KR20180083318A - Pd-1 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 높은 친화성으로 인간 PD-1에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 제공한다. 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 분자, 발현 벡터, 숙주 세포 및 본 발명의 항체를 발현시키는 방법을 또한 제공한다. 본 발명의 PD-1 항체는 PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 억제하며, 이에 의해 일반적으로 면역 반응 및 특히 TcR 및 CD28에 의해 매개되는 면역반응을 조절한다. 본 발명은 또한 본 발명의 PD-1 항체를 사용하여 감염성 질병 및 암을 포함한 다양한 질병을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

PD-1 항체 및 그의 용도
본 발명은 일반적으로 인간 질병의 치료에서 면역요법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 암을 치료하기 위한 항-PD-1 항체의 용도에 관한 것이다.
적응 면역반응은 T 세포 및 B 세포라 칭하는 림프구의 2가지 주요 부류의 활성화, 선택 및 클론 증식을 수반한다. 항원과의 조우 후에, T 세포는 증식하여 항원-특이성 효과기 세포로 분화하는 반면, B 세포는 증식하여 항체-분비 세포로 분화한다.
T 세포 활성화는 상기 T 세포와 항원-제공 세포(APC)간의 다수의 신호전달 사건을 요구하는 다단계 과정이다. T 세포 활성화가 일어나기 위해서는 2가지 유형의 신호가 휴지 T 세포에 전달되어야 한다. 첫 번째 유형은 항원-특이성 T 세포 수용체(TcR)에 의해 매개되며, 면역 반응에 특이성을 부여한다. 두 번째, 보조자극 유형은 상기 반응의 크기를 조절하며 상기 T 세포상의 부속 수용체를 통해 전달된다.
1차 보조자극 신호는 리간드 B7-1 또는 B7-2의 연동시 활성화 CD18 수용체를 통해 전달된다. 대조적으로, 동일한 B7-1 또는 B7-2 리간드에 의한 억제성 CTLA-4 수용체의 연동은 T 세포 반응의 약화를 생성시킨다. 따라서, CTLA-4 신호는 CD28에 의해 매개되는 보조자극을 길항한다. 높은 항원 농도에서, CD28 보조자극은 상기 CTLA-4 억제 효과를 무효화한다. 상기 CD28 및 CTLA-4 발현의 시간적 조절은 활성화와 억제 신호간의 균형을 유지시키며 자가면역의 발생을 방어하면서 유효 면역 반응의 발생을 보장한다.
CD28 및 CTLA-4의 분자 동족체들 및 이들의 B-7 유사 리간드가 최근에 확인되었다. ICOS는 CD28-유사 보조자극 수용체이다. PD-1(예정된 사멸 1)은 CD28, CTLA-4, ICOS 및 BTLA를 또한 포함하는 CD28과 수용체의 억제 구성원이다. PD-1은 활성화된 B 세포, T 세포 및 골수 세포상에서 발현된다. 상기 과의 초기 구성원, CD28 및 ICOS는 단클론 항체의 부가에 따라 T 세포 증식이 증대할 때 기능 효과에 의해 발견되었다(Hutloff et al. (1999) Nature 397:263-266; Hansen et al. (1980) Immunogenics 10:247-260). PD-1은 세포사멸성 세포에서 차별적 발현에 대한 선별을 통해 발견되었다(Ishida et al. (1992) EMBO J 11:3887-95). 상기 과의 다른 구성원, CTLA-4 및 BTLA는 각각 세포독성 T 림프구 및 TH1 세포에서 차별적 발현에 대한 선별을 통해 발견되었다. CD28, ICOS 및 CTLA-4는 모두 동종이량체화를 허용하는 짝없는 시스테인 잔기를 갖는다. 대조적으로, PD-1은 단량체로서 존재하는 것으로 제시되는데, 다른 CD28과 구성원들의 짝없는 시스테인 잔기 특징이 없다.
상기 PD-1 유전자는 Ig 유전자 상과의 부분인 55 kDa I형 막관통 단백질이다(Agata et al. (1996) Int Immunol 8:765-72). PD-1은 막 근위 면역수용체 티로신 억제 동기(ITIM) 및 막 원위 티로신-기반 전환 동기(ITSM)를 함유한다. PD-1은 CTLA-4와 구조적으로 유사하지만, B7-1 및 B7-2 결합에 중요한 MYPPPY 동기가 없다. PD-1에 대한 2개의 리간드, PD-L1 및 PD-L2가 확인되었으며, 이들은 PD-1에 결합시 T 세포 활성화를 하향조절하는 것으로 나타났다(Freeman et al. (2000) J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1 및 PD-L2는 모두, PD-1에 결합하지만 다른 CD28과 구성원들에는 결합하지 않는 B7 동족체이다. PD-1은 활성화된 B 세포, T 세포 및 골수 세포상에서 발현된 CD28과의 억제성 구성원이다. PD-1에 대한 하나의 리간드, PD-L1은 다양한 인간 암들에 풍부하다(Dong et al. (2002) Nat. Med. 8:787-9). PD-1과 PD-L1간의 상호작용은 종양 침윤성 림프구의 감소, T-세포 수용체 매개된 증식의 감소, 및 암성 세포에 의한 면역 회피를 생성시킨다(Dong et al. (2003) J. Mol. Med. 81:281-7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100). 면역 억제는 PD-1과 PD-L1과의 국소적인 상호작용을 억제시킴으로써 역전될 수 있으며, 그 효과는 PD-1과 PD-L2와의 상호작용이 또한 차단될 때 부가적이다(Iwai et al. (2002) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 99:12293-7; Brown et al. (2003) J. Immunol. 170:1257-66).
본 발명은 PD-1에 결합하고 다수의 바람직한 성질들을 나타내는 단클론 항체를 제공한다. 이들 성질은 예를 들어 인간 PD-1에 대한 높은 친화성 결합을 포함한다.
본 발명은 단리된 단클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기에서 상기 단클론 항체는 인간 PD-1에 높은 친화성으로 결합한다. 본 발명의 단클론 항체는 마우스, 키메릭 또는 인간화된 항체이다. 본 발명의 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab)2, or F(ab')2이다.
본 발명은 또한 항-PD-1 단클론 항체를 암호화하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 항-PD-1 단클론 항체를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 항-PD-1 단클론 항체를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 항-PD-1 항체를 사용하는 면역 반응의 조절 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 항-PD-1 항체를 사용하는 종양 세포의 성장 억제 방법을 제공한다.
하나의 태양에서, 항-PD-1 단클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기에서 상기 항체는 서열번호 1(중쇄 CDR1), 서열번호 2(중쇄 CDR2), 서열번호 3(중쇄 CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 4(경쇄 CDR1), 서열번호 5(경쇄 CDR2) 및 서열번호 6(경쇄 CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 단클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 태양에서, 치료제에 결합된 본 명세서에 기재된 바와 같은 단클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 면역접합체를 제공한다.
또 다른 태양에서, 대상체(subject)에게 상기 대상체의 면역 반응이 조절되도록 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 투여함을 포함하는, 상기 대상체에서 상기 면역 반응을 조절하는 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 대상체에게 종양 세포의 성장을 억제하기에 유효한 양으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여함을 포함하는, 상기 대상체에서 상기 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 대상체에게 상기 대상체가 감염성 질병에 대해 치료되도록 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여함을 포함하는, 상기 대상체에서 상기 감염성 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 비제한적인 실시예 및 첨부되는 도면과 함께 고려할 때 상세한 설명을 참조하여 보다 잘 이해될 것이며, 도면에서:
도 1A 및 1B는 PD-L1-Fc의 PD-1-형질감염된 CHO 세포(CHO/PD-1)에의 결합을 도시한다.
도 2는 PD-1-Fc-비오틴의 PD-L1-Fc에의 결합을 도시한다.
도 3은 67D9 및 hu67D9의 중(A) 및 경(B)쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 도시한다. 67D9VH 및 67D9VL은 각각 67D9의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 가리킨다. humIII은 인간화된 중쇄에 대한 프레임워크로서 선택되었고 humκIII은 인간화된 경쇄에 대해 선택되었다. hu67D9VH 및 hu67D9VL은 각각 hu67D9의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 가리킨다. 대시선은 인간 항체 프레임워크 중의 상응하는 잔기들과 동일한 아미노산들을 나타낸다. CDR은 괄호안에 있다.
도 4A 내지 4D는 3개의 항-PD-1 항체, 67D9, c67D9 및 hu67D9가 모두, 형질감염된 CHO-K1 세포상에서 발현된 PD-1에 대한 PD-L1-Fc의 결합을 유효하게 억제함을 입증하는 실험 결과를 도시한다.
도 5A 내지 5D는 각각의 항-PD-1 항체 67D9(마우스 Ab), c67D9(키메릭 Ab), 및 hu67D9(인간화된 Ab)가 PD-1(A)에는 결합하지만 ICOS(B), CTLA-4(C) 및 CD28(D)에는 결합하지 않음을 입증하는 실험 결과를 도시한다.
도 6A 내지 6C는 각각의 3개의 항-PD-1 항체, 67D9(마우스 Ab), c67D9(키메릭 Ab), 및 hu67D9(인간화된 Ab)가 혼합 림프구 반응 분석에서 T-세포 증식(A), IL-2(B) 분비 및 IFN-감마(C) 분비를 촉진함을 입증하는 실험 결과를 도시한다.
도 7A 내지 7C는 각각의 항-PD-1 항체 67D9(마우스 Ab), c67D9(키메릭 Ab), 및 hu67D9(인간화된 Ab)가 인간 PD-1-Fc(A) 및 키노몰구스 원숭이 PD-1-Fc(B)에는 결합하지만 마우스 PD-1-Fc(C)에는 결합하지 않음을 입증하는 실험 결과를 도시한다.
도 8은 PBS 중의 니보루맵, 펨브로리주맵 및 hu67D9(인간화된 67D9)의 DSC 써모그램을 도시한다.
도 9는 니보루맵 및 hu67D9의 동역학 및 친화성 측정 결과를 도시한다.
도 10은 니보루맵 및 hu67D9의, 세포 표면상에서 발현된 PD-1에의 결합을 도시한다.
도 11은 니보루맵 및 hu67D9의, 용해성 PD-1에의 결합을 도시한다.
도 12는 FITC 표지된 니보루맵의 존재하에서 세포 표면상에서 발현된 PD-1에 대한 니보루맵 및 hu67D9의 경쟁 결합을 도시한다.
도 13은 비오틴 표지된 니보루맵의 존재하에서 용해성 PD-1에 대한 니보루맵 및 hu67D9의 경쟁 결합을 도시한다.
도 14는 비오틴 표지된 PDL1-Fc의 존재하에서 용해성 PD-1에 대한 니보루맵 및 hu67D9의 경쟁 결합을 도시한다.
본 발명은 인간 PD-1에 특이적으로 결합하는 단리된 단클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 바람직한 기능 성질, 예를 들어 PD-1에의 높은 친화성 결합, 다른 CD28과 구성원들에 대한 교차 반응성의 결여, 혼합 림프구 반응에서 T 세포 증식 및 IL-2 및 IFN-감마 분비를 자극하는 능력, 하나 이상의 PD-1 리간드(예를 들어 PD-L1 및/또는 PD-L2)의 결합을 억제하는 능력, 및/또는 키노몰구스 원숭이 PD-1과 교차-반응하는 능력을 나타낸다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 PD-1에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 및 CTLA-4에 특이적으로 결합하는 단클론 항체의 복합 용도에 관한 것이다.
본 발명은 인간 PD-1에 특이적으로 결합하는 단리된 단클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 상기와 같은 항체의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 항-PD-1 항체를 사용하여 대상체에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 입증된 바와 같이, 항-PD-1 항체는 생체내에서 종양 세포 성장을 억제할 수 있다. 본 발명은 또한 면역 반응을 변경시킬뿐만 아니라 암 또는 감염성 질병과 같은 질병을 치료하기 위해 상기 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있기 위해서, 몇몇 용어들을 먼저 정의한다. 추가적인 정의는 상세한 설명 전체를 통해 제시한다.
"예정된 사멸 1", "예정 세포사 1", "PD-1", "PD1", "PDCD1", "hPD-1" 및 "hPD-I"란 용어들은 호환 가능하게 사용되며, 인간 PD-1의 변체, 동형, 종 동족체, 및 PD-1과 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다.
"세포독성 T 림프구-관련 항원-4", "CTLA-4", "CTLA4", "CTLA-4 항원" 및 "CD152"란 용어들은 호환 가능하게 사용되며, 인간 CTLA-4의 변체, 동형, 종 동족체, 및 CTLA-4와 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다.
"면역 반응"이란 용어는 병원체 침범 인체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암세포, 또는 자가면역 또는 병적인 염증의 경우에, 정상적인 인간 세포 또는 조직에 대한 선택적인 손상, 이들의 파괴, 또는 이들로부터의 제거를 생성시키는, 예를 들어 림프구, 항원 제공 세포, 식세포, 과립구, 및 상기 세포 또는 간에 의해 생성되는 용해성 거대분자(항체, 사이토킨 및 보체 포함)의 작용을 지칭한다.
본 명세서에서 지칭되는 바와 같은 "항체"란 용어는 전체 항체 및 그의 임의의 항원-결합 단편(즉 "항원-결합 부분") 또는 단쇄를 포함한다. "항체"는 다이설파이드 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄, 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 당단백질을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 VH라 약기됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 상기 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 명세서에서 VL이라 약기됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 상기 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성된다. 상기 VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라 칭하는 보다 보존되는 영역들과 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)이라 칭하는 고가변성의 영역들로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서부터 카복시-말단까지 하기의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 상기 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 상기 항체의 불변 영역은 다양한 면역계 세포(예를 들어 효과기 세포) 및 전통적인 보체 시스템의 제1 성분(C1q)을 포함하여, 숙주 조직 또는 인자에 대한 상기 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 항체의 "항원-결합 단편"이란 용어는 항원(예를 들어 PD-1)에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 완전길이 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 "항원-결합 단편"이란 용어내에 포함되는 결합 단편들의 예는 (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH 도메인으로 이루어지는 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 디설파이드 가교에 의해 연결되는 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어지는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 가지의 VL 및 VH 도메인으로 이루어지는 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어지는 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "단클론 항체" 또는 "다클론 항체 조성물"이란 용어는 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 단클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대해 단일의 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다.
"인간화된 항체"란 용어는 또 다른 포유동물 종, 예를 들어 마우스의 생식세포계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열상에 접목된 항체를 지칭한다. 추가적인 프레임워크 영역 변형이 상기 인간 프레임워크 서열내에서 이루어질 수도 있다.
"키메릭 항체"란 용어는 가변 영역 서열이 하나의 종으로부터 유래되고 불변 영역 서열이 또 다른 종으로부터 유래되는 항체, 예를 들어 상기 가변 영역 서열이 마우스 항체로부터 유래되고 상기 불변 영역 서열이 인간 항체로부터 유래되는 항체를 지칭하고자 한다.
IgG 항체에 대한 "높은 친화성"이란 용어는 표적 항원에 대해 10-8 M 이하, 보다 바람직하게는 10-9 M 이하 및 훨씬 더 바람직하게는 10-10 M 이하의 KD를 갖는 항체를 지칭한다. 그러나, "높은 친화성" 결합은 다른 항체 아이소타입들에 대해서 변할 수 있다. 예를 들어, IgM 아이소타입에 대한 "높은 친화성" 결합은 10-7 M 이하, 보다 바람직하게는 10-8 M 이하, 훨씬 더 바람직하게는 10-9 M 이하의 KD를 갖는 항체를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "대상체"란 용어는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. "비인간 동물"이라는 용어는 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예를 들어 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다. 지시된 경우를 제외하고, "환자" 또는 "대상체"란 용어는 호환 가능하게 사용된다.
본 발명의 다양한 태양을 하기 하위섹션들에 더욱 상세히 기재한다.
항-PD-1 항체
본 발명의 항체는 상기 항체의 특정한 기능상 특징 또는 성질을 특징으로 한다. 예를 들어, 상기 항체는 PD-1에 특이적으로 결합한다(예를 들어 인간 PD-1에 결합하며 다른 종, 예를 들어 키노몰구스 원숭이로부터의 PD-1과 교차-반응할 수 있다). 바람직하게, 본 발명의 항체는 높은 친화성으로, 예를 들어 1x10-7 M 이하의 KD로 PD-1에 결합한다. 본 발명의 항-PD-1 항체는 바람직하게는 하기의 특징들 중 하나 이상을 나타낸다:
(a) 인간 CD28, CTLA-4 또는 ICOS에 실질적으로 결합하지 않는다;
(b) 혼합 림프구 반응(MLR) 분석에서 T-세포 증식을 증가시킨다;
(c) MLR 분석에서 IFN-γ 및/또는 IL-2 분비를 증가시킨다;
(d) 인간 PD-1 및 키노몰구스 원숭이 PD-1에 결합한다;
(e) PD-L1의 PD-1에의 결합을 억제한다;
(f) 인간 PD-1에 1x10-7 M 이하의 KD로 결합한다.
바람직하게, 상기 항체는 인간 PD-1에 1x10-8 M 이하의 KD로 결합하거나, 인간 PD-1에 5x10-9 M 이하의 KD로 결합하거나, 또는 인간 PD-1에 1x10-8 M 내지 1x10-12 M 이하의 KD로 결합한다. 보다 바람직하게, 상기 항체는 인간 PD-1에 1x10-12 M 이하의 KD로 결합한다. 보다 바람직하게, 상기 항체는 인간 PD-1에 3.209x10-12 M의 KD로 결합한다.
본 발명의 항체는 상기 나열된 특징들의 임의의 조합, 예를 들어 상기 나열된 특징들 중 2, 3, 4, 5개 이상을 나타낼 수 있다.
PD-1에 대한 상기 항체의 결합 능력을 평가하기 위한 표준 분석, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블럿 및 RIA는 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 항체의 결합 동역학(예를 들어 결합 친화성)을 또한 당해 분야에 공지된 표준 분석에 의해, 예를 들어 Biacore 분석에 의해 평가할 수 있다. 상술한 특징들 중 어느 하나를 평가하기에 적합한 분석을 실시예에 상세히 기재한다.
하나의 태양에서, 본 발명은
(a) 서열번호 1(중쇄 CDR1), 서열번호 2(중쇄 CDR2), 서열번호 3(중쇄 CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열번호 4(경쇄 CDR1), 서열번호 5(경쇄 CDR2) 및 서열번호 6(경쇄 CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 단리된 단클론 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기에서 상기 항체는 PD-1, 바람직하게는 인간 PD-1에 특이적으로 결합한다.
바람직한 상기 항-PD-1 항체는
(a) 서열번호 8 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열번호 10 또는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함한다.
상동성 항체
본 발명의 항체는 본 명세서에 기재된 바람직한 항체의 아미노산 서열과 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기에서 상기 항체는 본 발명의 항-PD-1 항체의 목적하는 기능적 성질을 유지한다.
예를 들어, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 단클론 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공하며, 여기에서:
(a) 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 8 및 16으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열에 적어도 80% 상동성인 아미노산 서열을 포함하고;
(b) 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 10 및 18로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열에 적어도 80% 상동성인 아미노산 서열을 포함하며;
상기 항체는 하기의 성질들 중 하나 이상을 나타낸다:
(c) 인간 CD28, CTLA-4 또는 ICOS에 실질적으로 결합하지 않는다;
(d) 혼합 림프구 반응(MLR) 분석에서 T-세포 증식을 증가시킨다;
(e) MLR 분석에서 IFN-γ 및/또는 IL-2 분비를 증가시킨다;
(f) 인간 PD-1 및 키노몰구스 원숭이 PD-1에 결합한다;
(g) PD-L1의 PD-1에의 결합을 억제한다;
(h) 인간 PD-1에 1x10-7 M 이하의 KD로 결합한다.
다른 실시태양에서, 상기 VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 상기에 제시된 서열들에 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 2개의 아미노산 서열간의 상동성 퍼센트는 상기 2개의 서열간의 일치성 퍼센트와 동등하다. 상기 2개의 서열간의 일치성 퍼센트는, 상기 2개 서열의 최적의 정렬을 위해 도입시킬 필요가 있는 끊김(gap)의 수 및 각 끊김의 길이를 고려하여, 상기 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다(즉 상동성% = 동일한 위치의 #/위치들의 총 # x 100). 상기 서열들의 비교 및 2개 서열간의 일치성 퍼센트의 측정을 하기 비제한적인 실시예에 기재되는 바와 같이, 수학적 연산을 사용하여 수행할 수 있다.
면역접합체
또 다른 태양에서, 본 발명은 치료학적 부분, 예를 들어 세포독소, 약물(예를 들어 면역억제제) 또는 방사성독소에 접합된 항-PD-1 항체, 또는 그의 단편을 특징으로 한다. 상기와 같은 접합체를 본 명세서에서 "면역접합체"라 칭한다. 하나 이상의 세포독소를 포함하는 면역접합체를 "면역독소"라 칭한다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 유해한(즉 세포를 살해하는) 임의의 작용제를 포함한다. 예로서 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀올, 및 퓨로마이신 및 이들의 유사체 또는 동족체가 있다. 치료제는 또한 예를 들어 대사길항물질(예를 들어 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로유라실 데카바진), 알킬화제(예를 들어 메클로에타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카머스틴(BSNU) 및 로머스틴(CCNU), 사이클로토스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예를 들어 다우노루비신(이전에는 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어 닥티노마이신(이전에는 액티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신(AMC)), 및 유사분열 방지제(예를 들어 빈크리스틴 및 빈블라스틴)을 포함한다.
본 발명의 항체에 접합될 수 있는 치료학적 세포독소의 다른 바람직한 예는 듀오카마이신, 칼리키아미신, 메이탄신 및 아우리스타틴, 및 이들의 유도체를 포함한다.
세포독소를 당해 분야에서 입수할 수 있는 링커 기술을 사용하여 본 발명의 항체에 접합시킬 수 있다. 세포독소를 항체에 접합시키는데 사용된 링커 유형의 예는 비제한적으로 하이드라존, 티오에테르, 에스테르, 디설파이드 및 펩티드-함유 링커를 포함한다.
본 발명의 항체를 또한 방사성 동위원소에 접합시켜 세포독성 방사성약제(또한 방사성면역접합체라 칭함)를 생성시킬 수 있다. 진단학적으로 또는 치료학적으로 사용하기 위해 항체에 접합시킬 수 있는 방사성 동위원소의 예는 비제한적으로 요오드131, 인듐111, 이트륨90 및 루테튬177을 포함한다. 방사성면역접합체의 제조 방법은 당해 분야에 확립되어 있다. 제발린(Zevalin)(상표)(IDEC 파마슈티칼스(Pharmaceuticals) 및 벡사르(Bexxar)(상표)(코릭사 파마슈티칼스(Corixa Pharmaceuticals)를 비롯하여, 방사성면역접합체의 예를 상업적으로 입수할 수 있으며, 유사한 방법을 사용하여 본 발명의 항체를 사용하는 방사성면역접합체를 제조할 수 있다.
본 발명의 항체 접합체를 주어진 생물학적 반응의 변형에 사용할 수 있으며, 약물 부분이 전통적인 화학적 치료제로 제한되는 것으로 해석해서는 안 된다. 예를 들어, 상기 약물 부분은 목적하는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 상기와 같은 단백질은 예를 들어 효소 활성 독소, 또는 그의 활성 단편, 예를 들어 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예를 들어 종양 괴사 인자 또는 인터페론-감마; 또는 생물 반응 변형제, 예를 들어 림포킨, 인터류킨-1("IL-1"), 인터류킨-2("IL-2"), 인터류킨-6("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자("G-CSF") 또는 다른 성장 인자를 포함할 수 있다.
약학 조성물
또 다른 태양에서, 본 발명은 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제형화된, 본 발명의 단클론 항체 또는 그의 항원-결합 부분(들) 중 하나 또는 조합을 함유하는 조성물, 예를 들어 약학 조성물을 제공한다. 상기와 같은 조성물은 본 발명의 (예를 들어 2개 이상의 상이한) 항체, 또는 면역접합체 또는 이중특이성 분자들 중 하나 또는 조합를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 표적 항원상의 상이한 에피토프에 결합하거나 또는 상보성 활성을 갖는 항체들(또는 면역접합체들 또는 이중특이성들)의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물을 또한 복합 요법에서, 즉 다른 작용제와 함께 투여할 수 있다. 예를 들어, 상기 복합 요법은 적어도 하나의 다른 소염제 또는 면역억제제와 함께 본 발명의 항-PD-1 항체를 포함할 수 있다. 복합 요법에 사용될 수 있는 치료제의 예를 하기 본 발명의 항체의 용도에 대한 섹션에서 보다 상세히 기재한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한 담체"는 생리학적으로 적합한 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게, 상기 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여(예를 들어 주사 또는 주입에 의해)에 적합하다. 투여 경로에 따라, 상기 활성 성분, 즉 항체, 면역복합체 또는 이중특이성 분자를, 상기 화합물을 산, 및 상기 화합물을 불활성화시킬 수도 있는 다른 자연 조건으로부터 보호하는 물질로 코팅할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다. "약학적으로 허용 가능한 염"은 모 화합물의 목적하는 생물 활성을 유지하고 어떠한 바람직하지 못한 독물학적 효과도 부여하지 않는 염을 지칭한다. 상기와 같은 염의 예는 산 부가염 및 염기 부가염을 포함한다. 산 부가염은 무독성 무기산, 예를 들어 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화 수소산, 요오드화 수소산, 아인산 등으로부터뿐만 아니라 무독성 유기산, 예를 들어 지방족 모노- 및 디카복실산, 페닐-치환된 알칸산, 하이드록시 알칸산, 방향족산, 지방족 및 방향적 설폰산 등으로부터 유래된 것들을 포함한다. 염기 부가염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터뿐만 아니라 무독성 유기 아민, 예를 들어 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유래된 것들을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 또한 약학적으로 허용 가능한 산화방지제를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 산화방지제의 예는 (1) 수용성 산화방지제, 예를 들어 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 나트륨 비설페이트, 나트륨 메타비설파이트, 나트륨 설파이트 등; (2) 유용성 산화방지제, 예를 들어 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트제, 예를 들어 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 솔비톨, 타타르산, 인산 등을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예를 들어 올리브 오일, 및 주사성 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올리에이트를 포함한다. 적합한 유동성을 예를 들어 코팅 물질, 예를 들어 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 목적하는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지시킬 수 있다.
이들 조성물은 또한 보조제, 예를 들어 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물 존재의 방지는 앞의 멸균 과정에 의해서, 및 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 포함에 의해 보장될 수 있다. 등장화제, 예를 들어 당, 염화 나트륨 등을 상기 조성물에 포함시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 또한, 주사성 약제 형태의 연장된 흡수를, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 작용제의 포함에 의해 발생시킬 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사성 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 약학적으로 활성인 물질의 상기와 같은 매질 및 작용제의 사용은 당해 분야에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 상기 활성 화합물과 상용성이지 않은 경우를 제외하고, 본 발명의 약학 조성물에의 그의 사용이 고려된다. 보충적인 활성 화합물을 또한 상기 조성물에 혼입시킬 수 있다.
치료 조성물은 전형적으로 제조 및 보관 조건하에서 멸균성이고 안정성이어야 한다. 상기 조성물을 용액, 미세유화액, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제형화할 수 있다. 상기 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)을 함유하는 용매 또는 분산 매질, 및 그의 적합한 혼합물일 수 있다. 적합한 유동성을, 예를 들어 코팅제, 예를 들어 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 목적하는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지시킬 수 있다. 다수의 경우에, 등장화제, 예를 들어 당, 다가알콜, 예를 들어 만니톨, 솔비톨 또는 염화 나트륨을 상기 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 상기 주사성 조성물의 연장된 흡수를, 상기 조성물에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 발생시킬 수 있다.
멸균 주사성 용액을, 필요한 경우 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 조합과 함께 적합한 용매 중에 필요한 양으로 상기 활성 화합물을 혼입시킨 다음 멸균 미세여과함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액을, 상기 활성 화합물을 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들 중에서 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조한다. 멸균 주사성 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 앞서 멸균-여과된 용액으로부터의 활성 성분 + 임의의 추가적인 목적하는 성분의 분말을 생성시키는 진공 건조 및 동결-건조(동결건조)이다.
단일 투여형을 생성시키기 위해 담체 물질과 병용될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 대상체, 및 특정한 투여 방식에 따라 변할 것이다. 단일 투여형을 생성시키기 위해 담체 물질과 병용될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 생성시키는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 100% 중에서, 상기량은 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 활성 성분의 약 0.01 퍼센트 내지 약 99 퍼센트, 바람직하게는 약 0.1 퍼센트 내지 약 70 퍼센트, 가장 바람직하게는 약 1 퍼센트 내지 약 30 퍼센트의 범위일 것이다.
투여량 섭생을 최적의 목적하는 반응(예를 들어 치료 반응)을 제공하기 위해 조절한다. 예를 들어 1회 일시주사를 투여하거나, 수회의 분할 용량을 시간에 걸쳐 투여하거나, 또는 상기 용량을 치료 상황의 긴급성에 의해 지시되는 대로 비례적으로 감소시키거나 증가시킬 수 있다. 비경구 조성물을 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여량 단위로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 투여량 단위형은 치료하려는 대상체에게 단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며; 각 단위는 필요한 약학 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 생성시키도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여량 단위형에 대한 명세서는 (a) 상기 활성 화합물 특유의 특성 및 성취하고자 하는 특정한 치료 효과, 및 (b) 개인의 민감성 치료를 위한 상기와 같은 활성 화합물의 배합에 대한 당해 분야 본래의 제한에 의해서 및 이에 따라 직접 지시된다.
상기 항체의 투여를 위해서, 투여량 범위는 숙주 체중의 약 0.0001 내지 100 ㎎/㎏, 및 보다 대개는 0.01 내지 5 ㎎/㎏의 범위이다. 예를 들어 투여량은 0.3 ㎎/㎏ 체중, 1 ㎎/㎏ 체중, 3 ㎎/㎏ 체중, 5 ㎎/㎏ 체중 또는 10 ㎎/㎏ 체중이거나, 1 내지 10 ㎎/㎏의 범위이내 일 수 있다. 예시적인 치료 섭생은 주당 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 1개월에 1회, 3개월마다 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회의 투여를 수반한다. 본 발명의 항-PD-1 항체에 대한 바람직한 투여량 섭생은 정맥내 투여를 통한 1 ㎎/㎏ 체중 또는 3 ㎎/㎏ 체중을 포함하며, 이때 상기 항체는 하기의 투여 스케줄 중 하나를 사용하에 제공된다: (i) 6회의 투여량에 대해서 4주마다, 이어서 3개월마다; (ii) 3주마다; (iii) 3 ㎎/㎏ 체중 1회, 이어서 3주마다 1 ㎎/㎏ 체중.
한편으로, 항체를 서방성 제형으로서 투여할 수 있으며, 이 경우 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량 및 빈도는 환자에서 상기 항체의 반감기에 따라 변한다. 일반적으로, 인간 항체가 가장 긴 반감기를 보이며, 이어서 인간화된 항체, 키메릭 항체 및 비인간 항체의 순이다. 상기 투여량 및 투여 빈도는 상기 치료가 예방학적인지 치료학적인지에 따라 변할 수 있다. 예방학적 용도에서, 비교적 낮은 투여량이 긴 기간에 걸쳐 비교적 빈번하지 않은 간격으로 투여된다. 일부 환자는 그의 남은 생애 동안 계속해서 치료를 받는다. 치료학적 용도에서, 비교적 짧은 간격으로 비교적 높은 투여량이 때때로, 질병의 진행이 감소되거나 종료될 때까지 및 바람직하게는 환자가 질병 증상의 부분적인 또는 완전한 개선을 보일 때까지 요구된다. 그 후에, 상기 환자에게 예방학적 섭생이 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물 중의 활성 성분의 실제 투여량 수준을, 특정 환자에게 상기 환자에 대한 독성 없이 목적하는 치료 반응, 조성 및 투여 방식을 성취하기에 유효한 활성 성분의 양을 획득하기 위해 변화시킬 수 있다. 상기 선택된 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 특정 조성물, 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 분비 속도, 치료 지속기간, 사용되는 특정 조성물과 함께 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 조건, 일반적인 건강 및 선행 병력, 및 의학 분야에 주지된 유사한 인자들을 포함한 다양한 약동학적 인자들에 따라 변할 것이다.
본 발명의 항-PD-1 항체의 "치료학적으로 유효한 투여량"은 바람직하게는 질병 증상의 중증도의 감소, 질병 무증상 기간의 빈도 및 지속기간의 증가, 또는 질병 고통으로 인한 장애 또는 불구의 예방을 생성시킨다. 예를 들어, 종양 치료의 경우, "치료학적으로 유효한 투여량"은 바람직하게는 세포 성장 또는 종양 성장을 치료되지 않은 대상체에 비해 적어도 약 20%까지, 보다 바람직하게는 적어도 약 40%까지, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 60%까지, 및 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 80%까지 억제한다. 종양 성장을 억제하는 화합물의 능력을 인간 종양에서의 효능을 예견하는 동물 모델 시스템에서 평가할 수 있다. 한편으로, 조성물의 상기 성질을 숙련의에게 공지된 분석에 의해 상기 화학물의 억제 능력, 시험관내 상기와 같은 억제를 검사함으로써 평가할 수 있다. 치료 화합물의 치료 유효량은 대상체에서 종양 크기를 감소시키거나, 또는 달리 증상을 개선시킬 수 있다. 당해 분야의 통상적인 숙련가는 상기 대상체의 크기, 상기 대상체의 증상의 중증도, 및 선택된 특정 조성물 또는 투여 경로와 같은 인자들을 근거로 상기와 같은 양을 결정할 수 있을 것이다.
또 다른 태양에서, 본 명세는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-PD-1 항체 및 항-CTLA-4 항체를 포함하는 부분들의 약제 키트를 제공한다. 상기 키트는 또한 과증식성 질병(예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 암)의 치료에 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항-PD-1 및 항-CTLA-4 항체를 단위 투여형으로 함께 패키징할 수도 있다.
몇몇 실시태양에서, 상이한 결합 특이성을 갖는 2개 이상의 단클론 항체(예를 들어 항-PD-1 및 항-CTLA-4)를 동시에 투여하며, 이 경우에 투여되는 각 항체의 투여량은 지시된 범위내에 있다. 항체를 단일 용량으로서 투여하거나 또는 보다 통상적으로는 수시로 투여할 수 있다. 단일 투여량간의 간격은 예를 들어 매주, 매월, 3개월마다 또는 매년일 수 있다. 간격은 또한 환자 중의 표적 항원에 대한 항체의 혈액 수준을 측정함으로써 지시되는 바와 같이 불규칙적일 수 있다. 일부의 방법에서, 투여량을 약 1 내지 1000 ㎍/㎖ 및 일부의 방법에서 약 25 내지 300 ㎍/㎖의 혈장 항체 농도가 성취되도록 조절한다.
본 발명의 조성물을 당해 분야에 공지된 다양한 방법들 중 하나 이상을 사용하여 하나 이상의 투여 경로를 통해 투여할 수 있다. 숙련가에 의해 인식되는 바와 같이, 상기 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 변할 것이다. 본 발명의 항체의 바람직한 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 투여를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "비경구 투여"란 어구는 장 및 국소 투여 외의 투여 방식, 대개는 주사에 의한 투여 방식을 의미하며, 비제한적으로 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 낭내, 안내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
한편으로, 본 발명의 항체를 비-비경구 경로, 예를 들어 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어 비내, 경구, 질내, 직장내, 설하 또는 국소로 투여할 수 있다.
상기 활성 화합물을 빠른 방출에 대해 상기 화합물을 보호하는 담체와, 예를 들어 임플란트, 경피 패치 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 포함한 조절된 방출 제형으로 제조할 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 다중무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오쏘에스테르, 및 폴리락트산을 사용할 수 있다. 상기와 같은 제형의 다수의 제조 방법이 특허되거나 당해 분야의 숙련가들에게 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조하시오.
치료 조성물을 당해 분야에 공지된 의학적 장치들로 투여할 수 있다.
본 발명의 용도 및 방법
본 발명의 항체, 항체 조성물 및 방법은 예를 들어 PD-1의 검출 또는 PD-1의 봉쇄에 의한 면역 반응의 증대를 수반하는 다양한 시험관내 및 생체내 유용성을 갖는다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 항체는 인간 항체이다. 예를 들어, 상기 분자를 배양물 중의 세포에, 시험관내 또는 생체외에서, 또는 인간 대상체에게, 예를 들어 생체내에서 투여하여 다양한 상황에서 면역성을 증대시킬 수 있다. 상응하게, 하나의 태양에서, 본 발명은 대상체에게, 상기 대상체에서 면역 반응이 변형되도록 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 투여함을 포함하는, 상기 대상체에서 상기 면역 반응을 변형시키는 방법을 제공한다. 바람직하게, 상기 반응은 증대되거나, 자극되거나 또는 상향-조절된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "대상체"란 용어는 인간 및 비-인간 동물을 포함하고자 한다. 비-인간 동물은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예를 들어 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류 및 파충류를 포함하지만 포유동물, 예를 들어 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이 소 및 말이 바람직하다. 바람직한 대상체는 면역 반응의 증대가 필요한 인간 환자를 포함한다. 상기 방법은 T-세포 매개된 면역 반응을 증대시킴으로써 치료될 수 있는 질환을 갖는 인간 환자의 치료에 특히 적합하다. 특정한 실시태양에서, 상기 방법은 생체내에서 암세포의 치료에 특히 적합하다. 면역성의 항원-특이성 증대를 성취하기 위해서, 상기 항-PD-1 항체를 관심 항원과 함께 투여할 수 있다. PD-1에 대한 항체를 또 다른 작용제와 함께 투여할 때, 상기 둘을 어느 한 순서로 또는 동시에 투여할 수 있다.
본 발명은 샘플 중의 인간 PD-1 항원의 존재를 검출하거나, 또는 인간 PD-1 항원의 양을 측정하기 위한 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 상기 샘플 및 대조용 샘플을, 인간 PD-1에 특이적으로 결합하는 인간 단클론 항체, 또는 그의 항원-결합 부분과, 상기 항체 또는 그의 부분 및 인간 PD-1간의 복합체의 형성을 허용하는 조건하에서 접촉시킴을 포함한다. 이어서 상기 복합체의 형성을 검출하며, 여기에서 상기 대조용 샘플과 비교된 상기 샘플간의 상이한 복합체 형성은 상기 샘플 중 인간 PD-1 항원의 존재를 가리킨다.
CD28, ICOS 및 CTLA-4에 비해, PD-1에 대한 본 발명의 항체의 특이적인 결합을 고려하여, 본 발명의 항체를 세포 표면상의 PD-1 발현을 특이적으로 검출하는데 사용할 수 있으며, 더욱이 면역친화성 정제를 통해 PD-1을 정제하는데 사용할 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 대상체에서 면역 반응을 변형시키기 위한 약제의 제조에서 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 용도를 제공한다.
암
항체에 의한 PD-1의 봉쇄는 환자에서 암세포에 대한 면역반응을 증대시킬 수 있다. PD-1에 대한 리간드, PD-L1은 정상적인 인간 세포에서 발현되지 않고, 다양한 인간 암에 풍부하다(Dong et al. (2002) Nat Med 8:787-9). 상기 PD-1과 PD-L1간의 상호작용은 종양 침윤성 림프구의 감소, T-세포 수용체 매개된 증식의 감소, 및 암성 세포에 의한 면역 회피를 생성시킨다(Dong et al. (2003) J Mol Med 81:281-7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100). PD-L1에 대한 PD-1의 국소적인 상호작용을 억제시킴으로써 면역 억제를 역전시킬 수 있으며, 그 효과는 PD-L2에 대한 PD-1의 상호작용을 또한 차단할 때 부가된다. 선행 연구들이 PD-L1에 대한 PD-1의 상호작용을 억제시킴으로써 T-세포 증식을 복원시킬 수 있음을 입증하였지만, PD-1/PD-L1 상호작용의 차단에 의한 생체내 암 종양 성장에 대한 직접적인 효과에 대한 보고서는 없었다. 하나의 태양에서, 본 발명은 암성 종양의 성장이 억제되도록 항-PD-1 항체를 사용하는 대상체의 생체내 치료에 관한 것이다. 항-PD-1 항체를 단독으로 사용하여 암성 종양의 성장을 억제시킬 수 있다. 한편으로, 항-PD-1 항체를 하기에 기재하는 바와 같은 다른 면역원성 인자, 표준 암 치료, 또는 다른 항체와 함께 사용할 수 있다.
상응하게, 하나의 실시태양에서, 본 발명은 대상체에게 치료 유효량의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 투여함을 포함하는, 상기 대상체에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 항체를 사용하여 성장을 억제시킬 수 있는 바람직한 암은 면역요법에 전형적으로 반응성인 암을 포함한다. 치료하기에 바람직한 암의 비제한적인 예는 흑색종(melanoma)(예를 들어 전이성 악성 흑색종(metastatic malignant melanoma)), 신장암(renal cancer)(예를 들어 투명세포 암종(clear cell carcinoma)), 전립선암(prostate cancer)(예를 들어 호르몬 불응성 전립선 선암종(hormone refractory prostate adenocarcinoma)), 유방암(breast cancer), 결장암(colon cancer) 및 폐암(lung cancer)(예를 들어 비-소세포 폐암(non-small cell lung cancer))을 포함한다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 항체를 사용하여 성장을 억제시킬 수 있는 불응성 또는 재발성 암을 포함한다.
본 발명의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 다른 암의 예는 골암(bone cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 피부암(skin cancer), 두경부암(cancer of the head or neck), 피부 또는 안내 악성 흑색종(cutaneous or intraocular malignant melanoma), 자궁암(uterine cancer), 난소암(ovarian cancer), 직장암(rectal cancer), 항문 부위암(cancer of the anal region), 위암(stomach cancer), 고환암(testicular cancer), 자궁암, 나팔관 암종(carcinoma of the fallopian tubes), 자궁내막 암종(carcinoma of the endometrium), 자궁경부 암종(carcinoma of the cervix), 질암종(carcinoma of the vagina), 음문 암종(carcinoma of the vulva), 호지킨병(Hodgkin's Disease), 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 식도암(cancer of the esophagus), 소장암(cancer of the small intestine), 내분비계암(cancer of the endocrine system), 갑상샘암(cancer of the thyroid gland), 부갑상샘암(cancer of the parathyroid gland), 부신암(cancer of the adrenal gland), 연조직 육종(sarcoma of soft tissue), 요도암(cancer of the urethra), 음경암(cancer of the penis), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia), 급성 림프모구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia), 만성 림프구성 백혈병( chronic lymphocytic leukemia)을 포함한 만성 및 급성 백혈병, 유년기 고형 종양(solid tumors of childhood), 림프구성 림프종(lymphocytic lymphoma), 방광암(cancer of the bladder), 신장 또는 요관암(cancer of the kidney or ureter), 신우 암종(carcinoma of the renal pelvis), 중추신경계(CNS)의 신생물(neoplasm of the central nervous system(CNS)), 원발성 CNS 림프종(primary CNS lymphoma), 종양 혈관형성(tumor angiogenesis), 척추 축 종양(spinal axis tumor), 뇌간 신경교종(brain stem glioma), 뇌하수체 선종(pituitary adenoma), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 상피암(epidermoid cancer), 편평세포암(squamous cell cancer), T-세포 림프종(T-cell lymphoma), 석면에 의해 유발된 것들을 포함한 환경적으로 유발된 암 및 상기 암들의 조합을 포함한다. 본 발명은 또한 전이암, 특히 PD-L1을 발현하는 전이암의 치료에 유용하다(Iwai et al. (2005) Int. Immunol. 17:133-144).
임의로, PD-1에 대한 항체를 면역원성 인자, 예를 들어 암세포, 정제된 종양 항원(재조합 단백질, 펩티드 및 탄수화물 분자 포함), 세포, 및 면역자극성 사이토킨을 암호화하는 유전자에 의해 형질감염된 세포와 병용할 수 있다(He et al (2004) J. Immunol. 173:4919-28). 사용될 수 있는 종양 백신의 비제한적인 예는 흑색종 항원의 펩티드, 예를 들어 gp100의 펩티드, MAGE 항원, Trp-2, MART1 및/또는 티로신, 또는 사이토킨 GM-CSF를 발현하도록 형질감염된 종양 세포를 포함한다.
인간에서, 일부 종양은 흑색종과 같이 면역원성인 것으로 나타났다. PD-1 봉쇄에 의해 T 세포 활성화의 한계를 상승시킴으로써, 우리는 숙주에서 종양 반응이 활성화할 것을 예상할 수 있음이 기대된다.
숙주 면역 반응성을 활성화시키기 위해 사용될 수 있는 다른 항체를 항-PD-1과 함께 사용할 수 있다. 여기에는 DC 기능 및 항원 제공을 활성화하는 수지상 세포 표면상의 분자가 포함된다. 항-CD40 항체는 T 세포 헬퍼 활성을 유효하게 대체할 수 있으며(Ridge, J. et al. (1998) Nature 393: 474-478) PD-1 항체와 함께 사용될 수 있다(Ito, N. et al. (2000) Immunobiology 201 (5) 527-40). T 세포 보조자극 분자, 예를 들어 CTLA-4, OX-40(Weinberg, A. et al. (2000) Immunol 164: 2160-2169), 4-1BB(Melero, I. et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997), 및 ICOS(Hutloff, A. et al. (1999) Nature 397: 262-266)에 대한 활성화 항체가 또한 T 세포 활성화의 증가된 수준을 제공할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 대상체에서 종양 세포의 성장을 억제하기 위한 약제의 제조에서 치료 유효량의 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 용도를 제공한다.
감염성 질병
본 발명의 다른 방법들을 사용하여 특정한 독소 또는 병원체에 노출된 환자를 치료한다. 상응하게, 본 발명의 또 다른 태양은 대상체에게, 상기 대상체가 감염성 질병에 대해 치료되도록 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 투여함을 포함하는, 상기 대상체에서 감염성 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
항체 매개된 PD-1 봉쇄를 단독으로 또는 보조제로서 백신과 함께 사용하여 병원체, 독소, 및 자기-항원에 대한 면역 반응을 자극할 수 있다. 이러한 치료학적 접근법이 특히 유용할 수 있는 병원체의 예는 현재 유효 백신이 존재하지 않는 병원체, 또는 통상적인 백신이 완전하게 유효하지 않은 병원체를 포함한다. 여기에는 비제한적으로 HIV, 간염(A, B & C), 인플루엔자, 헤르페스, 지아르디아, 말라리아, 리슈마니아, 스타필로코커스 아우레우스, 슈도모나스 아에루기노사가 있다. PD-1 봉쇄가, 상기 감염 과정에 걸쳐 변경된 항원을 제공하는 HIV와 같은 감염인자들에 의해 확립된 감염에 특히 유용하다. 이들 신규의 에피토프는 항-인간 PD-1 투여시에 이물질로서 인식되며, 따라서 PD-1을 통한 음성 신호에 의해 꺾어지지 않는 강한 T 세포 반응을 유발시킨다.
본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 감염을 일으키는 병원성 바이러스의 일부 예는 HIV, 간염(A, B 또는 C), 헤르페스 바이러스(예를 들어 VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II 및 CMV, 엡스타인 바 바이러스), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕삭키 바이러스, 코르노바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 볼거리 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파르보바이러스, 우두 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기 바이러스, 유두종바이러스, 연속종 바이러스, 폴리오바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스 및 아르보바이러스성 뇌염 바이러스를 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 감염을 일으키는 병원성 세균의 일부 예는 클라미디아, 리켓차 세균, 마이코박테리아, 스타필로코커스, 스트렙토코커스, 뉴모노코커스, 메닝고코커스 및 코노코커스, 클렙시엘라, 프로테우스, 세라티아, 슈도모나스, 레지오넬라, 디프테리아, 살모넬라, 바실러스, 콜레라, 파상풍, 보툴리누스중독, 탄저병, 흑사병, 렙토스피라증, 및 라임병 세균을 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 감염을 일으키는 병원성 진균의 일부 예는 칸디다(Candida)(알비칸스(albicans), 크루세이(krusei), 글라브라타(glabrata), 트로피칼리스(tropicalis) 등), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 아스퍼질러스(Aspergillus)(푸미가투스(fumigatus), 니거(niger) 등), 뮤코랄레스(Mucorales) 속(뮤코르(mucor), 아브시디아(absidia), 리조푸스(rhizophus), 스포로트릭스 스켄키이(Sporothrix schenkii), 블라스토마이세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis), 콕시디오이데스 임미티스(Coccidioides immitis) 및 히스토플라스마 카프슐라툼(Histoplasma capsulatum)을 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 감염을 일으키는 병원성 기생충의 일부 예는 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica), 발란티디움 콜라이(Balantidium coli), 나에글레리아파울레리(Naegleriafowleri), 아칸타모에바 스페시즈(Acanthamoeba sp.), 지아르디아 람비아(Giardia lambia), 크립토스포리디움 스페시즈(Cryptosporidium sp.), 뉴모시스티스 카리니이(Pneumocystis carinii), 플라스모디움 비박스(Plasmodium vivax), 바베시아 미크로티(Babesia microti), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 레이슈마니아 도노바니(Leishmania donovani), 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondi), 및 니포스트롱길루스 브라실리엔시스(Nippostrongylus brasiliensis)를 포함한다.
상기 방법들 모두에서, PD-1 봉쇄를 다른 형태의 면역요법, 예를 들어 사이토킨 치료(예를 들어 인터페론, GM-CSF, G-CSF, IL-2) 또는 이중특이성 항체 요법(종양 항원의 증대된 제공을 제공한다)과 병행할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시태양은 대상체에서 감염성 질병의 치료를 위한 약제의 제조에서 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-PD-1 항체, 또는 그의 항원-결합 부분의 용도를 제공한다.
본 발명의 키트
또 다른 태양에서, 본 명세는 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 키트를 제공한다. 상기 키트는 또한 사용 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 태양에서, 상기 키트를 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법 또는 용도 중 어느 하나에 사용할 수 있다.
본 명세서에 예시적으로 기재된 발명을 본 명세서에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재하에서 적합하게 실행할 수 있다. 따라서, 예를 들어 "포함하는", "비롯한", "함유하는" 등의 용어들을 광범위하게 제한없이 판독할 것이다. 추가로, 본 명세서에 사용된 용어 및 표현은 설명을 위한 용어로서 제한 없이 사용되었으며 상기와 같은 용어 및 표현의 사용에, 도시되고 기재된 특징들 또는 그의 부분들의 임의의 균등물을 제외하고자 하지 않지만, 청구된 발명의 범위내에 다양한 변형들이 가능함을 인지한다. 따라서, 본 발명을 바람직한 실시태양 및 임의의 특징들에 의해 구체적으로 개시하였지만, 본 명세서에 개시된 상기 중에서 실현된 발명의 변형 및 변화가 당해 분야의 숙련가들에 의해 복원될 수 있으며 상기와 같은 변형 및 변화는 본 발명의 범위내에 있는 것으로 간주됨은 물론이다.
본 발명을 본 명세서에 광범위하고 일반적으로 기재하였다. 포괄적인 명세내에 있는 보다 좁은 종 및 아속 그룹들은 각각 본 발명의 부분을 또한 형성한다. 상기는 삭제된 물질이 본 명세서에 구체적으로 인용되는지의 여부에 관계없이 상기 속으로부터 임의의 발명의 요지를 제거하는 단서 조항 또는 음의 제한과 함께 본 발명의 일반적인 기재를 포함한다.
다른 실시태양들은 하기의 청구항 및 비제한적인 실시예내에 있다. 또한, 본 발명의 특징 또는 태양을 마쿠시 그룹에 의해 기재하는 경우, 당해 분야의 숙련가들은 본 발명이 또한 상기 마쿠시 그룹의 임의의 개별적인 구성원 또는 구성원들의 하위그룹에 의해 기재됨을 알 것이다.
실험 섹션
본 발명의 상이한 특징들을 추가로 예시하는 실시예들을 하기에 제공한다. 상기 실시예들은 또한 본 발명의 유용한 실시 방법을 예시한다. 이들 실시예는 청구된 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1. PD-1-Fc 및 PD-L1-Fc의 구성 및 발현
5' 단부에 Hind III 부위 및 3' 단부에 EcoRI 부위를 갖는, 인간 Fc에 융합된 인간 PD-1의 세포외 영역을 암호화하는 cDNA를 함유하는 DNA(서열번호 11)를 합성하였다. 상기 DNA를 Hind III 및 EcoRI로 절단하고 이어서 pcDNA3.1(+) 벡터(인비트로젠)(동일한 제한 효소들로 절단되었다)내로 클로닝하여, 발현 벡터 pcDNA3.1(+)-PD-1-Fc를 생성시켰다. 적합한 pcDNA3.1(+)-PD-1-Fc 발현 벡터를 리포펙타민 2000 시약(인비트로젠)을 사용하여 CHO-K1 세포(ATCC)내로 형질감염시켰다. 안정한 형질감염체를 500 ㎍/㎖ G418의 존재하에서 제한 희석에 의해 단리하였다. 최고량의 PD-1-Fc 단백질을 생성시키는 클론을 선택하고 무혈청 배지에서 증식시켰다. 최종적으로, 상기 PD-1-Fc 단백질을 상기 무혈청 배양 상등액으로부터 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제시켰다. 단백질 농도를 280 ㎚에서 흡광도에 의해 측정하였다. 상기 PD-1-Fc 융합 단백질의 아미노산 서열을 서열번호 23에 나타내었다.
5' 단부에 Hind III 부위 및 3' 단부에 EcoRI 부위를 갖는, 인간 Fc에 융합된 인간 PD-L1의 세포외 영역을 암호화하는 cDNA를 함유하는 DNA(서열번호 12)를 합성하였다. 상기 DNA를 Hind III 및 EcoRI로 절단하고 이어서 pcDNA3.1(+) 벡터(인비트로젠)(동일한 제한 효소들로 절단되었다)내로 클로닝하여, 발현 벡터 pcDNA3.1(+)-PD-L1-Fc를 생성시켰다. 적합한 pcDNA3.1(+)-PD-L1-Fc 발현 벡터를 리포펙타민 2000 시약(인비트로젠)을 사용하여 CHO-K1 세포(ATCC)내로 형질감염시켰다. 안정한 형질감염체를 500 ㎍/㎖ G418의 존재하에서 제한 희석에 의해 단리하였다. 최고량의 PD-L1-Fc 단백질을 생성시키는 클론을 선택하고 무혈청 배지에서 증식시켰다. 최종적으로, 상기 PD-L1-Fc 단백질을 상기 무혈청 배양 상등액으로부터 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제시켰다. 단백질 농도를 280 ㎚에서 흡광도에 의해 측정하였다. 상기 PD-L1-Fc 융합 단백질의 아미노산 서열을 서열번호 24에 나타내었다.
실시예 2. CHO 세포상에서 발현된 PD-1에 대한 PD-L1-Fc 결합의 특성화
세포 표면에서 재조합 인간 PD-1을 발현하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주를 개발하고 유식 세포측정에 의해 PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 측정하는데 사용하였다. 5' 단부에 Hind III 부위 및 3' 단부에 EcoRI 부위를 갖는, 완전길이 인간 PD-1을 암호화하는 cDNA를 함유하는 DNA(서열번호 13)를 합성하였다. 상기 DNA를 Hind III 및 EcoRI로 절단하고 이어서 pcDNA3.1(+) 벡터(인비트로젠)(동일한 제한 효소들로 절단되었다)내로 클로닝하여, 발현 벡터 pcDNA3.1(+)-PD-1을 생성시켰다. 적합한 pcDNA3.1(+)-PD-1 발현 벡터를 리포펙타민 2000 시약(인비트로젠)을 사용하여 CHO-K1 세포(ATCC)내로 형질감염시켰다. 안정한 형질감염체를 500 ㎍/㎖ G418의 존재하에서 제한 희석에 의해 단리하였다. 상기 완전길이 인간 PD-1의 아미노산 서열을 서열번호 14에 나타내었다. PD-L1-Fc 재조합 단백질을 비오틴 단백질 표지화 키트(롯슈(Roche))를 사용하여 비오틴으로 표지하였다. PD-1에 대한 PD-L1의 결합을, 상기 PD-1-형질감염된 CHO 세포(CHO/PD-1)와 상이한 농도의 비오틴-표지된 PD-L1-Fc(비오틴-PD-L1-Fc)를 배양시킴으로써 평가하였다. 상기 세포를 세척하고 결합을 아비딘-FITC로 검출하였다. 유식 세포측정 분석을 FACScan 유식 세포측정(벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))을 사용하여 수행하였다. 도 1A 및 1B에 도시된 결과는 비오틴-PD-L1-Fc가 CHO/PD-1 세포에 유효하게 결합할 수 있음을 가리켰다.
실시예 3. PD-L1-Fc에 대한 PD-1-Fc 결합의 특성화
PD-1-Fc 재조합 단백질을 비오틴 단백질 표지화 키트(롯슈)를 사용하여 비오틴으로 표지하였다. 상이한 농도의 비오틴-표지된 PD-1-Fc(PD-1-Fc-비오틴)를 PD-L1-Fc로 코팅된 96-웰 플레이트에 가한 다음, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 세척 후에, 아비딘-HRP를 가하고 상기 플레이트를 1시간 동안 추가로 배양하였다. 최종적으로, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)에 대한 기질로서 가하고, 흡광도를 450 ㎚에서 측정하였다. 도 2에 도시된 결과는 비오틴-PD-1-Fc가 PD-L1-Fc에 유효하게 결합할 수 있음을 가리켰다.
실시예 4. PD-1에 대한 단클론 항체의 생성
PD-1에 대한 단클론 항체를 생성시키기 위해서, 6주 된 암컷 BALB/c 마우스를 완전 프로인트 항원보강제(시그마 알드리치(Sigma-Aldrich)) 중의 재조합 PD-1-Fc 단백질로 3회 피하 면역시켰다. 최종 추가면역 후 4일째에, 상기 마우스를 죽이고 비장세포를 SP2/0 세포와 융합시켰다. 상기 융합된 세포를 하이포잔틴/아미노프테린/티미딘(HAT) 선택성 배지에 현탁시키고 96-웰 마이크로리터 플레이트에 도말하였다. 12일 후에, 항-PD-1 항체-생성 하이브리도마 클론을 인간 PD-1에 대한 특이적인 결합에 대해 선택하였다. 하나의 하이브리도마 세포주(인간 PD-1을 인식하는 mAb를 분비하였다)를 확립시키고 67D9라 명명하였다. 상기 67D9 항체 아이소타입은 마우스 Ab 아이소타이핑 키트(시그마)에 의해 (IgG2a, κ)인 것으로 판정되었다. 최종적으로, 상기 67D9 항체를 하이브리도마 세포 배양 상등액으로부터 단백질 G 친화성 크로마토그래프에 의해 정제하였다.
실시예 5. 67D9 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자의 클로닝
RNA를 TRIzolReagent(인비트로젠)로 67D9 하이브리도마 세포로부터 단리하였다. 67D9의 경쇄 및 중쇄에 대한 가변 영역 cDNA를 제조사의 설명에 따라 5'RACE 시스템(인비트로젠)에 의해 상기 하이브리도마 세포로부터 클로닝시켰다. 67D9 중쇄의 PCR 증폭을 위한 유전자-특이성 프라이머(GSP)는 하기와 같았다: GSP1-H, 5'-AGC TGG GAA GGT GTG CAC ACC ACT-3'; GSP2-H, 5'-CAG AGT TCC AGG TCA AGG TCA-3'; GSP3-H, 5'-CTT GAC CAG GCA TCC TAG AGT-3'. 67D9의 경쇄 가변 영역의 PCR 증폭에 사용된 GSP는 하기와 같았다: GSP1-L, 5'-TTG CTG TCC TGA TCA GTC CAA CT-3'; GSP2-L, 5'-TGT CGT TCA CTG CCA TCA ATC TT-3'; GSP3-L, 5'-TTG TTC AAG AAG CAC ACG ACT GA-3'. 최종 PCR 산물을 서열 측정을 위해 pGEM-T 벡터(프로메가(Promega))내에 클로닝시켰다. 67D9의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 각각 서열번호 15 및 16에 나타낸다. 67D9의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 각각 서열번호 17 및 18에 나타낸다.
실시예 6. 67D9 키메릭 항체의 구성 및 발현
5' 단부에 Hind III 부위 및 3' 단부에 EcoRI 부위를 갖는, 67D9 키메릭 항체(c67D9)를 암호화하는 cDNA를 함유하는 DNA(서열번호 19)를 합성하였다. 상기 DNA를 Hind III 및 EcoRI로 절단하고 이어서 pcDNA3.1(+) 벡터(인비트로젠)(동일한 제한 효소들로 절단되었다)내로 클로닝하여, 발현 벡터 pcDNA3.1(+)-c67D9H를 생성시켰다. 5' 단부에 Hind III 부위 및 3' 단부에 EcoRI 부위를 갖는, c67D9 경쇄를 암호화하는 cDNA를 함유하는 DNA(서열번호 20)를 합성하였다. 상기 DNA를 Hind III 및 EcoRI로 절단하고 이어서 pcDNA3.1(+) 벡터(인비트로젠)(동일한 제한 효소들로 절단되었다)내로 클로닝하여, 발현 벡터 pcDNA3.1(+)-c67D9L을 생성시켰다. 적합한 pcDNA3.1(+)-c67D9H 및 pcDNA3.1(+)-c67D9L 발현 벡터를 리포펙타민 2000 시약을 사용하여 CHO-K1 세포내로 동시-형질감염시켰다. 안정한 형질감염체를 500 ㎍/㎖ G418의 존재하에서 제한 희석에 의해 단리하였다. 최고량의 c67D9를 생성시키는 클론을 선택하고 무혈청 배지에서 증식시켰다. 최종적으로, c67D9를 상기 무혈청 배양 상등액으로부터 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제시켰다. 항체 농도를 280 ㎚에서 흡광도에 의해 측정하였다. 상기 c67D9 중쇄의 아미노산 서열을 서열번호 21에 나타내고 상기 c67D9 경쇄의 아미노산 서열을 서열번호 22에 나타내었다.
실시예 7. 항-PD-1 단클론 항체 67D9의 인간화
단백질 데이터 뱅크(PDB)를 67D9의 가변 단편(Fv)과 높은 서열 일치성을 갖는 항체 서열에 대해 검색하였다. 2개의 별도의 BLASTP 검색을 67D9의 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)에 대해 수행하였다. 항체 1HOD(PDB No.1HOD)는 67D9의 VH와 83% 일치성을 나타내고 67D9의 VL과 90% 일치성을 나타낸다. 우리는 상기 67D9의 VH 및 VL의 주형으로서 1HOD를 선택하였다. 상동성 모델링(인사이트(INSIGHT) II 2003, 액셀리스(Accelrys), 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)에 의해 상기 67D9 Fv의 3차원 구조를 구성하기 위해서, 상기 67D9의 VL 및 VH 서열과 이들의 주형을 각각 정렬시켰다. 구조적으로 보존된 영역들의 좌표를 상기 주형으로부터 지정하고 고리 영역을 인사이트 II의 상동성 프로그램에 의해 생성시켰다. 새로 형성된 구조에 분자 동역학 시뮬레이션을 수행하고 1000 단계의 최급강하법, 및 이어서 디스커버(Discover) 프로그램을 사용하는 접합체 구배 방법에 의해 에너지-최소화하였다. 최종적으로, 상기 67D9의 가변 영역의 분자 모델을 인사이트 II 분자 모델링 소프트웨어에 의해 수득하였다.
경쇄 하위그룹 카파 III(humκIII) 및 중쇄 하위그룹 III(humIII)의 인간 공통 서열을 각각 67D9의 인간화된 버전의 중쇄 및 경쇄에 대한 인간 프레임워크로서 선택하였다(도 3). 상기 인간화된 항체 중의 상보성-결정 영역(CDR)을 마우스 항체 67D9 중의 것과 일치하도록 선택하였다. 상기 67D9 Fv의 분자 모델은 67D9와 인간 항체 주형간에 상이한 8개의 프레임워크 영역(FR) 잔기가 상기 CDR의 5 Å 이내에 있으며 추정상 상기 CDR의 구조에 영향을 미치는 것을 입증하였다. 따라서, 상기 인간화된 67D9 항체(hu67D9) 중의 이들 8개의 FR 잔기는 인간 항체 잔기보다는 오히려 쥐 67D9 잔기로 선택되었다(도 3). 상기 hu67D9 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 각각 서열번호 7 및 서열번호 8에 나타내었다. 상기 hu67D9 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 각각 서열번호 9 및 서열번호 10에 나타내었다.
실시예 8. 항-PD-1 인간화된 항체 hu67D9의 발현
5' 단부에 Hind III 부위 및 3' 단부에 EcoRI 부위를 갖는, hu67D9 중쇄를 암호화하는 cDNA를 함유하는 DNA(서열번호 25)를 합성하였다. 상기 DNA를 Hind III 및 EcoRI로 절단하고 이어서 pcDNA3.1(+) 벡터(인비트로젠)(동일한 제한 효소들로 절단되었다)내로 클로닝하여, 발현 벡터 pcDNA3.1(+)-hu67D9H를 생성시켰다. 5' 단부에 Hind III 부위 및 3' 단부에 EcoRI 부위를 갖는, hu67D9 경쇄를 암호화하는 cDNA를 함유하는 DNA(서열번호 27)를 합성하였다. 상기 DNA를 Hind III 및 EcoRI로 절단하고 이어서 pcDNA3.1(+) 벡터(인비트로젠)(동일한 제한 효소들로 절단되었다)내로 클로닝하여, 발현 벡터 pcDNA3.1(+)-hu67D9L을 생성시켰다. 적합한 pcDNA3.1(+)-hu67D9H 및 pcDNA3.1(+)-hu67D9L 발현 벡터를 리포펙타민 2000 시약을 사용하여 CHO-K1 세포내로 동시-형질감염시켰다. 안정한 형질감염체를 500 ㎍/㎖ G418의 존재하에서 제한 희석에 의해 단리하였다. 최고량의 hu67D9를 생성시키는 클론을 선택하고 무혈청 배지에서 증식시켰다. 최종적으로, hu67D9를 상기 무혈청 배양 상등액으로부터 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제시켰다. 항체 농도를 280 ㎚에서 흡광도에 의해 측정하였다. 상기 hu67D9 중쇄의 아미노산 서열을 서열번호 26에 나타내고 상기 hu67D9 경쇄의 아미노산 서열을 서열번호 28에 나타내었다.
실시예 9. 결합 친화성 측정.
67D9, c67D9 및 hu67D9의 결합 친화성을 홀래쉬(Holash)와 동료들(Holash J, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99(17):11393-8)에 의해 기재된 유사한 방법을 사용하여 측정하였다. 간단히, 고정된 농도의 항-PD-1 항체를 상이한 농도의 PD-1-Fc와 1시간 동안 배양하였다. 이어서 상기 혼합물을 PD-1-Fc로 코팅된 96-웰 플레이트에 가한 다음 1시간 동안 배양하였다. 세척 후에, HRP-접합된 염소 항-인간 카파(c67D9 또는 hu67D9의 검출을 위해) 또는 HRP-접합된 염소 항-마우스 카파(67D9의 검출을 위해)를 가하고 상기 플레이트를 1시간 동안 추가로 배양하였다. 최종적으로, TMB를 HRP에 대한 기질로서 가하고, 흡광도를 450 ㎚에서 측정하였다. 우리의 결과는 67D9, c67D9 및 hu67D9의 결합 친화성이 각각 12.4 pM, 16.9 pM 및 15.4 pM임을 가리켰다.
실시예 10. 항-PD-1 항체에 의한 PD-1-발현 CHO-K1 세포에의 PD-L1 결합의 차단
항-PD-1 항체 67D9, c67D9 및 hu67D9를 유식 세포측정 분석을 사용함으로써, 형질감염된 CHO-K1 세포상에서 발현된 PD-1(CHO/PD-1)에의 PD-L1의 결합을 차단하는 능력에 대해 시험하였다. 간단히, 불포화 농도의 비오틴-PD-L1-Fc를 10 ㎍/㎖의 67D9, c67D9 또는 hu67D9와 1시간 동안 배양하였다. 이어서 상기 혼합물을 CHO/PD-1 세포에 가하였다. 1시간 후에, 상기 세포를 세척하고 그의 결합을 아비딘-PE로 검출하였다. 유식 세포측정 분석을 FACScan 유식 세포측정(벡톤 디킨슨)을 사용하여 수행하였다. 도 4A 내지 4D에 도시된 결과는 상기 3개의 항-PD-1 항체, 67D9, c67D9 및 hu67D9가 모두, 형질감염된 CHO-K1 세포상에서 발현된 PD-1에 대한 PD-L1-Fc의 결합을 유효하게 억제함을 가리켰다.
실시예 11. CD28과 구성원들에 대한 항-PD-1 항체의 결합
항-PD-1 항체의 특이성을 표준 ELISA를 사용하여 CD28과 구성원 ICOS, CTLA-4 및 CD28(R&D 시스템)에의 그의 결합을 검출함으로써 조사하였다. 간단히, 상이한 농도의 67D9, c67D9 또는 hu67D9를 ICOS, CTLA-4, CD28 또는 PD-1-Fc로 코팅된 96-웰 플레이트에 가한 다음, 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 세척 후에, HRP-접합된 염소 항-인간 카파(c67D9 또는 hu67D9의 검출을 위해) 또는 HRP-접합된 염소 항-마우스 카파(67D9의 검출을 위해)를 가하고 상기 플레이트를 1시간 동안 추가로 배양하였다. 최종적으로, TMB를 HRP에 대한 기질로서 가하고, 흡광도를 450 ㎚에서 측정하였다. 도 5A 내지 5D에 도시된 바와 같이, 항-PD-1 항체 67D9, c67D9 및 hu67D9는 각각 PD-1에 결합하였으나, 다른 CD28과 구성원들(ICOS, CTLA-4 및 CD28)에는 결합하지 않았다.
실시예 12. 혼합 림프구 반응에서 세포 증식 및 사이토킨 생성에 대한 항-PD-1 항체의 효과
혼합 림프구 반응을 사용하여 림프구 효과기 세포로의 PD-1 경로를 차단하는 효과를 입증하였다. 상기 분석에서 T 세포를 항-PD-1 항체의 존재 또는 부재하에서 증식, IFN-감마 분비 및 IL-2 분비에 대해 시험하였다. 간단히, 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 피콜 하이파크(Ficoll-Hypaque) 밀도 구배 원심분리에 의해 건강한 자원자의 헤파린 처리된 혈액으로부터 단리하였다. 인간 PBMC를 96-웰 편평바닥 플레이트에서 밤새 배양하였다. 상이한 항체 농도의 항-PD-1 항체(67D9, c67D9 또는 hu67D9), PMA(10 ng/㎖) 및 이오노마이신(10 ng/㎖)을 각 배양물에 가하였다. 대조용 IgG4 항체를 음성 대조용으로서 사용하였다. 상기 세포를 37 ℃에서 3일 동안 배양하였다. 이어서 상기 세포를 3H-티미딘으로 표지하고, 추가로 6시간 동안 배양하고, 마이크로베타(MicroBeta) 계수기(퍼킨엘머(PerkinElmer))에 의해 세포 증식에 대해 분석하였다. 도 6A에 도시된 결과는 3개의 항-PD-1 항체, 67D9, c67D9 및 hu67D9가 각각 농도 의존적인 방식으로 T-세포 증식을 촉진함을 가리켰다.
인간 PBMC를 밤새 96-웰 편평 바닥 플레이트에서 배양하였다. 상이한 항체 농도의 항-PD-1 항체(67D9, c67D9 또는 hu67D9), PMA(10 ng/㎖) 및 이오노마이신(10 ng/㎖)을 각 배양물에 가하였다. 대조용 IgG4 항체를 음성 대조용으로서 사용하였다. 상기 세포를 37 ℃에서 3일 동안 배양하였다. 이어서 100 ㎕의 배지를 사이토킨 측정을 위해 각 배양물로부터 취하였다. IFN-감마 및 IL-2의 수준을 ELISA 키트(R&D 시스템)를 사용하여 측정하였다. 결과는 3개의 항-PD-1 항체, 67D9, c67D9 및 hu67D9가 각각 농도 의존적인 방식으로 IL-2(도 6B) 및 IFN-감마(도 6C) 분비를 촉진함을 가리켰다.
실시예 13. 마우스 PD-1 및 키노몰구스 원숭이 PD-1에 대한 항-PD-1 항체 결합의 특성화
마우스 PD-1 및 키노몰구스 원숭이 PD-1을 실시예 1에서 인간 PD-1-Fc의 경우와 동일한 방법을 사용하여 Fc 융합 단백질로서 제조하였다. 상이한 농도의 67D9, c67D9 또는 hu67D9를 인간 PD-1-Fc, 마우스 PD-1-Fc, 또는 키노몰구스 원숭이 PD-1-Fc로 코팅된 96-웰 플레이트에 가한 다음, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 세척 후에, HRP-접합된 염소 항-인간 카파(c67D9 또는 hu67D9의 검출을 위해) 또는 HRP-접합된 염소 항-마우스 카파(67D9의 검출을 위해)를 가하고 상기 플레이트를 1시간 동안 추가로 배양하였다. 최종적으로, TMB를 HRP에 대한 기질로서 가하고, 흡광도를 450 ㎚에서 측정하였다. 도 7A 내지 7C에 도시된 바와 같이, 항-PD-1 항체 67D9, c67D9 및 hu67D9는 각각 인간 PD-1-Fc 및 키노몰구스 원숭이 PD-1-Fc에 결합하였으나, 마우스 PD-1-Fc에는 결합하지 않았다.
실시예 14. 열 안정성 측정
차동 주사 열량측정(DSC)을 겉보기 중간-점 풀림(unfolding) 온도(Tm)의 확인을 위해 수행하였다. DSC를 또한 상태의 열용량 및 온도 변화에 의해 유발될 수 있는 전이와 관련된 과잉 열의 측정에 사용하였다. 상기 과잉 열 용량의 적분은 상기 과정에 대한 엔탈피이다. 주요 풀림 전이는 현저한 흡열성 피크로서 나타난다.
DSC 실험을 PBS(pH 7.0) 중의 0.5 ㎎/㎖ 단백질 농도의 니보루맵, 펨브로리주맵 및 hu67D9 용액에 대해 VP-DSC(마이크로칼(Microcal), 노쓰햄프톤(Northhampton), 미국 매사추세츠주 소재)를 사용하여 수행하였다. 상기 mAb를 0.5 ㎎/㎖의 단백질 농도로 개별적으로 시험하고 단백질이 없는 완충제 대조용을 참조로서 사용하였다. 상기 샘플들을 10 ℃에서 초기 10분 평형에 이어서 100 ℃/시간의 속도로 10 ℃에서부터 120 ℃까지 스캐닝하였다. 적어도 5회의 완충제-완충제 스캔을 수행하여 기준선 값을 획득하고 열 이력을 확립시켰다. 상기 데이터를 오리진(Origin) 7.0(오리진-랩, 노쓰햄프톤, 미국 매사추세츠주 소재)을 사용하여 분석하였다. 모든 써모그램을 기준선 보정하고(선형 연결) 오리진에서 비-2-상태 모델을 사용하여 정합시켜 풀림의 겉보기 중간점 온도(Tm) 및 풀림의 겉보기 엔탈피(ΔH)를 획득하였다. 도 8 및 표 1에 도시된 바와 같이, hu67D9의 풀림 온도는 니보루맵 및 펨브로리주맵보다 더 높으며, 이는 hu67D9가 니보루맵 및 펨브로리주맵에 비해 더 양호한 열 안정성을 가졌음을 암시한다.
DSC에 의해 측정된 겉보기 중간점 풀림 온도 및 풀림의 엔탈피
항-PD-1 항체 Tm (°C) △H (kcal)
펨브로리주맵 72.3 829
니보루맵 69.2 581
인간화된 67D9 83.5 929
실시예 15. 동역학 및 친화성 측정
Biacore 시스템에 의해 사용된 표면 플라스몬 공명(SPR)의 광학 현상은 단백질-단백질 상호작용의 검출 및 측정을 표지의 사용 없이 실시간으로 가능하게 한다. 항체의 그의 항원에 대한 친화성을 상기 상호작용의 결합 동역학을 측정함으로써 측정할 수 있다.
동역학 및 친화성 상수의 평가에서, PD-1-Fc 융합 단백질을 고정화시키고 hu67D9 및 니보루맵을 실행 완충제로 희석하고 분석하였다.
친화성 상수를 상기 속도 상수들의 비로부터 계산하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, hu67D9의 KD는 3.209E-12M인 반면, 니보루맵의 KD는 2.116E-11M이다. 이들 결과는 hu67D9가 니보루맵보다 더 높은 친화성으로 PD-1에 결합함을 가리킨다.
실시예 16. 세포 표면 PD-1과의 결합 활성
Hu67D9를 표준 유식 세포측정 분석을 사용하여, 형질감염된 CHO-K1상에서 발현된 PD-1(CHO/PD-1)에 결합하는 능력에 대해 시험하였다.
hu67D9 또는 니보루맵의 연속 희석물을 각각 CHO/PD-1 세포와 배양하였다. 1시간 배양 후에, 상기 세포를 세척하고 FITC 표지된 항 인간 항체를 1시간 동안 배양하였다. 이어서 상기 세포를 세척하고 유식 세포측정 분석을 FACScan 유식 세포측정을 사용하여 수행하였다.
도 10에 도시된 바와 같이, hu67D9 및 니보루맵은 모두 상기 세포 표면상에서 발현된 PD-1에 결합할 수 있었다. 상기 hu67D9의 EC50 값은 니보루맵의 경우보다 훨씬 더 낮으며, 이는 상기 hu67D9가 니보루맵보다 더 높은 친화성으로 세포 표면 PD-1에 결합함을 가리킨다.
실시예 17. 용해성 PD-1과의 결합 활성
상기 항-PD-1 항체의 특이성을 표준 ELISA 기법을 사용하여 용해성 PD-1에의 그의 결합을 검출함으로써 조사하였다.
상이한 농도의 hu67D9 및 니보루맵을 PD-1-Fc로 코팅된 96-웰 플레이트에 가한 다음, 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 세척 후에, HRP-접합된 염소 항-인간 카파를 가하고 상기 플레이트를 1시간 동안 추가로 배양하였다. 최종적으로, TMB를 HRP에 대한 기질로서 가하였으며, 흡광도를 450 ㎚에서 측정하였다.
도 11에 도시된 바와 같이, hu67D9 및 니보루맵은 모두 상기 용해성 PD-1에 결합할 수 있었다. 상기 hu67D9의 EC50 값은 니보루맵의 경우보다 훨씬 더 낮으며, 이는 상기 hu67D9가 니보루맵보다 더 높은 친화성으로 용해성 PD-1에 결합함을 가리킨다.
실시예 18. 니보루맵과 경쟁적으로 결합하는 세포 표면 PD-1
Hu67D9를 유식 세포측정 분석으로, 형질감염된 CHO-K1 세포상에서 발현된 PD-1(CHO/PD-1)의 결합과 경쟁하는 능력에 대해 시험하였다.
불포화 농도의 FITC 표지된 니보루맵을 각각 연속 희석된 hu67D9 또는 니보루맵과 배양하였다. 1시간 배양 후에, 상기 세포를 세척하고 FACScan 유식 세포측정을 사용하여 유식 세포측정 분석을 수행하였다.
도 12에 도시된 바와 같이, hu67D9 및 니보루맵은 모두 FITC 표지된 니보루맵과 상기 세포 표면 PD-1과의 결합에 대해서 경쟁한다. 상기 hu67D9의 IC50 값은 니보루맵의 경우보다 훨씬 더 낮으며, 이는 상기 hu67D9가 니보루맵보다 더 높은 친화성으로 세포 표면 PD-1에 경쟁적으로 결합함을 가리킨다.
실시예 19. 니보루맵과 경쟁적으로 결합하는 용해성 PD-1
항-PD-1 항체의 경쟁적으로 결합하는 용해성 PD-1 활성을 표준 ELISA 기법을 사용하여 조사하였다.
불포화된 농도의 비오틴 표지된 니보루맵 및 연속 희석된 hu67D9 또는 니보루맵을 PD-1-Fc로 코팅된 96-웰 플레이트에 가한 다음, 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 세척 후에, HRP-아비딘을 가하고 상기 플레이트를 1시간 동안 추가로 배양하였다. 최종적으로 TMB를 HRP에 대한 기질로서 가하였으며, 흡광도를 450 ㎚에서 측정하였다.
도 13에 도시된 바와 같이, hu67D9 및 니보루맵은 모두 비오틴 표지된 니보루맵과 경쟁하고 용해성 PD-1에 결합한다. 상기 hu67D9의 EC50 값은 니보루맵의 경우보다 훨씬 더 낮으며, 이는 상기 hu67D9가 니보루맵보다 더 높은 친화성으로 용해성 PD-1에 경쟁적으로 결합함을 가리킨다.
실시예 20. PD-L1과 경쟁적으로 결합하는 용해성 PD1
항-PD-1 항체의 PD-L1과 경쟁적으로 결합하는 용해성 PD1을 표준 ELISA 기법을 사용하여 조사하였다.
불포화된 농도의 비오틴 표지된 PDL1-Fc 및 연속 희석된 hu67D9 또는 니보루맵을 PD-1-Fc로 코팅된 96-웰 플레이트에 가한 다음, 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 세척 후에, HRP-아비딘을 가하고 상기 플레이트를 1시간 동안 추가로 배양하였다. 최종적으로 TMB를 HRP에 대한 기질로서 가하였으며, 흡광도를 450 ㎚에서 측정하였다.
도 14에 도시된 바와 같이, hu67D9 및 니보루맵은 모두 비오틴 표지된 PDL1-Fc와 경쟁하고 용해성 PD-1에 결합한다. 상기 hu67D9의 EC50 값은 니보루맵의 경우보다 훨씬 더 낮으며, 이는 상기 hu67D9가 니보루맵보다 더 높은 친화성으로 용해성 PD1에 경쟁적으로 결합함을 가리킨다.
SEQUENCE LISTING <110> ASIA BIOTECH PTE. 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cgcaatgaca gcggcaccta cctctgtggg gccatctccc tggcccccaa ggcgcagatc 420 aaagagagcc tgcgggcaga gctcagggtg acagagagaa gggctagcga gcccaaatct 480 tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 540 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 600 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 660 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 720 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 780 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 840 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catctcggga ggagatgacc 900 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 960 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1020 tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1080 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1140 agcctctccc tgtccccggg taaatgagaa ttc 1173 <210> 12 <211> 1443 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the DNA containing cDNA encoding the extracellular region of human PD-L1 fused to human Fc <400> 12 aagcttgccg ccaccatgag gatatttgct gtctttatat tcatgaccta ctggcatttg 60 ctgaacgcat ttactgtcac ggttcccaag gacctatatg tggtagagta tggtagcaat 120 atgacaattg aatgcaaatt cccagtagaa aaacaattag acctggctgc actaattgtc 180 tattgggaaa tggaggataa gaacattatt caatttgtgc atggagagga agacctgaag 240 gttcagcata gtagctacag acagagggcc cggctgttga aggaccagct ctccctggga 300 aatgctgcac ttcagatcac agatgtgaaa ttgcaggatg caggggtgta ccgctgcatg 360 atcagctatg gtggtgccga ctacaagcga attactgtga aagtcaatgc cccatacaac 420 aaaatcaacc aaagaatttt ggttgtggat ccagtcacct ctgaacatga actgacatgt 480 caggctgagg gctaccccaa ggccgaagtc atctggacaa gcagtgacca tcaagtcctg 540 agtggtaaga ccaccaccac caattccaag agagaggaga aacttttcaa tgtgaccagc 600 acactgagaa tcaacacaac aactaatgag attttctact gcacttttag gagattagat 660 cctgaggaaa accatacagc tgaattggtc atcccagaac tacctctggc acatcctcca 720 aatgaaagga ctgctagcga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 780 ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 840 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 900 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 960 aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1020 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1080 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1140 accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1200 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1260 aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1320 ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1380 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtccccggg taaatgagaa 1440 ttc 1443 <210> 13 <211> 888 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 aagcttgccg ccaccatgca gatcccacag gcgccctggc cagtcgtctg ggcggtgcta 60 caactgggct 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agtgcaaggt ctccaacaaa ggcctcccgt cctccatcga gaaaaccatc 1080 tccaaagcca aagggcagcc ccgagagcca caggtgtaca ccctgccccc atcccaggag 1140 gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac 1200 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1260 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaggc taaccgtgga caagagcagg 1320 tggcaggagg ggaatgtctt ctcatgctcc gtgatgcacg aggctctgca caaccactac 1380 acacagaaga gcctctccct gtctctgggt aaatgagaat tc 1422 <210> 20 <211> 738 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the DNA containing the cDNA encoding the c67D9 light chain <400> 20 aagcttgccg ccaccatgga gaaagacaca ctcctgctat gggtcctgct tctctgggtt 60 ccaggttcca caggtgacat tgtgctgacc caatctccag cttctttggc tgtgtctcta 120 gggcagaggg ccaccatctc ctgcagagcc agcgaaagtg ttgatagtta tggcattagt 180 tttatgcact ggttccaaca gaaaccagga cagccacccc aactcctcat ctattctaca 240 tccaaccgag gatccggggt ccctgccagg tttagtggca gtgggtctgg gacagacttc 300 agcctcacca tccatcctat ggaggaggat gatactgcaa tgtatttctg tcagcaaagt 360 caggaggttc cgtggacgtt cggtggaggc accaagctgg aaatcaaacg gactgtggct 420 gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct 480 gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat 540 aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc 600 acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc 660 tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg 720 ggagagtgtt aggaattc 738 <210> 21 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of c67D9 heavy chain <400> 21 Glu Val Ile Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Asp Tyr Gly Asn Tyr Val Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 22 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of c67D9 light chain <400> 22 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Gln Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Arg Gly Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile His 65 70 75 80 Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Gln 85 90 95 Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 23 <211> 362 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequences of PD-1-Fc fusion protein <400> 23 Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr 1 5 10 15 Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe 20 25 30 Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr 35 40 45 Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu 50 55 60 Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu 65 70 75 80 Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn 85 90 95 Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala 100 105 110 Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg 115 120 125 Ala Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 130 135 140 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 145 150 155 160 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 165 170 175 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 180 185 190 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 195 200 205 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 210 215 220 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 225 230 235 240 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 245 250 255 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 260 265 270 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 275 280 285 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 290 295 300 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 305 310 315 320 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 325 330 335 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 340 345 350 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 360 <210> 24 <211> 455 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequences of PD-L1-Fc fusion protein <400> 24 Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser 1 5 10 15 Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu 20 25 30 Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln 35 40 45 Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg 50 55 60 Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala 65 70 75 80 Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys 85 90 95 Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val 100 105 110 Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro 115 120 125 Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys 130 135 140 Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys 145 150 155 160 Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr 165 170 175 Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr 180 185 190 Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile 195 200 205 Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr Ala Ser Glu 210 215 220 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 225 230 235 240 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 245 250 255 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 260 265 270 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 275 280 285 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 305 310 315 320 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 325 330 335 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 340 345 350 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 355 360 365 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 370 375 380 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 385 390 395 400 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 405 410 415 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 420 425 430 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 435 440 445 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 25 <211> 1431 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the DNA containing the cDNA encoding the hu67D9 heavy chain <400> 25 aagcttgccg ccaccatgga ttttcaggtg cagattttca gcttcctgct aatcagtgcc 60 tcagtcataa tatccagagg agaggtgcag ctcgtggaat ctgggggcgg actggtgcag 120 cccggtggaa gtctccggct gagctgcgcc gctagtgggt tcactttttc tacttacggg 180 atgtcttggg tccgacaggc accaggcaag gggctggagt gggtggctac tatttctgga 240 ggaggccgag acacctacta ccccgacacc gtcaagggac gttttactat cagccgtgac 300 aacagcaaga ataccctcta ccttcagatg tcttcactgc gagctgaaga caccgctgtg 360 tactattgtg cccgtcagga ctacggtaac tacgtgtggt tcgcttactg gggacaggga 420 accctggtca ccgtctcctc ggctagcacc aagggcccat ccgtcttccc cctggcgccc 480 tgctccagga gcacctccga gagcacagcc gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc 540 cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc 600 ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc 660 agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc aacgtagatc acaagcccag caacaccaag 720 gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt cccccatgcc caccctgccc agcacctgag 780 ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc 840 tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc 900 cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 960 gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 1020 ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag 1080 aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagagccac aggtgtacac cctgccccca 1140 tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac 1200 cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1260 acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac 1320 aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc tcatgctccg tgatgcacga ggctctgcac 1380 aaccactaca cacagaagag cctctccctg tctctgggta aatgagaatt c 1431 <210> 26 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of hu67D9 heavy chain <400> 26 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Asp Tyr Gly Asn Tyr Val Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 27 <211> 742 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the DNA containing the cDNA encoding the hu67D9 light chain <400> 27 aagcttgccg ccaccatgga ttttcaggtg cagattttca gcttcctgct aatcagtgcc 60 tcagtcataa tatccagagg agatattgtt ctgacccagt cccccgcttc actggctgtg 120 agtcctgggc agcgagctac catcagctgc cgggcttcag agtccgtgga tagctacgga 180 atttcattta tgcactggtt ccagcagaag ccaggccaac cacctcagtt gctgatatat 240 tcgacatcta atcggggaag cggtgtgcca gcccggttta gtggtagcgg ctctggtaca 300 gatttctctc ttacaattaa cccagtggag gcggatgaca ctgccaatta cttttgtcag 360 cagagccagg aagtgccttg gacttttggt cagggcacga aggtagagat taaacggact 420 gtggctgcac catctgtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact 480 gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc tatcccagag aggccaaagt acagtggaag 540 gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc caggagagtg tcacagagca ggacagcaag 600 gacagcacct acagcctcag cagcaccctg acgctgagca aagcagacta cgagaaacac 660 aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc 720 aacaggggag agtgttgaat tc 742 <210> 28 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of hu67D9 light chain <400> 28 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Gln Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Arg Gly Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Thr Ala Asn Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Gln 85 90 95 Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims (16)

  1. 항-PD-1 단클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 서열번호 1(중쇄 CDR1), 서열번호 2(중쇄 CDR2), 서열번호 3(중쇄 CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 4(경쇄 CDR1), 서열번호 5(경쇄 CDR2) 및 서열번호 6(경쇄 CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 상기 단클론 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 중쇄 가변 영역이 서열번호 8 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하고 상기 경쇄 가변 영역이 서열번호 10 또는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 단클론 항체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항원-결합 단편이 Fab, Fab', F(ab)2 또는 F(ab')2인 단클론 항체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 항체가 마우스, 키메릭 또는 인간화된 항체인 단클론 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단클론 항체를 암호화하는 단리된 핵산 분자.
  6. 제5항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  7. 제6항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
  9. 치료제에 결합된 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 면역접합체.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 치료제가 세포독소 또는 방사성 동위원소인 면역접합체.
  11. 대상체에게 상기 대상체에서 면역 반응이 조절되도록 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 투여함을 포함하는, 상기 대상체에서 상기 면역 반응을 조절하는 방법.
  12. 대상체에게 종양 세포의 성장을 억제하기에 유효한 양으로 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여함을 포함하는, 상기 대상체에서 상기 종양 세포의 성장을 억제하는 방법.
  13. 대상체에게 상기 대상체가 감염성 질병에 대해 치료되도록 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여함을 포함하는, 상기 대상체에서 상기 감염성 질병을 치료하는 방법.
  14. 대상체에서 면역 반응을 변형시키기 위한 약제의 제조에 있어서, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 용도.
  15. 대상체에서 종양 세포의 성장을 억제시키기 위한 약제의 제조에 있어서, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 용도.
  16. 대상체에서 감염성 질병을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 용도.

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