anticorpo, ou porção de ligação de antigénio do mesmo da invenção para utilização num método para inibir crescimento de células tumorais num indivíduo que compreende administrar ao indivíduo o anticorpo ou porção de ligação de antigénio do mesmo de modo que o crescimento do tumor seja inibido no indivíduo. Em ainda outra forma de realização, a invenção fornece um anticorpo ou porção de ligação de antigénio do mesmo da invenção para utilização num método para tratar infeção virai num indivíduo que compreende administrar ao indivíduo o anticorpo ou porção de ligação de antigénio do mesmo de modo que a infeção virai seja tratada no indivíduo. Em outra forma de realização, esses métodos compreendem administrar uma composição, biespecífica ou imunoconjugado da invenção.
Em ainda outra forma de realização, a invenção fornece um anticorpo ou porção de ligação de antigénio do mesmo da invenção para utilização num método para estimular uma resposta imunitária num indivíduo que compreende administrar ao indivíduo o anticorpo ou porção de ligação de antigénio do mesmo e pelo menos um anticorpo imunoestimulante adicional, tal como um anticorpo anti-PD- 1, um anticorpo anti-PD-Ll e/ou um anticorpo anti-CTLA-4, de modo que uma resposta imunitária seja estimulada no indivíduo, por exemplo, para inibir o crescimento tumoral ou para estimular uma resposta antiviral. Numa forma de realização, o anticorpo imunoestimulante adicional é um anticorpo anti-PD-1. Em outra forma de realização, o agente imunoestimulante adicional é um anticorpo anti-PD-Ll. Em ainda outra forma de realização, o agente imunoestimulante adicional é um anticorpo anti-CTLA-4. Em ainda outra forma de realização, um anticorpo ou porção de ligação de antigénio do mesmo da invenção é administrado com uma citocina (por exemplo, IL-2 e/ou IL-21), ou um anticorpo coestimulante (por exemplo, um anticorpo anti-CD 137 e/ou anti-GITR). Os anticorpos podem ser, por exemplo, anticorpos humanos, quiméricos ou humanizados. A invenção fornece anticorpos anti-LAG-3 e composições da invenção para utilização nos métodos anteriores, ou para o fabrico de um medicamento para utilização nos métodos anteriores (por exemplo, para tratamento).
Outros recursos e vantagens da presente divulgação ficarão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada e exemplos que não devem ser considerados limitantes.
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Mf? «M ·Ϊ5 êmj V*» nM mfl Cí Jwr Ç5 Í55 Ji eif» «tf A Figura IA mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO: 1) e sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 25F7. As regiões de CDR1 (SEQ ID NO: 5), CDR2 (SEQ ID NO: 6) e CDR3 (SEQ ID NO: 7) são delineadas e as derivações de linha germinativa V, D e J são indicadas. As regiões de CDR são delineadas utilizando o sistema Kabat (Kabat et ai. (1991) Sequences of Proteins of Immunological
Interest, 5a Edição, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). A Figura IB mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO: 3) e a sequência de aminoãcidos (SEQ ID NO: 4) da região variável de cadeia leve kappa do anticorpo monoclonal humano 25F7. As regiões de CDR1 (SEQ ID NO: S) , CDR2 (SEQ ID NO: 9) e CDR3 (SEQ ID NO: 10) são delineadas e as derivações de linha germinativa de V e J são indicadas. O anticorpo de sequências de aminoácidos de cadeia pesada e leve de comprimento completo 2 5F7 são mostradas nas SEQ ID NOs: 32 e 34, respetivamente. A Figura 2A mostra a sequência de aminoãcidos (SEQ ID NO: 12) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal LAG3.5. As regiões de CDR1 (SEQ ID NO: 15), CDR2 (SEQ ID NO: 16) e CDR3 (SEQ ID NO: 17) sao delineadas. O anticorpo de sequências de aminoácidos de cadeia pesada e leve de comprimento completo LAG3.5 são mostradas nas SEQ ID NOs: 35 e 37, respetivamente. A Figura 2B mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO: 13) e sequência de aminoãcidos (SEQ ID NO: 14) da região variável de cadeia leve kappa do anticorpo monoclonal LAGS . 5 . As regiões de CDR1 (SEQ ID NO: 18), CDR2 (SEQ ID NO: 19) e CDR3 (SEQ ID NO: 20) são delineadas. A Figura 3 mostra as sequências de aminoácidos de sequências de região variável de cadeia pesada CDR2 das variantes de LAG-3 LAG3.5 (SEQ ID NO: 16), LAG3.6 (SEQ ID NO: 24), LAG3.7 (SEQ ID NO: 25) e LAG3.8 (SEQ ID NO: 26), em comparação com a sequência de aminoãcidos da sequência de região variável de cadeia pesada CDR2 de anticorpo 25F7 (LAG3.1) (SEQ ID NO: 6) e sequência de linha germinativa humana correspondente (SEQ ID NO: 27). A região variável de cadeia pesada CDR2 de LAG3.5 difere da região variável de cadeia pesada CDR2 de 25F7 por arginina (R) na posição 54 (versus asparagina (N) ) e serina (S) na posição 56 (versus asparaginas (N) ) . Os CDRs restantes de LAG3.5 e 25F7 são idênticos.
As Figuras 4A e 4B são gráficos que mostram a atividade de ligação (EC50 e afinidade, respetivamente) de anticorpos LAG3.1 (25F7) , LAGS .2 , LAGS .5 , LAG3.6, LAGS .7 e LAGS.8 a células T CD4 + humanas ativadas.
As Figuras 5A, B, C, D e E são gráficos que mostram curvas de fusão térmica (isto é, estabilidade térmica) de anticorpos LAGS.1 (25F7), LAG3.5, LAGS .6, LAGS .7 e LAGS .8, respetivamente .
As Figuras 6A, B, C, D e E são gráficos que mostram as curvas de reversibilidade térmica (isto é, estabilidade térmica) de anticorpos LAG3.1 (25F7), LAG3.5, LAGS.6, LAGS.7 e LAG3.8, respetivamente. A Figura 7 é um gráfico que mostra a atividade de ligação de anticorpos LAG3.1 (25F7) e LAG3.5 a células T CD4+ humanas ativadas e ligação de antigénio (Biacore). A Figura 8 mostra os resultados de mapeamento de péptido utilizando espectrometria de massa (modificações químicas/estabilidade molecular) para anticorpos LAGS.1 (25F7) e LAGS.5 que refletem desamidação e isomerização depois de incubação por 5 dias sob condições de tensão aceleradas conforme descrito no presente documento. A Figura 9 é um gráfico que compara os perfis de hidrofilicidade de anticorpos LAGS.1 (25F7) e LAG3.5.
As Figuras 10A, B, C e D são gráficos que comparam a afinidade e estabilidade física (isto é, estabilidade térmica e química) de anticorpos LAG3.1 e LAGS.5 a 4 °C e 40 °C, isto é, ambas as condições de tensão aceleradas e estudos de estabilidade Ãem tempo realÃ, conforme descrito no presente documento.
As Figuras 11A e B são gráficos que comparam a modificação percentual das sequências de aminoácidos de anticorpos LAGS.1 e LAG3.5 a 4 °C e 40 °C.
Descrição Detalhada da Invenção A fim de que a presente divulgação possa ser mais prontamente compreendida, certos termos são primeiro definidos. Definições adicionais são estabelecidas ao longo da descrição detalhada.
Os termos Ã25F7Ã, Ãanticorpo 25F7Ã, Ãanticorpo LAG3.1à e ÃLAG3.1à referem-se ao anticorpo anti-LAG-3 humano descrito no documento US2011/0150892 AI. A sequência de nucleótidos (SEQ ID NO: 1) codificadora da região variável de cadeia pesada de 25F7 (LAG3.1) e a sequência de aminoãcidos correspondente (SEQ ID NO: 2) são mostradas na Figura IA (com sequências de CDR designadas como SEQ ID NOs: 4, 5 e 7, respetivamente) . A sequência de nucleótidos (SEQ ID NO: 3) codificadora da região variável de cadeia leve de 25F7 (LAG3.1) e a sequência de aminoãcidos correspondente (SEQ ID NO: 4) são mostradas na Figura 1B (com sequências de CDR designadas como SEQ ID NOs: 8, 9 e 10, respetivamente). 0 termo ÃLAG-3à refere-se ao Gene de Ativação de Linfócito-3. O termo ÃLAG-3à inclui variantes, isoformas, homólogos, ortólogos e parõlogos. Por exemplo, anticorpos específicos para uma proteína de LAG-3 humano podem, em determinados casos, ter uma reação cruzada com uma proteína de LAG-3 a partir de uma espécie diferente da humana. Em outras formas de realização, os anticorpos específicos para uma proteína de LAG-3 humano podem ser completamente específicos para a proteína de LAG-3 humano e podem não exibir espécies ou outros tipos de reatividade cruzada, ou podem ter uma reação cruzada com LAG-3 a partir de determinadas outras espécies, mas não todas as outras espécies (por exemplo, reação cruzada com LAG-3 de macaco, mas não LAG-3 de murganho). 0 termo ÃLAG-3 humanoà refere-se ao LAG-3 de sequência humana, tal como a sequência de aminoãcidos completa de LAG-3 humano que tem o Número de Acesso ao Genbank N° NP__002277 (SEQ ID NO: 29) . 0 termo ÃLAG-3 de murganhoà refere-se ao LAG-3 de sequência de murganho, tal como a sequência de aminoãcidos completa de LAG-3 de murganho que tem o Número de Acesso ao Genbank N-NP_032505. LAG-3 também é conhecido na técnica como, por exemplo, CD223. A sequência de LAG-3 humano pode diferir do LAG-3 humano do Número de Acesso ao Genbank N2 NP_Q02277 por ter, por exemplo, Mutações conservadas ou mutações em regiões nâo conservadas e o LAG-3 tem substancialmente a mesma função biológica que o LAG-3 humano de Número de Acesso ao Genbank N2 NP_002277. Por exemplo, uma função biológica de LAG-3 humano é ter um epítopo no domínio extracelular de LAG-3 que é especificamente ligado por um anticorpo da presente divulgação ou uma função biológica de LAG-3 humano se liga a moléculas de classe II MEC. 0 termo "LAG-3 de macaco" se destina a englobar proteínas de LAG-3 expressas por macacos do Velho Mundo e do Novo Mundo, o que inclui, mas sem limitação, LAG-3 de macaco cinomolgos e LAG-3 de macaco Rhesus. Uma sequência de aminoácidos representativa para LAG-3 de macaco ê a sequência de aminoácidos de LAG-3 de macaco Rhesus que também é depositada como Número de Acesso ao Genbank N2 XM_001108923. Outra sequência de aminoácidos representativa para LAG-3 de macaco é a sequência de macaco Rhesus alternativa de pa23-5 clone conforme descrito no documento n2 US 2011/0150892 AI. Essa sequência de Rhesus alternativa exibe uma única diferença de aminoãcido, na posição 419, em comparação com a sequência depositada no Genbank.
Uma sequência de LAG-3 humano particular geralmente será pelo menos 90% idêntica em sequência de aminoácidos ao LAG-3 humano de Número de Acesso ao Genbank N2 NP_002277 e contém resíduos de aminoácido que identificam a sequência de aminoácidos como sendo humana quando em comparação com sequências de aminoácidos de LAG-3 de outras espécies (por exemplo, murino). Em determinados casos, um LAG-3 humano pode ser pelo menos 95%, ou até mesmo pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico em sequência de aminoácidos ao LAG- 3 de Número de Acesso ao Genbank N2 NP__002277. Em determinadas formas de realização, uma sequência de LAG-3 humano exibirá não mais do que 10 diferenças de aminoácido em relação à sequência de LAG-3 de Número de Acesso ao
Genbank M2 NP_Q02277. Em determinadas formas de realização, o LAG-3 humano pode exibir não mais que 5, ou até mesmo não mais que 4, 3, 2 ou 1 diferença de aminoácido em relação à sequência de LAG- 3 de Número de Acesso ao Genbank N2 NP_002277. A identidade percentual pode ser determinada conforme descrito no presente documento. 0 termo !!resposta imunitária" refere-se à ação de, por exemplo, linfócitos, células que apresentam antigénio, células fagocíticas, granulócitos e macromoléculas solúveis produzidas pelas células acima ou pelo fígado (o que inclui anticorpos, citocinas e complemento) que resulta em dano seletivo a, destruição de ou eliminação do corpo humano de patõgenos invasores, células ou tecidos infetados com patógenos, células cancerígenas, ou, em casos de autoimunidade ou inflamação patológica, células ou tecidos humanos normais.
Uma "resposta de célula T específica de antigénio" refere-se a respostas de uma célula T que resultam do estímulo da célula T com o antigénio para o qual a célula T é específica. Exemplos não limitantes de respostas de uma célula T para o estímulo específico de antigénio incluem proliferação e produção de citocina (por exemplo, Produção de IL-2). 0 termo "anticorpo" conforme indicado no presente documento inclui anticorpos inteiros e qualquer fragmento de ligação de antigénio (isto é, "porção de ligação de antigénio") ou cadeias únicas dos mesmos. Anticorpos inteiros são glicoproteínas que compreendes pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações de dissulfeto. Cada cadeia pesada é compreendida por uma região variável de cadeia pesada (abreviada no presente documento como VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é compreendida por três domínios, CH1, CH2 e Ch3. Cada cadeia leve é compreendida por uma região variável de cadeia leve (abreviada no presente documento como VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é compreendida por um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas de regiões de determinação de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR) . Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro FRs, dispostos a partir do terminal amino para o terminal carboxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve contêm um domínio de ligação que interage com um antigénio. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores hospedeiros, o que inclui varias células do sistema imunitário (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico. 0 termo Ãporção de ligação de antigénioà de um anticorpo (ou simplesmente Ãporção de anticorpoÃ), conforme utilizado no presente documento, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a habilidade para se ligar especificamente a um antigénio (por exemplo, uma proteína de LAG-3). Foi demonstrado que a função de ligação de antigénio de um anticorpo pode ser formada por fragmentos de um anticorpo de comprimento completo. Exemplos de fragmentos de ligação englobados no termo Ãporção de ligação de antigénioà de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de articulação; (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CHi; (iv) um fragmento Fv que consiste nos domínios VH e CH1; (v) um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (vi) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Mature 341:544 a 546), que consiste num domínio VH; (vii) uma região de determinação de complementaridade (CDR); e (viii) um nanocorpo, uma região variável de cadeia pesada que contém um único domínio variável e dois domínios constantes. Ademais, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, os mesmos podem ser unidos, utilizando métodos recombinantes, por um ligante sintético que possibilita que os mesmos sejam feitos como uma cadeia de proteína única em que as regiões VL e VH se emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv); veja-se por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423 a 4 2 6; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5.879 a 5.883). Tais anticorpos de cadeia única também se destinam a serem englobados no termo "porção de ligação de antigénio" de um anticorpo. Esses fragmentos de anticorpo são obtidos utilizando técnicas convencionais conhecidas por peritos na especialidade, e os fragmentos são varridos em relação à utilidade da mesma maneira que são os anticorpos intactos.
Um "anticorpo isolado", conforme utilizado no presente documento, é destinado a referir-se a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos que têm diferentes especificidades antigénicas (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente a uma proteína de LAG-3 é substancialmente livre de anticorpos que se ligam especif icamente a antigénios em vez de às proteínas de LAG-3) . Um anticorpo isolado que se liga especificamente a uma proteína de LAG-3 humano pode, contudo, ter reatividade cruzada com outros antigénios, tal como proteínas LAG-3 a partir de outras espécies. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outro material celular e/ou substâncias químicas.
Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal" conforme utilizados no presente documento referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única. Uma composição de anticorpo monoclonal exibe uma especificidade e afinidade de ligação únicas para um epítopo particular. 0 termo Ãanticorpo humanoÃ, conforme utilizado no presente documento, destina-se a incluir anticorpos que têm regiões variáveis em que tanto as regiões estruturais quanto CDR são derivadas a partir de sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana. Ademais, se o anticorpo contém uma região constante, a região constante também é derivada das sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácido não codificados por sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagénese aleatória ou específica de local in vitro ou por mutação somática in vivo), Contudo, o termo Ãanticorpo humanoÃ, conforme utilizado no presente documento, não se destina a incluir anticorpos em que sequências de CDR derivadas da linha germinativa de outras espécies de mamífero, tal como um murganho, foram enxertadas em sequências estruturais humanas. 0 termo Ãanticorpo monoclonal humanoà refere-se a anticorpos que exigem uma especificidade de ligação única que têm regiões variáveis em que tanto as regiões estruturais quanto CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana. Numa forma de realização, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida a partir de um animal não humano transgénico, por exemplo, um murganho transgénico, que tem um genoma que compreende um transgene de cadeia pesada humano e um transgene de cadeia leve fundido a uma célula imortalizada. 0 termo Ãanticorpo humano recombinanteÃ, conforme utilizado no presente documento, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meio recombinante, tal como (a) anticorpos isolados a partir de um animal (por exemplo, um murganho) que é transgénico ou transcromossómico para genes de imunoglobulina humana ou um hibridoma preparado a partir dos mesmos (descrito adicionalmente abaixo), (b) anticorpos isolados a partir de uma célula hospedeira transformados para expressar o anticorpo humano, por exemplo, de um transfetoma, (c) anticorpos isolados a partir de uma biblioteca de anticorpo humano combinatória, recombinante, e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvem a junção de sequências genéticas de imunoglobulina humana a outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis em que as regiões estruturais e CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana. Em determinadas formas de realização, contudo, tais anticorpos humanos recombinantes podem ser submetidos a mutagénese in vitro (ou, quando um animal transgénico para sequências de Ig humana é utilizado, in vivo mutagénese somática) e, portanto, as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas de e relacionadas às sequências VH e VL de linha germinativa humana, podem não existir naturalmente no repertório da linha germinativa do anticorpo humano in vivo. 0 termo "isotipo" refere-se à classe de anticorpo (por exemplo, IgM ou IgGl) que é codificada pelos genes de região constante de cadeia pesada.
As frases "um anticorpo que reconhece um antigénio" e "um anticorpo específico para um antigénio" são utilizadas indistintamente no presente documento do termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antigénio." 0 termo "derivados de anticorpo humano" refere-se a qualquer forma modificada do anticorpo humano, por exemplo, um conjugado do anticorpo e outro agente ou anticorpo. 0 termo Aanticorpo humanizado" é destinado a referir-se a anticorpos em que sequências de CDR derivadas da linha germinativa de outras espécies de mamífero, tal como um murganho, foram enxertadas em sequências estruturais humanas. As modificações de região estrutural adicional podem ser feitas dentro das sequências estruturais humanas. 0 termo Aanticorpo quimérico" é destinado a referir-se a anticorpos em que as sequências de região variável são derivadas de uma espécie e as sequências de região constante são derivadas de outras espécies, tal como um anticorpo em que as sequências de região variável são derivadas de um anticorpo de murganho e as sequências de região constante são derivadas de um anticorpo humano.
Conforme utilizado no presente documento, um anticorpo que Ãse liga especificamente a um LAG-3 humano" é destinado a referir-se a um anticorpo que se liga a uma proteína de LAG-3 humano (e possivelmente uma proteína de LAG-3 de uma ou mais espécies não humanas) , mas não se ligam substancialmente a proteínas não LAG-3. Preferencialmente, o anticorpo se liga a uma proteína de LAG-3 humano com Ãalta afinidadeÃ, a saber, com uma KD de 1 x 10‘7 M ou menos, mais preferencialmente, 1 x IO”8 M ou menos, mais preferencialmente, 5 x IO”9 M ou menos, mais preferencialmente, 1 x 10”9 M ou menos. 0 termo Ãnão se liga substancialmenteà a uma proteína ou células, conforme utilizado no presente documento, significa que não se liga ou não se liga com uma alta afinidade à proteína ou às células, isto é, se liga à proteína ou às células com uma KD de 1 x 10'6 M ou mais, mais preferencialmente, 1 x 10”5 M ou mais, mais preferencialmente, 1 x 10”4 M ou mais, mais preferencialmente, 1 x 10”3 M ou mais, ainda mais preferencialmente, 1 x IO”2 M ou mais. 0 termo ÃKaSsocà ou ÃKaÃ, conforme utilizado no presente documento, é destinado a referir-se à taxa de associação de uma interação anticorpo- antigénio particular, enquanto o termo ÃKdisà ou ÃKd,à conforme utilizado no presente documento, é destinado a referir-se à taxa de dissociação de uma interação anticorpo-antigénio particular. 0 termo ÃKD,à conforme utilizado no presente documento, é destinado a referir-se à constante de dissociação, que é obtida a partir da razão de Kd em relação a Ka (isto ê, K^/Ka) e é expressa como uma concentração molar (M). Os valores de KD para anticorpos podem ser determinados utilizando métodos bem estabelecidos na técnica. Um método preferencial para determinar a KD de um anticorpo é utilizando de ressonância de plasmon de superfície, preferencialmente, utilizando um sistema de biossensor o sistema Biacore®. 0 termo Ãalta afinidadeà com um anticorpo IgG refere-se a um anticorpo que tem uma KD de 1 x 10”' M ou menos, mais preferencialmente, 5 x 10"& M ou menos, ainda mais preferencialmente, 1 x 10~8 M ou menos, ainda mais preferencialmente, 5 x IO"9 M ou menos e ainda mais preferencialmente, 1 x 10”9 M ou menos para um antigénio alvo. Contudo, ligação de Ãalta afinidadeà pode variar para outros isotipos de anticorpo. Por exemplo, ligação de Ãalta afinidadeà para um isotipo IgM refere-se a um anticorpo que tem uma KD de 10"6 M ou menos, mais preferencialmente, 10"7 M ou menos, ainda mais preferencialmente, 10~s M ou menos. 0 termo Ãdesamidaçãoà refere-se a um processo químico degradativo que ocorre espontaneamente em proteínas (por exemplo, anticorpos). A desamidação remove um grupo funcional amida de um resíduo de aminoácido, tal como asparagina e glutamina, o que danifica suas cadeias laterais que contêm amida. Especificamente, a cadeia lateral de uma asparagina ataca o grupo de péptido adjacente, Formando um intermediário de sucinimida simétrica. A simetria do intermediário resulta em dois produtos de hidrólise, aspartato ou isoaspartato. Uma reação semelhante pode ocorrer também em cadeias laterais de aspartato, gerando uma conversão parcial para isoaspartato. No caso de glutamina, a taxa de desamidação geralmente é dez vezes menos que asparagina, contudo, o mecanismo é essencialmente o mesmo, o que exige apenas moléculas de água para proceder. 0 termo Ãindivíduoà inclui qualquer animal humano ou não humano. 0 termo Ãanimal não humanoà inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelhas, cães, gatos, vacas, cavalos, galinhas, anfíbios e répteis, embora os mamíferos sejam preferenciais, tais como primatas não humanos, ovelhas, cães, gatos, vacas e cavalos. Vários aspetos da invenção são descritos em detalhes adicionais nas subsecções seguintes.
Anticorpos Anti-LAG-3 que Tem Estabilidade Aumentada e Propriedades Funcionais Vantajosas
Os anticorpos da invenção se ligam especificamente ao LAG-3 humano e têm estabilidade otimizada em comparação com anticorpos anti-LAG-3 anteriormente descritos, particularmente, em comparação com o anticorpo 25F7 (LAG3.1). Essa otimização inclui desamidação reduzida (por exemplo, estabilidade química aumentada) e redobramento térmico aumentado (por exemplo, estabilidade física aumentada), ao mesmo tempo que retêm alta afinidade com LAG~3 humano. Métodos para identificar locais de desamidação são conhecidos na técnica (veja-se, por exemplo, permuta de ião, fase reversa e cromatografia de interação hidrofóbica, e mapeamento de péptido de digestões proteolíticas (LC-MS). Ensaios adequados para medir estabilidade física incluem, por exemplo, análise de pontos de fusão e/ou redobramento de estrutura de anticorpo em seguida à desnaturação (por exemplo, reversibilidade percentual conforme descrito, por exemplo, no Exemplo 3, Seção 3).
Ligação a LAG-3 humano pode ser avaliada utilizando uma ou mais técnicas também bem estabelecidas na técnica. Por exemplo, um anticorpo pode ser testado por um ensaio de citometria de fluxo em que o anticorpo é reagido com uma linhagem celular que expressa LAG-3 humano, tal como células de CHO que foram transfetadas para expressar LAG-3 (por exemplo, LAG-3 humano, ou LAG-3 de macaco (por exemplo, macaco Rhesus ou cinomolgos) ou LAG-3 de murganho) em sua superfície celular. Outras células adequadas para utilização em ensaios de citometria de fluxo incluem células T ativadas de CD4+ estimuladas por anti-CD3 que expressam LAG-3 nativo. Adicional ou alternativamente, a ligação do anticorpo, o que inclui a cinética de ligação (por exemplo, valor de KD) , pode ser testada em ensaios de BIAcore. Ainda outros ensaios de ligação adequados incluem ensaios ELISA, por exemplo, utilizando uma proteína de LAG-3 recombinante.
Os anticorpos da invenção se ligam preferencialmente à proteína de LAG-3 humano com uma KD de 1 x 10“7 M ou menos, e mais preferencialmente, 1 x 10~8 M ou menos, 5 x 10“9 M ou menos, ou 1 x 10“9 M ou menos.
Tipicamente, o anticorpo se liga a LAG-3 em tecidos linfoides, tais como amígdalas, baço ou timo, que podem ser detetados por imunohistoquímica. Numa forma de realização, o anticorpo mancha tecido pituitário (por exemplo, são retidos no pituitário) conforme medido por imunohistoquímica. Em outra forma de realização, o anticorpo não mancha tecido pituitário (isto ê, não é retido no pituitário) conforme medido por imunohistoquímica.
Propriedades funcionais adicionais incluem reatividade cruzada com LAG-3 de outras espécies. Por exemplo, o anticorpo pode ligar-se a LAG-3 de macaco (por exemplo, macaco cinomolgos, macaco Rhesus), mas não se ligar substancialmente a LAG-3 de LAG-3 de murganho.
Preferencialmente, um anticorpo da invenção se liga ao LAG-3 humano com alta afinidade.
Outras propriedades funcionais incluem a habilidade do anticorpo para estimular uma resposta imunitária, tal como uma resposta de célula T específica de antigénio. Isso pode ser testado, por exemplo, avaliando-se a habilidade do anticorpo para estimular a produção de interleucina-2 (IL-2) numa resposta de célula T específica de antigénio. Em determinadas formas de realização, o anticorpo se liga ao LAG-3 humano e estimula uma resposta de célula T específica de antigénio. Em outras formas de realização, o anticorpo se liga ao LAG-3 humano, mas não estimula uma resposta de célula T específica de antigénio. Outros meios para avaliar a capacidade do anticorpo para estimular uma resposta imunitária incluem testar sua habilidade para inibir crescimento tumoral, tal como num modelo de enxerto tumoral in vivo (veja-se, por exemplo, Exemplo 6) ou a habilidade para estimular uma resposta autoimune, tal como a habilidade para promover o desenvolvimento de uma doença autoimune num modelo autoimune, por exemplo, a habilidade para promover o desenvolvimento de diabetes no modelo de murganho NOD.
Anticorpos preferenciais da invenção são anticorpos monoclonals humanos. Adicional ou alternativamente, os anticorpos podem ser, por exemplo, anticorpos monoclonais quiméricos ou humanizados. LAG3.5 de Anticorpo Monoclonal
Um anticorpo preferencial da invenção é o anticorpo monoclonal humano, LAG3.5, estrutural e quimicamente distinguido conforme descrito abaixo e nos Exemplos seguintes. A sequência de aminoãcidos de VH de LAG3.5 é mostrada na SEQ ID NO: 12 (Figura 2A) . A sequência de aminoãcidos de VL de LAG3.5 é mostrada na SEQ ID NO: 14 (Figura 2B).
As sequências de VH e VL (ou sequências de CDR) de outros anticorpos anti-LAG-3 que se ligam a um LAG-3 humano podem ser Ãmisturadas e combinadasà com as sequências VH e VL (ou sequências de CDR) de anticorpo LAG3.5. Preferencialmente, quando as cadeias VHe VL (ou CDRs dentro de tais cadeias) são misturadas e combinadas, uma sequência de VH de um pareamento de VH/VL particular é substituída por uma sequência de VH estruturalmente semelhante. Igualmente, de preferência, uma sequência de VL de um pareamento de VH/VL particular é substituída por uma sequência de VL estruturalmente semelhante.
Consequentemente, numa forma de realização, anticorpos da invenção ou porções de ligação de antigénio dos mesmos compreendem: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende sequência de aminoãcidos SEQ ID NO: 12 (isto é, a VH de LAG3.5); e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende sequência de aminoãcidos SEQ ID NO: 14 (isto é, a VL de LAG3.5) ou a VL de outro anticorpo anti-LAG3 (isto é, que difere de LAG3.5); em que o anticorpo se liga especif icamente a um LAG-3 humano.
Anticorpos da invenção ou porções de ligação de antigénio dos mesmos compreendem: (a) regiões CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de LAG3.5, SEQ ID NOs: 15, 16 e 17, respetivamente; e (b) regiões CDR1, CDR2 e CDR3 cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de LAG3.5, SEQ ID NOs:18, 19 e 20, respetivamente; em que o anticorpo se liga especif icamente a um LAG-3 humano.
Adicionalmente, um anticorpo ou porção de ligação de antigénio do mesmo é descrito no presente documento que inclui a região CDR2 variável de cadeia pesada de LAG3.5 combinada com CDRs de outros anticorpos que se ligam a um LAG-3 humano, por exemplo, um CDR1 e/ou CDR3 da região variável de cadeia pesada, e/ou um CDR1, CDR2 e/ou CDR3 da região variável de cadeia leve de um anticorpo anti-LAG-3 diferente.
Adicionalmente, é bem conhecido na técnica que o domínio CDR3 sozinho, independentemente do domínio (ou domínios) CDR1 e/ou CDR2, pode determinar a especificidade de ligação de um anticorpo para um antigénio cognato e que múltiplos anticorpos podem ser gerados de modo previsível com a mesma especificidade de ligação com base numa sequência de CDR3 comum. Veja-se, por exemplo, Klimka et al. , British J. of Cancer B3(2):252 a 260 (2000); Beiboer et al, , J. Mol. BioL 296:833 a 849 (2000); Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 95:8.910 a 8.915 (1998); Barbas et al. , J. Am. Chem. Soc. 116:2.161 a 2.162 (1994); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 92:2.529 a 2.533 (1995); Ditzel et al. , J. Immunol. 157:739 a 749 (1996); Berezov et al. , BIAjournal 8:Scientific Review 8 (2001); Igarashi et al., J. Biochem (Tokyo) 117:452 a 457 (1995); Bourgeois et al., J. Virol 72:807 a 810 (1998); Levi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90:4.374 a 4.378 (1993) ; Polymenis e Stoller, J. Immunol. 152:5.218 a 5.329 (1994) e Xu e Davis, Immunity 13:37 a 45 (2000) . Veja-se também, os Documentos de Patente N— 6.951.646; 6.914.128; 6.090.382; 6.818.216; 6.156.313; 6.827.925; 5.833.943; 5.762.905 e 5.760.185.
Adicionalmente, os anticorpos são descritos no presente documento os quais incluem o CDR2 da região variável de cadeia pesada de LAG3.5 e pelo menos o CDR3 da região variável de cadeia pesada e/ou leve de LAG3.5 (SEQ ID NOs: 17 e/ou 20), ou o CDR3 da região variável de cadeia pesada e/ou leve de outro anticorpo LAG-3, em que o anticorpo tem capacidade para a ligação especificamente a um LAG-3 humano. Esses anticorpos competem preferencialmente (a) pela ligação; (b) retêm as características funcionais; (c) se ligam ao mesmo epítopo; e/ou (d) têm uma afinidade de ligação semelhante a LAG3.5. Os anticorpos podem incluir adicionalmente o CDR2 da região variável de cadeia leve de LAG3.5 (SEQ ID NOs: 17 e/ou 20), ou o CDR2 da região variável de cadeia leve de outro anticorpo de LAG-3, em que o anticorpo tem capacidade para se ligar especificamente a um LAG-3 humano. Os anticorpos podem incluir adicionalmente o CDR1 da região variável de cadeia pesada e/ou leve de LAG3.5 (SEQ ID NOs: 17 e/ou 20), ou o CDR1 da região variável de cadeia pesada e/ou leve de outro anticorpo LAG-3, em que o anticorpo tem capacidade para a ligação especificamente a um LAG-3 humano. Modificações Conservadoras
Adicionalmente, os anticorpos são descritos no presente documento os quais compreendem sequências de região variável de cadeia pesada e/ou leve ou sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 que diferem daquelas de LAG3.5 por uma ou mais modificações conservadoras. Preferencialmente, contudo, os resíduos 54 e 56 do CDR2 de VH permanecem como arginina e serina, respetivamente (isto é, não são modificadas). Compreende-se na técnica que determinada modificação de sequência conservadora pode ser feita a qual não remove a ligação de antigénio. Veja-se, por exemplo, Brummell et al. (1993) Biochem 32:1.180 a 1.188; de Wildt et al. (1997) Prot. Eng. 10:835 a 841; Komissarov et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:26.864 a 26.870; Hall et al. (1992) J. Immunol. 149:1.605 a 1.612; Kelley e O'Connell (1993) Biochem. 32:6.862 a 6.935; Adib-Conquy et al. (1998)
Int. Immunol. 10:341 a 346 e Beers et al. (2000) Clin. Can.
Res. 6:2.835 a 2.843. Consequentemente, um anticorpo é descrito no presente documento que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende sequências CDR1, CDR2 e CDR3 e/ou uma região variável de cadeia leve que compreende sequências CDR1, CDR2 e CDR3 em que: (a) a sequência de CDR1 de região variável de cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 15, e/ou modificações conservadoras da mesma, exceto nas posições 54 e 56; e/ou (b) a sequência de CDR3 de região variável de cadeia pesada compreende SEQ ID MO: 17 e modificações conservadoras da mesma; e/ou (c) as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendem SEQ ID NO: 18, e/ou, SEQ ID NO: 19, e/ou SEQ ID NO: 2 0 e/ou modificações conservadoras das mesmas; e (d) o anticorpo se liga especif icamente a um LAG-3 humano.
Adicional ou alternativamente, o anticorpo pode ter uma ou mais das seguintes propriedades funcionais descritas acima, tal como ligação de alta afinidade a um LAG-3 humano, ligação a um LAG-3 de macaco, ausência de ligação a murganho LAG- 3, a habilidade para inibir ligação de LAG-3 a moléculas de classe II MHC e/ou a habilidade para estimular respostas de célula T específica de antigénio. 0 anticorpo descrito no presente documento pode ser, por exemplo, um anticorpo humano, humanizado ou quimérico.
Conforme utilizado no presente documento, o termo Ãmodificações conservadoras de sequênciaà é destinado a referir-se a modificações de aminoácido que não afetam ou alteram significativamente as características de ligação do anticorpo que contém a sequência de aminoácidos. Tais modificações conservadoras incluem substituições, adições ou exclusões de aminoácido. As modificações podem ser introduzidas num anticorpo da invenção por técnicas padrão conhecidas na especialidade, tais como mutagénese direcionada a local e mutagénese mediada por PCR. As substituições conservadoras de aminoácido são aquelas em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral semelhante. As famílias de resíduos de aminoácido que têm cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais ramificadas em beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Portanto, um ou mais resíduos de aminoácido dentro das regiões de um anticorpo da invenção podem ser substituídos por outros resíduos de aminoácido da mesma família de cadeia lateral e o anticorpo alterado pode ser testado em relação à função retida (isto ê, as funções estabelecidas acima) utilizando os ensaios funcionais descritos no presente documento.
Anticorpos Projetados e Modificados
Anticorpos podem ser preparados utilizando um anticorpo que tem um ou mais das sequências de VH e/ou VL de LAG3.5 como material de partida para projetar um anticorpo modificado. Um anticorpo pode ser projetado modificando-se um ou mais resíduos dentro de uma ou ambas as regiões variáveis (isto ê, VH e/ou VL) , por exemplo dentro de um ou mais regiões de CDR e/ou dentro de uma ou mais regiões estruturais. Adicional ou alternativamente, um anticorpo pode ser projetado modificando-se resíduos dentro da região (ou regiões) constante, por exemplo, para alterar a função (ou funções) efetoras do anticorpo.
Em determinadas formas de realização, o enxerto de CDR pode ser utilizado para projetar regiões variáveis de anticorpos. Anticorpos interagem com os antigénios alvo predominantemente através de resíduos de aminoácido que são localizados nas seis regiões de determinação de complementaridade de cadeia pesada e leve (CDRs). Por esse motivo, as sequências de aminoácidos dentro de CDRs são mais diversas entre anticorpos individuais do que nas sequências fora de CDRs. Devido ao facto de as sequências de CDR serem responsáveis pela maioria das interações anticorpo-antigénio, é possível expressar anticorpos recombinantes que imitam as propriedades de anticorpos que ocorrem naturalmente específicos construindo-se vetores de expressão que incluem sequências de CDR a partir do anticorpo que ocorre naturalmente específico enxertado nas sequências estruturais a partir de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (veja-se, por exemplo, Riechmann et al. (1998) Nature 332:323 a 327j_ Jones et al. (1986) Nature 321:522 a 525j_ Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10.029 a 10.033; Documentos de Patente ns U.S. 5.225.539; 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370). A invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação de antigénio do mesmo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 que compreendem SEQ ID NOs: 15, 16, 17, respetivamente, e uma região variável de cadeia leve que compreende sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 que compreendem SEQ ID NOs: 18, 19, 20, respetivamente (isto é, as CDRs de LAG3.5). Embora esses anticorpos contenham as sequências de CDR de VH eVL de anticorpo monoclonal LAG3.5, os mesmos podem conter sequências estruturais diferentes.
Tais sequências estruturais podem ser obtidas a partir de bancos de dados de DNA públicos ou referências publicadas que incluem sequências genéticas de anticorpo de linha germinativa. Por exemplo, as sequências de DNA de linha germinativa para genes de região variável de cadeia pesada e leve humanos podem ser encontradas no banco de dados de sequência de linha germinativa humana ÃVBaseà (disponível em www.mrc- cpe.cam.ac.uk/vbase), assim como em
Kabat et al. (1991), supra citado; Tomlinson et al. (1992) ÃThe Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals About Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loopsà J. Mol. Biol. 227:776 a 798; e Cox et al. (1994) ÃA Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usageà Eur. J. Immunol. 24:827 a 836. Como outro exemplo, as sequências de DNA de linha germinativa para genes de região variável de cadeia pesada e leve humanos podem ser encontradas no banco de dados Genbank. Por exemplo, as seguintes sequências de linha germinativa de cadeia pesada encontradas no murganho HuMAb HCo7 estão disponíveis no Número de Acesso ao Genbank N—: 1-69 (NG__001Q10 9, NT__024637 e BCQ70333), 3-33 (NG_0010109 e NT_024637) e 3-7 (NG_0010109 e NT_024637) . Como outro exemplo, as seguintes sequências de linha germinativa de cadeia pesada encontradas no murganho HuMAb HCol2 estão disponíveis no Número de Acesso ao Genbank N—: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 e BC070333), 5-51 (NG_0010109 e NT__024 63 7) , 4-34 (NG_0010109 e NT_024637), 3-30.3 (CAJ556644) e 3-23 (AJ406678).
As sequências de proteína de anticorpo são comparadas ao banco de dados de sequência de proteína compilada utilizando um dos métodos de procura por similaridade de sequência denominados BLAST intervalado (Altschul et al. (1997), supra), que é bem conhecido pelos peritos na especialidade.
Sequências estruturais preferenciais para utilização nos anticorpos da invenção são aquelas que são estruturalmente semelhantes às sequências estruturais utilizadas por anticorpos selecionados da invenção, por exemplo, semelhante às sequências estruturais 4-34 VH e/ou as sequências estruturais VK L6 utilizadas por anticorpos monoclonais preferenciais da invenção. As sequências de VH CDR1, CDR2 e CDR3, e as sequências de VK CDR1, CDR2 e CDR3 podem ser enxertadas nas regiões estruturais que têm a sequência idêntica àquela encontrada no gene de imunoglobulina de linha germinativa a partir do qual a sequência estrutural deriva, ou as sequências de CDR podem ser enxertadas em regiões estruturais que contêm uma ou mais mutações em comparação com as sequências de linha germinativa. Por exemplo, constatou-se que em determinados casos é benéfico modificar resíduos dentro das regiões estruturais para manter ou aprimorar a habilidade de ligação de antigénio do anticorpo (veja-se por exemplo, Documentos de Patente n— U.S. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370) .
Outro tipo de modificação de região variável é a modificação de resíduos de aminoácido dentro das regiões CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de VH e/ou VL para aprimorar, desse modo, uma ou mais propriedades de ligação (por exemplo, afinidade) do anticorpo de interesse. A mutagénese direcionada a local ou mutagénese mediada por PCR pode ser realizada para introduzir a mutação (ou mutações) e o efeito na ligação de anticorpo ou outra propriedade funcional de interesse pode ser avaliado em ensaios in vitro ou in vivo conforme descrito no presente documento e fornecido nos Exemplos. Preferencialmente, as modificações conservadoras (conforme discutido acima) são introduzidas. As mutações podem ser substituições, adições ou exclusões de aminoácido, mas são preferencialmente, substituições. Além disso, tipicamente não mais de um, dois, três, quatro ou cinco resíduos dentro de uma região CDR são alterados.
Consequentemente, anticorpos monoclonais anti-LAG-3 isolados ou porções de ligação de antigénio dos mesmos são descritos no presente documento os quais compreendem uma região variável de cadeia pesada que compreende; (a) uma região CDR1 de VH que compreende SEQ ID NO: 15, ou uma sequência de aminoácidos que tem uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, exclusões ou adições de aminoácidos em comparação com SEQ ID NO: 15; (b) uma região CDR2 de VH que compreende SEQ ID NO: 16, ou uma sequência de aminoãcidos que tem uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, exclusões ou adições de aminoácido em comparação com SEQ ID NO: 16 (preferencialmente, em que as posições 54 e 56 são as mesmas em SEQ ID NO: 16) ; (c) uma região CDR3 de VH que compreende SEQ ID NO: 17, ou uma sequência de aminoãcidos que tem uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, exclusões Ou adições de aminoácido em comparação com SEQ ID NO: 17; (d) uma região CDR1 de VL que compreende SEQ ID NO: IS ou uma sequência de aminoãcidos que tem uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, exclusões ou adições de aminoácido em comparação com SEQ ID NO: 18; (e) uma região CDR2 de VL que compreende SEQ ID NO: 19 ou uma sequência de aminoãcidos que tem uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, exclusões adições de aminoácido em comparação com SEQ ID NO: 19; e (f) uma região CDR3 de VL que compreende SEQ ID NO: 2 0 ou uma sequência de aminoãcidos que tem uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, exclusões ou adições de aminoácido em comparação com SEQ ID NO: 20.
Anticorpos projetados da invenção incluem aqueles em que modificações foram feitas em resíduos estruturais dentro de VH e/ou VL, por exemplo, para aprimorar as propriedades do anticorpo. Tipicamente, tais modificações estruturais são feitas para diminuir a imunogenicidade do anticorpo. Por exemplo, uma abordagem é Ãretromodificarà um ou mais resíduos estruturais para a sequência de linha germinativa correspondente. Mais especificamente, um anticorpo que foi submetido à mutação somática pode conter resíduos estruturais que diferem da sequência de linha germinativa da qual o anticorpo é derivado. Tais resíduos podem ser identificados comparando-se as sequências estruturais de anticorpo às sequências de linha germinativa das quais o anticorpo é derivado.
Outro tipo de modificação estrutural envolve mudar um ou mais resíduos dentro da região estrutural para remover epítopos de célula T para reduzir, desse modo, a imunogenicidade potencial do anticorpo. Essa abordagem também é denominada Ãdesimunizaçãoà e é descrita em detalhes adicionais na Publicação de Patente n- U.S. 20030153043.
Adicional ou alternativamente às modificações feitas dentro das regiões estruturais, os anticorpos da invenção podem ser projetados para incluir modificações dentro da região Fc, tipicamente para alterar um ou mais propriedades funcionais do anticorpo, tais como meia-vida de soro, fixação de complemento, ligação de recetor de Fc e/ou citotoxidade celular dependente de antigénio. Ademais, um anticorpo da invenção pode ser quimicamente modificado (por exemplo, uma ou mais porções químicas podem ser fixadas ao anticorpo) ou pode ser modificado para alterar sua glicosilação, novamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Cada uma dessas formas de realização é descrita em detalhes adicionais abaixo. A numeração de resíduos na região Fc é aquela do índice europeu de Kabat..
Numa forma de realização preferencial, o anticorpo é um anticorpo de isotipo IgG4 que compreende uma mutação de Serina para Prolina numa posição correspondente à posição 228 (S228P; índice europeu) na região de articulação da região constante de cadeia pesada. Essa mutação foi constatada abolir a heterogeneidade de interpontes de dissulfeto de cadeia pesada na região de articulação (Angal et al. supra; posição 241 com base no sistema de numeração de Kabat).
Numa forma de realização, a região de articulação de CHI é modificada de modo que o número de resíduos de cisteína na região de articulação seja alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Essa abordagem é descrita adicionalmente na Patente n- U.S. 5.677.425. 0 número de resíduos de cisteína na região de articulação de CHI é alterado para, por exemplo, facilitar a montagem das cadeias leve e pesada ou para aumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo.
Em outra forma de realização, a região Fc de articulação de um anticorpo é modificada para diminuir a meia-vida biológica do anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoãcido são introduzidas na interface de domínio CH2-CH3 do fragmento de articulação de Fc de modo que o anticorpo tenha enfraquecido a ligação de proteína A de Staphylococcyl (SpA) em relação à ligação de SpA de domínio de articulação de Fc nativo. Essa abordagem é descrita em detalhes adicionais na Patente n£ U.S. 6.165.745 .
Em outra forma de realização, o anticorpo é modificado para aumentar sua meia-vida biológica. Várias abordagens são possíveis. Por exemplo, uma ou mais das seguintes mutações podem ser introduzidas: T252L, T254S, T256F, conforme descrito na Patente n-9- U.S. 6.277.375. Alternativamente, para aumentar a meia-vida biológica, o anticorpo pode ser alterado dentro da região CHI ou CL para conter um epítopo de ligação de recetor de resgate tomado dos dois laços de um domínio CH2 de uma região Fc de uma IgG, conforme descrito nas Patentes n— U.S. 5.869.046 e 6.121.022.
Em ainda outras formas de realização, a região Fc é alterada substituindo-se pelo menos um resíduo de aminoãcido por um resíduo de aminoãcido diferente para alterar a função (ou funções) de efetor do anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoãcidos selecionados a partir de resíduos de aminoãcido 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 e 322 podem ser substituídos por um resíduo de aminoãcido diferente de modo que o anticorpo tenha uma afinidade alterada com um ligante efetor, mas retenha a habilidade de ligação de antigénio do anticorpo parente. 0 ligante efetor cuja afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um recetor de Fc ou o componente Cl de complemento. Essa abordagem é descrita em detalhes adicionais nas Patentes n— U.S. 5.624.821 e 5.648.260.
Em outro exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados a partir de resíduos de aminoácido 329, 331 e 322 podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido diferente de modo que o anticorpo tenha ligação de Clq alterada e/ou citotoxidade dependente de complemento (CDC) reduzida ou abolida. Essa abordagem é descrita em detalhes adicionais na Patente n2 U.S. 6.194.551.
Em outro exemplo, um ou mais resíduos de aminoácido dentro das posições de aminoácido 231 e 239 são alterados para, desse modo, alterar a habilidade do anticorpo de fixar complemento. Essa abordagem é descrita adicionalmente na Publicação PCT WO 94/29351.
Em ainda outro exemplo, a região Fc é modificada para aumentar a habilidade do anticorpo para mediar citotoxidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou para aumentar a afinidade do anticorpo para um recetor de Fcy modificando-se um ou mais aminoácidos nas seguintes posições: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ou 439. Essa abordagem é descrita adicionalmente na Publicação PCT WO 00/42072. Além disso, os locais de ligação em IgGl humano para FcyRI, FcyRII, FcyRIII e FcRn foram mapeados e variantes com ligação aprimorada foram descritas (veja-se Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6.591 a 6604) . Mutações específicas nas posições 256, 290, 298, 333, 334 e 339 demonstraram aprimorar a ligação a FcyRIII. Adicionalmente, os mutantes de combinação seguintes demostraram aprimorar a ligação a
FcyRI11 : T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A β S2 98A/E333A/K3 3 4A.
Em ainda outra forma de realização, a glicosilação de um anticorpo é modificada. Por exemplo, um anticorpo glicosilado pode ser feito (isto ê, o anticorpo é desprovido de glicosilação) . A glicosilação pode ser alterada para, por exemplo, aumentar a afinidade do anticorpo para antigénio. Tais modificações de hidrato de carbono podem ser alcançadas, por exemplo, alterando-se um ou mais locais de glicosilação dentro da sequência de anticorpo. Por exemplo, uma ou mais substituições de aminoãcido podem ser feitas as quais resultam na eliminação de um ou mais locais de glicosilação de estrutura de região variável para, desse modo, eliminar a glicosilação naquele local. Tal glicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo para o antigénio. Veja-se, por exemplo, as Patentes n— U.S. 5.714.350 e 6.350.861.
Adicional ou alternativamente, um anticorpo pode ser feito que tem um tipo alterado de glicosilação, tal como um anticorpo hipofucosilado que tem quantidades reduzidas de resíduos fucosil ou um anticorpo que tem estruturas de GlcNac de bissecção aumentadas. Tais padrões de glicosilação alterados foram demonstrados aumentar a habilidade de ADCC de anticorpos. Tais modificações de hidrato de carbono podem ser alcançadas, por exemplo, expressando-se o anticorpo numa célula hospedeira com maquinãrio de glicosilação alterado. As células com maquinário de glicosilação alterado foram descritas na técnica e podem ser utilizadas como células hospedeiras nas quais se expressa anticorpos recombinantes da invenção para, desse modo, produzir um anticorpo com glicosilação alterada. Por exemplo, as linhas de célula Ms704, Ms705, e Ms7 09 são desprovidas de gene de fucosiltransferase, FUT8 (α (1,6)-fucosiltransferase) , de modo que os anticorpos expressos nas linhas de célula em Ms704, Ms705 e Ms709 sejam desprovidos de fucose em seus hidratos de carbono. As linhas de célula Ms704, Ms705 e Ms709 ΡυΤ8’/_ foram criadas pela interrupção alvejada do gene FUT8 nas células CH0/DG44 utilizando dois vetores de substituição (veja-se Publicação de Patente n- U.S. 20040110704 e Yamane- Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614 a 622). Como outro exemplo, o documento EP 1.176.195 descreve uma linhagem celular com um gene FUT8 de funcionalidade interrompida que codifica uma fucosil transferase, de modo que os anticorpos expressos em tal linhagem celular exibam hipofucosilação reduzindo-se ou eliminando-se a enzima relacionada à ligação cx-1,6. 0 documento EP 1.176.195 também descreve linhagens celulares que têm uma baixa atividade de enzima para adicionar fucose à N-acetilglucosamina que se liga à região Fc do anticorpo ou não tem a atividade de enzima, por exemplo a linhagem celular de mieloma de rato YB2/0 (ATCC CRL 1662) . A Publicação PCT n- WO 03/035835 descreve uma linhagem celular CHO variante, células Lecl3, com habilidade reduzida para fixar fucose a hidratos de carbono ligados a Asn(297), resultando também na hipofucosilação de anticorpos expressos naquela célula hospedeira (veja-se também Shields et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26.733 a 26.740). Anticorpos com um perfil de glicosilação modificada podem ser produzidos em ovos de galinha, conforme descrito na Publicação PCT n- WO 06/089231. Alternativamente, anticorpos com um perfil de glicosilação modificado podem ser produzidos em células de planta, tal como Lemna. Métodos de produção de anticorpos num sistema de planta são revelados no pedido de Patente n-9- U.S. correspondente a Alston & Bird LLP número do Dossiê do Advogado 040989/314911, depositado em 11 de agosto de 2006. A Publicação PCT n9 WO 99/54342 descreve linhagens celulares projetadas para expressar glicosil transferases modificadas por glicoproteína (por exemplo, β(1,4)-Ν-acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII)) de modo que anticorpos expressos nas linhagens celulares projetadas exibam estruturas de GlcNac de bissecção aumentadas o que resulta na atividade de ADCC aumentada dos anticorpos (veja-se também Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176 a 180). Alternativamente, os resíduos fucose do anticorpo podem ser clivados utilizando uma enzima fucosidase,· por exemplo, a fucosidase α-L-fucosidase remove resíduos fucosil de anticorpos (Tarentino et al. (1975) Biochem. 14:5.516 a 5.523).
Outra modificação dos anticorpos no presente documento que é contemplada por essa divulgação é a peguilado. Um anticorpo pode ser peguilado, por exemplo, para aumentar a meia-vida biológica (por exemplo, soro) do anticorpo. Para peguilar um anticorpo, o anticorpo ou fragmento do mesmo, tipicamente é reagido com polietileno glicol (PEG) , tal como um derivado de aldeído ou éster reativo de PEG, em condições em que um ou mais grupos de PEG se tornam fixados ao anticorpo ou fragmento de anticorpo. Preferencialmente, a peguilação é realizada através de uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula de PEG reativa (ou um polímero solúvel em água reativo análogo). Conforme utilizado no presente documento, o termo "polietileno glicol" se destina a englobar quaisquer formas de PEG que foram usadas para derivar outras proteínas, tais como mono (C1-C10) alcóxi-ou arilõxi-polietileno glicol ou polietileno glicol-maleimida. Em determinadas formas de realização, o anticorpo a ser peguilado é um anticorpo glicosilado. Métodos para peguilar proteínas são conhecidos na técnica e podem ser aplicados aos anticorpos da invenção. Veja-se, por exemplo, os documentos EP 0 154 316 e EP 0 401 384. Propriedades Físicas de Anticorpo
Os anticorpos da invenção podem ser distinguidos por suas várias propriedades físicas para detetar e/ou diferenciar classes diferentes dos mesmos.
Por exemplo, os anticorpos podem conter um ou mais locais de glicosilação na região variável de cadeia leve ou pesada. Tais locais de glicosilação podem resultar em imunogenicidade aumentada do anticorpo ou uma alteração do pK do anticorpo devido à ligação de antigénio alterada (Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673 a 702; Gala e Morrison (2004) J Immunol 172:5.489 a 5.494; Wallick et al (1988) JExp Med 168:1.099 a 1.109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R a 56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452 a 457; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697 a 706). A glicosilação tem demonstrado ocorrer em motivos que contêm uma sequência N-X-S/T. Em alguns casos, é preferível ter um anticorpo anti-LAG-3 que não contenha glicosilação de região variável. Isso pode ser alcançado selecionando-se anticorpos que não contêm o motivo de glicosilação na região variável ou mudando-se resíduos dentro da região de glicosilação.
Numa forma de realização preferencial, os anticorpos não contêm locais de isomerismo de asparagina. A desamidação de asparagina pode ocorrer em sequências N-G ou D-G e resultar na criação de um ácido isoaspãrtico que introduz uma imperfeição na cadeia de polipéptido e diminui sua estabilidade (efeito de ácido isoaspártico).
Cada anticorpo terá um único ponto isoelétrico (pi) que geralmente está na faixa de pH entre 6 e 9,5. 0 pi para um anticorpo IgGl está tipicamente dentro da faixa de pH de 7 a 9,5 e o pi para um anticorpo IgG4 está tipicamente dentro da faixa de pH de 6 a 8. Hã uma especulação de que anticorpos com um pl fora da faixa normal podem ter algum desdobramento e instabilidade em condições in vivo. Portanto, é preferível ter um anticorpo anti-LAG-3 que contém um valor de pl esteja dentro da faixa normal. Isso pode ser alcançado selecionando-se anticorpos com um pl na faixa normal ou modificando-se resíduos de superfície carregados.
Moléculas de Ácido Nucleico Codificadoras de Anticorpos da Invenção
Em outro aspeto, a invenção fornece moléculas de ácido nucleico que codificam regiões variáveis de cadeia pesada e leve, ou CDRs, dos anticorpos da invenção. Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células inteiras, Num lisado de célula ou numa forma substancialmente pura ou parcialmente purificada. Um ácido nucleico é "isolado" ou "considerado substancialmente puro" quando purificado longe de outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucleicos celulares ou proteínas, por técnicas padrão, o que inclui tratamento com alcalina/SDS, bandamento CsCl, cromatográfica de coluna, eletroforese de gel de agarose e outras conhecidas na especialidade. Veja-se, Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing e Wiley Interscience, Nova Iorque. Um ácido nucleico da invenção pode ser, por exemplo, DNA ou RNA e pode ou não conter sequências intrónicas. Numa forma de realização preferencial, o ácido nucleico é uma molécula de cDNA.
Os ácidos nucleicos da invenção podem ser obtidos utilizando técnicas de biologia molecular padrão. Para anticorpos expressos por hibridomas (por exemplo, hibridomas preparados a partir de ratinhos transgénicos que carregam genes de imunoglobulina humana conforme descrito adicionalmente abaixo), cDNAs codificadores de cadeias leve e pesada do anticorpo feitos pelo hibridoma podem ser obtidos por técnicas padrão de amplificação de PCR ou clonagem de cDNA. Para anticorpos obtidos a partir de uma biblioteca de gene de imunoglobulina (por exemplo, utilizando técnicas de exibição de fago), um ácido nucleico codificador de tais anticorpos pode ser recuperado a partir da biblioteca genética.
As moléculas de ácidos nucleicos preferenciais da invenção incluem aquelas codificadoras das sequências VH e VL de anticorpo monoclonal LAG3.5 (SEQ ID NOs : 12 e 14, respetivamente) . Uma vez que os fragmentos de DNA codificadores dos segmentos VH e VL são obtidos, esses fragmentos de DNA podem ser adicionalmente manipulados por técnicas de DNA recombinante padrão, por exemplo, para converter os genes de região variável para genes de cadeia de anticorpo de comprimento completo, para genes de fragmento Fab ou para um gene scFv. Nessas manipulações, um fragmento de DNA codificador de VL- ou VH é operativamente unido a um fragmento de DNA codificador de outra proteína, tal como uma região constante de anticorpo ou um ligante flexível. 0 termo Ãoperativamente ligadoÃ, conforme utilizado nesse contexto, pretende significar que dois fragmentos de DNA são unidos de modo que as sequências de aminoãcidos codificadas pelos dois fragmentos de DNA permanecem na estrutura. 0 DNA isolado codificador da região VH pode ser convertido para um gene de cadeia pesada de comprimento completo ligando-se operativamente o DNA codificador de VH para outra molécula de DNA codificadora de regiões constantes de cadeia pesada (CHI, CH2 e CH3). As sequências de genes de região constante de cadeia pesada humanos são conhecidas na técnica (veja-se por exemplo, Kabat et al. (1991) , supra) e fragmentos de DNA que englobam essas regiões podem ser obtidos pela amplificação de PCR padrão. A região constante de cadeia pesada pode ser uma região constante IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD, porém, mais preferencialmente, é uma região constante IgGl ou IgG4. Para um gene de cadeia pesada de fragmento Fab, o DNA codificador de VH pode ser operativamente unido à outra molécula de DNA codificadora apenas da região constante CHI de cadeia pesada. 0 DNA isolado codificador da região VL pode ser convertido para um gene de cadeia leve de comprimento completo (assim como um gene de cadeia leve de Fab) ligando-se operativamente o DNA codificador de VL à outra molécula de DNA codificadora da região constante de cadeia leve, CL. As sequências de genes de região constante de cadeia leve são conhecidos na técnica (veja-se por exemplo, Kabat et al., supra) e fragmentos de DNA que englobam essas regiões podem ser obtidos por amplificação de PCR padrão. Em formas de realização preferenciais, a região constante de cadeia leve pode ser uma região constante em kappa ou lambda.
Para criar um gene scFv, os fragmentos de DNA codificadores de VH e VL são operativamente unidos a outro fragmento codificador de um ligante flexível, por exemplo, codificador da sequência de aminoácidos (Gly4-Ser)3, de modo que as sequências de VH e VL possam ser expressas como uma proteína de cadeia única contígua, com as regiões VL e VH unidas pelo ligante flexível (veja-se por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423 a 426y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5.87 9 a 5.883; McCafferty et al. , (1990) Nature 348:552 a 554) .
Produção de Anticorpos Monoclonais
Os anticorpos monoclonais (tnAbs) podem ser produzidos utilizando a técnica de hibridização (hibridoma) de célula somática bastante conhecida de Kohler e Milstein (1975) Nature 256: 495. Outras formas de realização para produzir anticorpos monoclonais incluem técnicas de transformação virai ou oncogénica de linfócitos B e exibição de fago. Os anticorpos quiméricos ou humanizados são também bem conhecidos na técnica. Veja-se, por exemplo, as Patentes n— U.S. 4.816.567; 5.225.539; 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370.
Anticorpos monoclonais humanos direcionados contra LAG-3 humano podem ser gerados utilizando ratinhos transgénicos ou transcromossõmicos que carregam partes do sistema imunitário humano em vez de sistema de murganho. Esses ratinhos transgénicos e transcromossõmicos incluem ratinhos denominados no presente documento como os HuMAb Mouse® e KM Mouse®, respetivamente, e são coletivamente chamados no presente documento de Ãratinhos Ig humanosÃ.
Os HuMAb Mouse® (Medarex®, Inc.) contêm minilocais de gene de imunoglobulina humana que codificam sequências de imunoglobulina de cadeia pesada (μ e γ) e κ humanas desarranjadas, junto com mutações alvejadas que inativam os locais de cadeia μ e κ endógenos (veja-se por exemplo, Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856 a 859). Consequentemente, os ratinhos exibem expressão reduzida de murganho IgM ou κ, e em resposta à imunização, os transgenes de cadeia pesada e leve humanos são submetidos à comutação de classe e mutação somática para gerar anticorpos monoclonais IgGr humanos de alta afinidade (Lonberg et al. (1994), supra; revisado em Lonberg (1994)
Handbook of Experimental Pharmacology 113:49 a 101; Lonberg, N. e Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65 a 93, e Harding e Lonberg (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536 a 546). A preparação e utilização do HuMAb Mouse® e as modificações genómicas realizadas por tais ratinhos são adicionalmente descritos em Taylor et al. (1992) Nucleic
Acids Research 20:6.287 a 6.295; Chen et al. (1993) International Immunology 5: 647 a 656 ; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3.720 a 3.724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117 a 123; Chen et al. (1993) EMBO J. 12: 821 a 830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2.912 a 2.920j Taylor et al. (1994) International
Immunology 6: 579 a 591; and Fishwild et al. (1996) Nature
Biotechnology 14: 845 a 851. Veja-se adicionalmente, as
Patentes n— U.S. 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318;
5.874.299; 5.770.429 e 5.545.807; Publicação PCT n— WO 92/03918; WO 93/12227; WO 94/25585; WO 97/13852; WO 98/24884; WO 99/45962 e WO 01/14424.
Adicionalmente, anticorpos humanos podem ser elevados utilizando um murganho que carrega sequências de imunoglobulina humana em transgenes e transcromossomas, tal murganho que carrega um transgene de cadeia pesada humano e um transcromossoma de cadeia leve humano. Esse murganho é denominado no presente documento um ÃKM mouse®Ã e é descrito em detalhes na Publicação PCT WO 02/43478. Uma forma modificada desse murganho, que adicionalmente compreende uma interrupção homozigota do gene recetor de FcyRIIB endógeno, também é descrita na Publicação PCT WO 02/43478 e denominada no presente documento ÃKM/FCGR2D mouse®Ã Adicionalmente, ratinhos com os transgenes de cadeia pesada HCo7 ou HCol2 ou ambos podem ser utilizados.
Animais transgénicos adicionais que podem ser utilizados para gerar anticorpos humanos incluem o Xenomouse (Abgenix, Inc., Patentes n— US 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 e 6.162.963), ÃTC miceà (Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97;722 a 727) e vacas que carregam transcromossomas de cadeia pesada e leve humanos (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889 a 894; Publicação PCT WO 02/092812).
Adicionalmente, anticorpos monoclonais humanos podem ser preparados utilizando métodos de exibição de fago para varrer bibliotecas de genes de imunoglobulina humana. Veja-se, por exemplo, as Patentes n— US 5.223.409; 5,403,484; 5.571.698; 5.427.908; 5.580.717; 5.969.108; 6.172.197; 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915; e 6.593.081 .
Os anticorpos monoclonais humanos podem ser também preparados utilizando ratinhos SCID nos quais células imunológicas humanas foram reconstituídas de modo que uma resposta de anticorpo humano pudesse ser gerada com a imunização. Veja-se, por exemplo, Patentes n— US 5.476.996 e 5.698.767.
Adicionalmente, anticorpos humanos anti-LAG-3 podem ser preparados utilizando exibição de fago em que os fagos compreendem ácidos nucleicos que codificam anticorpos gerados em animais transgénicos previamente imunizados com LAG-3. Preferencialmente, o animal transgénico é um murganho HuMab, KM ou Kirin. Veja-se, por exemplo a Patente n-U.S. 6.794.132.
Imunização de ratinhos de Ig Humana
Os ratinhos de Ig humana podem ser imunizados com uma preparação purificada ou enriquecida de um antigénio de LAG-3, proteína de LAG-3 recombinante ou células que expressam uma proteína de LAG-3. Veja-se, por exemplo, Lonberg et al. (1994), supra; Fishwild et al. (1996), supra; Publicações PCT n— WO 98/24884 ou WO 01/14424.
Preferencialmente, ratinhos com 6 a 16 semanas de idade são imunizados com 5 a 50 pg de proteína de LAG-3.
Alternativamente, uma porção de LAG-3 fundida a um polipéptido não de LAG-3 é utilizada.
Os ratinhos transgénicos podem ser imunizados intraperitonealmente (IP) ou intravenosamente (IV) com antigénio de LAG-3 em adjuvante de Freund completo, seguido por imunizações de IP ou IV subsequentes com o antigénio em adjuvante de Freund incompleto. Adjuvantes diferente de Freund ou células inteiras na ausência de adjuvante podem ser utilizadas. 0 plasma pode ser varrido por ELISA e células de ratinhos com títulos suficientes de imunoglobulina humana anti-LAG-3 podem ser utilizadas para fusões.
Geração de Hibridomas que Produzem Anticorpos Monoclonais Humanos
Para gerar hibridomas que produzem anticorpos monoclonais humanos, células de esplenõcitos e/ou nós linfáticos de ratinhos imunizados podem ser isoladas e fundidas a uma linhagem celular imortalizada apropriada, tal como uma linhagem celular de mieloma de murganho. Os hibridomas resultantes podem ser varridos para a produção de anticorpos específicos de antigénio. Geração de hibridomas é bastante conhecida na técnica. Veja-se, por exemplo, Harlow e Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nova Iorque. Geração de Transfetomas que Produzem Anticorpos Monoclonais da Invenção
Os anticorpos da invenção podem ser produzidos num transfetoma de célula hospedeira utilizando, por exemplo, uma combinação de técnicas de DNA recombinante e métodos de transfeção genética conforme é bem conhecido na técnica (por exemplo, Morrison, S. (1985) Science 229:1202). Numa forma de realização, o DMA codificador de cadeias pesada e leve de comprimento completo ou parcial obtido por técnicas de biologia molecular padrão é inserido num ou mais vetores de expressão de modo que os genes sejam operativamente unidos a sequências reguladoras translacionais e transcricionais. Nesse contexto, o termo "ligado operativamente" pretende significar que um gene de anticorpo é ligado a um vetor de modo que sequências de controlo transcricional e transcricional dentro do vetor sirvam às suas funções pretendidas de regular a transcrição e tradução do gene de anticorpo. 0 termo "sequência reguladora" destina-se a incluir promotores, Intensificadores e outros elementos de controlo de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou tradução dos genes de cadeia de anticorpo. Tais sequências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Sequências reguladoras preferenciais para expressão de célula hospedeira de mamífero incluem elementos virais que direcionam os altos níveis de expressão de proteína em células de mamíferos, tais como promotores e./ou intensificadores derivados de citomegalovírus (CMV), Simian Virus 40 (SV40), adenovirus, (por exemplo, o promotor tardio principal de adenovirus (AdMLP) e polioma.
Alternativamente, sequências reguladoras não virais podem ser utilizadas, tais como o promotor de ubiquitina ou promotor de β-globina. Ainda adicionalmente, elementos reguladores compostos de sequências a partir de diferentes fontes, tal como o sistema promotor de SRa, que contêm sequências do promotor prévio de SV40 e a repetição de terminal longo de vírus de leucemia de célula T humana tipo 1 (Takebe et ai. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466 a 472) . 0 vetor de expressão e sequências de controlo de expressão são escolhidos para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão utilizada. 0 gene de cadeia leve de anticorpo e o gene de cadeia pesada de anticorpo podem ser inseridos no mesmo ou em vetores de expressão separados. Em formas de realização preferenciais, as regiões variáveis são utilizadas para criar genes de anticorpo de comprimento completo de qualquer isotipo de anticorpo inserindo-se os mesmos nos vetores de expressão que jã codificam regiões constantes de cadeia pesada e regiões constantes de cadeia leve do isotipo desejado de modo que o segmento VH seja operativamente unido ao segmento (ou segmentos) de CH dentro do vetor e o segmento VL é operativamente unido ao segmento CL dentro do vetor. Adicional ou alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um péptido de sinal que facilita a secreção da cadeia de anticorpo a partir de uma célula hospedeira. 0 gene de cadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor de modo que o péptido de sinal seja ligado à estrutura ao terminal amino do gene de cadeia de anticorpo. 0 péptido de sinal pode ser um sinal de péptido de imunoglobulina ou um péptido de sinal heterólogo (isto é, um péptido de sinal de uma proteína não de imunoglobulina).
Adicionalmente aos genes de cadeia de anticorpo e sequências reguladoras, os vetores de expressão recombinantes da invenção podem carregar sequências adicionais, tais como sequências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes de marcador selecionável. 0 gene de marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras nas quais o vetor foi introduzido (veja-se, por exemplo, Patente n-U.S. 4.399.216; 4.634.665 e 5.179.017). Por exemplo, tipicamente o gene de marcador selecionável confere resistência a fármacos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, numa célula hospedeira na qual o vetor foi introduzido. Os genes de marcador selecionável preferenciais incluem o gene de dihidrofolato redutase (DHFR) (para utilização em células hospedeiras dhfr com seleção/'amplificação de metotrexato) e o neo gene (para seleção de G418).
Para a expressão das cadeias pesada e leve, o vetor de expressão (ou vetores de expressão) codificadores de cadeias pesada e leve é transfetado para uma célula hospedeira por técnicas padrão. As várias formas do termo Ãtransfeçãoà pretendem englobar uma grande variedade de técnicas comumente utilizadas para a introdução de DNA exógeno numa célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, transfeção de DEAE-dextrano e semelhantes. Embora seja teoricamente impossível expressar os anticorpos da invenção em células hospedeiras eucarióticas ou procarióticas, a expressão de anticorpos em células eucarióticas, e mais preferencialmente, células hospedeiras de mamífero, é a mais preferível devido ao facto de que tais células eucarióticas, e em particular células de mamíferos, têm maior probabilidade do que as células procarióticas de montar e secretar um anticorpo apropriadamente dobrado e imunologicamente ativo. Células hospedeiras de mamífero preferenciais para expressar os anticorpos recombinantes da invenção incluem Ovário de Hamster Chinês (células CHO) (o que inclui células CHO” CHO, descritas em Urlaub e Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4.216 a 4.220, utilizadas com um marcador selecionãvel DHFR, por exemplo, conforme descrito em R. J. Kaufman e P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601 a 621), Células de mieloma de NSO, Células de COS e células de SP2. Em particular, para a utilização com células de mieloma de NSO, outro sistema de expressão preferencial é o sistema de expressão genética GS revelado nos documentos n-°£ WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338.841. Quando vetores de expressão recombinantes codificadores de genes de anticorpo são introduzidos em células hospedeiras de mamífero, os anticorpos são produzidos cultivando-se as células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferencialmente, a secreção do anticorpo no meio de cultura em que as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser recuperados a partir do meio de cultura utilizando métodos de purificação de proteína padrão.
Imunoconjugados
Os anticorpos da invenção podem ser conjugados a um agente terapêutico para formar um imunoconjugado tal como um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC). Agentes terapêuticos adequados incluem antimetabólitos, agentes alquilantes, ligantes de sulco menor de DNA, intercaladores de DNA, reticuladores de DNA, inibidores de histona deacetilase, Inibidores de exportação nuclear, inibidores de proteasssoma, inibidores de topoisomerase I ou II, inibidores de proteína de choque térmico, inibidores de tirosina quinase, antibióticos e agente antimitõticos. No ADC, o anticorpo e o agente terapêutico são preferencialmente conjugados através de um ligante passível de clivagem tal como um ligante de peptidila, dissulfeto, ou hidrazona. Mais preferencialmente, o ligante é um ligante de peptidila tal como Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-
Vai, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser ou Glu. Os ADCs podem ser preparados conforme descrito nas Patentes n— US 7.087.600; 6.989.452 e 7.129.261; Publicações PCT n— WO 02/096910; WO 07/038658; WO 07/051081; WO 07/059404; WO 08/083312 e WO 08/103693; Publicações de Patente n— U.S. 20060024317; 20060004081 e 20060247295.
Moléculas Biespecíficas
Em outro aspeto, a presente divulgação apresenta moléculas biespecíficas que compreendem um ou mais anticorpos da invenção unidos a pelo menos um outro anticorpo ou porção de ligação de antigénio do mesmo para gerar uma molécula biespecífica que se liga a pelo menos dois locais de ligação ou moléculas alvo diferentes. Portanto, conforme utilizado no presente documento, "molécula biespecífica" inclui moléculas que têm três ou mais especificidades. Numa forma de realização preferencial, a molécula biespecífica compreende uma primeira especificidade de ligação para LAG-3 e uma segunda especificidade de ligação para uma molécula de acionamento que recruta células efetoras citotóxicas que podem exterminar uma célula alvo de expressão de LAG-3. Exemplos de moléculas de acionamento adequadas são CD64, CD89, CD16 e CD3. Veja-se, por exemplo, Kufer et aí., TRENDS in Biotechnology, 22 (5), 238 a 244 (2004).
Numa forma de realização, uma molécula biespecífica tem, adicionalmente a uma especificidade de ligação anti-Fc e uma especificidade de ligação anti-LAG-3, uma terceira especificidade. A terceira especificidade pode ser para um fator anti-intensificação (EF), por exemplo, uma molécula que se liga a uma proteína de superfície envolvida em atividade citotõxica e, portanto, aumenta a resposta imunitária contra a célula alvo. Por exemplo, 0 fator anti-intensificação pode ligar-se a uma célula T citotõxica (por exemplo, através de CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40 ou ICAM- 1) ou outra célula imune, o que resulta numa resposta imunitária aumentada contra a célula alvo.
Moléculas biespecíficas podem vir em diferentes tamanhos e formatos. Numa extremidade do espectro de tamanho, uma molécula biespecífica retém o formato de anticorpo tradicional, exceto pelo facto de que, em vez de ter dois braços de ligação de especificidade idêntica, a mesma tem dois braços de ligação casa um com uma especificidade diferente. No outro extremo estão moléculas biespecíficas que consistem em dois fragmentos de cadeia única de anticorpo (scFvs) ligados por uma cadeia de péptido, um constructo chamado de Bs(scFv)2. As moléculas biespecíficas de tamanho intermediário incluem dois fragmentos F(ab) diferentes ligados ao ligante de peptidila. As moléculas biespecíficas desses e de outros formatos podem ser preparadas por engenharia genética, hibridização somática ou métodos químicos. Veja-se, por exemplo, Kufer et al, citado supra; Cao e Suresh,
Bioconjugate Chemistry, 9 (6), 635-644 (1998); e van Spriel et al., Immunology Today, 21 (8), 391 a 397 (2000), e as referências citadas nos mesmos.
Composições Farmacêuticas
Em outro aspeto, a presente divulgação fornece uma composição farmacêutica que compreende um ou mais anticorpos da presente invenção formulados juntos com um transportador farmaceuticamente aceitável. A composição pode conter opcionalmente um ou mais ingredientes ativos farmaceuticamente adicionais, tal como outro anticorpo ou um fãrmaco. As composições farmacêuticas da invenção podem também ser administradas numa terapêutica de combinação com, por exemplo, outro agente imunoestimulante, agente anticancro, um agente antiviral, ou uma vacina, de modo que o anticorpo anti-LAG-3 intensifique a resposta imunitária contra a vacina. A composição farmacêutica pode compreender qualquer número de excipientes. Os excipient.es que podem ser utilizados incluem transportadores, agentes ativos de superfície, agentes espessantes ou emulsificantes, ligantes sólidos, auxiliares de dispersão ou suspensão, solubi1izantes, corantes, agentes flavorizantes, revestimentos, Agentes desintegrantes, lubrificantes, adoçantes, conservantes, agentes isotónicos e combinações dos mesmos. A seleção e utilização de excipientes adequados é ensinada em Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edição (Lippincott Williams & Wilkins 2003).
Preferencialmente, a composição farmacêutica é adequada para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parentérica, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, 0 composto ativo pode ser revestido num material para proteger o mesmo da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o mesmo. A frase Ãadministração parentéricaà conforme utilizado no presente documento significa modos de administração diferentes da administração enteral e tópica, geralmente por injeção, e inclui, sem limitação, injeção ou infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaraquenoide, intraespinal, epidural e intraesternal. Alternativamente, um anticorpo da invenção pode ser administrado através de uma via não parentérica, tal como uma via de administração tópica, epidérmica ou mucosal, por exemplo, intranasalmente, oralmente, vaginalmente, retalmente, sublingualmente ou topicamente.
As composições farmacêuticas da invenção podem incluir sais farmaceuticamente aceitáveis. Um Ãsal farmaceuticamente aceitávelà refere-se a um sal que retém a atividade biológica desejada do composto parente e não transmite quaisquer efeitos toxicológicos indesejados. Exemplos de tais sais incluem sais de adição ácida e sais de adição básica. Os sais de adição ácida incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, hidrobrómico, hidroiódico, fosforoso e semelhantes, assim como de ácidos orgânicos não tóxicos tais como ácidos alifáticos mono- e dicarboxílicos, ácidos alcanoicos substituídos por fenila, ácidos hidroxi alcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfõnicos alifáticos e aromáticos e semelhantes. Os sais de adição básica incluem aqueles derivados de metais alcalinos terrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e semelhantes, assim como de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N,N'-dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e semelhantes.
Composições farmacêuticas podem estar na forma de soluções ou dispersões aquosas estéreis. As mesmas também podem ser formuladas numa microemulsão, lipossoma, ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração de fármaco. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinado com um material transportador para produzir uma única forma farmacêutica irá variar dependendo do indivíduo sendo tratado e o modo particular de administração e geralmente será aquela quantidade da composição que produz um efeito terapêutico. Geralmente, de entre cem por cento, essa quantidade irá variar de cerca de 0,01% a cerca de noventa e cinco por cento de ingrediente ativo, preferencialmente, de cerca de 0,1% a cerca de 70%, mais preferencialmente, de cerca de 1% a cerca de 30% de ingrediente ativo em combinação com um transportador farmaceuticamente aceitável.
Regimes de dosagem são ajustados para fornecer a resposta desejada ideal (por exemplo, uma resposta terapêutica) . Por exemplo, um bolo único pode ser administrado, diversas doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais em forma de dosagem unitária para facilitar a administração e uniformidade de dosagem. A forma de dosagem unitária conforme utilizada no presente documento refere-se a unidades fisicamente distintas colocadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação ao transportador farmacêutico ativo exigido. Alternativamente, o anticorpo pode ser administrado como uma formulação de libertação sustentada, caso em que a administração frequente é exigida.
Para a administração do anticorpo, as faixas de dosagem de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e mais usualmente 0,01 a 5 mg/kg, do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, dosagens podem ser 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou dentro da faixa de 1 a 10 mg/kg. Um regime de tratamento exemplificativo exige a administração uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez ao mês, uma vez a cada 3 meses ou uma vez a cada três a 6 meses. Regimes de dosagem preferenciais para um anticorpo anti-LAG-3 da invenção incluem 1 mg/kg de peso corporal ou 3 mg/kg de peso corporal através da administração intravenosa, sendo que o anticorpo é dado utilizando um dos agendamentos de dosagem seguintes: (i) a cada quatro semanas para seis dosagens, depois a cada três meses; (ii) a cada três semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal uma vez seguido por 1 mg/kg de peso corporal a cada três semanas. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para alcançar uma concentração plasmática de anticorpo de cerca de 1 a 1.000 pg/ml e em alguns métodos cerca de 25 a 300 pg/ml.
Uma Ãdosagem terapeuticamente eficazà de um anticorpo anti-LAG-3 da invenção resulta preferencialmente numa diminuição na gravidade de sintomas de doença, um aumento na frequência e duração dos períodos livres de sintoma da doença, ou uma prevenção de enfraquecimento ou incapacidade devido à aflição de doença. Por exemplo, para o tratamento de indivíduos portadores de tumor, uma Ãdosagem terapeuticamente eficazà inibe preferencialmente o crescimento tumoral em pelo menos cerca de 20%, mais preferencialmente, em pelo menos cerca de 40%, ainda mais preferencialmente, em pelo menos cerca de 60%, e ainda mais preferencialmente, em pelo menos cerca de 80% em relação a indivíduos não tratados. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto terapêutico pode diminuir o tamanho de tumor ou, de outro modo, melhorar os sintomas num indivíduo que é tipicamente um humano ou pode ser outro mamífero. A composição farmacêutica pode ser uma formulação de libertação controlada, o que inclui implantes, Adesivos transdérmicos e sistemas de entrega microencapsulada. Polímeros biocompatíveis, biodegradáveis podem ser utilizados, tal como etileno acetato de vinilo, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido polilático. Veja-se, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1978.
As composições terapêuticas podem ser administradas através de dispositivos médicos tais como (1) dispositivos de injeção hipodérmicos sem agulha (por exemplo, documentos n— US 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824 e 4.596.556); (2) bombas de microinfusão (documento n£ US 4.487.603); (3) dispositivos transdérmicos (documento n£ US 4.486.194); (4) aparelhos de infusão (documentos n— US 4.447.233 e 4.447.224); e (5) dispositivos osmóticos (documentos n— US 4.439.196 e 4.475.196) .
Em determinadas formas de realização, os anticorpos monoclonals humanos da invenção podem ser formulados para garantir a distribuição apropriada in vivo. Por exemplo, para garantir que os compostos terapêuticos da invenção atravessem a barreira sangue-cérebro, os mesmos podem ser formulados em lipossomas, que podem adicionalmente compreender alvejar porções químicas para aprimorar o transporte seletivo para células ou órgãos específicos. Veja-se, por exemplo, os documentos n— US 4.522.811; 5.374.548; 5.416.016 e 5.399.331; V. V. Ranade (198 9) J.
Cl in. Pharmacol. 29:685; Umezawa et al. , (1988) Biochem.
Biophys. Res. Commun. 153:1038; Bloeman et al. (1995) FEBS
Lett. 3 57:14 0j_M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents
Chemother. 39:180; Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134; Schreier et al. (1994) J Biol. Chem. 269:9090;
Keinanen e Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123p e Killion e Fidler (1994) Immunomethods 4:273.
Utilizações da Invenção
Anticorpos (composições, biespecíficas e imunoconjugados) da presente invenção têm numerosas utilidades in vitro e in vivo que envolvem, por exemplo, a deteção de LAG-3 ou intensificação de respostas imunológicas por bloqueio de LAG-3. Numa forma de realização preferencial, os anticorpos são anticorpos humanos. Tais anticorpos podem ser administrados a células na cultura, in vitro ou ex vivo, ou a indivíduos humanos, por exemplo, in vivo, para intensificar a imunidade numa variedade de situações. Consequentemente, o anticorpo, ou porção de ligação de antigénio do mesmo da invenção pode ser utilizado num método para modificar uma resposta imunitária num indivíduo que compreende administrar ao indivíduo o anticorpo, ou porção de ligação de antigénio do mesmo de modo que a resposta imunitária no indivíduo seja modificada. Preferencialmente, a response é intensificada, estimulada ou regulada de modo ascendente.
Indivíduos preferenciais incluem pacientes humanos em necessidade de intensificação de uma resposta imunitária. Os métodos são particularmente adequados para tratar pacientes humanos que têm um distúrbio que pode ser tratado para aumentar uma resposta imunitária (por exemplo, a resposta imunitária mediada por célula T) . Adicionalmente, os métodos são particularmente adequados para o tratamento de cancro in vivo. Para alcançar intensificação de imunidade específica de antigénio, os anticorpos anti-LAG-3 podem ser administrados juntos com um antigénio de interesse ou o antigénio pode já estar presente no indivíduo a ser tratado (por exemplo, um indivíduo portador de vírus ou portador de tumor). Quando os anticorpos para LAG-3 são administrados juntos a outro agente, os dois podem ser administrados em qualquer ordem ou simultaneamente. São descritos adicionalmente métodos para detetar a presença de antigénio LAG-3 humano numa amostra, ou medir a quantidade de antigénio LAG-3 humano, que compreende entrar em contato com a amostra, e uma amostra controlo, com um anticorpo monoclonal humano, ou uma porção de ligação de antigénio do mesmo, que especificamente se liga ao LAG -3 humano, sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo ou a porção do mesmo e LAG-3 humano. A formação de um complexo é então detetada, em que uma formação de complexo diferente entre a amostra em comparação com a amostra controlo é indicativa da presença de antigénio de LAG-3 humano na amostra. Além disso, os anticorpos anti-LAG-3 da invenção podem ser utilizados para purificar LAG-3 humano através de purificação de imunoafinidade.
Dada a habilidade de anticorpos anti-LAG-3 da invenção para inibir a ligação de LAG-3 a moléculas de classe II MHC e para estimular respostas de célula T específica de antigénio, os anticorpos da invenção podem também ser utilizados em métodos in vitro e in vivo para estimular, intensificar ou regular de modo ascendente as respostas de célula T específica de antigénio. Por exemplo, os anticorpos da invenção podem ser utilizados num método para estimular uma resposta de célula T específica de antigénio que compreende colocar a referida célula T em contato com o anticorpo, de modo que uma resposta de célula T específica de antigénio seja estimulada. Qualquer indicador adequado de uma resposta de célula T específica de antigénio pode ser utilizado para medir a resposta de célula T específica de antigénio. As amostras não limitantes de tais indicadores adequados incluem produção de célula T aumentada na presença do anticorpo e/ou produção de citocina aumentada na presença do anticorpo. Numa forma de realização preferencial, a produção de interleucina-2 pela célula T específica de antigénio é estimulada.
A invenção também fornece um anticorpo da invenção para utilização num método para estimular uma resposta imunitária (por exemplo, uma resposta de célula T específica de antigénio) num indivíduo que compreende administrar o anticorpo ao indivíduo de modo que uma resposta imunitária (por exemplo, uma resposta de célula T específica de antigénio) no indivíduo seja estimulada. Numa forma de realização preferencial, o indivíduo é um indivíduo portador de tumor e uma resposta imunitária contra o tumor é estimulada. Noutra forma de realização preferencial, o indivíduo é um indivíduo portador de vírus e uma resposta imunitária contra o vírus é estimulada.
Em outra forma de realização, a invenção fornece um anticorpo da invenção para utilização num método para inibir o crescimento de células tumorais num indivíduo que compreende administrar ao indivíduo o anticorpo de modo que o crescimento dos tumores seja inibido no indivíduo. Em ainda outra forma de realização, a invenção fornece um anticorpo da invenção para utilização num método para tratar uma infeção virai num indivíduo que compreende administrar ao indivíduo o anticorpo da invenção de modo que a infeção virai seja tratada no indivíduo.
Esses e outros métodos da invenção são discutidos em detalhes adicionais abaixo.
Cancro 0 bloqueio de LAG-3 por anticorpos pode intensificar a resposta imunitária para células cancerígenas no paciente. Num aspeto, a presente invenção refere-se a um anticorpo anti-LAG-3 da presente invenção para utilização no tratamento de um indivíduo in vivo de modo que o crescimento de tumores cancerígenos seja inibido. Um anticorpo anti-LAG-3 pode ser utilizado sozinho para inibir o crescimento de tumores cancerígenos. Alternativamente, um anticorpo anti-LAG-3 pode ser utilizado em combinação com outros agentes imunogénicos, tratamentos para cancro padrão ou outros anticorpos, conforme descrito abaixo.
Consequentemente, numa forma de realização, a invenção fornece um anticorpo anti-LAG-3, ou porção de ligação de antigénio do mesmo da invenção para utilização num método para inibir o crescimento de células tumorais num indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-LAG-3, ou porção de ligação de antigénio do mesmo.
Preferencialmente, o anticorpo é um anticorpo humano anti-LAG-3 (tal como quaisquer dos anticorpos anti-LAG-3 humanos descritos no presente documento). Adicional ou alternativamente, o anticorpo pode ser um anticorpo anti-LAG-3 quimérico ou humanizado.
Os cancros preferenciais cujo crescimento pode ser inibido utilizando os anticorpos da invenção incluem cancros tipicamente responsivos à imunoterapia. Os exemplos não limitantes de cancros preferenciais para o tratamento incluem melanoma (por exemplo, melanoma maligno metastático), cancro renal (por exemplo, carcinoma de célula clara), cancro de próstata (por exemplo, adenocarcinoma de próstata refratário hormonal), cancro de mama, cancro de cólon e cancro de pulmão (por exemplo, cancro de pulmão de célula não pequena). Adicionalmente, a invenção inclui malignidades refratárias ou recorrentes cujo crescimento pode ser inibido utilizando os anticorpos da invenção.
Exemplos de outros cancros que podem ser tratados utilizando os anticorpos da invenção incluem cancro ósseo, cancro pancreãtico, cancro de pele, cancro da cabeça ou pescoço, melanoma maligno cutâneo ou intraocular, cancro uterino, cancro ovariano, cancro retal, cancro da região anal, cancro estomacal, cancro testicular, carcinoma dos tubos de Falõpio, carcinoma do endométrio, carcinoma do cérvix, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, doença de Hodgkin, linfoma não de Hodgkin, cancro do esófago, cancro do intestino delgado, cancro do sistema endócrino, cancro do gânglio de tiroide, cancro do glândula paratiroide, cancro da glândula adrenal, sarcoma de tecido mole, cancro da uretra, cancro do pénis, leucemia crónica ou agudo o que inclui leucemia mieloide agudo, leucemia mieloide crónica, Leucemia linfoblástico agudo, Leucemia linfocítica crónica, tumores sólidos de infância, linfoma linfócito, cancro da lâmina, cancro do rim ou ureter, carcinoma da pélvis renal, neoplasma do sistema nervoso central (CNS), linfoma CNS primário, angionese de tumor, tumor de medula espinhal, glioma de medula cerebral, adenoma pituitário, sarcoma de Kaposi, cancro epidermoide, cancro celular escamoso, linfoma célula T, cancros ambientalmente induzidos o que inclui aqueles induzidos por asbestos e combinações de cancros referidos. A presente invenção também é útil para tratamento de cancros metastãticos especialmente cancros metastãtico que expressam PD-L1 (Iwai et al. (2005) Int. Immunol. 17:133 a 144),
Opcionalmente, anticorpos para LAG-3 podem ser combinados com um agente imunogénico, tais células cancerígenas, antigénios tumorais purificados (o que inclui proteínas recombinant.es, péptidos e moléculas de hidrato de carbono), células e células transfetadas com genes codificadores de estimulação imunitária (He et al (2004) J. Immunol. 173:4.919 a 4.928_)_. Exemplos não limitantes de vacinas de tumor que podem ser utilizados incluem péptidos de antigénios de melanoma, tais péptidos de gplOO, antigénios MAGE, Trp-2, MARTI e/ou tirosinase ou células tumorais transfetadas para expressar a citocina GM-CSF (discutidas adicionalmente abaixo).
Em humanos, alguns tumores demonstraram ser imunogénicos tais como melanomas. Elevando-se o limite da ativação de célula T por bloqueio de LAG-3, as respostas de tumor no hospedeiro podem ser ativadas. 0 bloqueio de LAG-3 é provavelmente mais eficaz quando combinado com um protocolo de vacinação. Muitas estratégias experimentais para vacinação contra tumores foram delineadas (veja-se Rosenberg, S,, 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60 a 62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300 a 302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414 a 428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730 a 738; veja-se também Restifo, N. e Sznol, M., Cancer Vaccines, Ch. 61, páginas 3.023 a 3.043 em DeVita et al. (eds,), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, Quinta Edição). Numa dessas estratégias, uma vacina é preparada utilizando células tumorais autólogos ou alogénicas. Essas vacinas celulares demonstraram ser mais eficazes quando as células tumorais sao transduzidas para expressar GM-CSF. GM-CSF foi mostrado ser um ativador potente de apresentação de antigénio para a vacinação de tumor (Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei U.S.A. 90: 3.539 a 3.543) . 0 estudo de expressão genética e padrões de expressão genética de larga escala em vários tumores levaram à definição dos chamados específicos de tumor (Rosenberg, SA (1999) Immunity 10: 281 a 287) . Em muitos casos, esses antigénios específicos de tumor são antigénios diferenciação expressos nos tumores e na célula da qual o tumor surgiu, por exemplo, antigénios melanócitos gplOO, antigénios MAGE, e Trp-2. De modo mais importante, muitos desses antigénios podem ser mostrados como alvos de células T específicas de tumor encontradas no hospedeiro. Bloqueio de LAG-3 pode ser utilizado em combinação com uma coleta de proteínas recombinantes e/ou péptidos expressos num tumor a fim de gerar uma resposta imunitária para essas proteínas. Essas proteínas são normalmente vistas pelo sistema imunitário como autoantigénios e são, assim, tolerantes às mesmas. 0 antigénio tumoral pode incluir a proteína telomerase que é exigida para a síntese de telómeros de cromossomos e que é expressa em mais de 85% de cancros humanos e em apenas um número limitado de tecidos somáticos (Kim et al. (1994) Science 266: 2.011 a 2.013). (Esses tecidos somáticos podem ser protegidos de ataque imunitário por vários meios). 0 antigénio tumoral pode ser também "neoantigénios" expressos em células cancerígenas devido a mutações somáticas que alteram a sequência de proteína ou criam proteínas de fusão entre duas sequências não relacionadas (isto ê, bcr-abl no cromossomo Philadelphia) , ou idiotipo de tumores de célula B.
Outras vacinas de tumor podem incluir as proteínas de vírus implicadas em cancros humanos tal como os Papilomas Vírus Humanos (HPV), Vírus da Hepatite (HBV e HCV) e Vírus Sarcoma Herpes de Kaposi (KHSV). Outra forma de antigénio específico de tumor que pode ser utilizada em combinação com bloqueio de LAG-3 são proteínas de choque térmico purificadas (HSP) isoladas do próprio tecido tumoral. Essas proteínas de choque térmico contêm fragmentos de proteínas das células tumorais e essas HSPs são altamente eficientes na entrega a células que apresentam antigénio para elicitar imunidade de tumor (Suot & Srivastava (1995) Science 269:1.585 a 1.588j_Tamura et al. (1997) Science 278: 117 a 120) . Células dendríticas (DC) são células potentes que apresentam antigénio que pode ser utilizado para iniciar respostas específicas de antigénio. DCs podem ser produzidas ex vivo e carregadas com vários antigénios de proteína e péptido assim como extratos de célula tumoral (Nestlé et al. (1998) Nature Medicine 4: 328 a 332) . DCs podem ser também transduzidas por meios genéticos para expressar esses antigénios tumorais também. DCs também foram fundidas diretamente a células tumorais com o propósito de imunização (Kugler et al. (2000) Nature
Medicine 6:332 a 336). Como um método de vacinação, a imunização de DC pode ser efetivamente combinada com o bloqueio de LAG-3 para ativar respostas antitumorais mais potentes. 0 bloqueio de LAG-3 pode ser também combinado com tratamentos de cancro padrão. 0 bloqueio de LAG-3 pode ser efetivamente combinado com regimes quimioterápicos. Nesses casos, pode ser possível reduzir a dose de reagente quimioterápico administrado (Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5.301 a 5.304). Um exemplo de tal combinação é um anticorpo anti-LAG-3 em combinação com decarbazina para o tratamento de melanoma. Outro exemplo de tal combinação é um anticorpo anti-LAG-3 em combinação com interleucina-2 (IL-2) para o tratamento de melanoma. A razão científica por trás da utilização combinada de bloqueio de LAG-3 e quimioterapia é a morte celular que é uma consequência da ação citotóxica de mais compostos quimioterãpicos deve resultar em níveis aumentados in de antigénio tumoral na trajetória de apresentação de antigénio. Outras terapêuticas de combinação que podem resultar em sinergia com o bloqueio de LAG-3 através da morte celular são radiação, cirurgia e privação hormonal. Cada um desses protocolos cria uma fonte de antigénio tumoral no hospedeiro. Os inibidores de angiogenese podem ser também combinados com o bloqueio de LAG-3. A inibição de angiogenese causa a morte de célula tumoral que pode alimentar antigénio tumoral nas trajetórias de apresentação de antigénio de hospedeiro.
Anticorpos de bloqueio de LAG-3 podem ser também utilizados em combinação com anticorpos biespecíficos que alvejam células efetoras que expressam recetor de Fca ou Fcy para células tumorais (veja-se, por exemplo, Patentes n— U.S. 5.922.845 e 5.837.243). Anticorpos biespecíficos podem ser utilizados para alvejar dois antigénios separados. Por exemplo, anticorpos biespecíficos recetores de anti-Fc/de antigénio antitumoral (por exemplo, Her-2/neu) foram utilizados para alvejar macrófagos para locais de tumor. Esse alvejamento pode ativar mais efetivamente respostas específicas de tumor. 0 braço de célula T dessas respostas seria aumentado pela utilização de bloqueio de LAG-3. Alternativamente, o antigénio pode ser entregue diretamente a DCs pela utilização de anticorpos biespecíficos que se ligam a um antigénio tumoral e um marcador de superfície celular específico de célula dendrítica.
Tumores escapam da vigilância imunitária de hospedeiro por uma grande diversidade de mecanismos. Muitos desses mecanismos podem ser superados pela inativação de proteínas que são expressas pelos tumores e que são imunossupressoras. As mesmas incluem entre outras TGF-β (Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1.037 a 1.050), IL- 10 (Howard e 0'Garra (1992) Immunology Today 13: 198 a 200), e ligante Fas (Hahne et al. (1996) Science 274: 13.63 a 1.365). Anticorpos para cada uma dessas entidades podem ser utilizados em combinação com anti-LAG-3 para contra-acionar os efeitos do agente imunossupressor e respostas imunológicas tumorais favoráveis pelo hospedeiro.
Outros anticorpos que ativam a responsividade imunitária de hospedeiro podem ser utilizados em combinação com anti-LAG-3. Isso inclui moléculas sobre a superfície de células dendríticas que ativam a função DC e apresentação de antigénio. Os anticorpos anti-CD40 têm capacidade para substituir efetivamente a atividade auxiliadora de célula T (Ridge et al. (1998) Nature 393: 474 a 478) e podem ser utilizados em combinação com anticorpos de LAG-3 (Ito et al. (2000) Immunobiology 201 (5) 527 a 540) . Ativar anticorpos para moléculas coestimulantes de célula T tais como CTLA-4 (por exemplo, Patente n2 US 5.811.097), OX-40 (Weinberg et al. (2000) Immunol 164: 2.160 a 2.169), 4-1BB (Melero et al. (1997) Nature Medicine 3: 682 a 685 (1997) e ICOS (Hutloff et al. (1999) Nature 397: 262 a 266) pode fornecer também níveis aumentados de ativação de célula T. A transplantação de medula óssea está atualmente sendo utilizada para tratar uma variedade de tumores de origem hernatopoiética. Embora a doença do enxerto contra hospedeiro seja uma consequência desse tratamento, o benefício terapêutico pode ser obtido a partir de respostas de enxerto contra tumor. 0 bloqueio de LAG-3 pode ser utilizado para aumentar a efetividade das células T específicas de tumor enxertado de doador. Há também diversos protocolos de tratamento experimental que envolvem ativação ex vivo e expansão de células T específicas de antigénio e a transferência adotiva dessas células em recipientes a fim de estimular células T específicas de antigénio contra tumor (Greenberg e Riddell (1999) Science 285: 546 a 551) . Esses métodos podem ser tarribém utilizados para ativar respostas de célula T a agentes infeciosos tais como CMV. A ativação ex vivo na presença de anticorpos anti-LAG-3 pode aumentar a frequência e atividade das células T adotivamente transferidas,
Doenças Infeciosas
Adicionalmente, os métodos são descritos no presente documento os quais são utilizados para tratar pacientes que foram expostos a toxinas ou patógenos particulares. Consequentemente, um método para tratar uma doença infeciosa num indivíduo é descrito no presente documento, o qual compreende administrar ao indivíduo um anticorpo anti-LAG-3, ou porção de ligação de antigénio do mesmo de modo que o indivíduo seja tratado em relação à doença infeciosa. Preferencialmente, o anticorpo é um anticorpo anti-LAG-3 anti-humano humano (tal como quaisquer dos anticorpos humanos anti-LAG-3 descritos no presente documento). Adicional ou alternativamente, o anticorpo pode ser um anticorpo quimérico ou humanizado.
Semelhante a essa aplicação a tumores conforme discutido acima, o bloqueio de LAG-3 mediado por anticorpo pode ser utilizado sozinho, ou como um adjuvante, em combinação com vacinas, para estimular a resposta imunitária a patógenos, toxinas e autoantigénios. Exemplos de patógenos para os quais essa abordagem terapêutica pode ser particularmente útil incluem patógenos para os quais não há atualmente disponível vacina eficaz ou patógenos para os quais as vacinas convencionais são menos do que completamente eficazes. Esses incluem, mas não são limitados a HIV, Hepatite (A, B e C) , Influenza, Herpes, Giárdia, Malária, Leishmânia, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. 0 bloqueio de LAG-3 é particularmente útil contra infeções estabelecidas por agentes tais como HIV que apresentam antigénios alterados durante o curso de infeções. Esses epítopos inovadores são reconhecidos como estranhos no momento da administração de LAG-3 anti-humano, portanto, provocando uma resposta de célula T forte que não é amortecida por sinais negativos através de LAG-3.
Alguns exemplos de vírus patogénicos que causam infeções tratáveis por anticorpos anti-LAG-3, ou porções de ligação de antigénio dos mesmos, da invenção incluem HIV, hepatite (A, B ou C) , vírus da herpes (por exemplo, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II e CMV, vírus Epstein Barr), adenovirus, vírus influenza, flavivírus, echovírus, rinovírus, vírus de coxsackie, coronavírus, vírus sincicial respiratório, vírus da caxumba, rotavirus, Vírus do sarampo, vírus da rubéola, parvo vírus, vírus vaccinia, vírus HTLV, vírus da dengue, papiloma vírus, vírus do molusco, poliovirus, vírus da raiva, vírus JC e vírus arboviral de encefalite.
Alguns exemplos de bactérias patogénicas que causam infeções tratáveis pelos métodos descritos no presente documento incluem clamídia, bactéria rickettsial, micobactéria, staphylococci, streptococci, pneumonococci, meningococci e gonococci, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, difteria, salmonela, bacilli, cólera, tétano, botulismo, antraz, peste, leptospirose e bactéria da doença de Lymes.
Alguns exemplos de fungos patogénicos que causam infeções tratáveis por métodos descritos no presente documento incluem Cândida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc,), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), Genus Muc- orales (mucor, absidia, rhizopus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis e Histoplasma capsulatum.
Alguns exemplos de parasitas patogénicos que causam infeções tratáveis por métodos descritos no presente documento incluem Entamoeba histolytica, Balantidium coli,
Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondii, Nippostrongylus brasiliensis.
Em todos os métodos acima, o bloqueio de LAG-3 pode ser combinado com outras formas de imunoterapia tal como tratamento de citocina (por exemplo, interferões, GM-CSF, G-CSF, IL-2), ou terapêutica de anticorpo biespecífico que fornece apresentação aprimorada de antigénios tumorais (veja-se, por exemplo, Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6.444 a 6.448; Poljak (1994) Structure 2:1.121 a 1.123) .
Reações Autoímunes
Anti-anticorpos de LAG-3 podem provocar e amplificar respostas autoímunes. De facto, a indução de respostas antitumorais utilizando vacinas de célula tumoral e péptido revela que muitas respostas antitumorais envolvem anti-autorreatividades (van Elsas et al. (2001) J. Exp. Med. 194:481 a 489y Overwijk, et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 96: 2.982 a 2.987; Hurwitz, (2000) supra; Rosenberg e White (1996) J. Immunother Emphasis Tumor Immunol 19 (1): 81 a 84). Portanto, é possível considerar a utilização de anti-bloqueio de LAG-3 em combinação com várias autoproteínas a fim de planear protocolos de vacinação para gerar eficazmente respostas contra essas autoproteínas para o tratamento de doença. Por exemplo, a doença de Alzheimer envolve acumulação inapropriada de péptido Αβ em depósitos amiloides no cérebro; as respostas de anticorpo contra amiloide têm capacidade para limpar esses depósitos de amiloide (Schenk et al. , (1999) Nature 400: 173 a 177).
Outras autoproteínas podem ser também utilizadas como alvos tais como IgE para o tratamento de alergia e asma, e TNFa para artrite reumatóide. Finalmente, respostas de anticorpo a várias hormonas podem ser induzidas pela utilização de anticorpo anti-LAG-3. Neutralizar respostas de anticorpo a hormonas reprodutivas pode ser utilizado para contraceção. Neutralizar resposta de anticorpo a hormonas e outros fatores solúveis que são exigidos para o crescimento de tumores particulares pode ser também considerado como alvos de vacinação possíveis. Métodos análogos conforme descrito acima para a utilização de anticorpo anti-LAG-3 podem ser utilizados para a indução de respostas autoimunes terapêuticas para tratar pacientes que têm uma acumulação inapropriada de outros autoantigénios, tais como depósitos de amiloides, o que inclui Άβ na doença de Alzheimer, citocinas tais como TNFa e IgE.
Vacinas
Os anti-anticorpos de LAG-3 podem ser utilizados para estimular respostas imunológicas específicas de antigénio por coadministração de um anticorpo anti-LAG-3 com um antigénio de interesse (por exemplo, uma vacina). Consequentemente, um método de intensificar uma resposta imunitária a um antigénio num indivíduo é descrito no presente documento que compreende administrar ao indivíduo: (i) o antigénio; e (ii) um anticorpo antiLAG-3, ou porção de ligação de antigénio do mesmo de modo que uma resposta imunitária ao antigénio no indivíduo seja intensificada. Preferencialmente, o anticorpo é um anticorpo anti-LAG-3 anti-humano humano (tal como quaisquer dos anticorpos humanos anti-LAG-3 descritos no presente documento). Adicional ou alternativamente, o anticorpo pode ser um anticorpo quimérico ou humanizado. 0 antigénio pode ser, por exemplo, um antigénio tumoral, um antigénio virai, um antigénio bacteriano ou um antigénio de um patõgeno. Exemplos não limitantes de tais antigénios incluem aqueles discutidos nas secções acima, tais como os antigénios tumorais (ou vacinas de tumor) discutidos acima, ou ant igénios dos virus, Bactérias ou. outros patogenos descritos acima.
Rotas adequadas de administrar as composições de anticorpo (por exemplo, anticorpos monoclonais humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas e imunoconjugados) da invenção in vivo e in vitro são bem conhecidas na técnica e podem ser selecionadas pelos indivíduos de conhecimento comum na técnica. Por exemplo, as composições de anticorpo podem ser administradas por injeção (por exemplo, intravenosa ou subcutânea). Dosagens adequadas das moléculas utilizadas dependerão da idade e peso do indivíduo e a concentração e/ou formulação da composição de anticorpo.
Conforme descrito anteriormente, os anticorpos humanos anti-LAG-3 da invenção podem ser coadministrados com um ou mais agentes terapêuticos, por exemplo, um agente citotõxico, um agente radiotóxico ou um agente imunossupressor. 0 anticorpo pode ser unido ao agente (como um imuno complexo) ou pode ser administrado separado do agente. No último caso (administração separada), o anticorpo pode ser administrado antes, depois ou concomitantemente com o agente ou pode ser coadministrado com outras terapêuticas conhecidas, por exemplo, uma terapêutica anticancro, por exemplo, radiação. Tais agentes terapêuticos incluem, entre outros, agentes antineoplásticos tais como doxorubicina (adriamicina), sulfato de bleomicina cisplatina, carmustina, clorambucila, dacarbazina e ciclofosfamida hidroxiureia que, por eles mesmos, são apenas eficazes em níveis que são tóxicos ou subtóxicos para um paciente. Cisplatina é administrada intravenosamente como uma dose de 100 mg/ml uma vez a cada quatro semanas e adriamicina é administrada intravenosamente como uma dose de 6 0 a 7 5 mg/ml uma vez a cada 21 dias. A coadministração dos anticorpos humanos anti-LAG-3, ou fragmentos de ligaçao de antigénio dos mesmos, da presente invenção com agentes quimioterãpicos fornece dois agentes anticancro que operam através de diferentes mecanismos que rendem um efeito citotóxico para células tumorais humanas. Tal coadministração pode solucionar os problemas devido ao desenvolvimento de resistência a fármacos ou uma mudança na antigenicidade das células tumorais que tornaria as mesmas não reativas com o anticorpo.
Além disso, dentro do âmbito da presente invenção há kits que compreendem as composições de anticorpo da invenção (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas biespecíficas ou multiespecíficas, ou imunoconjugados) e instruções para utilização. 0 kit pode adicionalmente conter pelo menos um reagente adicional, ou um ou mais anticorpos humanos adicionais da invenção (por exemplo, um anticorpo humano que tem uma atividade complementar que se liga a um epítopo no antigénio de LAG-3 distinto do primeiro anticorpo humano). Os kits tipicamente incluem uma identificação que indica a utilização pretendida do conteúdo do kit. 0 termo identificação inclui qualquer material escrito ou gravado fornecido no ou com o kit, ou que, de outro modo, acompanha o kit. terapêutica de Combinação
Em outro aspeto, a invenção fornece um anticorpo anti-LAG-3 (ou porção de ligação de antigénio do mesmo) da invenção para utilização num método de terapêutica de combinação em que o anticorpo anti-LAG-3 (ou porção de ligação de antigénio do mesmo) é coadministrado com um ou mais anticorpos adicionais que são eficazes em respostas imunológicas estimulantes para, desse modo, intensificar, estimular ou regular de modo ascendente adicionalmente respostas imunológicas num indivíduo. Numa forma de realização, a invenção fornece um anticorpo anti-LAG-3 da invenção para utilização num método para estimular uma resposta imunitária num indivíduo que compreende administrar ao indivíduo um anticorpo anti-LAG-3 e um ou mais anticorpos imunoestimulantes adicionais, tal como um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-PD-Ll e/ou um anticorpo anti-CTLA-4, de modo que uma resposta imunitária seja estimulada no indivíduo, por exemplo, para inibir o crescimento tumoral ou para estimular uma resposta antiviral. Em outra forma de realização, o indivíduo é administrado com um anticorpo anti-LAG-3 e um anticorpo anti-PD-1. Em ainda outra forma de realização, o indivíduo é administrado com um anticorpo anti-LAG-3 e um anticorpo anti-PD-Ll. Em ainda outra forma de realização, o indivíduo é administrado com um anticorpo anti-LAG-3 e um anticorpo anti-CTLA-4. Numa forma de realização, o anticorpo anti-LAG-3 é um anticorpo humano, tal como um anticorpo da divulgação. Alternativamente, o anticorpo anti-LAG-3 pode ser, por exemplo, um anticorpo quimérico ou humanizado (por exemplo, preparado a partir de um murganho anti-LAG-3 mAb). Em outra forma de realização, o pelo menos um anticorpo imunoestimulante adicional (por exemplo, anti-PD-1, anti-PD-Ll e/ou anticorpo anti-CTLA-4) é um anticorpo humano. Alternativamente, o pelo menos um anticorpo imunoestimulante adicional pode ser, por exemplo, um anticorpo quimérico ou humanizado (por exemplo, preparado a partir de um murganho anti-PD-1, anti-PD-Ll e/ou anticorpo anti-CTLA-4).
Adicionalmente, um método para tratar uma doença hiperproliferativa (por exemplo, cancro) é descrito no presente documento, que compreende administrar um anticorpo de LAG-3 e um anticorpo de CTLA-4 a um indivíduo. 0 anticorpo anti-LAG-3 pode ser administrado numa dose subterapêutica, o anticorpo anti-CTLA-4 é administrado a uma dose subterapêutica, ou ambos são administrados numa dose subterapêutica. Adicionalmente, um método para alterar um evento adverso associado ao tratamento de uma doença hiperproliferativa com um agente imunoestimulantes é descrito no presente documento que compreende administrar um anticorpo anti-LAG-3 e uma dose subterapêutica de anticorpo anti-CTLA-4 a um indivíduo. 0 indivíduo pode ser humano. 0 anticorpo anti-CTLA-4 pode ser anticorpo monoclonal de sequência humana 10D1 (descrito na Publicação PCT n- WO 01/14424) e o anticorpo anti-LAG-3 pode ser um anticorpo monoclonal de sequência humana, tal como LAG3.5 descrito no presente documento. Outros anticorpos anti-CTLA-4 englobados pelos métodos da presente invenção incluem, por exemplo, aqueles revelados em: WO 98/42752; WO 00/37504; Patente n£ U.S. 6.207.156; Hurwitz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95(17) :10.067 a 10.071; Camacho et al. (2004) J. Clin. Oncology 22 (14S) : Resumo N° 2.505 (anticorpo CP-675206); e Mokyr et al. (1998) Cancer Res. 58:5.301 a 5.304. Em determinadas formas de realização, ο anticorpo anti-CTLA-4 se liga ao CTLA-4 humano com uma KD de 5 x 10"8 M ou menos, se liga ao humano CTLA-4 com uma KD de 1 x 10”8 M ou menos, se liga ao CTLA-4 humano com uma KD de 5 x 10“9 M ou menos, ou se liga ao CTLA-4 humano com uma KD de entre 1 x 10”8 M e 1 x IO”10 M ou menos.
Adicionalmente, um método para tratar uma doença hiperproliferativa (por exemplo, cancro) é descrito no presente documento, que compreende administrar um anticorpo de LAG-3 e um anticorpo de PD-1 a um indivíduo. 0 anticorpo anti-LAG-3 pode ser administrado a uma dose subterapêutica, o anticorpo anti-PD-1 é administrado a uma dose subterapêutica, ou ambos são administrados a uma dose subterapêutica. Adicionalmente, um método para alterar um evento adverso associado ao tratamento de uma doença hiperproliferativa com um agente imunoestimulantes é descrito no presente documento que compreende administrar um anticorpo anti-LAG-3 e uma dose subterapêutica de anticorpo anti-PD-1 a um indivíduo. 0 indivíduo pode ser humano. 0 anticorpo anti-PD-1 pode ser um anticorpo monoclonal de sequência humana r o anticorpo anti-LAG-3 é um anticorpo monoclonal de sequência humana, tal como LAG3.5 descrito no presente documento. Exemplos de anticorpos anti-PD-1 de sequência humana incluem 17D8, 2D3, 4H1, 5C4 e 4All, que são descritos na Publicação PCT n- WO 06/121168. Outros anticorpos anti-PD-1 incluem, por exemplo, lambrolizumabe (WQ2008/156712), e AMP514 (W02010/027423, W02010/027S27, W02010/027828 W02010/098788). 0 anticorpo anti-PD-1 pode ligar-se ao PD-1 humano com uma KD de 5 x 10‘8 M ou menos, ligar-se a PD-1 humano com uma KD de 1 x 1Q"8 M ou menos, ligar-se a PD-1 humano com uma KD de 5 x 10~9 M ou menos, ou ligar-se a PD-1 humano com uma KD de entre 1 x 10”8 M e 1 x 10"*° M ou menos.
Adicionalmente, um método para tratar uma doença hiperproliferativa (por exemplo, cancro) é descrito no presente documento que compreende administrar um anticorpo de LAG-3 e um anticorpo PD-L1 a um indivíduo. 0 anticorpo anti-LAG-3 pode ser administrado numa dose subterapêutica, o anticorpo anti-PD-Ll pode ser administrado a uma dose subterapêutica, ou ambos podem ser administrados a uma dose subterapêutica. Adicionalmente, um método para alterar um evento adverso associado ao tratamento de uma doença hiperproliferativa com um agente imunoestimulante é descrito no presente documento que compreende administrar um anticorpo anti-LAG-3 e uma dose subterapêutica de anticorpo ant.i-PD-Ll a um indivíduo. 0 indivíduo pode ser humano. 0 anticorpo anti-PD-Ll pode ser um anticorpo monoclonal de sequência humana e o anticorpo anti-LAG-3 pode ser um anticorpo monoclonal de sequência humana, t.al como LAG3.5 descrito no presente documento. Exemplos de anticorpos anti-PD-Ll de sequência humana incluem 3G1Q, 12A4, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7 e 13G4, que são descritos na Publicação PCT n2 WO 07/005874. Outros anticorpos anti-PD-Ll incluem, por exemplo, MPDL3280A (RG7446) (W02 010/07 7 634) , MEDI4736 (WO2011/066389) , e MDX1105 (W020071005874) . 0 anticorpo anti-PD-Ll pode ligar- se a um PD-L1 humano com uma KD de 5 x 10”8 M ou menos, se ligar a um PD-LI humano com uma KD de 1 x 10'8 M ou menos, se ligar um PD-LI humano com uma KD de 5 x 10”9 M ou menos, ou se ligar a um PD-L1 humano com uma KD de entre 1 x 10"8 M e 1 x 10”10 M ou menos. O bloqueio de LAG-3 e um ou mais segundos antigénios alvo tais como CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 por anticorpos pode intensificar a resposta imunitária a células cancerígenas no paciente. Cancros cujo crescimento pode ser inibido utilizando os anticorpos da presente divulgação incluem cancros tipicamente responsivos à imunoterapia. Exemplos representativos de cancros para tratamento com a terapêutica de combinação da presente divulgação incluem aqueles cancros especificamente listados acima na discussão de monoterapia com anticorpos anti-LAG-3.
Em determinadas formas de realização, a combinação de anticorpos terapêuticos discutida no presente documento pode ser administrada concomitantemente com uma única composição num transportador farmaceuticamente aceitável, ou concomitantemente com composições separadas com cada anticorpo num transportador farmaceuticamente aceitável. Em outra forma de realização, a combinação de anticorpos terapêuticos pode ser administrada sequencialmente. Por exemplo, um anticorpo anti-CTLA-4 e um anticorpo anti-LAG-3 podem ser administrados sequencialmente, tal como anticorpo anti-CTLA-4 que é administrado primeiro e anticorpo anti-LAG-3 em segundo, ou anticorpo anti-LAG-3 que é administrado primeiro e o anticorpo anti-CTLA-4 em segundo. Adicional ou alternativamente, um anticorpo anti-PD- 1 e um anticorpo anti-LAG-3 podem ser administrados sequencialmente, tal como anticorpo anti-PD-1 que é administrado primeiro e anticorpo anti-LAG-3 em segundo, ou anticorpo anti-LAG-3 que é administrado primeiro e o anticorpo anti-PD-1 em segundo. Adicional ou alternativamente, um anticorpo anti-PD-Ll e um anticorpo anti-LAG-3 podem ser administrados sequencialmente, tal como anticorpo anti-PD-Ll que é administrado primeiro e anticorpo anti-LAG-3 em segundo, ou anticorpo anti-LAG-3 que é administrado primeiro e o anticorpo anti-PD-Ll em segundo.
Ademais, se mais de uma dose da terapêutica de combinação for administrada sequencialmente, a ordem da administração sequencial pode ser invertida ou mantida na mesma ordem em cada ponto de tempo de administração, administrações sequenciais podem ser combinadas com administrações concomitantes, ou qualquer combinação das mesmas. Por exemplo, a primeira administração de uma combinação de anticorpo anti-CTLA-4 e anticorpo anti-LAG-3 pode ser concomitante, a segunda administração pode ser sequencial com anti-CTLA-4 primeiro e anti-LAG-3 em segundo, e a terceira administração pode ser sequencial com anti-LAG-3 primeiro e anti-CTLA-4 em segundo, etc. Adicional ou alternativamente, a primeira administração de uma combinação de anticorpo anti-PD-1 e anticorpo anti-LAG-3 pode ser concomitante, a segunda administração pode ser sequencial com anti-PD-1 primeiro e anti-LAG-3 em segundo, e a terceira administração pode ser sequencial com anti-LAG-3 primeiro e anti-PD-1 em segundo, etc. Adicional ou alternativamente, a primeira administração de uma combinação de anticorpo anti-PD-Ll e anticorpo anti-LAG-3 pode ser concomitante, a segunda administração pode ser sequencial com anti-PD-Ll primeiro e anti-LAG-3 em segundo, e a terceira administração pode ser sequencial com anti-LAG-3 primeiro e anti-PD-Ll em segundo, etc. Outro esquema de dosagem representativo pode envolver uma primeira administração que é sequencial com anti-LAG-3 primeiro e anti-CTLA-4 (e/ou anti- PD-1 e/ou anti-PD-Ll) em segundo, e as administrações subsequentes podem ser concomitantes.
Opcionalmente, a combinação de anti-LAG-3 e um ou mais anticorpos adicionais (por exemplo, anticorpos anti-CTLA-4 e/ou anti- PD-1 e/'ou anti-PD-Ll) pode ser adicionalmente combinada com um agente imunogénico, tais células cancerígenas, antigénios tumorais purificados (o que inclui proteínas recombinantes, péptidos e moléculas de hidrato de carbono), células, e células transfetadas com genes codificadores de citocinas de estimulação imunitária (He et al (2004) J. Immunol. (2004) J. Immunol. 173:4.919 a 4.928K Exemplos não limitantes de vacinas de tumor que podem ser utilizados incluem péptidos de antigénios de melanoma, tais péptidos de gplOO, antigénios MAGE, Trp-2, MARTI e/ou tirosinase ou células tumorais transfetadas para expressar a citocina GM-CSF (discutidas adicionalmente abaixo) . Um bloqueio de LAG-3 eCTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 combinado pode ser adicionalmente combinado com um protocolo de vacinação, tal como qualquer um dos protocolos de vacinação discutidos em detalhes acima em relação à monoterapia com anticorpos anti-LAG- 3.
Um bloqueio de LAG-3 e CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 combinado pode ser também adicionalmente combinado com tratamentos de cancro padrão. Por exemplo, um bloqueio de LAG-3 e CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 combinado pode ser efetivamente combinado com regimes quimioterãpicos. Nesses casos, é possível reduzir a dose de outro reagente quimioterápico administrado com a combinação da presente divulgação (Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5.301 a 5.304) . Um exemplo de tal combinação é uma combinação de anticorpos anti-LAG-3 e anti-CTLA-4 e/ou anticorpos anti-PD-1 e/ou anticorpos anti-PD-Ll adicionalmente em combinação com decarbazina para o tratamento de melanoma. Outro exemplo é uma combinação de anticorpos anti-LAG-3 e anti-CTLA-4 e/ou anticorpos anti-PD-1 anticorpos e/ou anticorpos anti-PD-Ll adicionalmente em combinação com interleucina-2 (IL-2) para o tratamento de melanoma. A razão científica por trás da utilização combinada de bloqueio de LAG-3 e CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 com quimioterapia é a morte celular que é uma consequência da ação citotóxica da maioria dos compostos quimioterápicos deve resultar em níveis aumentados in de antigénio tumoral na trajetória de apresentação de antigénio. Outras terapêuticas de combinação que podem resultar na sinergia com um bloqueio de LAG-3 e CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 combinado através da morte celular incluem radiação, cirurgia ou privação hormonal. Cada um desses protocolos cria uma fonte de antigénio tumoral no hospedeiro. Inibidores de angiogenese podem ser também combinados com um bloqueio de LAG-3 e CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 combinado. A inibição de angiogenese leva à morte de célula tumoral, o que pode ser uma fonte de alimentação de antigénio tumoral nas trajetórias de apresentação de antigénio em hospedeiro.
Uma combinação de anticorpos de bloqueio de LAG-3 e CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 pode ser também utilizada em combinação com anticorpos biespecíficos que alvejam células efetoras que expressam recetor de Fca ou Fcy para células tumorais (veja-se, por exemplo, Patentes n— U.S. 5.922.845 e 5.837.243). Anticorpos biespecíficos podem ser utilizados para alvejar dois antigénios separados. 0 braço de célula T dessas respostas seria aumentado pela utilização de um bloqueio de LAG-3 e CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 combinados.
Em outro exemplo, uma combinação de anticorpos anti-LAG-3 e anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e/ou anticorpos anti-PD-L1 pode ser utilizada em combinação com anticorpos antineoplásticos, tais como Rituxan® (rituximab), Herceptin® (trastuzumab), Bexxar® (tositumomab), Zevalin® (ibritumomab), Campath® (alemtuzumab), Lymphocide® (eprtuzumab), Avastin® (bevacizumab), and Tarceva® (erlotinib) e semelhantes. Como forma de exemplo e sem querer se ater à teoria, o tratamento com um anticorpo anticancro ou um anticorpo anticancro conjugado a uma toxina pode levar à morte de célula cancerígena (por exemplo, células tumorais) o que iria potenciarimunitária uma resposta mediada por CTLA-4, PD-1, PD-L1 ou LAG-3. Numa forma de realização exemplificativa, um tratamento de uma doença hiperproliferativa (por exemplo, um tumoral de cancro) pode incluir um anticorpo anticancro em combinação com anticorpos anti-LAG-3 e anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e/ou anti-PD-Ll, concomitante ou sequencialmente ou qualquer combinação dos mesmos, o que pode potenciar respostas imunológicas antitumoral pelo hospedeiro.
Tumores escapam da vigilância imunitária de hospedeiro por uma grande diversidade de mecanismos. Muitos desses mecanismos podem ser superados pela inativação de proteínas, que são expressas pelos tumores e que são imunossupressoras. Essas incluem, de entre outras, TGF-β (Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1.037 a 1.050), IL-10 (Howard e 0'Garra (1992) Immunology Today 13: 198 a 200), e ligante Fas (Hahne et al. (1996) Science 274: 1.363 a 1.365) . Em outro exemplo, os anticorpos para cada uma dessas entidades podem ser adicionalmente combinados com uma combinação de anticorpos anti-LAG-3 e anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e/ou anti-PD-Ll para neutralizar o efeito de agentes imunossupressores e favorecer respostas imunológicas antitumorais pelo hospedeiro.
Outros anticorpos que podem ser utilizados para ativar responsividade imunitária de hospedeiro podem ser adicionalmente utilizados em combinação com uma combinação de anticorpo anti-LAG-3 e anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e/ou anti-PD-Ll. Esses incluem moléculas sobre a superfície de células dendríticas que ativam a função de DC e apresentação de antigénio. Os anticorpos anti-CD40 (Ridge et al., supra) podem ser utilizados em combinação com uma combinação de anti-LAG-3 e anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e/ou anti-PD-Ll (Ito et al., supra). Outros anticorpos de ativação para moléculas de coestimulantes de célula T Weinberg et al., supra, Melero et al. supra, Hutloff et al,, supra) podem fornecer também níveis aumentados de ativação de célula T.
Conforme discutido acima, o transplante de medula óssea está atualmente sendo utilizado para tratar uma variedade de tumores de origem hematopoiética. Um bloqueio de LAG~3 e CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 combinado pode ser utilizado para aumentar a efetividade das células T específicas de tumor enxertado de doador.
Diversos protocolos de tratamento experimentais envolvem ativação ex vivo e expansão de células T específicas de antigénio e transferência adotiva dessas células em recipientes a fim de colocar células T específicas de antigénio contra tumor (Greenberg & Riddell, supra). Esses métodos podem ser também utilizados para ativar respostas de célula T a agentes infeciosos tais como CMV. A ativação ex vivo na presença de anticorpos anti-LAG-3 e anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e/ou anti-PD-Ll pode ser esperada para aumentar a frequência e atividade das células T adotivamente transferidas.
Adicionalmente, um método para alterar um evento adverso associado ao tratamento de uma doença hiperproliferativa (por exemplo, cancro) com um agente imunoestimulante é descrito no presente documento que compreende administrar um anticorpo anti-LAG-3 e uma dose subterapêutica de anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e/ou anticorpo anti-PD-Ll a um indivíduo. Por exemplo, tais métodos incluem um método de reduzir a incidência de colite ou diarreia induzida por anticorpo terapêutico imunoestimulante administrando-se um esteroide não absorvível ao paciente. Devido ao facto de qualquer paciente que receberá um anticorpo terapêutico imunoestimulante estar em risco de desenvolver colite ou diarreia induzida por tal anticorpo, toda essa população de paciente está adequada para a terapêutica de acordo com os métodos da presente invenção. Embora esteroides tenham sido administrados para tratar doença inflamatória intestinal (IBD) e evitar exacerbações de IBD, os mesmos não foram utilizados para evitar (diminuir s incidência de) IBD em pacientes que foram diagnosticados com IBD. Os efeitos secundários significativos associados aos esteroides, até mesmo esteroides não absorvíveis, desencorajaram a utilização profilática.
Em formas de realização adicionais, uma combinação de bloqueio de LAG-3 e CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 (isto ê, anticorpos terapêuticos imunoestimulantes anti-LAG-3 e anti-CTLA-4 e/ou anticorpos anti-PD-1 e/ou anti-PD-Ll) podem ser adicionalmente combinados com a utilização de qualquer esteroide não absorvível. Conforme utilizado no presente documento, um Ãesteroide não absorvível" ê um glucocorticoide que exibe metabolismo de primeira passagem extensivo de modo que, em seguida ao metabolismo no fígado, a biodisponibilidade do esteroide é baixa, isto ê, menos que cerca de 20%. Numa forma de realização da invenção, o esteroide não absorvível é budesonida. A budesonida é um glucocorticosteroide que atual localmente, que é extensivamente metabolizado, principalmente pelo fígado, seguido pela administração oral. ENTOCORT EC® (AstraZeneca) é uma formulação oral dependente de pH e tempo de budesonida desenvolvida para otimizar entrega de fãrmaco para o íleo e ao longo do cólon. ENTOCORT EC® é aprovado nos EUA para o tratamento de doença de Crohn leve a moderada que envolve o íleo e/ou cólon ascendente. A dosagem oral usual de ENTOCORT EC® para o tratamento de doença de Crohn é 6 a 9 mg/dia. ENTOCORT EC® é liberado nos intestinos antes de ser absorvido e retido na mucosa do intestino. Uma vez que o mesmo passa pelo tecido alvo da mucosa do intestino, ENTOCORT EC® é extensivamente metabolizado pelo sistema citocroma P450 no fígado para os metabõlitos com atividade de glucocorticoide negligenciável. Portanto, a biodisponibilidade é baixa (cerca de 10%) . A baixa biodisponibilidade de budesonida resulta numa razão terapêutica aprimorada em comparação com outros glucocorticoides com metabolismo de primeira passagem menos extensivo, Budesonida resulta em menos efeitos adversos, o que inclui menos supressão hipotalâmica-pituitária, do que corticosteroides que atuam sistematicamente. Contudo, a administração crónica de ENTOCORT EC® pode resultar em efeito de glucocorticoide sistémico tal como hipercorticismo e supressão adrenal. Veja-se PDR 58° ed. 2004; 608 a 610.
Em formas de realização ainda adicionais, um bloqueio de combinação de LAG-3 e CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 (isto ê, anticorpos terapêuticos imunoestimulantes anti-LAG-3 e anti-CTLA-4 e/ou anticorpos anti-PD-1 e/ou anti-PD-Ll) em combinação com um esteroide não absorvível podem ser adicionalmente combinados com um salicilato. Salicilatos incluem agentes 5-ASA tais como, por exemplo: sulfasalazina (AZULFIDINE®, Pharmacia & Upjohn); olsalazina (DIPENTUM®, Pharmacia & Upjohn); balsalazida (COLAZAL®, Salix Pharmaceuticals, Inc.); e mesalamina (ASACOL®, Procter & Gamble Pharmaceuticals; PENTASA®, Shire US; CANASA®, Axcan Scandipharm, Inc.; ROWASA®, Solvay).
De acordo com os métodos da presente invenção, um salicilato administrado em combinação com anticorpos antiLAG-3 e anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e/ou anti-PD-Ll e um esteroide não absorvível pode incluir qualquer sobreposição ou administração sequencial do salicilato e o esteroide não absorvível com o propósito de diminuir a incidência de colite induzida pelos anticorpos imunoestimulantes. Portanto, por exemplo, os métodos para reduzir a incidência de colite induzida pelos anticorpos imunoestimulantes de acordo com a presente invenção englobam administrar um salicilato não absorvível concomitante ou sequencialmente (por exemplo, um salicilato é administrado 6 horas depois de um esteroide não absorvível), ou qualquer combinação das mesmas. Adicionalmente, de acordo com a presente invenção, um salicilato e um esteroide não absorvível podem ser administrado pela mesma via (por exemplo, ambos são administrado oralmente) ou por rotas diferentes (por exemplo, um salicilato é administrado oralmente e um esteroide não absorvível é administrado retalmente), o que pode diferir da via (ou rotas) utilizada para administrar os anticorpos anti-LAG-3 e anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e/ou anti-PD-Ll. A presente divulgação é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos, que não devem ser interpretados como adicionalmente limitantes. Referência particular é feita às publicações PCT n— WO 09/045957, WO 09/073533, WO 09/073546 e WO 09/054863.
Exemplos
Exemplo 1; Projeto de Variantes de LAG3.1 (Anticorpo 25F7)
Variantes de anticorpo do anticorpo anti-LAG-3, 25F7 previamente descritos e denominados no presente documento LAGS.1, Foram criados primeiro analisando-se a sequência de aminoãcidos do anticorpo para potenciais locais degradação. A expressão de mutagénese direcionada para local de região VH de LAG3.1 foi realizada utilizando QuikChange II XL® Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies). As regiões de VH alteradas foram então subclonadas em vetores UCOE® (EMD Millipore) que contêm a região constante IgG4-S228P humana. Os vários vetores de cadeia pesada foram cada um cotransfetados com um vetor que expressa a cadeia de kappa de LAG3.1 em células CHO-S, e conjuntos estáveis foram selecionados para a expressão.
Cinco motivos de desamidação potencial foram identificados na CDR2 de cadeia pesada de região variável. Esses locais estavam localizados nas posições 52, 54, 56, 58 e 60 da região variável de cadeia pesada de LAG3.1 (SEQ ID NO: 2) (veja-se Figura IA). Em particular, a desamidação da sequência "NG" dentro da CDR2 de VH (SEQ ID NO: 6) foi observada em todas as condições, assim como isomerização adicional da sequência. A desamidação do material de partida foi cerca de 10%. Adicionalmente, foi constatado que essa sequência ÃNGÃ não correspondia a uma sequência de linha germinativa (veja-se a Figura 3) . Contudo, A sequência de linha germinativa de consenso foi um local de glicosilação potencial e, portanto, não foi incluído nas variantes de anticorpo.
Quatro variantes (denominadas no presente documento como LAG3.5, LAG3.6, LAG3.7 e LAG3.8) foram projetadas as quais atendiam dois dos motivos de desamidação potenciais (posições 54 e 56), conforme mostrado na Figura 3, Essas variantes foram submetidas a uma matriz de condições conforme resumido na Tabela 1 abaixo e as seguintes características foram analisadas: (a) estabilidades química e térmica (estabilidade física); (b) cromatografia por exclusão de tamanho (agregação); (c) Gel de Focalização
Isoelétrica (IEF) (heterogeneidade de carga); (d) atividade por análise de Biacore (ligação e atividade funcional); e (e) mapeamento de péptido por espectrometria de massa (modificações químicas/estabilidade molecular).
Tabela 1
Exemplo 2; Caracterização de Variantes LAG-3 1, Ligação de Célula T CD4+ Humana Ativada
Para testar a habilidade das variantes de anticorpo para se ligarem a um LAG-3 humano nativo na superfície das células T humanas ativadas, as células monocelulares de sangue periférico de doador saudável normais foram estimuladas em 15 cm de placas de cultura de tecido a uma densidade de 2xl0e6 células/ml, com uma combinação de anti-CD3 (eBioscience, Cat Ó16-0Q37-85) e anti-CD28 (BD Bioscience, Cat Ó 555725) anticorpos presentes na solução a 5 pg/ml e 3 pg/ml, respetivamente. Depois de três dias de estimulação, as células foram colhidas, lavadas com tampão IX com lx PFAE (lx PBS + 2% FBS, 0,02% de azida de sódio, 2mM de Na EDTA) , e resuspenssas em tampão Ix PFAE para manchamento.
Para a reação de ligação, as variantes de LAG3.1 foram serialmente diluídas com tampão lx PFAE frio, Depois 50 μΐ de solução de anticorpo diluída foi misturada com 50 μΐ de Fitc-labeled anti-humano CD4 (BD Bioscience, Cat Ó 555346) diluído 1:16 em tampão lx PFAE. Para a reação de ligação, 100 μΐ dessa mistura de anticorpo diluída foi adicionada a 2 x 105 células e a mistura foi incubada a 4 °C por 30 minutos. As células foram depois lavadas duas vezes com tampão lx PFAE. Uma diluição 1:200 de anticorpo específico de Fcv anti-humano de cabra identificado como PE Jackson ImmunoResearch, Cat. Ó 109-116-170) foi adicionada e a mistura foi incubada por 30 minutos a 4 °C, Seguido pela lavagem duas vezes com tampão lx PFAE frio. Depois da lavagem final, 150 μΐ de lx PFAE frio foi adicionado a cada solução e análise de ligação de anticorpo foi realizada por citometria de fluxo utilizando um citómetro de fluxo FACSCanto (BD Bioscience).
Os resultados da análise de citometria de fluxo são resumidos na Figura 4A que é um gráfico que mostra a EC50 para a ligação de anticorpo a células T CD4+ humanas ativadas. A Figura 4B é um gráfico que mostra a ligação de anticorpo a um LAG-3 humano solúvel/antigénio Fc por BIACORE. Conforme mostrado, as afinidades de ligação de LAG3.5 e LAG3.8 são ligeiramente inferiores, em comparação com LAG3.1, embora suas constantes de desassociação sejam ligeiramente superiores em comparação com LAG3.1. 2. Estabilidade Física A estabilidade térmica e a desnaturação térmica das variantes foi testada utilizando Microcal VP-DSC. Especificamente, cada variante foi diluída em PBS (Mediated! cat # 21-040-CV lot # 21040139). A concentração final de amostra foi 250 pg/ml depois da diluição em PBS. A amostra foi varrida a 74 °C, Resfriada a 25 °C, e reaquecida a 74 °C, 0 tampão PBS foi utilizado como um controlo preto. Dados foram ajustados a um modelo sem 2 estados e o ajuste de curva foi realizado por software Origin.
Conforme resumido na Tabela 2 e mostrado na Figura 5, LAG3.5 teve uma temperatura de fusão superior TM2 a LAG3.1, o que indica maior estabilidade geral.
Tabela 2
0 redobramento de anticorpo seguido pela desnaturação é uma medida inversa de potencial de agregação em longo prazo. Consequentemente, As variantes de LAG-3 também foram testadas e comparadas em termos de reversibilidade térmica. Especificamente, os anticorpos foram aquecidos a 74 °C e resfriados à temperatura ambiente antes de serem aquecidos de volta a 74 °C. A razão de área sob a curva do segundo para o primeiro termogramas fornece a estimativa de reversibilidade térmica, que é uma medida direta de reversibilidade conformacional.
Conforme resumido na Tabela 3 e mostrado na Figura 6, LAG3.5 teve reversibilidade térmica substancialmente superiora, a todas as outras variantes. Notavelmente, a reversibilidade percentual para AG3.5 (47%) foi mais do que o dobro daquela de LAG3.1 (20%). A reversibilidade térmica é fortemente correlacionada à agregação em longo prazo potencial. A reversibilidade inferior corresponde à agregação potencial superior. Com base nessa observação, LAG3.1 exibiria em potencial substancialmente maior agregação com o tempo, em comparação com LAG3.5. De maneira semelhante, todas as outras variantes poderiam potencialmente exibir maior agregação com o tempo em comparação com LAG3.5.
Tabela 3
3. Agregação
As variantes também foram testadas em relação à estabilidade como uma medida de agregação de proteína utilizando HPLC por Exclusão de Tamanho padrão (SEC-HPLC) de acordo com o seguinte protocolo: amostras de teste de anticorpo foram diluídas para 1,0 mg/ml com salina tamponada em fosfato (PBS) e 10 ul foi aplicado a um HPLC (Waters, modelo 2795) . A separação foi alcançada numa coluna de filtragem com gel (TOSOH Bioscience, TSKgel G3000 SWxl, 7,8 mm x 300 mm, produto Ó0S541) utilizando uma fase móvel de 0,1 M de fosfato de sódio, 0,15 M de cloreto de sódio, 0,1 M de sulfato de sódio, pH 7,2. 0 analito foi detetado monitorando-se a absorbância de UV a 280 nm, e a composição de percentual de área de pico de anticorpo foi determinada utilizando software Empower. Conforme mostrado na Tabela 4, LAG3.5 exibiu substancialmente agregação reduzida em comparação com LAG3.1.
Tabela 4
Exemplo 3; Seleção de Variante
Com base nos estudos descritos acima, a variante de anticorpo LAG3.5 foi selecionada para análise adicional, em vista de sua estabilidade química e física aprimorada em comparação com sua forma não modificada (LAG3.1), particularmente, sua alta capacidade de redobramento conformacional (reversibilidade térmica). Essa análise incluía uma abordagem de duas etapas de (a) tensão acelerada, (b) em seguida 12 semanas de avaliação de estabilidade em tempo real. Especificamente, LAG3.5 foi incubado a 1,0 mg/ml em pH 8,0, 50 mM de Bicarbonato de
Amónio, por 5 dias a 4 0 °C. 0 grau de modificações depois de 5 dias foi analisado, assim como o efeito na atividade e estabilidade. A variante de LAG3.5 foi depois submetida à es em tempo real em PBS por uma duração de 12 semanas e subsequentemente analisada. Os resultados desses estudos são descritos abaixo. 1. Ligação de antigénio
Conforme mostrado na Figura 7 (e Tabela 5) , nenhuma mudança na ligação de antigénio foi observada depois de 5 dias. Conforme mostrado também nas Figuras 10A e B, LAG3.5 não exibiu mudança na ligação de antigénio ou estabilidade física depois de 12 semanas. Em particular, LAG3,5 mantém afinidade superior a LAG3.8 durante as 12 semanas inteiras tanto a 4 °C quanto a 40 °C.
Tabela 5
2. Modificações Químicas/Estabilidade Molecular 0 mapeamento de péptido por espectrometria de massa foi utilizado para analisar a estabilidade química/molecular de LAG3.5 em comparação com LAG3.1. Especificamente, o anticorpo purificado foi reduzido, alquilado, dialisado e digerido com tripsina (Promega Cat. V5111) e GluC (Roche Cat. 11047817001). Digestões foram analisadas por espectrometria de massa MSMS nano-LC (Thermo Fisher LTQ Orbitrap).
Conforme mostrado na Figura 8, LAG3.1 mostrou heterogeneidade aumentada em VH em comparação com LAG3.5 quando submetido à estabilidade acelerada em pH superior, o que desamida resíduos de asparagina (etapa 1). A mudança na massa devido à isomerização poderia não ser detetada em condições experimentais atuais. A mudança percentual é expressa como uma razão de todas as mudanças combinadas com o pico parental.
Adicionalmente, conforme mostrado na Figura 11, LAG3.1 mostrou heterogeneidade aumentada em VH em comparação com LAG3.5 quando submetido a estabilidade em tempo real prolongada de 12 semanas, tanto em 4 °C quanto em 40 °C (etapa 2). 3. Estabilidade Física
Reversibilidade térmica foi medida em PBS e em pH 8,0. Sob ambas as condições, LAG3.5 novamente exibiu aproximadamente o dobro do nível de redobramento em comparação com LAG3.1. Especificamente, conforme mostrado nas Tabelas 6 a 8, LAG3.5 exibiu 43% de redobramento em comparação com 18% para LAG3.1 em PBS. LAG3.5 também exibiu 48% de redobramento em comparação com 29% de redobramento para LAG3.1 com pH 8,0.
Tabela 6 - DSC:fusão
Tabela 7 - Fluoroloçj-2 : desdobramento
Tabela 8: DSC:redobramento
4. Heterogeneidade de Carga
Para avaliar a heterogeneidade de carga, as variantes foram analisadas utilizando isoeletrofocalização (IEF) com marcadores padrão de pi 5,5 e pi 10,0 em comparação com LAG3.1. Resumidamente, as soluções de anticorpo foram aplicadas numa espessura de 1 mm de IEF pi 3-7 gel pré-fabricado (Invitrogen, CatÓ EC6648BOX) junto com marcadores pi 3-10 (SERVA, CatÓ 39212). Eletroforese foi realizada utilizando tampão IEF 3-7 Cátodo (Invitrogen, CatÓ LC537Q) e tampão IEF Ânodo (Invitrogen, CatÓ LC5300) e aplicando-se corrente elétrica da ordem de 100 V constante por 1 hora, 200 V constante por 1 hora, e 500 V constante por 30 minutos. Os géis de IEF foram manchados com Coomassie blue para detetar as faixas de proteína e desmanchados com solução de ácido acético e metanol. Os géis de IEF foram então analisados por software ImageQuant TL software. Com base nessa análise (dados não mostrados), LAG3.5 exibiram significativamente menos heterogeneidade em comparação com LAG3.1.
5. HIC-HPLC
Para avaliar a solubilidade, as variantes foram analisadas utilizando Cromatografia de Interação
Hidrofóbica padrão (HIC- HPLC) de acordo com o seguinte protocolo: 50 ul de 2M de sulfato de amónio foi adicionado a 50 ul de amostra de teste de anticorpo a 1 mg/ml. 80 ul da amostra de teste foi então aplicada a uma HPLC (Waters, modelo 2795) conectada em linha com uma coluna de HIC (TOSOH Bioscience, Éter-5PW TSK-gel, 7,5 mm x 75 mm, produto Ó07573). A amostra foi eluída numa taxa de fluxo de 1,0 ml/min com um gradiente de 100% de tampão A (2M de sulfato de amónio, 0,1 M de fosfato de sódio, pH 7,0) para 100% de tampão B (0,1 M de fosfato de sódio, pH 7,0) em 50 minutos. 0 anticorpo foi detetado monitorando-se absorbância de UV a 280 nm e dados foram analisados utilizando software Empower. Conforme mostrado na Figura 9, a hidrofilicidade de LAG3.5 exibiu solubilidade em altas concentrações de sulfato de amónio.
Exemplo 4; Reversão de Inibição de Resposta imunitária
Mediada por Célula T A atividade de LAG3.5 foi determinada por meio de um ensaio funcional que utilizou um hibridoma de célula T de murganho específica de antigénio (3A9). 0 hibridoma 3A9 expressa um recetor de célula T específico para um péptido de lisozima de ovo de galinha (HEL48-62) e secreta IL-2 quando cocultivado com células que apresentam antigénio, Compatibilizadas por MHC, pulsadas com péptido (LK35.2). Visto que hulAG-3-Fc tem capacidade para a ligação às linhagens de célula B de murganho positivas de classe II MHC, A expressão de hulAG-3 na linha 3A9 poderia enxertar um efeito inibitório através do engatamento com a classe II na linha que apresenta murino Uma comparação do perfil de resposta de péptido do 3A9 parente com aquela das células 3A9 transduzidas de humano de LAG-3 cocultivadas com células de compatibilizadas por MHC que apresentam antigénio demonstrou que a expressão de responsividade de péptido inibiu LAG-3 humano em comparação com células 3A9 de controlo. Essa inibição foi revertida pelo bloqueio de LAG-3 utilizando LAG3.5. Portanto, o bloqueio mediado por LAG-3 foi demonstrou para LAG3.5.
Exemplo 5: Ativação de Célula T por LAG3.5 A atividade funcional de LAG3.5 em células T primárias foi avaliada utilizando culturas de PBMC humanas estimuladas pelo superantigénio SEB. Os PBMC totais foram isolados do sangue de dezoito doadores humanos e estimulados por 72 horas nos dois formatos de ensaio: (i) uma quantidade fixa de anticorpo (20 pg/rrtl) e diluições em série de SEB, ou (ii) uma quantidade fixa de SEB (85 ng/ml) e diluições em série de anticorpo. IL-2 secretado, como uma medida da atividade de célula T, Foi monitorado por ELISA. 0 anticorpo anti-PD-1 e Ipilimumab foram utilizados como controles positivos e a atividade de LAG3.5 em combinação com anti-PD-1 ou anti-CTLA-4 foi também avaliada para um subconjunto de doadores.
Secreção de IL-2 aprimorada foi observada durante uma faixa de concentrações de SEB de quinze dos dezoito doadores com LAG3.5 apenas, em comparação com o tratamento de anticorpo de controlo de isotipo. Na maioria dos casos, a estimulação foi menor do que o observado para o
tratamento com anti-PD-1 ou Ipilimumab. Em relação a LAG3.5, os resultados dos dois formatos de ensaio (descritos acima) estavam de acordo um com o outro. Além disso, em 5 de 6 doadores testados, a combinação de LAG3.5 com anti-PD-1 ou Ipilimumab resultou em níveis superiores de estimulação do que o observado para anticorpo de controlo de isotipo combinado com anti-PD-1 ou Ipilimumab. Esses dados revelaram que LAG3.5 pode funcionar em ensaios de célula T humanas normais e podem ativar adicionalmente respostas mediadas por inibição de função de PD-1 e CTLA-4. SUMARIO DE LISTAGEM DE SEQUENCIA
LISTA DE SEQUÊNCIAS <110>
< 12 0 > OTIMIZAÇÃO DE ANTICORPOS QUE SE LIGAM AO GENE DE ATIVAÇÃO DE LINFÓCITO-33 (LAG-3) E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS
<13 0 > 11911-WO-PCT < 14 0 > <141> 30-05-2013 <150> 61/667,058 <151> 02-07-2012 <160> 52 <170> Patentln versão 3.5
<210> 1 <211> 360 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de sequência artificial:
Polinucleótido sintético" < 2 2 0 >
<221> CDS <222 > (1) . . (360) < 4 0 0 > 1 cag gtg cag eta cag cag tgg gge gca gga ctg ttg aag cct teg gag 48
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Phe Gly Tyr Ser Asp Tyr Glu Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gin 100 105 110 gga acc ctg gtc acc gtc tec tea 360
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <221> fonte <223> /'nota=ÃDescrição de sequência artificial:
Polinucleótido sintéticoà <400>2
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<221> CDS <222 > (1) . . (321) <4QG> 3 gaa att gtg fcfcg aca cag tct cca gcc acc cfcg tct ttg tct cca ggg 48
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Thr Phe Gly Gin Gly Thr Asn Leu Glu lie Lys 100 105
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Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr 1 5
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Polinucleótido sintéticoà <400> 11 caggfcgoagc fcacagcagfcg gggcgcagga ctgfct-gaagc ct-tcggagac ccfc.gfcccct.c 60 acctgcgctg tctatggtgg gtccfctcagt gattactact ggaactggat ccgccagccc 120 ecagggaagg ggctggagfcg gafctggggaa atcaatcatc gtggaagcac caactccaac 180 ccgtccctca agagtcgagt caccctatca ctagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgaggt ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgtt tggatatagt 300 gaetacgagt aeaactggtt cgaccectgg ggccagggaa cectggtcac egtctcctea 360
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Polinucleótido sintéticoà <400> 12
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Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Phe Gly Tyr Ser Asp Tyr Glu Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gin 100 105 110
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<221> CDS <222 > (1) . . (321) <4QG> 13 gaa att gtg ttg aca cag tct cca gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15 gaa aga gcc acc etc tcc tgc agg gcc agt cag agt att age age tac 96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser Tyr 20 25 30 tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag get ccc agg etc etc ate 144
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45 tat gat gca tcc aac agg gcc act ggc ate cca gcc agg ttc agt ggc 192
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly He Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct ggg aca gac ttc act etc acc ate age age eta gag cct 240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt sag cag cgt age aac tgg cct etc 288
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Leu 85 90 95 act ttt ggc cag ggg acc aac ctg gag ate aaa 321
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Asn Leu Glu lie Lys 100 105
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Leu 85 90 95
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 * * 15
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Met Trp Glu Ala Gin Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gin Pro Leu Trp 15 10 15
Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gin Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val 20 25 30
Trp Ala Gin Glu Gly Ala Pro Ala Gin Leu Pro Cys Ser Pro Thr lie 35 40 45
Pro Leu Gin Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gin 50 55 60
His Gin Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu 65 70 75 80
Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro 85 90 95
Arg Arg Tyr Thr val Leu Ser val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly 100 105 110
Arg Leu Pro Leu Gin Pro Arg Val Gin Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gin 115 120 125
Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala 130 135 140
Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys 145 150 155 160
Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gin Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro 165 170 175
Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val lie Leu Asn Cys Ser Phe Ser 180 185 190
Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gin 195 200 205
Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser 210 215 220
Phe Leu Phe Leu Pro Gin Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly 225 230 235 240
Cys lie Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser lie Met Tyr Asn 245 250 255
Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala 260 265 270
Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val 275 280 285
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Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu 305 310 315 320
Glu Asp Val Ser Gin Ala Gin Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His lie His 325 330 335
Leu Gin Glu Gin Gin Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala lie lie Thr 340 345 350
Val Thr Pro lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu 355 360 365
Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gin Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser 370 375 330
Leu Asp Thr Pro Ser Gin Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala 3B5 390 395 400
Gin Glu Ala Gin Leu Leu Ser Gin Pro Trp Gin Cys Gin Leu Tyr Gin 405 410 415
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Pro Gly Ala Gin. Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly 435 440 445
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Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gin Gly lie His Pro Pro Gin Ala Gin 485 490 495
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Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Gin Leu 515 520 525
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Val lie Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 15 10 15
Gly
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Gin Val Gin Leu Gin Gin Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Asp Tyr 20 25 30
Tyr Trp Asn Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Glu lie Asn His Asn Gly Asn Thr Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60
Ser Arg Val Thr Leu Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 65 70 75 80
Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Phe Gly Tyr Ser Asp Tyr Glu Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160
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Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205
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Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr 245 250 255
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Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285
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Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320
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gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt cfcccagggga aagagccacc SO ctctcctgca gggccagtca gagtattagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctctcac ttttggccag 300 gggaccaacc tggagatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttccogcca 360 tcfcgatgagc agfctgaaatc fcggaactgcc tctgtfcgtgfc gcctgofcgaa taacttctat 420
Gccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agoacctaca gcctcagcag caacctgaog 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ceatoagggc 600 ctgagctcgc ccgtcaeaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645
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Glu lie val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45
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Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140
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Gin Val Gin Leu Gin Gin Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Asp Tyr 20 25 30
Tyr Trp Asn Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175
Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 210 215 220
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr 245 250 255
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ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcatc gtggaagcac caactccaac ISO ccgtocotoa ag&amp;gtcgagt caccctatca ctagacacgt coaagaacca gttctccctg 240 aagctgaggt ctgtgaccgc egcggacacg gctgtgtatt actgtgcgtt tggatatagt 300 gactacgagt acaactggtt cgaoccctgg ggscagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 gctagcacca agggcccatc cgtcfctcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 420 agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 600 tacaectgca aegtagatca caagcccagc aaeaecaagg tggacaagag agttgagtce 660 aaatatggtc ccccatgccc accatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 720 ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc fcgaggtcacg 780 tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 840 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 300 cgtgtggtca gegtcetcac ogtcotgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 360 tgcaaggtct coaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc oaaagccaaa 1020 gggcagcccc gagagccaca ggfcgfcacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 1080 aaccaggtca gccfcgacctg ccfcggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1140 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200 gacggctcot tcttcctcta eagcaggcta aocgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 1260 aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgeaca aecactacac acagaagagc 1320 ctctccctgt etetgggtaa atga 1344 <210> 37 <211> 214
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Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45
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Thr Phe Gly Gin Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala 100 105 110
Pro Ser Vai Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125
Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140
Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160
Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr 180 185 190
Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser 195 200 205
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<221> M0D_RES <222 > (2) .. (2) <223> Resíduo isomerizado <400> 52 lie Asp His Arg Gly Ser Thr Asp Ser Asn Pro Ser Leu Lys 15 10
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não ê parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, ο IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição • US 20110150892 AI [0005] [0027] [0029] • WO 9425585 A [0105] • US 6951646 B [0065] • WO 9713852 A [0105] • US 6914128 B [0065] • WO 9824884 A [0105] [0111] • US 6090382 A [0065] • WO 9945962 A [0105] • US 6818216 B [0065] • WO 0114424 A [0105] [0111] [0174] • US 6156313 A [0065] • WO 0243478 A [0106] • US 6827925 B [0065] • US 5939598 A [0107] • US 5833943 A [0065] • US 6075181 A [0107] • US 5762905 A [0065] • US 6114598 A [0107] • US 5760185 A [0065] • US 6150584 A [0107] • US 5225539 A [0072] [0103] • US 6162963 A [0107] • US 5530101 A [0072] [0076] [0103] • WO 02092812 A [0107] • US 5585089 A [0072] [0076] [0103] • US 5223409 A [0108] • US 5693762 A [0072] [0076] [0103] • US 5403484 A [0108] • US 6180370 B [0072] [0076] [0103] • US 5571698 A [0108] • US 20030153043 A[0080] • US 5427908 A[0108] • US 5677425 A [0083] • US 5580717 A [0108] • US 6165745 A [0084] • US 5969108 A [0108] • US 6277375 B [0085] • US 6172197 B [0108] • US 5869046 A [0085] • US 5885793 A [0108] • US 6121022 A [0085] • US 6521404 B [0108] • US 5624821 A [0086] • US 6544731 B [0108] • US 5648260 A [0086] • US 6555313 B [0108] • US 6194551 B [0087] • US 6582915 B [0108] • WO 9429351 A [0088] • US 6593081 B [0108] • WO 0042072 A [0089] • US 5476996 A [0109] • US 5714350 A [0090] • US 5698767 A [0109] ® US 6350861 B [0090] • US 6794132 B [0110] • US 20040110704 A[0091] • US 4399216 A[0117] • EP 1176195 A [0091] • US 4634665 A [0117] • WO 03035835 A [0091] • US 5179017 A [0117] • WO 06089231 A [0091] • WO 8704462 A [0119] • WO 9954342 A [0091] • WO 8901036 A [0119] • EP 0154316 A [0092] • EP 338841 A [0119] • EP 0401384 A [0092] • US 7087600 B [0120] • US 4816567 A [0103] • US 6989452 B [0120] • US 5545806 A [0105] • US 7129261 B [0120] • US 5569825 A [0105] • WO 02096910 A [0120] • US 5625126 A [0105] • WO 07038658 A [0120] • US 5633425 A [0105] • WO 07051081 A [0120] • US 5789650 A [0105] • WO 07059404 A [0120] • US 5877397 A [0105] • WO 08083312 A [0120] • US 5661016 A [0105] • WO 08103693 A [0120] • US 5814318 A [0105] • US 20060024317 A [0120] • US 5874299 A[0105] ® US 20060004081 A[0120] • US 5770429 A[0105] • US 20060247295 A[0120] • US 5545807 A [0105] • US 5399163 A [0134] • WO 9203918 A [0105] • US 5383851 A [0134] • WO 9312227 A [0105] • US 5312335 A [0134] • US 5064413 A [0134] • WO 0037504 A [0174] • US 4941880 A [0134] • US 6207156 B [0174] • US 4790824 A [0134] • WO 06121168 A [0175] • US 4596556 A [0134] • WO 2008156712 A [0175] • US 4487603 A [0134] • WO 2010027423 A [0175] • US 4486194 A [0134] • WO 2010027827 A [0175] • US 4447233 A [0134] • WO 2010027828 A [0175] • US 4447224 A [0134] • WO 2010098788 A [0175] • US 4439196 A [0134] • WO 07005874 A [0176] • US 4475196 A [0134] • WO 2010077634 A [0176] • US 4522811 A [0135] • WO 2011066389 A [0176] • US 5374548 A [0135] • WO 20071005874 A [0176] • US 5416016 A [0135] • WO 09045957 A [0192] • US 5399331 A [0135] • WO 09073533 A [0192] • US 5922845 A [0154] [0182] • WO 09073546 A [0192] • US 5837243 A [0154] [0182] • WO 09054863 A [0192] • US 5811097 A [0156] • WO 61667058 A [0216] • WO 9842752 A [0174]
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Claims (35)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Anticorpo monoclonal isolado ou uma porção de ligação de antigénio do mesmo que liga LAG-3 humano, em que as regiões CDR 1, CDR2, e CDR3 de cadeia pesada compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 15, 16, e 17, respetivamente, e em que as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia leve compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 18, 19, e 20, respetivamente.
  2. 2 . Anticorpo ou porção de ligação de antigénio do mesmo de acordo com a reivindicação 1, em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.
  3. 3. Anticorpo ou porção de ligação de antigénio do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que exibe uma ou uma combinação das seguintes propriedades: (a) ligação a LAG-3 de macaco; (b) ausência de ligação a LAG-3 de murganho; (c) ligação a moléculas de classe II de histocompatibilidade principal (MHC) de LAG-3; (d) inibição de ligação de LAG-3 a moléculas de classe II de histocompatibilidade principal (MHC); ou (e) estimulação de uma resposta imunitária.
  4. 4. Anticorpo ou porção de ligação de antigénio do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que estimula produção de interleucina-2 (IL-2) numa resposta de célula T específica de antigénio e/ou estimula uma resposta imunitária antitumoral.
  5. 5. Anticorpo ou porção de ligação de antigénio do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que se liga a LAG-3 humano com uma KD de 0,27 x 10~9 M ou menos conforme determinado pela ressonância de plasmon de superfície.
  6. 6 . Anticorpo ou porção de ligação de antigénio do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que é um anticorpo humano.
  7. 7. Anticorpo ou porção de ligação de antigénio do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que é um isotipo de IgGl, IgG2 ou IgG4.
  8. 8. Anticorpo ou porção de ligação de antigénio do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que é um isotipo de IgG4.
  9. 9. Anticorpo ou porção de ligação de antigénio do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que é um fragmento de anticorpo ou um anticorpo de cadeia única.
  10. 10. Anticorpo, de acordo com as reivindicações 1 a 8, que é um anticorpo de comprimento completo.
  11. 11. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou 10, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal humano IgG4 de comprimento completo isolado que se liga a LAG-3 humano com uma KD de 0,27 x IO"9 M ou menos conforme determinado por ressonância de plasmon de superfície.
  12. 12. Molécula biespecífica que compreende o anticorpo ou porção de ligação de antigénio do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, e um segundo anticorpo ou porção de ligação de antigénio do mesmo.
  13. 13. Imunoconjugado que compreende o anticorpo ou porção de ligação de antigénio do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, unido a um agente terapêutico.
  14. 14. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 13, em que o agente terapêutico é uma citotoxina ou um isótopo radioativo.
  15. 15. Composição que compreende o anticorpo ou porção de ligação de antigénio do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, a molécula biespecífica de acordo com a reivindicação 12, ou o imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, e um transportador farmaceuticamente aceitável.
  16. 16. Composição, de acordo com a reivindicação 15, que compreende adicionalmente um agente anticancro.
  17. 17. Composição, de acordo com a reivindicação 16, em que o agente anticancro é um anticorpo ou um agente quimioterãpico.
  18. 18. Composição, de acordo com a reivindicação 17, em que o anticorpo é um anticorpo de comprimento completo.
  19. 19. Composição, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, em que o anticorpo é um isotipo de IgG4.
  20. 20. Ácido nucleico isolado codificador da região variável de cadeia pesada e leve do anticorpo ou porção de ligação de antigénio do mesmo de acordo com a reivindicação 1 ou 2.
  21. 21. Vetor de expressão que compreende o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 20.
  22. 22. Célula hospedeira que compreende o vetor de expressão de acordo com a reivindicação 21.
  23. 23. Método para preparar um anticorpo anti-LAG-3 que compreende expressar o anticorpo na célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 22, e isolar o anticorpo da célula hospedeira.
  24. 24. Anticorpo ou porção de ligação de antigénio do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou a molécula biespecífica, de acordo com a reivindicação 12, ou o imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, para utilização num método para estimular uma resposta imunitária num indivíduo,
  25. 25. Anticorpo porção de ligação de antigénio, molécula biespecífica ou imunoconjugado para utilização, de acordo com a reivindicação 24, em que o indivíduo é um indivíduo portador de tumor e uma resposta imunitária contra o tumor é estimulada.
  26. 26. Anticorpo, porção de ligação de antigénio, molécula biespecífica ou imunoconjugado para utilização, de acordo com a reivindicação 24, em que o indivíduo é um indivíduo portador de vírus e uma resposta imunitária contra o vírus é estimulada.
  27. 27. Anticorpo, porção de ligação de antigénio, molécula biespecífica ou imunoconjugado para utilização, de acordo com a reivindicação 24, em que a resposta imunitária é uma resposta de célula T específica de antigénio, de modo que uma resposta de célula T específica de antigénio seja estimulada.
  28. 28. Anticorpo, porção de ligação de antigénio, molécula biespecífica ou imunoconjugado para utilização de acordo com a reivindicação 27, em que a produção de interleucina-2 pela célula T específica de antigénio é estimulada.
  29. 29. Anticorpo, porção de ligação de antigénio, molécula biespecífica ou imunoconjugado para utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 26, que compreende adicionalmente a administração de pelo menos um anticorpo imunoestimulante adicional.
  30. 30. Anticorpo, porção de ligação de antigénio, molécula biespecífica ou imunoconjugado para utilização, de acordo com a reivindicação 29, em que o pelo menos um anticorpo adicional imunoestimulante é um anticorpo anti-PD-1.
  31. 31. Anticorpo, porção de ligação de antigénio, molécula biespecífica ou imunoconjugado para utilização, de acordo com a reivindicação 29, em que o pelo menos um anticorpo imunoestimulante adicional é um anticorpo anti-PD-Ll.
  32. 32. Anticorpo, porção de ligação de antigénio, molécula biespecífica ou imunoconjugado para utilização, de acordo com a reivindicação 29, em que o pelo menos um anticorpo imunoestimulante adicional é um anticorpo anti-CTLA-4.
  33. 33. Anticorpo ou porção de ligação de antigénio do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, molécula biespecífica, de acordo com a reivindicação 12, ou imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, para utilização num método para inibir o crescimento de células tumorais num indivíduo.
  34. 34. Anticorpo ou porção de ligação de antigénio do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, molécula biespecífica, de acordo com a reivindicação 12, ou imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, para utilização num método para tratar infeção virai num indivíduo.
  35. 35. Utilização do anticorpo ou porção de ligação de antigénio do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, da molécula biespecífica, de acordo com a reivindicação 12, ou do imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, no fabrico de um medicamento para estimular uma resposta imunitária, opcionalmente, uma resposta de célula T específica de antigénio, ou inibir o crescimento de células tumorais, ou tratar uma infeção virai num indivíduo.
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