KR100365632B1 - 인간b임파구제한분화항원에대한키메릭및방사선표지화된항체의b세포임파종치료를위한치료학적응용 - Google Patents

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윌리암 에이취. 래스테터
네이빌 한나
존 이. 레오나드
롤랜드 에이. 뉴맨
미첼 이. 레프
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Abstract

본 명세서에서는 B 세포 임파종을 치료하기 위해 고안된 치료법이 기술되어 있다. 이 방법은 면역학적으로 활성인 마우스/인간 키메릭 항-CD20 항체, 방사선 표지화된 항-CD20 항체를 투여 사용함을 포함하는 치료법 및 키메릭 항-CD20 항체 및 방사선 표지화 항-CD20 항체를 사용함을 포함하는 협동 치료법을 기초로 한다.

Description

인간 B 임파구 제한 분화 항원에 대한 키메릭 및 방사선 표지화된 항체의 B 세포 임파종 치료를 위한 치료학적 응용
37 C.F.R. δ 1.74(d)/(e)하의 저작권에 대한 고지
본 특허 서류의 개시의 일부는 저작권 보호에 해당하는 자료를 포함한다. 이 저작권에 대한 소유자는 특허 및 상표청(Patent and Trademark Office) 특허 파일 또는 기록에 나타난 바와 같은 본 특허 서류 또는 특허 개시 부분의 제3자에 의한 복사에 이의를 제기하지 않으며 그 외의 다른 모든 저작 판권을 소유하게 된다.
관련된 출원
본 출원은 계류중인 미합중국 특허 출원 제07/978,891호(출원일:1992년 11월 13일)의 CIP 출원이다. 본 특허 서류는 발명의 명칭이 "IMPAIRED DOMINANT SELECTABLE MARKER SEQUENCE FOR ENHANCEMENT OF EXPRESSION OF COLINKED GENE PRODUCT AND EXPRESSION VECTOR SYSTEMS COMPRISING SAME"인 계류중인 미합중국 특허 출원 제07/977,691호(출원일:1992년 11월 13일) 및 발명의 명칭이 "IMPAIRED DOMINANT SELECTABLE MARKER SEQUENCE AND INTRONIC INSERTION STRATEGIES FOR ENHANCEMENT OF EXPRESSION OF GENE PRODUCT AND EXPRESSION VECTOR SYSTEMS COMPRISING SAME"인 미합중국 특허 출원 제호(출원일:1992년 11월 13일)와 관련이 있다. 관련된 특허 서류는 본 명세서에 참조 문헌으로서 인용되어 있다.
기술 목차
A. 발명의 분야
B. 발명의 배경
C. 발명의 요약
D. 도면의 간단한 설명
E. 바람직한 실시 태양의 상세한 기술
F. 실시예
I. 방사선 표지화된 항-CD20 항체 2B8
A. 항-CD20 모노클로날 항체 (쥐) 제조("2B8")
B. 2B8-MX-DTPA 접합체(conjugate)의 제조
i. MX-DTPA
ii. 2B8의 제조
iii. 2B8과 MX-DTPA의 접합
iv. MX-DTPA 삽입 결정
v. 2B8-MX-DTPA의 면역반응성
vi. 인듐-[111]-표지화된 2B8-MX-DTPA ("I2B8")의 제조
vii. 이트륨-[90]-표지화된 2B8-MX-DTPA ("Y2B8")의 제조
C. 인간을 제외한 동물에 대한 연구
i. 방사선 표지화된 2B8-MX-DTPA의 분포
ii. I2B8의 종양 국소화
iii. 방사선 표지화된 2B8-MX-DTPA에 의한 생체분포 및 종양 국소화
D. 인간에 대한 연구
i. 2B8 및 2B8-MX-DTPA: 인간 조직을 사용한 면역체계 연구
ii. I2B8(조영) 및 Y2B8(치료)의 임상 분석
a. 단계 I/II 임상 시행: 일회 투여 치료법 연구
b. 단계 I/II 임상 시행: 다수회 투여 치료법 연구
II. 키메릭 항-CB20 제조
A. 키메릭 항-CD20 면역 글로불린 DNA 발현 벡터의 작제
B. 키메릭 항-CD20 형성 CHO 및 SP2/0 트랜스펙토마 (Transfectoma)의 형성
C. 키메릭 항-CD20 항체의 면역학적 활성 측정
i. 인간 Clq 분석
ii. 보체 의존성 세포 용혈물
iii. 항체 의존성 세포 세포독성 이펙터(effector) 검정
III. 키메릭 항-CD20를 사용한 생체내 B 세포의 제거
A. 인간을 제외한 영장류 연구
B. C2B8의 임상 분석
i. C2B8의 단계 I/II 임상 시행: 일회 투여 치료법 연구
ii. C2B8의 단계 I/II 임상 시행: 다수회 투여 치료법 연구
IV. 협동 치료법: C2B8 및 Y2B8
A. Y2B8의 제조
B. C2B8의 제조
C. 결과
V. 대체 치료법
VI. 기탁 정보
G. 서열 목록
H. 특허 청구의 범위
A. 발명의 분야
본 명세서 전반에 걸쳐 언급된 참조 문헌은 단지 본 건의 출원일 이전에 공지된 문헌중에 기술된 정보를 기재한 것 뿐이며, 참조 문헌은 "선행 기술"임을 명시하거나 함축함을 인정하거나, 또는 본 발명자들은 선행 발명 또는 선출원에 기초한 우선권을 발판으로 그러한 기술에 선행할 권리가 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 아니된다.
본 발명은 B 세포 표면 항원 Bp35("CD 20")에 대한 키메릭 및 방사선 표지화 항체를 사용하여 B 세포 임파종를 치료하는 방법에 관한 것이다.
B. 발명의 배경
척추동물문(예를 들면 인간, 꼬리없는 원숭이, 꼬리있는 원숭이 등을 포함하는 영장류)의 면역계는, 척추동물 숙주에 침입한 외래 미생물(항원)을 정확하고 특이적으로 인식하여, 그러한 외래 미생물에 특이적으로 결합하고, 그러한 외래 미생물을 제거/파괴하도록 진화된 각종 기관 및 세포로 구성되어 있다. 그 중에서도 임파구가 면역계에 있어서 중요하다. 임파구는 흉선, 비장 및 골수(성인)중에서 생성되며 인간(성인)의 순환계에 존재하는 총 백혈구의 약 30%를 차지한다. 임파구에는T 세포 및 B 세포라는 2종류의 주요 구성원이 존재한다. T 세포는 세포 매개된 면역에 관련하는 반면, B 세포는 항체 형성(체액 면역)과 관련이 있다. 그런데, T 세포와 B 세포는 전형적인 면역 반응에서 상호의존성인 것으로서 간주될 수 있으며 T 세포는 T 세포 수용체가 항원 제공 세포의 표면에서 주요 조직적합 복합체("MHC") 글리코단백질에 결합되는 항원 단편에 결합할 때 활성화된다. 그렇게 활성화되면, 본질적으로 항원에 대한 항체(면역글로불린)를 분화시키고 형성하도록 B 세포를 자극하는 생물학적 조정자("인터루킨")를 방출하게 된다.
숙주내의 각각의 B 세포는 그 표면상에 상이한 항체를 발현시키며, 따라서 하나의 B 세포는 하나의 항원에 대해 특이적인 항체를 발현하고, 다른 B세포는 또 다른 항원에 대해 특이적인 항체를 발현한다. 따라서, B 세포는 그 종류가 다양하며 그러한 다양성은 면역계에 있어서 중요한 점이다. 인간에 있어서, 각각의 B 세포는 상당히 많은 항체 분자(이를 테면 107내지 108)를 형성할 수 있다. 그러한 항체 형성은 대부분 외래 항원이 제거될 때 통상 중지된다(또는 실질적으로 감소한다). 그런데 경우에 따라서, 특정 B 세포는 그 증식이 감소되지 않는데, 그러한 증식으로 인하여 "B 세포 임파종"이라 불리는 암이 발생할 수 있다.
T 세포 및 B 세포 모두는 분화 및 동정에 대한 "마커(maker)"로서 활용될 수 있는 세포 표면 단백질을 포함한다. 그러한 인간 B 세포 마커중 하나가 인간 B 임파구 제한 분화 항원 Bp35이며 이를 "CD20"으로 칭한다. CD20은 초기 전구 B 세포 발생동안 발현되어 혈장 세포 분화시까지 잔류한다. 구체적으로, CD20 분자는 세포주기 개시 및 분화에 필요한 활성화 과정의 단계를 조절할 수 있고, 통상 신생물("종양") B 세포상에서 고농도로 발현된다. 정의상 CD20은 "악성 종양" B 세포(이를 테면 증식이 감소되지 않으므로 하여 B 세포 임파종을 유발시킬수 있는 B 세포)뿐만 아니라 "정상" B 세포 모두에 존재한다. 그러므로, CD20 표면 항원은 B 세포 임파종을 "표적화"하는 후보 물질로 작용할 가능성이 있다.
본질적으로, 그러한 표적화는 하기와 같이 개괄적으로 나타낼 수 있다. B 세포의 CD20 표면 항원에 특이적인 항체를 이를 테면 환자에게 주입한다. 이들 항 -CD20 항체는 (표면상) 정상 및 악성 종양 B 세포 모두의 CD20 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하며 CD20 표면 항원에 결합된 항-CD20 항체는 신생물 B 세포의 파괴 및 제거를 유도할 수 있다. 또한, 종양 파괴 효능을 갖는 화학적 제제 또는 방사능 표지는 항-CD20 항체에 접합되어(conjugation) 이를 테면 신생물 B 세포에 특이적으로 전달될 수 있다. 접근 방법과는 무관하게, 그 첫번째 목적은 종양을 파괴하는 것이며 이 특정의 접근 방법은 활용되는 특정 항-CD20 항체에 의해 결정될 수 있고 따라서 CD20 항원을 표적화하는 유효 접근법이 상당히 다양할 수 있다.
예를 들면, 그러한 CD20 표면 항원을 표적화하는 시도가 보고된 바 있다. 그 보고에 의하면 쥐(마우스) 모노클로날 항체 1F5 (항-CD20 항체)를 B 세포 임파종 환자에게 연속적으로 정맥내 주입에 의해 투여한다. 보고된 바에 의하면, 이때 순환성 종양 세포를 제거하기 위해서는 IF5의 농도가 매우 높아야 하며, 이를테면 2g을 초과하여야 하고 그 결과는 "일시적"인 것으로 기술되어 있다 [프레스(Press) 등의 "Monoclonal Antibody 1F5 (Anti-CD20) Serotherapy of Human B-CellLymphomas"Blood69/2:584-591(1987) 참조]. 이러한 방법에 잠재하는 문제점은 비인간 모노클로날 항체(이를 테면 쥐 모노클로날 항체)가 통상 인간 이펙터 기능이 결여되어 있다는 점인데, 이를 테면 이 비인간 모노클로날 항체는 특히 보체 의존성 세포용해를 매개하거나 또는 항체 의존성 세포 독성 또는 Fc 수용체 매개된 식작용을 통해 인간 표적 세포를 용해시킬수 있는 능력이 없다. 또한, 비인간 모노클로날 항체는 인간 숙주에 의해 외래 단백질로서 인식되며 따라서 그러한 외래 항체의 반복적 주입은 해로운 과민성 반응을 유도하는 면역 반응을 유발시킬 수 있다. 쥐를 통해 얻은 모노클로날 항체의 경우, 발생된 면역 반응을 종종 인간 항-마우스 항체 반응(Human Anti-Mouse Antibody response) 또는 "HAMA" 반응으로 칭한다. 추가로, 이들 "외래" 항체는 숙주의 면역계에 의해 공격당할 수 있어 실제로 이 항체는 표적 부위에 도달하기 전에 제거된다. 임파구 및 임파종 세포는 본래 하기와 같은 여러가지 이유로 하여 방사선 요법에 민감한데, 이를 테면, 방사선 표지화된 항체의 이온화 방사선의 국소적 방사는 항원에 결합된 항체 바로 가까이에서 표적 항원(이를 테면 CD20)의 존재 또는 부재하에 세포를 죽일수 있으며 침투한 방사선은 크게 또는 약하게 혈관에 분포된 종양 중 항체에 대한 제한된 접근 문제를 피할 수 있고, 필요로 하는 항체의 총량이 감소될 수 있기 때문이다. 방사성핵종은 세포 복구 메카니즘이 세포를 생존상태로 만들 수 없는 정도까지 세포 DNA를 손상시킬 수 있는 방사능 입자를 방출시키므로, 따라서 표적 세포가 종양인 경우, 방사능 표지는 효과적으로 종양 세포를 죽인다. 정의상 방사선 표지화된 항체는 환자(이를 테면 가능하게는 골수 이식 환자) 및 의료서비스 제공자 (이를 테면 방사능을 사용할경우 고도의 주의를 필요로 하는 자)에게 주의를 요할 수 있는 방사능 물질의 사용을 포함한다.
그러므로, B-세포 질환의 치료에 효과적인 쥐 모로클로날 항체의 능력을 향상시키기 위한 접근방법은 방사성 표지 또는 톡신이 종양 부위에 편재되게 방사능 표지 또는 톡신을 항체에 접합시키는 것이다. 예를 들면, 상기에서 언급한 IF5 항체는 요오드-131("131I")로 "표지화"되어 2명의 환자에게서 생체 분포에 대해 평가된 것으로 보고되었다 [어리(J. F. Eary) 등의 "Inaging and Treatment of B-Cell Lymphoma"J. Nuc. Med.31/8:1257-1268(1990); 및 프레스(O. W. Press) 등의 "Treatment of Refractory Non-Hodgkin's Lymphoma with Radiolabeled MB-1(Anti-CD37) Antibody"J. Clin. Onc.7/8:1027-1038(1989) (한 환자는131I 표지화된 IF5 에 의해 얻어진 "부분 반응"으로 치료되었다고 함); 골덴버그(D. M. Goldenberg") 등의 "Targeting, Dosimetry and Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphomas with Iodine-131-Labeled LL2 Monoclonal Antibody"J. Clin. Onc.9/4:548-564(1991) (다수회 주입된 8명의 환자 중 3 명은 HAMA 반응을 나타낸 것으로 기록되었음); 아펠바움(F. R. Appelbaum)의 "Radiolabeled Monoclonal Antibodies in the Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma"Hem./Onc. Clinics of N.A.5/5:1013-1025 (1991) (문헌참조); 프레스(O. W. Press) 등의 "Radiolabeled-Antibody Therapy of B-Cell Lymphoma with Auotlogous Bone Marrow Support"New England Journal of Medicine329/17:1219-12223(1993)(I-131 표지화된 항-CD20 항체 IF5 및 B1); 및카민스키(M. G. Kaminski) 등의 "Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphoma with [131I] Anti-B1 (Anti-CD20) Antibody"NEJM329/7(1993) (I-131 표지화된 항-CD20 항체 B1; 이후에는 "카민스키"라 칭한다) 참조].
톡신(이를 테면, 독소루비신 또는 미토마이신 C와 같은 화학치료제)도 또한 항체에 결합된다 [PCT 특허 공개 공보 제WO 92/07466(공개일:1992. 5.14) 참조].
"키메릭(Chimeric)" 항체, 이를 테면 2 종 이상의 상이한 종(이를 테면, 마우스 및 인간)에서 취한 것을 포함하는 항체는 "접합 (conjugated)" 항체에 대한 대안으로서 개발되어 왔다. 예를 들면, 류(A. Y. Liu)의 문헌 ["Production of a Mouse-Human Chimeric Monoclonal Antibody to CD20 with Potent Fc-Dependent Biologic Activity"J. Immun.139/10:3521-3526(1987) 참조]에서는 CD20 항원에 대한 마우스/인간 키메릭 항체에 대해 기술하고 있다. 이에 대해서는 또한 하기 문헌을 참조할 수 있다 [PCT 특허 공개 공보 제WO 88/04936호]. 그런데, 상기 문헌에서는 그러한 키메릭 항체를 사용하여 B-세포 질환을 치료하기 위한 능력, 효능 또는 실효성에 대해서는 언급하고 있지 않다. 본래 생체외 기능 분석(이를 테면, 보체 의존성 세포용해 ("CDC"); 항체 의존성 세포 독성("ADCC") 등)으로는, 어떤 키메릭 항체가 특이적인 항원을 발현하는 표적 세포를 생체내에서 파괴 또는 제거할 수 있는 능력이 있는가를 예측할 수가 없다는 점을 주목해야 한다 [로빈슨(R. D. Robinson) 등의 "Chimeric mouse-human anti-carcinoma antibodies that mediate different anti-tumor cell biological activities"Hum Antibod. Hybridomas2:84-93(1991)(검출불가능한 ADCC 활성을 갖는 키메릭 마우스-인간 항체) 참조]. 그러므로, 키메릭 항체의 잠재적인 치료 효능은 단지 생체내 실험에 의해서만 평가될 수 있다.
인간 (이에 제한되는 것은 아님)을 포함한 영장류의 B 세포 임파종의 치료를 위한 CD20 항원을 표적으로 하는 치료적 접근방법은 이 기술 분야에 필요하며, 또 커다른 기술 진보가 될 것이다.
C. 발명의 요약
본 명세서에 기술된 내용은 B 세포 질환, 특히 B 세포 임파종을 치료하기 위해 고안된 치료 방법에 관한 것이다. 이들 프로토콜은 임파종과 관련된 B 세포를 포함하여 말초 혈관 B 세포를 제거하기 위해 면역학적으로 활성인 키메릭 항-CD20 항체를 투여하고, 말초 B 세포와 관련된 국부 종양을 표적화하기 위해 방사선 표지화된 항-CD20 항체를 투여하고 협동 치료 방법으로서 키메릭 항-CD20 항체 및 방사선 표지화된 항-CD20 항체를 함께 투여하는 방법을 기본으로 하고 있다.
D. 도면의 간단한 설명
제1도는 면역학적으로 활성인 키메릭 항-CD20 항체("TCAE 8")의 제조에 유용한 탠덤형(tandem) 키메릭 항체 발현 벡터를 도시한 것이다.
제2A 내지 제2E도는 제1도의 벡터의 핵산 서열이다.
제3A 내지 3F도는 쥐의 경사슬(light chain) 및 중사슬(heavy chain) 가변 영역("TCAE 8 중 항-CD20 항체")을 추가로 포함하는 제1도 벡터의 핵산 서열이다.
제4도는 쥐의 항-CD20 모노클로날 항체 2B8로부터 유도된 쥐의 경사슬 가변 영역의 핵산 및 아미노산 서열(CDR 및 기본 구조 부위 포함)이다.
제5도는 쥐의 항-CD20 모노클로날 항체 2B8로부터 유도된 쥐의 중사슬 가변 부위의 핵산 및 아미노산 서열(CDR 및 기본 구조 부위 포함)이다.
제6도는 대조군으로서의 표지화된 Clq, 표지화된 Clq 및 쥐 항-CD20 모노클로날 항체 2B8, 및 표지화된 Clq 및 인간 IgGl, k를 포함하여 키메릭 항-CD20 항체에 대한 형광 물질 표지화된 인간 Clq의 결합에 나타내는 유동 혈구계산 결과를 나타낸 것이다.
제7도는 키메릭 항-CD20 항체 및 쥐 항-CD20 모노클로날 항체 2B8를 비교하는 보체 관련 세포용해의 결과를 나타낸 것이다.
제8도는 키메릭 항-CD20 항체 및 2B8를 비교하는 생체내 인간 이펙터 세포를 사용한 항체 매개 세포 독성의 결과를 나타낸 것이다.
제9A 내지 9C도는 면역학적으로 활성인 키메릭 항-CD20 항체를 각각 0.4 mg/kg(A), 1.6mg/kg(B) 및 6.4mg/kg(C)를 주입한 후 비인간 영장류의 말초혈 B 임파구 제거 결과를 나타낸 것이다.
제10도는 면역학적으로 활성인 키메릭 항-CD20 항체 0.01mg/kg을 주입한 후 특히 비인간 영장류의 말초혈 B 임파구 제거 결과를 나타낸 것이다.
제11도는 B 세포 임파아구 종양(lymphoblastic tumor)을 사용한 마우스의 이종 그래프 모델 중 Y2B8의 종양제거 효과의 결과를 나타낸 것이다.
제12도는 B 세포 임파아구 종양을 사용한 마우스의 이종 그래프 모델 중C2B8의 종양제거 효과의 결과를 나타낸 것이다.
제13도는 B 세포 임파아구 종양을 사용한 마우스의 이종 그래프 모델 중 Y2B8 및 C2B8의 배합물의 종양제거 효과의 결과를 나타낸 것이다.
제14A 및 14B도는 질환의 일부 경감(14A) 및 질환의 적은 정도의 경감(14B)을 나타내는 환자에 대한 시간에 따른 B 세포 수 감소를 나타내는 C2B8의 단계 I/II 임상 분석의 결과를 제공한다.
E. 바람직한 실시 태양의 상세한 기술
일반적으로, 항체는 2개의 경사를 및 2개의 중사슬로 구성되어 있으며 이 사슬은 일반적인 "Y"형을 형성하고 있는데, 이때 경사슬 및 중사슬은 둘이 함께 Y의 가지 부분을 형성하며, 중사슬은 Y의 기부를 형성한다. 경사슬 및 중사슬은 구조 및 기능 상동성이 있는 도메인들로 나뉜다. 경사슬 ("VL") 및 중사슬 ("VH") 둘다의 가변 도메인은 인식도 및 특이성을 결정한다. 경사슬 ("CL") 및 중사슬 ("CH")의 불변 영역 도메인들은 중요한 생물학적 특성, 이를 테면 항체 사슬 결합, 분비, 경태 반성(transplacental) 이동성, Fc 수용체 결합 보체 결합성 등을 부여한다. 항체 형성 세포 내에서 면역글로불린 유전자의 발현을 유도하는 일련의 현상은 복잡하다. 가변 도메인 영역 유전자 서열은 "VH","D", 및 "JH", "VL" 및 "JL"로서 칭하는 개개의 생식선 (germ line) 유전자 세그먼트에 위치하고 있다. 이들 유전자 세그먼트는 DNA 재배열에 의해 결합되어, 중사슬 및 경사슬로 각기 발현되는 완전한 V 영역을 형성한다. 그 다음 재배열되고 결합된 V 세그먼트(VL-JL및 VH-D-JH)는 경사슬및 중사슬 각각의 항원 결합 도메인 또는 완전한 가변 영역을 암호화한다.
항-CD20 쥐 모노클로날 항체(1F5)를 사용하는 인간 B 세포 임파종의 혈청 요법은 문헌에 기술되어 있으며[프레스(Press)의 69 Blood 584, 1987, 전반부 참조.] 기술된 바에 의하면 치료 반응은 불행하게도 일시적인 것이다. 또한, 시험 환자의 25%는 혈청 요법에 대해 인간 항-마우스 항체 (HAMA) 반응을 나타내는 것으로 기록되었다. 또한 상기 문헌에서는 톡신 또는 방사선 동위원소에 접합된 이들 항체가 그렇지 않은 항체와 비교하여 더욱 지속적인 임상적 이점을 제공할 수 있을 것이라 제시하고 있다.
B 세포 임파종의 감퇴 효과 및 상기 질환에 대한 존속적인 치료를 제공하고 자하는 강한 필요성 때문에, 본 발명자들은 특정 항체, 이를 테면 2B8을 공통으로 갖는 상이한 접근법을 시도하였다. 그러한 유용한 접근법 중 하나는 말초혈 B 세포를 용이하고 효율적으로 복구하는 포유류 계의 능력을 이용하는 것인데, 그러한 접근 방법을 사용하여 본 발명자들은 또한 B 세포 임파종을 제거하기 위한 수단으로서 말초혈 및 임파 조직중의 B 세포를 본질적으로 제거하고자 한다. 본 발명자들은 특히 면역학적으로 활성인 키메릭 항-CD20 항체를 사용하여 이를 달성하고자 한다. 다른 접근 방법으로, 본 발명자들은 방사능 표지를 사용하여 파괴시키기 위한 종양 세포를 표적화하고자 한다.
본 명세서에 기술된 용어 "항-CD20 항체"는 통상 CD20으로 칭하며, 전형적으로 인간 B 임파구 제한 분화 항원 Bp35로서 명명되는 35,000달톤의 세포 표면 비글리코실화 인단백질을 특이적으로 인식하는 항체이다. 본 명세서에서 항-CD20 항체와 관련하여 사용된 용어 "키메릭"은 가장 바람직하게는 재조합 데옥시리보핵산 기술을 사용하여 유도되고 인간(면역학적으로 연관성이 있는 종, 이를 테면 침팬지도 포함) 및 비인간 성분을 포함하는 항체를 의미하며, 이때 키메릭 항체의 불변 영역은 가장 바람직하게는 천연 인간 항체의 불변 영역과 거의 동일하며 키메릭 항체의 가변 영역은 가장 바람직하게는 비인간 공급원으로부터 유도되며 CD20 세포 표면 항원에 대한 목적하는 특이성 및 항원성을 갖는다. 비인간 공급원은 인간 CD20 세포 표면 항원 또는 인간 CD20 세포 표면 항원을 포함하는 물질에 대한 항체를 발생시키기 위해 사용될 수 있는 어떤 척추동물도 가능하다. 그러한 비인간 공급원으로는 설치류 (이를 테면 토끼, 쥐, 마우스, 등) 및 비인간 영장류(이를 테면 동반구 원숭이(Old World Monkey), 꼬리없는 원숭이, 등)이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 가장 바람직하게는 비인간 성분(가변 영역)는 쥐의 공급원으로 부터 유도된다. 본 명세서에서 키메릭 항-CD20 항체와 관련하여 사용된 "면역학적으로 활성인"이라는 문구는 인간 Clq와 결합하는 키메릭 항체를 의미하며 인간 B 임파성 세포주의 보체 의존성 용해("CDC")를 매개하며 항체 의존성 세포 독성(ADCC)을 통해 인간 표적 세포를 용해시킨다. 본 명세서에 사용된 문구 "간접 표지화" 및 "간접표지화 접근법"은 킬레이트화제가 항체에 공유 결합되며 1종 이상의 방사성핵종이 킬레이트화제내에 삽입되는 것을 의미한다. 바람직한 킬레이트화제 및 방사성핵종은 본 명세서에 참조 문헌으로서 인용되어 있는 문헌에 명시되어 있다 [스리베그타바(S.C. Srivagtaba 및 미스(R.C. Mease)의 "Progress in Research on Ligands, Nuclides and Techniques for Labeling Monoclonal Antibodies",Nucl.Mel. Bio.18/6: 589-603(1991)("스리베그타바") 참조]. 특히 바람직한 킬레이트화제로서는 1-이소티오시스마토벤질-3-메틸디오텔렌 트리아민펜트 아세트산("MX-DTPA")이며 간접 표지화의 특히 바람직한 방사성핵종은 인듐[111] 및 이트륨[90]이다. 본 명세서에서 사용된 용어 "직접 표지화" 및 "직접 표지화 접근법" 모두는 방사성핵종이 항체에 직접 공유 결합(통상 아미노산 잔기를 통해)된 상태를 의미한다. 바람직한 방사성핵종은 상기 스리베그타바 문헌에서 제공되며 직접 표지화의 방사성핵종은 티로신 잔기를 통해 공유 결합된 요오드[131]이다. 간접 표지화 접근법이 특히 바람직하다.
본 명세서에 기술된 치료적 접근법은 말초혈 B 세포를 신속히 복구 또는 회복시키기 위한 영장류 면역계의 능력을 근간으로 한다. 추가로, 영장류의 주요 면역 반응이 T 세포에 의해 야기되기 때문에, 면역계가 말초혈 B 세포 결함을 지닐 때, "비정상적" 예방조치(이를 테면 환자 격리)가 필요하지는 않다. 상기 및 기타 영장류의 면역계의 미묘한 차이로 인하여, B 세포 질환에 대한 본 발명자의 치료적 접근법은 면역학적으로 활성인 키메릭 항-CD20 항체를 사용하여 말초혈 B 세포를 제거가능하도록 하는 것이다.
정의상 말초 혈관 B 세포 질환은 치료를 위해서는 혈액에 도달해야 하므로 면역학적으로 활성인 키메릭 항-CD20 항체 및 방사선 표지화된 항-CD20 항체의 투여 경로는 바람직하게는 비경구적이며, 이 비경구적이란 용어는 정맥내, 근육내, 피하내, 직장내, 질내 또는 복강내 투여를 포함한다. 이 중에서 정맥내 투여가 가장 바람직하다.
면역학적으로 활성인 키메릭 항-CD20 항체 및 방사선 표지화된 항-CD20 항체는 전형적으로 제약학상 허용되는 완충제, 예를 들면 멸균 염수, 멸균 완충수, 프로필렌 글리콜, 이의 혼합물 등 중에서 표준 기술에 의해 제공된다. 비경구 투여제를 제조하기 위한 방법은 본 명세서에 참조 문헌으로서 인용된 문헌에 기술되어 있다[Pharmaceutical Carriers & Formulations,마틴(Martin)저, Remington's Pharmaceutical Sciences, 제15판 (필라델피아주 이스턴 소재의 Mark Pub. Co. 간행(1975)) 참조]. 환자에게 우수한 치료 효과를 제공하기에 유용한 면역학적으로 활성인 키메릭 항-CD20 항체의 특정 치료 유효량은 당 업계의 숙련가에게 익히 공지된 표준 기술에 의해 결정할 수 있다.
면역학적으로 활성인 키메릭 항-CD20 항체의 유효 투여량(이를 테면 치료 유효량)은 체중 kg 당 약 0.001 내지 약 30 mg, 더 바람직하게는 약 0.01 내지 약 25 mg, 가장 바람직하게는 약 0.4 내지 약 20.0 mg이다. 기타 투여량도 가능하며, 투여량에 영향을 미치는 요인은 질병의 중증도, 기존의 치료법, 환자의 전체적인 건강 상태, 존재하는 기타 질환 등이 있는데 이에 한정되지는 않는다. 숙련가들은 특정 환자에 대해 용이하게 평가를 내리고 상기 범위내에 해당하거나 또는 필요에 따라서 범위 이외에 존재하는 적절한 투여량을 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
상기 투여량 범위의 면역학적으로 활성인 키메릭 항-CD20 항체의 도입은 1회 투여 치료법 또는 다수회 투여 치료법으로서 수행할 수 있다. 키메릭 항체와 관련하여, 다수회 투여 치료법으로 이를 투여하는 것이 바람직하며 이러한 바람직한 접근법은 이 질환과 관련된 치료법을 기준으로 예상된다. 특별한 이론에 얽매이고자하는 것은 아니지만, 면역학적으로 활성인 키메릭 항-CD20 항체가 면역학적으로 활성이며 CD20에 결합하기 때문에, 면역학적으로 활성인 키메릭 항-CD20 항체를 개개인에게 도입하면, 말초 혈관 B 세포가 제거되기 시작할 것이며, 이때 주입한지 약 24시간 후에는 말초 혈관 B 세포가 거의 완전히 제거된다. 이러한 이유로 하여, 면역학적으로 활성인 키메릭 항-CD20 항체 (또는 방사선 표지화된 항-CD20 항체)를 환자에게 잇따라 투여하게 되면 a) 잔여 말초혈 B 세포가 제거되며 b) 임파절로 부터 B 세포가 제거되기 시작하며 c) 기타 조직원, 이를 테면 골수, 종양 등으로부터 B 세포가 제거되기 시작한다. 면역학적으로 활성인 키메릭 항-CD20 항체를 반복 투여하면 일련의 현상들이 발생하는데 각 현상은 질환의 효과적 치료에 중요한 것으로서 관측되었다. 첫번째 현상은 주로 환자의 말초혈 B 세포를 실질적으로 제거하는 것이고, 후속의 "현상들"은 대개는 동시에 또는 순차적으로 계의 나머지 B 세포를 제거하거나, 림프절 B 세포를 제거하거나, 또는 기타 조직의 B 세포를 제거하는 것이다.
실제로, 단일 투여가 유리하고 질환 치료/관리에 효과적으로 사용될 수 있긴 하나, 바람직한 치료 경로는 다단계 투여 치료시에 발생할 수 있는데, 가장 바람직하게는 체중 1 kg 당 면역학적으로 활성인 키메릭 항-CD20 항체 약 0.4 내지 약 20 mg을 1주일에 1번씩 약 2 내지 10주, 가장 바람직하게는 약 4주 동안 환자에게 투여된다.
방사선 표지화된 항-CD20 항체의 사용과 관련하여서는, 항체가 키메릭성이 아닌 것이 바람직한데, 그 이유는 쥐의 항체보다 키메릭 항체의 순환 반감기가 상당히 더 길기 때문인데, 이를테면 순환 반감기가 더 길면, 방사성핵종이 장기간 동안 환자에게 존재한다. 그러나, 방사선 표지화된 키메릭 항체는 쥐의 항체에 대한 키메릭 항체와 함께 낮은 밀리-큐리(milli-Curries: "mCi") 정도의 투여량으로 사용될 수도 있다. 상기와 같이 사용함으로써 치료 효용성은 유지하면서 골수 독성이 허용치로 감소되도록 할 수 있다.
각종 방사성핵종이 본 발명에 적용가능하며 당업계의 숙련가들은 각종 상황하에서 어떤 방사성핵종이 가장 적절한지를 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 예를 들면, 요오드[131]은 표적화된 면역요법에 사용되는 익히 공지된 방사성핵종이다. 그런데, 요오드[131]의 임상적 유용성은 몇몇 요인, 예를 들면 8일이라는 물리적 반감기, 혈액 및 종양 부위 모두에서의 요오드처리된 항체의 탈할로겐화, 및 종양의 국소 투여 침착(deposition)에 대해 최적에 못미치는 방출 특성(이를 테면 다량의 감마 성분) 때문에 제약이 따를 수 있다. 보다 우수한 킬레이트화제의 출현으로 금속 킬레이트화기를 단백질에 결합시키기 위한 기회는 인듐[131] 및 이트륨[90]과 같은 다른 방사성핵종을 사용할 기회를 증가시킨다. 이트륨[90]은 방사선 면역 요법 응용에서 사용할 때 몇몇 이점을 제공하는데, 이를 테면 64시간이라는 이트륨[90]의 반감기는 종양에까지 항체가 축적될 수 있도록 충분히 길며, 이를테면 요오드[131]과는 달리, 이트륨[90]은 자연 붕괴시에 감마 방사선을 수반하지 않은 고 에너지의 순수한 베타 방사체이며, 조직내 범위는 100 내지 1,000 배의 세포 직경이다. 또한, 최소량의 침투 방사선으로도 외래 환자에게 이트륨[90]-표지화된 항체를 투여할 수 있다. 또한, 세포를 죽이기 위해 표지화된 항체의 연합은 필요치않으며 이온화 방사선의 국소 방출은 표적 항원이 없는 인접 종양에 대해서 치사 수준이어야 한다.
이트륨[90]을 치료에 사용하기 어려운 점 중 하나는 의미있는 정도의 감마선이 없으므로 이를 사용한 조영이 어렵다는 사실에 기초한다. 이러한 문제를 제거하기 위해 이트륨[90]-표지화된 항-CD20의 치료 용량을 투여하기 앞서, 종양의 위치 및 상대적 크기를 결정하기 위해 진단 "조영" 방사성핵종, 이를테면 인듐[111]을 사용할 수 있다. 인듐[111]은 진단 방사성핵종으로서 특히 바람직한데, 그 이유는 약 1 내지 약 10 mCi가 독성 검출없이 안전하게 투여될 수 있고 조영 데이타는 일반적으로 후속의 이트륨[90]-표지화 항체 분포를 예견하기 때문이다. 대부분의 조영 연구는 5 mCi의 인듐[111]-표지화된 항체를 이용하는 것인데 그 이유는 이러한 투여량이 안전하며 더 낮은 투여량과 비교한 바 조영 효율성이 증가하기 때문이며, 이때 최적의 조영은 항체 투여 후 3 내지 6일째에 형성된다[뮤레이 (J. L. Murray)의 26J.Nuc.Med.3328(1985) 및 캐러구일로(J.A.Carraguillo) 등의 26J.Nuc. Med.67(1985)참조]
이트륨[90] 표지화 항-CD20 항체의 효과적인 1회 치료 투여량(이를테면 치료 유효량)은 약 5 내지 약 75 mCi, 더욱 바람직하게는 약 10 내지 약 40 mCi이다. 요오드[131] 표지화된 항-CD20 항체의 1회의 효과적인 비골수 제거 치료 투여량은 약 5 내지 약 70 mCi, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 약 40 mCi이다. 효과적인 1회 치료 제거 투여량(이를테면 자가 조직 골수 이식에 필요할 수 있는 투여량)은 약 30 내지 약 600 mCi, 더욱 바람직하게는 약 50 내지 약 500 mCi이다. 키메릭 항 -CD20항체는 쥐의 항체와 비교하여 순환 반감기가 더 길기 때문에, 요오드[131] 표지화 키메릭 항-CD20 항체의 효과적인 1회 치료 비골수 제거 투여량은 약 5 내지 약 40 mCi, 바람직하게는 약 30 mCi미만이다. 이를 테면 인듐[111] 표지에 대한 조영 기준은 통상 약 5 mCi 미만이다.
방사선 표지화된 항-CD20 항체를 사용한 치료법은 또한 1회 치료 또는 다수회 치료로 행할 수 있다. 방사성핵종 성분 때문에, 방사선으로 인한 치명적 골수 독성을 나타낼 지도 모르는 환자를 위해 치료 전에 말초 간 세포(peripheral stem cell: "PSC") 또는 골수("BM")를 채취("harvest")하는 것이 바람직하다. BM 및(또는) PSC를 표준 기술을 사용하여 채취한 다음 이를 세정하고 있을 지도 모르는 재주입을 위해 동결 건조시킨다. 추가로, 치료전에 진단용 표시화 항체(이를 테면 인듐[111])을 사용하여 환자에게 진단성 선량측정(dosimetry)을 수행하는 것이 가장 바람직한데, 그 목적은 치료적으로 표지화된 항체(이를 테면 이트륨[90] 사용)가 특정의 정상 기관 또는 조직에 불필요하게 집중되지 않도록 하기 위함이다.
키메릭 마우스/인간 항체는 기술되어 있다 [모리슨(S. L. Morrison) 등의PNAS I1: 6851-6854(1984년 11월); 유럽 특허 공보 제173424호; 불리안(G. L. Boulianne) 등의Nature312:642(1984년 12월); 노이바이거(M. S. Neubeiger) 등의 Nature 314:268 (1985년 3월); 유럽 특허 공보 제125023호; 탄(Tan) 등의J. Immunol135:8654(1985년 11월); 선(L.K.Sun)의 Hybridoma 5/1:517(1986년); 사아강(Sahagan) 등의J. Immunol.137:1066-1074(1986년) 참조]. [뮤런(Muron)의 Nature 312:597(1984년 12월); 딕슨(Dickson)의 Genetic Engineering News5/3(1985년 3월); 막스(Marx)의 Science 229 455(1985년 8월); 및 모리슨(Morrison)의 Science 229: 1202-1207](1985년 9월)참조]. 로빈슨 등의 PCT 공개 공보 제WO88/04936호에서는 CD20의 에피토프(epitope)에 대한 특이성을 갖는, 인간의 불변 영역 및 쥐의 가변 영역을 갖는 키메릭 항체에 대해 기술하고 있으며, 로빈슨 문헌에서의 이 키메릭 항체의 쥐의 부분은 2H7 마우스 모노클로날 항체(감마 2b, 카파)로부터 유도된다. 상기 문헌은 키메릭 항체가 B세포 질환의 치료에 대한 1순위 후보 물질이라는 사실에 대해 기술하고 있지만, 상기 문헌에서는 특히 치료 효율성을 지지할 수 있는 데이타 및 중요하게는 영장류 또는 인간과 같은 보다 진화된 포유류를 사용한 데이타가 없기 때문에 당업계의 숙련가에게는 그 문헌에서의 제시가 이 특정 항체에 대해 정확한 것인지 아닌지를 측정하기 위한 제시에 지나지 않는다.
키메릭 항체를 형성하는 방법은 당 업계의 숙련가에게는 유효하다. 예를 들면, 경사슬 및 중사슬은, 예를 들면, 별도의 플라스미드 중에서 면역글로불린 경사슬 및 면역글로불린 중사슬을 사용하여 별도로 합성할 수 있다. 그 다음 이 사슬들을 정제하여 생체내에서 완전한 항체내로 조립한다. 그러한 조립을 수행하는 방법이 문헌에 기술되어 있다[스카프(M. Scharff)의Harvey Lectures69:125(1974년) 참조]. 환원된 경사슬 및 중사슬을 단리하여 이들로 IgG 항체를 형성하는 생체외 반응 파라미터는 문헌에 기술되어 있다[베이촉(S. Beychok)의Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, New York, 제69면, 1979 참조]. 또한중사슬 및 경사슬을 완전한 H2L2IgG 항체로 세포내 회합 및 연결시키기 위해서는, 동일 세포내에서 경사슬 및 중사슬을 동시 발현시킬 수도 있다. 그러한 동시 발현은 동일 숙주 세포내에서 동일하거나 또는 상이한 플라스미드를 사용하여 달성할 수 있다.
기타 키메릭 비인간/인간 항-CD20 항체를 개발하기 위한 본 발명의 가장 바람직한 방법중 하나는 인간 공급원으로부터 제공되는 중사슬 및 경사슬 불변 영역을 암호화하는 DNA를 처음부터 포함하는 발현 벡터를 사용하는 것에 기초한다. 이러한 벡터에 비인간 가변 부위를 암호화하는 DNA를 삽입할 수 있어 다양한 비인간 항-CD20 항체를 형성하고 스크리닝(screening)하고 각종 특성(이를 테면 결합 특이성 유형, 에피토프 결합 영역 등)에 대해 분석할 수 있다. 그 다음 바람직하거나 또는 목적하는 항-CD20 항체의 경사슬 및 중사슬 가변 영역을 암호화하는 cDNA를 벡터내로 혼입시킬 수 있다. 본 발명에서는 이러한 유형의 벡터를 텐덤형 키메릭 항체 발현(Tandem Chimeric Antibody Expression: "TCAE") 벡터라 칭한다. 임파종을 치료하기 위한 면역학적으로 활성인 키메릭 항-CD20 항체를 발생시키기 위해 사용되는 가장 바람직한 TCAE 벡터는 TCAE 8이다. TCAE 8은 본 특허 서류의 양수인이 소유한 벡터인 TCAE 5.2라 칭하는 벡터의 유도체인데, TCAE 8과의 차이점은 TCAE 5.2에서는 우성 선택성 마커(네오마이신 인산기전이 효소: NEO)의 번역 개시 시작 부위는 공통 코작(Kozak) 서열인 반면, TCAE 8에서 이 영역은 부분적으로 손상된 공통 코작 서열이다. 단백질 발현에 관한 TCAE 벡터(또한 "ANEX 벡터"라고도 칭한다)의 우성 선택 마커의 개시 시작 부위의 영향에 관한 자세한 사항은 본원과 함께 출원된 동시 계류중인 출원에 상세히 기술되어 있다.
TCAE 8은 4개의 전사카세트를 포함하며 이들은 일렬로 존재하는데, 즉 인간 면역글로불린 경사슬이 없는 가변 영역, 인간 면역글로불린 중사슬이 없는 가변 영역, DHFR 및 NEO 순이다. 각각의 전사 카세트는 그 자신의 진핵세포 프로모터(promotor) 및 폴리아데닐화 영역(이에 대해서는 TCAE 8 벡터의 다이아그램인 제1도를 참조한다)를 포함한다. 구체적으로
1) 면역글로불린 중사슬 앞에 오는 CMV 프로모터/인핸서(enhancer)는 -350의 Nhe I 부위에서부터 -16의 Sst I 부위까지의 경사슬 앞의 프로모터/인핸서의 절단된 버젼이다[41 Cell 521, 1985년 참조].
2) 인간 면역글로불린 경사슬 불변 영역은 PCR 반응에 의해 cDNA의 증폭을 통해 유도된다. TCAE 8에서 이 영역은 인간 면역글로불린 경사슬 카파 불변 영역[캐버트(Kabat) 번호 매김에 의하면 아미노산 108-214, 알로형(allotype) Km 3 (캐버트(E.A. Kabat)의 "Sequences of Proteins of immunological interest" NIH Publication 제5판, 91-3242, 1991년 참조)] 및 인간 면역글로불린 중사슬 감마 1 불변 영역 (캐버트 번호매김에 의하면 아미노산 114-478, 알로형 Gmla, Gmlz)이다. 경사슬은 정상의 인간 혈액[캘리포니아주 라 졸라(La Jolla) 소재의 IDEC Pharmaceuticals Corporation]으로부터 단리시키고 그로부터 얻은 RNA를 사용하여 cDNA를 합성하고 PCR 기술을 사용하여 증폭시켰다(프라이머 공통 서열은 캐버트로부터 유도된다). 중사슬은 인간 IgGl 벡터로 형질감염시킨 세포로부터 유래된 RNA를 사용하여 만든 cDNA로부터 단리시킨다(PCR 기술 사용)된다[3Prot. Eng.531, 1990; vector pNγ1 62 참조]. 단리시킨 인간 IgG1에서 2개의 아미노산을 변화시켜 캐버트의 공통 아미노산 서열을 매칭시키는데, 다시 말해 아미노산 225는 발린(GTT)에서 알라닌(GCA)으로 변화시키고, 아미노산 287은 메티오닌(ATG)으로부터 리신(AAG)으로 변화시킨다.
3) 인간 면역글로불린 경사슬 및 중사슬 카세트는 면역글로불린 사슬의 분비에 관한 합성 신호 서열(signal sequence)을 포함한다.
4) 인간 면역글로불린 경사슬 및 중사슬 카세트는 전이성 판독 프레임(transitional reading frame)을 유지하고 면역글로불린 사슬에서 통상 발견되는 아미노산을 변화시키지 않는 경사슬 및 중사슬 면역글로불린 가변 영역을 삽입시킬 수 있는 특이적 DNA 제한 부위를 포함한다.
5) DHFR 카세트는 그 자신만의 진핵세포 프로모터(마우스 베타 글로빈 주요 프로모터: BETA) 및 폴리아데닐화 영역(소 성장 호르몬 폴리아데닐화: BGH)를 함유한다.
6) NEO 카세트는 그 자신만의 진핵세포 프로모터(BETA) 및 폴리아데닐화 영역(SV40 초기 폴리아데닐화: SV)를 포함한다.
TCAE 8 벡터 및 NEO 카세트와 관련하여, 코작(Kozak) 영역은 부분적으로 손상된 공통 코작 서열(상단의 Cla I 부위를 포함함)이다:
(TCAE 5.2 벡터에서, ClaI 및 ATG 부위 사이에서 변화가 생기는데, 즉 ccAcc가 존재한다)
TCAE 8의 완전한 서열 목록(4개의 전사 카세트의 특정 성분 포함)이 제2도에 명시되어 있다(SEQ. ID. NO. 1).
당업계의 숙련가에 의해 인지되는 바와 같이, TCAE 벡터는 면역학적으로 활성인 키메릭 항-CD20 항체의 생성 시간을 상당히 감소시키는 장점이 있다. 비인간 경사슬 및 중사슬 가변 영역의 생성 및 분리 후 이를 인간 경사슬 불변 전사 카세트 및 인간 중사슬 불변 전사 카세트 내로 혼입시키면 면역학적으로 활성인 키메릭 항-CD20 항체가 제조된다.
본 발명에서 쥐의 공급원 및 하이브리도마(hybridoma) 기술을 사용하여 CD20 항원에 대해 특이성을 갖는 가장 바람직한 비인간 가변 영역을 유도하였다. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기술을 사용하여, 쥐의 경사슬 및 중사슬 가변 영역을 직접 TCAE 8 벡터내로 클로닝하는데 이러한 방법이 비인간 가변 영역을 TCAE 벡터에 삽입하기 위한 가장 바람직한 경로이다. 이러한 바람직성의 근거는 원칙적으로 PCR 반응의 효율성 및 삽입의 정확도이다. 그런데, 이러한 과제를 달성하기 위한 다른 대등한 방법도 유효하다. 예를 들면, TCAE 8(또는 상응하는 벡터)를 사용하여, 비인간 항-CD20 항체의 가변 영역의 서열을 얻을 수 있으며, 이어서 서열 일부 또는 필요에 따라서 전체 서열의 올리고뉴클레오타이드 합성을 행하고 그 다음 일부 또는 총 합성 서열을 벡터내의 적절한 부위에 삽입시킬 수 있다. 당 업계의 숙련가는 이러한 과제를 달성하는 능력을 지니고 있을 것이다.
본 발명의 가장 바람직한 면역학적으로 활성인 키메릭 항-CD20 항체는 CD20에 대한 모노클로날 항체로부터 유도된 쥐의 가변 영역을 포함하는 TCAE 8 벡터를 사용하여 유도된다. 이 항체(이후에 상세히 설명할 것임)를 2B8로서 칭한다. TCAE 8 중 2B8로부터 얻어진 가변 영역의 완전한 서열(TCAE 8 중 항-CD20)을 제3도에 기재하였다(SEQ. ID. NO.2).
단백질 발현에 사용되는 숙주 세포는 가장 바람직하게는 포유류 기원이며, 당 업계의 숙련가는 그 중에서 발현될 목적하는 유전자 생성물에 가장 적합한 특정 숙주 세포주를 선택적으로 결정할 수 있다. 예시적인 숙주 세포주로서는 이에 한정되는 것은 아니지만 DG44 및 DUXB11(차이니스 햄스터 난소세포주: Chinese Hamster Ovary lines; DHFR 마이너스), HELA(인간 경부암종), CVI(원숭이 신장세포주), COS(CVI과 SV40 T 항원의 유도체), R1610(차이니스 햄스터 섬유아세포), BALBC/3T3(마우스 섬유아세포), HAK(햄스터 신장세포주), SP2/0(마우스 수초종(myeloma)), P3x63-Ag3.653(마우스 수초종), BEA-1clBPT(태아 소 내피성세포), RAJI(인간 임파구) 및 293(인간 신장)을 들 수 있다. 숙주 세포주는 영리 기관, 이를테면 아메리칸 티슈 컬쳐 콜렉션(American Tissue Culture Collection) 또는 간행물로부터 통상 입수된다.
바람직하게는 숙주 세포주는 DG44("CHO") 또는 SP2/0이다 [울랜드(G. Urland) 등의 "Effect of gamma rays and the dihydrofolate reductase locus: deletions and inversions"Som, Cell & Mol. Gen.12/6: 555-566(1986년) 및슐만(M. Shulman) 등의 "A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies"Nature276:269(1978년) 참조]. 가장 바람직하게는, 숙주 세포주는 DG44이다. 숙주 세포내로의 플라스미드의 형질감염은 당 업계의 숙련가에게 유효한 기술에 의해 달성될 수 있다. 이러한 방법에는 형질감염(전기 영동법 및 전기 천공법), 인벨로핑된(enveloped) DNA를 사용한 세포 융합, 미량주사법, 및 무손상(intact) 바이러스를 사용한 감염법을 들 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다 [리지웨이(Ridgway)의 A.A.G. "Mammalian Expression Vectors" Chapter 24.2 470-472면 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds.(메사츄세츠주 보스톤 버터워쓰 소재, 1988년) 참조]. 가장 바람직하게는 플라스미드를 숙주내로 도입하는 방법은 전기 천공법을 통한 것이다.
F. 실시예
하기 실시예는 본 발명을 한정하는 것으로 의도되지도 않고 그렇게 구성되지도 아니하였다. 하기 실시예는 단지 방사선 표지화된 항-CD20 항체("I2B8") 방사선 표지화된 항-CD20 항체("Y2B8"), 및 쥐의 항-CD20 모노클로날 항체("2B8")로부터 유도된 가변 영역 및 특정 벡터("TCAE 8")를 사용하여 유도된 면역학적으로 활성인 키메릭 항-CD20 항체(C2B8)를 사용하여 투여 영상을 예시하기 위한 것이다.
I. 방사능 표지화된 항-CD20 항체 2B8
A. 항-CD20 모노클로날 항체(쥐) 제조("2B8")
BALB/C 마우스를 인간 임파아구종 세포주 SB [아담즈(R. A. Adams) 등의 "Direct implantation and serial transplantation of human acute lymphoblasticleukemia in hamsters, SB-2".Can Res28:1121-1125(1968년) 참조; 이 세포주는 ATCC 기탁 번호 ATCC CCL 120 하에 메릴랜드주 록커빌 소재의 아메리칸 티슈 컬쳐 콜렉션으로부터 입수된다]를 사용하여 3 내지 4달 동안 약하게 주입하면서 반복적으로 면역시켰다. 공지된 CD20-특이 항체[사용된 항-CD20 항체는 Leu 16(캘리포니아주 산 호세 소재의 Beckton Dickinson에서 제조): Cat. No. 7670 및 B1(플로리다주 하이알레하(Hialeah) 소재의 (Coulter Corp.에서 제조) : Cat. No. 6602201이다]의 억제에 의해 측정한 것보다 항-CD20 항체의 더 큰 혈청 적가를 나타낸 마우스를 확인한 후, 이런 마우스의 비장을 꺼냈다. 비장 세포를 하기에 기술된 방법에 따라 마우스의 수초종 SP2/0과 융합시켰다 [아인펠드(D. A. Einfeld)등의 EMBO 7:711(1988년)(SP2/0은 ATCC 기탁 번호가 ACTT CRL 8006이다) 참조].
CD20 특이성에 대한 검정은 방사선면역검정법에 의해 달성한다. 요약하면, 정제된 항-CD20 B1은 하기에 기술된 바와 같은 요오도비드법(iodobead method)에 의해 I125로 방사선 표지화된다 [발레타인[M. A. Valentine]의J. Biol. Chem.264-11282(I125요오드화나트륨 (캘리포니아주 어어빈(Irvine) 소재의 ICN에서 제조): Cat. No. 28665H)) 참조]. 하이브리도마를 1 % BSA, PBS(pH 7.4) 및 100,000 SB 세포를 함유하는 동일 완충액 0.5 ml 중 I125표지화 항-CD20 B1(10 ng) 0.05 ml와 함께 각각의 융합 웰(well)로부터 취한 매질 0.05 ml를 공동 배양하여 스크리닝(screening)하였다. 실온에서 1시간 동안 배양시킨 후, 세포를 96개의 웰 적정 판(캘리포니아주 샌 디에고 소재의 V & P Scientific 제조)으로 이동 수거하고 물로 철저히 세척하였다. 비표지화 항-CD20 B1을 함유하는 웰 2벌 및 억제 항체를 포함하지 않는 웰을 각각 포지티브 및 네가티브 대조군으로서 사용하였다. 50 %보다 큰 억제율을 갖은 웰을 확장시키고 클로닝하였다. 가장 높은 억제율을 나타내는 항체를 "2B8"로서 명명되는 클론화 세포주로부터 유도하였다.
B. 2B8-MX-DTPA 접합체의 제조
i.MX-DTPA
탄소-14-표지화된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산("탄소-14 표지화된 MX-DTPA")을 2B8에 방사능 표지를 접합시키기 위한 킬레이트화제로서 사용하였다. MX-DTPA을 조작하여 금속 부재 조건을 유지하였는데, 이를테면 금속 부재 제제를 사용하고 가능하다면 폴리프로필렌 플라스틱 용기(플라스크, 비이커, 눈금 실린더, 피펫 팁(tip))를 알코녹스(Alconox)로 세척하고 Milli-Q 물로 세정하고 유사하게 사용하였다. MX-DTPA를 오토 갠소우(Otto Gansow) 박사 (메릴랜드주 베데스타(Bethesda) 소재의 National Institute of Health 근무)로부터 건조 고상물 상태로 얻어 4℃에서 건조 보관(광 차단)시키는데, 이때 원액은 2-5 mM의 농도에서 Milli-Q 물 중에서 제조하는데 -70℃에서 저장하였다. 또한 MX-DTPA를 물 중 이나트륨염으로서 코울터 이뮤놀리지(Coulter Immunology:플로리다주의 히알레하 소재)로부터 얻었으며 이를 -70℃에서 저장하였다.
ii.2B8의 제조
CENTRICON 30TM스핀 필터(30,000D, MWCO; 아미콘사(Amicon)제품)를 사용한완충액 반복 교환을 통해 150 mM의 NaCl을 함유하는 금속 부재 50 mM 비신 -NaOff, pH 8.6 중으로 정제된 2B8을 이동시킴으로써 MX-DTPA와의 접합을 위해 정제된 2B8 항체를 준비했다. 일반적으로, 단백질(10 mg/nl) 50-200 μL를 필터 유니트에 가한 다음 비신 완충액 2 ml를 가하였다. 필터를 Sorval SS-34 로터(6,000 rpm, 45분)중에서 4℃에서 원심분리시켰다. 보유 용적은 약 5-100 μL이였다. 동일 필터를 사용하여 이 공정을 2회 반복하였다. 보유 용적을 폴리프로필렌 나사 캡튜브(1.5 mL)로 옮기고 단백질에 대해 검정하고 10.0 mg/mL로 희석하고 사용할 때까지 4℃에서 저장하고 단백질을 유사하게 상기 방법을 사용하여 150 mM NaCl 및 0.05 % 아지드화나트륨을 함유하는 pH 5.5의 시트르산나트륨 50 mM로 옮겼다.
iii.2B8과 MX-DTPA의 접합
2B8과 MX-DTPA의 접합은 주위 온도에서 폴리프로필렌 튜브중에서 행하였다. 동결시킨 MX-DTPA 원액을 사용 직전에 해동시켰다. 10 mg/mL 농도의 단백질 550-200 mL를 MX-DTPA 대 2B8 4:1의 몰비에서 MX-DTPA와 반응시켰다. MX-DTPA 원액을 가하여 반응을 개시하고 온화하게 혼합하여 주위 온도에서 일야(14 내지 20시간) 접합시켰다. 반응하지 않은 MX-DTPA를 상기 실시예 I.B.ii에서 기술한 바와 같이 아지드화나트륨 0.05 %를 함유하는 무금속 생리 식염수(0.9 % w/v) 중에서 투석 또는 반복적 한외여과에 의해 접합체로부터 제거하였다. 단백질 농도를 10 mg/mL로 조정하고 방사선 표지화될때까지 폴리프로필렌 튜브중에서 4℃에서 저장하였다.
iv.MX-DTPA 혼입 측정
MX-DTPA 혼입은 신틸레이션 계수(Scintillation counting)에 의해 그리고 얻은 수치를 탄소-[14]-표지화된 MX-DTPA의 특이 활성에 대해 정제된 접합체와 비교하여 측정하였다. 비방사능 MX-DTPA(코울터 이뮤놀로지사(Coulter Immunology)에서 제조)를 사용하는 특정 연구의 경우, MX-DTPA 혼입은 접합체를 소정의 농도 및 특정의 활성을 갖는 이트륨-[90] 방사능 담체 용액 과량과 배양시켜 검정하였다.
소정 농도의 염화이트륨 원액을, 무담체 이트륨-[90](염화물 염)이 가해진 무금속 0.05N HCl 중에서 제조하였다. 이 용액 분취액을 액체 신틸레이션 계수에 의해 분석하여 이 제제에 대한 정확한 비활성을 측정하였다. 항체에 결합될 것으로 기대되는 킬레이트의 몰수의 3배에 해당하는 용적의 염화이트륨 (통상 항체 1mol 당 2 mol)을 폴리프로필렌 튜브에 가하고 2 M 아세트산나트륨을 사용하여 pH를 4.0 내지 4.5로 조정하였다, 이어서 접합된 항체를 가하고 혼합물을 주위 온도에서 15-30분동안 배양하였다. 20 mM EDTA를 최종 농도가 1 mM이 되도록 가하여 반응을 중단키고 2 M 아세트산나트륨을 사용하여 용액의 pH를 약 pH 6으로 조정하였다.
5분 동안 반응시킨 후, 총 용적을 고성능 크기 배제 크로마토그라피(이후에 상세히 설명할 것임)로 정제하였다. 용출된 단백질 함유 분획을 합하고 단백질 농도를 측정하고 분취량을 방사능에 대해 검정하였다. 이트륨-[90] 염화물 제제의 비활성 및 단백질 농도를 사용하여 킬레이트 혼입을 계산하였다.
v.2B8-MX-DTPA의 면역 반응성
접합 2B8의 면역 반응성은 전세포 ELISA를 사용하여 평가하였다. 배양물로 부터 원심 분리에 의해 중간 로그 페이즈(mid-log phase) SB 세포를 수거하고, 1 XHBSS로 2회 세척하였다. 세포를 HBSS 중에 1-2x106세포/mL가 되도록 희석하고, 96개의 웰을 갖는 폴리스티렌 미세적정판에 웰 1개 당 50,000 - 100,000개의 세포를 분취하여 놓았다. 이 판을 진공 하 40 내지 45℃에서 2시간 동안 건조시켜서 세포들을 판에 고정시키고, 사용할 때까지 판을 -20℃에서 보관하였다. 분석하기 위해서, 사용 직전에 판들을 주위 온도로 가온시킨 후, 1 X PBS (1% BSA 함유함; pH 7.2-7.4)로 2시간 동안 차단시켰다. 분석용 시료를 1 X PBS / 1% BSA 중에 희석시키고, 판에 가하고, 연속해서 동일 완충액 중에 희석시켰다(1:2). 주위 온도에서 1시간 동안 판을 인큐베이션시킨 후, 판을 1XPBS로 3회 세척시켰다. 2차 항체(염소 항-마우스 IgG1 특이성 HRP 접합체 50 μL)를 웰에 첨가하고(1XPBS/1%BSA 중에 1:1500로 희석), 주위 온도에서 1시간 동안 반응시켰다. 판들을 1XPBS로 4회 세척한 후, ABTS 기질 용액(50 mM 시트르산나트륨, 0.01% ABTS 및 0.001% H2O2를 함유함, pH 4.5)을 첨가하였다. 15 내지 30분 동안 반응시킨 후에 판들을 405 nm로 검정하였다. 비특이성 결합을 모니터하기 위하여 분석용 시료에 항원 네가티브 HSB 세포들을 함유시켰다. 접합체의 면역 반응성은 각각의 희석 계수에 대해서 흡광도 값을 플롯하여 이들을 동일 판에 대해 시험한 네가티브 항체(100% 면역 반응성을 나타냄)를 사용하여 얻어진 값들과 비교함으로써 계산하였다; 적정 프로필의 선형 부분 의 수 개의 값들을 비교하고, 평균치를 계산하였다(데이타는 나타내지 않음).
vi.인듐-[111]로 표지화된 2B8-MX-DTPA("I2B8")의 제조
접합체를 무담체 인듐-[111]으로 방사선 표지화시켰다. 0.05M HCl 중의 동위원소 (0.1-2 mCi/mg 항체)의 분액을 폴리프로필렌 관에 옮기고, 약 1/10 부피의 무금속 2M HCl을 첨가하였다. 5분 동안 반응시킨 후, 무금속 2M 아세트산나트륨을 첨가해서 용액의 pH를 4.0 내지 4.4로 조정하였다. 정상 염수 중의 10.0 mg/ml DTPA 원액 또는 0.05% 아지드화나트륨 함유 50mmM 시트르산나트륨/150mM NaCl로부터 약 0.5mg의 2B8-MX-DTPA를 첨가하고, 즉시 용액을 온화하게 혼합시켰다. 용액의 pH를 pH 검사지로 검사해서 pH가 4.0 내지 4.5인지를 확인하고, 혼합물을 주위 온도에서 15 내지 30분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 최종 농도가 1mM이 되도록 20mM EDTA를 첨가해서 반응을 중단시키고, 반응 혼합물에 2M 아세트산나트륨을 첨가하여 pH를 약 6.0으로 조정하였다.
5 내지 10분 동안 반응시킨 후, 비접합 방사선 동위 원소를 크기 배제 크로마토그래피로 제거하였다. HPLC 유닛은 각각 Waters U6K 또는 Rheodyne 700 주입 밸브가 장착된 Waters Model 6000 또는 TosoHaas Model TSK-6110 용매 전달 시스템으로 이루어졌다. 크로마토그래피 분리는 겔 투과 컬럼(BioRad SEC-250; 7.5x300 mm 또는 이에 필적하는 TosoHaas 컬럼) 및 SEC-250 가드 컬럼(7.5 x 100 mm)를 사용하여 수행하였다. 이 시스템에 프랙션 컬렉터(fraction collector; Pharmacia Frac200)와, 280 nm 필터가 설치된 UV 모니터(Pharmacia model UV-1)를 장착하였다. 시료를 가하고, 1XPBS(pH 7.4)를 사용하여 유속 1.0mL/분으로 균등하게 용출시켰다.ml 분획들을 유리관에 모으고, 그 분액을 감마 계수기로 계수하였다. 상부 및 하부 윈도우에 각각 100 및 500 KeV를 걸었다.
방사선 혼입도는 용출된 단백질 피이크와 관련된 방사능을 합하고, 이 값을컬럼으로부터 용출된 전체 방사능으로 나누어서 계산하고; 이어서, 이 값을 백분율로 나타내었다(데이타는 나타내지 않음). 몇몇 경우에 있어서, 방사선 혼입도는 즉석 박층 크로마토그래피("ITLC")를 사용하여 결정하였다. 방사선 표지화된 접합체를 1XPBS 또는 1XPBS/1mM DTPA 중에 1:10 또는 1:20으로 희석시키고, 이어서 ITLC SG 종이 1 × 5 cm 스트립의 한쪽 단부로부터 1.5cm 떨어진 곳에 1 μL 점적시켰다. 메탄올/물(1:1 v/v) 중의 10% 아세트산암모늄을 사용하여 크로마토그래피를 상승시키면서 종이를 현상시켰다. 스트립을 건조시키고, 횡방향으로 절반으로 절단하고, 각 부분의 방사능을 감수 계수법에 의해 측정하였다. 스트립의 아랫쪽 절반 부분의 방사능(단백질과 관련된 방사능)을 전체 방사능(위쪽 절반 부분과 아랫쪽 절반 부분의 방사능값을 합한 값)에 대한 백분율로 나타내었다(데이타는 나타내지 않음).
비활성은 방사선 표지화된 접합체의 적당량의 분액의 방사능을 측정함으로써 결정하였다. 이 값을 계수 효율 (대표적으로 75%)에 대해 보정하고, 접합체의 단백질 농도(280nm에서의 흡광도에 의해 이미 결정됨)와 결부시켜서, 얻어진 값을 mCi/mg 단백질로 나타내었다.
몇몇 실험에서는, 상기한 바와 유사한 방법에 따라서(단, HPLC에 의한 정제를 하지 않음, 이것을 "믹스-앤드-슛트"("mix-and-shoot") 프로토콜이라 부름) 2B8-MX-DTPA를 인듐[111]로 방사선 표지화시켰다.
vii.이트륨-[90] 표지화된 2B8-MX-DTPA("Y2B8")의 제조
I2B8의 제조시에 기재된 것과 동일한 프로토콜에 따라서(단, 2ng HCl을 사용하지 않음) 이트륨-[90]으로 표지화된 2B8-MX-DTPA("Y2B8") 접합체를 제조하였다; 이트륨으로 표지화된 접합체를 함유한 모든 제제물은 상기한 바와 같은 크기 배제 크로마토그래피로 정제하였다.
C.인간 이외의 동물에 대한 연구
i.방사선 표지화된 2B8-MX-DTPA의 생체 분포
생후 6 내지 8주의 BALB/c 마우스에서의 조직 생체 분포에 대해 I2B8을 평가하였다. 상기 "믹스-앤드-슛트" 방법에 따라서 임상용 2B8-MX-DTPA을 사용하여 방사선 표지화된 접합체를 제조하였다. 접합체의 특이 활성은 2.3 mCi/mg이고, 접합체는 50 mg/mL의 HSA를 함유하는 pH 7.4의 PBS 중에 제제하였다. 마우스에게 100 μL(약 21 μCi ) 의 I2B8을 정맥내 주사하고, 세마리의 마우스로 구성된 군들에 대해서 0시, 24시, 48시 및 72시에 경부 탈구시켜서 희생시켰다. 희생시킨 후, 꼬리, 심장, 폐, 간, 신장, 비장, 근육 및 대퇴골을 제거하고, 세척해서, 칭량하였다; 또한, 분석을 위하여 혈액 시료도 제거하였다. 각 조직 시험편의 방사능을 감마 계수법에 의해 측정하고, 이어서 조직 단위 g 당 주입된 선량의 백분율을 측정하였다. 각 기관의 혈액에 의해 나타내어지는 활성 기여도를 공제하려는 시도는 하지 않았다.
별도의 방법에서, 4℃ 및 30℃에서 10주 동안 반응시킨 2B8-MX-DTPA의 분액들을 비활성이 2.1 mCi/mg이 되도록 인듐-[111]으로 방사선 표지화시켰다. 이어서, 이 접합체들을 상기한 바와 같이 마우스에서의 생체 분포 연구에 사용하였다.
방사선 측정을 위해, 2B8-MX-DTPA를 비활성이 2.3 mCi/mg이 되도록 인듐-[111]으로 방사선 표지화시키고, 20 마리의 BALB/c 마우스 각각에 약 1.1 μCi를 주사하였다. 이어서, 5 마리의 마우스로 구성된 군들을 1시, 24시, 48시 및 72시에서 희생시키고, 그들의 기관을 제거해서, 분석을 위해 제조하였다. 또한, 피부, 근육 및 뼈의 일부분을 제거하고, 분석을 위해 처리하였다; 뇨와 변도 수거하여, 24 - 72시의 관찰시점에서 분석하였다.
유사한 방법을 이용하여, 2B8-MX-DTPA를 이트륨-[90]으로 방사선 표지화시키고, 72시간 동안 BALB/c 마우스에서의 생체 분포를 평가하였다. HPLC 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하여, 5 마리의 마우스로 구성된 4개의 군에 대해서 임상용 접합체 약 1 μCi을 정맥내 주사하였다(비활성 12.2 mCi/mg); 이어서, 군들을 1시, 24시, 48시 및 72시에서 희생시키고, 그들의 기관 및 조직을 상기한 바와 같이 분석하였다. 각 조직 시험편의 방사능을 감마 신틸레이션 계수기를 이용하여 브렘스트라렁(bremstrahlung) 에너지를 측정함으로써 결정하였다. 이어서, 활성치를 조직 단위 g 당 주입 선량의 백분율 또는 기관 당 주입 선량의 백분율로서 나타내었다. 기관 및 다른 조직을 반복해서 세정하여 표면의 혈액을 제거하는 반면, 기관들은 관류하지 않았다. 따라서, 기관의 활성치를 내부 혈액에 의해 나타내어지는 활성 기여도에 대하여 공제하지 않았다.
ii.I2B8의 종양 위치
라모스 B 세포 종양을 갖는 무흉선 마우스에 대해 방사선 표지화된 2B8-MX-DTPA의 위치를 결정하였다. 생후 6 내지 8주의 무흉선 마우스에, 무흉선 마우스의성장에 적합하도록 미리 조절된 1.2 × 107개의 라모스 종양 세포를 갖는 RPMI-1640 0.1 mL을 피하 주사하였다(좌측 후방 옆구리). 2 주내에 종양이 생기고, 무게는 0.07 내지 1.1g 이었다. 인듐-[111]으로 표지화된 2B8-MX-DTPA(16.7 μCi) 100 μL을 정맥내 주사하고, 3 마리의 마우스로 구성된 군들을 0시, 24시, 48시 및 72시에서 경부 탈구시켜서 희생시켰다. 희생시킨 후, 꼬리, 심장, 폐, 간, 신장, 비장, 근육, 대퇴골 및 종양을 제거하고, 세척하고, 칭량하였다; 또한, 혈액 시료도 분석을 위하여 제거하였다. 각 시험편의 방사능을 감마 계수법에 의해 측정하고, 조직 단위 g 당 주입 선량의 백분율을 측정하였다.
iii.방사선 표지화된 2B8-MX-DTPA를 이용한 생체 분포 및 종양 위치 연구
상기(실시예 I.B.Viii.a.) 기재된 예비 생체 분포 실험에 따라서, 접합 2B8을 비활성이 2.3 mCi/mg이 되도록 인듐-[111]으로 방사선 표지화시키고, 20 마리의 BALB/c 마우스 각각에 대해 약 1.1 μCi을 주사하여 방사선 표지화된 물질의 생체 분포를 측정하였다. 이어서, 5 마리의 마우스로 구성된 군들을 각각 1시, 24시, 48시 및 72시에서 희생시키고, 그들의 기관 및 피부, 근육 및 뼈의 일부를 제거하고, 분석을 위하여 처리하였다. 또한, 뇨 및 변도 수거하고, 24 - 72시의 관찰 시점에서 분석하였다. 혈액 중의 방사능 수준은 단위 g 당 주입 선량의 40.3%(1시)에서 18.9%(72시)로 떨어졌다(데이타는 나타내지 않음). 심장, 신장, 근육 및 비장에 대한 값들은 실험 전반에 걸쳐서 0.7-9.8% 범위로 유지되었다. 폐에서 관찰된 방사능 수준은 14.2%(1시)에서 7.6%(72시)로 감소하였다; 마찬가지로, 각 시점에서 간의단위 g당 주입 선량치는 10.3% 및 9.9% 이었다. 이 데이타를 사용하여, 하기 I2B8에 대한 흡수된 조사 선량치를 결정하였다.
비활성 12.2 mCi/mg 항체를 갖는 이트륨-[90]으로 표지화된 접합체의 생체 분포를 BALB/c 마우스에서 평가하였다. 90% 이상의 방사선 혼입도가 얻어지고, 방사선 표지화된 항체를 HPLC로 정제하였다. 주요 기관, 및 피부, 근육, 뼈, 뇨 및 변에 대해서 72 시간에 걸쳐 조직에 침착된 방사능을 평가하고, 조직 단위 g당 주입된 선량의 백분율로 나타내었다. 그 결과(명시하지 않음), 혈액의 방사능 수준이 단위 g 당 주입 선량 약 39.2%(1시)에서 약 15.4%(72시)로 강하된 반면, 꼬리, 심장, 신장, 근육 및 비장의 방사능 수준은 실험 전반에 걸쳐 10.2% 이하로 꽤 일정하게 유지되었다. 중요한 것은, 뼈의 방사능의 범위는 단위 g당 주입 선량 4.4%(1시) 내지 3.2%(72시)이었다. 종합해 볼 때, 이 결과들은 접합체들은 유리 이트륨을 거의 함유하지 않고, 연구하는 동안 유리 방사성 금속들이 거의 방출되지 않았다는 것을 알 수 있다. 이 데이타를 사용하여, 하기하는 Y2B8에 대해 흡수된 조사 선량치를 결정하였다.
종양 위치 연구를 위하여, 2B8-MX-DTPA를 제조하고 비활성이 2.7 mCi/mg이 되도록 인듐-[III]으로 방사선 표지화시켰다. 이어서, 표지화된 접합체 100 μL(약 24 μCi)를 라모스 B 세포 종양을 갖는 12마리의 무흉선 마우스 각각에 주입하였다. 종양의 무게는 0.1 내지 1.0 g이었다. 주입 후 0시, 24시, 48시 및 72시에서 혈액 50 μL를 레트로-오비탈(retro-orbital) 천공법에 의해 제거하고, 경부 탈구시켜 마우스들을 희생시키고, 꼬리, 심장, 폐, 간, 신장, 비장, 근육, 대퇴골 및종양을 제거하였다. 조직을 처리해서 칭량한 후, 각 조직 시험편의 방사능을 감마 계수법을 이용하여 측정하고, 그 값을 단위 g당 주입 선량의 백분율로 나타내었다.
이 결과(명시하지 않음),IIIIn-2B8-MX-DTPA의 종양 농도는 실험 과정 동안 끊임없이 증가하였다. 72시 후, 종양에는 주입 선량의 13 %가 축적되었다. 이와 반대로, 혈액 수준은 실험 과정 동안 30 %(0시)에서 13 %(72시)로 강하하였다. 모든 다른 조직들(근육 제외)은 실험 종결시 조직 단위 g당 주입 선량의 1.3 % 내지 6.0%를 함유하였다; 근육 조직은 단위 g당 주입 선량의 약 13 %를 함유하였다.
D.인간에 관한 연구
i. 2B8 및 2B9-MX-DTPA; 인체 조직에 관한 면역 조직학 연구
아세톤으로 고정시킨 32개의 서로 다른 인체 조직 그룹을 이용하여 쥐 단일클론 항체 28B의 조직 반응성을 평가하였다. 항체 2B8은 항-CD20 항원과 반응한다. 항 -CD20은 매우 제한적인 조직 분포 패턴을 가져서, 조혈 기원의 세포들을 포함한 임파 조직의 세포 집단에서만 관찰된다.
임파절에 있어서, 배 중심에서의 성숙 피질 B-임파구 및 증식 세포의 집단에 대해 면역 반응성이 관찰되었다. 또한, 말초 혈액, 편도선의 B세포 영역, 비장의 백색 수에서는 양성 반응성이 관찰되고, 흉선에서는 수질 임파구의 40 내지 70%가 발견되었다. 또한 양성 반응성은 대장의 고유층(파이어판)의 소포에서도 관찰되었다. 마지막으로, 방광, 유방, 경관, 식도, 폐, 이하선, 소장 및 위를 포함한 여러 기관의 지질 중의 응집 또는 산재 임파구들도 항체 2B8에 대해 양성이었다(데이타는 나타내지 않음)
모든 단순 상피 세포, 및 상이한 기관의 중층 상피는 반응성이 없는 것으로 발견되었다. 마찬가지로, 뇌, 척수 및 말초 신경의 신경외배엽 세포들을 포함한 신경외 배엽 세포에서도 반응성이 없는 것으로 관찰되었다. 또한, 골격근, 평활근, 섬유아세포, 상피세포 및 다형핵 염증 세포와 같은 간충조직 성분에서도 음성으로 나타났다(데이타는 명시하지 않음).
2B8-MX-DTPA 접합체의 조직 반응성은 아세톤으로 고정시킨 16개의 인체 조직군을 이용하여 평가하였다. 상기에서 음성 항체를 이용하여 입증한 바와 같이(데이타는 명시하지 않음), 2B8-MX-DTPA 접합체는 매우 제한적인 분포 패턴을 나타내어 임파 기원 세포군에서만 발견되는 CD20 항원을 인식하였다. 임파절에 있어서, 면역 반응성은 B 세포 집단에서 관찰되었다. 비장의 백색수 및 흉선의 간충조직 임파구에서는 강한 반응성이 관찰되었다. 또한, 방광, 심장, 대장, 간, 폐 및 자궁에 산재된 임파구에서도 면역 반응성이 관찰되었으며, 이 면역 반응성은 이들 조직에 염증 세포가 존재하기 때문에 나타난 것이다. 음성 항체의 경우와 마찬가지로, 신경 외배엽 세포 및 간충조직 성분과는 반응성이 없는 것으로 관찰되었다(데이타는 명시 하지 않음).
ii.I2B8(조영) 및 Y2B8(치료)의 임상 분석
a. 페이즈 I/II 임상 시험 단일 투여 치료 연구
현재, Y2B8의 단일 치료 투여로 처리한 후 I2B8의 단계 I/II 임상 분석을 수행하고 있다. 단일 투여 연구의 경우에는 다음 절차를 따른다;
1. 퍼지를 이용한 말초 간세포(PSC) 또는 골수(BM)의 수거
2. I2B8(조영)
3. Y2B8 치료(3회 투여량 수준);
4. PSC 또는 자가 BM 이식(필요한 경우, 연속 3일 동안 절대 호중구는 500/mm3이하이고 혈소판은 20,000/mm3이하이며, 골수 검사에서 골수 회수의 증거는 발견되지 않음)
Y2B8의 투여 수준은 다음과 같다:
최대 허용량("MTD")을 측정하기 위해 각 투여 수준에서 세명의 환자를 처치하였다.
조영(방사선 측정) 연구는 다음과 같이 수행하였다; 각 환자들은 I2B8을 사용한 2회의 생체내 생체 분포 연구에 이용하였다. 첫번째 연구에서, I2B8 2 mg(5mCi)을 1시간 동안 정맥내 주입에 의해 투여하고; 1주 후, 2B8(즉, 비접합 항체)을 250 mg/시를 초과하지 않는 양으로 정맥내 투여한 후, 1시간 동안 I2B8 2 mg(5mCi)을 정맥내 투여하였다. 양 연구에서, I2B8 주입 직후에, 각 환자를 조영하고, t = 14-18시(표시된 경우), t=24시, t=72시 및 t=96시(표시된 경우)에서 조영을 반복하였다. 인듐-[III] 표지에 대해 전신 평균 체류 시간을 측정하였다; 또한 이러한 측정은 인식 가능한 기관 또는 종양 병변("관심 병역")에 대해서도 수행하였다.
관심 영역을 표지의 전신 농도와 비교하였다; 이 비교를 기초로 하여, Y2B8의 위치 및 농도의 이론치를 표준 방법을 이용하여 결정할 수 있다. Y2B8의 이론 누적량이 전신 투여량 이론치의 8배보다도 더 크거나, 또는 간의 이론 누적량이 1500 cGy를 초과하면, Y2B8로 처리하지 않아야 한다.
조영 연구가 허용되면, 환자 체중 단위 kg 당 0.0 또는 1.0 mg의 2B8을 250mg/시를 초과하지 않는 속도로 정맥내 주입에 의해 투여한다. 이 후에, Y2B8 10, 20 또는 40 mCi을 20 mCi/시의 주입 속도로 정맥내 주입에 의해 투여한다.
b.단계 I/II 임상 시험; 다회 투여 치료 연구
Y2B8의 단계 I/II 임상 분석을 수행한다. 다회 투여 연구의 경우, 다음과 같은 절차에 따라서 수행한다.
1. PSC 또는 BM 수거
2. I2B8 조영
3. 4회 투여, 또는 80 mCi의 총 누적 투여량에 대해 Y2B8 치료 (3개의 투여 수준)
4. PSC 또는 자가 BM 이식(개업의의 결정을 토대로 함)
Y2B8의 투여 수준은 다음과 같다:
MTD를 결정하기 위하여 각 투여 수준으로 3명의 환자를 치료하여야 한다.
조영(방사선 측정) 연구는 다음과 같이 수행한다: 비표지화된 항체(즉, 2B8)의 바람직한 조영 투여량은 처음 두 환자를 이용하여 결정한다. 처음 두 환자에게 정상 염수 250 cc 중의 비표지화된 2B8 100 mg을 4시간 동안 투여한 후, I2B8 0.5 mCi을 투여하고, t=0, t=10분, t=120분, t=24시, 및 t=48시에서의 생체 분포 데이타를 위하여 혈액을 채취한다. t=2시, t=24시 및 t=48시에서 다수의 영역 감마 카메라 조영으로 스캐닝한다. t=48시에서 스캐닝한 후, 환자에게 상기한 바와 같이 250 mg의 2B8을 투여한 후, 4.5 mCi의 I2B8을 투여하고, 상기한 바와 같이 채혈 및 스캐닝을 수행한다. 100 mg의 2B8이 우수한 조영을 발생시키는 경우, 이어서 다음 두명의 환자에게 상기한 바와 같은 50 mg의 2B8을 투여하고, 이어서 0.5 mCi의 I2B8을 투여하고, 48시간 후에 100 mg의 2B8을 투여한 후, 4.5 mCi의 I2B8을 투여한다. 250 mg의 2B8이 우수한 조영을 발생시키는 경우, 이어서 다음 두 명의 환자에게 상기한 바와 같은 250 mg의 2B8을 투여하고, 이어서 0.5 mCi의 I2B8을 투여하고, 48시간 후에 500 mg의 2B8을 투여한 후 4.5 mCi의 I2B8을 투여한다. 그다음 환자들은 최적 조영을 제공하는 최저량의 2B8로 처리한다. 최적 조영은 (1) 항체가가장 느린 속도로 소멸하는 경우의 최상의 유효 조영; (2) 단일 기관에서 구획화를 최소화하는 최상의 분포; 및 (3) 병변에 대한 최상의 주관적인 해상도(종양/배경 비교).
처음 네명의 환자의 경우, I2B8을 마지막으로 투여한 후 14일 경과시에 Y2B8을 최초로 투여하고, 그 다음 환자들에 대해서는 I2B8 투여 후 2 내지 7일 경과시에 Y2B8을 최초로 투여한다.
Y2B8로 처리하기 전에, 처음 네명 이외의 환자에게는 2B8을 상기한 바와 같이 투여한 후, 5-10분 동안 Y2B8을 정맥내 주입에 의해 투여한다. t=0, t=10분, t=120분, t=24시 및 t=48시에서 생체 분포 분석을 위한 혈액을 채취한다. 4회 투여 또는 80 mCi의 총 누적 투여량에 대해서 거의 6 내지 8주마다 Y2B8을 반복 투여한다(처음 투여량과 동일 투여량). 환자들의 WBC가 3,000이거나 그보다 크고, AGC가 100,000이거나 그보다 커질 때까지 Y2B8을 환자에게 투여하지 않는 것이 가장 바람직하다.
3개의 투여 수준 연구를 종결한 후, MTD를 정한다. 이어서, 추가의 환자들을 등록하고, 이들에게 MTD를 투여한다.
II. 키메릭 항-CD20 항체 생산("C2B8")
A.키메릭 항-CD20 면역글로불린 DNA 발현 벡터의 제작
2B8 마우스 하이브리도마 세포 [Chomczynki, P. et al., "Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction"Anal. Biochem.162:156-159(1987)에 기재됨]로부터 RNA를 단리시키고, 그로부터 cDNA를 제조하였다. 5' 말단의 마우스 경사슬 시그날 서열 및 3' 말단의 마우스 경사슬 J 영역과 상동인 DNA 프라이머 세트를 이용하여 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 cDNA로부터 마우스 면역글로불린 경사슬 가변 영역 DNA를 단리시켰다. 프라이머의 서열은 다음과 같다:
1. VL센스 (SEQ. ID. NO 3)
(밑줄 친 부분은 Bg1 II 부위이고, 윗줄 친 부분은 출발 코돈이다.)
2. VL안티센스 (SEQ. ID. NO 4)
(밑줄 친 부분은 Bsi WI 부위이다.)
참조: 제1도 및 2도 (TCAE 8 중의 대응하는 Bg1 II 및 Bsi WI 부위를 나타냄) 및 제3도 (TCAE 8 중의 항-CD20의 대응 부위를 나타냄)
이와 같이 하여 얻어진 DNA 단편을 직접 TCAE 8 벡터에 인간 카파 경사슬 불변 도메인 앞에 클로닝시켜서, 서열화하였다. 쥐의 가변 영역 경사슬에 대해 결정된 DNA 서열을 제4도에 나타낸다(SEQ. ID. NO. 5); 참조: 제3도의 뉴클레오티드 978 내지 1362. 또한, 제4도는 쥐의 가변 영역, CDR 및 구조 영역으로부터의 아미노산 서열을 제공한다. 2B8로부터의 마우스 경사슬 가변 영역은 마우스 카파 VI족에 속한다(참조: 상기 Kabat 문헌).
마찬가지로, 마우스 중사슬 가변 영역을 단리시키고, 인간 IgGl 정상 도메인 앞에 클로닝시켰다. 프라이머는 다음과 같다:
1. VH센스 (SEQ. ID. NO. 6)
(밑출 친 부분은 Nlu I 부위이다.)
2. VH안티센스 (SEQ. ID. NO. 7)
(밑출 친 부분은 Nhe I 부위이다.)
참조: 제1도 및 2도 (TCAE 8 중의 대응하는 Mlu I 및 Nhe I 부위를 나타냄) 및 제3도 (TCAE 8 중의 항-CD20의 대응 부위를 나타냄)
이 마우스 중사슬의 서열은 제5도(SEQ. ID. NO. 8)에 나타낸다(참조: 제3도의 뉴클레오티드 2401 내지 2820). 또한, 제5도는 쥐의 가변 영역, CDR 및 구조 영역으로부터의 아미노산 서열을 제공한다. 2B8로부터의 마우스 중사슬 가변 영역은 마우스 VH 2B족에 속한다(참조: 상기 Kabat문헌).
D.키메릭 항-CD20을 생산하는 CHO 및 SP2/0 트랜스펙토마의 생산
차이니스 햄스터 난소("CHO") 세포 DG44를 SSFM II 결핍 히포크산틴 및 티미딘 배지(Gibco, Grand Island, NY, Form No. 91-0456PK) 중에서 성장시키고; SP2/0 마우스 골수종 세포는 5% 태아 소 혈청 및 20 ml/L 글루타민이 첨가된 둘베코 변형이글스 배지("DMEM")(Irvine Scientific, Santa Ana, Ca., Cat. No. 9024)에서 성장시켰다. 0.4 ml들이 일회용 쿠베트 중에서 BTX 600 전기천공 시스템(BTX, San Diego, CA)을 이용하여 Not I로 절단한 25 ㎍ CHO 또는 50 ㎍ SP2/0 플라스미드 DNA를 이용하여 4백만개의 세포들을 전기천공시켰다. 조건은 210 볼트(CHO의 경우) 또는 180 볼트(SP2/0의 경우), 및 400 마이크로패러데이 및 13 ohm이다. 각각의 전기 천공물을 96개의 웰이 있는 디쉬 6개에 약 7000 세포/웰의 양으로 플레이팅시켰다. G418(GENETICIN, Gibco, Cat. No. 860-1811)을 400 ㎍/ml (활성 화합물)(CHO의 경우, 50 μM 히포크산틴 및 8 μM 티미딘을 더 함유함) 또는 800 ㎍/ml (SP2/0의 경우) 함유하는 배지를 디쉬에 공급하고, 2일 후에 전기 천공시키고, 그 후 2 또는 3일 후에 집락이 생성되었다. 집락으로부터 취한 상징액을 인간 항체 특이성 ELISA를 이용하여 키메릭 면역글로불린 존재 여부에 대해 분석하였다. 가장 많은 양의 면역 글로불린을 생성하는 집락을 확전시켜서, 배지 및 메토트렉세이트(SP2/0의 경우: 25 nM, CHO의 경우 5 nM)를 함유하는 96개의 웰이 있는 판에 플레이팅시키고, 2 또는 3일마다 공급하였다. 상징액을 상기한 바와 같이 분석하고, 가장 많은 양의 면역글로불린을 생산하는 집락을 검사하였다. 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 이용하여 상징액으로부터 키메릭 항-CD20 항체를 정제하였다.
정제된 키메릭 항-CD20을 폴리아크릴아미드 겔 중에서 전기 영동시켜서 분석한 결과, 순도가 약 95% 이상이었다. 키메릭 항체의 친화성 및 특이성은 2B8을 기준으로 하여 측정하였다. 직접 및 경쟁 결합 분석으로 시험된 키메릭 항-CD20 항체를 쥐의 항-CD20 단일클론 항체 2B8과 비교해 볼 때, 많은 CD20 양성 B 세포주에대해서 필적하는 친화성 및 특이성이 입증되었다(데이타는 명시하지 않음). 키메릭 항체의 겉보기 친화성 상수("Kap")는 I125로 방사선 표지화된 키메릭 항-CD20의 직접 결합에 의해 측정하고, 스캐챠드 플롯(Scatchard plot)에 의해 방사선 표지화된 2B8과 비교하였다; CHO에 의해 생산된 키메릭 항-CD20의 Kap 이론치는 5.2 x 10-9M이고, SP2/0에 의해 생산된 항체의 Kap 이론치는 7.4 x 10-9M이었다. 2B8의 Kap 이론치는 3.5x10-9이다. 방사선 면역 분석법에 의한 직접 경쟁법을 이용하여 2B8과 효과적으로 경쟁할 수 있는 그의 능력을 비교함으로써 키메릭 항체의 특이성 및 면역반응성을 확인하였다. B 세포에서 CD20 항원과의 결합을 50% 억제하는데는 키메릭 항-CD20 및 2B8 항체가 실질적으로 동일한 양이 필요하였다. 즉, 아마도 키메리제이션(chimerization) 때문에 항-CD20 항체의 억제 활성 손실을 최소한으로 일어났다.
실험 II.B의 결과로부터, 무엇보다도, TCAE 8 벡터를 이용하여 CHO 및 SP2/0 트랜스펙토마로부터 키메릭 항-CD20 항체가 생산되고, 이 키메릭 항체들은 쥐의 항-CD20 단일클론 항체 2B8과 실질적으로 동일한 특이성 및 결합 능력을 가진다는 것을 알 수 있다.
C.키메릭 항-CD20 항체의 면역학적 활성 측정
i.인간 Clq 분석
형광 표지화된 Clq를 이용하여 유동 세포 계측법으로 인간 Clq 결합에 대해서 CHO 및 SP2/0 세포주에 의해 생산된 키메릭 항-CD20 항체를 평가하였다.(Clq는 Quidel, Mira Mesa, CA, Prod. No. A400으로부터 입수하고, FITC 표지는 Sigma, St. Louis, MO, Prod. No. F-7250으로부터 입수하고, Clq의 FITC 표지화는 문헌[Selected Methods In Cellular Immunology, Michell & Shiigi, Ed. (W.H. Freeman & CO., San Francisco, CA, 1980, p.292]에 기재된 방법을 이용하여 수행하였다.) 분석 결과는 Becton Dickinson FACSanTM유동 세포 계측기(형광 분석 범위는 515-545nm임)를 이용하여 얻었다. 동일량의 키메릭 항-CD20 항체, 인간 IgG1, K 골수종 단백질(Binding Site, San Diego, Ca, Prod. No. BP078) 및 2B8을 동일 갯수의 CD20 양성 SB 세포와 함께 인큐베이션시키고, 이어서 FACS 완충액(PBS 중의 0.2% BSA, pH 7.4, 0.02% 아지드화나트륨)으로 세척시켜서 비부착 항체를 제거하고, 이어서 FITC 표지화된 Clq와 함께 반응시켰다. 30-60분 후, 다시 세포들을 세척하였다. 제조업체의 지시에 따라서 FACScanTM을 이용하여 FITC로 표지화된 Clq를 포함하여 세 조건을 분석하였다. 그 결과를 제6도에 나타내었다.
제6도에 나타낸 결과로부터, 키메릭 항-CD20 항체 조건의 경우에만 형광이 유의하게 증가한다는 것이 관찰되었다. 즉, 키메릭 항-CD20 항체가 부착된 SB 세포만이 Clq 양성인 반면, 다른 조건들은 대조군과 동일한 패턴을 나타냈다.
ii.보체 의존성 세포 용혈
키메릭 항-CD20 항체를 그들이 인간 혈청(보체 공급원) 존재 하에서 임파종 세포주를 용혈시킬 수 있는 능력을 갖는지에 대해 분석하였다. 37℃에서 1시간 동안 100 μCi의51Cr을 1x106개의 SB 세포와 혼합시킴으로써51Cr로 CD20 양성 SB 세포를 표지화시켰다; 이어서, 표지화된 SB 세포를 동일량의 인간 보체 및 동일량(0-50 ㎍/ml)의 키메릭 항-CD20 항체 또는 2B8 존재하에서 37℃에서 4시간 동안 반응시켰다[참조: Brunner, K.T., et al, "Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on51Cr-labelled allogeneic target cells in vitro."Immunology 14:181-189(1968)]. 결과를 제7도에 나타내었다.
제7도의 결과로부터, 무엇보다도, 키메릭 항-CD20 항체가 이들 조건 하에서 유의하게 용혈도(49%)을 갖는다는 것을 알 수 있다.
iii.항체 의존성 세포의 세포독성 이펙터 분석
이 연구를 위하여, CD20 양성 세포(SB) 및 CD20 음성 세포(T 세포 백혈병 세포주 HSB; Adams, Richard, "Formal Discussion"Can Res. 27:2479-2482(1967); ATCC 수탁번호 ATCC CCL 120.1)를 이용하였다; 양자 모두51Cr로 표지화시켰다. 분석은 문헌 [Brunner, K.T. et al, "Quantative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on51Cr-labelled allogeneic target cellsin vitro;inhibition by isoantibody and drugs",Immunology 14:181-189(1968)]에 기재된 방법에 따라서 수행하였다; 37℃에서 4시간 인큐베이션시켰을때 CD20 양성 SB 타겟 세포(51Cr로 표지됨)의 키메릭 항-CD20 항체 의존성 세포에 의해 매개되는 실질적인 용혈이 관찰되었으며, 이 효과는 CHO 및 SP2/0에 의해 생산된 항체 모두에 대해서관찰되었다(이펙터 세포는 인간 말초 임파구이고, 이펙터 세포:타겟 세포 비율은 100:1이다). 타겟 세포의 효율적인 용혈은 3.9 ㎍/ml에서 얻어졌다. 이와 반대로, 동일 조건 하에서, 쥐의 항-CD20 단일클론 항체 2B8은 통계적으로 의미가 없는 효과를 나타냈고, CD20 음성 HSB 세포는 용혈되지 않았다. 그 결과를 제8도에 나타내었다.
실시예 II의 결과로부터, 무엇보다도, 실시예 I의 키메릭 항-CD20 항체가 면역학적으로 활성이 있다는 것을 알 수 있다.
III. 키메릭 항-CD20을 이용한 생체내에서의 B 세포 고갈
A.인간 이외의 영장류에 대한 연구
인간 이외의 3 종의 영장류에 대해 연구를 행하였다. 편의상, 이들을 "키메릭 항-CD20: CHO & SP2/0", "키메릭 항-CD20: CHO" 및 "고투여량(High Dosage) 키메릭 항-CD20"이라 부른다. 조건들은 다음과 같다.
키메릭 항-CD20: CHO & SP2/0
체중 4.5 내지 7kg의 시노몰로거스(cynomologus) 원숭이(White Sands Research Center, Alamogordo, NM) 6 마리를 각각 2 마리씩 3개의 군으로 나누었다. 각 군의 동물에게 동일량의 면역학적으로 활성인 키메릭 항-CD20 항체를 투여하였다. 각 군의 동물 중 한마리에는 CHO 트랜스펙토마에 의해 생산된 정제된 항체를 투여하고; 다른 한마리에는 SP2/0 트랜스펙토마에 의해 생산된 항체를 투여하였다. 세개의 군에 연속해서 4일 동안 매일 0.1 mg/kg, 0.4 mg/kg 및 1.6 mg/kg에 대응하는 투여량의 항체를 투여하였다. 키메릭 면역학적으로 활성인 항-CD20 항체를멸균 염수와 혼합시켜서 이것을 정맥내 각 주입에 의해 투여하였다; 각각의 주입 전에 혈액 시료를 채취하였다. 마지막 주입(T=0) 후 24시간 경과시에 추가의 혈액을 채취하기 시작하여, 1일, 3일, 7일, 14일 및 28일째에 추가의 혈액을 채취하였다; 또한, 제90일째에 연구를 종결할 때까지 2주 간격으로 혈액 시료를 채취하였다.
각 동물로부터 채취한 전혈 약 5ml를 2000 RPM으로 5분 동안 원심분리시켰다. 가용성 키메릭 항-CD20 항체 수준을 분석하기 위하여 혈장을 제거하였다. 펠렛(말초 혈액 백혈구 및 적혈구를 함유함)는 형광으로 표지화된 항체 분석을 위하여 태아 소 혈청 중에 재현탁시켰다. [참조: "Florescent Antibody Labeling of Lymphoid Cell Population"].
키메릭 항-CD20:CHO
체중 4 내지 6 kg의 시노몰거스 원숭이(White Sands) 6 마리를 각각 2 마리씩 3개의 군으로 나누었다. 멸균 염수 중에서 CHO 트랜스펙토마에 의해 생산된 면역학적으로 활성인 키메릭 항-CD20 항체를 모든 동물에게 투여하였다. 세개의 군은 다음과 같이 나누었다: 그룹 1은 4일 동안 매일 0.01mg/kg의 항체를 정맥내 주입에 의해 투여하고; 그룹 2는 4일 동안 매일 0.4mg/kg의 항체를 정맥내 주입에 의해 투여하고; 그룹 3은 6.4mg/kg의 항체를 1회 정맥내 주입에 의해 투여하였다. 세개의 그룹 모두에 있어서, 처리 개시 전에 혈액 시료를 얻었다; 추가로, 마지막으로 주입한 후, T=0일, 1일, 3일, 7일, 14일 및 28일에서 혈액 시료를 상기한 바와 같이 채취하고, 이 시료들을 형광으로 표지화된 항체 분석을 위하여 처리하였다.[참조:하기 "Fluorescent Antibody Labeling"]. 말초 혈액 B 세포 정량 분석 이외에, 마지막으로 주입한 후 7일, 14일 및 28일이 되는 날에 임파절을 생검하고, 유동 세포 계측법으로 임파구 집단을 정량 분석하기 위하여 단일 세포 제제를 염색했다.
고투여량 키메릭 항-CD20
두 마리의 시노몰거스 원숭이(White Sands)에게 연속해서 4주 동안 매주 CHO 트랜스펙토마(멸균 염수 중)로부터 생산된 면역학적으로 활성인 키메릭 항-CD20 항체 16.8mg/kg을 주입시켰다. 처리 종결시, 두 마리의 동물 모두를 골수 제거를 위하여 마취시켰다; 또한 임파절을 생검하였다. 두 세트의 조직을 문헌 [Ling, N.R. et al., "B-cell and plasma cell antigens"Leucocyte Typing III White Cell Differentiations Antigens,A.J. McMichael, Ed. (Oxford University Press, Oxford UK, 1987, p, 302]에 기재된 방법에 따라서 유동 세포 계측법에 의해 B 임파구의 존재 여부를 평가하기 위해 Leu 16을 이용하여 염색했다.
임파구 집단의 형광 항체 표지화
혈장을 제거한 후, 백혈구를 행크스 밸런스트 솔트 용액 (Hanks Balanced Salt Solution("HBSS"))으로 2회 세척하고, 혈장과 동일 부피의 태아 소 혈청(56℃에서 30분동안 가열하여 불활성화시킴) 중에 재현탁시켰다. 세포 제제물 0.1 ml 부피를 15 ml들이 원추형 원심분리관 6개 각각에 분배하였다. 인간 임파구 표면 마커 CD2(AMAC, Westbrook, ME). CD20 (Becton Dickinson) 및 인간 IgM (Binding Site, San Diego, CA)에 대해 특이성을 가지며 형광으로 표지화된 단일클론 항체들을 T 및 B 임파구 집단 확인을 위하여 3개의 관에 첨가하였다. 모든 시약은 대응하는 원숭이 임파구 항원에 대해 양성인 것으로 이미 시험되었다. 원숭이 B 세포 표면 CD20에 결합된 키메릭 항-CD20 항체를 조홍소(AMAC)로 커플링시킨 다클론 염소 항-인간 IgG를 사용하여 네번째 관에서 측정하였다. 이 시약은 원숭이 Ig와의 교차 반응을 방지하기 위하여 Ig-세파로스 컬럼에서 미러 흡착시켰으므로, 세포들과 결합된 키메릭 항-CD20 항체의 특이성 검출 및 정량 분석이 가능하다. 다섯번째 관에는 이중으로 염색된 B 세포 집단을 위해 항-IgM 및 항-인간 IgG 시약을 포함시켰다. 여섯번째 시료는 자기 형광 측정을 위하여 아무런 시약도 함유시키지 않았다. 세포들을 형광 항체와 함께 30분 동안 반응시키고, 세척하고, 고정 완충액(0.15M NaCl, 1% 파라포름알데하이드, pH 7.4) 0.5 ml로 고정시키고, Becton Dickinson FACScanTM장치로 분석하였다. 처음에는, 비표지화된 임파구를 이용한 도트-플롯 비트 맵(bitmap)에서 포워드 버서스 라입 앵글 광 산란(forward versus right angle light scatter)에 의해 임파구 집단을 확인하였다. 이어서, 전체 임파구 집단은 모든 다른 이벤트(event)를 제거함으로써 단리시켰다. 후속한 형광 측정은 제거된 임파구 특이성 이벤트만을 반영하였다.
말초 혈액 B 임파구의 제거
CHO 트랜스펙토마부터 유래된 키메릭 항-CD20 항체를 1.6 mg/kg 및 6.4 mg/kg의 투여 수준으로 주입한 원숭이의 경우와 SP2/0에 의해 생산된 항체를 0.4mg/kg의 투여 수준으로 주입한 원숭이의 경우에는 7일째 개시한 B세포 회수에서 약간 증가하는 것이 관찰되긴 하였지만, 생체 내에서 B 세포 고갈시 CHO와 SP2/0에의해 생산된 항체의 효능 사이에는 관찰할 수 있을 정도의 차이점을 전혀 확인할 수 없었다. 제9A도, B도 및 C도는 키메릭 항-CD20:CHO & SP2/0으로부터 유래된 결과를 제공하는데, 9A도는 0.4 mg/kg의 투여 수준에 관한 것이고, 9B도는 1.6mg/kg의 투여 수준에 관한 것이고, 9C도는 6.4mg/kg의 투여 수준에 관한 것이다.
제9도로부터 알 수 있는 바와 같이, 모든 시험 투여 범위에서 치료 처리 후 말초 B 세포 수준이 극적으로(95% 이상) 감소하였고, 이 수준은 주입 후 7일째까지 유지되었으며, 이 기간 후, B 세포를 회수하기 시작하고, 회수 개시 시간은 투여 수준과는 상관없다.
키메릭 항-CD20:CHO 연구에서는, 4일 동안 매일 10배나 적은 항체 투여 농도(0.01mg/kg)로 투여하였다(총 0.04 mg/kg). 제10도는 이 연구의 결과를 제공한다. 이 투여량은 말초 혈액 B 세포 집단을 항-표면 IgM 또는 Leu 16 항체로 평가된 정상 수준의 약 50%로 고갈시켰다. 이 결과로부터, B 임파구 집단에 대한 CD20 항원의 포화는 사람 이외의 영장류의 경우에는 이 기간 동안 이 투여 농도의 면역학적으로 활성인 키메릭 항-CD20 항체로는 달성되지 않았다는 것을 알 수 있으며, 항체로 코팅된 B 임파구는 치료 처리 후 처음 3일 동안에 혈액 시료에서 검출되었다. 그러나, 7일째에는, 항체로 코팅된 세포는 검출되지 않았다.
표 1은 말초 혈액 집단에 면역학적으로 활성인 키메릭 항-CD20 항체를 단일 및 다회 투여한 결과를 요약해서 나타낸 것이다; 단일 투여 조건은 6.4 mg/kg이고, 다회 투여 조건은 연속해서 4일 동안 0.4mg/kg이었다(이 결과들은 상기한 원숭이로부터 유래된 것이다).
표 I
표 1의 데이타로부터, 항체 과량 조건 하에서는 말초 혈액 중의 B세포 고갈이 단일 또는 다회 투여 수준과는 상관없이 신속하고 효과적으로 일어난다는 것을 알 수 있다. 또한, 마지막으로 투여한 후 적어도 7일 동안은 고갈이 관찰되고, 일부 B세포 회수는 21일째까지 관찰되었다.
표 II는 표 I의 처리 방식(4일 동안 매일 0.4 mg/kg 투여; 1회 투여 6.4mg/kg)을 이용하여 임파절의 세포 집단에 대한 면역학적으로 활성인 키메릭 항-CD20 항체의 효과를 요약하여 나타낸다; 또한, 정상 임파절(대조 원숭이, 겨드랑이 및 서혜부) 및 정상 골수(두마리의 원숭이)에 대한 비교치도 제공하였다.
표 II
표 II의 결과로부터, 두 처리 방식 모두에 있어서 B 임파구가 효과적으로 제거되었다는 것을 알 수 있다. 또한, 표 II로부터, 사람 이외의 영장류의 경우, 면역학적으로 활성인 키메릭 항-CD20 항체를 이용한 임파 조직에서의 B 세포의 완전포화는 달성되지 않았다는 것을 알 수 있다; 이밖에, 항체로 코팅된 세포들은 처리 후 7일째에 관찰되었으며, 14일째에 임파절 B 세포의 현저한 고갈이 관찰되었다.
이 데이타를 기초로 하여, 상기 고투여량 키메릭 항-CD20 연구를 주로 약리학/독성의 결정법으로 수행하였다. 즉, 이 연구는 키메릭 항체 투여와 관련된 모든 독성 뿐만 아니라 말초 혈액 임파절 및 골수로부터 B 세포 고갈 효능을 평가하기 위하여 수행하였다. 이밖에, 표 II의 데이타로부터 이 연구의 경우 임파절 B 세포의 대부분이 처리 후 7일째와 14일째 사이에서 고갈되었기 때문에, 매주 투여하는 방식이 더 효과적인 결과를 나타낸다는 것을 알 수 있다. 표 III은 고투여량 키메릭 항-CD20 연구의 결과를 요약해서 나타낸다.
표 III
a: Leu 16으로 염색된 집단.
b: 이중 염색 집단, 표면 IgM 세포 및 키메릭 항체로 코팅된 세포에 대해 양성임.
c: 이중 염색 표면 IgM 양성 세포 및 단일 염색(표면 IgM 음성) 세포를 포함하는 키메릭 항체를 위한 총 집단 염색.
d: 최종 16.8mg/kg 투여량 주입 후 경과 일수
처리 중지 후 22일째에 평가했을 때, 두 동물은 모두 5% 미만의 B세포를 함유하는 반면, 대조 임파절은 40% 함유하였다[참조: 상기 표 II]. 마찬가지로, 키메릭 항-CD20 항체로 처리된 동물의 골수에서는 CD20 양성 세포의 수준이 3% 미만인 반면, 정상 동물에서는 11-15%이었다[참조: 상기 표 II]. 처리 중지 후 36일째에 동물들을 평가했을 때, 동물 중 한마리(H)는 임파절에 약 12%의 B 세포 및 골수에 4.4%의 B 세포를 가지는 반면, 나머지 한마리(G)는 임파절에 약 5%의 B 세포 및 골수에 0.8%의 B 세포를 가졌다. 이 데이타는 B 세포 고갈이 유의적이라는 것을 나타낸다.
실시예 III.A의 결과로부터, 무엇보다도, 면역학적으로 활성인 키메릭 항-CD20의 투여량이 적으면 영장류에서 장기간 말초 혈액 B 세포 고갈이 일어난다는 것을 알 수 있다. 또한, 이 데이타로부터, 항체를 반복적으로 많은 양을 투여할 때 말초 임파절 및 골수에서 유의적인 B 세포 고갈이 달성된다는 것을 알 수 있다. 계속해서 시험 동물들을 관찰해 볼 때, 첫째 주 처리 동안 말초 B 임파구가 심하게 고갈되는 경우에도, 건강에 아무런 악영향을 주지 않는다는 것을 알 수 있다. 또한, B 세포 집단을 회수하여 관찰할 때, 이 영장류들의 다분화능성 간세포들은 이 처리에 의해 아무런 악영향을 받지 않는다는 결론을 내릴 수 있다.
B. C2B8의 임상 분석
i. C2B8의 단계 I/II 임상 시험: 단일 투여 치료 연구
조직학적으로 입증된 재발된 B 세포 임파종을 갖는 15명의 환자를 단계 I/II임상 시험에서 C2B8로 처리하였다. 각 환자에게 투여량 점증식 연구에서 C2B8을 단일 투여하였다; 환자 3명씩에 대해 10mg/㎡, 50 mg/㎡, 100 mg/㎡, 250 mg/㎡ 및 500 mg/㎡ 투여하였다. 처리는 0.22 마이크론 인-라인 필터를 통해 정맥내 주입에 의해 수행하고, C2B8은 최종 부피 250cc 또는 최대 농도 1mg/ml(정상 염수)가 되도록 희석시켰다. 초기 속도는 처음 1 시간 동안에는 50cc/시이고, 독성이 관찰되지 않으면, 투여 속도를 최대 200cc/시까지 점증시킬 수 있다.
독성(임상 의사에 의해 표현됨)은 "무", "발열", "보통증"(두명의 환자), "중증" (한명의 환자)으로 나타나고, 모든 환자는 치료 처리를 완료하였다. 말초 혈액 임파구 분석은 무엇보다도 C2B8이 T-세포 및 B-세포에 미치는 영향을 결정하는데 이용되었다. 모든 환자에게서 일치되는 점은, C2B8 주입 후 말초 혈액 B 임파구가 고갈되고, 이러한 고갈은 2주 이상 유지된다는 것이다.
한명의 환자(100 mg/㎡의 C2B8을 투여함)는 C2B8 처리에 대해서 부분 반응성(PR)을 나타내었다[4주 이상 지속되는(이 기간 동안에는 새로운 병변이 나타나지 않았으며 존재하는 병변도 확대되지 않음) 모든 측정가능한 지시 병변의 수직 직경의 곱의 합계가 50% 이상 감소함]; 적어도 한 명의 다른 환자(500 mg/㎡ 투여)는 C2B8 처리에 대해 소폭 반응성(MR)을 나타내었다[모든 측정가능한 지시 병변의 두개의 가장 긴 수직 직경의 곱의 합계가 25% 내지 50% 감소함]. 효과적으로 표현하기 위하여, PBL의 결과를 제14도에 나타내고, PR을 나타내는 환자에 대한 데이타는 제14A도에 나타내고, MR을 나타내는 환자에 대한 데이타는 제14B도에 나타내었다. 제14도에서는 다음과 같은 기호를 사용하였다: -■- = 임파구; □ = CD3+ 세포(T세포); ▲ = CD20+ 세포; ● = CD19+세포; ○ = 카파; △ =람다; ◆ = C2B8. 명백히 알 수 있는 바와 같이, B 세포 마커 CD20 및 CD19, 카파 및 람다는 2 주 이상의 기간 동안 고갈되는 반면, T 세포 수는 초기에 약간 감소하고, 이것은 비교적 신속하게 다시 거의 기저 수준으로 회복되었다.
ii.C2B8의 단계 I/II 임상 시험: 다회 투여 치료 연구
측정가능하게 진행중인 질환이 있으며 조직학적으로 확인된 B 세포 임파종을 갖는 환자가 이 연구에 적합하다. 이 연구는 두 부분으로 나누어진다: 투여량 한계 독성을 특성화하기 위한 투여량 점증, 및 생물학적 활성을 갖는 허용량 수준 결정으로 구성된 단계 I에서, 세명의 환자로 구성된 군에 C2B8을 총 4회의 주입 동안 매주 정맥내 주입에 의해 투여한다. 3개의 수준의 각각에서 누적 투여량은 다음과 같다: 500 mg/㎡(125mg/㎡/주입); 1000 mg/㎡(250mg/㎡/주입); 1500 mg/㎡(375mg/㎡/주입). 생물학적으로 활성을 갖는 허용량을 허용가능한 독성 및 충분한 활성을 갖는 최저 투여량으로 정해서 결정한다; 단계 II에서, 추가의 환자에게 생물학적으로 활성을 갖는 허용량을 투여하고, C2B8 4회 투여의 활성을 결정하는데 중점을 둔다.
IV. 복합 치료: C2B8 및 Y2B8
B 세포 임파아구 종양(라모스 종양 세포)을 이용하여 마우스 크세노그래픽 모델(nu/nu 마우스, 암컷, 생후 약 10주)로 C2B8 및 Y2B8을 이용한 복합 치료법을 연구하였다. 비교 목적으로, 또한 추가의 마우스를 C2B8 및 Y2B8로 처리하였다.
라모스 종양 세포(ATCC, CRL 1596)를 37℃ 및 5% CO2에서 10% 태아 소혈청 및 글루타민으로 보충된 RPMI-1640을 사용하여 배양시켰다. 25g 니들이 장착된 1cc 시린지를 사용하여 0.10ml(HBSS) 중에 1.7x106라모스 세포를 피하 주사에 의해 생후 약 7-10 주의 암컷 무모 마우스 9마리에 종양 주입을 개시하였다. 모든 동물은 적층 유동 후드에서 다루고, 우리, 침구류, 사료 및 물은 모두 오토클레이브시켰다. 종양을 절개하고 이들을 40메쉬 스크린을 통해 통과시킴으로써 종양 세포를 선별(passage)하였다; 세포들을 원심 달리(1300 RPM)에 의해 1xHBSS(50ml)로 2회 세척하고, 1XHBSS 중에 10x106세포/ml가 되도록 재현탁시키고, 사용할 때까지 70℃에서 냉동시켰다.
실험 조건을 위하여, 수 개의 냉동 구역으로부터 세포을 꺼내서 해동시키고, 원심 분리(1300 RPM)에 의해 펠렛화시키고, 1XHBSS로 2회 세척시켰다. 이어서, 세포들을 약 2.0X106세포/ml가 되도록 재현탁시켰다. 약 9 내지 12 마리의 마우스에게 25g 니들이 장착된 1cc 시린지를 이용하여 세포 현탁액 0.10ml를 피하 주사시켰다; 이 때, 동물의 좌측 거의 중앙 부분에 주사하였다. 약 2주 이내에 종양이 발달 하였다. 상기한 바와 같이 종양을 절개하고, 처리하였다. 연구 대상 마우스에게 상기한 바와 같이 0.10 ml HBSS 중의 1.67x106세포를 주사하였다.
예비 투여 실험을 기초로 하여, 이 연구에는 200 mg의 C2B8 및 100 μCi의 Y2B8이 사용될 것이라는 것이 결정되었다. 90 마리의 암컷 nu/nu 마우스(생후 약 10주)에게 종양 세포를 주사하였다. 약 10일 후, 24 마리의 마우스를 4개의 연구 그룹으로 배당하였으며(1 그룹 당 6 마리의 마우스), 이 때 각 그룹에는 필적하는 종양 크기 분포를 유지시키도록 하였다 [평균 종양 크기(종양의 길이x폭으로 나타내어짐)는 약 80mm2이었다]. 다음 그룹들을 25g 니들이 장착된 100 μl 해밀톤 시린지를 사용하여 테일-베인(tail-vain) 주사로 지시한 바와 같이 처리하였다.
A: 정상 염수
B: Y2B8 (100 μCi)
C: C2B8 (200 ㎍); 및
D: Y2B8 (100 μCi) + C2B8 (200 ㎍)
C2B8로 처리된 그룹에는 초기 주사 후 7일째에 또다시 C2B8을 주사하였다(200 ㎍/마우스). 캘리퍼를 이용하여 2 또는 3일마다 종양을 측정하였다.
처리 물질의 제조는 다음과 같은 방법을 따랐다.
A.Y2B8의 제조
이트륨-[90] 클로라이드 (6 mCi)를 폴리프로필렌관에 옮기고, 무금속 2M 아세트산나트륨을 사용하여 pH 4.1-4.4로 조정하였다. 2B8-MX-DTPA(정상 염수 중의 0.3mg; 2B8-MX-DTPA 제조에 대해서는 상기 참조)를 첨가하고, 와류시키면서 온화하게 혼합하였다. 15분 동안 반응시킨 후, 0.05X부피 20 mM EDTA 및 0.05X부피 2M 아세트산나트륨을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 방사능 농도는 75 mg/ml HSA 및 1mM DTPA를 함유하는 2.5 ml 1xPBS(제제 완충액) 중에서 반응 혼합물 5.0μL을 희석시킴으로써 측정하였다; 10.0 μl 내지 20 ml의 에컬럼TM(EcolumeTM) 신틸레이션 칵테일을 첨가하여 계수하였다. 반응 혼합물의 나머지를 3.0ml의 제제 완충액에 첨가하고, 멸균 여과시키고, 사용할 때까지 2-8 ℃에서 보관하였다. 비활성(주사시 14mCi/mg)은 방사능 농도 및 반응 혼합물에 첨가된 항체의 양을 기준으로 하여 계산된 단백질 농도를 이용하여 계산하였다. 단백질의 방사능은 즉석 박층 크로마토그래피를 이용하여 측정하였다. 방사능 주입도는 95%이었다. Y2B8을 사용 직전에 제제 완충액 중에서 희석시키고, 멸균 여과시켰다(최종 방사능 농도는 1.0mCi/ml임).
B.C2B8의 제조
C2B8은 상기한 바와 같이 제조하였다. C2B8을 5.0 mg/ml로 정상 염수 중의 멸균 시약으로서 제공하였다. 주사 전에, C2B8을 정상 염수 중에서 2.0mg/ml가 되도록 희석시키고, 멸균 여과시켰다.
C.결과
처리 후, 종양의 크기를 길이x폭으로 나타내고, 제11도(Y2B8 대 염수), 제12도(C2B8 대 염수), 및 제13도(Y2B8+C2B8 대 염수)에 지시한 날에 측정하였다. 표준 오차도 측정하였다.
제13도에 지시한 바와 같이, Y2B8 및 C2B8의 복합은 Y2B8이나 C2B8이 제공하는 효과에 필적하는 살종양 효과를 나타냈다.
V. 대체 치료법
상기 실시예에 비추어 인식되는 대체 치료법은 명백하다. 한 방법은 2B8 및 방사선 표지화된 2B8(예: Y2B8); 또는 2B8, C2B8 및 Y2B8; 또는 C2B8 및 Y2B8의 조합으로 약 1주 내에 치료 투여량의 C2B8을 사용하는 것이다. 또다른 방법은 방사선 표지화된 C2B8을 이용하는 것이다. 이 방법은 C2B8의 면역학적으로 활성인 부분의 잇점과 방사선 표지의 잇점을 모두 활용하는 것이다. 바람직한 방사선 표지는 쥐의 항체 2B8에 대한 더 큰 반감기의 C2B8을 고려하여 이트륨-90을 포함한다. C2B8이 B 세포를 고갈시키는 능력 및 방사선 표지를 사용함으로써 얻어지는 잇점 때문에, 바람직한 대체 방법은 전부는 아니더라도 대부분의 말초 B 세포가 고갈되도록 환자를 C2B8 (단일 투여 또는 다회 투여)로 처리하는 것이다. 이것은 방사선 표지화된 2B8을 사용하여 수행될 것이다; 말초 B 세포의 고갈 때문에, 방사선 표지화된 2B8은 종양 세포를 타겟할 기회가 증가한다. 요오드 [131]에 관한 문헌 (참조: Kaminski)에 보고된 결과를 고려해보면, 요오드[131]로 표지화된 2B8을 사용하는 것이 바람직하다. 바람직한 대체 방법은 종양의 투과성을 증가시키기 위한 노력으로 먼저 방사선 표지화된 2B8(또는 C2B8)을 사용한 후, C2B8로 단일 또는 다회 처리하는 것이다; 이 방법의 목적은 C2B8이 종양괴의 외부 및 내부에 도달하는 기회를 증가시키는 것이다. 또다른 방법은 화학치료제를 C2B8과 조합하여 사용하는 것을 포함한다. 이들 방법은 이른바 "스태거드(staggered)" 치료를 포함한다. 즉, 화학 치료제로 처리한 후 C2B8로 치료하고, 이어서 이 방법을 반복실시하는 것이다. 별법으로서, 처음에 C2B8을 단일 또는 다회 투여하여 처리한 후 화학치료제로 처리하는 것도 실시할 수 있다. 바람직한 화학치료제로는 시클로플수파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니슨을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다 [참조: Armitage, J.O. et al.,Cancer 50:1695(1982); 본 명세서에서는 이 문헌을 참조 인용함].
상기 대체 치료법은 대표적인 것들에 지나지 않으며 이들에 한정되는 것은 아니다.
VI. 기탁 정보
TCAE 8 중의 항-CD20 (기탁하기 위해E. Coli에 옮김)은 특허 절차상 미생물 기탁에 관한 국제적 승인을 위한 부다페스트 조약("부다페스트 조약")의 규정하에 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC; 미합중국 20852 메릴랜드주 로크빌 파크론 드라이브 12301 소재)에 기탁하였다. 이 미생물은 1992년 11월 9일에 ATCC에 의해 시험되고, 생존가능한 것으로 나타났다. ATCC는 이 미생물에 ATCC 수탁 번호: ATCC 69119(TCAE 8중의 항-CD20)를 부여하였다. 하이브리도마 2B8은 부다페스트 조약 규정 하에 1993년 6월 22일 ATCC에 기탁하였다. 이 배양물의 생존가능성은 1993년 6월 25일에 결정되었으며, ATCC는 이 하이브리도마에 ATCC 수탁번호 HB 11388을 부여하였다.

Claims (9)

  1. ATCC 기탁 번호 69119로 기탁된 TCAE 8 중 항-CD20을 포함하는 트랜스펙토마로부터 생성된 면역학적으로 활성인 키메릭 항-CD20 항체.
  2. 항-CD20 항체를 분비하며 ATCC 기탁 번호 HB 11388로 기탁된 하이브리도마(hybridoma).
  3. 제2항의 하이브리도마로부터 분비된 모노클로날 항체.
  4. 제2항에 따른 하이브리도마로부터 얻은 방사성 표지화된 항체.
  5. 제4항에 있어서, 방사선 표지가 이트륨[90], 인듐[111] 및 요오드[131]로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 방사선 표지화된 항체.
  6. ATCC 기탁번호 69119로 아메리칸 타입 티슈 컬렉션에 기탁된 트랜스펙토마로부터 생성된 키메릭 항-CD20 항체의 B-세포 고갈 활성을 가지며, 치료를 필요로 하는 대상에게 체중 1 kg당 0.4 내지 20.0 mg의 투여량에서 주입 후 24시간 내에 B 세포의 거의 완전한 고갈을 제공하는 1종 이상의 면역학적 활성의 키메릭 항-CD20 항체의 치료적 유효량을 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상에서의 B-세포 임파종치료용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 항-CD20 키메릭 항체가 ATCC 기탁번호 69119로부터 생성된 키메릭 항체인 조성물.
  8. ATCC 기탁번호 69119로부터 생성된 키메릭 항체의 B-세포 고갈 활성을 가지며, 체중 1 kg당 0.4 내지 20.0 mg의 투여량에서 인간 환자에게 주입 후 24시간 내에 B 세포의 거의 완전한 고갈을 제공하는 키메릭 항-CD20 항체, 및 제2의 방사선 표지화된 항-CD20 항체의 치료 유효량을 포함하는 B-세포 임파종 치료용 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 제2의 방사선 표지화된 항-CD20 항체가 ATCC 기탁번호 HB11388의 하이브리도마에 의하여 생성된 항-CD20 항체를 포함하는 것인 조성물.
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