RU2722451C1

RU2722451C1 - Pd-1 антитела и их применение.

Info

Publication number: RU2722451C1
Application number: RU2018115575A
Authority: RU
Inventors: Нана ГУ; Ке ШАО
Original assignee: Шанхай Чжанцзян Биотекнолоджи Ко., Лтд.
Priority date: 2015-09-29
Filing date: 2016-09-29
Publication date: 2020-06-01
Also published as: EP3356416A4; US20180282412A1; CN108368175A; KR102685020B1; CA3000638A1; WO2017058115A1; JP2018529368A; EP3356416B1; KR20180083318A; US10981991B2; EP3356416A1; BR112018006547A2; JP6952028B2; CA3000638C; CN108368175B

Abstract

Группа изобретений относится к медицине и касается анти-PD1 моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, где указанное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 1 (CDR1 тяжелой цепи), SEQ ID NO: 2 (CDR2 тяжелой цепи), SEQ ID NO: 3 (CDR3 тяжелой цепи), и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 4 (CDR1 легкой цепи), SEQ ID NO: 5 (CDR2 легкой цепи) и SEQ ID NO: 6 (CDR3 легкой цепи). Группа изобретений также касается выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей указанное антитело; вектора экспрессии; способа модулирования иммунного ответа у субъекта, содержащего введение субъекту указанного антитела; применения указанных антитела или его антигенсвязывающего фрагмента при производстве лекарственного средства для ингибирования роста опухолевых клеток у субъекта. Группа изобретений обеспечивает высокую аффинность к PD1 и термальную устойчивость антитела. 12 н. и 4 з.п. ф-лы, 20 пр., 14 ил., 1 табл.

Description

ОБЛАСТЬ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0001] Главным образом настоящее изобретение относится к иммунотерапии при лечении заболеваний человека. Более конкретно, настоящее изобретение относится к применению антител к PD-1 для лечения рака.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Адаптивный иммунный ответ включает активацию, селекцию и клональную пролиферацию двух основных классов лимфоцитов, названных Т-клетками и В-клетками. После обнаружения антигена Т-клетки пролиферируют и дифференцируются в антиген-специфичные эффекторные клетки, при этом В-клетки пролиферируют и дифференцируются в секретирующие антитела клетки.

[0003] Активация Т-клеток является многостадийным процессом и требует нескольких сигнальных событий между Т-клетками и антигенпрезентирующими клетками (АПК). Для того, чтобы произошла активация Т-клеток необходима доставка двух видов сигналов покоящейся Т-клетке. Первый вид опосредуется антигенспецифичными Т-клеточными рецепторами (TcR) и придает специфичность иммунному ответу. Второй вид, костимулирующий, регулирует степень ответа и его прохождение осуществляется через вспомогательные рецепторы на Т-клетках.

[0004] Первичный костимуляторный сигнал доставляется через активацию рецептора CD28 с момента захвата его лиганда В7-1 или В7-2. В противоположность захват ингибирующего рецептора CTLA4 теми же лигандами В7-1 или В7-2 приводит к затуханию иммунного ответа. Таким образом, сигналы CTLA4 антагонизируют костимуляцию, опосредованную CD28. При высоких концентрациях антигена костимуляция CD28 перекрывает ингибирующий эффект CTLA-4. Периодическая регуляция экспрессии СВ28 и CTLA-4 поддерживает баланс между активирующими и ингибирующими сигналами и обеспечивает развитие эффективного иммунного ответа, при этом сохраняя свой организм от развития аутоиммунитета.

[0005] Недавно были обнаружены молекулярные гомологи CD28 и CTLA-4 и их В-7 аналогичные лиганды. ICOS представляет собой CD28-похожий костимуляторный рецептор. PD-1 (Программируемая смерть 1) является ингибирующим членом семейства рецепторов CD28, которое также включает CD28, CTLA-4, ICOS и BTLA. PD-1 экспрессируется на активированных В клетках, Т клетках и миелоидных клетках. Первоначальные члены семейства, CD28 и ICOS, были открыты посредством функциональных эффектов на увеличение пролиферации Т-клеток после добавления моноклональных антител (Hutloff et al. (1999) Nature 397:263-266; Hansen et al. (1980) Immunogenics 10:247-260). PD-1 был открыт с помощью скрининга на дифференциальную экспрессию в апоптозных клетках (Ishida et al. (1992) EMBO J 11:3887-95). Другие члены семейства, CTLA-4 и BTLA, были открыты с помощью скрининга на дифференциальную экспрессию в цитотоксических Т-лимфоцитах и клетках ТН1, соответственно. CD28, ICOS и CTLA-4 все обладают непарными цистеиновыми остатками, обеспечивая возможность гомодимеризации. В противоположность PD-1 предположительно существует в виде мономера, поскольку не содержит непарного цистеина как у других членов семейства CD28.

[0006] Ген PD-1 представляет собой 55 кДа трансмембранный белок типа I, который является частью суперсемейства lg генов (Agata et al. (1996) Int Immunol 8:765-72). PD-1 содержит мембранный проксимальный иммунорецепторный тирозин ингибирующий мотив (ITIM) и мембранный дистальный мотив переключения на основе тирозина (ITSM). Несмотря на структурную близость с CTLA-4, в PD-1 отсутствует мотив MYPPPY, который является критичным для связывания с В7-1 и В7-2. Для PD-1 были обнаружены два лиганда, PD-L1 и PD-L2, которые, как было показано, снижают активацию Т клеток после связывания с PD-1 (Freeman et al. (2000) J Exp Med 192: 1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32: 634-43). Оба PD-L1 и PD-L2 являются гомологами В7, которые связываются с PD-1, но не связываются с другими членами семейства CD28. PD-1 представляет собой ингибирующий член семейства CD28, экспрессируемый на активированных В клетках, Т клетках и миелоидных клетках. Один лиганд для PD-1, PD-L1, присутствует во многих опухолях человека (Dong et al. (2002) Nat. Med. 8: 787-9). Взаимодействие между PD-1 и PD-L1 приводит к уменьшению лимфоцитов, инфильтрующих опухоль, снижению опосредуемой рецепторами Т-клеток пролиферации, и иммунному уходу раковых клеток (Dong et al. (2003) J. Mol. Med. 81: 281-7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10: 5094-100). Иммунная супрессия может быть прекращена ингибированием локального взаимодействия PD-1 с PD-L1, и указанный эффект усиливается при ингибировании также взаимодействия PD-1 с PD-L2 (Iwai et al. (2002) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 99: 12293-7; Brown et al. (2003) J. Immunol. 170: 1257-66).

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0007] В настоящем изобретении предложены моноклональные антитела, которые связываются с PD-1 и которые проявляют ряд желательных свойств. Эти свойства включают, например, высокую аффинность связывания с PD-1 человека.

[0008] В настоящем изобретении предложено выделенное моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, где указанное моноклональное антитело связывается с человеческим PD-1 с высокой аффинностью. Моноклональное антитело по настоящему изобретению является мышиным, химерным или гуманизированным антителом. Указанный антиген-связывающий фрагмент по настоящему изобретению представляет собой Fab, Fab', F(ab)2, или F(ab')2.

[0009] В настоящем изобретении также предложены выделенные молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют анти-PD-l моноклональное антитело.

[0010] В настоящем изобретении также предложены векторы экспрессии, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую анти-PD1 моноклональное антитело.

[0011] В настоящем изобретении также предложены клетки-хозяева, содержащие вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую анти-PDI моноклональное антитело.

[0012] В настоящем изобретении также предложены способы модулирования иммунного ответа с применением анти-PD-l антител. В частности, в настоящем изобретении предложен способ ингибирования роста опухолевых клеток с применением анти-PD-l антител.

[0013] В одном аспекте здесь предложены анти-PDI моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где указанное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 1 (тяжелой цепи CDR1), SEQ ID NO: 2 (тяжелой цепи CDR2), SEQ ID NO: 3 (тяжелой цепи CDR3) и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 4 (легкой цепи CDR1), SEQ ID NO: 5 (легкой цепи CDR2) и SEQ ID NO: 6 (легкой цепи CDR3).

[0014] В другом аспекте предложена композиция, содержащая моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент как здесь описано и фармацевтически приемлемый носитель.

[0015] В другом аспекте предложен иммуноконъюгат, содержащий моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент как здесь описано, соединенный с терапевтическим агентом.

[0016] В другом аспекте предложен способ модулирования иммунного ответа у субъекта, содержащий введение субъекту антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, как здесь описано, таким образом, что иммунный ответ у субъекта модулируется.

[0017] В другом аспекте предложен способ ингибирования роста опухолевых клеток у субъекта, содержащий введение субъекту антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, как здесь описано в количестве, эффективном для ингибирования роста опухолевых клеток.

[0018] В другом аспекте предложен способ лечения инфекционного заболевания у субъекта, содержащий введение субъекту антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, как здесь описано, так, что субъект лечится от инфекционного заболевания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0019] Настоящее изобретение будет более понятным со ссылкой на подробное описание при рассмотрении вместе с неограничивающими примерами и сопутствующими фигурами, на которых:

[0020] Фиг. 1А и 1В показывают связывание PD-L1-Fc с PD-1-трансфицированными клетками СНО (CHO/PD-1).

[0021] Фиг. 2 показывает связывание PD-1-Fc-биотина с PD-L1-Fc.

[0022] Фиг. 3 показывает аминокислотную последовательность вариабельных регионов тяжелой (А) и легкой (В) цепей антител 67D9 и hu67D9. 67D9VH и 67D9VL обозначают вариабельные регионы тяжелой и легкой цепей антитела 67D9, соответственно, humIII был выбран в качестве каркаса для гуманизированных тяжелых цепей, a humkIII был выбран для гуманизированных легких цепей. hu67D9VH и hu67D9VL обозначают вариабельные регионы тяжелой и легкой цепи антитела hu67D9, соответственно. Пунктир обозначает аминокислоты, которые являются такими же как соответствующие остатки в каркасе человеческого антитела. Участки CDR заключены в скобки.

[0023] Фиг. 4А-4D показывает результаты экспериментов, демонстрирующих что все три анти-PD-l антитела, 67D9, C67D9, и hu67D9, эффективно ингибируют связывание PD-L1-Fc с PD-1, экспрессированным на трансфицированных клетках СНО-K1.

[0024] Фиг. 5А-5D показывают результаты экспериментов, демонстрирующих что каждое из анти-PD-l антител 67D9 (мышиное AT), c67D9 (химерное AT), и hu67D9 (гуманизированное AT) связывается с PD-I (А), но не с ICOS (В), CTLA-4 (С) или CD28(D).

[0025] Фит.6А-6С показывают результаты экспериментов, демонстрирующих, что каждое из трех анти-PD-l антител, 67D9 (мышиное AT), c67D9 (химерное AT), и hu67D9 (гуманизированное AT), стимулируют пролиферацию Т-клеток (А), секрецию IL-2 (В) и секрецию IFN-гамма (С) в анализе реакции смешанной культуры лимфоцитов.

[0026] Фиг. 7А-7С показывают результаты экспериментов, демонстрирующих, что каждое из трех анти-PD-l антител 67D9 (мышиное AT), c67D9 (химерное AT), и hu67D9 (гуманизированное AT) связывается с человеческим PD-1-Fc (А) и PD-1-Fc яванского макака (В), но не с мышиным PD-1-Fc (С).

[0027] Фиг. 8 показывает термограммы ДСК (дифференциальной сканирующей калориметрии) для антител Ниволумаба, Пембролизумаба и hu67D9 (гуманизированное 67D9) в фосфатно-солевом буфере.

[0028] Фиг. 9 показывает результаты измерения кинетики и аффинности Ниволумаба и hu67D9.

[0029] Фиг. 10 показывает связывание Ниволумаба и hu67D9 с PD-1, экспрессируемым на клеточной поверхности.

[0030] Фиг. 11 показывает связывание Ниволумаба и hu67D9 с растворимым PD-1.

[0031] Фиг. 12 показывает конкурентное связывание Ниволумаба и hu67D9 с PD-1, экспрессируемым на клеточной поверхности в присутствии Ниволумаба, меченного с помощью ФИТЦ.

[0032] Фиг 13 показывает конкурентное связывание Ниволумаба и hu67D9 с растворимым PD1 в присутствии Ниволумаба, меченного с помощью биотина.

[0033] Фиг. 14 показывает конкурентное связывание Ниволумаба и hu67D9 с растворимым PD1 в присутствии PDL1-Fc, меченного с помощью биотина.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0034] Настоящее изобретение относится к выделенным моноклональным антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые специфично связываются с PD-1 человека. В некоторых воплощениях антитела по изобретению проявляют одно или более желательных функциональных свойств, таких как высокая аффинность связывания с PD-1, отсутствие кросс-реактивности с другими членами семейства CD28, способность стимулировать пролиферацию Т клеток и секрецию IL-2 и IFN-гамма в реакциях смешанной культуры лимфоцитов, способность ингибирования связывания одного или более лигандов PD-1 (например, PD-L1 и/или PD-L2), и/или способность к кросс-реагированию с PD-1 яванского макака. В другом аспекте настоящее изобретение относится к комбинированному применению моноклональных антител, которые специфично связываются с PD-1 и моноклональных антител, которые специфично связываются с CTLA-4.

[0035] В настоящем изобретении предложены выделенные моноклональные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфично связываются с человеческим PD-1, и способы создания таких антител.

[0036] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам ингибирования роста опухолевых клеток у субъекта, применяя анти-PD-l антитела. Как продемонстрировано в настоящем изобретении анти-PD-l антитела способны ингибировать рост опухолевых клеток in vivo. Настоящее изобретение также относится к способам применения антител для модификации иммунного ответа, а также для лечения заболеваний, таких как рак или инфекционные заболевания.

[0037] С целью более легкого понимания настоящего изобретения сначала даны определения некоторых терминов . Дополнительные определения указаны по ходу подробного описания изобретения.

[0038] Термины "Белок запрограммированной смерти 1 (Programmed Death 1)," "Белок запрограммированной смерти клетки 1," "PD-1," PD1," "PDCD1," "hPD-1" и "hPD-l" используются взаимозаменяемо, и включают варианты, изоформы, виды гомологов человеческого PD-1, и аналогов, обладающих по меньшей мере одним таким же эпитопом, как и PD-1.

[0039] Термины "ассоциированный с цитотоксическими Т лимфоцитами антиген-4," "CTLA-4," "CTLA4," "антиген CTLA-4" и "CD152" используются взаимозаменяемо и включают варианты, изоформы, виды гомологов человеческого CTLA-4, и аналоги, обладающие по меньшей мере одним таким же эпитопом, как и CTLA-4.

[0040] Термин "иммунный ответ" относится к действию, например, лимфоцитов, антигенпрезентирующих клеток, фагоцитов, гранулоцитов и растворимых макромолекул, продуцируемых вышеуказанными клетками или печенью (включая антитела, цитокины и компоненты комплемента), которое приводит к избирательному повреждению, деструкции или элиминации из человеческого тела внедряющихся патогенов, клеток или тканей, инфицированных патогенами, раковых клеток, или, в случае аутоиммунитета или патологического воспаления, нормальных клеток или тканей человека.

[0041] Термин "антитело" как здесь используется, включает полноцепочечные антитела и любые их антигенсвязывающие фрагменты (т.е. антигенсвязывающие части) или одинарные цепи. "Антитело" относится к гликопротеинам, содержащим по меньшей мере две тяжелых (Н) цепи и две легких (L) цепи, связанных дисульфидными связями, или их антигенсвязывающей части. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенной здесь как VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит три домена - СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенной здесь как VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен - CL. Области VH и VL могут быть далее разделены на гипервариабельные области, называемые гипервариабельными участками (complementarity determining regions, CDR), вперемежку с участками, которые являются более консервативными, называемые каркасными участками (framework regions, FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDRs и четырех FRs, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут содействовать связыванию иммуноглобулинов со своими тканями или факторами, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (Clq) классической системы комплимента.

[0042] Термин "антигенсвязывающий фрагмент" антитела, как здесь используется, относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфично связываться с антигеном (например, PD-1). Было показано, что антигенсвязывающая функция антител может осуществляться фрагментами полноцепочечных антител. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых в рамках термина "антигенсвязывающий фрагмент" антитела, включают (i) Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и СН1; (ii) F(ab')2 -фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd - фрагмент, состоящий из доменов VH и СН1; (iv) Fv - фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одиночного плеча (цепи) антитела, (v) dAb - фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), который состоит из домена VH; и (vi) выделенная гипервариабельная область (CDR).

[0043] Термины "моноклональное антитело" или "композиция моноклональных антител", как здесь используется, относится к препарату молекул антител одинакового молекулярного состава. Композиция моноклональных антител проявляет одинаковую специфичность и аффинность для конкретного эпитопа.

[0044] Термин "гуманизированное антитело" относится к антителам, в которых последовательности CDR, полученные из зародышевой линии других видов млекопитающих, таких как мыши, были пересажены на каркасные последовательности человека. Дополнительные модификации каркасного региона могут быть проведены внутри последовательностей каркасных областей человека.

[0045] Термин "химерное антитело" относится к антителам, в которых последовательности вариабельных областей получены из одних видов, а последовательности константных областей получены из других видов, таких как антитела ,в которых последовательности вариабельных областей получены из мышиных антитела, а последовательности константных областей получены из человеческих антител.

[0046] Термин "высокая аффинность" для антител IgG относится к антителам, обладающим K_D=10^-8 М или менее, более предпочтительно 10^-9 М или менее и более предпочтительно 10^-10 М или менее для целевого антигена. Однако, "высокая аффинность" связывания может варьироваться для других изотипов антител. Например, "высокая аффинность " связывания для изотипа IgM относится к антителам, обладающим K_D=10^-7 М или менее, более предпочтительно 10^-8 М или менее, более предпочтительно 10^-9 М или менее.

[0047] Как здесь используется, термин "субъект" включает как человека, так и других животных. Термин "другие животные " включает всех позвоночных, например, млекопитающих и не млекопитающих, таких как приматы, кроме человека, овец, собак, кошек, лошадей, коров, куриц, амфибий, рептилий, и т.п.. За исключением отдельного указания, термины "пациент" или "субъект" используются взаимозаменяемо.

[0048] Различные аспекты настоящего изобретения описаны далее в деталях в следующих подразделах.

[0049] Анти-PD-l антитела

[0050] Антитела по настоящему изобретению характеризуются конкретными функциональными признаками или свойствами антител. Например, антитела специфично связываются с PD-1 (например, связываются с PD-1 человека и могут перекрестно реагировать с PD-1 из других видов, таких как яванский макак). Предпочтительно, антитело по настоящему изобретению связывается с PD-1 с высокой аффинностью, например с K_D=1×10^-7 М или менее. Анти-PD-l антитела по настоящему изобретению предпочтительно проявляют одну или более из следующих характеристик:

(a) не связываются существенно с человеческими CD28, CTLA-4 или ICOS;

(b) увеличивают пролиферацию Т-клеток в анализе реакции Смешанной
Культуры Лимфоцитов (СКЛ);

(c) увеличивают секрецию IFN-** и/или IL-2 в анализе СКЛ;

(d) связываются с человеческим PD-1 и PD-1 яванского макака;

(e) ингибируют связывание PD-L1 с PD-1;

(f) связывается с человеческим PD-1 с K_D = 1x10^-7 М или менее,

[0051] Предпочтительно, антитело по изобретению связывается с человеческим PD-1 с K_D = 1x10^-8 М или менее, связывается с человеческим PD-1 с K_D = 5x10^-9 М или менее, или связывается с человеческим PD-1 с K_D в диапазоне между 1х10^-8 М и 1х10^-12М или менее. Более предпочтительно, антитело по изобретению связывается с человеческим PD-1 с K_D = 1x10^-12 М или менее. Более предпочтительно, антитело по изобретению связывается с человеческим PD-1 с K_D = 3.209 х 10^-12 М.

[0052] Антитело по изобретению может проявлять любую комбинацию из вышеприведенных признаков, например два, три, четыре, пять или более из вышеуказанных признаков.

[0053] Стандартные анализы для оценки способности связывания антител по отношению к PD-1 известны в уровне техники, включая, например, ELISA, вестерн-блоттинг и радиоиммунный анализ (RIAs). Кинетика связывания (например, аффинность связывания) антител также может быть оценена стандартными анализами, известными в уровне техники, например, анализом Biacore. Подходящие тесты для оценки любых из вышеприведенных характеристик описаны подробно в Примерах.

[0054] В одном аспекте, в настоящем изобретении предложено выделенное моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 1 (тяжелой цепи CDR1), SEQ ID NO: 2 (тяжелой цепи CDR2), SEQ ID NO: 3 (тяжелой цепи CDR3); и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 4 (легкой цепи CDR1), SEQ ID NO: 5 (легкой цепи CDR2) и SEQ ID NO: 6 (легкой цепи CDR3); где антитело специфично связывается с PD-1, предпочтительно с PD-1 человека.

[0055] Предпочтительное анти-PD-l антитело включает:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 16; и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 18.

[0056] Гомологичные антитела

[0057] Антитело по настоящему изобретению содержит вариабельные области тяжелой и легкой цепей, содержащие аминокислотные последовательности, которые гомологичны аминокислотным последовательностям предпочтительных антител, описанных здесь, и где указанные антитела сохраняют требуемые функциональные свойства анти-PD-1 антител по настоящему изобретению.

[0058] Например, в настоящем изобретении предложено выделенное моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где:

(a) вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 8 и 16;

(b) вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ IDNOs: 10 и 18; и

антитело проявляет одно или более из следующих свойств:

(c) не связывается существенно с человеческими CD28, CTLA-4 или ICOS;

(d) увеличивает пролиферацию Т-клеток в анализе реакции Смешанной Культуры Лимфоцитов (СКЛ);

(e) увеличивает секрецию IFN-y и/или IL-2 в анализе СКЛ;

(f) связывается с человеческим PD-1 и PD-1 яванского макака; (g) ингибирует связывание PD-L1 с PD-1;

(h) связывается с человеческим PD-1 с K_D = 1x10^-7 М или менее.

[0059] В других воплощениях, V_H и/или V_L аминокислотные последовательности могут быть на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичными последовательностям, данным выше.

[0060] Как здесь используется, процент гомологии между двумя аминокислотными последовательностями является эквивалентным проценту идентичности между этими двумя последовательностями. Процент идентичности между указанными двумя последовательностями представляет собой функцию количества идентичных положений, совместно разделяемых последовательностями (т.е. % гомологии =# идентичных положений /всего # положений х100), принимая во внимание количество гэпов и длину каждого гэпа, которые необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может быть проведено с использованием математического алгоритма, как описано далее в неограничивающих примерах.

[0061] Иммуноконъюгаты

[0062] В другом аспекте настоящее изобретение включает анти-PD-l антитело или его фрагмент, конъюгированные с терапевтическим фрагментом, таким как цитотоксин, лекарственное средство (например, иммунодепрессант) или радиотоксин. Такие конъюгаты в настоящем изобретении именуются «иммуноконъюгатами». Иммуноконъюгаты, которые включают один или несколько цитотоксинов, называются «иммунотоксинами». Цитотоксин или цитотоксичное средство включают любое средство, которое приносит вред клеткам (например, убивает). Примеры включают таксол, цитохалазин В, грамицидин D, этидиум бромид, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин, а также их аналоги и гомологи. Терапевтические средства также включают, например, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацил, декарбазин), алкилирующие средства (например, мехлорэтамин, тиоепа хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU) и ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусульфан, дибромманнит, стрептозотоцин, митомицин С и цис-дихлордиамин платина (II) (DDP) цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (ранее дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин, (ранее актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (АМС)), а также антимитотические средства (например, винкристин и винбластин).

[0063] Другие предпочтительные примеры терапевтических цитотоксинов, которые могут быть конъюгированы с антителами по настоящему изобретению, включают дуокармицины, калихеамицины, майтанзины и ауристатины, а также их производные.

[0064] Цитотоксины могут быть конъюгированы с антителами по настоящему изобретению с применением имеющейся в уровне технике линкерной технологии. Примеры типов линкеров, которые применялись для конъюгации цитотоксина к антителу, включают, без ограничения, гидразоны, тиоэфиры, сложные эфиры, дисульфиды и пептидсодержащие линкеры.

[0065] Антитела по настоящему изобретению также могут быть конъюгированы с радиоактивными изотопами для получения цитотоксичных радиоактивных фармацевтических препаратов, также называемых радиоиммуноконъюгатами. Примеры радиоактивных изотопов, которые могут быть конъюгированы с антителами для диагностического и терапевтического применения, включают, без ограничения, йод¹³¹, индий¹¹¹, иттрий⁹⁰ и лютеций¹⁷⁷. Способы получения радиоиммуноконъюгатов разработаны в уровне технике. Примеры коммерчески доступных радиоиммуноконъюгатов включают Zevalin™ (IDEC Pharmaceuticals) и Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals), при этом для получения радиоиммуноконъюгатов, включающих антитела по настоящему изобретению, могут применяться аналогичные способы.

[0066] Конъюгаты антител по настоящему изобретению могут применяться для модификации данного биологического ответа, при этом не следует считать, что фрагменты лекарственного препарата ограничены кругом классических химических лекарственных средств. Например, лекарственный фрагмент может представлять собой белок или полипептид, обладающий желаемой биологической активностью. Такие белки могут включать, например, ферментативно-активные токсины или их активные фрагменты, такие как абрин, рицин А, псевдомонадный экзотоксин или дифтерийный токсин; белок, такой как фактор некроза опухолей или интерферон-**; или модификаторы биологического ответа, такие как, например, лимфокины, интерлейкин-1 ("IL-1"), интерлейкин-2 ("IL-2"), интерлейкин-6 ("IL-6"), гранулоцитарно-макрофаг колониестимулирующий фактор ("GM-CSF"), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор ("G-CSF") или другие факторы роста.

[0067] Фармацевтические композиции

[0068] В другом аспекте настоящее изобретение относится к композициям, например фармацевтическим композициям, содержащим одно моноклональное тело или его антиген-связывающий участок (участки) или комбинацию таких тел или участков по настоящему изобретению, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Такие композиции могут включать одно антитело или их комбинацию (например, двух или нескольких различных антител), или иммуноконъюгаты, или биспецифичные молекулы по настоящему изобретению. Например, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может включать комбинацию антител (или иммуноконъюгатов, или биспецифичных антител), которые связываются с различными эпитопами на целевом антигене или которые имеют дополнительные виды активности.

[0069] Фармацевтические композиции по настоящему изобретению также могут назначаться в комбинированной терапии, т.е. в сочетании с другими средствами. Например, комбинированная терапия может включать анти-PD-l антитело по настоящему изобретению в комбинации с по меньшей мере одним другим противовоспалительным или иммунодепрессивным средством. Примеры терапевтических средств, которые могут применяться в комбинированной терапии более подробно описаны далее в разделе применения антител по настоящему изобретению.

[0070] Как здесь используется, термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает все без исключения растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и антигрибковые средства, изотонические и замедляющие абсорбцию средства и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Предпочтительно носитель подходит для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, с помощью инъекции или инфузии). В зависимости от пути введения, действующее соединение, т.е. антитело, иммуноконъюгат или биспецифичная молекула, может быть покрыто соответствующим веществом для защиты соединения от действия кислот и других естественных условий, которые могут инактивировать действующее соединение.

[0071] Фармацевтические соединения по настоящему изобретению могут включать одну или несколько фармацевтически приемлемых солей. Термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к соли, которая сохраняет желаемую биологическую активность исходного соединения и не дает каких бы то ни было нежелательных токсикологических эффектов. Примеры таких солей включают кислотно-аддитивные и основно-аддитивные соли. Кислотно-аддитивные соли включают соли, полученные из нетоксичных неорганических кислот, таких как хлористоводородная, азотная, фосфорная, серная, бромистоводородная, йодистоводородная, фосфорная и т.п., а также из нетоксичных органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенилзамещенные алкановые кислоты, гидроксиалкановые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты и т.п. Основно-аддитивные соли включают соли, полученные из щелочных и щелочноземельных металлов, таких как натрий, калий, магний, кальций и т.п., а также из нетоксичных органических аминов, таких как N,N'-дибензилэтилендиамин, N-метилглюкамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин и т.п.

[0072] Кроме этого фармацевтическая композиция по настоящему изобретению также может включать фармацевтически приемлемый антиоксидант. Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают: (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, гидрохлорид цистеина, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и т.п.; (2) маслорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбил пальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол и т.п.; и (3) хелатирующие металл реагенты, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТУ), сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и т.п.

[0073] Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые могут применяться в фармацевтических композициях по настоящему изобретению, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.), а также их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и пригодные для инъекций органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Надлежащая подвижность может поддерживаться, например, применением покрывающих материалов, таких как лецитин, в случае дисперсий сохранением требуемого размера частиц, а также применением ПАВ.

[0074] Описываемые композиции могут также содержать вспомогательные вещества, такие как консерванты, смачивающие средства, эмульгаторы и диспергирующие средства. Защита от присутствия микроорганизмов может быть гарантирована как процедурами стерилизации, см. выше, так и включением различных антибактериальных и антигрибковых средств, например парабена, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и т.п. Также может быть желательно включить в состав композиций изотонические средства, такие как сахара, хлорид натрия и т.п. Кроме того, длительная абсорбция инъецируемых лекарственных форм может быть достигнута введением агентов, которые задерживают абсорбцию, таких как моностеарат алюминия и желатин.

[0075] Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии, а также стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных пригодных для инъекций растворов или суспензий. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ известно в технике. В фармацевтических композициях по настоящему изобретению предполагается применение любой традиционной среды или агента, если они не являются несовместимыми с действующим соединением. Кроме этого в композиции могут быть включены дополнительные действующие вещества.

[0076] Терапевтические композиции, как правило, должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может принимать форму раствора, микроэмульсии, липосом или другой заданной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси. Надлежащая подвижность может поддерживаться, например, применением покрывающих материалов, таких как лецитин, в случае дисперсий сохранением требуемого размера частиц, а также применением ПАВ. Во многих случаях будет предпочтительно включить в состав композиции изотонические средства, например сахара, полиспирты, такие как манит и сорбит, или хлорид натрия. Пролонгированная абсорбция инъецируемых композиций может быть достигнута за счет введения в композиции агентов, которые задерживают абсорбцию, например моностеаратные соли и желатин.

[0077] Стерильные пригодные для инъекций растворы могут быть получены введением действующего соединения в требуемом количестве в подходящий растворитель вместе с одним из перечисленных выше ингредиентов или их комбинацией, если это необходимо, с последующей стерилизацией с помощью микрофильтрации. В основном дисперсии получают введением действующего соединения в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие требуемые ингредиенты из числа перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных пригодных для инъекций растворов, предпочтительными способами получения являются высушивание в вакууме и сушка вымораживанием (лиофилизация), которые позволяют получить порошок действующего ингредиента и любого дополнительного желаемого ингредиента из его полученного предварительно стерильного фильтрованного раствора.

[0078] Количество действующего ингредиента, которое может быть объединено с веществом носителя для получения лекарственной формы разовой дозировки, будет изменяться в зависимости от подвергаемого лечению субъекта и конкретного способа введения. Количество действующего ингредиента, которое может быть объединено с веществом носителя для получения лекарственной формы разовой дозировки, будет, как правило, являться таким количеством композиции, которое приводит к терапевтическому эффекту. В основном, исходя из процентной шкалы, это количество будет находиться в пределах от примерно 0,01 процента до примерно 99 процентов действующего ингредиента, предпочтительно от примерно 0,1 процента до примерно 70 процентов, наиболее предпочтительно от примерно 1 процента до примерно 30 процентов действующего ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

[0079] Требования по дозировке регулируются для обеспечения оптимальной желаемой реакции (например, терапевтической реакции). Например, может быть осуществлено однократное болюсное введение, может быть введено несколько отдельных доз в определенный промежуток времени или же доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена в зависимости от требований текущей ситуации в процессе лечения. Особенно предпочтительно получать парентеральные композиции в виде лекарственных форм разовой дозировки с целью облегчения введения и равномерности дозирования. В настоящем описании термин «лекарственные формы разовой дозировки» относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве доз для однократного введения субъектам, подвергающимся лечению; каждая единица содержит заранее установленное количество действующего соединения, рассчитанное на получение желаемого терапевтического эффекта, в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Спецификация лекарственных форм разовой дозировки по настоящему изобретению обусловливается и непосредственно зависит от (а) конкретных характеристик действующего соединения и конкретного терапевтического результата, который должен быть достигнут, и (b) ограничений по чувствительности у отдельных пациентов, существующих в технике составления смесей, подобных применяемому для лечения действующему соединению.

[0080] При введении антитела дозировка изменяется в диапазоне от примерно 0,0001 до 100 мг/кг и чаще от 0,01 до 5 мг/кг массы тела пациента, принимающего препарат. Например, дозировки могут составлять 0,3 мг/кг массы тела, 1 мг/кг массы тела, 3 мг/кг массы тела, 5 мг/кг массы тела или 10 мг/кг массы тела или в диапазоне 1-10 мг/кг. Типовой режим лечения определяет введение один раз в неделю, один раз каждые две недели, один раз каждые три недели, один раз в месяц, один раз каждые три месяца, один раз каждые 3-6 месяцев. Предпочтительные режимы дозирования для анти-PD-1 антитела по настоящему изобретению включают 1 мг/кг массы тела или 3 мг/кг массы тела при внутривенном введении, причем антитело вводят, используя один из следующих календарных планов: (i) каждые четыре недели для первых шести доз, затем каждые три месяца; (ii) каждые три недели; (iii) однократное введение 3 мг/кг массы тела, затем 1 мг/кг массы тела каждые три недели.

[0081] С другой стороны, антитела могут вводиться в виде составов с продолжительным высвобождением, причем в этом случае требуется менее частое введение. Дозировка и частота введения меняются в зависимости от времени полужизни антитела в организме пациента. Как правило, наиболее продолжительное время жизни демонстрируют антитела человека, за ними следуют гуманизированные антитела, химерные антитела и антитела, не являющиеся антителами человека. Дозировка и частота введения могут меняться в зависимости от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. При профилактическом применении вводят относительно низкие дозы через относительно продолжительные промежутки на протяжении длительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают получать лечение в течение всей жизни. При терапевтическом применении иногда требуются относительно высокие дозы в относительно короткие промежутки времени до тех пор, пока развитие заболевания не замедлится или не прекратится, и предпочтительно до тех пор, пока пациент не продемонстрирует частичное или полное облегчение симптомов заболевания. После этого лекарственное средство может вводиться пациенту в профилактическом режиме.

[0082] Фактические уровни дозировки действующих ингредиентов в фармацевтических композициях по настоящему изобретению могут подвергаться изменениям, с тем чтобы получить количество действующего ингредиента, которое является эффективным для достижения желаемой терапевтической реакции у конкретного пациента, для данной композиции и способа введения, без проявлений токсичности для пациента. Выбранный уровень дозировки будет зависеть от широкого круга фармакокинетических факторов, включая активность конкретной применяемой композиции по настоящему изобретению или ее сложного эфира, соли или амида, пути введения, времени введения, скорости выведения конкретного применяемого соединения, продолжительности лечения, других лекарственных средств, соединений и/или веществ, применяемых в комбинации с конкретными применяемыми композициями, возраста, пола, массы, болезненного состояния, общего состояния здоровья и предыдущей истории болезни пациента, подвергаемого лечению, и подобных факторов, хорошо известных в медицине.

[0083] "Терапевтически эффективная дозировка" анти-PD-l антитела по настоящему изобретению предпочтительно приводит к снижению тяжести симптомов заболевания, увеличению частоты и продолжительности бессимптомных периодов, или предотвращению поражений или нарушения здоровья в результате заболевания. Например, для лечения опухолей "терапевтически эффективная дозировка" предпочтительно ингибирует рост клеток рост опухоли по меньшей мере приблизительно на 20 %, более предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 40%, более предпочтительно на по меньшей мере приблизительно 60%, и еще более предпочтительно на по меньшей мере приблизительно 80% по сравнению с субъектами, не получавшими лечения. Способность соединения ингибировать рост опухоли может быть оценена в животной модели прогнозирования эффективности в отношении опухолей человека. Альтернативно, это свойство препарата может быть оценено тестированием способности соединения ингибировать in vitro с помощью анализов, известных квалифицированным в уровне техники специалистам. Терапевтически эффективное количество терапевтического соединения может уменьшать размер опухоли, или другим способом облегчать симптомы у субъекта. Квалифицированный в уровне техники специалист будет способен определить такие количества на основании таких факторов как размер субъекта, тяжесть симптомов у субъекта, и конкретного состава или выбранного пути введения.

[0084] В другом аспекте в настоящем описании предложен фармацевтический набор из частей, содержащий анти-PD-l антитело и анти-CTLA-4 антитело, как здесь описано. Набор может дополнительно содержать инструкции для применения для лечения гиперпролиферативного заболевания (такого как рак, как здесь описано). В другом воплощении анти-PD-1 и анти-CTLA-4 антитела могут быть упакованы вместе в единичную лекарственную форму.

[0085] В некоторых воплощениях два или более антител с разной специфичностью связывания (например, анти-PD-l и анти-CTLA-4) вводятся одновременно, в таких случаях дозировка каждого вводимого антитела находится в указанном диапазоне. Антитело может быть введено в виде разовой дозы или, более часто, может быть введено многократно. Интервалы между одиночными дозированиями могут составлять неделю, месяц, каждые три месяца или год. Интервалы также могут быть нерегулярными по показателям измерения уровня антитела к целевому антигену в крови у пациента. В некоторых способах дозировка подбирается для достижения уровня концентрации антитела в плазме приблизительно 1-1000 мкг/мл и в некоторых способах приблизительно 25-300 мкг/мл.

[0086] Композиции по настоящему изобретению могут вводиться одним или несколькими путями с применением одного или нескольких из числа разнообразных способов, известных в технике. Как поймет специалист в данной области техники, путь и/или форма введения будут изменяться в зависимости от желаемых результатов. Предпочтительные пути введения антител по настоящему изобретению включают внутривенный, внутримышечный, внутрикожный, интраперитонеальный, подкожный, спинальный или другие парентеральные пути введения, например, с помощью инъекции или инфузии. Фраза «парентеральное введение» в настоящем описании означает формы введения, отличные от кишечного и местного введения, как правило, с помощью инъекции или инфузии, т.е. не ограничиваясь перечисленным, внутривенные, внутримышечные, внутриартериальные, интратекальные, внутрисуставные, внутриглазничные, внутрисердечные, внутрикожные, интраперитонеальные, транстрахеальные, подкожные, субкутикулярные, внутрисуставные, субкапсулярные, субарахноидальные, интраспинальные, эпидуральные и внутригрудинные инъекции и инфузии.

[0087] Альтернативно, антитела по настоящему изобретению могут вводиться непарентеральными путями, такими как местный и эпидермальный пути введения или через слизистые оболочки, например, интраназально, перорально, вагинально, ректально, сублингвально или топически.

[0088] Препараты действующих соединений могут быть получены с применением носителей, которые будут предохранять эти соединения от быстрого высвобождения, т.е. могут применяться составы с регулируемым высвобождением, в т.ч. имплантаты, трансдермальные пластыри и микрокапсулированные системы доставки. Могут применяться биоразрушаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Большое количество способов получения таких составов запатентовано или известно всем специалистам в данной области техники. См, например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

[0089] Терапевтические композиции могут вводиться с помощью известных в технике медицинских приборов.

[0090] Применения и способы по настоящему изобретению

[0091] Антитела, композиции антител и способы настоящего изобретения обладают несколькими in vitro и in vivo применениями, включая, например, детекцию PD-1 или усиление иммунного ответа блокированием PD-1. В предпочтительном воплощении антитела по настоящему изобретению представляют собой человеческие антитела. Например, эти молекулы могут быть введены в клетки в культуре, in vitro или ex vivo, или человеку, например, in vivo, для усиления иммунитета в различных случаях. Соответственно, в одном аспекте в настоящем изобретении предложен способ модификации иммунного ответа у субъекта, содержащий введение субъекту антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, по настоящему изобретению таким образом, что иммунный ответ у субъекта модифицируется. Предпочтительно ответ усиливается, стимулируется или активируется.

[0092] Как здесь используется, термин "субъект" используется для охвата человека и других животных. Животные, отличные от человека, включают всех позвоночных, например млекопитающих и не млекопитающих, хотя млекопитающие являются предпочтительными, такие как приматы, отличные от человека, овцы, собаки, коты, коровы и лошади. Предпочтительные субъекты включают пациентов людей, которым требуется усиление иммунного ответа. Способы являются в частности подходящими для лечения пациентов людей, обладающих нарушениями, которые можно лечить усилением иммунного ответа, опосредуемого Т-клетками. В конкретном воплощении способы являются, в частности, подходящими для лечения раковых клеток in vivo. Для достижения антиген-специфичного усиления иммунитета, анти-PD-l антитела могут вводиться вместе с целевым антигеном. Когда антитела к PD-1 вводятся вместе с другими агентами, они могут быть введены по очереди или совместно.

[0093] В настоящем изобретении, кроме того, предложены способы детекции присутствия PD-1 антигена человека в образце, или измерения количества PD-1 антигена человека, содержащие приведение в контакт образца, и контрольного образца, с моноклональным антителом человека, или его функциональным фрагментом, которые специфично связываются с человеческим PD-1, в условиях, которые позволяют образование комплекса между антителом или его фрагментом и PD-1 человека. Затем проводят детекцию образования комплекса, при этом различия в образовании комплекса между [тестируемым] образцом по сравнению с контрольным образцом является показателем присутствия антигена PD-1 человека в образце.

[0094] Учитывая специфичное связывание антител по настоящему изобретению для PD-1, по сравнению с CD28, ICOS и CTLA-4, антитела по настоящему изобретению могут применяться для специфичной детекции экспрессии PD-1 на поверхности клеток и, более того, могут применяться для очистки PD-1 с помощью иммуноаффинной очистки.

[0095] В другом аспекте в настоящем изобретении предложено применение антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, как здесь описано при производстве лекарственного средства для модификации иммунного ответа у субъекта.

[0096] Рак

[0097] Блокирование PD-1 с помощью антител может усиливать иммунный ответ на раковые клетки у пациента. Лиганд для PD-1, PD-L1, не экспрессируется в нормальных клетках человека, однако широко представлен в различных опухолях человека (Dong et al. (2002) Nat Med 8:787-9). Взаимодействие между PD-1 и PD-L1 приводит к снижению инфильтрирующих опухоль лимфоцитов, снижению опосредованной Т клеточными рецепторами пролиферации, и уклонению раковых клеток от распознавания иммунной системой (Dong et al. (2003) J Mol Med 81:281-7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100). Иммунная супрессия может быть обращена с помощью ингибирования локального взаимодействия PD-1 с PD-L1, эффект усиливается, когда также блокируется взаимодействие PD-1 с PD-L2. Несмотря на то, что предшествующие исследования показали, что пролиферация Т клеток может быть восстановлена ингибированием взаимодействия PD-1 с PD-L1, не было сообщений о прямом эффекте на рост раковых опухолей in vivo в результате блокирования взаимодействия PD-1/PD-L1. В одном аспекте настоящее изобретение относится к лечению субъекта in vivo с использованием анти-PD-l антитела, таким образом, что ингибируется рост раковых опухолей. Анти-PD-1 антитело может применяться самостоятельно для ингибирования роста раковых опухолей. Альтернативно, анти-PD-l антитело может применяться в комбинации с другими иммуногенными средствами, обычным противораковым лечением или другими антителами, как описано далее.

[0098] Соответственно, в одном воплощении в настоящем изобретении предложен способ ингибирования роста опухолевых клеток у субъекта, содержащий введение субъекту терапевтически эффективного количества анти-PD-l антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента.

[0099] Предпочтительные виды рака, рост которых может ингибироваться с применением антител по изобретению, включают раковые заболевания, обычно реагирующие на иммунотерапию. Неограничивающие примеры предпочтительных видов рака для лечения включают меланому (например, метастатическую злокачественную меланому), рак почек (например, светлоклеточный рак), рак предстательной железы (например, гормональная рефрактерная аденокарцинома предстательной железы), рак молочной железы, рак толстой кишки и рак легких (например, немелкоклеточный рак легких). Кроме того, изобретение включает рефрактерные или рецидивирующие злокачественные опухоли, рост которых может ингибироваться с использованием антител по изобретению.

[00100] Примеры других видов рака, которые можно лечить с применением способов по изобретению, включают рак кости, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы или шеи, кожную или внутриглазную злокачественную меланому, рак матки, рак яичников, рак прямой кишки, рак анальной области, рак желудка, рак яичек, рак матки, карциному маточных труб, карциному эндометрия, карциному шейки матки, карциному влагалища, карциному вульвы, болезнь Ходжкина, неходжкинскую лимфому, рак пищевода, рак тонкой кишки, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечников, саркома мягких тканей, рак уретры, рак полового члена, хронический или острый лейкоз, включая острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, солидные опухоли детского возраста, лимфоцитарную лимфому, рак мочевого пузыря, рак почек или мочеточников, карциному почечной лоханки, новообразования центральной нервной системы (ЦНС), первичную лимфому ЦНС, опухолевый ангиогенеза, опухоли спинного мозга, глиомы ствола головного мозга, аденомы гипофиза, саркомы Калоши, эпидермоидного рака, плоскоклеточного рака, клеточной лимфомы, вызванные окружающей средой раковые образования, в том числе индуцированные асбестом, и комбинации указанных видов рака. Настоящее изобретение также применимо для лечения метастатических раков, особенно метастатических раков, которые экспрессируют PD-L1 (Iwai et al., 2005) Int. Immunol. 17: 133-144)

[00101] Необязательно, антитела к PD-1 могут быть комбинированы с иммуногенными агентами, такими как раковые клетки, очищенный опухолевые антигены (включая рекомбинантные белки, пептиды и углеводные молекулы), клетки, и клетки, трансфицированные генами, кодирующими иммуностимулирующие цитокины (Не et al (2004) J. Immunol. 173: 4919-28). Неограничивающие примеры раковых вакцин, которые могут применяться, включают пептиды меланомных антигенов, такие как пептиды gp100, антигенов MAGE, Trp-2, MART1 и/или тирозиназ, или опухолевые клетки, трансфицированные с целью экспрессии цитокина GM-CSF.

[00102] Было показано, что у людей некоторые опухоли являются иммуногенными, например меланомы. Предполагается, что повышая порог активации Т клеток посредством блокады PD-1, можно ожидать активацию опухолевых ответов у хозяина.

[00103] Другие антитела, которые могут применяться для активации отвечаемости иммунного ответа хозяина могут применяться в комбинации с анти-PD-l. Они включают молекулы на поверхности дендритных клеток (ДК), которые активируют функцию ДК и презентацию антигенов. Анти-CD40 антитела способны эффективно замещать активность Т хелперов (Ridge, J. et al. (1998) Nature 393: 474-478) и могу применяться совместно с антителами PD-1 (Ito, N. et al. (2000) Immunobiology 201 (5) 527-40). Активирующие антитела к костимуляторным молекулам Т клеток, таким как CTLA-4, ОХ-40 (Weinberg, А. et al. (2000) Immunol 164: 2160-2169), 4-1ВВ (Melero, I. et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997), и ICOS (Hutloff, A. et al. (1999) Nature 397: 262-266) также могут обеспечить повышенные уровни активации Т клеток.

[00104] В другом воплощении в настоящем изобретении предложено применение терапевтически эффективного количества анти-PD-l антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, как здесь описано, для производства лекарственного средства для ингибирования роста опухолевых клеток у субъекта.

[00105] Инфекционные заболевания

[00106] Другие способы по настоящему изобретению применяются для лечения пациентов, которые подверглись воздействию конкретных токсинов или патогенов. Соответственно, другой аспект настоящего изобретения предлагает способ лечения инфекционного заболевания у субъекта, содержащий введение субъекту анти-PD-l антитела, или его антигенсвязывающий фрагмент, так, что субъект лечится от инфекционного заболевания.

[00107] Опосредованная антителами блокада PD-1 может применяться сама по себе, или в виде адъюванта в комбинации с вакцинами, для стимулирования иммунного ответа на патогены, токсины и аутоантигены. Примеры патогенов, для которых этот терапевтически подход может быть в частности полезным, включают патогенов, для которых в настоящее время нет эффективных вакцин, или патогенов, для которых обычные вакцины менее чем полностью. Они включают, без ограничения, ВИЧ, Гепатиты (А, В, и С), Грипп, Герпес, Лямблию, Малярию, Лейшманию, Золотистый стафилококк, Синегнойную палочку. Блокада PD-1 в частности полезна против инфекций, развившихся в результате факторов, таких как ВИЧ, которые презентируют измененные антигены во время развития инфекции. Эти новые эпитопы распознаются как чужеродные во время введения анти-PDI антитела человека, таким образом провоцируя сильный Т клеточный ответ, который не ослабляется отрицательными сигналами через PD-1.

[00108] Некоторые примеры патогенетических вирусов, вызывающих инфекции, которые можно лечить способами по настоящему изобретению, включают ВИЧ, гепатиты (А, В, или С), вирус герпеса (например, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II, и ЦМВ, вирус Эпштейна-Барр), аденовирус, вирус гриппа, флавивирусы, эховирус, риновирус, вирус коксаки, коронавирус, респираторно-синцитиальный вирус, вирус паротита, ротавирус, вирус кори, вирус краснухи, парвовирус, вирус коровьей оспы, вирус HTLV, вирус лихорадки денге, папилломавирус, вирус моллюска, полиовирус, вирус бешенства, вирус JC и вирус арбовирусного энцефалита

[00109] Некоторые примеры патогенных бактерий, вызывающих инфекции, поддающиеся лечению способами по изобретению, включают хламидии, риккетсиальные бактерии, микобактерии, стафилококки, стрептококки, пневмококки, менингококки и конококки, клебсиеллу, протеус, серации, псевдомонады, легионеллу, дифтерию, сальмонеллу, бациллы, холеру, столбняк, ботулизм, сибирскую язву, чуму, лептоспироз и бактерии болезни Лайма.

[00110] Некоторые примеры патогенных грибов, вызывающих инфекции, поддающиеся лечению способами по изобретению, включают Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, и т.д.), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), Genus Mucorales (mucor, absidia, rhizophus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis и Histoplasma capsulatum.

[00111] Некоторые примеры патогенетических паразитов, поддающиеся лечению способами по изобретению, включают Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondi, и Nippostrongylus brasiliensis.

[00112] Во всех вышеуказанных способах блокада PD-1 может быть комбинирована с другими видами иммунотерапии, такими как лечение цитокинами (например, интерферонами, GM-CSF, G-CSF, IL-2), или терапия биспецифическими антителами, которые обеспечивают усиленную презентацию опухолевых антигенов.

[00113] В другом воплощении изобретения предложено применение анти-PD-1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, как здесь описано, при производстве лекарственного средства для лечения инфекционного заболевания у субъекта.

[00114] Наборы по настоящему изобретению

[00115] В другом аспекте в настоящем описании предложен набор, содержащий анти-PD-l антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как здесь описано. Набор также может дополнительно содержать инструкции по применению. В другом аспекте набор может применяться в любом из способов или применении, как здесь описано.

[00116] Настоящее изобретение, иллюстративно описанное здесь, может быть подходящим образом осуществлено на практике в отсутствие какого-либо элемента или элементов, ограничения или ограничений, специфично не раскрытых здесь. Так, например, термины «содержащий», «включающий» и т.д. должны пониматься расширительно и без ограничений. Кроме того, используемые здесь термины и выражения применялись как термины описания, а не ограничения, и не подразумевали использования таких терминов и выражений для исключения любых эквивалентов показанных и описанных признаков или их частей, но необходимо понимать, что различные модификации возможны в рамках заявленного изобретения. Таким образом, следует понимать, что, хотя настоящее изобретение было конкретно раскрыто в предпочтительных вариантах осуществления и необязательных признаках, модификации и изменения изобретений, воплощенных в настоящей заявке, могут быть использованы специалистами в данной области, и что такие модификации и варианты рассматриваются, как находящиеся в рамках настоящего изобретения

[00117] Настоящее изобретение было описано здесь широко и в целом. Каждый из более узких видов и субродовых группировок, входящих в общее описание, также являются частью изобретения. Оно включает в себя общее описание изобретения с оговоркой или отрицательным ограничением, исключающим какой-либо предмет из рода, независимо от того, упоминался ли здесь специально вырезанный материал

[00118] Другие варианты осуществления находятся в пределах следующей формулы изобретения и неограничивающих примеров. Кроме того, когда признаки или аспекты изобретения описаны в терминах формулы Маркуша, специалисты в данной области поймут, что изобретение также описано таким образом в терминах любого отдельного члена или подгруппы членов формулы Маркуша

ЭКСПЕРМЕНТАЛЬНЫЙ РАЗДЕЛ

[00119] Далее приведены примеры, дополнительно иллюстрирующие различные признаки настоящего изобретения. Примеры также иллюстрируют полезные способы осуществления изобретения. Эти примеры не ограничивают заявленное изобретение.

[00120] Пример 1. Создание и экспрессия PD-1-Fc и PD-LI-Fc

[00121] Синтезировали ДНК (SEQ ID NO. 11), содержащую кДНК, кодирующую внеклеточный регион человеческого PD-1 слитый с Fc-областью человека, с сайтами расщепления Hind III на её 5' конце и EcoRI на её 3' конце. ДНК расщепили с помощью Hind III и EcoRI и затем клонировали в pcDNA3.1 (+) вектор (Invitrogen), который подвергли расщеплению теми же ферментами рестрикции с получением экспрессионного вектор pcDNA3.1(+)-PD-1-Fc. Подходящий вектор экспрессии pcDNA3.1(+)-PD-1-Fc трансфицировали в клетки СНО-K1 (АТСС) с использованием липофетаминового реагента 2000 (Invitrogen). Стабильный трансфицированные клетки выделили с помощью предельного разведения в присутствии 500 мкг/мл G418. Клоны, продуцирующие наибольшее количество PD-1-Fc белка были отобраны и росли в бессывороточной среде. В заключение белок PD-1-Fc очистили с помощью аффинной хроматографии Protein А из бессывороточного культурального супернатанта. Концентрацию белка измерили посредство адсорбции при 280 нм. Аминокислотная последовательность слитого белка PD-1-Fc показана в последовательности SEQ ID NO: 23.

[00122] Синтезировали ДНК (SEQ ID NO. 12), содержащую кДНК, кодирующую внеклеточный регион человеческого PD-1L1 слитый с Fc-областью человека, с сайтами расщепления Hind III на её 5' конце и EcoRI на её 3' конце. ДНК расщепили с помощью Hind III и EcoRI и затем клонировали в pcDNA3.1 (+) вектор (Invitrogen), который подвергли расщеплению теми же ферментами рестрикции с получением экспрессионного вектора pcDNA3.1(+)-PD-L1-Fc. Подходящий вектор экспрессии pcDNA3.1(+)-PD-L1-Fc трансфицировали в клетки СНО-K1 (АТСС) с использованием липофетаминового реагента 2000 (Invitrogen). Стабильные трансфицированные клетки выделили с помощью предельного разведения в присутствии 500 мкг/мл G418. Клоны, продуцирующие наибольшее количество PD-LI-Fc белка были отобраны и росли в бессывороточной среде. Finally, the PD-L1-Fc protein очистили с помощью аффинной хроматографии Protein А из бессывороточного культурального супернатанта. Концентрацию белка измерили посредство адсорбции при 280 нм. Аминокислотная последовательность слитого белка PD-L1-Fc показана в последовательности SEQ ID NO: 24.

[00123] Пример 2. Характеристика связывания PD-LI-Fc с PD-1, эксперссирующимся на клетках СНО

[00124] Клеточные линии яичника китайского хомячка (СНО), которые экспрессируют рекомбинантный PD-1 человека на клеточной поверхности были разработаны и использовались для определения связывания PD-L1 с PD-1 с помощью проточной цитометрии. Синтезировали ДНК (SEQ ID NO.13), содержащую кДНК, кодирующую полноцепочечный белок PD-1 человека с сайтами рестрикции для Hind III на её 5' конце и для EcoRI на её 3' конце. ДНК подвергли расщеплению под действием Hind III и EcoRI и затем клонировали в вектор pcDNA3.1 (+) (Invitrogen), который подвергли расщеплению теми же ферментами рестрикции с получением экспрессионного вектора pcDNA3.1(+)-PD-1. Подходящий экспрессионный вектор pcDNA3.1(+)-PD-1 трансфицировали в клетки СНО-K1 (АТСС) с использованием липофетаминового реагента 2000 (Invitrogen). Стабильные трансфицированные клетки выделили с помощью предельного разведения в присутствии 500 мкг/мл G418. Аминокислотные последовательности полноцепочечного PD-1 человека показаны в SEQ ID NO: 14. PD-L1-Fc рекомбинантный белок метили с помощью биотина с использованием набора для мечения белка биотином (Roche). Связывание PD-L1 с PD-1 оценивали инкубированием PD-1-трансфицированных СНО клеток (CHO/PD-1) с различными концентрациями меченного биотином PD-L1-Fc (биотин-PD-L1-Fc). Клетки промыли и связывание детектировали с помощью авидин-ФИТЦ. Выполнили проточную цитометрию с использованием FACScan проточного цитометра (Becton Dickinson). Результаты показаны на Фиг. 1А и 1В, подтверждающие, что биотин-PD-L1-Fc способен эффективно связываться с CHO/PD-1 клетками.

[00125] Пример 3. Характеристика связывания PD-1-Fc с PD-L1-Fc

[00126] PD-1-Fc рекомбинантный белок метили с помощью биотина с использованием набора для мечения белка биотином (Roche). Различные концентрации меченного биотином PD-1-Fc (PD-1-Fc-биотин) добавили в 96-луночные планшеты, покрытые PD-L1-Fc, с последующим инкубированием при комнатной температуре в течение 1 ч. После промывки, добавили авидин-HRP и планшеты дополнительно инкубировали в течение 1ч. В заключение, 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ) добавили в качестве субстраты для пероксидазы хрена (HRP), и абсорбцию измеряли при 450 нм. Результаты показаны на Фиг. 2, подтверждая, что биотин-PD-1-Fc способен эффективно связываться с PD-L1I-Fc.

[00127] Пример 4. Создание моноклональных антител против PD-1

[00128] Для получения моноклональных антител к PD-1, 6-месячных самок мышей BALB/c иммунизировали трижды подкожно с помощью рекомбинантного белка PD-1-Fc в полном адъюванте Фрейнда (Sigma-Aldrich). Через четыре дня после последней бустерной инъекции мышей умерщвляли и спленоциты сливали с клетками SP2/0. Слитые клетки суспендировали в селективной среде гипоксантин/аминоптерин/тимидин (HAT) и помещали в 96-луночные микротитровальные планшеты. Через 12 дней продуцирующие анти-PD-1 антитело гибридомные клоны выбрали для специфического связывания с PD-1 человека. Одну гибридомную клеточную линию, которая секретировала моноклональные антитела, распознающие PD-1 человека, стабилизировали и назвали 67D9. Изотип антитела 67D9 определили как (IgG2a, k) с помощью изотипирующего набора мышиных AT (Sigma). В заключение 67D9 антитело очистили с помощью аффинной хроматографии Protein G из культуральных супернатантов гибридомной клеточной линии.

[00129] Пример 5. Клонирование генов вариабельных областей тяжелой и легкой цепи 67D9

[00130] РНК выделили из гибридомных клеток 67D9 с помощью TRIzolReagent (Invitrogen). КДНК вариабельных областей легкой и тяжелой цепи антитела 67D9 клонировали из гибридомных клеток с помощью системы 5'RACE (Invitrogen) в соответствии с инструкцией производителя. Ген-специфичные праймеры (GSPs) для ПЦР амплификации тяжелой цепи 67D9 были следующими: GSP1-H, 5'-AGC TGG GAA GGT GTG САС АСС АСТ-3'; GSP2-H, 5'-CAG AGT ТСС AGG ТСА AGG ТСА-3'; GSP3-H, 5"-СТТ GAC CAG GCA ТСС TAG AGT-3'.. GSPs применяемые для ПЦР амплификации вариабельных областей легкой цепи 67D9 были следующими: GSP1-L, 5'-TTG CTG ТСС TGA ТСА GTC САА СТ-3'; GSP2-L, 5"-TGT CGT ТСА CTG CCA ТСА АТС ТТ-3'; GSP3-L, 5'-TTG ТТС AAG AAG САС ACG ACT GA-3'. Финальные ПЦР продукты клонировали в вектор pGEM-T (Promega) для определения последовательностей. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела 67D9 показаны в последовательности SEQ ID NO: 15 и 16, соответственно Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи 67D9 показаны в последовательности SEQ ID NO: 17 и 18, соответственно.

[00131] Пример 6. Создание и экспрессия химерного антитела 67D9

[00132] Синтезировали ДНК (SEQ ID N0.19), содержащую кДНК, кодирующую тяжелую цепь химерного антитела 67D9 (c67D9), с сайтами рестрикции для Hind III на 5' конце и EcoRI на 3' конце. ДНК расщепили с помощью Hind III и EcoRI и затем клонировали в вектор pcDNA3.1 (+) (Invitrogen), который подвергли расщеплению теми же ферментами рестрикции с получением экспрессионного вектора pcDNA3.1(+)-c67D9H. Синтезировали ДНК (SEQ ID NO.20), содержащую кДНК, кодирующую легкую цепь химерного антитела, с сайтами рестрикции для Hind III на 5' конце и EcoRI на 3' конце. ДНК подвергли расщеплению с помощью Hind III и EcoRI и затем клонировали в вектор pcDNA3.1 (+) (Invitrogen), который подвергли расщеплению теми же ферментами рестрикции с получением экспрессионного вектора pcDNA3.1(+)-C67D9L Соответствующие экспрессионные векторы pcDNA3.1(+)-c67D9H и pcDNA3.1(+)-c67D9L котрансфицировали в клетки СНО-К1 с использованием липофетаминового реагента 2000. Стабильные трансфицированные клетки выделили с помощью предельного разведения в присутствии 500 мкг/мл G418. Клоны, продуцирующие наибольшее количество C67D9 были отобраны и выращены в бессысвороточной среде. В заключение, C67D9 очистили с помощью аффинной хроматографии Protein А из бессывороточного культурального супернатанта. Концентрацию антитела определяли абсорбцией при 280 нм. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи C67D9 показана в SEQ ID N0.21 и аминокислотная последовательность легкой цепи c67D9 показана в SEQ ID N0.22.

[00133] Пример 7. Гуманизация анти-PDI моноклонального антитела 67D9

[00134] В Базе данных структуры белков (PDB) провели поиск на последовательности антитела, которые обладают высокой идентичностью последовательностей с вариабельной областью (Fv) антитела 67D9. Провели два отдельных поиска BLASTP для вариабельной области легкой цепи (VL) и вариабельной области тяжелой цепи (VH) антитела 67D9. Антитело 1HOD (PDB No. 1 HOD) показало 83% идентичность с VH антитела 67D9 и 90% идентичность с VL антитела 67D9. Были выбраны антитела 1 HOD в качестве шаблона VH и VL для антитела 67D9. Для создания трехмерной структуры антитела 67D9 Fv посредством моделирования гомологии (INSIGHT II 2003, Accelrys, San Diego, CA), последовательности VL и VH антитела 67D9 и их шаблоны были выровнены, соответственно. Были заданы координаты структурно консервативных областей из шаблона и петлевые области были сгенерированы с помощью программы Homology от компании Insight II. Созданную заново структуру подвергли симуляции молекулярной динамики и затем минимизировали энергию за 1000 стадий способом наискорейшего спуска и затем методом сопряженных градиентов с использованием программы Discover. В заключение молекулярную модель вариабельных областей антитела 67D9 получили с помощью ПО молекулярного моделирования Insight II.

[00135] Консенсусные последовательности человеческих легкой цепи подгруппы каппа III (питкШ) и тяжелой цепи подгруппы III (humlll) были выбраны в качестве каркаса для тяжелой и легкой цепей гуманизированной версии антитела 67D9, соответственно (Фиг 3). Гипервариабельные области (CDRs) в гуманизированном антителе были идентичны таковым в мышином антителе 67D9. Молекулярная модель антитела 67D9 Fv показала, что восемь остатков каркасных областей (FR), которые отличались между 67D9 и шаблоном человеческого антитела, находились в 5 А от CDRs и возможно влияли на структуру CDRs. Таким образом, эти восемь остатков FR в гуманизированном антителе 67D9 (hu67D9) были выбраны такими же, как и в мышином антителе 67D9, а не как остатки в человеческом антителе (Фиг. 3). Нуклеотидные и аминокислотные последовательности hu67D9 вариабельной области тяжелой цепи показаны в SEQ ID NO. 7 и SEQ ID N0.8, соответственно. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности hu67D9 вариабельной области легкой цепи показаны в SEQ ID N0. 9 и SEQ ID N0.10, соответственно.

[00136] Пример 8. Экспрессия анти-PD-l гуманизированного антитела hu67D9

[00137] Синтезированную ДНК (SEQ ID N0.25), содержащую «ДНК, кодирующую тяжелую цепь антитела hu67D9, с сайтами рестрикции Hind III на её 5' конце и EcoRI на её 3' конце. ДНК расщепили с помощью Hind III и EcoRI и затем клонировали в вектор pcDNA3.1 (+) (Invitrogen), который подвергли расщеплению теми же ферментами рестрикции с получением экспрессионного вектора pcDNA3.1(+)-hu67D9H. ДНК (SEQ ID N0.27), содержащую кДНК, кодирующую легкую цепь антитела hu67D9, с сайтами рестрикции Hind III на её 5' конце и EcoRI на её 3' конце. ДНК расщепили с помощью Hind III и EcoRI и затем клонировали в вектор pcDNA3.1 (+) (Invitrogen), который подвергли расщеплению теми же ферментами рестрикции с получением экспрессионного вектора pcDNA3.1(+)-hu67D9L. Соответствующие экспрессионные векторы pcDNA3.1(+)-hu67D9H и pcDNA3.1(+)-hu67D9L котрансфицировали в клетки СН0-К1 с использованием липофетаминового реагента 2000. Стабильные трансфицированные клетки выделили с помощью предельного разведения в присутствии 500 мкг/мл G418. Клоны, продуцирующие наибольшее количество hu67D9 были отобраны и выращены в бессывороточной среде. В заключение, hu67D9 очистили с помощью аффинной хроматографии Protein А из бессывороточного культурального супернатанта. Концентрацию антитела определяли посредством абсорбции при 280 нм. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи hu67D9 показана в SEQ ID N0.26 и аминокислотная последовательность легкой цепи hu67D9 показана в SEQ ID N0.28.

[00138] Пример 9. Измерение связывающей аффинности.

[00139] Связывающие аффинности антител 67D9, c67D9, и hu67D9 определяли с использованием способа, аналогичного описанному Holash и коллегами (Holash J, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2002;99(17):11393-8). Вкратце, фиксированные концентрации анти-PD-l антитела инкубировали с различными концентрациями PD-1-Fc в течение 1 часа. Затем смесь добавили в 96-луночные планшеты, покрытые PD-1-Fc, с последующим инкубированием в течение 1 ч. После промывки, добавили HRP-конъюгированные козлиные антитела к каппа цепи человека (для детекции c67D9 или hu67D9 ) или HRP-конъюгированные козлиные антитела к каппа цепи мыши (для детекции 67D9) и планшеты дополнительно инкубировали в течение 1 ч. В заключение, ТМВ добавили в качестве субстрата для HRP, и абсорбцию измеряли при 450 нм. Полученные результаты показали, что связывающие активности (KD) антител 67D9, C67D9, и hu67D9 составляют 12.4 пМч 16.9 пМ и 15.4 пМ соответственно.

[00140] Пример 10. Блокирование связывания PD-L1 с PD-1-экспрессирующими клетками СНО-К1 посредством анти-PD-l антител

[00141] Анти-PD-l антитела 67D9, C67D9, и hu67D9 тестировали на способность блокировать связывание PD-L1 с PD-1, экспрессируемом на трансфицированных СНО-К1 (CHO/PD-1) клетках с использованием анализа проточной цитометрии. Вкратце, субнасыщающая концентрация биотин-PD-LI-Fc инкубировалась с 10 мкг/мл антител 67D9, C67D9, или hu67D9 в течение 1 часа. Затем смесь добавили к клеткам CHO/PD-1. Через 1 час клетки промыли и связывание определяли с помощью авидин-РЕ. Анализ проточной цитометрии выполнили с использованием проточной цитометрии FACScan (Becton Dickinson). Результаты показанные на Фиг. 4A-4D демонстрируют, что все три анти-PD-l антитела, 67D9, C67D9, и hu67D9, эффективно ингибируют связывание PD-LI-Fc с PD-1, экспрессируемым на трансфицированных клетках СНО-К1.

[00142] Пример 11. Связывание анти-PD-l антител с членами семейства CD28

[00143] Специфичность анти-PD-l антител тестировали определением их связывания с членами семейства CD28: ICOS, CTLA-4 и CD28 (R&D System) и использованием обычного ELISA. Вкратце, различные концентрации антител 67D9, C67D9, или hu67D9 добавили в 96-луночные планшеты, покрытые ICOS, CTLA-4, CD28 или PD-1-Fc, с последующим инкубированием при комнатной температуре в течение 2 ч. После промывки, добавили HRP-конъюгированные козлиные антитела к каппа цепи человека (для детекции C67D9 или hu67D9 ) или HRP-конъюгированные козлиные антитела к каппа цепи мыши (для детекции 67D9) и планшеты дополнительно инкубировали в течение 1 ч. В заключение, ТМВ добавили в качестве субстрата для HRP, и абсорбцию измеряли при 450 нм. Как показано на Фиг. 5A-5D, каждое из анти-PD-l антител 67D9, C67D9, и hu67D9 связывались с PD-I, но не с другими членами семейства CD28 (ICOS, CTLA-4 и CD28).

[00144] Пример 12. Эффект анти-PD-l антител на клеточную пролиферацию и продукцию цитокинов в реакции смешанной культуры лимфоцитов

[00145] Реакция смешанной культуры лимфоцитов применялась для демонстрации эффекта блокирования сигнального пути PD-1 на лимфоцитарные эффекторные клетки. Т клетки в анализа тестировались на пролиферацию, секрецию IFN-гамма -и IL-2 в присутствии или отсутствии анти-PD-1 антител. Вкратце, мононуклеарные клетки периферической крови человека (PBMCs) выделили из гепаринизированной крови здоровых добровольцев с помощью градиентного плотностного центрифугирования в фиколл-пак. PBMCs человека культивировали в 96-луночных планшетах с плоским дном в течение ночи. Анти-PD-l антитела (67D9, C67D9, или hu67D9) при различной концентрации антител, РМА (10 нг/мл), и иономицин (10 нг/мл) добавили к каждой культуре. Контрольное антитело lgG4 использовали в качестве отрицательного контроля. Клетки культивировали в течение 3 дней при 37°С. Затем клетки пометили с помощью ³Н-тимидина, культивировали в течение дополнительных 6 часов, и анализировали на клеточную пролиферацию с использованием счетчика MicroBeta (PerkinElmer). Результаты показаны на Фиг. 6А, подтверждающие что каждое их трех антител к PD-1, 67D9, c67D9, и hu67D9, инициируют пролиферацию Т-клеток зависимым от концентрации способом.

[00146] PBMCs человека культивировали в 96-луночных планшетах с плоским дном в течение ночи. Анти-PD-l антитела (67D9, C67D9, или hu67D9) в различных концентрациях антител, РМА (10 нг/мл), и иономицин (10 нг/мл) добавили к каждой культуре. Контрольное антитело lgG4 использовали в качестве отрицательного контроля. Клетки культивировали в течение 3 дней при 37°С. Затем 100 мкл среды взяли из каждой культуры для измерения цитокинов. Уровни IFN-гамма и IL-2 измерили с использованием наборов ELISA (R&D System). Результаты показали, что каждое из трех антител к PD-1, 67D9, C67D9, и hu67D9, инициируют секрецию IL-2 (Фиг. 6В) и IFN-гамма (Фиг. 6С) зависимым от концентрации способом.

[00147] Пример 13. Характеристика связывания анти-PD-l антитела с мышиным PD-1 и PD-1 яванского макака.

[00148] Мышиный PD-1 и PD-1 яванского макака получили в виде Fc слитого белка с использованием способа, аналогичного таковому для PD-1-Fc человека в Примере 1. Различные концентрации 67D9, C67D9, или hu67D9 добавили в 96-луночные планшеты, покрытые человеческим PD-1-Fc, мышиным PD-1-Fc, или PD-1-Fc яванского макака с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывки, добавили HRP-конъюгированные козлиные антитела к каппа цепи человека (для детекции c67D9 или hu67D9 ) или HRP-конъюгированные козлиные антитела к каппа цепи мыши (для детекции 67D9) и планшеты дополнительно инкубировали в течение 1 ч. В заключение, ТМВ добавили в качестве субстрата для HRP, и абсорбцию измеряли при 450 нм. Как показано на Фиг. 7А-7С, каждое из анти-PD-1 антител 67D9, c67D9, или hu67D9 связывалось с человеческим PD-1-Fc и PD-1-Fc яванского макака, но не с мышиным PD-1-Fc.

[00149] Пример 14. Измерения термостабильности

[00150] Измерения дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) проводились для идентификации явной средней температуры анфолдинга (Tm). DSC также применялась для измерения теплоемкости состояний и избыток тепла ассоциировался с переходом, который может быть индуцирован изменением температуры. Интеграл избытка теплоемкости является энтальпией для этого процесса Большинство нефолдинговых переходов выступает в качестве существенных эндотермических пиков.

[00151] DSC эксперименты проводили с использованием VP-DSC (Microcal, Northhampton, MA) для Ниволумаба, Пембролизумаба и hu67D9 растворов при концентрации белка 0.5 мг/мл в ФСБ (рН 7.0). Антитела тестировали индивидуально при концентрации белка 0.5 мг/мл, и в качестве референса использовали буферный контроль без белка. Образцы сканировали от 10°С до 120°С при скорости 100°С/час после первоначального уравновешивания в течение 10 мин при 10°С. По меньшей мере пять сканирований буфер-буфер было проведено для получения значений базовой линии и установления термической предыстории. Данные анализировали с помощью Origin 7.0 (Origin- Lab, Northampton, Massachusetts). Все термограммы были скорректированы по базовой линии (линейная зависимость) и аппроксимированы с использованием недвухуровневой модели в Origin для получения экспериментальных средних температур (Tm) анфолдинга и экспериментальной энтальпии анфолдинга (АН). Как показано на Фиг. 8 и Таблице 1, температура анфолдинга для hu67D9 выше, чем для Ниволумаба и Пембролизумаба, предполагая, что hu67D9 обладает лучшей термостабильностью по сравнению с Ниволумабом и Пембролизумабом.

[00153] Пример 15. Измерения кинетики и аффинности

[00154] Оптический феномен поверхностного плазмонного резонанса (SPR), применяемый в анализах Biacore позволяет детектировать и измерять белок-белковые взаимодействия в реальном времени без использования меток. Аффинность антитела к своему антигену может быть определена измерением кинетики связывания при взаимодействии.

[00155] При оценке кинетических и аффинных констант слитый белок PD-1-Fc иммобилизовали и hu67D9 и Ниволумаб развели в загружаемом буфере и анализировали.

[00156] Константы аффинности рассчитывались по соотношению констант скорости. Как показано на Фиг 9 KD антитела hu67D9 составляет 3.209Е-12М, при этом KD ниволумаба составляет 2.116Е-11М. Эти результаты свидетельствуют о том, что антитело hu67D9 связывается с PD-1 с более высокой аффинностью, чем Ниволумаб.

[00157] Пример 16 Активность связывания с PD-1 на клеточной поверхности

[00158] Hu67D9 тестировали на способность связываться с PD-1, экспрессируемом на трансфицированных клетках СНО-К1 (CHO/PD-1) с использованием обычного анализа проточной цитометрии.

[00159] Серия разведений антитела hu67D9 или ниволумаба инкубировались с клетками CHO/PD-1 соответственно. Через 1 час инкубации клетки промыли и меченое ФИТЦ античеловеческое антитело инкубировали в течение 1 часа. Затем клетки промыли и провели анализ проточной цитометрии с использованием проточного цитометра FACScan.

[00160] Как показано на Фиг. 10, оба антитела hu67D9 и Ниволумаб способный связывать PD-1, экспрессируемый на клеточной поверхности. Значение ЕС₅₀ антитела hu67D9 намного ниже, чем у Ниволумаба, что свидетельствует о том, что антитело hu67D9 связывается с PD-1 на клеточной поверхности с более высокой аффинностью, чем Ниволумаб.

[00161] Пример 17 Связывающая аффинность с растворимым PD-1

[00162] Специфичность анти-PD-l антител исследовалась определением из связывания с растворимым PD-1 с использованием обычной техники ELISA.

[00163] Различные концентрации hu67D9 и Ниволумаба добавили в 96-луночные планшеты, покрытые PD-1-Fc, с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 2 часов. После промывки HRP-конъюгированые козлиные антитела к каппа человека добавили и планшеты дополнительно инкубировали в течение 1 часа. В заключение добавили ТМВ в качестве субстрата для HRP, и абсорбцию измеряли при 450 нм.

[00164] Как показано на Фиг 11, оба антитела hu67D9 и Ниволумаб были способны связываться с растворимым PD-1. Значение ЕС₅₀ антитела hu67D9 намного ниже, чем у Ниволумаба, что свидетельствует о том, что антитело hu67D9 связывается с растворимым PD-1 с более высокой аффинностью, чем Ниволумаб.

[00165] Пример 18 Конкурентное связывание PD-1 на клеточной поверхности с Ниволумабом

[00166] Hu67D9 тестировали на способность конкурентного связывания с PD-1, экспрессируемым на трансфицированных клетках СНО-К1 (CHO/PD-1) с помощью проточной цитометрии.

[00167] Субнасыщающую концентрацию ФИТЦ меченого Ниволумаба инкубировали с сериями разведений антитела hu67D9 или Ниволумаба соответственно. Через 1 час инкубации клетки промыли и провели анализ проточной цитометрии с использованием проточного цитометра FACScan.

[00168] Как показано на Фиг. 12, оба антитела hu67D9 и Ниволумаб конкурируют за связывание PD-1 на клеточной поверхности с ФИТЦ меченым Ниволумабом. Значение IC50 для антитела hu67D9 намного ниже, чем у Ниволумаба, что свидетельствует о том, что антитело hu67D9 конкурентно связывается с PD-1 на клеточной поверхности с более высокой аффинностью, чем Ниволумаб.

[00169] Пример 19 Конкурентное связывание растворимого PD1 с Ниволумабом

[00170] Активность конкурентного связывания растворимого PD-1 с анти-PD-l антителами тестировалась с использованием обычной методики ELISA.

[00171] Субнасыщающую концентрацию меченого биотином Ниволумаба и серии разведений hu67D9 или Ниволумаба добавляли в 96-луночные планшеты, покрытые PD-1-Fc, с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 2 часов. После промывки, HRP-авидин добавляли и планшеты дополнительно инкубировали в течение 1 часа. В заключение добавили ТМВ в качестве субстрата для HRP, и абсорбцию измеряли при 450 нм.

[00172] Как показано на Фиг. 13, оба антитела hu67D9 и Ниволумаб конкурировали с меченым биотином Ниволумабом и связывались с растворимым PD-1. Значение IC₅₀ для антитела hu67D9 намного ниже, чем у Ниволумаба, что свидетельствует о том, что антитело hu67D9 конкурентно связывается с растворимым PD1 с более высокой аффинностью, чем Ниволумаб.

[00173] Пример 20 Конкурентное связывание растворимого PD1 с PD-L1

[00174] Конкурентное связывание растворимого PD1 с PD-L1 анти-PD-l антител тестировалась с использованием обычной методики ELISA.

[00175] Субнасыщающую концентрацию меченого биотином PDLI-Fc и серии разведенного hu67D9 или Ниволумаба добавили в 96-луночные планшеты, покрытые PD-1-Fc, с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 2 часов. После промывки, RP-авидин добавляли и планшеты дополнительно инкубировали в течение 1 часа. В заключение добавили ТМВ в качестве субстрата для HRP, и абсорбцию измеряли при 450 нм.

[00176] Как показано на Фиг. 14, оба антитела hu67D9 и Ниволумаб конкурировали с меченым биотином PDL1-Fc и связывались с растворимым PD-1. Значение IC₅₀ для антитела hu67D9 намного ниже, чем у Ниволумаба, что свидетельствует о том, что антитело hu67D9 конкурентно связывает растворимый PD1 с более высокой аффинностью, чем Ниволумаб.

Claims

1. Анти-PD1 моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где указанное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 1 (CDR1 тяжелой цепи), SEQ ID NO: 2 (CDR2 тяжелой цепи), SEQ ID NO: 3 (CDR3 тяжелой цепи), и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 4 (CDR1 легкой цепи), SEQ ID NO: 5 (CDR2 легкой цепи) и SEQ ID NO: 6 (CDR3 легкой цепи).

2. Моноклональное антитело по п. 1, где указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 16 и указанная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 18.

3. Моноклональное антитело по п. 1, где указанный антигенсвязывающий фрагмент представляет собой Fab, Fab', F(ab)2, или F(ab')2.

4. Моноклональное антитело по п. 1, где указанное антитело представляет собой мышиное, химерное или гуманизированное антитело.

5. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует моноклональное антитело по любому из пп. 1-4.

6. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 5.

7. Клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии по п. 6.

8. Композиция для специфического связывания с PD-1 человека, содержащая моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-4 и фармацевтически приемлемый носитель.

9. Иммуноконъюгат, содержащий моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-4, соединенные с терапевтическим агентом.

10. Иммуноконъюгат по п. 9, где терапевтический агент представляет собой цитотоксин или радиоактивный изотоп.

11. Способ модулирования иммунного ответа у субъекта, содержащий введение субъекту антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-4 таким образом, что иммунный ответ у субъекта модулируется.

12. Способ ингибирования роста опухолевых клеток у субъекта, содержащий введение субъекту антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-4 в количестве, эффективном для ингибирования роста опухолевых клеток.

13. Способ лечения инфекционного заболевания у субъекта, содержащий введение субъекту антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-4 таким образом, что субъект лечится от инфекционного заболевания.

14. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-4 при производстве лекарственного средства для модификации иммунного ответа у субъекта.

15. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-4 при производстве лекарственного средства для ингибирования роста опухолевых клеток у субъекта.

16. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-4 при производстве лекарственного средства для лечения инфекционного заболевания у субъекта.