ES2326144T3 - Anticuerpo quimerico anti-cd20. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para producir un anticuerpo anti-CD20 quimérico, comprendiendo el procedimiento expresar las cadenas ligera y pesada del anticuerpo en una línea celular huésped para producir el anticuerpo, en el que la cadena ligera del anticuerpo comprende la región variable de la cadena ligera cuya secuencia de aminoácidos es codificada por la secuencia del ácido nucleico mostrada en la Figura 4, y la cadena pesada del anticuerpo comprende la región variable de la cadena pesada cuya secuencia de aminoácidos es codificada por la secuencia del ácido nucleico mostrada en la Figura 5.

Description

Anticuerpo quimérico anti-CD20.

La presente invención está dirigida a un anticuerpo quimérico anti-CD20, inmunológicamente activo.

El sistema inmunitario de los vertebrados (por ejemplo, primates, que incluye seres humanos, simios, monos, etc.) consta de una serie de órganos y tipos de células que han evolucionado para: reconocer de forma precisa y específica microorganismos extraños ("antígeno") que invaden al huésped vertebrado; unirse específicamente a dichos microorganismos extraños; y eliminar/destruir dichos microorganismos extraños. Los linfocitos, entre otros, son críticos para el sistema inmunitario. Los linfocitos se producen en el timo, bazo y médula ósea (adulto) y representan aproximadamente 30% de los leucocitos totales presentes en el sistema circulatorio de los seres humanos (adulto). Hay dos subpoblaciones principales de linfocitos: las células T y las células B. Las células T son responsables de la inmunidad mediada por células, mientras que las células B son responsables de la producción de anticuerpos (inmunidad humoral). Sin embargo, las células T y las células B se pueden considerar como interdependientes, en una respuesta inmunitaria típica, las células T son activadas cuando el receptor de células T se une a fragmentos de un antígeno que están unidos a glicoproteínas del complejo principal de histocompatibilidad ("MHC") en la superficie de una célula presentadora de antígeno; dicha activación produce la liberación de mediadores biológicos ("interleuquinas") que, en esencia, estimulan a las células B para diferenciarse y producir anticuerpos ("inmunoglobulinas") contra el antígeno.

Cada célula B en el huésped expresa un anticuerpo diferente en su superficie, por lo tanto, una célula B expresará un anticuerpo específico para un antígeno, mientras que otra célula B expresará un anticuerpo específico para un antígeno diferente. Por consiguiente, las células B son bastante diversas, y esta diversidad es crítica para el sistema inmunitario. En seres humanos, cada células B puede producir un número enorme de moléculas de anticuerpo (es decir, aproximadamente 10^{7} a 10^{8}). Dicha producción de anticuerpos lo más normal es que cese (o disminuya sustancialmente) cuando se ha neutralizado el antígeno extraño. Sin embargo, a veces, la proliferación de una célula B particular continua constante; y dicha proliferación puede dar como resultado un cáncer denominado "linfoma de células B".

Tanto las células T como las B comprenden proteínas de superficie celular que se pueden usar como "marcadores" para la diferenciación e identificación. Uno de dichos marcadores de células B humanas es el antígeno de diferenciación restringido de linfocitos B humano Bp35, denominado "CD20". CD20 es expresado durante el desarrollo temprano de células pre-B y permanece hasta la diferenciación celular en el plasma. Específicamente, la molécula CD20 puede regular una etapa en el proceso de activación que es necesario para el inicio del ciclo celular y la diferenciación, y normalmente se expresa en niveles muy altos en las células B neoplásicas ("tumor"). Por definición, CD20 está presente tanto en células B "normales" como en células B "malignas", es decir las células B cuya proliferación constante puede conducir al linfoma de células B. Por lo tanto, el antígeno de superficie CD20 tiene el potencial de servir como candidato para la "localización" de linfomas de células B.

En esencia, dicha localización se puede generalizar como sigue: por ejemplo, se inyectan a un paciente anticuerpos específicos para el antígeno de superficie CD20 de células B. Estos anticuerpos anti-CD20 se unen específicamente al antígeno de superficie celular CD20 de células B (aparentemente) tanto normales como malignas; el anticuerpo anti-CD20 unido al antígeno de superficie CD20 puede conducir a la destrucción y reducción de células B neoplásicas. Además, los agentes químicos o marcadores radiactivos que tienen el potencial para destruir el tumor pueden conjugarse con el anticuerpo anti-CD20 de modo que el agente es "suministrado" específicamente, p. ej., en las células neoplásicas. Independientemente del procedimiento, un objetivo principal es destruir el tumor: el procedimiento específico se puede determinar por el anticuerpo anti-CD20 particular que se usa, y por lo tanto, los procedimientos disponibles para localizar el antígeno CD20 pueden variar considerablemente.

Por ejemplo, se han descrito intentos de dicha localización del antígeno de superficie CD20. Se administró supuestamente anticuerpo monoclonal murino (ratón) 1F5 (un anticuerpo anti-CD20) por infusión intravenosa continua a pacientes con linfoma de células B. Se describió que se necesitaron niveles extremadamente altos (>2 gramos) de 1F5 para reducir drásticamente las células tumorales en la circulación, y los resultados se describieron como "transitorios". Press y col., "Monoclonal Antibody 1F5 (Anti-CD20) Serotherapy of Human B-Cell Lymphomas", Blood 69/2:564-591 (1987). Un problema potencial con este procedimiento es que los anticuerpos monoclonales no humanos (p. ej., anticuerpos monoclonales murinos) normalmente carecen de funcionalidad efectora humana, es decir, no son capaces, entre otros, de mediar la lisis dependiente de complemento o producir la lisis de células diana humanas a través de la toxicidad celular dependiente de anticuerpo o la fagocitosis mediada por el receptor Fc. Además, los anticuerpos monoclonales no humanos pueden ser reconocidos por el huésped humano como una proteína extraña; por lo tanto, las inyecciones repetidas de estos anticuerpos extraños pueden conducir a la inducción de respuestas inmunitarias que conducen a reacciones de hipersensibilidad dañinas. Para anticuerpos monoclonales basados en murino, esto se denomina a menudo respuesta de anticuerpo humano anti-ratón, o respuesta "HAMA" (por sus siglas en inglés, "Human Anti-Mouse Antibody response". Además, estos anticuerpos "extraños" pueden ser atacados por el sistema inmunitario del huésped de modo que son, en efecto, neutralizados antes de que alcancen el sitio diana.

Los linfocitos y las células de linfoma son inherentemente sensibles a la radioterapia por varias razones: la emisión local de radiación ionizante de anticuerpos radiomarcados puede matar células con o sin el antígeno diana (p. ej., CD20) cercanas al anticuerpo unido al antígeno; la radiación penetrante puede eludir el problema de acceso limitado al anticuerpo en tumores voluminosos o poco vascularizados; y, se puede reducir la cantidad total de anticuerpo necesaria. El radionucleido emite partículas radiactivas que pueden dañar el ADN celular hasta el punto en el que los mecanismos de reparación celular no son capaces de permitir que la célula continúe viviendo; por lo tanto, si las células diana son tumores, el marcador radiactivo mata de forma beneficiosa las células tumorales. Los anticuerpos radiomarcados, por definición, incluyen el uso de una sustancia radiactiva que puede requerir tomar precauciones tanto para el paciente (es decir, posible transplante de médula ósea) como para el profesional sanitario (es decir, la necesidad de tener un grado alto de precaución cuando se trabaja con radiactividad).

Por lo tanto, un procedimiento para mejorar la capacidad de anticuerpos monoclonales murinos de ser eficaces en el tratamiento de trastornos de células B, ha sido conjugar un marcador radiactivo o toxina con el anticuerpo de modo que el marcador o la toxina son localizados en el sitio del tumor. Por ejemplo, el anticuerpo IF5 antes mencionado, se ha "marcado" con yodo 131 ("^{131}I") y se evaluó repetidamente la biodistribución en dos pacientes. Véase, Eary, J.F. y col., "Imaging and Treatment of B-Cell Lymphoma" J. Nue. Med. 31/8:1257-1268(1990); véase también, Press, O.W. y col., "Treatment of Refractory Non-Hodgkin's Lymphoma with Radiolabeled MB-1 (Anti-CD37) Antibody" J. Clin. Onc. 7/8:1027-1038 (1989) (indicación de que un paciente tratado con IF-5 marcado con ^{131}I logró una "respuesta parcial"); Goldenberg, D.M. y col., "Targeting, Dosimetry and Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphomas with Iodine-131-Labeled LL2 Monoclonal Antibody" J. Clin. Onc. 9/4:548-564 (1991) (se describe que 3 de 8 pacientes que recibieron inyecciones múltiples desarrollaron una respuesta de HAMA); Appelbaum, F.R., "Radiolabeled Monoclonal Antibodies in the Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma" Hem. I Onc. Clinics of N.A. 5/5:1013-1025 (1991) (artículo de revisión); Press, O.W. y col. "Radiolabeled-Antibody Therapy of B-Cell Lymphoma with Autologous Bone Marrow Support". New England Journal of Medicine 329/17:1219-12223 (1993) (anticuerpo anti-CD20 marcado con yodo-131 IF5 y B1); y Kaminski, M.G. y col. "Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphoma with [121I] Anti-B1 (Anti-CD20) Antibody". NEJM 329/7 (1993) (anticuerpo anti-CD20 marcado con yodo-131 B1; en lo sucesivo "Kaminski").

Las toxinas (es decir, agentes quimioterapéuticos tales como doxorrubicina o mitomicina C) también se han conjugado con anticuerpos. Véase, por ejemplo, la solicitud publicada PCT WO 92/07466 (publicada el 14 de mayo, 1992).

Se han desarrollado anticuerpos "quiméricos", es decir anticuerpos que comprenden porciones de dos o más especies diferentes (p. ej., ratón y ser humano), como una alternativa a los anticuerpos "conjugados". Por ejemplo, Liu, A.Y. y col., "Production of a Mouse-Human Chimeric Monoclonal Antibody to CD20 with Potent Fc-Dependent Biologic Activity" J. Immun. 139/10:3521-3526 (1987), describen un anticuerpo quimérico de ratón/ser humano dirigido contra el antígeno CD20. Véase también, la publicación PCT nº WO 88/04936. Sin embargo, en la referencia no se proporciona información sobre la capacidad, eficacia o factibilidad del uso de dichos anticuerpos quiméricos para el tratamiento de trastornos de células B. Hay que indicar que los ensayos funcionales in vitro (p. ej., la lisis dependiente de complemento ("CDC"); citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo ("ADCC"), etc.) no pueden predecir de forma inherente la capacidad in vivo de un anticuerpo quimérico para destruir o reducir células diana que expresan el antígeno específico. Véase, por ejemplo, Robinson, R.D. y col., "Chimeric mouse-human anti-carcinoma antibodies that mediate different antitumor cell biological activities", Hum. Antibod. Hybridomes 2:84-93 (1991) (anticuerpo quimérico de ratón-humano que tiene actividad de ADCC no detectable). Por lo tanto, la potencial eficacia terapéutica del anticuerpo quimérico sólo se puede evaluar correctamente por experimentación in vivo.

Lo que se necesita y lo que sería un gran avance en la materia, son procedimientos terapéuticos que localicen el antígeno CD20 para el tratamiento de linfomas de células B en primates, incluyendo, pero no limitado a seres humanos.

En el presente documento se describen procedimientos terapéuticos diseñados para el tratamiento de trastornos de células B, en particular linfomas de células B. Estos protocolos se basan en la administración de anticuerpos anti-CD20 quiméricos inmunológicamente activos para la reducción de células B en la sangre periférica, incluyendo células B asociadas con linfoma; la administración de anticuerpos anti-CD20 radiomarcados para localizar tumores asociados con células B periféricas y localizadas; y la administración de anticuerpos anti-CD20 quiméricos y anticuerpos anti-CD20 radiomarcados en una estrategia terapéutica cooperativa.

En resumen, la presente invención proporciona la materia objeto expuesta en las reivindicaciones.

La presente invención se describirá con más detalle con referencia a los dibujos que acompañan en los que:

Figura 1. Representación en diagrama de un vector de expresión de anticuerpo quimérico en tándem útil en la producción de anticuerpos anti-CD20 quiméricos inmunológicamente activos ("TCAE 8").

Figuras 2A a 2E. Secuencia del ácido nucleico del vector de la Figura 1.

Figuras 3A a 3F. Secuencia del ácido nucleico del vector de la Figura 1 que además comprende las regiones variables de la cadena ligera y pesada murina ("anti-CD20 en TCAE 8").

Figura 4. Secuencias del ácido nucleico y de aminoácidos (que incluyen las regiones CDR y armazón) de la región variable de la cadena ligera obtenida del anticuerpo monoclonal anti-CD20 murino 2B8.

Figura 5. Secuencias del ácido nucleico y de aminoácidos (que incluyen las regiones CDR y armazón) de la región variable de la cadena pesada obtenida del anticuerpo monoclonal anti-CD20 murino 2B8.

Figura 6. Resultados de citometría de flujo que ponen de manifiesto la unión de C1q humano con marcador fluorescente al anticuerpo anti-CD20 quimérico, incluyendo, como controles C1q marcado; C1q marcado y anticuerpo monoclonal anti-CD20 murino 2B8; y C1q marcado e IgGI,k humana.

Figura 7. Representa los resultados de la lisis relacionada con el complemento que compara el anticuerpo anti-CD20 quimérico y el anticuerpo monoclonal anti-CD20 murino.

Figura 8. Representa los resultados de citotoxicidad celular mediada por anticuerpo con células efectoras humanas in vivo que comparan el anticuerpo anti-CD20 quimérico y 2B8.

Figuras 9A, 9B y 9C. Proporcionan los resultados de la reducción de linfocitos B en la sangre periférica de primates no humanos después de infusión de 0,4 mg/kg (A); 1,6 mg/kg (B); y 6,4 mg/kg (C) de anticuerpo anti-CD20 quimérico inmunológicamente activo.

Figura 10. Proporciona los resultados, entre otros, de la reducción de linfocitos B en la sangre periférica de primate no humano, después de infusión de 0,01 mg/kg de anticuerpo anti-CD20 quimérico inmunológicamente activo.

Figura 11. Proporciona los resultados del impacto tumoricida de Y2B8 en un modelo xenográfico de ratón usando un tumor linfoblástico de células B.

Figura 12. Proporciona los resultados del impacto tumoricida de C2H8 en un modelo xenográfico de ratón utilizando un tumor linfoblástico de células B;

Figura 13. Proporciona los resultados del impacto tumoricida de una combinación de Y2B8 y C2B8 en un modelo xenográfico de ratón usando un tumor linfoblástico de células B; y

Figuras 14A y 14B. Proporcionan los resultados de un análisis clínico en fase I/II de C2B8 que ponen de manifiesto la reducción de la población de células B con el tiempo para pacientes que manifiestan una remisión parcial de la enfermedad (14A) y una remisión menor de la enfermedad (14B).

En general, los anticuerpos están compuestos de moléculas de dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas; estas cadenas forman una forma de "Y" general, con las cadenas tanto ligeras como pesadas formando los brazos de la Y y las cadenas pesadas formando la base de la Y. Las cadenas ligeras y pesadas se dividen en dominios de homología estructural y funcional. Los dominios variables de las cadenas tanto ligeras ("V_{L}") como pesadas ("V_{H}") determinan el reconocimiento y la especificidad. Los dominios de la región constante de las cadenas ligeras ("C_{L}") y pesadas ("C_{H}") confieren propiedades biológicas importantes, p. ej., asociación de cadenas de anticuerpo, secreción, movilidad transplacental, unión del complemento de unión al receptor F_{c}, etc. Las series de sucesos que conducen a la expresión del gen de la inmunoglobulina en las células que producen anticuerpos son complejas. Las secuencias génicas de las regiones de dominio variable están situadas en segmentos génicos de líneas germinales separadas denominados "V_{H}", "D" y "J_{H}" o "V_{L}" y "J_{L}". Estos segmentos génicos son unidos por las reordenaciones de ADN para formar las regiones V completas expresadas en las cadenas pesada y ligera, respectivamente. Los segmentos V unidos, reordenados (V_{L}-J_{L} y V_{H}-D-J_{H}) codifican entonces las regiones variables completas o dominios de unión al antígeno de las cadenas ligeras y pesadas, respectivamente.

La seroterapia de linfomas de células B humanas usando un anticuerpo monoclonal murino anti-CD20 (1F5) la han descrito Presa y col., (69 Blood 584, 1987, véase antes); desgraciadamente, las respuestas terapéuticas descritas eran transitorias. Además, se dice que 25% de los pacientes ensayados desarrollaron una respuesta de anticuerpo humano anti-ratón (HAMA) a la seroterapia. Press y col., sugieren que estos anticuerpos conjugados con toxinas o radioisótopos pueden proporcionar un beneficio clínico de mayor duración que el anticuerpo no conjugado.

Debido a los efectos debilitantes del linfoma de células B y a la necesidad real de proporcionar procedimientos de tratamiento viables de estas enfermedades, los autores de la invención han intentado diferentes procedimientos que tienen un anticuerpo particular, 2B8, como el enlace común entre los procedimientos. Uno de dichos procedimientos explota de forma provechosa la capacidad de los sistemas de mamíferos para recuperar fácil y eficazmente las células B de la sangre periférica; utilizando este procedimiento los autores de la invención buscan, en esencia, la purga o reducción de células B en la sangre periférica y tejido linfático como medio para eliminar también los linfomas de células B. Los autores de la invención llevan esto a cabo usando, entre otros, anticuerpos anti-CD20 quiméricos inmunológicamente activos. En otro procedimiento, buscan localizar células tumorales para la destrucción con marcadores radiactivos.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo anti-CD20" es un anticuerpo que reconoce específicamente una fosfoproteína no glicosilada de superficie celular de 35.000 Daltons, denominada normalmente el antígeno de diferenciación restringida de los linfocitos B humanos Bp35, referida normalmente como CD20. Tal como se usa en el presente documento, el término "quimérico" cuando se usa en referencia a los anticuerpos anti-CD20, abarca anticuerpos que se obtienen lo más preferiblemente usando técnicas de ácido desoxirribonucleico recombinante y que comprenden componentes tanto humanos (incluyendo especies inmunológicamente "relacionadas", p. ej., el chimpancé) como no humanos: la región constante del anticuerpo quimérico es, los más preferiblemente, sustancialmente igual a la región constante de un anticuerpo humano natural; la región variable del anticuerpo quimérico se obtiene, lo más preferiblemente, de una fuente no humana y tiene la antigenicidad y especificidad deseadas frente al antígeno de superficie celular CD20. La fuente no humana puede ser cualquier fuente de vertebrado que se pueda usar para generar anticuerpos frente a un antígeno de superficie celular CD20 humano o material que comprenda un antígeno de superficie celular CD20 humano. Dichas fuentes no humanas incluyen, pero no se limitan a roedores (p. ej., conejo, rata, ratón, etc.) y primates no humanos (p. ej., cercopitécidos, simios, etc.). Lo más preferiblemente, el componente no humano (región variable) se obtiene de una fuente murina. Tal como se usa en el presente documento la frase "inmunológicamente activo" cuando se usa en referencia a anticuerpos anti-CD20 quiméricos, significa un anticuerpo quimérico que se une a C1q humano, media la lisis dependiente de complemento ("CDC") de las líneas de células linfoides B humanas, y produce la lisis de células diana humanas por medio de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo ("ADCC"). Tal como se usa en el presente documento, las frases "marcaje indirecto" y "procedimiento de marcaje indirecto" significan ambas que un agente quelante se une covalentemente a un anticuerpo y se inserta al menos un radinucleido en el agente quelante. Los agentes quelantes y radionucleidos preferidos se exponen en Srivagtava, S.C. y Mease, R.C".,Progress in Research on Ligands, Nuclides and Techniques for Labeling Monoclonal Antibodies", Nucl. Med. Bio. 18/6: 589-603 (1991) ("Srivagtava"). Un agente quelante particularmente preferido es el ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen-triaminopentacético ("MX-DTPA"); los radionucleidos particularmente preferidos para el marcaje indirecto incluyen indio [111] e itrio [90]. Tal como se usa en el presente documento, las frases "marcaje directo" y "procedimiento de marcaje directo" significan ambas que un radionucleido se une de forma covalente directamente a un anticuerpo (normalmente por un resto de aminoácido). Los radionucleidos preferidos los proporciona Srivagtava; un radionucleido particularmente preferido para el marcaje directo es el yodo [131] unido covalentemente por los restos de tirosina. Se prefiere particularmente el procedimiento de marcaje indirecto.

Los procedimientos terapéuticos descritos en el presente documento se basan en la capacidad del sistema inmunitario de los primates para recuperar, o rejuvenecer, rápidamente, las células B de la sangre periférica. Además, debido a que la respuesta inmunitaria principal de los primates es producida por células T, cuando el sistema inmunitario tiene una deficiencia de células B en la sangre periférica, no es necesario el requisito de precauciones "extraordinarias" (es decir, aislamiento de pacientes, etc.). Como resultado de este y otros matices de los sistemas inmunitarios de los primates, el procedimiento terapéutico de los autores de la invención para los trastornos de células B permite la depuración de células B de la sangre periférica usando anticuerpos anti-CD20 quiméricos inmunológicamente activos.

Debido a que los trastornos de células B de la sangre periférica, pueden indicar una necesidad de acceso a la sangre para el tratamiento, la vía de administración de los anticuerpos anti-CD20 quiméricos inmunológicamente activos y los anticuerpos anti-CD20 radiomarcados, preferiblemente es la parenteral; tal como se usa en el presente documento, el término "parenteral" incluye la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, rectal, vaginal o intraperitoneal. De estas, la administración intravenosa es la más preferida.

Los anticuerpos anti-CD20 quiméricos inmunológicamente activos y los anticuerpos anti-CD20 radiomarcados normalmente se suministrarán por una técnica estándar en un tampón farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, disolución salina estéril, agua tamponada estéril, propilenglicol, combinaciones de los anteriores, etc. Los procedimientos para preparar los agentes administrables por vía parenteral se describen en Pharmaceutical Carriers & Formulations, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15ª Ed. (Mack Pub. Co., Easton, PA 1975). La cantidad terapéuticamente eficaz, específica, de anticuerpos anti-CD20 quiméricos inmunológicamente activos útiles para producir un efecto terapéutico único en cualquier paciente dado, se puede determinar por técnicas estándar conocidas por los expertos en la materia.

Las dosificaciones eficaces (es decir, cantidades terapéuticamente activas) de los anticuerpos anti-CD20 quiméricos inmunológicamente activos están en el intervalo de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal, más preferiblemente de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal, y los más preferiblemente de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 20,0 mg/kg de peso corporal. Otras dosificaciones son viables; los factores que influyen en la dosificación incluyen, pero no se limitan a la gravedad de la enfermedad; procedimientos de tratamiento previos; salud general del paciente; otras enfermedades presentes, etc. El experto en la materia podrá evaluar fácilmente a un paciente particular y determinar una dosificación adecuada que esté dentro de los intervalos, o si es necesario, fuera de los intervalos.

La introducción de los anticuerpos anti-CD20 quiméricos inmunológicamente activos en estos intervalos de dosis se puede llevar a cabo como un tratamiento único o mediante una serie de tratamientos. Con respecto a los anticuerpos quiméricos, se prefiere que dicha introducción se lleve a cabo mediante una serie de tratamientos. Con respecto a los anticuerpos quiméricos, se prefiere que dicha introducción se lleve a cabo mediante una serie de tratamientos; este procedimiento preferido se basa en la metodología de tratamiento asociada con esta enfermedad. Sin querer ligarse a ninguna teoría particular, debido a que los anticuerpos anti-CD20 quiméricos inmunológicamente activos son tanto inmunológicamente activos como que se unen a CD20, tras la introducción inicial de los anticuerpos anti-CD20 quiméricos inmunológicamente activos en el individuo, empezará la reducción de células B de la sangre periférica; los autores de la invención han observado una reducción casi completa en aproximadamente las 24 horas después de la infusión de tratamiento. Debido a esto, la posterior o las posteriores introducciones de anticuerpos anti-CD20 quiméricos inmunológicamente activos (o anticuerpos anti-CD20 radiomarcados) en el paciente, se supone que: a) eliminan las células B restantes de la sangre periférica; b) empiezan la reducción de células B de los nodos linfáticos; c) empiezan la reducción de células B de otras fuentes de tejidos, p. ej., la médula ósea, tumor, etc. Se pone de manifiesto otra vez que al usar introducciones repetidas de los anticuerpos anti-CD20 quiméricos inmunológicamente activos, tiene lugar una serie de sucesos, siendo considerado cada uno de dichos sucesos importante por los autores de la invención para el tratamiento eficaz de la enfermedad. Por lo tanto, el primer "suceso" se puede considerar como dirigido principalmente a reducir sustancialmente las células B de la sangre periférica del paciente; los posteriores "sucesos" se pueden considerar como dirigidos principalmente a eliminar de forma simultánea o seriada el resto de las células B del sistema eliminando células B de nódulos linfáticos, o eliminando células B de otras tejidos.

En efecto, aunque una dosis única proporciona beneficios y se puede usar eficazmente para el tratamiento/gestión de la enfermedad, se puede producir un curso del tratamiento preferido a lo largo de varias etapas; lo más preferiblemente, se introducen entre aproximadamente 0,4 y aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal de los anticuerpos anti-CD20 quiméricos inmunológicamente activos en el paciente una vez a la semana, durante entre aproximadamente 2 y 10 semanas, lo más preferiblemente durante aproximadamente 4 semanas.

Con respecto al uso de los anticuerpos anti-CD20 radiomarcados, se prefiere que el anticuerpo no sea quimérico; esta preferencia se basa en la semivida en circulación significativamente más larga de los anticuerpos quiméricos frente a los anticuerpos murinos (es decir, con una semivida en la circulación más larga, el radionucleido está presente en el paciente durante periodos prolongados). Sin embargo, los anticuerpos quiméricos radiomarcados se pueden usar beneficiosamente con dosificaciones de mili-Curies ("mCi") menores junto con el anticuerpo quimérico con respecto al anticuerpo murino. Este escenario permite una disminución de la toxicidad en la médula ósea a un nivel aceptable, mientras que se mantiene la utilidad terapéutica.

Se pueden aplicar una variedad de radionucleidos a la presente invención y los expertos en la materia podrán determinar fácilmente qué radionucleido es el más adecuado en una variedad de circunstancias. Por ejemplo, el yodo (131) es un radionucleido bien conocido usado para la inmunoterapia dirigida. Sin embargo, la utilidad clínica del yodo (131) puede estar limitada por varios factores que incluyen: la semivida física de 8 días; deshalogenación del anticuerpo yodado tanto en la sangre como en el sitio del tumor; y características de emisión (p. ej., componente gamma largo) que pueden ser subóptimas para la deposición de dosis localizada en el tumor. Con la llegada de agentes de quelación superiores, la oportunidad de unir grupos quelantes de metales a proteínas ha aumentado las oportunidades de usar otros radionucleidos tales como el indio [131] y el itrio [90]. El itrio [90] proporciona varios beneficios para el uso de aplicaciones radioinmunoterapéuticas: la semivida de 64 horas del itrio [90] es suficientemente larga para permitir la acumulación de anticuerpos por el tumor y a diferencia, por ejemplo del yodo [131], el itrio [90] es un emisor beta puro de alta energía sin irradiación gamma que lo acompañe en su desintegración, con un intervalo en el tejido de 100 a 1000 diámetros de células. Además, la cantidad mínima de radiación penetrante permite la administración al paciente ambulatorio de anticuerpos marcados con itrio [90]. Además, no es necesaria la internalización del anticuerpo marcado para matar la célula, y la emisión local de radiación ionizante debe ser letal para células tumorales adyacentes que carecen del antígeno diana.

Una limitación no terapéutica del itrio [90] se basa en la ausencia de radiación gamma significativa que hace que la generación de imágenes con éste sea difícil. Para evitar este problema, se puede usa un radionucleido de diagnóstico "por imagen", tal como el indio [111], para determinar la localización y el tamaño relativo de un tumor antes de la administración de dosis terapéuticas de anti-CD20 marcado con itrio [90]. Se prefiere en particular el indio [111] como radionucleido de diagnóstico: porque se pueden administrar de forma segura entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 mCi sin toxicidad detectable; y los datos de generación de imágenes normalmente predicen la posterior distribución del anticuerpo marcado con itrio [90]. La mayoría de los estudios por imágenes usan anticuerpo marcado con indio [111] de 5 mCi porque esta dosis es segura y tiene una eficacia de generación de imágenes mayor comparada con dosis menores, formándose la imagen óptima a los 3 a 6 días después de la administración de anticuerpo. Véase, por ejemplo, Murray J.L. 26 J. Nuc. Med. 3328 (1985) y Carraguillo, J.A. y col, 26 J. Nuc. Med. 67 (1985).

Las dosificaciones únicas de tratamiento eficaces (es decir, cantidades terapéuticamente eficaces) de anticuerpos anti-CD20 marcados con itrio [90] están en el intervalo entre aproximadamente 5 y aproximadamente 75 mCi, más preferiblemente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 40 mCi. Las dosificaciones únicas no mieloablativas de tratamiento eficaces de anticuerpos anti-CD20 marcados con yodo [131] están en el intervalo entre aproximadamente 5 y aproximadamente 70 mCi, más preferiblemente entre aproximadamente 5 y aproximadamente 40 mCi. Las dosificaciones únicas ablativas de tratamiento eficaces (es decir, pueden requerir el transplante autólogo de médula ósea) de anticuerpos anti-CD20 marcados con yodo [131] están en el intervalo entre aproximadamente 30 y aproximadamente 600 mCi, más preferiblemente entre aproximadamente 50 y menos de aproximadamente 500 mCi. En conjunto con un anticuerpo anti-CD20 quimérico, debido a la semivida más larga en la circulación frente a los anticuerpos murinos, las dosificaciones únicas de tratamiento no mieloablativas eficaces de anticuerpos anti-CD20 quiméricos marcados con yodo [131] están en el intervalo entre aproximadamente 5 y aproximadamente 40 mCi, más preferiblemente menos de aproximadamente 30 mCi. Los criterios para la generación de imágenes, por ejemplo, para el marcador de indio [111] normalmente son menos de aproximadamente 5 mCi.

Con respecto a los anticuerpos anti-CD20 radiomarcados, la terapia incluida aquí también puede ser usando un solo tratamiento terapéutico o usando múltiples tratamiento. Debido al componente radionucleido, se prefiere que antes del tratamiento se "recojan" células madre periféricas ("CMP") o médula ósea ("MO") para los pacientes que experimentan toxicidad de la médula ósea potencialmente mortal como resultado de la radiación. La MO y/o las CMP se recogen usando técnicas estándar y después se purgan y congelan para la posible reinfusión. Además, se prefiere más que antes del tratamiento se lleve a cabo un estudio de dosimetría de diagnóstico en el paciente usando un anticuerpo marcado de diagnóstico (p. ej., usando indio [111]), cuyo propósito es asegurar que el anticuerpo terapéuticamente marcado (p. ej., el uso de itrio [90]) no se "concentrará" innecesariamente en cualquier órgano o tejido normales.

Se han descrito anticuerpos quiméricos de ratón/humano. Véase, por ejemplo, Morrison, S.L. y col., PNAS
11:6851-6854 (noviembre 1984); publicación de patente europea nº 173404 Bonlianne, C.L. y col., Nature 312643 (diciembre 1984), Neubeiger, M.S. y col., Nature 314:268 (marzo 1985); publicación de patente europea nº 125023; Tan y col., J. Immunol. 135:8564 (noviembre 1925); Sun. L.K y col., Hybridoma 5/I:517 (1986); Sahagan y col., J. Immunol. 137:1066-1074 (1986). Véase, en general, Muron, Nature 312:597 (diciembre de 1984); Dickson, Genetic Engineering News 5/3 (marzo de 1985); Marx, Science 229 455 (agosto de 1985); y Morrison, Science 229:1202-1207 (septiembre de 1985). Robinson y col., en la publicación PCT nº WO 88/04936, describen un anticuerpo quimérico con región constante humana y región variable murina, que tiene especificidad para un epítopo de CD20; la parte murina del anticuerpo quimérico de las preferencias de Robinson se obtiene del anticuerpo monoclonal de ratón 2H7 (gamma 2b, kappa). Aunque la referencia indica que el anticuerpo quimérico descrito es un "primer candidato" para el tratamiento de trastornos de células B, esta declaración puede verse solo como una sugerencia para los expertos en la materia para determinar si esta sugerencia es o no correcta para este anticuerpo particular, en particular porque la referencia carece de cualquier dato que apoye esta aseveración de eficacia terapéutica, y lo que es importante, de datos que usen mamíferos de orden superior tales como primates o seres humanos.

Las metodologías para generar anticuerpos quiméricos están disponibles para los expertos en la materia. Por ejemplo, las cadenas ligera y pesada pueden ser expresadas por separado, usando por ejemplo, la cadena ligera de la inmunoglobulina y las cadenas pesadas de la inmunoglobulina en plásmidos separados. Estas después se pueden purificar y montar in vitro en anticuerpos completos; las metodologías para llevar a cabo estos montajes se han descrito. Véase, por ejemplo, Scharff, M., Harvey Lectures 69:125(1974). Los parámetros de reacción in vitro para la formación de anticuerpos IgG a partir de cadenas ligeras y pesadas aisladas reducidas también se ha descrito. Véase, por ejemplo, Beychok, S., "Cells of Immunoglobulin Synthesis" Academic Press, New York, p. 69, 1979. También es posible la coexpresión de cadenas ligeras y pesadas en las mismas células para lograr la asociación intracelular y unión de las cadenas pesadas y ligeras en anticuerpos IgG H_{2}L_{2}. Dicha coexpresión se puede llevar a cabo usando los mismos o diferentes plásmidos en la misma célula huésped.

Otro procedimiento, y uno que es el procedimiento más preferido de los autores de la invención para desarrollar un anticuerpo anti-CD20 quimérico no humano/humano, se basa en el uso de un vector de expresión que incluye, desde el principio, ADN que codifica las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera de una fuente humana. Dicho vector permite insertar ADN que codifica una región variable no humana de modo que se puede generar una variedad de anticuerpos anti-CD20 no humanos, cribar y analizar las diferentes características (p. ej., tipo de especificidad de unión, regiones de unión de epítopo, etc.); después, se puede incorporar en el vector el ADNc que codifica las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo anti-CD20 preferido o deseado. Estos tipos de vectores se denominan vectores de expresión de anticuerpo quimérico en tándem ("TCAE", por sus siglas en inglés Tandem Chimeric Antibody Expression). Un vector de TCAE más preferido que se usó para generar anticuerpos anti-CD20 quiméricos inmunológicamente activos para el tratamiento terapéutico de linfomas es TCAE 8. TCAE 8 es un derivado de un vector que pertenece al cesionario de este documento de patente, denominado TCAE 5.2, siendo la diferencia que en TCAE 5.2 el sitio de inicio de la traducción del marcador seleccionable dominante (neomicina fosfotransferasa, "NEO") es una secuencia Kozak consenso, mientras que para TCAE 8, esta región es una secuencia Kozak consenso parcialmente deteriorada. Los detalles en relación con el impacto del sitio de inicio del marcador seleccionable dominante de los vectores TCAE (también denominado "vector ANEX") frente a la expresión de proteína, se describen en detalle en la solicitud de patente en tramitación con la presente presentada con la misma.

TCAE 8 comprende cuatro (4) casetes de transcripción, y estos están ordenados en tándem, es decir una cadena ligera de inmunoglobulina humana que carece de una región variable; una cadena pesada de inmunoglobulina humana que carece de una región variable; DHFR; y NEO. Cada casete de transcripción contiene su propio promotor eucariota y región de poliadenilación (se hace referencia a la figura 1 que es una representación en diagrama del vector TCAE 8). Específicamente:

1)

el promotor/potenciador de CMV delante de la cadena pesada de inmunoglobulina es una versión truncada del promotor/potenciador delante de la cadena ligera, desde el sitio NheI a -350 al sitio SstI a -16 (véase, 41 Cell 521, 1985).

2)

una región constante de la cadena ligera de inmunoglobulina humana se obtuvo por amplificación del ADNc por una reacción de PCR. En TCAE 8, esta era la región constante kappa de la cadena ligera de inmunoglobulina humana (numeración Kabat, aminoácidos 108-214, alotipo Km 3, (véase, Kabat, E.A. "Sequences of proteins of immunological interest", NIH Publication, 5ª Ed. No. 91-3242, 1991)), y la región constante gamma 1 de la cadena pesada de inmunoglobulina humana (numeración Kabat de aminoácidos 114-478, alotipo Gmla, Gmlz). La cadena ligera se aisló de sangre humana normal (IDEC Pharmaceuticals Corporation, La Jolla, CA); el ARN de la misma se usó para sintetizar el ADNc que después se amplificó usando técnicas de PCR (los cebadores se obtuvieron con respecto al consenso de Kabat). La cadena pesada se aisló (usando técnicas de PCR) del ADNc preparado a partir del ARN que a su vez se obtuvo de células transfectadas con un vector IgG1 humano (véase, 3 Prot. Eng. 531, 1990; vector pN_{\gamma 1}62). Se cambiaron 2 aminoácidos en la IgG1 humana aislada para corresponder con la secuencia consenso de aminoácidos de Kabat, a saber: el aminoácido 225 se cambió de valina a alanina (GTT a GCA), y el aminoácido 287 se cambió de metionina a lisina (ATG a AAG);

3)

Los casetes de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina humana contienen secuencias señal sintéticas para la secreción de cadenas de inmunoglobulinas;

4)

Los casetes de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina humana contienen sitios de restricción de ADN específicos que permiten la inserción de regiones variables de inmunoglobulina ligera y pesada, que mantienen el marco de lectura de transición y no alteran los aminoácidos encontrados normalmente en las cadenas de inmunoglobulina;

5)

El casete de DHFR contenía su propio promotor eucariota (promotor principal de globina beta de ratón, "BETA") y región de poliadenilación (poliadenilación de hormona de crecimiento bovino, "BGH"); y

6)

El casete de NEO contenía su propio promotor eucariota (BETA) y región de poliadenilación (poliadenilación temprana de SV40, "SV").

Con respecto al vector TCAE 8 y al casete de NEO, la región Kozak era una secuencia Kozak consenso parcialmente deteriorada (que incluía un sitio ClaI secuencia arriba):

1

(En el vector TCAE 5.2, el cambio es entre las regiones ClaI y ATG, a saber: ccAcc).

La lista de secuencias completa de TCAE 8 (incluyendo los componentes específicos de los 4 casetes de transcripción) se presenta en la figura 2 (SEQ. ID. NO. 1). Como apreciarán los expertos en la materia, los vectores TCAE permiten de forma beneficiosa reducir sustancialmente el tiempo de generación de los anticuerpos anti-CD20 quiméricos inmunológicamente activos. La generación y el aislamiento de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada no humanas, seguido de su incorporación en el casete de transcripción constante de la cadena ligera humana y el casete de transcripción constante de la cadena pesada humana, permite la producción de anticuerpos anti-CD20 quiméricos inmunológicamente activos.

Los autores de la invención han obtenido una región variable no humana más preferida con especificidad frente al antígeno CD20 usando una fuente murina y tecnología de hibridoma. Usando técnicas de reacción en cadena de la polimerasa ("PCR"), se clonaron las regiones variables pesada y ligera murinas directamente en el vector TCAE 8; esta es la vía más preferida para la incorporación de la región variable no humana en el vector TCAE. Esta preferencia se basa principalmente en la eficacia de la reacción PCR y la exactitud de la inserción. Sin embargo, están disponibles otros procedimientos equivalentes para llevar a cabo esta tarea. Por ejemplo, usando TCAE 8 (o un vector equivalente), se puede obtener la secuencia de la región variable de un anticuerpo anti-CD20 no humano, seguido de la síntesis de oligonucleótidos de partes de la secuencia o, si es adecuado, la secuencia entera: después, las partes o la secuencia sintética entera se puede insertar en las posiciones adecuadas en el vector. Los expertos en la materia disponen de la capacidad para llevar a cabo esta tarea.

Los anticuerpos anti-CD20 quiméricos inmunológicamente activos más preferidos de los autores de la invención, se obtuvieron usando el vector TCAE 8 que incluía regiones variables murinas obtenidas de anticuerpo monoclonal contra CD20; este anticuerpo (se discute en detalle más adelante) se denomina "2BS". La secuencia completa de las regiones variables de 2BS en TCAE 8 ("anti-CD20 en TCAE 8") se presenta en la figura 3 (SEQ. ID. NO. 2).

La línea celular huésped usada para la expresión de proteínas, lo más preferiblemente, es de origen mamífero; los expertos en la materia disponen de la capacidad para determinar preferentemente líneas celulares huésped particulares que son las más adecuadas para expresar en las mismas el producto génico deseado. Los ejemplos de líneas celulares huésped incluyen, pero no se limitan a DG44 y DUXBH (líneas de ovario de hámster chino, deficiente en DHFR), HELA (carcinoma de cérvix humano), CVI (línea renal de mono), COS (un derivado de CVI con antígeno T de SV40), R1610 (fibroblasto de hámster chino) BALBC/3T3 (fibroblasto de ratón), HAK (línea renal de hámster), SP2/0 (mieloma de ratón), P3x63-Ag3.653 (mieloma de ratón), BFA-IcIBPT (células endoteliales bovinas), RAJI (linfocito humano) y 293 (riñón humano). Las líneas celulares huésped normalmente están disponibles en la American Tissue Culture Collection o en la bibliografía publicada.

Preferiblemente, la línea celular huésped es DG44 ("CHO") o SP2/O. Véase, Urland, G. y col., "Effect of gamma rays and the dihydrofolate reductase locus: deletions and inversions", Som. Call & Mol. Gen. 12/6:555-566 (1986), y Shulman, M. y col., "A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies". Nature 276:269 (1978), respectivamente. Lo más preferiblemente, la línea celular huésped es DG44. La transfección del plásmido en la célula huésped se puede llevar a cabo por cualquier técnica disponible para los expertos en la materia. Estas incluyen, pero no se limitan a transfección (incluyendo electroforesis y electroporación), fusión celular con ADN con envuelta, microinyección e infección con virus intactos. Véase, Ridgway, A.A.G. "Mammalian Expression Vectors". capítulo 24.2, pág. 470-472 Vectors, Rodriguez y Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, MA 1988). Lo más preferiblemente, la introducción del plásmido en el huésped es por electroporación.

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F. Ejemplos

Los siguientes ejemplos no se pretende ni deben considerarse limitantes de la invención. Los ejemplos tienen el propósito de poner de manifiesto: la dosis-generación de imagen usando un anticuerpo anti-CD20 radiomarcado ("I2B8"); anticuerpo anti-CD20 radiomarcado ("Y2B8"); y anticuerpo anti-CD20 quimérico inmunológicamente activo ("C2B8") obtenidos utilizando un vector específico ("TCAE 8") y regiones variables derivadas de anticuerpo monoclonal anti-CD20 murino ("2B8").

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I Anticuerpo anti-CD20 radiomarcado 2B8 A. Producción de anticuerpo monoclonal anti-CD20 (murino) ("2B8")

Se inmunizaron repetidamente ratones BALB/C con la línea celular linfoblastoide humana SB (véase, Adams, R.A. y col., "Direct implantation and serial transplantation of human acute lymphoblastic leukemia in hamsters, 5B-2". Cen. Res. 28:1121 -1125 (1968); esta línea celular está disponible en la American Tissue Culture Collection, Rockville, MD., con el número de acceso en ATCC, ATCC CCL 120), con inyecciones semanales a lo largo de un periodo de 3-4 meses. Se identificaron los ratones que presentaban títulos altos de anticuerpos anti-CD20 en el suero, determinados por inhibición de anticuerpos específicos de CD20 conocidos (los anticuerpos anti-CD20 usados fueron Leu 16, Beckton Dickinson, San José, CA, nº de cat. 7670; y BI, Coulter Corp., Hialeah, FL, nº de cat. 6602201); y después se sacaron los bazos de estos ratones. Las células del bazo se fusionaron con el mieloma de ratón SP2/0 de acuerdo con el protocolo descrito por Einfeld, D.A., y col., (1988) EMBO :711 (SP2/0 tiene un número de acceso en ATCC, nº ATCC CRL 8006).

Los ensayos de especificidad para CD20 se llevaron a cabo por radioinmunoensayo. Brevemente, se radiomarcaron con I^{125} anticuerpos anti-CD20 B1 purificados por el procedimiento de yodo en perlas como describen Valentine, M.A. y col., (1989) J. Biol. Chem. 264:11282. (yoduro de sodio I^{125}, ICN, Irvine, CA, nº de cat. 28665H). Los hibridomas se cribaron por coincubación de 0,05 ml de medio de cada uno de los pocillos de fusión junto con 0,05 ml de anti-CD20 B1 marcado con I 125 (10 ng) en BSA al 1%, PBS (pH 7,4), y 0,5 ml del mismo tampón que contenía 100.000 células SB. Después de incubar durante 1 h a temperatura ambiente, las células se recogieron por transferencia a placas de titulación de 96 pocillos (V&P Scientific, San Diego, CA), y se lavaron bien. Se usaron pocillos duplicados que contenían anti-CD20 B1 no marcado y pocillos que no contenían anticuerpo de inhibición, como controles positivos y negativos, respectivamente. Los pocillos que contenían más de 50% de inhibición se expandieron y se clonaron. El anticuerpo que
demostró la mayor inhibición se obtuvo de la línea celular clonada denominada en el presente documento "2B8".

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B. Preparación del conjugado 2B8-MX-DTPA i. MX-DTPA

Se usó ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético marcado con carbono ("MX-DTPA marcado con carbono 14") como agente quelante para la conjugación de 2B8 radiomarcado. Las manipulaciones de MX-DTPA se llevaron a cabo para mantener las condiciones exentas de metales, es decir, se utilizaron reactivos exentos de metales, y cuando era posible, se usaron igualmente envases de plástico de polipropileno (matraces, vasos de precipitados, probetas, puntas de pipeta) lavados con Alconox y aclarados con agua Milli-Q. MX-DTPA se obtuvo en forma de un sólido seco de Dr. Otto Gansow (National Institute of Health, Bethesda, MD) y se almacenó desecado a 4ºC (protegido de la luz), preparándose soluciones madre en agua Milli-Q con una concentración de 2-5 mM, con almacenamiento a -70ºC. MX-DTPA también se obtuvo de Coulter Immunology (Hialeah, Florida) en forma de la sal disódica en agua y almacenado a -70ºC.

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ii. Preparación de 2B8

Se preparó 2B8 purificado para la conjugación con MX-DTPA por transferencia del anticuerpo en bicina-NaOH 50 mM exento de metales, pH 8,6, que contenía NaCl 150 mM, usando intercambio de tampón repetido con filtros de centrifugación CENTRICON 30^{TM} (30.000D, MWCO; Amicon). En general, se añadieron 50-200 \mul de proteína (10 mg/nl) a la unidad de filtración, seguido de 2 ml de tampón de bicina. El filtro se centrifugó a 4ºC en un rotor Sorval SS-34 (6.000 rpm, 45 min). El volumen retenido era aproximadamente 30-100 \mul; este procedimiento se repitió 2 veces usando el mismo filtro. El retenido se transfirió a un tubo de polipropileno de 1,5 ml con tapa roscada, se ensayó la proteína, se diluyó hasta 10,0 mg/ml y se almacenó a 4ºC hasta su uso; la proteína se transfirió igualmente a citrato sódico 50 mM, pH 5,5, que contenía NaCl 150 mM y azida sódica al 0,05%, usando el protocolo anterior.

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iii. Conjugación de 2B8 con MX-DTPA

La conjugación de 2B8 con MX-DTPA se llevó a cabo en tubos de polipropileno a temperatura ambiente. Las disoluciones madre de MX-DTPA congeladas se descongelaron inmediatamente antes de usarlas. Se hicieron reaccionar 50-200 ml de proteína 10 mg/ml con MX-DTPA en una relación molar de MX-DTPA a 2B8 de 4:1. Las reacciones se iniciaron por adición de la disolución madre de MX-DTPA y mezclamiento suave; se dejó que la conjugación procediera durante la noche (14 a 20 h), a temperatura ambiente. El MX-DTPA sin reaccionar se separó del conjugado por diálisis o ultrafiltración repetida, como se ha descrito antes en el Ejemplo I.B.ii, en disolución salina normal exenta de metales (al 0,9% p/v) que contenía azida sódica al 0,05%. La concentración de proteína se ajustó a 10 mg/ml y se almacenó a 4ºC en un tubo de polipropileno hasta el radiomarcaje.

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iv. Determinación de la incorporación de MX-DTPA

La incorporación de MX-DTPA se determinó por recuento de centelleo y comparando el valor obtenido con el conjugado purificado con la actividad específica del MX-DTPA marcado con carbono-[14]. Para algunos estudios en los que se usó MX-DTPA no radiactivo (Coulter Immunology), la incorporación de MX-DTPA se evaluó incubando el conjugado con un exceso de una disolución vehículo radiactiva de itrio-[90] de concentración y actividad específica conocidas.

Se preparó una disolución madre de cloruro de itrio de concentración conocida en HCl 0,05 N exento de metales, a la que se añadió itrio-[90] sin vehículo (sal de cloruro). Se analizó una parte alícuota de esta disolución por recuento de centelleo de líquidos para determinar una actividad específica precisa de este reactivo. Se añadió un volumen de reactivo de cloruro de itrio igual a 3 veces el número de moles de quelato que se esperaba se unieran al anticuerpo (normalmente 2 mol/mol de anticuerpo), a un tubo de polipropileno, y el pH se ajustó a 4,0-4,5 con acetato sódico 2 M. Posteriormente se añadió el anticuerpo conjugado y la mezcla se incubó 15-30 min a temperatura ambiente. La reacción se inactivó por adición de EDTA 20 mM hasta una concentración final de 1 mM, y el pH de la disolución se ajustó a aproximadamente pH 6 con acetato sódico 2 M.

Después de 5 min de incubación, el volumen entero se purificó por cromatografía de exclusión por tamaño, de alto rendimiento (descrita más adelante). Las fracciones eluídas que contenían proteína se combinaron, se determinó la concentración de proteína, y se ensayó la radiactividad de una parte alícuota. La incorporación de quelato se calculó usando la actividad específica de la preparación de cloruro de itrio-[90] y la concentración de proteína.

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v. Inmunorreactividad de 2B8-MX DTPA

La inmunorreactividad de 2B8 conjugado se evaluó usando ELISA de células enteras. Se recogieron las células SB en fase semilogarítmica del cultivo por centrifugación y se lavaron 2 veces con 1x HBSS. Las células se diluyeron hasta 1-2 x 10^{6} células/ml en HBSS y se dividieron en partes alícuotas en placas de microtitulación de poliestireno de 96 pocillos con 50.000-100.000 células/pocillo. Las placas se secaron a vacío durante 2 h, a 40-45ºC para fijar las células al plástico; las placas se almacenaron secas a -20ºC hasta su uso. Para el ensayo, las placas se calentaron a temperatura ambiente inmediatamente antes de su uso, después se bloquearon con 1X PBS, pH 7,2-7,4 que contenía BSA al 1% (2 h). Las muestras para el ensayo se diluyeron en 1X PBS/BSA al 1%, se depositaron en los sitios y se hicieron diluciones seriadas (1:2) en el mismo tampón. Después de incubar las placas durante 1 h a temperatura ambiente, las placas se lavaron 3 veces con 1X PBS. Se añadió a los pocillos el anticuerpo secundario (conjugado de IgG1 anti-ratón de cabra-HRP específico, 50 \mul) (dilución 1:1500 en 1X PBS/BSA al 1%) y se incubaron durante 1 h, a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 4 veces con 1X PBS seguido de la adición de disolución de sustrato ABTS (citrato sódico 50 mM, pH 4,5, que contiene ATBS al 0,01% y H_{2}O_{2} al 0,001%). Las placas se leyeron a 405 nm después de 15-30 min de incubación. Se incluyeron células HSB negativas para el antígeno en los ensayos para controlar la unión no específica. La inmunorreactividad del conjugado se calculó mediante representación gráfica de los valores de absorbancia frente al respectivo factor de dilución y comparando estos valores obtenidos usando anticuerpo nativo (que representa 100% de inmunorreactividad) ensayado en la misma placa; se compararon varios valores en la parte lineal del perfil de titulación y se determinó un valor medio (no se muestra).

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vi. Preparación de 2B8-MX-DTPA marcado con indio-[111] ("I2B8")

Los conjugados se radiomarcaron con indio-[111] sin vehículo. Se transfirió una parte alícuota de isótopo (0,1-2 mCi/mg de anticuerpo) en HCl 0,05 M a un tubo de polipropileno y se añadió aproximadamente una décima parte de volumen de HCl 2 M exento de metales. Después de incubar durante 5 min, se añadió acetato sódico 2 M exento de metales para ajustar la disolución a pH 4,0-4,4. Se añadieron aproximadamente 0,5 mg de 2B8-MX-DTPA de una disolución madre de DTPA 10,0 mg/ml en disolución salina normal o citrato sódico 50 mM/NaCl 150 mM que contenía azida sódica al 0,05%, y la disolución se mezcló suavemente inmediatamente. El pH de la disolución se comprobó con papel pH para verificar un valor de 4,0-4,5 y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 15-30 min. Posteriormente, la reacción se inactivó por adición de EDTA 20 mM hasta una concentración final de 1 mM y la mezcla de reacción se ajustó a aproximadamente pH 6,0 usando acetato sódico 2 M.

Después de 5-10 min de incubación, el radioisótopo sin formar complejo se separó por cromatografía de exclusión por tamaño. La unidad de HPLC consistía en un sistema de suministro de disolvente Waters Modelo 6000 o TosoHaas Modelo TSK-6110, provistos, respectivamente, con una válvula de inyección Waters U6K o Rheodyne 700. Las separaciones cromatográficas se llevaron a cabo usando una columna de permeabilidad en geles (BioRad SEC-250; 7,5 x 300 mm o una columna comparable de TosoHaas) y una precolumna SEC-250 (7,5 x 100 mm). El sistema estaba equipado con un colector de fracciones (Pharmacia Frac200) y un control de UV equipado con un filtro de 280 nm (Pharmacia modelo UV-1). Las muestras se aplicaron y eluyeron de forma isocrática usando 1XPBS, pH 7,4, con un caudal de 1,0 ml/min. Se recogieron fracciones de ½ ml en tubos de vidrio y se hizo el recuento de partes alícuotas de estas en un contador gamma. Las ventanas inferior y superior se ajustaron a 100 y 500 KeV, respectivamente.

La incorporación de radiactividad se calculó sumando la radiactividad asociada con el pico de proteína eluída y dividiendo este número entre la radiactividad total eluída de la columna; este valor después se expresó como un porcentaje (no se muestran los datos). En algunos casos, la incorporación de radiactividad se determinó usando cromatografía en capa fina instantánea ("ITLC"). El conjugado radiomarcado se diluyó 1:10 o 1:20 en 1X PBS que contenía 1X PBS/DTPA 1 mM, después se aplicó 1 \mul como manchas puntuales de 1,5 cm desde un extremo de una tira de 1 x 5 cm de papel de ITLC SG. El papel se desarrolló por cromatografía ascendente usando acetato amónico al 10% en metanol:agua (1:1, v/v). La tira se secó, se cortó por la mitad transversalmente, y se determinó la radiactividad asociada con cada sección por recuento gamma. La radiactividad asociada con la mitad inferior de la tira (radiactividad asociada a la proteína) se expresó como un porcentaje de la radiactividad total, determinada sumando los valores de las mitades tanto superior como inferior (no se muestran los datos).

Las actividades específicas se determinaron midiendo la radiactividad de una parte alícuota adecuada del conjugado radiomarcado. Este valor se corrigió para la eficacia del recuento (normalmente 75%) y se relacionó con la concentración de proteína del conjugado, previamente determinada por la absorbancia a 280 nm, y el valor resultante se expresó como mCi/mg de proteína.

Para algunos experimentos, el 2B8-MX-DTPA se radiomarcó con indio [111] siguiendo un protocolo similar al descrito antes pero sin purificación por HPLC; esto se denominó como el protocolo de "mezcla y disparo".

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vii. Preparación de 2B8-MX-DTPA marcado con itrio-[90] ("Y2B8")

El mismo protocolo descrito para preparar I2B8, se siguió para preparar el conjugado 2B8-MX-DTPA marcado con itrio-[90] ("Y2B8") excepto que no se usaron los 2 ng de HCl; todos los conjugados marcados con itrio se purificaron por cromatografía de exclusión por tamaño, como se ha descrito antes.

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C. Estudios con animales no humanos i. Biodistribución de 2B8-MX-DTPA radiomarcado

Se evaluó la biodistribución en tejidos de I2B8 en ratones BALB/c de 6 a 8 semanas de edad. El conjugado radiomarcado se preparó usando 2B8-MX-DTPA de calidad clínica, siguiendo el protocolo de "mezcla y disparo" descrito antes. La actividad específica del conjugado era 2,3 mCi/mg y el conjugado se formuló en PBS, pH 7,4 que contenía HSA 50 mg/ml. Se inyectó a los ratones por vía intravenosa 100 \mul de I2B8 (aproximadamente 21 \muCi) y se sacrificaron grupos de 3 ratones por dislocación cervical a las 0, 24, 48 y 72 horas. Después de sacrificarlos, se sacaron la cola, corazón, pulmones, hígado, riñón, bazo, músculo y fémur, se lavaron y se pesaron; también se sacó una muestra de sangre para analizar. Se determinó la radiactividad asociada con cada muestra por recuento gamma y posteriormente se determinó el porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido. No se intentó descontar la contribución de la actividad representada por la sangre asociada con órganos individuales.

En un protocolo separado, se radiomarcó una parte alícuota de 2B8-MX-DTPA incubada a 4ºC y 30ºC durante 10 semanas, con indio-[111] a una actividad específica de 2,1 mCi/mg para ambas preparaciones. Después estos conjugados se usaron en estudios de biodistribución en ratones como se ha descrito antes.

Para las determinaciones de dosimetría, el 2B8-MX-DTPA se radiomarcó con indio-[111] a una actividad específica de 2,3 mCi/mg y se inyectaron aproximadamente 1,1 \muCi a cada uno de 20 ratones BALB/c. Posteriormente, se sacrificaron grupos de 5 ratones a las 1, 24, 48 y 72 horas y los órganos se sacaron y prepararon para el análisis. Además, se sacaron partes de piel, músculo y hueso y se procesaron para el análisis; también se recogieron la orina y las heces y se analizaron en los puntos de tiempo de 24-72 horas.

Usando un procedimiento similar, también se radiomarcó 2B8-MX-DTPA con itrio-[90] y se evaluó su distribución biológica en ratones BALB/c a lo largo de un periodo de 72 horas. Después de purificación por cromatografía de exclusión por tamaño de HPLC, se inyectó por vía intravenosa a 4 grupos de 5 ratones, aproximadamente 1 \muCi de conjugado clínicamente formulado (actividad específica: 12,2 mCi/mg); posteriormente se sacrificaron los grupos a las 1, 24, 48 y 72 horas y sus órganos y tejidos se analizaron como se ha descrito antes. La radiactividad asociada con cada muestra de tejido se determinó midiendo la energía de radiación de frenado con un contador de centelleo gamma. Los valores de actividad después se expresaron como porcentaje de la dosis inyectada por gramo de tejido o porcentaje de la dosis inyectada por órgano. Aunque los órganos y otros tejidos se aclararon repetidamente para eliminar la sangre superficial, los órganos no se perfusionaron. Por lo tanto, de los valores de actividad de los órganos no se descontó la contribución a la actividad representada por la sangre asociada internamente.

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ii. Localización tumoral de I2B8

La localización del 2B8-MX-DTPA radiomarcado se determinó en ratones atímicos que portaban tumores de células B Ramos. Se inyectaron en ratones atímicos de 6 a 8 semanas de edad por vía subcutánea (costado trasero izquierdo) 0,1 ml de RPMI-1640 que contenía 1,2 x 10^{7} células de tumor Ramos que se habían adaptado previamente para el crecimiento en ratones atímicos. Los tumores surgieron en 2 semanas y variaban en peso de 0,07 a 1,1 gramos. Se inyectó a los ratones por vía intravenosa 100 \mul de 2B8-MX-DTPA marcado con indio-[111] (16,7 \muCi) y se sacrificaron grupos de 3 ratones por dislocación cervical a las 0, 24, 48 y 72 horas. Después de sacrificarlos, se sacaron la cola, corazón, pulmones, hígado, riñón, bazo, músculo, fémur y tumor, se lavaron y pesaron; se sacó una muestra de sangre para analizar. La radiactividad asociada con cada muestra se determinó por recuento gamma y se determinó el porcentaje de la dosis inyectada por gramo de tejido.

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iii. Estudios de biodistribución y localización tumoral con 2B8-MX-DTPA radiomarcado

Siguiendo el experimento de biodistribución preliminar descrito antes (Ejemplo I.B.viii.a.), se radiomarcó el 2B8 conjugado con indio-[111] a una actividad específica de 2,3 mCi/mg y se inyectaron aproximadamente 1,1 \muCi en cada uno de 20 ratones BALB/c para determinar la distribución del material radiomarcado. Posteriormente, se sacrificaron grupos de 5 ratones a las 1, 24, 48 y 72 horas y se sacaron los órganos y una parte de piel, músculo y hueso y se procesaron para el análisis. Además, se recogieron la orina y las heces y se analizaron en los puntos de tiempo de 24-72 horas. El nivel de radiactividad en la sangre disminuyó de 40,3% de la dosis inyectada por gramo al cabo de 1 hora a 18,9% a las 72 h (no se muestran los datos). Los valores para el corazón, riñón, músculo y bazo permanecieron en el intervalo de 0,7-9,5% a lo largo del experimento. Los niveles de radiactividad encontrados en los pulmones disminuyeron de 14,2% al cabo de 1 hora a 7,6% a las 72 horas; de forma similar, los respectivos valores de dosis inyectada en el hígado por gramo eran 10,3% y 9,9%. Estos datos se usaron para determinar los cálculos de la dosis de radiación absorbida de I2B8 descritos a continuación.

La biodistribución del conjugado marcado con indio-[90], que tiene una actividad específica de 12,2 mCi/mg de anticuerpo, se evaluó en ratones BALB/c. Se obtuvieron incorporaciones de radiactividad de >90% y el anticuerpo radiomarcado se purificó por HPLC. La deposición de radiactividad en los tejidos se evaluó en los órganos principales, y en la piel, músculo, hueso y orina y heces a lo largo de 72 horas y se expresó como porcentaje de la dosis inyectada/g de tejido. Los resultados (no se muestran) pusieron de manifiesto que aunque los niveles de radiactividad asociados con la sangre disminuyeron desde aproximadamente 39,2% de dosis inyectada por gramo al cabo de 1 hora a aproximadamente 15,4% después de 72 horas, los niveles de radiactividad asociados con la cola, corazón, riñón, músculo y bazo permanecieron bastante constantes a 10,2% o menos a lo largo del transcurso del experimento. Es importante que la radiactividad asociada con el hueso variaba de 4,4% de la dosis inyectada por gramo de hueso al cabo de 1 hora a 3,2% a las 72 horas. Considerados juntos, estos resultados sugieren que se asociaba poco itrio libre con el conjugado y que se liberaba poco metal radiactivo libre durante el transcurso del estudio. Estos datos se usaron para determinar los cálculos de dosis absorbida de radiación para Y2B8 descritos a continuación.

Para los estudios de localización tumoral, se preparó 2B8-MX-DTPA y se radiomarcó con indio-[111] a una actividad específica de 2,7 mCi/mg. Posteriormente se inyectaron 100 \mul de conjugado marcado (aproximadamente 24 \muci) en cada uno de 12 ratones atímicos que portaban tumores de células B Ramos. Los tumores variaban en peso de 0,1 a 10 gramos. En los puntos de tiempo de 0, 24, 48 y 72 horas después de inyección, se sacaron 50 \mul de sangre por punción retrorbital, los ratones se sacrificaron por dislocación cervical, y se sacaron la cola, corazón, pulmones, hígado, riñón, bazo, músculo, fémur y tumor. Después de procesar y pesar los tejidos, se determinó la radiactividad asociada con cada muestra de tejido usando un contador gamma y los valores se expresaron como porcentaje de dosis inyectada por gramo.

Los resultados (no se muestran) pusieron de manifiesto que las concentraciones en los tumores de ^{111}In-2B8-MX-DTPA aumentaban continuamente a lo largo del transcurso del experimento. Se había acumulado 13% de la dosis inyectada en el tumor después de 72 horas. En contraste, los niveles en la sangre disminuyeron durante el experimento de aproximadamente 30% en el tiempo cero a 13% a las 72 horas. Todos los demás tejidos (excepto músculo) contenían entre 1,3 y 6,0% de la dosis inyectada por gramo de tejido al final del experimento; el tejido del músculo contenía aproximadamente 13% de la dosis inyectada por gramo.

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D. Estudios en seres humanos i. 2B8 y 2B8-MX-DTPA: Estudios inmunohistológicos con tejidos humanos

La reactividad en los tejidos del anticuerpo monoclonal murino 2B8 se evaluó usando un panel de 32 tejidos humanos diferentes fijados con acetona. El anticuerpo 2B8 reacciona con el antígeno anti-CD20 que tenía un patrón muy restringido de distribución tisular, observándose sólo en un subconjunto de células en tejidos linfoides, incluyendo las de origen hematopoyético.

En el nódulo linfático, se observó inmunorreactividad en una población de linfocitos B corticales maduros así como en células que proliferaban en los centros germinales. También se observó reactividad positiva en la sangre periférica, en zonas de células B de la amígdala, pulpa blanca del bazo, y 40-70% de los linfocitos medulares encontrados en el timo. También se observó reactividad positiva en los folículos de la lámina propia (placas de Peyer) de los intestinos gruesos. Finalmente, los agregados de células linfoides dispersos en el estroma de diferentes órganos, incluyendo la vejiga, pecho, cuello del útero, esófago, pulmón, parótida, próstata, intestino delgado y estómago, también eran positivos con el anticuerpo 2B8 (no se muestran los datos).

Se encontró que todas las células simples epiteliales, así como el epitelio estratificado y epitelio de diferentes órganos, no eran reactivos. Igualmente, no se observó reactividad con las células neuroectodérmicas, incluyendo las del cerebro, médula espinal y nervios periféricos. También se encontró que eran negativos los elementos mesenquimales, tales como las células musculares lisas y esqueléticas, fibroblastos, células endoteliales y células inflamatorias polimorfonucleares (no se muestran los datos).

La reactividad tisular del conjugado 2B8-MX-DTPA se evaluó usando un panel de 16 tejidos humanos que se habían fijado con acetona. Como se ha demostrado previamente con el anticuerpo nativo (no se muestran los datos), el conjugado 2B8-MX-DTPA reconocía el antígeno CD20 que presentaba un patrón muy restringido de distribución, encontrándose solo en un subconjunto de células de origen linfoide. En el nódulo linfático, se observó inmunorreactividad en la población de células B. Se observó reactividad fuerte en la pulpa blanca del bazo y en los linfocitos medulares del timo. También se observó inmunorreactividad en linfocitos dispersos en la vejiga, corazón, intestino grueso, hígado, pulmón y útero, y se atribuyó a la presencia de células inflamatorias presentes en estos tejidos. Como con el anticuerpo nativo, no se observó reactividad con células neuroectodérmicas o con elementos mesenquimales (no se muestran los datos).

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ii. Análisis clínico de I2B8 (generación de imagen) e Y2B8 (terapia) a. Estudio de terapia de dosis única en ensayo clínico en fase I/II

Actualmente se está llevando a cabo un análisis clínico en fase I/II de I2BS (generación de imagen) seguido del tratamiento con una dosis terapéutica de Y2B8. Para el estudio de una dosis única, se sigue el siguiente esquema:

1. Recolección de células madre periféricas (CMP) o médula ósea (MO) con purgado;

2. Generación de imagen con I2B8

3. Terapia con Y2B8 (3 niveles de dosis); y

4. Transplante autólogo de CMP o MO (si es necesario basado en el recuento de neutrófilos absoluto inferior a 500/mm^{3} durante 3 días consecutivos o plaquetas por debajo de 20.000/mm^{3} sin pruebas de recuperación de médula en el examen de la médula ósea).

Los niveles de dosis de Y2B8 son los siguientes:

2

Se van a tratar 3 pacientes con cada uno de los niveles de dosis para determinar una Dosis Máxima Tolerada ("DMT").

Los estudios de generación de imagen (dosimetría) se llevan a cabo como sigue: cada paciente está implicado en dos estudios de biodistribución in vivo usando I2B8. En el primer estudio, se administran 2 mg de I2B8 (5 mCi) como una infusión intravenosa (i.v.) a lo largo de 1 hora; 1 semana después se administra 2B8 (es decir, anticuerpo no conjugado) por vía i.v., a una velocidad no superior a 250 mg/h seguido inmediatamente de 2 mg de I2B8 (5 mCi) administrados por vía i.v. a lo largo de 1 hora. En ambos estudios, inmediatamente después de la infusión de I2B8, se genera la imagen en cada paciente, y la generación de imagen se repite en los tiempos t = 14-18 h (si se indica), t = 24 h; t = 72 h; y t = 96 h (si se indica). Se determinan los tiempos de retención medios del cuerpo entero para el marcador de indio [111]; dichas determinaciones también se hacen para órganos o lesiones tumorales reconocibles ("regiones de interés").

Las regiones de interés se comparan con las concentraciones en el cuerpo entero del marcador; basándose en esta comparación, se puede determinar un cálculo de la localización y concentración de Y2B8 usando protocolos estándar. Si la dosis acumulada calculada de Y2B8 es mayor de ocho (8) veces la dosis calculada en el cuerpo entero, o si la dosis acumulada calculada para el hígado supera 1500 cGy, no debe producirse el tratamiento con Y2B8.

Si los estudios de generación de imagen son aceptables, se administrará 0,0 ó 1,0 mg/kg de peso corporal del paciente de 2B8 por infusión i.v. a una velocidad no superior a 250 mg/h. A esto le sigue la administración de Y2B8 (10, 20 o 40 mCi) a una velocidad de infusión i.v. de 20 mCi/h.

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b. Ensayo clínico en fase I/II: estudio de terapia de múltiples dosis

Actualmente se está llevando a cabo un análisis clínico en fase I/II de Y2B8. Para el estudio de múltiples dosis, se sigue el siguiente esquema:

1. Recolección de CMP o MO;

2. Generación de imagen con I2B8

3. Terapia con Y2B8 (3 niveles de dosis) para 4 dosis o una dosis acumulada total de 80 mCi; y

4. Transplante autólogo de CMP o MO (basado en la decisión del médico).

Los niveles de dosis de Y2B8 son los siguientes:

3

Se van a tratar 3 pacientes con cada uno de los niveles de dosis para determinar la DMT.

Los estudios de generación de imagen (dosimetría) se llevan a cabo como sigue: con los dos primeros pacientes se determinará una dosis de generación de imagen preferida para el anticuerpo no marcado (es decir, 2B8). Los dos primeros pacientes recibirán 100 mg de 2BS no marcado en 250 ml de disolución salina normal a lo largo de 4 h seguido de 0,5 mCi de I2B8; se tomarán muestras de sangre para los datos de biodistribución en los tiempos t = 0, t = 10 min, t = 120 min, t = 24 h y t = 48 h. Se hará un escáner a los pacientes con múltiples cámaras gamma regionales en los tiempos t = 2 h, t = 24 h y t = 48 h. Después del escáner en t = 48 h, los pacientes recibirán 250 mg de 2B8 como se ha descrito, seguido de 4,5 mCi de I2B8; después le seguirán el análisis de sangre y escáner como se ha descrito. Si 100 mg de 2B8 producen generación de imagen superior, entonces los dos siguientes pacientes recibirán 50 mg de 2B8 como se ha descrito, seguido de 0,5 mCi de I2B8, seguido 48 h más tarde de 100 mg de 2B8 y después de 4,5 mCi de I2B8. Si 250 mg de 2B8 producen generación de imagen superior, entonces los dos pacientes siguientes recibirán 250 mg de 2B8 como se ha descrito, seguido de 0,5 mCi de I2B8, seguido 48 h más tarde de 500 mg de 2B8 y después de 4,5 mCi de I2B8. Posteriormente, los pacientes se tratarán con la cantidad más baja de 2B8 que proporcione la generación de imagen óptima. La generación de imagen óptima se definirá como: (1) la generación de imagen más eficaz con la desaparición de anticuerpo más lenta; (2) la mejor distribución que minimice la compartimentalización en un solo órgano; y (3) la mejor resolución subjetiva de la lesión (comparación tumor/fondo).

Para los primeros 4 pacientes, la primera dosis terapéutica de Y2B8 empezará 14 días después de la última dosis de I2B8; para los pacientes posteriores, la primera dosis terapéutica de Y2B8 empezará entre 2 y 7 días después de I2B8.

Antes del tratamiento con Y2B8, para los pacientes distintos de los 4 primeros, se administrará 2B8 como se ha descrito, seguido de infusión i.v. de Y2B8 a lo largo de 5-10 min. Se tomarán muestras de sangre para la biodistribución en los tiempos t = 0, t = 10 min, t = 120 min, t = 24 h y t = 48 h. Los pacientes recibirán dosis repetidas de Y2B8 (la misma dosis administrada con la primera dosis) aproximadamente cada 6 a 8 semanas durante un máximo de 4 dosis, o una dosis acumulada total de 80 mCi. Lo más preferido es que los pacientes no reciban una dosis posterior de Y2B8 hasta que el recuento de leucocitos de los pacientes sea mayor/igual que 21 a 3.000 y el recuento absoluto de granulocitos sea mayor/igual de 100.000.

Después de completarse el estudio de 3 niveles de dosis, se definirá una DTM. Entonces se reclutarán pacientes adicionales en el estudio que recibirán la DMT.

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II. Producción de anticuerpo anti-CD20 quimérico ("C2B8") A. Construcción del vector de expresión del ADN de inmunoglobulina anti-CD20 quimérica

Se aisló el ARN de la célula de hibridoma de ratón 2B8 (como describen Chomczynki, P. y col., "Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction". Anal. Biochem. 162:156-159 (1987)) y se preparó el ADNc a partir de este. Se aisló el ADN de la región variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina de ratón a partir de ADNc por reacción en cadena de la polimerasa usando un conjunto de cebadores de ADN con homología con las secuencias señal de la cadena ligera de ratón en el extremo 5' y la región J de la cadena ligera de ratón en el extremo 3'. Las secuencias de los cebadores eran las siguientes:

1. V_{L} homosentido (SEQ. ID. NO. 3)

4

(La parte subrayada es un sitio BalII; la parte de la línea superior es el codón de inicio).

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2. V_{L} antisentido (SEQ. ID. NO. 4)

5

(La parte subrayada es un sitio BsiWI).

Véase, en las figuras 1 y 2 los correspondientes sitios BglII y BsiWI en TCAE 8, y en la Figura 3 los correspondientes sitios en anti-CD20 en TCAE 8.

Este fragmento de ADN resultante se clonó directamente en el vector TCAE 8 delante del dominio constante de la cadena ligera kappa humana y se secuenció. La secuencia de ADN determinada para la región variable de la cadena ligera murina se presenta en las figuras 4 (SEQ. ID. NO. 5); véase también la figura 3, nucleósidos 978 a 1362. La figura 4 proporciona además la secuencia de aminoácidos de esta región variable murina, y las regiones CDR y de lectura. La región variable de la cadena ligera de ratón a partir de 2B8 está en la familia kappa VI de ratón. Véase, Karat, véase antes.

La región variable de la cadena pesada de ratón se aisló de forma similar y se clonó delante de los dominios constantes de IgGI humana. Los cebadores eran los siguientes:

1. V_{H} homosentido (SEQ. ID. NO. 6)

6

(La parte subrayada es un sitio MluI).

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2. V_{H} antisentido (SEQ. ID. NO. 7)

600

(La parte subrayada es un sitio NheI).

Véase, en las figuras 1 y 2 los correspondientes sitios MluI y NheI en TCAE 8, y en la Figura 3 los correspondientes sitios en anti-CD20 en TCAE 8.

La secuencia para esta cadena pesada de ratón se presenta en la Figura 5 (SEQ. ID. NO. 8); véase también en la Figura 3, nucleótidos 2401 a 2820. La figura 5 también proporciona la secuencia de aminoácidos de esta región variable murina, y las regiones CDR y de lectura. La región variable de la cadena pesada de ratón de 2B8 está en la familia VH 2B de ratón. Véase, Kabat, véase antes.

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B. Creación de transfectomas CHO y SP2/0 que producen anti-CD20 quimérico

Se hicieron crecer células de ovario de hámster chino ("CHO") DG44 en medio SSFM II deficiente en hipoxantina y timidina (Gibco, Grand Island, NY, Form No. 91-0456PK); se hicieron crecer células de mieloma de ratón SP2/0 en medio Eagle modificado por Dulbecco ("DMEM") (Irvine Scientific, Santa Ana, Ca., nº de cat. 9024) con suero de ternero fetal al 5% fetal y glutamina 20 ml/l añadidos. Se electroporaron 4 millones de células con 25 \mug de ADN plasmídico de CHO o 50 \mug de SP2/0, que se había tratado con enzima de restricción NotI, usando un sistema de electroporación BTX 600 (BTX, San Diego, CA) en cubetas desechables de 0,4 ml. Las condiciones eran 210 V para CHO o 180 V para SP2/0, 400 \muF, 13 ohmios. Cada electroporación se cultivó en 6 placas de 96 pocillos (aproximadamente 7.000 células/pocillo). Las placas se alimentaron con medio que contenía G418 (GENETICINA, Gibco, nº de cat. 860-1811) con 400 \mug/ml de compuesto activo para CHO (el medio incluía además hipoxantina 50 \muM y timidina 8 \muM) u 800 \mug/ml para SP2/0, 2 días después de la electroporación, y 2 ó 3 días sucesivos hasta que surgen las colonias. En el líquido sobrenadante de las colonias se ensaya la presencia de inmunoglobulina quimérica con un ELISA específico para anticuerpo humano. Las colonias que producían la mayor cantidad de inmunoglobulina se expandieron y se cultivaron en placas de 96 pocillos que contenían medio con metotrexato (25 nM para SP2/0 y 5 nM para CHO) y se alimentaron cada 2 ó 3 días. Los líquidos sobrenadantes se ensayaron como antes y se examinaron las colonias que producían la mayor cantidad de inmunoglobulina. El anticuerpo anti-CD20 quimérico se purificó del líquido sobrenadante usando cromatografía de afinidad en proteína A.

El anticuerpo anti-CD20 quimérico purificado se analizó por electroforesis en geles de poliacrilamida y se calculó que era más de aproximadamente 95% puro. La afinidad y especificidad del anticuerpo quimérico se determinaron basándose en 2B8. El anticuerpo anti-CD20 quimérico ensayado en ensayos de unión directos y competitivos, cuando se comparaba con el anticuerpo monoclonal anti-CD20 murino, ponía de manifiesto una afinidad y especificidad comparables en una serie de líneas de células B positivas para CD20 (no se presentan los datos). La constante de afinidad aparente ("Kap") del anticuerpo quimérico se determinó por unión directa del anticuerpo anti-CD20 quimérico radiomarcado con I^{125} y se comparó con 2B8 radiomarcado por representación de Scatchard; la Kap para el anti-CD20 quimérico producido por CHO era 5,2x10^{-9} M, y para el anticuerpo producido por SP2/0, 7,4x10^{-9} M. La Kap calculada para 2B8 era 3,5x10^{-9} M. Se usó la competición directa por radioinmunoensayo para confirmar tanto la especificidad como la retención de inmunorreactividad del anticuerpo quimérico comparando su capacidad para competir eficazmente con 2B8. Se necesitaban cantidades sustancialmente equivalentes de anticuerpos anti-CD20 quimérico y 2B8 para producir 50% de inhibición de la unión a los antígenos CD20 en células B (no se presentan los datos), es decir, había una pérdida mínima de la actividad de inhibición de los anticuerpos anti-CD20, posiblemente debido a la quimerización.

Los resultados del Ejemplo II.B indican, entre otros, que se generaron anticuerpos anti-CD20 quiméricos a partir de transfectomas CHO y SP2/0 usando los vectores TCAE 8, y estos anticuerpos quiméricos tenían sustancialmente la misma especificidad y capacidad de unión que en anticuerpo monoclonal anti-CD20 murino 2B8.

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C. Determinación de la actividad inmunológica de anticuerpos anti-CD20 quiméricos i. Análisis de C1q humano

Se evaluó la unión de los anticuerpos anti-CD20 quiméricos producidos tanto por las líneas celulares CHO como SP2/0 a C1q humano en un ensayo de citometría de flujo usando C1q marcado con fluoresceína (C1q se obtuvo de Quidel, Mira Mesa, CA, Nº Prod. A400 y el marcador FITC de Sigma, St. Louis MO, Nº Prod. F-7250; FITC). El marcaje de C1q se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo descrito en "Selected Methods In Cellular Immunology", Michell & Shiigi, Ed. (W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA, 1980, p. 292). Los resultados analíticos se obtuvieron usando un citómetro de flujo Becton Dickinson FACScan^{TM} (fluoresceína medida en un intervalo de 515-545 nm). Se incubaron cantidades equivalentes de anticuerpo anti-CD20 quimérico, proteína de mieloma IgG1,K humana, (Binding Site, San Diego, Ca, Nº Prod. BP078), y 2B8 con un número equivalente de células SB positivas para CD20, seguido de una etapa de lavado con tampón de FACS (BSA al 0,2% en PBS, pH 7,4, azida sódica al 0,02%) para separar el anticuerpo no unido, seguido de incubación con C1q marcado con FITC. Después de una incubación de 30-60 min, las células se volvieron a lavar. Se analizaron las 3 condiciones, incluida C1q marcado con FITC como control, en el dispositivo FACScan^{TM} siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados se presentan en la Figura 6.

Como ponen de manifiesto los resultados de la Figura 6, se observó un aumento significativo de la fluorescencia sólo para las condiciones de anticuerpo anti-CD20 quimérico; es decir, sólo las células SB con anticuerpo anti-CD20 quimérico adherente eran positivas para C1q, mientras que las otras condiciones produjeron el mismo patrón que el control.

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ii. Lisis celular dependiente de complemento

Se analizó la capacidad de los anticuerpos anti-CD20 quiméricos para producir la lisis de líneas células de linfoma en presencia de suero humano (fuente de complemento). Las células SB positivas para CD20 se marcaron con ^{51}Cr mezclando 100 \muCi de ^{51}Cr con 1x10^{6} células SB durante 1 h a 37ºC; después las células SB marcadas se incubaron en presencia de cantidades equivalentes de complemento humano y cantidades equivalentes (0-50 \mug/ml) de anticuerpos anti-CD20 quiméricos o 2B8 durante 4 h a 37ºC (véase, Brunner, K.T. y col., "Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51Cr-labeled allogeneic target cells in vitro". Immunology 14:181-189 (1966). Los resultados se presentan en la Figura 7.

Los resultados de la Figura 7 indican, entre otros, que los anticuerpos anti-CD20 quiméricos producían la lisis significativa (49%) en estas condiciones.

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iii. Ensayo de efector de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo

Para este estudio se usaron células positivas para CD20 (SB) y células negativas para CD20 (línea leucémica de células T HSB; véase, Adams, Richard, "Formal Discussion", Can. Res. 27:2479-2482(1967); nº de depósito en ATCC, ATCC CCL 120.1); ambas se marcaron con ^{51}Cr. El análisis se llevó a cabo siguiendo el protocolo descrito por Brunner, KT. y col., "Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51 Cr-labeled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and drugs". Immunology 14:181.189 (1968); se observó una lisis sustancial mediada por células dependiente de anticuerpo anti-CD20 quimérico de células diana SB positivas para CD20 (marcadas con ^{51}Cr) al final de una incubación de 4 h a 37ºC, y este efecto se observó tanto para los anticuerpos producidos por CHO como por SP2/0 (las células efectoras eran linfocitos periféricos humanos; la relación de células efectoras: diana era 100:1). La lisis eficaz de las células diana se obtuvo con 3,9 \mug/ml. En contraste, en las mismas condiciones, el anticuerpo monoclonal anti-CD20 murino 2B8 tenía un efecto estadísticamente insignificante, y las células HSB negativas para CD20 no sufrieron lisis. Los resultados se presentan en la Figura 8.

Los resultados del Ejemplo II indican, entre otros, que los anticuerpos anti-CD20 quiméricos del Ejemplo I eran inmunológicamente activos.

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III. Reducción de células B in vivo usando anti-CD20 quimérico A. Estudio en primates no humanos

Se llevaron a cabo 3 estudios separados en primates no humanos. Por conveniencia, estos se denominan en el presente documento "Anti-CD20 quimérico: CHO y SP2/0"; "Anti-CD20 quimérico: CHO"; y "Anti-CD20 quimérico de dosificación alta". Las condiciones eran las siguientes:

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Anti-CD20 quimérico: CHO y SP2/0

Se dividieron 6 monos cynomolgus con pesos que variaban de 4,5 a 7 kg (White Sands Research Center, Alamogordo, NM) en 3 grupos de 2 monos cada uno. Los dos animales de cada grupo recibieron la misma dosis de anticuerpo anti-CD20 quimérico inmunológicamente activo. Un animal de cada grupo recibió anticuerpo purificado producido por el transfectoma CHO; el otro recibió anticuerpo producido por el transfectoma SP2/0. Los 3 grupos recibieron dosificaciones de anticuerpo correspondientes a 0,1 mg/kg, 0,4 mg/kg y 1,6 mg/kg cada día durante 4 días consecutivos. El anticuerpo anti-CD20 quimérico inmunológicamente activo, que se había mezclado con disolución salina estéril, se administró por infusión intravenosa; se extrajeron muestras de sangre antes de cada infusión. Se extrajeron muestras de sangre adicionales empezando 24 h después de la última inyección (T=0) y sucesivamente los días 1, 3, 7, 14 y 28; también se cogieron muestras de sangre después a intervalos de dos semanas hasta completarse el estudio el día 90.

Se centrifugaron aproximadamente 5 ml de sangre entera de cada animal a 2000 rpm durante 5 min. Se separó el plasma para el ensayo de los niveles de anticuerpo anti-CD20 quimérico soluble. El sedimento (que contenía leucocitos y glóbulos rojos de la sangre periférica) se volvió a suspender en suero de ternero fetal para el análisis de anticuerpo marcado fluorescente (véase, "Marcaje con anticuerpo fluorescente de población de células linfoides", más abajo).

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Anti-CD20 quimérico: CHO

Se dividieron 6 monos cynomolgus con pesos que variaban de 4 a 6 kg (White Sands) en 3 grupos de 2 monos cada uno. Se inyectaron a todos los animales anticuerpos anti-CD20 quiméricos inmunológicamente activos producidos por el transfectoma CHO (en disolución salina estéril). Los 3 grupos se separaron como sigue: el subgrupo 1 recibió inyecciones intravenosas diarias de 0,01 mg/kg del anticuerpo a lo largo de un periodo de 4 días; el subgrupo 2 recibió inyecciones intravenosas diarias de 0,4 mg/kg del anticuerpo a lo largo de un periodo de 4 días; el subgrupo 3 recibió una sola inyección intravenosa de 6,4 mg/kg del anticuerpo. Para los 3 subgrupos, se obtuvo una muestra de sangre antes de empezar el tratamiento; además, también se extrajeron muestras de sangre en T = 0, 1, 3, 7, 14 y 28 días después de la última inyección, como se ha descrito antes; y estas muestras se procesaron para el análisis de anticuerpos marcados fluorescentes (véase, "Marcaje con anticuerpos fluorescente", más abajo). Además de la cuantificación de células B de la sangre periférica, se tomaron biopsias del nódulo linfático en los días 7, 14 y 28 después de la última inyección, y se tiñó una preparación de una célula para cuantificar las poblaciones de linfocitos por citometría de flujo.

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Anti-CD20 quimérico de alta dosificación

Se administró por infusión a 2 monos cynomolgus (White Sands) 16,8 mg/kg de los anticuerpos anti-CD20 quiméricos inmunológicamente activos de los transfectomas CHO (en disolución salina estéril) semanalmente a lo largo de un periodo de 4 semanas consecutivas. Tras concluir el tratamiento, ambos animales se anestesiaron para sacar la médula ósea; y también se cogieron biopsias del nódulo linfático. Se tiñeron ambos grupos de tejidos para ver la presencia de linfocitos B usando Leu 16 por citometría de flujo siguiendo el protocolo descrito por Ling, N.R. y col., "B-cell and plasma cell antigens". Leucocyte Typing III White Cell Differentiations Antigens, A.J. McMichael, Ed. (Oxford University Press, Oxford UK. 1987), p. 302.

Marcaje con anticuerpo fluorescente de población de células linfoides. Después de separar el plasma, los leucocitos se lavaron dos veces con disolución salina equilibrada de Hanks ("HBSS") y se volvieron a suspender en un volumen equivalente de plasma de suero bovino fetal (inactivado con calor a 56ºC durante 30 min). Se distribuyó un volumen de 0,1 ml de la preparación celular en cada uno de 6 tubos de centrífuga cónicos de 15 ml, se añadieron anticuerpos monoclonales marcados con fluoresceína con especificidad para los marcadores de superficie de linfocitos humanos CD2 (AMAC, Westbrook, ME), CD20 (Becton Dickinson) e IgM humana (Binding Site, San Diego, CA) en 3 de los tubos para identificar las poblaciones de linfocitos T y B. Todos los reactivos habían dado previamente ensayo positivo frente a los antígenos de linfocitos de mono correspondientes. En el cuarto tubo se midió el anticuerpo anti-CD20 quimérico unido a CD20 de la superficie de células B de mono, usando IgG anti-humana de cabra policlonal con ficoeritrina (AMAC). Este reactivo se adsorbió previamente en una columna de Ig de mono-sepharosa para prevenir la reactividad cruzada con la Ig de mono, permitiendo así la detección específica y cuantificación del anticuerpo anti-CD20 quimérico unido a las células. Un quinto tubo incluía reactivos tanto anti-IgM como IgG anti-humana para la tinción doble de la población de células B. Se incluyó una sexta muestra sin reactivos para determinar la autofluorescencia. Se incubaron las células con anticuerpos fluorescentes durante 30 min, se lavaron y se fijaron con 0,5 ml de tampón de fijación (NaCl 0,15 M, paraformaldehído al 1%, pH 7,4) y se analizaron en un instrumento FACScan^{TM} de Becton Dickinson. Las poblaciones de linfocitos se identificaron inicialmente por dispersión directa frente a ángulo recto de la luz en un mapa de bits de gráfico de puntos con leucocitos no marcados. Después se aisló la población total de linfocitos sacando todos los demás sucesos. Las posteriores mediciones de fluorescencia reflejaban solo los sucesos específicos de linfocitos que habían entrado.

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Reducción de los linfocitos B de la sangre periférica

No se pudo determinar una diferencia observable entre la eficacia de los anticuerpos producidos por CHO y por SP2/0 en la reducción de células B in vivo, aunque se observó un ligero aumento de recuperación de las células B después del día 7 en los monos a los que se había inyectado anticuerpos anti-CD20 quiméricos obtenidos de transfectomas CHO con niveles de dosificaciones de 1,6 mg/kg y 6,4 mg/kg, y en los monos a los que se había inyectado anticuerpo producido por SP2/0 con un nivel de dosificación de 0,4 mg/kg. Las figuras 9A, B y c proporcionan los resultados obtenidos del estudio de anti-CD10 quimérico: CHO y SP2/0, con la Figura 9A dirigida al nivel de dosis de 0,4 mg/kg; la Figura 9B dirigida al nivel de dosis de 1,6 mg/kg; y la Figura 9C dirigida al nivel de dosis de 6,4 mg/kg.

Como es evidente a partir de la Figura 9, había una disminución espectacular (>95%) de los niveles de células B periféricas después del tratamiento terapéutico, para todos los intervalos de dosis ensayados, y estos niveles se mantuvieron hasta 7 días después de infusión; después de este periodo, empezaba la recuperación de células B, y el tiempo de inicio de la recuperación era independiente de los niveles de dosificación.

En el estudio de anti-CD20 quimérico: CHO, se usó una concentración de dosificación de anticuerpo 10 veces inferior (0,01 mg/kg) a lo largo de un periodo de 4 inyecciones diarias (0,04 mg/kg total). La figura 10 proporciona los resultados de este estudio. Esta dosificación redujo la población de células B periféricas a aproximadamente 50% de los niveles normales calculados con anticuerpo IgM anti-superficie o Leu 16. Los resultados también indican que la saturación del antígeno CD20 en la población de linfocitos B no se logró con anticuerpo anti-CD20 quimérico inmunológicamente activo con esta concentración de dosis a lo largo de este periodo de tiempo para primates no humanos; se detectaron linfocitos B recubiertos con el anticuerpo en las muestras de sangre durante los 3 días iniciales después del tratamiento terapéutico. Sin embargo, el día 7 las células recubiertas de anticuerpo no eran detectables.

La Tabla I resume los resultados de una dosis única y múltiples dosis de anticuerpo anti-CD20 quimérico inmunológicamente activo en las poblaciones de sangre periférica; las condiciones de una dosis única eran 6,4 mg/kg; las condiciones de múltiples dosis eran 0,4 mg/kg a lo largo de 4 días consecutivos (estos resultados se obtuvieron de los monos descritos antes).

TABLA I Población de la sangre periférica del estudio de C2B8 en primates

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Los datos resumidos en la Tabla I indican que la reducción de células B en la sangre periférica en condiciones de exceso de anticuerpo, ocurrió de forma rápida y eficaz independientemente de los niveles de una o múltiples dosis. Además, se observó reducción durante al menos 7 días después de la última inyección, con recuperación parcial de células B observada el día 21.

La Tabla II resume el efecto de anticuerpos anti-CD20 quiméricos inmunológicamente activos en las poblaciones celulares de nódulos linfáticos, usando el régimen de tratamiento de la Tabla I (4 dosis diarias de 0,4 mg/kg; 1 dosis de 6,4 mg/kg); también se proporcionan los valores comparativos para los nódulos linfáticos normales (mono de control, axilares e inguinales) y la médula ósea normal (2 monos).

TABLA II Poblaciones de células de nódulos linfáticos

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TABLA II (continuación)

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TABLA II (continuación)

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Los resultados de la Tabla II ponen de manifiesto la reducción eficaz de los linfocitos B para ambos regímenes de tratamiento. La Tabla II indica además que para los primates no humanos, no se lograba la saturación completa de células B en el tejido linfáticos con el anticuerpo anti-CD20 quimérico inmunológicamente activo; además, se observaron células recubiertas de anticuerpo 7 días después de tratamiento, seguido de una reducción notable de las células B de nódulos linfáticos, observada el día 14.

Basándose en estos datos, se llevó a cabo el estudio de anti-CD20 quimérico de dosificación alta única al que se ha hecho referencia antes, principalmente para ver la determinación farmacológica/toxicológica. Es decir, este estudio se llevó a cabo para evaluar cualquier toxicidad asociada con la administración del anticuerpo quimérico, así como la eficacia de la reducción de células B de los nódulos linfáticos de la sangre periférica y la médula ósea. Además, debido a que los datos de la Tabla II indican que para este estudio la mayoría de las células B de nódulos linfáticos se habían reducido entre los días 7 y 14 después de tratamiento, un régimen de dosificación semanal tiene que dar resultados más eficaces. La Tabla III resume los resultados del estudio de anti-CD20 quimérico de alta dosificación.

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TABLA III Poblaciones celulares de nódulos linfáticos y médula ósea Poblaciones de linfocitos (%)

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Ambos animales evaluados a los 22 días después de cesar el tratamiento contenían menos de 5% de células B, comparado con 40% en los nódulos linfáticos de control (véase, Tabla II, más arriba). De igual forma, en la médula ósea de los animales tratados con anticuerpo anti-CD20 quimérico, los niveles de células positivas para CD20 eran menos de 3% comparado con 11-15% en los animales normales (véase, Tabla II, más arriba). En los animales evaluados a los 36 días después de cesar el tratamiento, uno de los animales (H) tenía aproximadamente 12% de células B en el nódulo linfático y 4,4% de células B en la médula ósea, mientras que el otro (G) tenía aproximadamente 5% de células B en el nódulo linfático y 0,8% en la médula ósea; los datos indican la reducción significativa de células B.

Los resultados del Ejemplo III.A indican, entre otros, que dosis bajas de anti-CD20 quimérico inmunológicamente activo conducen a la reducción de células B periféricas a largo plazo en primates. Los datos también indican que la reducción significativa de poblaciones de células B se logró en los nódulos linfáticos periféricos y la médula ósea cuando se administraron dosis altas repetidas del anticuerpo. El seguimiento continuado de los animales de ensayo ha indicado que incluso con esta reducción importante de linfocitos B periféricos durante la primera semana de tratamiento, no se observaron efectos adversos de salud. Además, puesto que se observó la recuperación de la población de células B, una conclusión que se extrae es que las células madre pluripotentes de estos primates no eran afectadas de forma adversa por el tratamiento.

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B. Análisis clínico de C2B8 i. Ensayo clínico en fase I/II de C2B8: estudio de la terapia de dosis única

Quince pacientes que tenían linfoma de células B reincidente histológicamente documentado, se trataron con C2B8 en un ensayo clínico en fase I/II. Cada paciente recibió una dosis única de C2B8 en un estudio de dosis creciente; había 3 pacientes por dosis: 10 mg/m^{2}; 50 mg/m^{2}; 100 mg/m^{2}; 250 mg/m^{2} y 500 mg/m^{2}. El tratamiento era por infusión i.v. a través de un filtro en línea de 0,22 \mum con C2B8 diluido en un volumen final de 250 ml o una concentración máxima de 1 mg/ml de disolución salina normal. La velocidad inicial era 50 ml/h durante la primera hora; si no se observaba toxicidad, la velocidad de dosificación se podía incrementar a un máximo de 200 ml/h.

La toxicidad (indicada por el médico) variaba de "ninguna" a "fiebre" a "moderada" (2 pacientes) a "grave" (1 paciente); todos los pacientes completaron el tratamiento de terapia y se analizaron los linfocitos de la sangre periférica para determinar, entre otros, el impacto de C2B8 en células T y células B. Sistemáticamente para todos los pacientes, los linfocitos B de la sangre periférica se redujeron después de infusión con C2B8 y dicha reducción se mantuvo durante más de 2 semanas.

Un paciente (que recibía 100 mg/m^{2} de C2B8) manifestó una respuesta parcial al tratamiento con C2B8 (reducción mayor que 50% en la suma de los productos de los diámetros perpendiculares de todas las lesiones indicadoras medibles que duran más de 4 semanas, durante las cuales no pueden aparecer nuevas lesiones y no pueden aumentar las lesiones existentes); al menos otro paciente (que recibía 500 mg/m^{2}) manifestó una respuesta minoritaria al tratamiento con C2B8 (reducción de menos de 50% pero al menos 25% en la suma de los productos de los dos diámetros perpendiculares más largos de todas las lesiones indicadoras medibles). Para representar la eficacia, los resultados de los PBL se muestran en la Figura 14; los datos para los pacientes que manifestaban una RP se muestra en la Figura 14A; para los pacientes que manifestaban una RM, los datos se muestran en la Figura 14B. En la Figura 14, se aplica los siguiente:

11 = linfocitos; 12 = células CD3+ (células T); 13 = células CD20^{+}; 14 = células CD19^{+}; 15 = Kappa; 16 = lambda; y 17 = C2B8. Como se pone de manifiesto, los marcadores de células B CD20, CD19, kappa y lambda, se redujeron durante un periodo de más de 2 semanas; aunque que había una reducción ligera inicial en los recuentos de células T, estos volvieron a un nivel de la línea base aproximado en un periodo de tiempo relativamente rápido.

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ii. Ensayo clínico de C2B8 en fase I/II: estudio de la terapia de múltiples dosis

Son seleccionables para este estudio los pacientes que tienen linfoma de células B histológicamente confirmado con enfermedad progresiva medible, que se separa en 2 partes: en la fase I, que consiste en un aumento de la dosis para caracterizar las toxicidades limitantes de la dosis y la determinación del nivel de dosis tolerada biológicamente activa, grupos de 3 pacientes recibirán semanalmente infusiones i.v. de C2B8 durante un total de 4 infusiones separadas. La dosis acumulada en cada uno de los 3 niveles será como sigue: 500 mg/m^{2} (125 mg/m^{2}/infusión); 100 mg/m^{2} (250 mg/m^{2}/infusión); 1500 mg/m^{2} (375 mg/m^{2}/infusión. una dosis tolerada biológicamente activa se define y se determinará, como la dosis más baja con toxicidad tolerable y actividad adecuada); en la fase II, pacientes adicionales recibirán la dosis tolerada biológicamente activa con énfasis en la determinación de la actividad de las 4 dosis de C2B8.

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IV. Terapia de combinación: C2B8 e Y2B8

Se investigó un procedimiento terapéutico de combinación usando C2B8 e Y2B8 en un modelo xenográfico de ratón (ratones nu/nu, hembra, de aproximadamente 10 semanas de edad) usando un tumor linfoblástico de células B (células de tumor Ramos). Con fines comparativos, también se trataron ratones adicionales con C2B8 e Y2B8.

Las células de tumor Ramos (ATCC, CRL 1596) se mantuvieron en cultivo usando RPMI-1640 complementado con suero ternero fetal al 10% y glutamina a 37ºC y CO_{2} al 5%. Los tumores se iniciaron en 9 ratones hembra carentes de sistema inmunitario de aproximadamente 7-10 semanas de edad, por inyección subcutánea de 1,7 x 10^{6} células Ramos en un volumen de 0,10 ml (HBSS) usando una jeringuilla provista de una aguja de 25 g. Todos los animales se manipularon en una campana protectora de flujo laminar y todas las jaulas, alimentos y agua del lecho se trataron en autoclave. Las células tumorales se pasaron extirpando los tumores y pasando estos por un tamiz de nº de malla 40; las células se lavaron 2 veces con 1X HBSS (50 ml) por centrifugación (1300 rpm), se volvieron a suspender en 1X HBSS hasta 10 x 10^{6} células/ml, y se congelaron a -70ºC hasta su uso.

Para las condiciones experimentales, las células de varios lotes congelados se descongelaron, se sedimentaron por centrifugación (1300 rpm) y se lavaron 2 veces con 1X HBSS. Después, las células se volvieron a suspender hasta aproximadamente 2,0 x 10^{6} células/ml. Se inyectaron a aproximadamente 9 a 12 ratones 0,10 ml de suspensión celular (s.c.) usando una jeringuilla lee provista de una aguja de 25 g; las inyecciones se hicieron en el costado izquierdo del animal, aproximadamente en la región media. Los tumores se desarrollaron en aproximadamente 2 semanas. Los tumores se extirparon y se procesaron como se ha descrito antes. A los ratones del estudio se les inyectaron, como se ha descrito antes, 1,67 x 10^{6} células en 0,10 ml de HBSS.

Basándose en los experimentos de dosificación preliminares, se determinó que se usarían 200 mg de C2B8 y 100 \muCi de Y2B8 para este estudio. Se inyectaron células tumorales a 90 ratones hembra nu/nu (de aproximadamente 10 semanas de edad). Aproximadamente 10 días más tarde, se asignaron 24 ratones a 4 grupos de estudio (6 ratones/grupo) mientras se intentaba mantener una distribución del tamaño del tumor comparable en cada grupo (el tamaño medio del tumor, expresado como el producto de la longitud x anchura del tumor, era aproximadamente 80 mm^{2}). Los siguientes grupos se trataron como se ha indicado por inyecciones en la vena de la cola, usando una jeringa de Hamilton de 100 \mul provista de una aguja de 25 g:

A. Disolución salina normal

B. Y2B8 (100 \muCi)

C. C2B8 (200 \mug); y

D. Y2B8 (100 \muCi) + C2B8 (200 \mug)

A los grupos ensayados con C2B8 se les dio una segunda inyección de C2B8 (200 \mug/ratón) 7 días después de la inyección inicial. Las mediciones de tumor se hicieron cada 2 ó 3 días usando un calibrador.

La preparación de los materiales de tratamiento se hizo de acuerdo con los siguientes protocolos:

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A. Preparación de Y2B8

Se transformó cloruro de itrio-[90] (6 mCi) en un tubo de polipropileno y se ajustó a pH 4,1-4,4 usando acetato de sodio 2 M exento de metales. Se añadió 2B8-MX-DTPA (0,3 mg en disolución salina normal; véase antes la preparación de 2B8-MX-DTPA) y se mezcló suavemente con agitación vortical. Después de 15 min de incubación, la reacción se inactivó por adición de 0,05X volúmenes de EDTA 20 M y 0,05X volúmenes de acetato sódico 2 M. La concentración de radiactividad se determinó diluyendo 5,0 \mul de la mezcla de reacción en 2,5 ml de 1X PBS que contenía HSA 75 mg/ml y DTPA ("tampón de formulación"); el recuento se llevó a cabo por adición de 10,0 \mul a 20 ml de cóctel de centelleo Ecolume^{TM}. El resto de la mezcla de reacción se añadió a 3,0 ml de tampón de formulación, se esterilizó por filtración y se almacenó a 2-8ºC hasta su uso. La actividad específica (14 mCi/mg en el momento de la inyección) se calculó usando la concentración de radiactividad y la concentración de proteína calculada basado en la cantidad de anticuerpo añadido a la mezcla de reacción. La radiactividad asociada a la proteína se determinó usando cromatografía de capa fina instantánea. La incorporación de radiactividad era 95%. Y2B8 se diluyó en tampón de formulación inmediatamente antes de usar y se esterilizó por filtración (la concentración final de radiactividad era 1,0 mCi/ml).

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B. Preparación de C2B8

C2B8 se preparó como se ha descrito antes. C2B8 se proporcionó como un reactivo estéril en disolución salina normal de 5,0 mg/ml. Antes de inyección, C2B8 se diluyó en disolución salina normal a 2,0 mg/ml y se esterilizó por filtración.

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C. Resultados

Después del tratamiento, el tamaño del tumor se expresó como un producto de la longitud y la anchura, y las mediciones se hicieron en los días indicados en la Figura 11 (Y2B8 frente a disolución salina); Figura 12 (C2B8 frente a disolución salina); y Figura 13 (Y2B8 + C2B8 frente a disolución salina). También se determinó el error típico.

Como se indica en la Figura 13, la combinación de Y2B8 y C2B8 presentaba efectos tumoricidas comparables a los efectos puestos de manifiesto por Y2B8 o C2B8.

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V. Estrategias de terapia alternativa

Las estrategias terapéuticas alternativas que se reconocen en vista de los ejemplos anteriores, son evidentes. Una de dichas estrategias usa una dosis terapéutica de C2B8 seguido, en aproximadamente 1 semana, de una combinación de 2B8 y 2B8 radiomarcado (p. ej., Y2B8); o 2B8, C2B8 y p. ej. Y2B8; o C2B8 y p. ej. Y2B8. Una estrategia adicional es el uso de C2B8 radiomarcado; dicha estrategia permite el uso de los beneficios de la parte inmunológicamente activa de C2B8 más los beneficios asociados con un radiomarcador. Los radiomarcadores preferidos incluyen itrio-90 dada la semivida en la circulación más larga de C2B8 frente al anticuerpo murino 2B8. Debido a la capacidad de C2B8 de reducir las células B y a los beneficios que se obtienen del uso de un radiomarcador, una estrategia alternativa preferida es tratar al paciente con C2B8 (con una dosis única o múltiples dosis) de modo que la mayoría, si no todas, las células B periféricas se hayan agotado. A esto le podría seguir el uso de 2B3 radiomarcado; debido a la disminución de células B periféricas, el 2B8 radiomarcado tiene una posibilidad mayor de localizar células tumorales. Se prefiere usar 2B8 marcado con yodo (131), dados los tipos de resultados descritos en la bibliografía con este marcador (véase, Kaminski). Una preferencia alternativa implica el uso primero de un 2B8 radiomarcado (o C2B8) en un esfuerzo para aumentar la permeabilidad de un tumor, seguido de tratamientos únicos o múltiples con C2B8; el intento de esta estrategia es aumentar la posibilidad de C2B8 tanto de salir como de entrar en la masa tumoral. Una estrategia adicional implica el uso de agentes quimioterapéuticos combinados con C2B8. Estas estrategias incluyen los tratamientos llamados "repetitivos", es decir, tratamiento con agente quimioterapéutico, seguido de tratamiento con C2B8, seguido de una repetición de este protocolo. Alternativamente, es viable el tratamiento inicial con dosis única o múltiples dosis de C2B8, seguido después de tratamiento quimioterapéutico. Los agentes quimioterapéuticos preferidos incluyen, pero no se limitan a: ciclofosfamida; doxorrubicina; vincristina; y prednisona. Véase, Armitage J.O. y col., Cancer 50:1695 (1982).

No se pretende que las estrategias de terapias alternativas anteriores sean limitantes, si no que se presentan como representativas.

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VI. Información de depósito

Anti-CD20 en TCAE 8 (transformado en E. coli con fines de depósito) se depositó en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en materia de Patentes ("Tratado de Budapest"). Los microorganismos fueron ensayados por ATCC el 9 de noviembre de 1992, y se determinó que eran viables en esta fecha. La ATCC asignó a estos microorganismos el siguiente número de depósito en ATCC: ATCC 69119 (anti-CD20 en TCAE 8). El hibridoma 2B8 se depositó en la ATCC el 22 de junio de 1993 bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest. La viabilidad del cultivo se determinó el 25 de junio de 1993, y la ATCC le asignó a este hibridoma el siguiente número de depósito en ATCC: HB 11388.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

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\bullet EP 173404 A [0031]

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\bullet EP 08013898 A [0130]

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\bullet EP 96200772 A [0130]

\bullet EP 94901444 A [0130]

\bullet US 9310953 W [0130]

\bullet US 08149099 B [0130]

\bullet US 07978891 B [0130]

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<120> Anticuerpo anti-CD20 quimérico

\vskip0.400000\baselineskip

<130> SMW/FP6575377

\vskip0.400000\baselineskip

<140> EP 08013898.5

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<150> PCT/US93/10953

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<151> 1992-11-13

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 11

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<170> PatentIn Reléase #1.0, Versión #1.30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8540 pares de bases

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADN genómico, monocatenario, circular

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

20

21

22

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9209 pares de bases

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Murino

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADN genómico, monocatenario, circular

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

24

25

26

27

28

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47 pares de bases

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADN genómico, monocatenario, lineal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30 pares de bases

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADN genómico, monocatenario, lineal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 384 pares de bases

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Murino

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADN genómico, monocatenario, lineal

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27 pares de bases

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADN genómico, monocatenario, lineal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29 pares de bases

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220> misc_feature "El nucleótido 3 es S en el que S es G o C".

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<220> misc_feature "El nucleótido 18 es M en el que M es A o C".

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<220> misc_feature "El nucleótido 19 es R en el que R es A o G".

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<220> misc_feature "El nucleótido 25 es R en el que R es G o A".

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADN genómico, monocatenario, lineal, antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 420 pares de bases

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Murino

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADN genómico, monocatenario, lineal

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27 pares de bases

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADN genómico, monocatenario, lineal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 128 aminoácidos

\vskip0.400000\baselineskip

<212> Péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Murino

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monocatenario, lineal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 140 aminoácidos

\vskip0.400000\baselineskip

<212> Péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Murino

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Monocatenario, lineal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

38

Claims (10)

1. Procedimiento para producir un anticuerpo anti-CD20 quimérico, comprendiendo el procedimiento expresar las cadenas ligera y pesada del anticuerpo en una línea celular huésped para producir el anticuerpo, en el que la cadena ligera del anticuerpo comprende la región variable de la cadena ligera cuya secuencia de aminoácidos es codificada por la secuencia del ácido nucleico mostrada en la Figura 4, y la cadena pesada del anticuerpo comprende la región variable de la cadena pesada cuya secuencia de aminoácidos es codificada por la secuencia del ácido nucleico mostrada en la Figura 5.

2. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que la línea celular huésped es una línea celular de mamífero.

3. Procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que además comprende purificar el anticuerpo.

4. Procedimiento de la reivindicación 3, que además comprende proporcionar el anticuerpo con un tampón farmacéuticamente aceptable.

5. Procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que las cadenas ligera y pesada del anticuerpo comprenden las regiones constantes humanas.

6. Línea celular huésped que comprende el ADN que codifica las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo anti-CD20 quimérico, en el que la cadena ligera del anticuerpo comprende la región variable de la cadena ligera cuya secuencia de aminoácidos es codificada por la secuencia del ácido nucleico mostrada en la Figura 4 y la cadena pesada del anticuerpo comprende la región variable de la cadena pesada cuya secuencia de aminoácidos es codificada por la secuencia del ácido nucleico mostrada en la Figura 5.

7. Línea celular huésped de la reivindicación 6, que es una línea celular de mamífero.

8. Uso de una línea celular huésped de acuerdo con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, para producir dicho anticuerpo.

9. Anticuerpo anti-CD-20 inmunológicamente activo, que comprende las cadenas ligera y pesada del anticuerpo, en el que la cadena ligera del anticuerpo comprende la región variable de la cadena ligera cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la Figura 4 y una región constante de la cadena ligera humana, y la cadena pesada del anticuerpo comprende la región variable de la cadena pesada cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la Figura 5 y una región constante de la cadena pesada humana.

10. Anticuerpo de la reivindicación 9, con un tampón farmacéuticamente aceptable.