ES2638545T3

ES2638545T3 - Optimización de anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activación de linfocitos (LAG-3) y sus usos

Info

Publication number: ES2638545T3
Application number: ES13737946.7T
Authority: ES
Inventors: Nils Lonberg; Mohan Srinivasan
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2012-07-02
Filing date: 2013-07-02
Publication date: 2017-10-23
Anticipated expiration: 2033-07-02
Also published as: PE20191324A1; LT2867258T; CY1123609T1; HRP20201852T1; TW201831515A; TW201726743A; CY2022035I2; DK2867258T3; EA202090227A1; CN108101991A; TW202540190A; EA201590138A1; NO2023008I1; IL236517B; TWI701045B; AU2017221874B2; PT3275899T; CY2022035I1; PT3795592T; EP4553086A2

Abstract

Un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une a LAG-3 humano, en el que las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, 16 y 17, respectivamente, y en el que las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, 19 y 20, respectivamente.

Description

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La expresión "derivados de anticuerpos humanos" se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo humano, por ejemplo, un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo.

Se pretende que el término "anticuerpo humanizado" se refiera a anticuerpos en los que las secuencias de la CDR

5 derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se hayan injertado en secuencias marco humanas. Se pueden realizar modificaciones adicionales de la región marco en las secuencias marco humanas.

Se pretende que el término "anticuerpo quimérico" se refiera a anticuerpos en los que las secuencias de la región

10 variable se deriven de una especie y las secuencias de la región constante se deriven de otra especie, tal como un anticuerpo en el que las secuencias de la región variable se derivan de un anticuerpo de ratón y las secuencias de la región constante se derivan de un anticuerpo humano.

Tal como se usa en el presente documento, se pretende que un anticuerpo se "une específicamente a una proteína

15 LAG-3 humana" se refiera a un anticuerpo que se une a una proteína LAG-3 humana (y posiblemente una proteína LAG-3 de una o más especies no humanas) pero que no se une sustancialmente a proteínas no LAG-3. Preferentemente, el anticuerpo se une a una proteína LAG-3 humana con "elevada afinidad", concretamente con una KD de 1 x 10-7 M o menos, más preferentemente 1 x 10-8 M o menos, más preferentemente 5 x 10-9 M o menos, más preferentemente 1 x 10-9 M o menos.

20 El término "no se une sustancialmente" a una proteína o células, como se usa en el presente documento, significa que no se une o no se une con una elevada afinidad a la proteína o las células, es decir, se une a la proteína o a las células con una KD de 1 x 10-6 M o más, más preferentemente 1 x 10-5 M o más, más preferentemente 1 x 10-4 M o más, más preferentemente 1 x 10-3 M o más, incluso más preferentemente 1 x 10-2 M o más.

25 Se pretende que el término "Kasoc " o "Ka", como se usa en el presente documento, se refiera a la velocidad de asociación de una interacción anticuerpo-antígeno concreta, mientras se pretende que el término "Kdis" o "Kd," como se usa en el presente documento, se refiera a la velocidad de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno concreta. Se pretende que el término "KD", como se usa en el presente documento, se refiera a la constante de

30 disociación, que se obtiene a partir del cociente de Kd y Ka (es decir, Kd/Ka) y se expresa como concentración molar (M). Se pueden determinar los valores de KD para los anticuerpos utilizando los métodos bien establecidos en la materia. Un método preferido para determinar la KD de un anticuerpo es utilizar la resonancia de plasmón superficial, utilizando preferentemente un sistema biosensor tal como un sistema Biacore®.

35 El término "elevada afinidad" para un anticuerpo IgG se refiere a un anticuerpo que tiene una KD de 1 x 10-7 M o menos, más preferentemente 5 x 10-8 M o menos, incluso más preferentemente 1 x 10-8 M o menos, incluso más preferentemente 5 x 10-9 M o menos e incluso más preferentemente 1 x 10-9 M o menos para un antígeno diana. Sin embargo, la unión con "elevada afinidad" puede variar para otros isotipos de anticuerpos. Por ejemplo, la unión con "elevada afinidad" para un isotipo IgM se refiere a un anticuerpo que tiene una KD de 10-6 M o menos, más

40 preferentemente 10-7 M o menos, incluso más preferentemente 10-8 M o menos.

El término "desamidación" se refiere a un proceso químico degradativo que se produce espontáneamente en las proteínas (por ejemplo, anticuerpos). La desamidación elimina un grupo funcional amida de un resto aminoácido, tal como asparagina y glutamina, dañando de este modo sus cadenas secundarias que contienen amida.

45 Específicamente, la cadena secundaria de una asparagina ataca el grupo peptídico adyacente, formando un intermedio de succinimida simétrico. La simetría del intermedio da como resultado dos productos de hidrólisis, tanto aspartato como isoaspartato. Se puede producir también una reacción similar en cadenas secundarias de aspartato, dando como resultado una conversión parcial en isoaspartato. En el caso de glutamina, la velocidad de desamidación es generalmente diez veces menor que la de la asparagina, sin embargo, el mecanismo es

50 esencialmente el mismo, requiriendo solo moléculas de agua para continuar.

El término "sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano. El término "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas, caballos, pollos, anfibios, y reptiles, aunque se prefieren mamíferos, tales como primates no humanos,

55 ovejas, perros, gatos, vacas y caballos.

Se describen diversos aspectos de la invención con detalles adicionales en las siguientes subsecciones.

Anticuerpos dirigidos contra LAG-3 que tienen estabilidad aumentada y ventajosas propiedades funcionales

60 Los anticuerpos de la invención se unen específicamente a LAG-3 humano y tienen estabilidad optimizada en comparación con los anticuerpos dirigidos contra LAG-3 anteriormente descritos, particularmente en comparación con el anticuerpo 25F7 (LAG3.1). Esta optimización incluye una desamidación reducida (por ejemplo, estabilidad química aumentada) y un mayor desplegado térmico (por ejemplo, estabilidad física aumentada), aunque reteniendo

65 a la vez una elevada afinidad de unión al LAG-3 humano.

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la capacidad de estimular las respuestas de los linfocitos T específicos de antígeno.

El anticuerpo descrito en el presente documento puede ser, por ejemplo, un anticuerpo humano, humanizado o quimérico

5 Tal como se usa en el presente documento, se entiende que la expresión "modificaciones conservativas de la secuencia" se refiere a modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de unión al anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Dichas modificaciones conservativas incluyen sustituciones, adiciones y deleciones de aminoácidos. Se pueden introducir modificaciones en un anticuerpo de la invención mediante técnicas normalizadas conocidas en la materia, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Sustituciones de aminoácidos conservativas son aquellas en las que el resto de aminoácido se sustituye por un resto de aminoácido que tiene una cadena secundaria similar. Las familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas secundarias similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas secundarias básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas secundarias ácidas

15 (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas secundarias polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas secundarias no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas secundarias beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas secundarias aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). De este modo, uno o más restos de aminoácidos en las regiones CDR de un anticuerpo de la invención se puede sustituir por otros restos de aminoácidos de la misma familia de cadena secundaria y se puede probar el anticuerpo alterado para la función retenida (es decir, las funciones anteriormente definidas) utilizando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.

Anticuerpos genomanipulados y modificados

25 Se pueden preparar anticuerpos utilizando un anticuerpo que tiene una o más de las secuencias VH y/o VL de LAG3.5 como material de partida para genomanipular un anticuerpo modificado. Un anticuerpo puede genomanipularse modificando uno o más restos en una o ambas regiones variables (es decir, VH y/o VL), por ejemplo en una o más regiones CDR y/o en una o más regiones del marco. De manera adicional o alternativa, un anticuerpo puede genomanipularse modificando restos en la(s) región(es) constante(s), por ejemplo, para alterar la(s) función(es) efectora(s) del anticuerpo.

En determinadas realizaciones, el injerto de la CDR se puede usar para genomanipular regiones variables de anticuerpos. Los anticuerpos interactúan con los antígenos diana predominantemente a través de restos de

35 aminoácidos que se localizan en las seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada y la cadena ligera. Por este motivo, las secuencias de aminoácidos en las CDR son más diversas entre anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Como las secuencias de la CDR son responsables de la mayoría de las interacciones anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imiten las propiedades de los anticuerpos específicos que se producen naturalmente construyendo vectores de expresión que incluyan secuencias de la CDR del anticuerpo específico que se produce naturalmente injertado sobre las secuencias marco de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (véanse, por ejemplo, Riechmann et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Véanse,

U.S.A. 86:10029-10033; las patentes de Estados Unidos números 5.225.539; 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370).

45 La invención se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 que comprenden las SEQ ID NO: 15, 16, 17, respectivamente, y una región variable de la cadena ligera que comprende las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 que comprenden las SEQ ID NO: 18, 19, 20, respectivamente (es decir, las CDR de LAG3.5). Aunque estos anticuerpos contienen las secuencias CDR de VH and VL del anticuerpo monoclonal LAG3.5, pueden contener diferentes secuencias marco.

Dichas secuencias marco pueden obtenerse a partir de bases de datos públicas del ADN o referencias publicadas que incluyen las secuencias génicas de anticuerpos de la línea germinal. Por ejemplo, las secuencias de ADN de la

55 línea germinal de los genes de la región variable de la región pesada y ligera humana se pueden encontrar en la base de datos de la secuencia de la línea germinal humana "VBase" (disponible en internet en www.mrccpe.cam.ac.uk/vbase), así como en Kabat et al. (1991), citado anteriormente; Tomlinson et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; y Cox et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836. Como ejemplo adicional, se pueden encontrar en la base de datos Genbank las secuencias de ADN de la línea germinal para los genes de la región variable de la cadena pesada y ligera. Por ejemplo, las siguientes secuencias de la cadena pesada de la línea germinal que se encuentran en el ratón HCo7 HuMAb están disponibles con los números de registro del Genbank adjuntos: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 y BC070333), 3-33 (NG_0010109 y NT_024637) y 3-7 (NG_0010109 & NT_024637).

65 Como ejemplo adicional, las siguientes secuencias de la cadena pesada de la línea germinal que se encuentran en el ratón HCo 12 H uMAb están disponibles con los números de acceso del Genbank adjuntos: 1-69 (NG_0010109,

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UE de Kabat.

En una realización preferida, el anticuerpo es un anticuerpo isotipo IgG4 que comprende una mutación de serina a prolina en una posición correspondiente a la posición 228 (S228P; índice de la UE) en la región bisagra de la región

5 constante de la cadena pesada. Se ha notificado que esta mutación elimina la heterogeneidad de los puentes disulfuro entre las cadenas pesada de la región bisagra (Angal et al. citado anteriormente; la posición 241 se basa en el sistema de numeración de Kabat).

En una realización, la región bisagra de CH1 está modificada de tal manera que el número de restos de cisteína en la región bisagra está alterado, por ejemplo, aumentado o disminuido. Esta solución se describe adicionalmente en la patente de Estados Unidos n.º 5.677.425. El número de restos de cisteína en la región bisagra de CH1 se altera para, por ejemplo, facilitar el ensamblaje de las cadenas ligera y pesada o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.

15 En otra realización, la región bisagra Fc de un anticuerpo se muta para disminuir la semivida biológica del anticuerpo. Más específicamente, se introducen una o más mutaciones de aminoácidos en la región de la interfase del dominio CH2-CH3 del fragmento bisagra Fc de tal manera que el anticuerpo tiene alterada la unión a la proteína A de estafilococo (SpA) con respecto a la unión de Spa al dominio de la bisagra de Fc natural. Esta solución se describe en detalle adicionalmente en la patente de Estados Unidos n.º 6.165.745.

En otra realización, el anticuerpo se modifica para aumentar su vida media biológica. Son posibles diversas soluciones. Por ejemplo, se pueden introducir una o más de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, tal como se ha descrito en la patente de Estados Unidos n.º 6.277.375. Como alternativa, para aumentar la vida media biológica, el anticuerpo se puede alterar en la región CH1 o CL para que contenga un epítopo de unión al receptor

25 de rescate a partir de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, como se describe en las patentes de Estados Unidos números 5.869.046 y 6.121.022.

En otras realizaciones más adicionales, la región Fc se altera sustituyendo al menos un resto de aminoácido por un resto de aminoácido diferente para alterar una o varias funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados entre los restos de aminoácidos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322, se pueden sustituir por un resto de aminoácido diferente de tal manera que el anticuerpo tiene una afinidad alterada por el ligando de un efector pero retiene la capacidad de unión a antígeno del anticuerpo progenitor. El ligando efector cuya afinidad se altera puede ser, por ejemplo, un receptor Fc o el componente CI del complemento. Esta solución se describe en detalle además en las patentes de Estados Unidos números 5.624.821 y 5.648.260.

35 En otro ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados entre los restos de aminoácidos 329, 331 y 322 se pueden sustituir por resto de aminoácido diferente de tal manera que el anticuerpo tiene alterada la unión a Clq y/o reducida

o eliminada la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Esta solución se describe en detalle adicionalmente en la patente de Estados Unidos n.º 6.194.551.

En otro ejemplo, uno o más restos de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos 231 y 239 se alteran para modificar de esta forma la capacidad del anticuerpo para fijar el complemento. Esta solución se describe adicionalmente en la publicación PCT WO 94/29351.

45 En otro ejemplo más, la región Fc se modifica para aumentar la capacidad del anticuerpo para mediar en la citotoxicidad dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor Fcγ modificando uno o más aminoácidos en las siguientes posiciones: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439. Esta solución se describe adicionalmente en la publicación PCT WO 00/42072. Por otra parte, los sitios de unión en la IgG1 para FcγR1, FcγRII, FcγRIII y FcRn se han cartografiado y se han descrito las variantes con unión mejorada (véase Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604). Se ha mostrado mostró que las mutaciones específicas en las posiciones 256, 290, 298, 333, 334 y 339 mejoran la unión a FcγRIII. Asimismo, se mostró que las siguientes combinaciones de mutantes mejoran la

55 unión a FcγRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A y S298A/E333A/K334A.

En otra realización adicional más, la glicosilación de un anticuerpo se modifica. Por ejemplo, se puede preparar un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilación). La glicosilación puede alterarse para, por ejemplo, aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Dichas modificaciones de los hidratos de carbono se pueden llevar a cabo, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glicosilación en la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden realizar una o más sustituciones de aminoácidos que dan como resultado la eliminación de uno

o más sitios de glicosilación de la región variable del marco para eliminar de esta forma la glicosilación en ese sitio. Dicha glicosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos números 5.714.350 y 6.350.861.

65 De manera adicional o alternativa, puede prepararse un anticuerpo que tenga un tipo de glicosilación alterado, tal

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Cada anticuerpo tendrá un único punto isoeléctrico (pI), que generalmente se encuentra en el intervalo de pH entre 6 y 9,5. El pI de un anticuerpo IgG1 se encuentra normalmente en el intervalo de pH de 7-9,5 y el pl de un anticuerpo IgG4 que se encuentra normalmente en el intervalo de pH de 6-8. Se especula que los anticuerpos con un pI fuera del intervalo normal pueden tener algún desplegado e inestabilidad en las condiciones in vivo. De este modo, se

5 prefiere tener un anticuerpo dirigido contra LAG-3 que contenga un valor de pl comprendido en el intervalo normal. Esto se puede conseguir ya sea seleccionando anticuerpos con un pl en el intervalo normal o bien mutando los restos de superficies cargadas.

Moléculas de ácidos nucleicos que codifican anticuerpos de la invención

En otro aspecto, la invención proporciona moléculas de ácidos nucleicos que codifican las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera, o las CDR, de los anticuerpos de la invención. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células completas, en un lisado celular, o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico se "aísla" o se "vuelve sustancialmente puro" cuando se purifica de otros componentes celulares u

15 otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, mediante técnicas convencionales, incluyendo tratamiento alcalino/con SDS, formación de bandas de CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otras bien conocidas en la materia. Véanse, Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley Interscience, Nueva York. Un ácido nucleico de la invención puede ser, por ejemplo, ADN o ARN y puede contener o no secuencias intrónicas. En una realización preferida, el ácido nucleico es una molécula de ADNc.

Los ácidos nucleicos de la invención pueden obtenerse usando técnicas de biología molecular convencionales. Para los anticuerpos expresados por hibridomas (por ejemplo, hibridomas preparados a partir de ratones transgénicos que contienen genes de la inmunoglobulina humana como se describe en detalle a continuación), se pueden obtener los

25 ADNc que codifican las cadenas ligera y pesada del anticuerpo preparado mediante el hibridoma mediante técnicas de amplificación de la PCR o de clonación del ADNc convencionales. Para los anticuerpos obtenidos de una genoteca de inmunoglobulina (por ejemplo, utilizando técnicas de expresión en fago), se puede recuperar un ácido nucleico que codifica dichos anticuerpos de la genoteca.

Las moléculas de ácidos nucleicos preferidas de la invención incluyen aquellas que codifican las secuencias VH y VL del anticuerpo monoclonal LAG3.5 (SEQ ID NO: 12 y 14, respectivamente). Una vez que se obtienen los fragmentos de ADN que codifican los segmentos VH y VL, estos fragmentos de ADN pueden manipularse adicionalmente mediante técnicas de ADN recombinante convencionales, por ejemplo, para convertir los genes de la región variable en genes de la cadena del anticuerpo de longitud completa, en genes del fragmento Fab o en un gen de scFv. En

35 estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica VL o VH está unido operativamente a otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo o un enlazador flexible. Se pretende que la expresión "unido operablemente", como se usa en este contexto, que signifique que los dos fragmentos de ADN están unidos de tal manera que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en marco.

El ADN aislado que codifica la región VH puede convertirse en un gen de la cadena pesada de longitud completa uniendo operativamente el ADN que codifica la VH con otra molécula de ADN que codifica las regiones constantes de la cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Las secuencias de los genes de la región constante de la cadena pesada humana se conocen en la materia (véase por ejemplo, Kabat et al. (1991), citado anteriormente) y los fragmentos de

45 ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener mediante amplificación de la PCR convencional. La región constante de la cadena pesada puede ser una región constante de IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero con máxima preferencia, es una región constante de IgG1 o IgG4. Para un gen de la cadena pesada del fragmento Fab, el ADN que codifica la VH puede estar unido operativamente a otra molécula de ADN que codifica solamente la región constante CH1 de la cadena pesada.

El ADN aislado que codifica la región VL puede convertirse en un gen de la cadena ligera de longitud completa (así como un gen de la cadena ligera de Fab) uniendo operativamente el ADN que codifica la VL con otra molécula de ADN que codifica la región constante de la cadena ligera, CL. Las secuencias de los genes de la región constante de la cadena ligera humana se conocen en la materia (véase, por ejemplo, Kabat et al., citado anteriormente) y los 55 fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener mediante amplificación de la PCR convencional. En realizaciones preferidas, la región constante de la cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda.

Para crear un gen scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL están unidos operativamente a otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly4-Ser)3, de tal manera que las secuencias VH y VL puedan expresarse como una proteína monocatenaria contigua, con las regiones VL y VH unidas por el enlazador flexible (véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554).

Producción de anticuerpos monoclonales

65 Los anticuerpos monoclonales (mAb) pueden producirse utilizando la técnica de hibridación de células somáticas

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(hibridoma) bien conocida de Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495. Otras realizaciones para producir anticuerpos monoclonales incluyen la transformación vírica u oncogénica de linfocitos B y las técnicas de expresión en fagos. Los anticuerpos quiméricos o humanizados también son bien conocidos en la materia. Véanse por ejemplo, las patentes de Estados Unidos con números 4.816.567; 5.225.539; 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370.

5 Los anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra LAG-3 humano pueden generarse utilizando ratones transgénicos o transcromosómicos que contienen partes del sistema inmunitario humano en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen los ratones denominados en el presente documento como HuMAb Mouse® y KM Mouse®, respectivamente, y que se denominan colectivamente en el presente

10 documento como "ratones Ig humanos".

El HuMAb Mouse® (Medarex®, Inc.) contiene miniloci del gen de la inmunoglobulina humana que codifican las secuencias de la cadena pesada (µ y γ) y la cadena ligera k no reordenadas de la inmunoglobulina humana, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci endógenos de las cadenas µ y k (véase, por ejemplo, Lonberg et al. 15 (1994) Nature 368(6474): 856-859). En consecuencia, los ratones presentan una expresión reducida de la IgM o k, de ratón y, en respuesta a la inmunización, los transgenes de la cadena pesada y ligera humana introducidos experimentan un cambio de clase y una mutación somática para generar anticuerpos monoclonales IgGκ humanos de elevada afinidad (Lonberg et al. (1994), citado anteriormente); revisado en Lonberg (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, y Harding 20 y Lonberg (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546). La preparación y uso del HuMAb Mouse®, y las modificaciones genómicas realizadas mediante dichos ratones, se describe adicionalmente en Taylor et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen et al. (1993) EMBO J. 12: 821830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; y

25 Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851. Véanse además, las patentes de Estados Unidos con números 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; 5.770.429; y 5.545.807; publicaciones PCT números WO 92/03918; WO 93/12227; WO 94/25585; WO 97/13852; WO 98/24884; WO 99/45962 y WO 01/14424.

30 Adicionalmente, los anticuerpos humanos pueden sensibilizarse utilizando un ratón que contiene secuencias de la inmunoglobulina humana en transgenes y transcromosomas, tales como un ratón que contiene un transgén de la cadena pesada humana y un transcromosoma de la cadena ligera humana. Este ratón se denomina en el presente documento "ratón KM®" y se describe en detalle en la publicación PCT WO 02/43478. Una forma modificada de este ratón, que comprende además una perturbación homocigótica del gen del receptor FcγRIIB endógeno, se describe

35 también en la publicación PCT WO 02/43478 y se denomina en el presente documento como "ratón KM/FCGR2D®". Además, se pueden usar cualquiera de los transgenes de la cadena pesada HCo7 o HCo12 o ambos.

Los animales transgénicos adicionales que se pueden usar para generar anticuerpos humanos incluyen el Xenomouse (Abgenix, Inc., patentes de Estados Unidos con números 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 y

40 6.162.963), "ratones TC (Tomizuka et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727) y vacas que contienen transcromosomas de la cadena pesada y la cadena ligera humanas (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894; publicación PCT WO 02/092812).

Adicionalmente, se pueden preparar anticuerpos monoclonales humanos utilizando métodos de expresión en fagos

45 para seleccionar genotecas de la inmunoglobulina humana. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados unidos números 5.223.409; 5.403.484; 5.571.698; 5.427.908; 5.580.717; 5.969.108; 6.172.197; 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915; y 6.593.081.

También se pueden preparar anticuerpos monoclonales humanos utilizando ratones SCID en los que se han

50 reconstituido células inmunitarias humanas de tal manera que se puede generar una respuesta de anticuerpos humanos tras la inmunización. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos números 5.476.996 y

5.698.767.

Adicionalmente, se pueden preparar anticuerpos dirigidos contra LAG-3 humanos utilizando la expresión en fagos

55 donde los fagos comprenden ácidos nucleicos que codifican anticuerpos generados en animales transgénicos anteriormente inmunizados con LAG-3. Preferentemente, el animal transgénico es un ratón HuMab, ratón KM, o ratón Kirin. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.º 6.794.132.

Inmunización de ratones Ig humanos

60 Los ratones Ig humanos se pueden inmunizar con una preparación purificada o enriquecida de un antígeno de LAG3, proteína LAG-3 recombinante, o células que expresan la proteína LAG-3. Véanse, por ejemplo, Lonberg et al. (1994), citado anteriormente; Fishwild et al. (1996), citado anteriormente; las publicaciones PCT WO 98/24884 y WO 01/14424. Preferentemente, ratones de 6-16 semanas de edad se inmunizaron con 5-50 µg de proteína LAG-3.

65 Como alternativa, se usó una porción de LAG-3 fusionada a un polipéptido no LAG-3.

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Los ratones transgénicos se pueden inmunizar por vía intraperitoneal (IP) o intravenosa (IV) con un antígeno de LAG-3 en adyuvante completo de Freund, seguido por inmunizaciones posteriores IP o IV con antígeno en adyuvante incompleto de Freund. Se pueden usar adyuvantes diferentes de los de Freund o células completas en ausencia de adyuvante. El plasma se puede cribar mediante ELISA y se pueden usar células de ratones con

5 suficientes títulos de inmunoglobulina dirigida contra LAG-3 humano para las fusiones.

Generación de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales humanos

Para generar hibridomas productores de anticuerpos monoclonales humanos, se pueden aislar esplenocitos y/o células de ganglios linfáticos de ratones inmunizados y fusionarse en una línea de células inmortalizadas adecuadas, tal como una línea celular de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes pueden cribarse según la producción de anticuerpos específicos de antígenos. La generación de hibridomas es bien conocida en la materia. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York.

15 Generación de transfectomas productores de anticuerpos monoclonales de la invención

Se pueden producir anticuerpos de la invención en un transfectoma de una célula hospedadora utilizando, por ejemplo, una combinación de técnicas de ADN recombinante y métodos de transfección génica como se conoce bien en la técnica (por ejemplo, Morrison, S. (1985) Science 229:1202). En una realización, el ADN que codifica las cadenas ligera y pesada de longitud parcial o completa obtenidas mediante técnicas de biología molecular convencionales se inserta en uno o más vectores de expresión de tal manera que los genes están unidos operativamente a secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción. En este contexto, se pretende que el término "unido operativamente" signifique que un gen de un anticuerpo está ligado en un vector de tal manera que las secuencias control de la transcripción y la traducción comprendidas en el vector sirvan para su función prevista

25 de regular la transcripción y la traducción del gen del anticuerpo.

Se pretende que el término "·secuencia reguladora" incluya promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o la traducción de los genes de la cadena del anticuerpo. Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Las secuencias reguladoras preferidas para la expresión en una célula hospedadora de mamífero incluyen elementos víricos que dirigen elevados niveles de expresión de proteínas en células de mamífero, tales como promotores y/o potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV), virus 40 de simio (VS40), adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardío mayor de adenovirus (AdMLP) y el polioma. Como alternativa, se pueden usar secuencias reguladoras no

35 víricas, tales como el promotor de la ubiquitina o el promotor de la globina β. Además, elementos reguladores compuestos de secuencias de diferentes fuentes, tales como el sistema promotor SRα, que contiene secuencias del promotor temprano del SV40 y de la repetición terminal larga del virus de la leucemia de linfocitos T de tipo 1 (Takebe et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472). El vector de expresión y las secuencias control de la expresión se seleccionan para que sean compatibles con la expresión de la célula hospedadora utilizada.

Se pueden insertar el gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo en el mismo vector o en vectores de expresión separados. En realizaciones preferidas, se utilizan las regiones variables para crear genes de anticuerpo de longitud completa de cualquier isotipo de anticuerpo insertándolos en vectores de expresión que ya codifican las regiones constantes de la cadena pesada y las regiones constantes de la cadena

45 ligera del isotipo deseado de tal manera que el segmento VH está unido operativamente al(a los) segmento(s) CH dentro del vector, y el segmento VL está unido operativamente al segmento CL dentro del vector. De manera adicional o alternativa, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo desde la célula hospedadora. El gen de la cadena de anticuerpo puede clonarse en el vector de tal manera que el péptido señal se una en marco al extremo amino del gen de la cadena del anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de la inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína no de inmunoglobulina).

Además de los genes de la cadena de anticuerpo y las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinante de la invención pueden contener secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la

55 replicación del vector en células hospedadoras (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células hospedadoras en las que se ha introducido el vector (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos números 4.399.216; 4.634.665 y 5.179.017). Por ejemplo, de forma típica, el gen marcador seleccionable transmite resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, o una célula hospedadora en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en las células hospedadoras dhfr con selección/amplificación por metotrexato) y el gen neo (para la selección de G418).

Para la expresión de las cadenas ligera y pesada, el(los) vector(es) de expresión que codifica(n) las cadenas pesada y ligera se transfecta(n) en una célula hospedadora mediante técnicas convencionales. Se pretende que las diversas 65 formas del término "transfección" abarquen una amplia variedad de técnicas comúnmente utilizadas para la introducción de ADN exógeno en una célula hospedadora procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación,

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precipitación con fosfato de calcio, transfección mediante DEAE-dextrano y similares. Aunque es teóricamente posible expresar los anticuerpos de la invención tanto en células hospedadoras procariotas como eucariotas, la expresión de anticuerpos en células eucariotas, y lo más preferente en células hospedadoras de mamífero, es la más preferida debido a que dichas células eucariotas, y en particular células de mamífero, son más propensas que

5 las células procariotas a ensamblarse y secretar un anticuerpo correctamente plegado e inmunológicamente activo.

Las células hospedadoras de mamífero preferidas para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen células de ovario de hámster chino (células CHO) (incluyendo células CHO dhfr, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, utilizadas con un marcador seleccionable DHFR, por 10 ejemplo, como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621), células NSO de mieloma, células COS y células SP2. En particular, para su uso en células NSO de mieloma, otro sistema de expresión preferido es el sistema de expresión génica GS desvelado en los documentos WO 87/04462, WO 89/01036, y EP 338.841. Cuando los vectores de expresión recombinante que codifican genes de anticuerpo se introducen en células hospedadoras de mamífero, se producen los anticuerpos cultivando las células hospedadoras

15 durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospedadoras o, más preferentemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que se hacen crecer células hospedadoras. Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo utilizando métodos de purificación de proteínas convencionales.

20 Inmunoconjugados

Los anticuerpos de la invención pueden conjugarse con un agente terapéutico para formar un inmunoconjugado tal como un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC). Los agentes terapéuticos adecuados incluyen antimetabolitos, agentes alquilantes, aglutinantes de la ranura menor del ADN, intercalantes de ADN, reticuladores del ADN, 25 inhibidores de la histona desacetilasa, inhibidores de la exportación nuclear, inhibidores de los proteosomas, inhibidores de la topoisomerasa I o II, inhibidores de la proteína de choque térmico, inhibidores de la tirosina quinasa, antibióticos, y agentes antimitóticos. En el ADC, el anticuerpo y el agente terapéutico se conjugan preferentemente mediante un enlazador escindible tal como un enlazador de peptidilo, disulfuro, o hidrazona. Más preferentemente, el enlazador es un enlazador de peptidilo tal como Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro-Val

30 Gly-Val-Val, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser, o Glu. Los ADC se pueden preparar como se describe en las patentes de Estados Unidos números 7.087.600; 6.989.452; y 7.129.261; las publicaciones PCT WO 02/096910; WO 07/038658; WO 07/051081; WO 07/059404; WO 08/083312; y WO 08/103693; publicaciones de patente de Estados Unidos 20060024317; 20060004081; y 20060247295.

35 Moléculas biespecíficas

En otro aspecto, la presente descripción presenta moléculas biespecíficas que comprenden uno o más anticuerpos de la invención unidos a al menos un anticuerpo o porción de unión a antígeno diferente de los mismos para generar una molécula biespecífica que se une a al menos dos sitios de unión o moléculas diana diferentes. De este modo, 40 como se usa en el presente documento, "molécula biespecífica" incluye moléculas que tienen tres o más especificidades. En una realización preferida, la molécula biespecífica comprende una primera especificidad de unión por LAG-3 y una segunda especificidad de unión por una molécula estimuladora que recluta células efectoras citotóxicas que pueden destruir una célula diana que expresa LAG-3. Los ejemplos de moléculas estimulantes adecuadas son CD64, CD89, CD16, y CD3. Véase, por ejemplo, Kufer et al., TRENDS in Biotechnology, 22 (5), 238

45 244 (2004).

En una realización, una molécula biespecífica tiene, además de la especificidad de unión dirigida contra Fc y una especificidad de unión dirigida contra LAG-3, una tercera especificidad. La tercera especificidad puede ser para un factor antipotenciación (EF), por ejemplo, una molécula que se une a una proteína superficial implicada en la

50 actividad citotóxica y que aumenta de esta forma la respuesta inmunitaria contra la célula diana. Por ejemplo, el factor antipotenciación se puede unir a un linfocito T citotóxico (por ejemplo, mediante CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, o ICAM-1) u otra célula inmunitaria, dando como resultado una respuesta inmunitaria aumentada contra la célula diana.

55 Las moléculas biespecíficas pueden estar en muchos formatos y tamaños diferentes. En un extremo del espectro de tamaños, una molécula biespecífica retiene el formato de anticuerpo tradicional, excepto que, en vez de tener dos brazos de unión de especificidad idéntica, tiene dos brazos de unión teniendo cada uno una especificidad diferente. En el otro extremo están las moléculas biespecíficas que consisten en dos fragmentos de anticuerpos monocatenarios (scFv) unidos mediante una cadena peptídica, lo que se denomina una construcción Bs(scFv)2. Las

60 moléculas biespecíficas de tamaño intermedio incluyen dos fragmentos F(ab) diferentes unidos por un enlazador de peptidilo. Las moléculas biespecíficas de estos y otros formatos pueden prepararse mediante ingeniería genética, hibridación somática, o métodos químicos. Véase, por ejemplo, Kufer et al., citado anteriormente; Cao y Suresh, Bioconjugate Chemistry, 9 (6), 635-644 (1998); y van Spriel et al., Immunology Today, 21 (8), 391-397 (2000), y las referencias citadas en el anterior.

65

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conlleva la administración una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses o una vez cada tres a 6 meses. Los regímenes de dosificación preferidos para un anticuerpo dirigido contra LAG-3 de la invención incluyen 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal mediante administración intravenosa, administrándose el anticuerpo usando uno de los

5 siguientes calendarios de dosificación: (i) cada cuatro semanas para seis dosificaciones, a continuación cada tres meses; (ii) cada tres semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal una vez seguido por 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas. En algunos métodos, la dosificación se ajusta para conseguir una concentración de anticuerpo en plasma de aproximadamente 1-1000 µg /ml y en algunos métodos aproximadamente 25-300 µg /ml.

Una "dosificación terapéuticamente eficaz" de un anticuerpo dirigido contra LAG-3 de la invención da como resultado preferentemente una disminución en la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y la duración de los periodos exentos de síntomas de la enfermedad, o una prevención del deterioro o la discapacidad debidos a la afección de la enfermedad. Por ejemplo, para el tratamiento de los sujetos que tienen tumores, una "dosificación terapéuticamente eficaz" inhibe preferentemente el crecimiento del tumor en al menos

15 aproximadamente un 20 %, más preferentemente en al menos aproximadamente un 40 %, aún de forma más preferente en al menos aproximadamente un 60 %, y todavía de forma más preferente en al menos aproximadamente un 80 % con respecto a los sujetos no tratados. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño del tumor, o mejorar de otra forma los síntomas en un sujeto, que es normalmente un ser humano o puede ser de otro mamífero.

La composición farmacéutica puede ser una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos, y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como etileno acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed.,

25 Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.

Las composiciones terapéuticas se pueden administrar mediante dispositivos médicos tales como (1) dispositivos de inyección hipodérmica sin aguja (por ejemplo, documentos US 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; y 4.596.556); (2) bombas de microinfusión (documento US 4.487.603); (3) dispositivos transdérmicos (documento US 4.486.194); (4) aparatos de infusión (documentos US 4.447.233 y 4.447.224); y (5) dispositivos osmóticos (documentos US 4.439.196 y 4.475.196).

En determinadas realizaciones, los anticuerpos monoclonales humanos de la invención pueden formularse para asegurar una distribución adecuada in vivo. Por ejemplo, para asegurar que los compuestos terapéuticos de la

35 invención cruzan la barrera hematoencefálica, se pueden formular en liposomas, que pueden comprender adicionalmente restos directores para potenciar el transporte selectivo en células u órganos específicos. Véase, por ejemplo los documentos US 4.522.811; 5.374.548; 5.416.016; y 5.399.331; V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685; Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038; Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180; Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134; Schreier et al. (1994) J Biol. Chem. 269:9090; Keinanen y Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; y Killion y Fidler (1994) Immunomethods 4:273.

Usos de la invención

45 Los anticuerpos (composiciones, moléculas biespecíficas, e inmunoconjugados) de la presente invención tienen numerosas utilidades in vitro e in vivo que implican, por ejemplo, la detección de LAG-3 o la potenciación de respuestas inmunitarias mediante el bloqueo de LAG-3. En una realización preferida, los anticuerpos son anticuerpos humanos. Dichos anticuerpos se pueden administrar a células en cultivo, in vitro o ex vivo, o a sujetos humanos, por ejemplo, in vivo, para potenciar la inmunidad en varias situaciones. En consecuencia, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de la invención puede utilizarse en un método para modificar una respuesta inmunitaria en un sujeto que comprende administrar al sujeto el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de tal manera que se modifica la respuesta inmunitaria en el sujeto. Preferentemente, la respuesta se potencia, estimula o regula en exceso.

55 Los sujetos preferidos incluyen pacientes humanos que necesitan potenciar una respuesta inmunitaria. Los métodos son particularmente adecuados para tratar pacientes humanos que tienen un trastorno que se puede tratar aumentando una respuesta inmunitaria (por ejemplo, la respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T). Adicionalmente, los métodos son particularmente adecuados para el tratamiento del cáncer in vivo. Para conseguir la potenciación de la inmunidad específica de antígeno, los anticuerpos dirigidos contra LAG-3 se pueden administrar junto con un antígeno de interés o el antígeno puede estar ya presente en el sujeto que se va a tratar (por ejemplo, un sujeto que tiene un tumor o que tiene un virus). Cuando los anticuerpos contra LAG-3 se administran junto con otro agente, los dos se pueden administrar en cualquier orden o simultáneamente.

Se describen además en el presente documento métodos para detectar la presencia del antígeno LAG-3 humano en

65 una muestra, o medir la cantidad del antígeno LAG-3 humano, que comprenden poner en contacto la muestra, y una muestra de control, con un anticuerpo monoclonal humano, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se

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ejemplo de dicha combinación es un anticuerpo dirigido contra LAG-3 combinado con descarbazina para el tratamiento del melanoma. Otro ejemplo de dicha combinación es un anticuerpo dirigido contra LAG-3 combinado con interleucina-2 (IL-2) para el tratamiento del melanoma. La lógica científica subyacente al uso combinado del bloqueo de LAG-3 y la quimioterapia es que la muerte celular, que es una consecuencia de la acción citotóxica de la

5 mayoría de compuestos quimioterapéuticos, debería dar como resultado mayores niveles de antígeno tumoral en la ruta de presentación del antígeno. Otros tratamientos combinados que pueden dar como resultado la sinergia con el bloqueo de LAG-3 a través de la célula son la radiación, la cirugía, y la privación de hormonas. Cada uno de estos protocolos crea una fuente de antígeno tumoral en el hospedador. Pueden también combinarse los inhibidores de la angiogénesis con el bloqueo de LAG-3. La inhibición de la angiogénesis conduce a la muerte de células tumorales que pueden alimentar al antígeno tumoral en las rutas de presentación del antígeno al hospedador.

Se pueden usar también anticuerpos que bloquean LAG-3 en combinación con anticuerpos biespecíficos que dirigen las células efectoras que expresan el receptor Fcα o Fcγ hacia las células tumorales (véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos números 5.922.845 y 5.837.243). Se pueden usar anticuerpos biespecíficos que se

15 dirijan a dos antígenos diferentes. Por ejemplo, se han utilizado anticuerpos biespecíficos dirigidos contra el receptor de FC/antígeno antitumoral (por ejemplo, Her-2/neu) para dirigir macrófagos a los sitios del tumor. Este direccionamiento puede activar más eficazmente respuestas específicas de tumor. El brazo de linfocitos T de estas respuestas aumentaría mediante el uso del bloqueo de LAG-3. Como alternativa, el antígeno puede administrarse directamente a las CD mediante el uso de anticuerpos biespecíficos que se unen al antígeno tumoral y al marcador superficial celular específico de células dendríticas.

Los tumores eluden la vigilancia inmunitaria del hospedador mediante una gran variedad de mecanismos. Muchos de estos mecanismos pueden superarse mediante la inactivación de las proteínas que expresan los tumores y que son inmunosupresoras. Estas incluyen entre otras TGF-β (Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050), IL-10

25 (Howard y O’Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200), y ligando Fas (Hahne et al. (1996) Science 274: 13631365). Los anticuerpos de cada una de estas entidades se pueden usar junto con un anticuerpo dirigido contra LAG3 para contrarrestar los efectos del agente inmunosupresor y favorecer las respuestas inmunitarias tumorales del hospedador.

Se pueden usar otros anticuerpos que activan la sensibilidad inmunitaria del hospedador junto con el anticuerpo dirigido contra LAG-3. Estos incluyen moléculas sobre la superficie de células dendríticas que activan la función CD y la presentación del antígeno. Los anticuerpos dirigidos contra CD40 son capaces de sustituir eficazmente la actividad de los linfocitos T auxiliares (Ridge et al. (1998) Nature 393: 474-478) y se pueden usar junto con los anticuerpos dirigidos contra LAG-3 (Ito et al. (2000) Immunobiology 201 (5) 527-40). Anticuerpos activadores de las

35 moléculas coestimulantes de los linfocitos T tales como CTLA-4 (por ejemplo, patente de Estados Unidos n.º 5.811.097), OX-40 (Weinberg et al. (2000) Immunol 164: 2160-2169), 4-1BB (Melero et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997), e ICOS (Hutloff et al. (1999) Nature 397: 262-266) pueden proporcionar también niveles aumentados de activación de linfocitos T.

El trasplante de médula ósea se usa actualmente para tratar varios tumores de origen hematopoyético. Aunque la enfermedad de injerto frente a hospedador es una consecuencia de este tratamiento, puede obtenerse un beneficio terapéutico del injerto frente a las respuestas tumorales. Se puede usar el bloqueo de LAG-3 para aumentar la eficacia de los linfocitos T específicos de tumor injertados en el donante.

45 Existen también varios protocolos de tratamiento experimentales que implican la activación y expansión ex vivo de linfocitos T específicos de antígenos y la transferencia adoptiva de estas células en receptores a fin de estimular los linfocitos T específicos de antígenos frente al tumor (Greenberg & Riddell (1999) Science 285: 546-51). Estos métodos se pueden usar también para activar respuestas de los linfocitos T a agentes infecciosos tales como CMV. La activación ex vivo en presencia de anticuerpos dirigidos contra LAG-3 puede aumentar la frecuencia y la actividad de los linfocitos T transferidos adoptivamente.

Enfermedades infecciosas

Adicionalmente, Se describen en el presente documento métodos que se utilizan para tratar pacientes que se han

55 expuesto a toxinas o patógenos concretos. En consecuencia, se describe en el presente documento un método para tratar una enfermedad infecciosa en un sujeto que comprende administrar al sujeto un anticuerpo dirigido contra LAG-3, o la porción de unión a antígeno del mismo, de tal manera que el sujeto se trata para la enfermedad infecciosa. Preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo humano dirigido contra LAG-3 humano (tal como cualquiera de los anticuerpos humanos dirigidos contra LAG-3 humano descritos en el presente documento). De manera adicional o alternativa, el anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico o humanizado.

Similar a su aplicación a los tumores que se ha descrito anteriormente, el bloqueo de LASG-3 mediado por anticuerpo se puede usar solo, o como un adyuvante, en combinación con vacunas, para estimular la respuesta inmunitaria a patógenos, toxinas, y autoantígenos. Los ejemplos de patógenos para los cuales esta solución 65 terapéutica puede ser particularmente útil incluyen patógenos para los cuales no existe actualmente vacuna eficaz, o patógenos para los cuales las vacunas convencionales son menos que completamente eficaces. Estas incluyen,

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respuesta inmunitaria en el sujeto. Preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo humano dirigido contra LAG-3 humano (tal como cualquiera de los anticuerpos humanos dirigidos contra LAG-3 humano descritos en el presente documento). De manera adicional o alternativa, el anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico o humanizado. El antígeno puede ser, por ejemplo, un antígeno tumoral, un antígeno vírico, un antígeno bacteriano o un antígeno

5 procedente de un patógeno. Los ejemplos no limitantes de dichos antígenos incluyen los descritos en las secciones anteriores, tales como los antígenos tumorales (o vacunas tumorales) analizados anteriormente, o antígenos procedentes de virus, bacterias u otros patógenos descritos anteriormente.

Las rutas adecuadas para administrar las composiciones de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas e inmunoconjugados) de la invención in vivo e in vitro son bien conocidas en la técnica y se pueden seleccionar por las personas normalmente expertas en la materia. Por ejemplo, las composiciones de anticuerpos se pueden administrar mediante inyección (por ejemplo, intravenosa o subcutánea). Las dosificaciones adecuadas de las moléculas utilizadas dependerán de la edad y el peso del sujeto y de la concentración y/o la formulación de la composición de anticuerpo.

15 Como se ha descrito anteriormente, los anticuerpos dirigidos contra LAG-3 humano de la invención pueden coadministrarse con uno o más agentes terapéuticos, por ejemplo, un agente citotóxico, un agente radiotóxico o un agente inmunosupresor. El anticuerpo puede unirse al agente (como un inmunocomplejo) o se puede administrar por separado del agente. En el último caso (administración separada), el anticuerpo puede administrarse antes, después

o simultáneamente con el agente o puede coadministrarse con otros tratamientos conocidos, por ejemplo, una terapia dirigida contra el cáncer, por ejemplo, radiación. Dichos agentes terapéuticos incluyen, entre otros, agentes antineoplásicos tales como doxorrubicina (adriamicina), sulfato de cisplatino bleomicina, carmustina, clorambucilo, dacarbazina y ciclofosfamida hidroxiurea que, por sí mismos, son solo eficaces a niveles que son tóxicos o subtóxicos para un paciente. Cisplatino se administra por vía intravenosa como una dosis de 100 mg/ml una vez

25 cada cuatro semanas y se administra adriamicina por vía intravenosa como una dosis de 60-75 mg/ml una vez cada 21 días. La coadministración de los anticuerpos dirigidos contra LAG-3 humano, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención con agentes quimioterapéuticos proporciona dos agentes anticancerosos que funcionan mediante diferentes mecanismos que dan como resultado un efecto citotóxico en células tumorales humanas. Dicha coadministración puede resolver problemas debido al desarrollo de resistencia a los fármacos o un cambio en la antigenicidad de las células tumorales que les volvería no reactivos con el anticuerpo.

También se incluyen en el alcance de la presente invención kits que comprenden las composiciones de anticuerpos de la invención (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas biespecíficas o multiespecíficas, o inmunoconjugados) e instrucciones para el uso. El kit puede contener además un reactivo adicional, o uno o más

35 anticuerpos humanos adicionales de la invención (por ejemplo, un anticuerpo humano que tiene una actividad complementaria que se une a un epítopo de un antígeno LAG-3 distinto del primer anticuerpo humano). Los kits incluyen normalmente una marca indicativa del uso previsto del contenido del kit. El término marca incluye cualquier material escrito, o grabado suministrado sobre o con el kit, o que acompaña de otra forma al kit.

Terapia de combinación

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo dirigido contra LAG-3 (o una porción de unión a antígeno del mismo) de la invención para su uso en un método de tratamiento combinado en el que el anticuerpo dirigido contra LAG-3 (o la porción de unión a antígeno del mismo) se coadministra con uno o más anticuerpos adicionales que son 45 eficaces para estimular respuestas inmunitarias para potenciar, estimular o regular en exceso todavía más las respuestas inmunitarias de un sujeto. En una realización, la invención proporciona un anticuerpo dirigido contra LAG3 de la invención para su uso en un método para estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto que comprende administrar al sujeto un anticuerpo dirigido contra LAG-3 y uno o más anticuerpos inmunoestimulantes adicionales, tales como un anticuerpo dirigido contra PD-1, un anticuerpo dirigido contra PD-L1 y/o un anticuerpo dirigido contra CTLA-4, de tal manera que se estimula una respuesta inmunitaria en el sujeto, por ejemplo, para inhibir el crecimiento tumoral o para estimular una respuesta antivírica. En otra realización, se administra al sujeto un anticuerpo dirigido contra LAG-3 y un anticuerpo dirigido contra PD-1. En otra realización adicional más, se administra al sujeto un anticuerpo dirigido contra LAG-3 y un anticuerpo dirigido contra PD-L1. En otra realización adicional, se administra al sujeto un anticuerpo dirigido contra LAG-3 y un anticuerpo dirigido contra CTLA-4. En una

55 realización, el anticuerpo dirigido contra LAG-3 es un anticuerpo humano, tal como un anticuerpo de la divulgación. Como alternativa, el anticuerpo dirigido contra LAG-3 puede ser, por ejemplo, un anticuerpo quimérico o humanizado (por ejemplo, preparado a partir de un mAb de ratón dirigido contra LAG-3). En otra realización, el al menos un anticuerpo inmunoestimulante adicional (por ejemplo, el anticuerpo dirigido contra PD-1, dirigido contra PD-L-1 y/o dirigido contra CTLA-4) es un anticuerpo humano. Como alternativa, el al menos un anticuerpo inmunoestimulante adicional puede ser, por ejemplo, un anticuerpo quimérico o humanizado (por ejemplo, preparado a partir de un anticuerpo de ratón dirigido contra PD-1, PD-L1 y CTLA-4).

Adicionalmente, se describe en el presente documento un método para tratar una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, cáncer), que comprende administrar un anticuerpo dirigido contra LAG-3 y un anticuerpo dirigido contra 65 CTLA-4 a un sujeto. El anticuerpo dirigido contra LAG-3 puede administrarse a una dosis subterapéutica, el anticuerpo dirigido contra CTLA-4 se administra a una dosis subterapéutica, o ambos se administran a una dosis

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