JP2020202854A - Ig様分子の生産方法および生産手段 - Google Patents
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Abstract
Description
多様な疾患の治療に用いられる治療用抗体の分野に関する。
ーナル抗体である。これらの製剤は、生体の免疫システムが、疾患のプロセスに関わる細
胞および/または分子を無力化または除去したり、侵入した病原体または感染した因子を
根絶する能力を高めるものである。
治療用の抗体では、エピトープは、例えば腫瘍細胞を取り除いたり、受容体−リガンド相
互作用を阻害したり、ウィルスを中立化するなどの望ましい機能を発揮するように選択さ
れる。
通常、大量に生産され、また、その生物物理学的特性および生物化学的特性が詳細に検査
されることで、バッチごとの品質も保たれ、基準を満たすようになってきている。
在する。その一部は、モノクローナル抗体の持つ本来の特徴である単一特異性と、疾患の
持つ複雑性に関係する。
因子の作用も冗長的であったり相乗的であったりし、別の受容体の発現が増えてシグナル
伝達のネットワーク間でのクロストークが起きることもある。従って、疾患に関わる複数
の異なる要素や反応経路を阻害することが、治療の効率の改善につながりうる。モノクロ
ーナル抗体が本来持つ単一特異性から、モノクローナル抗体は複雑な疾患のプロセスにお
ける1つのステップに対して干渉することしかできず、十分な効果を挙げられない場合が
ある。
の単一のエピトープを標的とするのみでは疾患の治療に十分な効果を挙げることができな
いことが明らかになってきた。その理由は、標的のエピトープに対し、もはやモノクロー
ナル抗体が結合し望ましい効果を発揮することができなくなる場合があるからである。一
例として、腫瘍細胞は、増殖因子の受容体にある標的エピトープの発現を減らしたり、突
然変異を加えたり、遮蔽したりしてモノクローナル抗体による治療をかわすことがしばし
ばある。
経路を有効にして成長を続け転移する。同様に、ウィルスや他の病原体も標的エピトープ
に突然変異を加えたり、欠失させたり、遮蔽したりしてモノクローナル抗体による治療を
かわす。
エフェクター機構の全てを発生させるわけではない。ここでのエフェクター機構の顕著な
例として以下が挙げられる;オプソニン化(抗原が食作用を受けやすくなる)、立体障害
(抗体に包まれた抗原が宿主細胞または粘膜表面に到達することを阻害される)、毒素の
無毒化、凝集、または沈降(いくつかの水溶性の抗原に結合した抗体が凝集し、その後除
去される)、補体の活性化および抗体による細胞毒性(抗体が、NK細胞および好中球に
より標的細胞を死滅させる)。
このような血清由来の治療用ポリクローナル抗体は、狂犬病ウィルス、サイトメガロ・ウ
ィルスおよびRSウィルスのようなウィルス感染症の治療および予防、破傷風毒素および
ボツリヌス毒素のような毒素の無効化、または抗D免疫付与の防止などに用いられる。
び毒素のような限られた範囲の標的にしか適用できないという点により妨げられている。
さらに、製品は、量および適合性の両方の点において、ドナーによる血液の供給状況に依
存しており、バッチごとにかなりのばらつきが生ずる結果となる。それに加えて、スクリ
ーニングの技術はウィルスの絶え間ない進化に追い付いておらず、免疫グロブリン製剤は
感染症の伝染を媒介する危険が付きまとう。最後に、血液収集、スクリーニングおよび免
疫グロブリン精製といった長い過程により、血漿由来免疫グロブリンは生産にコストがか
かる。
由来ポリクローナル抗体に関連した制限がない。この分野において、2種のヒトまたはヒ
ト化モノクローナル抗体の組み合わせが前臨床モデルおよび臨床試験で検査されている(
例として、HER2受容体に対する2種のモノクローナル抗体の混合物、受容体EGFR
に対する2種の抗体の混合物および狂犬病ウィルスに対する2種のモノクローナル抗体)
。
的な効果を挙げることができ、抗体のいずれか一方のみだけとは関連しないエフェクター
機構を誘導することが示されている。例えば、EGFRまたはHER2に対する2種のモ
ノクローナル抗体の混合物は、腫瘍細胞をより強力に殺傷することが示されている。これ
は、免疫系のエフェクターによる細胞毒性の促進に加え、受容体の内在化の促進および受
容体の下流のシグナル経路の阻害の強化を含む活動の組み合わせに基づく。
生産され、そして蛋白質のレベルで混合される。この方法の難点は、2種の抗体について
それぞれ臨床試験を展開し、組み合わせたものについてもその過程を(部分的に)繰り返
すことによる膨大なコストである。このことにより、抗体の組み合わせに基づいた治療は
コストの面で受け入れられないものとなりうる。
酵槽で混合し、結果として得た抗体の混合物を一の試料として精製しうる(国際公開第2
004/061104号)。この方法の難点は、組成のコントロールが難しいことであり
、それにより結果として得た組み換えポリクローナル抗体製剤の再現性も乏しいことにあ
る。特に、細胞を培養するに従うこのような組成の時間的な変化を考慮に入れると難しい
。
た。2種の抗体の組み合わせの場合では、混合物にある2種の異なる免疫グロブリン分子
が、同一または違う標的にある、異なったエピトープに対し結合する。二重特異性抗体で
は、単一の免疫グロブリン分子によりこれが達成される。
その同じエピトープに結合する2種の抗体の組み合わせの場合と同様の効果を発揮しうる
。さらに、IgG形式による二重特異性抗体は、一の分子に2つの異なる一価の結合部位
を組み合わせて有し、2種のIgG抗体の混合物は、一の試料に2つの異なる二価の結合
分子を組み合わせて有するため、これらの形式による異なる効果も観察されている。
る方が手間がかからない。その理由は、生産、前臨床および臨床試験を単一の分子につい
てすればよいからである。したがって、単一の二重特異性抗体に基づいた治療法は、より
手間のかからず、コスト効率の良い創薬プロセスにより促進され、より効率の良い抗体療
法を提供する。
産される。例えば、二重特異性抗体は抗体を分泌する2つの細胞株を融合するか、組み換
えDNA技術を用いて2つの抗体を一の細胞に発現させることにより生産されうる。これ
らの方法によると、複数の種類の抗体が産生される。その理由は、各抗体に対応する重鎖
が、同じ特異性を持つ2つの同一の重鎖のペアを含む単一特異性二量体(ホモ二量体とも
呼ばれる)、および、異なる特異性を持つ2つの異なる重鎖のペアを含む二重特異性二量
体(ヘテロ二量体とも呼ばれる)を形成しうるからである。
合わせとなりうる。この重鎖および軽鎖のミスペアリングとして知られる問題は、二重特
異性として発現される共通の軽鎖を共有する抗体を選択することで解決できる。しかし共
通の軽鎖を用いても、2つの重鎖および1つの共通する軽鎖を単一の細胞に発現すると、
3つの異なる抗体の種類が得られることになる。すなわち、2つの単一特異性の「親」抗
体(’parental’ antibody)および二重特異性抗体である。したがって、目的とする二
重特異性抗体は結果として得られた抗体混合物から生成する必要がある。
よびミスペアリングの重鎖および軽鎖を減らすことのためにいくつかの技術が採用されて
いる。しかし、上述の問題点のいくつかを消去あるいは最小化する二重特異性抗体の形式
が必要とされている。
体,二重特異性抗体,モノクローナル抗体の混合物,または単一特異性および二重特異性
の抗体の混合物を産生する様々な技術と方法が提供されている。
限を有している。従って、疾患を修飾する複数の分子を標的とした、混合物または二重特
異性のアプローチによる方式の生物学的治療剤を生産する、改善された、および/または
今までとは別の技術を生み出す必要がある。
ーチによる方式の生物学的治療剤を生産するための、改善された、および/または今まで
とは別の技術の方法および手段を提供する。本発明は、さらに、これらの方法および手段
の結果として得られる生産物および使用を提供する。
プローチが記述されている。これらの方法により、結果として得られる混合物における望
ましくない抗体の組成を減らすことができる。
れている(Ellerson JR., et al., J. Immunol 1976 (116) 510-517およびDeisenhofer J
. biochemistry 1981 (20) 2361-2370)。さらに、2つのCH3ドメインが相互に作用す
るとき、「接触」残基(”contact” residue;接触アミノ酸(contact amino acids)、
接触面残基(interface residues)または接触面アミノ酸(interface amino acieds)と
も呼ばれる)からなる蛋白質−蛋白質接触面で向かい合うことが知られている。
ミノ酸と相互作用する。接触アミノ酸は通常、抗体の三次元構造において相互に5.5Å
(好ましくは4.5Å)以内の距離にある。この1つのCH3ドメインの接触残基と異な
るCH3ドメインの接触残基の間の相互作用は、例えば、ファン・デル・ワールス力、水
素結合、水媒介水素結合(water-mediated hydrogen bonds)、塩橋若しくはその他の静
電気力、芳香族側鎖の間の引力相互作用、ジスルフィド結合またはその他の公知の力を介
してなされる。
のフォールディングと会合の大半に寄与していることがこれまでに示されている。その他
の(隣接した)アミノ酸残基もこの蛋白質―蛋白質接触面での相互作用に影響しうること
が想定される。
二量化よりもヘテロ二量化を促進するために、CH3ドメインの特異的な操作(engineer
ing)が適用されている。このようなCH3−CH3接触面の操作の例は、例えば国際公
開第1998/050431号、Ridgeway et al., 1996、Merchant et al. 1998に記述
されており、ノブ・イントゥ・ホール(Knob-into-Hole)アプローチとしても知られてい
る。この方法は、相補的な突起および空洞をもたらす変異を導入する。
入するとともに、第2のポリペプチドに対応する空洞(cavity)を導入し、該突起が該空
洞に位置するようになっている。これにより、ヘテロ多量体の形成が促進され、ホモ多量
体の形成が妨げられる。
、長いアミノ酸側鎖(例えば、チロシンまたはトリプトファン)に置き換えることにより
作成される。相補的な、突起と同一または類似の大きさの「空洞」または「穴」は、第2
のポリペプチドの接触面にある長いアミノ酸側鎖を、より短いアミノ酸側鎖(例えば、ア
ラニンまたはスレオニン)に置き換えることにより作り出される。突起および空洞は、ポ
リペプチドをコードする核酸の改変のような合成手段、またはペプチドの合成により作成
できる。
混合物の中で、興味のある二重特異性抗体の割合をせいぜい87%まで上げる程度である
。Merchantらは、CH3−CH3接触面の中の2つのCH3ドメインの間に追加したジス
ルフィド結合の導入により、混合物の二重特異性抗体の割合を95%にまで高めることに
成功した。それでも、このような二重特異性抗体を薬剤として用いるためには、二重特異
性抗体はホモ二量体から(分離)精製し、薬学的見地から容認可能な希釈剤または賦形剤
の形にしなければならない。このような混合物からヘテロ多量体を精製するのは、ホモ二
量体とヘテロ二量体の物理化学的な性質が類似しているため大きな課題になっている。
胞クローンからの二重特異性抗体の生産方法を提供することである。本発明によれば、ノ
ブ・イントゥ・ホール技術を手段の一つとして、単独でまたは他の手段と共に用い、混合
物中の、前記さらに改善された二重特異性抗体の割合を実現することができる。
により提供される。この技術は、鎖交換操作ドメイン(strand-exchange engineered dom
ain; SEED)CH3ヘテロ二量体の発案により、二重特異性および非対称性の融合蛋白質
を設計することに関わっている。これらのSEED・CH3ヘテロ二量体はヒトIgAお
よびIgGのCH3配列を交互に有する部分から構成されているヒトIgGおよびIgA
の派生物である。この結果として、SEED-bodiesと呼ばれる一対の相補的なヒトSEED
・CH3ヘテロ二量体が得られる(Davis JH. et al., Protein Engineering, Design &
Selection 2010(23)195-202; 国際公開第2007/110205号)。
欧州特許出願公開第01870459号若しくは米国特許出願公開第2010/0015
133号、国際公開第2007/147901号、国際公開2010/129304号、
Gunasekaran et al (2010)および国際公開第2009/089004号に記述されている
ように、CH3−CH3接触面にある、もともと電荷を有する接触残基の静電的操作に基
づいている。
ミノ酸の接触残基を、逆の電荷のアミノ酸残基に置き換えている(電荷反転戦略:charge
reversal strategy)。これにより、Fc二量体の向かい合う接触面の電荷の極性が変わ
り、静電的に適合するFc鎖を共発現させると好ましい引力相互作用を生じうる。従って
、望ましいFcヘテロ二量体の形成が促進され、一方で反発的な電荷の相互作用により望
ましくないFcホモ二量体の形成が阻害される。
用に関わっている報告がある。これらはD356/K439’, E357/K370’, K392/D399’および
D399/K409’(第1の鎖の残基と第2の鎖の残基を「/」で区切り、プライム記号(’)で
第2の鎖の残基の番号を表すKabat (1991)の報告の番号付けに従った)である。CH3−
CH3接触面は2回対称であるため、各々の特徴的な荷電残基のペアは本来のIgGで2
度現れる(すなわち、K439/D356’, K370/E357’, D399/K392’ およびK409/D399’の静
電相互作用も該接触面に存在する)。
D、あるいは第2の鎖のD399’Kの変異において、同一の電荷の反発によりホモ二量
体の形成が減少することが示された。異なった電荷に対しても反転操作を加えることによ
り、さらにこの反発効果が高められた。異なる相補的な電荷の反転がある、異なるCH3
ドメインの発現により、ヘテロ二量化が誘導され、結果として混合物における二重特異性
の種の割合が増加することが示された。
から約96%までの間の値にすることができた。本発明の目的の一つは、単一の細胞から
の二重特異性抗体の生産方法において、さらに改善された所望の二重特異性抗体の割合を
提供することである。本発明によれば、静電的な操作技術を手段の一つとして、単独でま
たは他の手段、例えばノブ・イントゥ・ホールアプローチと共に用い、前記さらに改善さ
れた所望の(二重特異性)抗体の割合を達成することができる。
g様分子を生産する方法では、それぞれの前記2つのIg様分子は接触面を形成すること
ができる2つのCH3ドメインを備え、前記方法は、前記細胞に、
a. 第1のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第1の核酸分子,
b. 第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第2の核酸分子,
c. 第3のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第3の核酸分子,およ
び、
d. 第4のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第4の核酸分子,
を与えることを含み、少なくとも2つの前記核酸分子で、前記第1および第2のCH3ド
メインを備えるポリペプチドと前記第3および第4のCH3ドメインを備えるポリペプチ
ドの選択的ペアリングのための手段を備え、前記方法は、前記宿主細胞を培養し、前記少
なくとも4つの核酸分子を発現させ、前記少なくとも2つの異なるIg様分子を培養物か
ら回収する工程をさらに備える。
数の生物学的な経路をより効率的に阻害するため、複数の(二重特異性)抗体を産生する
ことがしばしば望まれる。
る。例えば、抗体または小分子の薬による治療の間に、腫瘍細胞は抵抗性を得るため多く
の異なる戦略を用いる。抵抗性は、複数の細胞表面の受容体および水溶性分子に関わるこ
とがあり、複数のこのような疾患および逃避(escape)に関係した分子に同時に対処する
、抗体によるがん治療法を開発することが有益であると考えられている。
合、二重特異性抗体の混合物は新規で興味深い治療の方式である。このような二重特異性
抗体の混合物は単一の細胞から生産された方が、創薬プロセスを容易にし、好ましい。こ
れにより、創薬プロセスは、規制上の観点から見て手間がかからず、製薬および臨床的な
発展の観点から見てもコスト効率が良く、実現しやすいものとなる。
にする方法を用いることが望ましい。これにより、望ましい二重特異性IgG分子の混合
物を、望ましくない単一特異性のIgG分子から分離する必要性を減らすか、または完全
になくすことができる。従来技術において、単一の細胞から、単一特異性および二重特異
性抗体が生産されている(国際公開第2004/009618号)。しかし、これらの混
合物はいくつかの異なる二重特異性および単一特異性抗体の種類の複雑な混合になってい
る。
を生産する方法および手段を提供することである。後述されるように、好ましくは、単量
体の副産物の量と関わりなく、少なくとも95%、少なくとも97%または99%より高
い割合の二量体IgG分子の(二重特異性)抗体の混合物が結果として得られる方法を提
供する。概して述べると、複数の、生来のIgG分子が生産されている細胞では、半分子
(単量体の副産物)が存在するが、公知のサイズ排除クロマトグラフィーにより簡単に除
去される。
りの、単一細胞での少なくとも2つの異なったIg様分子を含む定められた混合物の生産
方法では、望ましくない他の二量体の抗体の種の形成が減少しているか、または欠く。結
果として得られた混合物は明確に定義され、その組成はCH3ドメインの変異の設計によ
り制御される。さらに、発現量の調節および/または発現に用いられる異なるトランスフ
ェクション比率は混合物の組成に影響する。
核酸分子にコードされたCH3ドメインと選択的にペアとなり、第3の核酸分子にコード
されているCH3ドメインは、第4の核酸分子にコードされたCH3ドメインと選択的に
ペアとなる。さらに、本発明は、本発明の方法により得られる少なくとも2つの異なるI
g様分子の混合物を提供する。
択的ペアリング」の意味は、結果として得られる、第1のCH3ドメインを備えるポリペ
プチドおよび/または第2のCH3ドメインを備えるポリペプチドを有する二量体の実質
的にすべてが、1つの第1のCH3ドメインを備えるポリペプチドと1つの第2のCH3
ドメインを備えるポリペプチドのペアからなる二量体である、ということである。
ング」の意味は、結果として得られる、第3のCH3ドメインを備えるポリペプチドおよ
び/または第4のCH3ドメインを備えるポリペプチドを有する二量体の実質的にすべて
が、1つの第3のCH3ドメインを備えるポリペプチドと1つの第4のCH3ドメインを
備えるポリペプチドのペアからなる二量体である、ということである。
コードする核酸分子が単一の細胞に導入されたとき、10の異なるIg様二量体(AA,
AB,AC,AD,BB,BC,BD,CC,CDおよびDD)の混合物の代わりに、主
として2つの特異的なIg様分子の混合物が生産される。
ンを備えるポリペプチド鎖は、アミノ酸置換T366Kを有し、前記第2のCH3ドメイ
ンを備えるポリペプチド鎖は、アミノ酸置換L351Dを有する。これらのアミノ酸の変
化は前記第1および第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖の選択的ペアリングの
ための好適な手段である。
換L351Kを有する。また、前記第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖は、好
ましくはさらに、Y349E、Y349DおよびL368Eの群から選択されたアミノ酸
の置換を有する。この群の中で、L368Eが最も好ましい。さらにもう一つの好適な一
実施形態では、前記第3のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖はアミノ酸置換E35
6KおよびD399Kを有し、前記第4のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖はアミ
ノ酸置換K392DおよびK409Dを有する。
くはさらに標的エピトープを認識する可変領域を備える。CH3ドメインを備えるポリペ
プチド鎖の一部である可変領域は、好ましくは共通の軽鎖を共有する。その場合、可変領
域のVHのみが異なり、一方で全ての可変領域のVLは実質的に同一である。
共通の軽鎖をコードする核酸分子を与えることをさらに備える。特に好適な一実施態様で
は、4つのCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖の前記4つの可変領域のそれぞれが異
なる標的エピトープを認識する。例えば、もし第1の核酸分子が抗原Aに特異的な可変ド
メインをさらに含む重鎖をコードしていた場合、第2の核酸分子は抗原Bに特異的な可変
ドメインをさらに含む重鎖をコードし、第3の核酸分子は抗原Cに特異的な可変ドメイン
をさらに含む重鎖をコードし、そして第4の核酸分子は抗原Dに特異的な可変ドメインを
さらに含む重鎖をコードする。そうすると、混合物は、ABに特異的な二重特異性Ig様
分子およびCDに特異的な二重特異性Ig様分子を含んで生産される。
またはBDに特異的な二重特異性抗体の形成は、少なくなるか、または、なくなる。その
理由は、前記第1および第2のCH3ドメインを備えるポリペプチドと前記第3および第
4のCH3ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングの手段による。2を超える
異なるIg様分子を含む定められた混合物の生産のために、例えば第5および第6のCH
3ドメインを備えるポリペプチドをコードする場合のような、さらなる核酸分子を用いる
ことももちろん可能である。
る必要はない。また、結果として得られる発現されたIg様分子の比率も1:1である必
要はない。公知の手段を用いて、最適化された比率の抗体の混合物を作製することは可能
である。例えば、核酸分子の発現レベルと、つまり結果として産生されるIg様分子の比
率はプロモーター、エンハンサーおよびリプレッサーのような異なる遺伝的要素を用いる
か、抗体をコードするDNA構築物のコピー数のゲノム組み込み部位を制御することで調
節されうる。
変異、ジスルフィド架橋、電荷反転変異を含む電荷の変異、またはこれらの組み合わせよ
りなる。選択的ペアリングのための前記手段は特定の範囲の型の変異から選びうることが
当業者は理解できるだろう。すなわち、CH3ドメインを備えるポリペプチド鎖をコード
する少なくとも4つの核酸分子が選択的ペアリングのための手段としての電荷の変異とし
て必要である。
える2つのポリペプチド鎖の選択的ペアリングに用いられる。特に好適な一実施形態では
、選択的ペアリングのための前記手段は、表Bから選択される少なくとも1つのCH3変
異を有することが本書で後述される。
記第1および第2のCH3ドメインを備えるポリペプチドと前記第3および第4のCH3
ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングのための手段を備え、前記第1および
第2のCH3ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングのための前記手段は、前
記第3および第4のCH3ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングのための手
段とは異なる。
ンを備えるポリペプチドの選択的ペアリングのための前記手段は、前記第3および第4の
CH3ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングのための前記手段とは異なる。
ここでの「異なる」の意味は、前記第1および第2のCH3ドメインを備えるポリペプチ
ドの選択的ペアリングのための手段は第1および第2の鎖の選択的ペアリングが好まれる
ように設計されているということである。該設計において、第1と、第3および/または
第4のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖との間の相互作用が実質的に起こらないよ
うにされている。言い換えると、第1のCH3ドメインを備えるポリペプチドと、前記第
3または第4のポリペプチドとの二量化は原則的に起こらないか、それに近いくらいまで
抑えられている。第3および第4のCH3ドメインを備えるポリペプチドは、野生型か、
第1および第2のCH3ドメインの選択的ペアリングのための手段とは異なる選択的ペア
リングの手段を備える。
る荷電接触アミノ酸の変異(反転)を用いて単一の二重特異性抗体の生産をすることに焦
点をあてている。しかし、本発明より前において、他の二量体副産物を共に顕著に生産す
ることなく、少なくとも2つの(二重特異性)Ig様分子の定められた混合物の生産をす
ることは実現できていない。
の混合物の効率よく制御された生産方法を提供する。2種の二重特異性のものが望ましい
システムにおいて、(2つの)二重特異性のものの割合が少なくとも95%、少なくとも
97%またはそれより高い割合が得られる。このことは、せいぜい5%、せいぜい3%ま
たはそれより少ない単一特異性の二価の副産物しか得られないということである。注記し
ておくと、単量体の副産物(すなわち半分子)の量はあまり重要でない。その理由は、こ
れらの半分子は大きさの違いを利用して簡単に分離できるからである。
ポリペプチド鎖の可変領域は異なる標的エピトープを認識し、一方で第3および第4のC
H3ドメインを備えるポリペプチド鎖の可変領域は同一の標的エピトープを認識する。こ
れにより、主として1種類の二重特異性Ig様分子および1種類の単一特異性Ig様分子
が結果として得られる。例えば、もし第1および第2のCH3ドメインを備えるポリペプ
チド鎖の可変領域が異なる標的エピトープを認識し、そしてもし第3および第4のCH3
ドメインを備えるポリペプチド鎖の可変領域が、両方とも同一の、第1および第2のCH
3ドメインにより認識される標的エピトープとは異なるエピトープを認識する場合、AB
またはCCに対する特異性を有するIg様分子の混合物がつくられる。
ペプチド鎖の可変領域により認識される標的エピトープが同一であり、しかし第1または
第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖の可変領域により認識される標的エピトー
プとは異なるものである。
異なる標的エピトープを認識し、第3および第4のCH3ドメインを備えるポリペプチド
鎖の可変領域が、両方とも、第1または第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖と
同一のエピトープを認識するとき、ABおよびAA、またはABおよびBBに対する特異
性を有するIg様分子の混合物がつくられる。
リペプチド鎖の可変領域により認識される標的エピトープが、第1または第2のCH3ド
メインを備えるポリペプチド鎖の可変領域により認識される標的エピトープと同一である
ものである。
定められた混合物を生産する方法および手段を提供することである。このような明確に定
義された混合物の非限定的な例は、ABに特異的な二重特異性抗体およびAA特異的な単
一特異性抗体の混合物である。他の例は、ABに特異的な二重特異性抗体およびBB特異
的な単一特異性抗体の混合物である。さらにもう一つの例は、ABに特異的な二重特異性
抗体およびCC特異的な単一特異性抗体の混合物である。ここでも、少なくとも90%、
好ましくは95%、最も好ましくは少なくとも97%、または99%をも超える望ましい
抗体を有する、目的とする抗体の混合物を産生する好適な手段および方法が提供される。
を備えるポリペプチド鎖の可変領域が同一の標的エピトープを認識し、一方で第3および
第4のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖の可変領域が、前記第1および第2の可変
領域により認識される標的エピトープとは異なる2番目の標的エピトープを認識する。こ
れにより、主としてAA特異性またはBB特異性を有する単一特異的なIg様分子の産生
が結果として起こる。二重特異性Ig様分子の形成は、減少するか、なくなる。
単一細胞で産生することが好まれる。例えば、2つの同一の標的分子の架橋が望まれると
き、または2つの標的が互いに離れすぎており単一の二重特異性抗体ではこれらに結合で
きないときである。単一の細胞で単一特異性抗体の混合物を生産すると、単一の治療用生
産物としてみなされるため有利な場合がある。
製造承認も得られている。単一細胞での単一特異性抗体の混合物の生産により、いくつか
のこのような混合物の効果および安全性の検査を容易にし、規制に関する承認と製造のた
めの効果およびコストを下げることができる。しかし、二重特異性の副産物の形成を5%
よりも少なくすることができる、単一細胞での単一特異性抗体の特定の混合物の生産方法
は現在まだ得られていない。本発明の他の目的の一つは、このような、二重特異性抗体の
形成を5%よりも少なくする、明確に定義されたホモ二量体の混合物の生産手段および生
産方法を提供することである。
れる混合物の生産に適している。ここでも、2を超える異なるIg様分子を含む定められ
た混合物を生産するため、例えば、第5および第6(そして第7および第8など)のCH
3ドメインを備えるポリペプチドをコードする核酸分子をさらに用いることが可能である
。
1つの本発明による変異の組み合わせを含む、少なくとも2つのCH3ドメインが用いら
れる。これらの変異を通して、2つのCH3ドメインの間に新規の特異的な相互作用が形
成される。本発明によるこれらの変異については以下で詳述する。
有する蛋白質性の分子を意味する。前記Ig様分子は、少なくとも1つの免疫グロブリン
CH3ドメインの機能をもつ配列を備え、好ましくは、該配列はIgG1のCH3ドメイ
ンを備える。少なくとも1つのCH3ドメインを有する蛋白質性分子は、さらに特定の結
合部分を備えることができる。
量体の結合分子または結合分子の混合物を設計するため、CH3ドメインを備える2つの
タンパク質性分子の選択的ペアリングに用いられる。CH3ドメインを備える蛋白質性の
分子に導入される結合部分は、以下の非限定的な例で示されるものを含むいかなる結合手
段でもよい;単一鎖のFvs、単一鎖若しくはタンデムのダイアボディ(TandAb(登録商標
))、VHH、Anticalins(登録商標)、Nanobodies(登録商標)、BiTE(登録商標)、Fab
、アンキリン反復蛋白質若しくはDARPINs(登録商標)、Avimers(登録商標)、DART、TC
R様抗体、Adnectins(登録商標)、Affilins(登録商標)、Trans-bodies(登録商標)、
Affibodies(登録商標)、TrimerX(登録商標)、MicroProteins、Fynomers(登録商標)
、Centyrins(登録商標)またはKALBITOR(登録商標)。
合わせ)である。CH3ドメインを備えるポリペプチド鎖の一部である可変領域は、好ま
しくは共通の軽鎖を共有する。そのような場合において、可変領域のVHのみが異なり、
一方で全ての可変領域においてVLは実質的に同一である。
容体および/またはペプチドその他の分子も本発明のCH3ドメインに導入することがで
きる。
実施形態において、Ig様分子は抗体である。好ましくは、これらの抗体の可変領域は共
通の軽鎖を共有するが、VH領域において異なりうる。
の分子であって、1または2以上の抗原上のエピトープに結合するドメインであって、抗
体の可変領域に由来するか、または配列相同性を有するものを含む分子を意味する。既知
の抗体はIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE、およびI
gMのようないくつかのアイソタイプを含む。本発明による抗体はいかなるアイソタイプ
または機能的派生体および/またはこれらの断片でもよい。好適な一実施形態において、
Ig様分子としてはIgGアイソタイプの抗体が産生される。その理由は、IgG抗体は
、例えば他のアイソタイプの抗体と比較して、より長い半減期を持つからである。
かなる由来の配列を有することができる。抗体は、全部がヒト抗体由来のような、1つの
由来からの配列で構成されていてもよいし、例えばキメラまたはヒト化抗体と結果的に呼
ばれるように、2以上の由来を持つ配列を有してもよい。
対象の場合は、ヒト抗体)。抗体の結合は、特異性と親和性の観点から表現される。特異
性により、結合ドメインがどの抗原またはエピトープと結合するかが決定される。親和性
は、特定の抗原またはエピトープとの結合する力を評価する尺度である。特異的結合は、
親和性(KD)において、少なくとも1×10−5M、より好適には1×10−7M、よ
り好適には1×10−9Mより高い親和性の結合として定義される。典型的には、治療用
のモノクローナル抗体で、1×10−10Mの親和性かそれよりも高い親和性のものが用
いられる。
の生産を引き起こす物質または分子を意味する。抗原の由来は様々であるが、とりわけ病
原体、腫瘍細胞若しくはその他の異常細胞、ハプテンまたは自己組織が挙げられる。分子
レベルでは、抗原は、抗体の抗原結合部位と結合する能力で特徴づけられる。抗原の混合
物もやはり「抗原」とみなされる。すなわち、当業者によれば、腫瘍細胞の溶解物、また
はウィルス粒子もしばしば「抗原」とみなされる一方で、このような腫瘍細胞溶解物また
はウィルス粒子の調合液も多くの抗原決定基として存在する。
ープ」の語は、免疫システム、具体的に言えば抗体、B細胞またはT細胞により認識され
る抗原の一部を意味する。エピトープは、通例、非自己の蛋白質に由来すると考えられる
が、宿主に由来した配列もエピトープとして分類されうる。
る、4つの鎖を有する。それぞれの軽鎖は可変領域と定常領域(VLとCL)の2つのド
メインを有する。それぞれの重鎖は、可変領域(VH)および3つの定常領域(CH1,
CH2,CH3)の4つのドメインを有する。重鎖のCH2およびCH3ドメインの領域
はFc(Fragment crystallizable)部分、Fcフラグメント、Fc主鎖または単にFc
と呼ばれる。
鎖と、2つの軽鎖を有するヘテロ4量体である。重鎖は、CH3−CH3ドメインの接触
面での相互作用と、ヒンジ部での相互作用を通して二量化する。ヒンジ部のジスルフィド
結合の数は免疫グロブリンのサブクラスによって異なる(Papadea and Check 1989)。
わち、重鎖のCH2およびCH3ドメインである。その生理学的機能の一部は、補体系お
よび様々な細胞の表面にある特定の受容体との相互作用である。2つの個々の重鎖のCH
3ドメインの間の相互作用は、重鎖の二量化を誘導する上で重要な役割を果たすことが知
られている。
メイン同士の接触面にはそれぞれの鎖からの20を超える接触残基が含まれ、CH3−C
H3相互作用で役割を果たしている(Deisenhofer J., Biochemistry 1981(20)2361-2370
; Miller S., J. Mol. Biol. 1990(216)965-973; Padlan, Advances in Protein Chemist
ry 1996(49)57-133)。
または単一特異性の抗体全長を生成することができる。VH/VLの組み合わせにより定
められる抗体の特異性は、CH3ドメインにより誘導される重鎖の二量化の挙動には一般
に影響しない。
酸」の語は、通常、ドメイン間の接触に関係しうるCH3ドメインに存在する任意のアミ
ノ酸残基のことを指す。この点については、第2の鎖の存在下および非存在下におけるC
H3ドメインの残基の溶媒接触可能表面積(solvent accessible surface area:ASA)の
算出において、2つの条件下の計算でASAに違い(>1Å2)を示す残基を接触残基と
同定する方法(Lee and Richards J. Mol. Biol.1971(55)379)を含む、公知の技術によ
り計算されうる。接触残基として同定された残基は、EUの番号方式に従うと、347,
349,350,351,352,353,354,355,356,357,360,
364,366,368,370,390,392,394,395,397,399,
400,405,407,409,439の位置にあるものである(表A)。
よい。本書で用いられる「荷電したアミノ酸残基」または「荷電残基」の語は、電気的に
荷電した側鎖を有するアミノ酸残基を意味する。これらは、アルギニン(Arg,R),
ヒスチジン(His,H)およびリシン(Lys、K)に存在するような正に荷電した側
鎖でもよいし、アスパラギン酸(Asp,D)およびグルタミン酸(Glu,E)に存在
するような負に荷電した側鎖でもよい。
ている側鎖をもたない他のすべてのアミノ酸を指す。これらの中立な残基には、セリン(
Ser,S),スレオニン(Thr,T),アスパラギン(Asn,N),グルタミン(
GLu,Q),システイン(Cys,C),グリシン(Gly,G),プロリン(Pro
,P),アラニン(Ala,A),バリン(Val,V),イソロイシン(Ile,I)
,ロイシン(Leu,L),メチオニン(Met,M),フェニルアラニン(Phe,F
),チロシン(Tyr,Y),およびトリプトファン(Trp,T)が含まれる。
H3ペアリング」、「ドメイン接触面」または単に「接触面」は、CH3ドメインを備え
る違うポリペプチドの2つのCH3ドメインの、アミノ酸残基の相互作用の結果としての
関連性を指す。すなわち、第1のCH3ドメインのアミノ酸および第2のCH3ドメイン
のアミノ酸の間の少なくとも1つの相互作用である。このような相互作用は、例えば、フ
ァン・デル・ワールス力、水素結合、水媒介水素結合、塩橋若しくはその他の静電気力、
芳香族側鎖の間の引力相互作用、ジスルフィド結合の形成、または他の公知の力である。
と前記第3および第4のCH3ドメインを備えるポリペプチドの、選択的ペアリングの前
記手段は公知のどんな手段でもよい。
はLのような大きなアミノ酸残基(すなわち「ノブ」または「突起」)が接触残基の位置
に含まれるCH3ドメインをコードし、一方で、少なくとも一つの他の核酸分子は、例え
ばG,A,S,TまたはVのような小さなアミノ酸残基(すなわち、「穴」または「空洞
」)が相補的な接触残基の位置に含まれるCH3ドメインをコードする。結果として得ら
れるCH3ドメインは、前記接触アミノ酸の立体コンフォメーションによりお互いにペア
となりやすい。ここで、ノブ・イントゥ・ホール技術については既に詳述した。
あった接触残基の位置に、すなわち、本来K,H,R,DまたはEであった位置に、野生
型と比較して逆の電荷を保持するアミノ酸を含むCH3ドメインをコードし、一方で、少
なくとも1つの他の核酸分子は、本来荷電した残基のあった相補的な接触残基の位置に、
野生型と比較して逆の電荷を保持するアミノ酸を含むCH3ドメインをコードする。結果
として得られた操作されたCH3ドメインは、前記接触アミノ酸の逆の電荷により互いに
ペアとなりやすい一方で、同一のCH3ドメイン同士では静電的反発力によりペアとなり
にくい。
開第2009/089004号、Gunasekaran et al (2010)に記載されたCH3の変異を
用いている。
択的ペアリングの手段は「ノブ」および「ホール」アミノ酸残基であり、前記第3および
第4のCH3ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングの手段は電荷が操作され
たアミノ酸である。好ましくは、前記第1および第2のCH3ドメインを備えるポリペプ
チドと前記第3および第4のCH3ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングの
両方の前記手段は、電荷を操作されたアミノ酸である。
択的ペアリングのために操作されたアミノ酸残基と比較して、前記第1および第2のCH
3ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングのために操作されたアミノ酸残基は
異なる。
れるCH3ドメインの新規の変異をコードする。以下で詳述するように、本発明は、顕著
な量の望ましくない(二量体の)副産物を生産することなく、目的とする特定の二重特異
性Ig様分子の生産を可能にする新規のCH3変異を提供する。さらに、本発明は、顕著
な量の望ましくない(二量体の)副産物を生産することなく、目的とする特定の単一特異
性Ig様分子の生産を可能にする新規のCH3変異を提供する。従って、本発明によるこ
れらのCH3変異のうち少なくとも一つの使用が好まれる。
の語は、ペプチド結合を通して、共有結合によりつながれたアミノ酸の鎖を指す。蛋白質
は一般に一または二以上のポリペプチド分子で構成される。全てのポリペプチドにおいて
、アミノ末端、またはN末端と呼ばれる一方の端、は遊離アミノ基を有している。遊離カ
ルボキシル基を持つもう一方の端は、カルボキシル末端またはC末端と呼ばれる。本発明
によるポリペプチドは、例えばグリコシル化のような、翻訳後修飾のプロセスを受けうる
。従って、本発明のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖は、少なくともIg・CH3
ドメインを包含したポリペプチド鎖を指し、翻訳後修飾を受けたものも含みうる。
び/またはRNAからなる分子として定義される。一実施形態では、二本鎖RNAが用い
られる。他の実施形態では、本発明の核酸分子は、例えば、DNA/RNAらせん、ペプ
チド核酸(peptide nucleic acid:PNA)、ロックド核酸(locked nucleic acid:LNA)お
よび/またはリボザイムのような他の種類の核酸構造を備える。従って、「核酸分子」の
語は、非天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチドおよび/または天然ヌクレオチドと同一の
機能を示す非核酸の構成要素を備える鎖をも包含する。
法において、前記方法は、前記宿主細胞に、少なくとも第1、第2、第3および第4のC
H3ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする核酸配列を導入する工程を備え、少な
くとも2つの前記核酸配列で、前記第1および第2のCH3ドメインを備えるポリペプチ
ドと前記第3および第4のCH3ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングの手
段を備え、前記核酸配列は順々にまたは同時に導入される方法を提供する。
を作成する方法において、前記方法は、前記宿主細胞に、少なくとも第1および第2のC
H3ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする核酸配列を導入する工程を備え、前記
第1のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖は中立的なアミノ酸残基から正に帯電した
アミノ酸残基への少なくとも1つの置換を備え、前記第2のCH3ドメインを備えるポリ
ペプチド鎖は中立なアミノ酸残基から負に帯電したアミノ酸残基への少なくとも1つの置
換を備え、前記核酸配列は、順々にまたは同時に導入される。前記宿主細胞を作製する前
記方法は、好ましくは、前記宿主細胞に共通の軽鎖をコードする核酸配列を導入する工程
を備える。
ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする核酸配列を備える組み換え宿主細胞におい
て、少なくとも2つの前記核酸分子で、前記第1および第2のCH3ドメインを備えるポ
リペプチドと前記第3および第4のCH3ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリ
ングの手段を備える。
鎖をコードする核酸配列を備える組み換え宿主細胞において、前記第1のCH3ドメイン
を備えるポリペプチド鎖は、中立的なアミノ酸残基から正に帯電したアミノ酸残基への少
なくとも1つの置換を備え、前記第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖は、中立
的なアミノ酸残基から負に帯電したアミノ酸残基への少なくとも1つの置換を備える組み
換え宿主細胞が提供される。
る。
胞でもよい。例えば、Escherichia (例えば、 E. coli ), Enterobacter, Salmonalla, B
acillus, Pseudomonas, Streptomyces, のような細菌、S. cerevisiae, K. lactis, P.
pastoris, Candida, または Yarrowiaのような酵母、Neurospora, Aspergillus oryzae,
Aspergillus nidulans および Aspergillus nigerのような糸状菌、Spodoptera frugiper
da SF-9または SF-21細胞のような昆虫細胞、および、好適には、CHO(Chinese hamst
er ovary)細胞、BHK細胞、SP2/0細胞およびNS−0ミエローマ細胞を含むマウ
ス細胞、COSおよびVero細胞のような霊長類の細胞、MDCK細胞、BRL 3A細胞、
ハイブリドーマ、腫瘍細胞、不死化した初代細胞、W138、HepG2、HeLa、H
EK293、HT1080またはPER.C6のような胚性の網膜細胞等の哺乳類の細胞が含ま
れる。
類の細胞の発現ベクターおよび宿主を用いることがある。ヒト細胞株、好ましくはPER.C6
は、ヒトにおけるグリコシル化パターンと一致する抗体を得るために、有利に用いられる
。細胞を育てまたは増殖させるための条件(Tissue Culture, Academic Press, Kruse an
d Paterson, editors (1973)参照)および組み換え産物の発現の条件とはいくぶん異なる
こともある。また、当業者に一般的に知られている方法により、生産物の割合および/ま
たは細胞の成長を互いに増加させるようにプロセスの最適化が通常行われる。
術はMammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach (M. Butler, ed., IRL Pres
s, 1991)で知ることができる。組み換え宿主細胞での抗体の発現は公知文献に幅広い記載
がある(例えば、欧州特許出願公開第0120694号、欧州特許出願公開第03141
61号、欧州特許出願公開第0481790号、欧州特許出願公開第0523949号、
米国特許第4816567号、国際公開第00/63403号)。軽鎖および重鎖をコー
ドする核酸分子は染色体外コピーおよび/または安定的に宿主細胞の染色体に統合されう
るが、後者が好ましい。
可能な若しくは本発明による方法で得られる組み換え宿主細胞の培養物において、前記培
養物は少なくとも、2つの異なるIg様分子か、またはヘテロ二量体Ig様分子のいずれ
かを生産するものが提供される。
いて、このような発現を誘導することができる配列は、CH3ドメインを備えるポリペプ
チドをコードする核酸分子の配列と機能的に関連があることが知られている。機能的に関
連がある、という意味は、CH3ドメインを備えるポリペプチドまたはその前駆物質をコ
ードする核酸配列は、CH3ドメインを備えるポリペプチドまたはその前駆物質の発現を
誘導することができるという点で、発現を誘導できる配列と関連している、ということで
ある。
でに入手可能である。目的とするポリペプチドをコードする配列が、コードされたポリペ
プチドの転写および翻訳を統御する配列について適切に挿入された場合、結果として得ら
れる発現カセットは目的とするポリペプチドを生産、言い換えれば発現、するのに有用で
ある。
含む。これらは宿主細胞で機能できる必要があり、これにより機能的に関連がある核酸配
列の発現を誘導する。プロモーターは恒常的でも調節性でもよく、ウィルス、原核生物若
しくは真核生物由来を含む様々な資源から得られ、または人工的に設計することができる
。
性のプロモーターによって起きうる。よく知られ、よく使われている、真核細胞での発現
のプロモーターには、アデノウィルスのような、ウィルス由来のプロモーター(例えばE
1Aプロモーター),サイトメガロウィルス(CMV)由来のプロモーター(例えばCM
V最初期(immediate early: IE)プロモーター),サルウィルス40(SV40)由来
のプロモーター等が含まれる。真核細胞からも適したプロモーターを得ることができ、メ
タロチオネイン(MT)プロモーター,伸長因子1α(EF−1α)プロモーター,アク
チンプロモーター,免疫グロブリンプロモーター,熱ショックプロモーター等がある。
エンハンサー/プロモーターは本発明に好適である。一実施形態において、発現を誘導で
きる配列は、CMVプロモーターの領域を備え、好適にはCMV最初期遺伝子エンハンサ
ー/プロモーターの−735から+95のヌクレオチド領域を備える。当業者は気づくだ
ろうが、本発明で用いられている発現配列は、インスレーター、マトリックス結合領域、
STARエレメント(STAR elements:国際公開第03/004704号)等のような発
現を安定化または促進する要素の組み合わせが好ましいだろう。これにより発現の安定性
および/または水準を高めることができる。
cience, 1995, Coligan JE, Dunn BM, Ploegh HL, Speicher DW, Wingfield PT, ISBN 0-
471-11184-8,Bendig, 1988に述べられているように幅広く記載がある。細胞の培養は、
その細胞に代謝させ、および/または成長させ、および/または分裂させ、および/また
は目的とする蛋白質を産生させることによってなる。これは当業者に公知の方法により達
成され、細胞に栄養を与えることを含むがそれだけではない。この方法には、表面に付着
しながら増殖する方法、懸濁液で増殖させる方法、またはこれらの組み合わせを含む。
ができる。培養は、例えば皿、ローラーボトル若しくは反応槽の中で、バッチ培養、流加
培養、連続培養、中空糸による培養等によりなされる。細胞培養により、大規模に(連続
的な)組み換えタンパク質の生産をするためには、細胞に懸濁液の中で増殖させることが
好ましいことが知られている。また、動物若しくはヒト由来血清または動物若しくはヒト
由来の血清の構成要素が無い条件下で細胞の培養をさせることが好ましいことが知られて
いる。こうして培地からの追加の動物若しくはヒト由来の蛋白質が無いため、精製は容易
になり安全性が高まる。一方で合成培地が再現性の点で最適であるため、システムもとて
も信頼できるものになる。
当業者に知られている方法により回収される。回収後、これらのIg様分子は公知の方法
を用いて精製されうる。このような方法には、免疫沈降法、遠心分離法、ろ過、サイズ排
除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、陽イオンおよび/または陰イオン交
換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー等が含まれる。IgG分子を
含む抗体の混合物には、プロテインAまたはプロテインG親和性クロマトグラフィーが好
適に用いられうる(例えば、米国特許4801687および米国特許5151504参照
)。
しくは共通の軽鎖を有する。従って、さらに提供されるのは、本発明による方法において
、前記宿主細胞に共通の軽鎖をコードする核酸分子を与える工程をさらに備える。これは
少なくとも2つの異なる重鎖とペアリングできる軽鎖であり、それにより機能的な抗原結
合ドメインを形成する。機能的な抗原結合ドメインは1つの抗原に特異的に結合すること
ができる。
を用いることが好ましい。これにより、機能的な抗原結合ドメインの形成において、適合
しない重鎖と軽鎖のミスペアリングを避けることができる。一態様において、1つのみの
同一のアミノ酸配列の、共通の軽鎖を用いることができる。別の方法では、アミノ酸配列
が同一でなくとも、機能的に等価な軽鎖を「共通」の意味に含めることを当業者は認識で
きるだろう。前記軽鎖の多くの変異型が存在し、これらは変異(欠失、置換、付加)が存
在するが機能的結合領域の形成に実質的に影響しない。従って、このような変異体も異な
る重鎖に結合することができ、機能的な抗原結合ドメインを形成する。
一方で重鎖とのペアリング後の結果としてできる抗体が結合特異性を保持している軽鎖を
指す。例えば、保存的なアミノ酸の変化、および/または重鎖とのペアになった時の結合
特異性に寄与しないか、部分的にしか寄与しない領域のアミノ酸の変化等を導入および試
験することにより、同一の軽鎖でなくとも、なおも機能的に等価な軽鎖を作成し、または
見つけることが可能である。
組み合わせが含まれる。共通の軽鎖の使用についての詳細な説明は、国際公開第2004
/009618号に記載がある。好ましくは、本発明で用いられる共通の軽鎖は、生殖細
胞系列様由来の軽鎖であり、より好ましくは、生殖細胞系列由来の軽鎖であり、好ましく
は、再構成されたヒト生殖細胞系列由来κ軽鎖であり、最も好ましくは、再構成されたヒ
ト生殖細胞系列由来κ軽鎖IgVκ1−39/JκまたはIGVκ3−20/Jκである
。
ペアリングを避けるため、当業者は、例えば国際公開第2009/080251号,国際
公開第2009/080252号および/または国際公開2009/080253号に説
明されているような、重鎖および軽鎖の強制ペアリングの手段を選択しうる。
CH3ドメインを提供する。本発明の前には、CH3−CH3ペアリングに関わることが
知られているCH3ドメインの荷電した接触アミノ酸が、逆の電荷(電荷反転)のアミノ
酸に置換され、これによりCH3−CH3ペアリングに影響を与えた。
において、荷電していないか、または中立なCH3のアミノ酸が荷電残基に置換されるか
らである。本発明のこの実施形態では、荷電した接触アミノ酸を反対の電荷のアミノ酸に
交換するのではなく、荷電していないCH3アミノ酸を荷電したものに置換する。
だけでなく、CH3接触面において、少なくとも1つの追加の電荷−電荷相互作用が創ら
れるという有利な点がある。CH3−CH3接触面に存在する電荷のペアに加えて、この
追加の電荷−電荷相互作用により、本発明による二量体は、野生型の二量体(野生型の二
量体は、CH3操作がされていない二重特異性IgG(AB)として定義され、親のホモ
二量体(AAまたはBB)と対照をなす)と比較して一般的により安定である。
らに増加させることが可能である。上述の通り、一般的に、二重特異性抗体を優先的に生
産する公知の方法では、望ましくない二量体の副産物が生産される。例えば、ノブ・イン
トゥ・ホール技術を用いると、目的とする二重特異性抗体の割合はせいぜい87%である
。一方で、荷電した接触アミノ酸が反対の電荷のアミノ酸に置換される静電的な操作のア
プローチでは、96%の割合になる(例えば、実施例11を参照)。
高める変異を導入することに成功した。例えば、実施例17では、本発明による変異を用
いた方法で、結果の混合物中に二量体の副産物が全く検出されないほどの高い割合の目的
とする二重特異性抗体が得られることが示されている。1つの重鎖が共通の軽鎖と対にな
っただけの、ペアとなっていない半分子はある程度混合物中に存在するが、これらは重鎖
の不均衡な発現の結果で、サイズ排除クロマトグラフィーにより混合物から簡単に分離で
きる。
ずに、単一細胞で高い割合の、医薬組成品に特に好適な二重特異性のIg様分子が生産さ
れる。
産する方法において、前記Ig様分子は、接触面を形成することができる2つのCH3ド
メインを備え、前記方法は、前記細胞に、
a. 第1のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第1の核酸分子
b. 第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第2の核酸分子
を与える工程を備え、前記第1のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖は、中立的なア
ミノ酸残基から正に荷電したアミノ酸残基への少なくとも1つの置換を備え、前記第2の
CH3ドメインを備えるポリペプチド鎖は、中立的なアミノ酸残基から負に荷電したアミ
ノ酸残基への少なくとも1つの置換を備え、前記方法は、前記宿主細胞を培養し、前記2
つの核酸分子を発現させ、前記ヘテロ二量体Ig様分子を培養から回収する工程をさらに
備える。
好ましくは、前記方法は、前記宿主細胞に共通の軽鎖をコードする核酸分子を与える工
程をさらに備えるが、それによる有利な点の概要は上述した。
置351にあるアミノ酸は、CH3−CH3接触面において接触残基のペアとなることが
報告されている。つまり、これらは結果として得られるIg様分子の三次元のコンフォメ
ーションにおいて十分近くに位置しており、お互いに相互作用することができる。従って
、第1のCH3ドメインは第2のCH3ドメインと優先的にペアとなる。
の荷電アミノ酸に置き換えられ、第2のCH3ドメインの位置351のロイシン(L)は
第2の荷電アミノ酸に置き換えられ、前記第1および第2の荷電したアミノ酸は反対の電
荷を有する。もし、荷電残基を位置366に保持する第1のCH3ドメインを備えるポリ
ペプチドが、抗原Aに対する特異性をもった可変領域をさらに備え、そして、もし、反対
の電荷の荷電残基を位置351に保持する第2のCH3ドメインを備えるポリペプチドが
、抗原Bに対する特異性をもった可変領域をさらに備える場合、AB特異性をもった二重
特異性Ig様分子が支配的に形成される。
るポリペプチドの選択的ペアリングの前記手段、または前記第3および第4のCH3ドメ
インを備えるポリペプチドの選択的ペアリングの前記手段は、前記第1または第3のCH
3ドメインの位置366のスレオニンを第1の荷電アミノ酸にする置換および前記第2ま
たは第4のCH3ドメインの位置351のロイシンを第2の荷電アミノ酸にする置換であ
り、前記第1および第2の荷電アミノ酸は反対の電荷を有する。
(例えば、Aに特異的)をさらに備えるポリペプチドの位置366において、スレオニン
(T)をリシン(K)にする置換、および第2のCH3ドメインを備え、可変領域(例え
ば、Bに特異的)をさらに備えるポリペプチドの位置351において、ロイシン(L)を
アスパラギン酸(D)にする置換である。これは、T366K/L351’Dのペアの変異と表示さ
れる。
位置351のアミノ酸はCH3−CH3接触面における接触残基のペアであると報告され
ている。位置366に導入されたリシンおよび位置351に導入されたアスパラギン酸は
反対の電荷を有し、これらのアミノ酸は静電的にお互いを引き合う。従って、第1のCH
3ドメインは第2のCH3ドメインを選択的に引きつける。また、位置366にリシンを
有する第1のCH3ドメインと位置351にアスパラギン酸を有する第2のCH3ドメイ
ンとのペアのIg様分子が支配的に形成される。
て、もし第2のCH3ドメインを備えるポリペプチドが抗原Bに対する特異性を有する場
合、「AB」特異的な二重特異性Ig様分子が支配的に形成される。注記すると、いくつ
かの実施形態において、前記第1および第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖の
可変領域は両方とも同一かもしれないが、その場合は単一特異性Ig様分子(例えば、「
AA」特異性)の形成が結果的に生じる。
の相互作用の置き換えの代わりに、新しく導入された荷電アミノ酸のペアの間の新規な相
互作用が生成される。この点は、これまでに開示または示唆はされていない。
の本発明による生産方法においては、前記第1のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖
はアミノ酸置換T366Kを備え、前記第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖は
アミノ酸置換L351Dを備える。
前記Ig様分子は接触面を形成することができる2つのCH3ドメインを備え、前記方法
は、前記細胞に、
−第1のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第1の核酸分子、および
−第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第2の核酸分子
を与えることを備え、前記第1のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖はアミノ酸置換
T366Kを備え、前記第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖はアミノ酸置換L
351Dを備え、前記方法は、前記宿主細胞を培養し、前記核酸分子を発現させ、前記ヘ
テロ二量体Ig様分子を培養から回収する工程をさらに備える。
g様分子を生産することが可能になる。これにより、ホモ二量体の混入は、5%より少な
く、好ましくは2%より少なく、より好ましくは1%より少なく、または、最も好ましく
はホモ二量体の混入を実質的になくすことができる。
前記Ig様分子は接触面を形成することができる2つのCH3ドメインを備え、混在する
ホモ二量体の存在は5%より少なく、好ましくは2%より少なく、より好ましくは1%よ
り少なく、最も好ましくはホモ二量体の混入は実質的になく、前記方法は、前記細胞に、
−第1のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第1の核酸分子、および
−第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第2の核酸分子
を与える工程を備え、前記第1のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖は、アミノ酸置
換T366Kを備え、前記第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖は、アミノ酸置
換L351Dを備え、前記方法は、前記宿主細胞を培養し、前記2つの核酸分子を発現さ
せ、前記ヘテロ二量体のIg様分子を培養から回収する工程をさらに備える。
本発明によるヘテロ二量体Ig様分子の生産方法においては、前記第1のCH3ドメイン
を備えるポリペプチド鎖はさらにアミノ酸置換L351Kを備える。さらに好ましくは、
前記第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖は、Y349E、Y349DおよびL
368Eよりなる群から選択されたアミノ酸置換をさらに備える。最も好ましくは、前記
第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖は、アミノ酸置換L368Eを備える。
2のCH3ドメインの位置368におけるロイシン(L)をグルタミン酸(E)にする置
換とさらに組み合わせることができる。これは、例えば、T366K/L351’D, L368’E変異と
表示できる(しかし、T336K/L351D-L368EまたはT366K/L351D, L368EまたはT366K-L351D,L
368Eのような別の方法による表示も可能である)。
インを備えるポリペプチドおよび抗原Bに特異性を持つ第2のCH3ドメインを備えるポ
リペプチドへのこの変異の導入により、二面性のAB特異性をもつ二重特異性Ig様分子
を特に良い割合で得ることができる。このペアの変異により、検知できる量のホモ二量体
の形成が無く、二重特異性抗体を得ることができる。
おいては、前記Ig様分子は接触面を形成することができる2つのCH3ドメインを備え
、混入するホモ二量体の存在は5%より少なく、好ましくは2%より少なく、より好まし
くは1%より少なく、そして最も好ましくは混入するホモ二量体が実質的に無く、前記方
法は、前記細胞に、
−第1のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第1の核酸分子、および
−第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第2の核酸分子
を与えることを含み、前記第1のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖はアミノ酸置換
T366Kを備え、前記第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖はアミノ酸置換L
351DおよびL368Eを備え、前記方法は、前記宿主細胞を培養し、前記2つの核酸
分子を発現させ、前記ヘテロ二量体Ig様分子を培養から回収する工程をさらに備える。
T)をリシン(K)に、第2のCH3ドメインの位置351のロイシン(L)をアスパラ
ギン酸(D)に、前記第2のCH3ドメインの位置349のチロシン(Y)をグルタミン
酸(E)に置換する。これは例えばT366K/L351’D,Y349’E変異と表示されるほか、例え
ばT366K-L351D:Y349EまたはT366K/L351D,Y349Eまたは単にT366K/L351DY349Eと表示される
。
silicoのデータによれば、Y349Eは、単一二量体の不安定化(より高い計算上のス
コア)だけでなく、ヘテロ二量体の安定性(より低い計算上のスコア)にもつながり、位
置349においてはアスパラギン酸(D)よりもグルタミン酸(E)の方がより好ましい
。従って、すでに位置351のアミノ酸置換を有する、第2のCH3ドメインを備えるポ
リペプチドに第2のアミノ酸置換を導入すると、ヘテロ二量化が起きやすくなる。
方法においては、前記Ig様分子は、接触面を形成することができる2つのCH3ドメイ
ンを備え、ホモ二量体の混入は5%より少なく、より好ましくは2%より少なく、さらに
より好ましくは1%より少なく、最も好ましくは実質的に無く、前記方法は、前記細胞に
、
−第1のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第1の核酸分子、および
−第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第2の核酸分子
を与えることを備え、前記第1のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖はアミノ酸置換
T366Kを備え、前記第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖はアミノ酸置換L
351DおよびY349Eを備え、前記方法は、前記宿主細胞を培養し、前記2つの核酸
分子を発現させ、前記ヘテロ二量体のIg様分子を培養から回収する工程をさらに備える
。
T)をリシン(K)に、第2のCH3ドメインの位置351のアスパラギン酸(D)をロ
イシン(L)に、前記第2のCH3ドメインの位置349のチロシン(Y)をグルタミン
酸(E)に、前記第2のCH3ドメインの位置368のロイシン(L)をグルタミン酸(
E)に置換する。これはT366K/L351’D,Y349’E,L368’E変異と表示される。2つの残基
Y349およびL368は二量体の相互作用に寄与しうる残基である。
(より高いin silicoのスコア)だけでなく、ヘテロ二量体の安定化(より低いin silico
のスコア)につながり、位置349および368のグルタミン酸は、アスパラギン酸(D
)よりも好ましい。従って、すでに位置351にアミノ酸置換を有するB−鎖に、第2お
よび第3のアミノ酸置換を導入することで、ヘテロ二量体の形成がさらに促進される。
法においては、前記Ig様分子は接触面を形成することができる2つのCH3ドメインを
備え、ホモ二量体の混入は5%より少なく、より好ましくは2%より少なく、さらにより
好ましくは1%より少なく、最も好ましくは実質的に無く、前記方法は、前記細胞に、
−第1のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第1の核酸分子、および
−第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第2の核酸分子
を与える工程を備え、前記第1のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖はアミノ酸置換
T366Kを備え、前記第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖はアミノ酸置換L
351D、Y349EおよびL368Eを備え、前記方法は、前記宿主細胞を培養し、前
記2つの核酸分子を発現させ、前記ヘテロ二量体のIg様分子を培養から回収する工程を
さらに備える。
T)をリシン(K)に、前記第1のCH3ドメインの位置351のロイシン(L)をリシ
ン(K)に、第2のCH3ドメインの位置351のロイシン(L)をアスパラギン酸(D
)に、前記第2のCH3ドメインの位置368のロイシン(L)をグルタミン酸(E)に
置換する。これはT366K,L351K/L351’D,L368’E変異と表示される。実施例に示されてい
るように、この変異も目的の(二重特異性)抗体の割合を高める。さらに、この変異では
、検出できる量のホモ二量体の形成が無く、二重特異性抗体を得ることができる。
記Ig様分子は接触面を形成することができる2つのCH3ドメインを備え、ホモ二量体
の混入は5%より少なく、より好ましくは2%より少なく、さらにより好ましくは1%よ
り少なく、最も好ましくは実質的に無く、前記方法は、前記細胞に、
−第1のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第1の核酸分子、および
−第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第2の核酸分子
を与える工程を備え、前記第1のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖は、アミノ酸置
換T366KおよびL351Kを備え、前記第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド
鎖は、アミノ酸置換L351DおよびL368Eを備え、前記方法は、前記宿主細胞を培
養し、前記2つの核酸分子を発現させ、前記ヘテロ二量体のIg様分子を培養から回収す
る工程をさらに備える。
T)をリシン(K)に、前記第1のCH3ドメインの位置351のロイシン(L)をリシ
ン(K)に、第2のCH3ドメインの位置351のロイシン(L)をアスパラギン酸(D
)に、前記第2のCH3ドメインの位置349のチロシン(Y)をアスパラギン酸(D)
に、前記第2のCH3ドメインの位置355のアルギニン(R)をアスパラギン酸(D)
に置換する。これはT366K,L351K/L351’D,Y349’D,R355’D変異と表示される。このT366K
-L351K/L351’D-Y349’Dのペアは、B−鎖のR355’D変異によりさらに改善され、BBに
ついてのin silicoのスコアが高まり、ABについてのin silicoのスコアもわずかに高く
なる。
記Ig様分子は接触面を形成することができる2つのCH3ドメインを備え、ホモ二量体
の混在は5%より少なく、より好ましくは2%より少なく、さらにより好ましくは1%よ
り少なく、最も好ましくは実質的に無く、前記方法は、前記細胞に、
−第1のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第1の核酸分子、および
−第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第2の核酸分子
を与える工程を備え、前記第1のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖は、アミノ酸置
換T366KおよびL351Kを備え、前記第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド
鎖は、アミノ酸置換L351D、Y349DおよびR355Dを備え、前記方法は、前記
宿主細胞を培養し、前記2つの核酸分子を発現させ、前記ヘテロ二量体のIg様分子を培
養から回収する工程をさらに備える。
として、CH3ドメインに導入される変異の一覧である。
ヘテロ二量体Ig様分子の生産方法は、前記第1および第2のCH3ドメインを備えるポ
リペプチドの選択的ペアリングの前記手段および/または前記第3および第4のCH3ド
メインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングの前記手段は、少なくとも1つの表Bに
示された変異の組み合わせを備え、これにより提供される。好ましくは、前記第1および
第2のCH3ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングの前記手段と、前記第3
および第4のCH3ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングの前記手段は、少
なくとも2つの表Bに示された変異の組み合わせを備える。
の単一特異性Ig様分子の混合物を生産することができ、二重特異性Ig様分子の混入は
5%より少なく、好ましくは2%より多く、より好ましくは、1%より少なく、最も好ま
しくは実質的に無い。本発明によるこれらの変異は、単一特異性抗体の混合物の生産に特
に好適である。このことは、2つの同一の標的分子の高水準の架橋が望まれるとき、腫瘍
細胞の補体による溶解のような特定のエフェクター機構を活性化するため、標的細胞での
抗体の密度を十分高くする必要があるとき、若しくは2つの標的が互いに離れすぎて単一
の二重特異性抗体では結合されないとき、または規制の承認を得るための手続きを単純に
するために特に有用である。
化することがしばしば望まれる。実施例10に示され、本発明から洞察されるように、第
1のCH3ドメインを備えるポリペプチド(例えば、A特異性を有する)の位置392の
リシン(K)をアスパラギン酸(D)に置換し、前記第1のCH3ドメインを備えるポリ
ペプチドの位置399のアスパラギン酸(D)をリシン(K)に置換し、前記第1のCH
3ドメインを備えるポリペプチドの位置409のリシン(K)をアスパラギン酸(D)に
置換したとき、AA特異性をもつ単一特異性Ig様分子を含む少なくとも2つの異なる単
一特異性Ig様分子の混合物を単一細胞で生産することができ、二重特異性の副産物(二
重特異性Ig様分子)の形成は5%より少なく、または3%より少なく、または実質的に
全く検出されない程度にまで減少する。
性Ig様分子の混合物の生産には特に好ましい。当業者ならば、機能的な変異体、すなわ
ち、K392E, D399R, K409Eは結果として同様の効果を挙げることができると認識できるだ
ろう。加えて、D399KおよびK409Dの置換を備える二重の変異体、または、K392DおよびK40
9D,D399RおよびK409E等も同様の効果を挙げることができるだろう。
ン(K)に、前記第1のCH3ドメインを備えるポリペプチドの位置357のグルタミン
酸(E)をリシン(K)に、前記第1のCH3ドメインを備えるポリペプチドの位置43
9のリシン(K)をアスパラギン酸(D)に、前記第1のCH3ドメインを備えるポリペ
プチドの位置370のリシン(K)をアスパラギン酸(D)に置換する場合の変異の組み
合わせでも同様である。この変異の組み合わせ(E356K, E357K, K439D, K370Dと表示され
る)も単一特異性Ig様分子の混合物の生産に特に好ましい。
同様の効果を挙げることができると認識できるだろう。加えて、E356KおよびK439D,E357
KおよびK370Dの置換を備えた三重若しくは二重変異体、またはその他の機能的な変異体も
同様の効果を挙げることができるだろう。
異性のIg様分子の生産方法では、前記2つのIg様分子のそれぞれは接触面を形成する
ことができる2つのCH3ドメインを備え、前記方法は、前記細胞に、
−A特異性を有する第1のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第1の核
酸分子、および
−B特異性を有する第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第2の核
酸分子
を与える工程を備え、前記第1のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖は、K392D
,D399KおよびK409Dの変異を備え、前記第2のCH3ドメインを備えるポリペ
プチド鎖は、野生型のCH3ドメインを備えるか、またはE356K,E357K,K4
39DおよびK370D変異を備え、前記方法は、前記宿主細胞を培養し、前記核酸分子
を発現させ、前記少なくとも2つの異なるIg様分子を培養から回収する工程をさらに備
える。
g様分子の生産方法では、前記2つのIg様分子のそれぞれは接触面を形成することがで
きる2つのCH3ドメインを備え、前記方法は、前記細胞に、
−A特異性を有する第1のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第1の核
酸分子、および
−B特異性を有する第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第2の核
酸分子
を与える工程を備え、前記第1のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖は、野生型のC
H3ドメインを備えるか、K392D,D399K,K409Dの変異を備え、前記第2
のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖は、E356K,E357K,K439D,K
370D変異を備え、前記方法は、前記宿主細胞を培養し、前記核酸分子を発現させ、前
記少なくとも2つの異なるIg様分子を培養から回収する工程をさらに備える。
二重特異性Ig様分子の形成は実質的に検出されない。当業者ならば、野生型または操作
されたCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第3の核酸分子を選択し、3
つの単一特異性抗体の混合物が生産される等のように前記宿主細胞に提供しうる。
子の生産方法、またはヘテロ二量体Ig様分子の生産方法においては、それぞれのCH3
ドメインを備えるポリペプチド鎖は異なる標的エピトープを認識する可変領域をさらに備
え、その標的エピトープは同一分子上に位置する。
生物学的)機能に、より効率的な拮抗作用を与えることができる。例えば、ヘテロ二量体
Ig様分子は、増殖因子の受容体若しくは腫瘍細胞が増殖するために重要な水溶性の分子
等に存在する2つのエピトープに同時に結合しうる。これにより、いくつかの独立したシ
グナル伝達経路を効率的に阻害し、制御されていない増殖に導きうる。そして、少なくと
も2つのIg様分子のいかなる組み合わせにおいて、このような増殖因子の受容体または
水溶性の分子に存在する2または3、または4のエピトープに同時に結合しうる。
おいては、標的分子は膜結合性分子である。
方法またはヘテロ二量体Ig様分子の生産方法では、それぞれのCH3ドメインを備える
ポリペプチド鎖は、標的エピトープを認識する可変領域をさらに備え、標的エピトープは
異なる分子に位置する。この場合では、それぞれの異なる標的分子は水溶性の分子または
膜結合性分子としうる。
分子は水溶性分子である一方、2番目の標的分子は膜結合性分子である。さらに別の場合
においては、標的分子の両方は膜結合性の分子である。一実施形態においては、異なる標
的分子は同一の細胞に発現しており、他の実施形態では異なる細胞に異なる標的分子が発
現される。
子の任意の組み合わせは、複数の膜結合性受容体を同時に阻害したり、腫瘍細胞へのサイ
トカイン若しくは増殖因子のような複数の水溶性分子を同時に中立化したり、または異な
るウィルス血清型若しくはウィルス株を中立化したりするのに好適である。
様分子の本発明による生産方法においては、少なくとも前記標的エピトープのうちの1つ
は腫瘍細胞に位置する。別の方法において、またはこれに加えて、少なくとも前記標的エ
ピトープのうちの1つはエフェクター細胞の表面に位置する。これは、例えば腫瘍細胞の
殺傷のためのT細胞またはNK細胞の動員に好適である。例えば、本発明による方法で生
産された少なくとも1つのIg様分子は、免疫エフェクター細胞に位置する標的分子に特
異的に結合することにより、免疫のエフェクター細胞、好ましくはヒト免疫エフェクター
細胞、を動員することができる。
ター細胞は活性化される。エフェクター機構の誘導には、例えば、本発明による方法によ
り生産されたIg様分子による、免疫で調節された細胞毒性の再変更が包含される。該I
g様分子は、T細胞受容体またはFcγ受容体のように細胞毒性を引き起こす分子に結合
することができ、これにより下流の免疫エフェクター経路を活性化することができる。
化されることにより、標的細胞の生存能力に影響を与える哺乳類の免疫システムの自然の
細胞集団のレパートリーを指す。免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー(NK)細
胞のようなリンパ球系の細胞、細胞傷害性T細胞を含むT細胞、またはB細胞を含むだけ
でなく、単球やマクロファージ、樹状細胞および好中性顆粒球のような骨髄細胞系列の細
胞も免疫エフェクター細胞とみなされる。従って、前記エフェクター細胞は、好ましくは
、NK細胞、T細胞、B細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞または好中性顆粒球であ
る。
,CD64,CD89,NKG2DおよびNKp46が含まれる。さらに提供されるのは
、本発明による、少なくとも2つの異なるIg様分子の生産方法またはヘテロ二量体Ig
様分子の生産方法であって、前記標的エピトープはCD3,CD16,CD25,CD2
8,CD64,CD89,NKG2DまたはNKp46分子に位置する。標的細胞の生存
能力には、細胞の生存、増殖および/または他の細胞との相互作用する能力が含まれる。
それぞれのCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖は、標的エピトープを認識する可変領
域をさらに備える。一実施形態においては、CH3ドメインを備えるポリペプチド鎖のそ
れぞれの2つの可変領域は、同一の標的エピトープを、異なる親和性で認識する。他の実
施形態においては、CH3ドメインを備えるポリペプチド鎖のそれぞれの2つの可変領域
は、異なる標的エピトープを認識する。
子は、膜結合性分子または水溶性分子でありうる。他の実施形態においては、異なる標的
エピトープは、異なる標的分子に位置し、該標的分子は、同一の細胞または異なる細胞に
発現される。あるいは、異なる標的分子は水溶性分子であるか、または1つの標的分子は
水溶性分子で2番目の標的分子は膜結合性分子でありうる。
腫瘍細胞に位置する。さらに他の好適な一実施形態においては、ヘテロ二量体Ig様分子
の少なくとも1つの標的分子は、エフェクター細胞(すなわち、NK細胞、T細胞、B細
胞、単球、マクロファージ、樹状細胞または好中性顆粒球、そして前記標的エピトープは
CD3,CD16,CD25,CD28,CD64,CD89,NKG2DまたはNKp
46分子に位置する)に位置する。
方法またはヘテロ二量体Ig様分子の生産方法では、上述のように、前記少なくとも2つ
の異なるIg様分子は抗体であり、最も好ましくはIgGアイソタイプの抗体であり、さ
らにより好ましくはIgG1アイソタイプの抗体である。
も2つのIg様分子の混合物がさらに提供される。前記(ヘテロ二量体)Ig様分子また
はIg様分子の混合物は、好ましくは、少なくとも1つの表Bに記載されたCH3変異を
備える。本発明による、少なくとも1つのIg様分子、または少なくとも2つのIg様分
子の混合物を含む医薬組成物だけでなく、(ヘテロ二量体)Ig様分子または少なくとも
2つのIg様分子の混合物において、少なくとも1つの表Bに記載された変異を備えるも
のも提供される。
分子である。他の実施形態においては、前記Ig様分子は、単一特異性抗体のような単一
特異性Ig様分子である。好適な一実施形態が提供する、本発明による方法で得られる少
なくとも2つの異なるIg様分子の混合物では、前記少なくとも2つの異なるIg様分子
は、同一の抗原にある異なるエピトープおよび/または異なる抗原にある異なるエピトー
プに結合する。
記ヘテロ二量体Ig様分子は、同一の抗原にある異なるエピトープおよび/または異なる
抗原にある異なるエピトープに結合する。この混合物および抗体の利点および好適な使用
法は上述した。
子の混合物では、前記少なくとも2つの異なるIg様分子は少なくとも1つのヘテロ二量
体Ig様分子を備える。一実施形態において、2つの前記少なくとも2つの異なるIg様
分子はヘテロ二量体Ig様分子である。
インを備え、前記2つのCH3ドメインの1つはアミノ酸置換L351DおよびL368
Eを備え、前記2つのCH3ドメインの他の一つはアミノ酸置換T366KおよびL35
1Kを備える。これらのアミノ酸置換は、上述したように、前記2つのCH3ドメインの
選択的ペアリングの好適な手段である。
、前記2つのCH3ドメインのもう一方のアミノ酸置換T366KおよびL351Kは、
あわせて、「DEKK組み合わせ変異」,「DEKK変異体」,「DEKKペア」,「D
EKK操作されたCH3ドメイン」,「DEKK」と呼ぶか、またはDEKKに言及する
他の名前が用いられる。アミノ酸置換L351DおよびL368Eを保持するCH3ドメ
インも「DE側」と呼び、アミノ酸置換T366KおよびL351Kを保持するCH3ド
メインも「KK側」と呼ぶ。
とも2つのIg様分子の混合物を含む医薬組成物も提供される。本発明による、前記(ヘ
テロ二量体)Ig様分子、または前記少なくとも2つのIg様分子は、好ましくは抗体で
ある。前記医薬組成物は前記(ヘテロ二量体)Ig様分子、単一特異性若しくは二重特異
性Ig様分子を含む混合物または単一特異性および二重特異性Ig様分子の組み合わせを
含む。
る、このような「薬学的に容認可能な担体」は、任意の、そして全ての溶媒、塩、分散媒
、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収を遅らせる薬剤、およびこ
れらに類似の生理学的に混合可能なもの等である。投与するルート(例えば、静脈内、皮
下、関節内等)により、Ig様分子は、Ig様分子を不活性化しうる酸の作用およびその
他の自然の条件からIg様分子を守るための物質にコートされうる。
Ig様分子の混合物を備える医薬組成物では、前記少なくとも2つの異なるIg様分子は
本発明による組み換え宿主細胞により生産される。さらに、提供される医薬組成物では、
本発明による任意の方法により得られるヘテロ二量体Ig様分子を備え、前記ヘテロ二量
体Ig様分子は本発明による組み換え宿主細胞により生産される。
鎖をコードする核酸分子に加え、少なくとも1つの表Bに記載された変異を備えるCH3
ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする少なくとも1つの核酸分子を備える組み換
え宿主細胞も提供される。
のではなく、本発明を単に明瞭にするために示される。
CH3ドメインを備えるIg様分子のペアリングを選択的に促進するかまたは阻害し、
CH3ドメインの異なる多種多様なIg様分子を得るため、ヘテロ二量体の形成を促進す
ると知られている多くのアミノ酸置換および、これまで報告のない、または試されていな
いがホモ二量体の形成を促進するように選ばれた多くの別のアミノ酸置換を、コンストラ
クトベクターに導入した(コンストラクトベクターMV1057;図1A)。
c部をコードする核酸配列を備える。表1はこの野生型Fcに導入されたアミノ酸置換の
リストであり、一連の7つのコンストラクトとなる。すべてのコンストラクトはGeneart
により作成された。コンストラクト1,2および3,またはその代替物は、これまでにヘ
テロ二量化を促進する報告があった(欧州特許出願公開第01870459号、国際公開
第2009/089004号)。コンストラクト6および7についても報告がある(国際
公開第98/50431号)。コンストラクト4および5は新しく、ホモ二量体を促進す
るよう設計されている。
これらのコンストラクトへのクローニングに、既知の特異性をもち、また既知のヒトIG
KV1-39軽鎖との結合能をもついくつかの抗体VH領域が用いられた。
上述のように、すべてのCH3変異体は、他の抗体ドメインと共に用いられることで、
二重特異性または単一特異性の抗体全長となりうる。VH/VLの組み合わせにより定め
られる抗体の特異性は、CH3ドメインにより誘導される重鎖の二量化の挙動には影響し
ない。モデルとなるVH/VLの組み合わせ、つまり、全ての軽鎖はヒト生殖細胞系列IG
KV1-39に基づき、VHは様々である組み合わせが、本研究を通じて用いられる。
はMerus社の様々なVHに対する内部の称呼であり、例えば、VH MF1337は破傷風トキソイ
ドに、MF1025はブタチログロブリンに、MF1122はウシフィブリノーゲンに特異性を有する
。
びBstEII(New England Biolabs/ cat# R0123L および R0162L/、製造業者の指示に従う
)により切断され、このベクターからVHフラグメントが切り出される。標準的な方法(
製造業者の指示に従う)により、ベクターMV1057はSfiIおよびBstEIIによって切断される
。
において精製され、切られたベクターおよびVH遺伝子挿入物は単離される。両方はライ
ゲーションにより結合され、その後、連結された核酸はE.coli DH5α(Invitrogen/ cat#
12297-016)に形質転換される(製造業者の指示に従う)。翌日、単一のコロニーが選び
出され、適切な挿入が起こっているベクターを同定するため配列決定する。
再クローンされたVH変異体、さらに共通の軽鎖であるヒトIGKV1-39をコードする様々
なプラスミドの、HEK293T細胞へのトランスフェクションは、IgGが発現できる
ような標準的な手順(de Kruif et al Biotech Bioeng. 2010)で行われる。トランスフ
ェクションの後、上清のIgGの発現レベルはForteBIO Octet-QKシステムで測定される
。該システムはバイオレイヤー干渉法(Bio-Layer Interferometry (BLI))に基づき、
リアルタイムの定量化と生体分子の相互作用の動的特性評価を可能にする。詳細はwww.fo
rtebio.com参照。5μg/mlを超える発現量が測定された場合、IgGはプロテインA
親和性精製を用いて精製される。
プロテインAカラム(GE Healthcare/ cat# 11-0034-95/ 製造業者の指示に従う)を用
いて培養の上清を精製した後、pH3.0の0.1Mクエン酸バッファに溶出し、直ちに
同体積の、pH8.0の1.0MのTris-HCLにより中和させるか、直接的に脱塩カラムを
用いてPBSに再バッファーする。別の方法では、プロテインAビーズ(セファロースビ
ーズCL-4B,GE healthcare cat#170780-01)を用いてIgGを精製してもよい。
抗原特異的ELISAは、抗原に対する結合活性を評価するために行われる。抗原補足
ELISAは、二重特異性抗体の結合活性を立証するために行われる。ビオチン化された
2番目の抗原が複合体の検出に用いられる(de Kruif et al Biotech Bioeng. 2010)。
精製されたIgG混合物は標準的な手順により、還元条件下および非還元条件下でSD
S−PAGE(NuPAGE(登録商標) 4-12% bis-tris gel/Invitrogen/ cat# NP0323BOX)
により解析された。また、ゲルの蛋白質はコロイド状の青色試薬(PageBlue(商標)prot
ein staining solution/Fermentas/ cat# RO571)により染色された。
IgGのグリコシル化は不均一なので、質量スペクトル分析に好適に用いられるよう、
1つの生産物がはっきりとした一の質量ををもつために脱グリコシル化をが行われた。1
0μgのIgG1に対し一単位のN−グリコシダーゼF(PNGase F;Roche Diag
nostics, Mannheim, Germany)を投与し、37℃で一晩培養した。元々の精製バッファ(
0.1Mクエン酸バッファpH3.0/1.0M Tris-HCL pH 8.0)を除去するため、1
0kDa・MWCO遠心分離フィルターカラム(Millipore)を用いたバッファ交換が行
われ、PBSに再バッファした。分離されたグリカン鎖を除去するために、同様のバッフ
ァ交換の手順が行われ、pH7.5の150mM酢酸アンモニウムに交換された。フィル
ターはpH7.5の150mM酢酸アンモニウム200μlで12分、11000rpm
、4℃の条件で洗い流された。洗い流された後、50μlの脱グリコシル化したIgGが
フィルターに投与され、pH7.5の150mM酢酸アンモニウム450μlが加えられ
た。その後、もう一度、12分、11000rpm、4℃の条件で遠心分離をした。毎回
150mMの新しいpH7.5酢酸アンモニウムバッファーを、総体積が500μlにな
るよう加え、全部で5回遠心分離を繰り返した。最後の遠心分離のステップの後、バッフ
ァ交換された、おおよそ25μlの残りの脱グリコシル化されたIgG1、が回収され、
エッペンドルフチューブに移され、質量スペクトル解析に用意された。
精製されたIgGの混合物の異なるIgGの種を同定し、どういった比率でこれらのI
gGの種が存在するかを決定するために、質量分析法が用いられる。簡潔に述べると、1
μM濃度のIgGを含むpH7.5の150mM酢酸アンモニウム2−3μlを自社製の
金メッキしたボロシリケート毛細管(Sutter P-97 プラー [Sutter Instruments Co., No
vato, CA, USA] および Edwards Scancoat six スパッタ装置 [Edwards Laboratories, M
ilpitas, CA, USA]を用いて)に投入し、高質量検出(Tahallah et al., RCM 2001)に最
適化するように調整されたLCT1質量分析器(Waters Corp., Milford, MA, USA)で解
析した。1300Vのキャピラリ電圧および200Vのサンプリングコーン電圧を用いた
。しかし、これらの設定はより高い解像度の「信号対雑音」(signal-to-noise)比が必
要な場合は調節された。衝突冷却を促進するために、ソース支持圧(source backing pre
ssure)を約7.5mbarに上昇させた。変性状態のIgG1を測定するためには、そ
の蛋白質を、5%ギ酸中で1μMの濃度で噴霧した。
MassLynx 4.1 ソフトウェアを用いて取得したスペクトルの処理が行われた(Waters C
orp., Milford, MA, USA)。最小のスムージングが用いられ、スペクトルが中心に置かれ
た。一連の各電荷状態(charge state)を用いて、その種の質量が計算された。各電荷状
態について、対応する強度がMassLynxにより割り当てられ、加算された。このアプローチ
は、試料のすべての種に対し相対的な定量化を可能にする。または、公知の、曲線下の面
積(area-under-the-curve:AUC)による方法を用いてピークの定量化を行うこともでき
る。全ての解析は、IgGの質量とその相対量の標準偏差を算出するために3度繰り返さ
れた。
既知の特異性および既知のヒトIGKV1−39軽鎖結合能を有する、いくつかの抗体
のVH領域(図3)が、野生型のコンストラクトベクターMV1057、または表1のコ
ンストラクト4若しくはコンストラクト5に再クローンするのに用いられ、結果としてベ
クターI−III(表2)を得た。結果として得た、異なるCH3領域および異なるVH
特異性をもつIg重鎖と、共通のヒト軽鎖をコードする核酸配列をそれぞれ含む、ベクタ
ーI,II,およびIIIが、そのあと細胞にトランスフェクションされた。該トランス
フェクションは、インタクトな単一特異性抗体の形成をみるために1つだけされるか、ま
たは、2若しくは3の単一特異性抗体の混合物を得るために、他の一若しくは二のコンス
トラクトベクターと組み合わせてされた。表3はトランスフェクションの一覧表と結果で
ある。
れかをトランスフェクションした細胞からは、ホモ二量体の形成のみの二価の単一特異的
なAA,BBまたはCCが得られている(図4)。トランスフェクションAについては、
この点は予測され、またこれまでに実証されていた。今回はじめて、実際に、三重のアミ
ノ酸置換のコンストラクト4(すなわち、K392D, D399K, K409D)または四重のアミノ酸
置換のコンストラクト5(すなわち、E356K, E357K, K439D, K370D)を含むCH3が操作
されたIg重鎖のホモ二量化が報告される(トランスフェクションGおよびH)。
興味深いことは、トランスフェクションMおよびNにより示されるように、野生型とC
H3が操作されたIg重鎖を、単一細胞に共通の軽鎖と共に共発現させると、望ましくな
い二重特異性抗体の存在が無く、わずか4−5%程、混入した「他の分子」が混合物に存
在するだけで、二種の単一特異性抗体の混合物が得られた。「他の分子」は、インタクト
なIgGの質量を有しないすべての分子として定義され、単一の重鎖および軽鎖のペアか
らなる半分子を含む。重要な点は、「他」区分は二重特異性生産物を含まないということ
である。
、AA:BBの比率がほぼ1:1となっている。しかし、トランスフェクションNではA
A:CCの比率がほぼ10:1となっている。従って、このトランスフェクションはDN
Aの比率を調整し再度行った(トランスフェクションU)。実際に、ベクターDNAI:
IIIが1:5のとき、混合物中の抗体生産物AA:CCの比率はほぼ1:1となった。
従って、トランスフェクションMおよびUによって示されるように、望ましくない副生産
物が無く(すなわち、ACまたは半分子A若しくはCの多量の存在が無い)、単一細胞で
、2つの異なる実質的に混じりけのない、単一特異性抗体を発現することができる(図5
)。野生型とコンストラクト4、または野生型とコンストラクト5のヘテロ二量体形成が
起こらないように、コンストラクト4および5の新規のCH3の改変は、野生型CH3と
実質的に異なる。この点は、単一細胞からの単一特異性抗体の混合物の大量生産への適用
に有利である。
4および5)は、さらなる望ましくない種の存在が無く、2つの異なる単一特異性抗体の
みの混合物を結果として得ることが予測される。コンストラクト4におけるCH3の改変
とコンストラクト5のCH3の改変が実質的に異なる場合、ヘテロ二量化が起こらないと
推論される。その場合、コンストラクト4および5のCH3操作された重鎖を、単一細胞
で野生型CH3重鎖と共に共発現させると、3つの単一特異性抗体のみが結果として得ら
れるだろう。
計された3つの異なるIg重鎖を、共通の軽鎖と共に単一細胞で発現させると、混合物に
他の混入が無く3つの純粋な単一特異性抗体の混合物が得られることが見出された(トラ
ンスフェクションO)(図6)。表3から明瞭にわかるとおり、トランスフェクションO
でベクターDNAが同じ割合になるようにしても、抗体AA:BB:CCの比率は1:1
:1では得られなかった。ベクターDNAの比率を変えてトランスフェクションすると(
1:1:10,トランスフェクションV)、混合物中のAA:BB:CCの比率は望まし
い比率に操ることができることが示された。以上から、これらの実験から示されたように
、単一細胞で2または3の実質的に純粋な単一特異性抗体が、望ましくない副生産物なし
でされうる。これは、治療用の単一特異性抗体の混合物の大量生産に利点が大きい。
CH3が操作された重鎖を用いた単一の二重特異性抗体の生産は他で報告されている。
ここで、この実験は、単一細胞からの2つの異なる二重特異性抗体の混合物の生産が実行
可能かどうかについて調査することを目的として設計された。
既知の特異性および既知のヒトIGKV1−39軽鎖との結合能を有する抗体のVH領
域(図3)を、表1のコンストラクト1−3または6−7を含むベクターに再クローンし
、ベクターIV−X(表4)を結果として得た。異なるCH3領域および異なるVH特異
性をもつIg重鎖と、共通のヒト軽鎖をコードする核酸配列をそれぞれ含む、ベクターI
V−Xが、そのあと細胞にトランスフェクションされた。該トランスフェクションは、イ
ンタクトな単一特異性抗体の形成の妨害を示すために1つだけされるか、または、二重特
異性抗体若しくは2つの二重特異性抗体の混合物を得るために、他のコンストラクトベク
ターと組み合わせてされた。表5はトランスフェクションの一覧表と結果である。
発現されると、ホモ二量体の形成能を維持していることが示されている(国際公開第20
09/089004号)。しかし、国際公開第2009/089004号のさらなる報告
では、コンストラクト3のような三重の荷電電荷のペアの変異を備えるように操作された
CH3ドメインでは、単独で発現されたとき、もはやホモ二量体の形成はできない。本研
究では、これらの発見は部分的に確かめられただけであった。実際には、トランスフェク
ションB,CおよびDで、高い割合のペアしていない半分子に加えて、IgG全長の存在
が示された。このことはコンストラクト1および2にコードされたCH3ドメインのホモ
二量化を示している。トランスフェクションEおよびFも、ぺアしていない半分子に加え
、IgGの全長の生産が結果的に見られた。このことは、コンストラクト3の三重の電荷
の変異でもホモ二量化を完全に損なうことではないことが示された。コンストラクト6お
よび7の「ノブ」および「ホール」CH3変異体もホモ二量体を形成することがさらに示
された(「ノブ−ノブ」のホモ二量体で18%、「ホール−ホール」のホモ二量体で42
%)。
ホモ二量体)を阻害または最小化するため、単独で発現された際にホモ二量化が完全に阻
害されるCH3変異体が好ましい。
抗体の混合物を単一細胞に発現することができることを示した。トランスフェクションK
およびLでは、予測される二重特異性の種BC+ABが実際に得られている(トランスフ
ェクションKで38%+47%、トランスフェクションLで16%+60%)。両方のト
ランスフェクションで比較的に高い割合の望ましくない半分子が観察された(トランスフ
ェクションKで15%半分子A+半分子C、トランスフェクションLで24%半分子A+
半分子C)。比較的高い割合でなお存在する半分子は、適合ペアの重鎖がバランスを欠い
た発現になっているため、ベクターIVの重鎖が少ない量しかないことに起因する。従っ
て、トランスフェクションSおよびTでは、ベクターDNAの比率を2:1:1に調整し
て再度トランスフェクションした。この結果、適合ペアからなるIgG重鎖が等しい量得
られ、IgG半分子の存在が無く、わずか3%のホモ二量体BBの存在だけで、純粋な二
重特異性IgGの混合物が得られた。理想的には、この低い単一特異性生産物の混入物の
割合を、実質的にゼロに減らすべきである。従って、混入する単一特異性抗体の存在を最
小にする二重特異性抗体の混合物を得られるさらなるCH3変異体を見出すことが望まれ
る。
の、3つの異なる標的エピトープを認識する2つの二重特異性抗体の実質的に純粋な混合
物が生産できることを示した。
単一細胞から、3つのエピトープを認識する2つの二重特異性抗体の混合物の生産、ま
たは単一細胞からの2または3の単一特異性抗体の混合物の生産が技術的に実行可能なこ
とが示された。そこで次に、我々は、様々なその他の混合物の、制御された生産の実行可
能性を探索した。
領域が、表1のコンストラクト1−3または7を含むベクターに再クローンするのに用い
られ、結果としてベクターI’,II’,III’,またはX’(「’」は対応するベク
ター番号と比較して、異なった特異性を示す)を得た。異なるCH3領域および異なるV
H特異性をもつIg重鎖と、共通のヒト軽鎖をコードする核酸配列をそれぞれ含む、ベク
ターI’−III’,X’およびIV−IXが、そのあと細胞にトランスフェクションさ
れた。該トランスフェクションは、様々な二重特異性および/または単一特異性の抗体の
混合物を得るため、他のコンストラクトベクターと組み合わせてなされた。得られうる様
々な混合物には、単一細胞から得られる、4つのエピトープを認識する2つの二重特異性
抗体の混合物、2つの二重特異性抗体および1つの単一特異性抗体、または1つの二重特
異性および1つの単一特異性抗体の混合物が含まれる。表6はトランスフェクションの一
覧表と予測される結果である。
、以前からのノブ・イントゥ・ホール変異体の大量生産は安定性の問題から妨げられるこ
とが知られている。従って、トランスフェクションZA,ZB,ZL,ZMおよびZNに
より結果として得た混合物は、大量生産に移ったときに問題があると予測される。
の理論的な混合物を生産することはできないかもしれない。その理由は、ノブ・イントゥ
・ホール変異体は不安定であると報告されており、「ノブ」または「ホール」を備えるC
H3ドメインがどちらの荷電変異体とも、または野生型のCH3ドメインとも二量化する
ことは除外できないからである。従って、単一細胞で共発現させるために、ホモ二量体ま
たはヘテロ二量体のみを選択的に形成し、表1のコンストラクト1−5とホモまたはヘテ
ロ二量化しないように操作された新しいCH3変異体を設計することが望まれる。
この研究の目的は、単一細胞において、異なるIgG重鎖を混ぜて発現させた場合に、
ヘテロ二量体のみまたはホモ二量体のみが結果として生産されるようにIgGのCH3領
域を操作することである。ここで、新規の操作されたCH3ドメインは既知の操作された
CH3ドメインまたは野生型CH3ドメインとホモ二量化またはヘテロ二量化しないよう
にする。従って、この基準を満たす新規に操作されたCH3ドメインを同定するための最
初の工程として、IgGのCH3ドメインの接触面にある多くの接触残基を1つずつある
いは群として、静電的相互作用による同一の重鎖間の反発−すなわち、ホモ二量体の形成
の減少−が起こるように置換し調べた。その目的は、これらの変異が、異なるIgG重鎖
を混合して発現させたときに、ホモおよび/またはヘテロ二量体の形成を誘導するのに使
えるよう、荷電残基に置換したときに同一鎖同士の反発がおきるような残基のリストを得
ることである。これにより、得られた全長IgGは安定になり、高い割合で生産される。
操作することにより、二重特異性抗体または二重特異性若しくは単一特異性抗体の混合物
を精製するために、同定された変異が用いられる。さらに、異なる重鎖をコードする複数
の核酸分子すべてが、異なり相補するCH3変異をもつように、新しく同定された電荷の
変異のペアは既存のペアと組み合わされ細胞での発現に用いられる。これにより、単一特
異性抗体のみ若しくは二重特異性抗体のみの混合物、または定められた単一特異性および
二重特異性抗体の混合物が選択的に得られる。本研究で試験された残基は、これまでに同
定された接触残基である(Deisenhofer J., 1981;Miller S., 1990;Padlan, 1996;Gun
asekaran, 2010)。このアプローチの論理的根拠は、反発電荷がそれぞれの有効なペアの
接触残基に導入されることにある。
ドを見ることにより、二量体の形成が減少するペアを同定する。すべての得られたペアに
ついて、単一の変異または他の単一の変異との組み合わせについてスクリーニングした。
その理由は、単一の非適合ペアによる反発的な静電相互作用は、この方法による検出に十
分な量の半分子を得るのに十分であるかは不明であるためである。これらの変異は組み合
わせでも用いられる。
導入した。また、標準的な手順に従い、HEK293T細胞にトランスフェクションする
ことにより、コンストラクトの発現が行われた。IgGの発現量はOctetにより測定した
。生産を2度失敗したときは、その変異は発現を阻害するものとして、その変異について
のさらなる追究は行わなかった。
いて精製した。蛋白質はコロイド状の青色試薬を用いて染色した。ホモ二量体は約150
kDのバンドとして捉えることができた。約75kDのより小さいバンドは、半分子の存
在を示していた(ネガティブコントロール:K392D,K409Dを参照)。ブロット
は図7に示した。
S354,Y349,L351,K360,T366,T394,およびV397を含む
多くの残基は今後の見込みがあり、組み合わせてさらなる試験を行うべきである。ここで
の選択は、ホモ二量体の形成の阻害における高いスコアと、他の非相補的な電荷との関連
で問題とならないような改変可能な接触残基の可用性との両方を考慮した。例えば、F4
05残基およびY407残基は、すでに荷電した残基との相互作用を含む、CH3−CH
3接触面で複数の相互作用を有することが知られている。これらの相互作用をする残基(
表A参照)のうちで、複数の電荷変異を導入すると問題となりうる。
7に作成され(表8)、既知の特異性および既知のヒトIGKV1−39軽鎖との結合能
をもつ抗体VH領域が、これらの新しいコンストラクトを含むベクター(表9参照)に再
クローンするのに用いられた。表10はトランスフェクションの一覧表と結果である。
ティブ質量分析(MS)で解析した。表10に結果を要約した。ZOトランスフェクショ
ンにより、混合物において最も高い割合のヘテロ二量体が得られた(69%AC)。興味
深いことに、ZOトランスフェクションにおいて、AAホモ二量体が存在しない一方、C
Cホモ二量体は少しの割合(7%)を含む。質量分析によれば、混合物に残存する蛋白質
は半分子Aからなり、AおよびC重鎖の不均衡な発現の結果と考えられる。トランスフェ
クション試料ZOからの未加工のMSデータを図8に示した。驚くことに、トランスフェ
クションZOによりかなりの量の二重特異性生産物を得たが、その反転電荷のペアである
トランスフェクションZP(L351K/T366’Dに対しZOはT366K/L351’D)は似たような結
果を得ることができず、52%のみの二重特異性生産物が観察され、かなりの量の2つの
ホモ二量体が存在した(30%AAおよび13%CC)。これに対しては、負に荷電した
Dは構造的にTとよく似ているため、T366Dは自身と反発するのに十分なほど強力で
なく、よってT366Dはなおホモ二量体を形成しうると説明され、実際に観察された。
トT366RおよびL351Eを含むすべての変形を試験することにより)からは同様の
割合の二重特異性抗体(BsAbs)を結果として得られることが予測される。
H3変異の設計)
実施例13で説明したように、新しく見出した荷電ペアT366K/L351’Dは、混合物にお
けるヘテロ二量体の割合を増加させる(69%)とともに、少しの割合の望ましくないC
Cホモ二量体(7%)(L351D/L351’D)および相当な割合の半分子A(24%)を混合
物に「コンタミネーションする」。本例では、in silicoのアプローチを用いて、CH3
の接触面での相互作用に関わるアミノ酸残基についてさらなる知見を得、CH3領域で対
向する相補的な置換を試験し、2つの重鎖のホモ二量体の効率的な形成を阻害する一方、
効率的なヘテロ二量化をさらに増加させる相補的な置換を含む新規のCH3ペアを見出す
。
り誘導される蛋白質−蛋白質のドッキング)は生体分子の複合体のモデリングのための、
情報を利用した柔軟なドッキングのアプローチである。HADDOCKは、第一原理計算
のドッキング方法とは違い、曖昧な相互作用の拘束(ambiguous interaction restraints
:AIRs)の中で同定されまたは予測された蛋白質の接触面の情報をコードし、ドッキング
過程を誘導する(de Vries et al., 2010)。HADDOCKウェブサーバへのインプッ
トは、結晶構造、NMR構造クラスタ、または構造モデル等の蛋白質の構造ファイルから
なる。ドッキングまたは微調整の後、HADDOCKはいわゆるHADDOCKスコアを
返す。HADDOCKスコアはファン・デル・ワールスエネルギー、静電エネルギー、覆
われる表面積および脱溶媒和エネルギーの加重平均である。HADDOCKスコアは、実
験データへの直接的な変換がしばしば難しいが、結合エネルギーまたは親和性の指標と解
される。これに加え、HADDOCKは、ドッキング計算の結果から、「トップ4」の構
造の構造ファイルを提供する。これらの構造ファイルはダウンロードされ、可視化される
ことができ、個々の残基の相互作用の詳細な解析を可能にする。
度の結晶構造をもった、IgGのFc部(構造1L6X)が起点の構造として用いられる
(http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1l6x ; Idusogie, E.E. e
t al., J.I. 2000(164)4178-4184)。
二量体のコンタミネーションの形成をもたらすことが見出された(表10)。HADDO
CKは、T366K/L351’Dに加え、ホモ二量化を阻むさらなる変異を探索するのに用いられ
る。
くつかのエネルギーの加重平均)、および、プログラムにより見出された4つの最小エネ
ルギー構造に対応する、4つの構造ファイルである。HADDOCKスコアは異なる構造
を比較するのに用いられる。その他のエネルギーは、構造において何が起きているかの指
標(例えば、良好な静電相互作用,より少ない覆われた表面,高いファン・デル・ワール
スエネルギー)を得るためにのみ用いられる。HADDOCKスコアは低ければ低いほど
よい。それぞれの変異ペアに対し、AA,ABおよびBB二量体のスコアが算出される。
エネルギーが相関するかどうかを調べた。表11にすべての理論的なエネルギーを示し、
図9に可視化した。
、HADDOCKスコアはAA,AB,およびBBで同一である。その他の多くの場合に
おいては、予測されるようにABペアが最低のスコアであった。T366K/L351Dペアについ
ては、BBスコアはABスコアよりわずかに良かった(-210.6 vs. -212.5)。しかしこ
の違いは計算の誤差の範囲である。HADDOCKを用いて、これらのペアのヘテロ二量
体の構造が可視化された。例えば、コンストラクトの組み合わせ1-2, 1-1および2-2を図
10に表示した。これらの可視化から、ヘテロ二量体には塩橋が形成されているのが明ら
かであり(図10A左側パネル)、同一の鎖の残基の間では静電的反発が起こっている(
図10BおよびC中央および右側パネル)。ホモ二量体に対するより高いHADDOCK
スコアは、変異した接触残基の静電的反発により説明される。これらの残基はお互いに曲
がるように避け、他の鎖の残基とは相互作用しないため、親和性が低下する。
ACヘテロ二量体およびL351D/L351’DのCCホモ二量体は同様のエネルギーをもち、混
合物におけるヘテロ二量体およびホモ二量体の両方の存在を説明している。その一方で、
T366K/T366’KのAAホモ二量体はほとんど混合物中に検出できず、T366K半分子Aが存在
する。表11および図9は、T366K/T366’KのAAホモ二量体のHADDOCKスコアは
、ACヘテロ二量体のスコアより高いことを示している。従って、このホモ二量体の形成
はエネルギー的により好ましくない。
実施例13において、T366K/L351’Dの変異電荷のペアとは別の方法によっても、混合
物中の二重特異性抗体の割合について同様の結果を得られうるように設計できるとの仮説
が立てられる。該別の方法は、T366R,T366D,T366E,L351E,L3
51K,およびL351Rの置換を含みうる。L351D/L351’DのCCホモ二量体の割合は3
66/351ペアの変異体を生成することにより減少しうる。全ての可能な変異のペアはHAD
DOCKで実行され、結果のスコアは表12に示され、図11に視覚化した。
似たような「パターン」を有することが観察された。多くの変形において、AAホモ二量
体はABヘテロ二量体よりも高いHADDOCKスコアを有することが見出されたが、B
Bホモ二量体はABヘテロ二量体と同等に好まれた。351残基は、もう一方の鎖の同じ
残基と「隣」であることが知られている。すなわち、鎖Aの351残基はCH3−CH3
接触面において鎖Bの351残基とペアとなる。BB二量体が形成されるとき、同一電荷
による負の影響はほとんどない。L351D/L351’Dの構造を見て説明すると、アスパラギン
酸はお互いに折れ曲がって避けあい、少なくとも位置355の自然発生的なアルギニンか
らの安定化の影響があり、さらに位置354の自然発生的なセリンによる負の電荷の安定
化がある(図12A参照)。これらの残基を変異させても(S354AおよびR355D)ほとんど
改善はない。図12Bからは、A354の主鎖の水素がホモ二量体の安定化の原因になっ
ていることが明らかである。この一連から、T366R/L351’Eペアが、二重特異性の分子に
対する最小のHADDOCKスコアを有し、最も好適であると考えられる。
この実施例における一連のHADDOCK解析では、T366K/L351’DまたはT366K/L351
’Eのペアを起点の構造とした。これらのAおよびB鎖の二重特異性の割合の予測値をさ
らに高めうる追加の変異を同定するため、B鎖に変異を追加しHADDOCKスコアおよ
びエネルギーを算出した。CH3ドメイン構造を、分子レベルでの蛋白質構造の視覚化の
ためのビューアー(YASARA, www.yasara.org)を用いて検討すると、個々の残基の間の距
離を算出することができる。その検討の間に、2つの残基Y349およびL368が、二量体の相
互作用に正または負の寄与をしうる、隣り合う残基であることが観察された。本実施例で
は、これらの変異により―L351変異に追加して―ホモおよびヘテロ二量体の二量体形
成への効果を検討した(図13を参照)。両方の残基はヘテロ二量体の安定性を増し(よ
り低いHADDOCKスコア)、BB二量体を不安定にする(より高いHADDOCKス
コア)。位置349および368のグルタミン酸(E)はアスパラギン酸(D)より好適
と示唆された。従って、すでに位置351にアミノ酸置換を有するB鎖での第2のアミノ
酸変異の導入は、ヘテロ二量化が好まれるようになると示唆された。
。ヘテロ二量化のさらなる増加をもたらしたB鎖における置換(すなわち、Y349D/Eおよ
びL368E)に、すでにT366Kの置換を備えるA鎖に追加の変異を加えた。図14に示される
ように、二重特異的なヘテロ二量体の形成に対し好適と考えられるいくつかの変異がある
。T366K-L351K/L351’D-Y349’Dペアでは、すべての4つの変異残基はヘテロ二量体のペ
アリングに関わっている。このことは、K351が結合に直接的に関与しないT366K-L351K/L3
51’E-L368’Eではあてはまらない。しかし、後者のヘテロ二量体のHADDOCKスコ
アは−228.9であり、T366K/ L351’E-L368’Eの−214.2より顕著に低い。この
ことは、位置351のKにおける水素結合の相互作用により説明される(図15参照)。
T366K-L351K/L351’D-Y349’Dペアでは、B鎖のR355’D変異によりさらに改善されうる。
これにより、BBのHADDOCKスコアを高めるが、ABのHADDOCKスコアもわ
ずかに高くなる。以上から、A鎖におけるT366Kの単一の変異と比較したとき、追加のL
351KはABスコアを低くし、AAおよびBBスコアはあまり変えない。理論的に、試
料における、より高い量の二重特異性のヘテロ二量体を得ることになる。
導する上で有効と推量される。従って、今度はA鎖においてT366KではなくT366Rとして、
図13で示したいくつかのHADDOCK解析を繰り返した。A鎖のR366とB鎖の二重の
変異を組み合わせるのは好ましくないことが示された(図16)。これは、この残基のサ
イズが大きく、構造にR366とのすべての塩橋が存在するとしても、他の接触面の相互作用
と干渉するためである。さらに、AAホモ二量体のHADDOCKスコアはK366よりR366
の方が低い。この点もヘテロ二量体の形成に好ましくない寄与となる。従って、接触面で
のR366を用いた、これ以上のHADDOCK分析を行うことを中止した。
表13および図17参照)。いくつかのペアでは、L351/L351’D相互作用への自然発生的
なR355の安定化の影響を取り去るために、R355D置換が含まれる。
roでの発現)
実施例16での解析から示唆されるように、T366K/L351’Dペアの周りに追加した変異
をもついくつかのCH3変異体は、より高い二重特異性成分の割合とより低いホモ二量体
成分の割合をもつ混合物を産生しうる。これらの最適な成績を収めたペアは生産のために
選択され、さらなる解析が行われた。さらに、コンストラクトT366RおよびL351Eも生成さ
れた。作成されたコンストラクト、および既知の特異性と既知のヒトIGKV1−39軽
鎖との結合能をもつ抗体VH領域の再クローンに用いられたコンストラクトのリストを表
14に示した。
4のリストに記載されたコンストラクトについても繰り返した。目的は、ヘテロ二量化の
適合パートナーが無い中でどのコンストラクトがホモ二量化するかを評価するためである
。理想的には、高い割合の半分子と低い割合のホモ二量体が形成されれば良い。コントロ
ール群として、これまでに報告された電荷変異を含むコンストラクトと、これまでに報告
されたノブ・イン・ホール変異を含むコンストラクトも、組み換え細胞によるIgG全体
の発現に用いられた。プロテインAで精製した上清をSDS−PAGEで解析し、結果を
スコアと共に表14に示した。
重鎖、またはこれまでのコンストラクトのアミノ酸置換を保持した重鎖との共発現の結果
を表15に表示した。それぞれアミノ酸置換T366KおよびL351’D:L368’Eを備える2つの
異なる重鎖の発現により、ホモ二量体AAまたはBBの存在が無く、混合物に約87%の
二重特異的ヘテロ二量体ABを得ることができた(表15の組み合わせ番号3)。約12
%のT366K置換を含む半分子(半分子A)が観察された。さらに、第1の重鎖に追加のア
ミノ酸置換L351Kが導入されると、二重特異性ヘテロ二量体ABの割合は増加することが
見出された。例えば、それぞれアミノ酸置換T366K:L351KおよびL351’D:L368’Eを備える
2つの異なる重鎖の共発現により、約92%の二重特異性ヘテロ二量体ABが得られ、一
方で、AAおよびBBホモ二量体は混合物に実質的に存在しなかった(表15の組み合わ
せ番号12)。
量体という、好ましい配分の結果になっている。ホモ二量体が存在しないのは、インタク
トなIgG分子を含む分画がヘテロ二量体ABのみで構成されるため有利である。精製、
および後の治療的応用のために、半分子はサイズ排除クロマトグラフィーのような標準的
なアプローチにより除去されうる。公知の電荷変異体およびノブ・イントゥ・ホール変異
体では「コンタミネーションする」ホモ二量体の抗体が除かれていない。しかし、これら
の新しく同定された電荷の変異体を二重特異性抗体の生産過程へ適用すると有利である。
までに説明されたE356K:D399K/K392’D:K409’DおよびE356K:D399K/K392’D:K409’D:K43
9’D電荷反転ペアよりさらに有利な点がある。つまり、これまでに記載された電荷変異体
はCH3−CH3接触面内に元々ある電荷の反転に基づいているが、新しく同定された電
荷の変異体はCH3−CH3接触面に追加の電荷ペア(電荷−電荷相互作用)を付加して
いる。CH3−CH3接触面での追加的な電荷のペアの導入により、接触面の安定性がさ
らに増加し、それによりインタクトな抗体の安定性がさらに増加する。組み合わせ番号4
,5,6,9,10,および11で用いられる変異についても同様に当てはまる。このこ
とが混合物中にAAおよびBBのホモ二量体が非常に少ない割合でしか存在しないという
、二重特異性ヘテロ二量体の好ましい割合につながっている。
全ての二重特異性の試料に対し、ネイティブMSを実行した。得られたグラフを解析し
、目的の種の相対的な比を2通りの方法(ピークの高さとピークの面積)で導出した。ピ
ークの面積による方法が科学的にはより正しい解析方法だが、これまでの他の研究におけ
るすべての解析がピークの高さで行われているため、比較の面から両方の方法を解析に含
めた。2つの方法における差は、測定の誤差の範囲内であったため、以降の測定について
はピークの面積の値のみを用いた。
た。数値は表15で見出すことができる。試料の約半数において、単一特異性IgGの総
混入量は5%より少なく、3つの場合のみ、10%を超えた。一方で野生型のIgGでは
約50%の単一特異性IgGが混合物に見出されると予測される。
これらの10の組み合わせには、組み合わせ1,2,3,4,5,6,9,10,11お
よび12(表15)が含まれる。これら10の選択は、nMSにより導出された混合物に
存在するホモ二量体の割合の低さに基づくだけでなく、生産の収率,SDS−PAGE,
CH3ドメインにある変異の数を含む全体的な物理化学的特性にも基づいて行った。
この研究では、インタクトのIgG分画に高い割合の二重特異性ヘテロ二量体と、非常
に少ない量(<5%)の親のIgGが得られた場合の一連のCH3変異のペアについて、
さらにIgG分子のFc部の安定性を解析する。重鎖のヘテロ二量化を促進するために用
いられた変異したCH3ドメインは、IgGのFc領域に、予期しない不安定化の効果を
及ぼしうる。これにより、in vivoの半減期の減少,エフェクター機能の減少および/ま
たは免疫原性の増加のような望ましくない特性を生む結果となりうる。
された電荷の変異を含む二重特異性分子と比較した(コンストラクト1を備える鎖Aおよ
びコンストラクト2を備える鎖B)。この研究のすべての二重特異性分子は同一の重鎖お
よび軽鎖の可変領域を含むため、観察された効果は分子のFc部の変異に起因し、可変領
域の違いに起因するものではないことが保証されている。
、CH3変異体の集合状態(aggregation state)の情報を提供する、分光学的(UV−
Vis光吸収,蛍光および光散乱)および顕微鏡的(ナイルレッド染色での光学および蛍
光顕微鏡による観察)解析が含まれる。
光光度計により25℃で記録される。スペクトルは、光路長1cmで250から400n
mの間でモニターされる。320nmおよびそれより長い波長の吸収量からIgGの集合
状態の情報が提供される。
光の方法は適宜最適化される。蛍光の放射はコンフォメーションおよび凝集の特性につい
ての情報を提供する。
)を0.01秒として400nmから750nmの同期スキャン(λem=λex)を実行し
て25℃でモニターされる。励起側および発光側スリットは適宜最適化される。例えば、
直角での光散乱では、IgG試料で5%の二量体が存在するかどうかを識別できる。
レッドを試料に加える。試料は顕微鏡用のスライドに充填され蛍光顕微鏡により解析され
る。粒子がカウントされるが、蛍光顕微鏡法により観察される最小の粒子のサイズは約0
.5μmである。
ォメーションの変化(例えばアンフォールディング)および/または凝集を引き起こす。
これまでに、電荷を操作された二重特異性抗体は改変されたCH3の融解温度が低くなる
ことが報告されている(Gunasekaran 2010)。従って、これらの研究は本発明の新規の電
荷変異体とすでに存在し知られている電荷の変異体との区別を目的とする。
の研究がなされる。CH3が操作されたIgGの熱安定性を調べるため、PCR装置を用
い、試料を4,50,55,60,65,70および75℃で1時間、100μg/ml
(PBSを溶媒)の濃度でインキュベートする。こののち、試料はゆっくりと冷却され、
15分で25℃とし、この温度で2時間保った後、4℃で翌日まで保管された。沈降され
た抗体は遠心分離により除去され、水溶性抗体の総IgG濃度がOctetプロテインAバイ
オセンサー(1/10PBS希釈)を用いてOctetにより導出された。
究される。プロテインLバイオセンサーを用いてIgG軽鎖とセンサーとを結合させた後
、溶液中でFcRnと共にインキュベートする。あるいは、Anti−Penta−HI
Sバイオセンサーを用いてHisタグがされたFcRn蛋白質と結合し、目的のIgGと
共にインキュベートさせてもよい。これらの方法はプロテインAバイオセンサーより高感
度の場合もあり、熱安定性研究に用いてもよい。
)IgG試料はヒト血清において37℃でインキュベートされ、コントロール試料は4℃
に保たれる。1,2,3および4週間後、試料は遠心分離され、沈降したIgGが除去さ
れる。その後、試料は抗原特異的ELISAで添加され、機能的なIgGの相対量が決定
される。精製されたコントロールの抗体はヒト血清に急激に投与され、参照群として用い
られる。
以前の実験では、CH3変異を備える2つの異なる重鎖と、共通の軽鎖との共発現によ
り、高い割合の二重特異性抗体が得られた(例17)。
。これらの8つの組み合わせは、組み合わせ3,4,5,6,9,10,11および12
を含んだ(表15)。この研究では、IgGのFc部の安定性に焦点を置き、これらの8
つの組み合わせが解析された。コントロール群には、野生型の二重特異性分子(すなわち
、CH3変異が無い)および/またはこれまでに報告されたCH3の電荷の変異が含まれ
た。注記すると、野生型の二重特異性分子については、ヘテロ二量体へ選択的に誘導する
手段を有さずに、2つの重鎖および共通の軽鎖が共発現された。従って、これらの「野生
型の二重特異性分子」はAA,ABおよびBBの混合物を表す。この研究のすべての二重
特異性分子は同一の重鎖および軽鎖の組み合わせを保持するため、観察された効果は分子
のFc部の変異に起因し、Fab部の変化に起因するものではないことが保証されている
。
異ペアは、予測されない構造的、またはその他のIgGのFc領域への不安定化効力と関
連付けられうる。このことは後に、これらの変異の存在によるin vivoの半減期の減少,
エフェクター機能の減少および/または免疫原性の増加のような、さらなる臨床上への発
展を阻みうる望ましくない問題を生む結果となりうる。
温度の上昇または下降のようなストレスを与えると、蛋白質のコンフォメーションの変
化(例えばアンフォールディング)および/または凝集を引き起こす。CH3が操作され
たIgGの熱安定性を調べるため、組み合わせ3−6および9−12(表15)と、野生
型二重特異性分子並びにコンストラクト1および2(E356K:D399K/ K392D’:K409D’の組
み合わせ。「電荷反転」ペアとも呼ばれる)を用いて得られた二重特異性分子とを、PC
R装置を用い、4,60,62.5,65,67.5,70および72.5℃で1時間、
100μg/ml(PBSを溶媒)の濃度でインキュベートした。こののち、試料はゆっ
くりと冷却され、15分をかけて25℃とし、この温度で2時間保った後、4℃で翌日ま
で保管した。沈降された抗体は遠心分離(18000rpm;4℃,20分)により除去
し、水溶性抗体の総IgG濃度を、Octetにより、プロテインAバイオセンサー(1/1
0PBS希釈)を用いて導出した。
組み合わせE356K:D399K/ K392D’:K409D’(三角))は、野生型の二重特異性分子(四角
)と比較し、熱安定性が減少している。組み合わせ3−6および9−12(菱形)からの
二重特異性分子も野生型と比較し、熱安定性が減少することが実証された。しかし、注目
すべき点として、3つの組み合わせにおいては、コントロールのCH3操作された二重特
異性抗体と比較して安定性が改善されたことが実証された。組み合わせ9,10および1
1の二重特異性分子は、他のCH3操作された(電荷反転)二重特異性分子より有意に安
定であり、最も高温の測定点においては野生型の二重特異性分子と同等に安定であった。
CH3が操作されたIgGの、凍結融解を反復した際の安定性を調べるため、組み合わ
せ3−6および9−12(表15)からの二重特異性分子と、野生型二重特異性分子並び
にコンストラクト1および2(E356K:D399K/ K392D’:K409D’の組み合わせ(電荷反転ペ
ア))を用いて得た二重特異性分子とを10回の凍結融解サイクルにかけた。各サイクル
において、試料を完全に凍結するまで−80℃に少なくとも15分置き、その後室温で融
解させた。完全に融解したら、再びこの凍結融解サイクルを繰り返した。10回の凍結融
解サイクルの後、沈降された抗体は遠心分離(18000rpm;4℃,20分)により
除去し、水溶性抗体の総IgG濃度を、Octetにより、プロテインAバイオセンサー(1
/10PBS希釈)を用いて導出した。凍結融解安定性テストは3回繰り返された。
体は、野生型の二重特異性分子と比較し、わずかに安定性が減少しているように観察され
た。対照的に、組み合わせ3,4および9からの二重特異性分子は野生型の二重特異性分
子と比較し、わずかに安定性が改善したと考えられた。以上から、凍結融解サイクルの厳
しい状況からは、CH3操作された変異体にとっての重要な安定性の問題は提起されない
と結論された。
CH3が操作されたIgGの、37℃に保持された血清での安定性を調べるため、組み
合わせ3−6および9−12(表15)からの二重特異性分子と、野生型二重特異性分子
並びに電荷反転した二重特異性分子を37℃の10%ヒト血清下でインキュベートした。
コントロールの試料は4℃に保たれた。1,2,または5日後、沈降された抗体を遠心分
離により除去した。その後、試料はフィブリノーゲン特異的ELISAで添加され、機能
的なIgGの相対量を導出した。精製されたコントロールの抗体はヒト血清に急激に投与
され、参照群として用いられた。
ても、すべての試料は非常に安定であった。組み合わせ4および5からの、より低いIg
G濃度の二重特異性分子は、特にT=1およびT=2の点でわずかに安定性が低い。しか
しこの実験の終点ではその違いは最小となっている(図22)。
変異IgGの安定性を評価するため、さらなる一連の分析方法が用いられた。組み合わ
せ3−6および9−12(表15)からの二重特異性分子,野生型の二重特異性分子(A
A,AB,BB),個々の親の抗体(AAおよびBB)並びにコンストラクト1および2
(E356K:D399K / K392D’:K409D’の組み合わせ(電荷反転ペア))を用いて得た二重特
異性分子がこれらの安定性のアッセイに試料として用いられた。
2日間,40℃で2週間,凍結融解5回)が適用された。これは、異なる試料について識
別をできるようにするためである。注記しておくと、これらの高ストレスレベルは、すべ
ての二重特異性分子で用いられる親の抗体のうちの一つ(2つの1122Fabを保持す
る、BBの方の親)が不安定になるものである。50℃で2日間の条件では、この蛋白質
の凝集がUV吸収で検出された。このことから示唆されるように、このストレス条件では
、二重特異性分子におけるFabとCH3の不安定性を区別することができないかもしれ
ない。従って、50℃でのインキュベーションからのデータは注意して取り扱う必要があ
る。
−ナイルレッドによる蛍光顕微鏡法(表16の「ナイルレッド粒子」);ナイルレッド色
素を加えた後、0.5μmより大きい粒子の量を観察するため。
−350nmでのUV分光分析(「UV350nm」);320nmより長い波長におけ
る吸収の変化は、蛋白質の集合状態に関する情報をもたらす。
−400nmでの90°光散乱(「LS400nm」);蛋白質の凝集の変化、例えばI
gGの単量体と二量体の違い、を観察する感度のよい技術である。
−自家蛍光;蛋白質の芳香族残基の蛍光波長の最大値と強度は、環境によって(例えば、
アンフォールディング)変化する。
−1,8-ANS蛍光分光分析;1,8-ANSはイオンペア形成を介し、静電的相互作用を通して陽イ
オンの群と結合する。蛋白質構造および/またはコンフォメーションの変化が検出される
。
UV−Vis吸収スペクトルは、Varian社の異なるクォーツキュベット(例えば光路長
1.0cmの黒色低用量Hellmaキュベットおよび0.2cm x 1.0cm透明Hellmaキュベット)
を用い、25℃で、ダブルビームと2つのモノクロメータのCary 300 Bio 分光光度計で
測定した。1.0cmの光路長を用いて、220から450nmの間のスペクトルをモニ
ターした。280nm付近の吸収が蛋白質の濃度の情報を提供する。320nmから45
0nmの間の領域は試料の集合状態についての情報を提供する。
90°光散乱スペクトル法は、蛋白質の凝集を研究するために開発された。該方法はCa
pelle 2005やDemeule 2007aの記載と同様に行われた。90°光散乱スペクトルは、Fluor
oMax蛍光光度計(Spex, Instruments S.A., Inc. U.K.)を用い、積算時間(integration
time)を0.01秒として400nmから750nmの同期スキャン(λem=λex)を
実行して25℃でモニターされる。最適な条件を得るため、異なるスリットの設定が試さ
れた。最適化した後は、そのスリット設定を用いてすべての測定を行った。
トリプトファン,チロシン,およびフェニルアラニン残基の蛍光放射は、これらのフル
オロフォアの局所環境に関する状況を与えてくれる。親水性および/または剛直性の、変
化または違いが測定される。一般的には、より疎水性と剛直性の高い環境は、蛍光強度の
増加と、放射最大となる値の青方偏移へと導く。自家蛍光分光分析により、蛋白質のその
時の状態の情報が提供され、物理的および化学的特性の変化がモニターされる。チロシン
およびトリプトファンのより詳細な情報は、Lakowiczの本(Lakowicz, 2006)に記載され
ている。
れた。試料は異なる波長で励起された。積算時間およびスリットの設定は最適化された。
最適化の後は、その積算時間とスリット設定をすべてのサンプルに適用した。
ナイルレッド染色法は、蛋白質の凝集を視覚化するために開発された。該染色法は、De
meule et al., 2007bに記載されたように行われた。
Wetzlar, Germany)により行われた。イメージはソニーNEX-5カメラおよびそのファーム
ウェアで取得された。対物レンズは10倍,20倍および40倍とした。顕微鏡での研究
では、スライドとカバーガラスの間の距離を0.1mmに固定し用いた。4×4のグリッ
ドのサイズは1mm×1mmであり、0.1μlに相当する。
8‐アニリノ‐1‐ナフタレンスルホン酸(1-anilinonaphthalene-8-sulfonic acid:
1,8-ANS)は荷電していない疎水性の蛍光小分子(分子量299.34Da)であり、膜表面と蛋
白質の両方を研究するために用いられる。
子収率〜0.7)に結合したときのみ、感知できる蛍光を発する。この特性により、1,8-
ANSは、蛋白質のフォールディング,コンフォメーションの変化,およびその他のこのプ
ローブの水への露出が変化するプロセスの感度の高いインジケーターとなっている。Mole
cular Plobes社のホームページwww.probes.comで1,8-ANSに関する情報を得ることができ
る。
における1,8-ANSの蛍光の直接的な比較は行わない。それぞれのIgGは異なる数の1,8-A
NSの結合部位を持つため比較できないからである。原理的には、1,8-ANSの蛍光が小さく
なるほど、より少ない1,8-ANS分子が抗体に結合している。ストレスによる、1,8-ANSの蛍
光強度および放射波長の変化が評価された。
された。テストされた試料の間に測定可能な違いを生み出すためには、厳しいストレス条
件(例えば、50℃で2日間)が必要である。これらの条件下で、組み合わせ番号9およ
び10の試料は他の試料より凝集しやすいようだ。
に厳しいストレス要素である50℃でのインキュベーションを考慮に入れると、T366K/L3
51E,Y349E (組み合わせ番号4)およびT366K,L351K/L351D,Y349E (組み合わせ番号11
)の2つの変異体が、この一群の中で最も安定的な蛋白質であり、それにわずかな差でT3
66K,L351K/L351D,Y349D(組み合わせ番号10)および T366K,L351K/L351D,L368E (組み
合わせ番号12)が続いている。
5から5:1)
偏った比でトランスフェクションした場合の混合物中のCH3変異したIgGの挙動に
ついての知識を深めるため、特にT366K:L351K/L351D’:L368E’ の組み合わせ(以下では
KK/DE または DEKKと呼ぶ)について、より詳細に比率に関する実験を行った。
までに用いられた抗体のVH領域が、コンストラクト1,2,68および69に再クロー
ンするのに用いられ、結果としてベクターI−V(表17)を得た。異なるCH3領域お
よび異なる抗原特異性をもつIg重鎖と、共通のヒト軽鎖をコードする核酸配列をそれぞ
れ含む、ベクターI−Vが、表18に示された異なるトランスフェクションの比率で、そ
のあと細胞にトランスフェクションされた。結果を図23に示した。
のAまたはCが存在するとき(AまたはCが「DE側」、Bが「KK側」)、ABまたは
BCが形成されるが、すべての場合において、超過した量のAまたはCは、ホモ二量体お
よび半分子の両方の混合物として存在する。しかし、超過した量のBが存在するとき(B
が「KK側」、AまたはCが「DE側」)、明確な違いがみられる。ABまたはBCはな
お形成されるが、Bの超過量は実質的にはホモ二量体としては存在せず、半分子のみ形成
される。
れより小さい値で検出されたピークについては、ここで用いられているnMSの技術が正
確に測定することができる閾値よりも低い。従って、2%より小さい測定は分析のノイズ
レベルの範囲内とみなし無視することにした。
:Bが1:3および1:5の比率の場合、ホモ二量体BBの存在が無く、高い割合の半分
子Bが観察されており(図23Aおよび23B)、KK側のCH3の変異ではホモ二量体
が起こりにくいことを示している。ホモ二量体が存在しないのは決定的に有利な点となる
。その理由は、特異性を加えるため、DEKK組み合わせの「KK側」が選ばれたとき、
ホモ二量体として存在する場合にこれまでに知られた悪影響が起こる可能性があるためで
ある(例えば、cMETまたはCD3抗体は、二価のホモ二量体として医薬組成物に存在
した時に、望ましくない悪い副作用を有することが知られている)。
ールの電荷反転CH3変異とは対照的である。図23Cで示されるように、E356K:D399K/
K392D’:K409D’の組み合わせの変異においては、Aが超過して存在するとき(Aが「K39
2D:K409D側」)、すべての場合において、余剰量のAは、ホモ二量体と半分子の両方の混
合物で存在する。Bが超過して存在するときも(Bが「E356K:D399K側」)、すべての場
合において、余剰量のBは、ホモ二量体と半分子の両方の混合物として存在する。より高
い1:3や1:5の比率においても、ホモ二量体が存在するが半分子Bは観察されない。
これにより、E356K:D399K側は、DEKK組み合わせのKK側ほどにはホモ二量体を好ま
ないことが示された。
成しないという、電荷反転CH3変異よりも明確な利点がある。
DEKK組み合わせの変異は、高い純度の二重特異性IgG分子(「AB」)の形成を
誘導することが示された。次に我々は、1つの細胞から、「ABとAA」または「ABと
AC」混合物のような、より複雑な抗体混合物の制御された生産の実行可能性を模索した
。これまでに用いられたFabの型が、「DEコンストラクト」または「KKコンストラ
クト」のいずれかを含むベクターに組み込まれた。そして、技術の多用性を示すため、こ
れらのベクターの様々な組み合わせが共発現され混合物が生成された。Fabの型MF1
337(破傷風毒素),MF1122(フィブリノーゲン)およびMF1025(チログ
ロブリン)が、これらの全体的に安定な挙動、良好な発現量およびこれらのFabを含む
IgGの間の質量の差から、選択された(表19参照)。
つかの場合で低い割合の半分子が存在した。さらに、多くの試料は非還元条件下のゲルに
おいて、約150kDaの位置に2つのバンドを示した。これは、試料に区別できる2つ
のIgGの種が存在することを反映している。還元条件下でのゲルでも、いくつかの試料
で2つの重鎖のバンドを見ることができた(データ不図示)
づいて算出された(表20の「観察された種」の割合)。結果を図24に示した。3つの
重鎖が共発現された全ての8試料において、予測された種に対応する2つの主要なピーク
が観察された。これらの試料のうち2つ(トランスフェクション2および4)およびトラ
ンスフェクション11において、少量の混入するDE−DEホモ二量体が観察された。半
分子は、大半の試料において非常に少ない量であるが検出された(2%より少ない)。し
かし、上述の通り、IgG全長の部分から容易に分離することが可能なために問題とはな
らない。
する種とは異なる種が予測されていた。これはトランスフェクションの誤りであったと結
論付けられた。すなわち、試料11では1122−KKの代わりに、1337−KKが、
1025−DEと共発現されたことが明らかだった。
によりさらなる試験が行われた。フィブリノーゲンまたはチオグロブリンでELISAプ
レートのコーティングを行い、検出はフルオレセインでラベルしたチオグロブリンまたは
破傷風毒素で行った。検出抗原は製造業者の指示に従い、フルオレセイン(Pierce NHS-f
luorescin Antibody Labeling kit, cat. #53029)でラベルした。フルオレセインでラベ
ルした抗原は、その後、FITC共役抗フルオレセイン抗体(Roche diagnostics, cat.
# 11426346910)で検出した。
は各トランスフェクションで予測される種を示す。概して、実験結果は予測される結果と
合うが、例外をイタリックまたはボールド体で示した。トランスフェクション1−3では
、種BC(トランスフェクション#1および#2)またはAC(トランスフェクション#
3)は「ネガティブ」と推測されるセルだが、顕著なバックグラウンドのシグナルを示し
ている。これまでの研究から、二重特異性ELISAは高いバックグラウンドのレベルに
悩まされることが知られている。これらのバックグラウンドのレベルは試料に存在しうる
半分子に起因するかもしれない。注記しておくと、二重特異性ELISAの結果から、ト
ランスフェクション#11では誤りが起こっていたことが確認された。BCではなく種A
C(ボールド体の値)が検出された。
2つの二重特異性抗体の改善された混合物)
実施例12では、トランスフェクションZAまたはZBからの混合物は、大量生産に移
ったときに問題になるのではないかという予測の仮説があった。その理由は、ノブ・イン
トゥ・ホール変異体は不安定と報告され、「ノブ」または「ホール」を備えるCH3ドメ
インが電荷を操作されたCH3ドメインと二量化することは除外できないからである。上
述の例で示されたように、選択的にヘテロ二量化を誘導し、ホモ二量体の形成は実質的に
無い新規の電荷ペアの変異体が見出された。これらの新規の電荷ペアの変異体を備えるC
H3ドメインを備えるポリペプチド鎖は、これまでに知られている電荷を操作されたCH
3ドメインを備えるポリペプチド鎖あるいはSEED bodiesと共に細胞に発現され、2つの
二重特異性分子のみを選択的に形成する結果となりうる。
ンにより誘導されるクローン細胞において、1つの二重特異性分子(AB)または2つの
二重特異性分子(ABとAC)の生産をするのに優れている。しかし、相補的なCH3変
異として用いることができるベクターのセットが1つだけでは、生産されうる混合物の種
類は限られてしまう。もしDEKKと組み合わせて用いることができる、第2の「直交す
る(orthogonal)」ベクターのセットがあれば、「ABとCD」または「ABとCC」混
合物のようなより複雑なIgGおよび/または二重特異性分子を生産することが可能であ
る。
H3操作されたベクターから発現された重鎖が「交差」二量体を作らないことである。「
交差」とは、1つのベクターのセットにより生産された重鎖が、そのほかのベクターのセ
ットにより発現された重鎖と二量化したIgG全長となることである。
Kを用い、野生型CH3ドメインとDE−またはKK−変異を含むCH3ドメインとの間
のペアリングが起こるかについて知見を得るためのin silico解析が行われた。同様に、
野生型CH3ドメインとE356K,D399KまたはK392D,K409D変異を含むCH3ドメインとの間
のペアリングが起こりうるか、野生型CH3ドメインとノブ・イントゥ・ホール変異を含
むCH3ドメインとの間のペアリングが起こりうるか、および上記の任意の組み合わせに
ついて解析した。HADDOCKで解析したCH3変異の組み合わせのリストを表22に
示した。結果のHADDOCKスコアは図25に要約した。
合わせのCH3と、電荷反転の組み合わせのCH3とを組み合わせた場合が最も成功であ
るようだ。この組み合わせにより、単一細胞に共発現させたときに混入する副産物(特に
AC,AD,BC,BD)が無く、望ましい組み合わせの2つの二重特異性分子(ABと
CD)を形成することができる。
びBDは比較的高いHADDOCKスコアを有する。一方で、望ましいABおよびCDは
最も低いHADDOCKスコアを有する。もちろん、DEKKまたは電荷反転のCH3組
み合わせのいずれかが同一の特異性を保持するコンストラクトに挿入されたとき(例えば
、DE側に「C」,KK側に「C」,E356K,D399K側に「A」およびE356K,D399K側に「B
」、または、DE側に「A」,KK側に「B」,E356K,D399K側に「C」およびE356K,D39
9K側に「C」)は、細胞に共発現させるとCCおよびABが主に生産される。
HADDOCKスコアはCDに対するHADDOCKスコアより低い。このことは、DE
KKのCH3組み合わせをコードするベクターと、野生型CH3をコードするベクターと
を一緒に共発現することにより、ABとCDの混合物を生産しようとするとき、ACおよ
びADが非常に混入しやすいことを示している。
とを一緒に共発現する場合の予測では、望ましくない二重特異性変異体が比較的低いHA
DDOCKスコアを有する結果となった。すなわち、共発現の際、これらの望ましくない
種が生産される蓋然性が高い。
E356K,D399K/K392’D,K409D’)が実質的に純粋な「ABとCD」および/または「AB
とCC」の抗体の混合物を得るのに理想的に好ましいと結論された。
する2つの二重特異性分子の混合物と、3つの標的/エピトープ(ABとCC)を認識す
る1つの二重特異性分子と1つの単一特異性分子の混合物とが生成された。これらの混合
物の生成においては、4つの異なるVHはすべて共通の軽鎖IGVK1−39とペアリン
グすることができるが、個々のVH/VLの組み合わせは全て異なる特異性を有する。
ばならない。すなわち、190Daよりも大きい値である。共発現の際予測される種がn
MSで同定され分離されることができるような質量の値をとるように、4つの個々のVH
が選択された。さらに、4つの選択されたVHは、2つの望ましい種に加え、混合物で生
まれうる大半の混入物をも同定するのに十分なほど大きい質量差をもつ。選択されたVH
のリストを表23に示した。
または電荷反転コンストラクトを含むベクターにクローンされ、また、いくつかの共発現
を行った。今までと同様、すべてのベクターは共通の軽鎖IGKV1−39をコードする
核酸も含んでいる。これまでに示したように、2つのベクターのセットを組み合わせたと
きに重要な要件は、2つの異なるセットのCH3操作されたベクターから発現された重鎖
が「交差」二量体を形成しないことである。「交差」とは、1つのベクターのセットから
生産される重鎖が、他のベクターのセットにより発現される重鎖と二量化しIgG全長と
なることである。電荷反転変異を含む重鎖とDEまたはKK変異を含む重鎖との間の「交
差」二量体の形成の可能性をテストするため、コントロールのトランスフェクションが行
われた。
おいて存在しうる混入物についてのさらなる概要を提供する。
−PAGEにより解析され、3つのコントロールの試料が含まれた(図26)。さらに、
試料のすべての種を同定するため、トランスフェクション#9−11からの蛋白質試料に
ついて、nMS解析が行われた。
は、「KK」コンストラクトと「E356K:D399K」または「K392D:K409D」のいずれかとの間
の予測されたミスマッチの結果となった。これらのトランスフェクションからの蛋白質試
料における半分子の量は、IgG分子全長の量を超えていた。
ほぼ等しい量で存在する結果となった。しかし、SDS−PAGEからは、このIgG全
長がDE/DE二量体、DE/E356K:D399K二量体、またはDE/K392D:K409D二量体のど
れを表しているのか導き出すことができない。注目すべきことには、トランスフェクショ
ン#9−11からの試料では、実質的に半分子は観察されなかった。
測される種の割合および混入する種はピークの高さで算出した。トランスフェクション#
9では、予測される種「ABとCD」が混合物の97%(30%ABおよび67%CD)
を表した。一方で、わずか約3%のみの混入するBDが存在する(図27A)。トランス
フェクション#11では、予測される種「ABとCC」が混合物の94%(33%ABお
よび61%CC)を表した。一方で、わずか6%のみのコンタミネーションするBC(4
.1%)およびAC(1.8%)が存在する(図27B)。
合わせて用いられると、「ABとCD」または「ABとCC」の混合物のようなより複雑
なIgGおよび/または二重特異性分子の混合物を生産することが可能になる。電荷反転
コンストラクトとDEKKコンストラクトを共に組み合わせて用いると、非常に限られた
量の「交差」二量体の形成しか起こらない。トランスフェクションの比率を調節すること
で、これら低い割合で混入する副産物を、さらに減少させることができると予測される。
CH3領域にDEKK変異の組み合わせを保持する二重特異性抗体の、薬物動態(pK
)の挙動を研究するため、この研究では、3つの異なるIgGバッチのpKパラメタを測
定し比較した。3つのバッチに含まれるのは以下である;1)野生型抗破傷風毒素の親の
抗体1337:1337(野生型Fc主鎖に2つのMF1337Fab)、2)野生型抗
破傷風毒素の親の抗体1516:1516(野生型Fc主鎖に2つのMF1516Fab
)、3)Fc領域にDEKK組み合わせ変異を保持するCH3操作された二重特異性抗破
傷風毒素抗体1516:1337(DE側にMF1516Fab、KK側にMF1337
Fab)。
:1516の特異性を持つように選択された。その理由は、いくつかのマウスの系統にお
いてこれらの抗体に対する処方前の血清反応が存在しないことがこれまでの研究に基づい
て知られているからである。ちなみに、処方前に血清反応が存在すると、研究結果の検討
が難しくなる。さらに、nMSにより、親の抗体間における、1337:1337(野生
型Fc)、1516:1337(DEKK Fc)および1516:1516(野生型F
c)の識別が可能になるだけの十分な質量差があることも理由の一つである。
クションに用いられたDNAはエンドトキシンの量が可能な限り少なくなるようにエンド
トキシンフリーのマキシプレップキットを用いて作成した。バッチは、その後、蛋白質の
濃度、凝集量、エンドトキシン量および二重特異性の生産物の割合について試験された。
のちのpKの研究におけるIgGバッチの使用についての許容基準にかなうことが示され
た。すなわち、ゲル濾過後のIgG濃度は0.3mg/mlより高く、凝集量は5%より
低く、エンドトキシン量は3EU/mg蛋白質であり、DEKKバッチは90%を超える
二重特異性IgGを含んでいた。
ていた。試料1516:1337では、約2%と見積もられる少量のDE:DEホモ二量
体が検出された(図28)。3つのIgGのバッチはpK研究に用いるための基準を満た
すと結論された。
(Harlan, The Netherlands)に、1mg/kgのヒトIgG(5ml/kg 免疫グロ
ブリン溶液/kg体重)を投与した。動物は投与時において7−8週齢であり、約18−
20グラムの体重であった。血液の試料は、投与前、投与後15,60分、並びに投与後
2,4,8,24,48,96,168,268および336時間に収集された。血清試
料が整えられ、分析まで−20度より低い温度で保存された。それぞれの群は4匹のマウ
スの3つの下位群からなる。すなわち、12マウス/群である。それぞれのマウスからは
6の時点から試料が収集された。
ral principles governing the use of animals in experiments of the European Commu
nities)およびオランダの立法(オランダの動物実験に関する法律:The Experiments on
Animals Act, 1997)に従い維持した。この研究は、米国国立衛生研究所実験動物福祉部
門が発行した、実験動物の人道的管理と使用に関する基準(Standards for Humane Care
and Use of Laboratory Animals)、識別番号45859-01(満了日:2015年4月30日
)も遵守して行われた。
。群2のマウスは単一特異性IgG抗体1337:1337全長の投与を受けた(四角)
。群3のマウスはDEKK操作されたCH3領域(DE側が1516、KK側が1337
)をもつ二重特異性IgG抗体1516:1337全長の投与を受けた(菱形)。
用いて、ELISAアッセイによりマウス血清中のモノクローナルヒト抗体の定量分析を
行った。簡潔に述べると、ELISAアッセイは以下の原理に基づく。96ウェルのEL
ISAプレートに抗ヒトIgGのコートがあり、ヒトモノクローナル抗体が該抗ヒトIg
Gに結合する。結合した抗体はその後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)
共役したポリクローナル抗ヒトIgG抗体を用いて可視化された。
に示した。DEKK変異の組み合わせを保持する二重特異性IgG全長と、親の単一特異
性抗体は著しく類似することが観察された。DEKK−二重特異性抗体にあるCH3変異
は、安定性または半減期を変えない。また、DEKK変異体は野生型IgGのようにふる
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Claims (34)
- 単一細胞からヘテロ二量体のIg様分子を生産する方法であって、
前記Ig様分子は、接触面を形成することができる2つのCH3ドメインを備え、
前記方法は、前記細胞に、
a.第1のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第1の核酸分子、
b.第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第2の核酸分子
を与えることを含み、
前記第1のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖は、中立的なアミノ酸残基から正に
荷電したアミノ酸残基への少なくとも一つの置換を備え、
前記第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖は、中立的なアミノ酸残基から負に
荷電したアミノ酸残基への少なくとも一つの置換を備え、
前記方法は、前記宿主細胞を培養し、前記2つの核酸分子を発現させ、前記ヘテロ二量
体Ig様分子を培養物から回収する工程をさらに備える、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
前記宿主細胞に、共通の軽鎖をコードする核酸分子を与えることをさらに含む、方法。 - 請求項1または2に記載の方法において、
前記第1のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖はアミノ酸置換T366Kを備え、
前記第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖はアミノ酸置換L351Dを備える
、方法。 - 請求項3に記載の方法において、
前記第1のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖はアミノ酸置換L351Kをさらに
備える、方法。 - 請求項3または4に記載の方法において、
前記第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖は、Y349E,Y349Dおよび
L368Eからなる群から選択される1つのアミノ酸置換をさらに備える、方法。 - 請求項5に記載の方法において、
前記第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖はアミノ酸置換L368Eをさらに
備える、方法。 - 請求項1から6のいずれか一項に記載の方法において、
混入するホモ二量体の存在は5%より少なく、好ましくは2%より少なく、より好まし
くは1%より少なく、最も好ましくは混入するホモ二量体が実質的に無い、方法。 - 請求項1から7のいずれか一項に記載の方法において、
それぞれの前記CH3ドメインを備えるポリペプチド鎖は、標的エピトープを認識する
可変領域をさらに備える、方法。 - 請求項8に記載の方法において、
前記CH3ドメインを備えるポリペプチド鎖の、それぞれの2つの可変領域は異なる標
的エピトープを認識する、方法。 - 請求項9に記載の方法において、
前記異なる標的エピトープは同一の標的分子に位置する、方法。 - 請求項10に記載の方法において、
前記標的分子は水溶性の分子である、方法。 - 請求項10に記載の方法において、
前記標的分子は膜結合性分子である、方法。 - 請求項9に記載の方法において、
前記異なる標的エピトープは異なる標的分子に位置する、方法。 - 請求項13に記載の方法において、
前記異なる標的分子は同一の細胞に発現する、方法。 - 請求項13に記載の方法において、
前記異なる標的分子は異なる細胞に発現する、方法。 - 請求項13に記載の方法において、
前記異なる標的分子は水溶性の分子である、方法。 - 請求項13に記載の方法において、
1つの標的分子は水溶性の分子であり、2番目の標的分子は膜結合性分子である、方法。 - 請求項8から10、12から15、または17のいずれか一項に記載の方法において、
前記標的エピトープの少なくとも1つは腫瘍細胞に位置する、方法。 - 請求項8から10、12から15、または17のいずれか一項に記載の方法において、
前記標的エピトープの少なくとも1つはエフェクター細胞に位置する、方法。 - 請求項19に記載の方法において、
前記エフェクター細胞は、NK細胞,T細胞,B細胞,単球,マクロファージ,樹状細
胞,または好中性顆粒球である、方法。 - 請求項19または20に記載の方法において、
前記標的エピトープは、CD3,CD16,CD25,CD28,CD64,CD89
,NKG2DまたはNKp46分子に位置する、方法。 - 請求項1から21のいずれか一項に記載の方法において、
前記ヘテロ二量体Ig様分子は、抗体,好ましくはヒトIgG,より好ましくはヒトI
gG1である、方法。 - 請求項2から22のいずれか一項に記載の方法において、
前記共通の軽鎖は生殖細胞系列由来の軽鎖であり、好ましくは再編成された生殖細胞系
列ヒトκ軽鎖IgVκ1−39*01/IGJκ1*01である。 - 請求項1−23のいずれか一項に記載の方法により得られるヘテロ二量体Ig様分子。
- 請求項24に記載のヘテロ二量体Ig様分子において、
前記ヘテロ二量体Ig様分子は、同一の抗原にある異なるエピトープおよび/または異な
る抗原にある異なるエピトープに結合する、ヘテロ二量体Ig様分子。 - 請求項24または25に記載のヘテロ二量体Ig様分子において、
前記Ig様分子は抗体である、ヘテロ二量体Ig様分子。 - 2つのCH3ドメインを備えるヘテロ二量体の抗体であって、
前記2つのCH3ドメインの1つは、
アミノ酸置換L351DおよびL368Eを備え、
前記2つのCH3ドメインの他の1つは、
アミノ酸置換T366KおよびL351Kを備える、ヘテロ二量体の抗体。 - 少なくとも第1および第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする核酸
配列を備える組み換え宿主細胞であって、
前記第1のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖は中立的なアミノ酸残基から正に荷
電したアミノ酸残基への少なくとも1つの置換を備え、
前記第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖は中立的なアミノ酸残基から負に荷
電したアミノ酸残基への少なくとも1つの置換を備える、組み換え宿主細胞。 - 請求項28に記載の組み換え宿主細胞において、
前記宿主細胞は、共通の軽鎖をコードする核酸配列をさらに備える、組み換え宿主細胞
。 - 請求項24から26のいずれか一項に記載のヘテロ二量体Ig様分子または請求項27
に記載のヘテロ二量体の抗体と、薬学的に容認可能な担体とを備える医薬組成物。 - 請求項30に記載の医薬組成物において、
前記ヘテロ二量体Ig様分子または前記ヘテロ二量体の抗体は請求項28または請求項2
9の組み換え宿主細胞で生産された、医薬組成物。 - ヘテロ二量体Ig様分子を生産するための宿主細胞を作成する方法であって、
前記方法は、
前記宿主細胞に、少なくとも第1および第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖
をコードする核酸配列を導入する工程を備え、
前記第1のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖は中立的なアミノ酸残基から正に荷
電したアミノ酸残基への少なくとも1つの置換を備え、
前記第2のCH3ドメインを備えるポリペプチド鎖は中立的なアミノ酸残基から負に荷
電したアミノ酸残基への少なくとも1つの置換を備え、
前記核酸配列は、順々にまたは同時に導入される、方法。 - 請求項32に記載の方法において、
前記宿主細胞に共通の軽鎖をコードする核酸配列を導入する工程をさらに備える、方法
。 - ヘテロ二量体Ig様分子を生産する、請求項28若しくは29に記載の組み換え宿主細
胞の、または請求項32若しくは33に記載の方法により得られる組み換え宿主細胞の、
培養物。
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