CN109273050B

CN109273050B - 一种用于解析复杂多聚体蛋白受体的脉冲电子顺磁共振数据的系统及方法与应用

Info

Publication number: CN109273050B
Application number: CN201810876406.4A
Authority: CN
Inventors: 张映辉; 顾为望
Original assignee: Wuyi University
Current assignee: Wuyi University
Priority date: 2018-08-03
Filing date: 2018-08-03
Publication date: 2021-07-13
Anticipated expiration: 2038-08-03
Also published as: CN109273050A

Abstract

本发明公开了一种用于解析复杂多聚体蛋白受体的脉冲电子顺磁共振数据的系统及方法与应用，包括：模块一：用于通过将细胞工程表达多聚体受体蛋白，经过脉冲电子顺磁共振收集、处理自旋标记在自然配体刺激下受体蛋白各亚基标记位点彼此距离的分布；模块二：用于根据配体刺激下解析的受体蛋白电磁共振的结构信息筛选出多聚体蛋白离子通道受体的脉冲电子顺磁共振图谱中部分符合实验数据的最佳蛋白结构模型；模块三：用于通过分子操作技术微观调整所述最佳结构模型，进行自旋标记旋转子的分布比较，找出实验数据和模块二不能匹配的部分背后代表的结构、构象信息；模块四：用于定量确定穿膜区临床药物作用靶点在配体作用下的空间结构特点。

Description

一种用于解析复杂多聚体蛋白受体的脉冲电子顺磁共振数据的系统及方法与应用

技术领域

本发明涉及蛋白生物技术、生物物理、药物作用靶向机制领域，具体涉及一种用于解析复杂多聚体蛋白受体的脉冲电子顺磁共振数据的系统及方法与应用。

背景技术

配体激活门控神经离子通道位于神经元后突触，是一大类接受前突触神经元释放的神经递质刺激而打开本身的离子通道，调节神经电位传导的受体。这些功能各异的离子通道肩负着大脑神经信号的传导、调控，影响人类的学习、记忆、情绪调节能力。而结构高度同源化，都是五亚基围成的轴对称离子通道，每个亚基的胞外区接近膜的区域都会存在一个由两个半胱氨酸界定的loop结构(即两个半胱氨酸形成二硫键中间有13个氨基酸序列)，作为受体胞外区结合配体引发下面跨膜区离子通道打开的重要的铰链组分，因此，这类受体又称为cys-loop受体，包括乙酰胆碱受体(acetylcholine receptors，nAChR)，甘氨酸受体(Glycine Receptors，GlyR)，5-羟色胺受体，谷氨酸受体(Glutamate receptor，GluCl)，γ-氨基丁酸A型受体(γ-Aminobutyric Acid Type A Receptors，GABA_AR)等。由于这些受体在中枢神经系统分布不同，亚基组成不同，所起到的功能亦不同。各种遗传性、后天发作神经类疾病都和这些受体息息相关。例如，医学研究表明γ-氨基丁酸受体和阿尔海默病(Alzheimer’s disease)，癫痫(epilepsy)，自闭症(autism)等均与有之有紧密联系，包括受体本身关键位点的突变，或者受体在大脑特定部位表达量的减少。基础研究表明抗这些疾病的相关神经药物的靶受体就是γ-氨基丁酸受体，甘氨酸受体则和自闭症(autism)、惊跳症(hyperekplexia)紧密相关。因此，现在有关各种神经药理研究、药物设计、离子通道门控机制都要涉及探明这些蛋白的结构，药物的靶位，和药物、配体引发受体异构化的门控开关机制。

在研究神经药物作用的机制过程中，发现药物在靶向神经受体的位点往往或有重叠，或完全不同。例如临床用麻醉剂R-etomidate，其靶向部位位于γ-氨基丁酸受体β3⁺亚基和α1^-亚基穿膜区相邻亚基间隙(“+/-”代表同一亚基穿膜区的两个侧面，如图1所示，图1中A为以γ-氨基丁酸A型受体GABA_AR的五聚体侧视图，胞外区是神经介质结合的部位，图中阴影部分的结构代表配体的结合；穿膜区(处于磷脂双层膜的部分)由每个亚基四个α螺旋二级结构组成，图中指示了穿膜区药物调节分子通常结合的靶部位；B为五聚体的胞外区正上方俯视图，以研究中的γ-氨基丁酸A型受体为例，由二种(α1)₂(β3)₃或三种(α1)₂(β3)₂γ₂不同的亚基组成，中间的孔道是整个离子通道；C为五聚体的穿膜区接近胞外部分横截面俯视图，从图中可以看到每个亚基提供一个穿膜区α螺旋围成离子通道的穿膜部分；D为两种结构不同却作用在同一受体上不同的亚基穿膜区间隙的麻醉或类似麻醉功能化学药物分子：R-etomidate主要作用于β3⁺α1^-，R-mTFD-MPAB(R-1-methyl-5-allyl-5-(m-trifluoromethyl-diazirinylphenyl)barbituric acid主要作用于α1⁺β3^-(在包含γ亚基的受体还有γ⁺β^-))，其作用的主要特异位点是β3的Met286、ASN265 Val290和α1(编码序列如Seq7所示)的Leu232和Leu236，且位于受体跨膜区上部。另一种Barbiturate类似功能衍生物R-mTFD-MPAB，其对γ-氨基丁酸受体的激活作用和R-etomidate高度相似，靶向部位也是受体跨膜区的上部，但靶向部位是位于在相邻亚基α1⁺和β3^-的间隙，主要特异位点是α1的Ser301和β3的Met227(如图1A所示)。两种不同结构的麻醉药物均作用于同一受体，作用部位相邻，都在受体穿膜的上部，且都是受体的正向增强调控作用。

用定点突变和脉冲电子顺磁共振技术(double electron electron resonanceelectron paramagnetic resonance，DEER EPR)测量标记在R-etomidate主要靶向位点β3M286在GABA_AR(α1)₂(β3)₃的距离分布，结果如图2所示，图2A为γ-氨基丁酸A型受体GABA_AR(α1)₂(β3)₃结构侧视图，在胞外区β3和α1亚基的间的loop C(β3)是GABA_AR自然配体γ-氨基丁酸(GABA)的结合部位；在穿膜区的上半部，β3和α1亚基间，是临床静脉麻醉药物R-etomidate的主要作用位点，包括β3Asn265、Met286、Val290及α1Leu232、Leu236等，巯基特异性反应的自旋标记MTSL通过化学交联标记到β3Met286C突变部位上(编码序列如SeqNo8所示)，深色条状代表β3，浅色条状代表α1。图2B为从俯视角度演示猜想需要实验验证的由β3和α1亚基组成的GABA_AR的数量构成和排列。脉冲电子顺磁共振实验可以测量标记在β3Met286C上的MTSL的N-O上自由基间的双极作用(dipolar interaction)，得到亚基之间的相互距离。在可能受体结构上，可以得到相邻亚基间和间隔亚基间的距离，如果五个亚基沿纵轴对称排列成对称五边形(俯视角度)，该比例应在1.6左右。图2C为电子自旋标记MTSL(S-(1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-2,5-dihydro-1H-pyrrol-3-yl)methylmethanesulfonothioate)的结构示意图，MTSL和蛋白主链的半胱氨酸通过二硫键(disulfide bond)交联，它的另一端有一个带有自由电子的N-O基团(Nitroxide)，在脉冲电子磁场中相互在一段距离内会产生相互作用DEER，通过四脉冲测量DEER信号随时间衰减的信号，通过Tikhonov regularization数学处理可以得到在受体上的距离分布。分布的距离峰较宽，这是因为MTSL分子的化学键可以旋转，所以它的分子朝向是多样化的，但是实际构象分布受周边环境的影响。图2D为GABA_AR(α1)₂(β3)₃蛋白的纯化与鉴定。从左到右分别为HEK293细胞表达的受体从细胞膜上溶解到缓冲液中的SDS-PAGE，纯化后的受体的SDS-PAGE，Western Blot验证α1亚基和β3亚基，可以看到在糖基消化酶(PNGase F)处理后两个亚基的分子量都下移，说明哺乳动物细胞表达的亚基β3、α1存在糖基化修饰。图2E为用可控、分步稀释法体外重组纯化的抗体到细胞膜上的技术路线图，图2F为分别在纯化蛋白洗脱溶液中和重组到脂质体上的蛋白的SDS-PAGE，由图2F可以证明体外重组的成功。

配体引发的神经离子通道cys-loop受体普遍认为受体的胞外区结合配体后(在loop C)引发的胞外区发生一种整体刚性的(rigid body)构象变化，这种紧张的力通过β1/β2loop、cys-loop、和联系跨膜区α螺旋的M2-M3 loop形成的铰链(Hinge)传导到下面的跨膜区，牵引整体跨膜区的上部向外扩展(如图3所示，图3为自然配体结合门控神经离子通道受体(以γ-氨基丁酸A型受体GABA_AR为例)胞外区通过异构化效应打开穿膜区亚基间隙，辅助靶向药物结合的“楔入(Wedge in)”理论示意图，图3A为GABA_AR的胞外区和穿膜区的结合部的侧面角度示意图，配体结合受体胞外区，所产生的构象变化依赖胞外区和跨膜区连接的铰链区(Hinge domain)传导。铰链区包括β3亚基胞外区的β1/β2loop,β6/β7loop(cysloop)，α1亚基胞外区的β8/β9loop和连接β3亚基跨膜M2/M3螺旋的M2-M3 loop、α1跨膜区的M1螺旋相互作用而成。配体作用胞外区‘loop C’会引发受体的跨膜离子通道、主要是上半部分向外扩张，打开相邻亚基间的距离(重要中间步骤)，以辅助特异药物“楔入”进一步稳定、增强胞外区自然配体的对GABA_AR的调节作用(这一模型是基于同源门控神经离子通道的晶体结构和分子动力学证据)。自然配体打开药物靶向亚基间隙的空间变化的量化指标由β3的Met286和α1的Ala291之间β碳原子间的距离变化ΔC_βα来衡量、代表。也是本专利技术测量的主要目标；图3B为从受体的正上方俯视配体激活受体穿膜区的变化)，从而形成离子通道壁的向外扩张最终打开离子通道，介导离子的穿过、影响细胞的膜电位。神经麻醉药物在受体跨膜区的靶向结合往往起到了增强胞外区配体结合引发的异构化作用。基于报导的γ-氨基丁酸A型受体同源受体的晶体学结构比较(例如GLIC、GluCl，比较受体的不同激活状态，比如无配体‘Apo’，磷脂分子结合‘lipid-bound’，激活‘activatio’状态)配体往往引发受体跨膜区相邻部位的向外扩张，神经药物象楔子一样楔入(Wedge in)靶位点，起到稳定、增强扩张状态，协同胞外区的配体结合打开跨膜离子通道。“Wedge in”是否是一种神经药物和配体协同激活离子通道的机制，现阶段有间接的电生理线索，基于已报导的晶体结构的分子动力学模拟结果支持。但囿于γ-氨基丁酸受体稀有的表达量，分子结构的复杂，体外的不稳定性，药物作用靶点的精细结构变化(Angstrom)难于量化分析，依然有大量的神经药物精确靶点难于确定，更主要的是缺乏一种直接的技术拿到量化结果，这些依然是麻醉药物领域研究麻醉药物、各种神经药物的靶向机制深层次的难题。

能直观、从整体到局部揭示γ-氨基丁酸受体的结构、构象变化一直以来在技术上是一个挑战。脉冲电子顺磁共振技术(pulsed Electronic Paramagnetic Resonance)是一项近年来在膜蛋白生物物理研究领域开始普遍采用的一种研究蛋白结构、尤其是涉及蛋白异构化机制的技术。作为一种主要的技术手段是通过异构化过程中相邻或有相互作用的蛋白结构域的变化，尤其是距离的变化，进而推断蛋白整体的构象变化和相应的激活机制。相比于传统的连续波电子顺磁共振(continuous wave Electronic ParamagneticResonance，CW EPR)，该技术能探测更微弱的偶极相互作用，探测距离能达到

γ-氨基丁酸A型受体本身是一个较大的蛋白，是五聚体，每个亚基分子量大约50KD，它的胞外区到跨膜区的距离一般在

离子通道的直径也在此范围。对于一种难于表达，难于大规模纯化拿到可结晶标准纯蛋白量的蛋白，传统的晶体学衍射技术现阶段取得突破比较困难，目前只有一个“人工”γ-氨基丁酸受体(由五个相同β3亚基组成)受体晶体学模型报导，但遗憾的是由于不具备代表性麻醉药理学活性(没有异源亚基的存在)，且在细胞工程表达时截掉了部分胞内区其代表性意义打了折扣。核磁共振技术也是可以考量的一个技术，同样受限于这种蛋白巨大的分子量，远远超过了该技术上限蛋白分子量50KD的限制。脉冲电子顺磁共振技术本身并没有蛋白大小的限制，测量标记在受体靶向位点上的自旋标记间的距离，而且在生物物理领域，这项技术的实施前提是将提纯后的膜蛋白锚定在脂质体磷脂双层膜上，模拟天然蛋白在体内环境下的动态结构，而不是被“固定”在蛋白晶格中。选择脉冲电子顺磁共振技术，开发一套完整的研究γ-氨基丁酸A型受体结构异构化机制，从而解析神经药物、麻醉药物的靶向机制，意味着需要建立起一整套独立、尚未尝试过的体外构建药物学活性γ-氨基丁酸A型受体，并应用该技术分析、验证实验原始数据的方法体系，打开一个新的研究神经药理、包括麻醉学药理基础问题、神经离子通道受体异构化机制的窗口。

大量的膜蛋白领域的脉冲电子顺磁共振研究都是选择蛋白的两个位点，得到一组距离的分布峰。对于五亚基的门控离子通道蛋白本身譬如细菌源的GLIC蛋白，或者其它由同种亚基组成的同源受体，鉴于五聚体对称分布，标记在每个亚基同一位点的自旋标记(共5个/受体)间的偶极相互作用将产生两组峰，分别对应相隔亚基之间、相邻亚基的距离分布(图2)。GLIC的研究证明了这一点。可以说这是多自旋标记的蛋白最理想/简单的一种状态。γ-氨基丁酸A型受体则不同：首先对于有药理学活性的α1/β3组成的受体，亚基α1和β3的数量、排列尽管猜测有三个β3亚基，但是排列和确切的数量依然没有定论。其二，对于标记在靶向药物作用位点的自旋标记，受到所在位置(穿膜区的不同亚基间隙，如在β3⁺α1^-，α1⁺β3^-，β3⁺β3^-，图2)、微观环境的影响，譬如可能形成的氢键、静电相互作用、范德华尔力使得每个标记的自旋状态均不同，这样会很大影响每对标记间的偶极相互作用，产生的长短距离分布可能与同亚基组成、均一对称的GLIC蛋白有显著不同。其三，对于很多膜蛋白，它们在磷脂细胞膜上的结构往往是一种动态平衡结构，即存在不同的构象，它们和结晶得到的单一蛋白快照(snapshot)结构往往有不同，预示它们的功能和作用机制。基于以上原因，对于重组在脂质体上模拟受体神经后突触细胞膜的γ-氨基丁酸受体(α1/β3)，标记在临床麻醉药物R-etomidate靶向位点β3M286的自旋标记产生的距离分布可能比理论上的长/短距离分布更为复杂，因为构象存在不止一种，得到的可能不是一组距离峰。

基于此，如何正确分析上述因素，解析得到的复杂图谱是亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种能够准确解析复杂多聚体蛋白受体的脉冲电子顺磁共振数据的系统及方法与应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种用于解析复杂多聚体蛋白受体的脉冲电子顺磁共振数据的系统，包括：

模块一：通过细胞工程方法表达多聚体受体蛋白并纯化，并通过化学交联反应将自旋标记连接到蛋白上关键靶向位点，经过体外重组方法锚定受体到脂质体上，经过脉冲电子顺磁共振收集、处理自旋标记在自然配体刺激下受体蛋白各亚基标记位点彼此距离的分布；

模块二：用于根据配体刺激下解析的受体蛋白电子顺磁共振的结构信息，找出符合近似反应离子通道特异性结构的距离峰，筛选出多聚体蛋白离子通道受体的脉冲电子顺磁共振图谱中符合实验数据部分的最佳蛋白结构模型；

模块三：用于通过分子操作技术微观调整所述最佳蛋白结构模型，进行自旋标记旋转子的分布比较(Rotamer Analysis)，找出实验数据和模块二不符合实验数据部分背后代表的结构、构象信息；

模块四：用于定量确定穿膜区临床药物作用靶点在配体作用下的空间结构特点，根据在初始蛋白模型上进行分子操作，得到扩张、微调整后的一系列结构模型，然后根据高斯解析分析(Gaussian Deconvolution Analysis)得到自旋标记的长段距离峰分组相对应的比例变化，和电子共振实验测得的距离分布比较，得到相应的最佳匹配模型，同时得到相应的扩张距离(相邻β3、α1亚基，在穿膜区β3M286和α1A291间β碳原子间的距离，ΔC_βα)，得出的药物局部靶向结构最接近实际蛋白在脂质体上的实际结构。

从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明系统通过一整套将脉冲电磁技术得到的原始蛋白结构数据，通过将蛋白建模、自选标记旋转子分布模拟、分子操作技术三种不同的计算方法综合起来解析实验数据所代表的蛋白构象、及所研究药物靶向位点的精细结构变化的创新方法。本发明系统适用于基于脉冲电子共振研究多自旋标记的复杂多聚体蛋白同时存在不同构象的情况，系统性地解释了既往研究中自旋标记测量后的距离和实际蛋白主链上对应氨基酸残基β碳原子间的距离不一致的原因，也是探索未知结构的蛋白在配体或药物作用下蛋白异构化、激活机制的一个新的技术途径，有广泛的借鉴意义和实践价值。脉冲电子共振技术通常测量共价连接在蛋白空间结构的两个位点上自旋标记间的距离来解析蛋白的构象、及变化，两个自旋标记在脉冲磁场的影响下的偶极相互作用(dipolar interaction)而得到的距离一般认为是研究膜蛋白结构的一个直接的“尺子”工具，由于实际蛋白在体内环境中的动态变化产生不同构象，自选标记本身的旋转构象的多样性、作为大基团导致距离分布规律难以解释和精确分析，因此，通常得到的距离分布实际上是一个概率分布，影响了数据的有效性、精确性。针对这一因素在分析复杂脉冲电子顺磁共振数据的影响，通过实际数据和计算数据的拟合将这一因素转换为结构解析的重要依据。创造性地结合旋转子分析、蛋白结构最佳模型筛选、分子结构微调等技术组合，形成了测定距离的“尺子”，从独特角度解决改善了脉冲电子共振技术解析蛋白结构的精度问题。用膜蛋白在磷脂膜上的实验数据契合可靠蛋白模型上的自旋标记旋转子分布更可靠测量药物靶向结构微小的变化。现有技术中，结晶蛋白往往不能完全代表膜蛋白在细胞膜上的天然构象，本发明方案采用的离子通道研究体系是在体外重组蛋白中，而且通过筛选、建立初始的γ-氨基丁酸A型受体的最佳模型(根据已发表晶体结构)，得到部分高质量的实验数据的拟合，进一步通过分子操作、自旋标记旋转子分析得到了总体最佳的计算与实验匹配结果，从而得出了蛋白的结构和膜上不同蛋白构象存在平衡的信息，本发明方案所使用的独特的数据处理分析技术在以往的膜蛋白相关研究中从未报道。

进一步地，所述模块二中的距离峰包括相邻亚基间和间隔亚基间的距离。

从上述描述可知，本发明的有益效果在于：该系统模块二是根据配体刺激下解析的受体蛋白电子顺磁共振的结构信息，发现两组符合近似反应离子通道受体特异性结构(如反映离子通道受体的五边形结构)的距离峰(每组包括相邻亚基间和间隔亚基间的距离)。为了进一步解析背后的结构信息，用同源蛋白建模的方法，以现有技术中已知的结构为模板进行同源建模。比如对于人γ-氨基丁酸A型受体(GABA_AR，(α1)₂/(β3)₃)选用的模板蛋白包括细菌离子通道(Gloeobacter)晶体(pH4/7)，C.elegans谷氨酸同源五聚体受体(GluCl)晶体(Apo、lipid-bound,activation)，人γ-氨基丁酸A型受体(β3同源五聚体)。这些已报导受体往往截掉了联系跨膜区的胞内loop结构，尽管如此，建立该模块的目的是筛选出一种能最大限度接近真实结构的受体结构模型作为下一步数据分析的基础。筛选手段是借鉴关于自选标记在实际的磁场分布实际上由两个因素决定，一个是自身存在多个可以自由旋转的化学键使自身可以呈现不同的构象，另一个是它的旋转朝向受周围蛋白残基各种微观作用的影响。借鉴这一特点，把在各种模型上的自旋分布同实验数据比较是检验分子模型符合度的一个方法，实践证明也确实能有效的甄别受体的可能结构：以人γ-氨基丁酸A型受体(β3同源五聚体)晶体为模板的结构模型进行的自旋标价模拟分布结果和实验数据中解析的长距离峰组基本一致，代表了至少锚定在磷脂膜上GABA_AR(α1)₂/(β3)₃的一种构象，而其他模型仅能部分的接近。

进一步地，所述体外重组方法包括以下步骤：

S1、在体外通过细胞工程方法进行诱导表达、纯化受体蛋白；

S2、受体蛋白纯化后，在体外通过控制稀释速度、分阶段将其从由洗涤剂(detergent)混合脂分子形成的micelle状态过渡到共存于micelle和形成的脂质体的中间状态，并最终完全地锚定于脂质体上。

从上述描述可知，本发明的有益效果在于：作为实验基础，体外研究要求人源γ-氨基丁酸A型受体较大多数蛋白的提纯，重组技术更为复杂，期间需要特殊的提纯、脂质体体外重组方法来保持其异构化活性和相关药物的反应特性。本发明方案将处于detergent/micelle包裹的受体蛋白进行分步稀释后，将所述受体蛋白重组到脂质体上，通过分步、可控重组速率的方法创新性地实现了体外重组的目的，并且较其它重组方法具有简洁、快速、高效、保持天然受体药物调节性等优点。该方法是综合考虑了以往关于正向膜蛋白重组(reconstitution)、逆向从细胞膜上溶解(solubilization)膜蛋白所经历动态、结构中间状态的普遍原理，根据不同神经介质离子通道受体的生化、生物物理特性，及纯化选用detergent/脂分子的特异性，可根据需要的灵活利用该技术路线，体外活性重组到人工脂质体上，具有可操作性强，适用范围广，能有效克服低表达量神经介质激活的离子通道受体蛋白的体外重组方法障碍、并保持受体天然活性、靶向药物可调控性等难题。

进一步地，所述步骤S2中，所述控制稀释速度的方法具体包括以下步骤：

将所述步骤S1纯化后的受体蛋白通过三个连续阶段以不同速度梯度稀释逐步形成重组的膜蛋白-脂质体，所述三个连续阶段具体为：

A、Detergent、脂质体和纯化的膜蛋白受体三者混合状态下的起始微团(micelle)形态阶段；

B、微团和受体蛋白、脂质体共存中间阶段；

C、单一的受体脂质体阶段；

稀释操作中，选择相邻阶段转换的detergent的临界浓度作为每一阶段的起始点或稀释终点，并在脂质体和微团混合中间阶段保持缓慢且匀速稀释。

从上述描述可知，本发明的有益效果在于：将所述步骤S1制备的纯化人γ-氨基丁酸A型受体的通过三个连续阶段以不同速度梯度稀释，各阶段遵循脂质体溶解、重组共经历的可逆过程的客观规律；操作中，选择相邻阶段转换的detergent的临界浓度作为每一阶段的起始点或稀释终点，并在脂质体和微团混合中间阶段保持慢匀速稀释，保证蛋白脂质体的充分形成，避免蛋白的聚集化损失。本发明方案采用了细胞膜上蛋白的溶解和逆向但为其镜像过程的蛋白脂质体重组都必经的三个阶段作为设计理论依据，选取特定的起点浓度和稀释后的终点浓度对应的各相邻阶段的分界。不同种类的同源受体的重组，即使选取的detergent种类不同，添加磷脂也不同，都可以同样针对性地在三个阶段对应的临界浓度，按照同样的方法重组。

进一步地，所述体外重组方法还包括步骤S3、通过超速离心法将重组到脂质体膜上的膜蛋白收集、重悬浮于缓冲液中。

优选地，所述多聚体受体蛋白为人源γ-氨基丁酸A型离子通道受体蛋白或与人源γ-氨基丁酸A型离子通道受体蛋白具有同源结构的五聚体门控神经离子通道受体。

从上述描述可知，本发明的有益效果在于：对高度特异的人源γ-氨基丁酸A型离子通道受体(α1)₂/(β3)₃，采用基于已发表同源蛋白受体晶体结构为模板构建多种受体结构模型，在此基础上比较实验所得的结构数据和自旋标记在各蛋白模型的模拟分布数据，甄别出最接近于人源γ-氨基丁酸A型离子通道受体(α1)₂/(β3)₃的蛋白结构为根据已经结晶的人源γ-氨基丁酸A型离子通道受体(由相同β3亚基组成五聚体“pentamer”)的同源蛋白建模模型。这样做的根据有两方面的因素：在模块二中得到的以β3同源五聚体晶体为模板的分子模型上面自旋标记间的距离大于标记位置M286位置氨基酸残基β碳原子间的距离(即蛋白穿膜区骨架相应位置上的距离)，即测量的距离大于蛋白的“尺寸”，相邻亚基间的平均距离大约大了

而间隔亚基间平均距离大了

这表明在晶体模型可能代表一种穿膜区靶向部位紧闭的状态，导致体积较大的标记基团伸出到受体的外部；而通过电生理实验也间接证明靶向部位在GABA刺激下更为开放。所以采用分子操作的技术模拟亚基间的向外沿对称轴放射性向外扩张，打开、增大靶向部位β3⁺/α1^-亚基间的距离。在不同增幅的状态下进行了系列扩张模型上的自旋标记距离峰模拟分布，和实验数据分布进行比较。在定性实验中，发现随靶向部位亚基间距增大(ΔC_βα)，自选标记的分布逐渐向受体内部迁移导致短距离分布峰的比例逐渐增大，而长距离峰的比例逐渐缩小。在实验数据和计算模拟数据的对比中分子操作实验证明了配体作用下，靶向部位受体的穿膜区较原始晶体分子模板应该更开放。

优选地，所述人源γ-氨基丁酸A型离子通道受体蛋白的亚基组成为(α1)₂/(β3)₃。

从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明方案还可适用于也适用于用脉冲电子顺磁共振的方法研究其它异源亚基构成的门控离子通道和人乙酰胆碱受体(n-acetylcholine receptor)和其它异源亚基组成的人源γ-氨基丁酸受体：例如(α1)₂/(β3)₂/γ2异源型多亚基五聚体受体(其它亚基组成的GABA_AR也同样适用，(α1-6)₂(β1–3)₂X，X是γ2orδ)。

进一步地，所述人γ-氨基丁酸A型受体α1亚基的Uniprot蛋白序列库的序列号为P14867，具体氨基酸序列如SeqNo.1所示，其中，第1～27个氨基酸为α1亚基信号肽残基序列，其相应的基因序列如SeqNo.2所示，信号肽相应的编码子为碱基215～295；所述人γ-氨基丁酸A型受体β3亚基的Uniprot蛋白序列库的序列号为P28472，具体氨基酸序列如SeqNo.3所示，其中第1～25个氨基酸为亚基β3信号肽序列，其相应的基因序列如SeqNo.4所示；所述的人γ-氨基丁酸A型受体γ2亚基的Uniprot蛋白序列库的序列号为P18507，具体氨基酸序列如SeqNo.5所示，其中，第1～39个氨基酸为γ2亚基信号肽序列，其相应的基因序列如SeqNo.6所示，信号肽相应的编码子为碱基226～342，成熟蛋白的编码为碱基343～1627。

进一步地，所述脉冲电子共振数据为脉冲电子顺磁共振数据。

本发明还包括一种利用上述系统进行数据解析的方法，包括以下步骤：

S01、通过同源蛋白建模和自旋标记旋转子分析(Rotamer Analysis)筛选出多聚体蛋白离子通道受体蛋白的脉冲电子顺磁共振图谱中符合实验数据部分的最佳蛋白结构模型；

S02、通过分子操作技术微观调整所述步骤S01筛选出的最佳蛋白结构模型，同时在调整后的一系列结构模型上计算自旋标记旋转子的分布，拟合实验数据与开始在所述步骤S01筛选出的最佳蛋白结构模型上计算出的分布数据不符合实验数据部分；

S03、量化所述步骤S02中的调整过程，鉴别受体蛋白的局部结构、整体构象变化，得出涉及蛋白异构化激活机制的临床药物靶向结构信息。

从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明方法可用于研究神经离子通道在胞外区结合自然配体引发离子通道的开放及药物作用于受体跨膜区协同增强的异构化机制一直是麻醉学领域最核心的药物靶向分子机制。本发明提供了一种新型的实验、数据分析技术体系，可用于分析自然配体γ-氨基丁酸(GABA)刺激下，用脉冲电子顺磁共振技术研究由全序列异种亚基组成的人源γ-氨基丁酸A型受体(GABA_AR，(α1)₂/(β3)₃)穿膜区在β3⁺/α^-亚基间隙的临床静脉注射用麻醉药物R-etomidate作用靶位点结构、异构化激活机制的方法。该方法对其它结构同源，功能相似神经元受体体外重组譬如体外表达的乙酰胆碱受体(nAChR)，甘氨酸受体(GlyR)，谷氨酸受体(GluCl)，5羟色胺受体(5-HT3R)也适用。解析两个自选标记在脉冲磁场的影响下的偶极相互作用(dipolar interaction)而得到的点对点距离一般认为是研究膜蛋白结构的一个直接的“尺子”工具。但是实际蛋白在体内环境中的动态变化产生的不同构象，自选标记本身的旋转构象的多样性、作为大基团导致距离分布规律难以解释、精确分析。本发明方案创造性地用旋转子分析(rotamer analysis)、蛋白结构最佳模型筛选、分子结构微调等技术组合选来改进测定距离的“尺子”，从独特角度解决了改善了脉冲电子顺磁共振技术解析蛋白结构的精度问题。

进一步地，所述步骤S02中需要对蛋白分子亚基间距离的微调，通过进一步调整最佳蛋白结构模型中分子亚基间的距离，将计算的出自旋标记旋转子分布与实验数据进行比较”，使得表述更清楚，得到最佳拟合实验数据的方法。

从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明方案对蛋白分子亚基间距离的微调也代表了以后分析复杂电子顺磁共振数据的一个新的技术途径。本发明将分子操作作为分析自旋标记分布受蛋白构象变化影响的一个重要中间技术环节并在分析复杂电子顺磁共振数据时运用了这一独特技术。

进一步地，所述临床药物为麻醉药物、镇静药物、抗焦虑药物。

从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明方案适用于研究门控离子通道胞外区配体结合和穿膜区神经药物靶向结合协同激活离子通道的普遍机制，也适用于其它靶向人γ-氨基丁酸受体穿膜区不同亚基间的药物作用机制，包括各种类似作用部位麻醉药物、镇静药物、抗焦虑药物。本发明方案提供了一个在分子水平研究药物作用特异性的新技术体系，适用于研究复杂蛋白的多构象、异构化机制。同时也解决了目前利用脉冲电子顺磁共振技术测量膜蛋白自旋标记位点间的距离遇到的普遍问题：测量的自选标记间的距离分布与蛋白主链上对应残基β碳原子间的距离不一致。

进一步地，所述麻醉药物为R-etomidate。

从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明方案揭示了在配体的作用下，临床麻醉药物R-etomidate在γ-氨基丁酸受体(α1)₂/(β3)₃作用靶点会呈现一种较晶体学模型更为开放的模型，提供了药物作用于门控离子通道穿膜区的特异亚基间β3/α1间隙位点的更为开放结构状态，是“楔子(wedge in)”打开离子通道机制的证据。因此，本发明提供了一种直接的体外验证麻醉药物作用γ-氨基丁酸受体靶点的方法，提供了药物靶向机制中重要的蛋白靶向部位的接近实际活性状态的结构信息，本发明方案也可以作为研究其它类似神经药物作用分子机理、辅助药物设计的一个直接的方法，本发明方法可对在未来相关药物设计、改进采用相同方法以发明新型药物提出了专利要求。

进一步地，所述方法还包括步骤S04、根据所述步骤S03得出的涉及蛋白异构化激活机制的临床药物靶向结构信息，利用胆固醇分子和临床药物分子在蛋白结构上计算锚定分析，并比较在不同蛋白结构模型上两种分子的锚定姿态、位置和药物分子的药理学关系，得出更符合利于发挥临床药物作用的分子姿态和相应锚定位置。

从上述描述可知，本发明的有益效果在于：在实际得到了在配体刺激下γ-氨基丁酸受体在细胞膜上存在两种蛋白的构象，一种在细胞膜上类似已报导的由同一β3亚基组成的人γ-氨基丁酸A型受体紧凑晶体模型。另一种是较前面紧凑结构更为开放的受体构象。为了进一步验证这些结构，采用胆固醇分子和临床药物分子在上述两种蛋白结构上的计算锚定分析。比较在紧凑和不同扩张蛋白结构模型上两种分子的锚定姿态、位置和相关药物分子的药理学关系，得出相对于紧凑模型，在磷脂膜上存在的扩张模型更适合调节分子的锚定，符合其发挥作用应该采纳的分子姿态和相应锚定位置。这也是从另一个角度验证我们前面的实验和计算生物学方法得出的受体蛋白结构合理性的技术手段；提供了当今根据已报导靶向受体晶体进行药物设计需要考量的实际靶向结构在细胞膜上与晶体结构上的差异。最后在以上多角度实验、拟合、验证的过程中确定这种扩张的靶向位点(如在GABA刺激下β3、α1亚基间隙扩展了

)。

本发明还包括上述系统在神经药物或辅助药物的设计或制备中的应用。

从上述描述可知，本发明的有益效果在于：该体系用于得到重要的蛋白构象、药物作用靶点位置精细变化的结构信息；是探索门控神经离子通道蛋白激活异构化机制，揭示神经药物靶向重要神经门控离子通道的机制的一个新的技术体系，体现了实验测量、计算验证和相关领域进展信息的整合、创新。该体系适用于针对神经药物作用的重要门控离子通道五聚体靶受体，尤其是由不同亚基组成有神经药物特异性作用的受体的结构研究。本发明系统可用于对麻醉药物作用γ-氨基丁酸受体靶点的体外直接验证方法，提供了药物靶向机制中重要的蛋白靶向部位的接近实际活性状态的结构信息，这也是可以作为一种研究其它类似神经药物作用分子机理、辅助药物设计的技术体系。

附图说明

图1为现有技术中五聚体神经介质激活的门控离子通道的结构示意图；

图2A为人γ-氨基丁酸A型受体GABA_AR(α1)₂(β3)₃结构侧视图；B为从俯视角度演示猜想需要实验验证的由β3和α1亚基组成的GABA_AR的亚基数量构成和排列；C为电子自旋标记MTSL(S-(1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-2,5-dihydro-1H-pyrrol-3-yl)methylmethanesulfonothioate)的结构示意图；D从左到右分别为HEK293细胞表达的受体从细胞膜上溶解到缓冲液中的SDS-PAGE图及纯化后的受体的SDS-PAGE、α1亚基和β3亚基WesternBlot验证结果图。E为用可控、分步稀释法体外重组纯化的抗体到细胞膜上的技术路线图；F为分别在纯化蛋白洗脱溶液中和重组到脂质体上的蛋白的SDS-PAGE图；

图3A为楔子“wedge in”作用机制示意图：GABA_AR的胞外区结合配体通过胞外区、穿膜区铰链结构扩展β3/α1亚基穿膜区间隙的R-etomidate靶向部位；B为配体激活受体穿膜区的变化过程示意图；

图4为本发明实施例的人源全序列γ-氨基丁酸受体的临床麻醉药物R-etomidate作用靶点的精微结构研究流程示意图；

图5A为室温下相应的自旋标记MTSL的CW EPR(continuous wave ElectronicParamagnetic Resonance)图；B、C分别是脉冲磁场下，在配体γ-氨基丁酸刺激下(+GABA)和没有配体刺激下(APO)GABA_AR(α1)₂(β3)₃自旋标记的spin echo(V_(t))随着时间的衰减信号示意图；B、C图中的子图为根据Tikhonov regularization计算出的距离的分步；D为高斯分布解析Tikhonov regularization计算出的分别有GABA和没有GABA(APO)自旋标记的距离分布图；E为根据五聚体的五边形对称结构示意图；

图6A为通过自旋标记MTSL的旋转子分析(rotamer analysis)直观示意图；B为自旋标记MTSL在各GABA_AR(α1)₂(β3)₃模型上的距离与距离分布概率关系图；C为自旋标记MTSL在β3GABA_AR/4COF为模板的模型上的分布与距离分布概率关系图；D为现有技术中报的导β3homopentamer GABA_AR(pdb#,4COF)晶体结构；

图7A为对4COF模型以受体的纵向中心对称轴向外放射性平行移动每个亚基的过程示意图；B为在一系列扩展模型上进行旋转体异构分析；

图8A为扩张模型上MTSL间的距离与距离分布概率曲线关系图；B为随β3(M286)和α1(A291)增加距离(Δ_βα)与长、短距离峰组占总分布比例的曲线关系图；C为不同蛋白构象：紧密型类晶体结构和扩展型开放结构的数据分析与相应的结构模型；

图9A为胆固醇分子在GABA_AR(α1)₂(β3)₃(4COF模型)上的锚定姿态俯视图；B为在4COF模型亚基间扩张

的锚定姿态示意图；C为B图翻转90°后的分子侧视图；D为胆固醇分子锚定的局部放大；E为D图水平旋转90°后的示意图；

图10A为R-etomidate分子结构示意图；B为三维显示在各系列扩展模型上，每个模型上锚定的R-etomidate分子的苯环顶端碳原子和受体离子通道壁上的Asn265的β碳原子空间位移的分布；C为各模型上锚定的R-etomidate的苯环碳顶端原子和Asn265的β碳原子的距离统计学分布图；D至G为在各个结构模型上R-etomidate分子锚定姿态示意图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。

本发明最关键的构思在于：本发明针对现有技术中的缺陷设计了在磷脂膜环境中用脉冲电子顺磁共振技术(pulsed EPR or DEER)测量临床麻醉药物R-etomidate在GABA_AR穿膜区的主要作用靶点上自旋标记的距离分布，建立了一种研究典型药物作用于神经离子通道穿膜区的靶向结构的模型。本发明所要解决的第一个核心问题是自旋标记的距离分布值和受体晶体结构尺寸的不匹配，这也是目前DEER应用测量蛋白的构象常常会遇到的一个问题。通过建立不同的GABA_AR(α1)₂/(β3)₃结构模型，通过将在受体模型上的自旋标记的Rotamer Analysis和实验数据的比对，筛选出代表这个异型亚基组成的受体的最佳晶体结构模型，也建立了自选标记构象和蛋白结构的紧密联系，这样DEER产生的距离不再是一个难以定量解释、仅仅是说明蛋白构象变化的定性指标，反而是根据找到的晶体匹配模型，进一步发掘蛋白在磷脂膜上有药理学功能构象的标尺。本发明解决的第二个核心问题是利用分子操作和旋转异构体分析(Rotamer Analysis)，通过长、短距离分布的相互比例变化和亚基间隙打开的量化关系，找出拐点，作为拟合实验数据，建立蛋白在R-etomidate靶点结构变化的关键量化指标(ΔC_βα)。作为神经离子通道是神经药物的主要靶受体，磷脂分子在亚基穿膜区间隙有重要的存在并执行调控功能，本发明利用计算锚定分析验证得到的蛋白构象模型，而且，也验证了从分子操作、拟合拿到的ΔC_βα。现有的配体激活的五聚体神经门控离子通道的激活机制都涉及通道的打开，受体穿膜区的向外伸展(至少是跨膜区的上半部，也是麻醉药物的靶向部位)；在现在很多受体和特异药物不能共结晶的情况下，本发明方案提供了在研究、论证药物靶点精微结构方面的完整方案，为以后通过研究穿膜区亚基间隙变化、解析门控离子通道受体激活机制，和辅助药物设计，打开了一条技术之路。

本发明实施例一为：一种用于解析复杂多聚体蛋白受体的脉冲电子顺磁共振数据的系统在人源全序列γ-氨基丁酸受体的临床麻醉药物R-etomidate作用靶点的精微结构研究中的应用，如图3所示。

准备待测蛋白样品测量CW EPR(continuous wave Electronic ParamagneticResonance)和pulsed EPR(pulsed Electronic Paramagnetic Resonance/Doubleelectron-electron resonance DEER)图谱。最后的样品被浓缩到80μl，将3-5μl的样品上样到玻璃毛细管(0.6mm ID*0.84mm OD round capillary,Vitrocom,Mountain Lakes,NJ)，该样品用于测量CW EPR spectroscopy。将10-15μL的样品上样到石英毛细管中(2.0mmID x 2.4mm OD)，并在干冰/异丙醇浴中快速冷冻。

CW EPR图谱反应自旋标记在蛋白相应部位的动力学和环境性质信息，测量是在X-band Bruker EMX spectrometer上，用ER123D介质谐振器(dielectric resonator,BrukerBiospin,Billerica,MA)测量，调谐幅度(Modulation amplitude)是1高斯(Gauss)；伴随微波能量(incident microwave power)是2mW；脉冲电子顺磁共振DEER spectroscopy则是在Bruker Elexsys E580spectrometer上用EN5107D2介质谐振器和一个9W的Q-band solid-state放大器(amplifier)测量。DEER测量采用的是four-pulse DEER；温度是80K，πpumppulse设定为32纳秒，频率则选在nitroxide最大吸收频率上；π/2andπobserve pulses分别设定为16和32纳秒，比pump脉冲设定低了17-20MHz。以上完成了第一个收集电子脉冲共振信号的实验模块；

模块二，处理上述实验得到的人γ-氨基丁酸A型受体GABA_AR(α1)₂/(β3)₃在自然配体(γ-氨基丁酸,GABA)刺激下的自旋标记在受体蛋白上的距离分布信息。利用现有受体同源蛋白结晶结构进行同源建模，并结合自选标记在这些模型上的旋转子分析(RotamerAnalysis)甄别出最佳的GABA_AR(α1)₂/(β3)₃结构模型。具体为DEER测得的偶极演化(dipolar evolution)数据通过程序包DEERAnalysis2013(Jeschke et al，2006)通过Tikhonov regularization(Jack H.Freed,J Magn Reson.2005)得出除去背景参数影响后的自旋标记相互距离分布，由于数据处理中存在的变化，每个数据点给出了最佳拟合和15％的方均根差(RMSD)(如图5所示，在配体γ-氨基丁酸(GABA)的作用前后，脉冲电子顺磁共振实验测量GABA_AR(α1)₂(β3)₃上自旋标记“MTSL”在β3M286C上的距离分布：在配体γ-氨基丁酸(GABA)的作用前后，脉冲电子顺磁共振实验测量GABA_AR(α1)₂(β3)₃上自旋标记“MTSL”在β3M286C上的距离分布。图5A为室温下相应的自旋标记MTSL的CW EPR(continuouswave Electronic Paramagnetic Resonance)。深色线条是实际测量得到的图谱，浅色的是计算分析拟合，图谱可以分解成两部分，移动组分(m)和不移动组分(i)，微量的尖锐移动组分代表可能的错误折叠蛋白，因其量微少、不予考虑。宽不移动组分对应的自旋标记correlation time约为10ns，这和处在磷脂分子头部和细胞膜中间疏水部分交界处的位置特点一致，这也是β3M286C应该处在的位置，CW EPR图谱证明了这一点。图5B和C分别是脉冲磁场下，在配体γ-氨基丁酸刺激下(+GABA)和没有配体刺激下(APO)GABA_AR(α1)₂(β3)₃自旋标记的spin echo(V_(t))随着时间的衰减信号；图5B和C图中的小图是根据Tikhonovregularization计算出的距离的分布，每个距离的分布值有一定的波动，这个波动的范围由虚线表示。实线代表分布距离的平均值，其中C图APO状态下距离的分布较为复杂，这是因为在没有GABA的刺激下，受体本身很多部位处于一种多态松散的状态，不能代表靶向药物作用位点有意义的状态。从图中显示的结果可以看出GABA加入前后受体R-etomidate靶向位点的构象变化，GABA刺激下的结构状态更有药理学意义。D为高斯分布解析Tikhonovregularization计算出的分别有GABA和没有GABA(APO)自旋标记的距离分布。由于APO状态下距离的分布较为复杂，不再讨论APO状态的距离分布。图5E为根据五聚体的五边形对称结构，间隔亚基和相邻亚基间的平均距离比为1.6左右，D中满足这一比例的平均距离可以分为两组，长距离分组(平均值：

)和短距离分组(平均值：

)。但是这两组距离值都和同源GLIC五聚体受体在同源位置上氨基酸残基β碳原子间测量的距离有较大同(见E右侧附表))。

对于得出的距离分布数据，在最佳拟合的分布中进行了高斯解析分析(Gaussiandeconvolution analysis)，将图谱分解成对称的4个高斯峰。在最为可能的GABA_AR(α1)2/(β3)3空间排列中(图1B)，根据五聚体离子通道近似轴对称等五边形几何结构(俯视受体穿膜区)，非相邻β3亚基上MTSL的距离和相邻β3亚基上的MTSL的距离比值应该接近～1.6。因此，可以将上述解析的4个峰分为两组，每组峰

的平均距离比值符合～1.6(图5E)。通过比较同源蛋白GLIC晶体结构在M286同源位置上的氨基酸残基β碳原子的距离可以看到得到的距离和测量的距离分布相差较大(图5E右)，因此，需要进一步探求这两组距离峰是代表同一受体蛋白上存在不同自旋标记MTSL的构象还是这两组峰分别代表了不同的蛋白构象结构。

为进一步分析结果，需要建立蛋白结构和R-etomidate靶向位点β3M286C上二硫键交联的自旋标记MTSL的构象之间的关系。现在已经普遍接受MTSL分子，它可以绕每个化学键旋转(如图6A所示)和周围的蛋白微环境产生相互作用。利用MTSL自旋标记旋转子结构库(rotamer library)和它们在各种可能受体结构上的模拟分布分析，并和实验数据比较，是目前筛选出最可能接近天然人γ-氨基丁酸A型受体GABA_AR，(α1)₂/(β3)₃的结构模型最可行的方法。

以线虫(C.elegans)的GluCl受体(氨基酸序列如SeqNo.9所示)，上述序列为满足蛋白结晶条件，将N端的第1～20个氨基酸残基的信号肽和第21～61个残基部分移去，蛋白的编码序列起始于SDS，受体在细胞内的M3-M4loop共计58个残基(第364～421个氨基酸)被移去，取而代之的是三个残基AGT，这样净少了55个残基，再者，C端的六个氨基酸被八个组氨酸代替后，作为模板；因此，调整后的建模模板氨基酸序列如SeqNo10所示。建模过程中GABA_AR的α1、β3亚基序列也同样把胞内的M3-M4 loop序列移去以简化。另外考虑到两种受体的序列较高的同源性：在穿膜区部位将α1的310FTK、β3的305IFF和GluCl IAN排列配对；在α1、β3的M4螺旋的最后26个残基高度保守，α1的383KKT和β3 414IPD与GluCl TEW排列配对，每个亚基对应在上述配对序列区间的序列被移去，用“AGT”代替，保持和GluCl结构、序列的同源性，α1亚基建模序列如SeqNo.11所示，β3亚基建模序列如SeqNo.12所示。根据以已发表的GluCl晶体结构为模板进行人γ-氨基丁酸A型受体GABA_AR(α1)₂/(β3)₃结构建模：Apostructure(pdb#4TNV)；“开放的”Ivermectin-结合的结构(pdb#3RHW)；POPC结合的结构(pdb#4NTW)，参考文献(Althoff et al.,2014；Hibbs和Gouaux,2011)。用

Maestro软件包进行建模、结构优化，其中进行了对蛋白结构进行了Prime操作(VSGB)，在穿膜区部分根据ASL在穿膜区螺旋部分设置了Implicit Membrane环境。建模质量统计如下表1所示，衡量指标为Ramachandran参数：

表1建模质量统计表

以β3homopentamer GABA_AR晶体学结构为模板(如SeqNo.13所示，在这个受体的配体结合部位结合有benzamidine，所以受体被认为处在激活后的失敏状态(desensitizedstate)。同样为了结晶，结晶蛋白序列N端的25个残基的信号肽被截去，取而代之的是monoVenus tag，序列起始为ETGQSV。胞内的M3-M4 loop序列被移去，一共114个残基，替代的是(SQPARAAA)。在C端加入了一个自牛rhodopsin衍生而来的九个氨基酸序列“TETSQVAPA”以方便用1D4抗体纯化。对GABA_AR(α1)₂/(β3)₃建模，模板采用已发表的人β3同源五聚体GABA_AR晶体结构(pdb#4COF,Miller and Aricescu,2014)。蛋白的建模程序和相关参数的设定同上。

以细菌GLIC晶体(如SeqNo.14所示，除信号肽(第1～43个氨基酸)以外保持完整，蛋白编码从QDM开始)结构模型进行同源建模。建模模板是根据在pH4 and 7条件下结晶、分别处于开放、和关闭(或者失敏状态，desensitized)的GLIC蛋白晶体结构(Sauguet etal.,2013；Sauguet et al.,2014)。蛋白的建模程序和相关参数的设定同上。

对电子顺磁共振测量的数据进行有效的验证，往往需要筛选出可能的最接近受体天然构象结构的模型，作为计算、结构分析的基础。所以计算自旋标记“MTSL”在以上各种GABA_AR(α1)₂/(β3)₃结构模型上的旋转构象分析(Rotamer Analysis)、得到的距离分布，并和DEER实验测得距离分布数据的比较。分析采用ETH Zurich开发的MMM程序而得。采用的旋转子构象库(Rotamer library)是R1_298K_warsh。

把以上根据不同的五聚体同源受体蛋白模板建立的各种GABA_AR(α1)₂/(β3)₃结构模型进行的自旋标记旋转子分布汇总(如图6所示，以不同GABA_AR同源受体蛋白晶体结构为模型蛋白建模和进行自旋标记MTSL的旋转子分析(rotamer analysis)，通过比较和脉冲电子顺磁共振测得距离数据的异同筛选GABA_AR(α1)₂(β3)₃的最佳蛋白结构模型。图6A为自旋标记MTSL的旋转子分析(rotamer analysis)：自旋标记MTSL自身分子形成键的转动而导致分子在蛋白上的分布是多向性的，而且受到所在受体蛋白环境的影响，所以有必要找到能代表研究受体的最佳蛋白结构模型。技术采用ETH Zurich的Rotamer Libraries和MMM程序在候选受体结构模型上进行旋转子分布模拟计算(rotamer analysis)，并与实验测量数据比较以找到最佳模型。图6B为以已经发表的晶体结构为模板进行蛋白建模，包括细菌GLIC蛋白的激活(pdb#,4HFI)和关闭构象(pdb#,4NPQ)，线虫谷氨酸受体未激活结构(pdb#,4TNV)和β3homopentamer GABA_AR(pdb#,4COF)。用A的方法在上述模型上的R-etomidate主要靶向位点(β3Met286)进行旋转子分布模拟分析，可以看出所有的自旋子分布都和实验的长距离数据分布重叠，这其中以GABA_AR(4COF)模型上的分布相互吻合度最好，如图6C所示。显而易见，除计算和试验的相互拟合以外，“4COF模型”上，相应部位的蛋白骨架上的β碳原子间的距离分别用黑色三角表示，都小于测量的长距离峰，这说明MTSL主要基团伸展到受体外部，这可能是由于晶体结构代表的是一种紧密型构象。而不能拟合的短距离分组则可能是一种MTSL呈现向内折叠的构象，代表了一种更为开放的受体结构。图6D为已报导β3homopentamer GABA_AR(pdb#,4COF)晶体结构，它的胞外区有很多糖基化位点，与图2D中所示的细胞工程表达的GABA_AR(α1)₂(β3)₃电泳、免疫检测一致)。旋转子分析体现的规律是所有的旋转子构象分布产生的距离分布都集中在实验数据解析后的长距离分组(平均距离是

)，短距离分组几乎看不到任何分布存在。另外，在以关闭状态的GLIC(pdb#,4NPQ)、失敏的GLIC(4HFI,Desensitized)、和Apo状态的GluCl(4TNV)为模板构建的GABA_AR模型上得到的距离分布都不如在以β3homopentamer GABA_AR(pdb#4COF)为模板建立模型得到的距离分布更符合实际实验测量得到的长距离分布(图6C)。而且我们发现在这个结构模型上相应的β3M286C位置上测量的间隔/相邻亚基间氨基酸残基β碳原子的平均距离

分别比实验测量的自旋标记间的平均距离分别短

和

由于自选标记MTSL本身的几何尺寸大约是

我们确定长距离分组代表的自旋标记本身在现有的类晶体结构上处于一种向受体外侧舒展的状态。而呈现短距离分布的旋转子则应该处于一种相向折叠的构象分布，它在现有结构上不存在很可能是因为晶体结构紧凑，体积相对较大的基团受到β3⁺α^-的穿膜区间的各种作用力阻碍不能穿入到受体的内部。

模块三，是通过分子操作技术微观调整现有最佳蛋白结构模型，通过自选标记旋转子的分布比较，得出实验数据代表的蛋白构象结构信息。

在现有基于纯合β3五聚体GABA_AR晶体结构的GABA_AR(α1)₂(β3)₃同源模型上，将各亚基以受体纵向对称轴(Z)为参照，放射状平行拉开不同的微小距离，以此来扩展穿膜区亚基间的距离，然后在此结构上做自旋标记在β3286M位点的距离分布的计算，并和实验所得数据进行比较(如图7A所示，对“4COF模型”进行分子操作，以受体的纵向中心对称轴向外放射性平行移动每个亚基，增加β3/α1亚基间的β碳原子间距离C_βα，量化标准由ΔC_βα来衡量，同图3)。球体代表了自旋标记的分布概率，通过两个圆用来辅助视觉的比较。这从定性的层面论证了MTSL较短距离和开放结构之间的关系。为了更方便量化操作，以相邻β3、α1亚基间在β3M286C和α1A291之间β碳原子之间的距离变化ΔC_βα衡量亚基间物理空间的变化(如图3和图7A所示)。沿此操作，逐步扩展原以纯合β3五聚体GABA_AR晶体结构构建的GABA_AR(α1)₂(β3)₃同源模型，ΔC_βα分别为0.42、0.53、0.63、0.74、0.84、1.27、

这些操作可以利用软件Visual Molecular Dynamics(VMD)实现。

为了验证我们提出的实验测出的短距离分布代表一种结构趋于扩张的蛋白模型，我们在上述一系列模型上进行rotamer analysis,从计算出的自选标记的分布趋势和蛋白扩张移动距离的关系上定性甄别以上观点。可以从(如图7B所示，在一系列扩展模型上进行Rotamer Analysis，可以看到随着亚基穿膜区亚基间隙的逐步开放，自旋标记MTSL分布逐渐向受体内部迁移(小球代表MTSL自旋标记的分布概率))看出自旋标记在系列扩张受体模型上随穿膜区β⁺α^-的扩展，其分布逐渐向受体内部迁移，并逐渐接近通道壁，所以可以得出非常清晰的结论,蛋白在自旋标记位点即R-etomidate靶向的β3⁺α1^-间隙紧凑相邻时自旋标记倾向在受体和周围磷脂膜分子的交界处分布，而当亚基相邻空间打开时，自旋标记的rotamer更倾向迁移分布到蛋白受体靠近离子通道的内部。

为了定量研究蛋白结构扩张和自旋标记内迁分布的关联，进而找出最佳拟合实验数据的蛋白结构模型以测量γ-氨基丁酸刺激下R-etomidate靶向穿膜区位点的精确结构变化，针对每一个扩展模型，我们将相应的自旋标记的分布分解成对应实验测量的长距离和短距离分组，分别积分实验长、短距离分布峰高的一半对应的距离坐标和分布曲线围成的面积，并和总面积相比标准化，作为模拟计算长短距离分组的组成(图8A量化分析扩展模型上自旋标记上的分布，构建实验数据代表的蛋白结构。图8A在以“4COF模型”为原始模型的系列扩张结构上进行Rotamer Analysis,将计算的距离分布和实验所得一起比较。ΔC_βα分别为0、0.53、0.63、0.84、1.7、2.1、

)。这种界定方法可以覆盖～90％的rotamer分布。在图8B显示了随β3(M286)和α1(A291)距离(ΔC_βα)的增加每个扩展模型上自旋标记在长、短距离分组上相互比例的变化趋势，可以看到这个趋势变化上有两个拐点，ΔC_βα分别为

和

在ΔC_βα比较小

的初始阶段，短距离变化不明显，但长距离组分比例下降很明显。当ΔC_βα扩展到

时，长短距离分组比例相似(比例均在～40％)，这一趋势基本保持稳定直至

在这一距离短距离分组明显高于长距离，而后虽然ΔC_βα进一步增大，但两者的比例关系基本不变。图8C中展示了两个拐点代表了不同的蛋白构象：在

时，此时长、短距离分组的比例相似，而后这个比例存在一段平台期，说明在同一受体上同时存在两组构象的自旋标记，一组向受体外伸出，一组向受体内靠近；即使用微量调整亚基间的彼此角度来模拟受体的不对称激活，也不能改善实际的分布(下方左边为数据分析，右边为单一构象模型)。在

时，短距离的分布显著高于长距离分布，而且这种分布随着进一步扩增稳定下来。在这个拐点代表的扩展模型很好地拟合了实验地短距离分布数据，此时代表了细胞膜上分别存在两种受体构象：紧密型类晶体结构和扩展型开放结构(上方左边为数据分析，右方为双构象平衡存在模型)。总之，

或者

代表了在细胞膜上，配体GABA的刺激下受体的构象比晶体结构更为开放。

根据上面的量化分析结果，可以在两个长短距离相互变化关系上找到两个拐点，一个是

另一个是

前者在结构模型上可以看出在β3⁺α^-亚基间隙打开幅度为

时，在同一蛋白结构上自旋标记可以同时存在两种构象：向外扩展型和向内插入型(图8C下部)。但是从实际的分布可以看到这种扩展后的模型上的自旋标记距离分布和实际测量的数据差异明显，尤其是较长距离分布上不能相互重叠(

和

)。对于另一个拐点

时，可以看到同时存在两个分布模型，一个是类似β3homopentamer GABA_AR晶体结构的紧凑模型，自旋选标记主要伸展到受体外部。另一个开放的结构模型，受体充分扩展后自旋标记伸向受体内部，此时主要呈现的是短距离分布，从视觉上很容易判断，它的分布和实验得到的短距离分布拟合度好(如图8C上部)。作为这一扩展模型的支持证据，在用电子显微镜观察、测量的Torpedo nAChR(一种海洋鱼类的乙酰胆碱受体，GABA_AR的同源蛋白)膜上结构，在β3M286C同源位置测得的间隔亚基间的β碳原子间的距离

和扩展后的结构模型

上相应的距离

相近。

模块四：定量确定穿膜区临床麻醉药物R-etomidate作用靶点在配体(γ-氨基丁酸)作用下的空间结构变量，并根据这种量化参数，检验对γ-氨基丁酸A型受体有重要调节作用的磷脂分子和靶向麻醉药物的锚定状态和其功能对应的关系。

在异源亚基组成的神经离子通道受体的激活过程中，根据结构、位置方面的比较，不同的亚基的位置分布是略不对称的，这可能涉及亚基顺序旋转激活离子通道的机制。我们可以通过分子操作改变亚基间的距离，也可以尝试改变特定亚基间的旋转角度，拉近某些亚基间的距离来比较它对自旋标记分布带来的影响，这一功能我们可以通过ChimeraUCSF实现。譬如，在

时，计算的拟合分布和实验在距离存在显著不能重叠的部分。为了改进拟合，如图8C所示，把一个β3亚基逆时针旋转0.8°，把两个α1亚基顺时针旋转1.3°(旋转角度根据大量尝试而得)，可以看到，在

的距离范围上，调整后的长距离分组里的间隔亚基间的距离峰和实验所得峰的重叠比例增加，但是计算分布和实验结果依然有较大差距。而且，在

距离上计算拟合得到的额外距离分布依然存在(图8C下方)。所以，综合前述结果得出的结论是γ-氨基丁酸刺激下，主要呈现的是GABA_AR(α1)₂/(β3)₃亚基间距离扩张的结构变化，亚基间相对角度旋转的作用不显著。实验、计算拟合的结果表明，此时的受体可能存在两种状态平衡，相对于紧凑的类似结晶状态的结构，新发现的状态是在R-etomidate做用的靶向部位β3M286所处的β3+α-亚基间隙更加开放，如果客观定量化这种空间差异，它的范围应该界定于

且

和实验数据拟合最好。

支持上面的扩张模型一方面是因为我们测量的受体是锚定在磷脂双层膜上，可以找到相似大小的乙酰胆碱受体的电镜负染照片佐证。为提高多角度证明实验和计算模拟得到的结果的可靠性。选取了两个重要的γ-氨基丁酸A型受体的作用分子通过计算机锚定实验比较它们的锚定姿态的合理性。第一个是胆固醇分子，胆固醇作为细胞膜上的重要组分，对GABA_AR有结构支持、活性调节很重要。电镜负染显像的天然细胞膜上的Torpedo nAChR乙酰胆碱受体，在各亚基间隙中嵌入了胆固醇分子；在GABA_AR(α1)₂(β3)₂γ2上的胆固醇锚定分子动力学实验表明，如果没有胆固醇分子，在我们研究的R-etomidate的类似亚基间隙部位会出现塌陷，导致分子的不稳定。对比胆固醇在紧凑原始晶体结构模型和扩展的结构模型上的锚定姿态发现，胆固醇分子的分子模型准备通过Maestro程序实现,锚定的部位通过选取R-etomidate靶向部位的β3N265,M286&V290,α1L232&M236，也参考了Brannigan(Heninet al.,2014)的胆固醇锚定分子动力学研究所选取的相关残基。锚定计算是通过Maestro里面软件包Glide实现。

如图9所示，胆固醇分子(Cholesterol)在GABA_AR(4COF模型)和扩展模型上的锚定(docking)比较-验证得到的扩展受体结构模型。A为从俯视角度观察胆固醇分子在GABA_AR(α1)₂(β3)₃(4COF模型)上的锚定姿态。相邻的两个亚基β3、α1分别用深色线条和浅色代表，为了方便其它的亚基被隐去。每个亚基的四个跨膜螺旋按位置分别为M1、M2、M3、M4，其中M2是围成离子通道壁的螺旋，上面的虚线圆代表离子通道。胆固醇分子的轮廓用网状勾勒，锚定结果表明这是唯一得到的分子姿态，它处于β3的M3、α1的M1的外围，没有和蛋白的具体接触。B为在4COF模型亚基间扩张

的锚定姿态。图示标识同上。以其中一个典型姿态为例，从俯视角度胆固醇分子主要介入β3的M3、α1的M1之间，象“楔子”楔入道亚基之间。C图为B图翻转90°后的分子侧视图：胆固醇分子以较为伸展的构象近似竖直的嵌入β3、α1的间隙。D图为胆固醇分子锚定的局部放大；E图为D图水平旋转90°后可以看到分子上部(胆固醇的羟基部分)朝上，并向内倾斜嵌入亚基间)。胆固醇在紧凑原始晶体结构模型和扩展的结构模型上的锚定姿态比较可以看出，在紧凑的原始晶体结构模型上，胆固醇分子只有一种锚定的姿态，只能贴附于受体的β3的跨膜M3螺旋和α1的M1螺旋的外部和磷脂层交界的部位，不存在可靠的分子作用状态；在扩张型的受体模型上，可以看到胆固醇分子采取了以舒展并有些倾斜的多个类似姿态深入到β3和α1亚基间隙，其锚定姿态的集合和在GABA_AR(α1)₂(β3)₂γ2模型上进行分子动力学模拟得到的锚定姿态集合类似(Brannigan G.,Biophysical Journal,2014 1938–1949)。更重要的是这些证据都支持门控离子通道激活的“楔入(wedge in)”理论(Hibbs,R.E.,and E.Gouaux.Nature.2011 474:54–60)(另参考图3)。

R-etomidate靶向锚定在GABA_AR(α1)₂(β3)₃上，正确的药物分子锚定姿态应该具有两个特点：1.羧基团应该位于β+α-靠近受体和外界脂膜交界处，接近β3M286,和α1Met236(Etomidate作用靶点)；2.Etomidate的苯环应该某种程度上和β3Asn265(M2，离子通道壁)接近，达到分子相互作用、能量的平衡。R-etomidate模型的准备和锚定的程序、步骤同前文所述。锚定的靶蛋白是原始晶体结构模型和在此基础上一系列扩张模型：ΔC_βα的值分别为

实验中不仅比较R-etomidate在上述模型上β+α-的分子锚定姿态，同时也比计算R-etomidate苯环顶端碳原子和位于受体离子通道壁上β3亚基M2 helix的265Asnβ碳原子之间的距离，作为比较不同空间大小对锚定姿态影响的量化指标。

和胆固醇分子的锚定姿态类似，在原始晶体模型和有限扩张模型

上，R-etomidate分子只能“贴附”在受体亚基穿膜区β3M3螺旋和α1M1螺旋靠近磷脂层的外侧(如图10所示，R-etomidate在GABA_AR(4COF模型)和扩展模型上的锚定(docking)比较-验证得到的扩展受体结构模型。A.R-etomidate分子结构，苯环顶端的实心圆部分代表分子苯环端的碳原子，根据R-etomidate药物活性和结构的关系，应该朝向受体内部。B.三维显示在各系列扩展模型上，每个模型上锚定的R-etomidate分子的苯环顶端碳原子和受体离子通道壁上的Asn265的β碳原子空间位移的分布：锚定的扩展模型分别是

和起始的以4COF为模板模型。C.各模型上锚定的R-etomidate的苯环碳顶端原子和Asn265的β碳原子的距离统计学比较。所在锚定模型与图B一致。根据统计学差异可以看出紧凑型结构

锚定R-etomidate的苯环顶端碳原子比扩展的结构模型

上距离Asn265的β碳原子(也即离子通道壁位置)更远，并且差异显著。D-G.在各个结构模型上R-etomidate分子锚定姿态的集合，比较它们相对于受体的锚定位置的不同。图中的球状分子为Asn265的立体模型。结合C数据比较，在扩展模型

上R-etomidate分子更能“楔入”受体亚基间隙到达受体内部，更符合靶向药物的“楔入(Wedge in)”辅助胞外区配体通过异构化打开离子通道(如图3所示))；在我们观测到长短距离分组比例出现拐点的ΔC_βα值为0.84或者

所对应的受体扩展结构上，R-etomidate的锚定状态开始向β⁺α^-间隙内测深入，视觉上药物分子能和β3Asn265有更广泛的分子靠近机会(图10D-G)。进一步统计学比较不同结构平台上β3Asn265的β碳原子和锚定R-etomidate苯环顶端的碳原子的距离：对于较紧凑的(ΔC_βα＝0或

)和较扩张(ΔC_βα＝0.84或

)的两类结构模型,两种结构分组内的距离不存在统计学上显著差异，而组间的距离差异显著，后者的距离较前者明显更接近(如图10B、C)，说明只有受体的R-tomidate靶向部位(β⁺α^-)足够开放时，R-etomidate才有足够的空间采取苯环端向内、羧基端向外的合理锚定姿态。其它类似R-etomidate新型药物的研发都把分子改造部位集中在羧基端，这也从药理学上说明了R-etomidate的分子锚定姿态需要苯环端深入到受体亚基间隙较深的部位利于可靠锚定，在羧基端的改造避免了对苯环在受体内部合理锚定的影响，使得麻醉药物的活性不被改变(相关药物不是本专利的核心内容，不被提及)。总结两种分子的锚定结果，可以得到在γ-氨基丁酸(GABA)的刺激下，GABA_AR(α1)₂/(β3)₃在磷脂膜上存在两种结构模型，一种类似β3homopentamer GABA_AR晶体紧凑型结构，另一种是较为开放的扩展型受体结构，后者有利于麻醉药物R-etomdate的靶向结合，也同时利于调节性脂类分子胆固醇的锚定在穿膜区，比较前者，后者在β3⁺α1^-亚基间隙R-etomidate靶向部位扩展幅度为

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 五邑大学

<120> 一种用于解析复杂多聚体蛋白受体的脉冲电子顺磁共振数据的系统及方法与应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 456

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Arg Lys Ser Pro Gly Leu Ser Asp Cys Leu Trp Ala Trp Ile Leu

1 5 10 15

Leu Leu Ser Thr Leu Thr Gly Arg Ser Tyr Gly Gln Pro Ser Leu Gln

20 25 30

Asp Glu Leu Lys Asp Asn Thr Thr Val Phe Thr Arg Ile Leu Asp Arg

35 40 45

Leu Leu Asp Gly Tyr Asp Asn Arg Leu Arg Pro Gly Leu Gly Glu Arg

50 55 60

Val Thr Glu Val Lys Thr Asp Ile Phe Val Thr Ser Phe Gly Pro Val

65 70 75 80

Ser Asp His Asp Met Glu Tyr Thr Ile Asp Val Phe Phe Arg Gln Ser

85 90 95

Trp Lys Asp Glu Arg Leu Lys Phe Lys Gly Pro Met Thr Val Leu Arg

100 105 110

Leu Asn Asn Leu Met Ala Ser Lys Ile Trp Thr Pro Asp Thr Phe Phe

115 120 125

His Asn Gly Lys Lys Ser Val Ala His Asn Met Thr Met Pro Asn Lys

130 135 140

Leu Leu Arg Ile Thr Glu Asp Gly Thr Leu Leu Tyr Thr Met Arg Leu

145 150 155 160

Thr Val Arg Ala Glu Cys Pro Met His Leu Glu Asp Phe Pro Met Asp

165 170 175

Ala His Ala Cys Pro Leu Lys Phe Gly Ser Tyr Ala Tyr Thr Arg Ala

180 185 190

Glu Val Val Tyr Glu Trp Thr Arg Glu Pro Ala Arg Ser Val Val Val

195 200 205

Ala Glu Asp Gly Ser Arg Leu Asn Gln Tyr Asp Leu Leu Gly Gln Thr

210 215 220

Val Asp Ser Gly Ile Val Gln Ser Ser Thr Gly Glu Tyr Val Val Met

225 230 235 240

Thr Thr His Phe His Leu Lys Arg Lys Ile Gly Tyr Phe Val Ile Gln

245 250 255

Thr Tyr Leu Pro Cys Ile Met Thr Val Ile Leu Ser Gln Val Ser Phe

260 265 270

Trp Leu Asn Arg Glu Ser Val Pro Ala Arg Thr Val Phe Gly Val Thr

275 280 285

Thr Val Leu Thr Met Thr Thr Leu Ser Ile Ser Ala Arg Asn Ser Leu

290 295 300

Pro Lys Val Ala Tyr Ala Thr Ala Met Asp Trp Phe Ile Ala Val Cys

305 310 315 320

Tyr Ala Phe Val Phe Ser Ala Leu Ile Glu Phe Ala Thr Val Asn Tyr

325 330 335

Phe Thr Lys Arg Gly Tyr Ala Trp Asp Gly Lys Ser Val Val Pro Glu

340 345 350

Lys Pro Lys Lys Val Lys Asp Pro Leu Ile Lys Lys Asn Asn Thr Tyr

355 360 365

Ala Pro Thr Ala Thr Ser Tyr Thr Pro Asn Leu Ala Arg Gly Asp Pro

370 375 380

Gly Leu Ala Thr Ile Ala Lys Ser Ala Thr Ile Glu Pro Lys Glu Val

385 390 395 400

Lys Pro Glu Thr Lys Pro Pro Glu Pro Lys Lys Thr Phe Asn Ser Val

405 410 415

Ser Lys Ile Asp Arg Leu Ser Arg Ile Ala Phe Pro Leu Leu Phe Gly

420 425 430

Ile Phe Asn Leu Val Tyr Trp Ala Thr Tyr Leu Asn Arg Glu Pro Gln

435 440 445

Leu Lys Ala Pro Thr Pro His Gln

450 455

<210> 2

<211> 1742

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

gtgaaatctt cagcaaagga gcacgcagag tccatgatgg ctcagaccaa gtgagtgaga 60

ggcagagcga ggacgcccct ctgctctggc gcgcccggac tcggactcgc agactcgcgc 120

tggctccagt ctctccacga ttctctctcc cagacttttc cccggtctta agagatcctg 180

tgtccagagg gggccttagc tgctccagcc cgcgatgagg aaaagtccag gtctgtctga 240

ctgtctttgg gcctggatcc tccttctgag cacactgact ggaagaagct atggacagcc 300

gtcattacaa gatgaactta aagacaatac cactgtcttc accaggattt tggacagact 360

cctagatggc tatgacaatc gcctgagacc aggattggga gagcgtgtaa ccgaagtgaa 420

gactgatatc ttcgtcacca gtttcggacc cgtttcagac catgatatgg aatatacaat 480

agatgtattt ttccgtcaaa gctggaagga tgaaaggtta aaatttaaag gacctatgac 540

agtcctccgg ttaaataacc taatggcaag taaaatccgg actccggaca catttttcca 600

caatggaaag aagtcagtgg cccacaacat gaccatgccc aacaaactcc tgcggatcac 660

agaggatggc accttgctgt acaccatgag gctgacagtg agagctgaat gtccgatgca 720

tttggaggac ttccctatgg atgcccatgc ttgcccacta aaatttggaa gttatgctta 780

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agaagatgga tcacgtctaa accagtatga ccttcttgga caaacagtag actctggaat 900

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gattggctac tttgttattc aaacatacct gccatgcata atgacagtga ttctctcaca 1020

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tgtgctcacc atgacaacat tgagcatcag tgccagaaac tccctcccta aggtggctta 1140

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tgagtttgcc acagtaaact atttcactaa gagaggttat gcatgggatg gcaaaagtgt 1260

ggttccagaa aagccaaaga aagtaaagga tcctcttatt aagaaaaaca acacttacgc 1320

tccaacagca accagctaca cccctaattt ggccaggggc gacccgggct tagccaccat 1380

tgctaaaagt gcaaccatag aacctaaaga ggtcaagccc gaaacaaaac caccagaacc 1440

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cactgggaat ttatttatgt tctcaacgca gtaattccca tctgccttta ttgcctctgt 1680

cttaaagaat ttgaaagttt ccttattttc ataattcatt taagacaaga gacccctgtc 1740

tg 1742

<210> 3

<211> 473

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Met Trp Gly Leu Ala Gly Gly Arg Leu Phe Gly Ile Phe Ser Ala Pro

1 5 10 15

Val Leu Val Ala Val Val Cys Cys Ala Gln Ser Val Asn Asp Pro Gly

20 25 30

Asn Met Ser Phe Val Lys Glu Thr Val Asp Lys Leu Leu Lys Gly Tyr

35 40 45

Asp Ile Arg Leu Arg Pro Asp Phe Gly Gly Pro Pro Val Cys Val Gly

50 55 60

Met Asn Ile Asp Ile Ala Ser Ile Asp Met Val Ser Glu Val Asn Met

65 70 75 80

Asp Tyr Thr Leu Thr Met Tyr Phe Gln Gln Tyr Trp Arg Asp Lys Arg

85 90 95

Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Leu Asn Leu Thr Leu Asp Asn Arg Val

100 105 110

Ala Asp Gln Leu Trp Val Pro Asp Thr Tyr Phe Leu Asn Asp Lys Lys

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Ser Phe Val His Gly Val Thr Val Lys Asn Arg Met Ile Arg Leu His

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Pro Asp Gly Thr Val Leu Tyr Gly Leu Arg Ile Thr Thr Thr Ala Ala

145 150 155 160

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Arg Asn Ile Gly Tyr Phe Ile Leu Gln Thr Tyr Met Pro Ser Ile Leu

245 250 255

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260 265 270

Ala Ala Arg Val Ala Leu Gly Ile Thr Thr Val Leu Thr Met Thr Thr

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Ile Asn Thr His Leu Arg Glu Thr Leu Pro Lys Ile Pro Tyr Val Lys

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Ala Ile Asp Met Tyr Leu Met Gly Cys Phe Val Phe Val Phe Leu Ala

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Leu Leu Glu Tyr Ala Phe Val Asn Tyr Ile Phe Phe Gly Arg Gly Pro

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Gln Arg Gln Lys Lys Leu Ala Glu Lys Thr Ala Lys Ala Lys Asn Asp

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Arg Ser Lys Ser Glu Ser Asn Arg Val Asp Ala His Gly Asn Ile Leu

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Leu Thr Ser Leu Glu Val His Asn Glu Met Asn Glu Val Ser Gly Gly

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Ile Gly Asp Thr Arg Asn Ser Ala Ile Ser Phe Asp Asn Ser Gly Ile

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Gln Tyr Arg Lys Gln Ser Met Pro Arg Glu Gly His Gly Arg Phe Leu

405 410 415

Gly Asp Arg Ser Leu Pro His Lys Lys Thr His Leu Arg Arg Arg Ser

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Ser Gln Leu Lys Ile Lys Ile Pro Asp Leu Thr Asp Val Asn Ala Ile

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Asp Arg Trp Ser Arg Ile Val Phe Pro Phe Thr Phe Ser Leu Phe Asn

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Leu Val Tyr Trp Leu Tyr Tyr Val Asn

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<212> DNA

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<400> 4

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tggacctcag gagatacccc ctggacgagc agaactgcac tctggaaatt gaaagctatg 600

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tgctgacaat gacaaccatc aacacccacc ttcgggagac cttgcccaaa atcccctatg 960

tcaaagccat tgacatgtac cttatgggct gcttcgtctt tgtgttcctg gcccttctgg 1020

agtatgcctt tgtcaactac attttctttg gaagaggccc tcaaaggcag aagaagcttg 1080

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ctcagcatat atat 1634

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<212> PRT

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Leu Thr Pro Gly Pro Thr Ser Gly Leu Ser Ala Ala Ala Thr Gly Ala

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Leu Ala Pro Ala Ile Gly Val Leu Pro Thr Leu Ile His Thr Ala Met

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Ile Ala Ile Pro Pro Ala Gly Thr Thr Thr Ala Ala Ala Leu Leu Pro

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Ala Ser Thr Ile Leu Val Leu Ala Leu Ala Ser Ala Met Val Gly Leu

130 135 140

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145 150 155 160

His Thr Ile Thr Thr Pro Ala Ala Met Leu Ala Ile Thr Ala Ala Gly

165 170 175

Ala Val Leu Thr Thr Leu Ala Leu Thr Ile Ala Ala Gly Cys Gly Leu

180 185 190

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Ser Ser Thr Gly Thr Pro Ala Gly Gly Ile Val Thr Gly Thr Leu Ala

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Ser Ser Val Gly Val Gly Ala Thr Ala Ser Thr Ala Leu Thr Gly Pro

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Ser Pro Val Gly Leu Ala Ala Thr Thr Gly Val Val Leu Thr Thr Ser

245 250 255

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275 280 285

Leu Ser Thr Val Ser Pro Thr Ile Ala Leu Ala Ala Val Pro Ala Ala

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Ile Ala Ala Leu Ser Leu Pro Leu Val Ser Thr Val Thr Ala Met Ala

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355 360 365

Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ile Ala Pro

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

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cctgacgctt tgatggtatc tgcaagcgtt tttgctgatc ttatctctgc cccctgaata 60

ttaattccct aatctggtag caatccatct ccccagtgaa ggacctacta gaggcaggtg 120

gggggagcca ccatcagatc atcaagcata agaataatac aaaggggagg gattcttctg 180

caaccaagag gcaagaggcg agagaaggaa aaaaaaaaaa aaagcgatga gttcaccaaa 240

tatatggagc acaggaagct cagtctactc gactcctgta ttttcacaga aaatgacggt 300

gtggattctg ctcctgctgt cgctctaccc tggcttcact agccagaaat ctgatgatga 360

ctatgaagat tatgcttcta acaaaacatg ggtcttgact ccaaaagttc ctgagggtga 420

tgtcactgtc atcttaaaca acctgctgga aggatatgac aataaacttc ggcctgatat 480

aggagtgaag ccaacgttaa ttcacacaga catgtatgtg aatagcattg gtccagtgaa 540

cgctatcaat atggaataca ctattgatat attttttgcg caaatgtggt atgacagacg 600

tttgaaattt aacagcacca ttaaagtcct ccgattgaac agcaacatgg tggggaaaat 660

ctggattcca gacactttct tcagaaattc caaaaaagct gatgcacact ggatcaccac 720

ccccaacagg atgctgagaa tttggaatga tggtcgagtg ctctactccc taaggttgac 780

aattgatgct gagtgccaat tacaattgca caattttcca atggatgaac actcctgccc 840

cttggagttc tccagttatg gctatccacg tgaagaaatt gtttatcaat ggaagcgaag 900

ttctgttgaa gtgggcgaca caagatcctg gaggctttat caattctcat ttgttggtct 960

aagaaatacc accgaagtag tgaagacaac ttccggagat tatgtggtca tgtctgtcta 1020

ctttgatctg agcagaagaa tgggatactt taccatccag acctatatcc cctgcacact 1080

cattgtcgtc ctatcctggg tgtctttctg gatcaataag gatgctgttc cagccagaac 1140

atctttaggt atcaccactg tcctgacaat gaccaccctc agcaccattg cccggaaatc 1200

gctccccaag gtctcctatg tcacagcgat ggatctcttt gtatctgttt gtttcatctt 1260

tgtcttctct gctctggtgg agtatggcac cttgcattat tttgtcagca accggaaacc 1320

aagcaaggac aaagataaaa agaagaaaaa ccctgcccct accattgata tccgcccaag 1380

atcagcaacc attcaaatga ataatgctac acaccttcaa gagagagatg aagagtacgg 1440

ctatgagtgt ctggacggca aggactgtgc cagttttttc tgctgttttg aagattgtcg 1500

aacaggagct tggagacatg ggaggataca tatccgcatt gccaaaatgg actcctatgc 1560

tcggatcttc ttccccactg ccttctgcct gtttaatctg gtctattggg tctcctacct 1620

ctacctgtga ggaggtatgg gttttactga tatggttctt attcactgag tctcatggag 1680

agatgtctgt tctaagtcca cttaaataat cctctatgtg gttgataagt atctgaatct 1740

gtttc 1745

<210> 7

<211> 464

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Met Lys Lys Ser Pro Gly Leu Ser Asp Tyr Leu Trp Ala Trp Thr Leu

1 5 10 15

Phe Leu Ser Thr Leu Thr Gly Arg Ser Tyr Gly Asp Tyr Lys Asp Asp

20 25 30

Asp Asp Lys Gln Pro Ser Leu Gln Asp Glu Leu Lys Asp Asn Thr Thr

35 40 45

Val Phe Thr Arg Ile Leu Asp Arg Leu Leu Asp Gly Tyr Asp Asn Arg

50 55 60

Leu Arg Pro Gly Leu Gly Glu Arg Val Thr Glu Val Lys Thr Asp Ile

65 70 75 80

Phe Val Thr Ser Phe Gly Pro Val Ser Asp His Asp Met Glu Tyr Thr

85 90 95

Ile Asp Val Phe Phe Arg Gln Ser Trp Lys Asp Glu Arg Leu Lys Phe

100 105 110

Lys Gly Pro Met Thr Val Leu Arg Leu Asn Asn Leu Met Ala Ser Lys

115 120 125

Ile Trp Thr Pro Asp Thr Phe Phe His Asn Gly Lys Lys Ser Val Ala

130 135 140

His Asn Met Thr Met Pro Asn Lys Leu Leu Arg Ile Thr Glu Asp Gly

145 150 155 160

Thr Leu Leu Tyr Thr Met Arg Leu Thr Val Arg Ala Glu Cys Pro Met

165 170 175

His Leu Glu Asp Phe Pro Met Asp Ala His Ala Cys Pro Leu Lys Phe

180 185 190

Gly Ser Tyr Ala Tyr Thr Arg Ala Glu Val Val Tyr Glu Trp Thr Arg

195 200 205

Glu Pro Ala Arg Ser Val Val Val Ala Glu Asp Gly Ser Arg Leu Asn

210 215 220

Gln Tyr Asp Leu Leu Gly Gln Thr Val Asp Ser Gly Ile Val Gln Ser

225 230 235 240

Ser Thr Gly Glu Tyr Val Val Met Thr Thr His Phe His Leu Lys Arg

245 250 255

Lys Ile Gly Tyr Phe Val Ile Gln Thr Tyr Leu Pro Ser Ile Met Thr

260 265 270

Val Ile Leu Ser Gln Val Ser Phe Trp Leu Asn Arg Glu Ser Val Pro

275 280 285

Ala Arg Thr Val Phe Gly Val Thr Thr Val Leu Thr Met Thr Thr Leu

290 295 300

Ser Ile Ser Ala Arg Asn Ser Leu Pro Lys Val Ala Tyr Ala Thr Ala

305 310 315 320

Met Asp Trp Phe Ile Ala Val Ser Tyr Ala Phe Val Phe Ser Ala Leu

325 330 335

Ile Glu Phe Ala Thr Val Asn Tyr Phe Thr Lys Arg Gly Tyr Ala Trp

340 345 350

Asp Gly Lys Ser Val Val Pro Glu Lys Pro Lys Lys Val Lys Asp Pro

355 360 365

Leu Ile Lys Lys Asn Asn Thr Tyr Ala Pro Thr Ala Thr Ser Tyr Thr

370 375 380

Pro Asn Leu Ala Arg Gly Asp Pro Gly Leu Ala Thr Ile Ala Lys Ser

385 390 395 400

Ala Thr Ile Glu Pro Lys Glu Val Lys Pro Glu Thr Lys Pro Pro Glu

405 410 415

Pro Lys Lys Thr Phe Asn Ser Val Ser Lys Ile Asp Arg Leu Ser Arg

420 425 430

Ile Ala Phe Pro Leu Leu Phe Gly Ile Phe Asn Leu Val Tyr Trp Ala

435 440 445

Thr Tyr Leu Asn Arg Glu Pro Gln Leu Lys Ala Pro Thr Pro His Gln

450 455 460

<210> 8

<211> 481

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Met Cys Ser Gly Leu Leu Glu Leu Leu Leu Pro Ile Trp Leu Ser Trp

1 5 10 15

Thr Leu Gly Thr Arg Gly Ser Glu Pro Arg Ser Val Asn Asp Tyr Lys

20 25 30

Asp Asp Asp Asp Lys Asp Pro Gly Asn Met Ser Phe Val Lys Glu Thr

35 40 45

Val Asp Lys Leu Leu Lys Gly Tyr Asp Ile Arg Leu Arg Pro Asp Phe

50 55 60

Gly Gly Pro Pro Val Ala Val Gly Met Asn Ile Asp Ile Ala Ser Ile

65 70 75 80

Asp Met Val Ser Glu Val Asn Met Asp Tyr Thr Leu Thr Met Tyr Phe

85 90 95

Gln Gln Tyr Trp Arg Asp Lys Arg Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Leu

100 105 110

Asn Leu Thr Leu Asp Asn Arg Val Ala Asp Gln Leu Trp Val Pro Asp

115 120 125

Thr Tyr Phe Leu Asn Asp Lys Lys Ser Phe Val His Gly Val Thr Val

130 135 140

Lys Asn Arg Met Ile Arg Leu His Pro Asp Gly Thr Val Leu Tyr Gly

145 150 155 160

Leu Arg Ile Thr Thr Thr Ala Ala Cys Met Met Asp Leu Arg Arg Tyr

165 170 175

Pro Leu Asp Glu Gln Asn Cys Thr Leu Glu Ile Glu Ser Tyr Gly Tyr

180 185 190

Thr Thr Asp Asp Ile Glu Phe Tyr Trp Arg Gly Gly Asp Lys Ala Val

195 200 205

Thr Gly Val Glu Arg Ile Glu Leu Pro Gln Phe Ser Ile Val Glu His

210 215 220

Arg Leu Val Ser Arg Asn Val Val Phe Ala Thr Gly Ala Tyr Pro Arg

225 230 235 240

Leu Ser Leu Ser Phe Arg Leu Lys Arg Asn Ile Gly Tyr Phe Ile Leu

245 250 255

Gln Thr Tyr Met Pro Ser Ile Leu Ile Thr Ile Leu Ser Trp Val Ser

260 265 270

Phe Trp Ile Asn Tyr Asp Ala Ser Ala Ala Arg Val Ala Leu Gly Ile

275 280 285

Thr Thr Val Leu Thr Met Thr Thr Ile Asn Thr His Leu Arg Glu Thr

290 295 300

Leu Pro Lys Ile Pro Tyr Val Lys Ala Ile Asp Met Tyr Leu Cys Gly

305 310 315 320

Ala Phe Val Phe Val Phe Leu Ala Leu Leu Glu Tyr Ala Phe Val Asn

325 330 335

Tyr Ile Phe Phe Gly Arg Gly Pro Gln Arg Gln Lys Lys Leu Ala Glu

340 345 350

Lys Thr Ala Lys Ala Lys Asn Asp Arg Ser Lys Ser Glu Ser Asn Arg

355 360 365

Val Asp Ala His Gly Asn Ile Leu Leu Thr Ser Leu Glu Val His Asn

370 375 380

Glu Met Asn Glu Val Ser Gly Gly Ile Gly Asp Thr Arg Asn Ser Ala

385 390 395 400

Ile Ser Phe Asp Asn Ser Gly Ile Gln Tyr Arg Lys Gln Ser Met Pro

405 410 415

Arg Glu Gly His Gly Arg Phe Leu Gly Asp Arg Ser Leu Pro His Lys

420 425 430

Lys Thr His Leu Arg Arg Arg Ser Ser Gln Leu Lys Ile Lys Ile Pro

435 440 445

Asp Leu Thr Asp Val Asn Ala Ile Asp Arg Trp Ser Arg Ile Val Phe

450 455 460

Pro Phe Thr Phe Ser Leu Phe Asn Leu Val Tyr Trp Leu Tyr Tyr Val

465 470 475 480

Asn

<210> 9

<211> 461

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 9

Met Ala Thr Trp Ile Val Gly Lys Leu Ile Ile Ala Ser Leu Ile Leu

1 5 10 15

Gly Ile Gln Ala Gln Gln Ala Arg Thr Lys Ser Gln Asp Ile Phe Glu

20 25 30

Asp Asp Asn Asp Asn Gly Thr Thr Thr Leu Glu Ser Leu Ala Arg Leu

35 40 45

Thr Ser Pro Ile His Ile Pro Ile Glu Gln Pro Gln Thr Ser Asp Ser

50 55 60

Lys Ile Leu Ala His Leu Phe Thr Ser Gly Tyr Asp Phe Arg Val Arg

65 70 75 80

Pro Pro Thr Asp Asn Gly Gly Pro Val Val Val Ser Val Asn Met Leu

85 90 95

Leu Arg Thr Ile Ser Lys Ile Asp Val Val Asn Met Glu Tyr Ser Ala

100 105 110

Gln Leu Thr Leu Arg Glu Ser Trp Ile Asp Lys Arg Leu Ser Tyr Gly

115 120 125

Val Lys Gly Asp Gly Gln Pro Asp Phe Val Ile Leu Thr Val Gly His

130 135 140

Gln Ile Trp Met Pro Asp Thr Phe Phe Pro Asn Glu Lys Gln Ala Tyr

145 150 155 160

Lys His Thr Ile Asp Lys Pro Asn Val Leu Ile Arg Ile His Asn Asp

165 170 175

Gly Thr Val Leu Tyr Ser Val Arg Ile Ser Leu Val Leu Ser Cys Pro

180 185 190

Met Tyr Leu Gln Tyr Tyr Pro Met Asp Val Gln Gln Cys Ser Ile Asp

195 200 205

Leu Ala Ser Tyr Ala Tyr Thr Thr Lys Asp Ile Glu Tyr Leu Trp Lys

210 215 220

Glu His Ser Pro Leu Gln Leu Lys Val Gly Leu Ser Ser Ser Leu Pro

225 230 235 240

Ser Phe Gln Leu Thr Asn Thr Ser Thr Thr Tyr Cys Thr Ser Val Thr

245 250 255

Asn Thr Gly Ile Tyr Ser Cys Leu Arg Thr Thr Ile Gln Leu Lys Arg

260 265 270

Glu Phe Ser Phe Tyr Leu Leu Gln Leu Tyr Ile Pro Ser Cys Met Leu

275 280 285

Val Ile Val Ser Trp Val Ser Phe Trp Phe Asp Arg Thr Ala Ile Pro

290 295 300

Ala Arg Val Thr Leu Gly Val Thr Thr Leu Leu Thr Met Thr Ala Gln

305 310 315 320

Ser Ala Gly Ile Asn Ser Gln Leu Pro Pro Val Ser Tyr Ile Lys Ala

325 330 335

Ile Asp Val Trp Ile Gly Ala Cys Met Thr Phe Ile Phe Cys Ala Leu

340 345 350

Leu Glu Phe Ala Leu Val Asn His Ile Ala Asn Lys Gln Gly Val Glu

355 360 365

Arg Lys Ala Arg Thr Glu Arg Glu Lys Ala Glu Ile Pro Leu Leu Gln

370 375 380

Asn Leu His Asn Asp Val Pro Thr Lys Val Phe Asn Gln Glu Glu Lys

385 390 395 400

Val Arg Thr Val Pro Leu Asn Arg Arg Gln Met Asn Ser Phe Leu Asn

405 410 415

Leu Leu Glu Thr Lys Thr Glu Trp Asn Asp Ile Ser Lys Arg Val Asp

420 425 430

Leu Ile Ser Arg Ala Leu Phe Pro Val Leu Phe Phe Val Phe Asn Ile

435 440 445

Leu Tyr Trp Ser Arg Phe Gly Gln Gln Asn Val Leu Phe

450 455 460

<210> 10

<211> 347

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 10

Ser Asp Ser Lys Ile Leu Ala His Leu Phe Thr Ser Gly Tyr Asp Phe

1 5 10 15

Arg Val Arg Pro Pro Thr Asp Asn Gly Gly Pro Val Val Val Ser Val

20 25 30

Asn Met Leu Leu Arg Thr Ile Ser Lys Ile Asp Val Val Asn Met Glu

35 40 45

Tyr Ser Ala Gln Leu Thr Leu Arg Glu Ser Trp Ile Asp Lys Arg Leu

50 55 60

Ser Tyr Gly Val Lys Gly Asp Gly Gln Pro Asp Phe Val Ile Leu Thr

65 70 75 80

Val Gly His Gln Ile Trp Met Pro Asp Thr Phe Phe Pro Asn Glu Lys

85 90 95

Gln Ala Tyr Lys His Thr Ile Asp Lys Pro Asn Val Leu Ile Arg Ile

100 105 110

His Asn Asp Gly Thr Val Leu Tyr Ser Val Arg Ile Ser Leu Val Leu

115 120 125

Ser Cys Pro Met Tyr Leu Gln Tyr Tyr Pro Met Asp Val Gln Gln Cys

130 135 140

Ser Ile Asp Leu Ala Ser Tyr Ala Tyr Thr Thr Lys Asp Ile Glu Tyr

145 150 155 160

Leu Trp Lys Glu His Ser Pro Leu Gln Leu Lys Val Gly Leu Ser Ser

165 170 175

Ser Leu Pro Ser Phe Gln Leu Thr Asn Thr Ser Thr Thr Tyr Cys Thr

180 185 190

Ser Val Thr Asn Thr Gly Ile Tyr Ser Cys Leu Arg Thr Thr Ile Gln

195 200 205

Leu Lys Arg Glu Phe Ser Phe Tyr Leu Leu Gln Leu Tyr Ile Pro Ser

210 215 220

Cys Met Leu Val Ile Val Ser Trp Val Ser Phe Trp Phe Asp Arg Thr

225 230 235 240

Ala Ile Pro Ala Arg Val Thr Leu Gly Val Thr Thr Leu Leu Thr Met

245 250 255

Thr Ala Gln Ser Ala Gly Ile Asn Ser Gln Leu Pro Pro Val Ser Tyr

260 265 270

Ile Lys Ala Ile Asp Val Trp Ile Gly Ala Cys Met Thr Phe Ile Phe

275 280 285

Cys Ala Leu Leu Glu Phe Ala Leu Val Asn His Ile Ala Asn Ala Gly

290 295 300

Thr Thr Glu Trp Asn Asp Ile Ser Lys Arg Val Asp Leu Ile Ser Arg

305 310 315 320

Ala Leu Phe Pro Val Leu Phe Phe Val Phe Asn Ile Leu Tyr Trp Ser

325 330 335

Arg Phe Gly His His His His His His His His

340 345

<210> 11

<211> 389

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 11

Met Arg Lys Ser Pro Gly Leu Ser Asp Cys Leu Trp Ala Trp Ile Leu

1 5 10 15

Leu Leu Ser Thr Leu Thr Gly Arg Ser Tyr Gly Gln Pro Ser Leu Gln

20 25 30

Asp Glu Leu Lys Asp Asn Thr Thr Val Phe Thr Arg Ile Leu Asp Arg

35 40 45

Leu Leu Asp Gly Tyr Asp Asn Arg Leu Arg Pro Gly Leu Gly Glu Arg

50 55 60

Val Thr Glu Val Lys Thr Asp Ile Phe Val Thr Ser Phe Gly Pro Val

65 70 75 80

Ser Asp His Asp Met Glu Tyr Thr Ile Asp Val Phe Phe Arg Gln Ser

85 90 95

Trp Lys Asp Glu Arg Leu Lys Phe Lys Gly Pro Met Thr Val Leu Arg

100 105 110

Leu Asn Asn Leu Met Ala Ser Lys Ile Trp Thr Pro Asp Thr Phe Phe

115 120 125

His Asn Gly Lys Lys Ser Val Ala His Asn Met Thr Met Pro Asn Lys

130 135 140

Leu Leu Arg Ile Thr Glu Asp Gly Thr Leu Leu Tyr Thr Met Arg Leu

145 150 155 160

Thr Val Arg Ala Glu Cys Pro Met His Leu Glu Asp Phe Pro Met Asp

165 170 175

Ala His Ala Cys Pro Leu Lys Phe Gly Ser Tyr Ala Tyr Thr Arg Ala

180 185 190

Glu Val Val Tyr Glu Trp Thr Arg Glu Pro Ala Arg Ser Val Val Val

195 200 205

Ala Glu Asp Gly Ser Arg Leu Asn Gln Tyr Asp Leu Leu Gly Gln Thr

210 215 220

Val Asp Ser Gly Ile Val Gln Ser Ser Thr Gly Glu Tyr Val Val Met

225 230 235 240

Thr Thr His Phe His Leu Lys Arg Lys Ile Gly Tyr Phe Val Ile Gln

245 250 255

Thr Tyr Leu Pro Ser Ile Met Thr Val Ile Leu Ser Gln Val Ser Phe

260 265 270

Trp Leu Asn Arg Glu Ser Val Pro Ala Arg Thr Val Phe Gly Val Thr

275 280 285

Thr Val Leu Thr Met Thr Thr Leu Ser Ile Ser Ala Arg Asn Ser Leu

290 295 300

Pro Lys Val Ala Tyr Ala Thr Ala Met Asp Trp Phe Ile Ala Val Ser

305 310 315 320

Tyr Ala Phe Val Phe Ser Ala Leu Ile Glu Phe Ala Thr Val Asn Tyr

325 330 335

Phe Thr Lys Ala Gly Thr Lys Lys Thr Phe Asn Ser Val Ser Lys Ile

340 345 350

Asp Arg Leu Ser Arg Ile Ala Phe Pro Leu Leu Phe Gly Ile Phe Asn

355 360 365

Leu Val Tyr Trp Ala Thr Tyr Leu Asn Arg Glu Pro Gln Leu Lys Ala

370 375 380

Pro Thr Pro His Gln

385

<210> 12

<211> 370

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 12

Met Trp Gly Leu Ala Gly Gly Arg Leu Phe Gly Ile Phe Ser Ala Pro

1 5 10 15

Val Leu Val Ala Val Val Cys Cys Ala Gln Ser Val Asn Asp Pro Gly

20 25 30

Asn Met Ser Phe Val Lys Glu Thr Val Asp Lys Leu Leu Lys Gly Tyr

35 40 45

Asp Ile Arg Leu Arg Pro Asp Phe Gly Gly Pro Pro Val Ala Val Gly

50 55 60

Met Asn Ile Asp Ile Ala Ser Ile Asp Met Val Ser Glu Val Asn Met

65 70 75 80

Asp Tyr Thr Leu Thr Met Tyr Phe Gln Gln Tyr Trp Arg Asp Lys Arg

85 90 95

Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Leu Asn Leu Thr Leu Asp Asn Arg Val

100 105 110

Ala Asp Gln Leu Trp Val Pro Asp Thr Tyr Phe Leu Asn Asp Lys Lys

115 120 125

Ser Phe Val His Gly Val Thr Val Lys Asn Arg Met Ile Arg Leu His

130 135 140

Pro Asp Gly Thr Val Leu Tyr Gly Leu Arg Ile Thr Thr Thr Ala Ala

145 150 155 160

Cys Met Met Asp Leu Arg Arg Tyr Pro Leu Asp Glu Gln Asn Cys Thr

165 170 175

Leu Glu Ile Glu Ser Tyr Gly Tyr Thr Thr Asp Asp Ile Glu Phe Tyr

180 185 190

Trp Arg Gly Gly Asp Lys Ala Val Thr Gly Val Glu Arg Ile Glu Leu

195 200 205

Pro Gln Phe Ser Ile Val Glu His Arg Leu Val Ser Arg Asn Val Val

210 215 220

Phe Ala Thr Gly Ala Tyr Pro Arg Leu Ser Leu Ser Phe Arg Leu Lys

225 230 235 240

Arg Asn Ile Gly Tyr Phe Ile Leu Gln Thr Tyr Met Pro Ser Ile Leu

245 250 255

Ile Thr Ile Leu Ser Trp Val Ser Phe Trp Ile Asn Tyr Asp Ala Ser

260 265 270

Ala Ala Arg Val Ala Leu Gly Ile Thr Thr Val Leu Thr Met Thr Thr

275 280 285

Ile Asn Thr His Leu Arg Glu Thr Leu Pro Lys Ile Pro Tyr Val Lys

290 295 300

Ala Ile Asp Met Tyr Leu Cys Gly Ala Phe Val Phe Val Phe Leu Ala

305 310 315 320

Leu Leu Glu Tyr Ala Phe Val Asn Tyr Ile Phe Phe Ala Gly Thr Ile

325 330 335

Pro Asp Leu Thr Asp Val Asn Ala Ile Asp Arg Trp Ser Arg Ile Val

340 345 350

Phe Pro Phe Thr Phe Ser Leu Phe Asn Leu Val Tyr Trp Leu Tyr Tyr

355 360 365

Val Asn

370

<210> 13

<211> 344

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 13

Glu Thr Gly Gln Ser Val Asn Asp Pro Gly Asn Met Ser Phe Val Lys

1 5 10 15

Glu Thr Val Asp Lys Leu Leu Lys Gly Tyr Asp Ile Arg Leu Arg Pro

20 25 30

Asp Phe Gly Gly Pro Pro Val Cys Val Gly Met Asn Ile Asp Ile Ala

35 40 45

Ser Ile Asp Met Val Ser Glu Val Asn Met Asp Tyr Thr Leu Thr Met

50 55 60

Tyr Phe Gln Gln Tyr Trp Arg Asp Lys Arg Leu Ala Tyr Ser Gly Ile

65 70 75 80

Pro Leu Asn Leu Thr Leu Asp Asn Arg Val Ala Asp Gln Leu Trp Val

85 90 95

Pro Asp Thr Tyr Phe Leu Asn Asp Lys Lys Ser Phe Val His Gly Val

100 105 110

Thr Val Lys Asn Arg Met Ile Arg Leu His Pro Asp Gly Thr Val Leu

115 120 125

Tyr Gly Leu Arg Ile Thr Thr Thr Ala Ala Cys Met Met Asp Leu Arg

130 135 140

Arg Tyr Pro Leu Asp Glu Gln Asn Cys Thr Leu Glu Ile Glu Ser Tyr

145 150 155 160

Gly Tyr Thr Thr Asp Asp Ile Glu Phe Tyr Trp Arg Gly Gly Asp Lys

165 170 175

Ala Val Thr Gly Val Glu Arg Ile Glu Leu Pro Gln Phe Ser Ile Val

180 185 190

Glu His Arg Leu Val Ser Arg Asn Val Val Phe Ala Thr Gly Ala Tyr

195 200 205

Pro Arg Leu Ser Leu Ser Phe Arg Leu Lys Arg Asn Ile Gly Tyr Phe

210 215 220

Ile Leu Gln Thr Tyr Met Pro Ser Ile Leu Ile Thr Ile Leu Ser Trp

225 230 235 240

Val Ser Phe Trp Ile Asn Tyr Asp Ala Ser Ala Ala Arg Val Ala Leu

245 250 255

Gly Ile Thr Thr Val Leu Thr Met Thr Thr Ile Asn Thr His Leu Arg

260 265 270

Glu Thr Leu Pro Lys Ile Pro Tyr Val Lys Ala Ile Asp Met Tyr Leu

275 280 285

Met Gly Cys Phe Val Phe Val Phe Leu Ala Leu Leu Glu Tyr Ala Phe

290 295 300

Val Asn Tyr Ile Phe Phe Ser Gln Pro Ala Arg Ala Ala Ala Ile Asp

305 310 315 320

Arg Trp Ser Arg Ile Val Phe Pro Phe Thr Phe Ser Leu Phe Asn Leu

325 330 335

Val Tyr Trp Leu Tyr Tyr Val Asn

340

<210> 14

<211> 359

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 14

Met Phe Pro Thr Gly Trp Arg Pro Lys Leu Ser Glu Ser Ile Ala Ala

1 5 10 15

Ser Arg Met Leu Trp Gln Pro Met Ala Ala Val Ala Val Val Gln Ile

20 25 30

Gly Leu Leu Trp Phe Ser Pro Pro Val Trp Gly Gln Asp Met Val Ser

35 40 45

Pro Pro Pro Pro Ile Ala Asp Glu Pro Leu Thr Val Asn Thr Gly Ile

50 55 60

Tyr Leu Ile Glu Cys Tyr Ser Leu Asp Asp Lys Ala Glu Thr Phe Lys

65 70 75 80

Val Asn Ala Phe Leu Ser Leu Ser Trp Lys Asp Arg Arg Leu Ala Phe

85 90 95

Asp Pro Val Arg Ser Gly Val Arg Val Lys Thr Tyr Glu Pro Glu Ala

100 105 110

Ile Trp Ile Pro Glu Ile Arg Phe Val Asn Val Glu Asn Ala Arg Asp

115 120 125

Ala Asp Val Val Asp Ile Ser Val Ser Pro Asp Gly Thr Val Gln Tyr

130 135 140

Leu Glu Arg Phe Ser Ala Arg Val Leu Ser Pro Leu Asp Phe Arg Arg

145 150 155 160

Tyr Pro Phe Asp Ser Gln Thr Leu His Ile Tyr Leu Ile Val Arg Ser

165 170 175

Val Asp Thr Arg Asn Ile Val Leu Ala Val Asp Leu Glu Lys Val Gly

180 185 190

Lys Asn Asp Asp Val Phe Leu Thr Gly Trp Asp Ile Glu Ser Phe Thr

195 200 205

Ala Val Val Lys Pro Ala Asn Phe Ala Leu Glu Asp Arg Leu Glu Ser

210 215 220

Lys Leu Asp Tyr Gln Leu Arg Ile Ser Arg Gln Tyr Phe Ser Tyr Ile

225 230 235 240

Pro Asn Ile Ile Leu Pro Met Leu Phe Ile Leu Phe Ile Ser Trp Thr

245 250 255

Ala Phe Trp Ser Thr Ser Tyr Glu Ala Asn Val Thr Leu Val Val Ser

260 265 270

Thr Leu Ile Ala His Ile Ala Phe Asn Ile Leu Val Glu Thr Asn Leu

275 280 285

Pro Lys Thr Pro Tyr Met Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Ile Phe Met Ile

290 295 300

Tyr Leu Phe Tyr Phe Val Ala Val Ile Glu Val Thr Val Gln His Tyr

305 310 315 320

Leu Lys Val Glu Ser Gln Pro Ala Arg Ala Ala Ser Ile Thr Arg Ala

325 330 335

Ser Arg Ile Ala Phe Pro Val Val Phe Leu Leu Ala Asn Ile Ile Leu

340 345 350

Ala Phe Leu Phe Phe Gly Phe

355

Claims

1.一种用于解析复杂多聚体蛋白受体的脉冲电子顺磁共振数据的系统，其特征在于：包括：

模块一：通过细胞工程方法表达多聚体蛋白并纯化，并通过化学交联反应将自旋标记连接到蛋白上关键靶向位点，经过体外重组方法锚定受体到脂质体上，经过脉冲电子顺磁共振收集、处理自旋标记在自然配体刺激下受体蛋白各亚基标记位点彼此距离的分布；

模块三：用于通过分子操作技术微观调整所述最佳蛋白结构模型，进行自旋标记旋转子的分布比较，找出实验数据和模块二不符合实验数据的部分背后代表的结构、构象信息；

模块四：用于定量确定穿膜区临床药物作用靶点在配体作用下的空间结构特点，根据在初始蛋白模型上进行分子操作，得到扩张、微调整后的一系列结构模型，然后根据高斯解析分析得到自旋标记的长段距离峰分组相对应的比例变化和电子顺磁共振实验测得的距离分布比较，得到相应的最佳匹配模型，同时得到相应的扩张距离，得出的药物局部靶向结构最接近实际蛋白在脂质体上的实际结构。

2.根据权利要求1所述的用于解析复杂多聚体蛋白受体的脉冲电子顺磁共振数据的系统，其特征在于：所述模块二中的距离峰包括相邻亚基间和间隔亚基间的距离。

3.根据权利要求1所述的用于解析复杂多聚体蛋白受体的脉冲电子顺磁共振数据的系统，其特征在于：所述体外重组方法包括以下步骤：

S2、受体蛋白纯化后，在体外通过控制稀释速度、分阶段将其从由detergent混合脂分子形成的micelle状态过渡到共存于micelle和形成的脂质体的中间状态。

4.根据权利要求3所述的用于解析复杂多聚体蛋白受体的脉冲电子顺磁共振数据的系统，其特征在于：所述步骤S2中，所述控制稀释速度的方法具体包括以下步骤：

A、Detergent、脂质体和纯化的膜蛋白受体三者混合状态下的起始微团形态阶段；

B、微团和受体蛋白、脂质体共存中间阶段；

C、单一的受体脂质体阶段；

5.根据权利要求1所述的用于解析复杂多聚体蛋白受体的脉冲电子顺磁共振数据的系统，其特征在于：所述多聚体受体蛋白为人源γ-氨基丁酸A型离子通道受体蛋白或与人源γ-氨基丁酸A型离子通道受体蛋白具有同源结构的五聚体门控神经离子通道受体。

6.根据权利要求5所述的用于解析复杂多聚体蛋白受体的脉冲电子顺磁共振数据的系统，其特征在于：所述人源γ-氨基丁酸A型离子通道受体蛋白的亚基组成为(α1)₂/(β3)₃。

7.一种利用如权利要求1～6任一项所述的系统进行数据解析的方法，其特征在于：包括以下步骤：

S01、通过同源蛋白建模和自旋标记旋转子分析筛选出多聚体蛋白离子通道受体蛋白的脉冲电子顺磁共振图谱中符合实验数据部分的最佳蛋白结构模型；

S02、通过分子操作技术微观调整所述步骤S01筛选出的最佳蛋白结构模型，同时在调整后的一系列结构模型上计算自旋标记旋转子的分布，拟合实验数据与在所述步骤S01筛选出的最佳蛋白结构模型上计算出的分布数据不符合实验数据部分；

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤S02中需要对蛋白分子亚基间距离的微调，通过进一步调整最佳蛋白结构模型中分子亚基间的距离，将计算的出自旋标记旋转子分布与实验数据进行比较，得到最佳拟合实验数据的方法。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述临床药物为麻醉药物、镇静药物、抗焦虑药物。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法还包括步骤S04、根据所述步骤S03得出的涉及蛋白异构化激活机制的临床药物靶向结构信息，利用胆固醇分子和临床药物分子在蛋白结构上计算锚定分析，并比较在不同蛋白结构模型上两种分子的锚定姿态、位置和药物分子的药理学关系，得出更符合利于发挥临床药物作用的分子姿态和相应锚定位置。

11.一种如权利要求1-6任一项所述的系统在神经药物或辅助药物的设计或制备中的应用。