CN104520319B

CN104520319B - 用于产生免疫球蛋白样分子的方法和手段

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Publication number: CN104520319B
Application number: CN201380032190.9A
Authority: CN
Inventors: 科内利斯·阿德里安·德克吕夫; 林达·约翰娜·阿莱达·亨德里克斯; 敦·洛格滕伯格
Original assignee: Meares Co
Current assignee: Meares Co
Priority date: 2012-04-20
Filing date: 2013-04-19
Publication date: 2017-08-25
Anticipated expiration: 2033-04-19
Also published as: AU2018201326A1; PT2838918T; US20210071222A1; US9758805B2; CA2870821C; CN107383197A; EA202090591A2; LT2838918T; HRP20191446T1; KR20230091201A; KR20150035534A; HK1206041A1; EA202090591A3; SG10201607369QA; KR20230093359A; NZ630568A; EA035344B1; AU2013249986B2; KR102171431B1; EP2838917B1

Abstract

本发明提供了用于在单个宿主细胞中产生一种或更多种免疫球蛋白样分子的手段和方法。也提供了能够产生目的单特异性和/或双特异性免疫球蛋白样分子的新的CH3突变。

Description

用于产生免疫球蛋白样分子的方法和手段

技术领域

本发明涉及分子生物学、医学和生物治疗剂领域。尤其涉及用于治疗多种疾病的治疗性抗体领域。

背景技术

许多目前使用的生物治疗剂是分离的重组人或人源化单克隆抗体，其增强机体免疫系统中和或消除参与疾病过程的细胞和/或分子或者消灭侵入的病原体或感染原的能力。单克隆抗体与抗原的单个特定区域或表位结合，并且对于治疗中的使用，通常根据期望的功能性质进行选择，例如杀死肿瘤细胞，阻断受体-配体相互作用或病毒中和。目前，大约有30种经FDA批准的单克隆抗体，这些单克隆抗体通常被大量生产，并且可详细分析其生物物理和生物化学特性以确保批与批之间的一致性，这有助于控制合格率(regulatoryacceptability)。尽管具有这些有利的特性，但是单克隆抗体也有许多缺点，其中一些涉及到其单特异性的性质和疾病的复杂性。疾病过程在性质上常常是多因素的，并且涉及疾病调节因素的繁多的或协同的作用或不同受体的上调，包括其信号网络之间的串扰(crosstalk)。因此，对参与病理的多种不同因素和途径的阻断可导致改善治疗效果。由于其单特异性的性质，单克隆抗体可能仅干扰复杂疾病过程中的单个步骤，这往往不具有最佳效果。除了不能完全解决疾病过程的多个方面外，已经很清楚的是，靶向单个细胞蛋白质或可溶性蛋白质或病原体的单个表位通常不足以有效地治疗疾病，这是因为对于单克隆抗体来说与之结合并发挥所预期效果的靶表位可能不再可利用。例如，肿瘤细胞经常通过下调、突变或屏蔽存在于生长因子受体上的靶表位来逃避单克隆抗体的治疗。通过激活替选受体和/或其配体，肿瘤细胞然后可开发出不同途径来持续生长和转移。类似地，病毒和其他病原体频繁突变并失去或屏蔽靶表位，从而逃避单克隆抗体的治疗。与单个表位结合的单克隆抗体通常不招募由多克隆抗体诱发的全方位的效应机制，其中包括：调理素作用(增强抗原的吞噬作用)、位阻(包被抗体的抗原被阻止附着到宿主细胞或粘膜表面)、毒素中和、凝集或沉淀(抗体结合多个可溶性抗原引起的聚集和随后的清除)，激活补体和抗体依赖性细胞的细胞毒性(抗体能够通过自然杀伤细胞和嗜中性粒细胞杀伤靶细胞)。

用于治疗应用的多克隆抗体可以从混合人血清中获得。这种血清来源的治疗性多克隆抗体可例如用于治疗或预防由病毒(例如狂犬病病毒、巨细胞病毒和呼吸道合胞体病毒)引起的感染、中和毒素(例如破伤风毒素和肉毒杆菌毒素)或预防Rhesus D同种异体移植物免疫。以下事实阻止了血清来源的多克隆抗体制剂更广泛的应用：来源血浆仅可用于有限范围的靶标，例如感染性疾病和毒素。此外，在数量和适宜性二者方面，产品高度依赖于供体血液的可用性，导致批次之间相当大的差异。此外，筛选技术跟不上不断进化的病毒，因此，免疫球蛋白产品具有传播传染性疾病的潜在风险。最后，血液采集、筛选和免疫球蛋白纯化的漫长过程意味着血浆来源的免疫球蛋白生产昂贵。

单克隆抗体的混合物可以提高单克隆抗体的效力，同时避免了与血清来源的多克隆抗体有关的局限性。在本领域中，已经在临床前模型和临床试验中测试了两种人的或人源化单克隆抗体的组合(例如针对HER2受体的两种单克隆抗体的混合物，针对EGFR受体的两种抗体的混合物、针对狂犬病病毒的两种单克隆抗体)。在本领域中，已经显示出两种单克隆抗体的组合可具有附加效应或协同效应，并且招募与任一单独的抗体都不相关的效应机制。例如，针对EGFR或HER2的两种单克隆抗体的混合物表现为基于下述活性的组合更强效地杀伤肿瘤细胞，所述活性包括：加强受体内化、提高对受体的下游信号通路的阻断，以及增强免疫效应子介导的细胞毒作用。对于基于2种单克隆抗体的组合疗法，组成抗体可分别产生并且在蛋白质水平上组合。这种方法的一个缺点是在临床试验中单独开发2种抗体并且(部分地)用组合重复该过程的费用巨大。这导致基于抗体组合的治疗的成本不可接受。或者，可以将产生组成单克隆抗体的2种重组细胞系在发酵罐中混合，并且可将所得抗体混合物纯化作为单一制剂(WO2004/061104)。这种方法的一个缺点是其组成的控制性差，因此所得重组多克隆抗体制剂的再现性差，尤其是考虑到这样的组成可能在细胞被培养时随着时间而改变，更是如此。

在过去的十年中，出现了双特异性抗体来作为使用2种抗体的组合的一种替代选择。虽然，2种抗体的组合代表了与相同或不同靶标上的不同表位结合的2种不同的免疫球蛋白分子的混合物，而在双特异性抗体中，这通过单个免疫球蛋白分子实现。通过与相同或不同靶标上的2个表位结合，双特异性抗体可具有与同相同表位结合之2种抗体的组合相比类似的效果。此外，在单一制剂中由于IgG形式的双特异性抗体与单个分子中的2个不同的单价结合区组合以及2个IgG抗体的混合物与2个不同的二价结合分子组合，也已经观察到了这些形式的不同效果。从技术和管理角度来看，由于制造、临床前试验和临床试验涉及单一分子，这使得开发单一双特异性抗体的复杂性较低。因此，复杂性较低并且具有成本效益的药物开发过程同时提供更有效的抗体治疗，促进了基于单一双特异性抗体的疗法。

已通过多种方法产生了基于IgG形式的双特异性抗体，其由两条重链和两条轻链构成。例如，可以通过使两个抗体分泌性细胞系融合以产生新的细胞系或通过用重组DNA技术在单个细胞中表达两种抗体来产生双特异性抗体。这些方法产生了多种抗体，这是因为来自每个抗体的各自的重链可能形成单特异性二聚体(也称为同二聚体)，其包含两个相同的具有相同特异性的配对重链，以及双特异性二聚物(也称为异二聚体)，其包含两个不同的具有不同特异性的配对重链。此外，来自各个抗体的轻链和重链可随机配对形成不适当的、非功能性的组合。这个问题被称为重链和轻链的错配对，可以通过选择用具有共同轻链的抗体表达为双特异性来解决。但即使在使用共同轻链时，在单个细胞中表达两种重链和一种共同轻链也将产生3种不同的抗体种类，即2种单特异性的“亲本”抗体和所述双特异性抗体，所以需要从所得抗体混合物中纯化目的双特异性抗体。虽然已经使用技术来进一步提高双特异性抗体在亲本抗体和双特异性抗体之混合物中的百分率并降低重链和轻链错配对的百分率，但仍需要消除或最小化上面提到的一些缺点的双特异性形式。

总之，本领域提供了多种用于产生随后可用于患者中的治疗应用的单克隆抗体、双特异性抗体、单克隆抗体的混合物、或单特异性抗体和双特异性抗体的混合物的技术和方法。然而，如上面所讨论的，每一种这些现有的技术和方法都有其缺点和局限性。因此，需要用于产生靶向多种疾病调节分子(disease-modifying molecule)的混合物形式或双特异性方式的生物治疗剂的改进的和/或替代的技术。

发明内容

本发明提供了用于改进和/.或替选的技术之方法和手段，所述方法和手段用于产生靶向多种疾病调节分子的混合物形式或双特异性方式的生物治疗剂，以及由这些方法和手段得到的产品和用途。

在本领域中描述了多种方法来促进某种目的双特异性抗体的形成，从而减少所得混合物中不希望的抗体的含量。

对于抗体，众所周知的是CH3-CH3相互作用是Fc二聚化的主要驱动力(EllersonJR等，J.Immunol 1976(第116卷)第510-517页；Deisenhofer J.biochemistry 1981(第20卷)第2361-2370页)。另外众所周知的是，当两个CH3结构域彼此相互作用时，它们在包含“接触”残基(也称为接触氨基酸、界面残基或界面氨基酸)的蛋白质-蛋白质界面接触。第一CH3结构域的接触氨基酸与第二CH3结构域的一个或更多个接触氨基酸相互作用。在抗体三维结构中，接触氨基酸彼此通常在5.5埃(优选在4.5埃)内。来自一个CH3结构域的接触残基与来自不同的CH3结构域的接触残基之间的相互作用可能通过例如范德华力、氢键、水介导的氢键、盐桥或其他静电力、芳香族侧链之间的吸引相互作用、二硫键，或本领域技术人员已知的其他力。之前已经表明，在人IgG1的CH3结构域界面处大约三分之一的接触氨基酸侧链可能是结构域折叠和缔合的主要贡献者。可以进一步设想，其他(相邻)的氨基酸残基可能影响蛋白质-蛋白质界面中的相互作用。

在本领域中已应用了干扰抗体重链二聚化的方法。在CH3结构域中进行特定改造以比同二聚化更有利于异二聚化。CH3-CH3界面的这样改造的实例包括引入互补的突起突变和空腔突变，也被称为“结进孔(knob-into-hole)”方法，例如WO1998/050431、Ridgeway等(1996)和Merchant等(1998)中所描述的。

通常，该方法包括在第一多肽的界面引入突起以及在第二多肽的界面引入对应的空腔，这样所述突起可置于所述空腔中，从而促进异多聚体的形成而阻碍同多聚体的形成。“突起”或“结”通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换第一多肽界面的小的氨基酸侧链而构建。与突起相同或相似大小的补偿性的(compensatory)“空腔”或“孔”通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链而在第二多肽界面产生。突起和空腔可以通过合成手段(例如改变该编码多肽的核酸)或通过肽合成而制得。

单独使用结进孔技术，目的双特异性抗体在2种亲本抗体和双特异性抗体混合物中的比例最多为87％。通过在CH3-CH3界面的两个CH3结构域之间引入另外的二硫键，Merchant等人成功地将双特异性抗体的比例提高至混合物的95％。尽管如此，为了将这样的双特异性抗体用作药物，还必须将双特异性抗体从同二聚体中被纯化(分离)出来，并配制到可药用稀释剂或赋形剂中。由于同二聚体和异二聚体的物理化学性质的相似性，从这种混合物中纯化异二聚体是一个重大挑战。本发明的一个目的是提供用于在单个细胞克隆中产生双特异性抗体并且双特异性抗体在混合物中的比例的方法。因此，根据本发明，可使用结进孔技术作为一种手段(单独或与其他手段一起)来实现在混合物中所述进一步提高的双特异性比例。

CH3-CH3界面的这种改造的另一个实例由异二聚体Fc技术提供，通过设计链交换改造结构域(strand-exchange engineered domain，SEED)CH3异二聚体，其支持双特异性并且不对称的融合蛋白的设计。这些SEED CH3异二聚体是由人IgA和IgG的CH3序列的交替片段组成的人IgG和IgA CH3结构域的衍生物，其导致了互补的人SEED CH3异二聚体的配对，即所谓的SEED-体(Davis JH.等，Protein Engineering，Design&Selection 2010(第23卷)第195-202页；WO2007/110205)。

用于产生给定的目的双特异性抗体的另一种方法是基于CH3-CH3界面内天然带电的接触残基的静电性改造，例如在EP01870459或US2010/0015133、WO2007/147901、WO2010/129304，Gunasekaran等(2010)和WO2009/089004中所描述的。这些出版物描述了在重链CH3结构域中的突变，其中天然存在的带电氨基酸的接触残基被相反电荷的氨基酸残基替换(即电荷逆转策略)。这就造成跨Fc二聚体界面改变的电荷极性，这样静电匹配的Fc链的共表达支持有利的吸引性相互作用，从而促进所需要的Fc异二聚体的形成，而不利的排斥性电荷相互作用抑制不期望的Fc同二聚体的形成。

根据描述，CH3-CH3界面内四个独特的带电残基对参与了结构域-结构域的相互作用。这些是D356/K439’、E357/K370’、K392/D399’和D399/K409’(根据Kabat(1991)编号，其中第一链中的残基与第二链的残基通过“/”分开，并且其中的撇号(’)表示第二链中的残基编号)。由于CH3-CH3界面显示了二次对称性，每个独特的电荷对在完整的IgG中表示两次(即，在界面中也存在K439/D356’，K370/E357’，D399/K392’和K409/D399’电荷相互作用)。利用这种二次对称性，已证实单个电荷逆转(例如第一链中的K409D，或者第二链中的D399'K)导致同二聚体因相同电荷的排斥而形成减少。不同的电荷逆转的组合进一步增强了这种排斥效果。已证实包含不同的互补的电荷逆转的不同CH3结构域的表达，可以驱动异二聚化，导致双特异性种类在混合物中的比例增加。

使用上述方法，可在单个细胞中产生比例在约76％至约96％的双特异性抗体。本发明的一个目的是提供一种用于在单个细胞中产生双特异性抗体并且期望的双特异性抗体的百分率进一步提高的方法。根据本发明，可使用静电改造技术作为手段之一，单独地或与其他手段(例如结进孔方法)一起，以实现所述进一步提高所期望的(双特异性)抗体的百分率。

在一个方面，本发明提供了一种用于从单个宿主细胞中产生至少两种不同的免疫球蛋白样(Ig-like)分子的方法，其中所述的两种免疫球蛋白样分子各自包含能够形成界面的两个CH3结构域，所述方法包括在所述细胞中提供：

a)编码第一含CH3结构域之多肽链(CH3domain-comprising polypeptide chain)的第一核酸分子，

b)编码第二含CH3结构域之多肽链的第二核酸分子，

c)编码第三含CH3结构域之多肽链的第三核酸分子，以及

d)编码第四含CH3结构域之多肽链的第四核酸分子，

其中所述核酸分子中的至少两种具有用于使所述第一含CH3结构域之多肽链与所述第二含CH3结构域之多肽以及使所述第三含CH3结构域之多肽与所述第四含CH3结构域之多肽优先配对的手段，所述方法还包括培养所述宿主细胞以及使所述至少四种核酸分子能够表达并且从培养物中收获所述至少两种不同的免疫球蛋白样分子的步骤。

通常希望产生超过一种(双特异性)抗体以例如更有效地干扰参与疾病过程的多种生物途径或者干扰病原体的入侵、复制和/或传播。

超过一种双特异性抗体的混合物对于某些疾病的治疗也特别有用。例如，在用抗体或小分子药物的治疗过程中，肿瘤细胞使用许多不同的策略发展出抗性。抗性可能涉及多种细胞表面受体以及可溶性分子，并且其被认为有利于开发同时解决多种此类疾病相关分子和逃避相关分子的基于抗体的癌症治疗。在包含超过2种此类疾病相关靶分子或表位和逃避相关靶分子或表位的情况下，双特异性抗体的混合物提供一种创新的和有吸引力的治疗形式。优选地，由单个细胞产生这种双特异性抗体的混合物以有利于药物开发过程，即，从管理角度看复杂性较低，从药物制造和临床开发的角度看具有成本效益并且可行。在基于单个细胞的方法中，希望使用能够进行控制并且有效产生双特异性抗体的方法，从而减少或甚至完全消除对从不期望单特异性的IgG分子中分离期望双特异性IgG分子的混合物的需求。在现有技术中，已经由单个细胞产生了单特异性抗体和双特异性抗体的混合物(WO2004/009618)，但这些混合物代表多种不同的双特异性和单特异性抗体种类的复杂混合(concoction)。本发明的另一个目是提供用于在单个细胞中产生限定的双特异性抗体混合物的手段和方法。优选地，不论单体副产物的量如何，提供的方法使得(双特异性)抗体的混合物占二聚体IgG分子的比例为至少95％、至少97％或甚至超过99％，参见本文下文。通常，在产生多个完整的IgG分子的细胞中，可能存在能够通过本领域已知的尺寸排阻色谱法简单地除去的半分子(单体副产物)。

在一个实施方案中，本发明提供用于在单个细胞中产生至少两种不同的免疫球蛋白样分子的限定混合物而不是单一目的(双特异性)抗体的方法，其中其他的不期望二聚抗体种类的形成减少或者甚至不存在。所得混合物是良好限定的，并且其组成由CH3结构域突变体的设计来控制。此外，表达水平和/或用于表达的不同转染比率的调节影响混合物的组成。在根据本发明的方法中，第一核酸分子编码优先与由第二核酸分子编码的CH3结构域配对的CH3结构域，而第三核酸分子编码优先与由第四核酸分子编码的CH3结构域配对的CH3结构域。本发明还提供了可由本发明的方法获得的至少两种不同的免疫球蛋白样分子的混合物。

如本文所用的术语“所述第一含CH3结构域之多肽与所述第二含CH3结构域之多肽优先配对”是指基本上所有包含第一含CH3结构域之多肽和/或第二含CH3结构域之多肽的所得二聚体都是由与一个第二含CH3结构域之多肽配对的一个第一含CH3结构域之多肽组成的二聚体。同样，术语“所述第三含CH3结构域之多肽和所述第四含CH3结构域之多肽优先配对”是指基本上所有包含第三含CH3结构域之多肽和/或第四含CH3结构域之多肽的所得二聚体都是由与一个第四含CH3结构域之多肽配对的一个第三含CH3结构域之多肽组成的二聚体。结果是，当向单个细胞中引入编码四种不同的(A、B、C、D)含CH3结构域之多肽的核酸分子时，产生的主要是两种特定的免疫球蛋白样分子的混合物，而不是10种不同免疫球蛋白样的二聚体(AA、AB、AC、AD、BB、BC、BD、CC、CD和DD)的混合物。

如下文更详细地解释的，在一个优选的实施方案中，所述第一含CH3结构域之多肽链包含氨基酸替换T366K，并且所述第二含CH3结构域之多肽链包含氨基酸替换L351D。这些氨基酸改变是用于使所述第一含CH3结构域之多肽链与所述第二含CH3结构域之多肽链优先配对的优选手段。所述第一含CH3结构域之多肽链优选还包含氨基酸替换L351K。此外，所述第二含CH3结构域之多肽链优选还包含选自Y349E、Y349D和L368E的氨基酸替换，最优选L368E。在另一个优选的实施方案中，所述第三含CH3结构域之多肽链包含氨基酸替换E356K和D399K，并且所述第四含CH3结构域之多肽链包含氨基酸替换K392D和K409D。

在根据本发明的方法中，每一种含CH3结构域之多肽链优选还包含识别靶表位的可变区。作为含CH3结构域之多肽链的一部分的该可变区优选地具有共同的轻链。在这种情况下，只有可变区的VH不同，而所有可变区中的VL基本相同。因此，在一个优选方面，提供了一种根据本发明的方法，其还包括为所述宿主细胞提供编码共同轻链的核酸分子。在一个特别优选的实施方案中，所述4个含CH3结构域之多肽链的4个可变区各自识别不同的靶表位。举例来说，如果所述第一核酸分子编码的重链还包含抗原A特异性的可变结构域，所述第二核酸分子编码的重链还包含抗原B特异性的可变结构域，所述第三核酸分子编码的重链还包含抗原C特异性的可变结构域，所述第四核酸分子编码的重链还包含抗原D特异性的可变结构域，那么然后，将产生含有AB特异性的双特异性免疫球蛋白样分子和CD特异性的双特异性免疫球蛋白样分子的混合物。由于使所述第一含CH3结构域之多肽与第二含CH3结构域之多肽优先配对以及使所述第三含CH3结构域之多肽与第四含CH3结构域之多肽优先配对的手段，单特异性抗体(具有AA、BB、CC或DD特异性)或具有AC、AD、BC或BD特异性的双特异性抗体的形成被降低或甚至不存在。当然，可使用另外的核酸分子，例如编码第五含CH3结构域之多肽和第六含CH3结构域之多肽的核酸分子以产生包含超过两种不同免疫球蛋白样分子的限定混合物。

值得注意的是，在根据本发明的方法中使用的核酸的比率未必是1∶1∶1∶1，并且所表达得到的免疫球蛋白样分子的比率未必是1∶1。可使用本领域中已知的手段来产生具有最佳比率的抗体混合物。例如，通过使用不同的遗传元件(例如启动子、增强子和抑制子)或通过控制编码抗体的DNA构建体的基因组整合位点的拷贝数，可以调节核酸分子的表达水平并由此调节所产生得到的免疫球蛋白样分子的比率。

用于优先配对的所述手段优选地可包括经改造的互补结进孔突变、二硫键、电荷突变(包括电荷逆转突变)，或它们的组合。本领域技术人员将理解，可以在某些类型的突变中选择所述用于优先配对的手段，即，所有至少4种编码含CH3结构域之多肽链的核酸分子全部可以包含例如电荷突变作为用于优先配对的手段。另外，在某些情况下，未经改造的野生型CH3也可用于使两种野生型的含CH3结构域之多肽链优先配对。在一个特别优选的实施方案中，所述用于优先配对的手段包括选自表B中的至少一种CH3突变，如在本申请的其他部分中所解释的。因此，一个优选的实施方案提供了根据本发明的一种方法，其中所有4种核酸分子均具有用于使所述第一含CH3结构域之多肽与所述第二含CH3结构域之多肽以及使所述第三含CH3结构域之多肽与所述第四含CH3结构域之多肽优先配对的手段，其中用于使所述第一含CH3结构域之多肽与所述第二含CH3结构域之多肽优先配对的所述手段不同于用于使所述第三含CH3结构域之多肽与所述第四含CH3结构域之多肽优先配对的那些手段。

本发明的一个方面提供了一种根据本发明的方法，其中用于使所述第一含CH3结构域之多肽与所述第二含CH3结构域之多肽优先配对的所述手段不同于用于使所述第三含CH3结构域之多肽与所述第四含CH3结构域之多肽优先配对的所述手段。“不同于”意指，设计用于使所述第一含CH3结构域之多肽与所述第二含CH3结构域之多肽优先配对的所述手段，以使得有利于第一链和第二链的优先配对。该设计使得基本上不发生第一含CH3结构域之多肽链与第三和/或第四含CH3结构域之多肽链之间的相互作用。换句话说，所述第一含CH3结构域之多肽与所述第三多肽或第四多肽之间的二聚化被降低到基本为零，等等。第三含CH3结构域之多肽和第四含CH3结构域之多肽可以是野生型的，或者可以包含用于优先配对的手段，其中所述手段不同于用于使第一CH3结构域与第二CH3结构域优先配对的手段。目前的研究集中在使用例如结进孔技术或使存在于CH3结构域中的带电接触氨基酸突变(逆转)来产生单种双特异性抗体。然而，在本发明之前，还没有实现产生至少两种(双特异性)免疫球蛋白样分子的限定混合物而没有显著共产生其他二聚物副产物。

本发明提供了用于高效并且可控地产生良好限定的免疫球蛋白样分子的混合物并且在混合物中具有高的双特异性比例的方法。在需要两种双特异性的系统中，甚至获得了至少95％、至少97％或更高的(两种)双特异性的比例。这意味着，仅获得了至多5％、至多3％或更少的单特异性二价副产物。值得注意的是，单体副产物(即半分子)的量不那么重要，因为这些半分子可利用其大小差异容易地从二聚体中分离。

在另一个优选的实施方案中，第一和第二含CH3结构域之多肽链的可变区识别不同的靶表位，而第三和第四含CH3结构域之多肽链的可变区识别相同的靶表位。这将导致主要产生一种双特异性免疫球蛋白样分子和一种单特异性免疫球蛋白样分子。例如，如果第一和第二含CH3结构域之多肽链的可变区识别不同的靶表位，并且如果第三和第四含CH3结构域之多肽链的可变区二者识别不同于第一和第二CH3结构域所识别靶表位的相同靶表位，则将形成具有AB或CC特异性的免疫球蛋白样分子的混合物。因此，还提供了一种根据本发明的方法，其中，第三和第四含CH3结构域之多肽链的可变区识别的靶表位相同，但是不同于第一或第二含CH3结构域之多肽链的可变区识别的靶表位。

或者，当第一和第二含CH3结构域之多肽链的可变区识别不同的靶表位，并且当第三和第四含CH3结构域之多肽链的可变区二者与第一或第二含CH3结构域之多肽链识别相同的表位时，将形成具有AB和AA，或AB和BB特异性的免疫球蛋白样分子的混合物。因此，随之提供了一种根据本发明的方法，其中第三和第四含CH3结构域之多肽链的可变区识别的靶表位与第一或第二含CH3结构域之多肽链的可变区识别的靶表位相同。本发明的另一个目的是提供一种在单个细胞培养物中产生双特异性抗体和单特异性抗体的限定混合物的手段和方法。这样良好限定的混合物的一个非限制性实例是具有AB特异性的双特异性抗体和具有AA特异性的单特异性抗体的混合物。另一个实例是具有AB特异性的双特异性抗体和具有BB特异性的单特异性抗体的混合物。另一个实例是具有AB特异性的双特异性抗体和具有CC特异性的单特异性抗体的混合物。另外，提供优选的手段和方法，其产生目的抗体为至少90％、更优选至少95％且最优选至少97％或甚至99％以上的期望抗体的混合物。

在另一个实施方案中，提供了一种根据本发明方法，其中，第一和第二含CH3结构域之多肽链的可变区识别相同的靶表位，而第三和第四含CH3结构域之多肽链可变区识别第二靶表位，所述第二靶表位不同于所述第一和第二可变区识别的靶表位。这将导致主要产生具有AA特异性或BB特异性的单特异性免疫球蛋白样分子。双特异性免疫球蛋白样分子的形成被减少或甚至避免。在多个实施方案中，优选在单个细胞中产生单特异性抗体的混合物，而不是双特异性抗体的混合物。例如，当需要两个相同的靶分子交联时，或者当两个靶标彼此位置过远而无法将其通过单个双特异性抗体结合时。在单个细胞中产生单特异性抗体的混合物也可能是有利的，因为所述混合物可以被看作是单一治疗产物。在本领域中，多种单特异性抗体的治疗效果及安全性已被证实并且已经获得了市场授权。在单个细胞中产生单特异性抗体的混合物将因此有利于测试数种这样的混合物的效果和安全性，并将减少注册审批和制造的精力和成本。然而，目前没有可用于在单个细胞中产生单特异性抗体的特定混合物且其中双特异性副产物的形成降到低于5％的方法。本发明的另一个目的是提供在单个细胞中产生这种良好限定的同二聚体抗体混合物且其中双特异性抗体的形成被降到低于5％的手段和方法。

因此，一种根据本发明的方法适于产生任何期望的双特异性和/或单特异性免疫球蛋白样分子的混合物。此外，可以使用另外的核酸分子，例如编码第五和第六(以及第七和第八等)含CH3结构域之多肽的核酸分子，以产生包含超过两种不同免疫球蛋白样分子的限定混合物。

优选地，在一种根据本发明的方法中，使用至少两个这样的CH3结构域，其包含由本发明提供的突变的至少一种组合。通过这些突变，在两个CH3结构域之间形成了新的特异性相互作用。根据本发明的这些突变将在下面更详细地讨论。

本文使用的术语“免疫球蛋白样分子”指的是具有至少一个免疫球蛋白(Ig)结构域的蛋白质分子。所述免疫球蛋白样分子包含具有至少免疫球蛋白CH3结构域的功能的序列，优选包含IgG1的CH3结构域的序列。具有至少一个CH3结构域的蛋白分子可以进一步配备有特定的结合部分。因此，可将包含用于优先配对之手段的本发明CH3结构域用于使两种含CH3结构域之蛋白分子优先配对，以设计需要的异二聚体的结合分子或结合分子的混合物。可将与含CH3结构域之蛋白质分子结合的部分设计为是任何结合件(binding agent)，包括但不限于，单链Fvs、单链或串联双体(Tandem diabodies)VHH、 Fab、锚蛋白重复蛋白或DART、TCR样抗体、 MicroProteins、或在一个优选实施方案中，结合部分是抗体可变区(即VH/VL组合)。作为含CH3结构域之多肽链的一部分的可变区优选具有共同轻链。在这种情况下，仅可变区的VH不同，而所有可变区的VL基本相同。

替选地或另外地，其他分子可以被设计到本发明的CH3结构域，所述其他分子包括细胞因子、激素、可溶性配体、受体和/或肽。

在一个更优选的实施方案中，所述免疫球蛋白样分子包含全长Fc骨架。在一个最优选的实施方案中，免疫球蛋白样分子是抗体。这些抗体的可变区优选具有共同轻链，但是其VH区可以不同。本文所用的术语“抗体”是指属于免疫球蛋白蛋白质类的蛋白质分子，其含有与抗原上的表位结合的一个或更多个结构域，其中这样的结构域来自于抗体的可变区或与抗体的可变区具有序列同源性。抗体是本领域已知的，并且包括多种同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE和IgM。根据本发明的抗体可以是这些同种型的任一种，或其功能衍生物和/或其片段。在一个优选实施方案中，产生的免疫球蛋白样分子是IgG同种型的抗体，因为IgG抗体相比于其他同种型的抗体例如具有较长的半衰期。

利用根据本发明的方法产生的抗体可以具有任何起源的序列，包括小鼠和人的序列。抗体可以由仅来自一种来源的序列组成，例如全人抗体，或者它们可以具有超过一种来源的序列，例如产生嵌合抗体或人源化抗体。用于治疗用途的抗体优选尽可能地是待治疗对象的天然抗体(例如人抗体用于人对象)。抗体的结合可以表示在特异性和亲和力方面。特异性决定了哪一种抗原或其表位与结合结构域结合。亲和力是与特定抗原或表位的结合强度的度量。特异性结合被定义为具有至少1×10^-5M、更优选1×10^-7M、更优选高于1×10^-9M的亲和力(K_D)的结合。通常，对于治疗性应用的单克隆抗体具有高达1×10^-10M或甚至更高的亲和力。本文所用的术语“抗原”是指当其被引入体内时触发免疫系统的抗体产生的物质或分子。抗原等可来源于病原生物体、肿瘤细胞或其他异常细胞，可衍生自半抗原，或甚至是其自身结构。在分子水平上，抗原的特征是其能够与抗体的抗原结合位点结合。抗原的混合物也可以被看作是“抗原”，即本领域技术人员应当理解的是，有时肿瘤细胞的裂解物或病毒颗粒可以被表示为“抗原”，然而这样的肿瘤细胞裂解物或病毒颗粒制剂中存在许多抗原决定簇。抗原包含至少一个，但往往更多个表位。本文所用的术语“表位”是指被免疫系统、特别是抗体、B细胞，或T细胞识别的抗原部分。虽然表位通常被认为来源于非自身蛋白质，但是来源于宿主的可被识别序列也可被认为归类为表位。

术语“CH3结构域”在本领域中是公知的。IgG的结构有四条链，两条轻链和两条重链；每条轻链具有两个结构域，可变轻链和恒定轻链(VL和CL)，且每条重链具有四个结构域，可变重链(VH)和三个恒定重链结构域(CH1、CH2、CH3)。重链的CH2和CH3结构域区域被称为Fc(可结晶片段)部分、Fc片段、Fc骨架或简单地Fc。IgG分子是具有两条重链和两条轻链的异四聚体，其中所述重链是通过铰链区的二硫键(-S-S-)结合在一起的。重链通过在CH3-CH3结构域界面的相互作用以及通过在铰链区的相互作用二聚化。铰链二硫键的数目在免疫球蛋白亚类中各不相同(Papadea和Check 1989年)。免疫球蛋白分子的Fc片段是重链两个C末端恒定区(即CH2和CH3结构域)的二聚体。其生理功能是与补体系统以及与多种细胞表面上的特异性受体相互作用等。已知两条单独重链的CH3结构域之间的相互作用在驱动重链二聚化中发挥重要作用。因此，CH3结构域指导抗体重链的缔合，并且已知的是CH3结构域之间的界面包含有来自每条链的超过20个接触残基，所述接触残基在CH3-CH3相互作用中发挥作用(Deisenhofer J.，Biochemistry 1981(第20卷)第2361-2370页；Miller S.，J.Mol.Biol.1990(第216卷)第965-973页；Padlan，Advances in Protein Chemistry 1996(第49卷)第57-133页)。本发明的CH3变体因此可以用于与其他抗体结构域缔合，以产生双特异性的或单特异性的全长抗体。由VH/VL的组合所限定抗体的特异性通常不影响由CH3结构域驱动的重链的二聚化行为。

本文中使用的术语“接触残基”、“接触氨基酸”、“界面残基”和“界面氨基酸”通常是指存在于CH3结构域中的任何可参与域间接触的氨基酸残基，如可以通过本领域已知技术计算，包括计算存在和不存在第二链的情况下CH3结构域残基的溶剂可及表面积(ASA)(Lee和Richards J.Mol.Biol.1971(55)379)，其中这两种计算之间显示出ASA差异的残基被鉴定为接触残基。根据EU编号系统，已鉴定的接触残基包括在位置347、349、350、351、352、353、354、355、356、357、360、364、366、368、370、390、392、394、395、397、399、400、405、407、409、439处的残基(表A)。

表A：CH3结构域界面残基列表

A链中的界面残基	B链中的接触残基
		Q347	K360
Y349	S354，D356，E357，K360
		T350	S354，R355
L351	L351，P352，P353，S354，T366
		S354	Y349，T350，L351
R355	T350
		D356	Y349，K439
E357	Y349，K370
		K360	Q347，Y349
S364	L368，K370
		T366	L351，Y407
L368	S364，K409
		K370	E357，S364
N390	S400
		K392	L398，D399，S400，F405
T394	T394，V397，F405，Y407
		P395	V397
V397	T394，P395
		D399	K392，K409
S400	N390，K392
		F405	K392，T394，K409
Y407	T366，T394，Y407，K409
		K409	L368，D399，F405，Y407
K439	D356

在CH3-CH3界面内的接触残基可以是带电荷的氨基酸，或中性的氨基酸残基。本文所用的术语“带电荷的氨基酸残基”或“带电荷的残基”是指具有带电侧链的氨基酸残基。这些可以是带正电荷的侧链，例如存在于精氨酸(Arg，R)、组氨酸(His，H)和赖氨酸(Lys，K)中，或者可以是带负电荷的侧链，例如存在于天冬氨酸(Asp，D)和谷氨酸(Glu，E)中。如本文所用的术语“中性氨基酸残基”或中性残基是指所有其他不携带带电侧链的氨基酸。这些中性残基包括丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酰胺(GLu，Q)、半胱氨酸(Cys，C)、甘氨酸(Gly，G)、脯氨酸(Pro，P)、丙氨酸(Ala，A)、缬氨酸(Val，V)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、酪氨酸(Tyr，Y)和色氨酸(Trp，T)。

如本文使用的术语“CH3-CH3结构域界面”或“CH3界面”、“CH3-CH3配对”、“结构域界面”或简化的“界面”是指分离的含CH3结构域之多肽的两个CH3结构域之间的缔合，其为氨基酸残基相互作用的结果，即，第一CH3结构域的氨基酸与第二CH3结构域的氨基酸之间的至少一种相互作用。这种相互作用例如通过范德华力、氢键、水介导的氢键、盐桥或其他静电力、芳香族侧链之间的吸引相互作用、二硫键的形成，或本领域技术人员已知的其他力。

如本文所用的，用于使所述第一含CH3结构域之多肽与所述第二含CH3结构域之多肽以及所述第三含CH3结构域之多肽与所述第四含CH3结构域之多肽优先配对的所述手段可以是本领域中已知的任何手段。在一个实施方案中，至少一种核酸分子编码在接触残基位处置含有大氨基酸残基(即“结”或“突起”)(如R、F、Y、W，I或L)的CH3结构域，而至少一种另外的核酸分子编码在互补接触残基位置处含有小氨基酸残基(即“孔”或“空腔”)(如G、A、S、T或V)的CH3结构域。由于所述接触氨基酸的空间构象，所得CH3结构域将彼此优先配对。本文之前已经详细描述了所述结进孔技术。在本发明的另一个实施方案中，至少一种核酸分子编码在天然带电的接触残基位置(即，天然存在的K、H、R、D或E)处包含现在携带有与野生型相反电荷之氨基酸的CH3结构域，而且至少一种另外的核酸分子编码在天然带电的互补接触残基处包含现在携带与野生型相反电荷之氨基酸的CH3结构域。由于所述接触氨基酸的相反的电荷，所得经改造的CH3结构域将彼此优先配对，而相同CH3结构域的配对会由于静电斥力而减少。在一个实施方案中，使用如在EP01870459、WO2009/089004，Gunasekaran等(2010)中描述的CH3突变。在一个实施方案中，用于使所述第一含CH3结构域之多肽与第二含CH3结构域之多肽优先配对的手段是“结”和“孔”氨基酸残基，而用于使所述第三含CH3结构域之多肽与所述第四含CH3结构域之多肽优先配对的手段是经电荷改造的氨基酸。优选地，用于使所述第一含CH3结构域之多肽与第二含CH3结构域之多肽优先配对以及所述第三含CH3结构域之多肽与所述第四含CH3结构域之多肽优先配对的两种所述手段都是经电荷改造的氨基酸。在一个实施方案中，与被改造用于使所述第三含CH3结构域之多肽与所述第四含CH3结构域之多肽优先配对的氨基酸残基相比，对不同的氨基酸残基进行改造以使所述第一含CH3结构域之多肽与所述第二含CH3结构域之多肽优先配对。在一个特别优选的实施方案中，至少第一核酸分子和第二核酸分子编码具有如本发明所提供的新突变的CH3结构域。如在下文中更详细地描述的，本发明提供了新的CH3的突变，其能够产生某些目的双特异性免疫球蛋白样分子，而无显著量的不期望(二聚体)的副产物。本发明还提供了新的CH3的突变，其能够产生某些目的单特异性免疫球蛋白样分子，而无显著量的不期望(二聚体)的副产物。因此，优选使用根据本发明的这些CH3突变中的至少一种。

如本文所用的术语“多肽”、“多肽分子”或“多肽链”指的是通过肽键共价连接在一起的氨基酸的链。蛋白质通常由一个或更多个多肽分子构成。每个多肽在被称为氨基末端或N末端的一端具有游离氨基。具有其游离羧基的另一端被称为羧基末端或C末端。根据本发明的多肽可以已经经过了翻译后修饰过程，并可以例如被糖基化。本发明的含CH3结构域之多肽链因而指的是至少涵盖Ig CH3结构域的多肽链，并且其可以已经经过翻译后修饰过程。

如本文所用的术语“核酸分子”定义为包括核苷酸链、更优选DNA和/或RNA链的分子。在一个实施方案中，使用双链RNA。在另一些实施方案中，本发明的核酸分子包含其他类型的核酸结构，例如，DNA/RNA螺旋、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)和/或核酶。因此，术语“核酸分子”也涵盖包含有与天然核苷酸呈现出相同功能的非天然核苷酸、经修饰的核苷酸和/或非核苷酸结构单元(non-nucleotide building block)的链。

本发明还提供一种用于制备用来产生至少两种不同免疫球蛋白样分子的宿主细胞的方法，该方法包括以下步骤：向所述宿主细胞中引入编码至少第一、第二、第三和第四含CH3结构域之多肽链的核酸序列，其中所述核酸序列中的至少两种具有用于使所述第一含CH3结构域之多肽与所述第二含CH3结构域之多肽以及使所述第三含CH3结构域之多肽与所述第四含CH3结构域之多肽优先配对的手段，其中将所述核酸序列相继地或同时地引入。

本发明的另一个方面是提供用于制备用来产生异二聚体免疫球蛋白样分子的方法，该方法包括以下步骤：向所述宿主细胞中引入编码至少第一和第二含CH3结构域之多肽链的核酸序列，其中所述第一含CH3结构域之多肽链包含至少一个中性氨基酸残基被带正电荷的氨基酸残基的替换，并且其中所述第二含CH3结构域之多肽链包含至少一个中性氨基酸残基被带负电荷的氨基酸残基的替换，其中将所述核酸序列相继地或同时地引入。所述用于制备所述宿主细胞的方法优选还包括向所述宿主细胞引入编码共同轻链的核酸序列的步骤。

本文还提供了一种重组宿主细胞，其包含编码至少第一、第二、第三和第四含CH3结构域之多肽链的核酸序列，其中所述核酸分子中的至少两种具有用于使所述第一含CH3结构域之多肽与所述第二含CH3结构域之多肽优先配对以及使所述第三含CH3结构域之多肽与所述第四含CH3结构域之多肽优先配对的手段。本发明还提供了一种重组宿主细胞，其包含编码至少第一和第二含CH3结构域之多肽链的核酸序列，其中所述第一含CH3结构域之多肽链包含至少一个中性氨基酸残基被带正电荷的氨基酸残基的替换，并且其中所述第二含CH3结构域之多肽链包含至少一个中性氨基酸残基被带负电荷的氨基酸残基的替换。

根据本发明的重组宿主细胞，优选地还包含编码共同轻链的核酸序列。

根据本发明的“宿主细胞”可以是能够表达重组DNA分子的任何宿主细胞，包括：细菌，例如埃希氏杆菌(Escherichia)(如大肠杆菌)、肠杆菌(Enterobacter)、沙门氏菌(Salmonalla)、芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、链霉菌(Streptomyces)；酵母，例如酿酒酵母(S.cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、假丝酵母(Candida)或耶氏酵母(Yarrowia)；丝状真菌(例如链孢霉(Neurospora)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)和黑曲霉(Aspergillus niger)；昆虫细胞，例如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)SF-9或SF-21细胞；以及优选的哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、BHK细胞、包括SP2/0细胞和NS-0骨髓瘤细胞小鼠细胞；灵长类动物细胞，如COS和Vero细胞、MDCK细胞、BRL 3A细胞、杂交瘤、肿瘤细胞、永生化原代细胞；人细胞，例如W138、HepG2、HeLa、HEK293、HT1080或胚胎视网膜细胞如PER.C6等。通常，所选择的表达系统将包括哺乳动物细胞表达载体和宿主，使得抗体可以适当地被糖基化。人细胞系(优选PER.C6)可有利地被用于获得具有完全的人糖基化模式的抗体。用于细胞生长或繁殖的条件(参见例如Tissue Culture，Academic Press，Kruse和Paterson，编辑(1973))和用于表达重组产物的条件可有一些区别，并且根据本领域技术人员通常已知的的方法，通常进行过程的优化以提高产品的比例和/或所述细胞相对于彼此的生长。一般而言，最大化哺乳动物细胞培养物生产率的原理、方案和实用技术可以在Mammalian Cell Biotechnology：a Practical Approach(M.Butler编辑，IRL Press，1991)中找到。在重组宿主细胞中表达抗体已经在本领域中被广泛描述(参见例如EP0120694、EP0314161、EP0481790、EP0523949；美国专利4,816,567、WO00/63403)。编码轻链和重链的核酸分子可以作为染色体外拷贝存在和/或稳定地整合到宿主细胞的染色体中，后者是优选的。

本发明的另一个方面提供了根据本发明的重组宿主细胞的培养物，或可由根据本发明的方法获得或已获得的重组宿主细胞的培养物，所述培养物产生至少两种不同免疫球蛋白样分子或是产生异二聚体免疫球蛋白样分子。

为了获得编码含CH3结构域之多肽的核酸序列的表达，本领域技术人员众所周知，可以将能够驱动这种表达的序列功能性地连接到编码含CH3结构域之多肽的核酸序列上。功能性连接意图描述的是：使编码含CH3结构域之多肽或其前体的核酸序列连接到能够驱动表达的序列上，使得这些序列可以驱动含CH3结构域之多肽或其前体的表达。有用的表达载体可在本领域中得到，如Invitrogen的pcDNA载体系列。其中编码目的多肽的序列相对于控制所编码多肽的转录和翻译的序列正确地插入，所得表达盒可用于产生目的多肽，被称为表达。驱动表达的序列可以包括启动子、增强子等等，以及它们的组合。这些应该能够在宿主细胞中起作用，从而驱动与它们功能性连接的核酸序列的表达。启动子可以是组成型的或调节型的，并可以从多种来源获得，包括病毒、原核或真核来源，或人工设计的。目的核酸的表达可以来自于天然启动子或其衍生物，或来自于完全异源的启动子。用于在真核细胞中表达的一些众所周知的和十分常用的启动子包括：来自病毒(如腺病毒)的启动子如ElA的启动子、来自巨细胞病毒(CMV)的启动子如CMV立即早期(IE)启动子、来自猿猴病毒40(Simian Virus 40，SV40)的启动子等等。合适的启动子也可以来自于真核细胞，例如金属硫蛋白(MT)启动子、延伸因子1α(EF-1α)启动子、肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、热休克启动子等。任何能够驱动宿主细胞中目的序列的表达的启动子或增强子/启动子都适用于本发明。在一个实施方案中，能够驱动表达的序列包含来自CMV启动子的区域，优选包含CMV立即早期基因增强子/启动子的核苷酸-735至+95的区域。本领域技术人员将认识到，在本发明中使用的表达序列可以适当地与能稳定或增强表达的元件(例如绝缘子、基质附着区、STAR元件(WO03/004704)等)组合。这可以增强稳定性和/或表达水平。

在重组宿主细胞中产生蛋白质已被广泛描述，例如在Current Protocols inProtein Science，1995，Coligan JE，Dunn BM，Ploegh HL，Speicher DW，Wingfield PT，ISBN 0-471-11184-8；Bendig，1988中。对细胞进行培养以使其能够代谢和/或生长和/或分裂和/或产生目的重组蛋白。这可以通过本领域技术人员公知的方法来完成，包括但不限于为细胞提供营养物。该方法包括附着于表面的生长、悬浮生长，或它们的组合。可以通过本领域公知的方法来对多个培养条件进行优化以优化蛋白质的产量。培养可以在例如培养皿、滚瓶或生物反应器中进行，采用分批、补料分批、连续系统、中空纤维等。为了实现通过细胞培养物大规模(连续)产生重组蛋白质，在本领域中优选使细胞能悬浮生长，并且优选地使细胞能在没有动物或人来源的血清或者动物或人来源的血清组分下培养。由于没有来自培养基的附加的动物或人蛋白质，因而更易于纯化并且提高了安全性，同时，由于合成培养基具有最好的重现性，因而该系统也很可靠。

在宿主细胞中表达免疫球蛋白样分子，并通过本领域技术人员通常已知的的方法从细胞或优选从细胞培养基中收获免疫球蛋白样分子。收获后，这些免疫球蛋白样分子可以通过使用本领域中已知的方法进行纯化。这样的方法可包括沉淀、离心、过滤、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、阳离子和/或阴离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法等等。对于包含IgG分子、蛋白A或蛋白G的抗体的混合物，可以适当地使用亲和色谱法(参见例如，美国专利4,801,687和5,151,504)。

根据本发明的方法产生的免疫球蛋白样的分子和/或其混合物优选地具有共同轻链。因此，还提供了一种根据本发明的方法，其还包括向所述宿主细胞提供编码共同轻链的核酸分子。这是能够与至少两种不同的重链配对从而形成功能性抗原结合结构域的轻链。功能性抗原结合结构域能够特异性结合抗原。优选地，使用能够与根据本发明的方法产生的所有重链配对从而形成功能性抗原结合结构域的共同轻链，这样避免了不匹配的重链和轻链的错配。在一个方面，仅使用具有一种相同氨基酸序列的共同轻链。或者，本领域技术的技术人员将认识到，“共同”也指氨基酸序列不相同的功能等效的轻链。存在所述轻链的许多变体，其中存在不实质性影响功能性结合区的形成的突变(缺失、替换、添加)。这样的变体因此也能够结合不同的重链并且形成功能性抗原结合结构域。因此，本文所用的术语“共同轻链”是指可能相同的轻链或具有一些氨基酸序列差异但是在与重链配对后所得抗体保持了结合特异性的轻链。例如，如通过引入和测试保守氨基酸改变和/或在与重链配对时对结合特异性没有或仅有部分帮助的区域中的氨基酸改变等，可能制备或找到不相同但依然功能上仍然等效的轻链。某些共同轻链和这样的功能等效变体的组合涵盖在术语“共同轻链”中。可参考WO2004/009618中对共同轻链的用法的详细描述。优选地，本发明使用的共同轻链是种系样轻链，更优选地是种系轻链，优选重排的种系人κ轻链，最优选地是重排的种系人κ轻链IgVκ1-39/Jκ或者IGVκ3-20/Jκ。

或者，技术人员可以选择将使重链和轻链强制(forced)配对的手段作为使用共同轻链的替选，并避免不匹配的重链和轻链的错配，所受手段描述在例如WO2009/080251、WO2009/080252和/或WO2009/080253中。

本发明提供了新的经改造CH3结构域，以及CH3突变的新组合。在本发明之前，使已知参与CH3-CH3配对的CH3结构域的带电荷的接触氨基酸由相反电荷的氨基酸替换(电荷逆转)，从而影响CH3-CH3配对。根据本发明的突变是这种方法的创造性替代，因为现在是使野生型CH3中不带电荷的或中性的CH3氨基酸被带电荷的残基替换。在本实施方案中，本发明并不通过相反电荷的氨基酸来交换带电荷的接触氨基酸，而是用带电荷的CH3氨基酸替换不带电荷的CH3氨基酸。本发明的方法不仅提供了有效地操纵CH3结构域的二聚化的方法，而且还具有在CH3界面产生至少一种另外的电荷-电荷相互作用的优点。鉴于在CH3-CH3界面上除了现有的电荷对之外的这种另外电荷-电荷相互作用，根据本发明的二聚体相比于野生型二聚体(野生型二聚体被定义为与其亲本同二聚体(AA或BB)相比不带有CH3改造的双特异性IgG(AB))通常更稳定。此外，已经令人惊讶的是可进一步提高混合物中一种或更多种目的免疫球蛋白样分子的比例。如前文所述，在本领域用于优先产生双特异性抗体的已知方法通常包括一些不期望二聚副产物的产生。例如，使用结进孔技术的目的双特异性抗体的比例最多是87％，而其中用相反电荷的氨基酸替换带电接触氨基酸的静电改造方法也导致比例高达96％(参见例如实施例11)。相当令人惊讶地，本发明人已经成功地引入突变，以进一步提高了混合物中目的免疫球蛋白样分子的比例。例如，实施例17公开了一种使用根据本发明的突变的方法，其中，目的双特异性抗体的比例被提高到这样的程度，即在生成的混合物中完全没有检测到二聚副产物。仅由与共同轻链配对的单条重链组成的未配对的半分子在一定程度上存在于所述混合物中，但这些是重链不平衡表达的结果，并且可以通过尺寸排阻色谱法容易地从混合物分离。因此，使用根据本发明的这种突变，在单个细胞中可以产生具有高比例的双特异性免疫球蛋白样分子，并且基本上没有污染性的二聚副产物存在，其特别适用于生产药物组合物。

因此，本发明的一个优选的实施方案提供了一种用于从单个细胞产生异二聚体免疫球蛋白样分子的方法，其中所述免疫球蛋白样分子包含能够形成界面的两个CH3结构域，所述方法包括在所述细胞中提供：

a.编码第一含CH3结构域之多肽链的第一核酸分子，

b.编码第二含CH3结构域之多肽链的第二核酸分子，

其中，所述第一含CH3结构域之多肽链包含至少一个中性氨基酸残基被带正电荷的氨基酸残基的替换，并且其中所述第二含CH3结构域之多肽链包含至少一个中性氨基酸残基被带负电荷的氨基酸残基的替换，所述方法还包括培养所述宿主细胞并且使所述两种核酸分子能够表达以及从培养物中收获所述异二聚体免疫球蛋白样分子的步骤。

所述方法优选地还包括为所述宿主细胞提供编码共同轻链的核酸分子的步骤，其具有如本文之前所概述的优点。

一个CH3结构域366位的氨基酸和第二CH3结构域351位的氨基酸已被报道为是CH3-CH3界面的一对接触残基，这意味着在所得到的免疫球蛋白样分子的三维构象中，它们位于足够靠近彼此的位置，以便能够彼此间相互作用。因此，第一CH3结构域将与第二CH3结构域优先配对。

在一个实施方案中，第一CH3结构域366位的苏氨酸(T)被第一带电荷的氨基酸替换，并且第二CH3结构域351位的亮氨酸(L)被第二带电荷的氨基酸替换，其中，所述第一和第二带电荷的氨基酸带相反电荷。如果在366位携带有带电残基的第一含CH3结构域之多肽还包含具有抗原A特异性的可变结构域，并且如果在351位携带有相反电荷残基的第二含CH3结构域之多肽还包含具有抗原B特异性的可变结构域，则将主要形成具有AB特异性的双特异性免疫球蛋白样分子。因此，还提供了一种根据本发明的方法，其中，用于使所述第一含CH3结构域之多肽与所述第二含CH3结构域之多肽优先配对的所述手段或用于使所述第三含CH3结构域之多肽与所述第四含CH3结构域之多肽优先配对的所述手段是用第一带电荷的氨基酸替换所述第一或第三CH3结构域366位的苏氨酸并且用第二带电荷的氨基酸替换所述第二或第四CH3结构域351位的亮氨酸，其中所述第一和第二带电荷的氨基酸带相反电荷。

根据本发明的突变的一个优选组合是：第一含CH3结构域之多肽第366位苏氨酸(T)被赖氨酸(K)替换，该多肽还包含一个可变结构域(例如具有特异性A)，并且第二含CH3结构域之多肽第351位的亮氨酸(L)被天冬氨酸(D)替换，该多肽还包含一个可变结构域(例如具有特异性B)。这被表示为T366K/L351’D配对突变。如之前所解释的，一个CH3结构域366位的氨基酸和第二CH3结构域351位的氨基酸已被报道为是CH3-CH3界面的一对接触残基。在366位引入的赖氨酸和在351位引入的天冬氨酸具有相反的电荷，使得这些氨基酸彼此静电吸引。因此，第一CH3结构域将优先吸引第二CH3结构域并且将主要形成包含在366位具有赖氨酸的第一CH3结构域的免疫球蛋白样分子，所述第一CH3结构域与在351位具有天冬氨酸的第二CH3结构域配对。如果第一含CH3结构域之多肽具有抗原A特异性，并且如果第二含CH3结构域之多肽具有抗原B特异性，将主要形成具有“AB”特异性的双特异性的免疫球蛋白样分子。注意，在一些实施方案中，所述第一和第二含CH3结构域之多肽链两者的可变结构域的特异性可以是相同的，这将导致形成单特异性免疫球蛋白样分子(例如具有“AA”特异性)。如上所述，根据本发明的突变的优点之一是这一事实：在新引入的带电荷的氨基酸对之间产生新的相互作用，而不是替换现有的带电氨基酸相互作用。这是以前没有公开或暗示过的。因此，本发明的一个方面提供了一种根据本发明的方法，其用于从单个宿主细胞产生至少两种不同的免疫球蛋白样分子，其中，所述第一含CH3结构域之多肽链包含氨基酸替换T366K且所述第二含CH3结构域之多肽链包含氨基酸替换L351D。一个实施方案提供了一种用于从单个细胞产生异二聚体免疫球蛋白样分子的方法，其中所述免疫球蛋白样分子包含能够形成界面的两个CH3结构域，所述方法包括在所述细胞中提供：

-编码第一含CH3结构域之多肽链的第一核酸分子，和

-编码第二含CH3结构域之多肽链第二核酸分子，

其中，所述第一含CH3结构域之多肽链包含氨基酸替换T366K，并且其中所述第二含CH3结构域之多肽链包含氨基酸替换L351D，所述方法还包括培养所述宿主细胞并且使所述两种核酸分子能够表达以及从培养物中收获所述异二聚体免疫球蛋白样分子的步骤。

使用上面提到的根据本发明的氨基酸替换，成为可能的是从单个细胞中产生异二聚体免疫球蛋白样分子，从而使污染性同二聚体的存在是少于5％、优选少于2％、更优选少于1％、或最优选地，凭此使污染性同二聚体基本上不存在。因此，一个实施方案提供了一种用于从单个细胞产生异二聚体免疫球蛋白样分子的方法，其中所述免疫球蛋白样分子包含能够形成界面的两个CH3结构域，并且其中污染性同二聚体的存在少于5％，优选少于2％，更优选少于1％，且最优选地污染性同二聚体基本上不存在，所述方法包括在所述细胞中提供：

-编码第一含CH3结构域之多肽链的第一核酸分子，和

-编码第二含CH3结构域之多肽链的第二核酸分子，

优选地，提供了用于产生至少两种不同的免疫球蛋白样分子的根据本发明的方法，或用于产生异二聚体免疫球蛋白样分子的根据本发明的方法，其中所述第一含CH3结构域之多肽链还包含氨基酸替换L351K。更优选地，所述第二含CH3结构域之多肽链还包含选自Y349E、Y349D和L368E的氨基酸替换。最优选地，所述第二含CH3结构域之多肽链还包含氨基酸替换L368E。

因此，在一个优选实施方案中，根据本发明的上述T366K/L351’D突变进一步与在第二CH3结构域的第368位谷氨酸(E)对亮氨酸(L)的替换相组合。例如，这表示为T366K/L351'D，L368'E突变(但替代的表示方式也是可能的，如T336K/L351D-L368E或T366K/L351D，L368E或T366K-L351D，L368E)。如实施例17中所示，将根据本发明的这种突变引入到具有抗原A特异性的第一含CH3结构域之多肽和具有抗原B特异性的第二含CH3结构域之多肽导致具有双重AB特异性的双特异性免疫球蛋白样分子有特别好的比例。利用这种突变配对，甚至能够获得双特异性抗体而不形成任何可检测量的同型二聚体。因此，一个特别优选的实施方案提供了一种用于从单个细胞中产生异二聚体免疫球蛋白样分子的方法，其中所述免疫球蛋白样分子包含能够形成界面的两个CH3结构域且其中污染性同二聚体的存在少于5％，优选少于2％，更优选少于1％，且最优选地污染性同二聚体基本上不存在，所述方法包括在所述细胞中提供：

-编码第一含CH3结构域之多肽链的第一核酸分子，和

-编码第二含CH3结构域之多肽链的第二核酸分子，

其中，所述第一含CH3结构域之多肽链包含氨基酸替换T366K，并且其中所述第二含CH3结构域之多肽链包含氨基酸替换L351D和L368E，所述方法还包括培养所述宿主细胞并且使所述两种核酸分子能够表达以及从培养物中收获所述异二聚体免疫球蛋白样分子的步骤。

在又一个优选的实施方案中，第一CH3结构域366位的苏氨酸(T)被赖氨酸(K)替换，第二CH3结构域351位的亮氨酸(L)被天冬氨酸(D)替换并且所述第二CH3结构域349位的酪氨酸(Y)被谷氨酸(E)替换。这例如表示为T366K/L351'D，Y349'E突变，但表示这些突变的其他方式可以包括例如T366K-L351D：Y349E或T366K/L351D，Y349E或仅T366K/L351DY349E。残基Y349是351位残基的相邻残基，可能有助于二聚体相互作用。根据计算机模拟数据，Y349E增加了异二聚体的稳定性(较低计算机模拟得分)以及同二聚体的不稳定化作用(较高计算机模拟得分)且349位上的谷氨酸(E)，比天冬氨酸(D)更有利。因此，在已经包含351位氨基酸替换的第二含CH3结构域之多肽中引入第二氨基酸替换进一步有利于异二聚化。

因此，一个特别优选的实施方案提供一种用于从单个细胞产生异二聚体免疫球蛋白样分子的方法，其中所述免疫球蛋白样分子包含能够形成界面的两个CH3结构域，并且其中污染性同二聚体少于5％，更优选少于2％，甚至更优选少于1％，且最优选基本上不存在，所述方法包括在所述细胞中提供：

-编码第一含CH3结构域之多肽链的第一核酸分子，和

-编码第二含CH3结构域之多肽链的第二核酸分子，

其中所述第一含CH3结构域之多肽链包含氨基酸替换T366K，并且其中所述第二含CH3结构域之多肽链包含氨基酸替换L351D和Y349E，所述方法还包括培养所述宿主细胞并且使所述两种核酸分子能够表达以及从培养物中收获所述异二聚体免疫球蛋白样分子的步骤。

在又一个优选的实施方案中，第一CH3结构域366位的苏氨酸(T)被赖氨酸(K)替换，第二CH3结构域351位的亮氨酸(L)被天冬氨酸(D)替换，所述第二CH3结构域349位的酪氨酸(Y)被谷氨酸(E)替换，并且所述第二CH3结构域368位的亮氨酸(L)被谷氨酸(E)替换。这被表示为T366K/L351'D，Y349'E，L368'E突变。这两个残基Y349和L368是可能有助于二聚体相互作用的残基。根据计算机模拟数据，Y349E和L368E增加了异二聚体的稳定性(较低计算机模拟得分)和BB二聚体的不稳定性(较高计算机模拟得分)并且349和368位的谷氨酸(E)比天冬氨酸(D)更有利。因此，在已经包含了351位的氨基酸替换的B链引入第二和第三个氨基酸替换，进一步有利于异二聚化。因此，一种特别优选的实施方案提供一种从单个细胞产生异二聚体免疫球蛋白样分子的方法，其中所述免疫球蛋白样分子包含能够形成界面的两个CH3结构域，并且其中污染性同二聚体少于5％，更优选少于2％，甚至更优选少于1％，且最优选基本上不存在，所述方法包括在所述细胞中提供：

-编码第一含CH3结构域之多肽链的第一核酸分子，和

-编码第二含CH3结构域之多肽链的第二核酸分子，

其中所述第一含CH3结构域之多肽链包含氨基酸替换T366K，并且其中所述第二含CH3结构域之多肽链包含氨基酸替换L351D和Y349E和L368E，所述方法还包括培养所述宿主细胞并且使所述至少两种核酸分子能够表达以及从培养物中收获所述异二聚体免疫球蛋白样分子的步骤。

在又一个优选的实施方案中，第一CH3结构域366位的苏氨酸(T)被赖氨酸(K)替换，所述第一CH3结构域351位的亮氨酸(L)被赖氨酸(K)替换，第二CH3结构域351位的亮氨酸(L)被天冬氨酸(D)替换，并且所述第二CH3结构域368位的亮氨酸(L)被谷氨酸(E)替换。这被表示为T366K，L351K/L351'D，L368'E突变。这种突变也增强了目的(双特异性)抗体的比例，如实施例中所示。同样地，利用这些突变也使得能够获得双特异性抗体而不形成任何可检测量的同二聚体。因此，还提供了一种从单个细胞产生异二聚体免疫球蛋白样分子的方法，其中所述免疫球蛋白样分子包含能够形成界面的两个CH3结构域，并且其中污染性同型二聚体少于5％，优选少于2％，更优选少于1％，且最优选基本上不存在，所述方法包括在所述细胞中提供：

-编码第一含CH3结构域之多肽链的第一核酸分子，和

-编码第二含CH3结构域之多肽链的第二核酸分子，

其中，所述第一含CH3结构域之多肽链包含氨基酸替换T366K和L351K，并且其中所述第二含CH3结构域之多肽链包含氨基酸替换L351D和L368E，所述方法还包括培养所述宿主细胞并且使所述两种核酸分子能够表达以及从培养物中收获所述异二聚体免疫球蛋白样分子的步骤。

在又一个优选的实施方案中，第一CH3结构域366位的苏氨酸(T)被赖氨酸(K)替换，所述第一CH3结构域351位的亮氨酸(L)被赖氨酸(K)替换，第二CH3结构域351的位亮氨酸(L)被天冬氨酸(D)替换，所述第二CH3结构域349位的酪氨酸(Y)被天冬氨酸(D)替换，并且所述第二CH3结构域355位的精氨酸(R)被天冬氨酸(D)替换。这表示为T366K，L351K/L351'D，Y349'D，R355'D突变。T366K-L351K/L351'D-Y349'D配对可被B链的R355'D突变进一步改进，这导致了更高的BB计算机模拟得分，而且AB计算机模拟得分也稍微提高。因此，进一步提供了一种从单个细胞产生异二聚体免疫球蛋白样分子的方法，其中所述免疫球蛋白样分子包含能够形成界面的两个CH3结构域，并且其中污染性同型二聚体少于5％，更优选少于2％，甚至更优选少于1％，且最优选基本上不存在，所述方法包括在所述细胞中提供：

-编码第一含CH3结构域之多肽链的第一核酸分子，和

-编码第二含CH3结构域之多肽链的第二核酸分子，

其中，所述第一含CH3结构域之多肽链包含氨基酸替换T366K和L351K，并且其中所述第二含CH3结构域之多肽链包含氨基酸替换L351D和Y349D和R355D，所述方法还包括培养所述宿主细胞并且使所述两种核酸分子能够表达以及从培养物中收获所述异二聚体免疫球蛋白样分子的步骤。

表B提供了可引入到CH3结构域中的突变的概述，所述突变作为用于优先配对的优选手段以产生异二聚体或同二聚体。

表B：

CH3中的氨基酸替换	构建体#	与以下优先配对
			-(野生型)	-	野生型
E356K，D399K	1	构建体2或3
			K392D，K409D	2	构建体1
K392D，K409D，K439D	3	构建体1
			K392D，D399K，K409D	4	构建体4
E356K，E357K，K439D，K370D	5	构建体5
			T366W	6	构建体7
T366S，L368A，Y407V	7	构建体6
			T366K	43	构建体63，69，70，71，73
L351D	63	构建体43，68
			T366K，L351K	68	构建体63，69，70，71，72，75
L351D，L368E	69	构建体43，68
			L351E，Y349E	70	构建体43，68
L351D，Y349E	71	构建体43，68
			L351D，R355D	72	构建体43，68
L351D，Y349E，L368E	73	构建体43
			L351D，Y349D，R355D	75	构建体68

因此，在此还提供了用于产生至少两种不同的免疫球蛋白样分子的根据本发明的方法，或者用于产生异二聚体免疫球蛋白样分子的根据本发明的方法，其中，用于使所述第一含CH3结构域之多肽与所述第二含CH3结构域之多肽优先配对的所述手段和/或用于使所述第三含CH3结构域之多肽与所述第四含CH3结构域之多肽优先配对的所述手段包含有表B中所示突变的至少一种组合。优选地，用于使所述第一含CH3结构域之多肽与所述第二含CH3结构域之多肽优先配对的所述手段和用于使所述第三含CH3结构域之多肽与使所述第四含CH3结构域之多肽优先配对的所述手段包含有表B中所示突变的至少两种组合。

本发明还提供了CH3突变的新组合，利用这种组合，使得在单个细胞中产生至少两种单特异性免疫球蛋白样分子的混合物成为可能，其中污染性双特异性免疫球蛋白样分子少于5％，优选多于2％，甚至更优选少于1％，且最优选甚至基本上不存在。因此，根据本发明的这些突变特别适用于产生单特异性抗体的混合物，它在以下情况是有利的，例如当期望两种相同的靶分子具有高交联水平时，当需要靶细胞上抗体的密度足够高以招募某些效应器功能(如肿瘤细胞的补体介导裂解)时，或当两个靶标彼此之间离得太远以至于它们不能由单一的双特异性抗体结合时，或者为了简化监管部门的批准手续时。在这些情况下，通常期望优化这样单特异性抗体的生产平台。如实施例10中所示，本发明提供了这样的认识：当第一含CH3结构域之多肽(例如具有特异性A)392位的赖氨酸(K)被天冬氨酸(D)替换时，以及当所述第一含CH3结构域之多肽399位的天冬氨酸(D)被赖氨酸(K)替换时，以及当所述第一含CH3结构域之多肽409位的赖氨酸(K)被天冬氨酸(D)替换时，使得在单个细胞中产生至少两种不同的单特异性的免疫球蛋白样分子的混合物成为可能，包括具有AA特异性的单特异性的免疫球蛋白样分子，其中双特异性副产物(双特异性免疫球蛋白样分子)的形成被减少到低于5％，或甚至低于3％或甚至基本上不可检测。因此，上述突变(本文称为K392D、D399K、K409D)的组合对于产生单特异性的免疫球蛋白样分子的混合物特别优选。本领域技术人员将理解，其功能性变体，即K392E、D399R、K409E，可导致类似的效果。此外，双突变体(包括D399K和K409D替换)或其他功能性变体例如K392D和K409D、D399R和K409E等等也可能导致类似的效果。

同样适用于以下突变的组合，其中第一含CH3结构域之多肽的356位的谷氨酸(E)被赖氨酸(K)替换，以及其中所述第一含CH3结构域之多肽的357位的谷氨酸(E)被赖氨酸(K)替换，以及其中所述第一含CH3结构域之多肽的439位的赖氨酸(K)被天冬氨酸(D)替换，以及其中所述第一含CH3结构域之多肽的370位的赖氨酸(K)被天冬氨酸(D)替换。突变(本文称为E356K、E357K、K439D、K370D)的组合对于产生单特异性免疫球蛋白样分子的混合物也特别优选。本领域技术人员将理解，其功能性变体，即E356R、E357R、K439E、K370E，可导致类似的效果。此外，三或双突变体(包括E356K和K439D以及E357K和K370D替换)或其他功能性变体也可导致类似的效果。因此，另一个实施方案提供了一种用于从单个宿主细胞产生至少两种不同的单特异性免疫球蛋白样分子的方法，其中所述两种免疫球蛋白样分子各自包含能够形成界面的两个CH3结构域，所述方法包括在所述细胞中提供：

a)编码具有A特异性的第一含CH3结构域之多肽链的第一核酸分子，

b)编码具有B特异性的第二含CH3结构域之多肽链的第二核酸分子，其中，所述第一含CH3结构域之多肽链包含K392D、D399K、K409D突变和所述第二含CH3结构域之多肽链包含野生型CH3结构域或包含E356K、E357K、K439D、K370D突变，所述方法还包括培养所述宿主细胞并且使所述核酸分子能够表达以及从培养物中获得所述至少两种不同的免疫球蛋白样分子的步骤。

一个替选实施方案提供了一种用于从单个宿主细胞产生至少两种不同的单特异性免疫球蛋白样分子的方法，其中，所述两种免疫球蛋白样分子各自包含能够形成界面的两个CH3结构域，所述方法包括在所述细胞中提供：

b)编码具有B特异性的第二含CH3结构域之多肽链的第二核酸分子，其中，所述第一含CH3结构域之多肽链包含野生型CH3结构域或包含K392D、D399K、K409D突变，并且所述第二含CH3结构域之多肽链包含E356K、E357K、K439D、K370D突变，所述方法还包括培养所述宿主细胞并且使所述核酸分子能够表达以及从培养物中收获所述至少两种免疫球蛋白样分子的步骤。

如实施例10中所示，两种单特异性免疫球蛋白样分子可以在单个细胞中产生，其中双特异性免疫球蛋白样分子的形成基本上不可检测。本领域技术人员可以选择编码野生型或改造的含CH3结构域之多肽链的第三核酸分子，以提供给所述宿主细胞，从而产生三种单特异性抗体的混合物，等等。

在本发明的一个方面，提供了用于产生至少两种不同的免疫球蛋白样分子或用于产生异二聚体免疫球蛋白样分子的根据本发明的方法，其中含CH3结构域之多肽链还各自包含识别不同靶表位的可变区，其中所述靶表位位于同一分子上。与仅靶向一个表位情况相比，这通常使得能够更有效地对抗所述靶分子的(生物)功能。例如，异二聚体免疫球蛋白样分子可同时与存在于例如对肿瘤细胞的增殖至关重要的生长因子受体或可溶性分子上的两个表位结合，从而有效地阻止导致不受控制的细胞增殖的多个独立的信号传导途径，并且至少两种免疫球蛋白样分子的任何组合可以同时与存在于这样的生长因子受体或可溶性分子上的2个、或甚至3个或4个表位结合。

在一个优选实施方案中，靶分子是可溶性分子。在另一优选实施方案中，靶分子是膜结合分子。

在本发明的另一个方面，提供了用于产生至少两种不同的免疫球蛋白样分子或用于产生异二聚体免疫球蛋白样分子的的根据本发明的方法，其中，含CH3结构域之多肽链还各自包含识别靶表位的可变区，其中靶表位位于不同的分子上。在这种情况下，不同的靶分子各自都可以是可溶性分子或膜结合分子。在一个实施方案中，不同的靶分子都是可溶性的分子。或者，一个靶分子是可溶性分子，而第二靶分子是膜结合分子。在另一个替代方案中，这两种靶分子都是膜结合的分子。在一个实施方案中，不同的靶分子在相同细胞上表达，而在另一些实施方案中，不同的靶分子在不同的细胞上表达。作为一个非限制性的实例，任何异二聚体免疫球蛋白样分子或至少两种免疫球蛋白样分子的任何组合可适合用于同时阻断多种膜结合受体、中和多种水溶性分子(例如针对肿瘤细胞的细胞因子或生长因子)或中和不同病毒血清型或病毒株。

一个优选实施方案提供了用于产生至少两种不同的免疫球蛋白样分子或用于产生异二聚体免疫球蛋白样分子的根据本发明的方法，其中至少一种所述靶表位位于肿瘤细胞上。替选地或另外地，至少一种所述靶表位位于效应细胞的表面。这适合于例如招募用于肿瘤细胞杀伤的T细胞或NK细胞。例如，根据本发明的方法产生的至少一种免疫球蛋白样分子，通过特异性结合到位于免疫效应细胞上的靶分子，其能够招募免疫效应细胞，优选人免疫效应细胞。在另一个实施方案中，一旦免疫球蛋白样分子结合到靶标分子上时，所述免疫效应细胞被激活。效应机制招募可以例如涵盖：通过施用根据本发明的方法产生的能够与细胞毒性触发分子(诸如T细胞受体或Fcγ受体)结合的免疫球蛋白样分子使免疫调制细胞毒性重定向，从而激活下游的免疫效应途径。如本文所用的术语“免疫效应细胞”或“效应细胞”是指在哺乳动物免疫系统天然细胞库中的细胞，其可以被激活来影响靶细胞的生存力。免疫效应细胞包括淋巴系的细胞，如自然杀伤(NK)细胞、T细胞(包括细胞毒性T细胞、或B细胞)，而且骨髓系的细胞也可以被视为免疫效应细胞，如单核细胞或巨噬细胞，树突状细胞和嗜中性粒细胞。因此，所述效应细胞优选NK细胞、T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或嗜中性粒细胞。

免疫效应细胞呈递的靶抗原可以包括CD3、CD16、CD25、CD28、CD64、CD89、NKG2D和NKp46。因此，还提供了根据本发明的用于产生至少两种不同的免疫球蛋白样分子或用于产生异二聚体免疫球蛋白样分子的一种方法，其中所述靶表位位于CD3、CD16、CD25、CD28、CD64、CD89、NKG2D或NKp46分子上。

靶细胞的生存力可包括细胞存活、增殖和/或与其他细胞相互作用的能力。

因此，在一个方面，本发明提供了根据本发明的用于产生异二聚体免疫球蛋白样分子的方法，其中含CH3结构域之多肽链还各自包含识别靶表位的可变区。在一个实施方案中，含CH3结构域之多肽链的2个可变区各自识别相同的靶表位，但具有不同的亲和性。在另一个实施方案中，含CH3结构域之多肽链的2个可变区各自识别不同的靶表位。在另一个实施方案中，不同的靶表位位于同一靶分子上，其可以是膜结合分子或可溶性分子。在另一个实施方案中，不同的靶表位位于不同的靶分子上，其可以在相同细胞或不同细胞上表达。或者，不同的靶分子可以是可溶性分子，或一个靶分子可以是可溶性分子而第二靶分子是膜结合分子。在一个优选实施方案中，异二聚体免疫球蛋白样分子的至少一种靶分子位于肿瘤细胞上。在另一个优选的实施方案中，异二聚体免疫球蛋白样分子的至少一种靶分子位于效应细胞上(即NK细胞、T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或嗜中性粒细胞，且所述靶表位可以位于CD3、CD16、CD25、CD28、CD64、CD89、NKG2D或NKp46分子上)。

在一个优选实施方案中，提供了根据本发明的用于产生至少两种不同的免疫球蛋白样分子或用于产生异二聚体免疫球蛋白样分子的方法，其中，所述至少两种不同的免疫球蛋白样分子是抗体，最优选IgG同种型抗体，甚至更优选地如上文所述的IgG1同种型。

还提供了可通过根据本发明的方法获得的免疫球蛋白样分子、异二聚体免疫球蛋白样分子、或至少两种免疫球蛋白样分子的混合物。所述(异二聚体)免疫球蛋白样分子或免疫球蛋白样分子的混合物优选包含至少一种如在表B中描述的CH3突变。因此在此还提供了包含至少一种如在表B中所描述的突变的(异二聚体)免疫球蛋白样的分子或至少两种免疫球蛋白样分子的混合物，以及包含根据本发明的至少一种免疫球蛋白样分子或至少两种免疫球蛋白样分子的混合物的药物组合物。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白样分子是双特异性的免疫球蛋白样分子，如双特异性抗体。在另一个实施方案中，所述免疫球蛋白样分子是单特异性的免疫球蛋白样分子，如单特异性抗体。一个优选实施方案提供了可根据本发明的方法获得的至少两种不同的免疫球蛋白样分子的混合物，其中所述至少两种不同的免疫球蛋白样分子与相同抗原上的不同表位结合和/或与不同抗原上的不同表位结合。还提供了可根据本发明的方法获得的异二聚体免疫球蛋白样分子，其中所述异二聚体免疫球蛋白样分子与相同抗原上的不同表位结合和/或与不同抗原上的不同表位结合。这种混合物和抗体的优点和优选的用途是本文中之前描述的。本发明还提供了可通过根据本发明的方法获得的至少两种不同的免疫球蛋白样分子的混合物，其中所述至少两种不同的免疫球蛋白样分子包括至少一种异二聚体免疫球蛋白样分子。在一个实施方案中，所述的至少两种不同的免疫球蛋白样分子中的两种都是异二聚体免疫球蛋白样分子。另一个优选实施方案提供了包含2个CH3结构域的异二聚体抗体，其中所述两个CH3结构域中的一个中包含氨基酸替换L351D和L368E，并且其中所述两个CH3结构域的另一个中包含氨基酸替换T366K和L351K。如前面所解释的，这些氨基酸替换是用于使所述两个CH3结构域优先配对的优选手段。在所述两个CH3结构域的一个中的氨基酸替换L351D和L368E和所述两个CH3结构域的另一个中的氨基酸替换T366K和L351K一起被称为‘DEKK突变组合’、‘DEKK变体’、‘DEKK对’、‘DEKK改造的CH3结构域’、‘DEKK'或使用参照DEKK的替代名称。携带氨基酸替换L351D和L368E的CH3结构域也被称为‘DE侧’而携带氨基酸替换T366K和L351K的CH3结构域也被称为‘KK-侧’。

还提供了包含可根据本发明的方法获得的(异二聚体)免疫球蛋白样的分子或至少两种免疫球蛋白样分子的混合物的药物组合物。根据本发明的所述(异二聚体)免疫球蛋白样的分子或所述至少两种免疫球蛋白样分子优选是抗体。所述药物组合物可以包含所述(异二聚体)免疫球蛋白样的分子、包含单特异性或双特异性的免疫球蛋白样分子的混合物、或单特异性的和双特异性的免疫球蛋白样分子的组合。此外，根据本发明的药物组合物包含可药用载体。如本文所使用的，这样的“可药用载体”包括任何以及所有的溶剂、盐类、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等生理上相容的物质。取决于施用的途径(例如，静脉内、皮下、关节内等)，免疫球蛋白样分子可以被包被在一种材料内，保护所述免疫球蛋白样分子不受酸以及其他可能会使免疫球蛋白样分子失活的自然条件的作用。在一个方面，提供了包含可通过根据本发明的任意方法获得的至少两种免疫球蛋白样分子的混合物的药物组合物，其中所述至少两种不同的免疫球蛋白样分子是由根据本发明的重组宿主细胞产生的。此外，提供了包含可根据本发明的任意方法获得的异二聚体免疫球蛋白样分子的药物组合物，其中所述异二聚体免疫球蛋白样分子是由根据本发明的重组宿主细胞产生的。

在此还提供了编码含有至少一种表B中所示突变的含CH3结构域之多肽链的核酸分子，以及包含至少一种核酸分子的重组宿主细胞，所述核酸分子编码含有至少一种表B中所示突变的含CH3结构域之多肽链。

通过下面的实施例进一步说明本发明。这些实施例不以任何方式限制本发明，而只是用来阐明本发明。

附图说明

图1：A)构建体载体MV1057的示意图。填充区域是抗体VH区被克隆进去的区域。B)噬菌体展示载体MV1043的示意图。

图2：野生型IgG1Fc的氨基酸序列，存在于构建体载体MV1057中(应用的是EU编号方案)。

图3：用于克隆到多种构建体中的VH区的核苷酸和氨基酸序列。

图4：转染A、G和H的质谱数据。

图5：转染M和U的质谱数据。

图6：转染O的质谱数据。

图7：通过将中性氨基酸用带电荷的氨基酸替换阻止同型二聚体化。

图8：转染样品ZO(T366K/L351’D)的本性(Native)MS谱(A)和转染样品ZO(T366K/L351’D)卷积(Convoluted)MS谱。第二/主峰表示双特异性分子(B)。

图9：实验验证突变对的HADDOCK得分。

图10：CH3-CH3界面相互作用的卡通图；A)K409D：K392D/D399’K：E356’K，B)D399K：E356K/D399’K：E356’K，C)K409D：K392D/K409’D：K392’D。

图11：各种366/351’电荷突变体的HADDOCK得分。

图12：CH3-CH3界面相互作用的卡通图；A)L351D/L351’D，B)L351D：S354A：R355D/L351’D：S354’A：R355’D。

图13：L351位附近另外的电荷突变的HADDOCK得分。

图14：A链中T366位和B链中L351位附近另外的电荷突变的HADDOCK得分。

图15：CH3-CH3界面相互作用的卡通图。

图16：T366/L351附近变异的HADDOCK得分。

图17：T366/L351附近另外变异的HADDOCK得分。

图18：在构建体T366K，L351K与构建体L351D(左手图)或L351D，Y349E(右手图)共表达后得到的双特异性免疫球蛋白的nMS谱的实例，放大完整IgG的单电荷状态(半体未示出)。

图19：A)本性MS结果显示AA、AB、BB、A和B(所有种类总计100％)的相对丰度；B)同上，但现在没有AB，为了对不期望种类AA、BB、A和B有更好地了解。

图20：热稳定性测定结果。正方形：野生型；三角形：电荷逆转对E356K：D399K/K392D：K409D；圆形：上面每个图形所示的突变体CH3组合。

图21：10×冻融实验的结果。1122＝第1亲本抗体BB；1337＝第二亲本抗体AA；野生型＝AA、AB、BB；CR＝电荷逆转对E356K：D399K/K392D：K409D的双特异性；3-6和9-12＝来自表15的中3-6和9-12组合的双特异性分子。

图22：血清稳定性结果，通过使用纤维蛋白原作为包被抗原的ELISA测定。A)稀释至0.5微克/毫升的IgG样品的ELISA数据；B)稀释至0.05微克/毫升IgG样品的ELISA数据；结果被标准化为T＝0天的时间点(100％)。1337＝第二个亲本抗体AA；野生型＝AA、AB、BB；CR＝电荷逆转对E356K：D399K/K392D：K409D的双特异性；3-6和9-12＝来自表15的3-6和9-12组合的双特异性分子。

图23：转染比率为1∶5至5∶1的比率实验的nMS结果。A)DEKK突变组合，在DE侧具有特异性“A”并且在KK侧具有特异性“B”；B)DEKK突变组合，在DE侧具有特异性“C”并且在KK侧具有特异性“B”；C)突变的电荷逆转组合，在E356K：D399K侧具有特异性“A”并且在K392D：K409D侧具有特异性“B”。

图24：来自表20的转染#1-11的nMS结果。

图25：具有不同CH3经改造载体的二聚体的HADDOCK得分。灰色条：期望种类AB和CD；黑色条：不期望种类AA、BB、CC、DD、AC、BC、AD、BD。

图26：来自表20的转染#1-11的SDS-PAGE。对照样品DE/KK、DE/DE和KK/KK也包括在内。

图27：转染#9(A)和转染#11(B)的nMS。

图28：凝胶过滤样品1516：1516(A)、1337：1337(B)和1516：1337(C)的nMS。

图29：DEKK经改造抗体及其两种亲本抗体的样品的血清水平(pK研究)。

具体实施方式

实施例

实施例1：氨基酸替换以产生多种不同的CH3结构域

将多个已知促进异二聚体形成的氨基酸替换以及多个先前未被报道也未测试但被选来促进同二聚体形成的替选氨基酸替换引入构建体载体(构建体载体MV1057；图1A)中，以获得其CH3结构域不同的广泛多种免疫球蛋白样分子，使得CH3结构域(包括免疫球蛋白样分子)的配对被优先促进或抑制。如图2所示，构建体载体MV1057包含编码正常野生型IgG1 Fc部分的核酸序列。表1列出了被引入该野生型Fc中的氨基酸替换，产生了一系列的七个构建体。所有构建体均在Geneart产生。如同构建体6和7(WO98/50431)，先前已描述过构建体1、2和3，或其替代物驱动异二聚化(EP01870459，WO2009/089004)。构建体4和5是新的，并且被设计为促进同二聚化。

表1

实施例2：将VH克隆至含有CH3突变的构建体中

将若干具有已知特异性并且已知能够与人IGKV1-39轻链配对的抗体VH区用于克隆至这些构建体中。如前所述，所有的CH3变体可用于与其他抗体结构域缔合以产生双特异性或单特异性全长抗体。VH/VL组合限定的抗体特异性将不会影响由CH3结构域驱动的重链二聚化行为。在整个研究中，使用模型VH/VL组合，其中所有的VL均基于种系人IGKV1-39，而VH改变。图3提供了在整个研究中使用的抗体VH区的全序列和特异性。MF编码是指不同VH的内部Merus名称，例如，VH MF1337对破伤风类毒素具有特异性，MF1025对猪甲状腺球蛋白具有特异性，MF1122对牛纤维蛋白原具有特异性。用限制性酶Sfil和BstEII(New EnglandBiolabs/目录号#R0123L和R0162L/根据生产商的使用说明)消化噬菌体展示载体MV1043(图1B)中存在的VH区，从而从该载体释放VH片段。根据标准方法(根据生产商的使用说明)，用Sfil和BstEII消化载体MV1057。用凝胶纯化片段和载体(Promega/目录号#V3125/根据生产商的使用说明)以分离切割载体和VH基因插入片段。通过连接，将两者结合，然后将连接产物转化至E.coli DH5α中(Invitrogen/目录号#12297-016/根据生产商的使用说明)。经过夜筛选后，挑选单菌落，并且通过测序来鉴定含有正确插入片段的载体。

实施例3：全IgG在HEK293T细胞中的转染和表达

根据标准方法，在HEK293T细胞中对各种编码再克隆的VH变体、以及还编码共同轻链huIGKVl-39的质粒进行转染，使得IgG能够表达(de Kruif等Biotech Bioeng.2010)。转染后，利用ForteBIO Octet-QK系统测量上清中IgG的表达水平，所述系统基于生物层干涉测量(Bio-Layer Interferometry，BLI)，并且能够实现对生物分子相互作用的实时量化和动力学表征；详情参见www.fortebio.com。当测量到表达水平超过5μg/ml时，利用蛋白质A亲和纯化来纯化IgG。

实施例4：纯化IgG

利用蛋白质A柱纯化培养物上清(GE Healthcare/目录号#11-0034-95/根据生产商的使用说明)，用0.1M柠檬酸缓冲液pH 3.0洗脱，并立即用等体积的1.0M Tris-HCL pH8.0中和，或利用脱盐柱直接重新缓冲至PBS。或者，可利用蛋白质A珠(琼脂糖珠CL-4B，GEhealthcare目录号#170780-01)纯化IgG。

实施例5：抗原特异性(Ag-specific)ELISA's

进行抗原特异性ELISA以确定对该抗原的结合活性，并进行捕获ELISA来证明双特异性抗体的结合活性。使用生物素化的二抗检测复合物(de Kruif等BiotechBioeng.2010)。

实施例6：SDS-PAGE

根据标准方法，在还原和非还原条件下，通过SDS-PAGE(4-12％bis-tris凝胶/Invitrogen/目录号#NP0323BOX)分析纯化的IgG混合物，用胶体蓝(PageBlue^TM蛋白质染色溶液/Fermentas/目录号#RO571)进行凝胶中的蛋白质染色。

实施例7：IgG1的酶促去糖基化

由于IgG的糖基化中存在不均一性，对蛋白质进行去糖基化以产生具有不同质量且适于进行质谱分析的单一产物。每10μg IgG1，于37℃下过夜孵育一单位的N-糖苷酶F(PNGase F；Roche Diagnostics，Mannheim，德国)。利用10kDa MWCO离心过滤柱(Millipore)进行缓冲液交换以去除初始纯化缓冲液(0.1M柠檬酸缓冲液pH 3.0/1.0MTris-HCL pH 8.0)，并重新缓冲至PBS。进行类似的缓冲液交换步骤以去除分离的聚糖链，并将缓冲液换成pH 7.5的150mM乙酸铵。在4℃和11,000rpm下，用200μL pH 7.5的150mM乙酸铵洗涤滤器12分钟。洗涤之后，将50μL去糖基化的IgG加样到滤器，并添加450μL pH 7.5的150mM乙酸铵，然后在4℃和11,000rpm下，进行另一轮12分钟的离心。总共，重复离心5次，每次添加新鲜的150mM pH 7.5的乙酸铵缓冲液至总体积为500μL。在最后一步离心后，收集约25μL剩下缓冲液交换的去糖基化IgG1，并转移至微量离心管，为质谱分析做准备。

实施例8：本性质谱分析

使用质谱以鉴定纯化的IgG混合物中的不同IgG种类，并确定这些IgG种类以什么比率存在。简言之，将2至3μl 150mM pH 7.5的乙酸铵中1μM浓度的IgG加样至内部制作的镀金硼硅酸盐毛细管(利用Sutter P-97拉制器[Sutter Instruments Co.，Novato，CA，USA]和Edwards Scancoat六溅射器(sputter-coater)[Edwards Laboratories，Milpitas，CA，USA)，以在LCT 1质谱(Waters Corp.，Milford，MA，USA)上进行分析，并对所述质谱进行调整以在高质量检测中具有最佳性能(Tahallah等，RCM 2001)。使用1300V的毛细管电压，采样锥电压为200V；然而，当需要更高分辨率的“信噪比”时，调整这些设置。将源前级压力(backing pressure)提升以促使碰撞冷却至约7.5毫巴。喷洒5％甲酸中的1μM浓度的蛋白质，以在变性条件下测定IgGl。

实施例9：数据处理和量化

利用MassLynx 4.1软件(Waters Corp.，Milford，MA，USA)，对获取的谱进行处理。采用最小滤波(smoothing)，然后集中光谱。利用成系列的每个电荷状态来计算种类的质量。通过MassLynx，指派每个电荷状态的对应强度，并且相加。该方法使得能够在一个样品中相对量化所有种类。或者，利用本领域中已知的曲线下面积(AUC)方法进行峰的量化。将所有的分析重复三次以计算IgG质量和其相对丰度的标准偏差。

实施例10：来自单个细胞的2或3种单特异性抗体的混合物

将若干具有已知特异性并且已知能够与人IGKV1-39轻链(图3)配对的抗体VH区用于再克隆至野生型构建体载体MV1057中，或表1中的构建体4或构建体5中，从而得到载体I至III(表2)。随后，将得到的载体I、II和III单独转染到细胞中以证明仅形成完整的单特异性抗体，或与一种或两种其他构建体载体组合转染到细胞中以获得两种单特异性或三种单特异性抗体的混合物，所述载体I、II和III，每个包含编码共同的人轻链以及具有不同CH3区和不同VH特异性的Ig重链的核酸序列。表3示出了转染方案和结果。

表2：不同构建体中插入的VH特异性

表3：转染方案和结果

nd＝未进行。

观察到，转染A、G和H导致仅形成同二聚体，从用载体I、II或III中任意一种载体转染的细胞获得100％的二价单特异性AA、BB或CC(图4)。尽管这是预期内的，并且先前在转染A中也证明过，但是事实上现在第一次显示CH3改造的Ig重链的同二聚化(转染G和H)被报道，所述重链包含构建体4的三元氨基酸替换((即，K392D、D399K、K409D)或构建体5的四元氨基酸替换(即，E356K、E357K、K439D、K370D)。

接着，在单个细胞中进行两个载体的共表达实验。有趣的是，转染M和N显示野生型和CH3改造的Ig重链可与共同轻链一起在单个细胞中共表达，从而产生两种单特异性抗体的混合物，而不在混合物中存在不期望的双特异性抗体，但存在少至4％至5％的污染性“其他分子”。“其他分子”定义为不具有完整IgG的质量的所有分子，包括由单重链和轻链对组成的半分子。重要的是，部分“其他”不包括双特异性产物。在转染M中，当转染相等比率的载体DNA时，AA∶BB的比率接近1∶1。然而，转染N导致AA∶CC的比率几乎为10∶1。因此，用调整比率的DNA重复该转染(转染U)。事实上，载体DNA I∶III的1∶5的比率使混合物中AA∶CC抗体产物的比率相等，趋于接近1∶1的比率。因此，转染M和U表明可在无不期望的副产物的情况下(即，不大量存在AC或半分子A或C)，在单个细胞中表达两种不同的基本纯的单特异性抗体(图5)。构建体4和5的新CH3修饰显著不同于野生型CH3，使得野生型和4或野生型和5之间不发生异二聚化，这有利于从单个细胞大规模产生单特异性抗体混合物的应用。

与这些结果类似，同样预期两种不同的CH3改造的Ig重链的转染(构建体4和5)仅导致两种不同单特异性抗体的混合物，而不存在其他不期望的种类。推断，构建体4的CH3修饰与构建体5的CH3修饰显著不同，使得不发生异二聚化。在此情况下，构建体4和5的CH3改造的重链连同野生型CH3重链一起在单个细胞中的共表达仅导致3种单特异性抗体。

事实上，观察到情况正是如此，即发现，还可通过在单个细胞中表达三种不同的Ig重链(设计成形成同二聚体而非异二聚体)与共同轻链一起，来获得三种纯单特异性抗体的混合物，并且混合物中不存在污染物质(转染O)(图6)。由表3可知，采用在转染O期间使用的相等比率的载体DNA，未获得1∶1∶1比率的AA∶BB∶CC抗体。使用改变的载体DNA比率(1∶1∶10，转染V)的转染证明了混合物中AA∶BB∶CC的比率可被控制朝向预期的比率。

总之，这些实验表明两种或三种基本纯的单特异性抗体可在无不期望的副产物的情况下在单个细胞中表达，有利于大规模产生治疗性单特异性抗体的混合物。

实施例11：来自单个细胞的两种双特异性抗体的混合物

鉴于其他地方已报道过CH3改造的重链用于产生单一双特异性抗体的用途，本实验设计成研究从单个细胞产生2种不同双特异性抗体的混合物是否可行。

将具有已知特异性并已知能够与人IGKV1-39轻链(图3)配对的抗体VH区用于再克隆至包含表1中的构建体1至3或6至7的载体中，从而得到载体IV至X(表4)。随后，将载体IV至X单独转染至细胞中以证明完整单特异性抗体的形成受到限制，或与另一构建体载体组合转染至细胞中以获得双特异性抗体或两种双特异性抗体的混合物，所述载体IV至X的每个包含编码共同的人轻链以及具有不同CH3区和不同VH特异性的Ig重链的核酸序列。表5示出了转染方案和结果。

表4：不同构建体中插入的VH特异性

表5：

先前已证明，由构建体1和2编码的CH3改造的Ig重链在单个细胞中单独表达时仍能够形成同二聚体(WO2009/089004)。然而，WO2009/089004还报道改造成包含三元电荷对突变的CH3结构域(例如构建体3中存在的CH3结构域)，当其单独表达时不再能够形成同二聚体。

在本研究中，这些发现仅部分确认。事实上，除了高比例的未配对半分子之外，转染B、C和D的结果还证明存在全IgG，从而证明由构建体1和2编码的CH3结构域中部分同二聚化。除了未配对的半分子外，转染E和F还导致产生全IgG，从而证明构建体3的三元电荷突变不完全限制同二聚化。进一步证明构建体6和7的“结”和“孔”CH3变体也形成同二聚体(18％同二聚体是“结-结”，42％同二聚体是“孔-孔”)。

优选当其单独表达时完全避免同二聚化的CH3变体，以便当其与第二CH3变体共表达进行异二聚化时避免或最小化不期望的副产物(同二聚体)。

有趣的是，本实验首次证明还可以在单个细胞中表达双特异性抗体的混合物而使混合物中几乎无同二聚体。转染K和L清楚地表明确实获得预期的双特异性种类BC+AB(在转染K中为38％+47％，在转染L中为16％+60％)。在两种转染中，均观察到相对高百分率的不期望的半分子(转染K中为15％半分子A+半分子C，转染L中为24％半分子A+半分子C)。仍染存在的相对高百分率的半分子归因于由于匹配对中重链表达不平衡而引起载体IV中具有少量的匹配重链。因此，在转染S和T中，用调整比率的载体DNA(2∶1∶1)重复转染。这导致等量的构成匹配对的IgG重链，以及不存在半IgG分子，存在少至3％同二聚BB的双特异性IgG的纯混合物。理想地，污染性单特异性产物的这种低比例应降低至基本为0。因此，期望发现可导致双特异性抗体混合物中存在最少污染性单特异性抗体的的另外的CH3突变体。

本研究首次证明可在单个细胞中产生识别3种不同靶表位的两种双特异性抗体的基本纯混合物，并且混合物中存在最少的单特异性抗体。

实施例12：多种混合物

如已证明的，从单个细胞产生识别3种表位的2种双特异性抗体的混合物，或从单个细胞产生2或3种单特异性抗体的混合物在技术上是可行的，我们接下来探索可控地产生多种其他混合物的可行性。将具有已知特异性并且已知能够与人IGKV1-39轻链配对的第四抗体VH区用于再克隆至包含表1中的构建体1至3或7的载体中，从而产生载体I’、II’、III’或X’(’指不同的特异性，相比较于对应的载体编号)。随后，将得到的载体I’至III'、X’和IV至IX与其他构建体载体组合转染至细胞中以获得双特异性和/或单特异性抗体的多种混合物，所述载体I’至III’、X’和IV至IX的每种包含编码共同的人轻链以及具有不同CH3区和不同VH特异性的Ig重链的核酸序列。从单个细胞获得的多种混合物包括识别4种表位的2种双特异性抗体的混合物、2种双特异性抗体和一种单特异性抗体的混合物或1种双特异性和一种单特异性抗体的混合物。表6示出了转染方案和预期结果。

表6

尽管，从理论上，所有混合物的产生应为可行的，但是由其他人先前的工作可知大规模产生经典的结进孔变体受不稳定问题的限制。因此，预期由转染ZA、ZB、ZL、ZM和ZN产生的混合物当转移到更大的规模化生产时会具有问题。

由于，已报道结进孔变体不稳定，并且不能排除包含“结”或“孔”的CH3结构域与带电变体或野生型CH3结构域形成二聚体，因此，表1中存在的构建体的当前组不允许以更大规模从单个细胞产生所有理论混合物。因此，期望设计新的CH3变体，其被改造成优先仅形成同二聚体或异二聚体，并且其不与表1中的构建体1至5形成同二聚体或异二聚体以能够在单个细胞中共表达。

实施例13：鉴定新电荷对突变体

本研究目的是改造IgG CH3区，从而当不同IgG重链在单个细胞中混合表达时导致仅产生异二聚体或仅产生同二聚体，其中新改造的CH3结构域不会与已知改造的CH3结构域或野生型CH3结构域形成同或异二聚体。因此，作为鉴定符合标准的新的经改造CH3结构域的第一步，IgGCH3结构域中的许多界面接触残基被逐个地或成组地扫描，寻找可通过静电相互作用而导致相同重链排斥的替换，即，降低同二聚体形成的替换。目的是获得这样的一系列残基，当其被带电残基替换时，导致相同链排斥，使得当不同的IgG重链混合表达时，这些突变可用于驱动同和/或异二聚体形成，由此使获得的全长IgG稳定并且以高比例产生。随后，通过改造一个或更多个IgG重链中CH3残基的匹配对(CH3区)，使用鉴定的替换来产生双特异性抗体或双特异性抗体或单特异性抗体的混合物。此外，新鉴定的电荷突变体对可与已存在的对组合，使得编码所有均携带不同的互补CH3突变的不同重链的多种核酸分子可用于在细胞中表达，从而可优先获得仅单特异性抗体或仅双特异性抗体的混合物，或限定的单特异性抗体和双特异性抗体的混合物。本研究中的待测试残基为先前确定的接触残基(Deisenhofer J.，1981；Miller S.，1990；Padlan，1996，Gunasekaran，2010)。该方法的基本原理是将排斥电荷改造到接触残基的每个可用对中。然后，在非还原SDS-PAGE上分析样品以确定降低二聚体形成的对，如显现存在约72kD的条带。根据该方法，由于一个非匹配对之间的排斥静电相互作用可足以或不足以产生足够量的半分子用于检测，作为单突变或与单其他突变组合来筛选所有可用对，并将突变组合。

根据表7，通过Geneart，将氨基酸替换引入构建体载体MV1057中，并且根据标准方法，通过转染至HEK293T细胞中进行构建体的表达。在Octet中测量IgG表达水平。当两次不能产生，则认为突变不利于表达，并且该突变不再进一步研究。

表7：制备的多种构建体中氨基酸替换的列表(EU编号)

在SDS-PAGE中分析包含＞5μg/ml IgG的上清，并利用蛋白质A纯化IgG。利用胶体蓝对蛋白质染色。同二聚体作为约150kD的条带可见。更小的约75kD的条带表示存在半分子(参见阴性对照：K392D和K409D)。印迹示出在图7中。

如表7右手列所示，分析SDS-PAGE凝胶结果并评分。认为许多残基有希望在组合中进行进一步测试，包括残基Q347、S354、Y349、L351、K360、T366、T394和V397。该选择基于在抑制同二聚体的形成中的的高得分以及可进行修饰而不引起问题的接触残基的可用性，例如，其他非互补电荷。例如，已知残基F405和Y407在CH3-CH3界面具有多种相互作用，包括与已带电残基的相互作用，在这些相互作用残基中引入多种电荷突变后，所述相互作用可能具有问题(参见表A)。在载体MV1057中产生新构建体(表8)，并将具有已知特异性并且已知能够与人IGKV1-39轻链配对的抗体VH区用于再克隆至包含这些新构建体的载体中(参见表9)，使得可进一步测试组合。表10示出了转染方案和结果。

表8：

表9：不同构建体中插入的VH特异性

表10：

表达CH3变体组合，并在SDS-PAGE中(数据未示出)和本性质谱(MS)中分析。结果总结于表10中。ZO转染导致混合物中最高比例的异二聚体(69％AC)。有趣的是，在ZO转染中，不存在AA同二聚体，而包含小比例的CC同二聚体(7％)。质谱分析揭示了混合物中剩余的蛋白质由半A分子组成，其可能来自于A和C重链的不等表达。来自转染样品ZO的原始MS数据示出在图8中。

令人惊讶的是，尽管转染ZO导致相当量的双特异性产物，但是转染ZP的逆转电荷对(ZO的L351K/T366'D对T366K/L351’D)并未导致类似的结果，仅观察到52％的双特异性产物，其中相当量的两种同二聚体(30％AA和13％CC)。这种情况的解释是，带负电荷的D在结构上接近类似于T，因此，T366D可能不足以有效地排斥自身，因此，T366D仍形成同二聚体，与实际观察到的一样。

可设想，新发现的T366K/L351’D对的微小变体(例如，通过测试所有置换，包括新构建体T366R和L351E)可导致类似百分率的BsAb。

实施例14：HADDOCK用于设计新CH3突变体以驱动有效异二聚化

如实施例13中所述，新发现的电荷对T366K/L351’D增加了混合物中异二聚体的比例(69％)，其中小部分为不期望的CC同二聚体(7％)(L351D/L351’D)，并且具有相当部分的半A分子(24％)“污染性”混合物。在该实施例中，使用计算机模拟(in silico)方法以进一步加深对CH3界面相互作用涉及的氨基酸残基的了解，从而测试相对CH3区中的互补替换并发现包含互补替换的新CH3对，其进一步提高有效地异二聚化，而避免两条重链有效形成同二聚体。

HADDOCK(高模糊性驱动的蛋白质-蛋白质对接(High Ambiguity Drivenprotein-protein DOCKing))是用于制作生物分子复合物模型的信息驱动的灵活对接方法。HADDOCK自身与从头计算对接法的区别在于以下事实：HADDOCK编码来自不明确的相互作用限制(ambiguous interaction restraints，AIRs)中已确定的或已预测的蛋白质界面的信息以驱使对接过程(de Vries等，2010)。

HADDOCK网络服务器的输入由蛋白质结构文件组成，其可为晶体结构、NMR结构簇或模型化结构。对接或精化后，HADDOCK返回所谓的HADDOCK得分，其为VanderWaals能、静电能、包埋表面积能和去溶剂化能的加权平均值。虽然常常难以获得实验数据的直接翻译，但是HADDOCK得分可解释为表示结合能或亲和性。除此之外，HADDOCK提供由对接运行产生的“前四”结构的结构文件。这些结构文件可下载并被可视化，使得能够详细分析各残基的相互作用。

在该实施例中，对IgG1重链的CH3结构域之间的相互作用进行了研究。使用IgG的Fc部分的高分辨率晶体结构(结构1L6X)作为起始结构。(http：//www.resb.org/pdb/explore.do？structureId＝116x；Idusogie，E.E.等，J.I.2000(164)4178-4184))。

在实施例13中，发现载体XIII和XVI的共转染导致形成CC同二聚污染物(表10)。使用HADDOCK以搜索避免同二聚化的T366K/L351’D对的另外突变。

HADDOCK的输出由计算的能量、HADDOCK得分(能量的加权平均值)和四个结构文件的组组成，所述四个结构文件对应于程序发现的四个最低能量结构。HADDOCK得分用于比较不同结构；其他能量仅用于获得结构中正发生什么的指示(例如，好的静电相互作用、更小的包埋表面、较高的范德华能)。HADDOCK得分越低越好。对于每个突变对，计算AA、AB和BB二聚体的得分。

在HADDOCK中分析来自实施例12的突变对组以观察计算的能量是否与实验数据相关。表11示出了图9中可见的所有理论能量。

表11：

＊由于高VanderWaals能得分，该值一般较高，可能归因于T366W/T366’W的空间位阻(steric clash)。

对于2种野生型CH3结构域，由于A和B CH3区域相同，AA、AB和BB的HADDOCK得分相同。在大多数其他情况下，AB对得分最低，与预期一样。对于T366K/L351D对，BB得分略优于AB得分(-210.6对-212.5)，但是，所述差异在计算误差内。利用HADDOCK可见这些对的异二聚体结构。例如，构建体组合1-2、1-1和2-2示出在图10中。由这些视觉化图像明显可以看出，异二聚体中形成盐桥(图10A左手图)，而相同链的残基之间存在静电排斥(图10B和C，中间和右手图)。因此，可通过突变的界面残基的静电排斥来解释同二聚体较高的HADDOCK得分。这些残基彼此远离弯曲，并且不与另一条链上的残基相互作用，导致亲和性下降。

表11和图9确认了实施例13中观察到的结果。T366K/L351’D AC异二聚体和L351D/L351’D CC同二聚体以类似的能量形成，解释了混合物中异二聚体和同二聚体的存在。另一方面，尽管存在T366K半A分子，但是T366K/T366’K AA同二聚体在混合物中几乎检测不到。表11和图9实际上显示T366K/T366’K AA同二聚体的HADDOCK得分高于AC异二聚体的得分，因此该同二聚体的形成在能量上是不利的。

实施例15：366/351变化

在实施例13中，假设可设计T366K/L351’D突变体电荷对的替选，就混合物中双特异性抗体的百分率方面而言，其可具有类似的结果。替选可包括替换T366R、T366D、T366E、L351E、L351K和L351R。L351D/L351’D的CC同二聚体的比例可通过产生366/351对的变体来降低。在HADDOCK中，分析所有可能的突变对，将得到的分数示出在表12中，并在图11中可视化。

表12

当查看HADDOCK得分时，观察到当与T366K/L351，D相比时，突变中的一些具有类似的“模式”。对于大多数置换，发现AA同二聚体比AB异二聚体具有更高的HADDOCK得分，但是BB同二聚体似乎与AB异二聚体一样有利。尽管已知351残基为另一链上的自身的“邻居”，即，在CH3-CH3界面，链A的残基351与链B的残基351配对，但是当形成BB二聚体时，几乎不存在该相同电荷的负影响。查看L351D/L351’D结构，上述情况通过彼此弯曲远离的天冬氨酸、在至少355位天然存在的精氨酸的稳定化影响以及通过354位天然存在的丝氨酸的负电荷的同样一些稳定化来解释(参见图12A)。这些残基的突变(S354A和R355D)仅提供了很小改善。由图12B清楚可见，A354的骨架-氢导致同二聚体的稳定化。对于双特异性分子，来自该系列的HADDOCK得分最低的T366R/L351’E对似乎最有利。

实施例16：T366K/L351’D附近的突变

在该实施例中的HADDOCK分析系列中，将T366K/L351’D或T366K/L351’E对用作起始结构。将B链上另外的突变用于计算HADDOCK得分和能量，以鉴定能进一步增加这些A链和B链的双特异性的预测百分率的另外突变。当利用用于在分子水平可视化蛋白质结构的观察器(YASARA，www.yasara.org)研究CH3结构域的结构时，可计算各残基之间的距离。在如此做的同时，观察到两个残基Y349和L368为对二聚体相互作用具有正面或负面影响的邻近残基，并且在该实施例中，除L351D突变外，该残基也均已突变，以研究关于同和异二聚体的二聚体形成的结果(参见图13)。两个残基似乎均增加了异二聚体的稳定性(较低的HADDOCK得分)，同时增加了BB二聚体的不稳定性(较高的HADDOCK得分)。349和368位上的谷氨酸(E)似乎比天冬氨酸(D)更有利。因此，在已包含351位的氨基酸替换的B链中引入第二氨基酸替换似乎更有利于异二聚化。

在下组HADDOCK分析中，将T366K/L351’D对再次用作起始结构。除B链中进一步增加异二聚化的替换(即，Y349D/E和L368E)外，向已包含T366K替换的A链添加另外的突变。如图14所示，存在若干突变对似乎有利于双特异性异二聚体的形成。在T366K-L351K/L351’D-Y349’D对中，所有四个突变残基均参与异二聚体配对，但是T366K-L351K/L351’E-L368’E的情况不是这样，其中K351不直接参与结合。然而，该后者异二聚体的HADDOCK得分为-228.9，显著低于T366K/L351’E-L368’E的-214.2，这可通过351位K的氢键键合的相互作用解释(参见图15)。T366K-L351K/L351’D-Y349’D对可通过B链中的R355'D突变进一步改善，这导致更高的BB-HADDOCK得分，但同时AB HADDOCK得分略微更高。总的来说，与A链中的单独T366K突变相比，另外的L351K导致更低的AB得分以及类似的AA和BB得分。在理论上，这将导致样品中更高量的双特异性异二聚体。

由图11显然的是，366位为R比为K可更有效地驱动异二聚化。因此，重复图13中示出的一些HADDOCK分析，但是现在利用A链中的T366R而非T366K。证明了，将A链中的R366与B链中的双突变组合是不利的(图16)。这可能归因于该残基的尺寸较大，干扰其他界面相互作用，即使所有预期的与R366的盐桥均存在于结构中。同样，对于R366，AA同二聚体的HADDOCK得分低于对于K366的得分，这同样对异二聚体的形成具有不利影响。因此，未利用界面中的R366进行进一步HADDOCK分析。

根据HADDOC预测，选择总共14个最佳表现对(参见表13和图17)。在一些对中，包括了R355D替换以消除L351/L351’D相互作用上的天然存在的R355的稳定化影响。

表13：

实施例17：利用基于HADDOCK预测的CH3突变体，体外表达双特异性

实施例16中的分析表明在T366K/L351’D对的周围具有另外突变的一些CH3变体产生的混合物具有较高比例的双特异性组分以及潜在较低比例的同二聚组分。选择这些最佳表现对用于生产和进一步分析。此外，还产生构建体T366R和L351E。表14列出了产生的构建体，将其用于再克隆具有已知特异性并且已知能够与人IGKV1-39轻链配对的抗体VH区。包含各构建体的IgG的表达先前在实施例13中报道过，并用表14中列出的构建体重复该表达。目的是评价构建体中的哪一个可在不存在匹配的异二聚化伴侣的情况下同二聚化。理想地，将形成高百分率的半体和低百分率的同二聚体。作为对照，还将包含先前报道的电荷突变的构建体以及包含先前报道的结进孔突变的构建体用于通过重组细胞表达为完整IgG。在SDS-PAGE中分析蛋白质A纯化的上清，如表14所示，分析结果并评分。

表14：

CH3中的氨基酸替换	构建体#	IgG％	半分子％
				E356K，D399K	1	64.2	35.8
K392D，K409D	2	30.9	69.1
				K392D，K409D，K439D	3	24.5	75.5
T366W	6	27.6	72.4
				T366S，L368A，Y407V	7	58.6	41.4
T366K	43	32.9	67.1
				L351D	63	89.8	10.2
T366D	64	89.6	10.4
				T366K，L351K	68	34.7	65.3
L351D，L368E	69	83.7	16.3
				L351E，Y349E	70	67.8	32.2
L351D，Y349E	71	79.7	20.3
				L351D，R355D	72	100	-
L351D，Y349E，L368E	73	79.3	20.7
				L351D，Y349D	74	88.6	11.4
L351D，Y349D，R355D	75	89.9	10.1
				L351K，L368K	76	56.6	43.4
L351R	77	100	-
				T366E	78	44.4	55.6
T366R	79	29.6	70.4
				L351E	80	100	-

共同轻链与携带表14中所示构建体的氨基酸替换的两种不同重链或携带先前构建体的氨基酸替换的重链的共表达结果示出在表15中。分别包含氨基酸替换T366K和L351’D：L368'E的两种不同重链的表达导致混合物中约87％的双特异性AB异二聚体，其中不存在AA或BB同二聚体(表15的组合nr. 3)。观察到约12％的半分子(半A)包含T366K替换。此外，当在第一重链中引入另外的氨基酸替换L351K时，发现双特异性AB异二聚体的百分率有所增加。例如，分别包含氨基酸替换T366K：L351K和L351'D：L368'E的两种不同重链的共表达导致约92％的双特异性AB异二聚体，而AA和BB同二聚体基本上不在混合物中存在(表15的组合nr. 12)。组合10和11同样导致有利分布，具有高百分率的异二聚体，并且几乎不存在同二聚体。不存在同二聚体是有利的，因为包含完整IgG分子的部分仅由AB异二聚体构成。对于纯化以及随后的治疗应用，半分子可通过标准方法(例如，尺寸排阻色谱法)去除。因此，在产生双特异性抗体的生产过程中，应用这些新鉴定的电荷突变体比不排除“污染性”同二聚体抗体的存在的已知电荷突变体和结进孔突变体提供更多优点。此外，与先前所述E356K：D399K/K392’D：K409'D和E356K：D399K/K392’D：K409’D：K439'D电荷逆转对相比，T366K/L351’D：L368’E和T366K：L351K/L351’D：L368’E电荷对的另外优势在于：先前所述电荷变体是基于CH3-CH3界面内已有电荷的逆转，而新鉴定的电荷变体为向CH3-CH3界面添加另外的电荷对(电荷-电荷相互作用)。在CH3-CH3界面中引入另外电荷对可进一步增加界面的稳定性，并由此增加完整抗体的稳定性。同样适用于组合nr.4、5、6、9、10和11中使用的突变，其同样导致混合物中有利比例的双特异性异二聚体，其中存在极低比例的AA和BB同二聚体。

表15：

＊链A携带MF1337的特异性(＝破伤风类毒素)；＊＊链B携带MF1122的特异型(＝纤维蛋白原)

本性MS

在所有双特异性样品上进行本性MS。以下列两种方式分析获得的图表以确定存在的种类的相对比例：通过峰高和通过峰面积。峰面积是更科学正确的分析方式，但是由于其他研究先前的所有分析均是基于峰高，所以出于比较目的，两种方法均包括在分析中。方法间的差异在测量误差内，因此，仅峰面积值用于进一步测量。两个代表性谱图示出在图18中。结果概述通过图表示出在图19中，数值可在表15中找到。在约一半的样品中，单特异性IgG的总污染物低于5％，并且仅在3例中，该值＞10％，而对于wt IgG，预期在混合物中发现约50％的单特异性IgG。

从表15选择10个2种不同重链组合的组用于进一步分析。这十个组合包括组合1、2、3、4、5、6、9、10、11和12(表15)。这些十个的选择基于通过nMS确定混合物中存在低百分率的同二聚体，但也基于其总体物理化学特异性，包括产量、SDS-PAGE以及CH3结构域中存在的突变数目。

实施例18：IgG稳定性分析

在本研究中，可针对IgG分子的Fc部分的稳定性，对一系列CH3突变对进一步分析，所述突变对导致完整IgG部分(fraction)中具有高比例的双特异性异二聚体和极少量(＜5％)的亲代IgG。用于促进重链异二聚化的突变的CH3结构域可对IgG的Fc区具有预期之外的不稳定影响，其可导致不期望的特性，例如，体内半衰期降低，效应功能降低和/或免疫原性增加。将新鉴定的电荷对和野生型双特异性以及包含先前鉴定的电荷突变的双特异性(链A包含构建体1，链B包含构建体2)进行比较。本研究中，所有双特异性分子均包含相同的重链和轻链可变区，确保观察到的影响由分子Fc部分中的突变而非由可变区中的变化引起。

在这些双特异性上进行一系列稳定性研究。这些研究包括光谱分析(UV-Vis吸收、荧光和光散射)和显微分析(用尼罗红染色的光学和荧光显微术)，从而提供关于CH3变体聚集状态的信息。

用双光束、两个单色仪的Cary 300 Bio分光光度计于25℃记录UV-Vis吸收光谱。利用1cm的通路(path)长度监测250nm至400nm的光谱。在320nm和更长波长的吸收提供了关于IgG聚集状态的信息。

利用FluoroMax分光荧光计，于25℃下监测固有荧光光谱。对荧光方法进行优化。荧光发射提供关于构象和聚集特性的信息。利用FluoroMax分光荧光计，通过在400nm和750nm之间运行积分时间为0.01秒的同步扫描(λ_em＝λ_eχ)于25℃监测90°光散射光谱，。对激发和发射狭缝进行优化。例如，直角光散射可辨别无和具有5％二聚体的IgG样品。

对于用尼罗红染色的荧光显微术，在临测定前，向样品添加尼罗红乙醇溶液。将样品充满显微镜载玻片，并通过荧光显微镜分析。对颗粒计数。通过荧光显微镜可观察到的颗粒的尺寸下限是约0.5μm。

在蛋白质上施加应力(stress)，例如温度、pH和机械应力或变性剂可导致构象变化(例如，解折叠)和/或聚集。如先前所报道，电荷改造的双特异性抗体降低经修饰CH3的解链温度(Gunasekaran 2010)，这些研究目的在于区别本发明的新的电荷突变体和存在的已知电荷突变体。

用蛋白质A生物传感器且通过利用与IgG结合的FcRn，使用Octet探索热稳定性研究。利用PCR机器，在4、50、55、60、65、70和75℃下，以100ug/ml(PBS中)的浓度，孵育样品1小时，以检测CH3改造的IgG的热稳定性。接下来，经15分钟时间，将样品慢慢冷却至25℃，并保持在该温度2小时，随后，将其在4℃下贮存过夜。通过离心去除沉淀抗体，其后，利用蛋白质A生物传感器，通过Octet确定可溶性抗体的总IgG浓度(在PBS中稀释为1/10)。使用Octet，对测量CH3改造的IgG与FcRn的结合的试验进行探索。将蛋白质L生物传感器用于使IgG的轻链与传感器结合，接着与溶液中的FcRn孵育，或将抗-五-组氨酸生物传感器用于结合组氨酸标记的FcRn蛋白质，接着与目的IgG孵育。这些方法可比使用蛋白质A生物传感器更灵敏，并且还可用于热稳定性研究。此外，分析所有样品的血清稳定性。简要地，于37℃下，在人血清中孵育(经改造的)IgG样品，将对照样品保持在4℃。1、2、3和4周后，离心样品以去除沉淀的IgG。随后，在抗原特异性ELISA中滴定样品以确定功能性IgG的相对量。使用人血清中新鲜掺入的纯化对照抗体作为参考。

实施例19：稳定性分析

在先前实验中，通过包含CH3突变的两种不同重链和共同轻链的共表达获得高百分率的双特异性抗体(实施例17)。

从表15选择八个2种不同重链组合的组用于进一步分析。这些八个组合包括组合3、4、5、6、9、10、11和12(表15)。在本研究中，分析这些八个组合，重点关注IgG的Fc部分的稳定性。作为对照，包括了野生型双特异性(即，无CH3突变)和/或基于先前已报道的CH3电荷突变的双特异性。注意，对于野生型双特异性，在不使用用于优先趋向异二聚体的手段的情况下，使2种重链和共同轻链共表达。因此，这些“野生型双特异性”表示AA、AB和BB的混合物。在本研究中，所有双特异性设计成携带相同的VH/VL组合，确保观察到的影响是由分子Fc部分中的突变而非Fab部分中的变化导致。

假设，用于促进两种不同重链的异二聚配对的突变对可与对IgG的Fc区产生预期之外的结构或其他不稳定影响相关。由于存在这些突变，随后这将导致不期望的问题，进一步限制临床开发，例如，降低体内半衰期、降低效应功能和/或增加免疫原性。

热稳定性

施加应力，例如，增加或降低温度，可导致构象改变(例如，解折叠)和/或蛋白质聚集。利用PCR机器，在4、60、62.5、65、67.5、70和72.5℃下，以100μg/ml(PBS中)的浓度孵育来自组合3至6和9至12(表15)的双特异性分子以及野生型双特异性分子和在使用构建体1和2(E356K：D399K/K392D'：K409D'组合，也称为“电荷逆转”对)时获得的双特异性分子1小时，以测定CH3改造的IgG的热稳定性。接下来，经15分钟的时间，将样品慢慢冷却至25℃，并保持在该温度2小时，其后，在4℃贮存过夜。第二天，通过离心去除沉淀的抗体(18,000rpm，4℃，20分钟)，随后，利用蛋白质A生物传感器，通过Octet确定可溶性抗体的总IgG浓度(在PBS中稀释为1/10)。结果示出在图20中。与野生型双特异性抗体(正方形)相比，观察到对照CH3改造的双特异性抗体(电荷逆转E356K：D399K/K392D'：K409D'组合(三角形))热稳定性降低。与野生型相比，来自组合3至6和9至12(菱形)的双特异性分子也显示热稳定性降低。然而，与对照CH3改造的双特异性抗体相比，三个组合明显显示稳定性改善。组合9、10和11的双特异性比其他CH3改造的(电荷逆转)双特异性显著更稳定，与在最高温度下测量的野生型双特异性一样稳定。

冻融稳定性

为了测定CH3改造的IgG分子在重复冷冻和解冻时的稳定性，将来自组合3至6和9至12(表15)的双特异性分子以及野生型双特异性分子和在使用构建体1和2(E356K：D399K/K392D'：K409D'组合，也称为电荷逆转对)时获得的双特异性分子暴露于十个随后的冷冻-解冻循环，其如下进行：将样品放置在-80℃至少15分钟，直至其完全冷冻。随后，在室温下将样品解冻。当样品完全解冻时，重复冷冻-解冻循环。10个冷冻-解冻循环后，通过离心去除沉淀的抗体(18,000rpm，4℃，20分钟)，其后，利用蛋白质A生物传感器，通过Octet确定可溶性抗体的总IgG浓度(在PBS中稀释为1/10)。重复冷冻-解冻稳定性测试三次。结果示出在图21中。观察到，与野生型双特异性相比，对照电荷逆转CH3改造的双特异性抗体的稳定性表现为轻微降低。相比之下，与野生型双特异性分子相比，来自组合3、4和9的双特异性分子的稳定性表现为轻微改善。总之，可得出结论，对CH3改造的变体来说，冷冻-解冻循环的严格条件不会引起重大的稳定性问题。

体外血清稳定性

在37℃下，于10％人血清中孵育来自组合3至6和9至12(表15)的双特异性分子，以及野生型双特异性分子和电荷逆转双特异性分子，以测定CH3改造的IgG在保持在37℃的血清中的稳定性。将对照样品保持于4℃下的人血清中。1、2或5天后，通过离心去除沉淀的抗体。随后，在纤维蛋白原特异性ELISA中滴定样品，以确定功能性IgG的相对量。使用人血清中新鲜掺入的纯化对照抗体作为参考。

纤维蛋白原ELISA数据表明所有样品在37℃的10％人血清中相当稳定地存在5天。在更低IgG浓度下，来自组合4和5的双特异性分子的稳定性似乎稍差，尤其在T＝1和T-2下，但是在该实验结束点时，仅具有最小差异(参见图22)。

实施例20：其他稳定性测试

使用另一系列的分析方法来评价变体IgG的稳定性。将来自组合3至6和9至12(表15)的双特异性分子以及野生型双特异性(AA、AB和BB)、各亲代抗体(AA和BB)和在使用构建体1和2(E356K：D399K/K392D'：K409D'组合(电荷逆转对))时获得的双特异性分子用作这些稳定性测定中的样品。将所有IgG稀释至0.2mg/ml，并施加若干应力条件(在50℃下2天，在40℃下2周，5×冷冻-解冻)，目的是能够区别不同样品。注意到，这些高应力水平导致这样的情况，其中所有双特异性中使用的亲代抗体之一(BB亲代，携带两个1122Fabs)变得不稳定。在50℃下2天时，通过UV吸收检测该蛋白质的聚集。这表明该应力条件不可区别双特异性中Fab和CH3的不稳定性，由50℃孵育得到的数据应谨慎使用。

结果总结于表16中。使用的分析方法包括：

-利用尼罗红(表16中“尼罗红颗粒”)的荧光显微术；以观察添加尼罗红染料后颗粒＞0.5μm的量。

-350nm处的UV光谱测定法(“UV 350nm”)；波长＞320nm下吸收中的变化给出关于蛋白质聚集状态的信息。

-400nm处的90°光散射(“LS 400nm”)；观察蛋白质聚集中改变(例如，单体和IgG二聚体之间的差异)的灵敏技术，。

-固有荧光；在环境改变时(例如，解折叠)，蛋白质中芳香族残基的荧光波长最大值和强度改变。

-1，8-ANS荧光光谱学；1，8-ANS通过静电相互作用与阳离子基团结合，形成离子对，并且可检测蛋白质结构和/或构象中的变化。

UV-VIS光谱学

用来自Varian的双光束、两个单色仪Cary 300 Bio分光光度计，于25℃下，在不同石英比色杯(例如，路径长度为1.0cm的黑色低体积Hellma比色杯和0.2cm×1.0cm的透明Hellma比色杯)中测定UV-Vis吸收光谱。利用1.0cm的路径长度，监测220nm和450nm之间的光谱。280nm周围的吸收提供了关于蛋白质浓度的信息。320nm和450nm之间的区域可提供关于样品聚集状态的信息。

90°光散射

开发了90°光散射光谱法以研究蛋白质聚集，并如Capelle，2005；Demeule，2007a中所述进行该方法。利用FluoroMax分光荧光计(Spex，Instruments S.A.，Inc.U.K.)，通过在400nm和750nm之间运行积分时间为0.01秒的同步扫描(λ_em＝λ_eχ)，于25℃下监测90°光散射光谱。测试不同的狭缝设置以发现最优条件。优化后，将相同的狭缝设置用于所有测量。

稳态(Steady-state)荧光发射

色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基的荧光发射给出了关于这些荧光团局部环境的信息。测定疏水性和/或刚性(rigidity)中的变化或差异。一般，更疏水和严格的环境导致荧光强度增加和发射最大值蓝移。固有荧光光谱学可提供关于蛋白质当前状态的信息，并且监测物理和化学特性中的变化。关于酪氨酸和色氨酸荧光的更多信息可在Lakowicz的书[Lakowicz，2006]中找到。

于25℃下记录不同的石英比色杯中的荧光发射和激发光谱。样品在不同波长下被激发。优化积分时间和狭缝设置。优化后，将相同的积分时间和狭缝设置应用于所有样品。

用尼罗红染色的荧光显微术

开发了尼罗红染色方法以可视化蛋白质聚集，并按照Demeule等，2007b中所述进行该方法。

在装备有汞灯的Leica DM RXE显微镜(Leica Microsystems GmbH，Wetzlar，Germany)上进行显微术观察。用Sony NEX-5摄像机及其固件获取图像。物镜为10×、20×和40×。对于显微术检查，使用在载玻片和盖玻片之间具有0.1mm的固定距离。4x4网格的尺寸为1mm×1mm，相当于0.1μL。

1，8-ANS荧光光谱学

1-苯胺基萘-8-磺酸(1，8-ANS)为用于研究膜表面和蛋白质的不带电小疏水荧光探针(Mw 299.34Da)。

1，8-ANS在水中基本上是非荧光的，并且仅当与膜(量子产率-0.25)或蛋白质(量子产率-0.7)结合时，会变成明显荧光的。1，8-ANS的这种特性使其成为蛋白质折叠、构象改变以及其他修饰探针暴露于水的过程的灵敏指示剂。关于1，8-ANS的参考文献可在Molecular Probes，www.probes.com的互联网主页上找到。

利用FluoroMax分光计记录1，8-ANS的荧光发射光谱。不进行IgG之间1，8-ANS荧光的直接比较。每个IgG可具有不同数目的1，8-ANS结合位点，因此不能进行比较。原则上，荧光越低，越少的1，8-ANS分子与抗体结合。对由应力引起的1，8-ANS荧光强度和发射波长中的改变进行评价。

表16：稀释至0.2mg/ml后，各IgG样品上不同强制降解结果的概述。单元格的颜色表示T＝0和施加应力后之间的变化：暗灰色＝较大变化，浅灰色＝小变化，无色＝无变化(＝稳定)。

＊“组合#”指表15中所列突变的组合；＊＊通过荧光显微术的非常小的颗粒，这些颗粒的相关性未知；2d4℃＝4℃下2天；2d50℃＝50℃下2天；2w4℃＝4℃下2周；2w40℃＝40℃下2周；T0＝实验起始；5FT＝5个冷冻解冻循环

总之，这些数据表明，各IgG样品显著稳定。需要若干苛刻的应力条件(例如，50℃下2天)以在测试样品间产生可测定的差异。在这些条件下，组合#9和#10的样品似乎聚集超过其他样品。

对于蛋白质间的稳定性，最大区别因素是冷冻-解冻循环和温度上升。将50℃下孵育的非常严格的应力因素考虑在内，T366K/L351E，Y349E(组合#4)和T366K，L351K/L351D，Y349E(组合#11)变体为组内两种最稳定的蛋白质，紧接着为T366K，L351K/L351D，Y349D(组合#10)和T366K，L351K/L351D，L368E(组合#12)。

实施例21：比率实验的本性MS；转染比率为1∶5至5∶1

进行更详细的比例实验以更多地了解CH3突变的IgG，特别是T366K：L351K/L351D'：L368E'组合(从现在开始称为KK/DE或DEKK)在不对称(skewed)转染混合物中的行为。

将先前使用的已知能够与共同人IGKV1-39轻链配对的抗体VH区用于再克隆至构建体1、2、68和69，从而产生表17的载体I至V。随后，以表18中所示的不同转染比率将载体I至V转染到细胞中，所述载体I至V的每个包含编码共同的人轻链以及具有不同CH3区和不同抗原特异性的Ig重链的核酸序列。结果示出在图23中。

表17：

表18：

转染nr	载体	比率
			1	I和III	5∶1
2	I和III	3∶1
			3	I和III	1∶1
4	I和III	1∶3
			5	I和III	1∶5
6	II和III	5∶1
			7	II和III	3∶1＊
8	II和III	1∶1
			9	II和III	1∶3
10	II和III	1∶5
			11	IV和V	5∶1
12	IV和V	3∶1
			13	IV和V	1∶1
14	IV和V	1∶3
			15	IV和V	1∶5

＊由于技术错误，该样品未测定。

图23A和B表明，在所有情况下，对于DEKK突变组合，当存在过量的A或C时(A或C在“DE侧”上，B在“KK侧”上)，形成AB或BC，但是剩余的A或C作为同二聚体和半体的混合物存在。然而，当存在过量B时(B在“KK侧”上，A或C在“DE侧”上)，存在明显差异。仍形成AB或BC，但是剩余的B基本上不作为同二聚体存在，仅形成半体。通过峰高Nota bene再次测量百分率：在2％或更低范围内检测到的峰低于应用nMS技术可精确测量的阈值。因此，将＜2％的测量值视为处于分析的噪音水平内，并因此被忽略。令人吃惊的是，过量的B仅导致较高百分率的半体B。尤其是在A∶B的比例为1∶3和1∶5时，在不存在同二聚体BB的情况下，观察到较高百分率的半体B(图23A和23B)，表明KK侧上的CH3突变不利于同二聚化。不存在同二聚体提供关键优势，因为DEKK组合的该“KK侧”可被选来引入特异性，当其作为同二聚体存在时，可能具有已知的不利影响(例如，已知，当作为二价同二聚体存在于治疗组合物时，cMET或CD3抗体具有不期望的不良副作用)。

对于不同的DE∶KK比例，观察到的发现与载体IV和V中的对照电荷逆转CH3突变相反。图23C表明，在所有情况下，对于E356K：D399K/K392D'：K409D’突变组合，当存在过量A时(A在“K392D：K409D侧”上)，剩余的A以同二聚体和半体的混合物存在，但是同样地，在所有情况下，当存在过量B时(B在“E356K：D399K侧”上)，剩余的B以同二聚体和半体的混合物存在。甚至在更高比例1∶3和1∶5下，未观察到半体B，但是存在同二聚体，这表明E356K：D399K侧不如DEKK组合的KK侧那样地不利于同二聚化。

总之，DEKK突变组合提供超过电荷逆转CH3突变的明显益处，在于异二聚体的链之一不形成同二聚体。

实施例22：利用DEKK组合的多种混合物

由于已证明DEKK突变组合驱动形成高纯度的双特异性IgG分子(“AB”)，接着我们探索可控制地从一个细胞产生更复杂的抗体混合物(例如，“AB和AA”或“AB和AC”混合物)的可行性。将先前使用的模型Fabs引入包含“DE构建体”或“KK构建体”的载体中，并使这些载体的多种组合共表达以产生混合物，从而证明该技术的多功能性。模型Fabs MF1337(破伤风类毒素)、MF1122(纤维蛋白原)和MF1025(甲状腺球蛋白)的选择基于其总体稳定的表现、良好表达水平以及包含这些Fabs的IgG间的质量差(参见表19)。

表19：

特异性	Fab名称	IgG质量	Δ质量MF1122
				破伤风(A)	(MF)＊1337	146747.03	+1842.05
纤维蛋白原(B)	(MF)1122	144904.98	0
				甲状腺球蛋白(C)	(MF)1025	144259.87	-645.11

＊MF＝Merus Fab，名称，例如，MF1337和1337，均交换使用。

表20：转染方案：

SDS-PAGE分析证明，大多数样品主要由全IgG组成，在一些情况下，存在小百分率的半体。此外，在非还原凝胶上，很多样品在ca.150 kDa处显示出两条带，反映出样品中存在两种不同IgG种类。同样在还原凝胶上，两条重链条带可见于一些样品中(数据未示出)。

在所有样品上进行本性MS，并根据峰高计算观察到的种类的百分率(在表20中观察到的种类％)。结果示出在图24中。在三种重链共表达的全部八个样品中，观察到与预期种类相对应的两个主峰。在这些样品中的两个样品(转染2和4)以及转染11中，观察到少量的污染DE-DE同二聚体。在大多数样品中，检测到很少量的半体(少于2％)，如前所述，所述半体不会成为问题，因为它们可容易地与全长IgG部分分离。在nMS之后，发现样品11中观察到的IgG质量对应于不同的种类，而非预期的，推断这归因于转染错误，即，在样品11中，显然1025-DE与1337-KK，而非1122-KK共转染。

在夹层ELISA中进一步测试IgG样品，以确认期望特异性的功能性存在。用纤维蛋白原或甲状腺球蛋白完成ELISA板的包被，并利用荧光素标记的甲状腺球蛋白或破伤风类毒素进行检测。根据生产商的使用说明，用荧光素标记检测抗原(Pierce NHS-荧光素抗体标记试剂盒，目录号#53029)。随后，可通过FITC缀合的抗荧光素抗体(Roche diagnostics，目录号#11426346910)检测荧光素标记的抗原。

双特异性ELISA的结果(OD450值)总结于表21中。灰色单元格表示每个转染的预期种类。概括地说，结果符合预期结果，除了斜体或黑体所示的以外。转染1至3中，对种类BC(tr.#1和2)或AC(tr.#3)假定的“阴性”孔证明了显著背景信号。由先前研究已知，双特异性ELISAs可遭受较高的背景水平。这些背景水平还可由样品中潜在存在的半体引起。显然，双特异性ELISA结果确实证实转染11中发生了错误，因为检测到种类AC(黑体值)而非BC。

表21：来自双特异性ELISA的OD450值

实施例23：来自单个细胞识别4种不同表位的两种双特异性抗体(AB和CD)的改善混合物

在实施例12中，假设，预期由转染ZA或ZB产生的混合物在转移至大规模生产时会变成问题，因为，结进孔变体被报道不稳定，并且不可排除包含“结”或“孔”的CH3结构域与电荷改造的CH3结构域形成二聚体。由于上述实施例中证明，发现新电荷对突变优先驱动异二聚化，同时几乎不形成同二聚体，因此，包含这些新电荷对突变体的含CH3结构域之多肽链可与先前已知的电荷改造的含CH3结构域之多肽链或潜在地与SEED体一起在细胞中表达，并且可能导致仅优先形成两种双特异性分子。

由上述实施例可知，通过克隆细胞，DEKK突变组合对于产生一种双特异性(AB)或两种双特异性(AB加AC)是极好地，所述细胞中重链的二聚化是由CH3结构域驱动。然而，仅使用互补CH3突变的一个载体组限制了可产生的混合物种类之可能性的数目。如果将第二“正交”载体组用于与DEKK组合，将能够产生IgG和/或双特异性的更复杂混合物，例如，“AB和CD”或“AB和CC”混合物。当组合两个载体组时，一个重要条件是由两个不同的CH3改造的载体组表达的重链不能形成“交叉”二聚体，即，由一个载体组产生的重链与由另一载体组表达的重链二聚化成全IgG。

为了测试“交叉”二聚体的潜在形成，利用HADDOCK进行计算机分析以进一步了解野生型CH3结构域和包含DE-或KK突变的CH3结构域之间是否会发生可能的配对。类似地，分析野生型CH3结构域和包含E356K，D399K或K392D，K409D突变的CH3结构域之间的潜在配对，以及野生型CH3结构域和包含结进孔突变和上述任何组合的CH3结构域之间的潜在配对。将在HADDOCK中分析的CH3突变体组合列于表22中，获得的HADDOCK得分总结于图25中。

表22：在HADDOCK中分析的CH3变体，对每个携带CH3变体的重链分配单字母代码。＊出于一致性问题，将野生型链命名为“C”和“D”；＊＊当与结进孔变体组合时，电荷逆转变体命名为“A”和“B”，当与DE/KK变体组合时，命名为“C”和“D”。

图25表明，基于这些HADDOCK预测，当在单个细胞中共转染时，将DEKK的CH3组合与电荷逆转CH3组合进行组合最可能成功形成两种双特异性的期望组合(AB和CD)，同时无污染副产物(尤其是AC、AD、BC、BD)。由图25可见，这些不期望的双特异性种类AC、AD、BC和BD具有相对较高的HADDOCK得分，而期望的AB和CD种类具有最低HADDOCK得分。当然，当将DEKK或电荷逆转CH3组合引入携带相同特异性的构建体时(例如，“C”在DE侧上，“C”在KK侧上，“A”在E356K，D399K侧上和“B”在E356K，D399K侧上，或“A”在DE侧上，“B”在KK侧上，“C”在E356K，D399K侧上和“C”在E356K，D399K侧上)，这将导致在细胞中共表达时主要产生CC和AB。

相反，当查看对共表达DEKK与野生型的预测时，可看出AC和AD的HADDOCK得分均低于CD的HADDOCK得分，这表明当试图通过共表达编码DEKK之CH3组合的载体与编码野生型CH3的载体来产生AB和CD的混合物时，AC和AD非常可能为污染物。最后，预测将DEKK或电荷逆转变体与结进孔变体共表达导致具有相对较低HADDOCK得分的不期望双特异性变体，即，在共表达时，产生这些不期望种类的可能性较高。

由此推断，将DEKK的CH3组合与电荷逆转CH3组合(E356K，D399K/K392’D，K409D’)进行组合理想地适于获得基本纯的“AB和CD”和/或“AB和CC”抗体混合物。

接着，通过将上述付诸实施来产生识别4种靶/表位(AB和CD)的2种双特异性的混合物以及识别3种靶/表位(AB和CC)的一种双特异性抗体和1种单特异性抗体的混合物。这些混合物利用4种不同的VH产生，所述VH均能够与共同轻链IGVK1-39配对，但是各VH/VL组合均具有不同的特异性。(预期)种类间要具有足够的质量差(即＞190Da)以能够进行本性MS分析。选择出四种单独的VH，这些VH应具有这样的质量使得在共转染时可通过hMS鉴定并分离出预期的种类。此外，所选的4种VH的质量差还要足够大以鉴定出混合物中除两种期望种类之外的大多数可能污染物。所选的VH列于表23中。

表23：

VH(靶)	作为wt IgG的质量
		A(RTK1)	146786.78
B(破伤风类毒素)	146106.20
		C(纤维蛋白原)	144904.98
I)(RTK2)	145421.37

将4种不同VH克隆到包含“DE”或“KK”构建体或电荷逆转构建体的载体中，如表24所示，进行若干共转染。NB：如通常，所有载体还包含编码共同轻链IGKV1-39的核酸。如先前所述，当结合两个载体组时，重要的条件是由两个不同的CH3改造的载体组表达的重链不能形成“交叉”二聚体，即，由一个载体组产生的重链与由另一载体组表达的重链二聚化成全IgG。进行对照转染，以测试包含电荷逆转突变的重链和包含DE或KK突变的重链之间“交叉”二聚体的这种潜在形成。

表24：

表25进一步提供了表24中转染#9至11中预期种类以及可能污染物的质量的概述。

表25：对于转染#9至11中的每一个，通过质量分选种类，利用上述质量计算质量差。灰色单元格：预期(和期望)种类；斜体：质量差太小以至于不能在nMS分析中分开。＊种类：单字母表示半体；两个字母代码为完整IgG。

在SD-PAGE上分析获自转染#1至#11的所有纯化的蛋白质样品，包括三个对照样品(图26)。此外，在来自转染#9至#11的蛋白质样品上进行nMS分析以鉴定样品中的全部种类。由图26可见，转染#3和#4导致“KK”构建体与“E356K：D399K”或“K392D：K409D”之间预期的不匹配，并且，在来自这些转染的蛋白质样品中半体的量超过全IgG分子的量。转染#7和#8导致这样的蛋白质样品，其中半体和全IgG以约等量存在。但是，由SDS-PAGE不能推断出全IgG是否表示DE/DE二聚体、DE/E356K：D399K二聚体或DE/K392D：K409D二聚体。显著地，在来自转染#9至#11的蛋白质样品中几乎未观察到半体。

转染#9和#11的nMS分析示出在图27中。通过峰高计算预期种类和污染种类的百分率。证明了，对于转染#9，预期种类“AB和CD”在混合物中占了97％(30％AB和67％CD)，而仅存在少至约3％的污染BD(图27A)。对于转染#11，预期种类“AB和CC”在混合物中占94％(33％AB和61％CC)，而仅存在少至约6％的污染BC(4.1％)和AC(1.8％)(图27B)。这些数据表明，当将第二“正交”载体组用于与DEKK组合时，确实可能产生IgG和/或双特异性的更复杂混合物，例如“AB和CD”或“AB和CC”混合物。将电荷逆转构建体与DEKK构建体组合在一起导致仅非常有限地形成“交叉”二聚体。通过调整转染比例，预期可甚至进一步降低这些污染副产物的低百分率。

实施例24：在小鼠中进行单次剂量药代动力学研究

在本研究中，确定并比较三个不同IgG批次的药代动力学参数，以研究其CH3区中携带DEKK突变组合的双特异性抗体的药代动力学(pK)行为。所述三个IgG批次包括1)野生型抗破伤风类毒素亲代抗体1337：1337(两个MF1337Fab在野生型Fc骨架上)；2)野生型抗破伤风类毒素亲代抗体1516：1516(两个MF1516Fabs在野生型Fc骨架上)；3)CH3改造的双特异性抗破伤风类毒素抗体1516：1337，其中其Fc区中携带DEKK突变组合(MF1516Fab在DE侧上，MF1337Fab在KK侧上)。

根据特异性，选择被包括在DEKK双特异性产物中的亲代抗体1337：1337和1516：1516，因为基于先前研究可知，在数种小鼠品系中均不存在抗这些抗体的给药前血清应答。NB：存在给药前血清应答当然使本研究无效。此外，亲代抗体间存在足够的质量差以能够通过nMS鉴定1337：1337(wt Fc)、1516：1337(DEKK Fc)和1516：1516(wt Fc)种类。如前所述制备三个IgG批次，但是用于转染的DNA利用无内毒素maxiprep试剂盒制备以确保内毒素的量尽可能低。随后，测试这些批次的蛋白质浓度、聚集水平、内毒素水平和双特异性产物百分率。证明了，在pK研究中满足随后使用IgG批次的接受标准，即，凝胶过滤后的IgG浓度＞0.3mg/mL，聚集水平＜5％，内毒素水平＜3EU/mg蛋白质以及DEKK批次包含＞90％的双特异性IgG。

经凝胶过滤的样品的本性质谱表明预期种类以高百分率存在。在样品1516：1337中，检测到少量的DE：DE同二聚体，其估计为ca.2％(图28)。由此可得出结论，3个IgG批次适用于pK研究中。

对3组雌性C57BL/6J小鼠(Harlan，The Netherlands)给药1mg/kg人IgG(5ml/kg免疫球蛋白溶液/kg体重)以比较三个批次间的pK参数。在给药时间，动物为7至8周龄，体重为约18至20克。在给药前以及给药后15分钟、60分钟、2小时、4小时、8小时、24小时、48小时、96小时、168小时、268小时和336小时收集血液样品。制备血清样品并贮存于＜-20℃下，直至分析。每一组由3个4只小鼠的亚组组成，即，12只小鼠/组。从每只小鼠取样6个时间点。根据欧洲共同体(Directive86/609/EEC)和荷兰立法(动物实验法，1997)中管理动物在实验中使用的基本原则保持动物的福利。还依照由美国国立卫生研究院实验室动物福利办公室颁布的标识号为45859-01(期满日：2015年4月30日)的人文关怀和实验室动物使用标准来进行本研究。

组1小鼠接受全长单特异性IgG 1516：1516抗体(三角形)；组2小鼠接受全长单特异性IgG 1337：1337抗体(正方形)；组3小鼠接受具有DEKK改造的CH3区(1516在DE侧上，1337在KK侧上)的全长双特异性IgG 1516：1337抗体(菱形)；

使用定量人IgG ELISA(ZeptoMetrix，NY USA；ELISA试剂盒nr.0801182)，利用ELISA测定定量分析小鼠血清中的单克隆人抗体。简言之，ELISA测定基于以下原理：人单克隆抗体与96孔ELISA板中包被的抗人IgG结合。随后，利用与辣根过氧化酶(HRP)缀合的多克隆抗人IgG抗体使结合抗体可视化。每孔的光密度(OD)与血清样品中的抗体量成正比。结果示出在图29中，观察到携带DEKK突变组合的双特异性全长IgG抗体和其亲代单特异性抗体二者的血清水平显著相似。由此得出结论，DEKK双特异性抗体中存在的CH3突变既未改变稳定性也未改变半衰期，DEKK变体表现得像野生型IgG。

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Claims

1.一种用于从单个宿主细胞产生至少两种不同的免疫球蛋白样分子的方法，其中所述两种免疫球蛋白样分子各自包含能够形成界面的两个CH3结构域，所述方法包括在所述细胞中提供：

a.编码第一含CH3结构域之多肽链的第一核酸分子，

b.编码第二含CH3结构域之多肽链的第二核酸分子，

c.编码第三含CH3结构域之多肽链的第三核酸分子，和

d.编码第四含CH3结构域之多肽链的第四核酸分子，

其中，所述第一含CH3结构域之多肽链在366位氨基酸处包含赖氨酸(K)残基并且在351位氨基酸处包含赖氨酸(K)残基；并且其中所述第二含CH3结构域之多肽链在351位氨基酸处包含天冬氨酸(D)残基并且在368位氨基酸处包含谷氨酸(E)残基；并且其中所述第三含CH3结构域之多肽链在356位氨基酸处包含赖氨酸(K)残基并且在399位氨基酸处包含赖氨酸(K)残基；并且其中所述第四含CH3结构域之多肽链在392位氨基酸处包含天冬氨酸(D)残基并且在409位氨基酸处包含天冬氨酸(D)残基，所述方法还包括培养所述宿主细胞并且使所述至少四种核酸分子能够表达以及从培养物中收获所述至少两种不同的免疫球蛋白样分子的步骤。

2.权利要求1所述的方法，其还包括为所述宿主细胞提供编码共同轻链的核酸分子。

3.权利要求1所述的方法，其中所述含CH3结构域之多肽链各自还包含识别靶表位的可变区。

4.权利要求3所述的方法，其中4个所述含CH3结构域之多肽链的4个可变区各自识别不同的靶表位。

5.权利要求3所述的方法，其中所述第一含CH3结构域之多肽链的可变区和所述第二含CH3结构域之多肽链的可变区识别不同的靶表位，而所述第三含CH3结构域之多肽链的可变区和所述第四含CH3结构域之多肽链的可变区识别相同的靶表位。

6.权利要求5所述的方法，其中所述第三含CH3结构域之多肽链的可变区和所述第四含CH3结构域之多肽链的可变区识别的靶表位与所述第一含CH3结构域之多肽链的可变区或所述第二含CH3结构域之多肽链的可变区识别的靶表位相同。

7.权利要求5所述的方法，其中所述第三含CH3结构域之多肽链的可变区和所述第四含CH3结构域之多肽链的可变区识别的靶表位与所述第一含CH3结构域之多肽链的可变区或所述第二含CH3结构域之多肽链的可变区识别的靶表位不同。

8.权利要求3所述的方法，其中所述第一含CH3结构域之多肽链的可变区和所述第二含CH3结构域之多肽链的可变区识别相同的靶表位，而所述第三含CH3结构域之多肽链的可变区和所述第四含CH3结构域之多肽链的可变区识别不同于所述第一可变区和所述第二可变区识别之靶表位的第二靶表位。

9.权利要求3所述的方法，其中所述靶表位位于相同的靶分子上。

10.权利要求9所述的方法，其中所述靶分子是可溶性分子。

11.权利要求9所述的方法，其中所述靶分子是膜结合分子。

12.权利要求3所述的方法，其中所述靶表位位于不同的靶分子上。

13.权利要求12所述的方法，其中所述不同的靶分子在相同细胞上表达。

14.权利要求12所述的方法，其中所述不同的靶分子在不同细胞上表达。

15.权利要求12所述的方法，其中所述不同的靶分子是可溶性分子。

16.权利要求12所述的方法，其中一种靶分子是可溶性分子，而第二种靶分子是膜结合分子。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两种不同的免疫球蛋白样分子是抗体。

18.权利要求3至8、12至14或16中任一项所述的方法，其中至少一种所述靶表位位于肿瘤细胞上。

19.权利要求3至8、12至14或16中任一项所述的方法，其中至少一种所述靶表位位于效应细胞上。

20.权利要求19所述的方法，其中所述效应细胞是NK细胞、T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或嗜中性粒细胞。

21.权利要求19所述的方法，其中所述靶表位位于CD3、CD16、CD25、CD28、CD64、CD89、NKG2D或NKp46分子上。

22.可由根据权利要求1至21中任一项所述的方法获得的至少两种不同免疫球蛋白样分子的混合物。

23.根据权利要求22的混合物，其中所述至少两种免疫球蛋白样分子与相同抗原上的不同表位和/或不同抗原上的不同表位结合。

24.根据权利要求22的混合物，其中所述至少两种不同的免疫球蛋白样分子包括至少一种异二聚体免疫球蛋白样分子。

25.根据权利要求22的混合物，其中所述至少两种不同的免疫球蛋白样分子中的两种是异二聚体免疫球蛋白样分子。

26.一种重组宿主细胞，其包含编码至少第一含CH3结构域之多肽链、第二含CH3结构域之多肽链、第三含CH3结构域之多肽链和第四含CH3结构域之多肽链的核酸序列，其中所述第一含CH3结构域之多肽链在366位氨基酸处包含赖氨酸(K)残基并且在351位氨基酸处包含赖氨酸(K)残基；并且其中所述第二含CH3结构域之多肽链在351位氨基酸处包含天冬氨酸(D)残基并且在368位氨基酸处包含谷氨酸(E)残基；并且其中所述第三含CH3结构域之多肽链在356位氨基酸处包含赖氨酸(K)残基并且在399位氨基酸处包含赖氨酸(K)残基；并且其中所述第四含CH3结构域之多肽链在392位氨基酸处包含天冬氨酸(D)残基并且在409位氨基酸处包含天冬氨酸(D)残基。

27.根据权利要求26的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码共同轻链的核酸序列。

28.一种药物组合物，其包含权利要求22至25中任一项所述的至少两种不同的免疫球蛋白样分子以及可药用载体。

29.根据权利要求28的药物组合物，其中所述至少两种不同的免疫球蛋白样分子是由根据权利要求26或27的重组宿主细胞产生的。

30.一种用于制备用来产生至少两种不同的免疫球蛋白样分子的宿主细胞的方法，所述方法包括向所述宿主细胞中引入编码至少第一含CH3结构域之多肽链、第二含CH3结构域之多肽链、第三含CH3结构域之多肽链和第四含CH3结构域之多肽链的核酸序列，其中所述第一含CH3结构域之多肽链在366位氨基酸处包含赖氨酸(K)残基并且在351位氨基酸处包含赖氨酸(K)残基；并且其中所述第二含CH3结构域之多肽链在351位氨基酸处包含天冬氨酸(D)残基并且在368位氨基酸处包含谷氨酸(E)残基；并且其中所述第三含CH3结构域之多肽链在356位氨基酸处包含赖氨酸(K)残基并且在399位氨基酸处包含赖氨酸(K)残基；并且其中所述第四含CH3结构域之多肽链在392位氨基酸处包含天冬氨酸(D)残基并且在409位氨基酸处包含天冬氨酸(D)残基，并且其中将所述核酸序列相继引入或同时引入。

31.根据权利要求30的方法，其还包括向所述宿主细胞中引入编码共同轻链之核酸序列的步骤。

32.一种权利要求26或27的重组宿主细胞的培养物或者由根据权利要求30或31的方法获得的重组宿主细胞的培养物，其产生至少两种不同的免疫球蛋白样分子。