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[Gebiet der Erfindung]
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Die
vorliegende Erfindung betrifft neue Oligonukleotidanaloga, die Gegensinn-Aktivität und Antigen-Aktivität mit hervorragender
Stabilität
oder hervorragende Aktivität
als Nachweismittel (Sonde) für
ein spezifisches Gen oder als Primer für das Starten einer Amplifikation
zeigen, und neue Nukleosidanaloga, die Intermediate für deren
Herstellung sind.
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[Stand der Technik]
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Oligonukleotidanaloga,
die hervorragende Gegensinn-Aktivität oder Antigen-Aktivität haben
und im Körper
stabil sind, sind erwartungsgemäß nützliche
Arzneimittel. Zusätzlich
sind Oligonukleotidanaloga mit einem hohen Grad der Fähigkeit
zur stabilen Komplementärkettenbildung
mit DNA oder mRNA als Nachweismittel für ein spezifisches Gen oder
als Primer für
das Starten einer Amplifikation nützlich.
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Im
Gegensatz dazu werden natürlich
vorkommende Oligonukleotide durch verschiedene Nukleasen, die im
Blut und in Zellen vorhanden sind, bekanntlich rasch zersetzt. In
einigen Fällen
können
natürlich
auftretende Oligonukleotide keine-ausreichende Empfindlichkeit zur
Verwendung als Nachweismittel für
spezifische Gene oder als Primer für das Starten einer Amplifikation
aufgrund von Einschränkungen
ihrer Affinität
zu komplementären
Basensequenzen haben.
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Um
diese Nachteile zu überwinden,
sind verschiedene, nicht natürlich
auftretende Oligonukleotidanaloga hergestellt worden, und ihre Entwicklung
für die
Verwendung als Arzneimittel oder als Nachweismittel für spezifische
Gene ist versucht worden. Bekannte Beispiele solcher nicht natürlich vorkommenden
Oligonukleotidanaloga umfassen solche, worin ein Sauerstoffatom, das
an ein Phosphoratom in einer Phosphordiesterbindung eines Nukleotids
gebunden ist, durch ein Schwefelatom ersetzt ist, solche, worin
das Sauerstoffatom durch eine Methylengruppe ersetzt ist, solche,
worin das Sauerstoffatom durch ein Boratom ersetzt ist, und solche,
worin ein Zuckerrest oder ein Basenrest eines Oligonukleotids chemisch
modifiziert ist. Beispielsweise hat die ISIS Corp. ein Oligonukleotid
ISIS2922 vom Thioat-Typ (Vitravene) als therapeutisches Mittel für menschliche
Cytomegalovirus retinitis entwickelt, und ISIS2922 ist in den Vereinigten
Staaten auf den Markt gebracht worden.
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WO-A-9839352
offenbart Nukleosidanaloga mit einer Verbrückungsgruppe -O-CH2-
zwischen den Positionen 2' und
4' und Oligonukleotide,
die diese Nukleoside enthalten und die angeblich eine gewisse Nukleaseresistenz
haben. WO 9914226 offenbart Nukleoside, die eine -O-(CH2)2-Verbrückungsgruppe
zwischen den Positionen 2' und
3' enthalten, und
Oligonukleotide, die diese Nukleoside enthalten. Diese können angeblich
für eine
Gegensinntherapie eingesetzt werden, es gibt jedoch keinen Hinweis
darauf, dass die Verwendung dieser Verbrückung die Stabilität der Nukleasen
verbessern könnte.
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Im
Hinblick auf die Stärke
der Gegensinn-Aktivität
oder Antigen-Aktivität
in dem vorstehend genannten, nicht natürlich vorkommenden Oligonukleotidanaloga,
nämlich
die Fähigkeit,
eine stabile komplementäre Kette
mit DNA oder mRNA zu bilden, Stabilität gegen verschiedene Nukleasen
auszubilden und im Hinblick auf die nachteiligen Nebenwirkungen
aufgrund von nicht-spezifischen Bindungen mit verschiedenen Proteinen im
Körper
besteht jedoch ein Bedarf an einem nicht natürlich vorkommenden Oligonukleotidanalogen,
das sogar höhere
Stabilität
im Körper
hat, eine geringere Wahrscheinlichkeit nachteiliger Nebenwirkungen
hat und eine höhere
Fähigkeit
zur Bildung von komplementären
Ketten hat.
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[Offenbarung der Erfindung]
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung haben eingehende Forschungen über einen
langen Zeitraum über
nicht natürlich
vorkommende Oligonukleotidanaloga mit hervorragender Gegensinn-Aktivität oder Antigen-Aktivität, hervorragender
Stabilität
im Körper
und geringer Häufigkeit
nachteiliger Nebenwirkungen durchgeführt. Als Ergebnis dieser Forschung
haben sie gefunden, dass Oligonukleotidanaloga oder Nukleosidanaloga
mit einer Etherbindung im Molekül
als Gegensinn- oder Antigen-Arzneimittel
mit hervorragender Stabilität, als
Nachweismittel (Sonde) für
ein spezifisches Gen, als Primer zum Starten der Amplifikation oder
als Intermediate für
ihre Produktion nützlich
sind und haben die vorliegende Erfindung gemacht.
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Im
Folgenden wird die vorliegende Erfindung eingehender beschrieben.
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Die
neuen Nukleosidanalogen der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen
der Formel (1):
[worin R
1 und
R
2 gleich oder unterschiedlich sind und
ein Wasserstoffatom, eine Hydroxyschutzgruppe, eine Phosphorsäuregruppe,
eine geschützte
Phosphorsäuregruppe
oder -P(R
3)R
4 darstellen
[worin R
3 und R
4 gleich
oder unterschiedlich sind und eine Hydroxygruppe, eine geschützte Hydroxygruppe,
eine Mercaptogruppe, eine geschützte
Mercaptogruppe, eine Aminogruppe, eine Alkoxygruppe mit 1 bis 4
Kohlenstoffatomen, eine Alkylthiogruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen,
eine Cyanalkoxygruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder eine mit
einer Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen substituierte Aminogruppe
darstellen];
A eine Alkylengruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen
darstellt; und
B eine Purin-9-ylgruppe, eine 2-Oxopyrimidin-1-ylgruppe
oder eine substituierte Purin-9-ylgruppe oder eine 2-Oxopyrimidin-1-ylgruppe mit mindestens
einem Substituenten darstellt, der aus der folgenden Gruppe α ausgewählt ist];
oder
ein Salz davon.
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Die
Oligonukleotidanalogen der vorliegenden Erfindung sind Oligonukleotidanaloge
mit einer oder zwei oder mehr Strukturen der Formel (2)
[worin A eine Alkylengruppe
mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellt; und B eine Purin-9-ylgruppe,
eine 2-Oxopyrimidin-1-ylgruppe
oder eine substituierte Purin-9-ylgruppe oder eine substituierte
2-Oxo-pyrimidin-1-ylgruppe mit mindestens einem Substituenten darstellt,
der aus der folgenden Gruppe α ausgewählt ist];
oder
ein pharmakologisch geeignetes Salz davon;
(α-Gruppe)
eine
Hydroxygruppe
eine geschützte
Hydroxygruppe
eine Alkoxygruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen,
eine
Mercaptogruppe,
eine geschützte
Mercaptogruppe,
eine Alkylthiogruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen,
eine
Aminogruppe,
eine geschützte
Aminogruppe,
eine Aminogruppe, die mit einer Alkylgruppe mit
1 bis 4 Kohlenstoffatomen substituiert ist,
eine Alkylgruppe
mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und
ein Halogenatom.
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"Die Alkylengruppe
mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen" der
Gruppe A in den folgenden Formeln (1) oder (2) kann Methylen, Ethylen,
Trimethylen und Tetramethylen umfassen, vorzugsweise eine Methylengruppe.
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Die
Schutzgruppe der "Hydroxyschutzgruppe" bei R1 und
R2 und "die
geschützte
Hydroxygruppe" bei R3 und R4 oder der α-Gruppe in
den vorstehenden Formeln (1) und (2) beziehen sich auf eine Schutzgruppe, die
durch chemische Methoden, wie Hydrogenolyse, Zersetzung, Hydrolyse,
Elektrolyse und Fotolyse, oder durch ein biologisches Verfahren,
wie Hydrolyse im menschlichen Körper,
gespalten werden kann, und solche Schutzgruppen können "eine aliphatische
Acylgruppe", wie
eine Alkylcarbonylgruppe umfassen, beispielsweise Formyl, Acetyl,
Propionyl, Butyryl, Isobutyryl, Pentanoyl, Pivaloyl, Valeryl, Isovaleryl,
Octanoyl, Nonanoyl, Decanoyl, 3-Methylnonanoyl, 8-Methylnonanoyl,
3-Ethyloctanoyl, 3,7-Dimethyloctanoyl, Undecanoyl, Dodecanoyl, Tridecanoyl,
Tetradecanoyl, Pentadecanoyl, Hexadecanoyl, 1-Methylpentadecanoyl, 14-Methylpentadecanoyl,
13,13-Dimethyltetradecanoyl, Heptadecanoyl, 15-Methylhexadecanoyl,
Octadecanoyl, 1-Methylheptadecanoyl, Nonadecanoyl, Eicosanoyl und
Heneicosanoyl, eine carboxylierte Alkylcarbonylgruppe, wie Succinoyl,
Glutaroyl und Adipoyl, eine Halogen-niederalkylcarbonylgruppe, wie
Chloracetyl, Dichloracetyl, Trichloracetyl und Trifluoracetyl, eine
Niederalkoxyniederalkylcarbonylgruppe, wie Methoxyacetyl, und eine
ungesättigte
Alkylcarbonylgruppe, wie (E)-2-Methyl-2-butenoyl;
"eine aromatische
Acylgruppe", wie
eine Arylcarbonylgruppe, wie Benzoyl, α-Naphthoyl und β-Naphthoyl,
eine Halogenarylcarbonylgruppe, wie 2-Brombenzoyl und 4-Chlorbenzoyl,
eine niederalkylierte Arylcarbonylgruppe, wie 2,4,6-Trimethylbenzoyl
und 4-Toluoyl, eine niederalkoxylierte Arylcarbonylgruppe, wie 4-Anisoyl, eine carboxylierte
Arylcarbonylgruppe, wie 2-Carboxybenzoyl, 3-Carboxybenzoyl und 4-Carboxybenzoyl,
eine nitrierte Arylcarbonylgruppe, wie 4-Nitrobenzoyl und 2-Nitrobenzoyl,
eine niederalkoxycarbonylierte Arylcarbonylgruppe, wie 2-(Methoxycarbonyl)benzoyl
und eine arylierte Arylcarbonylgruppe, wie 4-Phenylbenzoyl;
"eine Tetrahydropyranylgruppe
oder eine Tetrahydrothiopyranylgruppe", wie Tetrahydropyran-2-yl, 3-Bromtetrahydropyran-2-yl, 4-Methoxytetrahydropyran-4-yl,
Tetrahydrothiopyran-2-yl und 4-Methoxytetrahydrothiopyran-4-yl;
"eine Tetrahydrofuranylgruppe
oder eine Tetrahydrothiofuranylgruppe", wie Tetrahydrofuran-2-yl und Tetrahydrothiofuran-2-yl;
"eine Silylgruppe", wie eine Tri-niederalkylsilylgruppe,
wie Trimethylsilyl, Triethylsilyl, Isopropyldimethylsilyl, t-Butyldimethylsilyl,
Methyldiisopropylsilyl, Methyldi-t-butylsilyl und Triisopropylsilyl und
eine Tri-niederalkylsilylgruppe, die mit einer oder zwei Arylgruppen
substituiert ist, wie Diphenylmethylsilyl, Diphenylbutylsilyl, Diphenylisopropylsilyl
und Phenyldiisopropylsilyl;
"eine Niederalkoxymethylgruppe", wie Methoxymethyl,
1,1-Dimethyl-1-methoxymethyl,
Ethoxymethyl, Propoxymethyl, Isopropoxymethyl, Butoxymethyl und
t-Butoxymethyl;
"eine
niederalkoxylierte Niederalkoxymethylgruppe", wie 2-Methoxyethoxymethyl;
"eine Halogenniederalkoxymethylgruppe", wie 2,2,2-Trichlorethoxymethyl
und Bis (2-chlorethoxy)methyl;
"eine niederalkoxylierte Ethylgruppe", wie 1-Ethoxyethyl
und 1-(Isopropoxy)ethyl;
"eine
halogenierte Ethylgruppe",
wie 2,2,2-Trichlorethyl;
"eine
Methylgruppe, die mit 1 bis 3 Arylgruppen substituiert ist", wie Benzyl, α-Naphthylmethyl, β-Naphthylmethyl,
Diphenylmethyl, Triphenylmethyl, α-Naphthyldiphenylmethyl
und 9-Anthrylmethyl;
"eine Methylgruppe,
die mit 1 bis 3 Arylgruppen substituiert ist", worin der Arylring mit einer Niederalkylgruppe, einer
Niederalkoxygruppe, einem Halogenatom oder einer Cyangruppe substituiert
ist", wie 4-Methylbenzyl, 2,4,6-Trimethylbenzyl,
3,4,5-Trimethylbenzyl, 4-Methoxybenzyl, 4-Methoxyphenyldiphenylmethyl,
4,4'-Dimethoxytriphenylmethyl,
2-Nitrobenzyl, 4-Nitrobenzyl,
4-Chlorbenzyl, 4-Brombenzyl und 4-Cyanbenzyl;
"eine Niederalkoxycarbonylgruppe", wie Methoxycarbonyl,
Ethoxycarbonyl, t-Butoxycarbonyl und Isobutoxycarbonyl;
"eine Niederalkoxycarbonylgruppe,
die mit einem Halogenatom oder einer Tri-niederalkylsilylgruppe
substituiert ist",
wie 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl und 2-Trimethylsilylethoxycarbonyl;
"eine Alkenyloxycarbonylgruppe", wie Vinyloxycarbonyl
und Allyloxycarbonyl; und
"eine
Aralkyloxycarbonylgruppe, worin der Arylring mit einer oder zwei
Niederalkoxygruppen oder Nitrogruppen substituiert sein kann", wie Benzyloxycarbonyl,
4-Methoxybenzyloxycarbonyl, 3,4-Dimethoxybenzyloxycarbonyl, 2-Nitrobenzyloxycarbonyl
und 4-Nitrobenzyloxycarbonyl.
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"Die Hydroxyschutzgruppe" bei R1 und
R2 kann vorzugsweise "die aliphatische Acylgruppe", "die aromatische Acylgruppe", "die Methylgruppe,
die mit 1 bis 3 Arylgruppen substituiert ist", "die
Methylgruppe, die mit 1 bis 3 Arylgruppen substituiert ist, worin
der Arylring mit einer Niederalkylgruppe, Niederalkoxygruppe, einem
Halogenatom oder einer Cyangruppe substituiert ist" oder "die Silylgruppe" umfassen; stärker bevorzugt eine
Acetylgruppe, Benzoylgruppe, Benzylgruppe, eine p-Methoxybenzoylgruppe,
eine Dimethoxytritylgruppe, eine Monomethoxytritylgruppe oder eine
tert-Butyldiphenylsilylgruppe.
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Die
Schutzgruppe der "geschützten Hydroxygruppe" in R3 und
R4 oder die α-Gruppe kann vorzugsweise "die aliphatische
Acylgruppe" oder "die aromatische Acylgruppe", stärker bevorzugt
eine Benzoylgruppe umfassen.
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Die
Schutzgruppe der "geschützten Phosphorsäuregruppe" bei R1 und
R2 in der vorstehenden Formel (1) stellt
eine Schutzgruppe dar, die gespalten werden kann durch ein chemisches
Verfahren, wie Hydrogenolyse, Hydrolyse, Elektrolyse und Fotolyse,
und ein biologisches Verfahren, wie Hydrolyse im menschlichen Körper, und
solche Schutzgruppen können "eine Niederalkylgruppe", wie Methyl, Ethyl,
n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, s-Butyl, tert-Butyl, n-Pentyl, Isopentyl,
2-Methylbutyl, Neopentyl, 1-Ethylpropyl, n-Hexyl, Isohexyl, 4-Methylpentyl,
3-Methylpentyl,
2-Methylpentyl, 1-Methylpentyl, 3,3-Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 1,1-Dimethylbutyl,
1,2-Dimethylbutyl, 1,3-Dimethylbutyl, 2,3-Dimethylbutyl und 2-Ethylbutyl
umfassen;
"eine
cyanierte Niederalkylgruppe",
wie 2-Cyanethyl und 2-Cyan-1,1-dimethylethyl;
"eine Ethylgruppe,
die mit einer Silylgruppe substituiert ist", wie 2-Methyldiphenylsilylethyl, 2-Trimethylsilylethyl und
2-Triphenylsilylethyl;
"eine
halogenierte Niederalkylgruppe",
wie 2,2,2-Trichlorethyl, 2,2,2-Tribromethyl, 2,2,2-Trifluorethyl
und 2,2,2-Trichlor-1,1-dimethylethyl;
"eine Niederalkenylgruppe", wie Ethenyl, 1-Propenyl,
2-Propenyl, 1-Methyl-2-propenyl, 1-Methyl-1-propenyl, 2-Methyl-1-propenyl, 2-Methyl-2-propenyl,
2-Ethyl-2-propenyl, 1-Butenyl, 2-Butenyl, 1-Methyl-2-butenyl, 1-Methyl-1-butenyl,
3-Methyl-2-butenyl,
1-Ethyl-2-butenyl, 3-Butenyl, 1-Methyl-3-butenyl, 2-Methyl-3-butenyl, 1-Ethyl-3-butenyl,
1-Pentenyl, 2-Pentenyl, 1-Methyl-2-pentenyl, 2-Methyl-2-pentenyl,
3-Pentenyl, 1-Methyl-3-pentenyl,
2-Methyl-3-pentenyl, 4-Pentenyl, 1-Methyl-4-pentenyl, 2-Methyl-4-pentenyl, 1-Hexenyl,
2-Hexenyl, 3-Hexenyl,
4-Hexenyl und 5-Hexenyl;
"eine
Cycloalkylgruppe",
wie Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl,
Norbornyl und Adamantyl;
"eine
cyanierte Niederalkenylgruppe",
wie 2-Cyanbutenyl;
"eine
Aralkylgruppe",
wie Benzyl, α-Naphthylmettyl, β-Naphthylmethyl, Indenylmethyl,
Phenanethrenylmethyl, Anthracenylmethyl, Diphenylmethyl, Triphenylmethyl,
1-Phenethyl, 2-Phenethyl,
1-Naphthylethyl, 2-Naphthylethyl, 1-Phenylpropyl, 2-Phenylpropyl,
3-Phenylpropyl, 1-Naphthylpropyl, 2-Naphthylpropyl, 3-Naphthylpropyl, 1-Phenylbutyl,
2-Phenylbutyl, 3-Phenylbutyl,
4-Phenylbutyl, 1-Naphthylbutyl, 2-Naphthylbutyl, 3-Naphthylbutyl,
4-Naphthylbutyl, 1-Phenylpentyl, 2-Phenylpentyl, 3-Phenylpentyl,
4-Phenylpentyl, 5-Phenylpentyl, 1-Naphthylpentyl, 2-Naphthylpentyl, 3-Naphthylpentyl,
4-Naphthylpentyl,
5-Naphthylpentyl, 1-Phenylhexyl, 2-Phenylhexyl, 3-Phenylhexyl, 4-Phenylhexyl,
5-Phenylhexyl, 6- Phenylhexyl,
1-Naphthylhexyl, 2-Naphthylhexyl, 3-Naphthylhexyl, 4-Naphthylhexyl,
5-Naphthylhexyl und 6-Naphthylhexyl;
"eine Aralkylgruppe, worin der Arylring
mit einer Nitrogruppe oder einem Halogenatom substituiert ist", wie 4-Chlorbenzyl,
2-(4-Nitrophenyl)ethyl, o-Nitrobenzyl, 4-Nitrobenzyl, 2,4-Dinitrobenzyl
und 4-Chlor-2-nitrobenzyl;
"eine
Arylgruppe", wie
Phenyl, Indenyl, Naphthyl, Phenanthrenyl und Anthracenyl; und
"eine Arylgruppe,
die mit einer Niederalkylgruppe, einem Halogenatom oder einer Nitrogruppe
substituiert ist", wie
2-Methylphenyl,
2,6-Dimethylphenyl, 2-Chlorphenyl, 4-Chlorphenyl, 2,4-Dichlorphenyl,
2,5-Dichlorphenyl, 2-Bromphenyl, 4-Nitrophenyl und 4-Chlor-2-nitrophenyl;
vorzugsweise "die Niederalkylgruppe", "die Niederalkylgruppe,
die mit einer Cyangruppe substituiert ist", "die Aralkylgruppe" oder "die Aralkylgruppe,
worin der Arylring mit einer Nitrogruppe oder einem Halogenatom
substituiert ist";
stärker
bevorzugt eine 2-Cyanethylgruppe, eine 2,2,2-Trichlorethylgruppe
oder eine Benzylgruppe.
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"Die Alkoxygruppe
mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen" bei
R3 und R4 oder die α-Gruppe in
den vorstehenden Formeln (1) oder (2) können Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy,
Isopropoxy, n-Butoxy, Isobutoxy, s-Butoxy oder tert-Butoxy, vorzugsweise
Methoxy oder Ethoxy umfassen.
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Die
Schutzgruppe der "geschützten Mercaptogruppe" bei R3 und
R4 oder der α-Gruppe
in der vorstehenden Formel (1) oder (2) kann, zusätzlich zu
der vorstehend genannten Hydroxyschutzgruppe, "eine Gruppe, die ein Disulfid bildet" umfassen, wie eine
Alkylthiogruppe, wie Methylthio, Ethylthio, tert-Butylthio, und
eine Aralkylthiogruppe, wie Benzylthio, vorzugsweise "die aliphatische
Acylgruppe" oder "die aromatische Acylgruppe", stärker bevorzugt
eine Benzoylgruppe.
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"Die Alkylthiogruppe
mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen" bei
R3 und R4 oder die α-Gruppe in
den vorstehenden Formeln (1) oder (2) können Methylthio, Ethylthio,
Propylthio, Isopropylthio, Butylthio, Isobutylthio, s-Butylthio
und tert-Butylthio, vorzugsweise Methylthio oder Ethylthio enthalten.
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Die
Schutzgruppe der "geschützten Aminogruppe" der α-Gruppe in
den vorstehenden Formeln (1) und (2) können umfassen:
"eine aliphatische
Acylgruppe", wie
eine Alkylcarbonylgruppe, wie Formyl, Acetyl, Propionyl, Butyryl,
Isobutyryl, Pentanoyl, Pivaloyl, Valeryl, Isovaleryl, Octanoyl,
Nonanoyl, Decanoyl, 3-Methylnonanoyl, 8-Methylnonanoyl, 3-Ethyloctanoyl,
3,7-Dimethyloctanoyl, Undecanoyl, Dodecanoyl, Tridecanoyl, Tetradecanoyl,
Pentadecanoyl, Hexadecanoyl, 1-Methylpentadecanoyl, 14-Methylpentadecanoyl,
13,13-Dimethyltetradecanoyl, Heptadecanoyl, 15-Methylhexadecanoyl,
Octadecanoyl, 1-Methyl-heptadecanoyl, Nonadecanoyl, Eicosanoyl und
Heneicosanoyl, eine carboxylierte Alkylcarbonylgruppe, wie Succinoyl,
Glutaroyl und Adipoyl, eine Halogenniederalkylcarbonylgruppe, wie
Chloracetyl, Dichloracetyl, Trichloracetyl und Trifluoracetyl, eine
Niederalkoxyniederalkylcarbonylgruppe, wie Methoxyacetyl, und eine
ungesättigte
Alkylcarbonylgruppe, wie (E)-2-Methyl-2-butenoyl;
"eine aromatische Acylgruppe", wie eine Arylcarbonylgruppe,
wie Benzoyl, α-Naphthoyl
und α-Naphthoyl,
eine Halogenarylcarbonylgruppe, wie 2-Brombenzoyl und 4-Chlorbenzoyl,
eine niederalkylierte Arylcarbonylgruppe, wie 2,4,6-Trimethylbenzoyl
und 4-Toluoyl, eine niederalkoxylierte Arylcarbonylgruppe, wie 4-Anisoyl, eine carboxylierte
Arylcarbonylgruppe, wie 2-Carboxybenzoyl, 3-Carboxybenzoyl und 4-Carboxybenzoyl,
eine nitrierte Arylcarbonylgruppe, wie 4-Nitrobenzoyl und 2-Nitrobenzoyl,
eine niederalkoxycarbonylierte Arylcarbonylgruppe, wie 2-(Methoxycarbonyl)benzoyl
und eine arylierte Arylcarbonylgruppe, wie 4-Phenylbenzoyl;
"eine Niederalkoxycarbonylgruppe", wie Methoxycarbonyl,
Ethoxycarbonyl, t-Butoxycarbonyl und Isobutoxycarbonyl;
"eine Niederalkoxycarbonylgruppe,
die mit Halogen oder einer Tri-niederalkylsilylgruppe substituiert
ist", wie 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl
und 2-Trimethylsilylethoxycarbonyl;
"eine Alkenyloxycarbonylgruppe", wie Vinyloxycarbonyl
und Allyloxycarbonyl; und "eine
Aralkyloxycarbonylgruppe, worin der Arylring mit einer Niederalkoxygruppe
oder einer Nitrogruppe substituiert sein kann", wie Benzyloxycarbonyl, 4-Methoxybenzyloxycarbonyl,
3,4-Dimethoxybenzyloxycarbonyl, 2-Nitrobenzyloxycarbonyl, und 4-Nitrobenzyloxycarbonyl,
vorzugsweise "die
aliphatische Acylgruppe" oder "die aromatische Acylgruppe", stärker bevorzugt
eine Benzoylgruppe.
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"Die Aminogruppe,
die mit einer Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen substituiert
ist" bei R3 und R4 oder der α-Gruppe in den vorstehenden
Formeln (1) oder (2) können
Methylamino, Ethylamino, Propylamino, Isopropylamino, Butylamino,
Isobutylamino, s-Butylamino, tert-Butylamino, Dimethylamino, Diethylamino, Dipropylamino,
Diisopropylamino, Dibutylamino, Diisobutylamino, Di(s-butyl)amino
und Di(tert-butyl)amino, vorzugsweise Methylamino, Ethylamino, Dimethylamino,
Diethylamino oder Diisopropylamino.
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"Die Cyanalkoxygruppe
mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen" bei
R3 und R4 in der
vorstehenden Formel (1) stellt eine Gruppe dar, worin die vorstehend
beschriebene "Alkoxygruppe
mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen" mit einer
Cyangruppe substituiert ist, und eine solche Gruppe kann Cyanmethoxy,
2-Cyanethoxy, 3- Cyanpropoxy, 4-Cyanbutoxy,
3-Cyan-2-methylpropoxy oder 1-Cyanmethyl-1,1-dimethylmethoxy,
vorzugsweise eine 2-Cyanethoxygruppe umfassen.
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"Die Alkylgruppe mit
1 bis 4 Kohlenstoffatomen" der α-Gruppe in
der vorstehenden Formel (1) oder (2) kann Methyl, Ethyl, Propyl,
Isopropyl, Butyl, Isobutyl, s-Butyl und tert-Butyl, vorzugsweise
eine Methyl- oder Ethylgruppe umfassen.
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"Das Halogenatom" der α-Gruppe in
der vorstehenden Formel (1) oder (2) kann ein Fluoratom, ein Chloratom,
ein Bromatom oder ein Iodatom, vorzugsweise ein Fluoratom oder ein
Chloratom umfassen.
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Die
bevorzugten Gruppen der "Purin-9-ylgruppe" und der "substituierten Purin-9-ylgruppe" bei B in der vorstehenden
Formel (1) oder (2) kann als Ganzes 6-Aminopurin-9-yl (d. h. Adeninyl),
6-Aminopurin-9-yl, wobei die Aminogruppe geschützt ist, 2,6-Diaminopurin-9-yl,
2-Amino-6-chlorpurin-9-yl, 2-Amino-6-chlorpurin-9-yl, wobei die Aminogruppe
geschützt
ist, 2-Amino-6-fluorpurin-9-yl,
2-Amino-6-fluorpurin-9-yl, wobei die Aminogruppe geschützt ist,
2-Amino-6-brompurin-9-yl, 2-Amino-6-brompurin-9-yl, wobei die Aminogruppe
geschützt
ist, 2-Amino-6-hydroxypurin-9-yl
(d. h. Guaninyl), 2-Amino-6-hydroxypurin-9-yl, wobei die Aminogruppe geschützt ist,
2-Amino-6-hydroxypurin-9-yl, wobei die Aminogruppe und die Hydroxygruppe
geschützt
sind, 6-Amino-2-methoxypurin-9-yl, 6-Amino-2-chlorpurin-9-yl, 6-Amino-2-fluorpurin-9-yl,
2,6-Dimethoxypurin-9-yl, 2,6-Dichlorpurin-9-yl
oder 6-Mercaptopurin-9-yl, stärker
bevorzugt eine 6-Benzoylaminopurin-9-ylgruppe, eine Adeninylgruppe,
eine 2-Isobutyrylamino-6-hydroxypurin-9-ylgruppe oder eine Guaninylgruppe.
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Die
bevorzugten Gruppen der "2-Oxo-pyrimidin-1-ylgruppe" und der "substituierten 2-Oxo-pyrimidin-1-ylgruppe" bei B in der vorstehenden
Formel (1) oder (2) können
als Ganzes 2-Oxo-4- aminopyrimidin-1-yl (d.
h. Cytosinyl), 2-Oxo-4-aminopyrimidin-1-yl, wobei die Aminogruppe geschützt ist,
2-Oxo-4-amino-5-fluorpyrimidin-1-yl,
2-Oxo-4-amino-5-fluorpyrimidin-1-yl, wobei die Aminogruppe geschützt ist,
4-Amino-2-Oxo-5-chlorpyrimidin-1-yl, 2-Oxo-4-methoxypyrimidin-1-yl,
2-Oxo-4-mercaptopyrimidin-1-yl, 2-Oxo-4-hydroxypyrimidin-1-yl (d.
h. Uracinyl), 2-Oxo-4-hydroxy-5-methylpyrimidin-1-yl (d. h. Thyminyl)
oder 4-Amino-5-methyl-2-Oxo-pyrimidin-1-yl (d. h. 5-Methylcytosinyl)
umfassen, stärker
bevorzugt 2-Oxo-4-benzoylaminopyrimidin-1-yl, Cytosinyl, Thyminyl,
Uracinyl, 2-Oxo-4-benzoylamino-5-methyl-pyrimidin-1-yl
oder 5-Methylcytosinyl.
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"Das Nukleosidanaloge" bezieht sich auf
einen nicht-natürlichen
Typ eines "Nukleosids", worin Purin oder
Pyrimidin an Zucker gebunden ist.
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"Das Oligonukleotidanaloge" bezieht sich auf
einen nicht-natürlichen
Typ von "Oligonukleotid"-Derivaten, worin
2 bis 50 "Nukleoside", die gleich oder
unterschiedlich sein können, über eine
Phosphorsäurediesterbindung
verbunden sind, und solche Analoge können vorzugsweise Zuckerderivate,
worin der Zuckerrest modifiziert ist, Thioatderivate, worin der
Phosphorsäurediesterrest
zur Thioatgruppe umgewandelt worden ist, Esterprodukte, worin ein
terminaler Phosphorsäurerest
verestert ist, und Amidprodukte, worin eine Aminogruppe an einer
Purinbase amidiert ist, umfassen, stärker bevorzugt die Zuckerderivate,
worin der Zuckerrest modifiziert ist, und die Thioatderivate, worin
der Phosphorsäurediesterrest
zur Thioatgruppe umgewandelt worden ist.
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"Das Salz davon" betrifft Salze der
Verbindung (1) der vorliegenden Erfindung, da sie in Salze umgewandelt
werden können,
und solche Salze können
vorzugsweise anorganische Salze, wie Metallsalze, wie Alkalimetallsalze,
wie Natriumsalze, Kaliumsalze und Lithiumsalze, Erdalkalimetallsalze,
wie Calciumsalze und Magnesiumsalze, Aluminiumsalze, Eisensalze,
Zinksalze, Kupfersalze, Nickelsalze und Kobaltsalze, Aminsalze,
wie anorganische Salze, wie Ammoniumsalze, organische Salze, wie
t-Octylaminsalze,
Dibenzylaminsalze, Morpholinsalze, Glucosaminsalze, Phenylglycinalkylestersalze,
Ethylendiaminsalze, N-Methylglucaminsalze,
Guanidinsalze, Diethylaminsalze, Triethylaminsalze, Dicyclohexylaminsalze,
N,N'-Dibenzylethylendiaminsalze,
Chlorprocainsalze, Procainsalze, Diethanolaminsalze, N-Benzyl-phenethylaminsalze,
Piperazinsalze, Tetramethylammoniumsalze und Tris(hydroxymethyl)aminomethansalze,
anorganische Säuresalze,
wie Halogenwasserstoffsäuresalze,
wie Fluorwasserstoffsäuresalze,
Chlorwasserstoffsäuresalze,
Bromwasserstoffsäuresalze
und Iodwasserstoffsäuresalze,
Salpetersäuresalze,
Perchlorsäuresalze,
Schwefelsäuresalze und
Phosphorsäuresalze,
organische Säuresalze,
wie Niederalkansulfonsäuresalze,
wie Methansulfonsäuresalze,
Trifluormethansulfonsäuresalze
und Ethansulfonsäuresalze,
Arylsulfonsäuresalze,
wie Benzolsulfonsäuresalze
und p-Toluolsulfonsäuresalze,
Essigsäuresalze, Äpfelsäuresalze,
Fumarsäuresalze,
Bernsteinsäuresalze,
Citronensäuresalze,
Weinsäuresalze,
Oxalsäuresalze
und Maleinsäuresalze,
und Aminosäuresalze, wie
Glycinsalze, Lysinsalze, Argininsalze, Ornithinsalze, Glutaminsäuresalze
und Asparaginsäuresalze
umfassen.
-
Da
die modifizierten Oligonukleotide oder die Polynukleotidanalogen
der vorliegenden Erfindung in ein Salz umgewandelt werden können, beziehen
sich "die pharmakologisch
geeigneten Salze davon" auf
ein Salz davon, und solche Salze können vorzugsweise anorganische
Salze, wie Metallsalze, wie Alkalimetallsalze, wie Natriumsalze,
Kaliumsalze und Lithiumsalze, Erdalkalimetallsalze, wie Calciumsalze
und Magnesiumsalze, Aluminiumsalze, Eisensalze, Zinksalze, Kupfersalze,
Nickelsalze und Kobaltsalze, Aminsalze, wie anorganische Salze,
wie Ammoniumsalze, organische Salze, wie t-Octylaminsalze, Dibenzylaminsalze,
Morpholinsalze, Glucosaminsalze, Phenylglycinal kylestersalze, Ethylendiaminsalze,
N-Methylglucaminsalze, Guanidinsalze, Diethylaminsalze, Triethylaminsalze,
Dicyclohexylaminsalze, N,N'-Dibenzylethylendiaminsalze,
Chlorprocainsalze, Procainsalze, Diethanolaminsalze, N-Benzyl-phenethylaminsalze,
Piperazinsalze, Tetramethylammoniumsalze und Tris(hydroxymethyl)aminomethansalze,
anorganische Säuresalze,
wie Halogenwasserstoffsäuresalze,
wie Fluorwasserstoffsäuresalze,
Chlorwasserstoffsäuresalze,
Bromwasserstoffsäuresalze
und Iodwasserstoffsäuresalze,
salpetrige Säuresalze,
Perchlorsäuresalze,
Schwefelsäuresalze
und Phosphorsäuresalze,
organische Säuresalze,
wie Niederalkansulfonsäuresalze,
wie Methansulfonsäuresalze,
Trifluormethansulfonsäuresalze
und Ethansulfonsäuresalze,
Arylsulfonsäuresalze,
wie Benzolsulfonsäuresalze
und p-Toluolsulfonsäuresalze,
Essigsäuresalze, Äpfelsäuresalze,
Fumarsäuresalze,
Bernsteinsäuresalze,
Citronensäuresalze,
Weinsäuresalze,
Oxalsäuresalze
und Maleinsäuresalze,
und Aminosäuresalze,
wie Glycinsalze, Lysinsalze, Argininsalze, Ornithinsalze, Glutaminsäuresalze
und Asparaginsäuresalze
umfassen.
-
Unter
den erfindungsgemäßen Verbindungen
(1) und Salzen davon können
bevorzugte Verbindungen umfassen:
- (1) Verbindungen,
worin R1 ein Wasserstoffatom, eine aliphatische
Acylgruppe, eine aromatische Acylgruppe, eine Methylgruppe, die
mit 1 bis 3 Arylgruppen substituiert ist, eine Methylgruppe, die
mit 1 bis 3 Arylgruppen substituiert ist, deren Arylring mit einer
Niederalkylgruppe, Niederalkoxygruppe, einem Halogenatom oder einer
Cyangruppe substituiert ist, oder eine Silylgruppe ist, und Salze
davon;
- (2) Verbindung, worin R1 ein Wasserstoffatom,
eine Acetylgruppe, eine Benzoylgruppe, eine Benzylgruppe, eine p-Methoxybenzylgruppe,
eine Dimethoxytritylgruppe, eine Monomethoxytri tylgruppe oder eine
tert-Butyldiphenylsilylgruppe ist, und Salze davon;
- (3) Verbindung, worin R2 ein Wasserstoffatom,
eine aliphatische Acylgruppe, eine aromatische Acylgruppe, eine
Methylgruppe, die mit 1 bis 3 Arylgruppen substituiert ist, eine
Methylgruppe, die mit 1 bis 3 Arylgruppen substituiert ist, deren
Arylring mit einer Niederalkylgruppe, Niederalkoxygruppe, einem
Halogenatom oder einer Cyangruppe substituiert ist, eine Silylgruppe,
eine Phosphoramiditgruppe, eine Phosphonylgruppe, eine Phosphorsäuregruppe
oder eine geschützte
Phosphorsäuregruppe
ist, und Salze davon;
- (4) Verbindung, worin R2 ein Wasserstoffatom,
eine Acetylgruppe, eine Benzoylgruppe, eine Benzylgruppe, eine p-Methoxybenzylgruppe,
eine tert-Butyldiphenylsilylgruppe, -P(OC2H4CN)(NCH(CH3)2), -P(OCH3)(NCH(CH3)2), eine Phosphonylgruppe
oder eine 2-Chlorphenyl- oder 4-Chlorphenylphosphorsäuregruppe
ist, und Salze davon;
- (5) Verbindung, worin A eine Methylengruppe ist, und Salze davon;
- (6) Verbindung, worin B eine 6-Aminopurin-9-yl-(d. h. Adeninyl-),
6-Aminopurin-9-yl-, wobei die Aminogruppe geschützt ist, 2,6-Diaminopurin-9-yl-,
2-Amino-6-chlorpurin-9-yl-, 2-Amino-6-chlorpurin-9-yl-,
wobei die Aminogruppe geschützt
ist, 2-Amino-6-fluorpurin-9-yl-, 2-Amino-6-fluorpurin-9-yl-, wobei
die Aminogruppe geschützt
ist, 2-Amino-6-brompurin-9-yl-, 2-Amino-6-brompurin-9-yl, wobei die Aminogruppe
geschützt
ist, 2-Amino-6-hydroxypurin-9-yl- (d. h. Guaninyl-), 2-Amino-6-hydroxypurin-9-yl-,
wobei die Aminogruppe geschützt
ist, 2-Amino-6-hydroxypurin-9-yl-,
wobei die Aminogruppe und die Hydroxygruppe geschützt sind, 6-Amino-2-methoxypurin-9-yl-,
6-Amino-2-chlorpurin-9-yl-,
6-Amino-2-fluorpurin-9-yl-, 2,6- Dimethoxypurin-9-yl-,
2,6-Dichlorpurin-9-yl-, 6-Mercaptopurin-9-yl-, 2-Oxo-4-aminopyrimidin-1-yl-
(d. h. Cytosinyl-), 2-Oxo-4-aminopyrimidin-1-yl-,
wobei die Aminogruppe geschützt
ist, 2-Oxo-4-amino-5-fluorpyrimidin-1-yl-, 2-Oxo-4-amino-5-fluorpyrimidin-1-yl,
wobei die Aminogruppe geschützt
ist, 4-Amino-2-Oxo-5-chlorpyrimidin-1-yl-,
2-Oxo-4-methoxypyrimidin-1-yl-, 2-Oxo-4-mercaptopyrimidin-1-yl-,
2-Oxo-4-hydroxypyrimidin-1-yl-
(d. h. Uracinyl-), 2-Oxo-4-hydroxy-5-methylpyrimidin-1-yl- (d. h.
Thyminyl-), 4-Amino-5-methyl-2-oxo-pyrimidin-1-yl- (d. h. Methylcytosinyl-)
oder eine 4-Amino-5-methyl-2-oxopyrimidin-1-yl-Gruppe ist, worin
die Aminogruppe geschützt
ist, und Salze davon;
- (7) Verbindung, worin B eine 6-Benzoylaminopurin-9-yl-, Adeninyl-,
2-Isobutyrylamino-6-hydroxypurin-9-yl-, Guaninyl-, 2-Oxo-4-benzoylaminopyrimidin-1-yl-,
Cytosinyl-, 2-Oxo-5-methyl-4-benzoylaminopyrimidin-1-yl-,
5-Methylcytosinyl-, Uracinyl- oder
eine Thyminylgruppe ist, und Salze davon.
-
Die
vorstehenden Punkte (1) und (2), (3) und (4) oder (6) und (7) geben
die stärker
bevorzugten Verbindungen in aufsteigender Reihenfolge an, und in
der Formel (1) ist die Verbindung, die durch optionales Auswählen von
R1 aus (1) und (2), optionales R2 aus (3) und (4), optionales Auswählen von
A aus (5) und optionales Auswählen
von B aus (6) und (7) oder durch optionales Kombinieren erhalten
werden, und Salze davon bevorzugte Verbindungen, und die Verbindungen
und die Salze davon, die aus den folgenden Gruppen ausgewählt sind,
sind besonders bevorzugt.
-
(Gruppe von Verbindungen)
-
- 2'-O,4'-C-Ethylenguanosin,
- 2'-O,4'-C-Ethylenadenosin,
- 3',5'-Di-O-benzyl-2'-O,4'-C-ethylen-6-N-benzoyladenosin,
- 3',5'-Di-O-benzyl-2'-O,4'-C-ethylen-2-N-isobutyrylguanosin,
- 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-6-N-benzoyladenosin,
- 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-2-N-isobutyrylguanosin,
- 2'-O,4'-C-Ethylen-2-N-isobutyrylguanosin,
- 2'-O,4'-C-Ethylen-6-N-benzoyladenosin,
- 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-6-N-benzoyladenosin-3'-O-(2-cyanethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit,
- 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-2-N-isobutyrylguanosin-3'-O-(2-cyanethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit,
- 2'-O,4'-C-Ethylneuridin,
- 2'-O,4'-C-Ethylen-5-methyluridin,
- 2'-O,4'-C-Ethylencytidin,
- 2'-O,4'-C-Ethylen-5-methylcytidin,
- 3',5'-Di-O-benzyl-2'-O,4'-C-ethylneuridin,
- 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylneuridin,
- 3',5'-Di-O-benzyl-2'-O,4'-C-ethylen-5-methyluridin,
- 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-5-methyluridin,
- 3',5'-Di-O-benzyl-2'-O,4'-C-ethylen-4-N-benzoylcytidin,
- 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-4-N-benzoylcytidin,
- 3',5'-Di-O-benzyl-2'-O,4'-C-ethylen-4-N-benzoyl-5-methylcytidin,
- 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-4-N-benzoyl-5-methylcytidin,
- 2'-O,4'-C-Ethylen-4-N-benzoylcytidin,
- 2'-O,4'-C-Ethylen-4-N-benzoyl-5-methylcytidin,
- 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-uridin-3'-O-(2-cyanethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit,
- 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-5-methyluridin-3'-O-(2-cyanethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit,
- 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-4-N-benzoylcytidin-3'-O-(2-cyanethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit, und
- 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-4-N-benzoyl-5-methylcytidin-3'-O-(2-cyanethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit.
-
Unter
den Oligonukleotidanalogen, die eine oder zwei oder mehr Strukturen
der Formel (2) und die pharmakologisch geeigneten Salze davon der
vorliegenden Erfindung enthalten, können bevorzugte Verbindungen
umfassen:
- (8) Oligonukleotidanaloge, worin
A eine Methylengruppe ist, und pharmakologisch geeignete Salze davon;
- (9) Oligonukleotidanaloge, worin B eine 6-Aminopurin-9-yl- (d.h.
Adeninyl-), 6-Aminopurin-9-yl-, wobei die Aminogruppe geschützt ist,
2,6-Diaminopurin-9-yl-, 2-Amino-6-chlorpurin-9-yl-, 2-Amino-6-chlorpurin-9-yl-, wobei
die Aminogruppe geschützt
ist, 2-Amino-6-fluorpurin-9-yl-, 2-Amino-6-fluorpurin-9-yl-, wobei die
Aminogruppe geschützt
ist, 2-Amino-6-brompurin-9-yl-, 2-Amino-6-brompurin-9-yl, wobei
die Aminogruppe geschützt
ist, 2-Amino-6-hydroxypurin-9-yl- (d. h. Guaninyl-), 2-Amino-6-hydroxypurin-9-yl-,
wobei die Aminogruppe geschützt
ist, 2-Amino-6-hydroxypurin-9-yl-, wobei die Aminogruppe und die
Hydroxygruppen geschützt
sind, 6-Amino-2-methoxypurin-9-yl-,
6-Amino-2-chlorpurin-9-yl-, 6-Amino-2-fluorpurin-9-yl-, 2,6-Dimethoxypurin-9-yl-,
2,6-Dichlorpurin-9-yl-, 6-Mercaptopurin-9-yl-, 2-Oxo-4-aminopyrimidin-1-yl-
(d. h. Cytosinyl-), 2-Oxo-4-aminopyrimidin-1-yl-, wobei die Aminogruppe
geschützt
ist, 2-Oxo-4-amino-5-fluorpyrimidin-1-yl-, 2-Oxo-4-amino-5-fluorpyrimidin-1-yl,
wobei die Aminogruppe geschützt
ist, 4-Amino-2-Oxo-5-chlorpyrimidin-1-yl-,
2-Oxo-4-methoxypyrimidin-1-yl-,
2-Oxo-4-mercaptopyrimidin-1-yl-, 2-Oxo-4-hydroxypyrimidin-1-yl-
(d. h. Uracinyl-), 2-Oxo-4-hydroxy-5-methylpyrimidin-1-yl- (d. h.
Thyminyl-), 4-Amino-5-methyl-2-Oxo-pyrimidin-1-yl- (d. h. Methylcytosinyl-)
oder eine 4-Amino-5-methyl-2-oxopyrimidin-1-yl-Gruppe
ist, worin die Aminogruppe geschützt
ist, und pharmakologisch geeignete Salze davon; und
- (10) Oligonukleotidanaloge, worin B eine 6-Benzoylaminopurin-9-yl-, Adeninyl-,
2-Isobutyrylamino-6-hydroxypurin-9-yl-, Guaninyl-, 2-Oxo-4-benzoylaminopyrimidin-1-yl-,
Cytosinyl-, 2-Oxo-5-methyl-4-benzoylaminopyrimidin-1-yl-,
5-Methylcytosinyl-, Uracinyl- oder eine Thyminylgruppe ist, und
pharmakologisch geeignete Salze davon.
-
Die
vorstehenden Punkte (9) und (10) geben die stärker bevorzugten Oligonukleotidanalogen
in aufsteigender Reihenfolge an, und in der Formel (2) sind die
Oligonukleotidanalogen, die durch optionales Auswählen von
A aus (8) und optionales Auswählen
von B aus (9) und (10) oder durch optionales Kombinieren davon erhalten
werden, und die pharmakologisch geeigneten Salze davon bevorzugt.
-
Die
spezifischen Verbindungen, die in den erfindungsgemäßen Verbindungen
der vorstehenden Formel (1) enthalten sind, sind in den Tabellen
1 und 2 veranschaulicht. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind jedoch
nicht darauf beschränkt.
-
In
Tabelle 1 und Tabelle 2 gibt Bsp.-Vb.-Nr. die Beispielsverbindungsnummer
an, Me stellt eine Methylgruppe dar, Bn stellt eine Benzylgruppe
dar, Bz stellt eine Benzoylgruppe dar, PMB stellt eine p-Methoxybenzylgruppe
dar, Tr stellt eine Triphenylmethylgruppe dar, MMTr stellt eine
4-Methoxytriphenylmethyl (Monomethoxytrityl)-Gruppe dar, DMTr stellt
eine 4,4'-Dimethoxytriphenylmethyl
(Dimethoxytrityl)-Gruppe dar, TMTr stellt eine 4,4',4"-Trimethoxytriphenylmethyl
(Trimethoxytrityl)-Gruppe dar, TMS stellt eine Trimethylsilylgruppe dar,
TBDMS stellt eine tert-Butyldimethylsilylgruppe dar, TBDPS stellt
eine tert-Butyldiphenylsilylgruppe dar und TIPS stellt eine Triisopropylsilylgruppe
dar.
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In
den vorstehenden Tabellen 1 und 2 umfassen bevorzugte Verbindungen
die folgenden Verbindungen: (1-5), (1-7), (1-23), (1-24), (1-31),
(1-35), (1-39), (1-43), (1-49), (1-51), (1-67), (1-68), (1-75), (1-79), (1-83), (1-87),
(1-93), (1-95), (1-111), (1-112), (1-119), (1-123), (1-127), (1-131),
(1-137), (1-139), (1-155), (1-156), (1-163), (1-167), (1-171), (1-175),
(1-177), (1-178), (1-185), (1-186), (1-193), (1-194), (1-201), (1-202),
(2-1), (2-2), (2-3), (2-4), (2-10), (2-15), (2-19), (2-22), (2-27),
(2-31), (2-34), (2-39), (2-43), (2-46), (2-51), (2-55), (2-57), (2-58), (2-59),
(2-60), (2-66), (2-71), (2-75), (2-78), (2-83), (2-87), (2-90),
(2-95), (2-99), (2-102),
(2-107), (2-111), (2-113), (2-114), (2-115), (2-116), (2-122), (2-127),
(2-131), (2-134), (2-139), (2-143), (2-146), (2-151), (2-155), (2-158),
(2-163), (2-167), (2-169), (2-170), (2-171), (2-172), (2-178), (2-183),
(2-187), (2-190), (2-195), (2-199), (2-202), (2-207), (2-211), (2-214),
(2-219), (2-223), (2-225), (2-226), (2-233), (2-234) , (2-235) oder (2-236).
-
Stärker bevorzugte
Verbindungen können
umfassen:
2'-O,4'-C-Ethylenguanosin
(1-5),
2'-O,4'-C-Ethylenadenosin
(1-7),
3',5'-Di-O-benzyl-2'-O,4'-C-ethylen-6-N-benzoyladenosin
(1-23) ,
3',5'-Di-O-benzyl-2'-O,4'-C-ethylen-2-N-isobutyrylguanosin
(1-24),
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-6-N-benzoyladenosin
(1-31) ,
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-2-N-isobutyrylguanosin
(1-35),
2'-O,4'-C-Ethylen-2-N-isobutyrylguanosin
(1-177),
2'-O,4'-C-Ethylen-6-N-benzoyladenosin
(1-178),
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-6-N-benzoyladenosin-3'-O-(2-cyanethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit
(1-185),
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-2-N-isobutyrylguanosin-3'-O-(2-cyanethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit
(1-186),
2'-O,4'-C-Ethylneuridin
(2-1),
2'-O,4'-C-Ethylen-5-methyluridin
(2-2),
2'-O,4'-C-Ethylencytidin
(2-3),
2'-O,4'-C-Ethylen-5-methylcytidin
(2-4),
3',5'-Di-O-benzyl-2'-O,4'-C-ethylneuridin
(2-10),
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylneuridin
(2-15),
3',5'-Di-O-benzyl-2'-O,4'-C-ethylen-5-methyluridin
(2-22),
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-5-methyluridin
(2-27),
3',5'-Di-O-benzyl-2'-O,4'-C-ethylen-4-N-benzoylcytidin
(2-34),
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-4-N-benzoylcytidin
(2-39) ,
3',5'-Di-O-benzyl-2'-O,4'-C-ethylen-4-N-benzoyl-5-methylcytidin
(2-46) ,
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-4-N-benzoyl-5-methylcytidin (2-51),
2'-O,4'-C-Ethylen-4-N-benzoylcytidin
(2-225),
2'-O,4'-C-Ethylen-4-N-benzoyl-5-methylcytidin
(2-226),
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-uridin-3'-O-(2-cyanethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit
(2-233),
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-5-methyluridin-3'-O-(2-cyanethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit (2-234),
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-4-N-benzoylcytidin-3'-O-(2-cyanethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit (2-235),
und
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-4-N-benzoyl-5-methylcytidin-3'-O-(2-cyanethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit
(2-236).
-
Die
erfindungsgemäße Verbindung
(1) kann nach dem nachstehend Verfahren
A
beschriebenen Verfahren A hergestellt werden.
-
In
Verfahren A stellt X eine Schutzgruppe dar, Y stellt eine Schutzgruppe
dar, A hat die gleiche Bedeutung wie vorstehend definiert, während B1 eine Purin-9-ylgruppe, eine substituierte
Purin-9-ylgruppe oder eine substituierte 2-Oxo-pyrimidin-1-ylgruppe darstellt,
wobei die Substituenten unter den vorstehend genannten Substituenten α ausgewählt sind,
jedoch ausschließlich
einer ungeschützten
Aminogruppe einer "Aminogruppe,
die geschützt
sein kann", während B2 eine Purin-9-ylgruppe, eine substituierte
Purin-9-ylgruppe oder eine substituierte 2-Oxo-pyrimidin-1-ylgruppe
darstellt, wobei die Substituenten unter den vorstehend genannten Substituenten α ausgewählt sind,
jedoch ausschließlich
einer geschützten
Aminogruppe einer "Aminogruppe, die
geschützt
sein kann", R7 stellt eine Gruppe dar, die eine Austrittsgruppe
bildet, und R8 stellt eine aliphatische
Acylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen dar.
-
Die
Schutzgruppe von X ist dieselbe Gruppe wie "die Hydroxyschutzgruppe" im vorstehend genannten Substituenten
R1.
-
Die
Schutzgruppe von Y ist dieselbe Gruppe wie "die Hydroxyschutzgruppe" im vorstehend genannten Substituenten
R2.
-
"Die Gruppe, die eine
Austrittsgruppe bildet" in
R7 kann eine Niederalkylsulfonylgruppe,
wie Methansulfonyl und Ethansulfonyl, eine Halogen-substituierte
Niederalkylsulfonylgruppe, wie Trifluormethansulfonyl, und eine
Arylsulfonylgruppe, wie p-Toluolsulfonyl,
vorzugsweise eine Methansulfonylgruppe oder eine p-Toluolsulfonylgruppe
umfassen.
-
"Die aliphatische
Acylgruppe mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen" in R8 kann
Acetyl, Propionyl, Butyryl und dergleichen, vorzugsweise Acetyl
umfassen.
-
Im
Folgenden wird jede Stufe des Verfahrens A eingehend beschrieben.
-
(Stufe A-1)
-
In
dieser Stufe wird eine Verbindung (4) durch Umsetzen einer Verbindung
(3), die durch die nachstehend beschriebenen Methoden B bis D hergestellt
werden kann, mit einem Reagens zur Einführung einer Austrittsgruppe
in Anwesenheit eines Basenkatalysators in einem inerten Lösungsmittel
hergestellt.
-
Das
hier einsetzbare Lösungsmittel
umfasst aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Hexan, Heptan, Ligroin
und Petroleumether, aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol,
Toluol und Xylol, halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid,
Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Dichlorethan, Chlorbenzol und
Dichlorbenzol, Ester, wie Ethylformiat, Ethylacetat, Propylacetat,
Butylacetat und Diethylcarbonat, Ether, wie Diethylether, Diisopropylether,
Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethoxyethan und Diethylenglycoldimethylether,
Ketone, wie Aceton, Methylethylketon, Methylisobutylketon, Isophoron
und Cyclohexanon, Nitroverbindungen, wie Nitroethan und Nitrobenzol,
Nitrile, wie Acetonitril und Isobutyronitril, Amide, wie Formamid,
N,N-Dimethylformamid, N,N-Dimethylacetamid, N-Methyl-2-pyrrolidon, N-Methylpyrrolidinon
und Hexamethylphosphorsäuretriamid,
Sulfoxide, wie Sulfolan, und Pyridinderivate, vorzugsweise Pyridin.
-
Der
hier einsetzbare Basenkatalysator kann vorzugsweise eine Base, wie
Triethylamin, Pyridin und Dimethylaminopyridin umfassen.
-
Das
Reagens zum Einführen
einer Austrittsgruppe kann Alkylsulfonylhalogenide, wie Methansulfonylchlorid
und Ethansulfonylbromid, und Arylsulfonylhalogenide, wie p-Toluolsulfonylchlorid,
vorzugsweise Methansulfonylchlorid und p-Toluolsulfonylchlorid umfassen.
-
Die
Reaktionstemperatur variiert in Abhängigkeit vom Ausgangsmaterial,
dem Lösungsmittel,
dem Reagens zum Einführen
einer Austrittsgruppe und des Basenkatalysators, sie ist jedoch üblicherweise
0°C bis 50°C, vorzugsweise
10°C bis
40°C.
-
Die
Reaktionsdauer variiert in Abhängigkeit
vom Ausgangsmaterial, dem Lösungsmittel,
dem Reagens zum Einführen
einer Austrittsgruppe, dem Basenkatalysator und der Reaktionstemperatur,
sie ist jedoch üblicherweise
10 Minuten bis 24 Stunden, vorzugsweise 1 bis 10 Stunden.
-
Nach
der Reaktion wird die gewünschte
erfindungsgemäße Verbindung
(4) erhalten, beispielsweise durch Neutralisieren der Reaktionslösung, Konzentrieren
des Reaktionsgemisches, Zugeben eines mit Wasser nicht mischbaren
organischen Lösungsmittels,
wie Ethylacetat, Waschen mit Wasser, Abtrennen einer organischen
Schicht, die die gewünschte
Verbindung enthält,
Trocknen über
wasserfreiem Magnesiumsulfat und Abdestillieren des Lösungsmittels.
-
Das
so erhaltene gewünschte
Produkt kann, falls erforderlich, durch herkömmliche Verfahren, wie Umkristallisation
und Kieselgelsäulenchromatographie
weiter gereinigt werden.
-
(Stufe A-2)
-
In
dieser Stufe wird die Verbindung (5) durch Umsetzen der Verbindung
(4), die in Stufe A-1 hergestellt wurde, mit einem Säureanhydrid
in Anwesenheit eines Säurekatalysators
in einem Lösungsmittel
hergestellt.
-
Das
hier einsetzbare Lösungsmittel
kann Ether, wie Diethylether, Dioxan und Tetrahydrofuran, Nitrile, wie
Acetonitril und Isobutyronitril, Amide, wie Formamid, N,N-Dimethylformamid,
N,N-Dimethylacetamid, N-Methyl-2-pyrrolidon, N-Methylpyrrolidinon und Hexamethylphosphorsäuretriamid,
und organische Säuren, wie
Essigsäure,
vorzugsweise Essigsäure
umfassen.
-
Der
hier einsetzbare Säurekatalysator
kann anorganische Säuren,
wie Chlorwasserstoffsäure,
Schwefelsäure
und Salpetersäure,
vorzugsweise Schwefelsäure
(insbesondere konzentrierte Schwefelsäure) umfassen.
-
Das
hier einsetzbare Säureanhydrid
kann ein Anhydrid einer niederaliphatischen Carbonsäure, wie Essigsäureanhydrid
und Propionsäureanhydrid,
vorzugsweise Essigsäureanhydrid
umfassen.
-
Die
Reaktionstemperatur variiert in Abhängigkeit vom Ausgangsmaterial,
dem Lösungsmittel,
dem Säurekatalysator
und dem Säureanhydrid
und ist üblicherweise
0°C bis
50°C, vorzugsweise
10°C bis
40°C.
-
Die
Reaktionsdauer variiert in Abhängigkeit
vom Ausgangsmaterial, dem Lösungsmittel,
dem Säurekatalysator,
dem Säureanhydrid
und der Reaktionstemperatur, sie ist jedoch üblicherweise 10 Minuten bis
12 Stunden, vorzugsweise 30 Minuten bis 3 Stunden.
-
Nach
der Reaktion wird die gewünschte
erfindungsgemäße Verbindung
(5) beispielsweise durch Konzentrieren des Reaktionsgemisches, Zugeben
eines organischen Lösungsmittels,
das mit Wasser nicht mischbar ist, wie Ethylacetat, Waschen mit
Wasser, Abtrennen einer organischen Schicht, die die gewünschte Verbindung
enthält,
Trocknen über
wasserfreiem Magnesiumsulfat und Abdestillieren des Lösungsmittels
erhalten.
-
Das
so erhaltene gewünschte
Produkt kann, falls erforderlich, durch herkömmliche Verfahren, wie Umkristallisation,
Kieselgelsäulenchromatographie
und dergleichen weiter gereinigt werden.
-
(Stufe A-3)
-
In
dieser Stufe wird die Verbindung (6) durch Umsetzen der Verbindung
(5), hergestellt in Stufe A-2, mit einer trimethylsilylierten Verbindung,
die dem Purin oder Pyrimidin entspricht, welches einen gewünschten Substituenten
haben kann, der wie in der Literatur beschrieben hergestellt wird
(H. Vorbrggen, K. Krolikiewicz und B. Bennua, Chem. Ber., 114, 1234–1255 (1981)),
in Anwesenheit eines Säurekatalysators
und eines inerten Lösungsmittels
hergestellt.
-
Das
hier einsetzbare Lösungsmittel
umfasst aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol, Xylol,
halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid, Chloroform,
Tetrachlorkohlenstoff, 1,2-Dichlorethan, Chlorbenzol und Dichlorbenzol,
Nitrile, wie Acetonitril und Isobutyronitril, Amide, wie Formamid,
N,N-Dimethylformamid, N,N-Dimethylacetamid, N-Methyl-2-pyrrolidon, N-Methylpyrrolidinon
und Hexamethylphosphorsäuretriamid,
Kohlenstoffsulfid, vorzugsweise 1,2-Dichlorethan umfassen.
-
Der
hier einsetzbare Säurekatalysator
kann Lewis-Säurekatalysatoren,
wie AlCl3, SnCl4,
TiCl4, ZnCl2, BF3, Trimethylsilyltrifluormethansulfonat,
vorzugsweise Trimethylsilyltrifluormethansulfonat umfassen.
-
Die
Reaktionstemperatur variiert in Abhängigkeit vom Ausgangsmaterial,
dem Lösungsmittel
und dem Säurekatalysator,
sie ist jedoch üblicherweise
0°C bis
100°C, vorzugsweise
50°C bis
80°C.
-
Die
Reaktionsdauer variiert in Abhängigkeit
vom Ausgangsmaterial, dem Lösungsmittel,
dem Säurekatalysator
und der Reaktionstemperatur, sie ist jedoch üblicherweise 1 Stunde bis 24
Stunden, vorzugsweise 1 Stunde bis 8 Stunden.
-
Nach
der Reaktion wird die gewünschte
Verbindung (6) dieser Reaktion beispielsweise durch Konzentrieren
des Reaktionsgemisches, Zugeben eines mit Wasser nicht mischbaren
organischen Lösungsmittels, wie
Ethylacetat, Waschen mit Wasser, Abtrennen einer organischen Schicht,
die die gewünschte
Verbindung enthält,
Trocknen über
wasserfreiem Magnesiumsulfat und Abdestillieren des Lösungsmittels
erhalten.
-
Das
so erhaltene gewünschte
Produkt kann, falls erforderlich, durch ein herkömmliches Verfahren, beispielsweise
durch Umkristallisation, Kieselgelsäulenchromatographie und dergleichen
weiter gereinigt werden.
-
(Stufe A-4)
-
In
dieser Stufe wird die erfindungsgemäße Verbindung (1a) durch Cyclisieren
der in Stufe A-3 hergestellten Verbindung (6) in Anwesenheit eines
Basenkatalysators in einem inerten Lösungsmittel hergestellt.
-
Das
hier einsetzbare Lösungsmittel
umfasst Wasser, Pyridinderivate, Acetonitrile, wie Acetonitril und Isobutyronitril,
Amide, wie Formamid, N,N-Dimethylformamid, N,N-Dimethylacetamid,
N-Methyl-2-pyrrolidon, N-Methylpyrrolidinon und Hexamethylphosphorsäuretriamid,
und ein Gemisch davon, vorzugsweise ein Gemisch aus Wasser und Pyridin
umfassen.
-
Der
hier einsetzbare Basenkatalysator kann Alkalimetallhydroxide, wie
Natriumhydroxid und Kaliumhydroxid, Alkalimetallcarbonate, wie Natriumcarbonat
und Kaliumcarbonat, Alkalimetallalkoxide, wie Natriummethoxid und
Natriumethoxid, und wässri ges
Ammoniak, vorzugsweise Alkalimetallhydroxide (insbesondere Natriumhydroxid)
umfassen.
-
Die
Reaktionstemperatur variiert in Abhängigkeit vom Ausgangsmaterial,
dem Lösungsmittel
und dem Basenkatalysator, sie ist jedoch üblicherweise 0°C bis 50°C, vorzugsweise
10°C bis
30°C.
-
Die
Reaktionsdauer variiert in Abhängigkeit
vom Ausgangsmaterial, dem Lösungsmittel,
dem Säurekatalysator
und der Reaktionstemperatur, sie ist jedoch üblicherweise 1 Minute bis 5
Stunden, vorzugsweise 1 Minute bis 30 Minuten.
-
Nach
der Reaktion wird die gewünschte
Verbindung (1a) der vorliegenden Reaktion beispielsweise durch Konzentrieren
des Reaktionsgemisches, Zugeben eines mit Wasser nicht mischbaren
organischen Lösungsmittels,
wie Ethylacetat, Waschen mit Wasser, Abtrennen einer organischen
Schicht, die die gewünschte Verbindung
enthält,
Trocknen über
wasserfreiem Magnesiumsulfat und Abdestillieren des Lösungsmittels
erhalten.
-
Das
so erhaltene gewünschte
Produkt kann, falls erforderlich, durch ein herkömmliches Verfahren, wie Umkristallisation,
Kieselgelsäulenchromatographie
und dergleichen weiter gereinigt werden.
-
(Stufe A-5)
-
In
dieser Stufe wird die Verbindung (1b) durch Umsetzen der in Stufe
A-4 erhaltenen Verbindung (1a) mit einem Reagens zum Entfernen einer
Schutzgruppe in einem inerten Lösungsmittel
hergestellt.
-
Das
Verfahren zum Entfernen einer Schutzgruppe variiert in Abhängigkeit
von der Art der Schutzgruppe und ist nicht besonders eingeschränkt, solange
es keine anderen Nebenreaktionen bewirkt, und es kann beispielsweise
gemäß den in "Protective Groups
in Organic Synthesis" (Theodora
W. Greene und Peter G. M. Wuts, 1999, herausgegeben von Wiley-Interscience
Publication) beschriebenes Verfahren durchgeführt werden.
-
Insbesondere
kann das Verfahren zum Entfernen der Schutzgruppe durch das folgende
Verfahren hergestellt werden, wenn die Schutzgruppe (1) "eine aliphatische
Acylgruppe oder eine aromatische Acylgruppe", (2) "eine Methylgruppe, die mit 1 bis 3 Arylgruppen
substituiert ist" oder "eine Methylgruppe,
die mit 1 bis 3 Arylgruppen substituiert ist, wobei die Arylgruppe
mit einer Niederalkylgruppe, eine Niederalkoxygruppe, einem Halogenatom
oder einer Cyangruppe substituiert ist" oder (3) "eine Silylgruppe" ist.
-
(1)
Wenn die Schutzgruppe eine aliphatische Acylgruppe oder eine aromatische
Acylgruppe ist, kann die Reaktion zum Entfernen der Schutzgruppe
durch Behandlung mit einer Base in einem inerten Lösungsmittel
durchgeführt
werden.
-
Das
hier einsetzbare Lösungsmittel
ist nicht besonders eingeschränkt,
solange es mit Wasser einfach mischbar ist, keine Reaktion zeigt
und das Ausgangsmaterial zu einem gewissen Grad auflösen kann,
und es kann wässrige
oder wasserfreie Amide, wie Dimethylformamid und Dimethylacetamid,
halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid, Chloroform,
1,2-Dichlorethan oder Tetrachlorkohlenstoff, und Ether, wie Tetrahydrofuran,
Diethylether und Dioxan, vorzugsweise Ether, stärker bevorzugt Tetrahydrofuran
umfassen.
-
Die
hier einsetzbare Base kann Alkalimetallhydroxide, wie Lithiumhydroxid,
Kaliumhydroxid und Natriumhydroxid, Alkalimetallcarbonate, wie Natriumcarbonat
und Kaliumcarbonat, Alkalimetallalkoxide, wie Natriummethoxid und
Natriumethoxid, und eine Ammoniaklösung, wässriges Ammoniak und eine Ammoniak/Methanol-Lösung umfassen.
-
Die
Reaktionstemperatur ist 0°C
bis 60°C,
vorzugsweise 20°C
bis 40°C.
-
Die
Reaktionsdauer ist 10 Minuten bis 24 Stunden, vorzugsweise 1 Stunde
bis 3 Stunden.
-
Nach
der Reaktion wird die gewünschte
Verbindung (1b) der vorliegenden Reaktion beispielsweise durch Konzentrieren
des Reaktionsgemisches, Zugeben eines mit Wasser nicht mischbaren
organischen Lösungsmittels,
wie Ethylacetat, Waschen mit Wasser, Abtrennen einer organischen
Schicht, die die gewünschte Verbindung
enthält,
Trocknen über
wasserfreiem Magnesiumsulfat und Abdestillieren des Lösungsmittels
erhalten.
-
Das
so erhaltene gewünschte
Produkt kann, falls erforderlich, durch ein herkömmliches Verfahren, wie Umkristallisation,
Kieselgelsäulenchromatographie
und dergleichen weiter gereinigt werden.
-
(2)
Wenn die Schutzgruppe "eine
Methylgruppe, die mit einer bis drei Arylgruppen substituiert ist" oder "eine Methylgruppe,
die mit einer bis drei Arylgruppen substituiert ist, wobei der Arylring
mit einer Niederalkylgruppe, Niederalkoxygruppe, einem Halogenatom
oder einer Cyangruppe substituiert ist" ist, wird die Reaktion in einem inerten
Lösungsmittel
unter Einsatz eines Reduktionsmittels durchgeführt.
-
Das
hier einsetzbare Lösungsmittel
kann vorzugsweise Alkohole, wie Methanol, Ethanol und Isopropanol,
Ether, wie Diethylether, Tetrahydrofuran und Dioxan, aromatische
Kohlenwasserstoffe, wie Toluol, Benzol und Xylol, aliphatische Kohlenwasserstoffe,
wie Hexan und Cyclohexan, Ester, wie Ethylacetat und Propylacetat,
organische Säuren,
wie Essigsäure,
oder ein Gemisch dieser organischen Lösungsmittel und Wasser umfassen.
-
Das
hier einsetzbare Reduktionsmittel ist nicht besonders eingeschränkt, solange
es üblicherweise
für eine
katalytische Re duktion eingesetzt wird, und es kann vorzugsweise
Palladium auf Kohlenstoff, Raney-Nickel, Platinoxid, Platinschwarz,
Rhodiumaluminiumoxid, Triphenylphosphinrhodiumchlorid und Palladiumbariumsulfat
umfassen.
-
Der
Druck ist nicht besonders eingeschränkt, er ist jedoch üblicherweise
1 bis 10 atm.
-
Die
Reaktionstemperatur ist 0°C
bis 60°C,
vorzugsweise 20°C
bis 40°C.
-
Die
Reaktionsdauer ist 10 Minuten bis 24 Stunden, vorzugsweise 1 bis
3 Stunden.
-
Nach
der Reaktion wird die gewünschte
Verbindung (1b) der vorliegenden Reaktion beispielsweise durch Entfernen
des Reduktionsmittels aus dem Reaktionsgemisch, Zugeben eines mit
Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels, wie Ethylacetat,
Waschen mit Wasser, Abtrennen einer organischen Schicht, die die
gewünschte
Verbindung enthält,
Trocknen über
wasserfreiem Magnesiumsulfat und Abdestillieren des Lösungsmittels
erhalten.
-
Das
so erhaltene gewünschte
Produkt kann, falls erforderlich, durch ein herkömmliches Verfahren, wie Umkristallisation,
Kieselgelsäulenchromatographie
und dergleichen weiter gereinigt werden.
-
Wenn
die Schutzgruppe "eine
Methylgruppe, die mit 3 Arylgruppen substituiert ist", d. h. eine Tritylgruppe
ist, kann die Reaktion zum Entfernen der Schutzgruppe auch unter
Einsatz einer Säure
durchgeführt werden.
-
In
diesem Fall kann das hier eingesetzte Lösungsmittel aromatische Kohlenwasserstoffe,
wie Benzol, Toluol and Xylol, halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie
Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, 1,2-Dichlorethan,
Chlorbenzol und Dich lorbenzol, Alkohole, wie Methanol, Ethanol,
Isopropanol und tert-Butanol, Nitrile, wie Acetonitril und Isobutyronitril,
Amide, wie Formamid, N,N-Dimethylformamid, N,N-Dimethylacetamid,
N-Methyl-2-pyrrolidon, N-Methylpyrrolidinon und Hexamethylphosphorsäuretriamid,
und organische Säuren,
wie Essigsäure,
vorzugsweise organische Säuren
(insbesondere Essigsäure)
oder Alkohole (insbesondere tert-Butanol) umfassen.
-
Die
hier einsetzbare Säure
umfasst vorzugsweise Essigsäure
oder Trifluoressigsäure.
-
Die
Reaktionstemperatur ist 0°C
bis 60°C,
vorzugsweise 20°C
bis 40°C.
-
Die
Reaktionsdauer ist 10 Minuten bis 24 Stunden, vorzugsweise 1 bis
3 Stunden.
-
Nach
der Reaktion kann die gewünschte
Verbindung (1b) der vorliegenden Reaktion durch Neutralisieren des
Reaktionsgemisches, Zugeben eines mit Wasser nicht mischbaren organischen
Lösungsmittels, wie
Ethylacetat, Waschen mit Wasser, Abtrennen einer organischen Schicht,
die die gewünschte
Verbindung enthält,
Trocknen über
wasserfreiem Magnesiumsulfat und Abdestillieren des Lösungsmittels
erhalten werden.
-
Das
so erhaltene gewünschte
Produkt kann, falls erforderlich, durch ein herkömmliches Verfahren, wie Umkristallisation,
Kieselgelsäulenchromatographie
und dergleichen weiter gereinigt werden.
-
(3)
Wenn die Schutzgruppe "eine
Silylgruppe" ist,
kann sie üblicherweise
durch Behandlung mit einer Verbindung, die ein Fluoranion bildet,
wie Tetrabutylammoniumfluorid, Fluorwasserstoffsäure, Fluorwasserstoffsäurepyridin
und Kaliumfluorid, oder mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Methansulfonsäure, para-Toluolsulfonsäure, Trifluoressigsäure und
Trifluor methansulfonsäure,
oder anorganische Säuren,
wie Chlorwasserstoffsäure,
entfernt werden.
-
Wenn
die Schutzgruppe mit einem Fluoranion entfernt wird, wird die Reaktion
manchmal durch Zugeben von organischen Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure und
Propionsäure
gefördert.
-
Das
hier einsetzbare Lösungsmittel
ist nicht besonders eingeschränkt,
solange es keine Reaktion zeigt und das Ausgangsmaterial zu einem
gewissen Grad auflöst,
und es kann vorzugsweise Ether, wie Diethylether, Diisopropylether,
Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethoxyethan und Diethylenglycoldimethylether,
Nitrile, wie Acetonitril und Isobutyronitril, Wasser, organische
Säuren,
wie Essigsäure,
und ein Gemisch davon umfassen.
-
Die
Reaktionstemperatur ist 0°C
bis 100°C,
vorzugsweise 20°C
bis 70°C.
-
Die
Reaktionsdauer ist 5 Minuten bis 48 Stunden, vorzugsweise 1 Stunde
bis 24 Stunden.
-
Nach
der Reaktion wird die gewünschte
Verbindung (1b) der vorliegenden Reaktion beispielsweise durch Konzentrieren
des Reaktionsgemisches, Zugeben eines mit Wasser nicht mischbaren
organischen Lösungsmittels,
wie Ethylacetat, Waschen mit Wasser, Abtrennen einer organischen
Schicht, die die gewünschte Verbindung
enthält,
Trocknen über
wasserfreiem Magnesiumsulfat und Abdestillieren des Lösungsmittels
erhalten.
-
Das
so erhaltene gewünschte
Produkt kann, falls erforderlich, durch ein herkömmliches Verfahren, wie Umkristallisation,
Kieselgelsäulenchromatographie
und dergleichen weiter gereinigt werden.
-
(Stufe A-6)
-
In
dieser Stufe wird die erfindungsgemäße Verbindung (1c) durch Umsetzen
der in Stufe A-5 erhaltenen Verbindung (1b) mit einem Reagens zum
Entfernen einer Schutzgruppe in einem inerten Lösungsmittel hergestellt.
-
Das
Verfahren zur Entfernung der Schutzgruppe variiert in Abhängigkeit
von der Art der Schutzgruppe und ist nicht besonders eingeschränkt, solange
es keine anderen Nebenreaktionen bewirkt, und es kann beispielsweise
durch das in "Protective
Groups in Organic Synthesis" (von
Theodora W. Greene, 1981, herausgegeben von A Wiley-Interscience
Publication) beschriebene Verfahren durchgeführt werden.
-
Das
Verfahren zum Entfernen der Schutzgruppe kann insbesondere durch
das folgende Verfahren durchgeführt
werden, wenn die Schutzgruppe eine aliphatische Acylgruppe oder
eine aromatische Acylgruppe ist.
-
Das
Verfahren zum Entfernen der Schutzgruppe wird üblicherweise durch Umsetzen
mit einer Base in einem inerten Lösungsmittel durchgeführt, wenn
die Schutzgruppe eine aliphatische Acylgruppe oder eine aromatische
Acylgruppe ist.
-
Das
hier einsetzbare Lösungsmittel
ist nicht besonders eingeschränkt,
solange es mit Wasser leicht mischbar ist, keine Reaktion zeigt
und das Ausgangsmaterial zu einem gewissen Grad auflöst, und
es kann wässrige
oder wasserfreie Alkohole, wie Methanol und Ethanol, Amide, wie
Dimethylformamid und Dimethylacetamid, halogenierte Kohlenwasserstoffe,
wie Methylenchlorid, Chloroform, 1,2-Dichlorethan oder Tetrachlorkohlenstoff,
und Ether, wie Tetrahydrofuran, Diethylether und Dioxan, vorzugsweise
Alkohole, stärker
bevorzugt Methanol umfassen.
-
Die
hier eingesetzte Base kann Alkalimetallhydroxide, wie Lithiumhydroxid,
Kaliumhydroxid und Natriumhydroxid, Alkalime tallcarbonate, wie Natriumcarbonat
und Kaliumcarbonat, Alkalimetallalkoxide, wie Natriummethoxid und
Natriumethoxid, und Ammoniak, vorzugsweise Ammoniak umfassen.
-
Die
Reaktionstemperatur ist 0°C
bis 50°C,
vorzugsweise 10°C
bis 40°C.
-
Die
Reaktionsdauer ist 10 Minuten bis 24 Stunden, vorzugsweise 10 Minuten
bis 15 Stunden.
-
Nach
der Reaktion wird die gewünschte
Verbindung (1c) der vorliegenden Reaktion beispielsweise durch Konzentrieren
des Reaktionsgemisches, Zugeben eines mit Wasser nicht mischbaren
organischen Lösungsmittels,
wie Ethylacetat, Waschen mit Wasser, Abtrennen einer organischen
Schicht, die die gewünschte Verbindung
enthält,
Trocknen über
wasserfreiem Magnesiumsulfat und Abdestillieren des Lösungsmittels
erhalten.
-
Das
so erhaltene gewünschte
Produkt kann, falls erforderlich, durch ein herkömmliches Verfahren, wie Umkristallisation,
Kieselgelsäulenchromatographie
und dergleichen weiter gereinigt werden.
-
Das
vorstehend beschriebene Intermediat (3) kann durch die nachstehend
beschriebenen Verfahren B bis D hergestellt werden.
-
-
In
den Verfahren B bis D haben X und Y dieselben Bedeutungen wie vorstehend
definiert, R9 stellt eine Gruppe dar, die
eine Austrittsgruppe bildet, E stellt eine Ethylen-, Trimethylen- oder Tetramethylengruppe
dar, und Z stellt eine Einfachbindung, eine Methylen- oder Ethylengruppe
dar.
-
Die
Gruppe, die eine Austrittsgruppe bildet, in R9 kann
die vorstehend in R7 beschriebene Gruppe
umfassen, vorzugsweise eine Trifluormethansulfonylgruppe.
-
R11 und R12 sind identisch
und stellen ein Wasserstoffatom oder zusammen ein Sauerstoffatom
dar.
-
Wenn
R11 und R12 zusammen
ein Sauerstoffatom bilden, stellt R10 eine
Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen dar, wie Methyl, Ethyl,
Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, s-Butyl und tert-Butyl, vorzugsweise
eine Methylgruppe. Wenn R11 und R12 gleich sind und ein Wasserstoffatom darstellen,
kann R10 eine Aralkylgruppe, wie eine Benzylgruppe,
eine Alkoxyalkylgruppe, wie eine Methoxymethylgruppe, eine Arylcarbonyloxymethylgruppe,
wie eine Benzoyloxymethylgruppe, eine Aralkyloxymethylgruppe, wie
eine Benzyloxymethylgruppe, eine Alkoxyalkoxyalkylgruppe, wie eine
Methoxyethoxymethylgruppe, eine Silylgruppe, wie Trimethylsilyl,
t-Butyldimethylsilyl, Diphenylmethylsilyl, Diphenylbutylsilyl, Diphenylisopropylsilyl
und Phenyldiisopropylsilyl, umfassen.
-
Die
Verbindung (7), d. h. das Ausgangsmaterial in Verfahren B oder Verfahren
C, kann durch das folgende Verfahren hergestellt werden.
-
Eine
Verbindung, die der Verbindung (6) entspricht, worin der "X"-Rest ein Wasserstoffatom ist, wird aus
1,1,5,6-Diisopropyliden-D-glucose, das käuflich erwerbbar ist, gemäß dem in
der Literatur beschriebenen Verfahren hergestellt (R. D. Yous sefyeh,
J. P. H. Verheyden, J. G. Moffatt. J. Org. Chem., 44, 1301–1309 (1979)),
und danach kann die Verbindung (6) gemäß dem in der Literatur beschriebenen
Verfahren hergestellt werden (T. Waga, T. Nishizaki, I, Miyakawa,
H. Ohrui, H. Meguro, Biosci. Biotechnol. Biochem., 57, 1433–1438 (1993))
(wenn X = Bn).
-
(Verfahren B)
-
(Stufe B-1)
-
In
dieser Stufe wird die Verbindung (8) durch Umsetzen der durch das
vorstehende Verfahren hergestellten Verbindung mit einem Reagens
zum Einführen
einer Austrittsgruppe in Anwesenheit eines Basenkatalysators in
einem inerten Lösungsmittel
hergestellt.
-
Das
hier einsetzbare Lösungsmittel
kann Amide, wie Dimethylformamid und Dimethylacetamid, halogenierte
Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid, Chloroform, 1,2-Dichlorethan
oder Tetrachlorkohlenstoff, und Ether, wie Tetrahydrofuran, Diethylether
und Dioxan, vorzugsweise Methylenchlorid umfassen.
-
Der
hier einsetzbare Basenkatalysator kann vorzugsweise eine Base, wie
Triethylamin, Pyridin und Dimethylaminopyridin umfassen.
-
Das
für das
Einführen
einer Austrittsgruppe einsetzbare Reagens kann vorzugsweise Trifluormethansulfonsäurechlorid
oder Trifluormethansulfonsäureanhydrid
umfassen.
-
Die
Reaktionstemperatur variiert in Abhängigkeit vom Ausgangsmaterial,
dem Lösungsmittel
und dem Säurekatalysator,
sie ist jedoch üblicherweise –100°C bis –50°C, vorzugsweise –100°C bis –70°C.
-
Die
Reaktionsdauer variiert in Abhängigkeit
vom Ausgangsmaterial, dem Lösungsmittel,
dem Säurekatalysator
und der Reaktionstemperatur, sie ist jedoch üblicherweise 30 Minuten bis
12 Stunden, vorzugsweise 30 Minuten bis 3 Stunden.
-
Nach
der Reaktion wird die gewünschte
Verbindung (8) der vorliegenden Reaktion beispielsweise durch Konzentrieren
des Reaktionsgemisches, Zugeben eines mit Wasser nicht mischbaren
organischen Lösungsmittels,
wie Ethylacetat, Waschen mit Wasser, Abtrennen einer organischen
Schicht, die die gewünschte Verbindung
enthält,
Trocknen über
wasserfreiem Magnesiumsulfat und Abdestillieren des Lösungsmittels
erhalten.
-
Das
so erhaltene gewünschte
Produkt kann, falls erforderlich, durch ein herkömmliches Verfahren, wie Umkristallisation,
Kieselgelsäulenchromatographie
und dergleichen weiter gereinigt werden.
-
(Stufe B-2)
-
In
dieser Stufe wird die Verbindung (9) durch Umsetzen der in Stufe
B-1 hergestellten Verbindung (8) mit einem Cyanierungsmittel in
einem inerten Lösungsmittel
hergestellt.
-
Das
hier einsetzbare Lösungsmittel
kann Amide, wie Dimethylformamid und Dimethylacetamid, halogenierte
Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid, Chloroform, 1,2-Dichlorethan
oder Tetrachlorkohlenstoff, Ether, wie Tetrahydrofuran, Diethylether
und Dioxan, Acetonitril, Dimethylsulfoxid und dergleichen, vorzugsweise
Amide (Dimethylformamid) umfassen.
-
Das
hier einsetzbare Cyanierungsmittel kann KCN, NaCN und Trimethylsilancyanid,
vorzugsweise NaCN umfassen.
-
Die
Reaktionstemperatur variiert in Abhängigkeit vom Ausgangsmaterial,
dem Lösungsmittel
und dem Cyanierungsmittel, sie ist jedoch üblicherweise 0°C bis 100°C, vorzugsweise
30°C bis
70°C.
-
Die
Reaktionsdauer variiert in Abhängigkeit
vom Ausgangsmaterial, dem Lösungsmittel,
dem Cyanierungsmittel und der Reaktionstemperatur, sie ist jedoch üblicherweise
30 Minuten bis 12 Stunden, vorzugsweise 1 bis 3 Stunden.
-
Nach
der Reaktion wird die gewünschte
Verbindung (9) der vorliegenden Reaktion beispielsweise durch Konzentrieren
des Reaktionsgemisches, Zugeben eines mit Wasser nicht mischbaren
organischen Lösungsmittels,
wie Ethylacetat, Waschen mit Wasser, Abtrennen einer organischen
Schicht, die die gewünschte Verbindung
enthält,
Trocknen über
wasserfreiem Magnesiumsulfat und Abdestillieren des Lösungsmittels
erhalten.
-
Das
so erhaltene gewünschte
Produkt kann, falls erforderlich, durch ein herkömmliches Verfahren, wie Umkristallisation,
Kieselgelsäulenchromatographie
und dergleichen weiter gereinigt werden.
-
(Stufe B-3)
-
In
dieser Stufe wird die Verbindung (10) durch Umsetzen der in Stufe
B-2 hergestellten Verbindung (9) mit einem Reduktionsmittel in einem
inerten Lösungsmittel
hergestellt.
-
Das
hier einsetzbare Lösungsmittel
umfasst halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid, Chloroform,
1,2-Dichlorethan oder Tetrachlorkohlenstoff, aliphatische Kohlenwasserstoffe,
wie Hexan, Heptan, Ligroin und Petroleumether, aromatische Kohlenwasserstoffe,
wie Benzol, Toluol und Xylol, Ether, wie Diethylether, Diisopropylether,
Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethoxyethan und Diethylenglycoldimethylether,
und Ketone, wie Aceton, Methylethylketon, Methylisobutylketonisophoron
und Cyclohexanon, vorzugsweise halogenierte Kohlenwasserstoffe (insbesondere
Methylenchlorid) umfassen.
-
Das
hier einsetzbare Reduktionsmittel kann Diisobutylaluminiumhydrid
und Triethoxyaluminiumhydrid, vorzugsweise Diisobutylaluminiumhydrid
umfassen.
-
Die
Reaktionstemperatur variiert in Abhängigkeit vom Ausgangsmaterial,
dem Lösungsmittel
und dem Reduktionsmittel, sie ist jedoch üblicherweise –100°C bis –50°C, vorzugsweise –90°C bis –70°C.
-
Die
Reaktionsdauer variiert in Abhängigkeit
vom Ausgangsmaterial, dem Lösungsmittel,
dem Reduktionsmittel und der Reaktionstemperatur, sie ist jedoch üblicherweise
30 Minuten bis 12 Stunden, vorzugsweise 1 Stunde bis 5 Stunden.
-
Nach
der Reaktion wird die gewünschte
Verbindung (10) der vorliegenden Reaktion beispielsweise durch Konzentrieren
des Reaktionsgemisches, Zugeben eines mit Wasser nicht mischbaren
organischen Lösungsmittels,
wie Ethylacetat, Waschen mit Wasser, Abtrennen einer organischen
Schicht, die die gewünschte Verbindung
enthält,
Trocknen über
wasserfreiem Magnesiumsulfat und Abdestillieren des Lösungsmittels
erhalten.
-
Das
so erhaltene gewünschte
Produkt kann, falls erforderlich, durch ein herkömmliches Verfahren, wie Umkristallisation,
Kieselgelsäulenchromatographie
und dergleichen weiter gereinigt werden.
-
(Stufe B-4)
-
In
dieser Stufe wird die Verbindung (3a), eines der Ausgangsmaterialien
der Verfahrens A, durch Umsetzen der in Stufe B-3 hergestellten
Verbindung (10) mit einem Reduktionsmittel in einem inerten Lösungsmittel
hergestellt.
-
Das
hier einsetzbare Lösungsmittel
kann Alkohole, wie Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol,
Isobutanol, t-Butanol, Isoamylalkohol, Diethylenglycol, Glycerin,
Octanol, Cyclohexanol und Methylcellosolv, und Essigsäure, vorzugsweise
Alkohole (insbesondere Ethanol) umfassen.
-
Das
hier einsetzbare Reduktionsmittel kann Alkalimetallborhydride, wie
Natriumborhydrid und Lithiumborhydrid, Aluminiumhydridverbindungen,
wie Lithiumaluminiumhydrid und Lithiumtriethoxidaluminiumhydrid, und
Boran, vorzugsweise Natriumborhydrid, umfassen.
-
Die
Reaktionstemperatur variiert in Abhängigkeit vom Ausgangsmaterial,
dem Lösungsmittel
und dem Reduktionsmittel, sie ist jedoch üblicherweise 0°C bis 50°C, vorzugsweise
10°C bis
40°C.
-
Die
Reaktionsdauer variiert in Abhängigkeit
vom Ausgangsmaterial, dem Lösungsmittel,
dem Reduktionsmittel und der Reaktionstemperatur, sie ist jedoch üblicherweise
10 Minuten bis 12 Stunden, vorzugsweise 30 Minuten bis 5 Stunden.
-
Nach
der Reaktion wird die gewünschte
Verbindung (3a) der vorliegenden Reaktion beispielsweise durch Konzentrieren
des Reaktionsgemisches, Zugeben eines mit Wasser nicht mischbaren
organischen Lösungsmittels,
wie Ethylacetat, Waschen mit Wasser, Abtrennen einer organischen
Schicht, die die gewünschte Verbindung
enthält,
Trocknen über
wasserfreiem Magnesiumsulfat und Abdestillieren des Lösungsmittels
erhalten.
-
Das
so erhaltene gewünschte
Produkt kann, falls erforderlich, durch ein herkömmliches Verfahren, wie Umkristallisation,
Kieselgelsäulenchromatographie
und dergleichen weiter gereinigt werden.
-
(Verfahren C)
-
(Stufe C-1)
-
In
dieser Stufe wird die Verbindung (11) durch Umsetzen der im vorstehenden
Verfahren hergestellten Verbindung (7) mit einem Oxidationsmittel
in einem inerten Lösungsmittel
hergestellt.
-
Das
hier einsetzbare Lösungsmittel
kann aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Hexan, Heptan, Ligroin und
Petroleumether, aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol
und Xylol, halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid,
Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Dichlorethan, Chlorbenzol und
Dichlorbenzol, Ester, wie Ethylformiat, Ethylacetat, Propylacetat,
Butylacetat und Diethylcarbonat, Ether, wie Diethylether, Diisopropylether,
Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethoxyethan, Diethylenglycoldimethylether,
und Ketone, wie Aceton, Methylethylketon, Methylisobutylketon, Isophoron
und Cyclohexanon, vorzugsweise halogenierte Kohlenwasserstoffe (insbesondere
Methylenchlorid) umfassen.
-
Das
hier einsetzbare Oxidationsmittel kann das Swern-Reagens für die Oxidation,
das Dess-Martin-Reagens für
die Oxidation, einen Chromtrioxidkomplex, wie Pyridinhydrochlorid/Chromtrioxidkomplex
(Pyridinchlorchromat und Pyridindichromat), vorzugsweise das Swern-Reagens
für die
Oxidation (nämlich
Dimethylsulfoxid-oxalylchlorid) umfassen.
-
Die
Reaktionstemperatur variiert in Abhängigkeit vom Ausgangsmaterial,
dem Lösungsmittel
und dem Oxidationsmittel, sie ist jedoch üblicherweise –100°C bis –50°C, vorzugsweise –100°C bis –70°C.
-
Die
Reaktionsdauer variiert in Abhängigkeit
vom Ausgangsmaterial, dem Lösungsmittel,
dem Oxidationsmittel und der Reaktionstemperatur, sie ist jedoch üblicherweise
30 Minuten bis 12 Stunden, vorzugsweise 1 Stunde bis 5 Stunden.
-
Nach
der Reaktion wird die gewünschte
Verbindung (11) der vorliegenden Reaktion beispielsweise durch Konzentrieren
des Re aktionsgemisches, Zugeben eines mit Wasser nicht mischbaren
organischen Lösungsmittels,
wie Ethylacetat, Waschen mit Wasser, Abtrennen einer organischen
Schicht, die die gewünschte Verbindung
enthält,
Trocknen über
wasserfreiem Magnesiumsulfat und Abdestillieren des Lösungsmittels
erhalten.
-
Das
so erhaltene gewünschte
Produkt kann, falls erforderlich, durch ein herkömmliches Verfahren, wie Umkristallisation,
Kieselgelsäulenchromatographie
und dergleichen weiter gereinigt werden.
-
(Stufe C-2)
-
In
dieser Stufe wird die Verbindung (12) durch Umsetzen der in Stufe
C-1 hergestellten Verbindung (11) mit einem Kohlenstoffzahl-Erhöhungsreagens
in einem inerten Lösungsmittel
hergestellt.
-
Das
hier einsetzbare Lösungsmittel
kann aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Hexan, Heptan, Ligroin und
Petroleumether, aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol
und Xylol, halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid,
Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Dichlorethan, Chlorbenzol und
Dichlorbenzol, Ester, wie Ethylformiat, Ethylacetat, Propylacetat,
Butylacetat und Diethylcarbonat, Ether, wie Diethylether, Diisopropylether,
Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethoxyethan, Diethylenglycoldimethylether,
und Ketone, wie Aceton, Methylethylketon, Methylisobutylketon, Isophoron
und Cyclohexanon, vorzugsweise halogenierte Kohlenwasserstoffe (insbesondere
Methylenchlorid) umfassen.
-
Das
hier einsetzbare Reagens umfasst das Wittig-Reagens, das Horner-Emmons-Reagens,
das Peterson-Reaktionsreagens, das Reaktionsmittel des TiCl4-CH2Cl2-Zn-Systems
und das Tebbe-Reagens,
vorzugsweise das Wittig-Reagens, das Horner-Emmons-Reagens und das Tebbe-Reagens.
-
Die
Reaktionstemperatur variiert in Abhängigkeit vom Ausgangsmaterial,
dem Lösungsmittel
und dem Kohlenstoffzahl-Erhöhungsreagens,
sie ist jedoch üblicherweise –20°C bis 20°C, vorzugsweise
0°C.
-
Die
Reaktionsdauer variiert in Abhängigkeit
vom Ausgangsmaterial, dem Lösungsmittel,
dem Kohlenstoffzahl-Erhöhungsreagens
und der Reaktionstemperatur, sie ist jedoch üblicherweise 30 Minuten bis
12 Stunden, vorzugsweise 1 Stunde bis 5 Stunden.
-
Nach
der Reaktion wird die gewünschte
Verbindung (12) der vorliegenden Reaktion beispielsweise durch Konzentrieren
des Reaktionsgemisches, Zugeben eines mit Wasser nicht mischbaren
organischen Lösungsmittels,
wie Ethylacetat, Waschen mit Wasser, Abtrennen einer organischen
Schicht, die die gewünschte Verbindung
enthält,
Trocknen über
wasserfreiem Magnesiumsulfat und Abdestillieren des Lösungsmittels
erhalten.
-
Das
so erhaltene gewünschte
Produkt kann, falls erforderlich, durch ein herkömmliches Verfahren, wie Umkristallisation,
Kieselgelsäulenchromatographie
und dergleichen weiter gereinigt werden.
-
(Stufe C-3)
-
In
dieser Stufe wird die Verbindung (3a) durch selektives Einführen einer
Hydroxygruppe an einen endständigen
Kohlenstoff einer Olefingruppe der in Stufe C-2 hergestellten Verbindung
(12) in einem inerten Lösungsmittel
hergestellt.
-
Das
hier einsetzbare Lösungsmittel
umfasst aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Hexan, Heptan, Ligroin
und Petroleumether, aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol,
Toluol und Xylol, halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid,
Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Dichlorethan, Chlorbenzol und
Dichlorbenzol, Ester, wie Ethylformiat, Ethylacetat, Propylacetat,
Butylacetat und Diethylcarbonat, Ether, wie Di ethylether, Diisopropylether,
Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethoxyethan und Diethylenglycoldimethylether,
und Ketone, wie Aceton, Methylethylketon, Methylisobutylketon, Isophoron
und Cyclohexanon, vorzugsweise Ether (insbesondere Tetrahydrofuran)
umfassen.
-
Das
hier einsetzbare Reaktionsreagens kann Boran, Disiamylboran, Thexylboran,
9-BBN(9-borbicyclo[3.3.1]nonan), vorzugsweise 9-BBN umfassen.
-
Die
Reaktionstemperatur variiert in Abhängigkeit vom Ausgangsmaterial,
dem Lösungsmittel
und dem Reagens, sie ist jedoch üblicherweise
0°C bis
50°C, vorzugsweise
10°C bis
40°C.
-
Die
Reaktionsdauer variiert in Abhängigkeit
vom Ausgangsmaterial, dem Lösungsmittel,
dem Reagens und der Reaktionstemperatur, sie ist jedoch üblicherweise
6 Stunden bis 48 Stunden, vorzugsweise 12 Stunde bis 24 Stunden.
-
Nach
der Reaktion wird die gewünschte
Verbindung (3a) der vorliegenden Reaktion beispielsweise durch Konzentrieren
des Reaktionsgemisches, Zugeben eines mit Wasser nicht mischbaren
organischen Lösungsmittels,
wie Ethylacetat, Waschen mit Wasser, Abtrennen einer organischen
Schicht, die die gewünschte Verbindung
enthält,
Trocknen über
wasserfreiem Magnesiumsulfat und Abdestillieren des Lösungsmittels
erhalten.
-
Das
so erhaltene gewünschte
Produkt kann, falls erforderlich, durch ein herkömmliches Verfahren, wie Umkristallisation,
Kieselgelsäulenchromatographie
und dergleichen weiter gereinigt werden.
-
(Verfahren D)
-
(Stufe D-1)
-
In
dieser Stufe wird die Verbindung (13) durch Umsetzen der in Stufe
C-1 hergestellten Verbindung (11) mit einem Kohlenstoffzahl-Erhöhungsreagens
in einem inerten Lösungsmittel
hergestellt.
-
Das
hier einsetzbare Lösungsmittel
kann aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Hexan, Heptan, Ligroin und
Petroleumether, aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol
und Xylol, halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid,
Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Dichlorethan, Chlorbenzol und
Dichlorbenzol, Ester, wie Ethylformiat, Ethylacetat, Propylacetat,
Butylacetat und Diethylcarbonat, Ether, wie Diethylether, Diisopropylether,
Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethoxyethan und Diethylenglycoldimethylether,
und Ketone, wie Aceton, Methylethylketon, Methylisobutylketon, Isophoron
und Cyclohexanon, vorzugsweise Ether (insbesondere Tetrahydrofuran),
stärker
bevorzugt halogenierte Kohlenwasserstoffe (insbesondere Methylenchlorid) umfassen.
-
Das
hier einsetzbare Kohlenstoffzahl-Erhöhungsreagens kann das Wittig-Reagens
und das Horner-Emmons-Reagens umfassen.
-
Die
Reaktionstemperatur variiert in Abhängigkeit vom Ausgangsmaterial,
dem Lösungsmittel
und dem Reagens, sie ist jedoch üblicherweise –20°C bis 40°C, vorzugsweise
0°C bis
20°C.
-
Die
Reaktionsdauer variiert in Abhängigkeit
vom Ausgangsmaterial, dem Lösungsmittel,
dem Reagens und der Reaktionstemperatur, sie ist jedoch üblicherweise
30 Minuten bis 12 Stunden, vorzugsweise 1 Stunde bis 5 Stunden.
-
Nach
der Reaktion wird die gewünschte
Verbindung (13) der vorliegenden Reaktion beispielsweise durch Konzentrieren
des Reaktionsgemisches, Zugeben eines mit Wasser nicht mischbaren
organischen Lösungsmittels,
wie Ethylacetat, Waschen mit Wasser, Abtrennen einer organischen
Schicht, die die gewünschte Verbindung
enthält,
Trocknen über
wasserfreiem Magnesiumsulfat und Abdestillieren des Lösungsmittels
erhalten.
-
Das
so erhaltene gewünschte
Produkt kann, falls erforderlich, durch ein herkömmliches Verfahren, wie Umkristallisation,
Kieselgelsäulenchromatographie
und dergleichen weiter gereinigt werden.
-
(Stufe D-2)
-
In
dieser Stufe wird die Verbindung (14) durch Umsetzen der in Stufe
D-1 hergestellten Verbindung (13) mit einem Reduktionsmittel in
einem inerten Lösungsmittel
hergestellt.
-
Diese
Stufe kann gemäß (2) der
Stufe A-5 durchgeführt
werden. Wenn R10 eine optional substituierte Benzylgruppe
ist und R11 und R12 Wasserstoffatome
sind, kann die Verbindung (3b) in dieser Stufe direkt hergestellt
werden.
-
(Stufe D-3)
-
In
dieser Stufe wird die Verbindung (3b), eines der Ausgangsmaterialien
des Verfahrens A, durch Umsetzen der in Stufe D-2 hergestellten
Verbindung (14) mit einem Reduktionsmittel hergestellt.
-
(a) R11 und
R12 bilden zusammen ein Sauerstoffatom.
-
Das
hier einsetzbare Lösungsmittel
kann Alkohole, wie Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol,
Isobutanol, t-Butanol, Isoamylalkohol, Diethylenglycol, Glycerin,
Octanol, Cyclohexanol und Methylcellosolv, und Essigsäure, vorzugsweise
Alkohole (insbesondere Ethanol) umfassen.
-
Das
hier einsetzbare Reduktionsmittel kann Alkalimetallborhydride, wie
Lithiumborhydrid, Aluminiumhydridverbindungen, wie Lithiumaluminiumhydrid
und Lithiumtriethoxidaluminium hydrid, und Boran, vorzugsweise Boran
und Lithiumaluminiumhydrid umfassen.
-
Die
Reaktionstemperatur variiert in Abhängigkeit vom Ausgangsmaterial,
dem Lösungsmittel
und dem Reduktionsmittel, sie ist jedoch üblicherweise 0°C bis 50°C, vorzugsweise
10°C bis
40°C.
-
Die
Reaktionsdauer variiert in Abhängigkeit
vom Ausgangsmaterial, dem Lösungsmittel,
dem Reduktionsmittel und der Reaktionstemperatur, sie ist jedoch üblicherweise
10 Minuten bis 12 Stunden, vorzugsweise 30 Minuten bis 5 Stunden.
-
Nach
der Reaktion wird die gewünschte
Verbindung (3b) der vorliegenden Reaktion beispielsweise durch Konzentrieren
des Reaktionsgemisches, Zugeben eines mit Wasser nicht mischbaren
organischen Lösungsmittels,
wie Ethylacetat, Waschen mit Wasser, Abtrennen einer organischen
Schicht, die die gewünschte Verbindung
enthält,
Trocknen über
wasserfreiem Magnesiumsulfat und Abdestillieren des Lösungsmittels
erhalten.
-
Das
so erhaltene gewünschte
Produkt kann, falls erforderlich, durch ein herkömmliches Verfahren, wie Umkristallisation,
Kieselgelsäulenchromatographie
und dergleichen weiter gereinigt werden.
-
(b) R11 und
R12 sind Wasserstoffatome und R10 ist
eine andere als eine Benzylgruppe.
-
Wenn
R10 eine Silylgruppe ist, kann diese Stufe
gemäß dem Verfahren
nach (3) der Stufe A-5 durchgeführt
werden.
-
Wenn
R10 eine Aralkylgruppe, wie eine Benzylgruppe,
eine Alkoxyalkylgruppe, wie eine Methoxymethylgruppe, eine Arylcarbonyloxymethylgruppe,
wie eine Benzoyloxymethylgruppe oder eine Aralkyloxymethylgruppe,
wie eine Benzyloxymethylgruppe und eine Alkoxyalkoxyalkylgruppe,
wie eine Methoxyethoxymethylgruppe, ist, wird ein Säurekatalysator
eingesetzt, und der in die sem Fall eingesetzte Säurekatalysator kann eine organische
Säure,
wie p-Toluolsulfonsäure,
Trifluoressigsäure
und Dichloressigsäure,
und eine Lewis-Säure,
wie BF3 und AlCl3 umfassen.
-
Das
hier einsetzbare Lösungsmittel
kann aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol und Xylol,
halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid, Chloroform,
Tetrachlorkohlenstoff, 1,2-Dichlorethan, Chlorbenzol und Dichlorbenzol,
Nitrile, wie Acetonitril und Isobutyronitril, Amide, wie Formamid,
N,N-Dimethylformamid, N,N-Dimethylacetamid, N-Methyl-2-pyrrolidon, N-Methylpyrrolidinon
und Hexamethylphosphorsäuretriamid,
und Kohlenstoffsulfid umfassen.
-
Die
Reaktionstemperatur variiert in Abhängigkeit vom Ausgangsmaterial,
dem Lösungsmittel
und dem Säurekatalysator,
sie ist jedoch üblicherweise
0°C bis
50°C, vorzugsweise
10°C bis
40°C.
-
Die
Reaktionsdauer variiert in Abhängigkeit
vom Ausgangsmaterial, dem Lösungsmittel,
dem Säurekatalysator
und der Reaktionstemperatur, sie ist jedoch üblicherweise 10 Minuten bis
12 Stunden, vorzugsweise 30 Minuten bis 5 Stunden.
-
Nach
der Reaktion wird die gewünschte
Verbindung (3b) der vorliegenden Reaktion beispielsweise durch Konzentrieren
des Reaktionsgemisches, Zugeben eines mit Wasser nicht mischbaren
organischen Lösungsmittels,
wie Ethylacetat, Waschen mit Wasser, Abtrennen einer organischen
Schicht, die die gewünschte Verbindung
enthält,
Trocknen über
wasserfreiem Magnesiumsulfat und Abdestillieren des Lösungsmittels
erhalten.
-
Das
so erhaltene gewünschte
Produkt kann, falls erforderlich, durch ein herkömmliches Verfahren, wie Umkristallisation,
Kieselgelsäulenchromatographie
und dergleichen weiter gereinigt werden.
-
Oligonukleotide,
die ein modifiziertes Nukleosid oder ein Thioatderivat davon enthalten,
können
durch das nachstehend beschriebene Verfahren E unter Einsatz der
erfindungsgemäßen Verbindung
(1) hergestellt werden.
-
-
Im
Verfahren E haben A und B die gleiche Bedeutung wie vorstehend definiert,
R13 stellt eine Hydroxyschutzgruppe dar
(insbesondere eine Tritylgruppe, die mit einer Methoxygruppe substituiert
sein kann), R14 stellt eine Phosphonylgruppe
oder eine Gruppe dar, die durch Umsetzen von mono-substituierten
Chlor(alkoxy)phosphinen oder di-substituierten Alkoxyphosphinen,
die später
beschrieben werden, gebildet wird.
-
(Verfahren E)
-
(Stufe E-1)
-
In
dieser Stufe wird die Verbindung (15) durch Umsetzen der in Verfahren
A hergestellten Verbindung (1) mit einem Schutzmittel in einem inerten
Lösungsmittel
hergestellt.
-
Das
hier einsetzbare Lösungsmittel
kann vorzugsweise aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol
und Xylol, halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid,
Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Dichlorethan, Chlorbenzol und
Dichlorbenzol, Ester, wie Ethylformiat, Ethylacetat, Propylacetat,
Butylacetat und Diethylcarbonat, Ether, wie Diethylether, Diisopropylether,
Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethoxyethan und Diethylenglycoldimethylether,
Ketone, wie Aceton, Methylethylketon, Methylisobutylketon, Isophoron
und Cyclohexanon, nitrierte Verbindungen, wie Nitroethan und Nitrobenzol,
Nitrile, wie Acetonitril und Isobutyronitril, Amide, wie Formamid,
Dimethylformamid (DMF), Dimethylacetamid und Hexamethylphosphorsäuretriamid,
Sulfoxide, wie Dimethylsulfoxid und Sulfolan, aliphatische tertiäre Amine,
wie Trimethylamin, Triethylamin und N-Methylmorpholin, und aromatische
Amine, wie Pyridin und Picolin, stärker bevorzugt halogenierte
Kohlenwasserstoffe (insbesondere Methylenchlorid) und aromatische
Amine (insbesondere Pyridin) umfassen.
-
Das
hier einsetzbare Schutzmittel ist nicht besonders eingeschränkt, solange
nur die 5'-Position
selektiv geschützt
werden kann und es unter sauren oder neutralen Bedingungen entfernt
werden kann, es umfasst jedoch vorzugsweise Triarylmethylhalogenide,
wie Tritylchlorid, Monomethoxytritylchlorid und Dimethoxytritylchlorid.
-
Wenn
Triarylmethylhalogenide als Schutzmittel eingesetzt werden, wird üblicherweise
eine Base eingesetzt.
-
In
diesem Fall kann die hier eingesetzte Base heterocyclische Amine,
wie Pyridin, Dimethylaminopyridin und Pyrrolidinopyridin, und aliphatische
tertiäre
Amine, wie Trimethylamin und Triethylamin, vorzugsweise Pyridin,
Dimethylaminopyridin und Pyrrolidinopyridin umfassen.
-
Wenn
eine flüssige
Base als Lösungsmittel
eingesetzt wird, ist es, da die Base selbst als Säurefänger funktioniert,
nicht erforderlich, eine weitere Base zuzugeben.
-
Die
Reaktionstemperatur variiert in Abhängigkeit vom Ausgangsmaterial,
dem Reagens und dem Lösungsmittel,
sie ist jedoch üblicherweise
0°C bis
150°C, vorzugsweise
20°C bis
100°C.
-
Die
Reaktionsdauer variiert in Abhängigkeit
vom Ausgangsmaterial, dem Lösungsmittel,
und der Reaktionstemperatur, sie ist jedoch üblicherweise 1 Stunde bis 100
Stunden, vorzugsweise 2 bis 24 Stunden.
-
Nach
der Reaktion wird die gewünschte
Verbindung (15) der vorliegenden Reaktion beispielsweise durch Konzentrieren
des Reaktionsgemisches, Zugeben eines mit Wasser nicht mischbaren
organischen Lösungsmittels,
wie Ethylacetat, Waschen mit Wasser, Abtrennen einer organischen
Schicht, die die gewünschte Verbindung
enthält,
Trocknen über
wasserfreiem Magnesiumsulfat und Abdestillieren des Lösungsmittels
erhalten.
-
Das
so erhaltene gewünschte
Produkt kann, falls erforderlich, durch ein herkömmliches Verfahren, wie Umkristallisation,
Kieselgelsäulenchromatographie
und dergleichen weiter gereinigt werden.
-
(Stufe E-2)
-
In
dieser Stufe wird die Verbindung (16) durch Umsetzen der in Stufe
E-1 hergestellten Verbindung (15) mit monosubstituierten Chlor(alkoxy)phosphinen
oder di-substituierten Alkoxyphosphinen, die üblicherweise für die Amidierung
eingesetzt werden, in einem inerten Lösungsmittel hergestellt.
-
Das
hier einsetzbare Lösungsmittel
ist nicht besonders eingeschränkt,
solange es die Reaktion nicht beeinträchtigt, und kann Ether, wie
Tetrahydrofuran, Diethylether und Dioxan, und halogenierte Kohlenwasserstoffe,
wie Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Dichlorethan,
Chlorbenzol und Dichlorbenzol umfassen.
-
Die
mono-substituierten Chlor(alkoxy)phosphine, die hier einsetzbar
sind, können
Phosphinderivate, wie Chlor(morpholino)methoxyphosphin, Chlor(morpholino)cyanethoxyphosphin,
Chlor(dimethylamino)methoxyphosphin, Chlor(dimethylamino)cyanethoxyphosphin,
Chlor(diisopropylamino)methoxyphosphin und Chlor(diisopropylamino)cyanethoxyphosphin,
vorzugsweise Chlor(morpholino)methoxyphosphin, Chlor(morpholino)cyanethoxyphosphin,
Chlor(diisopropylamino)methoxyphosphin und Chlor(diisopropylamino)cyanethoxyphosphin
umfassen.
-
Wenn
mono-substituierte Chlor(alkoxy)phosphine eingesetzt werden, wird
ein Säurefänger eingesetzt, und
in einem solchen Fall kann der hier einsetzbare Säurefänger heterocyclische
Amine, wie Pyridin und Dimethylaminopyridin, und aliphatische Amine,
wie Trimethylamin, Triethylamin und Diisopropylamin, vorzugsweise
aliphatische Amine (insbesondere Diisopropylamin) umfassen.
-
Die
hier einsetzbaren di-substituierten Alkoxyphosphine können Phosphinderivate,
wie Bis(diisopropylamino)cyanethoxyphosphin, Bis(diethylamino)methansulfonylethoxyphosphin,
Bis(diisopropylamino)(2,2,2-trichlorethoxy)phosphin und Bis(diisopropylamino)(4-chlorphenylmethoxy)phosphin,
vorzugsweise Bis(diisopropylamino)cyanethoxyphosphin umfassen.
-
Wenn
di-substituierte Alkoxyphosphine eingesetzt werden, wird eine Säure eingesetzt,
und in einem solchen Fall kann die einsetzbare Säure Tetrazol, Essigsäure oder
p-Toluolsulfonsäure
umfassen.
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Die
Reaktionstemperatur ist nicht besonders eingeschränkt, sie
ist jedoch üblicherweise
0°C bis
80°C, vorzugsweise
Raumtemperatur.
-
Die
Reaktionsdauer variiert in Abhängigkeit
von dem Ausgangsmaterial, dem Reagens und der Reaktionstemperatur,
sie ist jedoch üblicherweise
5 Minuten bis 30 Stunden, vorzugsweise 30 Minuten bis 10 Stunden,
wenn die Reaktion bei Raumtemperatur durchgeführt wird.
-
Nach
der Reaktion wird die gewünschte
Verbindung (16) der vorliegenden Reaktion beispielsweise durch Konzentrieren
des Reaktionsgemisches, Zugeben eines mit Wasser nicht mischbaren
organischen Lösungsmittels,
wie Ethylacetat, Waschen mit Wasser, Abtrennen einer organischen
Schicht, die die gewünschte Verbindung
enthält,
Trocknen über
wasserfreiem Magnesiumsulfat und Abdestillieren des Lösungsmittels
erhalten.
-
Das
so erhaltene gewünschte
Produkt kann, falls erforderlich, durch ein herkömmliches Verfahren, wie Umkristallisation,
Kieselgelsäulenchromatographie
und dergleichen weiter gereinigt werden.
-
Alternativ
dazu wird in dieser Stufe die Verbindung (16) durch Umsetzen der
in Stufe E-1 hergestellten Verbindung (15) mit Tris-(1,2,4-triazolyl)phosphit
in einem inerten Lösungsmittel
(vorzugsweise halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid)
und nachfolgender Zugabe von Wasser, um eine H-Phosphonierung zu
bewirken, hergestellt.
-
Die
Reaktionstemperatur ist nicht besonders eingeschränkt, sie
ist jedoch üblicherweise –20°C bis 100°C, vorzugsweise
10°C bis
40°C.
-
Die
Reaktionsdauer variiert in Abhängigkeit
vom Ausgangsmaterial, dem Reagens und der Reaktionstemperatur, und
ist übli cherweise
5 Minuten bis 30 Stunden, vorzugsweise 30 Minuten, wenn die Reaktion
bei Raumtemperatur durchgeführt
wird.
-
Nach
der Reaktion wird die gewünschte
Verbindung (16) der vorliegenden Reaktion beispielsweise durch Konzentrieren
des Reaktionsgemisches, Zugeben eines mit Wasser nicht mischbaren
organischen Lösungsmittels,
wie Ethylacetat, Waschen mit Wasser, Abtrennen einer organischen
Schicht, die die gewünschte Verbindung
enthält,
Trocknen über
wasserfreiem Magnesiumsulfat und Abdestillieren des Lösungsmittels
erhalten.
-
Das
so erhaltene gewünschte
Produkt kann, falls erforderlich, durch ein herkömmliches Verfahren, wie Umkristallisation,
Kieselgelsäulenchromatographie
und dergleichen weiter gereinigt werden.
-
(Stufe E-3)
-
In
dieser Stufe wird das gewünschte
Oligonukleotidanaloge durch ein automatisches DNA-Synthetisiergerät unter
Einsatz mindestens einer in Stufe E-2 hergestellten Verbindung (16)
und käuflich
erwerbbaren Phosphoramiditreagenzien, die für die Herstellung eines Oligonukleotidanalogen
mit einer gewünschten
Nukleotidsequenz erforderlich sind, gemäß herkömmlichen Verfahren hergestellt.
-
Ein
Oligonukleotidanaloges mit einer gewünschten Nukleotidsequenz kann
mit einem DNA-Synthetisiergerät,
wie Perkin-Elmer Model 392, unter Einsatz des Phosphoramiditverfahrens
gemäß dem in
der Literatur beschriebenen Verfahren synthetisiert werden (Nucleic
Acids Research, 12, 4539 (1984)).
-
Im
Fall des Umwandelns in ein Thioat, kann ein Thioatderivat zusätzlich gemäß dem in
der Literatur beschriebenen Verfahren (Tetrahedron Letters, 32,
3005 (1991), J. Am. Chem. Soc., 112, 1253 (1990)) unter Einsatz,
neben Schwefel, eines Reagenses, das ein Thioat bildet, durch Umsetzen
mit einer dreiwertigen Phosphorsäure,
wie Tetraethylthiuramdisulfid (TETD, Applied Biosystems Inc.) oder
dem Beaucage-Reagens (Millipore Corp.) erhalten werden.
-
Das
erhaltene rohe Oligonukleotidanaloge kann mit Oligo Pak (Umkehrphasenchromatographiesäule) gereinigt
werden, und die Reinheit des Produkts kann durch HPLC-Analyse bestätigt werden.
-
Die
Kettenlänge
des erhaltenen Oligonukleotidanalogen ist normalerweise 2 bis 50
Einheiten, vorzugsweise 10 bis 30 Einheiten an Nukleosiden.
-
Die
Fähigkeit
zur Komplementärkettenbildung
und die Nukleaseenzymresistenz des erhaltenen Oligonukleotidanalogen
kann gemäß dem nachstehend
beschriebenen Verfahren bestimmt werden.
-
(Testmethode 1)
-
Die
Fähigkeit
des erfindungsgemäßen Oligonukleotidanalogen
zur Hybridbildung mit komplementärer DNA
und RNA kann durch Hybridisieren der verschiedenen erhaltenen Oligonukleotidanalogen
mit einem Oligonukleotidanalogen, das aus einer natürlich vorkommenden
DNA oder RNA mit komplementärer
Sequenz zusammengesetzt ist, und Messen der Schmelztemperatur (Tm-Wert)
bestimmt werden.
-
Eine
Probenlösung,
die gleiche Mengen des Oligonukleotidanalogen und eines natürlich vorkommenden
komplementären
Oligonukleotids in einer Natriumphosphatpufferlösung enthielt, wurde in ein
siedendes Wasserbad gegeben und dann langsam auf Raumtemperatur
gekühlt
(annealing). Die Temperatur der Lösung wurde dann allmählich von
20°C auf
90°C in
der Zellkammer eines Spektrofotometers (wie Shimadzu UV-2100PC)
und nachfolgender Messung der UV-Absorption bei 260 nm erhöht.
-
(Testmethode 2) Messung
der Nukleaseenzymresistenz
-
Zu
dem Oligonukleotid in einer Pufferlösung wurde eine Nuklease gegeben,
und das Gemisch wurde erwärmt.
Beispiele von Nukleasen, die eingesetzt werden, umfassen Snake Venom
Phosphodiesterase, Endonuklease P1 und Endonuklease S1. Obwohl hinsichtlich
der Pufferlösung
keine besonderen Einschränkungen
bestehen, außer
dass es eine Pufferlösung
ist, die für
Enzyme geeignet ist, wird Tris-HCl-Puffer im Fall von Snake Venom
Phosphodiesterase eingesetzt, während
Natriumacetatpuffer im Fall von Endonuklease P1 eingesetzt wird.
Zusätzlich
werden Metallionen bei Bedarf zu der Pufferlösung gegeben. Beispiele von
eingesetzten Metallionen umfassen Mg2+ im
Fall der Snake Venom Phosphodiesterase und Zn2+ im
Fall von Endonuklease. Die Reaktionstemperatur ist vorzugsweise
0 bis 100°C
und stärker
bevorzugt 30 bis 50°C.
-
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
wird nach einem vorbestimmten Zeitraum zugegeben, und danach wird
2 Minuten bei 100°C
erhitzt, um die Reaktion abzubrechen.
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Beispiele
für Verfahren,
die eingesetzt werden, um die Menge des verbleibenden Oligonukleotids
zu bestimmen, umfassen ein Verfahren, bei dem das Oligonukleotid
mit einem Radioisotop usw. markiert wird und danach das Spaltungsreaktionsprodukt
mit einem Analysiergerät
und dergleichen bestimmt wird, ein Verfahren, bei dem das Spaltungsreaktionsprodukt
durch Umkehrphasenhochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)
bestimmt wird, und ein Verfahren, bei dem das Spaltungsreaktionsprodukt
mit einem Farbstoff (wie Ethidiumbromid) gefärbt wird und mit einem Bildverarbeitungsverfahren
unter Einsatz eines Computers untersucht wird.
-
Die
Dosierungsformen des Oligonukleotidanalogen mit einer oder zwei
oder mehr Strukturen der Formel (2) gemäß der vorliegenden Erfindung
können
Tabletten, Kapseln, Granulate, Pulver oder Sirup für die orale
Verabreichung oder Spritzen oder Zäpfchen für die parenterale Verabreichung
sein. Diese Dosierungsformen werden durch bekannte Verfahren unter
Einsatz von Additiven, wie Trägern
(wie organische Träger,
wie Zuckerderivate, wie Lactose, Saccharose, Glucose, Mannitol und
Sorbitol, Stärkederivate,
wie Maisstärke, Kartoffelstärke, α-Stärke und
Dextrin, Cellulosederivate, wie kristalline Cellulose, Gummiarabikum,
Dextran, und Pullulan, und anorganische Träger, wie Silicatderivate, wie
leichtes Kieselsäureanhydrid,
synthetisches Aluminiumsilicat, Calciumsilicat und Magnesiumaluminiummetasilicat,
Phosphate, wie Calciumhydrogenphosphat, Carbonate, wie Calciumcarbonat,
und Sulfate, wie Calciumsulfat), Gleitmittel (wie Stearinsäure, Stearinsäuremetallsalze,
wie Calciumstearat und Magnesiumstearat, Talk, kolloidales Kieselgel,
Wachse, wie Bienenwachs und Spermaceti, Borsäure, Adipinsäure, Sulfate,
wie Natriumsulfat, Glycol, Fumarsäure, Natriumbenzoat, DL-Leucin,
Fettsäurenatriumsalz,
Laurylsulfate, wie Natriumlaurylsulfat und Magnesiumlaurylsulfat,
Kieselsäuren,
wie Kieselsäureanhydrid
und Kieselsäurehydrat,
und die vorstehend genannten Stärkederivate), Bindemittel
(wie Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon,
Macrogol und Verbindungen, die den vorstehend genannten Trägern ähnlich sind),
Zerfallshilfsmittel (wie Cellulosederivate, wie niedersubstituierte
Hydroxypropylcellulose, Carboxymethylcellulose, Calciumcarboxymethylcellulose
und intern verbrückte
Natriumcarboxymethylcellulose, und chemisch modifizierte Stärkecellulosen,
wie Carboxymethylstärke,
Natriumcarboxymethylstärke
und verbrücktes
Polyvinylpyrrolidon), Stabilisierungsmittel (Paraoxybenzoate, wie
Methylparaben und Propylparaben, Alkohole, wie Chlorbutanol, Benzylalkohol
und Phenylethylalkohol, Benzalkoniumchlorid, Phenolderivate, wie
Phenol und Cresol, Thimerosal, Dehydroessigsäure, und Sorbensäure), Korrigenzien
(wie Süßstoffe,
Säuerungsmittel,
Aromen und dergleichen, die üblicherweise eingesetzt
werden), Verdünnungsmittel
und dergleichen hergestellt.
-
Während die
Dosis in Abhängigkeit
vom Zustand der Krankheit, dem Alter des Patienten, der Verabreichungsmethode
und dergleichen abhängt,
ist es beispielsweise im Fall der oralen Verabreichung wünschenswert,
einen aktiven Bestandteil in einer Menge von 0,01 mg/kg Körpergewicht
(vorzugsweise 0,1 mg/kg Körpergewicht)
bis 1000 mg/kg Körpergewicht
(vorzugsweise 100 mg/kg Körpergewicht)
zu verabreichen, und im Fall der intravenösen Verabreichung ist es wünschenswert,
einen aktiven Bestandteil in einer Menge von 0,001 mg/kg Körpergewicht
(vorzugsweise 0,01 mg/kg Körpergewicht)
bis 100 mg/kg Körpergewicht
(vorzugsweise 10 mg/kg Körpergewicht)
als einzelne Dosis pro Tag oder in verteilten Dosen mehrere Male
zu verabreichen.
-
[Beispiele]
-
Beispiel 1
-
3',5'-Di-O-Benzyl-2'-0,4'-C-ethylen-4-N-benzoylcytidin
-
(Beispielsverbindungsnummer
2-34
-
Eine
wässrige
2N Natriumhydroxidlösung
(68 ml) wurde zu einer Lösung
der in Referenzbeispiel 11 erhaltenen Verbindung (6,80 g, 8,86 mmol)
in Pyridin (136 ml) bei 0°C
gegeben, und das Gemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das
Reaktionsgemisch wurde durch tropfenweises Zugeben einer wässrigen
20%igen Essigsäure
neutralisiert und mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformschicht
wurde mit einer gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
gewaschen und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde durch Chromatographie
auf einer Kieselgelsäule
(unter Einsatz von Dichlormethan : Methanol = 100 : 3 als Elutionsmittel)
gereinigt, wobei die Titelverbindung erhalten wurde (3,3 g, 6,02
mmol, 68 %).
1H-NMR (400MHz, CDCl3): 8,64(2H, brs), 7,89(2H, d, 7,6Hz), 7,64–7,60(1H,
m), 7,54–7,51(2H,
m), 7,48–7,37(3H,
m), 7,36-7,26(8H,
m), 6,18(1H, s), 4,70(1H, d, 11Hz), 4,60(1H, d, 11Hz), 4,55(1H,
d, 11Hz), 4,46(1H, d, 2,9Hz), 4,42(1H, d, 11Hz), 4,10–4,02(2H,
m), 3,89(1H, d, 2,9Hz), 3,75(1H, d, 11Hz), 3,62(1H, d, 11Hz), 2,34–2,26(1H,
m), 1,39–1,36(1H,
m).
FAB-MAS(mNBA): 554(M+H)+
-
Beispiel 2
-
2'-O,4'-C-Ethylen-4-N-benzoylcytidin
-
(Beispielsverbindungsnummer
2-225)
-
Eine
Lösung
(31,7 ml) von 1,0 M Trichlorboran in Dichlormethan wurde tropfenweise
zu einer Lösung der
in Beispiel 1 erhaltenen Verbindung (2,06 g, 3,72 mmol) in wasserfreiem
Methylenchlorid (317 ml) bei –78°C gegeben,
und das Gemisch wurde 1 Stunde bei –78°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde
langsam auf –20°C erwärmt, und
das Reaktionsgefäß wurde
in ein Eis-Natriumchlorid-Bad
gegeben, und das Gemisch wurde 2 Stunden bei zwischen –20°C und –10°C gerührt. Methanol
(12 ml) wurde langsam zu dem Gemisch gegeben, und das Gemisch wurde
10 Minuten gerührt.
Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wurde durch tropfenweises Zugeben
einer gesättigten
wässrigen
Natriumhydrogencarbonatlösung
auf 7–8
eingestellt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmt und
im Vakuum konzentriert. Der Rückstand
wurde durch Chromatographie auf einer Kieselgelsäule (unter Einsatz von Dichlormethan
: Methanol = 100 : 5 als Elutionsmittel) gereinigt, wobei die Titelverbindung
(1,21 g, 3,24 mmol, 87%) als weißer Feststoff erhalten wurde.
1H-NMR(500MHz, DMSO-d6):
11,23(1H, brs), 8,70(1H, d, 7,2Hz), 8,00 (2H, d, 7,5Hz), 7,3–6(4H, m),
5,97(1H, s), 5,35(1H, dd, 5 und 10Hz), 4,10(1H, dd, 5 und 10Hz),
4,03(1H, d, 3,2Hz), 3,95-3,85(2H,
m), 3,83(1H, d, 3,2Hz), 3,65–3,51(2H,
m), 2,06-1,98(1H,
m), 1,26(1).
FAB-MAS(mNBA): 374(M+H)+
-
Beispiel 3
-
2'-O,4'-C-Ethylen-cytidin
-
(Beispielsverbindungsnummer
2-3)
-
Eine
Lösung
der in Beispiel 2 erhaltenen Verbindung (0,1 g, 0,268 mmol) in Methanol,
gesättigt
mit Ammoniak (12 ml), wurde über
Nacht stehen gelassen. Das Gemisch wurde bis zum Eintrocknen konzentriert, wobei
die Titelverbindung (0,054 g, 75%) als weißer Feststoff erhalten wurde.
1H-NMR(500MHz, DMSO-d6):
8,18(1H, d, 7,4Hz), 7,10(2H, br), 5,84(1H, s), 5,69(1H, d, 7,6Hz),
5,27–5,24(2H, m),
3,86(1H, d, 3,2Hz), 3,90–3,78(2H,
m), 3,76(1H, d, 3,2Hz), 3,56(1H, dd, 5,5 und 12Hz), 3,49(1H, dd,
5,5 und 12Hz), 2,01–1,93(1H,
dt, 7,5 und 12Hz), 1,22(1H, dd, 3,6 und 13Hz).
FAB-MAS (mNBA):
270(M+H)+
-
Beispiel 4
-
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-4-N-benzoylcytidin
-
(Beispielsverbindungsnummer
2-39)
-
Eine
Lösung
der in Beispiel 2 erhaltenen Verbindung (1,29 g, 3,46 mmol) in wasserfreiem
Pyridin wurde azeotrop destilliert, um Wasser zu entfernen. Das
Produkt wurde in wasserfreiem Pyridin (26 ml) unter einer Stickstoffatmosphäre gelöst, und
4,4'-Dimethoxytritylchlorid
(1,76 g, 5,18 mmol) wurde zu der Lösung gegeben, und das Gemisch
wurde über
Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Eine kleine Menge Methanol wurde zu dem Reaktionsgemisch gegeben,
und dann wurde das Lösungsmittel
im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde
zwischen Wasser und Chloroform aufgetrennt, und die organische Schicht
wurde mit einer gesättigten wässrigen
Natriumhydrogencarbonatlösung
und einer gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
gewaschen und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde durch Chromatographie
auf einer Kieselgelsäule
(unter Einsatz von Dichlor methan : Methanol = 100 : 5 als Elutionsmittel)
gereinigt, wobei die Titelverbindung (2,10 g, 3,11 mmol, 90%) als
farbloser amorpher Feststoff erhalten wurde.
1H-NMR(270MHz,
DMSO-d6): 11,27(1H, brs), 8,59(1H, m), 6,92-8,01(19H, m), 6,03(1H,
s), 5,56 (1H, m), 4,17(1H, m), 4,08(1H, m), 3,86(2H, m), 3,77(6H,
s), 3,24(2H, m), 1,98(1H, m), 1,24 (1H, m).
FAB-MAS(mNBA):
676(M+H)+
-
Beispiel 5
-
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-4-N-benzoylcytidin-3'-O-(2-cyanethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit
-
(Beispielsverbindungsnummer
2-235)
-
Eine
Lösung
der in Beispiel 4 erhaltenen Verbindung (6,53 g, 9,66 mmol) in wasserfreiem
Pyridin wurde azeotrop destilliert, um Wasser zu entfernen. Das
Produkt wurde unter einer Stickstoffatmosphäre in wasserfreiem Dichlormethan
(142 ml) gelöst.
N,N-Diisopropylamin (2,80 ml, 16,1 mmol) wurde zu der Lösung gegeben,
und dann wurde 2-Cyanethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit (2,16
ml, 9,66 mmol) tropfenweise in einem Eisbad zugegeben. Das Gemisch
wurde 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde
mit einer gesättigten
wässrigen
Natriumhydrogencarbonatlösung
und einer gesättigten
wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen
und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde durch Chromatographie auf
einer Kieselgelsäule
(unter Einsatz von Dichlormethan : Triethylamin = 50: 1 – Dichlormethan
: Ethylacetat : Triethylamin = 60 : 30 : 1 als Elutionsmittel) gereinigt,
wobei die Titelverbindung (7,10 g, 8,11 mmol, 84%) als blassweiße Verbindung
erhalten wurde.
1H-NMR (400MHz, CDCl3): 1,1–1,2(12H,
m), 1,35(1H, m), 2,11(1H, m), 2,3 (2H, m), 3,35–3,7(6H, m), 3,8(6H, m), 3,9–4,1(2H,
m), 4,33(1H, m), 4,45(1H, m), 6,23(1H, s), 6,9(4H, m), 7,3-7,9(15H, m), 8,7–8,8(1H,
m).
-
Beispiel 6
-
3',5'-Di-O-benzyl-2'-O,4'-C-ethylen-5-methyluridin
(Beispielsverbindungsnummer 2-22)
-
Eine
wässrige
2N Natriumhydroxidlösung
und ein Lösungsmittelgemisch
(5 ml), wobei das Lösungsmittelgemisch
Pyridin : Methanol : Wasser = 65 : 30 : 5 enthielt, wurden zu der
in Referenzbeispiel 10 erhaltenen Verbindung (418 mg, 0,62 mmol)
in Pyridin : Methanol : Wasser = 65 : 30 : 5 (5 ml) bei 0°C gegeben,
und das Gemisch wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das
Reaktionsgemisch wurde mit 1N Chlorwasserstoffsäure neutralisiert und mit Ethylacetat
(etwa 30 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde mit einer gesättigten
wässrigen
Natriumhydrogencarbonatlösung
(etwa 30 ml) und einer gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
(etwa 30 ml) gewaschen, über
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert.
Der Rückstand
wurde durch Chromatographie auf einer Kieselgelsäule (unter Einsatz von Hexan :
Ethylacetat = 1 : 1 als Elutionsmittel) gereinigt, wobei ein farbloser
amorpher Feststoff erhalten wurde (228 mg, 0,49 mmol, 79%).
1H-NMR (400MHz, CDCl3):
1,35(1H, d, 13Hz), 1,41(3H, s), 2,28(1H, dt, 9,4 und 13Hz), 3,60(1H,
d, 11Hz), 3,76(1H, d, 11Hz), 3,94(1H, d, 3,0Hz), 4,10(1H, d, 7,0Hz),
4,14(1H, d, 7,0Hz), 4,31(1H, d, 3,0Hz), 4,51(1H, d, 12Hz), 4,54(1H,
d, 12Hz), 4,58(1H, d, 12Hz), 4,75(1H, d, 12Hz), 6,06(1H, s), 7,3(10H,
m), 7,91(1H, s), 8,42(1H, brs).
FAB-MAS(mNBA): 465(M+H)+
-
Beispiel 7
-
2'-O,4'-C-Ethylen-5-methyluridin
-
(Beispielsverbindungsnummer
2-2)
-
Eine
Lösung
der in Beispiel 6 erhaltenen Verbindung (195 mg, 0,42 mmol) in Methanol
(10 ml) wurde unter einer Wasserstoffatmosphäre bei Atmosphärendruck
in Anwesenheit eines Hydrierungskatalysators 5 Stunden gerührt. Das
Reaktionsgemisch wurde filtriert, um den Katalysator zu entfernen,
und das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert. Der Rückstand
wurde durch Chromatographie auf einer Kieselgelsäule (unter Einsatz von Dichlormethan
: Methanol = 10 : 1 als Elutionsmittel) gereinigt, wobei ein farbloses
Pulver erhalten wurde (76 mg, 0,268 mmol, 64%).
1H-NMR
(400MHz, CD3OD): 1,33(1H, dd, 3,8 und 13Hz),
1,86(3H, d, 0,9Hz), 1,94(1H, ddd, 7,5, 11,7 und 13Hz), 3,68(1H,
d, 12Hz), 3,75(1H, d, 12Hz), 3,9–4,0(2H, m), 4,05(1H, d, 3,2Hz),
4,09(1H, d, 3, 2Hz), 6,00(1H, s), 8,28(1H, d, 1,1Hz).
FAB-MAS(mNBA):
285(M+H)+
-
Beispiel 8
-
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-5-methyluridin
-
(Beispielsverbindungsnummer
2-27)
-
Eine
Lösung
der in Beispiel 7 erhaltenen Verbindung (1,45 g, 5,10 mmol) in wasserfreiem
Pyridin wurde azeotrop destilliert, um Wasser zu entfernen. Das
Produkt wurde in wasserfreiem Pyridin (44 ml) unter einer Stickstoffatmosphäre gelöst, und
4,4'-Dimethoxytritylchlorid
(2,59 g, 7,65 mmol) wurde zu der Lösung gegeben, und das Gemisch
wurde über
Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Eine kleine Menge Methanol wurde zu dem Reaktionsgemisch gegeben,
und dann wurde das Lösungsmittel
im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde
zwischen Wasser und Chloroform aufgetrennt, und die organische Schicht
wurde mit einer gesättigten wässrigen
Natriumhydrogencarbonatlösung
und einer gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
gewaschen und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde durch Chromatographie
auf einer Kieselgelsäule
(unter Einsatz von Dichlormethan : Methanol = 100 : 10 als Elutionsmittel)
gereinigt, wobei die Titelverbindung (2,42 g, 4,13 mmol, 81%) als
farbloser amorpher Feststoff erhalten wurde.
1H-NMR(270MHz,
DMSO-d6): 11,36(1H, s), 7,68(1H, s), 6,90-7,44(13H, m), 5,89(1H,
s), 5,55(1H, d), 4,09(1H, m), 4,04(1H, d), 3,82(2H, m), 3,74(6H,
s), 3,19(2H, m), 1,99(1H, m), 1,36(1H, m), 1,17(3H, s).
FAB-MAS(mNBA):
587(M+H)+
-
Beispiel 9
-
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-5-methyluridin-3'-O-(2-cyanethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit
-
(Beispielsverbindungsnummer
2-234)
-
Eine
Lösung
der in Beispiel 8 erhaltenen Verbindung (4,72 g, 8,05 mmol) in wasserfreiem
Pyridin wurde azeotrop destilliert, um Wasser zu entfernen. Das
Produkt wurde unter einer Stickstoffatmosphäre in wasserfreiem Dichlormethan
(142 ml) gelöst.
N,N-Diisopropylamin (2,80 ml, 16,1 mmol) wurde zu der Lösung gegeben,
und dann wurde 2-Cyanethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit (2,16
ml, 9,66 mmol) tropfenweise in einem Eisbad zugegeben. Das Gemisch
wurde 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde
mit einer gesättigten
wässrigen
Natriumhydrogencarbonatlösung
und einer gesättigten
wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen
und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde durch Chromatographie auf
einer Kieselgelsäule
(unter Einsatz von Hexan : Ethylacetat Triethylamin = 50 : 50 :
1 – Hexan
: Ethylacetat : Triethylamin = 30 : 60 : 1 als Elutionsmittel) gereinigt,
wobei die Ti telverbindung (5,64 g, 7,17 mmol, 89%) als farbloser
amorpher Feststoff erhalten wurde.
1H-NMR(400MHz,
CDCl3): 1,1–1,2(15H, m), 1,4(1H, m), 2,08(1H,
m), 2,4(2H, m), 3,2-4,0(14H, m), 4,38(2H, m), 4,47(1H, m), 6,06(1H,
s), 6,8–6,9(4H,
m), 7,2–7,5(9H,
m), 7,91(1H, m).
FAB-MAS (mNBA): 787(M+H)+
-
Beispiel 10
-
3',5'-Di-O-benzyl-2'-O,4'-C-ethylen-6-N-benzoyladenosin
-
(Beispielsverbindungsnummer
1-23)
-
Eine
wässrige
2N Natriumhydroxidlösung
und ein Lösungsmittelgemisch
(5 ml), wobei das Lösungsmittelgemisch
Pyridin : Methanol : Wasser = 65 : 30 : 5 enthielt, wurden zu der
in Referenzbeispiel 12 erhaltenen Verbindung (238 mg, 0,30 mmol)
in Pyridin : Methanol : Wasser = 65 : 30 : 5 (5 ml) bei 0°C gegeben,
und das Gemisch wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das
Reaktionsgemisch wurde mit 1N Chlorwasserstoffsäure neutralisiert und mit Ethylacetat
(etwa 30 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde mit einer gesättigten
wässrigen
Natriumhydrogencarbonatlösung
(etwa 30 ml) und einer gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
(etwa 30 ml) gewaschen, über
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert.
Der Rückstand
wurde durch Chromatographie auf einer Kieselgelsäule (unter Einsatz von Dichlormethan
: Methanol = 50 : 1 als Elutionsmittel) gereinigt, wobei ein farbloser
amorpher Feststoff (133 mg, 0,23 mmol, 78%) erhalten wurde
1H-NMR(400MHz, CDCl3):
1,44(1H, d, 13Hz), 2,31(1H, dd, 13 und 19Hz), 3,56(1H, d, 11Hz),
3,70(1H, d, 11Hz), 4,10(2H, m), 4,24(1H, s), 4,45(1H, d, 12Hz),
4,53–4,67(4H,
m), 6,52(1H, s), 7,3(10H, m), 7,53(2H, m), 7,62(1H, m), 8,03(2H,
d, 7,6Hz), 8,66(1H, s), 8,78(1H, s), 9,00(1H, brs).
FAB-MAS(mNBA):
578(M+H)+
-
Beispiel 11
-
2'-O,4'-C-Ethylen-6-N-benzoyladenosin
-
(Beispielsverbindungsnummer
1-178)
-
Eine
1M Bortrichloridlösung
(1,5 ml, 1,5 mmol) in Dichlormethan wurde langsam tropfenweise zu
einer Lösung
der in Beispiel 10 erhaltenen Verbindung (116 mg, 0,20 mmol) in
wasserfreiem Methylenchlorid (5 ml) bei –78°C zugegeben, und das Gemisch
wurde 3 Stunden bei –78°C gerührt. Zu
dem Reaktionsgemisch wurde eine 1M Bortrichloridlösung (1,5
ml, 1,5 mmol) in Dichlormethan gegeben, und das Gemisch wurde 2
Stunden gerührt.
Das Gemisch wurde langsam auf Raumtemperatur erwärmt und dann rasch auf –78°C abgekühlt, und dann
wurde Methanol (5 ml) zu dem Gemisch gegeben. Das Reaktionsgemisch
wurde langsam auf Raumtemperatur erwärmt und im Vakuum konzentriert.
Der Rückstand
wurde durch Chromatographie auf einer Kieselgelsäule (unter Einsatz von Dichlormethan
: Methanol = 9 : 1 als Elutionsmittel) gereinigt, wobei ein weißes Pulver
(49 mg, 0,17 mmol, 84%) erhalten wurde.
1H-NMR
(400MHz, CD3OD): 1,45(1H, dd, 4,3 und 13Hz),
2,12(1H, m), 3,72(1H, d, 12Hz), 3,79(1H, d, 12Hz), 4,04(1H, dd,
7,3 und 12Hz), 4,15(1H, dt, 4,3 und 9,4Hz), 4,36(1H, d, 3,2Hz),
4,43(1H, d, 3,2Hz), 6,57(1H, s), 7,57(2H, m), 7,66(1H, m), 8,09(2H,
d, 8,0Hz), 8,72(1H, s), 8,85(1H, s).
FAB-MAS(mNBA): 398(M+H)+
-
Beispiel 12
-
2'-O,4'-C-Ethylenadenosin
-
(Beispielsverbindungsnummer
1-7)
-
Eine
Lösung
der in Beispiel 11 erhaltenen Verbindung (14 mg, 0,035 mmol) in
mit Ammoniak gesättigtem
Methanol (1 ml) wurde über
Nacht stehen gelassen. Das Gemisch wurde konzentriert, und der Rückstand wurde
durch Chromatographie auf einer Kieselgelsäule (unter Verwendung von Dichlormethan
: Methanol = 10 : 1 als Elutionsmittel) gereinigt, wobei ein weißes Pulver
erhalten wurde (10 mg, 0,034 mmol, 98%).
1H-NMR
(400MHz, CD3OD): 1,32(1H, dd, 4 und 13Hz),
2,04(1H, dt, 7,4 und 12Hz), 3,53(1H, dd, 5 und 12Hz), 3,61(1H, dd,
5,2 und 12Hz), 3,90(1H, dd, 7,4 und 12Hz), 3,97(1H, dt, 4 und 12Hz),
4,15(1H, d, 3,1Hz), 4,21(1H, d, 3,1Hz), 5,27(1H, t, 5,2Hz) 5,39(1H,
d, 3,1Hz), 6,33(1H, s), 7,29(2H, s), 7,66(1H, m), 8,14(1H, s), 8,42(1H,
s).
FAB-MAS(mNBA): 294(M+H)+
UV(λmax): 260(pH7),
260(pH1), 258(pH13)
-
Beispiel 13
-
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-6-N-benzoyladenosin
-
(Beispielsverbindungsnummer
1-31)
-
Eine
Lösung
der in Beispiel 11 erhaltenen Verbindung (14 mg, 0,035 mmol) in
wasserfreiem Pyridin wurde azeotrop destilliert, um Wasser zu entfernen.
Das Produkt wurde in wasserfreiem Pyridin (1 ml) unter einer Stickstoffatmosphäre gelöst, und
4,4'-Dimethoxytritylchlorid
(18 mg, 0,053 mmol) wurde zu der Lösung gegeben, und das Gemisch
wurde 5 Stunden bei 40°C
gerührt.
Eine kleine Menge Methanol wurde zu dem Reaktionsgemisch gegeben,
und dann wurde das Lösungsmittel
im Vakuum eingedampft. Der Rückstand
wurde zwischen Wasser und Chloroform aufgetrennt, und die organische
Schicht wurde mit einer gesättigten wässrigen
Natriumhydrogencarbonatlösung
und einer gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
gewaschen und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde durch Chromatographie
auf einer Kieselgelsäule
(unter Verwendung von Dichlormethan Methanol = 100 : 5 als Elutionsmittel)
gereinigt, wobei die Titelverbindung (18 mg, 0,026 mmol, 73%) als
farbloser amorpher Feststoff erhalten wurde.
1H-NMR(400MHz,
CDCl3): 1,63(1H, m), 2,14(1H, 7,5, 12, und
13Hz), 3,37(1H, d, 11Hz), 3,41(1H, d, 11Hz), 3,79(6H, s), 4,10 (2H,
m), 4,48(1H, d, 3,3Hz), 4,59(1H, d, 3,3Hz), 6,54(1H, s), 6,85(4H,
m), 7,2–7,6(12H,
m), 8,02(2H, m), 8,45(1H, s), 8,82(1H, s), 9,02(1H, brs).
FAB-MAS(mNBA):
700(M+H)+
-
Beispiel 14
-
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-6-N-benzoyladenosin-3'-O-(2-cyanethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit
-
(Beispielsverbindungsnummer
1-186)
-
Eine
Lösung
der in Beispiel 13 erhaltenen Verbindung (16 mg, 0,023 mmol) in
wasserfreiem Pyridin wurde azeotrop destilliert, um Wasser zu entfernen.
Das Produkt wurde unter einer Stickstoffatmosphäre in wasserfreiem Dichlormethan
(0,5 ml) gelöst.
Tetrazol-N,N-diisopropylaminsalz (10 mg) wurde zu der Lösung gegeben,
und dann wurde 2-Cyanethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphoramidit
(etwa 20 μl)
tropfenweise in einem Eisbad zugegeben. Das Gemisch wurde über Nacht
bei Raumtemperatur gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde mit einer gesättigten wässrigen Natriumhydrogencarbonatlösung und
einer gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
gewaschen und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde durch Chromatographie
auf einer Kieselgelsäule
(unter Einsatz von Dichlormethan : Ethylacetat = 2 : 1 als Elutionsmittel)
gereinigt, wobei die Titelverbindung (20 mg, 0,022 mmol, 97%) als
weißer
Feststoff erhalten wurde.
1H-NMR(400MHz,
CDCl3): 1,0–1,2(12H, m), 1,54(1H, m),
2,15(1H, m), 2,33(2H, m), 3,3–3,6
(6H, m), 3,80(6H, s), 4,08 (2H, m), 4,65 (1H, m), 4,75(1H, m), 6,53(1H,
s), 6,84(4H, m), 7,2-7,6(12H,
m), 8,01(2H, m), 8,53(1H, s), 8,83(1H, s), 9,01(1H, brs).
FAB-MAS(mNBA):
900(M+H)+
-
Beispiel 15
-
3',5'-Di-O-benzyl-2'-O,4'-C-ethylenuridin
-
(Beispielsverbindungsnummer
2-10)
-
Eine
wässrige
1N Natriumhydroxidlösung
(2 ml) wurde zu einer Lösung
der in Referenzbeispiel 13 erhaltenen Verbindung (194 mg, 0,292
mmol) in Pyridin (3 ml) bei 0°C
gegeben, und das Gemisch wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das
Reaktionsgemisch wurde mit 1N Chlorwasserstoffsäure neutralisiert und mit Ethylacetat
(10 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde mit einer gesättigten
wässrigen
Natriumhydrogencarbonatlösung
und einer gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
gewaschen, über
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert.
Der Rückstand
wurde durch Chromatographie auf einer Kieselgelsäule (unter Einsatz von Dichlormethan
: Methanol = 100 : 3 als Elutionsmittel) gereinigt, wobei ein farbloses Öl (105 mg,
0,233 mmol, 80%) erhalten wurde.
1H-NMR(400MHz,
CDCl3): 1,36(1H, m), 2,29(1H, m), 3,63(1H,
d, 11Hz), 3,74(1H, d, 11Hz), 3,87(1H, d, 2,9Hz), 4,03(2H, m), 4,29(1H,
d, 2,9Hz), 4,49(1H, d, 12Hz), 4,50(1H, d, 11Hz), 4,53(1H, d, 11Hz),
4,73(1H, d, 12Hz), 5,20(1H, dd, 2 und 8Hz), 6,04(1H, s), 7,2–7,4(10H,
m), 8,13(1H, d, 8,2Hz), 8,57(1H, brs).
FAB-MAS(mNBA): 451(M+H)+
-
Beispiel 16
-
2'-O,4'-C-Ethylenuridin
-
(Beispielsverbindungsnummer
2-1)
-
Eine
Lösung
der in Beispiel 15 erhaltenen Verbindung (100 mg, 0,222 mmol) in
Methanol (4 ml) wurde unter einer Wasserstoffatmosphäre bei Atmosphärendruck
in Anwesenheit eine Hydrierungskatalysators 5 Stunden gerührt. Das
Reaktionsgemisch wurde filtriert, um den Katalysator zu entfernen,
und das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert. Der Rückstand
wurde durch Chromatographie auf einer Kieselgelsäule (unter Einsatz von Dichlormethan
: Methanol = 10 : 1 als Elutionsmittel) gereinigt, wobei ein farbloses Öl (45 mg,
0,167 mmol, 75%) erhalten wurde.
1H-NMR
(400MHz, CD3OD): 1,35(1H, dd, 4 und 13Hz),
2,13(1H, ddd, 7,11 und 13Hz), 3,66(1H, d, 12Hz), 3,73(1H, d, 12Hz),
3,91–4,08(2H,
m), 4,01(1H, d, 3,2Hz), 4,12(1H, d, 3,2Hz), 5,66(1H, d, 8,2Hz),
6,00(1H, s), 8,37(1H, d, 8,2Hz).
FAB-MAS(mNBA): 271(M+H)+
-
Beispiel 17
-
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylenuridin
-
(Beispielsverbindungsnummer
2-15)
-
Eine
Lösung
der in Beispiel 16 erhaltenen Verbindung (28 mg, 0,104 mmol) in
wasserfreiem Pyridin wurde azeotrop destilliert, um Wasser zu entfernen.
Das Produkt wurde in wasserfreiem Pyridin (3 ml) unter einer Stickstoffatmosphäre gelöst, und
4,4'-Dimethoxytritylchlorid
(50 mg, 0,15 mmol) wurde zu der Lösung gegeben, und das Gemisch
wurde über
Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Eine kleine Menge Methanol wurde zu dem Reaktionsgemisch gegeben,
und dann wurde das Lösungsmittel
im Vakuum eingedampft. Der Rückstand
wurde zwischen Wasser und Chloroform aufgetrennt, und die organische
Schicht wurde mit einer gesättigten
wässrigen
Natriumhydrogencarbonatlösung
und einer gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
gewaschen und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde durch Chromatographie
auf einer Kieselgelsäule (unter
Einsatz von Dichlormethan Methanol = 100 : 3 als Elutionsmittel)
gereinigt, wobei die Titelverbindung (25 mg, 0,044 mmol, 42%) als
farbloses Öl
erhalten wurde.
1H-NMR (400MHz, CD3OD): 1,35(1H, dd, 3 und 14Hz), 2,03(1H,
ddd, 8,11 und 14Hz), 2,46(1H, d, 8Hz), 3,36(1H, d, 11Hz), 3,41(1H,
d, 11Hz), 3,80(3H, s), 3,81(3H, s), 3,97(2H, m), 4,21(1), 4,33(1H,
brm), 5,31(1H, m), 6,10(1H, s), 6,86(4H, m), 7,2–7,5(9H, m), 8,27(1H, d, 8,2Hz),
8,43(1H, brs).
FAB-MAS(mNBA): 573(M+H)+
-
Beispiel 18
-
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylenuridin-3'-O-(2-cyanethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit
-
(Beispielsverbindungsnummer
2-233)
-
Eine
Lösung
der in Beispiel 17 erhaltenen Verbindung (6 mg, 0,0105 mmol) in
wasserfreiem Pyridin wurde azeotrop destilliert, um Wasser zu entfernen.
Das Produkt wurde unter einer Stickstoffatmosphäre in wasserfreiem Dichlormethan
(0,5 ml) gelöst.
Tetrazol-N,N-diisopropylaminsalz (3 mg) wurde zu der Lösung gegeben,
und dann wurde 2-Cyanethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphoramidit
(etwa 5 μl)
tropfenweise in einem Eisbad zugegeben. Das Gemisch wurde über Nacht
bei Raumtemperatur gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde mit einer gesättigten wässrigen Natriumhydrogencarbonatlösung und
einer gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
gewaschen und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde durch Chromatographie
auf einer Kieselgelsäule
(unter Einsatz von Dichlormethan : Ethylacetat = 2 : 1 als Elutionsmittel)
gereinigt, wobei die Titelverbindung (8 mg) als weißer Feststoff
erhalten wurde.
1H-NMR(400MHz, CDCl3): 1,1–1,2(13H,
m), 2,09(1H, m), 2,4(2H, m), 3,3–3,6(6H, m), 3,81(6H, m), 3,94(2H, m),
4,35(1H, m), 4,47(1H, m), 5,18(1H, d, 8,2Hz), 6,08(1H, s), 6,86(4H,
m), 7,2–7,4(9H,
m), 8,31(1H, d, 8,2Hz).
FAB-MAS(mNBA): 773(M+H)+
-
Beispiel 19
-
3',5'-Di-O-benzyl-2'-O,4'-C-ethylen-4-N-benzoyl-5-methylcytidin
-
(Beispielsverbindungsnummer
2-46)
-
Eine
wässrige
1N Natriumhydroxidlösung
(5 ml) wurde zu einer Lösung
der in Referenzbeispiel 14 erhaltenen Verbindung (310 mg, 0,396
mmol) in Pyridin (5 ml) bei 0°C
gegeben, und das Gemisch wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das
Reaktionsgemisch wurde durch tropfenweises Zugeben einer wässrigen
20%igen Essigsäure
neutralisiert und mit Dichlormethan extrahiert. Die Dichlormethanschicht
wurde mit einer gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
gewaschen und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde durch Chromatographie
auf einer Kieselgelsäule
(unter Einsatz von Dichlormethan : Methanol = 100 : 2 als Elutionsmittel)
gereinigt, wobei die Titelverbindung (190 mg, 0,334 mmol, 84%) erhalten
wurde.
1H-NMR(400MHz, CDCl3):
1,37(1H, m), 1,58(3H, s), 2,30(1H, dt, 10 und 13Hz), 3,64(1H, d,
11Hz), 3,79(1H, d, 11Hz), 3,95(1H, d, 3,0Hz), 4,04(2H, dd, 2,3 und
10Hz), 4,37(1H, d, 3,0Hz), 4,50(1H, d, 12Hz), 4,56 (1H, d, 11Hz),
4,61(1H, d, 11Hz), 4,76(1H, d, 12Hz), 6,11(1H, s), 7,2–7,5(13H,
m), 8,09(1H, s), 8,29(2H, m).
FAB-MAS(mNBA): 568(M+H)+
-
Beispiel 20
-
2'-O,4'-C-Ethylen-4-N-benzoyl-5-methylcytidin
-
(Beispielsverbindungsnummer
2-226)
-
Eine
1M Bortrichloridlösung
(1,6 ml) in Dichlormethan wurde tropfenweise zu einer Lösung der
in Beispiel 19 erhaltenen Verbindung (120 mg, 0,211 mmol) in wasserfreiem
Dichlormethan (5 ml) bei –78°C gegeben,
und das Gemisch wurde 4 Stunden bei –78°C gerührt. Methanol (1 ml) wurde
langsam tropfenweise zu dem Gemisch gegeben, und das Gemisch wurde
10 Minuten gerührt.
Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wurde durch tropfenweises Zugeben
einer gesättigten
wässrigen
Natriumhydrogencarbonatlösung
auf 7–8 eingestellt.
Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmt und
im Vakuum konzentriert. Der Rückstand
wurde durch Chromatographie auf einer Kieselgelsäule (unter Einsatz von Dichlormethan
: Methanol = 100 : 6 als Elutionsmittel) gereinigt, wobei die Titelverbindung
(29 mg, 0,075 mmol, 36%) als weißer Feststoff erhalten wurde.
1H-NMR(400MHz, d-DMSO): 1,24(1H, m), 2,01(3H,
s), 2,0(1H, m), 3,54(1H, dd, 5,4 und 12Hz), 3,64(1H, dd, 5,4 und
12Hz), 3,88(3H, m), 4,10(1H, m), 5,36(1H, d, 5,4Hz), 5,49(1H, t,
5,0Hz), 5,95(1H, s), 7,4–7,6
(3H, m), 8,21(2H, m), 8,49(1H, s), 13,17(1H, brs).
FAB-MAS(mNBA):
388(M+H)+
-
Beispiel 21
-
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-4-N-benzoyl-5-methylcytidin
(Beispielsverbindungsnummer 2-51)
-
Eine
Lösung
der in Beispiel 20 erhaltenen Verbindung (44 mg, 0,114 mmol) in
wasserfreiem Pyridin wurde azeotrop destilliert, um Wasser zu entfernen.
Das Produkt wurde in wasserfreiem Pyridin (1 ml) unter einer Stickstoffatmosphäre gelöst, und
4,4'-Dimethoxytritylchlorid
(60 mg, 0,177 mmol) wurde zu der Lösung gegeben, und das Gemisch
wurde über
Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Eine kleine Menge Methanol wurde zu dem Reaktionsgemisch gegeben,
und dann wurde das Lösungsmittel
im Vakuum eingedampft. Der Rückstand
wurde zwischen Wasser und Chloroform aufgetrennt. Die organische
Schicht wurde mit einer gesättigten
wässrigen
Natriumhydrogencarbonatlösung
und einer gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung gewaschen
und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde durch Chromatographie
auf einer Kieselgelsäule
(unter Einsatz von Dichlormethan Methanol = 100 : 4 als Elutionsmittel)
gereinigt, wobei die Titelverbindung (73 mg, 0,106 mmol, 93%) als
farbloses Öl
erhalten wurde.
1H-NMR(400MHz, CDCl3): 1,46(1H, m), 1,49(3H, s), 2,06(1H, m),
2,59(1H, d, 8,6Hz), 3,36(1H, d, 11Hz), 3,39(1H, d, 11Hz), 3,80(3H,
s), 3,81(3H, s), 3,99(2H, m), 4,30(1H, d, 3,3Hz), 4,39(1H, m), 6,12(1H,
s), 6,85(4H, m), 7,2–7,5(12H,
m), 8,03(1H, s), 8,28(2H, m).
FAB-MAS(mNBA): 573(M+H)+
-
Beispiel 22
-
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-4-N-benzoyl-5-methylcytidin-3'-O-(2-cyanethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit
-
(Beispielsverbindungsnummer
2-236)
-
Eine
Lösung
der in Beispiel 21 erhaltenen Verbindung (35 mg, 0,0507 mmol) in
wasserfreiem Pyridin wurde azeotrop destilliert, um Wasser zu entfernen.
Das Produkt wurde unter einer Stickstoffatmosphäre in wasserfreiem Dichlormethan
(1 ml) gelöst.
Tetrazol-N,N-diisopropylaminsalz (17 mg) wurde zu der Lösung gegeben,
und dann wurde 2-Cyanethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphoramidit
(32 μl,
0,1 mmol) tropfenweise in einem Eisbad zugegeben. Das Gemisch wurde über Nacht
bei Raumtemperatur gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde mit einer ge sättigten wässrigen Natriumhydrogencarbonatlösung und
einer gesättigten
wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen
und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde durch Chromatographie auf
einer Kieselgelsäule
(unter Einsatz von Dichlormethan Ethylacetat = 2 : 1 als Elutionsmittel)
gereinigt, wobei die Titelverbindung (40 mg, 0,0445 mmol, 89%) als
weißer
Feststoff erhalten wurde.
1H-NMR(400MHz,
CDCl3): 1,2(12H, m), 1,36(3H, s), 1,37(1H,
m), 2,10(1H, m), 2,36(2H, m), 3,3–3,6(6H, m), 3,81(6H, m), 3,98(2H,
m), 4,42(1H, m), 4,49(1H, m), 6,11(1H, s), 6,88(4H, m), 7,2–7,5(12H,
m), 8,14(1H, s), 8,28(2H, m).
FAB-MAS(mNBA): 890(M+H)+
-
Beispiel 23
-
2'-O,4'-C-Ethylen-5-methylcytidin
-
(Beispielsverbindungsnummer
2-226)
-
Eine
Lösung
der in Beispiel 20 erhaltenen Verbindung (11,6 mg, 0,030 mmol) in
mit Ammoniak gesättigtem
Methanol (2 ml) wurde über
Nacht stehen gelassen. Das Gemisch wurde konzentriert, wobei ein
weißer Feststoff
(8,5 mg, 0,030 mmol) erhalten wurde.
1H-NMR(400MHz,
d-DMSO): 1,20 (1H, m), 1,82(3H, s), 1,97(1H, m), 3,49(1H, dd, 5
und 12Hz), 3,58(1H, dd, 5 und 12Hz), 3,85(2H, m), 5,23 (1H, d, 5Hz),
5,32 (1H, t, 5Hz), 5,84(1H, s), 6,7(1H, brs), 7,2(1H, brs), 8,08(1H,
s).
FAB-MAS(mNBA): 284(M+H)+
UV(λmax) : 279(pH7),
289(pH1), 279(pH13)
-
Beispiel 24
-
3',5'-Di-O-benzyl-2'-O,4'-C-ethylen-2-N-isobutyrylguanosin
-
(Beispielsverbindungsnummer
1-24)
-
Eine
wässrige
1N Natriumhydroxidlösung
(2 ml) wurde zu einer Lösung
der in Referenzbeispiel 15 erhaltenen Verbindung (etwa 200 mg) in
Pyridin (2 ml) gegeben, und das Gemisch wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur
gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde mit 1N Chlorwasserstoffsäure neutralisiert
und mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde mit
einer gesättigten
wässrigen
Natriumhydrogencarbonatlösung
und einer gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
gewaschen, über
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert.
Der Rückstand
wurde durch Chromatographie auf einer Kieselgelsäule (unter Einsatz von Dichlormethan
: Methanol = 50 : 1 als Elutionsmittel) gereinigt, wobei ein farbloser amorpher
Feststoff (20 mg, 0,036 mmol, 6%, 2 Stufen) erhalten wurde.
1H-NMR(400MHz, CDCl3):
1,27(3H, s), 1,29(3H, s), 1,43(1H, dd, 3 und 13Hz), 2,28(1H, m),
2,59(1H, qui, 6,9Hz), 3,54(1H, d, 11Hz), 3,68(1H, d, 11Hz), 4,03(2H,
m), 4,15 (1H, d, 3,0Hz), 4,31(1H, d, 3,0Hz), 4,45(1H, d, 12), 4,56(1H,
d, 12Hz), 4,61(1H, d, 12Hz), 4,63(1H, d, 12Hz), 6,18(1H, s), 7,2-7,4(10H, m), 8,19(1H,
s), 11,93(1H, brs).
FAB-MAS(mNBA): 560(M+H)+
-
Beispiel 25
-
2'-O,4'-C-Ethylen-2-N-isobutyrylguanosin
-
(Beispielsverbindungsnummer
1-177)
-
Eine
Lösung
der in Beispiel 24 erhaltenen Verbindung (10 mg, 0,018 mmol) in
Methanol (2 ml) wurde unter einer Wasserstoffatmosphäre bei Atmosphärendruck
in Anwesenheit eines Hydrierungskatalysators 5 Stunden gerührt. Das
Reaktionsgemisch wurde filtriert, um den Katalysator zu entfernen,
und das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert. Der Rückstand
wurde durch Chromatographie auf einer Kieselgelsäule (unter Einsatz von Dich lormethan
: Methanol = 10 : 2 als Elutionsmittel) gereinigt, wobei ein farbloses Öl (5 mg,
0,013 mmol, 72%) erhalten wurde.
1H-NMR
(400MHz, CD3OD): 1,21(3H, s), 1,22(3H, s),
1,41(1H, dd, 4 und 13Hz), 2,18(1H, m), 2,69(1H, qui, 6,9Hz), 3,69(1H,
d, 12Hz), 3,76(1H, d, 12Hz), 4,0(2H, m), 4,26(1H, d, 3,2Hz), 4,30(1H,
d, 3,2Hz), 6,30(1H, s), 8,40(1H, s).
FAB-MAS(mNBA): 380(M+H)+
-
Beispiel 26
-
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-2-N-isobutyrylguanosin
-
(Beispielsverbindungsnummer
1-35)
-
Eine
Lösung
der in Beispiel 25 erhaltenen Verbindung (5 mg, 0,013 mmol) in wasserfreiem
Pyridin wurde azeotrop destilliert, um Wasser zu entfernen. Das
Produkt wurde in wasserfreiem Pyridin (1 ml) unter einer Stickstoffatmosphäre gelöst, und
4,4'-Dimethoxytritylchlorid
(14 mg, 0,04 mmol) wurde zu der Lösung gegeben, und das Gemisch
wurde 3 Stunden bei 40°C
gerührt.
Eine kleine Menge Methanol wurde zu dem Reaktionsgemisch gegeben,
und dann wurde das Lösungsmittel
im Vakuum eingedampft. Der Rückstand
wurde durch Chromatographie auf einer Kieselgelsäule (unter Einsatz von Dichlormethan
: Methanol = 100 : 6 als Elutionsmittel) gereinigt, wobei die Titelverbindung
(4 mg, 0,0059 mmol, 45%) als farbloser Feststoff erhalten wurde.
1H-NMR(400MHz, CDCl3):
1,26(3H, d, 1,4Hz), 1,28(3H, d, 1,4Hz), 1,66(1H, m), 2,15(1H, m),
2,59(1H, qui, 6,9Hz), 3,65 (1H, m), 3,78(1H, m), 4,06(2H, m), 4,35(1H,
m), 4,38(1H, d, 3,2Hz), 6,23(1H, s), 6,8(4H, m), 7,2–7,5(9H,
m), 8,01(1H, s), 8,19(1H, brs).
FAB-MAS(mNBA): 682(M+H)+
-
Beispiel 27
-
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-2-N-isobutyrylguanosin-3'-O-(2-cyanethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit
-
(Beispielsverbindungsnummer
1-185)
-
Eine
Lösung
der in Beispiel 26 erhaltenen Verbindung (4 mg, 0,0058 mmol) in
wasserfreiem Pyridin wurde azeotrop destilliert, um Wasser zu entfernen.
Das Produkt wurde unter einer Stickstoffatmosphäre in wasserfreiem Dichlormethan
(0,5 ml) gelöst.
Tetrazol-N,N-diisopropylaminsalz (5 mg) wurde zu der Lösung gegeben,
und dann wurde 2-Cyanethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphoramidit
(9 μl, 0,03
mmol) tropfenweise in einem Eisbad zugegeben. Das Gemisch wurde
1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde mit einer gesättigten wässrigen Natriumhydrogencarbonatlösung und
einer gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
gewaschen und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde durch Chromatographie
auf einer Kieselgelsäule
(unter Einsatz von Dichlormethan : Ethylacetat = 2 : 1 als Elutionsmittel)
gereinigt, wobei die Titelverbindung (4 mg) als weißer Feststoff
erhalten wurde.
1H-NMR(400MHz, CDCl3): 1,1–1,4(19H,
m), 2,1(1H, m), 2,4(2H, m), 2,6(1H, m), 3,3–3,6(6H, m), 3,8(6H, s), 4,0–4,6(4H,
m), 6,2(1H, s), 6,8(4H, m), 7,2–7,5(9H,
m), 8,1(1H, s).
-
Beispiel 28
-
2'-O,4-C-Ethylenguanosin
-
(Beispielsverbindungsnummer
1-5)
-
Eine
Lösung
der in Beispiel 25 erhaltenen Verbindung (0,5 mg) in mit Ammoniak
gesättigtem
Methanol (0,5 ml) wurde 5 Stunden bei 60°C stehen gelassen. Das Gemisch
wurde konzentriert, wobei ein weißes Pulver (0,4 mg) erhalten
wurde.
FAB-MAS(mNBA): 310(M+H)+
UV(λmax): 255(pH7),
256(pH1), 258–266(pH13)
-
Beispiel 29
-
Synthese des
Oligonukleotidderivats
-
Die
Synthese eines Oligonukleotidderivats wurde unter Einsatz eines
mechanischen Nukleinsäuresynthetisiergeräts (ABI
Modell 392 DNA/RNA-Synthetisiergerät: ein Produkt von Perkin-Elmer
Corporation) in einem Maßstab
von 1,0 μmol
durchgeführt.
Die Lösungsmittel,
Reagenzien und Konzentrationen an Phosphoramidit in jedem Synthesezyklus
sind dieselben wie diejenigen bei der Synthese von natürlichen
Oligonukleotiden. Lösungsmittel,
Reagenzien und Phosphoramidite der natürlichen Nukleoside sind Produkte
von PE Biosystems Corporation. Jede modifizierte Oligonukleotidderivatsequenz
wurde durch Wiederholen der Kondensation der in Beispiel 9 erhaltenen
Verbindung oder von Amiditen, die die 4 Spezies der Nukleinsäurebasen enthalten,
für die
Nukleotidsynthese mit 5'-Hydroxythymidin,
hergestellt durch Entfernen der Schutzgruppe von der DMTr-gruppe
von 5'-O-DMTr-thymidin (1,0 μmol) unter
Einsatz von Trichloressigsäure,
synthetisiert, wobei die 3'-Hydroxygruppe
des Thymidins an einen CGP-Träger
gebunden ist. Der Synthesezyklus ist wie folgt:
- 1)
Detritylierung: Trichloressigsäure/Dichlormethan;
35 sec
- 2) Kopplung: Phosphoramidit (etwa 20 Äquivalente), Tetrazol/Acetonitril;
25 sec oder 10 min
- 3) Endgruppe: 1-Methylimidazol/Tetrahydrofuran, Essigsäureanhydrid/Pyridin/Tetrahydrofuran;
15 sec
- 4) Oxidation: Iod/Wasser/Pyridin/Tetrahydrofuran; 15sec
-
In
dem vorstehenden Zyklus 2) war, wenn die in Beispiel 9 erhaltene
Verbindung eingesetzt wurde, die Reaktionsdauer 10 Minuten, und
wenn Phosphoramidite eingesetzt wurden, war die Reaktionsdauer 25
Sekunden.
-
Nach
der Synthese einer gewünschten
Oligonukleotidderivatsequenz wurde die 5'-DTMr-Gruppe entfernt, und der Träger, der
das gewünschte
Produkt enthielt, wurde mit einer konzentrierten wässrigen
Ammoniaklösung
herkömmlich
behandelt, um das Oligomer von dem Träger abzulösen und die Cyanethylgruppe, welche
die Phosphorgruppe schützt,
zu entfernen. Die Aminoschutzgruppe in Adenin, Guanin und Cytosin wurde
von dem Oligomer entfernt. Das Oligonukleotidderivat wurde durch
Umkehrphasen-HPLC (HPLC: LC-VP: ein Produkt von Shimazu Corp.; Säule: Wakopak
WS-DNA: ein Produkt von Wako Pure Chemical Industry Ltd.) gereinigt,
wobei das gewünschte
Oligonukleotid erhalten wurde.
-
Nach
diesen Syntheseverfahren wurde die folgende Oligonukleotidsequenz
(wobei diese Oligonukleotidsequenz im Folgenden als "Oligonukleotid 1" bezeichnet wird)
erhalten (0,23 μmol,
23% Ausbeute).
-
5'-gcgttttttgct-3' (Sequenznummer 2
in dem Sequenzprotokoll), wobei der Zuckerrest der Thymidine an
den Basennummern 4 bis 8 2'-O,4'-C-Ethylen ist.
-
Referenzbeispiel 1
-
3,5-Di-O-benzyl-4-trifluormethansulfonyloxymethyl-1,2-O-isopropyliden-α-D-erythropentofuranose
-
Wasserfreies
Pyridin (0,60 ml, 7,5 mmol) wurde zu einer Lösung von 3,5-Di-O-benzyl-4-hydroxymethyl-1,2-O-isopropyliden-α-D-erythropentofuranose
(2000 mg, 5,0 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (50 ml) und Trifluormethansulfonsäureanhydrid
(1010 mg, 6,0 mmol) unter einer Stickstoffatmosphäre bei –78°C gegeben,
und das Gemisch wurde 40 Minuten gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde
zwischen Methylenchlorid und einer gesättigten wässrigen Natriumhydrogencarbonatlösung (etwa
100 ml) aufgetrennt. Die organische Schicht wurde mit einer gesättigten
wässrigen
Natriumhydrogencarbonatlösung
(etwa 100 ml) und ei ner gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
(etwa 100 ml) gewaschen, über
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert,
wobei ein weißes
Pulver (2520 mg, 4,73 mmol, 95%) erhalten wurde, das in der folgenden
Reaktion ohne weitere Reinigung eingesetzt wurde.
1H-NMR(400MHz,
CDCl3): 1,34(3H, s), 1,63(3H, s), 3,48(1H,
d, 10Hz), 3,53(1H, d, 10Hz), 4,21(1H, d, 5,0Hz), 4,5(4H, m), 4,74(1H,
d, 12Hz), 4,80(1H, d, 12Hz), 5,01(1H, d, 12Hz), 5,73(1H, d, 4,6Hz),
7,3(10H, m).
-
Referenzbeispiel 2
-
3,5-Di-O-benzyl-4-cyanmethyl-1,2-O-isopropyliden-α-D-erythropentofuranose
-
Die
in Referenzbeispiel 1 erhaltene Verbindung (2520 mg, 4,73 mmol)
wurde in Dimethylsulfoxid (50 ml) bei 90°C gelöst. Zu der Lösung wurde
Natriumcyanid (463 mg, 9,46 mmol) bei Raumtemperatur gegeben, und
das Gemisch wurde 3 Stunden bei 50°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde
zwischen Wasser (etwa 100 ml) und Ethylacetat (etwa 100 ml) aufgetrennt.
Die organische Schicht wurde mit einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung (etwa
100 ml) gewaschen, über
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert.
Der Rückstand
wurde durch Chromatographie auf einer Kieselgelsäule (unter Einsatz von Hexan
: Ethylacetat = 4 : 1) gereinigt, wobei ein farbloses Öl (1590
mg, 3,89 mmol, 82%) erhalten wurde.
1H-NMR(400MHz,
CDCl3): 1,34(3H, s), 1,62(3H, s), 2,88(1H,
d, 17Hz), 3,15(1H, d, 17Hz), 3,50(1H, d, 10Hz), 3,58(1H, d, 10Hz),
4,08(1H, d, 5,1Hz), 4,52(1H, d, 12Hz), 4,56(1H, d, 12Hz), 4,57(1H,
m), 4,58(1H, d, 12Hz), 4,76(1H, d, 12Hz), 5,73(1H, d, 3,7Hz), 7,3(10H,
m).
-
Referenzbeispiel 3
-
3,5-Di-O-benzyl-4-formylmethyl-1,2-O-isopropyliden-α-D-erythropentofuranose
-
Eine
1,5M Toluollösung
von Isobutylaluminiumhydrid (2 ml, 3,0 mmol) wurde langsam tropfenweise
zu einer Lösung
der in Referenzbeispiel 2 erhaltenen Verbindung (610 mg, 1,49 mmol)
in Dichlormethan (10 ml) unter einer Stickstoffatmosphäre bei –78°C gegeben,
und das Gemisch wurde 1 Stunde bei –78°C gerührt und dann auf Raumtemperatur
erwärmt.
Zu dem Reaktionsgemisch wurde Methanol (5 ml) und eine gesättigte wässrige Ammoniumchloridlösung (etwa
20 ml) gegeben, und dieses Gemisch wurde 30 Minuten gerührt. Das Reaktionsgemisch
wurde mit Ethylacetat (etwa 30 ml) extrahiert. Die organische Schicht
wurde mit einer gesättigten
wässrigen
Natriumhydrogencarbonatlösung
(etwa 30 ml) und einer gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
(etwa 30 ml) gewaschen, über
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert,
wobei ein Produkt erhalten wurde, das in der nachfolgenden Reaktion
ohne weitere Reinigung eingesetzt wurde.
-
Referenzbeispiel 4
-
3,5-Di-O-benzyl-4-hydroxyethyl-1,2-O-isopropyliden-α-D-erythropentofuranose
-
NaBH4 (7,6 mg, 0,2 mmol) wurde zu einer Lösung der
in Referenzbeispiel 3 erhaltenen Verbindung (154 mg, 0,377 mmol)
in Ethanol (5 ml) gegeben, und das Gemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur
gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde zwischen Ethylacetat (etwa 10 ml) und
Wasser (etwa 10 ml) aufgetrennt, und die organische Schicht wurde
mit einer gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
(etwa 10 ml) gewaschen, über
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert.
Der Rückstand
wurde durch Chromatographie auf einer Kieselgelsäule (unter Einsatz von Hexan
: Ethylacetat = 2 : 1) gereinigt, wobei ein farbloses Öl (117 mg,
0,284 mmol, 75%) erhalten wurde.
1H-NMR(400MHz,
CDCl3): 1,33(3H, s), 1,66(3H, s), 1,78(1H,
ddd, 4,0, 8,5, 15Hz), 2,51(1H, ddd, 3,4, 6,4, 15Hz), 3,31(1H, d,
10HZ), 3,54 (1H, d, 10Hz), 3,80(2H, m), 4,13(1H, d, 5,3Hz), 4,43(1H,
d, 12Hz), 4,52(1H, d, 12Hz), 4,55(1H, d, 12Hz), 4,65(1H, dd, 4,0,
5,3Hz), 4,77(1H, d, 12Hz), 5,77(1H, d, 4,0 Hz), 7,3(10H, m).
FABMS(mNBA):
415(M+H)+, [α]D+57,4° (0,91, Methanol).
-
Referenzbeispiel 5
-
3,5-Di-O-benzyl-4-formyl-1,2-O-isopropyliden-α-D-erythropentofuranose
-
Oxalylchlorid
(6,02 ml, 69,0 mmol) wurde zu auf –78°C gekühltes Methylenchlorid (200
ml) gegeben. Eine Lösung
von Dimethylsulfoxid (7,87 ml, 110 mmol) in wasserfreiem Methylenchlorid
(100 ml) wurde tropfenweise zu dieser Lösung gegeben. Nach dem Rühren während 20
Minuten wurde eine Lösung
von 3,5-Di-O-benzyl-1,2-O-isopropyliden-α-D-erythropentofuranose
(9210 mg, 23,02 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (100 ml) tropfenweise
zu diesem Gemisch gegeben, und das Gemisch wurde 30 Minuten gerührt. Triethylamin
(28 ml, 200 mmol) wurde zu diesem Reaktionsgemisch gegeben, und
das Gemisch wurde langsam auf Raumtemperatur erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde
zwischen Dichlormethan und Wasser (etwa 300 ml) aufgetrennt. Die
organische Schicht wurde mit Wasser (etwa 300 ml) und einer gesättigten
wässrigen Natriumchloridlösung (etwa
300 ml) gewaschen, über
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert.
Der Rückstand
wurde durch Chromatographie auf einer Kieselgelsäule (unter Einsatz von Hexan
Ethylacetat = 5 : 1) gereinigt, wobei ein farbloses Öl erhalten
wurde (8310 mg, 20,88 mmol, 91%).
1H-NMR
(400MHz, CDCl3): 1,35(3H, s), 1,60(3H, s),
3,61(1H, d, 11Hz), 3,68(1H, d, 11Hz), 4,37(1H, d, 4,4Hz), 4,46(1H,
d, 12Hz), 4,52(1H, d, 12Hz), 4,59(1H, d, 12Hz), 4,59(1H, dd, 3,4,
4,4Hz), 4,71(1H, d, 12Hz), 5,84(1H, d, 3,4Hz), 7,3 (10H, m), 9,91(1H,
s).
FABMS (mNBA) : 397(M–H)+, 421(M+Na)+,
[α]D+27,4° (0,51,
Methanol).
-
Referenzbeispiel 6
-
3,5-Di-O-benzyl-4-vinyl-1,2-O-isopropyliden-α-D-erythropentofuranose
-
Eine
0,5M Toluollösung
des Tebbe-Reagenses (44 ml, 22 mmol) wurde zu einer Lösung der
in Referenzbeispiel 5 erhaltenen Verbindung (8310 mg, 20,88 mmol)
in wasserfreiem Tetrahydrofuran (300 ml) unter einer Stickstoffatmosphäre bei 0°C gegeben,
und das Gemisch wurde 1 Stunde bei 0°C gerührt. Diethylether (300 ml)
wurde zu dem Reaktionsgemisch gegeben, und dann wurde eine 0,1N
wässrige
Natriumhydroxidlösung
(20 m) langsam zugegeben. Das Gemisch wurde durch Celite filtriert,
um Präzipitate
abzutrennen, und die Präzipitate
wurden mit Diethylether (etwa 100 ml) gewaschen. Die organische
Schicht wurde über
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert.
Der Rückstand
wurde durch Chromatographie auf basischem Aluminiumoxid unter Einsatz
von Dichlormethan gereinigt, wobei ein Rohprodukt erhalten wurde,
das durch Chromatographie auf einer Kieselgelsäule (unter Einsatz von Hexan
Ethylacetat = 8 : 1 – 5
: 1) gereinigt wurde, wobei ein farbloses Öl (5600 mg, 14,14 mmol, 68%)
erhalten wurde.
1H-NMR(400MHz, CDCl3): 1,28(3H, s), 1,52(3H, s), 3,31(1H, d,
11Hz), 3,34(1H, d, 11Hz), 4,25(1H, d, 4,9Hz), 4,40(1H, d, 12Hz),
4,52(1H, d, 12Hz), 4,57(1H, dd, 3,9, 4,9Hz), 4,9(1H, d, 12Hz), 4,76(1H,
d, 12Hz), 5,25(1H, dd, 1,8, 11Hz), 5,52(1H, dd, 1,8, 18Hz), 5,76(1H,
d, 3,9Hz), 6,20(1H, dd, 11,18Hz), 7,3 (10H, m).
FABMS(mNBA):
419(M+Na)+
-
Referenzbeispiel 7
-
3,5-Di-O-benzyl-4-hydroxyethyl-1,2-L-isopropyliden-α-D-erythropentofuranose
-
Eine
0,5M Tetrahydrofuranlösung
von 9-BBN (9-Borbicyclo[3.3.1]nonan) (80 ml, 40 mmol) wurde tropfenweise
zu einer Lösung
der in Referenzbeispiel 6 erhaltenen Verbindung (5500 mg, 13,89
mmol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (200 ml) unter einer Stickstoffatmosphäre gegeben,
und das Gemisch wurde über Nacht
bei Raumtemperatur gerührt.
Wasser wurde zu dem Reaktionsgemisch gegeben, bis die Gasbildung aufhörte, 3N
wässrige
Natriumhydroxidlösung
(30 ml) wurde zugegeben, und dann wurde langsam eine 30%ige wässrige Wasserstoffperoxidlösung, die
zwischen 30 und 50°C
gehalten wurde, zugegeben. Dieses Gemisch wurde 30 Minuten gerührt und
zwischen einer gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
(etwa 200 ml) und Ethylacetat (200 ml) aufgetrennt. Die organische
Schicht wurde mit einer neutralen Phosphorsäurepufferlösung (etwa 200 ml) und einer
gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
(etwa 200 ml) gewaschen und über
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert.
Der Rückstand
wurde durch Chromatographie auf einer Kieselgelsäule (unter Einsatz von Hexan
: Ethylacetat = 2 : 1 – 1
: 1) gereinigt, wobei ein farbloses Öl (5370 mg, 12,97 mmol, 93%)
erhalten wurde.
1H-NMR(400MHz, CDCl3): 1,33(3H, s), 1,66(3H, s), 1,78(1H, ddd,
4,0, 8,5, 15Hz), 2,51(1H, ddd, 3,4, 6,4, 15Hz), 3,31(1H, d, 10Hz),
3,54(1H, d, 10Hz), 3,80(2H, m), 4,13(1H, d, 5, 3Hz), 4,43(1H, d,
12Hz), 4,52(1H, d, 12Hz), 4,55(1H, d, 12Hz), 4,65(1H, dd, 4,0, 5,3Hz),
4,77(1H, d, 12Hz), 5,77(1H, d, 4,0 Hz), 7,3(10H, m).
FABMS
(mNBA): 415 (M+H)+, [α]D+57
4° (0,91,
Methanol).
-
Referenzbeispiel 8
-
3,5-Di-O-benzyl-4-(p-Toluolsulfonyloxyethyl)-1,2-O-isopropyliden-α-D-erythropentofuranose
-
Triethylamin
(1,8 ml, 13 mmol), Dimethylaminopyridin (30 mg, 0,25 mmol) und p-Toluolsulfonylchlorid (858
mg, 4,5 mmol) wurden zu einer Lösung
der in Referenzbeispiel 4 erhaltenen Verbindung gegeben, und dann
wurde das Gemisch mit Toluol (1035 mg, 2,5 mmol) in wasserfreiem
Dichlormethan (35 ml) unter einer Stickstoffatmosphäre bei 0°C azeotrop
destilliert, und das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur
gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde zwischen Dichlormethan und einer gesättigten
wässrigen
Natriumhydrogencarbonatlösung
(etwa 100 ml) aufgetrennt. Die organische Schicht wurde mit einer
gesättigten
wässrigen Natriumhydrogencarbonatlösung (etwa
100 ml) und einer gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
(etwa 100 ml) gewaschen und über
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert. Der
Rückstand
wurde durch Chromatographie auf einer Kieselgelsäule (unter Einsatz von Hexan
: Ethylacetat = 3 : 1) gereinigt, wobei ein farbloses Öl (1340
mg, 2,6 mmol, 94%) erhalten wurde.
1H-NMR(400MHz,
CDCl3): 1,33(3H, s), 1,49(3H, s), 1,99(1H,
dt, 7,6 und 15Hz), 2,47(3H, s), 2,60(1H, ddd, 5,7, 7,6, 15Hz), 3,28(1H,
d, 10Hz), 3,45(1H, d, 10Hz), 4,11(1H, d, 5,3Hz), 4,32(2H, m), 4,42(1H,
d, 12Hz), 4,50(1H, d, 12Hz), 4,54(1H, d, 12Hz), 4,62(1H, dd, 4,0,
5,2Hz), 4,76(1H, d, 12Hz), 5,74(1H, d, 4,0 Hz), 7,3(12H, m), 7,78(2H,
d, 8,3Hz).
FAB-MAS (mNBA) : 569(M+H)+
-
Referenzbeispiel 9
-
1,2-Di-O-acetyl-3,5-di-O-benzyl-4-(p-toluolsulfonyloxyethyl)-α-D-erythropentofuranose
-
Essigsäureanhydrid
(1,88 ml, 20 mmol) und konzentrierte Schwefelsäure (0,01 ml) wurden zu einer Lösung der
in Referenzbeispiel 8 erhaltenen Verbindung (1340 mg, 2,36 mmol)
in Essigsäure
(15 ml) gegeben, und das Gemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur
gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde in Wasser (60 ml) in einem Eisbad gegossen
und 30 Minuten gerührt,
und dann wurde das Gemisch zwischen einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung (etwa
100 ml) und Ethylacetat (etwa 100 ml) aufgetrennt. Die organische
Schicht wurde mit einer neutralen Phosphorsäurepufferlösung, einer gesättigten
wässrigen
Natriumhydrogencarbonatlösung
und einer gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
gewaschen und über
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann konzentriert. Der
Rückstand
wurde durch Chromatographie auf einer Kieselgelsäule (unter Einsatz von Hexan
: Ethylacetat = 2 : 1) gereinigt, wobei ein farbloses Öl (1290
mg, 2,11 mmol, 89%, α : β = 1 : 5)
erhalten wurde.
1H-NMR(400MHz, CDCl3): (β-Derivat)
1,86(3H, s), 2,05(3H, s), 2,08 (1H, m), 2,18(1H, m), 2,42(3H, s),
3,30(1H, d, 10Hz), 3,33(1H, d, 10Hz), 4,23(1H, d, 5,1Hz), 4,24(2H,
m), 4,42(2H, s), 4,45(1H, d, 12Hz), 4,55(1H, d, 12Hz), 5,28(1H,
d, 5,1Hz), 6,01(1H, s), 7,3(12H, m), 7,73(2H, d, 8,3Hz).
FAB-MAS
(mNBA) : 613(M+H)+
-
Referenzbeispiel 10
-
2'-O-Acetyl-3',5'-di-O-benzyl-4'-p-toluolsulfonyloxyethyl-5-methyluridin
-
Trimethylsilyliertes
Thymin (500 mg, etwa 2 mmol), das gemäß dem Verfahren nach H. Vorbrggen,
K. Krolikiewicz und B. Bennua (Chem. Ber., 114, 1234–1255 (1981))
hergestellt wurde, wurde zu einer Lösung der in Referenzbeispiel
9 erhaltenen Verbindung (650 mg, 1,06 mmol) in wasserfreiem 1,2-Dichlorethan
(15 ml) bei Raumtemperatur unter einer Stickstoffatmosphäre gegeben.
Trimethylsilyltrifluormethansulfonat (0,36 ml, 2 mmol) wurde tropfenweise
zu dem Gemisch gegeben, und das Gemisch wurde 1 Stunde bei 50°C gerührt. Eine
gesättigte
wässrige
Natriumhydrogencarbonatlösung
(etwa 50 ml) wurde zu dem Reaktionsgemisch gegeben, und das Gemisch
wurde durch Celite filtriert. Dichlormethan (etwa 50 ml) wurde zu
dem Filtrat gegeben. Die organische Schicht wurde mit einer gesättigten
wässrigen
Natriumhydrogencarbonatlösung
(etwa 50 ml) und einer gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
(etwa 50 ml) gewaschen und über
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert.
Der Rückstand
wurde durch Chromatographie auf einer Kieselgelsäule (unter Einsatz von Hexan
: Ethylacetat = 1,2 : 1) gereinigt, wobei ein farbloser amorpher
Feststoff (432 mg, 0,64 mmol, 60%) erhalten wurde.
1H-NMR (400MHz, CDCl3):
1,52 (3H, d, 0,9Hz), 1,94 (1H, dt, 7,5 und 15Hz), 2,06(3H, s), 2,23(1H,
dt, 6,0 und 15Hz), 2,42(3H, s), 3,38 (1H, d, 10Hz), 3,67 (1H, d,
10Hz), 4,17 (2H, m), 4,36(1H, d, 6,0Hz), 4,41(1H, d, 12Hz), 4,44(1H,
d, 12Hz), 4,48(1H, d, 12Hz), 4,58(1H, d, 12Hz), 5,39(1H, dd, 5,1
und 6, 0Hz), 6,04(1H, d, 5,1Hz), 7,3(12H, m), 7,73(2H, dt, 1,8 und
8,3Hz), 8,18(1H, s).
FAB-MAS(mNBA): 679(M+H)+
-
Referenzbeispiel 11
-
2'-O-Rcetyl-3',5'-di-O-benzyl-4'-p-toluolsulfonyloxyethyl-4-N-benzoylcytidin
-
Trimethylsilyliertes
Benzoylcytosin (300 mg, etwa 1,0 mmol), das gemäß dem Verfahren nach H. Vorbrggen,
K. Krolikiewicz und B. Bennua (Chem. Ber., 114, 1234–1255 (1981))
hergestellt wurde, wurde zu einer Lösung der in Referenzbeispiel
9 erhaltenen Verbindung (383 mg, 0,626 mmol) in wasserfreiem 1,2-Dichlorethan
(4 ml) gegeben. Trimethylsilyltrifluormethansulfonat (0,18 ml, 0,995
mmol) bei 0°C
wurde zu dem Gemisch gegeben, und das Gemisch wurde 1 Stunde bei
50°C gerührt. Eine
gesättigte
wässrige
Natriumhydrogencarbonatlösung
(etwa 10 ml) und Methylenchlorid (etwa 20 ml) wurde zu dem Gemisch
gegeben, und das Gemisch wurde dann gerührt. Die erhaltenen weißen Präzipitate
wurden durch Celite filtriert. Die organische Schicht des Filtrats
wurde mit einer gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
(etwa 20 ml) gewaschen und über
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert,
wobei ein farbloser amorpher Feststoff (397 mg, 83%) erhalten wurde.
1H-NMR(400MHz, CDCl3):
8,70(1H, br), 8,18(1H, d, 7,4Hz), 7,87(2H, d, 7,5Hz), 7,72(2H, d,
8,3Hz), 7,61–7,57(1H,
m), 7,51–7,48(2H,
m), 7,43–7,21(13H,
m), 6,02(1H, d, 2,9Hz), 5,40(1H, dd, 5,8, 2,9Hz), 4,57(1H, d, 11Hz),
4,39 (1H, d, 11Hz), 4,32–4,28(3H,
m), 4,19–4,16(2H,
m), 3,69(1H, d, 11Hz), 3,31(1H, d, 11Hz), 2,40(3H, s), 2,30–2,23(1H,
m), 2,06(3H, s), 1,95–1,89(1H,
m).
FAB-MAS(mNBA): 768(M+H)+
-
Referenzbeispiel 12
-
2'-O-Acetyl-3',5'-di-O-benzyl-4'-p-toluolsulfonyloxyethyl-6-N-benzoyladenosin
-
Trimethylsilyliertes
Benzoyladenosin (500 mg, etwa 2,0 mmol), das gemäß dem Verfahren nach H. Vorbrggen,
K. Krolikiewicz und B. Bennua (Chem. Ber., 114, 1234–1255 (1981))
hergestellt wurde, wurde zu einer Lösung der in Referenzbeispiel
9 erhaltenen Verbindung (600 mg, 0,98 mmol) in wasserfreiem 1,2-Dichlorethan
(15 ml) bei Raumtemperatur unter einer Stickstoffatmosphäre gegeben.
Nach dem tropfenweisen Zugeben von Trimethylsilyltrifluormethansulfonat
(0,36 ml, 2 mmol) zu dem Gemisch wurde das Gemisch 4 Stunden bei
50°C gerührt. Eine
gesättigte
wässrige
Natriumhydrogencarbonatlösung
(etwa 50 ml) und Dichlormethan (50 ml) wurden zu dem Reaktionsgemisch
gegeben, und das Gemisch wurde zwischen diesen zwei Schichten aufgetrennt.
Die organische Schicht wurde mit einer gesättigten wässrigen Natriumhydrogencarbonatlösung (etwa
50 ml) und einer gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
(etwa 50 ml) gewaschen und über
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert.
Der Rückstand
wurde durch Chromatographie auf einer Kieselgelsäule (unter Einsatz von Dichlormethan
: Methanol = 50 : 1) gereinigt, wobei ein farbloser amorpher Feststoff
(405 mg, 0,51 mmol, 52%) erhalten wurde.
1H-NMR(400MHz,
CDCl3): 2,0(1H, m), 2,06(3H, s), 2,32(1H,
dt, 6,0 und 15Hz), 2,40(3H, s), 3,36(1H, d, 10Hz), 3,58(1H, d, 10Hz),
4,22(2H, m), 4,39(1H, d, 12Hz), 4,45(1H, d, 12Hz), 4,47(1H, d, 12Hz),
4,59(1H, d, 12Hz), 4,62(1H, d, 5,6Hz), 5,94(1H, dd, 4,5 und 5,6Hz),
6,21(1H, d, 4,5Hz), 7,2–7,3(12H,
m), 7,54(2H, m), 7,62 (1H, dt, 1,2 und 6,2Hz), 7,72 (2H, d, 8,3Hz),
8,02(2H, m), 8,21(1H, s), 8,75(1H, s), 8,97(1H, brs).
FAB-MAS(mNBA):
792(M+H)+
-
Referenzbeispiel 13
-
2'-O-Acetyl-3',5'-di-O-benzyl-4'-p-Toluolsulfonyloxyethyluridin
-
Trimethylsilyliertes
Uracil (200 mg, etwa 0,8 mmol), das gemäß dem Verfahren nach H. Vorbrggen,
K. Krolikiewicz und B. Bennua (Chem. Ber., 114, 1234–1255 (1981))
hergestellt wurde, wurde zu einer Lösung der in Referenzbeispiel
9 erhaltenen Verbin dung (200 mg, 0,327 mmol) in wasserfreiem 1,2-Dichlorethan
(8 ml) bei Raumtemperatur unter einer Stickstoffatmosphäre gegeben.
Nach dem tropfenweisen Zugeben von Trimethylsilyltrifluormethansulfonat
(0,145 ml, 0,8 mmol) zu dem Gemisch wurde das Gemisch 1 Stunde bei 70°C gerührt. Eine
gesättigte
wässrige
Natriumhydrogencarbonatlösung
(etwa 10 ml) wurde zu dem Reaktionsgemisch gegeben, das Gemisch
wurde durch Celite filtriert, und Dichlormethan (etwa 10 ml) wurde
zu dem Filtrat gegeben. Die organische Schicht wurde mit einer gesättigten
wässrigen
Natriumhydrogencarbonatlösung
und einer gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
gewaschen und über
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert.
Der Rückstand
wurde durch Chromatographie auf einer Kieselgelsäule (unter Einsatz von Dichlormethan
: Methanol = 100 : 2) gereinigt, wobei ein farbloses Öl (199 mg,
0,299 mmol, 92%) erhalten wurde.
1H-NMR(400MHz,
CDCl3): 1,94(1H, dt, 7,4 und 15Hz), 2,07(3H,
s), 2,23(1H, dt, 5,9 und 15Hz), 2,43(3H, s), 3,36(1H, d, 10Hz),
3,65(1H, d, 10Hz), 4,17(2H, dd, 6 und 7Hz), 4,31(1H, d, 5,9Hz),
4,38 (1H, d, 11Hz), 4,39(1H, d, 11Hz), 4,40(1H, d, 11Hz), 4,58(1H,
d, 11HZ), 5,29(1H, dd, 2,4 und 8,2Hz), 5,33(1H, dd, 4,5 und 6Hz), 6,00(1H,
d, 4,5Hz), 7,2–7,4(12H,
m), 7,61(1H, d, 8,2Hz), 7,74(1H, d, 8,3Hz), 8,14(1H, brs).
FAB-MAS(mNBA):
665(M+H)+
-
Referenzbeispiel 14
-
2'-O-Acetyl-3',5'-di-O-benzyl-4'-p-toluolsulfonyloxyethyl-4-N-benzoyl-5-methylcytidin
-
Trimethylsilyliertes
Benzoyl-5-methylcytosin (400 mg, etwa 1,2 mmol), das gemäß dem Verfahren nach
H. Vorbrggen, K. Krolikiewicz und B. Bennua (Chem. Ber., 114, 1234–1255 (1981))
hergestellt wurde, wurde zu einer Lösung der in Referenzbei spiel
9 erhaltenen Verbindung (400 mg, 0,653 mmol) in wasserfreiem 1,2-Dichlorethan
(6 ml) gegeben. Nach der Zugabe von Trimethylsilyltrifluormethansulfonat
(0,180 μl,
1,0 mmol) zu dem Gemisch bei 0°C
wurde das Gemisch 1 Stunde bei 50°C
gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmt. Eine
gesättigte
wässrige
Natriumhydrogencarbonatlösung
(etwa 5 ml) und Methylenchlorid (etwa 10 ml) wurden zu dem Reaktionsgemisch
gegeben, und das Gemisch wurde gerührt. Das Gemisch wurde durch
Celite filtriert, um weiße
Präzipitate
zu entfernen. Die organische Schicht des Filtrats wurde mit einer
gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
gewaschen und über
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert,
wobei ein farbloser amorpher Feststoff (320 mg, 0,409 mmol, 63%)
erhalten wurde.
1H-NMR(400MHz, CDCl3): 1,68(3H, s), 1,95(1H, dt, 7,3 und 15Hz),
2,07(3H, s), 2,25(1H, dt, 6 und 15Hz), 2,43(3H, s), 3,40 (1H, d,
10Hz), 3,71(1H, d, 10Hz), 4,18(2H, m), 4,37(1H, d, 5,8Hz), 4,42(1H,
d, 12Hz), 4,46(1H, d, 12Hz), 4,51(1H, d, 12Hz), 4,61(1H, d, 12Hz),
5,42 (1H, dd, 4,9 und 5,8Hz), 6,07(1H, d, 4,9Hz), 7,2–7,6(17H,
m), 7,74(2H, d, 8,3Hz), 8,28 (2H, d, 7,0Hz).
FAB-MAS(mNBA):
782(M+H)+
-
Referenzbeispiel 15
-
2'-O-Acetyl-3',5'-di-O-benzyl-4'-p-toluolsulfonyloxyethyl-2-N-isobutyrylguanosin
-
Trimethylsilyliertes
Isobutyrylguanosin (650 mg, etwa 1,5 mmol), das gemäß dem Verfahren
nach H. Vorbrggen, K. Krolikiewicz und B. Bennua (Chem. Ber., 114,
1234–1255
(1981)) hergestellt wurde, wurde zu einer Lösung der in Referenzbeispiel
9 erhaltenen Verbindung (400 mg, 0,65 mmol) in wasserfreiem 1,2-Dichlorethan
(10 ml) bei Raumtemperatur unter einer Stickstoffatmosphäre gegeben.
Nach der Zugabe von Trimethylsilyltrifluormethansulfonat (0,2 ml,
1,2 mmol) zu dem Gemisch wurde das Gemisch 4 Stunden bei 50°C gerührt. Eine
gesättigte
wässrige
Natriumhydrogencarbonatlösung
(etwa 5 ml) wurde zu dem Reaktionsgemisch gegeben, und die organische
Schicht wurde mit einer gesättigten
wässrigen
Natriumhydrogencarbonatlösung
und einer gesättigten
wässrigen
Natriumchloridlösung
gewaschen und über
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert,
wobei ein Produkt erhalten wurde, das in der nachfolgenden Reaktion
ohne weitere Reinigung eingesetzt wurde.
-
(Testbeispiel 1)
-
(Tm-Messungstest)
-
Eine
Probenlösung
(1000 μl)
mit einer Endkonzentration von NaCl von 100 mM, Natriumphosphatpufferlösung (pH
7,2) von 10 mM, Oligonukleotid (1) von 4 μM, und komplementäre DNA (im
Folgenden als Oligonukleotid (2) bezeichnet) mit einer Sequenz,
die durch ihre komplementäre
Kette angezeigt wird (Sequenz: 5'-agcaaaaaacgc-3' (Sequenz-Nr. 1 des
Sequenzprotokolls) oder eine komplementäre RNA (im Folgenden als Oligonukleotid
(3) bezeichnet) mit einer Sequenz, die durch die Sequenz 5'-agcaaaaaacgc-3' angegeben wird (Sequenz-Nr.
1 des Sequenzprotokolls) von 4 μM
wurde in einem kochenden Wasserbad erwärmt und langsam auf Raumtemperatur
während
etwa 2 Stunden abgekühlt.
Die Probenlösung
wurde dann erwärmt
und unter Einsatz eines Spektrofotometers (UV-3100PC: ein Produkt
von Shimadzu Corp.) gemessen. Die Probe wurde in einer Zelle erwärmt (Zelldicke:
1,0 cm, zylindrischer Manteltyp) durch Zirkulieren von Wasser, das
in einem Heizbad (Haake FE2 : ein Produkt von EKO Corp.) erhitzt
wurde, und die Temperatur wurde unter Einsatz eines digitalen Thermometers
(SATO SK1250MC) überwacht.
Die Temperatur wurde von 20°C
auf 95°C erhöht, und
die Inten sität
der UV-Absorption bei der maximalen Absorptionswellenlänge in der
Nähe von
260 nm wurde für
jede Steigerung der Temperatur um 1°C gemessen. Natürlich vorkommende
DNA (im Folgenden als Oligonukleotid (4) bezeichnet) mit der Sequenz,
die durch die Sequenz 5'-gcgttttttgct-3' (Sequenz-Nr. 2 des Sequenzprotokolls)
angegeben wird, welche dieselbe Sequenz wie die des Oligonukleotids
(1) ist (Verbindung des Beispiels 29) wurde als Kontrolle eingesetzt,
und es wurde dasselbe Verfahren durchgeführt.
-
Die
Temperatur, bei der die Veränderung
pro 1°C
ein Maximum erreichte, wurde als Tm (Schmelztemperatur) angenommen,
und die Fähigkeit
zur Komplementärkettenbildung
des Oligonukleotidanalogen wurde bei dieser Temperatur beurteilt.
-
Im
Folgenden sind die Ergebnisse der Messung des Tm-Wertes des Oligonukleotids
(4) (natürlich
vorkommende DNA) und des Oligonukleotids (1) (Verbindung des Beispiels
29), bezogen auf das Oligonukleotid (2) (komplementäre DNA)
und das Oligonukleotid (3) (komplementäre RNA), angegeben.
-
-
Aus
der vorstehenden Tabelle geht hervor, dass das erfindungsgemäße Oligonukleotidanaloge
im Vergleich zu natürlich
vorkommender DNA einen deutlich höheren Tm sowie eine deutlich
höhere
Fähigkeit
zur Komplementärkettenbildung
zeigt.
-
(Testbeispiel 2)
-
(Messung der Nukleaseenzymresistenz)
-
Exonuklease
oder Endonuklease wurde in eine Pufferlösung des Oligonukleotids, das
15 Minuten bei 37°C
gehalten wurde, gemischt. Das Lösungsgemisch
wurde dann bei 37°C über einen
vorbestimmten Zeitraum gehalten. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
wurde zu einem Teil des Lösungsgemisches
gegeben, und das Gemisch wurde 2 Minuten bei 100°C erhitzt, um die Reaktion abzubrechen.
Die Menge des in dem Gemisch verbleibenden Oligonukleotids wurde
durch Umkehrphasen-HPLC bestimmt, und die auf die Zeit bezogenen Änderungen
der Menge des Oligonukleotids in Anwesenheit der Nuklease wurden
gemessen.
-
Die
erfindungsgemäßen Oligonukleotidanalogen
zeigten deutliche Nukleaseresistenz.
-
[Industrielle Anwendbarkeit]
-
Die
erfindungsgemäßen neuen
Oligonukleotidanalogen und Nukleosidanalogen sind als Gegensinn- oder
Antigen-Arzneimittel mit hervorragender Stabilität, als Nachweismittel (Sonden)
für ein
spezifisches Gen, als Primer für
das Starten der Amplifikation oder als Intermediate für deren
Produktion nützlich.