TW201249871A

TW201249871A - Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly

Info

Publication number: TW201249871A
Application number: TW100143904A
Authority: TW
Inventors: Tomoyuki Igawa; Shinya Ishii; Miho Funaki; Naoka Hironiwa; Atsuhiko Maeda; Junichi Nezu; Yoshinao Ruike; Takeshi Baba; Shun Shimizu
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2010-11-30
Filing date: 2011-11-30
Publication date: 2012-12-16
Also published as: RU2757786C2; US20180258161A1; US20240158482A1; JP2017019773A; MX365235B; RU2658504C9; CN103328632A; JP6030452B2; KR20220045258A; RU2642318C2; US20140234340A1; TWI654204B; JP6745858B2; EP4231014A3; TWI812066B; KR102568454B1; HK1251592A1; TW202043266A; EP2647706B1; US11891434B2

Description

201249871 四、指定代表圖： (一）本案指定代表圖為：第（丨）圖。 (二）本代表圖之元件符號簡單說益。 ψ ”、、五、本案;^化學式時’請揭示最能顯示發雜徵的化學無。工、. 六、發明說明：【發明所屬之技術領域】造方法與醫藥本發明係關於一種抗原結合分子及其製用途。【先前技術】抗體在血漿中的安定性高、副作用少，因此當做醫藥品受重視。其中IgG型之抗體醫藥已有多數上市，現在也有多數抗體醫藥正在開發中（非專利文獻丨、非專利文獻 2)。另一方面，就適用於第2世代之抗體醫藥的技術而言已開發出各種技術，已有使效應子機能、抗原結合能力、樂物動態、安定性提尚、或使免疫原性風險減低的技術等報告（非專利文獻3)。抗體醫藥一般由於投予量非常高，故難製作皮下投予製劑，且製造成本高等據認為係課題。就減低抗體醫藥之投予量的方法而言，有人考慮提高抗體之藥物動態之方法’及提高抗體與抗原之親和性（affinity) 之方法。 2 201249871 就提高抗體之藥物動態之方法而言，有人報告怪定區的人工胺基酸取代（非專利文獻4、5)。就増合能力、抗原中和能力之技術而言’有人報告親和性成熟技術 (非專利文獻6)，可藉由對於可變區之CDR區等導入胺基酸變異而增加對於抗原之結合活性。藉由增加抗原… 力’可使於體外（in vitro)之生物活性提古旦丨土扠阿，或減少投予量’而且也可提高於體内（in vivo)之藥效（非專利文獻另-方面，抗體每1分子能中和之抗原量取決於親和性，藉由強化親和性能以少抗體量中和抗原，且可利用各種方法強化抗體之親和性（非專利文獻6)。再者，若能對於抗原共價鍵結並使親和性為無限大，則能以i分子抗體中和1分子抗原(2價時為2分子抗原）。但是，至今二的方法’以i分子抗體中和i分子抗原。價時為2分子抗 =之化學理論中和反應為極限’不可能以抗原量以下的抗體量將抗原完全中和。亦即，強化親和性之效果存在極限 I非專利文獻9 )。中料為了使其t和效果持續固夕月間，需要在此期間投予比起活體内所產生之抗原量更 1 =體量’僅是上述抗體之藥物動態提高、或親和性成技街’於必要抗體投予量之減少存在極限。是乂柷原里以下的抗體量於目的期間持續抗原之果就達成此效果的新方、、土女

依存性結合的抗體（專lit 報告對於抗原為pH 性條件下強力結合，且於妙υ°對於心原在血聚令之中 ° ;核内體内之酸性條件下從抗原解 3 201249871 離之pH依存性抗原結合 ° »抗體’可於核内體内從抗原解離。 pH依存（H原結合抗體，可於將抗原解離後，將抗體利用

FcRn再度循環於血漿φ 良中而再度結合於抗原，故能以1個抗體反複結合於多數抗原。又’抗原之血製中滞留性，比起結合於FcRn而再度循環的抗體，非常之短，中滞留性長之抗體若結合於如此於血！中滯留性短的抗原，則抗體抗原複合體之血漿中滯留性會與抗體同樣增長。目此，藉由抗原與抗體結合，血聚中滯留性增長’且血I中抗原濃度升高。於如此的情形，即使提高抗體對於抗原之親和性，也無法促進抗原從血漿中消失。上述pH依存性抗原結合抗體比起通常之抗體，當做促進抗原從血漿中消失之方法據報告為有效（專利文獻1)。如上所述，pH依存性抗原結合抗體以丨個抗體結合於多數抗原，且比起通常的抗體能促進抗原從血漿中消失，故具有通常的抗體無法獲得的作用。但是至今為止，為了達成該pH依存性抗原結合抗體能反複結合於抗原之效果’及達成促進抗原從血漿中消失之效果，僅知道利用血衆中與核内體内之pH的差異而對於抗原抗體反應賦予pH 依存性之方法。又，本發明之先前技術文獻如下。【先前技術文獻】【專利文獻】

【專利文獻 1】W0 2009/125825，ANTIGEN-BINDING 4 201249871

MOLECULE CAPABLE OF BINDING TO TWO OR MORE ANTIGEN MOLECULES REPEATEDLY 【非專利文獻】【寻t 專矛1J 文獻 1】Monoclonal antibody successes in the clinic, Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Nature Biotechnology 23, 1073 - 1078 (2005) 【非專利文獻 2 】Pavlou AK, Belsey MJ.， The therapeutic antibodies market to 2008., Eur J Pharm Biopharm. 2005 Apr;59( 3):389-96. 【非專利文獻 3】Kim SJ，Park Y，Hong HJ·, Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. 2005 Aug 31;20(1):17-29. Review· 【非專利文獻 4】Hinton PR, Xiong JM，Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushi ta N.，An engineered human IgGl antibody with longer serum half-life., J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56 【非專利文獻 5】Ghetie V，Popov S，Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES. , Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat Biotechnol. 1997 Jul;15(7):637-40 【非專利文獻 6】Proc Nat 1 Acad SciUSA. 2005Jun 14;102(24):8466-71. Epub 2005 Jun 6. A general method 201249871 for great 1y improving the affinity of antibodies by using combinatorial 1ibrari es.Ra j pal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R. 【非專利文獻 7】WuH，PfarrDS, Johnson S, Brewah YA, Woods RM, Patel NK, White WI, Young JF, Kiener PA. Development of Motav i zumab, an U11ra-potent Anti body for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respiratory Tract. J Mol Biol. 2007, 368, 652-665 【非專利文獻 8】Hanson CV, NishiyamaY, Paul S. Catalytic antibodies and their applications.Curr Opin Biotechnol. 2005 Dec;16(6):631-6. 【非專利文獻 9】Rathanaswami P, Roa 1 stad S，Roskos L, Su QJ，Lackie S，Babcook J. Demonstration of an 體内（in vivo) generated sub-picomolar affinity fully human monoclonal antibody to interleukin-8. Biochem Biophys Res Commun. 2005 Sep 9 ; 334(4):1004-13. 【發明内容】【發明欲解決之課題】本發明係有鑑於如此的狀況而產生，其目的在於提供促進利用抗原結合分子使抗原攝入細胞内之方法、增加1 分子之抗原結合分子對於抗原之結合次數之方法、利用抗 6 201249871 原結合分子之投予促進血漿中之抗原漢度減少之方法改善抗原結合分子之血聚中滞留性之方法、促進抗原攝入細胞内之抗原結合分子'增加對於抗原之結合次數之抗原結合分子、能利用投予而促進綠中之抗原濃度減少之抗原結合分子、改善血漿中滞留性之抗原結合分子、含有該抗原結合分子之醫藥組成物、及此等之製造方法。【解決課題之方式】本案發明人等針對^足i隹士丨田> π Λ 了促進利用抗原結合分子（具有抗原結合能力之多胜肽等分子）使抗原攝入細胞内之方法、使丄分子抗原結合分子對於抗原之結合次數增加方法、促進利用抗原結合分子之投子诚^1 刀丁心仅卞减j血漿中之抗原濃度之方法、改善抗原結合分子之血漿中滯留性之方法努力研究。其結果，本案發明人等著眼於血裝中與早期核内體内㈣濃度的差由使用具有顯示鈣依存性之抗原抗體反應的抗原結合分子，能夠促進利用抗原結合分子使抗原攝入細胞内、猎由抗原結合分子多次結合於抗原使（分子抗原結合分子對於抗原的結合次數增加、利用抗原結合分子之投予促進血漿中之抗原濃度減少、及改善抗原結合分子之血漿中滯留性。亦即本發明係關於藉由顯示具鈣依存性之抗原抗體反應之抗原結合分子’促進抗原攝入細胞内之方法、增加1 分子抗原結合分子對於抗原之結合次數之方法利用抗原 0刀子之投予促進血漿中之抗原濃度減少之方法、改善抗原結合分子之血漿中滞留性之方法、抗原攝入細胞内受 201249871 促進之抗原結合分子、對於抗原之結合次數經增加之抗原、、.口〇刀子ab藉由其投予促進血漿中之抗原濃度減少之抗原結合分子、血漿中滯留性經改善之抗原結合分子、含有該抗原結合分子之醫藥組成物、及該等之製造方法等，更具體而言’係關於以下： [1 ] 一種抗原結合分子，其包含抗原結合域與人類 FcRn、”。合域，在2種不同鈣濃度條件下的抗原結合活性不同，抗原結合分子在低鈣濃度條件下的抗原結合活性比起在高妈濃度條件下的抗原結合活性為低，且於中性pH條件下對於人類FcRn具結合活性。 [2 ]如[1 ]之抗原結合分子，其中低鈣濃度為離子化鈣 ?辰度 0·1βΜ〜30//M。 [3 ]如[1 ]之抗原結合分子，其中高鈣濃度為離子化鈣濃度 1 00 # M~1 0 mM。 [4 ]如[1 ]或[2 ]之抗原結合分子，其中低鈣濃度為核內體内之離子化鈣濃度。 [5] 如[1]或[3]之抗原結合分子，其中高鈣濃度為血漿中之離子化鈣濃度。 [6] 如[1]至[5]中任一項之抗原結合分子，其中前述 FcRn結合域為Fc區域。 [7] 如[1]至[6]中任一項之抗原結合分子，其中，於酸性pH條件下之抗原結合活性比起於中性pH條件下之抗原結合活性低。 1個胺基酸經組 [8] 如[7]之抗原結合分子，其中至少 8 201249871 胺酸取代’或至少有1個組胺酸插入。 [9 ]如[1 ]至[8 ]中任—項之抗原結合分子，其係結合於膜抗原或可溶型抗原。 [1 0 ]如[1 ]至[9 ]中任一項之抗原結合分子，其中，該抗原係選自於由1L，、IL-6、IgA、人類Glypican3、及 IgE構成的群組。 [11 ] 一種抗原結合分子，其包含抗原結合域與人類 FcRn、，，。σ域於2種不同的鈣濃度條件下的抗原結合活性不同，抗原結合分子在低鈣濃度條件下的抗原結合活性比起在高弼濃度條件下的抗原結合活性為低，且包含於抗原 s域的輕鏈或重鏈含有來自於人類抗體之鈣結合模體 (motif)。 [1 2 ]如[11 ]之抗原結合分子，其中鈣結合模體包含於抗原結合域之輕鏈CDR1、CDR2及/或CDR3。 [13] 如[12]之抗原結合分子，其中鈣結合模體包含於輕鏈CDR1之以Kabat編號法表示之3〇位、31位及/或32 位。 [14] 如[12]或[13]之抗原結合分子，其中㈣結合模體包含於輕鏈CDR2之以Kabat編號法表示之50位。 [15] 如[12]至[14]中任一項之抗原結合分子，其中鈣結合杈體包含於輕鏈CDR3之以Kabat編號法表示之92位。 [16 ]如[12 ]至[15 ]中任一項之抗原結合分子，其中抗原結合分子為IgA、或人類Glypican3任一者。 [1 7 ]如[11 ]之抗原結合分子，其中，鈣結合模體包含 201249871 於抗原結合域之重鏈CDRl、CDR2及/或CDR3。 [18 ]如[16 ]之抗原結合分子，其中，鈣結合模體包含於重鏈CDR3之以Kabat編號法表示之95位、96位、1 00a 位、及/或101位。 [1 9 ]如[1 7 ]或[1 8 ]之抗原結合分子，其中抗原結合分子為IL-6R、或IL-6任一者。 [20] 如[11]至[19]中任一項之抗原結合分子，其包含於pH中性域之條件下對於FcRn具結合活性之FcRn結合域。 [21] 如[20]之抗原結合分子，其中前述FcRn結合域為 Fc區域。 [22] 如[1]至[1〇]、[2〇]或[21]中任一項之抗原結合分子’其中，前述Fc區域之胺基酸序列當中，以EU編號法表示之 248、2 50、252、2 54、255、256、257、258、265、 286 、 289 、 297 、 303 、 305 、 307 、 308 、 309 、 311 、 312 ' 314 、 315 、 317 、 332 、 334 ' 360 、 376 、 380 、 382 、 384 、 385、386 ' 387、389、424、428、433、434、及 436 中任一者以上之胺基酸為與天然型Fc區域之胺基酸不同之Fc 區域。 [23] 如[22]之抗原結合分子，其中，前述Fc區域之以 EU編號法表示之胺基酸為； 237位之胺基酸為Met、 248位之胺基酸為Ile、 250 位之胺基酸為 Aia、phe、lie、Met、Gin、Ser、 10 201249871

Val、Trp、或 Tyr、 252位之胺基酸為Phe、Trp、或Tyr、 254位之胺基酸為Thr、 255位之胺基酸為Glu、 256位之胺基酸為Asp、Glu、或Gin、 257 位之胺基酸為 Ala、Gly、lie、Leu、Met、Asn、

Ser、Thr、或 Val、 258位之胺基酸為His、 265位之胺基酸為Aia、 286位之胺基酸為Ala或Glu、 289位之胺基酸為jjis、 297位之胺基酸為Aia、 303位之胺基酸為Aia、 305位之胺基酸為Ala、 307 位之胺基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、 Lys 、 Leu 、 Met 、 Asn 、 Pro 、 Gin 、 Arg 、 Ser 、 Val 、 Trp 、或 Tyr、 308 位之胺基酸為 Ala、Phe、lie、Leu、Met、Pro、 Gin、或 Thr、 309 位之胺基酸為 Ala、Asp、Glu、Pro、或 Arg、 311位之胺基酸為Ala、His、或lie、 312位之胺基酸為Ala或His' 314位之胺基酸為Lys或Arg、 315位之胺基酸為Ala、Asp或His、 11 201249871 317位之胺基酸為Ala、 332位之胺基酸為val、 334位之胺基酸為Leu、 360位之胺基酸為His、 376位之胺基酸為Ala、 38〇位之胺基酸為Ala、 382位之胺基酸為Ala、 384位之胺基酸為Ala、 385位之胺基酸為Asp或His、 386位之胺基酸為pr〇、 387位之胺基酸為Glu、 389位之胺基酸為Ala或Ser、 424位之胺基酸為Ala、 428 位之胺基酸為 Aia、ASp、phe、Gly、His、lie、 Lys Leu Asn、Pr〇、Gin、Ser ' Thr、Val、Trp、或 Tyr、 433位之胺基酸為LyS、 434 位之基酸為 Ala、Phe、His、Ser、Trp、或 Tyr、或 436 位之胺基酸為 His 、lie、Leu、Val、中任一者以上之組合。 [24] 如[1]至[23]中任一項之抗原結合分子，其中，該抗原結合分子為抗體。 [25] —種抗原結合分子之製造方法，該抗原結合分子具有選自於以下中至少1種機能:⑴促進抗原攝入細胞内 12 201249871 之機能、（π)對於抗原結合2次以上之機能、（iii)促進血聚中之抗原濃度減少之機能、及（ιν)優異的血豫中滯留性機能，包含以下步驟（a)〜（e); (〇獲得在低鈣濃度條件下之抗原結合分子么抗原結合活性、 (b) 獲得於南鈣濃度條件下之抗原結合分子之抗原結合活性、 (c) 選擇在低妈濃度條件下之抗原結合活性比起於高約展度條件下之抗原結合活性低的抗原結合分子、 (d) 獲得編碼為前述步驟（c)所選擇之抗原結合分子的基因、 (e) 使用前述步驟（d)獲得之基因製造抗原結合分子。 [26 ] —種抗原結合分子之製造方法，該抗原結合分子具有選自於以下中至少1種機能：⑴促進抗原攝入細胞内之機能、（ii)對於抗原結合2次以上之機能、（iii)促進血漿中之抗原濃度減少之機能、及（iv)優異的血漿中性機能，印驾包含以下步驟（a)〜（e); (a) 於高鈣濃度條件下使抗原結合分子或抗原結合分子庫接觸抗原、 (b) 將前述步驟（a)中結合於抗原之抗原結合分子置在低鈣濃度條件下、 (C)取得於前述步驟（b)解離之抗原結合分子、 13 201249871 基因 (d)獲得編碼為前述步騾（c)取得之抗原結合分子的 (e)使用前述步驟⑷獲得之基因製造抗原結合分子 [2”-種抗原結合分子之製造方法，該抗原結。具有選自於以下中至少i種機能:⑴促進抗原攝入細扔

内之機能、（ii)對於抗原結合2次以上之機能、（iu)^ L 血I中之抗原濃度減少之機能、及（iv)優異的血聚中滯性機能，留包含以下步驟（a)~(f); (a) 在低鈣濃度條件下使抗原結合分子或抗原結合分子庫接觸抗原、 π (b) 選擇於前述步驟（a)未結合於抗原之抗原結合分 (c) 使前述步驟（b)選擇之抗原結合分子於高鈣壤片條件下接觸抗原、 & (d) 取得於前述步驟（c)結合於抗原之抗原結合分子、 (e) 獲得編碼為前述步驟（d )取得之抗原結合分子基因、 < (f) 使用前述步驟（e)獲得之基因產生抗原結合分子。 [28]如[25]至[27]中任一項之抗原結合分子之製造方法’更包含以下步驟：改變抗原結合分子中之胺基酸，賦予或提高於中性pH條件下對於人類FcRn之結合活性。 [29 ]如[25]至[27]中任一項之抗原結合分子之製造方法’更包含以下步驟：改變抗原結合分子中之胺基酸，使於 14 201249871 酸性pH條件下之抗原結合活性低於中性pH條件下之抗原結合活性。 [30] 如[25]至[27]中任一項之抗原結合分子之製造方法，其中，低鈣濃度為離子化鈣濃度0 · 1从Μ〜30 μ Μ。 [31] 如[25]至[27]中任一項之抗原結合分子之製造方法’其中’南妈濃度為離子化#5濃度100yM〜10mM。 [32] 如[25]至[27]中任一項之抗原結合分子之製造方法，其中，低妈濃度為核内體内之離子化J弓濃度。 [33] 如[25]至[27]中任一項之抗原結合分子之製造方法，其中，高鈣濃度為金漿中之離子化鈣濃度。 [34] 如[29 ]之抗原結合分子之製造方法，其中，抗原結合分子中之胺基酸之改變，係將抗原結合分子中至少1 個以上之胺基酸以組胺酸取代或插入至少1個組胺酸之改變。 [35] 如[25]至[34]中任一項之抗原結合分子之製造方法’其中’前述抗原結合分子所結合之抗原係選自於由 IL-6R、IL-6、IgA、人類 Glypican3、及 IgE 構成的群組的抗原。 [36] 如[25]至[35]中任一項之抗原結合分子之製造方法，其中’前述抗原結合分子為抗體。 [37] —種醫藥組成物，其包含如[1]至[24]中任一項之抗原結合分子或由如[25 ]至[36 ]項中任一項之抗原結合分子之製造方法製造之抗原結合分子、及藥學上可容許之載體。 . 15 201249871 [38] 如[3 7 ]之醫藥組成物，其係用胞内。於促進抗原攝入細於促進血漿中之抗 [39]如[37]之醫藥組成物，其係用原濃度減少。其用於促進抗原攝入細胞内或 ’包含抗原結合分子，該抗原人類FcRn結合域且於2種不同活性不同’抗原結合分子在低性比起於高鈣濃度條件下之抗 [40] —種醫藥組成物，促進血漿中之抗原濃度減少結合分子含有抗原結合域與的弼濃度條件下的抗原結合弼濃度條件下之抗原結合活原結合活性為低。 [41] 如[40]之醫藥組成物，其中，低鈣濃度為離子化 1丐濃度0. 1/z Μ〜30以Μ、。 [42] 如[40]之醫藥組成物，其中，高鈣濃度為離子化弼濃度 100 β Μ~1 0 βιΜ。 [43] 如[4〇]或[41]之醫藥組成物，其中，低鈣濃度為核内體内之離子化鈣濃度。 [44] 如[40]或[42]之醫藥組成物，其中，高妈濃度為血聚中之離子化鈣濃度。 [45] 如[4〇]至[44]中任一項之醫藥組成物，其中，包 3於則述抗原結合分子之FcRn結合域為Fc區域。 [46] 如[40]至[45]中任一項之醫藥組成物，其中，前述^原結合分子於酸性pH條件下之抗原結合活性低於中性PH條件下之抗原結合活性。 [47] 如請求項46之醫藥組成物，其中，前述抗原結 16 201249871 合分子之至少1個胺基酸經組胺酸取代、或至少有1個組胺酸插入。 [48] 如[40]至[47]中任一項之醫藥組成物，其中，前述抗原結合分子所結合之抗原，係選自於由IL-6R、IL-6、 IgA、人類Glypican3、及構成的群組的抗原。 [49] 一種抗原結合分子之篩選方法，該抗原結合分子具有選自於以下中至少1種機能：（i )促進抗原攝入細胞 &機對於抗原結合2次以上之機能、（iii)促進血聚中之抗原濃度減少之機能、及（iv)優異的血漿中滯留性機能，包含以下步驟（a)〜（c); (a) 獲付在低#5漢度條件下之抗原結合分子之抗原結合活性、 (b) 獲件於向辦濃度條件下之抗原結合分子之抗原結合活性、曲、擇在低妈浪度條件下之抗原結合活性比起於高鈣濃度條件下之抗原結人 Q α活性低的抗原結合分子。種抗原結合分子之篩選方法，該抗原詰合分子具有選自於以下中至少 ^ 1種機能（i)促進抗原攝入細胞内之機邊、（ii)對於抗原社艰. ’、、、、Q s 2次以上之機能、（i i i)促進血機At 機此、及（i v)優異的血漿中滯留性包含以下步驟（a)〜（c); (a)於高鈣濃度條件干下使抗原結合分子或抗原結合分 17 201249871 子庫接觸抗原、 (b)將前述步 7驟（a)中結合於抗原之抗原結合分子置在低#5濃度條件下、 (C)取得於刚述步驟（b)解離之抗原結合分子。 [51 ]種抗原結合分子之筛選方法，該抗原結合分子八有選自於以下中至少i種機能：⑴促進抗原攝入細胞内之機月b、（11)對於抗原結合2次以上之機能、（i i i)促進血漿中之抗原濃度減少之機能、及(iv)優異的血漿中滯留性機能，包含以下步驟（a)~(d); (a) 在低約濃度條件下使抗原結合分子或抗原結合分子庫接觸抗原、 (b) 選擇於前述步驟未結合於抗原之抗原結合分子、 (c) 使前述步驟（b)選擇之抗原結合分子於高鈣濃度條件下結合於抗原、 (d) 取得於前述步驟（幻結合於抗原之抗原結合分子。 [52] 如[49]至[51]項中任一項之抗原結合分子之篩選方法’其中’低鈣濃度為離子化鈣濃度0. 1 " 30 // Μ。 [53] 如[49]至[51]項中任一項之抗原結合分子之篩選方法’其中’高鈣濃度為離子化鈣濃度100/zM~10mM。 [54] 如[49]至[52]項中任一項之抗原結合分子之篩選方法’其中’低鈣濃度為核内體内之離子化鈣濃度。 [55] 如[49]至[51]或[53]項中任一項之抗原結合分 18 201249871 子之篩選方法，其中，高鈣濃度為血漿中之離子化鈣濃度。 [56] 如[49]至[55]項中任一項之抗原結合分子之篩選方法’其中，前述抗原結合分子所結合之抗原為選自於由 IL-6R、IL-6、IgA、人類 Glypican3、及 IgE 構成的群組的抗原。 [57] 如[49]至[56]項中任一項之抗原結合分子之篩選方法，其中’抗原結合分子為抗體。 [58 ] —種促進利用抗原結合分子使抗原攝入細胞内之方法’其係藉由投予如[1]至[24]項中任一項之抗原結合分子或依照如[25 ]至[36 ]中任一項之抗原結合分子之製造方法所製造之抗原結合分子。 [5 9 ] —種促進血漿中之抗原濃度減少之方法，其係藉由投予如[1 ]至[24 ]項中任一項之抗原結合分子或依照如 [25]至[36]中任一項之抗原結合分子之製造方法所製造之抗原結合分子。 [6 0 ] —種增加1分子之抗原結合分子對於抗原之結合次數之方法’其係藉由投予如[1 ]至[24 ]項中任一項之抗原結合分子或依照如[2 5 ]至[3 6 ]中任一項之抗原結合分子之製造方法所製造之抗原結合分子。 [61 ] —種改善抗原結合分子之血漿中滯留性之方法，其係藉由投予如[1 ]至[24 ]項中任一項之抗原結合分子或依照如[25]至[36]中任一項之抗原結合分子之製造方法所製造之抗原結合分子。 [62 ] —種促進利用抗原結合分子使抗原攝入細胞内 19 201249871 之方法’其係藉由投予如下的抗原結合分子域與人類恤結合域’且於2種不同的約濃度條：二二原結合活性不同’抗原結合分子之低妈濃度條件下… 結合活性低於高鈣濃度條件下之抗原結合活性。几'、 [63] 一種促進血衆中之抗原濃度減少之方法，由投予如下的抗原結合分子包社八士抗原結合域與人類FcRn 且於2種不同的鈣濃度條件下的抗原結合活性不 :’抗原結合分子之低鈣濃度條件下之抗原結合活性低於向詞遭度條件下之抗原結合活性。 [64] —種增加丨分子之抗原結合分子對於抗原之結合次數之方法，其係藉由使用如下的抗原結合分子.包含抗原結：域與人類FcRn結合域，且於2種不同的約濃度條件下的抗原結合活性不同’抗原結合分子之低鈣濃度條件下之抗原結合活性低於高鈣濃度條件下之抗原結合活性。 [65] 種改善抗原結合分子之血漿中滯留性之方法，其係藉由使用如下的抗原結合分子：包含抗原結合域與 ^類FcRn結合域，且於2種不同的弼濃度條件下的抗原結合活性不同，抗原結合分子之低鈣濃度條件下之抗原結合活性低於高鈣濃度條件下之抗原結合活性。 [66] 如[62]至[65]中任一項之方法，其中前述低鈣濃度為離子化鈣濃度〇. 1 # M~30//Μ。之方法，其中，高鈣濃度 [67]如[62]至[66]中任一項為離子化鈣濃度100# Μ〜10 mM。 [68] 如[62 ]至[67 ]中任一項之方法，其中，低鈣濃度 20 201249871 為核内體内之離子化鈣濃度。 [69] 如[62]至[68]中任一項將士 ★私7 方法’其中’高鈣漠度為血漿中之離子化鈣濃度。 [70] 如[62]至[69]中任一項之 ^ ^ v '爻方法，其中，包含於前述杬原、、Ό 0为子之FcRn結合域為Fc區域。 [71] 如[62]至[69]中任一項之 ^ Λ 孓方法，其中，前述抗原結合分子於酸性pH條件下之技；5 #人仵下之抗原結合活性低於中性pH條件下之抗原結合活性。 [7 2 ]如[71 ]之方法，j：中，前+ 引迷抗原結合分子之至少 1個胺基酸經組胺酸取代、哎至φ古 4王y有1個組胺酸插入。 [73] 如[62]至[72]中任一項之太、土唄之方法，其中，前述抗原結合分子所結合之抗原係選自於由a_6R、il_6、丨以、人類Glypican3、及IgE構成的群組。 [74] 如[62]至[73]中任一項之方法，其中，前述抗原結合分子為抗體。又，本發明係關於本發明之方法使用之套組，其包含本發明之抗原結合分子或依照本發明之製原結合分子…本發明係關於一種利用抗原抗原攝入細胞内之促進劑、血漿中之抗原濃度之減少促進劑、1分子之抗原結合分子對於抗原之結合次數增加劑、或抗原結合分子之血漿中滯留性改善劑，其包含本發明之抗原結合分子或依照本發明之製造方法製造之抗原結合分子當做有效成分。又，本發明係關於一種本發明之抗原結合分子或依照本發明之製造方法製造之抗原結合分子之用 21 201249871 途，係用於製造利用抗原結合分子之抗原攝入細胞内促進劑、血漿中之抗原濃度之減少促進劑、1分子之抗原結合分子對於抗原之結合次數增加劑、或抗原結合分子之血漿中滯留性改善劑。又’本發明係關於用在本發明之方法之本發明之抗原結合分子或依照本發明之製造方法製造之抗原結合分子。【發明之效果】依照本發明’可提供促進利用抗原結合分子使抗原攝入細胞内之方法、增加1分子之抗原結合分子對於抗原之結合次數之方法、利用抗原結合分子之投予而促進血毅中之抗原濃度之減少之方法、改善抗原結合分子之血聚中滞留性之方法。藉由促進以抗原結合分子使抗原攝入細胞内’能促進利用抗原結合分子之投予而減少抗原之血毁中之抗原濃度，同時可改善抗原結合分子之血漿中滯留性，可增加1分子之抗原結合分子對於抗原之結合次數，能於體内（in vivo)比起通常之抗原結合分子發揮更為優異的效果》【實施方式】【實施發明之形態】本發明提供促進利用抗原結合分子使抗原攝入細胞内之方法、增加1分子之抗原結合分子對於抗原之結合次數之方法、促進利用抗原結合分子之投予而減少血默中之抗原濃度之方法、及改善抗原結合分子之血漿中滯留性之方 22 201249871 法。具體而言，提供藉由使用抗原結合分子之低两濃度條件下之抗原結合活性（本發明有時記載為「結合能力」）低於高鈣濃度條件下之抗原結合活性的抗原結合分子，而促進抗原結合分子所為之使抗原攝入細胞内之方法、增加1 分子之抗原結合分子對於抗原之結合次數之方法、促進抗原結合分子之投予所致血漿中之抗原濃度之減少之方法、及改善抗原結合分子之血漿中滞留性之方法。胺基酸本說明書中，例如 Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、

Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、ΡΓ0/Ρ、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、 Thr/T 、 Gly/G 、 Trp/W 、 His/H 、 Tyr/Y 、 Ile/I 、 Val/V 所表示，胺基酸以單字母碼或3字母碼或其兩者表示記載。抗原本說明書中，「抗原」只要含有抗原結合域所結合之抗原決疋基即可’其構造不限於特定構造。就其他含意而 °抗原也可為無機物也可為有機物，對於投予本發明之活體可為外源性或内在性者。依照本發明之方法，藥物動態經改善之抗原結合分子含有的抗原結合域所結合之抗原’較佳為例如:受體蛋白質(膜結合型受體、可溶型受體) 或細胞表面標記等膜抗原、細胞激素等可溶型抗原、含有僅存在於外源性生物之抗原決定基的抗原等。抗原例如下列分子，17-Ia、4-1 RR λ IBB 4Dc、6-_*-PGFla、8"^-PGF2a、 8 側氧基 _dG、Al Βέ a s* . _ 0 w脲甘文體、A33、ACE、ACE_2、活化素 (act i viη)、活仆本 Λ _ „ 、匕素A '活化素ΑΒ、活化素Β、活化素c、 23 201249871 活化素RIA、活化素RIA ALK-2、活化素RIB ALK-4、活化素 RI ΙΑ、活化素 RI IB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、 ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、 Addressin(Addressins) 、Adiponectin 、ADP-r i bosy 1 cyclase-1、aFGF、AGE、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、 Allergen、a 1-antichymotrypsin、a 1-antitrypsin、 a-synuclein、拮抗劑、aminin (aminin)、 amy 1 i n、類澱粉/3、類澱粉免疫球蛋白重鍵可變區、類澱粉免疫球蛋白輕鍵可變區、雄激素（androgen)、ANG、血· 管收縮素原（angiotensinogen)、血管生成素 fAngiopoiet in)配體-2、抗 Id、ant i thrombin 111、碳疽、 APAF-1、APE ' APJ、APO A1、APO 血清類澱粉 A、APO-SAA、 APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin (Artemin)、ASPARTIC、心房性納利尿因子、心房性鈉利尿胜肽、心房性納利尿胜肽A、心房性鈉利尿胜肽B、心房性鈉利尿胜肽C、av/b3 integrin、Axl、B7-1、B7-2、B7-H、BACE、BACE-1、炭疽桿菌（Baci 1 lus anthraci s)防禦抗原、Bad、BAFF、BAFF-R、 Bag-卜 BAK、Bax、BCA-卜 BCAM ' Be 卜 BCMA、BDNF、b-ECGF、 yS -2-微球蛋白、yS内醯胺分解酶、bFGF、BID、Bik、BIM、 BLC、BL-CAM、BLK、B 淋巴球刺激因子（BlyS)、BMP、BMP-2 (BMP-2a) 、 BMP-3 (Osteogenin (Osteogenin)) 、 BMP-4 (BMP-2b) 、 BMP-5 、 BMP-6 (Vgr-1) 、 BMP-7 (OP-1) 、 BMP-8 (BMP-8a) 、 BMPR 、 BMPR-IA (ALK-3) 、 BMPR-IB (ALK-6)、 BMPR-II (BRK-3)、BMP、BOK、Bombesin、骨來源神經營養 24 201249871 因子（Bone-derived neurotrophic factor)、牛成長荷爾蒙、BPDE、BPDE_DNA、BRK-2、BTC、B淋巴球細胞黏著分子、CIO、Cl 抑制因子、Clq、C3、C3a、C4、C5、C5a(補體 5a)、CA125、CAD-8、Cadherin-3、calcitonin、cAMP、碳酸脱水酵素-IX、癌胎兒抗原（CEA)、癌關連抗原 (carcinoma-associated anti gen) ' cardiotrophin-1、 CathepsinA、CathepsinB、CathepsinC/DPPI、CathepsinD、 CathepsinE ' Catheps i nH、CathepsinL、Catheps i nO、 CathepsinS 、 CathepsinV 、 CathepsinX/Z/P 、 CBL 、 CCI 、 CCK2、CCL、CCL1/I-309、CCLll/eotaxin、CCL12/MCP-5、 CCL13/MCP-4、CCL14/HCC-1 ' CCL15/HCC-2、CCL16/HCC-4、 CCL17/TARC 、 CCL18/PARC 、 CCL19/ELC 、 CCL2/MCP-1 、 CCL20/MIP-3-a 、 CCL21/SLC、 CCL22/MDC、 CCL23/MPIF-1 、 CCL24/eotaxin-2 、 CCL25/TECK 、 CCL26/eotaxin-3 、 CCL27/CTACK 、 CCL28/MEC 、 CCL3/MlP-l-a 、 CCL3Ll/LD-78-yS ' CCL4/MIP-1-y5 、（:CL5/RANTES 、 CCL6/C10、CCL7/MCP-3、CCL8/MCP-2、CCL9/10/MTP-1- r、 CCR、CCIU、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、 CCR8 、 CCR9 、 CD1 、 CD10 、 CD105 、 CDlla 、 CDllb 、 CDllc 、 CD123、CD13' CD137' CD138、CD14、CD140a、CD146、CD147、 CD148 、 CD15 、 CD152 、 CD16 、 CD164 、 CD18 、 CD19 、 CD2 、 CD20、CD2卜 CD22、CD23、CD25、CD26、CD27L、CD28、CD29、 CD3、CD30、CD30L、CD32、CD33 (p67 蛋白質）、CD34、CD37、 CD38' CD3E、CD4、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、 25 201249871 CD49b、CD5、CD5卜 CD52、CD54、CD55、CD56、CD6、CD61、 CD64、CD66e、CD7、CD70、CD74、CD8、CD80 (B7-1)、CD89、 CD95、CD105、CD158a、CEA、CEACAM5、CFTR、cGMP、CGRP 受體、CINC 、 CKb8-l 、 Claudinl8 、 CLC 、肉毒桿菌 (Clostridium botu 1 inum)毒素、Clostridium difficile (Clostridium difficile)毒素、Clostridium perfringens (Clostridium perfringens)毒素、c-Met、CMV、CMV UL、 CNTF、CNTN-1、補體因子3 (C3)、補體因子D、皮質類固醇結合球蛋白、群落刺激因子-1受體、COX、C-Ret、CRG-2、 CRTH2、CT-卜 CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CLl/fractalkine、 CX3CR1 、 CXCL 、 CXCLl/Gro-α 、 CXCL10 、 CXCL11/I-TAC 、 CXCL12/SDF-卜 α/yS、CXCL13/BCA-1、CXCL14/BRAK、 CXCL15/ Lungkine (Lungkine) 、 CXCL16 、 CXCL16 、 CXCL2/Gro-/3 CXCL3/Gro-r 、CXCL3、CXCL4/PF4、 CXCL5/ENA-78、CXCL6/GCP-2、CXCL7/NAP-2、CXCL8/IL-8、 CXCL9/Mig、CXCL10/IP-10、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、 CXCR4、CXCR5、CXCR6、cystatinC、cytokeratin 腫瘤關連抗原、DAN ' DCC、DcR3、DC-SIGN、崩壞促進因子、Delta 狀蛋白質（Delta-like protein)配體 4、des(l-3)-IGF-l (腦 IGF-1)、Dhh、DHICA 氧化酶、Dickkopf-1、Digoxin、二肽基肽解酶 IV、DK1、DNAM-卜 Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、 Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR (ErbB-1)、含有 EGF 狀域之蛋白質 7(EGF 1 ike domai n containing protein 7) 、 elastase 、 elastin 、 EMA 、 26 201249871 EMMPRIN 、 ΕΝΑ 、 ENA-78 、 Endosialin (Endosialin)、 endothelin 受體、内毒素、enkephal inase、eNOS、Eot、 eotaxin、eotaxin-2、eotaxini (eotaxini)、EpCAM、Ephrin B2/EphB4、Epha2酪胺酸激酶受體、上皮增殖因子受體 (EGFR)、ErbB2受體、ErbB3酪胺酸激酶受體、ERCC、 erythropoietin (ΕΡ0) 、 erythropoietin 受體、 E-selectin、ET-1、Exodus (Exodus)-2、RSV 之 F 蛋白質、 F10、F11、F12、F13、F5、F9、第 la 因子、第 IX 因子、第Xa因子、第VII因子、第VIII因子、第VIIIc因子、 Fas' Fca R' Fc epsilon RI ' Fc^ lib' ¥c γ RI ' Yc γ Rlla ' Fey Rllla、Fct Rlllb、FcRn、FEN-1、ferritin、FGF、 FGF-19、FGF-2、FGF-2 受體、FGF-3、FGF-8、酸性 FGF(FGF-acidic)、鹼性 FGF(FGF-basic)、FGFR、FGFR-3、 f i br i n、纖維母細胞活化蛋白質（FAP)、纖維母細胞增殖因子、纖維母細胞增殖因子-10、fibronectin' FL、FLIP、 Flt-3、FLT3配體、葉酸受體、卵泡刺激荷爾蒙（FSH)、 fractalkine(CX3C)、游離型重鏈、游離型輕鏈、fzm、 FZD10、FZD2、FZD3' FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、 G250、Gas 6、GCP-2、GCSF、G-CSF、G-CSF 受體、GD2、 GD3、GDF、GDF-1、GDF-15 (MIC-1)、GDF-3 (Vgr-2)、GDF-5 (BMP-14/CMP-1)、GDF-6 (BMP-13/CDMP-2)、GDF-7 (BMP-12/CDMP-3) 、 GDF-8 (myostatin) 、 GDF-9 、 GDNF 、 gelsolin、GFAP、GF-CSF、GFR-α 1、GFR-α 2、GFR-α 3、 GF-/3 1、gH外被糖蛋白質、GITR、升糖素、升糖素受體、 27 201249871 升糖素狀胜肽1受體、Glut 4、谷胺酸羧基肽解酶π、糖蛋白質荷爾蒙受體、糖蛋白質lib/11 la (GP lib/111a)、

Glypican-3、GM-CSF、GM-CSF 受體、gpl30、gpl40、gp72、顆粒球-CSF (G-CSF)、GRO/MGSA、成長荷爾蒙釋放々因子、 GR0- /3、GR0- r、py lori 菌（H. py lori)、半抗原（NP-cap 或 NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCC 1、HCMV gB 外被糖蛋白質、HCMV UL、造血增瘦因子（Hemopoietic growth factor) (HGF)、Hep B gpl20、heparanase、肝素輔因子 11、肝細胞增殖：因子（hepatic growth factor)、万 anthracis防禦抗原、C型肝炎病毒E2糖蛋白質、E型肝炎、Herl、Her2/neu (ErbB-2)、Her3 (ErbB-3)、 Her4 (ErbB-4)、單純皰疹病毒（HSV) gB糖蛋白質、HGF、 HGFA、高分子量黑色素瘤關連抗原（High molecular weight melanoma-associated antigen) (HMW-MAA) 、 GP120 等 HIV 外被蛋白質、HIV MIB gp 120 V3 環圈、HLA、HLA-DR、HM1. 24、 HMFG PEM 、 HMGB-1 、 HRG 、 Hrk 、 HSP47 、 Hsp90 、 HSV gD 糖蛋白質、人類心肌肌凝蛋白、人類細胞巨病毒（HCMV)、人類成長荷爾蒙（hGH)、人類血清白蛋白、人類組織型纖維蛋白溶酶原活化因子（t-PA)、Huntingtin、HVEM、IAP、ICAM、 ICAM-1 ^ ICAM-3 > ICE ' ICOS ' IFN-α > IFN-^ > IFN- r ' IgA、IgA 受體、igE、IGF、IGF 結合蛋白質、IGF-卜 IGF-1 R、IGF~2、IGFBP、IGFR、IL、IL-卜 IL-10、IL-10 受體、 IL—11、IL-11 受體、IL-12、IL-12 受體、IL-13、IL-13 受體、IL-15、IL-15 受體、IL-16、IL-16 受體、IL-17、 28 201249871 IL-17 受體、IL-18 (IGIF)、IL-18 受體、IL-Ια、IL-l/5、 IL-1 受體、IL-2、IL-2 受體、IL-20、IL-20 受體、il-2卜 IL-21 受體、IL-23、IL-23 受體、IL-2 受體、il-3、il-3 受體、IL-3卜IL-31受體、IL-3受體、IL-4、IL-4受體、 IL-5、IL-5 受體、IL-6、IL-6 受體、IL-7、IL-7 受體、 IL-8、IL-8受體、IL-9、IL-9受體、免疫球蛋白免疫複合體、免疫球蛋白、INF-α、INF-q:受體、INF-/5、INF-/5 受體、INF -7、INF -7受體、I型IFN、I型IFN受體、 influenza、inhibin、inhibin α、inhibin ^、iNOS、胰島素、胰島素A鏈、膜島素B鏈、騰島素狀增殖因子i、胰島素狀增殖因子2、胰島素狀增殖因子結合蛋白質、 integrin、integrin a 2、integrin a 3、integrin a 4、 integrin a 4/β 1 、 integrin a -V/β -3 、 integrin a -V/ β -6 、 integr in a 4//3 7 、 integrin a 5 / 1、integrin a 5 / 3、integrin a 5 / /5 6、 integrin a - δ ( a V) 、 integrin a - Θ 、 integrin β 1 、 integrinyS2、integrin/3 3(GPIIb-IIIa)、IP-10、I一TAC、 JE 、 kallikrein 、 kallikreinll 、 kallikreinl2 、 kal1ikreinl4 、 kal1ikreinl5 、 kal1ikrein2 、 kal1ikrein5 、 kal1ikrein6 、 kal1ikreinLl 、 kal1ikreinL2 、 ka11i kre i nL3 、 kal1ikreinL4 、 kallistatin、KC、KDR、角質化細胞增殖因子（KGF)、角質化細胞增瘦因子-2 (KGF-2)、KGF、殺手免疫球蛋白狀受體、ki t 配體（KL)、Kit 酿胺酸激酶、laminin5、LAMP、 29 201249871 LAPP (amilin '胰島類澱粉多胜肽）、LAP (TGF-l)、潛伏期關連胜肽、潛在型TGF-1、潛在型TGF-1 bpl、LBP、LDGF、 LDL、LDL受體、LECT2、lefty、leptin、黃體形成荷爾蒙 (leutinizing hormone)(LH)、Lewis-Y 抗原、Lewis-Y 關連抗原、LFA-1、LFA-3、LFA-3 受體、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-selectin、LT-a、LT-b、LTB4、 LTBP-1、肺界面活性劑、黃體形成荷爾蒙、i ymph〇tact in、 lympotoxin/3 受體、Lysosphingolipid 脂質受體、Mac-1、巨噬體-CSF (M-CSF)、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、maspin、 MCAM、MCK-2、MCP、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-I (MCAF)、M-CSF、MDC、MDC (67 a. a· )、MDC (69 a.a.)、 megs in (megs in)、Mer、MET酪胺酸激酶受體家族 '金屬蛋白酶、膜糖蛋白質0X2、mesothelin、MGDF受體、MGMT、 MHC (HLA-DR)、微生物蛋白質（microbial protein)、MIF、 MIG' MIP' MIP-1 a ' MIP-1 β ' MIP-3 a > MIP-3 β ' MIP-4、MK、ΜΜΑΠ、MMP、匪P-卜 MMP-10、MMP-U、MMP-12、 MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、 MMP-8、MMP-9、單核球吸引蛋白質（monocyte attractant protein)、單核球群落抑制因子（monocyte colony inhibitory factor)、小鼠促性腺激素關連

(gonadotropin-associated)胜肽、MPIF、Mpo、MSK、MSP、 MUC-16、MUC18、mutin(Mud)、Muller 管抑制因子、Mug、 MuSK、髓磷脂關連糖蛋白質、骨髓前驅細胞抑制因子-1 (MPIF-I)、NAIP、Nanobody (Nanobody)、NAP、NAP-2、NCA 30 201249871 90、NCAD、N-Cadherin、NCAM、nepr i lysin、神經細胞黏著分子、neroserpin (neroserpin)、神經成長因子（NGF)、 neurotrophiπ_3、neurotrophin_4、neurotrophin_6、 neuropi 1 ini、neurturin、NGF- yS 、NGFR、NKG20、N_ 甲硫胺酿基人類成長荷爾蒙、nNOS、NO、Nogo-A、Nogo受體、 C型肝炎病毒來源之非構造蛋白質3型（NS3)、NOS、Npn、 NRG-3 ' NT ' NT-3 ' NT-4 ' NTN ' OB ' OGGI ' oncostatinM ' OP-2、0PG、0PN、0SM、0SM 受體、骨誘.導因子（osteoinductive factor)、Osteopontin、OX40L、OX40R、氧化型 LDL、pl50、 p95、PADPr、副甲狀腺荷爾蒙、PARC、PARP、PBR、PBSF、 PCAD' P-Cadherin、PCNA、PCSK9、PDGF、PDGF 受體、PDGF-AA、 PDGF-AB 、 PDGF-BB 、 PDGF-D 、 PDK-1 、 PECAM 、 PEDF 、 PEM 、 PF-4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIGF、PIN、PLA2、胎盤增殖因子、胎盤鹼性磷解酶（PLAP)、胎盤lactogen、纖維蛋白溶酶原活化因子抑制因子-1、血小板增殖因子 (platelet-growth factor)、pigR、PLP、不同大小的聚甘醇鏈（poly glycol chain)(例如：PEG-20、PEG-30、PEG40)、 PP14 、 prekallikrein 、 prion 蛋白質、procalcitonin 、程式化細胞死蛋白質1、腺島素前體、prQlactin、蛋白質前體轉換酵素PC9、prorelaxin (prorelaxin)、前列腺專一性膜抗原（PSMA)、proteinA、proteinC、proteinD、 proteinS、proteinZ、PS、PSA、PSCA、PsmAr、PTEN、PTHrp、 Ptk、PTN、P-selectin 糖蛋白質配體-；l、R51、RAGE、RANK、 RANKL、RANTES、relaxin、relaxinA 鏈、relaxinB 鏈、腎 31 201249871

素（renin)、呼吸器多核體病毒（RSV) F、Ret、reticulon (reticulon)4、風濕因子、RLI P76、RPA2、RPK-1、RSK、 RSV Fgp ' S100 ' RON-8 ' SCF/KL ' SCGF ' Sclerostin (Sclerostin)、SDF-1、SDF1 a 、SDF1 yS 、SERINE (SERINE)、血清類澱粉P、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、志賀類毒素 II、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、 SMOH、SOD、SPARC、神經胺醇磷酸受體1、葡萄球菌之脂胞壁酸（lipoteichoic acid)、Stat、STEAP、STEAP-II、幹細胞因子（SCF)、鏈激酶、過氧化超氧化物歧化酶、 syndecan-1、TACE、TACI、TAG-72 (腫瘤關連糖蛋白質 -72)、TARC、TB、TCA-3、T 細胞受體 a / 卢、TdT、TECK、 TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、Tenascm、TERT、睪丸 PLAP 狀鹼性磷解酶、TfR、TGF、TGF-α、TGF-/5、TGF-沒泛專一性（TGF-/5 Pan Specific)、TGF-/? RII、TGF-/3 Rllb、 TGF-/3 RIII、TGF-0 R1 (ALK-5)、TGF-/3 1、TGF-万 2、 TGF-yS 3、TGF-yS 4、TGF_y5 5、TGF_I、凝血（thrombin)、血小板生成素（Thrombopoiet in) (TPO)、胸腺間質性淋巴蛋白質（Thymic stromal 1 ymphoprotei n)受體、胸腺 Ck-1、甲狀腺刺激荷爾蒙（TSH)、曱狀腺素、甲狀腺素結合球蛋白、T i e、TIMP、TIQ、組織因子、組織因子蛋白酶抑制因子、組織因子蛋白質、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF受體 I、TNF 受體 II、TNF_a、TNF-yS、TNF_yS 2、TNFc、TNF-RI、 TNF-RII ' TNFRSF10A (TRAIL R1 Ap〇-2/DR4) > TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5/KILLER/TRICK-2A/TRICK-B) 、 TNFRSF10C 32 201249871

(TRAIL R3 DcRl/LIT/TRID) 、 TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2/TRUNDD) 、 TNFRSF11A (RANK ODF R/TRANCE R)、 TNFRSF11B (OPG 0CIF/TR1) 、 TNFRSF12 (TWEAK R FN14)、 TNFRSF12A 、 TNFRSF13B (TACI) 、 TNFRSF13C (BAFF R)、 TNFRSF14 (HVEM ATAR/HveA/LIGHT R/TR2)、TNFRSF16 (NGFR P75NTR) 、 TNFRSF17 (BCMA) 、 TNFRSF18 (GITR AITR)、 TNFRSF19 (TROY TAJ/TRADE)、TNFRSF19L (RELT)、TNFRSF1A (TNF R1 CD120a/p55-60) 、 TNFRSF1B (TNF RII CD120b/p75-80) 、 TNFRSF21 (DR6) 、 TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2) 、 TNFRSF25 (DR3

Apo-3/LARD/TR-3/TRAMP/WSL-l) 、 TNFRSF26 (TNFRH3)、 TNFRSF3 (LTbR TNF RIII/TNFC R) 、 TNFRSF4 (0X40 ACT35/TXGP1 R) 、 TNFRSF5 (CD40 p50) 、 TNFRSF6 (Fas Apo-1/APT1/CD95) 、 TNFRSF6B (DcR3 M68/TR6) 、 TNFRSF7 (CD27) 、 TNFRSF8 (CD30) 、 TNFRSF9 (4-1 BB CD137/ILA)、 TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1) ' TNFSF10 (TRAIL Apo-2 配體/TL2)、TNFSF11 (TRANCE/RANK 配體 ODF/OPG 配體）、 TNFSF12 (TWEAK Apo-3 配體/DR3 配體）、TNFSF13 (APRIL TALL2) 、 TNFSF13B (BAFF BLYS/TALL1/THANK/TNFSF20)、 TNFSF14 (LIGHT HVEM 配體/LTg)、TNFSF15 (TL1A/VEGI)、 TNFSF18 (GITR 配體 AITR 配體/TL6)、TNFSF1A (TNF-a Conectin (Conectin)/DIF/TNFSF2) ' TNFSF1B (TNF-b LTa/TNFSFl) 、 TNFSF3 (LTb TNFC/p33) 、 TNFSF4 (0X40 配體 gp34/TXGPl) 、 TNFSF5 (CD40 配體 33 201249871 CD154/gp39/HIGMl/IMD3/TRAP)、TNFSF6 (Fas 配體 Apo-l 配體/ΑΡΤΙ 配體）、TNFSF7 (CD27 配體 CD70)、TNFSF8 (CD30 配體00153)、丁評8卩9(4-166配體00137配體）、1'肝-〇:、 TNF-/3、TNIL-I、毒性代謝產物（toxic metabolite)、 TP-l、t-PA、Τρο、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、 TRANCE、transferrin 受體、TGF-a 及 TGF-Θ 等轉形增殖因子（TGF)、穿膜型糖蛋白質NMB、transcyletin、TRF、 Trk、TR0P-2、凝血細胞（thromboblast)糖蛋白質、TSG、 TSLP、腫瘤壞死因子（TNF)、腫瘤關連抗原CA 125、Lewis Y關連糖全示寸腫瘤關連抗原、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、 uPAR-1、尿激酶、VAP-1、血管内皮增殖因子（VEGF)、vaspin (vaspin) 、 VCAM 、 VCAM-1 、 VECAD 、 VE-Cadherin 、 VE-Cadherin-2、VEFGR-1 (flt-1)、VEFGR-2、VEGF 受體 (VEGFR)、VEGFR-3 (f lt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、維生素 B12 受體、hydronectin 受體、VLA、VLA-1、VLA-4、 VNRintegrin、Von Willebrand 因子（vWF)、WIF-卜 WNT1、 WNT10A、WNT10B、WNTU、WNT16、WNT2、WNT2B/13、WNT3、 WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、 WNT8B 、WNT9A 、WNT9B、XCL1 、XCL2/SCM-卜/5 、 XCLl/lymponectin' XCR1 ' XEDAR' XIAP' XPD' HMGB1 ' IgA ' A冷、CD81, CD97，CD98，DDR1，DKK1，EREG、Hsp90, IL-17/IL-17R 、 IL-20/IL-20R 、氧化 LDL， PCSK9, preka11ikrein , RON, TMEM16F ' S0D1, Chromogranin A, Chromogranin B、tau，VAP1、高分子 kininogen、IL-31、 34 201249871 IL-31R、Navl. l'Navl. 2、Navl. 3、Navl_ 4、Navl. 5、Navl. 6、 Navi. 7 ' Navi.8 'Navi. 9 'EPCR' Cl, Clq, Clr, Cls, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, factor B, factor D, factor H, properdin 、 sclerost in 、 fibrinogen, fibrin, prothrombin, thrombin,組織因子，factor V，factor Va, factor VII, factor Vila, factor VIII, factor Villa, factor IX, factor IXa, factor X, factor Xa, factor XI, factor XIa, factor XII, factor Xlla, factor XIII, factor Xllla, TFPI, antithrombin III, EPCR, thrombomodulin ' TAPI, tPA, plasminogen, plasmin, PAI-1, PAI-2 、 GPC3 、 Syndecan-1 、 Syndecan-2 、 Syndecan-3、Syndecan-4、LPA、SIP 及荷爾蒙及成長因子用之受體當中’在活體體液中不會留在細胞而以可溶型式存在之分子。意指抗原中存在之抗原決定部位之抗原決定基 (ep i tope )’係本說明書揭示之抗原結合分子中之抗原結合域所結合之抗原上之部位。因此，例如：抗原決定基可由其構造定義。又，該抗原決定基也可由認識該抗原決定基之抗原結合分子中之對於抗原之結合活性定義。抗原為胜肽或多胜肽時，也可利用構成抗原決定基之胺基酸殘基指定抗原決定基。又，抗原決定基為糖鏈時，也可利用特定糖鏈構造來指定抗原決定基。直線狀抗原決定基，係包含認識胺基酸一次序列的抗 35 201249871 原決定基的抗原決定基。直線狀抗原決定基典型在固有序列中至少含有3個，且最普通為至少5個，例如約8至約 10個，6至2 0個胺基酸。立體構造抗原決定基，與直線狀抗原決定基相對照，係指含有抗原決定基之胺基酸之一次序列並非所認識之抗原決定基之早一規定成分的抗原決定基（例如：胺基酸之一次序列不一定由規定抗原決定基之抗體所認識之抗原決定基）。立體構造抗原決定基’可能包含對於直線狀抗原決定基為更多之數之胺基酸。關於立體構造抗原決定基之認識，抗體認識胜肽或蛋白質之三維構造。例如：蛋白質分子折疊形成三維構造時’形成立體構造抗原決定基之某個胺基酸及/或多胜肽主鏈，可以並排，抗體可認識抗原決定基。決定抗原決定基之立體構造之方法，包含例如X射線、、-〇日日子、一維核磁共振分光學及部位專一性旋轉標諸及電磁場磁性共振分光學，但不限於該等。例如參考：Epi t〇pe Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996)、第 66 卷、Morris(編）。結合活性以下例示確認含有對抗IL-6R之抗原結合域的待驗抗原結合分子其對於抗原決定基之結合的確認方法，但是確邊含有對抗IL-6R以外之抗原的抗原結合域之待驗抗原結合分子其對於抗原決定基之結合的確認方法，也可依照下列例示適當實施。例如：含有對抗IL-6R之抗原結合域的待驗抗原結合 36 201249871 分子會認識IL-6R分子中存在之線狀抗原決定基之情事，例如可以如下方式確認。為了上述目的，合成由構成il_6r 之細胞外域之胺基酸序列構成的線狀胜肽。該胜肽可化學 5成或，利用IL-6R之cDNA中之編碼為相當於細胞外域之胺基酸序列之區域，以基因工程方法可獲得。其次，評價由構成細胞外域之胺基酸序列所構成的線狀胜肽與含有對於IL - 6 R之抗原結合域的待驗抗原結合分子間的結合活性。例如，利用以經固定化之線狀胜肽為抗原之EUSA，可評價該抗原結合分子對於該胜肽之結合活性。或，依據 IL-6R表現細胞中，該抗原結合分子之結合時由於線狀胜肽所致抑制的水平，可以明確獲得對於線狀胜肽之結合活 I1生。利用該荨試驗’可以明確獲得該抗原結合分子對於線狀胜肽之結合活性。又’含有對抗IL-6R之抗原結合域的待驗抗原結合分子會認識立體構造抗原決定基之情事，可由以下方式確認。為了上述目的，製備表現IL-6R之細胞。含有對抗IL_6R 之抗原結合域的待驗抗原結合分子接觸IL_6R表現細胞時，會強力結合於該細胞，另一方面，對於固定化有該抗原結合分子之由構成IL-6R之細胞外域的胺基酸序列而成的線狀胜肽’實質上不結合時等。在此，實質上不結合，係指對於人類IL-6R表現細胞之結合活性之80%以下、通常50%以下’較佳為30%以下，尤佳為15%以下之結合活性。包含對抗IL-6R之抗原結合域之待驗抗原結合分子其對於IL-6R表現細胞之結合活性之測定方法，例 37 201249871 如：Antibodies A Laboratory Manual 記載之方法（Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420)。亦即，可利用以il-6R表現細胞為抗原之 ELISA 或 FACS(fluorescence activated cell sorting) 之原理評價。 ELISA格式中，包含對抗IL-6R之抗原結合域之待驗抗原結合分子其對於IL-6R表現細胞之結合活性，可利用比較酵素反應所生成之訊號水平而定量評價。亦即，在固定化有IL-6R表現細胞之ELISA板添加待驗多胜肽組合體，利用s忍識待驗抗原結合分子之酵素標記檢測結合於抗體細胞之待驗抗原結合分子。或FACS中，製作待驗抗原結合分子之稀釋系列，決定對於IL-6R表現細胞之抗體結合力價（titer)，藉此可比較待驗抗原結合分子對於il_6r表現細胞之結合活性。待驗抗原結合分子對於在懸浮於緩衝液等之細胞表面上表現之抗原之結合，可利用流式細胞計數器檢測。流式細胞計數器已知例如如下裝置。 FACSCanto™ Π FACSAria™ FACSArray™

FACSVantage™ SE FACSCaliburTM (均為 Bd Biosciences 公 EPICS ALTRA HyPerSort Cytomics FC 500 38 201249871

EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC

Cell Lab Quanta / Cell Lab Quanta SC(均為 Beckman

Coulter公司之商品名）例如：包含對抗IL-6R之抗原結合域之待驗抗原結合分子其對於抗原之結合活性之理想測定方法，例如以下方法。首先，以認識與表現IL-6R之細胞反應之待驗抗原結合分子的經FITC標定的二次抗體染色。將待驗抗原結合分子以適當理想的緩衝液稀釋，可將該抗原結合分子製成所望濃度。例如可使用1Mg/ml至1〇 ng/ml之間的任一濃度。其次，以FACSCalibur⑽公司）測；t螢光強度及細胞數。抗體對於該細胞之結合量，反映於使用CM綱^ tware(BD公司）解析所得之螢光強度，亦即幾何平均值 (幾何平均）°亦即’藉由獲得該幾何平均之健，可測定待 =抗原結合分子之結合量所代表之待驗抗原結合分子之往合活性。包含對抗IL-6R之;^ έ士人某抗原結合分驗抗原結合分子與，、有抗原決疋基之情事，可蕻 :::=-競爭一-結:::::：試驗為較佳的交驗㈣檢測。例如彼此競錢⑻ 具體而言，；^ 1 的IL-6R蛋白質、且斷°式驗中，塗覆在微滴定板之井上或非存在借於候選的彼此競爭抗原結合分子存在下 …4白質=後，添加待驗抗原結合分子。井中斤、，〜之待驗抗原結合分子之量，間接相 39 201249871 關於成為錢競爭之候料彼㈣爭抗原结Μ子對於相同抗原決定基之結合之結合能力。亦即，彼此競爭抗原結合分子對於相同抗原決定基之親和性愈Α，則對於塗覆有待驗抗原結合分子之IL，蛋白質之井的結合活性愈低。經由IL-6R蛋白質而結合於井之待驗抗原結合分子之量’可藉由預先標記抗原結合分子而輕易測定。例如，經生物素標記之抗原結合分子’可藉由抗生物素蛋白過氧化酶接合體及適當基質測定。利用過氧化酶等酵素標記之交叉阻斷試驗’尤其稱為彼此競爭EUSA試驗n结合分子可以用能檢測或測定之其他標記物f予以標記。具體而言’放射標記或螢光標記等為公知。比起於不存在候選之彼此競爭抗原 '刀卞殂兮體下實施之對照試驗中獲得之牡人活卜更寸i、° 0活性，彼此競爭抗原結合分子若能阻斷包含對抗IL，之抗原結合域之待驗抗原結合分子之結合至少、20%，較佳為至少2〇_5〇%，更佳為至少 50%，則該待驗抗原結合分子係與彼此競爭抗原結合分子實質上結合於相同抗原衫基’或對於相同抗原決定基之結合為彼此競爭之抗原結合分子。匕s對抗IL 6R之抗原結合域之待驗抗原結合分子所結合之抗原決定基在鑑定構造時’待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子共有抗原決定基之情事，可藉由比較兩者之抗原結合分子對於構成該抗原m之胜肽導入有胺基酸變異而成之胜肽之結合活性而予以評價。

可藉由比較前述ELISA 如此測定結合活性之方法，例如 40 201249871 格式中’待驗抗原結合分子及對照抗原結合分子對於導入有變異的線狀胜肽的結合活性而測定。就EL ISA以外之方法而言，也可藉由將對於結合於管柱之該變異胜肽的結合活性’以使待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子流下該豸柱後/谷出到洛出液中之抗原結合分子進行定量而測定。使變異胜肽例如與GST之融合胜肽吸附於管柱之方法為公知。又’當鑑定的抗原決定基為立體抗原決定基時，待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子共有抗原決定基之情事，可藉由以下方法評價。首先，製備表現IL_6R之細胞以及表現對於抗原決定基導入有變異之〖L — 6R的細胞。對於該等細胞懸浮於PBS等適當緩衝液而成的細胞懸浮液添加待驗IL-6R與對照IL-61^其次，對於經適當緩衝液洗滌的細胞懸浮液，添加能夠認識待驗IL_6R與對照il_6r 的經FITC標記的抗體。利用FACSCal ibur(BD公司）測定標記抗體所染色之細胞之螢光強度及細胞數。將待驗與對照IL-6R之濃度以適當緩衝液適當稀釋以製備為所望濃度後使用。例如可使用10_至1〇 _之間的任一濃度。標記抗體對於該細胞之結合量，反映於使用 QUEST S〇ftware⑽公司）解析所獲得之螢光㈣，亦” 何平均值。亦即藉由獲得該幾何平均*，可以敎以標記抗體之結合量所代表之待驗IL_6R與對照^⑽之結合活性。本方法中，例如「實質上不結合於變異几，表現細 41 201249871 胞」之情事’可藉由以下方乃凌判斷。首先，將已對於表現變異IL-6R之細胞社a夕注& > = ,σ之待驗抗原結合分子與對照抗原結 5分子以標記抗體染色。接著，檢測細胞之螢光強度。螢光檢測使用FACSCaUbur當做流式細胞計數儀時，獲得之螢光強度可以使用CEI I OHpct。r LL QUEST Software解析。從抗原結。刀子存在下及非存在下之幾何平均值，將其比較値（△幾何平均）依下列計算式計算，可以求得抗原結合分子之結合所致之螢光強度之增加比例。 △ 4何平均值=幾何平均值（多胜肽組合體存在下）/幾何平均值（多胜肽組合體非存在下）將由解析獲得之反映待驗抗原結合分子對於變異 IL-6R表現細胞之結合量的幾何平均比較値（變異il_6r分子△幾何平均値），與反映待驗抗原結合分子對於il_6r 表現細胞之結合量的Λ幾何平均值比較値進行比較。於該情形，求取對於變異IL-6R表現細胞及IL_6R表現細胞之 △幾何平均比較値時使用之待驗抗原結合分子之濃度調整為彼此相同或貫質上為相同濃度尤佳。可利用預先確認認識IL-6R中之抗原決定基的抗原結合分子當做對照抗原結合分子。待驗抗原結合分子對於變異IL_6R表現細胞之△幾何平均比較値’若比起待驗抗原結合分子對於〗L_6r表現細胞之△幾何平均比較値之至少80%、較佳為5〇%、更佳為 30%、尤佳為15%還小，則判定為「實質上不結合於變異 IL-6R表現細胞」。求取幾何平均値（Ge〇metric Mean)之 42 201249871

什舁式’記載於 CELL QUEST Software User，s Guide(BD biosciences公司）。若比較比較値而其實質上可視為相同之程度’則可評價待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子之抗原決定基為相同。抗原結合域本說明書中’ 「抗原結合域」只要能結合於目的之抗原則可使用任思構造之域。如此的域，例如：抗體之重鏈及輕鏈之可變區、存在於生體内之細胞膜蛋白質Avimei所含之約35個胺基酸之稱為a域之模組（W02004/04401 1、 WO2005/040229)、包含於細胞膜表現之糖蛋白質 Hbronectin中之蛋白質所結合之域i〇Fn3域之

Adnectin(W02002/032925)、以構成由 ProteinA 之 58 個胺基酸構成的3個螺旋束（bund 1 e)的I gG結合域為支架 (scaffold)的 Affibody(W01 995/001 937)、具含 33 個胺基酸殘基之轉彎（turn)與2個反向並行之螺旋以及迴圈的次單元返覆層疊的構造的ankyr in返覆（ankyr in repeat: AR) 之分子表面所露出之區DARP i ns (Des i gned Ankyr i n Repeat proteins)(W02002/020565)、將嗜中性球明膠酶結合 1ipocalin (neutrophil gelatinase -associated lipocalin(NGAL))等lip0caiin分子中高度保守的8個反向並行的股中央方向扭曲成的活塞桶（barrel)構造的單側予以支撐的4個迴圈區Antical in等（W02003/029462)、就八目縵、泪田鰻等無顎類之獲得免疫系統而言不具免疫球蛋白之構造的可變性淋巴球受體（variable lymphocyte 201249871 receptor(VLR))之富含白胺酸殘基之返覆 (leucine-rich-repeatCLRR))模組返覆疊層而獲得之馬蹄形構造之内部之平行型片構造之中空區（w〇2〇〇8/〇16854) 為佳。本發明之抗原結合域之較佳例，例如含抗體之重鏈及輕鏈之可變區的抗原結合域。如此的抗原結合域，例如「scFvUinglechainFv)」、「單鏈抗體（singlechain antibody)」、「Fv」、「scFV2(singlechainFv2)」、「Fab」或「F(ab’）2」等為較佳。本發明之抗原結合分子中’抗原結合域可以結合於相同的抗原決定基。在此，相同之抗原決定基可存在於由例如：序列編號.1 5記載之胺基酸序列構成的蛋白質中。又，可存在於由序列編號：15記載之胺基酸序列之2〇號至365 號之胺基酸構成的蛋白質中。或，本發明之抗原結合分子中，抗原結合域可以結合於彼此不同的抗原決定基。在此，不同的抗原決定基，可存在於由例如：序列編號：丨5記載之胺基酸序列構成的蛋白質中。又，可存在於由序列編號： 15記載之胺基酸序列< 2G 365 E之胺基酸構成之蛋白質中。鈣結合模體本發明之抗原結合分子中’抗原結合域包含鈣結合模體轉、结合模II ’只I是在低妈漢度條件下的抗原結合活性：於在高鈣濃度條件下之抗原結合活性，則可包含於抗原^合域之任一位置。抗原結合域為抗體之可變區時，鈣結合模體也可包含於可變區之重鏈，也可包含於可變區之 44 201249871 輕鏈。又’鈣結合模體也可包含於重鏈及輕鏈之兩者。非限定之另—態樣中，鈣結合模體也可包含於可變區之框架序列’也可包含於可變區之CDR序列。又，弼結合模體也可包含於框架序列與CDR序列兩者。本發明之非限定之一態樣中，鈣結合模體包含視鈣離子濃度之條件而改變對抗抗原之抗原結合分子之結合活性之胺基酸殘基。該胺基酸殘基，例如理想者有具金屬螯合作用之胺基酸。具金屬螯合作用之胺基酸，例如絲胺酸 (Ser(S))、蘇胺酸（Thr(T))、天冬醯胺酸（Asn(N))、麩醯胺酸（Gln(Q))、天冬胺酸（Asp(D))、麵胺酸（Giu(E))、組胺酸（His(H))及酷胺酸（Tyr(Y))等較佳。具有在低妈濃度條件下之抗原結合活性低於在高#5濃度條件下之抗原結合活性的性質的既有抗原結合域所存在之鈣結合模體，可適當當做本發明之鈣結合模體。如此的既有的抗原結合域之非限定例，例如：在低鈣濃度條件下之抗原結合活性低於在高約濃度條件下之抗原結合活性之抗體之可變區所含之妈結合棋體。如此的抗體之非限定例，例如含序列編號：1 及序列編號：2之IL-6受體抗體及含序列編號：25及序列編號：2 6之IL-6抗體。又’已知具多數個飼離子結合部位且據認為係從分子進化上共通之起源而來的

TroponinC、攜鈣素（Calmodul in)、Parvalbumin、肌凝蛋白輕鏈等，其結合模體也可當做本發明之鈣結合模體使用。本發明之抗原結合域為抗體之可變區時，鈣結合模體也可包含於可變區之重鏈’也可包含於可變區之輕鏈。又， 45 201249871 鈣結合模體也可包含於重鏈及輕鏈之兩者。非限定之另一態樣中，鈣結合模體可包含於可變區之框架序列，也可包含於可變區之CDR序列。又，鈣結合模體，可包含於框架序列與CDR序列兩者。可設計重鏈或輕鏈之CDR1、C])R2及或CDR3使付含有該等弼結合模體。例如：本發明之非限定一態樣中，可設計以序列編號：41、序列編號：63、序列編號：64表示之人類抗體之輕鏈可變區所含之鈣結合模體，使包含於本發明之抗原結合分子之輕鏈可變區。如此的鈣結合模體，例如以Kabat編號法表示之30位、31位、 32位、50位及/或92位中任一個以上之胺基酸為包含具金屬螯合作用之胺基酸的鈣結合模體。如此的鈣結合模體之非限定態樣’例如與從以序列編號：41、序列編號：63、序列編號：64表示之人類抗體之輕鏈可變區之以Kabat編號法表不之30位、31位、32位、50位及/或92位之5個胺基酸中選出的1〜4個胺基酸為相同之胺基酸，係包含於對應之Kabat編號法之胺基酸部位的鈣結合模體。於此情形，輕鏈可變區之以Kabat編號法表示之3〇位、31位、 3 2位、5 0位及/或9 2位之5個胺基酸部位之中，與以序列編號：41、序列編號：63、序列編號：64表示之人類抗體之輕鏈可變區中之對應的胺基酸部位所含之胺基酸為不相同之胺基酸胺基酸部位，宜為包含具金屬螯合作用之胺基酸。又，例如：本發明之非限定之另一態樣中，可設計以序列編號：1表示之重鏈可變區所包含之鈣結合模體，使其包含於本發明之抗原結合分子之重鏈可變區。如此的辦社 46 201249871 〇模體例如以Kabat編號法表示之95位、96位及/或100a 位之胺基酸為包含具金屬螯合作用之胺基酸的鈣結合模體例如.本發明之非限定之另--態樣中，可設計以序列、’扁號.2 5表示之重鏈可變區所包含之鈣結合模體，使其包3於本發明之抗原結合分子之重鏈可變區。如此的鈣結合模體，例如以Kabat編號法表示之95位及/或1〇1位之胺基酸為包含具金屬螯合作用之胺基酸的鈣結合模體。具該等金屬螯合作用之胺基酸，例如絲胺酸（Ser(s))、蘇胺酸（Thr(T))、天冬醯胺酸（Asn(N))、麩醯胺酸（Gln(Q))、天冬胺酸（Asp(D))、麩胺酸（Glu(E)、組胺酸（His(H))及酪胺酸（Tyr(Y))等。又，為了鈣離子之結合，也可涉及該等位置之胺基酸之主鏈之羰基。如後述實施例所記載，藉由將包含於鈣結合模體之胺基酸移植到所望的抗原結合域， 7人思外地可對於該抗原結合域賦予約離子結合活性。又，也可適當使用Cadherin域、Calm〇dulin所包含之EF 手、Protein kinase C所包含之C2域、血液凝固蛋白質 FactorIX所包含之Gla域、去唾液酸糖蛋白 (asialoglycoprotein)受體或甘露糖結合受體所包含之[ 型凝集素、LDL受體所包含之a域、Annexin、 thrombospondin3型域及EGF狀域也可理想地使用。專一性專-性係指其中之-的分子對於其一或多數之結合對象的分子以外之分子未顯示任何顯著結合之狀態。又，抗原結合域也可用在對於某抗原中所含之多數抗原決定基當 47 201249871 中特定抗原決定基為專一性的情形。又，抗原結合域所結合之抗原決定基包含在多數不同抗原時，具該抗原結合域之多胜肽組合體可以與含該抗原決定基之各種抗原結合。抗體本說明書中，抗體係指天然者或部分或完全合成所製造之免疫球蛋白。抗體可從其天然存在之血漿或血清等天然資源或產生抗體之融合瘤細胞之培養上清單離，或可使用基因重組等方法部分或完全合成。抗體例如免疫球蛋白之同種型（isotype)及此等同種型之次類（subclass)為較佳例。人類免疫球蛋白已知有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、 IgAl、IgA2、IgD、IgE、IgM9種類型（同種型）。本發明之抗體在該等同種型之中，可含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。製作具有所望結合活性之抗體之方法於該技術領域之人士為公知。以下列舉製作與IL_6結合之抗體（抗杬體）之方法。與IL-6R以外之抗原結合的抗體也可依據下列例示適當製作。抗IL-6R抗體可使用公知方法以多株或單株抗體之形式取彳于。抗IL-6R抗體，宜製作哺乳動物來源的單株抗體。甫乳動物來源的單株抗體，包含由融合瘤產生者，及以基因工程的方法以含抗體基因之表現載體轉形而得之寄主細胞所產生者等。本發明之單株抗體包含「人類化抗體」或「嵌合抗體」。單株抗體產生融合瘤，可使用公知技術依例如以下方式製作。亦即，使用IL — 6R蛋白質當做感作抗原，依通常 48 201249871 之免疫方法將哺乳動物免疫。將獲得之免疫細胞以通常的細胞融合法與公知之母細胞融合。其次依照通常之篩選法’篩選單株抗體產生細胞，可選擇產生抗IL_6r抗體之融合瘤。具體而言，單株抗體之製作係依例如以下所示方式實行。首先’藉由表現在序列編號：1 6揭示其核：g：酸序列之 IL-6R基因，取得當做抗體取得之感作抗原使用的以序列編號：15表示的IL-6R蛋白質。亦即，藉由將編碼為IL_6R 之基因序列插入公知之表現載體，而將適當的寄主細胞轉形。從該寄主細胞中或培養上清中以公知方法精製所望之人類IL-6R蛋白質。為了從培養上清中取得可溶型之 IL-6R，例如可使 Mullberg 等人（J. lmmunol. (1994) 152 (10)，4958-4968)記載之序列編號：15表示之il-6r多胜肽序列當中1至357號之胺基酸構成之蛋白質表現，以代替表現以序列編號：15表示之I l-6R蛋白質。又，經精製的天然IL-6R蛋白質也同樣可當做感作抗原使用。對於哺乳動物免疫時使用之感作抗原，可使用該精製 IL-6R蛋白質。IL-6R之部分胜肽也可當做感作抗原使用。於此時，該部分胜肽可利用人類IL_6R之胺基酸序列以化學合成取得。又，也可將IL_6R基因之一部分納入表現載體使表現而取得。再者，使用蛋白質分解酵素將IL-6R蛋白質分解也可取得，但是當做部分胜肽使用之IL_6R胜肽之區域及大小不限於特別之態樣。較佳區域可從序列編號：15之胺基酸序列當中相當於2〇_357胺基酸之胺基酸 49 201249871 序列選擇任意序列。構成當做感作抗原之胜肽的胺基酸的數目至少為5以上，例如6以上或7以上較佳。更具體而言，可將8〜50、較佳為10〜30個殘基之胜肽當做感作抗原使用。又，將IL-6R蛋白質之所望之部分多胜肽或胜肽與不同的多胜肽融合成的融合蛋白質可利用為感作抗原。為了製ie ®做感作抗原使用之融合蛋白質，例如可適當利用抗體之Fc片段或胜肽標籤（tag)等。表現融合蛋白質之載體，可藉由將編碼為所望之二種或更多種多胜肽片段之基因於框架内（inf rame)融合，並將該融合基因以前述方式插入表現載體而製作。融合蛋白質之製作方法記載於 Molecular Cloning 2nd ed. (Sambrook,J et al., Molecular Cloning 2nd ed.， 9. 47-9. 58( 1989)Cold

Spring Harbor Lab. press)。可當做感作抗原使用之r_6r 之取得方法及使用其之免疫方法，在w〇2〇〇3/〇〇〇883、 W02004/022754、W02006/006693 等亦有具體記載。以該感作抗原免疫之哺乳動物不限於特定動物，宜考慮與細胞融合使用之母細胞之間的適合性選擇。一般的嚅齒類動物’例如小鼠、大鼠、倉鼠、或兔、猴等較佳。依公知方法將上述動物以感作抗原.免疫。例如就一般方法而言，係藉由將感作抗原對於哺乳動物之腹腔内或皮下注射而投予以實施免疫。具體而言，將以 PBS(Phosphate-Buf fered Sal ine)或生理食鹽水等以適當稀釋倍率稀釋過的感作抗原，視所望與通常的佐劑例如佛 50 201249871 洛依德完全佐劑混合並乳化後，將該感作抗原對於哺乳動物母4至21日投予數次。又，感作抗原免疫時可以使用適當載體。尤其使用小分子量之部分胜肽當做感作抗原時，有時以結合有白蛋白、血藍蛋白（keyh〇ie lympet hemocyanin)等載體蛋白質的該感作抗原胜肽進行免疫為理想。又’產生所望抗體之融合瘤可使用DNA免疫並依以下方式製作。DNA免疫，係指在免疫動物中投予以能表現編碼為抗原蛋白質之基因的態樣構建之載體DNA的該免疫動物十’藉由感作抗原在該免疫動物之活體内表現，能提供免疫刺激之免疫方法。比起對於免疫動物投予蛋白質抗原之一般免疫方法’ DNA免疫可期待如下的優越性。 —可維持如IL-6R之膜蛋白質之構造而提供免疫刺激 —無需精製免疫抗原為了以DNA免疫獲得本發明之單株抗體，首先將表現 IL-6R蛋白質之DNA對於免疫動物投予。編碼為IL_6R之 DNA可利用PCR等公知方法合成。將獲得之DNA插入適當表現載體並對於免疫動物投予。表現載體例如可以理想地利用PCDNA3.1等市售表現載體。將載體對於活體投予之方法，可使用一般使用之方法。例如，可藉由將吸附有表現載體之金粒子以基因搶導入免疫動物個體之細胞内而實施 DNA免疫。再者，g忍識Il-6R之抗體之製作也可使用國際公開W02003/104453記載之方法製作。以此方式將哺乳動物免疫，確認血清中與IL 6R結合 201249871 之抗體力價上升後，從哺乳動物採取免疫細胞以供細胞融合。較佳之免疫細胞尤佳為使用脾細胞。與前述免疫細胞融合之細胞，可使用哺乳動物之骨髓瘤細胞。骨髓瘤細胞宜具有為了篩選的適當選擇標記。選擇仏$ ’係指能於特定培養條件下生存之（或無法生存）之形質。選擇標記中，次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶 (hypoxanthine-guanine phosphoribosy1 transferase) 缺損（乂下簡稱為HGPRT缺損）、或胸腺嘴咬激酶缺損（以下簡稱為τκ缺損）等為公知。具HGPRT或τκ缺損之細胞，具有次育嘌呤一胺基喋呤—胸腺嘧啶感受性（以下簡稱為HU 感受性）。HAT感受性之細胞在HAT選擇培養基中無法合成 DNA會死滅，但若與正常細胞融合則會利用正常細胞之補救合成路徑（salvage pathway)繼續合成MA，故能在選擇培養基中增殖。 HGPRT缺損或TK缺損之細胞，各可以含6硫鳥嘌呤 (thi〇gUanine) ' 8氮雜鳥嘌呤（以下簡稱為8ag)、或溴去氧尿嘧啶之培養基選擇。於DNA中納入該等喷啶類似物之正常細胞會死滅。另一方面，未納入該等嘧啶類似物之該等酵素缺損之細胞，能在選擇培養基中生存。其他稱為G418耐受性之選擇標記，係利用新黴素耐受性基因提供對於2 -去氧鍵徽胺4心陆，由 ePi：amine)糸抗生物質（慶大黴素 (gentamycin類似體）之耐受性。對細胞融合為理想的各種骨髓瘤細胞為公知。如此的骨髓瘤細胞例如可理想地使用 52 201249871 P3(P3x63Ag8.653)(J. Immunol.(1979)123 (4)， 1 548-1 550) 、 P3x63Ag8U. 1(Current Topics 1 n

Microbiology and Immunology( 1 978)81, 1 -7) ' NS-1(C. Eur. J. Immunol.(1976)6 (7)， 511-519) 、 MPC-ll(Cell(1976)8 (3), 405-415) 、 SP2/0(Nature(1978)276 (5685), 269-270) 、 F0(J.

Immunol. Methods( 1 980)35 ( 1-2)， 1-21) 、 SI 94/5.ΧΧ0.BU.1(J. Exp. Med.(1978)148 (1)， 313-323)、R210(Nature(1979)277 (5692)，131-133)等。 F0(J. Immunol. Methods( 1 980)35 ( 1-2), 1-21 ) χ S194/5.ΧΧ0.BU.1(J. Exp. 基本上可依照公知方法例如Ke 11 er與Mi 1 stein等人的方法（Methods Enzymol.(1981 )73，3-46)等，實施前述免疫細胞與骨髓瘤細胞之細胞融合。更具體而言，可於例如細胞融合促進劑存在下於通常的營養培養液中實施前述細胞融合。融合促進劑可使用例如聚乙二醇（PEG)、仙台病毒（HVJ)等，為更提高融合效率，可視所望添加使用二甲基亞砜等辅助劑。免疫細胞與骨髓瘤細胞之使用比例可任意設定。例如至10倍較佳。前述細相對於骨髓瘤細胞將免疫細胞定為胞融合使用之培養液，例如適於前述骨髓瘤細胞株增殖之咖64。培養液、画培養液、此外，可使用該種細胞培養使用之通常之培養液，再者，可理想地添加胎牛血清（fcs) 等血清補液。 53 201249871 前細胞融合係將前述免疫細胞與骨髓瘤細胞以既定量於述心養液中《分混合，並且將預先加溫至約37。匚之PM 溶液（例如平均分子量1_至6_左右）以通常3〇至 6〇%(w/v)之濃度添加。藉由將混合液緩慢混合會形成所望之融合細胞（融合瘤）。接著’逐次添加上述列舉之適當培養液’反複實施離心並去除上清之操作，可將對於融: 瘤之生長不利的細胞融合劑等除去。以如此方式獲得之融合瘤，可藉由於通常之選擇培養液’例如HAT培養液（含次黃嗓吟、胺基嗓呤、胸腺嘴咬之培養液）培養而選擇。為了使所望之融合瘤以外之細胞（非融合細胞）死滅’可使繼續進行使用上述HAT培養液之培養足夠時間(通常該足夠時間為數曰至數週）。其次，以通常之極限稀釋法’實施產生所望抗體之融合瘤之㈣及單— 選殖。以如此方式獲得之融合瘤，可利用因應細胞融合使用之月题瘤具有之選擇標記的選擇培養液而選擇。例如具 HGPRT或Π缺損之細胞，可藉由以HAT培養液（含次黃邊吟、胺基嗓呤及胸腺㈣之培養液）培養而選擇。亦即，、: 使用HAT感又性骨髓瘤細胞於細胞融合日寺，可纟Hu讲養液中將成功與正常細胞細胞融合的細胞選擇性增殖。為了使所望融合瘤以外之細胞（非融合細胞）死滅，可以繼續使用上述HAT培養液之培養^夠時間。具體而言，—般可藉由數日至數週的培養而選擇所望之融合瘤。其次可利用‘ 常之極限稀釋法’實施產生所望之抗體的融合瘤的筛選及 54 201249871 單一選殖。所望之抗體之筛選及單一選殖 —選殖’可依照基於公知抗原

胞表面之結合的系統。為了利用FACS篩選產生本發明之單株抗體的融合瘤，首先要製備表現IL_6R之細胞。用於篩選之較佳細胞為使IL 6R強制表現之哺乳動物細胞。藉由以當做寄主細可以選擇性檢測抗胞之未經轉形之哺乳動物細胞為對照體對於細胞表面之IL-6R的結合活性。亦即，藉由選擇產生未結合於寄主細胞而結合於IL_6R強制表現細胞的抗體的融合瘤，可以取得產生IL_6R單株抗體之融合瘤。或抗體對於經固定化之IL-6R表現細胞的結合活性可依據ELISA之原理評價。例如，將IL_6R表現細胞固定化在ELISA平板的井。使融合瘤之培養上清接觸井内之固定化細胞，以檢測結合於固定化細胞的抗體。單株抗體為小鼠來源時，與細胞結合之抗體可利用抗小鼠免疫球蛋白抗體檢測。該等篩選所選擇之產生具有對於抗原之結合能力的所望抗體的融合瘤，可利用極限稀釋法等選殖。以此方式製作之產生單株抗體之融合瘤可在通常之支立養液中繼代培養。而且，該融合瘤可於液態氮中長期保存。 55 201249871 將該融合瘤依照通常方法培養，可從其培養上清取得所望之單株杬體◊或可將融合瘤對於與其具適合性之哺乳動物投予使增殖，並從其腹水獲取單株抗體。前者之方法對於獲得高純度抗體為適當。攸該融合瘤等抗體產生細胞選殖的抗體基因所編碼之杬體也可適當利用。藉由將經選殖的抗體基因納入適當載體並導入寄主，可以表現該基因所編碼的抗體。抗體基因之單離與對於載體之導入、及用於將寄主細胞轉形之方法，例如已由Vandamme等人確立（Eur. J. βίπϋ^·(ι99^192 (3)，767_775)。下列所述重組抗體之製造方法亦為公知。例如’可從產生抗IL-6R抗體之融合瘤細胞取得編碼為抗IL-6R抗體之可變區（ν區）之cDNAe為此，通常首先從融合瘤萃取全體RNA。用於從細胞萃取mRNA之方法，例如可利用如下方法。胍（guanidine)超離心法（Biochemistry ( 1 979) 1 8 (24)， 5294-5299) — AGPC 法（Anal. Biochem. (1 987) 162 ( 1 ), 1 56-159) 萃取到的 mRNA 可使用 mRNA Purification Kit (GE Health care bioscience 製）等精製。或如 QuickPrepmRNA Purification Kit (GE Health care bioscience 製）等，

也有用於從細胞直接萃取全體mRNA之市售套組。使用如此的套組，可從融合瘤取得mRNA ^從獲得之mRNA使用反轉錄酵素可合成編碼為抗體V區之cDNA。CDNA可利用AMV 56 201249871

Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(生化學工業社製）等合成。又，為了 cDNA之合成及放大，可適當利用SMART RACE cDNA放大套組（Clontech製）及使用 PCR 之 5 -RACE 法（Proc· Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85 (23)， 8998-9002 、 Nucleic Acids Res. (1989) 17 (8)，291 9-2932)。又，在如此的cDNA合成之過程中，可在cDNA的兩末端導入後述適當的限制酶部位。從獲得之PCR產物精製目的之cI)NA片段，其次與載體 DNA連結。以如此方式製作重組載體，並導入大腸菌等，選擇群落（colony)後，從形成有該群落之大腸菌製備所望之重組載體。並且針對該重組載體是否具有目的cDNA之鹼基序列，可使用公知之方法例如二去氧核苷酸鏈終結法等確認。為了取得編碼為可變區之基因，利用使用可變區基因放大用引子之5’ -RACE法係屬簡便。首先，以從融合瘤細胞萃取之RNA當做模板，合成cDNA，獲得5，_RACE cDna 庫。5 _RACE cDNA庫之合成可適當使用SMART RACE cDNA 放大套組等市售套組。以獲得之5’ -RACE cDNA庫為模板，以pcR法將抗體基因放大。依據公知之抗體基因序列可設計小鼠抗體基因放大用之引子。此等引子為依免疫球蛋白之次類而各不相同的鹼基序列。因此，次類理想為預先使用Is〇 StHp小鼠單株抗體同種型決定套組（R〇che diagn〇stics)等市售套組決定。 57 201249871 具體而言，當目的為取得例如編碼為小鼠¥之基因時，可利用將編碼為當做重鏈之rl、r2a、⑼、當做輕鏈之，鏈與λ鏈的基因放大的引子。為了放大W 之可變區基因’ -般係利用於3’側之引子黏合有相當於接近可變區之恆定區之部分的引子。另一方面，5，侧之引子係利用5 RACE cDNA庫製作套組所附帶的引子。利用如此放大之PCR產物，可再構成由重鏈與輕鏈之組合而成的免疫球蛋白。以再構成之免疫球蛋白對於之結合活性當做指標，可以篩選所望之抗體。例如目的為取得對抗IL-6R之抗體時，抗體對於IL_6R之結八，更佳為專一性的。與IL-6R結合之抗體可藉由例如以下方式疒選；二師 (1) 使從融合瘤獲得之含有由cDNA編碼之v π & 1 k的抗體接觸IL - 6 R表現細胞之步驟、 (2) 檢測IL-6R表現細胞與抗體之間的結合之步驟、及 (3) 選擇與IL-6R表現細胞結合之抗體之步驟。檢測抗體與IL-6R表現細胞之間的結合的方法為公知。具體而言，可利用先前所述FACS等方法，檢測抗體與 IL-6R表現細胞間之結合。為了評價抗體之結合活性，可適當利用IL-6R表現細胞之固定標本。以結合活性為指標之抗體之篩選方法，亦宜使用利用噬菌體載體之淘選法。從多株抗體表現細胞群，以重鏈與輕鏈之次類之庫的形式取得抗體基因時，利用噬菌體載體之篩選方法係屬有利。編碼為重鏈與輕鏈之可變區之基 58 201249871 因’可藉由以適當連結子序列連結，而形成單鏈Fv(scFv)。藉由將編碼為scFv之基因插入噬菌體載體，可取得於表面表現scFv之噬菌體。該噬菌體與所望抗原接觸後，藉由回收與抗原結合之噬菌體，可以回收編碼為具目的結合活性之scFv的DNA。該操作可視需要反複實施，而將具所望之結合活性之scFv濃縮。獲得編碼為目的抗1L-6R抗體之V區的cdna後，將該 cDNA以認'識插入於該cDNA之兩末端的限制酶部位之限制酶消化者。較佳之限制酶，係認識構成抗體基因之鹼基序列中出現頻度低之驗基序列並消化。再者，為了將ι副本，肖匕片丰又以正確方向插入載體，宜插入提供附著末端之限制酶。糟由將以上述方式經消化之編碼為抗抗體之V區的cDNA插入適當表現載體，可以取得抗體表現載體。此時，^將編碼為抗體恒定區α區）之基因 '與編碼為前述V區之基因於框架⑽合，則可取得嵌合抗體。在此’嵌合抗體係指恆定區與可變區之來源不同者。因此， =鼠-人類等的異種嵌合抗體，人類—人類同種後合含在本㈣之嵌合抗體。藉㈣先在純定區之體=插入前述V區基因’可以構建礙合抗體表現載 ;體而言，可於例如保持有編碼為所望之抗體怪定區 = 現載體之5,側，適當配置消化前述Μ 基因之限制酶之限制酶序制酶.¾ &精由將以相同組合之限載體/。I兩者於框架内融合，可以構建嵌合抗體表現 59 201249871 為了製造抗IL-6R單株抗體’可以將抗體基因於由表現控制區控制之下表現的方式納入表現載體.用於表現抗體之表現控制區，例如包含增強子或啟動子。又，也可在胺基末端附加適當的信號序列，以使表現的抗體分泌到細胞外。例如係使用具胺基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS(序列編號：11 3)之胜肽當做信號序列，但是也可加成其他適當的信號序列。將表現的多胜肽在上述序列之羧基末端部分切斷’切斷的多胜肽可以成熟多胜肽之形式分泌到細胞外。其次，藉由以該表現載體將適當的寄主細胞轉形，可以取得表現編碼為抗IL-6R抗體之DNA的重組細胞。為了表現抗體基因，可將編碼為抗體重鏈（H鏈）及輕鏈（L鏈）之DNA納入分別的表現載體。藉由納入有η鏈與l 键之載體’對於相同寄主細胞同時轉形（co — transfect)，可以表現具備Η鏈與L鏈之抗體分子。或可將編碼為η鏈及L鏈之DNA納入單一的表現載體，而將寄主細胞轉形（參照國際公開W0 94/1 1 523)。用以藉由將經單離之抗體基因導入適當寄主而製作抗體之寄主細胞與表現載體的多數組合為公知。該等表現系均可應用於單離本發明之抗原結合域或CD3結合域。真核細胞當做寄主細胞時’可適當使用動物細胞、植物細胞、或真菌細胞。具體而言，動物細胞例如以下細胞。 (1) 哺乳類細胞、：CHO、C0S、骨髓瘤、BHK(baby hamster kidney) 、 Hela 、 Vero 等 (2) 兩生類細胞：非洲爪蟾卵母細胞等 60 201249871 (3)昆蟲細胞：sf9、sf21、Τη5 等或植物細胞以煙草（Nic〇tiana tabacum)等煙草 (Nicotiana)屬來源之細胞而得之抗體基因表現系為公知。植物細胞之轉形可以適當利用癒傷組織培養之細胞。又’真菌細胞可以利用如下的細胞。酵母.啤酒酵母（Saccharomyces serevisiae)等糖化酵母（Saccharomyces)屬、曱醇同化酵母（Pichia pastoris)等 Pichia 屬絲狀菌.黑麴黴（ASpergiiius niger)等麴菌 (Aspergi1lus)屬又’利用原核細胞之抗體基因之表現系亦為公知。例如使用細菌細胞時，可以適當利用大腸菌（E. c〇H)、枯草菌等細菌細胞。於該等細胞中，以轉形導人含有目的抗體基因之表現載體《藉由將經轉形之細胞於體外培養，可從該轉形細胞之培養物獲取所望之抗體。里驵机遛之產 w 3刊用I ! 轉殖動物。亦即，從墓人古始_ & ‘ 攸等入有編碼為所望抗體之基因的動物可獲取該抗1體。例如，^脚甘m枝抗體基因藉由於框架内插入編碼；乳汁中固有產生之蛋白皙的萁贷白質的基因内部，可以構建融合，因。乳汁中分泌之蛋白晳質例如可利用羊冷酪蛋白等。> 含有插入有抗體基因之融人之嘁。基因的DNA片段注入羊胚，；將該經注入之胚胎導入雌I " ^ I人雌平體内。從接受胚胎的羊產生j 基因轉殖羊（或其子孫）所產

盥乳、、十“哲）所產之礼汁，可以取得所望之抗I 與礼汁蛋白質之融合蛋白質。又，為了增加從基因轉殖^ 61 201249871 產生之含所望之抗體之乳汁量’可對於基因轉殖羊投予荷爾蒙（Bio/Technology (1994)， 12 (7)， 699-702)。本說明書記載之多胜肽組合體對於人類投予時，該組合體中之抗原結合域，可適當採用以降低對於人類之異種抗原性專為目的經人為改變過的基因重组型抗體來源的抗原結合域。基因重組型抗體例如包含人類化（Humanized) 抗體等。該等改變抗體可使用公知方法適當製造。本說明書記載之用於製作多胜肽組合體中的抗原結合域所使用之抗體之可變區，通常由插入在4個框架區（FR) 的3個互補性決定區（complementarity_determini叫 region ; CDR)構成。CDR係實質上決定抗體之結合專一性之區域。CDR之胺基酸序列富有多樣性。另一方面，構成 FR之胺基酸序列，即使在具有不同之結合專一性的抗體之間也常會顯不高度同一性。所以，一般可利用⑽之移植而將某抗體之結合專一性移植到其他抗體。人類化抗體也稱為再構成（reshaped)人類抗體。具體而言，將人類以外之動物例如小鼠抗體之⑽移植到以貝抗體而成之人類化抗體等為公知。為了獲得人類化抗體之㈣為已知。具體而言’就將小鼠抗體之 Εχ^ι〇η 為公知。於Over丨an . 人類抗…引子中:一一

_❹料料料之小鼠抗體之 ⑽的驗基序列。引子各準備“固FR 植到人㈣時，選擇與小鼠之FR且一^J、鼠⑽移

U之FR具尚同一性之人類FR 62 201249871 =:rcDR機能為有利。亦即，-般較隹為利用與 /移植之小鼠⑽_之胺基酸序列為高同—性之胺基k序列構成之人類FR。又，連結之驗基序列可設計為彼此於框架内連接。藉由各引子’可個別合成人類FR。其結果，可獲得於各f; ^有編竭為小鼠⑽之DNA的產物。各產物之編碼為小 -⑽之驗基序列’可設計成彼此重疊。接著，使以人類抗體基因為模板而合成之產物之重…DR部分彼此黏合’進行互補鏈合成反應。制該反應，人類⑼經由小鼠 CDR之序列而連結。最後’將連結有3個CDR與4個FR之V區基因，利用黏合在# 5,末端與3,末端並附加有適當之限制酶認識序列的引子，將其全長放大。藉由將以上述方式獲得之腿與編碼為人類抗體C區之DNA以於框架内融合之方式插入於表現載體中，藉此可製作人類型抗體表現用載體。將該重組載體導入寄主並樹立重組細胞後，培養該重組細胞，使編碼為該人類化抗體之DNA表現，藉此使該培養細胞之培養物中產生該人類化抗體（參照歐洲專利公開Ep 239400、國際公開 w〇l 996/002576 )。以定性或定量測定以上述方式製作之人類化抗體對於抗原之結合活性並進行評價’可以理想地選擇當經由CDR 連結時該CDR會形成良好之抗原結合部位的人類抗體之叩°視需要，可以將FR之胺基酸殘基取代，使再構成人類抗體之CDR能形成適當的抗原結合部位。例如，虞用將小 63 201249871 鼠CDR移植到人類FR時使用之pCR法，可對於FR導入胺基酸序列之變異。具體而言，可對於與FR黏合之引子導入部分的鹼基序列的變異。以如此的引子合成之FR，導入有鹼基序列之變異。以上述方法測定並評價將胺基酸取代過的變異型抗體對於抗原之結合活性，可以選擇具所望性質之變異 FR 序列（Sato，K.etal.，Cancer Res，1993，53, 851-856)。又，可以將具有人類抗體基因所有曲目的基因轉殖動物（參照國際公開 W01993/012227 、 f01992/003918 、 W01994/002602 ' W01994/025585 ' W01996/034096 ' W01 996/033735)當做免疫動物，以DNA免疫取得所望之人類抗體。再者，使用人類抗體庫以淘選取得人類抗體之技術亦為已知。例如，將人類抗體之v區以單鏈抗體（scFv)之形式，以噬菌體呈現法使表現在噬菌體之表面。可以選擇表現與抗原結合之scFv的噬菌體。藉由解析選擇之噬菌體之基因，可以決定編碼為與抗原結合之人類抗體之v區的DNA 序列。決定與抗原結合之scFv之DNA序列後，將該V區序列與所望之人類抗體c區之序列於框架内融合後插入適當表現載體，可以製作表現載體。將該表現載體導入上述列舉之適當表現細胞中，並使編碼為該人類抗體之基因表現可取得該人類抗體。該等方法已為公知（參照國際公開 W01 992/〇〇l〇47、觀 992/020791、WO1 993/00621 3、 WO1993/011236 、 W01993/019172 、 WO1995/001438 、 64 201249871 WO1995/015388) ° 又’就取得抗體基因之而言，除上述以外，也可適當使用 Bernasconi 等人（Science (2002) 298，21 99-2202) 或W02008/081 008記載之B細胞選殖（各抗體之編碼序列之鑑定及選殖、其單離、及各抗體（尤其IgG1、IgG2、IgG3 或igG4)製作用之表現載體構建之用途等）之方法。 EU編號法依照本發明使用之方法’指定為抗體之CDR與FR之胺基§^ 位置係依照 Kabat 規定（Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health, Bethesda，Md.，1 987年及1991年）。本說明書中，抗原結合分子為抗體或抗原結合片段時’可變區之胺基酸係依照Kabat編號法，恆定區之胺基酸係依照Kabat之胺基酸位置的EU編號法表示。抗原對於細胞内之攝入或對於細胞内之攝入之促進本發明中，由抗原結合分子所為之「抗原對於細胞内之攝入」’係指抗原由於胞吞作用而被攝入細胞内。又，本發明中，促進對於細胞内之攝入」，係指於血漿中，與抗原結合之抗原結合分子攝入細胞内之速度受促進、及/ 本發明中，對或&攝入的抗原再循環到血漿中之量減少。於細胞内之攝入速度之促進程度，當比較抗原結合分子在 Μ _濃度條件下之抗原結合活性低於在高鈣濃度條件下之抗原結合活性之度受促進即可。之前之抗原結合分子，對於細胞内之攝入速。因此，本發明中是否由抗原結合分子使抗 65 201249871 原對於細胞内之攝人受促進，可以由是否抗原對於細胞内之攝入速度增大而判斷。抗原對於細胞内之攝入速度例如可對於含人類FcRn表現細胞之培養液添加抗原結合分子與抗原，經時測定抗原於培養液中濃度之減少、或經時測定人類FcRn表現細胞内攝入之抗原之量而計算。藉由本發明之抗原結合分子促進抗原攝入細胞内之攝入速度的方法，例如藉由投予抗原結合分子，能促進血漿中之抗原之消失速度。因此，是否由於抗原結合分子促進杬原對於細胞内之攝入，例如可藉由測定是否血漿中存在之抗原之消失速度受加速，或是否由於抗原結合分子之投予使血漿中之抗原濃度減低而能確認。亦即，也可藉由本發明之抗原結合分子之投予’而促進血漿中之抗原濃度減少。 1分子之抗原結合分子對於抗原之結合次數又，本發明中，「1分子之抗原結合分子對於抗原之結合次數」，係指1分子抗原結合分子分解至消失為止之期間能夠結合於抗原之次數。本發明中，「使丨分子抗原結合分子對於抗原之結合次數增加」，係指以於血漿中，抗原與抗原結合分子結合，且結合有抗原之抗原結合分子攝入細胞内並在體内將抗原解離後，抗原結合分子回到血漿中當做1個循環時，1分子抗原結合分子被分解而消失為止之期間能夠周轉的該循環數增加。本發明中，只要抗原結合分子在低鈣濃度條件下之抗原結合活性不低於在高鈣濃度條件下之抗原結合活性之抗原結合分子、或在低转 66 201249871 濃度條件下之抗原結合活結合活性之前之抗原結合因此，是否循環數增加，性低於在高鈣濃度條件下之抗原刀子比較，循環數有增加即可。可藉由是否前述「對於細胞内之攝入有促進」斷。或是否後述「血漿中滯留性有改善」而判血漿中滯留性之改善本發明中’「血漿中滯留性之改善」，可代換為「藥物動態之提高」、「藥物動態之改善」、「優異之藥物動態」、「血聚中滯留性之提高」、「優異之血漿中滯留性」或「血漿中滯留性加長」，該等語句係以相同含意使用。本發月中，血聚中滯留性改善」，包含從抗原結合分子對於人類、小鼠m兔、犬等動物投予之後到從血漿中消失為止(例如:於細胞内被分解等而成為抗原結合分子不能再回到血漿中之狀態為止）之時間不僅增長且從投予抗原結合分子到其被分解並消失為止之期間於可結合到抗原之狀態(例如:抗原結合分子非結合於抗原之狀態）滞留於血聚中之時間增長。亦即包含非結合於抗原 =原結合分子（抗原非結合型抗原結合分子）被分解而消失為止之時間增長。 _抗原結合分子即使存在於血漿中，若該抗原結合分子以:抗原日寺’該抗原結合分子不能與新的抗原結合。所於原' ° 口 ” +未與抗原結合之時間增長’能與新的 =…合的時間會增長（能與新抗原結合之機會增加），能減>、在活體内抗原未與抗原結合分子結合之時間，可以增 67 201249871 長抗=與抗原結合分子結合之時間。若能藉由抗原結合分 =2=予使抗原從血漿中消失加速，則抗原非結合型抗原〇刀子之血漿中濃度增加，且抗原與抗原結合分子結合之時間加長。亦即，本發明中，「抗原結合分子於血聚中滞留性之改善」，係包含在低妈濃度條件下之抗原結合活性不低於在高舞濃度條件下之抗原結合活性之抗原非結合型抗原結合分子、七ν ° 子或在低鈣濃度條件下之抗原結合活性於在高約濃度條件下之抗原結合活性之前之抗原非結合: 抗原結，分子比較，本發明之抗原非結合型抗原結合分子之任一樂物動態參數有所改善（血聚中半衰期增加 =滯留時間增加、血㈣料降低任-者）、或抗原結合 /刀：投予後，抗原與抗原結合分子結合之時間延長、或由於抗原結合分子使抗原從血漿中消失加速。 - 藥物動態參數是否改善’可藉由測定抗原結合分子或結合型抗原結合分子之血聚中半衰期、平均血焚中滯留時間、血漿中廓清等任一參數（由藥理動力學演習 (南山堂以判斷。例如：將抗原結合分子對^m 猴、兔'犬、人類等投予時，測定抗原結合分子或抗^ 結合型抗原結合分子之金梁中濃度並計算各每血中半衰期增長或平均…滞留時間增長時，則可= 結合分子之血聚中滞留性有改善。該等參數可利用二領域之人士公知之方法測定’例如可使用能二體 winN〇nlin(Pharsight) m Q 解=

Noncompartmental而適當評價曰竹抗原非結合型抗原結合分 68 201249871 子之血漿中濃度之測定，可以利用該技術領域之人士公知之方法實施，例如可使用Clin Pharmacol. 2008 Apr;48(4):406-17中的測定方法。本發明中，「血漿中滯留性改善」，也包含抗原結合分子投予後’抗原與抗原結合分子結合之時間延長。抗原結合分子投予後，抗原與抗原結合分子結合之時間是否延長，可/則疋抗原結合分子非結合型抗原（游離型抗原）之血漿中濃度、或抗原結合分子非結合型抗原濃度（游離型抗原》辰度）相對於總抗原濃度，由該濃度之比例開始上升為止之時間判斷。本發明中，血漿中之抗原濃度」之測定，可使用該技術領域之人士公知的方法實施抗原結合分子非結合型抗原之血漿中濃度、或抗原結合分子非結合型抗原濃度相對於總抗原濃度之比例之測定，例如：可使用pharm Res. 2〇〇6 Jan;23(l):95-103中的測定方法。又，抗原在活體内顯示某些機能時，抗原是否與中和抗原機能之抗原結合分子（拮抗物分子）結合，也可利用該抗原之機能是否受中和以評價。抗原之機能是否受中和，可藉由測定反映抗原機能之某些活體内之標記以評價。抗原是否與活化抗原機能之抗原結合分子（促效劑分子）結合，可藉由測定反映抗原機能之某些活體内之標記以評價。抗原結合分子非結合型抗原之血漿中濃度之測定、抗原結合分子非結合型抗原濃度對於總抗原濃度之比例之測定' 活體内標記之測定等測定不不特別限定，宜於抗原結 69 201249871 。本發明中，「抗不特別限定，可由合分子投予後經過固定時間後進行較佳原結合分子投予後經過固定時間後」並 =技術領域之人士依投予之抗原結合分子之性質等適時決定’例如抗原結合分子投予後經過i曰後、抗原結合分子才又予I過3日後、抗原結合分子投予經過7日|、抗原結合分子投予經過14日後、抗原結合分子投予經過Μ日後等。本發月中，改善人類之血漿中滯留性較佳。難以測定於人類之血毁中滞留性時，也可基於小鼠（例如：正常小鼠、人類抗原表現基因轉殖小鼠、人類FcRn表現基因轉殖小鼠、等）或猴（例如：長尾獼猴（Macaca fascicularis)等）之血漿中滯留性，來預測於人類之血漿中滯留性。於細胞外與抗原結合分子結合之抗原於細胞内從抗原結合分子之解離又，本發明也可當做促進於細胞外與抗原結合分子結合之抗原於細胞内從抗原結合分子解離之方法。本發明中’抗原從抗原結合分子解離之處只要是在細胞内的任一處均可’較佳為早期核内體内。本發明中，「於細胞外與抗原結合分子結合之抗原於細胞内從抗原結合分子之解離」’不需要是在細胞外與抗原結合分子結合之攝入細胞内之抗原全部在細胞内從抗原結合分子解離，只要在細胞内從抗原結合分子解離之抗原之比例，係抗原結合分子在低转濃度條件下之抗原結合活性不低於在高鈣濃度條件下之抗原結合活性之抗原結合分子、或在低鈣濃度條件下之 70 201249871 抗原結合活性低於在高鈣濃度條件下之抗原結合活性之前之抗原結合分子比較，於細胞内從抗原結合分子解離之抗原之比例較高即可。又’促進於細胞外與抗原結合分子結合之抗原在細胞内從抗原結合分子解離之方法，也可稱為對於抗原結合分子賦予對於與抗原結合之抗原結合分子攝入細胞内、於細胞内抗原從抗原結合分子解離容易促進之性質之方法。將以結合於抗原之狀態攝入細胞内之抗原、纟士人分子，以非結合抗原之狀態釋放到細胞外又，本發明也可當做促進以結合於抗原之狀態攝入細胞内之抗原結合分子，以非結合於抗原之狀態釋放到細胞外之方法。本發明中，「以結合於抗原之狀態攝入細胞内之抗原結合分子，以非結合於抗原之狀態釋放到細胞外」，不需要為以結合於抗原之狀態攝入細胞内之抗原結合分子全部以非結合於抗原之狀態釋放到細胞外，只要比較以# 結合於抗原之狀態釋放到細胞外之抗原結合分子之比例為’抗原結合分子在低鈣濃度條件下之抗原結合活性不低於咼鈣濃度條件下之抗原結合活性之抗原結合分子、或在低鈣濃度條件下之抗原結合活性低於在高鈣濃度條件下之抗原結合活性之前，釋放到細胞外之抗原結合分子之比例增同即可。釋放到細胞外之抗原結合分子，宜維持抗原結合活性較佳。又’促進以結合於抗原之狀態攝入細胞内之抗原結合分子以未結合於抗原之狀態釋放到細胞外之方法也可稱為對於抗原結合分子賦予容易促進使結合於抗 71 201249871 原之抗原結合分子攝入細胞内，並促進抗原結合分子未與抗原之狀態釋放到細胞外之促進之性質的方法。鈣濃度之條件本發明中，低鈣濃度條件下，通常意指離子化鈣濃度為Ο.Ι/iM〜3〇βΜ。較佳為0.5/ίζΜ〜10"Μ，尤佳為接近在活體内的早期核内體内中的離子化鈣濃度的1/z I又，本發明中，高鈣濃度條件下，通常意指離子化鈣濃度為〜10 mM，較佳為200 /zM〜5 mM，尤佳為接近活體内之血衆中（血中）之離子化鈣濃度之〇.5 _〜2.5 mM。因此本發明中，「抗原結合分子在低鈣濃度條件下之抗原結合活性低於高鈣濃度條件下之抗原結合活性」，係指抗原結合分子於離子化鈣濃度〇.丨"M~3〇舡M之抗原結合活性，若於於離子化鈣濃度1〇〇 " Μ〜10 mM之抗原結合活性。較佳為抗原結合分子在離子化鈣濃度〇. 5 " 〇以M之抗原結合活性，若於在離子化鈣濃度2〇〇 # M〜5 mM之抗原結合活性’尤佳在為活體内之早期核内體内之離子化鈣濃度時的抗原結合活性，若於在活體内之血漿中之離子化辦濃度時的抗原結合活性，具體而言，意指抗原結合分子在離子化鈣濃度1 # Μ〜5 v Μ之抗原結合活性若於在離子化鈣濃度〇. 5 mM〜2. 5 mM之抗原結合活性。再者’本發明中，「抗原結合分子在低鈣濃度條件下之抗原結合活性低於高鈣濃度條件下之抗原結合活性」的表達方式，也可表達為抗原結合分子於高鈣濃度條件下之抗原結合活性高於在低鈣濃度條件下之抗原結合活性。 72 201249871 又’抗原結合分子在低鈣濃度條件下之抗原結合活性低於在高妈濃度條件下之抗原結合活性」之表達方式中，也包3藉由改變抗原結合分子中之胺基酸序列，使抗原結合刀子在低鈣濃度條件下之抗原結合活性低於在高鈣濃度條件下之抗原結合活性、或使抗原結合分子於高鈣濃度條件下之抗原肖合活&高在低鈣濃度條件下之抗原，吉合活性之 If开/亦即’本發明中，只要抗原結合分子在低鈣濃度條件下之抗原結合活性與於高鈣濃度條件下之抗原結合活性之比增大即可。例如：如後述，使KD(Ca 3 " M)/KD(Ca 2⑹ 之値增大之態樣。& 了使抗原結合分子在低鈣濃度條件下之抗原結合活性與於高釣濃度條件T之抗原結合活性之比增大，例如可選擇在低鈣濃度條件下之抗原結合活性低者、或稭由改變抗原結合分子中之胺基酸序列，而降低在低約/辰度條件下之抗原結合活性，也可選擇於高辦濃度條件下之抗原結合活性高，或藉由改變抗原結合分子中之胺基馱序列，而提高於高鈣濃度條件下之抗原結合活性，或兩者均可。又’本發明中，有時會記載「在低鈣濃度條件下之抗原結合活性低於高鈣濃度條件下之抗原結合活性」為「低鈣艰度條件下之抗原結合能力若於高鈣濃度條件下之抗原結合能力」’X，有時會記载「使在簡濃度條件下之抗原結合活性低於在高弼濃度條件下之抗原結合活性」為「使低弼濃度條件下之抗原結合能力低於高飼濃度條件下之抗原結合能力，。 73 201249871

FcRn 與屬於免疫球蛋白超級家族之Fcr受體不同kb 尤其是人類FcRn，在構造的上與主要組織不適合性複合體 (MHC)第I類之多胜肽在構造的相類似，且

”弗1類之MHC 刀子有22至29%之序列同一性（Ghetie等人，

Today (1997) 18 ( 12)，592一598)〇FcRn，係由與關可U =性 /5或輕鏈（/S2微球蛋白）複合體化之穿膜α或重鏈構成的異二聚體的形式表現。如MHC，FcRni α鏈係由3個細胞外域（α 1、α 2、α 3)構成，且短的細胞質域係將蛋白質留在細胞表面。αΐ及α2域會與抗體之fc區域中之FcRn 結合域交互作用（Raghavan等人（lmmunity ( 1 994) h 303-315)。

FcRn係於哺乳動物之母性胎盤或卵黃嚢表現其涉及 UG從母親移動到胎兒。此外，於表現FcRri之嚅齒類新生兒的小腸中，涉及母體IgG從攝取FcRn之初乳或乳橫切移動到刷子緣上皮。FcRn有多數種類，在多數其他組織、及各種内皮細胞系表現。其在人類成人血管内皮、肌肉血管系、及肝臟洞狀毛細血管也有表現。FcRn會與I gG，並且再循環到血清，而據認為有維持I gG之血漿中濃度之作用。FcRn對於IgG分子之結合’通常係嚴格依存於pH，最適結合據認為是小於7. 0之pH酸性域。以含序列編號：17表示之信號序列之多胜肽當做前驅體之人類FcRn，於活體内（序列編號：18記載包含信號序列之其多胜肽）會與人類召2 -微球蛋白形成複合體。與 74 201249871 沒2-微球蛋白形成複合體之可溶型人_ FcRn可使用通常之重組表現方法製造。可以則賈本發明之FcRn結合域對於與如此的肖终微球蛋白形成複合體之可溶型人類FcRn 的結合活性。本發明中’未特別記載時，人類FcRn指能與本發明之FcRn結合域結合之形態者，例如人類f心與人類万2 -微球蛋白之複合體。

FcRn結合域本發明之抗原結合分子，具有抗原結合域與人類FcRn 結合域。人類FcRn結合域，只要是抗原結合分子在酸性 PH及/或中性pH具有人類FcRn結合活性即不特別限定、又’也可為直接或間接對於人類FcRn具結合活性之域。如此的域’例如：直接對於人類FcRn具結合活性之¥型免疫球蛋白之Fc區域、白蛋白、白蛋白d〇main3、抗人類⑽ 抗體、抗人類FcRn胜肽、抗人類FcRn Scaff〇id分子等、 :間接對於人類FcRn具結合活性之與igG或白蛋白結合之刀子等。本發明中’宜具於pH酸性域及pH中性域具人類 FCRn結合活性之域為較佳。該域只要是預先在pH酸性域及PH中性域具人類FeRn結合活性之域，即可直接使用。該域在PH酸性域及/或pH中性域沒有人類恤結合活性或弱時’可改變抗原結合分子中之胺基酸而獲得人類F. 結合活性’但較佳為改變人類㈣結合域中之胺基酸而獲得於PH酸性域及/或邱中性域之人類以肚結合活性◎又，也可預先在pH酸性域及/或pH中性域改變具人類結合活性之域中之胺基酸，而提高人類FcRn結合活性。人類 75 201249871

FcRn結合域之胺基酸改變， τ藉由比較胺基酸改變前與改變後之ΡΗ酸性域及/或DK击ω a 士 Ρίί中性域中的人類FcRn結合活性’而找出目的之改變。人類FcRn結合域，宜盔古且為直接與人類FcRn結合之區。人類FcRn結合區之較佳你丨

例如抗體之Fc區域。但是能與白蛋白或IgG等具有盥人猫p D 人 “員FcRni結合活性之多胜肽結〇之區，也可經由白蛋白 τ _ _ 白或1gG專而間接結合於人類 F·。所以，本發明之人、人類 un，，·„。{^，也可為與白蛋白或Ϊ gG具結合活性之多胜人… 夕胜肽結合之區。尤其，人類FcRn結 s域，較佳為於中性djj之Λ Ρ之人類FcRn結合活性較高者，可以預先選擇在t性PH之人齠ρ D .,. 处 FcRn、，Ό 0活性高之人類FcRn 、，口口域’也可改變抗原結合乃子中之胺基酸而賦予在中性 pH之人類FcRn結合活性，或 ^ ^ ^ ^ 飞了 k问於中性PH之人類FcRn 結合活性。測定對於人類FcRn之处 <>、、，。合活性時，pH以外之由該技術領域之人士適當 ' u田選擇，無特別限定。如：WO2009/125825 記載，於㈣e

。己載於MES緩衝液、37t之條件又，抗原結合分子之人魅Ρ β J …… 結合活性之測定可依照該技術領域之人士公知之方法

H 1+h 、楚進仃，例如可使用Biac〇re(GE

He·⑽）相定。抗原結合分子與人類恤之_活性^則定’可藉由料固定切抗原結合分子或人類_ —類⑽或抗原結合分子當做分析物使其在此，酸性PH中，對於人類他之結合活性，係指 76 201249871 於 pH4.0~pH6.5 夕 ΡΗ5· 5〜PH6. 5之人類。活性。較佳為意指於之早期核内體/^結合活性，尤佳為接近於活體内性。又，於中PH的PH5.8〜pH6.〇的人類FcRn結合活戲一。之人：：人類⑽之結合活性，係指於 PH7. ◦〜PH8.0之人類ρ p心結合活性。較佳為意指於人頬FcRn結合活性，尤佳為意指於接近活體内之血聚中之PH之PH7.4的人類⑽結合活性。改變杬原結合分子中之胺基酸而賦予於 =结合活性、或提高於中性邱之人類Fc二活性社八：：使用」gG型免疫球蛋白之Fc區域當做人類F. …B’ ’可藉由改變人類FcRn結合域之胺基酸對於抗原、’。°刀子賦予於中性pH之人類FcRn結合活性、或提高中性pH之人類&人、土

Rn、，，口 a活性。用於改變之較佳 …白之F…，…類天然型改變，只要能賦予於中性pH之人類_結合活性或提古人類FcRn結合活性’則可在任意位置改變胺基i抗原: 合分子’當含有人類IgGkFc區域當做人類他結合^ 時，宜包含使於中性pH對於人類FcRn之結合強於然型_之改變。可進行如此改變之胺基酸，例如·Ευ編號法m號〜m號、227號、228號、23G號、232號·、扁號^號、243號〜252號、254號〜⑽號、262號々3 274號、276號' 278號〜289號、如號〜川號、315號〜^ 號、似號、325號、327號〜咖號、341號、⑷號、如 77 201249871 號、360號、362號、370號、375號〜378號、38〇號、哪號、385 號〜387 號、389 號、396 號、414 號、416 號、423 號、424號、426號〜438號、440號及442號之位置之胺基酸。更具體而言，例如表1記載之胺基酸改變。藉由使用該等改變，能對於IgG型免疫球蛋白之Fc區域賦予、或提高（加強）於t性pfl對於人類FcRn之結合活性。又，能使於PH酸性域對於人類FcRn之結合活性比起人類天然型 IgGl為強之改變’例如表2所示。該等改變之中，可以適當選擇於中性pH也能強化對於人類FcRn之結合之改變，並使用於本發明。

FcRn結合域之「胺基酸之改變」或「胺基酸改變」，係包含改變為與母FcRn結合域之胺基酸序列不同之胺基酸序列。只要母FcRn結合域之修飾改變體在pH中性域能與人類FcRn結合，則* — FcRn結合域均可當做母FcRn結合域。又’對於已施加改變之FcRn結合域當做母Μη結合域再施加改變而得之士入A , 柯心t cKn結合域，也可理想地當做本發明之F c R η結合域。母p r r η έ士人从可r cKn結合域，係指多胜肽本身、包含母FcRn結合域之纽忐铷 ^ a < 且成物、或意指編碼為母FcRn結合域之聚核苷酸序列。母Ρ ρ έ士人 , Α ^ CKn結合域，可包含於抗體之項概略説明過的重组„ ，生之A知Fc區域。母FcRn結合域之起源不限定，但可從非Α # β , 類動物之任意生物或人類取得。較佳之任意生物，例如，丨、@ ^ 鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、荒地鼠、書苗、兔、犬、羊、綿i 、巾千、牛、馬、駱駝、及非人類靈長類選擇之生物。其他能椹心樣中’母FcRn結合域也可從長尾獼 78 201249871 猴、天竺鼠、紅毛猩獲、黑獲獲、或人類取得。較佳為母 FcRn結合域，係從人類IgG1取得，但不限於igG之特定類別。此係指可適當使用人類IgG卜IgG2、邮、或_ 之Fc區域當做母FcRn結合域。同樣地，本說明書中，意指可將來自於前述任意生物之IgG之任意類別或次類之Fc 區域，較佳為當做母FcRn結合域。天然存在之IgG之變異體或經操作之型，例如公知文獻㈧虹厂〇pin. (2009) 20 (6), 685-91 ' Curr. Opin. Immunol. (2008) 20 (4)， 460-470 'Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23 (4), 195-202 、 W02009/086320 、 W02008/092117 、 W02007/041 635、及 W02006/1 05338)記載者，但不限定。改變例如包含一以上之變異，例如：取代為與母FcRn 結合域之胺基酸為不同之胺基酸殘基之變異、或對於母 FcRn結合域之胺基酸插入一個以上胺基酸殘基或由母 FcRn結合域之胺基酸有一個以上之胺基酸之缺損等。較佳為改變後之FcRn結合域之胺基酸序列中，至少部分包含至少天然未產生之FcRn結合域之胺基酸序列。如此的變種必然與母FcRn結合域有低於1 〇〇%之序列同一性或類似性。較佳實施形態中’變種與母FcRn結合域之胺基酸序列有約 7 5 %〜低於1 0 0 %之胺基酸序列同一性或類似性，更佳為約 80%〜低於100%，更佳為約85%〜低於100%，又更佳為約9〇%~ 低於1 00%、最佳為約95%〜低於1 00%之同一性或類似性之胺基酸序列。本發明之一非限定態樣中，母FcRn結合域及本發明之經改變之FcRn結合域之間’有至少1個胺基酸的 79 201249871 差異。母FcRn結合域與改變FcRn結合域之胺基酸之不同，也可利用尤其以前$ EU編號法指定之胺基酸殘基之位置之指定之胺基酸差異而理想地指定。又，於PH酸性域對於人類FcRn之結合能比起母人類 IgG為強之改變’例如表2。該等改變之中，可以適當選擇於PH中性域仍能強化對於人類FcRn之結合的改變，並使用在本發明。又，對於Fv4_IgG1於酸性條件下與人類之結合可以加強之改變之組合如表6_丨及6 2。尤佳之母人類IgG之Fc區域之改變胺基酸，例如EU編號法237號、 238 號、239 號、248 號、25G 號、252 號、254 號、255 號、 256 號、257 號、258 號、265 號、27G 號、286 號、289 號、 297 號、298 號、3G3 號、3G5 號、3G7 號、308 號、3G9 號、 311 號、312 號、314 號、315 號、：m 號、325 號、332 號、 334 號、360 號、376 號、380 號、382 號、384 號、385 號、 386 號、387 號、389 號、424 號、428 號、433 號、434 號及436號之位置之胺基酸。尤佳之改變’例如：母IgG之Fc區域之EU編號法 237號之Gly取代為Met之胺基酸取代、 238號之pro取代為Aia之胺基酸取代、 239號之Ser取代為Lys之胺基酸取代、 248號之Lys取代為ne之胺基酸取代、 250 號之 Thr 取代為 Ala、Phe、lie、Met、Gin、Ser、

Val、Trp、或Tyr之胺基酸取代、 252號之Met取代為phe、Trp、或Tyr之胺基酸取代' 80 201249871 254號之Ser取代為Thr之胺基酸取代、 255號之Arg取代為giu之胺基酸取代、 256號之Thr取代為Asp、Glu、或Gin之胺基酸取代、 257 號之 Pro 取代為 Ala、Gly、lie、Leu、Met、Asn、 Ser、Thr、或Val之胺基酸取代、 258號之Glu取代為His之胺基酸取代、 265號之Asp取代為AU之胺基酸取代、 270號之Asp取代為Phe之胺基酸取代、 286號之Asn取代為Ala或Glu之胺基酸取代、 289號之Thr取代為His之胺基酸取代、 297號之Asn取代為Ala之胺基酸取代、 298號之Ser取代為Gly之胺基酸取代、 303號之Val取代為Ala之胺基酸取代、 305號之Val取代為Ala之胺基酸取代、 307 號之 Thr 取代為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、 Lys 、 Leu 、 Met 、 Asn 、 Pro 、 Gin 、 Arg 、 Ser 、 Val 、 Trp 、或Tyr之胺基酸取代、 308 !虎之 Val 取代為 Ala、Phe、lie、Leu、Met、Pro、 G1 n、或Thr之胺基酸取代、 309 號之 Leu 或 Val 取代為 Ala、Asp、Glu、Pro、或

Arg之胺基酸取代、 311號之Gin取代為Ala、His、或lie之胺基酸取代、 312號之Asp取代為Ala或His之胺基酸取代、 314號之Leu取代為Lys或Arg之胺基酸取代、 81 201249871 315號之Asn取代為Ala或His之胺基酸取代、 317號之Lys取代為八13之胺基酸取代、 325號之Asn取代為Gly之胺基酸取代、 332號之He取代為Val之胺基酸取代、 334號之Lys取代為Leu之胺基酸取代、 360號之Lys取代為jjis之胺基酸取代、 376號之Asp取代為Aia之胺基酸取代、 380號之Glu取代為Aia之胺基酸取代、 382號之Glu取代為Aia之胺基酸取代、 384號之Asn或Ser取代為Ala之胺基酸取代、 385號之Gly取代為Asp或His之胺基酸取代、 386號之Gin取代為Pro之胺基酸取代、 387號之Pro取代為Glu之胺基酸取代、 389號之Asn取代為Ala或Ser之胺基酸取代、 424號之Ser取代為Ala之胺基酸取代、 428 號之 Met 取代為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、 Lys 、 Leu 、 Asn 、 Pro 、 Gin 、 Ser 、 Thr 、 Val 、 Trp 、或 Tyr 之胺基酸取代、 433號之His取代為Lys之胺基酸取代、 434 號之 Asn 取代為 Ala、Phe、His、Ser、Trp、或 Tyr之胺基酸取代、及 436號之Tyr或Phe取代為His之胺基酸取代。改變之胺基酸數目不特別限定，可僅改變1處胺基酸’也可改變2處以上之胺基酸。2處以上之胺基酸之改 82 201249871 變之組合，例如 m , 衣3屺載之組合。對於人類FcRn ° 又，可以使於Ρ1ί酸性域 . 〈結合比起母人Τ 合’如表4~1〜4ς 賴1 gG為加強之改變之組性域也能加強對於人…中’可以適當選擇於邱中本發明。再者， FcRn之結合的改變的組合，使用在相對於Fv4-1gG 1，於中性條件下加強對於人類F<：Rn之結合的改變的組合m-Ι及5-2。藉由將選自於該等胺基酸中至少1個胺基酸取代為其他胺基酸’旎提高於抗原結合分子之pH中性域之人類FcRn 結合活性。【表1】

83 201249871 【表2】

位置胺基酸改變 221 V.K 222 Y 223 εκ 224 Υ.Ε 225 E. K.W 227 K. E. G 228 Υ, K. G 230 E.G 232 Κ 233 R. S. Μ, T, W. Y, G 234 H, R. E. I. V, F, D. Y, G 235 Y. V. N, S. T. Q. D 236 I. V. K, P. E Q. H, W. Y, D. T. Μ, Λ F, S. N, R 237 I, W, S, T. E, R N, Q. K, K D. P. L M 238 A, U D. S. T. H. W. V, I, G, M. F, E, K 239 M, R. T, G, V. E. D. L A 240 I. M,T 241 E. W.L 243 E, W 244 L 245 R 246 Y, H 247 D 248 Y 249 P. Q. Y. H 250 I. E. Q 251 T.D 252 V.W.Q 254 H 255 E, Y,H 256 A 257 A. I. Μ. N, S. V, T. U Y, C 258 D_ Y. K A 259 I. F. N 260 S, D· E, Η，Y 262 UE 263 I 264 F, A. I. T, N, S. D 265 R. P. G, A 266 I 267 K.E. A 268 E.M 269 M, W, K, P, l, S. G. V. F. Y, A 270 K, S. L A 271 A, V, S, Y, I, T 272 A, U R, I, D, Η. V. W. Y. P. T 274 M, F, G, E, I. T. N 276 D. F. H. R. L V. W. A 278 R. S. V. Μ. N, I. L D 279 A, D. G. Η. Μ. N. Q. R. S. T. W. Y. C. I 281 D· Y 282 G. K. E. V 283 A, D, F. G, Η. I. K. L N. P. Q, R. S, T, W. Y 284 T, L Q, E 285 N, Y. W. Q. K, E. D. Y 286 F, L Y,巳 P, D, K, A 287 S.H 288 N, P, Y, H, D. I, V. C. E, a U Q. R 289 H 291 Q.H 292 Y. E. D 293 V 294 1.K, G 295 V.T 296 E. I, L 298 F, E. T, H

位置胺基酸改變 299 W, F. Η, Y 300 K. A, G, V. M, Q. N. E 301 E 302 I 303 Y, E,A 304 N.T 305 A. H 306 Y 307 A, E. M. G, Q，H 308 A, R, F, C, Y, W. N. H 311 A. I, K. L Μ. V, W. T. H 312 A.P.H 315 T.H 316 K 317 Α,Ρ,Η 318 N. T. R, L Y 319 U. W, Η, Μ, V, A 320 L, W. H, hJ 324 T.D 325 F. M.D 326 A 327 D. Κ, Μ, Y. H. L 328 G. A, W, R, F 329 k, a W 330 G, W. V, P. H, F 331 L.F.Y 332 F. Η, K, L, M. R, S. W. T. Q. E. Y, D. Κ V 333 U F. M, A 334 A 335 H. F, N, V, M, W, I, S. P, L 336 E.K 337 A 33Θ A 339 N, W 341 P 343 E, Η. K, Q. R. T. Y 360 H, A 362 A 375 R 376 A, G. 1. Μ. P, T, V 377 K 378 Q. D, N, W 3B0 A. N. S, T, Q. R H 382 A. F. Η, I. K. L. Μ. N. Q. R S. T. V. W. Y 385 N. E 386 H 387 H. Q 414 A 423 N 424 A 426 H, L V, R 427 N 42B F 429 Q 430 A, F. G, Η, I, K, L Μ. N, Q. R. S, T, V, Y 431 Η, K 432 H 433 P 434 G, T. M, S, 435 K 436 I. LT 437 H 438 K. L. T. W 440 K 442 K 84 201249871

[表3】_ 胺基酸改變之組合 M252Y/S254T/T256E_ M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F/Y436H H433K/N434F/Y436H T307A/E380A T307A/E380A/N434H T307A/E380A/N434A N434H/N315H N434H/T289H N434H/T370A/E380A ~~ T250Q/M428L ~~ T250Q/N434A M252W/N434A M252Y/N434A T256A/N434A T256D/N434A T256E/N434A T256S/N434A P257I/Q311I T307A/N434A T307E/N434A T307Q/N434A V3Q8P/N434A L309G/N434A Q311H/N434A Q311R/N434A N315D/N434A A378V/N434A E380S/N434A E382V/N434A S424E/N434A M428L/N434A N434A/Y436I T437Q/N434A T437R/N434A 85 201249871 【表4-1】胺基酸改變之組合 L234I/L235D G236A/V308F7[332£ G236R/L328R G236A/I332E/N434S S239E/V264I/A330Y/I332E S239E/V264丨 / 丨332E lS239E/V264l/S298A/A330Y/i332E S239D/D265h7iM297D/I332E S239D/E272Y/T332E S239D/E272S/I332E S239D/E272丨 /丨332E S239D/N297D/I332E S239D/K326T7I332E S239Q/1332Q S239Q/1332N ~ S239D/I332D S239D/I332E S239Q/1332E ~ S239E/I332E F241W/F243W " F241Y/F243Y/V262T/V264T F241W/F243W/V262A/V264A F241L/V262I F243L/V262[/V264W_ F243L/K288D/R292P/Y300L/V305I/P396L/H435K F243L/K288D/R292P/Y300L/H435K F243L/R292P/Y30QLyV3051/P396L/H435K P245G/V308F ~ T250I/V259I/V308F T2501/V308F ~ ^+ T250I/V3Q8F/N434S T250Q/V308F/M428L T250Q/M428L L251I/N434S ^ L251N/N434S L251F/N434S L251V/N434S~ L251M/N434S ~ T252L/T254S/T256F_ M252Y/S254T/T256E/N434M M252Y/S254T/T256E/M428L/N434S M252Y/S254T/T256E_ M252Y/S254T/T256E/V308F M252Y/S254T/T256E/N434S M252Y/S254t7T256E/N434A M252Y/S254T/T256E/M428L M252Y/S254T/T256E/T307Q M252F/T256D" M252Y/T256Q_ M252Y/P257L M252Y/P257N—— M252Y/V2591_ M252Y/V279Q~ M252Y/V308P/N434Y M252Q/V308F M252Y/V308F一 — 86 201249871 表4-2係接續表4-1。【表4-2】_

M252Q/V308F/N434S

M252Y/V308F/M428L M252Y/V308F/N434M ""

M252Y/V308F/N434S

M252Y/Y319I

M252Q/M428L/N434S M252Y/M428L —

M25FY/N434M

M252Y/N434S

M252Y/N434A

M252Y/N434Y

S254T/V308F R255H/N434A ~

R255Q/N434S

R255H/N434S

T256V7V308F

T25CP/Q311I

T256P/1332E T^fiP/[3^PF/S44nY ~

T256P/E43QQ T256P/N434H ~ Ϊ^56Ε/Ν434Υ

T256P/S440Y

P257Y/V279Q

P257L/V279E

P257N/V279Q

P257N/V279E

P257N/V279Y

P257L/V279Q Ρ257Ν厂281S_ P257L/^281S P257N/V284E P257N/L306Y P257L/V308Y ——

P257LyV308F

P257N/V308Y

P257I/Q311I/N434H

P257L/Q3i1V

P25TL/G385N P25TL/M428L +

P257I/E430Q

P257I/N434H

P257L/N434Y

E258H/N434A E258H/N434H — —

V259i7T307Q/V308F

V259I/V3Q8F

V259I/V308F/Y319L

V259i/V308F/Y319I

V259A/V308F

V259I/V308F/N434M

V259i7V308F/N434S

V259I/V3Q8F/M428L/N434S V259I/V308F/M428L~ V259I/Y319I WT9I/V319t/N434S V259I/M428L +

V2T9I/M428L/N434S V259I/M434S 87 201249871

表4-3係接續表4-2。【表4-3】 V259I/N434Y — V264I/A330L/1332E ^ V264I/I332E P265F/N297E/I332E S267L/A327S 一 E272R7v279L V279E/V284E ^ V279Q/L306Y — V279Y/V306F — V279Q/V308F — V279Q7G385H — ^281S/V308Y ^28tS/V308F ~~ "281S/N434Y E283F/V284E ~~ V284E/V308F V284E/G385H "" K288A/N434A K288D/H435K K288V/H435D T289H/N434A T289H/N434H ^ L306I/V308F T307P/V308F T307Q/V3Q8F/N434S ^ T307Q/V308F/Y319L 一 T307S/V308F T307Q/V308F 一 T307a7e310A/N434A ~~ T307Q/E380A/N434A_ T307Q/M428L ^ T307q7N434M ^ T3Q7I/N434S ~ T307V/M434S T307Q/N434S_ T307Q/N434Y — V308T/L309P/Q311S — — V308F/L3Q9Y_ V308f7Q31 IV V308F/Y319F V308F/Y319I/N434M V308F/Y319I V308f7Y319L — V308f7y319I/M428L V308F/Y3 ί 9I/M428L/N434S V308F7Y319L/N434S ~~ V308F/I332E ~~ ^ V308F/G385H ~~ V308F/M428L/N434M V308F/M420L ~ V30BF/M428L/N434S_ V308P/N434Y V3QBF/N434M V308FVN434S V308F/M434Y Q311G/N434S ~~ Q311D/N434S Q311E/N434S Q311N/N434S 88 201249871

表4-4係接續表4-3。【表4-4】 Q311Y/N434S ^ Q3HF/N434S Q3MW/N434S _ Q311A/N434S Q311K/N434S — — ~~ Q311T/N434S _ 0311R/N434S_ 0311L/N434S — Q311M/N434S ~~ 0311V/N434S Q3111/N434S ~~ Q31WN434Y 一 D312H/N434A — D3T2H/N434H L314Q/N434S 一 L314V/N434S L314M/N434S L314F/N434S L314I/N434S —— — N315H/N434A N315H/N434H ~~ Y319I/V3D8F " ^ Y3191/M428L ^ Y319I/M428L/N434S 73191/N434M Y319I/N434S L328H/I332E — L328N/I332E L328E/I332E ~~ L328I/1332E ^ L328Q/I332E — — L328D/I332E L328R/M428L/N434S _ A330L/I332E ~~ A330Y/I332E ^ 1332E/D376V 1332E/N434S P343R/E345D ~~ D376V/E430Q D376V/E430R D376V/N434H — E380A/N434A _ G385R/Q386T/P387R/N389P G385D/Q386P/N389S N414F/Y416H M428L/N434M ~ M428L/N434S — M428L/N434A M428L/N434Y ~ ~~ II429N/N434S E430D/N434S E430T/N434S ^ E430S/N434S E43QA/N434S ^ E43QF/N434S ~~ E430Q/N434S E43QL/N434S ^QI/N434S A431T/N434S 89 201249871 表4_5係接續表4-4。【表4-5】_

A431S/N434S

A431G/N434S

A431V/N434S

A431N/N434S

A431F/N434S

A431H/N434S

L432F/N434S

L432N/N434S

L432Q/N434S

L432H/N434S

L432G/N434S

L432I/N434S

L432V/N434S

L432A/N434S

H433K/N434F

H433L/N434S

H433M/N434S

H433A/N434S

H433V/N434S

H433K/N434S

H433S/N434S

H433P/N434S

N434S/M428L

N434S/Y436D

N434S/Y436Q

N434S/Y436M

N434S/Y436G

N434S/Y436E

N434S/Y436F

N434S/Y436T

N434S/Y436R

N434S/Y436S

N434S/Y436H

N434S/Y436K

N434S/Y436L

N434S/Y436V

N434S/Y436W

N434S/Y436I

N434S/T437I 90 201249871 【表5-1】

改變體名 KD (M) feS酸改變 IgG1 ND 無 IgG1-v1 3.2E-06 M252Y/S254T/T256E IgG1-v2 8.1E-07 N434W IKG1-F3 2.5E-06 N434Y lgG1-F4 5.8E-06 N434S IgG1-F5 6.8E-06 N434A IgG1-F7 5.6E-06 M252Y IgG1-F8 4.2E-06 M252W IgG1-F9 1.4E-07 M252Y/S254T/T256E/N434Y IgG1-F10 6.9E-08 M252Y/S254T/T256E/N434W IgG1-F11 3.1E-07 M252Y/N434Y IKG1-F12 1.7E-07 M252Y/N434W IgG1-F13 3.2E-07 M252W/N434Y IrG1-F14 1.8E-07 M252W/N434W IgG1-F19 4.6E-07 P257L/N434Y IgG1-F20 4.6E-07 V308F/N434Y IgG1-F21 3.0E-08 M252Y/V308P/N434Y IgG1-F22 2.0E-06 M428L/N434S IgG1-F25 9.2E-09 M252Y/S254T/T256E/V308P/N434W IgG1-F26 1.0E-06 I332V IgG1-F27 7.4E-06 G237M IgG1-F29 1.4E-06 I332V/N434Y IsG1-F31 2.8E-06 G237M/V308F IgG1-F32 8.0E-07 S254T/N434W IgG1-F33 2.3E-06 S254T/N434Y IgG1-F34 2.8E-07 T256E/N434W IgG1-F35 8.4E-07 T256E/N434Y IgG1-F36 3.6E-07 S254T/T256E/N434W IrG1-F37 1.1E-06 S254T/T256E/N434Y IkG1-F38 1.0E-07 M252Y/S254T/N434W IgG1-F39 3.0E-07 M252Y/S254T/N434Y IgG1-F40 8.2E-08 M252Y/T256E/N434W IgG1-F41 1.5E-07 M252Y/T256E/N434Y IsG1-F42 1.0E-06 M252Y/S254T/T256E/N434A IeG1-F43 1.7E-06 M252Y/N434A IgG1-F44 1.1E-06 M252W/N434A IgG1-F47 2.4E-07 M252Y/T256Q/N434W IgG1-F48 3.2E-07 M252Y/T256Q/N434Y IgG1-F49 5.1E-07 M252F/T256D/N434W IgG1-F50 1.2E-06 M252F/T256D/N434Y IgG1-F51 8.1E-06 N434F/Y436H IgG1-F52 3.1E-06 H433K/N434F/Y436H IgG1-F53 1.0E-06 I332V/N434W IgG1-F54 8.4E-08 V308P/N434W IgG1-F56 9.4E-07 I332V/M428L/N434Y 91 201249871 表5-2係接續表5_1。【表5-2】

IgG1-F57 1.1E-05 G385D/Q386P/N389S IeG1-F58 7.7E-07 G385D/Q386P/N389S/N434W IgG1-F59 2.4E-06 G385D/Q386P/N389S/N434Y IgG1-F60 1.1E-05 G385H IgG1-F61 9.7E-07 G385H/N434W IgG1-F62 1.9E-06 G385H/N434Y IgG1-F63 2.5E-06 N434F IgG1-F64 5.3E-06 N434H IgG1-F65 2.9E-07 M252Y/S254T/T256E/N434F IgG1-F66 4.3E-07 M252Y/S254T/T256E/N434H IgG1-F67 6.3E-07 M252Y/N434F IgG1-F68 9.3E-07 M252Y/N434H IgG1-F69 5.1E-07 M428L/N434W IgG1-F70 1.5E-06 M428L/N434Y IgG1-F71 8.3E-08 M252Y/S254T/T256E/M428L/N434W IgG1-F72 2.0E-07 M252Y/S254T/T256E/M428L/N434Y IsG1-F73 1.7E-07 M252Y/M428L/N434W IgG1-F74 4.6E-07 M252Y/M428L/N434Y IgG1-F75 1.4E-06 M252Y/M428L/N434A IgG1-F76 1.0E-06 M252Y/S254T/T256E/M428L/N434A IgG1-F77 9.9E-07 T256E/M428L/N434Y IgG1-F78 7.8E-07 S254T/M428L/N434W IgG1-F79 5.9E-06 S254T/T256E/N434A IgG1-F80 2.7E-06 M252Y/T256Q/N434A IgG1-F81 1.6E-06 M252Y/T256E/N434A IgG1-F82 1.1E-06 T256Q/N434W IgG1-F83 2.6E-06 T256Q/N434Y IgG1-F84 2.8E-07 M252W/T256Q/N434W IgG1-F85 5.5E-07 M252W/T256Q/N434Y IgG1-F86 1.5E-06 S254T/T256Q/N434W IgG1-F87 4.3E-06 S254T/T256Q/N434Y IgG1-F88 1.9E-07 M252Y/S254T/T256Q/N434W IgG1-F89 3.6E-07 M252Y/S254T/T256Q/N434Y IgG1-F90 1.9E-08 M252Y/T256E/V308P/N434W IgG1-F91 4.8E-08 M252Y/V308P/M428L/N434Y IgG1-F92 1.1E-08 M252Y/S254T/T256E/V308P/M428L/N434W IgG1-F93 7.4E-07 M252W/M428L/N434W IgG1-F94 3.7E-07 P257L/M428L/N434Y IgG1-F95 2.6E-07 M252Y/S254T/T256E/M428L/N434F IgG1-F99 6.2E-07 M252Y/T256E/N434H 92 201249871 【表6 -1】

變異體名 KD (M) 胺基酸改變 IeG1 ND IgG 1 -v 1 3.2E-06 M252Y/S254T/T256E teG 1 - v2 8.1E-07 N434W IsG1_F3 2.5E-06 N434Y kG1-F4 5.8E-06 N434S IgG1-F5 6.8E-06 N434A IeG1-F7 5.6E-06 M252Y IeG1-F8 4.2E-06 M252W bG1-F9 1.4E-07 M252Y/S254T/T256E/N434Y IrG1-F10 6.9E-08 M252Y/S254T/T256E/N434W 3.1E-07 M252Y/N434Y IrG1-F12 1.7E-07 M252Y/N434W IkG1-F13 3.2E-07 M252W/N434Y lsG1-F14 1.8E-07 M252W/N434W UG1-F19 4.6E-07 P257L/N434Y IeG1-F20 4.6E-07 V308F/N434Y IffG1-F21 3.0E-08 M252Y/V308P/N434Y IgG1-F22 2.0E-06 M428L/N434S IkG1-F25 9.2E-09 M252Y/S254T/T256E/V308P/N434W IkG1-F26 1.0E-06 I332V IgG1-F27 7.4E-06 G237M ieG1-F29 1.4E-06 I332V/N434Y IeG1-F31 2.8E-06 G237M/V308F IkG1-F32 8ΌΕ-07 S254T/N434W kG1-F33 2.3E-06 S254T/N434Y IrG1-F34 2.8E-07 T256E/N434W le：G1-F35 8.4E-07 T256E/N434Y UG1-F36 3.6E-07 S254T/T256E/N434W IgG1-F37 1.1E-06 S254T/T256E/N434Y UG1-F38 1.0E-07 M252Y/S254T/N434W IeG1-F39 3.0E-07 M252Y/S254T/N434Y IeG1-F40 8.2E-08 M252Y/T256E/N434W IgG1-F41 1.5E-07 M252Y/T256E/N434Y IgG1-F42 1.0E-06 M252Y/S254T/T256E/N434A leG1-F43 1.7E-06 M252Y/N434A IgG1-F44 1.1E-06 M252W/N434A lgG1-F47 2.4E-07 M252Y/T256Q/N434W IgG1-F48 3.2E-07 M252Y/T256Q/N434Y IeG1-F49 5.1E-07 M252F/T256D/N434W !kG1-F50 1.2E-06 M252F/T256D/N434Y IkG1-F51 8.1E-06 N434FA436H IeG1-F52 3.IE-06 H433K/N434F/Y436H IeG1-F53 1.0E-06 I332V/N434W IeG1-F54 8.4E-08 V308P/N434W IffG1«F56 9.4E-07 I332V/M428L/N434Y IkG1-F57 1.1E-05 G385D/Q386P/N389S kG1-F58 7.7E-07 G385D/Q386P/N389S/N434W IkG1-F59 2.4E-06 G385D/Q386P/N389S/N434Y IkG1-F60 1.1E-05 G385H IgG1-F61 9.7E-07 G385H/N434W UG1-F62 1.9E-06 G385H./N434Y !ffG1-F63 2.5E-06 N434F IeG1-F64 5.3E-06 N434H 93 201249871 表6-2係接續表6-1。【表6-2】

IeG1-F65 2.9E-07 M252Y/S254T/T256E/N434F IeG1-F66 4.3E-07 M252Y/S254T/T256E/N434H IeG1-F67 6.3E-07 M252Y/N434F IgG1-F68 9.3E-07 M252Y/N434H IgG1-F69 5.1E-07 M428L/N434W UG1-F70 1.5E-06 M428L/N434Y IsG1-F71 8.3E-08 M252Y/S254T/T256E/M428L/N434W IeG1-F72 2.0E-07 M252Y/S254T/T256E/M428L/N434Y IeG1-F73 1.7E-07 M252Y/M428L/N434W IeG1-F74 4.6E-07 M252Y/M428L/N434Y IgG1-F75 1.4E-06 M252Y/M428L/N434A IkG1-F76 1.0E-06 M252Y/S254T/T256E/M428L/N434A IeG1-F77 9.9E-07 T256E/M428L/N434Y IgG1-F78 7.8E-07 S254T/M428L/N434W IeG1-F79 5.9E-06 S254T/T256E/N434A IeG1-F80 2.7E-06 M252Y/T256Q/N434A IgG1-F81 1.6E-06 M252Y/T256E/N434A IeG1-F82 1.1E-06 T256Q/N434W IeG1-F83 2.6E-06 T256Q/N434Y IgG1-F84 2.8E-07 M252W/T256Q/N434W IeG1-F85 5.5E-07 M252W/T256Q/N434Y IgG1-F86 1.5E-06 S254T/T256Q/N434W IeG1-F87 4.3E-06 S254T/T256Q/N434Y IsG1-F88 1.9E-07 M252Y/S254T/T256Q/N434W IgG1-F89 3.6E-07 M252Y/S254T/T256Q/N434Y IeG1-F90 1.9E-08 M252Y/T256E/V308P/N434W IgG1-F91 4.8E-08 M252Y/V308P/M428L/N434Y IeG1-F92 1.1E-08 M252Y/S254T/T256E/V308P/M428L/N434W IeG1-F93 7.4E-07 M252W/M428L/N434W IeG1-F94 3.7E-07 P257L/M428L/N434Y IeG1-F95 2.6E-07 M252Y/S254T/T256E/M428L/N434F IeG1-F99 6.2E-07 M252Y/T256E/N434H 針對該等胺基酸改變如 Drug Metab Dispos. 可使用公知技術適當實施，例 2007 Jan;35(l):86-94 、 Int

Immunol. 2006 Dec;18(12):1759-69 ' J Biol Chem. 2001 Mar 2; 276 (9):6591-604 、 J Biol Chem. 2007;282(3):1709-17 、 J Immunol. 2002;1 69(9):51 71 -80 、 J Immunol. 2009;182( 1 2): 7663-71 'Molecular Cel 1, Vol. 7, 867-877, April, 200 1 ' Nat Biotechnol. 1 997 Jul;1 5(7):637-40 ' 94 201249871

Nat Biotechnol. 2005 Oct;23(l〇):i283-8 ' Proc Natl

Acad Sci USA. 2006 Dec 5 ; 1 03(49):1 8709-14、 EP2154157 、 US20070141052 、 W02000/042072 、 W02002/060919 > W02006/020114 > W02006/03137〇 W02010/033279 、 W02006/053301 、 W02009/086320 中，係進行人類天然型IgGl之Fc區域之改變。依照 The Journal of Immunology,2009 182: 7663-7671，PH酸性域（ρΗ6·0)之人類天然型IgG1之人類

FcRn結合活性為KD 1 · 7 // Μ，於PH中性域，人類天然型 I gG 1幾乎無法檢測到人類FcRn結合活性。因此，本發明之方法使用之抗原結合分子之較佳態樣，例如在pH酸性域之人類FcRn結合活性為KD 20 μ Μ以下且於pH中性域之人類FcRn結合活性為人類天然型IgG1以上之抗原結合分子。更佳態樣為例如於pH酸性域之人類FcRn結合活性為 2. 0 /z Μ以下且於pH中性域之人類FcRn結合活性為 # Μ以下之杬原結合分子。更佳態樣例如於pH酸性域之人類FcRn結合活性為KD 0.5/zM以下且於pH中性域之人 T FcRn結合活性為KD15"m以下之抗原結合分子。亦即，且使抗原結合分子於酸丨生pH條件下之抗原結合活性低於在中性PH條件下之抗原結合活性。X，在此所示之〇値， 4糸以 m ·. 6 ournal of Immunology,2009 182: 7663-7671 去、方法（將抗原結合分子固定於晶片，而流過人類虽做分析物）測定時之値。人類FcRn結合活性之値可使用Κ])(解離定數），但由 95 201249871 :广類天然型，PH中性域(ρΗ7·4)幾乎不認為有人類 /.η結合活性，故計算⑶有所困難。就判斷於ρΗ7.4之 “員FCRn結合活性是否高於人類天'然型IgGl之方法而二，例如於Β—以相同濃度流過分析物時之結合回應姓人j斷之方法。亦即’若於ΡΗ7· 4對於固定化有抗原分子之晶片流過人類恤時之回應大過於ρΗ7·4對於疋化有人類天然丨IgG1之晶片流過人類F·時之回 ^則可判斷該抗原結合分子於ρΗ7·4之人類_結合活性鬲於人類天然型IgGl。〔H7.0也可备做pH中性域使用。中性μ藉由使用 .’可以促進人類FcRn肖FcRn結合域之弱的交互作用。就測定條件使用之、、田由 _ ’仟便用之-度而言’可於urc~5(rc之任意 ::㈣結合親和性，佳為為了決定人類FcRn結合域與二cRn之結合親和性，使用15。。~4吖之溫度。更佳為 ^ 了決u類他結合域與人類FeRn 3V 同樣使用 2〇、2i'22、23，u™、 3〇、31、32、33、34、》π。"，、、田疮— 及35 C任一由201至35t:之任意 :二貫施例5記載之2吖的此溫度’係關於本發明之態 1一例°於較佳態樣中’人類他與FcRn結合域之交 2用’可如實施例5記載，於pH7.Q及饥測定。抗原對於人類他之結合親和性，可如實施例3記載，以Biacore測定。 2。。樣中’本發明之抗原結合分子》ρΗ7· 0及起天然型人類igG為高之人類FcRn結合活 96 201249871 性。更佳態樣中，於pH7.〇及25°C之人類FcRn結合活性，係比天然型人類IgG高28倍，或強〇 3·2"Μ。更佳態樣中於ρΗ7· 0及25 C之人類FcRn結合活性，比天然型人類IgG高38倍、或強KD 2. 3 ^ M。 J 1人類IgGl、igG2、igG3、或igG4，較佳為關於 :類FcRn結合活性或活體内的結合活性，用於與抗原結合分子比較之參考天然型人類IgG用途的天然型人類，較佳為適當使用與目的之抗原結合分子含相同抗原結合域及就人類FcRn結合域含天然型人類IgG &區域之參照抗原結合分子。更佳為，天然型人類_，係用於在關於人類FcRn結合活性或活體内之結合活性與抗原結合分子比較之參照天然型人類IgG用途中使用。更具體而言’本發明記載之對於血漿中之抗原消失活 &有長期效果之抗原結合分子’係於pH7 ()及肌比起天然型人類IgGl有高28倍〜440倍之範圍之FcRn結合活性，或有KD為3.0//M至〇·2βΜ之範圍之FcRr^合活性。為了-平價本發明之抗原肖合分子對於金衆中之抗原消失活性的長期效果，長期間之血漿中抗原濃度，可測定在抗原結合分子投予2曰後、4日後、7曰後、14日後、28曰後、 56日後、或84日後，血漿中之總抗原濃度或游離抗原濃度及抗原/抗原結合分子莫耳比而決定。血漿中抗原濃度或杬原/杬原結合分子莫耳比減少是否係由於本發明記載之抗原結合分子而達成’可利用在先前記載t i或多數任意時點評價減少而決定。 97 201249871 更具體而言，本發明記裁之對於血漿中之抗原消失活性具紐期效果之抗原結合分子，係於pH7. 0及251具有比天然型人類IgG高440倍之人類FcRn結合活性、或KJ)強 0.2# Μ之FcRn結合活性。為了評價本發明之抗原結合分子對於血漿中之抗原消失活性之短期效果，短期間之血漿中抗原濃度，可於抗原結合分子投予丨5分鐘後、丨小時後、 2小時後、4小時後、8小時後、12小時後、或24小時後，藉由測疋血漿中之總抗原濃度或游離抗原濃度及抗原/抗原結合分子莫耳比而決定。本發明之方法，不拘於標的抗原種類，可適應於任意之抗原結合分子。例如：抗原結合分子係與膜抗原結合之抗體時，對於活體内投予之抗體係與抗原結合，之後抗體維持與抗原結合並與抗原一起利用内化（internal izati〇n)而攝入細胞内之核内體。之後，抗體維持與抗原結合的狀態移動到溶體，抗體與抗原一起由溶體分解。經由内化而從血漿中消失，稱為抗原依存性的消失，已有人報告許多抗體分子（Drug

Discov Today. 2006 Jan;llU-2):81-8)。1 分子之 IgG 抗體以2價結合於抗原時，1分子之抗體係以結合於2分子之抗原的狀態内化，並且維持此狀態於溶體被分解。因此，為通常之抗體時，1分子之IgG抗體無法結合於3分子以上之抗原。例如為具中和活性之1分子之IgG抗體時，無法中和3分子以上之抗原。

IgG分子之血漿中滯留性較長（消失慢），係由於已知 98 201249871 虽做IgG分子之再利用（salvage)受體的人類FcRn的作用。利用胞飲作用攝人核内體之IgG分子，在核㈣以酸性條件下會與在核内體内表現的人類以如結合。無法結合於人類FcRn之IgG分子會前進到溶體，於此被分解，但與人類FcRn結合之igG分子會移往細胞表面並於血漿中之中性條件下從人類FcRn解離，藉此再度回到血漿中。又，抗原結合分子為與可溶型抗原結合之抗體時，對於活體内投予之抗體會與抗原結合，之後抗體維持與抗原、、’=合的狀態被攝入細胞内。攝入細胞内之抗體中的多數會由FcRn而釋放到細胞外，但此時由於以維持結合於抗原之狀態釋放到細胞外，因此無法再度與抗原結合。因此，與和膜抗原結合之抗體同樣，為通常之抗體時，丄分子之抗體無法與3分子以上之抗原結合。對於抗原會在血漿中之高鈣濃度條件下強力結合，且於核内體内之低鈣濃度條件下從抗原解離之鈣濃度依存性抗原結合抗體，能於核内體内從抗原解離。鈣濃度依存性抗原結合抗體，由於將抗原解離後，抗體會利用FcRn於血漿中再循裱且能再度與抗原結合，因此丨個抗體能與多數抗原返覆結合。又，與抗原結合分子結合之抗原藉由於核内體内解離，不會於血漿中再循環，因此能促進利用抗原結合分子所為之使抗原攝入細胞内，並且促進由於抗原結 s刀子之技予所為之抗原消失，能使血漿中之抗原濃度降低0 抗原結合分子 99 201249871 本發明提供一種抗原結合分子，其包含：抗原結合域以及人類FcRn結合域’且纟2個不同之轉濃度條件下的抗原結合活性相異，抗原結合分子在低辦濃度條件下之抗原結合活性低於在高鈣濃度條件下之抗原結合活性。

本發明之抗原結合分子’只要是具有對於當做對象之抗原的專-性結合活性之抗原結合域即可，不特別限定。抗原結合域之較佳例，例如具抗體之抗原結合區之域。抗體之抗原結合區’例如⑽或可變區。抗體之抗原結合區為⑽時’也可含有全長抗體所包含之全部6個⑽，也可含1個或2個以上之⑽。就抗體之結合區而言含C])R 時’所3之CDR可進行胺基酸之缺損、取代、加成及/或插入等，又也可為CDR之一部分。又，本發明之方法中當做對象之抗原結合分子，例如具拮抗物活性之抗原結合分子(括抗物抗原結合分子）、且促效劑活性之抗原結合分子(促效劑抗原結合分子）〜胞傷害活性之分子等’但較佳態樣，例如:拮抗物抗原結：

分子，尤其認識受體或細胞激素等抗原之枯抗物抗原結；分子。 Q 本發明中’成為對象之抗原結合分子不特別限定為“抗原、。分子。本發明使用之抗原結合分子為具抗原結合活性E 、、住心原Ί σ域）與人類F cRn結合域。. 明中，尤以含有蛊人細人尽發佳 ”人類FcRn之結合域的抗原結合分子較具有抗原結合域與人類FcRn結合域之抗原結合分 100 201249871 子’例如抗體。本發明之抗體之較佳例，例如¥抗體。抗體使用IgG抗體時，其種類不限定，可使用

IgG3、IgG4等同功型(次類)之IgG。又本發明之抗原結〇刀子中可含抗體之恆定區，也可在恆定區部分導入胺基酸變異。導人之胺基酸變異，例如：對於Fc^纟體之結合增大或減低者（Proc Natl Acad Sci u s Α· 2〇〇6 I 14;103(ll):4〇〇5-l〇.)等，但不限於該等。又藉由適當選擇IgG2等適當恆定區，能使pH依存性結合變化。本發明當做對象之抗原結合分子為抗體時，抗體可為小鼠抗體、人類抗體、大鼠抗體、兔抗體、山羊抗體、駱駝抗體等之類的動物來源之抗體。再者，例如嵌合抗體，其中人類化抗體等將胺基酸序列取代而得之改變抗體亦可。又，也可為二種專一性抗體、使各種分子結合成之抗體修飾物、含抗體片段之多胜肽等。「嵌合抗體」，係指組合不同動物來源的序列而製作之抗體。嵌合抗體之具體例，例如：由小鼠抗體之重鏈、輕鏈之可變（V)區與人類抗體之重鏈、輕鏈之固定（c)區構成的抗體。人類化抗體」，也稱為再構成（reshaped)人類抗體，係將人類以外之哺乳動物來源之抗體，例如小鼠抗體之互補性決定區（CDR;complementarity determining regi〇n) 移植到人類抗體之CDR者。用於鑑定CDR之方法為公知 (Rabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987)， National Institute of Health, 101 201249871

Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877)。又，其一般的基因重組方法亦為公知（參照歐洲專利申请案公開編號EP 1 25023號公報、w〇 96/02576號公報）。雙專一性抗體，係指在同一抗體分子内具有認識不同抗原決定基之可變區的抗體。二種專一性抗體可為認識2 種以上不同抗原之抗體，也可為認識同一抗原上之不同的 2個以上之抗原決定基之抗體。又’含抗體片段之多胜肽，例如：Fab片段、F(ab，）2 片 ^又、 scFv(Nat Biotechnol. 2005

Sep;23(9):1 1 26-36. )domain antibody(dAb)(W02004/058821, W02003/002609)、 scFv-Fc(W02005/037989)、dAb-Fc、Fc 融合蛋白質等。含

Fc區域之分子可將Fc區域當做人類FcRn結合域使用。又，該等分子可以融合人類FcRn結合域。再者’本發明能適用之抗原結合分子，也可為抗體狀分子。抗體狀分子（scaffold分子、胜肽分子），係指藉由與標靶分子結合而發揮機能之分子（Current Opinion in Biotechnology 2006, 17:653-658 ' Current Opinion in Biotechnology 2007， 18:1-10 ' Current Opinion in

Structural Biology 1997， 7:463-469、 Protein Science 2006， 15:14-27)，例如：DARPins(W02002/020565)、

Affibody(W0199 5/001 937) 、 Avimer(W02004/04401 1, W02005/040229)、Adnectin(W02002/032925)等。即使是該等抗體狀分子，也能對於標的分子以鈣濃度依存性結合， 102 201249871 促進由於抗原結合分子所致抗原攝入細胞内，促進由於抗原結合分子之投予所致血漿中之抗原濃度減少、並改善抗原結合分子之血漿中滯留性、增加1個抗原結合分子所致對於抗原之結合次數增加。又’抗原結合分子’也可為與標的結合之受體蛋白質融合有人類FcRn結合域之蛋白質，例如：TNFR-Fc融合蛋白貝、IL1R-Fc融合蛋白質、VEGFR-Fc融合蛋白質、 CTLA4-Fc 融合蛋白質等（Nat Med. 2003 Jan;9(1):47-52、

BioDrugs. 2006;20(3):15卜60·)。該等為受體人類 FcRn 結合域之融合蛋白質，也能對於標的分子以鈣濃度依存性結合’並且促進由於抗原結合分子所致抗原攝入細胞内，並促進由於抗原結合分子之投予所致血漿中之抗原濃度減少、並改善抗原結合分子之血漿中滯留性、增加1個抗原結合分子對於抗原之結合次數。又’抗原結合分子也可為與標的結合具中和效果之人工配體蛋白質與人類FcRn結合域之融合蛋白質，例如：人工配體蛋白質’例如變異IL-6CEMB0 J. 1 994 Dec 15;13( 24 ):5863-70.)等。該等人工配體融合蛋白質也能對於標的分子以鈣濃度依存性的結合，並促進抗原結合分子所致抗原攝入細胞内、促進由於抗原結合分子之投予所致血漿中之抗原濃度減少、改善抗原結合分子之血漿中滯留性、增加1個抗原結合分子對於抗原之結合次數。再者’本發明之抗體也可有糖鏈改變。糖鏈經改變之抗體之例’例如：糖化經修飾之抗體（W099/54342等）、對 103 201249871 於糖鏈加成的岩藻糖缺損之抗體（W〇〇〇/6i739、 W002/31 140、WO2006/067847 ' W02006/067913 等）、具有有二等分GlcNAc之糖鏈的抗體（W002/79255等）等。測定對於抗原之結合活性時，離子化鈣濃度以外之條件’可由該技術領域之人士適當選擇，不特別限定。例如可於HEPES緩衝液、37°C之條件測定。例如可使用 Biacore(GE Healthcare)等測定。抗原結合分子與抗原之結合活性之測定，於抗原為可溶型抗原時，可藉由於固定化有抗原結合分子之晶片’使抗原當做分析物流過，而評 Ί貝對於可浴型抗原之結合活性’抗原為膜型抗原時，可藉由於固定化有抗原之晶片’使抗原結合分子當做分析物而流過，以評價對於膜型抗原之結合活性。本發明之抗原結合分子中，只要在低鈣濃度條件下之抗原結合活性弱於在高鈣濃度條件下之抗原結合活性，則在低鈣濃度條件下之抗原結合活性與於高鈣濃度條件下之抗原結合活性之比不特別限定，較佳為對於抗原在低鈣濃度條件下之KD(Dissociation constant:解離常數）與高鈣/辰度條件下之KD之比KD(Ca 3//M)/KD(Ca 2 mM)之値為 2以上，更佳為KD(Ca 3/zM)/KD(Ca 2 mM)之値為10以上，又更佳為KD(Ca M)/KD(Ca 2 mM)之値為40以上。KD(Ca 3//M)/KD(Ca 2 mM)之値之上限不特別限定，只要是該技術領域之人士之技術能製作，可為4〇〇、1〇〇〇、1〇〇〇〇等各種値。就抗原結合活性之値而言，於抗原為可溶型抗原時， 104 201249871 可使用KD(解離常數），抗原為膜型抗原時，可使用視 KD( Apparent dissociation constant:視解離常數解離常數）、及、視KD(視解離常數），可利用該技術領域之人士公知之方法測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、Scat chard作圖法、流式細胞計數儀等。又’本發明之抗原結合分子中’代表在低鈣濃度條件下之抗原結合活性與於高鈣濃度條件下之抗原結合活性之比的另一指標，例如可使用解離速度常數kd(Dissociati⑽ rate constant :解離速度常數）。代表結合活性之比之指標’使用kd(解離速度常數）代替kd(解離常數）時，對於抗原在低鈣濃度條件下之kd(解離速度常數）與高鈣濃度條件下之kd(解離速度常數）之比kd(低鈣濃度條件下）/kd(高鈣濃度條件下）之値，較佳為2以上，更佳為5以上，更佳為 10以上，又更佳為30以上。kd(低鈣濃度條件下）/kd(高鈣濃度條件下）之値之上限不特別限定，只要該技術領域之人士之技術常識能製作，可為5〇、1〇〇、2〇〇等各種値。抗原結合活性之値，於抗原為可溶型抗原時可使用 kd(解離速度常數），於抗原為膜型抗原時，可使用視 kd(Apparent dissociation rate constant:視解離速度书數）°kd (解離速度常數）、及視kd (視解離速度常數），可以由該技術領域之人士公知之方法測定，例如可使用

Biacore(GE healthcare)、流式細胞計數儀等。又’本發明t，測定不同@濃度之抗原結合分子之抗原結合活性時，鈣濃度以外之條件宜為相同。 105 201249871 叙冰為了獲仵在低鈣濃度條件下之抗原結合活性低於在高 ’:艰度條件下之抗原結合活性之抗原結合分子，使抗原结 :分子在㈣濃度條件下之抗原結合活性低於在高約濃度條件下之抗原結性（減弱）之方法（賦予鈣濃度依存性原結合活性之方法），不特別限定。在㈣濃度條件下之抗原結合活性低於高㈣度條件下之抗原結合活性（較弱）之抗原結合分子（顯示鈣濃度依存性結扑例™於體外（ιηνι⑽呈現的抗二二述對於抗原之齊濃度依存性結合為指標進行筛選，而直接取得。他方法例如有直接取得具有如此性質之抗原結合分子之方法。例如:將對於動物(小鼠、大鼠、倉鼠、兔、人類免疫球蛋白基因轉殖小鼠、人類免疫球蛋白基因轉殖大鼠、人類免疫球蛋白基因轉殖兔、羊轮、路轮等）以抗原進行免疫而得之抗體，以對於抗原之辦濃度依存性結合為指標進行筛選’直接去得具目的性質之抗體亦可。又也可對於抗原結合分子令之胺基酸序列導入無規變異，依照上述方法’測定於不同飼濃度條件下之抗原結合分子之抗原結合活性’並與改變前之抗原結合分子比較，選擇在低約濃度條件下之抗原結合活性比起於高弼濃度條件下之抗原結合活性為低者。依照上述方法等，使抗原結合分子在低鈣濃度條件下之抗原結合活性低於在高㈣度條件下之抗原結合活性 (減弱）（KD(低鈣濃度條件下）/〇(高鈣濃度條件下）之値增 106 201249871 大）時，不特別限宁 ^ 疋，較佳為與以KD(低鈣濃度條下）/KD(高鈣濃度條俥π w # 掀件、件下）之値比起原本之抗體，通常以上’較佳為5倍以上，更佳為1〇倍以上者。倍再者，本發明之職予妈濃度依存性抗原結合活性之方法’可藉由使用於中性PH具人類FcRn結合活性之抗原辞合分子、或於中性絲工，η 、 PH賦予人類FcRn結合活性或提高之方法予以組合，而能増強促進抗原攝人細胞内之機能、增加 1分子之抗原結合分子對於抗原之結合次數之機能、促進，於抗原結合分子之投予所致血漿中之抗原濃度減少之機能、或改善抗原結合分子之血衆中滯留性之機能。賦予或提高於中性PH之人類⑽結合活性之方法，例如:改變上述人類FcRn結合域之胺基酸之方法。在此，「中性邱之人類FcRn結合活性」，係指於PH6. 7〜pH1 〇· 〇對於人類FcRn 之結合活性’較佳之人類FcRn結合活性，例如pH7 ()〜pH8.〇之間之人類FcRn結合活性’更佳之人類FcRn結合活性，例如於PH7. 4之人類FcRn結合活性。又，本發明之賦予鈣濃度依存性抗原結合活性之方 =可藉由組合使用在具邱依存性抗原結合活性之抗原結合分子、或促進pH依存性抗原結合活性之方法，而增強促進抗原攝入細胞内之機能、增加i分子之抗原結合分子對於抗原之結合次數之機能、促進由於抗原結合分子之投予減v血名中之抗原濃度之機能、或改善抗原結合分子之血漿中滯留性之機能。賦予pH依存性抗原結合活性之方法，例如：WO20〇9/125825記載之方法。 107 201249871 具體而言，例如可以組合對於本發明之鈣濃度依存性抗原結合分子，使抗原結合分子於酸性ρί{之抗原結合活性低於中性pH之抗原結合活性（減弱）之方法。在此，「酸性 pH中之抗原結合活性低於中性pH之抗原結合活性（減弱）j ’係指抗原結合分子於PH4. 0〜ρΗ6· 5之抗原結合活性弱於pH6 _ 7〜pH 1 0 · 0之抗原結合活性。較佳為抗原結合分子於pH5. 5〜pH6. 5之抗原結合活性弱於pH7. 0〜pH8. 0之抗原結合活性’尤佳為抗原結合分子於PH5 · 8之抗原結合活性弱於在pH7. 4之抗原結合活性。本發明中，酸性pH通常為卩114.0〜？{16.5’較佳為？115.5〜？116.5，尤佳為？115.8。又、本發明中’中性pH通常為ρΗ6· 7〜ρΗ10· 0，較佳為 pH7. 0〜pH8. 0，尤佳為 pH7. 4。又，抗原結合分子之「於酸性pH之抗原結合活性低於中性pH之k原結合活性」，也可表達為抗原結合分子於中性之抗原結合活性高於酸性之pH中的抗原結合活性。亦即，本發明中，抗原結合分子於酸性pH之抗原結合活性與中性pH之抗原結合活性之差可增大即可（例如如後述， KD(pH5. 8)/KD(pH7. 4)之値增大即可）。為了使抗原結合分子於酸性pH之抗原結合活性與中性pH之抗原結合活性之差加大，例如可減低於酸性pH之抗原結合活性，也可增大於中性p Η之抗原結合活性，或兩者。本發明中’酸性PH之抗原結合活性只要弱於中性ρΗ 之杬原結合活性，則酸性ρΗ之抗原結合活性與中性之抗原結合活性之差不特別限定，較佳為對於抗原於8 108 201249871 之 KD 與於 ρΗ7·4 之 KD(Dissociation constant :解離常數）之比KD(pH5.8)/KD(pH7.4)之値為2以上，更佳為 KD(pH5. 8)/KD(pH7. 4)之値為10以上，又更佳為 KD(pH5.8)/KD(pH7.4)之値為 4〇以上。 KD(pH5. 8)/KD(pH7. 4)之値之上限不特別限定，只要該技術領域之人士之技術能製作，可為400、1〇〇〇、1〇〇〇〇等各種値。又’代表酸性pH之抗原結合活性與中性pH之抗原結合活性之差之其他指標，例如也可使用解離速度常數 kd(Di ssociat ion rate constant :解離速度常數）。代表結合活性之差之指標，當使用kd(解離速度常數）代替KD(解離常數）時’對於抗原於PH5. 8之kd(解離速度常數）與於 PH7.4之kd(解離速度常數）之比kd(pH5.8)/kd(pH7_4)之値，較佳為2以上，更佳為5以上，又更佳為以上，再更佳為30以上。kd(pH5. 8)/kd(pH7. 4)之値之上限不特別限定，只要該技術領域之人士之技術常識能製作，可為5〇、 100、200等任意値。賦予pH依存性抗原結合活性之方法不特別限定，例如將抗原結合分子中至少1個胺基酸取代為組胺酸、或在抗原結合分子中插入至少1個組胺酸，而使PH5. 8之抗原結 5活f生弱於pH7. 4之抗原結合活性之方法。藉由將抗體中之胺基酸以組胺酸取代，能對於抗體賦予pH依存性之抗原 ° /舌性’係為已知（febs Letter, 309( 1 )， 85-88, 9 2))。本發明中’對於抗原結合分子導入（進行）組胺酸 109 201249871 變異（取代）或插入之位置不特別限定’只要與變異或插入前相比較’於PH5. 8之抗原結合活性弱於ρΗ7· 4之抗原結合活性（KD(pH5.8)/KD(pH7.4)之値增大）即可，可在任旁部位。例如：抗原結合分子為抗體時’例如抗體之可變區等。導入（進行）組胺酸變異或插入之數目可由該技術領域之人士適當決定’可僅將1處以組胺酸取代，或僅於丨處插入組胺酸，也可將2處以上之多數處以組胺酸取代，或於2處以上之多數處插入組胺酸。又’也可同時導入組胺酸變異以外之變異（變異為組胺酸以外之胺基酸）。再者，也可同時進行組胺酸變異與組胺酸插入。取代為組胺酸或組胺酸之插入可利用該技術領域之人士公知之丙胺酸掃描之丙胺酸取代為組胺酸之組胺酸掃描等方法無規進行也可於無規導入有組胺酸變異或插入之抗原結合分子庫中，選擇比起變異前之KD(PH5.8)/KD(PH7.4)之値增大之抗原結合分子。對於抗原結合分子，將至少丨個胺基酸取代為組胺商文、或於抗原結合分子胺基酸插入至少1個組胺酸時，不特別限定’但以組胺酸取代或插入後之抗原結合分子於 p Η 7. 4之抗原結合活性與組胺酸取代或插入前之抗原結合分子於ρΗ7· 4之抗原結合活性為同等較佳。在此，組胺酸取代或插入後之抗原結合分子於pH?· 4之抗原結合活性，與組胺酸取代或插入前之抗原結合分子於ρΗ7. 4之抗原結合活性為同等，係指組胺酸取代或插入後之抗原結合分子，維持組胺酸取代或插入前之抗原結合分子所具有之抗 110 201249871 原結合活性之10%以上，較佳為50%以上，更佳為8〇%以上，更佳為90%以上。由於組胺酸取代或插入造成抗原結合分子之抗原結合活性減低時，可藉由抗原結合分子中之1或多數胺基酸之取代、缺損、加成及/或插入等，使得抗原結合活性與組胺酸取代或插入前之抗原結合活性為同等。本發明中也包含如此的組胺酸取代或插入後藉由進行1或多數胺基酸之取代、缺損、加成及/或插入使得結合活性成為同等之抗原結合分子。又’使抗原結合分子於PH5. 8之抗原結合活性弱於 ρΗ7· 4之抗原結合活性之其他方法，例如將抗原結合分子中之胺基酸取代為非天然型胺基酸之方法、或於抗原結合分子中之胺基酸插入非天然型胺基酸之方法。非天然胺基酸已知能夠人為控制 pKa(Angew. Chem. Int. Ed. 2005，44 34 ^ Chem Soc Rev. 2004 Sep 10 ; 33(7) ：422-30. > Amino Acids. 1 999; 1 6(3-4): 345-79.)。因此本發明中，可將非天然型胺基酸代替上述組胺酸。又，上述組胺酸取代及/ 或插入，與非天然型胺基酸之取代及/或插入，也可同時進行。本發明使用之非天然型胺基酸’可為任意非天然型胺基酸，可使用對於該技術領域之人士為公知之非天然型胺基酸等。再者，抗原結合分子包含抗體悝定區日寺，使抗原結合分子於PH5.8之抗原結合活性弱於肌4之抗原結合活性之另-方法，例如改變抗原結合分子所包含之抗體恨定區之方法。如此的抗體恆定區之改變之具體例，例如 111 201249871 W02009/125825記載之取代恆定區之方法。又’抗體恆定區之改變方法，例如：探討多數恆定區之同功型（IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)，並選擇ρΗ5· 8之抗原結合活性降低之（ΡΗ5. 8之解離速度加快）之同功型之方法。再者，藉由對於野生型同功型之胺基酸序列（野生型

IgGl、IgG2、IgG3、IgG4胺基酸序列）導入胺基酸取代，使ρΗ5· 8之抗原結合活性降低（pjj5. 8之解離速度加快）之方法。由於同功型（igG1、IgG2、IgG3、IgG4)，使抗體恆定區之鉸鏈區之序列大幅不同，鉸鏈區之胺基酸序列之不同會大大地影響抗原結合活性，因此依抗原或抗原決定基之種類選擇適當的同功型，可選擇於pH5. 8之抗原結合活性降低（PH5. 8之解離速度加速）的同功型。又，鉸鏈區之胺基酸序列之差異會大大地影響抗原結合活性，因此野生型同功型之胺基酸序列之胺基酸取代處據認為以鉸鏈區為理想。依照上述方法等，當抗原結合物質於pH5. 8之抗原結 σ活I·生弱於ΡΗ7· 4之抗原結合活性（KD(pH5. 8)/KD(pH7. 4) 之値增大）時’不特別限定’但kd(pH5.8)/kd(pH7 4)之値比起原本的抗體，通常為2倍以上，較佳為5倍以上，更佳為1 0倍以上較佳。抗原結合分子再者，本發明提供一種抗原結合分子其於2種不同的妈濃度條件下的抗原結合活性不同，在低㈣度條件下之抗原結合活性低於高㈣度條件下之抗原結合活性。本 112 201249871 發明較佳為提供一種抗原結合分子，其於離子化與濃度〇. 1 A Μ〜3 0 // Μ之低鈣濃度條件下之抗原結合活性，低於離子化鈣濃度100# Μ〜10 mM之高鈣濃度條件下之抗原結合活陡更具體而s ’於活體内之早期核内體内之離子化I弓濃度（低鈣濃度’例如1# Μ〜5# M)的抗原結合活性低於活體内之血漿中之離子化鈣濃度（高鈣濃度，例如〇 5mM〜25mM) 之抗原結合活性的抗原結合分子。本發明之在低鈣濃度條件下之抗原結合活性低於在高詞濃度條件下之抗原結合活性的抗原結合分子，只要是在低鈣濃度條件下之抗原結合活性低於高鈣濃度條件下之抗原結合活性即可，其結合活性之差不限定，只要在低鈣濃度條件下之抗原結合活性稍低即可。本發明之在低鈣濃度條件下之抗原結合活性低於在高約》辰度條件下之抗原結合活性之抗原結合分子之較彳土，離、樣，係在低鈣濃度條件下之KD與高鈣濃度條件下之KD之比KD(低Ca)/KD(高Ca)之値為2以上’更佳為Κ])(低 Ca)/KD(高Ca)之値為1〇以上，更佳為KD(低Ca)/KD(高k) 之値為40以上。KD(低Ca)/KD(高Ca)之値之上限不特別限定，只要是該技術領域之人士之技術能製作，可為4⑽、 1 000、10000等任意值。再者，本發明之在低鈣濃度條件下之抗原結合活性低於在高鈣濃度條件下之抗原結合活性之抗原結合分子之其他較佳態樣，係對於抗原在低鈣濃度條件下之匕與之之比kd(低Ca)/kd(高Ca)之値為2以上，更佳為kd(低 113 201249871

Ca)/kdUCa)之値為5以上，更佳為W低Ca)/kd(高Ca) 之値為1〇以上’更佳為kd(低Ca)/kd(高⑷之値為3〇以上。kd(低Ca)/kd(高Ca)之値之上限不特別限定，只要是該技術領域之人士之技術能製作即可，可為5q、H挪等任意値。本發明之抗原結合分子’可更具有於上述中性pH條件下之人類FcRn結合活性。藉由組合該中性pH條件下之人類FcRn結合活性、與鈣濃度依存性抗原結合活性可增強促進抗原攝入細胞内之機能、增加i分子之抗原結合：子對於抗原之結合次數之機能、促進由於抗原結合分子之投予所致金聚中之抗原濃度減少之機能、或改善抗原結合分子之血漿中滞留性之機能。又，本發明之抗原結合分子，也可更具有上述pH依存性抗原結合活性，亦即於酸性pH條件下之抗原結合活性低於中性pH條件下之抗原結合活性之抗原結合活性。藉由組合該PH依存性抗原結合活性、與鈣濃度依存性抗原結合活性，能增加促進抗原攝入細胞内之機能、促進1分子之抗原結合分子結合於抗原之結合次數之機能、促進抗原結合分子之投予所致血漿中之抗原濃度減少之機能、或改善抗原結合分子之血漿中滯留性之機能。又，本發明之抗原結合分子只要在低鈣濃度條件下之抗原結合活性低於在高鈣濃度條件下之抗原結合活性即可，可具有其他任何性質，例如促效劑抗原結合分子或拮抗物抗原結合分子等。本發明之較佳抗原結合分子，例如 114 201249871 拮抗物抗原結合分子。拮抗物抗原結合分子通常為抑制配體（促效劑）與受體之結合，並且 ^ ^ 列，主田又體之對於細胞内之信號傳遞之抗原結合分子。、又’已賦予pH依存性抗原結合活性之抗原結合分子，可以有至少、1個胺基酸以組胺酸取代，或插入有至少丄個組胺酸。 —又’本發明之抗原結合分子所結合之抗原不特別限定：可結合於任意抗原。例如:受體蛋白質(膜結合型受體、 :溶型受體)或細胞表面標記等膜抗原、細胞激素等可溶型抗原等。其他抗原之具體例如上述。篩選方法本發月供碑選抗原結合分子在低弼濃度條件下之抗原二活性低於在高飼濃度條件下之抗原結合活性之抗原結 :刀子之方法。又，提供—種抗原結合分子之篩選方法， °亥抗原結合分子係具有從以下選出的至少1種機能： (i)促進抗原攝入細胞内之機能、 (i i)對於抗原結合2次以上之機能、 (iii) 促進血漿中之抗原濃度減少之機能，及 (iv) 優異之血漿中滯留性機能。、具體而言，本發明提供一種抗原結合分子之筛選方法，其係包含以下步驟（a)〜（c” (a)獲得低鈣濃度條件下之抗原結合分子之抗原結合活性、 (b)獲得高鈣濃度條件下之抗原結合分子之抗原結合 115 201249871 活性、 (c)選擇在低鈣濃度條件下之抗原結舍活性低於在高妈濃度條件下之抗原結合活性之抗原結合分子。再者，本發明提供一種抗原結合分子之请選方法’係包含以下步驟（a)~(c); (a) 於高鈣濃度條件下使抗原結合分孑或抗原結合分子庫接觸抗原、 (b) 將於前述步驟（a)與抗原結合之抗原結合分子置在低鈣濃度條件下、 (c) 取得於前述步驟解離之抗原結合分子。再者，本發明提供一種抗原結合分子之篩選方法，係包含以下步驟（a)~(d); (a) 在低鈣濃度條件下使抗原結合分子或抗原結合分子庫接觸抗原、 (b) 選擇於前述步驟（a)未結合於抗原之抗原結合分子、 (c) 使前述步驟（b)選擇之抗原結合分子於高鈣濃度條件下與抗原結合、 (d) 取得於前述步驟（<：)與抗原結合之抗原結合分子。再者’本發明提供一種抗原結合分子之篩選方法，係包含以下步驟（a)〜（c); (a) 使固定有抗原之管柱，於高鈣濃度條件下接觸抗原結合分子或抗原結合分子庫、 (b) 使於前述步驟（a)與管柱結合之抗原結合分子在 116 201249871 低鈣濃度條件下從管杈溶出、 (c)取得前述步驟（b)溶出之抗原結合分子。又，本發明提供—種抗原結合分子之篩選方法，係包含以下步驟（a)〜U); (a) 在低飼濃度條件下使抗原結合分子或抗原結合分子庫通過固定有抗原之管柱、 (b) 將於前述步驟（a)未結合於管枉而溶出之抗原結合分子回收、 (C)使於前述步驟（b)回收之抗原結合分子於高鈣濃度條件下與抗原結合、 (d)取得於前述步驟（c)與抗原結合之抗原結合分子。再者，本發明提供—種抗原結合分子之篩選方法，係包含以下步驟（a)〜（d); (a)於阿鈣/辰度條件下使抗原結合分子或抗原結合分子庫接觸抗原、 (b) (c) 度條件下 :於前述步驟⑷與抗原結合之抗原結合分子、述步驟(b)取得之抗原結合分子置在低鈣濃 (d)取得前述步驟（㈣则之基準為弱之抗原::;;。活性比起於前述步又，該等步驟可以返覆2 如上述㈣方法1包含返因此，本發明提供次以上之牛驟 a c)或（a)〜（d)之步驟2 λ上之步驟。（a)〜（c)或（㈧別限定，通常為1〇次以内。步驟返覆的次數不特 117 201249871 本發明之筛選方法中，低詞濃度條件下之抗原結合分子之抗原結合活性，只要是離子化約濃度為〇1终3〇“ 之間之抗原結合活性即可，不特別限定、較佳之離子化辦濃度，例如0.5/zM〜10//M之間之抗原結合活性。更佳之離子化鈣濃度，例如活體内之早期核内體内之離子化鈣濃度，具體而言例如1 V M〜5 // Μ之抗原結合活性。又，於高鈣濃度條件下之抗原結合分子之抗原結合活性，只要是離子化鈣濃度為100 # Μ〜10 raM之間之抗原結合活性即不特別限定，較佳之離子化鈣濃度，例如2〇〇以M〜5 mM之間之抗原結合活性。更佳之離子化鈣濃度，例如於活體内之血漿中之離子化鈣濃度，具體而言，例如0.5 mM〜2.5 mM之抗原結合活性。抗原結合分子之抗原結合活性，可依照該技術領域之人士所公知之方法測定，針對離子化鈣濃度以外之條件，可由該技術領域之人士適當決定。抗原結合分子之抗原結合活性，可就KD(Dissociation constant :解離常數）、視 KD(Apparent dissociation constant :視解離常數）、解離速度ko(Dissociation rate:解離速度常數）、或視 kd(Apparent dissociation :視解離速度常數）等評價。該等可由該技術領域之人士公知之方法測定，例如可使用

Biacore (GE healthcare)、Scatchard 作圖法、FACS 等。本發明中’選擇於高鈣濃度條件下之抗原結合活性高在低鈣濃度條件下之抗原結合活性之抗原結合分子之步驟，與選擇在低鈣濃度條件下之抗原結合活性低於在高弼 118 201249871 濃度條件下之抗原含意。結合活性之抗原結合分子之步驟為相同只要於南約濃度條件下度條件下之抗原結合活性，合活性與在低鈣濃度條件下定’較佳為於高鈣濃度條件度條件下之抗原結合活性之又更佳為40倍以上。之抗原結合活性高於在低鈣濃則於高妈濃度條件下之抗原結之抗原結合活性之差不特別限下之抗原結合活性為在低約濃 2倍以上，更佳為1〇倍以上，依照本發明之篩選方法篩選之抗原結合分子可為任竟抗原結合分子，例如可篩選上述抗原結合分子。例如·可篩選具天S序列之抗原結合分子’也可_選胺基酸序列經取代之抗原結合分子。本發明之篩選方法所篩選之抗原結合分子可以任音方法製備，例如:可使用預先已存在的抗體、預先已存在：庫 (嗤菌體庫等）、對於動物免疫獲得之融合瘤或從免疫動物之B細胞製作之抗體或庫、對於該等抗體或庫導入可螯合鈣之胺基酸（例如天冬胺酸或麩胺酸）或導入有非天然胺基酸變異之抗體或庫（可螯合鈣之胺基酸（例如天冬胺酸或麩胺酸）或提高非天然胺基酸之含有率之庫或於特定處有可螯合鈣之胺基酸（例如天冬胺酸或麩胺酸）或導入有非天然胺基酸變異之庫等）等。依照本發明之篩選方法，可獲得當對於人類、小鼠、猴等動物投予時，具有選自於以下當中至幻種機能^抗原結合分子： 119 201249871 (i )促進抗原攝入細胞内之機能、 (i i )對於抗原結合2次以上之機能' (i i i)促進血漿中之抗原濃度減少之機能、及 (1 v )優異之血漿中滯留性機能。因此本發明之篩選方法，可當做能篩選具有該等機能中至少1種機能之抗原結合分子的篩選方法。又’依照本發明之篩選方法獲得之該等抗原結合分子’可以減少對患者之投予量或投予頻度，結果能減少總才又予$ 所以可S忍為當做醫藥品特別優異。因此，本發明之碑選方法可當做篩選用於當做醫藥組成物之抗原結合分子之篩選方法。抗原結合分子之製造方法本發明提供製造抗原結合分子在低鈣濃度條件下之抗原結合活性低於在高鈣濃度條件下之抗原結合活性之抗原結合分子之製造方法。又本發明提供—種抗原結合分子之製造方法’該抗原結合分子具有選自於以下之至少1種機能： (i )促進抗原攝入細胞内之機能、 (i i)對於抗原結合2次以上之機能、 (11 Ο促進血漿中之抗原濃度減少之機能、及、 (iv)優異之血漿中滯留性機能。具體而言，本發明提供一種抗原結合分子之製造方法’係包含以下步驟（a )〜（e ); (a)獲得在低鈣濃度條件下之抗原結合分孑之抗原結 12〇 201249871 合活性、獲件於高鈣濃度條件下之抗原結合分子之抗原結合活性、擇在低弼濃度條件下之抗原結合活性低於在高下之抗原結合活性之抗原結合分子、 (C)選鈣濃度條件基因⑷取得編碼為前述步驟(c)選擇之抗原結合分子之 IN使用前述步驟（d)獲得之基因產生抗原結合分子。又本發明提供-種抗原結合分子之製造方法，係包含以下步驟（aMe); (a) 於向約濃度條件下使抗原結合分子或抗原結合分子庫接觸抗原、 (b) 將前述步驟（a)與抗原結合之抗原結合分子置在低鈣濃度條件下、 (〇取得於前述步驟（1〇解離之抗原結合分子' (d) 獲得編碼為前述步驟（c)取得之抗原結合分子之基因、 (e) 使用前述步驟（d)獲得之基因產生抗原結合分子。又，（a)〜（d)之步驟也可返覆2次以上。因此，本發明提供如上述方法’1包含返覆⑷〜⑷之步驟2次以上之步

驟。（aMd)之步驟之返覆次數不特別限定，通常為ι〇次以内D 又，本發明提供一種抗原結合分子之製造方法，係包含以下步驟（a)〜（f); 121 201249871 (a)在低鈣濃度條件午下使杬原結合分子或抗原結合分子庫與抗原接觸、子 ⑻選擇於前述步驟⑷未與抗原結合之抗原結合分 (c)使於前述步驟 4 7驟（b)選擇之抗原結合分子於高度條件下與抗原接觸、鈣濃基因 ⑷取得於前述步驟(C)與抗原結合之抗原結合分子、 (e)獲得編碼為前述步驟⑷取得之抗原結合分子之 ⑴使用m述步驟（e)獲得之基因產生抗原結合分子。曰又’（a)〜(e)之步驟也可返覆2次以上。因此本發明提供如上述方法，更包合峨〆、，匕3返覆（a)~(e)之步驟2次以上之步的返覆次數不特別限定，通常為1 〇次以内再者本發明提供_種抗原結合分子之製^ n 包含以下步驟（a)〜（e); ” (a)於南鈣濃度條件下使抗原子庫接觸固定有抗原之管柱、低钙(二使於别述步驟U)與管柱結合之抗原結合分子在低妈)辰度條件下從管柱溶出、在 )取知於則述步驟（b)溶出之抗原結合分子、美因獲侍編碼為前述步驟（c)取得之抗原結合分子之結合分子或抗原結合分 (e 使用前述步驟（d)獲得之基因產生抗原結合分子 122 201249871 又，（a)〜（d)之步驟也可返覆2次以上。因此，本發明曰、如上述方法，更包含返覆（a)〜（d)之步驟2次以上之步驟。（a)〜（d)之步驟的返覆次數不特別限定，通常為1〇次以内。又，本發明提供一種抗原結合分子之製造方法，係包含以下步驟（a)〜（f); ⑷在低妈濃度條件下使抗原結合分子或抗原結合分子庫通過固定有抗原之管柱、 (b) 將於則述步驟未與管柱結合而溶出之抗原結合分子回收、 (c) 使於前述步驟（b)回收之抗原結合分子於高鈣濃度條件下與抗原結合、 (d) 取得於前述步驟（c)與抗原結合之抗原結合分子、 (e) 獲得編碼為前述步驟（d)取得之抗原結合分子的基因、 ⑴使用前述步驟（e)獲得之基因產生抗原結合分子。又，⑷〜（e)之步驟也可返t2次以上。因此，本發明提供如上述方法，更包含返覆⑷〜⑷之步驟2次以上之步驟。（a)〜（e)之步驟的返覆次數不特別限定，通常為次以内。又，本發明提供一種抗原結合分子之製造方法，係包含以下步驟（a)〜（f); ⑷^高每濃度條件下使抗原結合分子或抗原結合分子庫接觸抗原、 123 201249871 (b) 取得於前述步驟u)與抗原結合之抗原結合分子、 (c) 將則述步驟（b)取得之抗原結合分子置在低鈣濃度條件下、 )取知刚述步驟（c)中抗原結合活性弱於前述步驟 (b)選擇之基準的抗原結合分子、 (e) 獲彳于編碼為前述步驟取得之抗原結合分子之基因、 (f) 使用前述步驟（e)獲得之基因產生抗原結合分子。又’（a)〜（e)之步驟也可返覆2次以上。因此，本發明提供如上述方法，更包含返覆（a)〜（e)之步驟2次以上之步驟。u)〜（e)之步驟的返覆次數不特別限定，通常為1〇次以内。 ,本發明之製造方法使用之抗原結合分子可以任意方法二備例如：可使用預先已存在的抗體、預先已存在之庫（噬

菌體庫等）、對於動物免疫獲得之融合瘤或從免疫動物之B 細胞製作之抗體或庫、對於該等抗體或庫導入可螯合鈣之胺基酸（例如天冬胺酸或麩胺酸）或導入有非天然胺基酸變異之抗體或庫（可螯合詞之胺基酸（例如天冬胺酸或麩胺酸）或提高非天然胺基酸之含有率之庫或於特定處有可螯合鈣之胺基酸（例如天冬胺酸或麩胺酸）或導入有非天然胺基酸變異之庫等）等。上述製造方法中，在低鈣濃度條件下之抗原結合分子之抗原結合活性，只要離子化鈣濃度為0.1wM~30"M之間之抗原結合活性即不特別限定，較佳之離子化鈣濃度，例 124 201249871 如0.5^ Μ〜10# Μ之間之抗原結合活性。更佳之離子化鈣濃度，更佳之離子化鈣濃度，例如活體内之早期核内體内之離子化鈣濃度’具體而言例> ^μ〜5//Μ之抗原結合活性。又，於高弼濃度條件下之抗原結合分子之抗原結合活性，只要是離子化約濃度$ 1〇MM]〇mM之間之抗原結合活性即不特別限定’較佳之離子化鈣濃度，例如2〇〇终5 籠之間之抗原結合活性。更佳之離子化鈣濃度，例如於活體内之血聚中之離子化⑴農度，具體而言，例如〇.5·25 ιπΜ之抗原結合活性。抗原結合分子之抗原結合活性，可依照該技術領域之人士所公知之方法敎，針對離子㈣濃度以外之條件，可由該技術領域之人士適當決定。選擇於高㈣度條件下之抗原結合活性高在㈣濃度〃下之抗原結合活性之抗原結合分子之步驟，盥選擇在 =濃度條件下之抗原結合活性低於在高轉濃度條件下之抗原結合活性$ γ @ #人几原、，’0 σ分子之步驟為相同含意。只要於高鈣濃度條件人 :條件下―，則= :活:::二濃度條件下之抗原結合活性之差二季乂佳為於南鈣濃度冬度條件^ ㈣為在低域牛下之抗原結合活性之2倍以上，又更佳為40倍以上。勹倍以上，依照本發明之g条、张抗原結合分子，例如 '法篩選之抗原結合分子可為任意可師選上述抗原結合分子。例如：可_ 125 201249871 選具天然'序列之抗原結合分子，也可篩選胺基酸序列經取代之抗原結合分子。上述製造方法中，抗原與抗原結合分子之結合可在任意狀態進行，不特別限定。例如：可藉由使經固定化之抗原結合分子接觸抗原’而使抗原結合分子與抗原結合，也可藉由使經固定化之抗原與抗原結合分子接觸，而使抗原結合分:與抗原結合。又’也可藉由在溶液中使抗原結合分子與抗原接觸’而使抗原結合分子與抗原結合。又，本發明之製造方法也可使用在上述中性具有人類FcRn、..σ σ，舌性之抗原結合分子，也可組合賦予或提高於中性ΡΗ之人類FcRn、_合活性之方法。本發明之製造方法，組合用於賦予或提高於中性pH之人類結合活性之方 :時’可包含改變抗原結合分子中之胺基酸，並賦予或提高於中性pH條件下之人類FcRn結合活性之步驟。又，於中性PH具人類FcRn結合活性之抗原結合分子之人類㈣、° 口域例如於上述令性pH具人類FcRn結合活性之人類 FcRn結合域為較佳例。因此，本發明之製造方法中，也可包含預先選擇在中性pH之人類FcRn結合活性高之具人類 FcRn、’α σ域之抗原結合分子，及/或改變抗原結合分子中之胺基酸並賦予或提高於中性PH之人類FcRn結合活性之步驟。再者本發明之製造方法也可使用在上述# Μ依存性 =結m之抗原結合分子’也可與賦予pH依存性抗原 ^ /舌ι±之方法（w〇 2〇〇9/125825)組合。本發明之製造方 126 201249871 法中組合賦予pH依存性抗原結合活性之方法時，可以更包含：預先選擇於酸性pH條件下之抗原結合活性低於中性ρη 條件下之抗原結合活性的抗原結合分子、及/或改變抗原結合分子中之胺基酸，並使於酸性pH條件下之抗原結合活性低於中性pH條件下之抗原結合活性之步驟。又’具pH依存性抗原結合活性之抗原結合分子，較佳例為：抗原結合分子之至少1個胺基酸以組胺酸取代或至少有1個組胺酸插入之抗原結合分子。因此本發明之製造方法中’也可更包含：就抗原結合分子而言，使用至少1個胺基酸以組胺酸取代或至少有1個組胺酸插入之抗原結合分子，或將抗原結合分子之至少1個胺基酸取代為組胺酸或至少插入1個組胺酸之步驟。又，本發明之製造方法，也可使用非天然胺基酸代替組胺酸。因此，可將上述組胺酸取代為非天然胺基酸而理解本發明。依照本發明之製造方法’可製造對於人類、小鼠、猴等動物投予時，具有從以下選出之至少丨種機能的抗原結合分子： (i )促進抗原攝入細胞内之機能、 (i i )對於抗原結合2次以上之機能、 (i i i)促進血漿中之抗原遭度減少之機能、及 (iv)優異之血漿中滯留性機能。因此本發明之製造方法可利用為當做獲得具有該等機能中至少其中之一之機能的抗原結合分子之製造方法。 127 201249871 又，該等抗原結合分子可、法I 士千了減少對患者之投予量或投予頻度，結果為可減少總投子晉里’故可認為當做醫藥品特別優異。因此本發明之製4 t i -Γ* lk方法可利用為當做製造當做醫藥組成物之抗原結合分子之製造方、去本發明之製造方法中緙锃+甘m 次肀獲侍之基因，通常係載持（插入）適當載體，並導入寄主细朐。兮 7 土、田脃。5亥载體只要能穩定保持插入之核酸即T，無特別限制’例如寄主若使用大腸菌，則選殖用載體以PBluescript載體（stratagene公司製）等為較佳，但可使用市售的各種載體。本發明之抗原結合分子於生產之目的使用載體時，尤以表現載體為有用。表現載體只要是在試管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個體内表現抗原結合分子之載體即可，無特別限制，例如若於試管内表現，以pBEST載體較佳（pR0MEGA公司製）、若於大腸菌表現，為pET載體較佳（invi tr〇gen公司製），若於培養細胞表現，以 PME18S-FL3 載體較佳（GenBank Accession No. AB0 09864)，若於生物個體表現，以pME18S载體（M〇1 Cel i

Biol. 8·466-472(1988))等較佳。本發明之DNA插入載體時’可依常法，例如利用限制酶部位之接合酶反應進行 (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. ( 1 987) Publish. John Wiley & Sons.Section 11.4-ll_ 11)。上述寄主細胞不特別限制，可因應目的使用各種寄主細胞。用於使抗原結合分子表現之細胞，例如：細菌細胞 (例：鏈球菌、葡萄球菌、大腸菌、鏈黴菌、枯草菌）、真 128 201249871 菌細胞（例：酵母、麵菌）、昆蟲細胞（例：Dr〇sophi 1 a S2、 spodoptera SF9)、動物細胞（例：CHO、COS、HeLa、C127、 3T3、BHK、HEK293、Bowes黑色素瘤細胞）及植物細胞。對於寄主細胞導入載體，例如可使用磷酸鈣沉澱法、電氣脈衝穿孔法（Current protocols in Molecular Biology edit Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons· Section 9. 1-9. 9)、脂轉染法、顯微注射法等公知之方法進行。寄主細胞之培養可依照公知之方法進行。例如：動物細胞為寄主時，培養液例如可使用DMEM、MEM、RPMI 1 640、 IMDM。此時’可併用fbs、胎牛血清（FCS)等血清補液，也可於無血清培養進行細胞培養。培養時之pH，定為約6〜8 為較佳。培養通常於約3〇~4(rc進行約15〜2〇〇小時，並視需要施行培養基之更換、通氣、攪拌。為了使寄主細胞表現之抗原結合分子分泌到小胞體之内腔 '細胞周邊腔、或細胞外之環境，可以在目的多胜肽納入適當的分泌信號。該等信號對於目的之抗原結合分子可為内因性也可為異種信號。另方面，於體内（i n v i vo)產生多胜肽之系，例如：使用動物之產生系或使用植物之產生系。對於該等動物或植物導入目的聚核普酸，並使在動物或植物之體内產生多胜肽並回收。本發明中，「寄主」包含該等動物、植物。 —使用動物時，有使用哺乳類動物、昆蟲之產生系。哺乳類動物可使用山千豬'綿羊、小鼠、牛等（VickiGUser 129 201249871 SPECTRUM Biotechnology Applications (1993)) 〇 ^ , 用哺乳類動物時，可使用基因轉殖動物。使例如可製備編碼為本發明之抗原結合分子之 ^ 酸，與編碼為如山羊石酿蛋白之類在乳汁中固有產生核，胜肽的基因的融合基因。其次，將含該融合基因的聚：：酸片段注人山羊胚’並將該胚胎移植到雌山羊。^ 胎的山羊產生之基因㈣山羊(或其子孫)所產之乳汁文：以取得所望之抗原結合分子。又，為了增加從基因轉殖山平產生之含所望之抗原結合分子之乳汁量，可對於基因轉殖山羊投予適當的荷爾蒙（Ebert et al., (1994) 12: 699-702)。又，本發明之使抗原結合分子產生之昆蟲，例如可使用蠶。使用蠶時，#由將插入有編碼為目的抗原結合分子之聚核Μ的桿狀病毒感染f，可從該蠢之體液獲得目的之抗原結合分子。再者’植物使用在產生本發明之抗原結合分子時，例如可使用煙草。使用煙草時，例如將編碼為目的抗原結合分子之聚核苷酸插入於植物表現用載體例如pM〇N 53〇,將該載體導人如農桿菌UgrQbacterium Widens)之細菌。使該細菌桿染煙草’例# Ν—他⑽，可從該煙草葉獲得所望之抗原結^H(Maetal.，Eur J·

Im_〇i· (1994) 24: 131-8)。又，將同樣的細菌感染浮坪（Lemna minor)，並選殖化後，可從浮萍的細胞獲得所望之抗原結合分子（Cox KM et al. Nat· Bi〇techn〇1. 2_ 130 201249871

Dec;24(12):1591-1597)。如此獲得之抗原結合分子’可從寄主細胞内或細胞外 (培養基、乳汁等）單離’並精製為實質上為純且均勻的抗原結合分子。抗原結合分子之分離、精製，只要是通常之多胜肽之精製使用的分離、精製方法即可，無任何限定。例如可適當選擇層析管柱、過濾、超過濾、鹽析、溶劑沉澱、溶劑萃取、蒸餾、免疫沈降、SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳、4電點電泳法、透析、再結晶等’並組合而將抗原結合分子分離、精製。層析，例如親和性層析、離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾、逆相層析、吸附層析等（Strategies f〇；r Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al.(1996) Cold Spring Harbor Laboratory Press)。該等層析，如液相層析可使用例如HPLC、FpLC等液相層析進灯。親和性層析使用之管柱，例如pR〇TE丨N A管柱、pR〇TE! N G管柱。例如：使用PR〇TEINA之管柱，如HyperD，p〇R〇s，

Sepharose F. F. (Pharmacia 製）等 D 視需要，在抗原結合分子精製前或精製後使適當的蛋白質修飾酵素作用藉此可任意施加修飾，或部分除去胜

醫藥組成物之抗原結合分子、由本又，本發明係關於包含本發明之 131 201249871 發明之篩選方法單離之抗原結合分子、或依照本發明之製造方法製造之抗原結合分子的醫藥組成物。本發明之抗原結合分子、由本發明之篩選方法單離之抗原結合分子、或依照本發明之製造方法製造之抗原結合分子，為具有選自於以下當中至彡i種機能的抗原結合分子，能期待抗原結合分子之投予頻度減，故當做醫藥組成物為有用： (i )促進抗原攝入細胞内之機能、 (i i)對於抗原結合2次以上之機能、 (111 )促進血漿中之抗原濃度減少之機能、及 (iv)優異之血漿中滯留性機能。又，本發明之醫藥組成物可包含藥學上可容許之載體。本發明中，醫藥組成物，係指通常 '疾患之治療或預防、或檢査•診斷用的藥劑。本發明之醫藥組成物，能以該技術領域之人士公知之方法製劑化’如：能以與水或其他藥學上可容許之液體的無菌性溶液、或懸浮液劑之注射劑之形式以非經口的使用。例如:藥理學上可容許之載體或介質，具體而言，可考慮適當組合滅菌水或生理食鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、安定劑、香味劑、賦形劑、運載劑、防腐劑、黏結劑#，以一般認可的製藥實務要求的單位用量形態混合而製劑化。該等製劑中的有效成分量，可設定可獲得指示範圍之適當容量。用於庄射之無菌組成物，可使用如注射用蒸鶴水之載劑而依通常之製劑實務配方。 132 201249871 輔助華=，例如生理食鹽水'葡萄糖…^ 也可併用適當的溶解輔助劑，例如醇(乙醇等)、梨糖醇酸醒8„50等子性界面活性劑（聚山液？如麻油、黃豆油’溶解輔助劑可併用笨甲衝液^ 甲H也可摻合緩衝劑（例如：璘酸鹽緩酸鈉緩衝液）、止痛劑(例如:鹽酸普羅卡因）、安疋劑（例如：笨甲醇及酚）、抗氧填在適當的安瓶。 “的注射液通常充本發明之醫藥組成物較佳為以非經口投予。例如可製成注射劑型、經鼻投予劑型、經肺投予劑型、㉟皮投予型之組成物。例如可利用靜脈内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等對於全身或局部投予。投予方法可視患者之年齡、症狀適當選擇。含抗原結合分子之醫藥組成物之投予量’例如可設定為每次體重丄 u 〇.〇〇〇1呢至1000呢之範圍。或，可定為例如每位患者為〇.〇〇1〜U)_“g之投予量，但本發明不_定限於該等數値。投予量及投予方法’ 4見患者之體重、年齡、症狀等而變動’但如為該技術領域之人士，可考慮該等條件，設定適當的投予量及投予方法。又’本發明之醫藥組成物，可為用於促進抗原攝入細胞内、或促進血聚中之抗原濃度減少之醫藥組成物。’ 又，本發明’係關於藉由投予本發明之抗原結合分子 133 201249871 或依照本發明之製造方法於抗原結合分子使抗原攝之抗原遭度之減少之方法 (in vitro)任一者進行。鼠、猴等）、或人類等。所製造之抗原結合分子，促進由入細胞内之方法、或促進血漿中。投予可於體内（in vivo)或體外投予對象’例如非人類動物（小又’本發明係關於藉由使用本發明之抗原結合分子' 或依照本發明之製造方法所製造之抗原結合分子，使工分子之抗原結合分子對於抗原之結合次數增加之方法、或改善抗原結合分子之血漿中滯留性之方法。又，本發明s己載之胺基酸序列所包含之胺基酸，有時會受到轉譯後修飾（例如：N末端之麩醯胺酸由於焦麩胺醯基化而修飾為焦麩胺酸為該技術領域之人士熟知之修飾），但如此的胺基酸為轉譯後修飾時，當然也包含在本發明記載之胺基酸序列。又’本發明提供至少包含本發明之抗原結合分子之用於本發明之方法之套組。該套組，除此以外，也可預先包裝藥學上可容許之載體 '介質、記載使用方法之指示書等。又’本發明係關於含有本發明之抗原結合分子或依照本發明之製造方法所製造之抗原結合分子當做有效成分之利用抗原結合分子使抗原攝入細胞内之攝入促進劑、血漿中之抗原濃度之減少促進劑、使1分子之抗原結合分子對於抗原之結合次數增加劑、或抗原結合分子之血漿中滯留性改善劑。又’本發明係關於本發明之抗原結合分子或依照本發 134 201249871 明之製造方法所製造之抗原結合分子之用途，係使用在利用抗原結合分子使抗原攝入細胞内之攝入促進劑、血漿中之抗原濃度之減少促進劑、使1分子之抗原結合分子對於抗原之結合次數增加劑、或抗原結合分子之血漿中滯留性改善劑之製造。又’本發明係關於本發明之抗原結合分子或依照本發明之製造方法所製造之抗原結合分子，其係使用在促進利用抗原結合分子使抗原攝入細胞内之方法、促進血漿中之抗原濃度減少之方法、增加1分子之抗原結合分子對於抗原之結合次數之方法、或改善抗原結合分子之血漿中滞留性之方法。又，本說明書引用之所有先前技術文獻，係納入本說明書當做參照。【實施例】以下以實施例更具體說明本發明，但本發明不限於該荨實施例。 [貫施例1 ]鈣依存性的抗原結合抗體之抗原消失加速效果之概念 (1-1 )pH依存性的結合抗體之利用抗原結合抗體之抗原消失加速效果 W0 2009/125825 記載之 H54/L28-IgG1 為人類化抗 IL 6叉體抗體，Fv4-IgGl為對於H54/L28-IgGl賦予對於 ^容型人類IL-6受體以pH依存性結合之特性（中性條件下、’。。，且於酸性條件下解離）的人類化抗il_6受體抗體。 135 201249871 W〇 2〇〇9/_…小鼠之體内試驗中，與投予 H54/L28-IgG1與抗原可溶型人類Μ受體之混合物予FV4，G1與抗原可溶型人類1“受體之思合 Π，顯示可溶型人類IL_6受體之消失能大幅加速。通吊之與可溶型人類IL-fi戽掷^丄主入頰1L 6文體結合之抗體所結合可溶型人類IL-6受體，會與抗體_起由FeRU於血再循環’相對於此’，pH依存性的與可溶型人類… 體結合之抗體，會於核㈣内之酸性條件下將與抗體^ 之可溶型人類J“受體解離。解離的可溶型人類二體會由溶體分解，故可大幅加速可溶型人類IL-6受體之、; 失體以PH依存性的與可溶型人類Μ受體結合之仇體β由於FcRn而於血漿中*循援與可溶型人…受體、反^ 分；处“ 精由反複此現象’ 1個抗體刀子月…人反複結合於可溶型人類IL_6受體（圖u .又，如W〇 2009/125825記載，通常之人類化抗IL_6 『體抗體’與膜型人類IL_6受體結合後，會以人類化抗广6受體抗體與膜型人類受體之複合 :化’之後溶體於分解。相對於此，以PH依存性的：二人類化抗！“受體抗體，於與膜型人類IL_ :: 内化後，會於核内體内之酸性條件下從膜：二 =，藉此一循環一環之抗體= 人類IL 6文體、!。σ ’ #由如此返覆，i個抗體分子能、覆多次與膜型人類IL-6受體結合（圖2)。 (1-2)血漿中及核内體中之pH及鈣濃度 136 201249871 於圖1及圖2所示之PH依存性的結合抗體的作用中，利用血漿中與核内體内之環境不同，亦即PH之差異（血漿中ΡΗ7· 4核内體内：ρΗ6· 〇) ’使血漿中與抗原強力結合，並於核内體内從抗原解離係屬重要。Α 了使血漿中與核内體内之pH依存性的結合抗體對於抗原之結合能力有如此

差異’血漿中與核内體内之環境差異的大小係屬重要。pH 同亦即氫離子濃度之不同。亦即，pH7. 4之血聚中之氫離子濃度為約4〇nM，pH6.〇之核内體内之氫離子濃度為'·々10GG nM，血渡中與核内體内，因子（氫離子約有約25倍的差別。辰度為了使圖1及圖2所示作用更容易達成，或為了增強其作用’據認為利用血漿中與核内體内之氫離子濃度之不 5使用依存於浪度之不同大的因子的抗體即可。探索血漿1核内體内的》農度不同大之因子，結果發現：約。血梁中之離子㈣濃度為約U — 1.3 mM，核内體内之離子化約濃度為約3" Μ ’ ▲聚中與核内體内的因子(鈣)之濃度有約 =0倍的差異，其差比起氫離子濃度差（25倍）為大。亦即， :由使用於冋鈣艰度條件下(i •卜i. 3⑹會與抗原結合，在低H辰度條件下（3 # M)會從抗原解離之離子化舞濃度依存性的結合抗體’據認為可更容易達錢1及圖2所示之作用，或能增強其作用。 W0 2009/1 25825中，係藉由導入組胺酸，係作在 4 ” ρΗ6· 0之性質改變的邱依存性的結合抗體。組胺文於血水中之中性條件下為中性電荷’但於核内體内之酸 137 201249871 !生條件下具正電何。利用該組胺酸之電荷變化，可以對於抗體與抗原之交互作用碑予PH依存性。另-方面，如圖3 所示’使用組胺酸時1 了於-聚中與抗原結合並於核内體内從抗原解離，抗體之組胺酸殘基必需與抗原之正電荷之胺基酸或成為氫鍵之捐出者的胺基酸交互作目，故用於發揮目的作用t pH依存性的結合抗體所結合之抗原側之抗原決定基ϋ為正電荷之胺基酸或能成為氫鍵之捐出者的胺基酸。另方面如圖4所不，由於考慮鈣依存性的結合抗體會介由鈣離子而與抗原結合’故抗原側之抗原決定基為可螯合㈣子之負電荷之胺基酸或能成為氫鍵接受者的之胺基酸’因此可以導向由導入組胺酸所製作之pH依存性的結合體無法導向的抗原衫基。再者，如_ 5所示，藉由使用同時具鈣依存性與ρΗ依存性之抗體’據認為可導^具有廣泛性質之抗原決定基。 [實施例2]使用嗟菌體呈現技術從人類抗體庫取得ca 依存性的結合抗體 (2-1)未改變（naive)人類抗體噬菌體呈現庫之製作以從人類PBMC製作之polyA RNA或市售人類p〇iyA腸等當做模板’參考（Methods Μο1 Βι〇1 2〇〇2;1 78:87-lGG.)，構建提示由人類抗體序列構成之μ 域之多數人類抗體噬菌體呈現庫。 ⑺2)利用珠粒淘選由庫取得^依存性的結合抗段 138 201249871 從構建之人類抗體噬菌體呈現庫之最初之選拔，係僅 /辰縮具備對於抗原之結合能力之抗體片段、或以Ca依存性的結α把力為指標濃縮。濃縮成具備Ca依存性的結合能力之抗體片段時，係於Ca離子存在下使抗原結合後利用 EDTA將Ca離子螯合，以溶出噬菌體。抗原使用經生物素標記之人類IL-6受體。由保持以上述方式構建之噬菌體呈現用phagemid之大腸菌產生嗟菌體，將獲得之培養液以2. 5 μ NaCl/1 0%PEG 沉澱後以TBS稀釋，製成噬菌體庫液。對於噬菌體庫液添加BSA，CaCl2，製成使終濃度4% BSA,離子化鈣濃度ι.2 mM。淘選係參考一般方法，即使用固定化於磁性珠粒之抗原之淘選方法（j Immunol Methods. 2008 Mar 20;332(1-2)：2-9. ' J Immunol Methods. 2001 Jan 1 ; 247( 1-2):191-203. 、 Biotechno1 Prog. 2002

Mar-Apr;18(2):212-20. > Mol Cell Proteomics. 2003 Feb;2(2):61-9.)。磁性珠粒使用 NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或 Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin) o 具體而言，於製備之噬菌體庫液添加250 pmol生物素標記抗原’於室溫使與抗原接觸60分鐘。添加經BSA阻斷的磁性珠粒’於室溫結合15分鐘。將珠粒以1 mL的1. 2 mM 0&(]12/168(含1.2 111^1€3〇12788)洗滌1次。之後，於濃縮具備結合能力之抗體片段時，以一般方法進行溶出，於漢 139 201249871 縮具備Ca依存性的結合能力的抗體片段時，於2㈣ EDTA/TBS(含2%EDTA之TBS)將珠粒懸浮，並回收噬菌體。於回收之噬菌體溶液中，添加處在對數增殖期（〇D6〇〇 0.4-0.5)之大腸菌株丁卩11〇|111>，於37。(：、11^ 利用緩慢搜掉培養使感染。將經感染之大腸菌塗覆在225 _ χ 225 mm之平板。再度從該大腸菌開始培養，並培養噬菌體。第2次以後的淘選，係以Ca依存性的結合能力為指標進行濃縮。具體而言，於製備的噬菌體庫液添加4〇如〇1 之生物素標記抗原，於室溫使與抗原接觸6〇分鐘。添加以 BSA阻斷的磁性珠粒，於室溫使結合15分鐘。將珠粒以的 1.2 mM CaCh/TBST(含 1.2 mM CaCl2，0.1% Tween-20 之TBS)與1.2 mM CaCl2/TBS各洗滌！次。之後，添加〇 ι •nL之2 mM EDTA/TBS(含2%EDTA之TBS)，將珠粒於室溫懸浮，並立即使用磁座分離珠粒，回收嗤菌體溶液。將回收之噬菌體洛液，添加到處於對數增殖期（〇D6〇〇〇 . H 之大腸菌株TGI 1G mL，於37t、！ hr，緩㈣拌培養以使感染。將經感染之大腸菌塗覆在225㈣χ 225 -之平板。再度從該大腸菌開始培養，與上述同樣進行^體之培養，反複2次淘選。 (2-3)利用噬菌體ELISA之評價從依上述方法獲得之大腸菌單一菌落，參考（Meth〇ds

Mol Biol· 2002; 1 78: 133-145.)回收含噬菌體之培養上清。對於含噬菌體之培養上清添加BSA、 CaCh，使終濃度為4%BSA、鈣離子濃度丨.2_，以供EUSA。將streptawen 140 201249871 96微滴定平板（Roche)以含生物素標記抗原之pBS ι〇〇 " L 塗覆一晚。以PBST(含〇. l%Tween20之PBS)洗滌，去除抗原後’以4% BSA-TBS 250 //L阻斷1小時以上。去除4% BSA-TBS ’於其中添加製備的培養上清，於37。〇靜置1小時’使嗟菌體呈現抗體結合。以丨.2 mM CaCh/TBST (含 1· 2 mM CaCl2，0· 1% Tween20 之 TBS)洗滌後，添加 1. 2 mM CaCl2/TBS 或 1 mM EDTA/TBS ’ 於 37°C 靜置 30 分鐘並溫育。以1· 2 mM CaCl2/TBST洗滌後，以4% BSA、離子化鈣濃度 1.2 mM之TBS稀釋成的HRP結合抗M13抗體（Amersham Parmacia Biotech)溫育 1 小時。以 1 2 mM CaCl2/TBST 洗滌後，以TMB single solution(ZYMED)檢測，並藉由硫酸之添加使反應停止後，測定4 5 0 nm之吸光度。對於判斷有 Ca依存性的結合能力的抗體片段，使用專一性引子進行鹼基序列解析。 (2-4)抗體之表現與精製利用嗟菌體EL ISA ’針對判斷有Ca依存性的結合能力的選殖體’進行對於動物細胞表現用質體的導入。抗體之表現係使用以下方法進行。將人類胎腎細胞來源的

Freestyle 293-F 株（Invitrogen)懸浮於 FreeStyle 293 Expression Medium 培養基（invitrogen)，以 1.33 X 106 個/mL的細胞密度在6井盤的各井各接種3 mL，以脂轉染法將製備的質體導入細胞。於C〇2培養箱（37度、8%C(h，90 rpm)培養4日’從獲得之培養上清，使用rPr〇tein a Sepharose Fast Flow(Amersham Biosciences)，以該技 141 201249871 術領域之人士公知之方法精製抗體。精製抗體濃度，使用刀光光度计測疋於28〇nm之吸光度。從獲得之値，以PACE 法使用什真之吸光係數，計算抗體濃度（Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423) 〇 [實施例3]取得之抗體對於人類iL_6受體之Ca依存性的結合能力之評價將實施例2取得之抗體6RL#9-IgGl(重鏈序列編號： 1、輕鏈序列編號：2)、6RK#12-IgGl(重鏈序列編號：66、輕鏈序列編號：67)及、FH4-IgGl(重鏈序列編號：3、輕鏈序列編號：4)，使用 Biacore T100(GE Healthcare)，評價於pH7. 4之人類介白素6受體（hi L6R)結合活性。運行緩衝液’使用含3 " Μ或2 mM CaCl2之0. 05% Surfactant P20，10 _〇1/1 ACES 150 mmol/1 NaCl(pH7.4 或 pH6.0) 測定。

於 Sensor chip CM4(GE Healthcare)上，以胺基偶聯法將重組型PROTEIN A(Thermo Scientific)適量固定化後，使抗體結合。注入適當濃度的hiL-6R當作分析物，使與感應晶片上之抗體交互作用。之後，注入1 〇 mmo 1 /L

Glycine-HCl (pHl. 5)，使感應晶片再生。測定於37 °C進行。測定之結果’獲得之傳感圖如圖6。從該等結果，可知：6RL#9-IgGl、6RK#12-IgGl 及 FH4-IgGl 抗體均為，於 Ca濃度為3 // Μ之條件下比起在Ca2+濃度為2 mM之條件下時，對於hIL6R之結合較弱。該等抗體之中，就具Ca依存性之抗體而言，使用 142 201249871 6RL#9-IgGl (重鏈序列編號：1、輕鏈序列編號：2)、及、 FH4-IgGl (重鏈序列編號：3、輕鏈序列編號：4)進一步進行反應速度論解析。就不具C a依存性之抗體而言，使用 W0 2009/125825 記载之 H54/L28-IgGl(重鏈序列編號·· 5、輕鏈序列編號：6)。就高鈣離子濃度而言，使用2 mM，低鈣離子濃度之條件使用3 // Μ。抗原使用人類IL-6受體

(IL-6R)。於 Sensor chip CM4 (GE Healthcare)上以胺偶聯法適量固定protein A (Invitrogen)，並於其中捕集目的之抗體。運行緩衝液使用1〇 mm〇l/L ACES、150 mmol/L

NaCl ' 〇· 05% (w/v) Tween20、2 mmol/L CaCl2、pH7.4 或 10 mmol/L ACES、150 mmol/L NaCl、0. 05% (w/v) Tween20、 3 // mol/L CaCl2、pH7. 42 種類。測定均於 37°C 實施，IL-6R 之稀釋也使用分別的緩衝液。關於H54L28-IgGl，將IL-6R稀釋液與空白運行緩衝液以流速20 y L/min注射3分鐘，使捕捉於感應晶片上之抗體與IL-6R交互作用。之後，以流速20 /z L/mi η流過1 〇分鐘運行緩衝液，觀察IL-6R之解離後，將10 mm〇i/L Glycine-HCl，pHl. 5 以流速 30# L/min 注射 30 秒，將感應晶片再生。從測定獲得之傳感圖，計算動力學參數結合速度常數ka(l/Ms)、及解離速度常數kd(l/s)，基於該値計算各抗體對於人類IL-6受體之解離常數KD (M)。各參數之計算係使用 Biacore T100 Evaluation Software (GE Healthcare)。關於FH4-IgGl、6RL#9-IgGl，係使IL-6R稀釋液與空 143 201249871

白運行緩衝液以流速5 e L/m i η注射1 5分鐘，使捕捉於感應晶片上之抗體與IL-6R交互作用。之後，將1〇 mm〇l/L

Glycine-HCl，pHl.5 以流速 30"L/min 注射 30 秒，將感應晶片再生。對於測定獲得之傳感圖使用steady state affinity model計算解離常數kd (Μ)。各參數之計算使用 Biacore Τ100 Evaluation Software (GE Healthcare)。依該方法求出之於2 mM CaCh存在下之各抗體與IL-6R 間的解離常數Ko ’如表7。於H54/L28-IgGl未觀察到由於 Ca濃度之差異所致對於il-6R之結合之差異，但是於 FH4-IgGl、6RL#9-IgGl，觀察到於低濃度Ca條件下的結合顯著減弱（圖7、8、9)。【表7】 H54/L28—|gQi FH4-lgG1 6RL#9-lgG1 KD (M) 1.9E-9 5. 9E-7 2. 6E-7 針對H54/L28-IgGl ’可與於2 Ca濃度存在下為同樣方法’計具Ca >辰度為3 β Μ之條件下之Kd。針對 FH4-IgGl、6RL#9-IgGl，於Ca濃度為3//M時，幾乎未觀察到對於IL-6R之結合，因此，難以利用上述方法計算Kd，仁藉由使用下式1月匕預測Kd (Biacore T100 Software

Handbook, BR-1006-48， AE 01/2007)。 [式1]

Req=C*Rmax/ (KD+C) +R 丨上述式1中之各項目含意如下；

Req (RU):穩疋狀態結合水平（steady state binding levels) 144 201249871

Rm (RU):分析物之表面結合能力（Analyte binding capacity of the surface) RI (RU):於試樣中之容積折射率之貢獻（Bulk refractive index contribution in the sample) C (M):分析物濃度（Analyte concentration)

Kd (M):平衡解離常數（Equilibrium dissociation constant) 使用該式1，概算Ca濃度為3 " mo 1 /L時預測之各抗體與IL-6R之解離常數KD，結果如表8。【表8】 H54L28-lgG1 FH4-lgG1 6RL#9-lg61 Reo (RU) - 5 10 fU _ 一一一一一 39 72 RI (RU) ^^--^ 0 0 C (Μ) —---- 5Ε-06 5Ε-06 K〇 (Μ) 2. 2Ε-9 3.4Ε-05 3.1Ε-05 上述表8中’ Req、Rnax、RI、C係基於測定結果而假定之值。由該結果，可預測：FH4-IgGl、6RL#9-IgG卜藉由從2 mM CaCl2改為3/z M CaCl2，對於IL-6R之Kd各升高約60 倍、約12 0倍（6 0倍、12 0倍以上的親和性會減低）。表9 整理 H54/L28-IgGl、FH4-IgGl、6RL#9-IgGl 之 3 抗體於 2 mM CaCl2存在下及3 // M CaCU存在下之Kd値、及、Kd値之C a依存性。【表9】 H54/L28-lgG1 FH4-leG1 6RL#9-IkG1 KD (Μ) (2mM CaCU) 1.9E-9 5. 9E-7 2. 6E-7 KD (Μ) (3μΜ CaCI2) 2. 2E-9 3. 4E-5以上 3.1£-5以上 Ca依存性約1倍約60倍以上約120倍以上 145 201249871 [實施例4 ]對於取得之抗體之鈣離子結合評價其次，為了評價鈣離子對於抗體之結合，利用差示掃描型熱量測定（DSC)評價熱變性中間溫度（Tm値） (MicroCal VP-Capillary DSC、MicroCal 製）。熱變性中間溫度（T m値）係安定性之指標’若妈離子結合而蛋白質安定化，則熱變性中間溫度（Tm値）比起鈣離子未結合時會增高（JBioChem. 2008 Sepl2 ; Vol.283 ; No. 37:pp25l4〇 -25149)之性質，評價鈣離子對於抗體之結合。將經精製之抗體對於 20 mM Tris-HC1，150 mM NaCl，2 mM CaCl2, pH7.4、或 20mMTris-HCl，150mMNaCl，3#MCaCh，pH7.4 之溶液進行透析（EasySEP，TOMY)。將蛋白質溶液以透析用溶液製備成0· 1 mg/mL，於20°C至115。(：之240°C /hr之升溫速度測定DSC。依據獲得之DSC之變性曲線，計算各抗體之Fab域之熱變性中間溫度（Tm値），如表1 〇。【表10】可變區序列鈣離子濃度 △ Tm[0C] 3μΜ 2mM 2mM - 3μΜ H54/L28 92. 87 92.87 0.00 FH4 74.71 78.97 4.26 6_ 77. 77 78. 98 1.21 由表1 0之結果，顯示#5依存性結合能力之FH4及6RL#9 會由於鈣離子濃度而使Fab之Tm値變動，未顯示鈣依存性結合能力之H54/L28的Tm値不會變動。以FH4及6RL#9所示之Fab之Tm値之變動，顯示該等抗體有鈣離子結合，且 Fab部分安定化。由此顯示，FH4及6RL#9有鈣離子結合， 146 201249871 另一方面’ H54/L28無鈣離子結合。 [實施例5]使用正常小鼠之^依存性結合抗體對於抗原於血漿中滯留性之影響評價 (5-1)使用正常小鼠之體内（in vW〇)試驗對於正常小鼠（c57BL/6】_se、CharlesRiverjapan) 單獨投予hsIL-6R(可溶型人類IL_6受體：於參考例i势作）或同時投予hsIL-6U抗人類a_6受體抗體後，評= hSIL-6R及抗人類IL-6受體抗體之體内動態。將讣溶液（&g/mL)、或hsIL-6R與抗人類R_6受體抗體之混合溶液對於尾靜脈α 10 一單次投予。抗人類受體抗體，使用上述 H54/L28_Ig(n、6RL#9-IgG1、FH4_igGi。混合溶液中之hsIL-6R濃度均為5#g/mL，但是抗人類IL-6受體抗體濃度依每種抗體不同，H54/L28_igGi為〇. 1 mg/mL、6RL#9-IgGl 及 FH4-IgG1 為 1〇 mg/mL，此時由於相對於hsIL-6R，抗人類IL-6受體抗體有足夠量過剩存在，因此可認為hs IL-6R大部分與抗體結合。投予後丨5分鐘、7小時、1日、2日、4日、7日、14日、21日、28日進行採血。將採取的血液立即於4t、12,〇〇〇 rpm進行Η 分鐘離心分離，並獲得血漿。經分離之血漿，直到實施測定為止’保存在設定為_2〇°c以下之冷凍庫。 (5-2)利用ELISA法測定正常小鼠血漿中之抗人類 IL-6受體抗體濃度小鼠血毁中之抗人類IL_6受體抗體濃度，係以ELISa 法測疋。首先，將 Anti-Human IgG(y -chain specific) 147 201249871 F(ab’）2 Fragment of Antibody (SIGMA)分注到 Nunc-Iminuno Plate, Maxi Soup (Nalge nunc International) ’ 於 4°C 靜置 1 晚，製作 Anti-Human IgG 固相化板。製備血漿中濃度為0.64' 0.32、0.16、0.08、 0.04、0.02、0.01/zg/mL之檢量線試樣與稀釋1〇〇倍以上之小鼠血衆測定試樣，分注到Ant i -Human I gG固相化板，於25C進行1小時溫育。之後使Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D)於 25°C 反應 1 小時，再使 Streptavidin-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies)於 25°C 反應 0· 5 小時，以 TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories)當做基質進行發色反應，以 1N-Sulfuric acid(Showa Chemical) 停止反應後，以微平板讀取儀測定450 nm之吸光度。小鼠血漿中濃度係由檢量線之吸光度使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)計算。以該方法測定之靜脈内投予後之正常小鼠中之 H54/L28-IgGl、6RL#9-IgGl、FH4-IgGl 在血漿中抗體濃度變動，如圖10。 (5-3)利用電化學發光法測定血漿中hsIL-6R濃度

小鼠之血漿中hsIL-6R濃度，係以電化學發光法測定。製備調整為 2000、1000、500、250、125、62.5、31.25 pg/mL之hsIL-6R檢量線試樣及稀釋50倍以上之小鼠血漿測定試樣，混合以 SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)釕化 5 1MonocIona 1 Anti-human IL-6R

Antibody(R&D)及 Biotinylated Anti-human IL-6 R 148 201249871

Antibody (R&D)及 tocilizumab (重鏈序列編號：13、_ 鏈序列編號：14)溶液混合，於4它使反應i晚。此時於Assay buffer中含有1〇 mMEDTA，使樣本中之游離Ca濃度降低，目的為使樣本中幾乎所有的hsIL-6R從6RL#9-lgGl或 FH4-IgGl解離’且與添加之t〇ci 1 izumab成為結合狀態。之後，分注如 MA400 PR Streptavidin PUte(Mes。Scale

Discovery)。再於25°C使反應1小時並洗滌後，分注Read

Buffer T(x4)(Meso Scale Discovery)，立即以 SECTOR PR

400 reader(Meso Scale Discovery)進行測定。hsIL_6R 濃度係由檢量線之回應，使用解析軟體s〇FTmax PROCMolecular Devices)計算。以該方法測定之靜脈内投予後之正常小鼠於血漿中之hsIL-6R濃度變動如圖u。結果，hsIL-6R單獨顯示非常快消失，相對於此，同時投予hsIL-6R與無Ca依存性結合之通常之抗體 H54/L2 8-IgGl時，hsIL-6R之消失會大幅延遲。相對於此，同時投予hsIL-6R以及具有1〇〇倍以上之Ca依存性結合之 6RL#9-IgGl或FH4-IgGl時，hsIL-6R之消失會大幅加速。比起同時投予H54/L28-IgGl之情形，同時投予6RL#9-IgGl 及FH4-IgGl時，Dayl之血漿中之hsIL_6R濃度能分別減低3 9倍及2倍。藉此，確認鈣依存性結合抗體可加速抗原從血漿中消失。 [實施例6 ]探討Ca依存性抗原結合抗體之抗原消失加速效果之提高（製作抗體） (6-1)關於IgG抗體對FcRn之結合 149 201249871 ¥抗體藉由與FcRn結合’會具有長的眭。I gG與FcRn之結合，僅於酸性吓留於中性條件下⑽·4)幾乎未認為有結合。以抗體Γ ^ C於核内體内之酸性條件下會與核内體内之 c η結合’錯此回到細胞表面上，於血漿中之會從FcRn解離。若對於㈣之^區域導入變里^下 ^於酸性條件下對於FcRn之結合，則由於不會核内體= 循裱於血製中’故抗體之血锻中滯留性會顯著減損。改善IgG抗體之血漿中滯留性之方法，有人報告於酸性條件下提高對於FeRK結合之方法^由對於丨扣抗體之Fc區域導入胺基酸取代，並提高於酸性條件下對於之結合，從核内體内再循環到血漿中之效率會提高其結果，血漿中滯留性會改善。導入胺基酸取代時重要者/，'=、不提高於中性條件下對於FcRn之結合。若於中性條件下結合於FcRn，則即使於核内體内之酸性條件下藉由與FcRn 結合而回到細胞表面上，於中性條件下之血漿中若igG抗體不會從FcRn解離，IgG抗體不會再循環到血漿中，故反而會減損血漿中滯留性。例如：J Immunol· 2002;169(9):517 卜 80·記載，藉由將對於I gG 1導入胺基酸取代’而於中性條件下（pH7. 4)認為對於小鼠FcRn有結合之抗體對於小鼠投予時，據報告抗體之血漿中滯留性會惡化。又，如j Immun〇1. 2009;182(12):7663-71·或 J Biol Chem. 2007 Jan 19；282(3): 1 709-1 7.或 J Immunol. 2002 Nov 150 201249871

IgGl導入胺基酸取

性條件下（PH7. 4)對於人類FcRn之結合之優點。 l;169(9):5171-80.記載，藉由對於 ^ 代’會提高於酸性條件下（pH6〇)之人類若同時將於中性條件下（ρΗ7· 4)對於人類與Ca依存性性抗原結合之抗體，由於具有使可溶型之抗原之消失加速，使丨個抗體分子返覆多次與可溶型之抗原結合之效果’故極有用。使該抗原消失加速效果更為提尚之方法，有人驗證使中性條件下（pH7. 4)對於FcRn之結合增強之方法。 (6-2)中性條件下具有對於FcRn之結合的Ca依存性的人類IL-6受體結合抗體之製備對於具鈣依存性的抗原結合能力之FH4-IgGl與 6RL#9-IgGl、及當做對照之不具鈣依存性的抗原結合能力的H54/L28-IgG卜導入於中性條件下（pH7.4)使對於FcRn 之結合增加之胺基酸變異。胺基酸變異之導入係利用使用 PCR之該技術領域之人士公知之方法進行。具體而言，製作相對於IgGl之重鏈恆定區、相對於IgGl之重鏈悝定區，將EU編號法434號由Asn取代成Trp之FH4-N434W(重鏈 151 201249871 序列編號：7、輕鏈序列編號：8)與6RL#9-N434W(重鏈序列編號：9、輕鏈序列編號：10)與H54/L28-N434WC重鍵序列編號：11、輕鏈序列編號：1 2)。導入胺基酸取代之方法，係使用 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene) ’以附屬説明書記載之方法製作變異體，並將獲得之質體片段插入動物細胞表現載體，製作成目的之表現載體。抗體之表現、精製、濃度測定，係以實施例 2記載之方法實施。 [實施例7]使用正常小鼠評價Ca依存性結合抗體之消失加速效果 (7-1 )使用正常小鼠之體内試驗對於正常小鼠（C57BL/6J mouse、Charles River· Japan) 單獨投予hsIL-6R(可溶型人類il-6受體：參考例！製作）或將hsIL-6R及抗人類Il-6受體抗體同時投予後，評價 hsIL-6R及抗人類IL-6受體抗體之體内動態。將hsiL-6R 溶液（5"g/mL)、或hsIL-6R與抗人類IL_6受體抗體之混合溶液對於尾靜脈以1 〇 mL/kg單次投予。抗人類I L_6受體抗體，使用上述 H54/L28-N434W 、 6RL#9-N434f 、 FH4-N434W。 /昆〇浴液中之h s I卜6 R濃度均為5 # g / m L，但抗人類 IL-6受體抗體濃度依各抗體而不同，H54/L28_N434W為 0· 042 mg/mL、6RL#9-N434W 為〇. 55 mg/mL、FH4-N434W 為 1 mg/mL。此時由於對於hsIL_6R，抗人類IL 6受體抗體以足里過剩存在，因此可認為hs丨L_6R大部分與抗體結 152 201249871 合。投予後15分鐘、7小時、1日、2日、4日、7日、14 28日進行彳木血。將採取之血液立即於4它、I?，〇〇〇 P進行15 ”鐘離心分離，獲得血聚。將分離之赢聚在實施測定為止’保存於設定在—耽以下之冷康庫。 (7-2)利用ELISA法測定正常小鼠血漿中之抗人類 IL-6受體抗體濃度 J、鼠血漿中之抗人類！L_6受體抗體濃度，係以與實施例6同樣之ELISA法測定。該方法測定之靜脈内投予後之

正常小鼠中，H54/L28-N434W、6RL#9-N434W、FH4-N434W 之血漿中抗體濃度變動如圖丨2。 (7-3)利用電化學發光法測定血漿中hsIL_6R濃度小鼠之血漿中h s IL - 6 R濃度，以電化學發光法測定。

製備調整為 2000、1000、500、250、125、62. 5、31.25 pg/mL 之hs IL-6R檢量線試樣及稀釋5〇倍以上之小鼠血漿測定試樣，並以 SULFO-TAG NHS EsteKMeso Scale Discovery) 釕化之 Monoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D)及 Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody (R&D)混合，並於4C使反應1晚。此時之Assay buffer中含有10 mM EDTA，並使樣本中之游離Ca濃度降低而使樣本中幾乎全部的 hsIL-6R 從 6RL#9-N434W 或 FH4-N434W 解離，目的為使

成為以游離體的形式存在之狀態。之後，分注於MA400 PR

Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)。再於 25°C 反應1小時並洗蘇後’分注Read Buffer T(x4)(Meso Scale Discovery)，立即以 SECTOR PR 400 reader(Meso Scale 153 201249871

Discovery)測定。hsIL-6R濃度，係由檢量線之回應使用解析軟體 SOFTmax PR〇(M〇lecuiar Devices)計算。該方法測定之靜脈内投予後之正常小鼠於血聚中之hsIL_6R濃度變動如圖1 3。結果，於PH7.4對於FcRn之結合增強，但是當同時投予hsIL-6R與無Ca依存性結合之通常之抗體 H54/L28-N434W 時，比起單獨投予 hsIL_6R 時，hslL 6Ri 消失大幅減慢。相對於此，同時投予hsIL_6R與具1〇〇倍以上之Ca依存性結合且於ρΗ7·4對於FcRn之結合增強之

抗體6RL#9-N434W或FH4-N434W時，比起單獨投予hsIL_6R 時，hsIL-6R之消失加速。比起單獨投予hsIL_6R時同時投予6RL#9-N434W及FH4-N434W時，Dayl之血聚中之 hsIL-6R濃度各減低3倍及8倍。藉此，可確認對於鈣依存性結合抗體，藉由使於pH7.4對於FcRn之結合能力增強，可以更加速抗原從企漿中消失。將hsIL-6R與無Ca依存性結合之通常之抗體 H54/L28-IgGl比較，具有與hsIL-6R及1〇〇倍以上之ca 依存性結合之抗體6RL#9-IgGl或FH4-IgGl，確認有使 hsIL-6R之消失增大之效果，具有與hsIL_6R與1〇〇倍以上之Ca依存性結合，且於pH7. 4對於FcRn之結合增強之抗體 6RL#9-N434W 或 FH4-N434W，確認 hs IL-6R 之消失比起hsIL-6R單獨時能加速。該等數據，與如圖1所示，與 P Η依存性的抗原結合之抗體同樣，啟示與c 3依存性的抗原結合之抗體在核内體内會將抗原解離。如實施例丨所 154 201249871 示’與pH依存性的抗原結合之抗體受限於能當做標的之抗原決定基（圖3) ’但藉由使用與本探討發現的[a依存性的抗原結合之抗體（圖4、5 )，能更加廣以將核内體依存性的抗原解離之抗體為標的之抗原決定基。 [貫施例8 ]利用X射線結晶結構解析鑑定9抗體之鈣離子結合部位 (8 _ 1 ) X射線結晶結構解析如實施例4所示’ 6RL#9抗體與鈣離子結合，係由熱變性溫度Tm値之測定所啟示。但是由於無法預測6RL#9抗體之哪個部位與鈣離子結合，因此，藉由使用X射線結晶結構解析之方法’指定妈離子所交互作用之6RL#9抗體之序列中之殘基。 (8-2)6RL#9抗體之表現及精製將為了 X射線結晶結構解析使用而使表現之6RL#9抗體予以精製。具體而言’將各能表現6rl#9抗體之重鏈（序列編號：1)與輕鏈（序列編號：2)之方式製備之動物表現用質體’暫時導入動物細胞。對於懸浮於Freestyle 293

Expression Medium 培養基（Invitrogen)，使得最終細胞岔度成為1 X 106細胞/mL之8 0 0 mL之人類胎兒腎細胞來源FreeStyle 293-F株（Invitrogen)，導入以脂轉染法製備的質體。將導入有質體之細胞，於c〇2培養箱（37t：、 8%C〇2、90 rpm)中培養5日。依照使用rprotein A Sepharose Fast Flow(Amersham Biosciences)之該技術領域之人士公知之方法，從如上述獲得之培養上清精製抗 155 201249871 體。使用分光光度計測定精製之抗體溶液於280 nm之吸光度。使用依PACE法計算之吸光係數，由測定値計算抗體濃度（Protein Science (1995) 4， 2411-2423)。 (8-3)從6RL#9抗體精製Fab片段使用分子量區分尺寸10000MWC0之超過濾膜時，將 6RL#9 抗體濃縮至 21 mg/mL。使用 L-Cystein 4 mM、EDTA 5 mM、20 mM磷酸鈉緩衝液（pH 6. 5) ’至備以5 mg/mL稀釋而得之2. 5 mL之該抗體之試樣。添加〇. 125 mg之 PapainCRoche Applied Science)，並將經攪拌之該試樣於 3 5°C鏡置2小時。靜置後，溶解蛋白酶抑制劑蛋白酶抑制劑迷你長尾獼猴’再將溶有無EDTA(Roche Applied Science)l錠之10 mL之25 mM MES緩衝液（PH6)添加到該試樣，於冰中靜置，藉此，以papa in停止蛋白酶反應。其次，將該試樣添加到於下流游隨機連結之丨尺寸之

ProteinA 載體管柱 HiTrap MabSelect SUre(GE Healthcare) 之25 mM MES緩衝液pH6，經平衡化之1 尺寸之陽離子交換管柱HiTrap SP HP(GE Healthcare)。同緩衝液中之 NaCl濃度藉由直接上升到3〇〇mM並進行溶出可獲得6rl#9 抗體之Fab片段之精製區分。其次，將獲得之精製區分以 5000MWCO超過濾臈濃縮為約〇·8鈍。於以含5〇祕之100 mM HEPES緩衝液（pH 8)平衡化之凝膠過濾管柱 Superdex 200 1 0/300 GL(GE HeaHhcare)中，添加漠缩液。結晶化用之精製咖抗體之Fab片段使用同緩衝液從管柱溶出。X ’上述所有的f柱操作係於6至7.代之低s 156 201249871 下實施。 :-广9抗體之Fab片段於。存在下之結晶化曰=以-般的條件設定獲得㈣"ab片段之種結二？’使用以使成為5 _之方式添加有之精製 :體之Fab片段，使用5_嶋之超過濾膜 ^ 利用hanging-drop蒸氣擴散法，實施如 …式漢縮之試樣之結晶化。貯存溶液，使用含2 腿_之100 mM时娜緩衝液（pH75)。在蓋玻片上對 ;8//1之貝τ存溶液及。.…之前述濃縮試樣之混合液，添加含29%PEG侧及之於i〇〇mMHEpEs 緩衝液(/Ιί7.5)巾破碎之前述種結晶稀釋< m剛〇倍之稀釋系列之溶液〇 p " 1，Μ +也』1 。 1錯此製備結晶化滴劑。將該結晶化滴劑於2(TC靜置2曰至3曰，測定藉此獲得之薄板狀結晶之X射線繞射數據。 (8 5)6RL#9抗體之Fab片段於Ca非存在下之結晶化精製6RL#9抗體之Fab片段使用5〇〇〇MWC〇之超過濾膜濃縮為15 mg/ml。其次，利用hanging-drop蒸氣擴散法，實施以前述方式濃縮之試樣之結晶化。貯存溶液使用含 18-25%之 PEG4000 之 1〇〇錢 HEPES 緩衝液（pH7. 5)。在蓋玻片上對於〇.8//丨之貯存溶液及〇8//1之前述濃縮試樣之混合液，添加以含25% PEG4000之1〇〇 niM HEPES 緩衝液（ρΗ7. 5)中破碎之ca存在下獲得之6rl#9抗體之Fab 片段之結晶稀釋為1 〇〇 -1 〇〇〇〇倍而得之稀釋系列之溶液〇. 2 # 1 ’製備結晶化滴劑。將該結晶化滴劑於2〇<>c靜置2 157 201249871 曰至3日’測定藉此獲得之薄板狀之結晶之χ射線繞射數據。 (8-6)6RL#9抗體之Fab片段於Ca存在下之結晶X射線繞射數據之測定將浸於含 35% PEG4000 及 5 mM CaCh 之 l〇〇mM HEPES 緩衝液（pH7. 5)之溶液而得之6RL#9抗體之Fab片段於Ca 存在下獲得之單結晶’使用微小的附尼龍環的銷，將各外液鏟出，而使該單結晶於液態氮中凍結。使用高能量加速器研究機構之放射光設施Phonton Factory之束線 B L -17 A ’測疋則述冷;東結晶之X射線繞射數據。又，測定中藉由一直於-178°C之氮氣流中放置冷凍結晶，維持冷束狀。使用束線具備並安裝的C C D偵測器 Quantum315r(ADSC) ’使結晶每次旋轉1。，收集總共180 張繞射影像。晶格常數之決定、對於繞射斑點賦予指數、及繞射數據之處理’係以程式Xia2(ccP4 Software

Suite) 、 XDS Package(Walfgang Kabsch)及 Scala(CCP4

SoftwareSuite)進行。最終，獲得解析能力至多2 2埃之繞射強度數據。本結晶，屬於空間群P2121 21，晶格常數a —45.47 埃、b=79.86 埃、c=116.25 埃、α = 90。、冷= 90。、7 = 90。。 (8-7)6RL#9抗體之Fab片段於Ca非存在下之結晶之 X射線繞射數據之測定將浸於含 35% PEG4000 之 100 mM HEPES 緩衝液（PH7. 5) 之 >谷液的6RL#9抗體之Fab片段於Ca非存在下獲得之單会士 158 201249871 晶之一，藉由使用附微小的尼龍環的的銷，將外液鐘出，使該單結晶於液態氮中冷凍。使用高能量加速器研究機構之放射光設施Phonton Factory之束線BL-5A，測定前述冷凍結晶之X射線繞射數據。又，測定中一直將冷束結晶放置在_ 1 7 8 C之氣氣流中’藉此維持冷;東狀態。使用束線具備並安裝的CCD偵測器Quantum21 Or(ADSC)，使結晶每次旋轉1 °，收集總共18 0張繞射影像。晶格常數之決定、對於繞射斑點賦予指數、及繞射數據之處理，係以程式 Xia2(CCP4 Software Suite) ' XDS Package(Walfgang Kabsch)及 Scala(CCP4 Software Suite)進行。最終，獲得解析能力至多2. 3埃之繞射強度數據。本結晶，屬於空間群 P212121，晶格常數 a=45_40 埃、b=79.63 埃、c = 116.07 埃、α = 90。、冷=90。、7=90。，與 Ca 存在下之結晶為同型。 (8-8)6RL#9抗體之Fab片段於Ca存在下之結晶之結構解析利用使用程式Phaser(CCP4 Software Suite)之分子取代法’決定6RL#9抗體之Fab片段於Ca存在下之結晶之結構。從獲得之結晶格子之大小以及6RL#9抗體之Fab片段之分子量’預測非對稱單元中之分子數為一個。依據一次序列上之相同性’將從pDB c〇de:丨ZA6之結構座標取出之A鍵1 1 2-220號及b鏈116_218號之胺基酸殘基部分當做CL及CH1區之探索用模型分子。其次，將從pDB c〇de: 1ZA6之結構座標取出之b鏈ι_115號之胺基酸殘基部分， 159 201249871 當做VH區之探索用模型分子。最後，將從觸c〇de漏之結構座標取出之輕鏈3-147號之胺基酸殘基，當做几區之探索用模型分子。依照該順序，從旋轉函數及並進函數決疋各探索用杈型分子於結晶格子内之走向與位置，而獲彳I Fab^e始結構模型。對於該起始結構模型，進行使VH、VL、CH1、CL之各域移動的剛體精密化，對於25-3.0埃之反射數據，結晶學的可靠度因子尺値為46.9%、Free R値為48·6%。χ，一面參考利用使用程式RefmaC5(CCP4 Software Suite)之結構精密化、與由實驗決定之結構因子Fo與從模型計算之結構因子Fc及使用位相計算之以2Fo-Fc、Fo-Fc當做係數之電子密度興圖，面反複進行於程式Coot (Paul Ems ley)上進行模型修正，藉此進行模型之精密化。最後，依據以2F〇_Fc、F〇_Fc 當做係數之電子密度舆圖，將Ca離子及水分子納入模型，以使用程式Refmac5(CCP4 Software Suite)進行精密化。藉由使用解析能力為25-2. 2埃之2 1 020個反射數據，最終’對於3440個原子之模型，結晶學的可靠度因子R値為 20· 0%、Free R 値為 27. 9%。 (8-9)6RU9抗體之Fab片段於Ca非存在下之結晶之χ 射線繞射數據之測定 6RL#9抗體之Fab片段於Ca非存在下之結晶之結構，係使用同型Ca存在下結晶之結構決定。從6RL#9抗體之 Fab片段於Ca存在下之結晶之結構座標，窺視水分子與“ 離子分子’進行使VH、VL、CHI、CL之各域移動之剛體精 160 201249871 密化。對於25-3.0埃之反射數據，結晶學的可靠度因子R 値為30.3%、Free R値為31.7%。再者，一面參考利用使用程式Ref mac 5(CCP4 Software Suite)之結構精密化、與由實驗決定之結構因子Fo與從模型計算之結構因子Fc及使用位相計算之以2Fo-Fc、Fo-Fc當做係數之電子密度舆圖’ 一面反複進行於程式Coot(Paul Emsley)上進行模型修正，藉此進行模型之精密化。最後，依據以2f〇_Fc、F()_Fc 當做係數之電子密度與圖’將水分子納入模型，以使用程式Refmac5(CCP4 Software Suite)進行精密化。藉由使用解析能力為25-2.3埃之18357個反射數據，最終，對於 3351個原子之模型，結晶學的可靠度因子R値為2〇 9%、 Free R 値為 27. 7%。 (8-10)6RL#9抗體之Fab片段於Ca存在或非存在下之結晶之X射線繞射數據之比較若比較6RL#9抗體之Fab片段於Ca存在下之結晶及 Ca非存在下之結晶之結構，可觀察到重鏈CDR3有重大變化。圖14顯示由X射線結晶結構解析決定之6RU9抗體之 Fab片段之重鏈CDR3之結構。具體而言，於Ca存在下之 6RL#9抗體之Fab片段之結晶中，重鏈CDR3環圈部分之中心部分存在有鈣離子。鈣離子，據認為會與重鏈cdr3之 95位、96位及l〇0a位（Kabat編號法）交互作用。α存在下時’與抗原之結合會由於重要重鏈CDR3環圈與飼結合而安定化，據認為成為對與抗原之結合最適之結構。抗體之重鏈CDR3有鈣結合之例，至今A +盔 j主7馬止無人報告，抗體之重鏈 161 201249871 C D R 3 有鹤 6士人 π δ之、、。構為新穎結構。重鏈CDR3盥抗席夕处合已知為最重I 、原之、，，。里要’本實施例發現的鈣離子對於重鏈結構維持為必I 替之要之板體，據認為辦離子對於與抗原結人I 有重要作用+ & '即具有本模體之抗體據認為對於約離+ 依存性的抗片右处人几頌有結合之可能性極高，例如若能製作具體之合成庫，目,丨诚4 、則據〜為可從如此的庫有效率的取性結合抗體。子、匕例9 ]使用嗤菌體呈現技術從人類抗體庫取得c a 依存性的與1 L-6'结合之抗體 (9 1)未經改變的（nai_ve)人類抗體噬菌體呈現庫之作依照從人類PBMC製作之多A RNA，或以市售之人類多 A RNA等為模板之該技術領域之人士公知之方法，構建呈見彼此不同的人類抗體序列《Fab域的多數嗤菌體構成的人類抗體噬菌體呈現庫。 (9-2)利用珠粒淘選從庫取得Ca依存性的與抗原結合之抗體片段從構建之未經改變的人類抗體噬菌體呈現庫最初之選拔，係藉由濃縮成僅具對於抗原（IL_6)之結合能力之抗體片段而實施。抗原使用經生物素標記之丨L_6。從保持有經構建之噬菌體呈現用噬粒（phagemid)之大腸菌生產噬菌體。藉由對於進行噬菌體之大腸菌之培養液添加2. 5 M NaCl/l〇%PEG ’使沉澱的噬菌體的集團以TBS 稀釋，藉此獲得噬菌體庫液。其次，對於噬菌體庫液添加 162 201249871 BSA及CaCh ’使終濃度成為4%BSA及i. 2mM鈣離子濃度。淘選方法’係參照一般方法即使用固定化於磁性珠粒之抗原的淘選方法（J. Immunol. Methods· (2008) 332 (卜 2)， 2-9 、 J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203 '

Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20 、 Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2)， 61-9)。磁性珠粒可使用 NeutrAv i din coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 或 Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)。

具體而言，於製備的噬菌體庫液添加250 pmol之生物素標記抗原，藉此使該噬菌體庫液於室溫接觸抗原6 〇分鐘。添加以BSA阻斷的磁性珠粒，將抗原與噬菌體之複合體於室溫結合於磁性珠粒15分鐘。將珠粒以1. 2 mM

CaCl2/TBST(含 1 2 mM CaCl2 之 TBST)洗滌 3 次後，以 1 mL 之 1. 2 mM CaCl2/TBS(含 1. 2 mM CaCh 之 TBS)再洗蘇 2 次。之後’將添加有0. 5 mL之1 mg/mL之胰蛋白酶之珠粒於室溫懸浮1 5分鐘後，立即使用磁座分離珠粒，將噬菌體溶液回收。將回收的嗤菌體溶液，添加到處於對數增瘦期（6 〇〇為0.4-0.5)之1〇111[之大腸菌株了61。於37。(：緩慢授掉，培養上述大腸菌1小時，藉此使噬菌體感染大腸菌。將經感染之大腸菌，接種到225 mm X 225 mm的平板。其次，從經接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，以製備噬菌體庫液。第2次後之淘選’係以Ca依存性結合能力為指標，實 163 201249871 施嗤菌體之濃縮。具體而言’係於製備的噬菌體庫液添加 40 pmol之生物素標記抗原，藉此使噬菌體庫於室溫與抗原接觸60分鐘。添加經BSA阻斷的磁性珠粒，使抗原與噬菌體之複合體於室溫結合於磁性珠粒15分鐘。珠粒以1社之 1. 2 mM CaCl2/TBST 與 1. 2 mM CaCl2/TBS 洗滌。之後，將添加有〇. 1 mL之2 mM EDTA/TBS的珠粒於室溫懸浮後，立即使用磁座分離珠粒，並回收噬菌體溶液。於回收之噬菌體溶液添加1〇〇 mg/mL之胰蛋白酶5//L，藉此切斷未呈現Fab之噬菌體之pHj蛋白質（幫助者（helper)噬菌體來源之Pi 11蛋白質），使未呈現Fab之噬菌體失去對於大腸菌之感染能力。將從經胰蛋白酶處理之噬菌體溶液回收之噬菌體，添加到處於對數增殖期（〇D6〇〇為〇. 4_〇. 7)之1〇 ‘ 之大腸菌株TG1。於37°c缓慢攪拌進行i小時上述大腸菌之攪拌培養，使噬菌體感染大腸菌.將感染的大腸菌接種在225 mm X 225 nun之平板。其次，從接種的大腸菌的培養液回收噬菌體，藉此回收噬菌體庫液。以Ca依存性結合月b力為指標之淘選，返覆3次。 (9-3)利用噬菌體ELISA所為之評價從依照上述方法獲得之大腸菌之單一菌落，參考常法 (Methods Mol. Biol. (2002) 1 78，133-145)回收含噬菌體之培養上清。將添加有BSA及CaCh使終濃度為及1.2 mM鈣離子濃度之含噬菌體之培養上清，以下列步驟供ELISA»將StreptaWell 96微滴定平板（R〇che)以含生物素標記抗原之100"L之PBS塗覆—晚。將該板之各井以 164 201249871

PBST洗滌，以去除抗原後，將該井以250 " L之4%BSA-TBS

阻斷1小時以上。將已去除4%BSA_TBS之各井中添加有製備之培養上清的該板，於37°C靜置1小時，藉此使呈現嗟菌體之抗體結合於各井存在之抗原。於以丨.2 mM

CaCl2/TBST 洗滌之各井中，添加 1. 2 CaCl2/TBS 或 1 mM EDTA/TBS ’將該板於37°C靜置30分鐘並溫育。以1. 2 mM

CaCh/TBST洗滌後’將以設為終濃度4%BSA及2 mM離子化鈣濃度之TBS稀釋過的HRP結合抗M13抗體（Amersham Pharmacia Biotech)添加到各井之板溫育丨小時。以丨.2 _ CaCh/TBST洗滌後，使添加有TMB single溶液（ZYMED)之各井中之溶液之發色反應藉由添加硫酸而停止後，從45〇 nm之吸光度測定該發色。使用經單離之96選殖體進行噬菌體ELISA，獲得對於 IL-6具有Ca依存性結合能力之6KC4-i#85抗體、6LC4-1#15 抗體及6LC4-2#16抗體。由上述噬菌體ELISA之結果，進行判斷為具有對於Ca依存性抗原之結合能力的抗體片段為模板’而以專一性引子放大之基因之鹼基序列解析。 6KC4-1#85抗體之重鏈可變區之序列記載於序列編號：25，及輕鍵可變區之序列記載於序列編號：26。將編碼為 6KC4-1#85抗體之重鏈可變區（序列編號：25)之聚核苷酸，以PCR法與編碼為IgGl來源序列之聚核苷酸（序列編號： 65)連結成之DNA片段，納入動物細胞表現用載體，構建表現序列編號：27表示之重鏈之載體。將編碼為6KC4-1#85 抗體之輕鍵可變區（序列編號：26)之聚核苷酸、以pcR法 165 201249871 與編碼為天然型Kappa鏈之恆定區（序列編號：28)之聚核苷酸連結成之序列編號：29表示之序列之DNA片段，納入動物細胞表現用載體。以同樣方法，將6LC4-1 #15抗體（重鏈序列編號68、輕鏈序列編號69)及6LC4-2#16抗體（重鏈序列編號70、輕鏈序列編號71)納入細胞表現用載體。製作之改變體之序列，經該技術領域之人士公知之方法確認。 (9-4)抗體之表現與精製噬菌體EL ISA之結果，將判斷為具有對於Ca依存性抗原之結合能力之選殖體，導入動物細胞表現用質體。抗體之表現係使用以下方法實施。將人類胎兒腎細胞來源

FreeStyle 293-F 株（Invitrogen)懸浮於 FreeStyle 293 Expression Medium 培養基（Invitrogen)，以 1.33 X 106 細胞/mL之細胞密度對於6井板之各井各接種3 mL。製備之質體’以脂轉染法導入細胞。於c〇2培養箱（37度、8%C〇2、 90 rpm)中培養 4 日。使用 rpr〇tein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，以該技術領域之人士公知之方法’從上述獲得之培養上清精製抗體。使用分光光度計測定經精製之抗體溶液於28〇 ηιη之吸光度。藉由使用 PACE法計算之吸光係數，從得到之測定値計算抗體濃度 (Protein Science (1995) 4，24Π-2423)。 (9-5)1弓依存性的抗1[6抗體之結合評價將取得之抗體使用 Biacore T100(GE Healthcare)， 4½於pH7. 4相關於人類介白素6 (hIL6)結合活性（解離 ^數Kd (M)) °運行緩衝液係使用含3// Μ或1. 2mM CaCl2 166 201249871 之 0_05% Tween20， 10 mmol/1 ACES, 150 mmol/1 NaCl(pH7. 4)測定。於 Sensor chip CM5(GE Healthcare)上以胺基偶聯法適量固定化重組型 PROTEIN A/G(Thermo Scientific)後，使抗體結合。注射當做分析物之適當濃度之h IL6 (人類介白素6、鎌倉Technoscience) ’使與感應晶片上之抗體交互作用。之後，注射 10 mm〇l/L Glycine-HCl (pHl.5)，使感應晶片再生。測定於37°C進行。測定之結果，獲得之傳感圖如圖15。從該等結果’可知：6LC4-l#15-IgGl及 6LC4-2#16-IgGl、6KC4-l#85-IgGl 抗體於 Ca2+濃度為 3# Μ 之條件下’比起於Ca2+濃度為1. 2mM之條件下，對於h IL6 之結合較弱。上述結果不僅是鈣依存性抗原結合之性質為實施例3所示之IL-6R ’在IL-6也有顯示，故顯示對於其他抗原也能適用。 [貫施例1 0 ] 6KC4-1 #85抗體之妈離子結合評價 (10-1 )6KC4-1#85抗體之妈離子結合評價評價從人類抗體庫取得之鈣依存性的抗原結合抗體 6KC4-1 #85抗體是否會與鈣結合。以離子化鈣濃度不同之條件，依實施例4記載之方法評價所測定之Τπ値是否有變動。 6KC4-1#85抗體之Fab域之Tm値如表U。如表u， 6KC4 1#85杬體之Fab域之Tm値會由於鈣離子之濃度而變動’所以可知：6KC4-1#85抗體會與鈣結合。【表11】 167 201249871 抗體鈣離卞濃裏~~ △ Tm(0C) 2 mM~3 u M 3/i Μ 2 mM 6KC4-1#85 71.49 ' 75.39 3.9 U〇-2)6KC4-1#85抗體之辑離子結合部位之鑑定實施例10之（10-1)顯示6KC4_1#85抗體會與鈣離子結合，但是6KC4-1#85不具有如後述hVk5_2序列之鈣結合模體。所以，為了鑑定鈣離子是否與6KC4_1#85抗體之哪一個殘基有鈣離子結合，製作6KC4_1#85抗體之CDR所存在之Asp(D)殘基取代為與鈣離子之結合或螯合無關的au(a) 殘基之改變重鏈（6_H1-11 (序列編號：30) ' 6 —H 1-12(序列編號：31) ' 6_H1-13(序列編號：32)、6_H1-14(序列編號： 33) ' 6—H1-15(序列編號：34))及改變輕鏈（6_Ll-5(序列編號.35)及6_L1-6(序列編號：36))。從導入有含改變抗體基因之表現載體的動物細胞的培養液，依實施例2記載之方法精製改變抗體。經精製之改變抗體之鈣結合，依實施例4記載之方法測定。測定結果如表12。 168 201249871 【表12】重鏈輕鏈改變殘基鈣離子濃度 ΔΤιη (°C) 3uM 2 mM 2 mM-3 u M 6KC4-1#85 6KC4-1#85 野生型 71.49 75.39 3.9 6H1-11 6KC4-1#85 H 鎖 61 位(Kabat 編號法） 71.73 75.56 3.83 6H1-12 6KC4-1#85 Η 鎖 95 位(Kabat 編號法丨 72.9 73.43 0.53 6H1-13 6KC4-1#85 Η 鎖 100a 位 (Kabat 編號法） 70.94 76.25 5.31 6H1-14 6KC4-1#85 Η鎖 lOOg位 (Kabat 編號法） 73.95 75.14 1.19 6H1-15 6KC4_1#85 Η 鎖 101 位(Kabat 編號法） 65.37 66.25 0.87 6KC4-1#85 6L1-5 L 鎖 50 位(Kabat 編號法） 71.92 76.08 4.16 6KC4-1#85 6L1-6 L 鎖 92 位(Kabat 編號法） 72.13 78.74 6.61 如表12所示，藉由將6KC4-1#85抗體之重鏈CDR3之 95位或101位（Kabat編號法）取代為Ala殘基，6KC4-1#85 抗體會失去鈣結合能力，因此可認為該殘基對於與鈣之結合為重要。從6KC4-1#85抗體之改變抗體之鈣結合性可知，6KC4-1#85抗體之重鏈CDR3之環圈基部附近存在之鈣結合模體，也可利用為本發明之抗原結合分子所包含之抗原結合域之鈣結合模體。本模體，係與實施例8發現之模體同樣之重鏈CDR3之鈣結合模體，因此，若同樣能製作例如具本模體之合成庫時，則據認為可從如此之庫有效率地取得鈣依存性結合抗體。 169 201249871 探索實施例11 ]與鈣離子結合之人類生殖細胞系列序列之系列序列之抗體人類生殖細胞系 (11-1)人類生殖細胞系列序列之取得至今為止無人報告以含人類生殖細胞與鈣離子結合之情事。所以，為了判定含選殖包含以從Human 列序列之抗體是否會與鈣離子結合

Fetal Spreen Poly RNA(cl〇ntech)製備之 π.當做模板之人類生殖細胞系列序列的抗體之生殖細胞系列的序列。將經選殖之DNA片段插入動物細胞表現載體。將獲得之表現載體之鹼基序列依該技術領域之人士公知之方法決定，其序列編號如表1 3。編碼為序列編號：37(Vkl )、序列編號：38(Vk2)、序列編號：39(Vk3)、序列編號：40(Vk4) 及序列編號：41 (Vk5)5 1聚核苷酸，與利用PCR法編碼為天然型Kappa鏈之恆定區（序列編號：28)之聚核苷酸連結成的DNA片段，納入動物細胞表現用載體。又’序列編號： 42(Vkl)、序列編號：43(Vk2)、序列編號：44(Vk3)、序列編號：45(Vk4)及編碼為序列編號：46(Vk5)之聚核苷酸’ 與編碼為利用PCR法而IgGl之C末端2個胺基酸缺損之多胜肽（序列編號：65)之聚核苷酸連結之DNA片段，納入動物細胞表現用載體。製作之改變體之序列經以該技術領域之人士公知之方法確認。 170 201249871 【表13】 .輕鏈生殖細胞系列序列 :重鍵可變區序列編號輕鏈可變菡序列編號 Vk1 42 37 Vk2 43 38 Vk3 44 39 Vk4 45 40 Vk5 46 41 (11-2)抗體之表現與精製將插入有取得之5種人類生殖細胞系列序列的DNA片段的動物細胞表現載體導入動物細胞。抗體之表現係以以下方法進行。將人類胎兒腎細胞來源Freestyle 293-F株 (Invitrogen)懸浮於 FreeStyle 293 Expression Medium 培養基（Invi trogen)，以1. 33 x 1 06細胞/mL之細胞密度對於6井板之各井接種3 mL。製備之質體以脂轉染法導入細胞。於C〇2培養箱（37度、8%C〇2、90 rpm)中進行4日培養。使用 rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham

Biosciences)並使用該技術領域之人士公知之方法，從上述獲得之培養上清精製抗體。使用分光光度計精製之抗體溶液測定於280 nm之吸光度。使用依pace法計算之吸光係數’可從獲得之測定値計算抗體濃度（Pr〇tein Science (1995) 4， 2411-2423)。 (11 - 3)含人類生殖細胞系列序列之抗體之鈣離子結合活性之評價 6平價經精製之抗體之鈣離子結合活性。將經精製之抗體提供給以 20 mM Tris-ΗΠ' 150 mM NaCL· 2 mM CaCl2(pH7· 4) 或 20 mM Tris_Hcl、15〇 mM NaC1，3#m CaCl2(pH7 4)之溶液為外液之透析（EasySEP、T0MY)處理。使用供透析之溶 171 201249871 液及製備為o.l mg/mL之抗體溶液當做待驗物質，從2(rc 至115 C以24(TC /hr之升溫速度進行Dsc測定。依據獲得之DSC之變性曲線計算之各抗體之Fab域之熱變性中間溫度（Tm値），如表14。【表14】钿胞系列序列鈣離子濃度 ΔΤπι 0C) 3/zM 2 mM 2 mM-3uM Vkl 80.32 80.78 0.46 Vk2 80.67 80.61 -0.06 Vk3 81.64 81.36 -0.28 Vk4 70.74 70.74 0 Vk5 71.52 74.17 2.65 其結果，含hVkl、hVk2、hVk3、hVk4序列之抗體之 Fab域之Tm値，不依存於含該Fab域之溶液中之鈣離子濃度’不變動。另一方面，含hVk5序列之抗體之Fab域之 Tm値’會由於含該Fab域之抗體溶液中之鈣離子濃度而變動，因此顯示hVk5序列會與鈣離子結合。 [實施例12]人類Vk5(hVk5)序列之評價 (12-l)hVk5 序列

Kabat資料庫中’ hVk5序列僅有hVk5-2序列登載。以下將hVk5與hVk5-2以相同含意處理。 (12-2)糖鏈非加成型hVk5-2序列之構建、表現及精勢 hVk5-2序列在20位（Kabat編號法）之胺基酸具有加成 N型糖鏈之序列。對於蛋白質加成之糖鏈由於存在異質性，故由物質均勻性之觀點，以不加成糖鏈為理想。而，製作 172 201249871 20位（Kabat編號法）之Asn(N)殘基取代為Thr(Th^基之改變體hVk5-2_L65(序列編號：47)。胺基酸之取代，係使用 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene) 之該技術領域之人士公知之方法進行。將編碼為改變體 hVk5-2_L6 5之DNA納入動物表現用載體。納入有製作之改變體hVk5-2_L65之DNA的動物表現用載體，與納入有表現當做重鏈之CI M_H (序列編號：48 )的動物表現用載體，以實施例2記載之方法一起導入到動物細胞中。於導入之動物細胞中表現之含hVk5-2_L65及CIM_H之抗體，以實施例2記載之方法精製。 (12-3)含糖鏈非加成型hVk5_2序列之抗體之物性評價經取得之含改變序列hVk5-2_L65之抗體，是否比起為供改變之基礎的hVk5-2序列之抗體，其異質性有所減少之情事，係使用離子交換層析分析。離子交換層析之方法如表15所示。分析結果如圖16所示，顯示糖鏈加成部位經改變之hVk5-2_L65，比起原本的hVk5-2序列，異質性有所減少。 173 201249871 【表15】鈣離子濃度管柱 TOSOH TSKgel DEAE-NPR 移動相 A; 10 mM Tris-HCl, 3// M CaCl2(pH8.0) B; 10 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，M CaCh (pH8.0) 梯度時程 %B = 0 - (5min) - 0 - 2%/lmin 管柱溫度 40°C 檢測 280 nm 注入量 100^/L (5/7g) 其次，將含有異質性減少之hVk5-2_L65序列的抗體是否會與鈣離子結合之情事，使用實施例4記載之方法評價。其結果，如表16所示，含有糖鏈加成部位經改變之 hVk5-2_L65之抗體之Fab域之Tm値，也會由於抗體溶液中之鈣離子濃度之變化而變動。亦即，顯示含糖鏈加成部位經改變之hVk5-2_L65之抗體之Fab域，會有弼離子結合。【表16】輕鏈糖鏈加成序列鈣離子濃度 ΔΤπα(°〇 3μΜ 2 mM 2 mM-3jU Μ hVk5-2 有 71.52 74.17 2.65 hVk5-2_L65 無 71.51 73.66 2.15 [實施例1 3 ]對於含hVk5-2序列之CDR序列之抗體分子之鈣離子結合活性之評價 (13-1)含hVk5-2序列之CDR序列之改變抗體之製作、表現及精製 hVk5-2_L65序列，係存在於人類Vk5-2序列之框架的糖鏈加成部位之胺基酸受改變之序列。於實施例1 2顯示即使改變糖鍵加成部位，妈離子仍會結合，但是一般而言， 174 201249871 框架序列為生殖細胞系列之序列從免疫原性之觀點為理想。所以’探討是否可能將抗體之框架序列取代為未加成糖鏈之生殖細胞系列序列之框架序列而維持對於該抗體之鈣離子之結合活性。將編碼為經化學合成之hVk5-2序列之框架序列改變為hVkl、hVk2、hVk3及hVk4序列之序列（各為CaVU (序列編號：49)、CaVk2(序列編號：50)、CaVk3(序列編號： 51)、CaVk4 (序列編號：5 2)的聚核苷酸，以PCR法與編碼為天然型Kappa鏈之恆定區（序列編號：28)之聚核苷酸連結成的DNA片段’納入動物細胞表現用載體。經製作之改變體之序列以該技術領域之人士公知之方法破認。以上述方式製作之各質體，與納入有編碼為CIM_H(序列編號：48) 之聚核苷酸之質體’ 一起以實施例2記載之方法導入動物細胞。從以上述方式導入之動物細胞之培養液，精製表現之所望之抗體分子。 (1 3-2)含hVk5-2序列之CDR序列之改變抗體之鈣離子結合活性之評價以實施例4記載之方法評價鈣離子是否會結合於含 hVk5-2序列以外之生殖細胞系列序列（hVkb hVk2、hVk3、 hVk4)之框架序列及hVK5-2序列之CDR序列的改變抗體。評價結果如表17。各改變抗體之Fab域之Tm値，顯示會由於抗體溶液中之鈣離子濃度變化而變動。是以，顯示含 hVk5-2序列之框架序列以外的框架序列的抗體也會與鈣離子結合。亦即，顯示hVk5-2序列之CDR序列所具有之模體 175 201249871 對於與鈣離子之結合係屬重要，確認框架序列可為任意框架。【表17】生殖細胞系列(輕鍵框架序列）鈣離子濃度 3μΜ 2 mM △ Tm (°C) 2 mM-3 μ Μ hVkl 77.51 79.79 2.28 hVk2 78.46 80.37 1.91 hVk3 77.27 79.54 2.27 hVk4 80.35 81.38 1,03 hVk5-2 71.52 74.17 2.65 再者’可知：改變為含有hVk5-2序列以外之生殖細胞系列序列（hVkl、hVk2、hVk3、hVk4)之框架序列及hVK5-2 序列之CDR序列的各抗體之Fab域之熱安定性之指標熱變性溫度（Tm値）’比以含有當做供改變之基礎的hVk5-2序列的抗體之Fab域之Tm値為增加。從該結果，發現：含 hVkl、hVk2、hVk3、hVk4 之框架序列及 hVk5-2 序列之 CDR 序列的抗體，具有與鈣離子結合之性質，此外，於熱安定性之觀點也為優異之分子。 [實施例14 ]人類生殖細胞系列hVk5-2序列存在之鈣離子結合部位之鑑定 (14-l)hVk5-2序列之CDR序列中之變異部位之設計如實施例13記載，含hVk5-2序列之CDR部分導入於其他生殖細胞系列之框架序列之輕鏈之抗體也會顯示與鈣離子結合。由此結果’啟示hvk5-2存在之鈣離子結合部位在CDR之中存在。與鈣離子結合，亦即螯合鈣離子之胺基 176 201249871 酸’例如負電荷之胺基酸或能成為氫鍵之接受者之胺基酸。所以，評價含有hVk5-2序列之CDR序列中存在之Asp(D) 殘基或Glu(E)殘基取代為Ala(A)殘基之變異hvk5_2序列的抗體是否會與舞離子結合。 (14-2)hVk5-2序列之Ala取代體之製作及抗體之表現及精製製作含有hVk5-2序列之CDR序列中存在之Asp及/或 G1 u殘基改變為A1 a殘基之輕鏈的抗體分子。如實施例i 2 記載，由於未加成糖鏈之改變體hVk5_2—L65維持與鈣離子結合，故由鈣離子結合性之觀點，可認為與hVk5_2序列為同等。本實施例令，以hVk5_2_L65為模板序列，進行胺基酸取代。製作之改變體如表丨8。胺基酸之取代使用

QuikChange Site-Directed Mutagenesis

Kit(stratagene) 、 PCR 或 In fusi〇n Advantage pcR cloning kit(TAKARA)等該技術領域之人士公知之方法進行’構建胺基酸經取代之改變輕鏈之表現載體。 177 201249871 【表18】輕鏈改變體名改變部位 (ICabat編號法）序列編號 hVk5-2_L65 野生型 4 7 hVk5-2_L66 30 5 3 hVk5-2_L67 31 5 4 hVk5-2_L68 32 5 5 hVk5-2_L69 50 5 6 hVk5-2_L70 30, 32 5 7 hVk5-2_L71 30, 50 5 8 hVk5-2_L72 30, 32, 50 5 9 hVk5-2_L73 92 6 0 獲得之表現載體之驗基序列以該技術領域之人士公知之方法決定。將製作之改變輕鏈之表現載體與重鏈 CIM_H(序列編號：48)之表現載體，一起暫時性導入人類胎兒腎癌細胞來源 HEK293H 株（Invitrogen)、或 FreeStyle293細胞（Invi trogen)，以使抗體表現。從獲得之培養上清，使用 rProtein A SepharoseTM Fast Flow(GE Hea 1 thcare)，以該技術領域之人士公知之方法精製抗體。經精製之抗體溶液於280 nm之吸光度，使用分光光度計測定。藉由使用PACE法計算之吸光係數，從獲得之測定値計算抗體濃度（Protein Science (1995) 4，2411-2423)。 (14-3)含hVk5-2序列之Ala取代體的抗體之鈣離子結合活性評價判定獲得之精製抗體是否會與鈣離子結合。具體而言’將經精製之抗體供以20 mM Tris-HC1、150 mM NaCl、 2 mM CaCl2(pH7. 5)或 20 mM Tris-ΗΠ、150 mM NaCl(pH7. 5) 178 201249871 之溶液（表 1 9表示tp香社。己栽鈣離子濃度〇 β Μ)為外液之透析如爾、丽）處理。使用透析用之溶液並以製備為〇 i mg/此之抗體溶液當做待驗物質，於2代至115t以 240°C/hr之升溫速度進行DSC測定。依據獲得之Dsc之變性曲線计算之各抗體之Fab域之熱變性中間溫度値），如表19。表中存在有藉由將hVk5_2序列之CDR序列中存在之Asp或Glu殘基取代為與鈣離子之結合或螯合無關的

Ala殘基’由於抗體溶液之鈣離子濃度之變化其Fab域之

Tm値不會變動之抗體。顯示由於a丨a取代而Tm値不變動之取代部位（32位及92位（Kabat編號法）），對於鈣離子與抗體之結合特別重要^ 【表19】輕鏈改變體名改變部位(Kabat編號鈣離子濃度 ATm(0C) 法） ΟμΜ 2 mM 2 hVk5-2_L65 野生型 71.71 73.69 1.98 hVk5-2_L66 30 71.65 72.83 1.18 hVk5-2_L67 31 71.52 73.30 1.78 hVk5-2_L68 32 73.25 74.03 0.78 hVk5-2_L69 50 72.00 73.97 1.97 hVk5-2_L70 30, 32 73.42 73.60 0.18 hVk5-2_L71 30, 50 71.84 72.57 0.73 hVk5-2_L72 30, 32, 50 75.04 75.17 0.13 hVk5-2_L73 92 75.23 75.04 -0.19 [實施例15]含具鈣離子結合模體之hVkl序列之抗體之鈣離子結合活性之評價 (15-1)具鈣離子結合模體之hVkl序列之製作及抗體之表現及精製 179 201249871 從實施例14記載之A1 a取代體之鈣之結合活性之結果’顯示hVk5-2序列之CDR序列之中，Asp或G1 u殘基對於軒結合為重要。所以，評價是否僅將30位、31位、32 位、5 0位及92位（Kabat編號法）之殘基導入其他生殖細胞系列之可變區序列，仍能與鈣離子結合。具體而言，製作人類生殖細胞系序列hVkl序列之30位、31位、32位、50 位及92位（Kabat編號法）之殘基取代為hVk5-2序列之30 位、31位、32位、50位及92位（Kabat編號法）之殘基之改變體L f Vk 1 _Ca (序列編號：61)。亦即，判定是否含有僅導入有hVk5-2序列中之該等5殘基的hVkl序列的抗體能與鈣結合。改變體之製作與實施例2同樣進行。將獲得之輕鏈改變體LfVkl_Ca與含輕鏈hVkl序列之LfVkl(序列編號：62) ’與重鏈CIM_H(序列編號：48)一起表現。抗體之表現及精製與實施例14以同樣方法實施。 (15-2)含具鈣離子結合模體之人類hVki序列之抗體之在弓離子結合活性之評價以貫細*例4 s己載之方法判定如上述獲得之精製抗體是否會與鈣離子結合。其結果如表2〇。含有具hvki序列之 LfVkl的抗體之Fab域之Tm値不會隨抗體溶液中之鈣濃度變化而變動’另—方面’含有LfVkl—Ca之抗體序列之Tm 値會隨抗體溶液中之鈣濃度之變化而變化rc以上，因此，顯示含LfVkl_Ca之抗體會與鈣結合。由上述結果，鈣離子之結合’完全不需要hVk5_2之CDR序列，僅在構建LfVkl_Ca 序列時導入之殘基也就足夠。 180 201249871 【表2 0】輕鏈改變體纖子濃度 △ Tm(°C) 3//M 2 mM 2 mM-3# Μ LfVkl 83.18 83.81 0.63 LfVkl一Ca 79.83 82.24 2.41 (15-3)分解抑制型LfVkl_Ca序列之構建、表現及精製製作實施例15之（15-2)中的人類生殖細胞系序列 hVkl序列之30位、31位、32位、50位及92位（Kabat編號法）之殘基改為hVk5-2序列之30位、31位、32位、50 位及92位（Kabat編號法）之殘基的改變體LfVkl —Ca(序列編號：61) ’顯示鈣離子結合。而，據認為含LfVkl —Ca序列之Ca依存性抗體（Ca結合抗體），但由於新穎序列Lf Vk 1 —Ca序列當做醫藥品之保存安定性不明，故其當做醫藥品之可應用性不明。而，利用Lf Vk 1 — Ca之熱加速試驗評價安定性。將L鏈具有LfVkl — Ca之抗體於20 πιΜ

Histidine-HCl、150 mM NaCl、ρΗ6.0 之溶液於 4°C 之條件透析一晚。將經透析之抗體製備成〇. 5 mg/mL，於5°C或 50°C保存3日。將保存後之各抗體以實施例12記載之方法進行離子乂換層析。其結果’如圖17所示，確認[f Vk 1 Ca於50 C保存3曰時會顯著分解。LfVkl Ca序列，據報告於30位、31位及32位（Kabat編號法）存在Asp且於酸性條件下會分解之Asp-Asp序列於CDR1序列中存在

Pharm. Blomed. Anal. (2008) 47( 1 )，23_3〇)，故據認為 3〇位、31位及32位（Kabat編號法）為可分解處。為了避 181 201249871 免LfVkl —Ca之分解’製作可能分解之3處Asp(D)殘基取代為Ala(A)殘基之改變體LfVkl_Cal (序列編號：72)、 LfVkl_Ca2(序列編號：73)及 LfVkl_Ca3(序列編號：74)。胺基酸之取代係使用 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)之該技術領域之人士公知之方法進行。將編碼為改變體之dna納入動物表現用載體。製作之納入有改變體之DNA的動物表現用載體，與納入使表現為重鏈之GC Η(序列編號：1〇2)的動物表現用載體’以實施例14記載之方法一起導入動物細胞中中。將導入之動物細胞中表現之抗體，以實施例14記載之方法精製。 (15-4)含分解抑制型LfVkl — Ca序列之抗體之安定性評價利用熱加速後之各抗體之異質性之比較以評價於實施例15之（15-3)取得之抗體是否比起含成為供改變之基礎之LfVkl_Ca序列之抗體在ρΗ6·0溶液中之分解受抑制。與上述同樣，將抗體於5t或5(TC保存3日》保存後之各抗體以實施例12記載之方法進行離子交換層析。分析之結果，如圖17所示，30號（Kabat編號法）部位經改變之 LfVkl一Cal，比起原本的LfVkl_Ca序列的異質性少由於熱加速所致分解顯示顯著受抑制。亦即，顯示“^匕^序財之30位存在之Asp⑻殘基分解，並且顯示Asp一殘基之分解能藉由胺基酸改變避免。 (15-5)輕鏈30位Asp殘基分解抑制型Lfvu—以序列 182 201249871 之製作及抗體之表現及精製從實施例1 5之（1 5 - 4、#淑 V 4 ) 3己載之A1 a取代體之分解抑制之結果，顯示LfVkl Ca序列夕rnD十a 。 ~ 汁夕j之CDR序列之中之30位（Kabat 編號法Asp(D)殘基於酸性條件分解，且藉由將3〇位 (Kabat .編號法）取代為其他胺基酸((15_4)中係取代為 Ala(A)殘基），能抑制分解。而’對於3Μα(κ^^編號法）之殘基取代為能螯合㉝離子之殘基之—個&⑻殘基而成序列(稱為LfVkl_Ca6。序列編號：75)，是否能於維持鈣結合能力之下使分解受抑制進行評價。改變體之製作與實施例14同樣進行。將獲得之輕鏈改變體LfVkl-Ca6及輕鏈 LfVkl_Ca序列與重鏈GC_H(序列編號：1〇2) 一起表現。抗體之表現及精製，係與實施例丨4以同樣方法實施。 (1 5-6)¼鏈30位Asp殘基分解抑制型Lf Vkl_Ca序列之評價如以上述方法獲付之精製抗體之酸性條件下之保存安定性’以實施例15之（15-4)記載之方法判定。其結果如圖 18所示’含LfVkl_Ca6序列之抗體，顯示比起含原本的 LfVkl_Ca序列之抗體其分解受抑制。再者，以實施例1 5記載之方法判定含Lf Vkl_Ca序列之抗體及含LfVkl_Ca6序列之抗體是否會與^弓離子结人。其結果如表21。含Lf Vkl_Ca序列之抗體及含分解抑制型 LfVkl_Ca6序列之抗體之Fab域之Tm値，各隨抗體溶液中之鈣濃度之變化而變化1°C以上。 183 201249871 【表21】輕鏈改變體鈣離子濃度 △ Tm (。0 2 3"M 2 mM LfVk1_Ca 78.45 80. 06 1.61 LfVk1_Ca6 78.44 79.74 1.30 由以上之結果，若考慮安定性，顯示30位為能與Asp 以外之鈣離子交互作用之胺基酸（Asn、Glu、Gln、Ser、Thr、

His、Tyr等），且31位、32位、50位及92位（Kabat編號法）之序列之全部或一部分為hVk5_2之胺基酸、或能與鈣父互作用之胺基酸（ASp、Asn、Glu、Gin' Ser、Thr、His、 Tyr等），顯示對於抗體之鈣離子之結合為重要。例如據認為若能製作具有如此的模體之合成庫，則能從如此的庫有效率的取得4弓依存性結合抗體。 [實施例1 6 ]利用NMR評價具含鈣離子結合模體之人類 hVk 1序列之抗體之轉離子結合活性 (16-1)抗體之表現與精製將用於NMR測定而使表現之含LfVkl-Ca之抗體與含 LfVkl之抗體精製。具體而言，將含LfVkl-Ca之抗體以各能使表現重鏈（序列編號：13 )與輕鏈（序列編號· 6丨）的方式製備之動物表現用質體對於動物細胞暫時性導入。又，將含LfVk 1之抗體以各能使表現重鏈（序列編號：13)與輕鏈（序列編號 62)之方式製備之動物表現用質體暫時性導入動物細胞。於以最終細胞密度成為i χ 1〇6細胞/mL之方式懸浮於 FreeStyle 293 Expression Medium 培養基 (Invitrogen)之100 mL之人類胎兒腎細胞來源FreeStyle 293-F株（Invitrogen)之細胞懸浮液中，添加標記胺基酸。 184 201249871 具體而言，添加針對 Asp/Glu/Gln/Asn標記體，將 L-Aspart i c ac i d-13C4, 15N( 1 0 mg) 、 L-G1 utami c acid-13Cs，15N(2.5 mg)、L-Glutamine-13Cs，15N2(60 mg)、 L-Asparagine-13C4, 15N2 . H2〇(2. 5 mg) 、 /5 -chloro_L-alanine(6 mg)懸浮於10 mL之水而成的溶液以0. 22 // m濾膜過濾之液體。針對Leu標記體，添加將 L-Leucine-15N(30 mg)、；5-chloro-L-alanine(6 mg)懸浮於10 mL之水而成的溶液以0. 2 2 μ m濾膜過濾之液體。將以脂轉染法製備之質體導入細胞。導入有質體之細胞於C〇2 培養箱（37°C、8%C〇2、90 rpm)中培養5日依照使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)之該技術領域之人士公知之方法’從如上述方法獲得之培養上清精製抗體。使用分光光度計測定經精製之抗體溶液於2 8 0 nm之吸光度。使用利用PACE法計算之吸光係數，從測定値計算抗體濃度（Protein Science (1995) 4，2411-2423)。 (16-2)Fab片段之製備使用分子量區分尺寸30, 00 OMWCO之超過濾膜，將各種抗體濃縮至 8. 2-11 · 8 mg/mL。使用 L-Cystein 1 mM、EDTA 2 mM、50 mM乙酸/125 mMTris緩衝液（ΡΗ 6· 8)，製備稀釋成8 mg/mL之該抗體之試樣。將對於各抗體添加1/24〇量之 Papain(Roche Applied Science)並經攪拌之該試樣，於37°C靜置1小時。靜置後’添加到於各下游以連續連結

大小 1 mL 之 ProteinA 載體管柱 HiTrapMabSelect Sure(GE Healthcare)而成之經以50 mM乙酸/125 mMTris緩衝液（PH 185 201249871 6.8)平衡化之結合有617_(；17_1^1__計2(^卵3)胜肽之大小 1 mL 之 HiTrap NHS-activated HP(GE Healthcare)。藉由

以上游的Gly-Gly-Tyr-Arg胜肽去除活化papain，並以下游的ProteinA載體管柱去除Fc片段及未消化抗體，獲得 Fab片段之精製區分。為了防止Fab區分所包含之不活性 Papain活化’於Fab區分添加半胱胺酸蛋白酶抑制劑 E64(Sigma)10 // M。又’上述所有的管柱操作係於2〇至25°C 之室溫下實施。 (16-3)LfVkl一Ca抗體及LfVkl抗體之Fab片段之NMR 試樣製備將抗體溶液使用MWC0 5000之超過濾器 Vivaspin(Sartorius)離心至〇.5 mL以濃縮。其次，於上述超過濾器設置透析過濾杯，對於NMR用緩衝液：5 mM d-BisTris, 20 mM NaCl, 0. 〇〇ι % (w/v) NaNs, 5 % (v/v) 2H2〇，pH 7. 0(使用NaOH、HC1調整pH)進行緩衝液取代（於透析過慮杯補充上述緩衝液5 mL並離心濃縮至〇. 5 mL之操作返覆3次）’最後濃縮至〇· 25 mL。最後，以NMR緩衝液清洗超過濾器，與濃縮液合併，抗體溶液針對Lf Vk 1 _Ca 抗體調成42 0 // L、針對LfVkl抗體調成270 // L。於此階段再度確認pH，並且視需要以NaOH、HC1調整為PH 7. 0。使用 UV 測定器 Nanodrop(Thermo Fisher Scientific)，測定於280 nm之吸光度，並且以280 nm之莫耳吸光係數定為 70000 · cm 1，定量 Fab 片段。Leu 標記 LfVkl_Ca 抗體、Leu 標記 LfVkl 抗體成為 0.12 mM、Asp、Glu、Asn、 186 201249871

Gin標記LfVkl_Ca抗體、 0^ sp Glu、Asn、Gin 標記抗體成為〇. 24 _。該；^ q # ,^ Λ#5式樣之中，針對LfVkl_Ca抗體，使用移液營充填於首獅ς 、、 5 _ 之 NMR 試管（shigemi),針對 L f V k 1抗體，充填於直挪、二5 mm之水溶液用對稱形微型試管 s igenu)。於LfVkl_Ca抗體之ca、定實驗，於抗體溶液添加CaCh洛液，使對於抗體依；^ ea、卜2 + 10,莫耳等量。於添加使用之_溶液中，準備溶於隱緩衝液之10、20、50、10“咖2溶液。利用針筒邰刀為比現有製品更為延長之特別訂製的微型針筒 (ιτο)，將CaCh溶液之必要量直接添加到充填於nmr試管之抗體溶液並且使添加容量成為3_1〇“之範圍，將試管以Vortex混合器攪拌後，以手動離心器（Shi随dz幻離心分離。 (16-4)用於觀測LfVkl_Ca抗體及LfVkl_Ca抗體之

Fab片段之醯胺基信號之·R測定 NMR測疋使用設置有TCI CryoProbe之NMR分光器 DRX750 (Bruker Biospin)。設定溫度定為 307K(GasF1〇w 535 L/h)。用於觀測醯胺基信號之關R測定，使用HSQC。測定法，15N展開期，使用α碳與羰基碳之同時"c去偶聯、及溶劑水信號消去用之伴隨3-9-19pulse train之1Η-15Ν FHSQC，且用於控制其之脈衝程式，使用由製造商（Bruker Biospin)準備當做標準者。NMR之測定條件如下。光譜寬：12019Hz (f2)，1 976 Hz (fl)、數據點數：2048 (f2)， 128 (f 1)。數據處理，使用 Topspin 3. 0(Bruker Biospin)。 187 201249871 數據處理條件如下。將f 2、f 1同時乘以當做窗函數之 shifted Sine (QSINE)，並且進行填零（zero filling)使成為2倍之數據點數後，進行傅利葉變換。使用NMR解析軟體Sparky(UCSF)計算信號之化學偏移。 (16-5)主鏈醯胺基之NMR信號之指派（assignment) 至今為止，toci 1 izumab(重鏈序列編號：13、輕鏈序列編號：14)之Fab片段之主鏈醯胺基之NMR信號中，有 8 0%指派（數據未公開）。LfVkl_Ca抗體之Fab片段之胺基酸序列，除了與輕鏈CDR1、CDR2、CDR3的一部分、及輕鏈 73、83號之胺基酸殘基以外，toci 1 izumab與Fab片段之胺基酸序列相同。針對兩抗體的胺基酸序列相同之部分，其NMR信號具有相同或接近的化學偏移，可移動 toci 1 i zumab之指派資訊。針對Leu標記試樣，輕鏈11、 (33) 、（46) 、（47) 、（54) 、（78) 、 125 、 135 、 136 、 154 、 175、179、181、201、重鏈 18、46、64、71、81、83、114、 144、147、165、176、181、184、195 可行指派。上述未附括弧的編號與toe i 1 i zumab為相同的化學偏移，為能行才曰派之殘基編號’有附括弧之編號與t 〇 c i 1 i z u m a b具有相近的化學偏移’其他沒有具相近化學偏移之信號，故為能指派之殘基編號。另一方面，針對Asp、Glu、Asn、Gln標記試樣，比較LfVkl_Ca抗體與LfVkl抗體之光譜，於 Lf Vkl_Ca新觀測到4個信號。此可分類為該兩抗體間在

Asp ' Glu、Asn、Gin殘基中，當做ca2 +結合模體導入之序列之不同輕鏈Asp30、31、32、92、Glu50之5個殘基當中 188 201249871 任4個殘基來源者。 (16-6)Ca2 +之LfVkl_Ca抗體上之結合部位之鑑定將LfVkl_Ca抗體之Fab片段之Ca2+未添加狀態、與添加20莫耳等量之HSQC光譜比較，並抽取有化學偏移變化之信號。其結果，從Leu標記試樣可知：輕鏈[別33 涉及結合，其他Leu殘基不涉及結合。又，從Asp、Glu、

Asn、Gin 標記試樣可知：輕鏈 Asp30、31 ' 32、92、Glu50 之5個殘基中的任4個殘基涉及結合，其他Asp、Giu、Asn、 Gin殘基當中除】個殘基以外的全部殘基不涉及結合。由以上，鑑定當做Ca2 +結合模體導入之胺基酸序列之中，至少輕鏈CDR1、以及輕鏈CDR2、CDR3兩者或任一之胺基酸涉及Ca結合。此與實施例15確認之位、31位、32位、 50位及92位（Kabat編號法）當中的4個為hVk5-2序列之胺基酸對於鈣離子結合為重要之結果為一致。 (16-7)滴定實驗之Ca2 +解離常數之計算對於Ca2 +濃度為LfVkl一Ca抗體之Fab片段，利用〇、卜 2 ' 5、10、20莫耳等量時之lH」5NHSQC光譜。以鑑定為結合部位之輕鏈Leu33之信號之]H或化學偏移為縱軸，以上述Ca2+之莫耳等量為橫軸作圖，使用製圖軟體 Gnuplot，進行以下式2所示函數之適擬。 [式2] f(x)= 4xxxa2)0 5} 4xxxa2)0'5} s X[1-0.5/ax{(axx+a+Kd)-( (axx+a+Kd)2 -^ tx[0.5/ax{(axx+a+Kd)-( (axx+a+Kd)2 - 189 201249871 式2表示之函數中，s、t各代表Ca2 +非結合時之化學偏移[ppm]、Ca2 +飽和結合時之推定化學偏移[ppm]、a代表抗體Fab片段濃度[Μ ]、Kd代表解離常數、X代表對於抗體Fab片段添加之Ca2+之莫耳等量。適擬時，以s，t，Kd 當做適擬參數。其結果，從1Η化學偏移估計

Kd = 7. 1χ1(Γ5[Μ]、從 15Ν 化學偏移估計 Kd = 5. 9χ1(Γ5[Μ]。 [實施例1 7 ]hVk5-2變異體序列之鈣結合評價獲得Vk5-2(序列編號：41)以外，分類為Vk5-2之Vk5~2 變異體1(序列編號：63)及Vk5-2變異體2(序列編號：64)。針對該等變異體也進行鈣結合評價。將Vk5-2、Vk5-2變異體1及Vk5-2變異體2之DNA片段分別納入動物細胞用表現載體。獲得之表現載體之鹼基序列以該技術領域之人士公知之方法決定。各納入有Vk5-2、Vk5-2變異體1及Vk5~2 變異體2之DNA片段的動物細胞用表現載體，與納入有表現當做重鏈之CIM_H(序列編號：48)的動物表現用載體， —起以實施例13記載之方法導入動物細胞中，並且精製抗體。評價經精製之抗體之鈣離子結合活性》將經精製之抗體提供給以 20 mM Tris-ΗΠ、150 mM NaC卜 2 mM CaCl2(pH7. 5) 或 20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl(pH7.5)之溶液（表 22 表示記載4弓離子濃度〇mM)當做外液之透析（EasySEP、TOMY) 處理。使用透析使用之溶液及製備為〇. 1 mg/mL之抗體溶液當做待驗物質，於2(TC至115°C以24(TC/hr之升溫速度進行DSC測定。依據獲得之DSC之變性曲線計算之各抗體之Fab域之熱變性中間溫度（Tm値），如表22。 190 201249871

ΔΤπι (°C) 2 mM-OmM

其結果’含Vk5-2、Vk5-2變異體1及vk5-2變異體2 之序列的抗體t Fab域之Tm値’會隨含該㈣域之抗體溶液中之I弓離子濃度而轡舍ϊ，i + 辰厌叫1動由此顯示含分類為Vk5-2之序列的抗體會與_離子結合。 [實施例18]鈣依存性的與人類CM之抗體 (18-1)可溶型人類CD4之製備可溶型人類CD4以如下方式製備。將編碼為膜貫通區缺扣之人類CD4之胺基酸序列加成有Myc標嵌的序列（序列編號.76)的DNA序列納入動物細胞表現用載體。製作之重組人類CD4之序列以該技術領域之人士公知之方法確認。 (18-2)與可溶型人類CD4結合之抗體之表現與精製 TNX355-IgGl(重鏈序列編號：77、輕鏈序列編號：78) 及Q425(重鏈序列編號：79、輕鏈序列編號：80)，為抗人類CD4抗體。再者’ Q425L9C重鏈序列編號：81、輕鏈序列編號：82)為Q425之L鏈改變體。將編碼為 TNX35 5- 1gG 1 (重鏈序列編號：77、輕鏈序列編號：78)、 Q425(重鏈序列編號：79、輕鏈序列編號：80)及Q425L9C重鏈序列編號：81、輕鏈序列編號：8 2)之胺基酸之DNA序列，導入動物細胞表現用質體。抗體之表現係使用以下方法進行。將人類胎兒腎細胞來源 FreeStyle 293-F株 191 201249871 (Invitrogen)懸浮於 FreeStyle 293 Expression Medium 培養基（Invi trogen)，以1. 33 x 1 〇6細胞/mL之細胞密度對於6井板之各井各接種3 mL。製備之質體以脂轉染法導入細胞。於C〇2培養箱（37°C、8%C〇2、90 rpm)中培養4日。使用 rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，以該技術領域之人士公知之方法，從上述獲得之培養上清精製抗體。使用分光光度計測定經精製之抗體溶液於280 nm之吸光度。藉由使用由PACE法計算之吸光係數，從獲得之測定値計算抗體濃度（p r 〇 t e i n

Science (1995) 4， 241卜2423)。 (18-3)取得之抗體對於人類CD4之鈣依存性結合能力評價取得之抗體對於可溶型人類CD4之鈣依存性結合能力’使用Biacore T100 (GE Healthcare)評價。高躬離子濃度使用1.2 mM，低鈣離子濃度之條件使用3μ μ。抗原使用可溶型人類CD4(於18-1製備）。於Sens〇r chip CM4(GE Healthcare)上以胺偶聯法將 protein G(Invitr〇gen)適量固定化，並使其捕捉目的之抗體。運行緩衝液使用含12 mmol/L CaCI〗或 3"mol/L CaCU 之 1〇 mmol/L· ACES、150 _1/L NaCl、〇· 05% (w/v) Tween20、l. 2 _〇1/L CaCh、

PH7.4或PH6.0。測定均於37t實施，人類CD4之稀釋也使用各自的緩衝液。抗體之傳感圖如圖19。如圖19, TNX355-IgGl抗體由於即使運行緩衝液之條件變化時傳感圖之形狀也不變化，因此確認TNX355_IgGl為對於人類CM 192 201249871 不顯示鈣依存性的結合活性的通常之抗體。另一方面，Q425 抗體及Q425L9抗體均於齊離子濃度為M(低約離子濃度）時之抗原結合量比起鈣離子濃度為丨· 2 mM (高鈣離子濃度）時之抗原結合量少’顯示Ca依存性結合能力。尤其， Q425L9抗體若於鈣離子濃度為3 " μ時’當以200 nM之分析物（可溶性人類CD4)測定時完全未觀測到結合相。亦即，確認Q425抗體及Q425L9抗體對於人類CM顯示鈣依存性的結合活性的鈣依存性結合。 [實施例19]使用正常小鼠評價Ca依存性結合抗體對於抗原之血製中滯留性之影響 (1 9 -1)使用正常小鼠之體内試驗實施例18製備之Q425及Q425L9，係以鈣依存性的與可溶型人類CD4結合之抗體。但是至今為止，雖已如實施例5及實施例6所示，由IL6R明白具有將以鈣依存性的與抗原結合之性質的抗體與抗原同時投予時，比以將無鈣依存性的與抗原結合之性質的抗體與抗原同時投予時，會有加速抗原消失之性質，但是其他抗原是否也具有使抗原之消失加速之性質尚為不明。所以評價對於正常小鼠（C57BL/6J mouse、Charles

River japan)將可溶型人類CD4(實施例18中製備）單獨投予或將可溶型人類CD4及抗人類cD4抗體同時投予後之可溶型人類CD4及抗人類CD4抗體之體内動態。將可溶型人類CD4溶液（5〇wg/mL)、或可溶型人類CD4及抗人類⑶4 抗體之混合溶液對於尾靜脈以丨〇 mL/kg單次投予。抗人類 193 201249871 CD4 抗體使用上述 TNX355_IgG1、Q425_Ig(n、Q425L9_igGi。混合溶液中之可溶型人類CD4濃度均為5〇 # g/mL，但抗人類CD4抗體濃度依抗體而不同’ TNX355_Ig(n為〇 264 mg/mL、Q425-IgGl 為〇· 197 mg/mL、及 Q425L9-IgGl 為 2. 594 mg/mL ’此時由於抗人類CD4抗體對於可溶型人類C])4存在充分過剩量，故可認為可溶型人類CD4大部分與抗體結合。投予後，可溶型人類CD4單獨投予之群於2分鐘、5 分鐘、15分鐘、3 0分鐘、1小時、2小時採血。同時投予可溶型人類CD4及無鈣依存性的抗原結合能力的 TNX355-IgGl的群，於投予後5分鐘、2小時、7小時、j 日、3日、7日、14日、28日採血。同時投予具可溶型人類CD4及鈣依存性的抗原結合能力的Q425_IgG1及 Q425L9-IgGl之群，於投予後5分鐘、3〇分鐘、2小時、7 小時、1日、3日、8日、14日、28日採血。將採取之血液立即於4 C以12，0 0 0 rpm進行15分鐘離心分離，獲得血漿。分離之血漿直到實施測定為止，保存於設定在_ 2 〇以下之冷凍庫。 (19 - 2)利用EL IS A法測定正常小鼠血漿中之抗人類 CD4抗體濃度小鼠血漿中之抗人類CD4抗體濃度以ELISA法測定。

首先’將 Anti-Human IgG(r -chain specific) F(ab，）2 Fragment of Antibody (SIGMA)分注於 Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup (Nalge nunc International)，於 4〇C 靜置1晚’製作Ant i-Human IgG固相化板。製備血漿中濃 194 201249871

度為 0. 64、0. 32、〇. 16、0. 08、0· 04、0. 02、0. 01 /z g/mL 之檢量線試樣及稀釋1 〇〇倍以上之小鼠血漿測定試樣，分注到Ant i-Human IgG固相化板，於25°C進行1小時溫育。之後，使 Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D) 於 2 5 °C 反應 1 小時，再使 Streptavidin-P〇lyHRP80(Stereospeci f ic Detection Technologies)於 25°C 反應 0. 5 小時，以 TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)當做基質進行發色反應，以 1N-Sulfuric acid(Showa Chemical)停止反應後’以微平板讀取儀測定4 5 〇 nm之吸光度。小鼠血漿中濃度’由檢量線之吸光度使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)計算。以該方法測定之靜脈内投予後之正常小鼠中， TNX355-IgGl、Q425-IgGl 及 Q425L9-IgGl 之血漿中抗體濃度變化如圖20。 (19-3)以電化學發光法測定血漿中可溶型人類CD4濃度小鼠之企衆中可溶型人類CD4濃度以ELISA法測定。針對sCD4單獨投予之群· Q425、Q425—L9同時投予之群，將 TNX 分注於 Nunc-Immuno piate, Maxis〇up(Nalge nunc International)，於4〇c靜置丨晚，製作ΤΝχ固相化板。以含1 OmM EDTA之緩衝液製備血漿中濃度為丨〇、5、 2' 5 1· 25、〇· 625、0. 3125、〇. 156 以 g/mL 之檢量線試樣及稀釋1 00倍以上之小鼠金製測定試樣，分注到I·固相 195 201249871 化板’並於 25°C進行 3 小時溫育。之後使

Anti-c-myc-HRP(Miltenyi Biotech)於 25°C 反應 1 小時，以 TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)當做基質進行發色反應，以in-硫酸（Showa Chemical)停止反應後，以微平板讀取儀測定450 nm之吸光度。小鼠企漿中濃度，使用檢量線之吸光度使用解析軟體 SOFTmax PR〇(Molecular Devices)計算。針對與TNX同時投予之群，將Q425分注到Nunc-Immuno

Plate， MaxiSoup (Nalge nunc International)，於 4°C 靜置1晚，製作Q425固相化板。以含2mM Ca2+之緩衝液製備血漿中濃度為 20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 /zg/mL 之檢量線試樣及稀釋1 0 0倍以上之小鼠血漿測定試樣，分注到TNX固相化板，並於25°C進行3小時溫育。之後將

Anti-c-myc-HRP (Miltenyi Biotech)於 25。(：反應 1 小時，使用 TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX

Laboratories)當做基質進行發色反應，以iN_硫酸（Showa Chemical)停止反應後’以微平板讀取儀測定450 nm之吸光度。小鼠血漿中濃度，從檢量線之吸光度使用解析軟體 SOFTmax PRO(Molecular Devices)計算。該方法測定之靜脈内投予後之正常小鼠中之血漿中可溶型人類CD4濃度變化如圖21。結果’可/谷型人類CD4單獨顯示非常快消失，相對於此’同時投予可溶型人類CD4與無ca依存性結合之通常之抗體TNX355-IgGl時，可溶型人類CD4之消失大幅減慢。 196 201249871 相對於此，同時投予可溶型人類CD4與具Ca依存性結合之 Q425-IgG1或Q425L9-IgG1時，可溶型人類cd4之消失大幅加速。比起同時投予TNX355_IgG1之情形，同時投予 Q425-IgGl或Q425L9-IgGl時可促進可溶型人類CD4消失。藉此，不僅於IL-6R確認鈣依存性結合抗體可達成抗原從血漿中消失，於人類CD4也確認。 [貫施例2 0 ] i弓依存性的與人類I gA結合之抗體 (20-1)人類IgA(hlgA)之製備為抗原之人類I gA之重組人類I ga (以下h I gA)依如下方式製備。使含H(WT)-IgAl (序列編號：83)與L(WT)(序列編號：14)之hlgA表現，並依該技術領域之人士公知之方法使用離子交換層析及凝膠過濾層析精製。 (2 0 - 2)與人類I g A結合之抗體之表現與精製 GA1 -1 gG 1 (重鏈序列編號：84 '輕鏈序列編號：8 5)、 GA2-IgGl(重鏈序列編號：86、輕鏈序列編號：87)、 GA3-IgGl (重鏈序列編號：88、輕鏈序列編號：89)及 GA4-IgGl(重鏈序列編號：90、輕鏈序列編號：91)，係與人類I gA結合之抗體。再者，與實施例6及實施例7同樣，為了使抗原（hlgA)從血漿中之消失更為增大，為了增強小鼠FcRn對於GA2-IgGl於pH7. 4之結合，製作導入有N434W 之胺基酸取代之GA2-N434WC重鏈序列編號：92、輕鏈序列編號：87)。將編碼為GAl-IgGl (重鏈序列編號：84、輕鏈序列編號：85)、GA2-1 gG 1 (重鏈序列編號：8 6、輕鏈序列編號：8 7)、G A 3 -1 g G1 (重鍵序列編號：8 8、輕鍵序列編號： 197 201249871 8 9)、G A 4 -1 g G1 (重鍵序列編號.9 0、輕鍵序列編號：g 1) 及GA2_N434W(重鍵序列編號.92、輕鍵序列編號：87)之 DNA序列以該技術領域之人士公知之方法納入動物表現用質體。抗體之表現使用以下方法進行。將人類胎兒腎細胞來源 FreeStyle 293-F 株（Invitrogen)懸浮於 FreeStyle 293 Expression Medium 培養基（Invitrogen)，以 1. 33 x 106

個/mL之細胞密度對於6井盤的各井各接種3 mL，將以脂轉染法製備之質體導入細胞。於C〇2培養箱（37°C、8%C〇2，90 rpin)培養 4日’ 4文獲付之培養上清使用 rProtein A

SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)以該技術領域之人士公知之方法精製抗體。精製抗體濃度，使用分光光度計測定於28 0 nm之吸光度。從獲得之値使用依pace 法計算之吸光係數，計算抗體濃度（Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423)。 (20-3)取得之抗體對於人類IgA之Ca依存性結合能力評價取得之抗體使用Biacore T200 (GE Healthcare)關於人類IgA結合活性（解離常數Kd (Μ))進行評價。運行緩衝液使用含 3yM 或 1.2 mM CaCh 之 0.05% tween20，20 mmol/1 ACES, 150 mmol/1 NaCl(pH7. 4 及 pH5. 8)、含 0. 1 # Μ 或 10 mM CaCh 之 0.05% tween20，20 mmol/1 ACES, 150 mmol/1 NaCl、pH8.0 進行測定。於 Sensor chip CM5(GE Healthcare)上以胺基偶聯法將重組型 PROTEIN A/G(Thermo Scientific)適量固定化 198 201249871 後’使抗體結合。注入當做分析物之適當濃度的h I g A (記載於（20-1))，使與感應晶片上之抗體交互作用。之後，注入10 mmol/L Glycine-HCl，pHl. 5，使感應晶片再生。測定於37°C進行。測定結果使用Biacore T200 Evaluation Sof tware(GE Heal thcare)，利用曲線適擬之解析及平衡値解析’計算解離常數Kd 其結果如表2;^又，獲得之傳感圖如圖 22。可知：GA2-IgGl、GA3-IgGl、GA4-IgGl 於 Ca2 +濃度為1. 2 mM時與人類IgA強力結合，但於Ca2+濃度為3 /z Μ時與人類I gA為弱結合。【表23】抗體名條件適擬(fit) ka kd KD GA1-lgG1 PH8.0, 1〇mMCa 1：1binding model 1.10E+06 2.40E-01 2. 20E-07 PH8. 6, 0.1 ^ M Ca 1：1binding model ϊ. 2〇E+〇6 1.20E-01 1.00E-07 PH7.4, 1.2mMCa 1：1binding model 5.70E+05 8.40E-02 1.50E-07 PH7.4, 3_ yM Ca 1:1binding model 6. 40E+05 1.20E-01 1.90E-07 pH5. 8. 1.2 mM Ca 1：1binding model 6. 80E+05 9. 90E-02 1.40E-07 PH5.8, 3 Ca 1 Mbinding model 7.10E+05 1.10E-01 1.50E-07 GA2-igG1 pH7. 4, 1.2 mM Ca 1:1binding model 4. 00E+05 1.60E-02 3. 90E-08 PH7.4, 3 Ca Steady State Affinity - - 6. 70E-06 PH5.8, 1.2mMCa Steady State Affinity - - 4.00E-06 PH5.8, 3 "M Ca Steady State Affinity - - 5. OOE-06 GA3-lgG1 PH7.4, 1.2 mM Ca 1:1binding model 4.30E+05 3.30E-02 7. 90E-08 pH7.4, 3 juM Ca Steady State Affinity - - - PH5.8. 1.2mMCa 1:Ibinding model 4.40E+05 3. 50E-02 8.10E-08 PH5.8. 3 Ca Steady State Affinity - - 1.10E-06 GA4-lgG1 PH7.4, 1.2mMCa Steady State Affinity - - 4.20E-07 pH7.4, 3 x/M Ca Steady State Affinity - - 8. 90E-07 PH5.8. 1.2 mM Ca Steady State Affinity - - 1.10E-06 pH5.8, 3 //M Ca Steady State Affinity - - 1.50E-06 [實施例21 ]使用正常小鼠評價Ca依存性人類I gA結合抗體對於抗原之血漿中滯留性之影響 (21 -1)使用正常小鼠之體内試驗評價對於正常小鼠（C57BL/6J mouse、Charles River 199 201249871

Japan))if 人類 TgAr λ #ε τ .— Μ(人類IgA :貫施例2〇製作）單獨投將人類IgA及抗人類IgA抗體同時投予後之人類w及抗人類UA抗體之體内動態。將人類IgA溶液⑻ 或人類IgA及抗人類IgA抗體之混合溶液對於 .…次投予。抗人類IgA抗體，使用上述 ^A3-IgGl,GA2_N434W〇 IgG1、混合溶液中之人類IgA濃度均為8〇"g/mL，但抗人類

IgA抗體濃度因應各抗體對於hlgA之親和性而依抗體不同 ’ GAl-IgGl 為 100 mg/mL、GA2_IgG1 為 28·9 岐/以、 GA3-IgGl 為 53· 8 ing/mL、GA2-N434W 為 1 mg/mL。此時，由於對於人類IgA之抗人類igA抗體係有足量過剩，故可認為人類IgA大部分與抗體結合。投予後5分鐘、7小時、 1日、2日、3日、7日進行採血。將採取之血液立即於4〇c 以12，00 〇 rpm進行15分鐘離心分離，獲得血漿。分離之血漿直到實施測定為止，保存在設定為_2〇〇c以下之冷凍庫。 (21-2)利用ELISA法測定正常小鼠血漿中之抗人類 IgA抗體濃度小鼠血漿中之抗人類IgA抗體濃度以ELISA法測定。首先’將 Anti-Human IgG(y -chain specific) F(ab’）2 Fragment of Antibody (SIGMA)分注於 Nunc-I mmuno Plate, MaxiSoup(Nalge nunc International)，於 4°C 靜置1晚，製作Anti-Human IgG固相化板。製備血漿中濃度為 0.5、0.25、0.125、0.0625、0.031 25、0.0 1 563、 200 201249871 0. 0 781 3 " g/mL之檢量線試樣及稀釋100倍以上之小鼠血敵測定試樣，分注到Anti-Human IgG固相化板，於25°C 溫育 1 小時。之後，使 Goat Anti-Human IgG (τ chain specific) Biotin (BIOT) Conjugate(Southern Biotechnology Associats Inc.)於 25°C 反應 1 小時，再將 Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)於 25°C 反應 1 小時，使用 TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)為基質進行發色反應，以IN-硫酸（Showa Chemical)使反應停止後，以微平板讀取儀測定450 nm之吸光度。小鼠血漿中濃度，係從檢量線之吸光度使用解析軟體 SOFTmax ?的(^〇16(：1113]^1^¥丨063)計算。該方法測定之靜脈内投予後之正常小鼠中的GA卜IgGl、GA2-IgGl、GA3-IgGl及 GA2-N434W之血漿中抗體濃度變化如圖23。 (2卜3)利用EL ISA法測定血漿中人類I gA濃度小鼠之血漿中人類IgA濃度，以ELISA法測定。首先，將 Goat anti-Human IgA Antibody(BETHYL)分注於 Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup(Nalge nunc

International) ’ 於 4°c靜置 i 晚’製作 Anti_Human igA 固相化板。製備血漿中濃度為0.4、0.2、〇.卜0.〇5、〇.〇25、 0_0125、0.00625yg/mL之人類IgA檢量線試樣及稀釋1〇〇倍以上之小鼠血漿測定試樣，於該等檢量線試樣及血漿測定試樣100//L添加500 ng/mL之hsIL-6R200#L，於室溫靜置1小時。之後分注於Anti-Human IgA固相化板，再於 201 201249871 室溫靜置 1 小時。之後，使 Biotinylated Anti-human IL_6 R Anti body (R&D)於室溫反應 i 小時，再使 Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)於室溫反應 1 小時，以 TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)為基質進行發色反應，以IN-硫酸（Showa Chemical)使反應停止後，以微平板讀取儀測定450 nm之吸光度。小鼠血漿中濃度，係從：檢量線之吸光度使用解析軟體sOFTmax PRCKMolecular Devices)計算。該方法測定之靜脈内投予後之正常小鼠中之血漿中人類IgA濃度變化如圖24。結果’相對於人類I gA單獨之消失，同時投予人類I ga 與Ca依存性結合弱（依存性程度小）之抗體GAl-IgGl時，人類IgA之消失慢。相對於此，同時投予人類IgA與有1 〇〇倍以上之Ca依存性結合之GA2-IgGl時，人類IgA之消失大幅加速。從圖23所示之血漿中抗體濃度、圖24所示之血漿：中人類IgA濃度及表23所示之各抗體之KD値，求出血名中存在之非結合型之人類I g A濃度。其結果如圖2 5。如圖25,與GA卜IgGl投予群之非結合型之抗原（人類IgA) 之濃度比較，GA2-igG1或GA3_IgG1投予群之非結合型之抗原（人類IgA)之濃度低，因此顯示藉由鈣依存性結合抗體加速抗原之消失，能降低非結合型之抗原（人類IgA)。再者，於PH7.4之FcRn結合經增強之GA2-N434W，其抗原之消失比GA2-IgGl快，投予7小時後成為檢測極限以下。從以上確認：鈣依存性結合抗體比起pH或沒有鈣依存 202 201249871 性的結合之通常之抗體，可加速抗原從血漿中消失，該現象不僅於實施例5所示之人類IL6R或實施例19所示之人類CD4,在人類IgA也會發生。又，與實施例6及實施例7 之人類IL6R同樣，也確認藉由增加對於鈣依存性結合抗體在PH7. 4之FcRn結合，在人類IgA也能加速抗原之消失。一如參考實施例3卜以pH依存性的與人類IL__6受體結合之Fv4-IgGl’比起以非pH依存性的與人類Il_6受體結合之H54/L28-IgG卜人類iL-6受體之消失能加速，但是，人類IL-6受體單獨無法加速消失.為了加速人類^_6受體單獨之消失，必需使用使中性區之對於F c R n之結合增強 < Fv4-IgGl-vl 或 Fv4-IgGl-v2 。另一方面，令人意外地發現，Ca依存性的與人類igA 、”。合之GA2-IgGl，儘官含有於中性區對於FcRn之結合未增強之天然型IgGl之恆定區，但是人類IgA之消失比起人

IgA單獨加速。如此的現象，於GA2_IgG1發生的理由，據認為是由於以下機制。為人類IL-6受體之單體抗原時，對於2價之抗體有2 個抗原結合’且會形成由抗原抗體3分子構成的抗原抗體複合體。另一方面，人類IgA為二聚體抗原，抗體也是2 仏’故兩者之抗原抗體複纟體據認'為會形成抗原抗體4分子以上構成的抗原抗體複合體（免疫複合體）。対於多元體抗原免疫複合體時，該免疫複合體可對於FcgR、FcRn、補體體等介由多價之Fc區域以avidity結合，因此，相對於 203 201249871 入表現該等受體之細胞，不且 « ^ ^ 丄，、pH/Ca依存性之對抗單體抗原之通㊉#几體’由於對於天鈇 …、igbi型的受體的親和性不足’納入細胞之效率低。原本陶作用為將納入細胞内之抗體從㈣體再循環到血㈣，但對於如此之對於F. 能以多價結合之大型免疫複合體，已知會介由Μη而從核内體移到溶體並被分解。亦即，如圖26，形成對於多元體抗原之大型免疫複合體之通常抗體，其可加速抗原之消失，但是由於在核内體内’抗原不會從抗體解離，而合虫抗原同時使抗體也消失，故抗體！分子之使抗原消失之效率差。亦即’不具pH/c：a依存性之對於單體抗原的通常抗體雖旎加速抗原之消失，但其效率據認為係差的。相對於此，包含對抗多元體抗原之天然型IgGi之恆定區之PH/Ca依存性抗體形成大型免疫複合體時，如圖”，該免疫複合體會對於FcgR、FcRn、補體受體等經由多價之 Fc區域以avidity結合，並納入表現該等受體之細胞。之後，於核内體内抗原從PH/Ca依存性抗體解離，藉此解除免疫複合體之形成。抗原由於不能與FcRn結合，故相對於移到溶體並被分解，由於抗體不會形成免疫複合體，故據認為能以FcRn再循環於血漿中。亦即’含對抗多元體抗原之天然I gG 1型之恆定區的 pH/Ca依存性抗體若形成大型免疫複合體，並以avidity 與FcgR、FcRn、補體受體等結合，據認為能僅選擇性地大幅加速抗原之消失。如此的現象，據認為在對抗人類I g A 之GA2-IgGl也會發生。據認為當做不使用參考實施例31 204 201249871 所不之對於天然型1gG1以胺基酸取代增加中性區之FcRn 之結合之方法，而大幅加速多元體抗原之消失之方法有用。為了發揮如此的作用，據認為抗原抗體必需形成大型 =疫複合體，且1gG1也要以aviditY與FcgR/FcRn強力結 °抗原若為二量體以上之抗原，則若能篩選形成大型免疫複。體，且以avidity與上述受體結合之依存性柷體，能不進行胺基酸取代而使用天然型IgG1之恆定區，有效率的加速抗原之消失。又，一般而言為了使抗原與抗體形成大型免疫複合體，據認為抗原必需為多元體抗原（例如IgA，IgE等免疫球蛋白或TNF，CD154等TNF超級家私）’但據認為即使是單體抗原’但使用認識該單體抗原存在之2個以上之抗原決定基之適當的2種以上之pH/Ca依存性抗體之混合物’也能形成大型免疫複合體。又，使用 °忍識單體抗原存在之2個以上之抗原決定基之適當的多專性pH/Ca依存性抗體（例如：圖28所示之含認識抗原決定基A之右臂與認識抗原決定基b之左臂之天然型I g(j之恆定區的雙專一性抗體），據認為也能形成大型免疫複合體。亦即’即使對於單體抗原，若能篩選適當pH/Ca依存性抗體’則藉由使用含天然型I gG 1之恆定區之抗體之混合物或多專一性天然型I gG 1之恆定區之抗體，可不使用其之胺基酸經取代之變異型IgGl而可有效率加速抗原之消失。 [實施例22 ]鈣依存性的與人類G1 ypi can3結合之抗體 (22-1)人類 Glypican3(GPC3)之製備當做抗原之重組人類G1 y p i can3 (以下GPC3)，以下列 205 201249871 :式製備。培養將不含人類Glypican3之膜貫通區之胺基序]連、D 6個殘基之組胺酸的序列（序列編號：9 3)穩定導表見之質體的CH0細胞，並回收培養上清。將獲得之圪養上π進仃離子交換層析精製後，進行使用Hi s標籤之親和性精製及凝膠過濾層析精製，獲得GPC3。 (22-2)與人類GPC3結合之抗體之表現與精製將杬人類Glypican3抗體、CSCM-〇l_〇〇5(重鏈序列： 94 '輕鏈序列：95)、CSCM_〇1_〇〇9(重鏈序列：96、輕鏈序列.97)、CSCM-〇l_〇l5(重鏈序列：98、輕鏈序列：99)、 CSCM-〇l_〇23(重鏈序列：1〇〇、輕鏈序列：1〇1)及GC-igGi(重鏈序列：1 0 2、輕鏈序列：1 〇 3)各插入動物表現用質體。抗體之表現使用以下方法進行。將人類胎兒腎細胞來源

FreeStyle 293-F 株（Invitrogen)懸浮於 FreeStyle 293 Expression Medium 培養基（Invitrogen)，以 1.33 X 106 個/mL之細胞密度對於6井盤的各井各接種3 mL，以脂轉染法將製備之質體導入細胞。以C〇2培養箱（37。(：、8%C〇2, 90 rpm)培養4曰’從獲得之培養上清使用rProteiη A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，以該技術領域之人士公知之方法精製抗體。精製抗體濃度，使用分光光度計測定於280 nm之吸光度。從獲得之値，使用依 PACE法計算之吸光係數計算抗體濃度（Protein Science 1 995 ; 4 : 241卜2423)。又，針對GC-IgGl抗體，從穩定表現GC-IgGl抗體之CH0細胞培養上清，以同樣方法精製抗體並計算濃度。 206 201249871 (22-3)取得之抗體對於人類GPC3之Ca依存性結合能力評價

取得之抗體以下列步驟供ELISA。將StreptaWell 96 微滴定板（Roche)以含生物素標記抗原之loo# LPBS塗覆一晚。將該板之各井以 ACES buffer(10 mM ACES, 150 mM

NaCl, 100 CaCl2,0.05% Tween20，pH7.4)洗滌，以去除抗原後’將該井以含2%BSA之ACES Buffer 250 " L阻斷 1小時以上。於去除含2%BSA之ACES Buffer之各井，添加預先從l〇eg/mL各稀釋4倍之精製IgGg 100/zl，將該板靜置1小時，藉此使IgG與各井存在之抗原結合。以 ACES Buffer洗滌過之各井中，添加「1〇 mM ACES15〇

NaCl，1.2mMCaCl2，pH7.4」、「i〇mMACES，150mMNaCl， 3//M CaCl2，PH7.4」、「10 mM ACES，15〇 mM Nan，12 mMCaCl2, PH5.8」或「lOmMACES，UOmMNaCl, 3//MCaCl2, PH5.8」’將該板於37°C靜置30分鐘並溫育。以訧以如衍” 洗滌後，以含2%BSA之ACES Buffer稀釋過之HRP結合抗人類IgG抗體（BI0S0URCE)對於各井添加，將板溫育i小時。以ACES Buf f er洗滌後，添加有TMB single溶液（zymed) 之各井中之溶液之發色反應藉由硫酸之添加使停止後，測定於450 nm之吸光度之發色。測定之結果如圖29。GC-IgGl中，無論鈣離子之濃度，吸光度為相同，相對於此，csciwjm、cSeM_Q1 CSCM-0U—M5及CSCM-01_023中’比起1.2 _辦離一子濃度 (高妈離子濃度）之吸光度，詞離子濃度（㈣離子^ 207 201249871 度）之吸光度顯著較低。由該結果可知：cscm qi呢、 cscM-cn—m'csnw及⑽丸似具有_離子濃度而與抗原之結合會變化之性質，顯示對於人類 GlypicanS也可取得㈣存性抗體。該等触存性的抗人類G1yP1Can3抗體，比起通常之抗人類〜仏㈣抗體，與上述實施例之人類IL_6R、人類CD4、人類W同樣，據 5忍為可加速人類Glvnir'an?之、、古土 $ . wypicand之确失。再者，對於該等鈣依存性抗人類抗Glypican3抗體，藉由增加於pH7. 4對於F — 之結合，據認為可進一步加速人類Glypican3之消失。 [實施例23]鈣依存性的與IgE結合之抗體 (23-1)生物素化人類IgE之製備抗原人類IgE以下列方式製備。製作插入有編碼為

IgE_H(序列編號：1Q4、c末端連結有生物素加成序列）及 L(WT)(序列編號：⑷之觀序列的動物細胞表現載體，並且使用該表現載體及FreeStyle293(Invitr〇gen)在培養上清中使C末端結合有生物素加成序列之全長之人類㈣蛋白質表現。從獲得之培養上清，進行離子交換層析、使用抗生物素之親和性精製及凝膠過濾層析精製，獲得生物素化人類IgE。 (23-2)與人類IgE結合之抗體之表現與精製 GEB010G(重鏈序列編號：m、輕鏈序列編號：1〇6)、 GEB0220C重鏈序列編號：1〇7、輕鏈序列編號：1〇8)、 GEB0230(重鏈序列編號：ι〇9、輕鏈序列編號：ιι〇)及 Xo 1 a 1 r (重鏈序列編號：i丨丨、輕鏈序列編號：丨1 2)，為與 208 201249871 人類I gE結合之抗體。將GEBO10 0 (重鏈序列編號：1 〇 5、輕鏈序列編號：1 06)、GEB022Ο(重鏈序列編號：1 〇7、輕鏈序列編號：108)、GEB0230C重鏈序列編號：109、輕鏈序列編號：110)及Xolair(—般名Omalizumab)(重鏈序列編 5虎.111、輕鍵序列編5虎.11 2 )以該技術領域之人士公知的方法納入各動物表現用質體。抗體之表現以下列方法進行。對於人類胎兒腎細胞來源FreeStyle 293-F株 (Invi trogen)，以脂轉染法將製備之質體導入細胞。於c〇2 培養箱（37°C、8%C〇2，90 rpm)進行4至7日培養，從獲得之培養上清，使用 rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，以該技術領域之人士公知之方法精製抗體。精製抗體濃度，係使用分光光度計測定於280 nm之吸光度。從獲得之値，使用依PACE法計算之吸光係數，計算抗體濃度（Protein Science 1 995 ; 4 : 241卜2423)。 (23-3)取得之抗體對於人類igE之Ca依存性結合能力之評價取得之抗體對於人類I gE之Ca依存性結合能力之評價，使用ELISA法進行。具體而言，於NUNCUiMUN0384井板 MaxiSorp (Thermo fisher scientific 公司製 464718) 添加 l#g/mL 之 Goat anti-rabbit IgG-Fc polyclonal antibody(Bethyl laboratory 公司製 A120-111A)或 1 ^ g/inL 之 Goat anti -human I gG-Fc polyclonal ant ibody( ICN biomedicals 公司製 55071) 40/zL。於室 209 201249871 溫進行1小時溫育後’除去溶液，添加稀釋為2〇%之 Mocking One 試藥（Nacalai tesque 公司製〇3953_95) 50# L。於室溫進行！小時溫育後，去除溶液，添加以含 1.2 mM氣化鈣之Tris緩衝溶液稀釋過的精製抗體4〇# [。於4°C進行-晚溫育後，以含u-氯化每與〇〇5%(w/v) 之Tween-20的Tris緩衝溶液80# [洗滌3次，添加以含 1.2 mM氣化鈣之Tris緩衝溶液稀釋為5〇〇ng/mL2生物素化人類IgE((23-l)製作）40#L。於室溫進行i小時溫育後，以含 1.2mM 氣化鈣與 0.05%(w/v)之 Tween_2〇i 緩衝溶液80#L進行3次洗滌，添加含2mM氣化鈣之ACES 緩衝溶液（pH7. 4)或含3" Μ氯化鈣之虬£5緩衝溶液（pH7. 4) 80/^L，立即去除溶液後，再添加含2禮氣化鈣之“以緩衝溶液（PH7.4)或含3" Μ氣化鈣之ACES緩衝溶液（pH7 4) 80/zL。於37°C進行1小時溫育後，以含12 _氯化鈣與〇_ 〇5%(w/v)之 Tween-20 之 Tris 緩衝溶液 80// L 洗滌 3 次，

添加以含1.2 mM氣化鈣之Tris緩衝溶液稀釋為25 ng/mL 之HRP標記鏈抗生物素（Thermo fisher scientific公司製21 1 32)40 "L。於室溫進行！小時溫育後，以含12 -

氣化鈣與〇.〇5%(w/v)之Tween-20之Tris緩衝溶液80"L

洗滌3次，添加發色基質（KPL公司製5〇_66_〇6: ABTS

Peroxidase substrate system 1 component)4〇//L。於室溫進行15分鐘或30分鐘溫育後，測定4〇5nm之吸光度 (Molecular devices 公司製 SpectraMax P1US384)。測定結果如圖30。Xolair中，不依存於鈣離子濃度， 210 201249871 GEB(J0 ,相同’相對於此’於_100、GEB〇220及，比起於2禮鈣離子濃度（高鈣離子濃度）之吸光又:於心Μ _子濃度（低弼離+濃度）之吸光度顯著較 \由該結果顯示：G删⑽、_22()及⑽隱具有隨好離子/農度，與抗原之結合變化之性f。上述現象顯示，對於人類IgE也可取得触存‘隊體。該㈣依存性抗人類=抗體’比起χ—ΐΓ等通常之抗人類㈣抗體，與上，貫施例之人類IL，、人類CD4、人類igA同樣，據認為可加速人_ IgE之消失。再者’藉由對於該㈣依存性抗口類UE抗體，使於ρΗ7·4對於FcRn之結合增強據認為可更加速人類IgE之消失。 [參考例1]可溶型人類IL_6受體（hsIL_6R)之製備】抗原人類IL-6受體之重組人類IL_6受體，以下列方式製備。以該技術領域之人士公知之方法構建並培養穩定 f 現由 J. Immunol· 152，4958-4968 (1 994)報告之 ^^末端側1號至357號之胺基酸序列構成的可溶型人類IL_6受體（以下稱為hsIL-6R)之CH0穩定表現株，使hsIL_6R表見從獲得之培養上清，以Blue Sepharose 6 FF管柱層析、凝膠過濾管柱層析2個步驟精製hsIL_6R。於最終步驟，以溶出為主要峰部之區分當做最終精製品。 [參考例2]人類FcRn之製備

FcRn，為FcRn與万2-微球蛋白之複合體。依據公開之人類FcRn基因序列製備寡DNA引子（JExpMed. 1994

Dec 1; 180(6)·· 2377-81)。編碼為全體基因之DNA片段， 211 201249871 使用製備之引子，並以人類cDNA(Human Placenta

Marathon-Ready cDNA，Clontech)為模板，以 PCR 製備。使用獲得之DNA片段當做模板，將編碼為含信號區 (1^1;1〜1^112 90 )之細胞外域的〇^片段以？〇?放大，並插入哺乳動物細胞表現載體。同樣，依據公開的人類沒2_微球蛋白基因序列（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26): 16899-16903 (2002))製作募DNA引子。編碼為全體基因之 DNA片段，使用製備之引子，及以人類cDNA(Humanpiacenta

Marathon-Ready cDNA，Clontech)當做模板，以 pcR 製備。使用獲得之DNA月段當做模板，將編碼為含信號區 (Met 1〜Met 11 9)之蛋白質全體之DNA片段以PCR放大，並插入哺乳動物細胞表現載體。可溶型人類FcRn以下列步驟使表現。將為了表現人類 FcRn(序列編號：17)及冷2-微球蛋白（序列編號：18)而構建之質體’利用使用PEI(P〇lyscience)之脂轉染法，導入人類胎兒腎癌來源細胞株HEK293H(Invitrogen)之細胞。回收獲4于之培養上清，使用IgG Sepharose 6 Fast

Flow(Amersham Biosciences)精製後，以 HiTrap Q HP(GE

Healthcare)(J Immunol. 2002 Nov 1； 169(9): 5171-80) 將FcRn進一步精製。 [參考例3 ] pH依存性的抗原結合抗體之抗原消失加速效果之提高探討（體内試驗） (3-1)於中性條件下具對於fcRn之結合之ρη依存性人類IL-6受體結合抗體之製備 212 201249871 對於含VH3-IgGl(序列編號：19)與VL3_CK(序列編號：20)之Fv4-IgGl，導入於中性條件下（pH74)使對於 FcRn之結合增加之變異。具體而言，製備對於丨以丨之重鏈恆疋區，EU編號法之252號從Met取代為Tyr、254號從Ser取代為Thr、256號從Thr取代為Glu之 VH3-IgGl-vl (序列編號：21)、及對於IgGl之重鏈恆定區， EU編號法之434號從Asn取代為Trp之VH3-IgGl-v2(序列編號.22)。胺基酸取代之導入，係使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)或 In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)，以附屬説明書記載之方法製作變異體’並將獲得之質體片段插入動物細胞表現載體’製作目的之Η鏈表現載體及l鏈表現載體。獲得之表現載體之鹼基序列，以該技術領域之人士公知之方法決定。含Η54(序列編號：5)與L28(序列編號__ 6)之 H54/L28-IgGl、含 VH3-IgGl(序列編號：19)與 VL3-CK(序列編號：20)之Fv4-IgGl、含VH3-IgG卜vl (序列編號：21) 與 VL3-CK(序列編7虎.20)之 Fv4_IgGl_vl、及含 VH3-IgGl-v2(序列編號：22)與VL3-CK(序列編號：20)之

Fv4-1gG 1 -v2之表現及精製，依以下方法進行。依照製造商提供之實驗步驟記載，使FreestyleHEK293 (Invitrogen) 或HEK293H株（Invitrogen)表現抗體。將人類胎兒腎癌細胞來源HEK293H株（Invitrogen)懸浮於含10%胎牛血清 (Invi trogen)之 DMEM 培養基（Invitrogen)，並以 5〜6 X 105 213 201249871 個/mL之細胞密度對於各黏著細胞用培養皿（直徑1 〇 cm, CORNING)之各皿接種 i〇 mL，於 CO2 培養箱（37°C、5 % CO2) 内培養一日夜後，抽走培養基，添加 CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培養基 6.9 mL。將製備之質體以脂轉染法導入細胞。回收獲得之培養上清後，離心分離 (約2000 g、5分鐘、室溫）去除細胞，再通過〇. 22 M ^濾膜减11^£乂（註冊商標）-〇乂（^^111?01^)滅菌，獲得培養上清。獲得之培養上清使用rprot?in A Sephar〇se(商標）

Fast FlowUmersham Biosciences)，依該技術領域之人士公知之方法精製。精製抗體濃度，係使用分光光度計測定於280 nm之吸光度。從獲得之値，使用依Pr〇tei[i Science 1995，4 : 2411-2423之方法計算之吸光係數，計算抗體濃度。依該技術領域之人士公知之方法使表現並精製。 (3-2)使用人類FcRn基因轉殖小鼠及正常小鼠之體内試驗對於人類卩〇1?11基因轉殖小鼠（36.1111^1?11_/_汕1^^1^ 系統 276 +/ +小鼠、jackson Lab〇rat〇ries、Meth〇ds Μ〇ι Βι〇1· 2010;602:93-1 04.)及正常小鼠（C57BL/6J 小鼠、 Charles River japan)單獨投予hsIL_6R(可溶型人類1卜6 文體：參考例1製備）’或同時投予hsIL-6R及抗人類Il__6 受體抗體後，評價hsIL-6R及抗人類IL_6受體抗體之活體内之動態。將hsIL-6R溶液（5// g/mL)或hsIL-6R及抗人類 IL ^又體抗體之混合溶液（各為g/mL、〇. 1 mg/mL)對於尾靜脈1 0 mL/kg單次投予。此時，由於對於hsIL_6R存在 214 201249871 刀里k剩的抗人類I L - 6兵·Η·胁-Γ 、又體抗體，故可認為hs IL-6R幾乎全部與抗體。招_ ; , R八μ &予15分後、7小時後Μ日後、2 3曰後、4曰後、7 ρ 4 , ^ 後、14日後' 21日後、28日後採血。將採取之血液立即於。 ' 4 L以15, 〇〇〇 rpm進行15分鐘離心分離，獲得血漿。八M^ —、。刀離之血漿於實施測定為止’保存在設疋為-20C以下之冷凍庫。抗人類iL—6受體抗體，於人類他基因轉殖小鼠使用上述H54/L28-IgG卜Fv4-IgG卜 4 IgGl v2，於正常小鼠使用上述H54/L28-IgGl、

Fv4—IgGl 、 Fv4-IgG卜v卜及 ' Fv4_IgG卜v2 。 (3 3)利用ELISA法測定血漿中抗人類IL_6受體抗體濃度小鼠血漿中之抗人類IL_6受體抗體濃度，以eusa法測定。首先將抗人類IgG(T鏈特異的）F(ab，）2抗體片段 (Slgma)分注於 Nunc-Il«munoPlate, MaxiSorp (Nalge Nunc International)，於靜置一晚，製備抗人類IgG 固相化板。製備血漿中濃度為〇. 8、〇. 4 ' 〇. 2、〇. 1、〇. 〇5、 0.025、0.0125/zg/mL之檢量線試樣及稀釋1〇〇倍以上之小鼠血漿測疋试樣，對於該等檢量線試樣及企漿測定試樣 100/z L 添加 20 ng/mL 之 hsIL-6R 200 /z L，於室溫靜置 1 小時。之後’分注到抗人類I gG固相化板，於室溫靜置1 小時。之後將生物素化抗人類IL-6 R抗體（R&D)於室溫反應 1 小時’再使 Streptavidin-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies)於室溫反應 1 小時，以 TMB One

Component HRP Microwell Substrate (BioFX 215 201249871

Laboratories)當做基質進行發色反應，以1N硫酸（Sh〇wa

Chemical)使反應停止後，以微平板讀取儀測定450 nm之吸光度。小鼠血漿中濃度，係從檢量線之吸光度，使用解析軟體 SOFTmax PR〇(M〇lecular Devices)計算。以該方法測定之靜脈内投予後之人類FcRn基因轉殖小鼠之血漿中抗體濃度變化如圖31，於正常小鼠之血漿中抗體濃度變化如圖33。 (3-4)利用電化學發光法測定血漿中hsIL_6R濃度小鼠之血漿中hsIL-6R濃度，以電化學發光法測定。製備調整為 2000、1〇〇〇、5〇〇、250、125、62.5、及 31.25 pg/mL之濃度的hsIL-6R檢量線試樣及稀釋5〇倍以上之小鼠血聚測定試樣。將試樣與以SULF〇_TAG NHS Ester(Mes〇

ScaleDiscovery)釕化之單株抗人類IL_6R抗體（r&d)'生物素化抗人類IL-6 R抗體（R&D)、及WT_Ig(n溶液混合，於3rc使反應一晚。此時之抗人類IL 6受體抗體：為比起含H(WT)(序列編號：13)與L(WT)(序列編號：14)之 WT IgGl之終/農度過剩於試樣所包含之抗人類受體抗體濃度之333 //g/mL，目的為使試樣中幾乎所有hsIL-6R 與WT IgGl結合之狀態。之後，分注於隨〇〇 π

StreptaV1din Plate(Mes〇 Scale Disc〇very)。再於室溫使反應1小時並洗務後，分注Read Buffer T(x4)(Mes〇

Scale DiSC〇Very)，立即以 SECTOR PR 400 reader(Mes〇

ScaleD1SC〇very)測定。hsIL_6R濃度’係從檢量線之回應使用解析軟體·Tmax PRQ(Mc)leeuiaF Deviees)_^ 216 201249871 該方法測定之靜脈内投予後之血漿中hsIL-6R濃度變化如 hsIL-6R濃度變化如圖34。人類FcRn基因轉殖小鼠於圖3 2，正常小鼠之血漿中度 (3-5)利用電化學發光法測疋血聚中游離hsIL-6R濃為了評價可溶型人类員IL_6受體在血漿中以哪個程度 ’以電化學發光法測定小鼠血漿中未被抗人類il —6受中和體抗體結合（中和）之可溶型人類IL_6受體濃度（游離 hsIL-6R 濃度）。將調整為 1〇〇〇〇、5〇〇〇、25〇〇、125〇、、 312.5、或1 56.25 pg/mL之hsIL-6R檢量線試樣及小鼠之血漿試樣12//L，添加到於〇.22以m之濾杯（MiUip〇re) 乾燥過的適量 rprotein A Sephar〇se Fas1： Fi〇w (ge Healthcare)樹脂，以使血漿中存在之全部IgG型抗體（小鼠IgG、抗人類IL-6受體抗體及抗人類IL_6受體抗體_可溶型人類IL-6受體複合體）吸附於pR〇TEIN a。之後，以咼速離心機離心下來，回收通過溶液。通過溶液中不含與 PROTEIN A結合之抗人類il-6受體抗體-可溶型人類il-6 受體複合體’故藉由測定通過溶液中之hsIL-6R濃度，可測定血漿中之游離hsIL-6R濃度。其次將通過溶液與以 SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)釕化之單株抗人類IL-6R抗體（r&d)及生物素化抗人類il-6 R抗體

(R&D)混合，於室溫反應1小時。之後，分注於MA40 0 PR

Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)。再於室溫進行1小時反應’並洗滌後，分注Read Buffer T(x4)(Meso 217 201249871

Scale Discovery)，立即以 SECT〇R pR 400 reader(Meso

Scale Discovery)測定。hsiL_6R濃度，係從檢量線之回應’使用解析軟體 SOFTmax PR〇(M〇lecular Devices)計算。該方法測定之靜脈内投予後之正常小鼠血漿中之游離 hsIL-6R濃度變化如圖35。 (3-6)pH依存性的人類IL_6受體結合之效果比較H54/L28-IgGl具有pH依存性人類IL_6受體結合之Fv4-IgGl之體内試驗之結果。如圖31及圖33，兩者之抗體血漿中滯留性大約同等，但如圖32及圖34，與具pH 依存性人類IL-6受體結合之Fv4_IgG1同時之hsIL_6R，

比起與H54/L28-IgGl同時投予之hsiL-6R，確認hsIL-6R 之消失較快。該傾向於人類FcRn基因轉殖小鼠與正常小鼠兩者均確3忍，發現：藉由賦予pH依存性人類I受體結合月b力，在4日後之血漿中hs丨L_6R濃度大約可減低約口倍及約34倍。 (3-7)於中性條件下（pH7 4)對於FcRn結合之效果據報告··天然型人類IgG1於中性條件下（pH74)與人類FcRn幾乎不結合（親和性極弱）。對於天然型人類IgG1 藉由將Εϋ編號法434號從Asn取代為Trp，可增加於中性條件下（PH7.4)對於人自FeRn之結纟（：Im麵〇1 2〇〇9;182(12):7663_71·) 。 & 車交 Fv4_ig(n 、及對於

Fv4-IgG1導入有該胺基酸取代iFv4_IgGi_v2於人類基因轉殖小鼠之體内試驗之結果。如圖31，兩者之抗體血聚中滯留性大約同等’但如32 ’與在中性條件下⑽· 4) 218 201249871 對於人類FcRn之結合增加之Fv4-IgGl-v2同時投予之 hsIL-6R ’比起與Fv4_IgG1同時投予之hsIL_6R，確認 hsIL-6R之消失較快。發現：藉由賦予於中性條件下（pH7. 4) 對於人類FcRn之結合’ 4日後之血漿中hsIL-6R濃度能減少約4倍。由人類FcRn與小鼠FcRn之同一性，據認為eu編號法434號從Asn取代為Trp，也會使中性條件下（pjj7. 4)對於小鼠FcRn之結合增加。又，有人報告βυ編號法252號從Met取代為Tyr、254號從Ser取代為Thr、256號從Thr 取代為Glu，能使中性條件下（ρΗ7·4)對於小鼠FcRn之結合（J Immunol. 2002;169(9):517卜80.)。比較

Fv4-IgG1、及對於Fv4_IgG1各導入有該等胺基酸取代之 Fv4 IgGl vi與Fv4-IgGl-v2在正常小鼠之體内試驗之結果。如圖33，比起Fv4-IgGl，於中性條件下（pH74)使對於小鼠FcRn之結合也增加之Fv4_IgG1_vl與之也漿中滯留性稍低（1日後之血漿令抗體濃度各為低約 1. 5倍及約1. 9倍）。如圖34,與中性條件下（PH7.4)之對於小鼠FcRn之結合增加之Fv4-IgG1-vl或Fv4_IgG1_v2同時投予^ hsIL-6R’ 比起與 Fv4_IgG1 同時之 hsIL_6R，確認 hsi^^ 之消失顯著較快。發現藉由於中性條件下（pH74)賦予對於小鼠FcRn之結合，Fv4_IgG1_vl與Fv4_ig(j卜v2在1日後之血漿中hsIL-6R濃度各可減少約32倍及約8〇倍。發現藉由賦予於令性條件下(ρΗ7·4)對於小鼠之結合，如 219 201249871 上述’抗體之血漿中濃度稍低，但是血漿中hsIL-6R濃度減低效果顯示超出其許多的情形。又，比起hsIL-6R單獨之投予群’發現與Fv4-IgGl-vl或Fv4-IgGl-v2同時投予之hsIL-6R’其hsIL-6R之消失較快。如圖34,比起hsIL-6R 單獨投予，與Fv4-IgGl-vl或Fv4-IgGl-v2同時投予 hsIL-6R時’發現1日後之血漿中hsIL_6R濃度各可減低約4倍及約1丨倍。其亦即意指：藉由投予pH依存性的與可溶型IL-6受體結合，且賦予於中性條件下（ρΗ7· 4)對於小鼠FcRn之結合的抗體，能由抗體加速可溶型受體之 /肖失。亦即’藉由對於活體投予如此的抗體’能減少活體内血漿中之抗原濃度。如圖35, H54/L28-IgGl在投予7日後為止，檢測到游離hsIL-6R濃度，但Fv4-IgGl投予後1日以後未檢測到游離 hsIL 6R，Fv4-IgGl_vl 或 Fv4-IgGl-v2 於投予後 7 小時以後未檢測到游離hsIL-6R。亦即，對於hslL-6R具pH依存性結合之Fv4-IgGl，比起H54/L28-IgGl顯示較低之游離hsIL-6R濃度，故藉由對於hsIL_6R賦予pH依存性結合，會發揮較向之hsIL-6R之中和效果，且相對於使於pH7.4對於FcRn之結合增加之Fv4-IgG卜vl及 Fv4-IgG卜v2 ,顯示較低之游離hsIL_6R濃度，故藉由於 PH7.4使對於FcRn之結合增加，可發揮更高hsiL_6R之中和效果。如H54/L28-IgGl之通常之中和抗體，若投予抗體，會降低結合之抗原之廓清，使抗原在血漿中長期滯留。由於 220 201249871 抗體投予使欲中和其作用之抗原之紅铲上水r印留性增長並不。藉由對於抗原之結合賦予pH依存性(中性條件下社 ^酸性條件下解離），能使抗原之血聚中滞留性縮短^ :’藉由賦予於中性條件下(pH7.4)對人類Feb之結合，能使抗原之血Η滯留性更短。再者，藉由投予邱依存性與抗原結合且賦予於中性條件下（pH7.4)對於之結合之抗體’ I頁示比起抗原單獨之廓清，能使料增大。= 為止，並不知道由於抗體投予’ #比起抗原單獨之廟清：廓清增大之方法，本研究發現的方法，對於當做利用抗體投予使抗原從血聚中消失之極有用。χ，本研究首次發現於中性條件下⑽7.4)使對FcRn之結合增加的好處。又， ^於中性條件下（pH7.4)使對於⑽之結合增加之具不同胺基酸取代之FV4-IgG卜vl與Fv4_IgGW2兩者均認為有同樣效果，故不拘胺基酸取代之種類，只要為中性條件下 (ρΗ7· 4)使對於人類FcRn之結合增加之胺基酸取代，均認為有加速抗原之消失之效果。亦即，藉由使用】Bi〇1 Chen]. 2007 ; 282(3) :1 709-1 7報告之EU編號法257號之pro取代為He之胺基酸取代、EU編號法311號之Gln取代為ne 之胺基酸取代、j Immunol. 2009:182( 1 2):7663-71.報告之EU編號法434號之Asn取代為Ala、Tyr或Trp之胺基酉文取代、EU編號法252號之Met取代為Tyr之胺基酸取代、 EU編號法307號之Thr取代為Gin之胺基酸取代、EU編號法308號之Val取代為Pro之胺基酸取代、EU編號法250 號之Thr取代為Gin之胺基酸取代、eu編號法428號之Met 221 201249871 取代為Leu之胺基酸取代、eu編號法380號之Glu取代為 Ala之胺基酸取代、Εϋ編號法378號之AU取代為之胺基酸取代、EU編號法436號之Tyr取代為ne之胺基酸取代、J Biol Chem. 2006 Aug 18;281 (33):23514-24 報告之EU編號法252號之Met取代為Tyr之胺基酸取代、Eu 編號法254號之Ser取代為Thr之胺基酸取代、EU編號法 256號之Thr取代為Glu之胺基酸取代、Nat Biotechnol.

2005 0ct;23( 1 0): 1 283-8.報告之 433 號之 His 取代為 LyS 之胺基酸取代、434號之Asn取代為Phe之胺基酸取代、 436號之Tyr取代為His之胺基酸取代等、及該等胺基酸取代之組合，據認為可製作藉由投予使抗原從血漿中消失之抗體分子。 [參考例4]對於人類FcRn之結合活性之評價當做評價使用Biacore之抗體與FcRni交互作用的測定系，據報告有在 j I_un〇l. 2009;182(12):7663-71.記載之感應晶片固定化有抗體並以人類FcRn為分析物之系。為此目的’依參考例4記載製備人類FcRn。使用該系，評價 Fv4-IgGl、Fv4-IgGl-vl 及 Fv4-IgGl-v2 於 ρΗ6· 0 及

ρΗ7. 4對於人類FcRn之結合活性（解離常數KD)。待驗物質抗體直接固定化在Series S感應晶片CM5並供試驗。抗體固定化於感應晶片’係使用50 ^的丨几磷酸鈉/15〇 mmol/L

NaCl，0.05% (v/v%) Surfactant P20 pH6.0 當做運行緩衝液’使用胺偶聯套組依製造商的指引，以固定化量5〇〇為目標實施。 222 201249871 運行緩衝液使用50 mmol/L磷酸鈉/150 mmol/L NaCl, 0. 0 5% Surfactant P20 pH6. 0、或 50 mmol/L 磷酸鈉 /150 mmol/L NaCl，0· 05% Surfactant P20 ρΗ7· 4，使用製作之感應晶片實施測定。測定均於25°C進行。將人類FcRn稀釋液以運行緩衝液（當做參照溶液）以流速5 # L/mi η注射 10分鐘，使感應晶片上之抗體與人類FcRn交互作用。之後以流速5 # L/min流過1分鐘運行緩衝液，觀察FcRn解離後，將 20 mmol/L Tris-HCl/150 mmol/L· NaCl，pH8.1 以流速30 /z L/min注射15秒，並返覆2次，使感應晶片再生。測定結果之解析以Biacore T100 Evaluation 5〇衍评&]^(^^.2.0.1)進行。由至少6個不同濃度之1^1?11 之測定結果，以穩定狀態親和性法（steady_state affinity method)解析並計算解離常數（〇)。Fv4_IgG1、

Fv4-IgGl-vl 及 Fv4-IgG卜v2 於 ρΗ6·0 及 pH7.4 對於人類

FcRn之結合活性（解離常數KD)之結果，如下表24。【表24】 ___ =KD(竭 --PH7.4

Fv4-IgG1 1.99 ΝΑ

Fv4-IgG1-v1 0.32 36.55

Fv4-IgG1-v2 0.11 11 ,〇3

Fv4-IgGl於PH7.4對於人類FcRn之結合非常弱，無法計算KD値（ΝΑ)。相對於此，Fv4-IgG卜vl與Fv4-IgGl-V2 在ρΗ7_ 4對於人類FcRn認為有結合，値各計算為 223 201249871 36.55//M 與 11·〇3μΜ。又，pH6. 0 對於人類 FcRn 之 KD 値各計算為1. 99以Μ與〇. 32μ Μ與0_ 11 // Μ。如圖31，人類 FcRn基因轉殖小鼠中，與Fv4_Ig(n相比較藉由為 Fv4-IgGl-v2，hsIL-6R之消失會加速，故可認為藉由改變人類IgGl，使最低在pH7 4對於人類FcRn之結合強於 11.03//M，能加速抗原之消失。又，如】Ιπ]_η〇ι 2002; 169(9):5171-80.所示，人類 IgG1 對於小鼠 FcRn 比起對於人類FcRn以強約1〇倍結合，因此，於Fv4 —丨^卜“ 與Fv4-IgGl-v2,預測pH7.4對於小鼠FcRn之結合會比起對於人類FcR之結合強約1〇倍。圖34所示正常小鼠中， Fv4-IgGl-vl 與 Fv4_IgG1_v2 之 hsIL_6R 之消失加速比起圖32所示之人類FcRn基因轉殖小鼠中之Fv4_igG卜w 之hsIL 6R之消失加速大，因此據認為，因應pH? 4對於 FcRn之結合強度，hsIL-6R之消失加速會增大。 [參考例5]中性條件下對於人類⑽之結合經增強之 PH依存性人類IL_6受體結合抗體之製備 (5-l)Fv4-IgGl之重鏈恆定區改變體之製作，為使人類他基因轉殖小鼠中，PH依存性人類IL、6 文體結合抗體之抗原消失效果更增大，對於Fv4-IgG1導入生條件▲下為使對於人類FcRn之結合增強之各種改二具體而言’藉由將表25]及25_2記載之胺基酸改變 _:F:IgGl之重鏈值定區導入，製作各種變異體（變異 =版基酸編號依EU、編號法）。又，胺基酸取代之導入， ^考例3記載之該技術領域之人士公知之方法實施。 224 201249871 【表25-1】

變異體名 KD (M) 胺基酸改變 IeG1 ND IrG1-v1 3.2E-06 M252Y/S254T/T256E IsG1-v2 8.1E-07 IM434W IhG1-F3 2.5E-06 IM434Y IsG1-F4 5.8E-06 N434S lgG1-F5 6.8E-06 N434A IsG1-F7 5.6E-06 M252Y IgG1-F8 4.2E-06 M252W I^G1-F9 1.4E-07 M252Y/S254T/T256E/N434Y IkG1-F10 6.9E-08 M252Y/S254T/T256E/N434W IkG1-F11 3.1E-07 M252Y/N434Y IgG1-F12 1.7E-07 M252Y/N434W IgG1-F13 3.2E-07 M252W/N434Y IgG1-F14 1.8E-07 M252W/N434W IsG1-F19 4.6E-07 P257L/N434Y IsG1-F20 4.6E-07 V308F/N434Y IgG1-F21 3.0E-08 M252Y/V308P/N434Y IeG1-F22 2.0E-06 M428L/N434S IerG1-F25 9.2E-09 M252Y/S254T/T256E/V308P/N434W IkG1-F26 1.0E-06 1332V IKG1-F27 7.4E-06 G237M IKG1-F29 1.4E-06 I332V/N434Y IgG1-F31 2.8E-06 G237M/V308F kG1-F32 8.0E-07 S254T/N434W IeG1-F33 2.3E-06 S254T/N434Y IkG1-F34 2.8E-07 T256E/N434W IgG1-F35 8.4E-07 T256E/N434Y IgG 卜 F36 3.6E-07 S254T/T256E/N434W IgG1-F37 1.1E-06 S254T7T256E/N434Y IgG1-F38 1.0E-07 M252Y/S254T/N434W IeG1-F39 3.0E-07 M252Y/S254T/N434Y IkG1-F40 8.2E-08 M252Y/T256E/N434W IgG1-F41 1.5E-07 M252Y/T256E/N434Y IffG1-F42 1.0E-06 M252Y/S254T/T256E/N434A IeG1-F43 1.7E-06 M252Y/N434A IeG1-F44 1.1E-06 M252W/N434A IeG1-F47 2.4E-07 M252Y/T256Q/N434W IgG1-F48 3.2E-07 M252Y/T256Q/N434Y IgG1-F49 5.1E-07 M252F/T256D/N434W IgG1-F50 1.2E-06 M252F/T256D/N434Y IkG1-F51 8.1E-06 N434F/Y436H IgG1-F52 3.1E-06 H433K/N434F/Y436H IgG1-F53 1.0E-06 I332V/N434W kG1-F54 8.4E-08 V308P/N434W IgG1-F56 9.4E-07 I332V/M428L/N434Y IeG1-F57 1.1E-05 G385D/Q386P/N389S IgG1-F58 7.7E-07 G385D/Q386P/N389S/N434W IsG1-F59 2.4E-06 G385D/Q386P/N389S/N434Y IgG1-F60 1.1E-05 G385H IgG1-F61 9.7E-07 G385H/N434W teG1-F62 1.9E-06 G385H/N434Y IkG1-F63 2.5E-06 N434F IeG1-F64 5.3E-06 N434H 225 201249871 表25_2係接績於表25-1 【表25-2】

IeG1-F65 2.9E-07 M252Y/S254T/T256E/N434F IgG1-F66 4.3E-07 M252Y/S254T/T256E/N434H IgG1-F67 6.3E-07 M252Y/N434F IgG1-F68 9.3E-07 M252Y/N434H IeG1-F69 5.1E-07 M428L/N434W IgG1-F70 1.5E-06 M428L/N434Y IgG1-F71 8.3E-08 M252Y/S254T/T256E/M428L/N434W IeG1-F72 2.0E-07 M252Y/S254T/T256E/M428L/N434Y IgG1-F73 1.7E-07 M252Y/M428L/N434W IgG1-F74 4.6E-07 M252Y/M428L/N434Y IeG1-F75 1.4E-06 M252Y/M428L/N434A IgG1-F76 1ΌΕ-06 M252Y/S254T/T256E/M428L/N434A IgG1-F77 9.9E-07 T256E/M428L/N434Y IsG1-F78 7.8E-07 S254T/M428L/N434W IeG1-F79 5.9E-06 S254T/T256E/N434A IsG1-F80 2.7E-06 M252Y/T256Q/N434A IgG1-F81 1.6E-06 M252Y/T256E/N434A IgG1-F82 1.1E-06 T256Q/N434W IeG1-F83 2.6E-06 T256Q/N434Y IeG1-F84 2.8E-07 M252W/T256Q/N434W IgG1-F85 5.5E-07 M252W/T256Q/N434Y IgG1-F86 1.5E-06 S254T/T256Q/N434W IeG1-F87 4.3E-06 S254T/T256Q/N434Y IeG1-F88 1.9E-07 M252Y/S254T/T256Q/N434W IgG1-F89 3.6E-07 M252Y/S254T/T256Q/N434Y IgG1-F90 1.9E-08 M252Y/T256E/V308P/N434W IgG1-F91 4.8E-08 M252Y/V308P/M428L/N434Y IgG1-F92 1.1E-08 M252Y/S254T/T256E/V308P/M428L/N434W IgG1-F93 7.4E-07 M252W/M428L/N434W IeG1-F94 3.7E-07 P257L/M428L/N434Y IgG1-F95 2.6E-07 M252Y/S254T/T256E/M428L/N434F IeG1-F99 6.2E-07 M252Y/T256E/N434H 製備之含重鏈與L(WT)(序列編號：14)之變異體，依參考例3記載之該技術領域之人士公知之方法使表現並精製。 (5-2 )對於人類FcRn之結合評價使用 Biacore T100 (GE Healthcare)，進行人類 FcRn 與抗體之速度論解析。為該目的，依參考例2記載製備人類FcRn。在感應晶片CM4 (GE Healthcare)上以胺偶聯法將PROTEIN L (ACTIGEN)適量固定化，使其捕捉目的之抗 226 201249871 體。其次’注射FcRn稀釋液與運行緩衝液（當做參照溶液），使捕捉於感應晶片上之抗體與人類FcRn交互作用。運行緩衝液使用50 mmol/L磷酸鈉、15〇 mm〇i/L NaC卜0. 05% (w/v) Tween20、pH7_ 0 ’ FcRn之稀釋也使用各自的緩衝液。晶片再生使用10 mmol/L甘胺酸-HC1，pH15。測定均於 25 C實施。從測定獲得之傳感圖，計訴動力學參數結合速度常數ka (Ι/Ms)、及解離速度常數kd (1/s)，依該値計算各抗體對於人類FcRn之KD (Μ)。各參數之計算使用

Biacore Τ100 Evaluation Software (GE Healthcare)。依Biacore評價於中性條件下（pH7 〇)對於人類FcRn 之結合之結果’如表6-1及6-2。在此’天然型IgG1結合非常弱’ T能計# KD，在表6]表示記載為ND。 [參考例6 ]中性條件下對於人類FcRn之結合經增強之 pH依存性人類.IL-6受體結合抗體之體内試驗使用參考例4製備之賦予於中性條件下對於人類FcRn 之結合能力之重鏈，製作中性條件下具有對於人類FcRn之結合能力之pH依存性人類IL_6受體結合抗體，並驗證於活體内之抗原消失效果。具體而言，依參考例3記載之該技術領域之人士公知之方法以下抗體表現並精製：含 VH3-IgGl 與 VL3-CK 之 Fv4-igGl 、含 VH3-IgGl-v2 與 VL3-CK 之 Fv4-IgGl-v2 、含 VH3-IgGl-F14 與 VL3-CK 之 Fv4-IgG卜F14 、含 VH3-IgG卜F20 與 VL3__CK 之 Fv4_IgG1_F2〇、含 VH3-IgG卜F21 與 VL3-CK 之 Fv4_IgG1_F21 、 227 201249871 含 VH3-IgG卜F25 與 VL3-CK 之 Fv4-IgG卜F25 、含 VH3-IgG卜F29 與 VL3-CK 之 Fv4-IgGl-F29 、含 VH3-IgG1-F35 與 VL3_CK2Fv4_IgG1_F35、含 VHS—UG卜F48 與 VL3-CK 之 Fv4—Ig(n_F48、含 VH3-IgG卜F93 與 VL3-CK 之 Fv4-IgGl-F93 、含 VH3-IgG卜F94 與 VL3_CKiFv4_IgG1F94。針對製備之pH依存性的人類α_6受體結合抗體，與參考例3之方法同樣實施使用人類FcRn基因轉殖小鼠 — / — U 系統 276 +/+小鼠、Jackson

Laboratories ^ Methods Mol Bi〇l. 2010;602:93-104.) 之體内試驗。獲得之靜脈内投予後之人類FcRn基因轉殖小鼠中血漿中可溶型人類IL-6受體濃度變化如圖3 示:於中性條件下對於人類FcRn之結合經增強之二的人類IL-6受體結合抗體’均為與中性條件下幾乎不1對於人類FcRn之結合能力之Fv4-IgG1比較時，血漿… 型人類IL — 6受體濃度變為較低。其中，列舉效果特別心之例’與Fv4_IgG1—F14同時之可溶型人類— 6受體之1 日後之血漿中濃度’比起與Fv4_IgGi同時，約低W倍。又’與Fv4-IgG卜F21同時投予之可溶型人類r"受體 7小時後之血漿中濃度，比起與Fv4_IgG1同時投予時低24倍。又，與Fv4_IgG卜阳同時投予之可溶型人類、'、、受體之7小時後之血㈣濃度，為檢測極限（156η_ 以下，比起與Fv4-IgGl同時投予時，據認為抗原濃) 228 201249871 著低200倍以上。由該等顯示 ‘马了增強抗原消失效果，對於pH依存性的抗原結合抗 ®使在中性條件下對於人類

FcRn之結合增強非常有效。 π %增強抗原消失效果導

入之於中性條件下使對於人類F rcKn之結合增強之胺基酸改變之種類’包含表6-1、表6-2 澈t 衣〇 Z 5己載之改變，不特別限疋據D忍為導入任意改變’均能你活咖 J此便居體内之抗原消失效果增強。再者，與 Fv4-IgG1-F14、Fv4_Ig(n_F21 、 Fv4-IgG卜F25、Fv4-Ig(n-F48 之 4 種 pH 依存性的人類 iL 6 受體結合抗體同時投予之可溶型人類IL_6受體，比起可溶聖人類IL 6文體之單獨投予群，顯示較低的血漿中濃度變化。如此的pH依存性的人類IL_6受體結合抗體對於處於血水中之可,谷型人類IL-6受體濃度為固定濃度之狀態（穩定狀態）的活體内投予，可以使血漿中之可溶型人類IL_6 受體濃度為穩定狀態之血漿中濃度維持在更低。亦即，藉由將如此的抗體對於活體内投予，能減低活體内血漿中之抗原濃度。 [參考例7]低用量（〇. 01 mg/kg)之Fv4-IgGl-F14之有效性之驗證使用參考例6製備之Fv4-1gG 1-F14，與參考例6之方法同樣進行低用量（〇. 〇1 mg/kg)之體内試驗，與參考例6 獲得之Fv4-IgGl及Fv4-IgG卜F14投予1 mg/kg時之結果比較（結果如圖37及38)。其結果’ Fv4-IgG卜F14之0.01 mg/kg投予群之血漿 229 201249871 中抗體濃度，比起1 mg/kg投予群，低約刚倍（圖Μ)，儘管如此，血襞中可溶型人類IL_6受體濃度變化大約同等 (圖37)。又’Fv4_IgG1_F14之。〇1 _投予群7小時後之血毁中可溶型人類IL_6受體濃度以卜㈠抑之 1 mg/kg投予群，顯示約低3倍。再者，Fv4_IgG1F14 在任一用量之投予群，均比可溶型人類IL — 6受體單獨投予群，顯示更低之血漿中可溶型人類IL_6受體濃度變化（圖 37) 〇由此可顯示：對於Fv4-IgGl使於中性條件下對於人類 FcRn之結合增強之Fv4_IgG1_FU，即使是〜[[扣丨之1〇〇分之1之投予量，也能有效使血漿中可溶型人類丨L_6受體濃度降低。亦即，藉由對於pH依存性的抗原結合抗體，使中性條件下對於FcRn之結合能力增強，據認為能以較低投予量仍可有效使抗原消失。 [參考例8 ]利用使用正常小鼠之穩定狀態模型之體内試驗 (8-1)於中性條件下對於小鼠FcRn之結合評價針對參考例5製備之含VH3-IgGl(序列編號：19)與L(WT)(序列編號：14) 之 VH3/L(WT)-IgGl 、含VH3-IgGl-v2(序列編號：22)與L(WT)(序列編號： W)之 VH3/L(WT)-IgGl-v2、含VH3-IgG卜F20(序列編號：23)與L(WT)(序列編號：14)之 VH3/L(WT)-IgGl-F20 、 230 201249871 ’依以下方法評價中性條件下（PH7. 4)對於小鼠FcRn 之結合評價。

使用 Biacore T100 (GE Healthcare)，解析小鼠 FcRn 與抗體之速度論。在感應晶片CM4 (GE Healthcare)上以胺偶聯法將PROTEIN L (ACTIGEN)適量固定化，使其捕捉目的之抗體。其次，注射FcRn稀釋液與運行緩衝液（當做參照溶液）’使捕捉於感應晶片上之抗體與小鼠FcRn交互作用。運行緩衝液使用50 _〇l/L磷酸鈉、15〇 mm〇i/L

NaCl、〇. 〇5% (w/v) Tween20、pH7.4, FcRn 之稀釋也使用各自的緩衝液。晶片再生使用10 mmol/L甘胺酸-HC1, PH1. 5。測定均於25 °C實施。從測定獲得之傳感圖，計算動力學參數結合速度常數ka(1/Ms)、及解離速度常數kd (1/s)，依该値計异各抗體對於小鼠之〖ο 各參

數之計算使用 Biacore T100 EValuation Software (GE

Healthcare)。結果如表26(PH7.4之小鼠FcRn親和性）。在此，恆定區為天_ IgG1VH3/L(WT)_IgG1(表“之咖），對小鼠 Wn之結合非常弱’不能計算〇，故表26中表示記載為 ⑧。測定結果，於中性條件下對於人類_之結合經Μ 之該等改變體，對於小鼠FeRn也同樣，於中性條件下^示結合增強。 231 201249871 【表26】 KD (Μ) igGl ND lgG1-v2 ~1.04E-06~ lgG1-F20 Ϊ.17Ε-07^ (8-2)血漿中可溶型人類IL__6受體濃度為穩定狀態之正常小鼠之體内試驗使用實施例3及參考例5製備之H54/L28_IgG1、

Fv4-IgGl、Fv4-IgGl-V2 及 Fv4-IgGl-F20 ,依下列方法進行體内試驗。於正常小鼠（C57BL/6J 小鼠、Charles River Japan) 之背部皮下埋入充填有可溶型人_【"受體之注入泵浦 (Mm-GSM(mc： P贈瞻L2GG4、aizet)，藉此製作血聚中可溶型人類IL-6受體濃度維持穩定狀態之動物模型。對該動物模型’投予柷人類IL_6受體抗體’並評價投予後之可溶型人類IL-6受體於活坪向今* At 又篮於活體内之動態。為抑制產生對抗可〉谷型人類IL _ 6受體之中· 中和抗體’將單株抗小鼠CD4抗體 (R&D)對於尾靜脈以2〇 g kg早-人技予。之後，將充填有 92.8eg/mL可溶型人類a 又菔t /支入泵浦埋入小鼠背部皮下。注入泵浦埋入3德曰後，將虹人類IL-6受體抗體對於尾靜脈以1 mg/kg單次投予 κ八于技予抗人類IL-6受體抗體 15刀釦後' 7小時後、；[日後' 俊2曰後、3曰後、4曰後、7 曰後、14曰後、21曰後、28 θ ^ ,0 8日後採血。將採取之血液立即於4 C以1 5, 000 rpm進行15八户 1 b 77鐘離心分離，獲得血埽將分離之血漿直到實施試，驗為止保存在設定為-20°C以下 232 201249871 之冷凍庫。以ELISA法測定血聚中抗人類IL-6受體抗體濃 (8-3) 度與參考例3以同樣方法實施。 (8 4)以電化干發光法測定血漿中遭度與實施例5以同樣方法實施。如圖39 ’對於血漿中可溶型人類il_6受體濃度維持約4〇叫/‘之穩定狀態的正常小鼠（hsIL-6R群），若投予可溶型人類IL-6受體之中和抗體肝机…抑，則血漿中可溶型人類IL-6受體濃度會升高到65〇投予前之15倍）。另一方面，㈣於奶机旧糾賦予邱依存性的抗原結合能力之Fv4—_之投予群，維持血裝中可溶里人類IL-6文體濃度為約7。ng/mL。自此顯示:由於通常之中和抗體H54/L28-IgG1之投予引起的血聚中可溶型人類IL-6文體濃度的升高，會藉由賦予pH依存性結合能力，而能抑制在約〗〇分之1。再者’投予對於PH依存性的人類IL-6受體結合抗體導入有於中性條件下對於FcRn之結合之改變的 Fv-IgGl-v2及Fv_IgG1_F2〇，顯示可維持血漿中可溶型人類IL-6受體濃度為穩定狀態之1〇分之i以下之狀態。在此Fv IgGi-v2從投予起14日後，血漿中可溶型人類几一6 又體/辰度為约2 ng/mL，可降低為投予前之分之】。又， v igGl’O，從投予起7小時後、1曰後、2曰後、4曰後之血襞中可溶型人類几-6受體濃度，為檢測極限（156 233 201249871 ng/mL)以下，顯示可低至投予前之25分之1以下。由以上顯示，藉由投予對於血漿中之抗原濃度維持穩定狀態之動物模型，同時具備pH依存性的抗原結合能力與· 於中條件下對於FcRn之結合能力之抗體，能使血聚中之抗原之消失速度增加、血漿中抗原濃度顯著降低。通常之抗體，如H54/L28-IgGl，藉由對標的抗原結合，其作用僅能"口，且更壞的是會造成血漿中之抗原濃度上升。另一方面，同時具備pH依存性的抗原結合能力與於中 I·生條件下對於FcRn之結合能力之抗體不僅可中和標的抗原，且發現能使血漿中之標的抗原之濃度降低。藉由將抗原從血漿中除去，可期待中和以上之高度效果。又對於僅中和不夠的標的抗原’據認為可顯示效果。 [參考例9 ]對於增強抗原消失所必要之pH中性域之對於人類FcRn之結合親和性之閾値鑑定、及抗原消失與中性域對於人類FcRn之結合親和性之關係 (9-1)用於體内試驗之抗體製備製備包含於pH中性域對於FcRn之結合經增加之 VH3-IgGl(序列編號：19)與VL3_CK(序列編號：2〇)之 Fv4-IgGl之Fc變異體。具體而言，製備VH3_M73(序列編號：24)及VH3-IgGl-vl(序列編號：21)。胺基酸取代之導入，依照參考例3記載之該技術領域之人士公知之方法實施。依參考例3 δ己載之該技術領域之人士公知之方法表現並精製含Η54(序列編號：5)與L28(序列編號：6)之 234 201249871 H54/L28_IgGl、含 VH3-IgGl(序列編號：19)與 VL3-CK(序列編號：20)之Fv4-IgGl、含VH3-M73C序列編號：24)與 VL3-CK(序列編號：20)之 Fv4-M73、含 VH3-IgGl-vl (序列編號：21)與VL3-CK(序列編號：20)之Fv4-IgG卜vl、及含 VH3-IgG卜v2(序列編號：22)與VL3-CK(序列編號：20)之 Fv4-IgGl-v2 。 (9-2)pH中性條件下對於人類FcRn之抗體之結合親和性之評價依參考例3記載，製備含VH3-IgGl (序列編號：19)與 L(WT)(序列編號：14)之 VH3/L(WT)-IgGl、含 VH3-M73C序列編號：24)與 L(WT)(序列編號：14)之 VH3/L(WT)-M73、含VH3-IgGl-vl(序列編號：21)與L(WT)(序列編號：14) 之 VH3/L(WT)-IgGl-vl、及含 VH3-IgGl-v2(序列編號：22) 與L(WT)(序列編號：14)之VH3/L(WT)-IgG卜v2，並評價於中性pH(ρΗ7· 0)與人類FcRn之結合。 VH3/L(WT)-IgGl-vl 及 VH3/L(WT)-IgGl-v2 對於人類

FcRn之結合活性，使用參考例5記載之方法測定。由於 VH3/L(WT)-IgGl 及 VH3/L(WT)-M73 對人類 FcRn 之結合活性低’故以實施例5記載之方法無法測定對人類FcRn之結合活性，是以，該等抗體依以下記載之方法評價。抗體與人類 FcRn 結合之動態使用 Biac〇re T1〇〇(GE Healthcare) 解析。在感應晶片CM4(GE Healthcare)上以胺偶聯法將適量PROTEIN LUCTIGEN)固定化，使晶片捕捉目的之抗體。其次，將稀釋FcRn溶液與運行緩衝液（當做參照溶液）注 235 201249871 入’使感應aa片上捕捉之抗體與人類F c R η交互作用。運行緩衝液使用 50 mmol/l 構酸納、150 mmol/1 NaCl、0 05% (w/v) Tween 20、PH7.0。FcRn使用各緩衝液稀釋。晶片使用10 mmol/1甘胺酸-HCl(pH1.5)再生。測定於25〇c進行0 各杬體之KD(Μ)，使用同時使適擬於傳感圖之結合及解離相，且實行中之組的全部曲線一次適擬的Biac〇re Π 00 Evaluation Software(GE Healthcare),從傳感圖數據導出。將傳感圖適擬於Biac〇re T1〇Q Evaluati〇n

Software提供之！： i結合模型結合」模型。針對結合交互作用的數個，使用基於平衡之方法，對於分析物濃度之對數，將平衡結合回應Req作圖，由非線形回歸分析導入KD。針對中性條件下（pH7.0)之人類FcRn結合，由Biac〇re 得到之結果如表2 7。【表27】 KD(M) IgG1 8.8E-05 M73 1 ·4Ε - 05 IgG1-v1 3.2Ε-06 IgG1-v2 8.1Ε-07 予行 (9-3)使用人類FcRn基因轉殖小鼠系統276之同時投梃型之抗體之抗原消失效果之體内試驗使用同時投予模型之抗體之體内試驗，依參考例3進。邊试驗使用之抗人類j"受體抗體，為先前記載之 236 201249871 H54/L28-IgGl 、 Fv4-IgGl 、 Fv4-M73 、 Fv4-IgGl-vl 、及

Fv4-IgGl-v2。該試驗使用之小鼠為人類FcRn基因轉殖小鼠（B6.mFcRn-/-_hFcRn Tg 系統 276 +/+小鼠、jackS0n Laboratories; Methods Mol Biol. (2010) 602: 93-104) 〇如圖 40 ， H54/L28-IgGl 、 Fv4-IgGl 、 Fv4-M73 、

Fv4-IgG卜v；l、及Fv4-IgGl-v2之藥物動態為同等，該等抗體於試驗期間維持類似之血漿中濃度。血t中hsIL-6濃度變化如圖41。比起與Fv4-IgGl同時投予之hsIL-6R，與Fv4-IgG卜V2同時之hsIL-6R顯示廓清增大，但與Fv4-M73及Fv4一IgG卜vl同時投予hsIL_6R 顯示廓清降低。M73、vl A v2所有Fc變異體，對於人類 FcRn在pH中性條件下（pH7.〇)之結合親和性增大，但顯示 hsIL-6R廓清增大的只有Fv4_IgG1_v2，Fv4 —们3及

Fv4-IgGl-vl未顯示增大。此顯示：為了增大抗原廓清，與 PH7. 0對於人類FcRn之結合親和性為kd & 2 " m或比天然型人類IgGl(對人類FcRn之結合親和性為κ]) 88#们高u 倍之IgG卜v"“匕，pH7 〇對於人類_之抗體之結合親和性至少要比其高高。圖42顯示PH7.0對於人類FcRkFc變異體之結合親和陡、與同時投予hsIL_6R及Fc變異體1曰後之血漿中 hsIL-6R濃度之間的關係。係將本實施例及參考例6 之 FC 變異體（Fv4一1扣1、Fv4-M73、Fv4-IgG卜vl、

Fv4-IgGl-v2

Fv4-IgGl-F14

Fv4-IgGl-F2l

Fv4-IgGl-F25

Fv4-IgGl-F20 、

Fv4-IgGl-F29 、 237 201249871

Fv4-IgG卜F93 、及

Fv4-IgGl-F35 、 Fv4-igGl-F48

Fv4-Ign-F94)作圖。若pH7.〇對於人類他之抗體之結合親和性增大，則反映抗原料之血㈣__6κ濃度會先增加後急速降低。此顯示:與天然型人類刷比較為使抗原廓清增大’需要使pH7.〇對於人類Μη之抗體之結口親# I·生車乂佳為比KD 2. 3 # Μ(從圖42之曲線對應獲得之値）強。抗體對人類FcRn《結合親和性為kd Μ". 2.3/zM時，則抗原廓清降低（較高之匕丨卜⑽濃度）。換言之，PH7.0對於人類FcRni抗體之結合親和性為增強抗原之消失，較佳為必需比天然型人類IgG1高38倍，不然據認為抗原廢清會降低。圖43顯示ΡΗ7·0對於人類““之以變異體之結合親和性、與同時投予hsIL_6R及以變異體^日後之血漿中抗體濃度之間的關係。係將本實施例及參考例6記載之Fc變異體（Fv4-IgGl、Fv4-M73、Fv4-IgG卜vl、Fv4-IgG卜v2、

Fv4-IgGl-F21 、

Fv4-IgGl-F14

Fv4-IgGl-F20

Fv4-IgGl-F25 ^ Fv4-IgGl-F29 ' Fv4-IgGl-F35 '

Fv4 IgGl F48、Fv4-IgGl-F93 ' 及 Fv4-IgGl-F94)作圖。右使pH7. 0對於人類FcRn之抗體之結合親和性增大，反映抗體之藥物動態（廓清）之血漿中抗體濃度會先維持，但之後急速降低。此顯示：為維持與天然型人類IgG1 (對於人類 FcRn之結合親和性為KD 88 # M)類似之抗體之藥物動態，而要使pH7. 0對於人類FcRn之抗體之親和性弱於KD 0· 2 y Μ(從圖43之曲線對應得到之値）。抗體對人類FcRn 238 201249871 之結合親和性強於KD 0.2/zM時’抗體之廓清會増大（亦即’抗體急速從血聚消失）。換言之，pH7 〇對於人類以如之抗體之結合親和性’為了顯示與天然型人類丨丨類似之抗體藥物動態’比起天然型人類IgGl，需要44〇倍以内之南度’不然’據認為抗體會從血製急速消失。若考慮圖42及43兩者，為維持與天然型人類。以類似之抗體藥物動態且比& IgG1之抗原廓清增大（亦即使血衆中抗原濃度減少）’ PH7.0對於人類㈣之抗體之吐合親和性必需為2·3//ΜΜ2“’或換言之，pH"對於人類FcRn之抗體之結合親和性必需比天然型人類⑽ 為高38倍至44。倍之範圍。與具長期間之抗體消失活性之

IgGl類似之藥物動態之此種抗體’由於長期間作用性，據認為料慢性疾患等需長投予間隔之抗體㈣為有益。另一方面，藉由使pH7.〇對於人類FcRn之抗體之結人親和性強於KD 〇.2"M，或換言之便比起天然型人類 S 1 ’於PH7· 〇抗體對於人類F R 热on μ Κη之結合親和性增大為高於440七’抗體雖比天然型人類j 據切、為γ历更快仗血漿消失，但據w為抗原廓清於短期間也會相當婵強。β , 各、去本旦， a々日田增強。能誘導抗原濃唐急速大量減少之如此的辰度需要由於其即效性，據認為對於；相關抗原從血漿中除去急、為有益。 < 〜注疾病#抗體治療就抗體丨分子從血漿 PH7.0對於人“ d 纟之1 ’為利用投予、人類FcRn之結合親和性評價抗原消失效率時之曹H 之抗體Fc變異體羊寻重要要因。為評價抗體1分子之抗 239 201249871 原消失效率，於本實施例及參考m記載之體内試驗之各時點實施以下計算。 A値：各時點之抗原之莫耳濃度 B値：各時點之抗體之莫耳濃度 C値：每個抗體莫耳濃度之抗原莫耳濃度（抗原/抗體莫耳比）

c= A/B 針對各抗體之C値（抗原/抗體莫耳比）之變化如圖 44 C値較小時，抗體每1分子之抗原消失效率會較高，但C値更大時，抗體每丨分子之抗原消失效率會較低。與 IgGl相比較’若C値較小’顯示可藉由Fc:變異體獲得較高抗原消失效率’但是若比IgGl，C値較大，顯示Fc變異體關於抗原消失效率具負面效果。Fv4-M73及Fv4-IgGl-vl 以外的所有Fc變異體，比起Fv4-IgGl，顯示抗原消失效率增大。Fv4-M73及Fv4-IgGl_vl顯示對抗原消失效率有負面影響，此與圖42 —致。圖45顯示pH7_ 0對於人類FcRn之Fc變異體之結合親和性、與同時投予hsIL-6R及Fc變異體1日後之c値（抗原/抗體莫耳比）之間的關係。將本實施例及參考例6記载之 Fc 變異體（Fv4-IgGl 、 Fv4-M73 、 Fv4-IgGl-vl 、 Fv4_IgGl-v2 、 Fv4-IgGl-F14 、 Fv4-IgGl-F20 、

Fv4-IgGl-F21 、 Fv4-IgGl-F25 、 Fv4-IgGl-F29 、

Fv4-IgGl-F35 、 Fv4_IgGl-F48 、 Fv4-IgGl-F93 、及 Fv4-IgGl-F94)作圖。其顯示與天然型人類IgGl比較為達 240 201249871 成更咼之抗原消失效率，必需使pH7. 〇對於人類之抗體之親和性強於〇 3·0^Μ(從圖45之曲線對應到之値）。換言之，ΡΗ7.0冑於人类員FcRn之抗體之結合親和性，為了使比起天然型人類IgG1達成較高抗原消失效率必需比天然型人類IgGl至少高29倍。結論為，對於FcRn於pH7 〇具KD 3 〇/zM至〇·^μ 之結合親和性之抗體變異體之群、或換言t，料Μη於 PH7.0比起天_人類IgG1有高29倍至州倍之範圍之結合親和性之抗體變異體之群，具與_類似之抗體藥物動態’但具增大之血漿中抗體消失能力。目此，如此的抗體=起UG1顯示增大的抗原消失效率。藉由與⑽類似之樂物動·態，能使抗原長期間從血渡消失（長期間作用性之抗原消失），所以能以長投予間隔投予，此據認為對於慢性疾病相關之抗體治療物質有利。對於FcRn於pH7.〇且強於KD 〇.2“之結合親和性之抗體變異體之群，或換言之對FcRn於pH7.〇具比天然型人類高4㈣之結合親抗體變異體之群’具急速的抗體廓清(短期間之抗體此顯示:儘管如此’如此的抗體會由於暴露於抗原 s蝴（即效性之抗原消失），故如此的抗體比IgG1 顯不增大之抗原消失效率 Γ , 如參考例8，於正常小鼠之

Fv4-IgGl-F2〇，抗原從血漿水之大幅消失會在非常短期間誘 ^抗原消失效果不持續。如此的概況，據認為對於需要使疾病相關抗原於非常短_ 、急性疾病時，為有利。^迅從Μ枯渴之 241 201249871 [參考例1 〇 ]使用人類FcRn基因轉殖小鼠系統276之穩定狀態注入模型之Fv4-IgG卜F14之體内試驗使用人類FcRn基因轉殖小鼠系統276之下列穩定狀態注入模型進行Fv4-IgG卜F14之體内試驗。試驗群由對照群 (無抗體）、以 1 mg/kg 用量之 Fv4-IgGl、及 1 mg/kg、〇 2 mg/kg、及〇. 〇1 mg/kg 之用量之 Fv4-igG卜F14 構成。對於人類 FcRn基因轉殖小鼠系統 276(B6.mFcRn-/-. hFcRn Tg 系統 276 +/+ 小鼠 (B6.mFcRn-/~ hFCRN Tg276 B6.Cg-Fcgrt < tmlDcr >

Tg(FCGRT)276Dcr (Jackson #4919)) 、 Jackson

Laboratories; Methods Mol Bi〇l. (2010) 602: 93-104) 之背部皮下’埋入充填有可溶型人類IL-6受體之注入泵浦 (MINI-OSMOTIC PUMP MODEL 2004 ; alzet)，藉此製作維持血漿中可溶型人類IL-6受體濃度為固定之模型動物。對於模型動物投予抗人類IL-6受體抗體，評價投予後之可溶型人類IL-6受體於活體内之動態。為抑制產生對抗可溶型人類IL-6交體之中和抗體’在埋入注入泵浦前，於將抗體對尾靜脈投予14日後，以20 mg/kg投予單株抗小鼠CD4抗體（R&D)。其次，將填充有92. 8 // g/ml之可溶型人類受體的注入泵浦埋入小鼠之背部皮下。埋入注入泵浦3曰後，將抗人類IL-6受體抗體（H54/L28_IgG1及 H54/L28-IgGl-F14)對於尾靜脈以img/kg單次投予。投予抗人類IL-6受體抗體15分鐘後、7小時後、1日後、2日後、3日後、4日後、7日後、14日後、21日後、及28日 242 201249871 後採血。將採取之血液立即於rc以15,〇〇〇 rpm進行i5 刀鐘離“刀離，獲得血漿。分離之血漿在實施測定為止前保存在設定為-2 〇 °c以下之冷凍庫。小鼠血漿中之hsIL-6R濃度以電化學發光測定。製備調整為 2,00〇、1，000、50〇、25〇、125、62 5、及 31.25pg/mi 之濃度之hsIL-6R檢量線試樣及稀釋5〇倍以上之小鼠血漿試樣。將試樣與經 SULF〇_TAG NHS Ester(Mes〇 Scaie

Discovery)釕化之單株抗人類IL_6R抗體（R&D)、生物素化抗人類IL-6R抗體（R&D)、及WT-IgGl溶液混合，於37π 反應一晚。就抗人類IL-6受體抗體而言，含 t 〇 c i 1 i z u m a b (重鏈序列編號：1 3、輕鍵序列編號：14 )之 WT-1 gG 1之終濃度比起試樣所包含之抗人類丨L_6受體抗體濃度為過剩之333 # g/m 1，目的為使試樣中之幾乎全部 hsIL-6R分子成為與WT-IgGl結合之狀態。之後，將試樣分注於 MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale

Discovery)，於室溫使反應1小時並洗滌。分注Read Buffer T(x4)(Meso Scale Discovery)，立即以 Sector PR 400 Reader(Meso Scale Discovery)測定。hsIL-6R 濃度，係從檢量線之回應使用解析軟體SOFTmax PRCKMolecular Devices)計算。圖46顯示抗體投予後之血漿中hs IL-6R濃度之時間曲線。比起未投予抗體之基線的h s IL - 6 R水平，由於投予1 mg/kg Fv4-IgGl，血漿中hsIL-6R濃度增加數倍。另一方面’由於 1 mg/kg 之 Fv4-IgGl-F14 投予，比較 Fv4-IgGl 243 201249871 群及基線群時，血漿中濃度發生顯著減少。於第2日，未松測到血漿中hslL-6R濃度（血漿中hsiL-6R濃度之定量極限於該測定系為1. 56 ng/mL)，持續到第η曰。 H54/L28-IgGl-F14 ，比起 H54/L28-IgGl ，血漿中 hsIL-6R濃度顯示減少，但減少程度小。減少之程度，當 Fv4可變區具有對於hsiL-6R之pH依存性結合特性時，會相當大。此顯示：若使於pH7. 〇對於人類FcRn之結合親和性增大’對於使血漿中抗原濃度減少有效，但是若組合pH 依存性的抗原結合及於pH中性域對於人類FcRn之結合親和性之增大’則抗原消失會顯著增大。使用較低用量之Fv4-IgGl-F14之試驗，即使是1 mg/kg 之1 / 1 00 0. 0 1 mg/kg，也能使血漿中抗原濃度比基線更減少，顯示分子使抗原從血漿枯渴之效率為顯著。 [參考例11 ]同時投予模型中，人類FcRn基因轉殖小鼠系統276及系統32之比較至此的體内試驗，係使用人類FcRn基因轉殖小鼠系統 276(Jackson Laboratories)進行。為比較與人類 FcRn 基因轉殖小鼠系統276不同的基因轉殖系統系統32之差異，本案發明人等使用人類FcRn基因轉殖小鼠系統 32(B6. mFcRn-/-. hFcRn Tg 系統 32 +/ +*l(B6.mFcRn-/- hFCRN Tg32; B6. Cg-Fcgrt < tinlDcr > Tg(FCGRT)32Dcr) (Jackson #4915)) 、 Jackson Laboratories; Methods Mol Biol. (2010) 602: 93-104)進行 H54/L28-IgGl 、

Fv4-IgGl、及Fv4-IgGl-v2之同時投予試驗。試驗方法， 244 201249871 除了使用人類FcRn基因轉殖小鼠系統32代替人類FcRn基因轉殖小鼠系，统276以外’與參考例3之試驗方法相同。圖47顯示人類FcRn基因轉殖小鼠系統276及系統π 兩者中’ ▲漿中hsIL-6R濃度變化。H54/L28-IgGl、 FV4 IgG1、及Fv4~IgGl-v2，顯示類似之血漿中hsIL 6R 濃度—時間曲線。任意小鼠均為若PH7.G對於人類FcRn之結合親和性增大，則抗原從血聚之消失同程度增強（比較

Fv4-IgGl 與 Fv4_Ig(n_v2)。圖48顯示人類FcRn基因轉殖小氣系統276及系統u 兩者中之血聚中抗體濃度變化。H54/L28-IgG1、Fv4_Ig(n、及Fv4-IgG卜V2顯示類似之血漿中抗體濃度_時間曲線。就結論而言’系統276與系統32之間未觀察到顯著差異，於PH7.0使對於人類FcRn之結合親和性增大之變異體，關於血漿中抗原濃度之消 η穴 <瑨強，於表現人類FcRn 之2個不同的基因轉殖小鼠系統為有效。 [參考例⑵中性㈣於人類㈣之結合親和性增大之各種抗體Fc變異體之製作 (12-l)Fc變異體之製作為進一步改善抗原消失曲線 r D Ί 巾性域對於人類

FcRn之結合親和性增大為目、的’將各種變異導入

Fv4-IgGl。具體而言，製作表15 所不之胺基酸變異導入

Fv4-IgGl之重鏈恆定區的Fc變里牌/ k異體（變異部位之胺基酸編號依EU編號法記載）。胺基酸取 '之導入，依照參考例 3記載之該技術領域之人士公知巧w <方法實施。 245 201249871 將製備之含重鏈與L(WT)(序列編號：14)之進一步的變異體（IgG卜F100至IgG卜F1 052)，依參考例3記載之該技術領域之人士公知之方法表現並精製。 (1 2 - 2 )人類F c R η結合之評價抗體與人類FcRn之結合之動態’針對igGi^ 咖-V2、及IgG卜？2至咖七呢針對IgGi及M73依來可例5 5己載，或 ⑽⑽之人類載解析。針對於中性條件下表28-U28〜2卜。的利用Biac⑽所得之結果，如 246 201249871 【表2 8 -1】

變異體名 KD (M) 胺基酸改變部位 F1 8.10E-07 N434W F2 3.20E-06 M252Y/S254T/T256E F3 2.50E-06 N434Y F4 5.80E-06 N434S F5 6.80E-06 N434A F7 5.60E-06 M252Y F8 4.20E-06 M252W F9 1.40E-07 M252Y/S254T/T256E/N434Y F10 6.90E-08 M252Y/S254T/T256E/N434W F11 3.10E-07 M252Y/N434Y F12 1.70E-07 M252Y/N434W F13 3. 20E-07 M252W/N434Y F14 1.80E-07 M252W/N434W F19 4.60E-07 P257L/N434Y F20 4.60E-07 V308F/N434Y F21 3.00E-08 M252Y/V308P/N434Y F22 2.00E-06 M428L/N434S F25 9.20E-09 M252Y/S254T/T256E/V308P/N434W F26 1.00E-06 I332V F27 7.40E-06 G237M F29 1.40E-06 I332V/N434Y F31 2.80E-06 G237M/V308F F32 8.00E-07 S254T/N434W F33 2.30E-06 S254T/N434Y F34 2.80E-07 T256E/N434W F35 8.40E-07 T256E/N434Y F36 3.60E-07 S254T/T256E/N434W F37 1.10E-06 S254T/T256E/N434Y F38 1.00E-07 M252Y/S254T/N434W F39 3.00E-07 M252Y/S254T/N434Y F40 8.20E-08 M252Y/T256E/N434W F4I 1.50E-07 M252Y/T256E/N434Y F42 1.00E-06 M252Y/S254T/T256E/N434A F43 1.70E-06 M252Y/N434A F44 1.10E-06 M252W/N434A F47 2.40E-07 M252Y/T256Q/N434W F48 3. 20E-07 M252Y/T256Q/N434Y F49 5.10E-07 M252F/T256D/N434W F50 1.20E-06 M252F/T256D/N434Y F51 8.10E-06 N434F/Y436H 247 201249871 表2 8 _ 2係接續表2 8 -1。【表2 8 - 2】

F52 3.10E-06 H433K/N434F/Y436H F53 1.00E-06 I332V/N434W F54 8.40E-08 V308P/N434W F56 9.40E-07 I332V/WI428L/N434Y F57 1.10E-05 G385D/Q386P/N389S F58 7.70E-07 G385D/Q386P/N389S/N434W F59 2.40E-06 G385D/0386P/N389S/N434Y F60 1.10E-05 G385H F61 9. 70E-07 G385H/N434W F62 1.90E-06 G385H/N434Y F63 2.50E-06 N434F F64 5.30E-06 N434H F65 2.90E-07 M252Y/S254T/T256E/N434F F66 4.30E-07 M252Y/S254T/T256E/N434H F67 6.30E-07 M252Y/N434F F68 9.30E-07 M252Y/N434H F69 5.10E-07 M428L/N434W F70 1.50E-06 M428L/N434Y F71 8.30E-08 M252Y/S254T/T256E/M428L/N434W F72 2.OOE-07 M252Y/S254T/T256E/M428L/N434Y F73 1.70E-07 M252Y/M428L/N434W F74 4.60E-07 M252Y/M428L/N434Y F75 1.40E-06 M252Y/M428L/N434A F76 1.00E-06 M252Y/S254T/T256E/M428L/N434A F77 9.90E-07 T256E/M28L/N434Y F78 7.80E-07 S254T/M428L/N434W F79 5.90E-06 S254T/T256E/N434A F80 2.70E-06 M252Y/T256Q/N434A F81 1.60E-06 M252Y/T256E/N434A F82 1.10E-06 T2560/N434W F83 2.60E-06 T256Q/N434Y F84 2.80E-07 M252W/T2560/N434W F85 5.50E-07 M252W/T2560/N434Y F86 1.50E-06 S254T/T2560/N434W F87 4. 30E-06 S254T/T256Q/N434Y F88 1.90E-07 M252Y/S254T/T256Q/N434W F89 3.60E-07 M252Y/S254T/T256Q/N434Y F90 1.90E-08 M252Y/T256E/V308P/N434W F91 4.80E-08 M252Y/V308P/M428L/N434Y F92 1.10E-08 M252Y/S254T/T256E/V308P/M428L/N434W F93 7. 40E-07 M252W/M428L/N434W F94 3. 70E-07 P257L/M428L/N434Y 表28-3係接續表28-2 248 【表28-3】

F95 2.60E-07 M252Y/S254T/T256E/M428L/N434F F99 6. 20E-07 M252Y/T256E/N434H F101 1.10E-07 M252W/T256Q/P257L/N434Y FI 03 4.40E-08 P238A/M252Y/V308P/N434Y FI 04 3. 70E-08 M252Y/D265A/V308P/N434Y Π 05 7. 50E-08 M252Y/T307A/V308P/N434Y F106 3. 70E-08 M252Y/V303A/V308P/N434Y F107 3. 40E-08 M252Y/V308P/D376A/N434Y F108 4.10E-08 M252Y./V305A/V308P/N434Y F109 3. 20E-08 M252Y/V30BP/Q311A/N434Y F111 3. 20E-08 M252Y/V308P/K317A/N434Y F112 6. 40E-08 M252Y/V308P/E380A/N434Y F113 3. 20E-08 M252Y/V308P/E382A/N434Y F114 3. 80E-08 M252Y/V308P/S424A/N434Y F115 6. 60E-06 T307A/N434A F116 8. 70E-06 E380A/N434A F118 1.40E-05 M428L F119 5. 40E-06 T250Q/M428L F120 6. 30E-08 P257L/V308P/M428L/N434Y F121 1.50E-08 M252Y/T256E/V308P/M428L/N434W F122 1.20E-07 M252Y/T256E/M428L/N434W F123 3. 00E-08 M252Y/T256E/V308P/N434Y FI 24 2.90E-07 M252Y/T256E/M428L/N434Y F125 2. 40E-08 M252Y/S254T/T256E/V308P/M428L/N434Y FI 28 1.70E-07 P257L/M428L/N434W FI 29 2. 20E-07 P257A/M428L/N434Y F131 3. 00E-06 P257G/M428L/N434Y F132 2.10E-07 P257I/M428L/N434Y F133 4. 10E-07 P257M/M428L/N434Y F134 2. 70E-07 P257N/M428L/N434Y F135 7. 50E-07 P257S/M428L/N434Y F136 3. 80E-07 P257T/M428L/N434Y F137 4. 60E-07 P257V/M428L/N434Y F139 1.50E-08 M252W/V308P/N434W FI 40 3. 60E-08 S239K/M252Y/V308P/N434Y F141 3. 50E-08 M252Y/S298G/V308P/N434Y FI 42 3. 70E-08 M252Y/D270F/V308P/N434Y F143 2. 00E-07 M252Y/V308A/N434Y FI 45 5. 30E-08 M252Y/V308F/N434Y F147 2. 40E-07 M252Y/V308I/N434Y F149 1.90E-07 M252Y/V308L/N434Y F150 2. 0OE-07 M252Y/V308M/N434Y 249 201249871 表28-4係接續表28-3 【表28-4】

F152 2.70E-07 M252Y/V3080/N434Y F154 1.80E-07 M252Y/V308T/N434Y F157 1.50E-07 P257A/V308P/M428L/N434Y F158 5.90E-08 P257T/V308P/M428L/N434Y F159 4.40E-08 P257V/V308P/M428L/N434Y F160 8. 50E-07 M252W/M428I/N434Y F162 1. 60E-07 M252W/M428Y/N434Y F163 4. 20E-07 M252W/M428F/N434Y F164 3. 70E-07 P238A/M252W/N434Y F165 2.90E-07 M252W/D265A/N434Y F166 1.50E-07 M252W/T307Q/N434Y F167 2.90E-07 M252W/V303A/N434Y F168 3.20E-07 M252W/D376A/N434Y F169 2.90E-07 M252W/V305A/N434Y F170 1.70E-07 M252W/Q311A/N434Y F171 1.90E-07 M252W/D312A/N434Y F172 2. 20E-07 M252W/K317A/N434Y F173 7. 70E-07 M252W/E380A/N434Y F174 3. 40E-07 M252W/E382A/N434Y F175 2. 70E-07 M252W/S424A/N434Y F176 2. 90E-07 S239K/M252W/N434Y F177 2. 80E-07 M252W/S298G/N434Y F178 2. 70E-07 M252W/D270F/N434Y F179 3.10E-07 M252W/N325G/N434Y F182 6. 60E-08 P257A/M428L/N434W F183 2. 20E-07 P257T/M428L/N434W F184 2. 70E-07 P257V/M428L/N434W F185 2. 60E-07 M252W/I332V/N434Y F188 3. 0OE-06 P257I/Q311I F189 1.90E-07 M252Y/T307A/N434Y F190 1.10E-07 M252Y/T3070/N434Y F191 I.60E-07 P257L/T307A/M428L/N434Y F192 1.10E-07 P257A/T307A/M428L/N434Y F193 8. 50E-08 P257T/T307A/M428L/N434Y F194 1.20E-07 P257V/T307A/M428L/N434Y F195 5. 60E-08 P257L/T307Q/M428L/N434Y F196 3. 50E-08 P257A/T3070/M428L/N434Y F197 3. 30E-08 P257T/T307Q/M428L/N434Y F198 4. 80E-08 P257V/T307Q/M428L/N434Y F201 2.10E-07 M252Y/T307D/N434Y F203 2. 40E-07 M252Y/T307F/N434Y F204 2.10E-07 M252Y/T307G/N434Y 250 表28-5係接續表28-4 【表28-5】

F205 2.00E-07 M252Y/T307H/N434Y F206 2. 30E-07 M252Y/T307I/N434Y F207 9. 40E-07 M252Y/T307K/N434Y F208 3.90E-07 M252Y/T307L/N434Y F209 1.30E-07 M252Y/T307M/N434Y F210 2.90E-07 M252Y/T307N/N434Y F211 2.40E-07 M252Y/T307P/N434Y F212 6.80E-07 M252Y/T307R/N434Y F213 2.30Ε-Ό7 M252Y/T307S/N434Y F214 1.70E-07 M252Y/T307V/N434Y F215 9.60E-08 M252Y/T307W/N434Y F216 2.30E-07 M252Y/T307Y/N434Y F217 2.30E-07 M252Y/K334L/N434Y F218 2. 60E-07 M252Y/G385H/N434Y F219 2. 50E-07 M252Y/T289H/N434Y F220 2. 50E-07 M252Y/Q311H/N434Y F221 3.10E-07 M252Y/D312H/N434Y F222 3. 40E-07 M252Y/N315H/N434Y F223 2. 70E-07 M252Y/K360H/N434Y F225 1.50E-06 M252Y/L314R/N434Y F226 5. 40E-07 M252Y/L314K/N434Y F227 1.20E-07 M252Y/N286E/N434Y F228 2. 30E-07 M252Y/L309E/N434Y F229 5.10E-07 M252Y/R255E/N434Y F230 2.50E-07 M252Y/P387E/N434Y F236 8.90E-07 K248I/M428L/N434Y F237 2. 30E-07 M252Y/M428A/N434Y F238 7.40E-07 M252Y/M428D/N434Y F240 7.20E-07 M252Y/M428F/N434Y F241 1.50E-06 M252Y/M428G/N434Y F242 8.50E-07 M252Y/M428H/N434Y F243 1.80E-07 M252Y/M428I/N434Y F244 1.30E-06 M252Y/M428K/N434Y F245 4.70E-07 M252Y/M428N/N434Y F246 1.10E-06 M252Y/M428P/N434Y F247 4.40E-07 M252Y/M428Q/N434Y F249 6.40E-07 M252Y/M428S/N434Y F250 2.90E-07 M252Y/M428T/N434Y F251 1.90E-07 M252Y/M428V/N434Y F252 1.00E-06 M252Y/M428W/N434Y F253 7.10E-07 M252Y/M428Y/N434Y F254 7.50E-08 M252W/T307Q/M428Y/N434Y 251 201249871 表28_6係接續表28-5 【表28-6】

F255 1.10E-07 M252W/Q311A/M428Y/N434Y F256 5.40E-08 M252W/T307Q/Q311A/M428Y/N434Y F257 5.00E-07 M252Y/T307A/M428Y/N434Y F258 3. 20E-07 M252Y/T307Q/M428Y/N434V F259 2. 80E-07 M252Y/D270F/N434Y F260 1.30E-07 M252Y/T307A/Q311A/N434Y F261 8. 40E-08 M252Y/T307Q/Q311A/N434Y F262 1.90E-07 M252Y/T307A/Q311H/N434Y F263 1.10E-07 M252Y/T307Q/Q311H/N434Y F264 2. 80E-07 M252Y/E382A/N434Y F265 6.80E-07 M252Y/E382A/M428Y/N434Y F266 4. 70E-07 M252Y/T307A/E382A/M428Y/N434Y F267 3. 20E-07 M252Y/T307Q/E382A/M428Y/N434Y F268 6. 30E-07 P238A/M252Y/M428F/N434Y F269 5. 20E-07 M252Y/V305A/M428F/N434Y F270 6. 60E-07 M252Y/N325G/M428F/N434Y F271 6. 90E-07 M252Y/D376A/M428F/N434Y F272 6. 80E-07 M252Y/E380A/M428F/N434Y F273 6. 50E-07 M252Y/E382A/M428F/N434Y F274 7. 60E-07 M252Y/E380A/E382A/M428F/N434Y F275 4. 20E-08 S239K/M252Y/V308P/E382A/N434Y F276 4.10E-08 M252Y/D270F/V308P/E382A/N434Y F277 1.30E-07 S239K/M252Y/V308P/M428Y/N434Y F278 3. 00E-08 M252Y/T307Q/V308P/E382A/N434Y F279 6.10E-08 M252YA308P/Q311H/E382A/N434Y F280 4.10E-08 S239K/M252Y/D270F/V308P/N434Y F281 9.20E-08 M252Y/V308P/E382A/M428F/N434Y F282 2. 90E-08 M252YA308P/E382A/M428L/N434Y F283 1.00E-07 M252Y/V308P/E382A/M428Y/N434Y F284 1.00E-07 M252Y/V308P/M428Y/N434Y F285 9. 90E-08 M252Y/V308P/M428F/N434Y F286 1.20E-07 S239K/M252Y/V308P/E382A/M428Y/N434Y F287 1.00E-07 M252Y/V308P/E380A/E382A/M428F/N434Y F288 1.90E-07 M252Y/T256E/E382A/N434Y F289 4. 80E-07 M252Y/T256E/M428Y/N434Y F290 4. 60E-07 M252Y/T256E/E382A/M428Y/N434Y F292 2. 30E-08 S239K/M252Y/V308P/E382A/M428I/N434Y F293 5. 30E-08 M252Y/V308P/E380A/E382A/M428I/N434Y F294 1.10E-07 S239K/M252Y/V308P/M428F/N434Y F295 6. 80E-07 S239K/M252Y/E380A/E382A/M428F/N434Y F296 4. 90E-07 M252Y/Q311A/M428Y/N434Y F297 5.10E-07 M252Y/D312A/M428Y/N434Y 252 201249871 表28-7係接續表28-6 【表28-7】

F298 4. 80E-07 M252Y/Q311A/D312A/M428Y/N434Y F299 9.40E-08 S239K/M252Y/V308P/0311A/M428Y/N434Y F300 8. 30E-08 S239K/M252Y/V308P/D312A/M428Y/N434Y F301 7.20E-08 S239K/M252Y/V308P/0311A/D312A/M428Y/N434Y F302 1.90E-07 M252Y/T256E/T307P/N434Y F303 6. 70E-07 M252Y/T307P/M428Y/N434Y F304 1.60E-08 M252W/V308P/M428Y/N434Y F305 2. 70E-08 M252Y/T256E/V308P/E382A/N434Y F306 3.60E-08 M252W/V308P/E382A/N434Y F307 3. 60E-08 S239K/M252W/V308P/E382A/N434Y F308 1.90E-08 S239K/M252W/V308P/E382A/M428Y/N434Y F310 9. 40E-08 S239K/M252W/V308P/E382A/M428I/N434Y F311 2. 80E-08 S239K/M252W/V308P/M428F/N434Y F312 4. 50E-07 S239K/M252W/E380A/E382A/M428F/N434Y F313 6. 50E-07 S239K/M252Y/T307P/M428Y/N434Y F314 3. 20E-07 M252Y/T256E/Q311A/D312A/M428Y/N434Y F315 6. 80E-07 S239K/M252Y/M428Y/N434Y F316 7.00E-07 S239K/M252Y/D270F/M428Y/N434Y F317 1.10E-07 S239K/M252Y/D270F/V308P/M428Y/N434Y F318 1.80E-08 S239K/M252Y/V308P/M428I/N434Y F320 2.00E-08 S239K/M252Y/V308P/N325G/E382A/M428I/N434Y F321 3.20E-08 S239K/M252Y/D270F/V308P/N325G/N434Y F322 9.20E-08 S239K/M252Y/D270F/T307P/V308P/N434Y F323 2.70E-08 S239K/M252Y/T256E/D270F/V308P/N434Y F324 2.80E-08 S239K/M252Y/D270F/T307Q/V308P/N434Y F325 2.10E-08 S239K/M252Y/D270F/T307Q/V308P/Q311A/N434Y F326 7.50E-08 S239K/M252Y/D270F/T307Q/Q311A/N434Y F327 6.50E-08 S239K/M252Y/T256E/D270F/T307Q/Q311A/N434Y F328 1.90E-08 S239K/M252Y/D270F/V308P/M428I/N434Y F329 1.20E-08 S239K/M252Y/D270F/N286E/V308P/N434Y F330 3.60E-08 S239K/M252Y/D270F/V308P/L309E/N434Y F331 3, 0OE-08 S239K/M252Y/D270F/V308P/P387E/N434Y F333 7. 40E-08 S239K/M252Y/D270F/T307Q/L309E/Q311A/N434Y F334 1.90E-08 S239K/M252Y/D270F/V308P/N325G/M428I/N434Y F335 1.50E-08 S239K/M252Y/T256E/D270F/V308P/M428I/N434Y F336 1.40E-08 S239K/M252Y/D270F/T307Q/V308P/Q311A/M428I/N434Y F337 5.60E-08 S239K/M252Y/D270F/T307Q/Q311A/M428I/N434Y F338 7.70E-09 S239K/M252Y/D270F/N286E/V308P/M428I/N434Y F339 1.90E-08 S239K/M252Y/D270F/V308P/L309E/M428I/N434Y F343 3.20E-08 S239K/M252Y/D270F/V308P/M428L/N434Y F344 3.00E-08 S239K/M252Y/V308P/M428L/N434Y F349 1.50E-07 S239K/M252Y/V308P/L309P/M428L/N434Y 253 201249871 表2 8 - 8係接續表2 8 - 7 【表28-8】

F350 1. 70E-07 S239K/M252Y/V308P/L309R/M428L/N434Y F352 6. 00E-07 S239K/M252Y/L309P/M428L/N434Y F353 1. 10E-06 S239K/M252Y/L309R/M428L/N434Y F354 2. 80E-08 S239K/M252Y/T307Q/V308P/M428L/N434Y F356 3. 40E-08 S239K/M252Y/D270F/V308P/L309E/P387E/N434Y F357 1.60E-08 S239K/M252Y/T256E/D270F/V308P/N325G/M4281/N434Y F358 1.00E-07 S239K/M252Y/T307Q/N434Y F359 4. 20E-07 P257V/T3070/M428I/N434Y F360 1.30E-06 P257V/T3070/M428V/N434Y F362 5. 40E-08 P257V/T307Q/N325G/M428L/N434Y F363 4.10E-08 P257V/T3070/Q311A/M428L/N434Y F364 3. 50E-08 P257V/T307Q/0311A/N325G/M428L/N434Y F365 5. 10E-08 P257V/V305A/T307Q/M428L/N434Y F367 1.50E-08 S239K/M252Y/E258H/D270F/T307Q/V308P/Q311A/N434Y F368 2.00E-08 S239K/M252Y/D270F/V308P/N325G/E382A/M428I/N434Y F369 7.50E-08 M252Y/P257V/T3070/M428I/N434Y F372 1.30E-08 S239K/M252W/V308P/M428Y/N434Y F373 1.10E-08 S239K/M252W/V308P/Q311A/M428Y/N434Y F374 1.20E-08 S239K/M252W/T256E/V308P/M428Y/N434Y F375 5.50E-09 S239K/M252W/N286E/V308P/M428Y/N434Y F376 9. 60E-09 S239K/M252Y/T256E/D270F/N286E/V308P/N434Y F377 1.30E-07 S239K/M252W/T307P/M428Y/N434Y F379 9. 00E-O9 S239K/M252W/T256E/V308P/Q311A/M428Y/N434Y F380 5. 60E-09 S239K/M252W/T256E/N286E/V308P/M428Y/N434Y F381 1. 10E-07 P257V/T307A/0311A/M428L/N434Y F382 8. 70E-08 P257V/V305A/T307A/M428L/N434Y F386 31-08 M252Y/V308P/L309E/N434Y F387 1.50E-07 M252Y/V308P/L309D/N434Y F388 7. 00E-O8 M252Y/V308P/L309A/N434Y F389 1.70E-08 M252W/V308P/L309E/M428Y/N434Y F390 6.80E-08 M252W/V308P/L309D/M428Y/N434Y F391 3.60E-08 M252W/V308P/L309A/M428Y/N434Y F392 6.90E-09 S239K/M252Y/N286E/V308P/M428I/N434Y F393 1.20E-08 S239K/M252Y/N286E/V308P/N434Y F394 5. 30E-08 S239K/M252Y/T3070/Q311A/M428I/N434Y F395 2. 40E-08 S239K/M252Y/T256E/V308P/N434Y F396 2. 00E-08 S239K/M252Y/D270F/N286E/T307Q/0311A/M428I/N434Y F397 4.50E-08 S239K/M252Y/D270F/T307Q/Q311A/P387E/M428I/N434Y F398 4. 40E-09 S239K/M252Y/D270F/N286E/T307Q/V308P/Q311A/M428I/N4 34Y F399 6.50E-09 S239K/M252Y/D270F/N286E/T307Q/V308P/M428I/N434Y F400 6.10E-09 S239K/M252Y/D270F/N286E/V308P/Q311A/M428I/N434Y 254 表28-9係接續表28-8 【表28-9】

F401 6. 90E-09 S239K/M252Y/D270F/N286E/V308P/P387E/M428I/N434Y F402 2. 30E-08 P257V/T307Q/M428L/N434W F403 5.10E-08 P257V/T307A/M428L/N434W F404 9.40E-08 P257A/T307Q/L309P/M428L/N434Y F405 1.70E-07 P257V/T307Q/L309P/M428L/N434Y F406 1.50E-07 P257A/T307Q/L309R/M428L/N434Y F407 1.60E-07 P257V/T307Q/L309R/M428L/N434Y F408 2.50E-07 P257V/N286E/M428L/N434Y F409 2.00E-07 P257V/P387E/M428L/N434Y F410 2. 20E-07 P257V/T307H/M428L/N434Y F411 1.30E-07 P257V/T307N/M428L/N434Y F412 8.80E-08 P257V/T307G/M428L/N434Y F413 1.20E-07 P257V/T307P/M428L/N434Y F414 1.10E-07 P257V/T307S/M428L/N434Y F415 5.60E-08 P257V/N286E/T307A/M428L/N434Y F416 9.40E-08 P257V/T307A/P387E/M428L/N434Y F418 6. 20E-07 S239K/M252Y/T307P/N325G/M428Y/N434Y F419 1.60E-07 M252Y/T307A/Q311H/K360H/N434Y F420 1.50E-07 M252Y/T307A/Q311H/P387E/N434Y F421 1.30E-07 M252Y/T307A/Q311H/M428A/N434Y F422 1.80E-07 M252Y/T307A/Q311H/E382A/N434Y F423 8.40E-08 M252Y/T307W/Q311H/N434Y F424 9.40E-08 S239K/P257A/V308P/M428L/N434Y F425 8.00E-08 P257A/V308P/L309E/M428L/N434Y F426 8.40E-08 P257V/T307Q/N434Y F427 1.10E-07 M252Y/P257V/T3070/M428V/N434Y F428 8.00E-08 M252Y/P257V/T307Q/M428L/N434Y F429 3.70E-08 M252Y/P257V/T307Q/N434Y F430 8.10E-08 M252Y/P257V/T307Q/M428Y/N434Y F431 6.50E-08 M252Y/P257V/T3070/M428F/N434Y F432 9.20E-07 P257V/T307Q/Q311A/N325G/M428V/N434Y F433 6.00E-08 P257V/T3070/Q311A/N325G/N434Y F434 2.00E-08 P257V/T307Q/Q311A/N325G/M428Y/N434Y F435 2. 50E-08 P257V/T307Q/Q311A/N325G/M428F/N434Y F436 2.50E-07 P257A/T307Q/M428V/N434Y F437 5. 70E-08 P257A/T307Q/N434Y F438 3.60E-08 P257A/T3070/M428Y/N434Y F439 4.00E-08 P257A/T307Q/M428F/N434Y F440 1.50E-08 P257V/N286E/T307Q/Q311A/N325G/M428L/N434Y F441 1.80E-07 P257A/Q311A/M428L/N434Y F442 2. 00E-07 P257A/0311H/M428L/N434Y F443 5. 50E-08 P257A/T307Q/Q311A/M428L/N434Y 255 201249871 表2 8 -1 0係接續表2 8 - 9 【表28-10】

F444 1.40E-07 P257A/T307A/Q311A/M428L/N434Y F445 6. 20E-08 P257A/T307Q/Q311H/M428L/N434Y F446 1.10E-07 P257A/T307A/Q311H/M428L/N434Y F447 1.40E-08 P257A/N286E/T307Q/M428L/N434Y F448 5. 30E-08 P257A/N286E/T307A/M428L/N434Y F449 5. 70E-07 S239K/M252Y/D270F/T307P/N325G/M428Y/N434Y F450 5. 20E-07 S239K/M252Y/T307P/L309E/N325G/M428Y/N434Y F451 1.00E-07 P257S/T307A/M428L/N434Y F452 1.40E-07 P257M/T307A/M428L/N434Y F453 7. 80E-08 P257N/T307A/M428L/N434Y F454 9. 60E-08 P257I/T307A/M428L/N434Y F455 2. 70E-08 P257V/T307Q/M428Y/N434Y F456 3. 40E-08 P257V/T307Q/M428F/N434Y F457 4. 00E-08 S239K/P257V/V308P/M428L/N434Y F458 1. 50E-08 P257V/T307Q/V308P/N325G/M428L/N434Y F459 1.30E-08 P257V/T307Q/V308P/Q311A/N325G/M428L/N434Y F460 4.70E-08 P257V/T307A/V308P/N325G/M428L/N434Y F462 8. 50E-08 P257A/V308P/N325G/M428L/N434Y F463 1.30E-07 P257A/T307A/V308P/M428L/N434Y F464 5.50E-08 P257A/T307Q/V308P/M428L/N434Y F465 2.10E-08 P257V/N286E/T307Q/N325G/M428L/N434Y F466 3. 50E-07 T256E/P257V/N434Y F467 5.70E-07 T256E/P257T/N434Y F468 5. 70E-08 S239K/P257T/V308P/M428L/N434Y F469 5.60E-08 P257T/V308P/N325G/M428L/N434Y F470 5. 40E-08 T256E/P257T/V308P/N325G/M428L/N434Y F471 6.60E-08 P257T/V308P/N325G/E382A/M428L/N434Y F472 5.40E-08 P257T/V308P/N3256/P387E/M428L/N434Y F473 4. 50E-07 P257T/V308P/L3O9P/N325G/M428L/N434Y F474 3.50E-07 P257T/V308P/L309R/N325G/M428L/N434Y F475 4.30E-08 T256E/P257V/T307Q/NI428L/N434Y F476 5. 50E-08 P257V/T307Q/E382A/M428L/N434Y F477 4.30E-08 P257V/T307Q/P387E/M428L/N434Y F480 3.90E-08 P257L/V308P/N434Y F481 5. 60E-08 P257T/T307Q/N434Y F482 7.00E-08 P257V/T307Q/N325G/N434Y F483 5.70E-08 P257V/T307Q/Q311A/N434Y F484 6. 20E-08 P257V/V305A/T307Q/N434Y F485 9. 70E-08 P257V/N286E/T307A/N434Y F486 3.40E-07 P257V/T307Q/L309R/0311H/M428L/N434Y F488 3. 50E-08 P257V/V308P/N325G/M428L/N434Y F490 7. 50E-08 S239K/P257V/V308P/0311H/M428L/N434Y 256 201249871 表28-11係接續表28-10 【表28-11】

F492 9. 80E-08 P257V/V305A/T307A/N325G/M428L/N434Y F493 4. 90E-07 S239K/D270F/T307P/N325G/M428Y/N434Y F497 3.1OE-06 P257T/T307A/M428V/N434Y F498 1.30E-06 P257A/M428V/N434Y F499 5. 20E-07 P257A/T307A/M428V/N434Y F500 4. 3OE-08 P257S/T307Q/M428L/N434Y F506 1.90E-07 P257V/N297A/T307Q/M428L/N434Y F507 5.1OE-08 P257V/N286A/T307Q/M428L/N434Y F508 1.10E-07 P257V/T307Q/N315A/M428L/N434Y F509 5. 80E-08 P257V/T307Q/N384A/M428L/N434Y F510 5. 30E-08 P257V/T307Q/N389A/M428L/N434Y F511 4. 20E-07 P257V/N434Y F512 5. 80E-07 P257T/N434Y F517 3.10E-07 P257V/N286E/N434Y F518 4. 20E-07 P257T/N286E/N434Y F519 2. 60E-08 P257V/N286E/T307Q/N434Y F521 1.10E-08 P257V/N286E/T307Q/M428Y/N434Y F523 2. 60E-08 P257V/V305A/T307Q/M428Y/N434Y F526 1.90E-08 P257T/T307Q/M428Y/N434Y F527 9. 40E-09 P257V/T307Q/V308P/N325G/M428Y/N434Y F529 2.50E-08 P257T/T307Q/M428F/N434Y F533 1.20E-08 P257A/N286E/T307Q/M428F/N434Y F534 1.20E-08 P257A/N286 E/T307Q/M428Y/N434Y F535 3. 90E-08 T250A/P257V/T307Q/M428L/N434Y F538 9. 90E-08 T250F/P257V/T3070/M428L/N434Y F541 6. 0OE-08 T250I/P257V/T307Q/M428L/N434Y F544 3.10E-08 T250iyi/P257V/T307Q/M428L/N434Y F549 5. 40E-08 T250S/P257V/T307Q/M428L/N434Y F550 5. 90E-08 T250V/P257V/T307Q/M428L/N434Y F551 1.20E-07 T250W/P257V/T307Q/M428L/N434Y F552 1.10E-07 T250Y/P257V/T307Q/M428L/N434Y F553 1. 7OE-07 M252Y/Q311A/N434Y F554 2. 80E-08 S239K/M252Y/S254T/V308P/N434Y F556 11-06 M252Y/T307Q/Q311A F559 8.00E-08 M252Y/S254T/N286E/N434Y F560 2.80E-08 M252Y/S254T/V308P/N434Y F561 1.40E-07 M252Y/S254T/T307A/N434Y F562 8.30E-08 M252Y/S254T/T307Q/N434Y F563 1.30E-07 M252Y/S254T/Q311A/N434Y F564 1.90E-07 M252Y/S254T/Q311H/N434Y F565 9.20E-08 M252Y/S254T/T307A/Q311A/N434Y F566 6.10E-08 M252Y/S254T/T307Q/Q311A/N434Y 257 201249871 表28-12係接續表28-11 【表28-12】

F567 2. 20E-07 M252Y/S254T/M428I/N434Y F568 1.10E-07 M252Y/T256E/T307A/Q311H/N434Y F569 2.00E-07 M252Y/T2560/T307A/Q311H/N434Y F570 1.30E-07 M252Y/S254T/T307A/Q311H/N434Y F571 8.10E-08 M252Y/N286E/T307A/Q311H/N434Y F572 1.00E-07 M252Y/T307A./Q311H/M428I/N434Y F576 1.60E-06 M252Y/T256E/T307Q/Q311H F577 1.30E-06 M252Y/N286E/T307A/Q311A F578 5. 70E-07 M252Y/N286E/T307Q/Q311A F580 8. 60E-07 M252Y/N286E/T307Q/Q311H F581 7. 20E-08 M252Y/T256E/N286E/N434Y F582 7. 50E-07 S239K/M252Y/V308P F583 7. 80E-07 S239K/M252Y/V308P/E382A F584 6.30E-07 S239K/M252Y/T256E/V308P F585 2. 90E-07 S239K/M252Y./N286E/V308P F586 1.40E-07 S239K/M252Y/N286E/V308P/M428I F587 1.90E-07 M252Y/N286E/M428L/N434Y F592 2. 00E-07 M252Y/S254T/E382A/N434Y F593 3.10E-08 S239K/M252Y/S254T/V308P/M428I/N434Y F594 1.60E-08 S239K/M252Y/T256E/V308P/M428I/N434Y F595 1.80E-07 S239K/M252Y./M428I/N434Y F596 4.00E-07 M252Y/D312A/E382A/M428Y/N434Y F597 2.20E-07 M252Y/E382A/P387E/N434Y F598 1.40E-07 M252Y/D312A/P387E/N434Y F599 5. 20E-07 M252Y/P387E/M428Y/N434Y F600 2. 80E-07 M252Y/T2560/E382A/N434Y F601 9. 60E-09 M252Y/N286E/V308P/N434Y F608 G236A/S239D/I332E F611 2. 80E-07 M252Y/V305T/T307P/V308I/L309A/N434Y F612 3. 60E-07 M252Y/T307P/V308丨/L309A/N434Y F613 S239D/A330L/I332E F616 S239D/K326D/L328Y F617 7. 40E-07 S239K/N434W F618 6.40E-07 S239K/V308F/N434Y F619 3.10E-07 S239K/M252Y/N434Y F620 2.10E-07 S239K/M252Y/S254T/N434Y F621 1. 50E-07 S239K/M252Y/T307A/Q311H/N434Y F622 3. 50E-07 S239K/M252Y/T256Q/N434Y F623 1.80E-07 S239K/M252W/N434W F624 1.40E-08 S239K/P257A/N286E/T307Q/M428L/N434Y F625 7.60E-08 S239K/P257A/T3070/M428L/N434Y F626 1.30E-06 V308P 258 表28-13係接續表28-12 【表28-13】

F629 3. 90E-08 M252Y/V279L/V308P/N434Y F630 3. 70E-08 S239K/M252Y/V279L/V308P/N434Y F633 2. 40E-08 M252Y/V282D/V308P/N434Y F634 3. 20E-08 S239K/M252Y/V282D/V308P/N434Y F635 4. 50E-08 M252Y/V284K/V308P/N434Y F636 4. 80E-08 S239K/M252Y/V284K/V308P/N434Y F637 1.50E-07 M252Y/K288S/V308P/N434Y F638 1.40E-07 S239K/M252Y/K288S/V308P/N434Y F639 2. 70E-08 M252Y/V308P/G385R/N434Y F640 3. 60E-08 S239K/M252Y/V308P/G385R/N434Y F641 3.00E-08 M252Y/V308P/Q386K/N434Y F642 3. 00E-08 S239K/M252Y/V308P/Q386K/N434Y F643 3. 20E-08 L235G/G236R/S239K/M252Y/V308P/N434Y F644 3. OOE-08 G236R/S239K/M252Y/V308P/N434Y F645 3. 30E-08 S239K/M252Y/V308P/L328R/N434Y F646 3. 80E-08 S239K/M252Y/N297A/V308P/N434Y F647 2. 90E-08 P238D/M252Y/V308P/N434Y F648 P238D F649 1.20E-07 S239K/M252Y/N286E/N434Y F650 1.70E-07 S239K/M252V/T256E/N434Y F651 1.80E-07 S239K/M252Y/0311A/N434Y F652 2. 40E-07 P238D/M252Y/N434Y F654 3. 20E-08 L235K/S239K/M252Y/V308P/N434Y F655 3. 40E-08 L235R/S239K/M252Y/V308P/N434Y F656 3. 30E-08 6237K/S239K/M252Y/V308P/N434Y F657 3. 20E-08 6237R/S239K/M252Y/V308P/N434Y F658 3. 20E-08 P238K/S239K/M252Y/V308P/N434Y F659 3. O0E-08 P238R/S239K/M252Y/V308P/N434Y F660 3.10E-08 S239K/M252Y/V308P/P329K/N434Y F661 3. 40E-08 S239K/M252Y/V308P/P329R/N434Y F663 6. 40E-09 S239K/M252V/N286E/T307Q/V308P/Q311A/N434Y F664 3. 90E-08 M252Y/N286A/V308P/N434Y F665 2. 00E-08 M252Y/N286D/V308P/N434Y F666 2.10E-08 M252Y/N286F/V308P/N434Y F667 3. 00E-08 M252Y/N286G/V308P/N434Y F668 4. 00E-08 M252Y/N286H/V308P/N434Y F669 3. 50E-08 M252Y/N286I/V308P/N434Y F670 2.10E-07 M252Y/N286K/V308P/N434Y F671 2. 20E-08 M252Y/N286L/V308P/N434Y F672 2.40E-08 M252Y/N286M/V308P/N434Y F673 2. 30E-08 M252Y/N286P/V308P/N434Y F674 3. 20E-08 M252Y/N286Q/V308P/N434Y 259 201249871 表28-14係接續表28-13 【表28-14】

F675 5.10E-08 M252Y/N286R/V308P/N434Y F676 3.20E-08 M252Y/N286S/V308P/N434Y F677 4.70E-08 M252Y/N286T/V308P/N434Y F678 3.30E-08 M252Y/N286V/V308P/N434Y F679 1.70E-08 M252Y/N286W/V308P/N434Y F680 1.50E-08 M252Y/N286Y/V308P/N434Y F681 4.90E-08 M252Y/K288A/V308P/N434Y F682 8.20E-08 M252Y/K288D/V308P/N434Y F683 5.00E-08 M252Y/K288E/V308P/N434Y F684 5.10E-08 M252Y/K288F/V308P/N434Y F685 5.30E-08 M252Y/K2886/V308P/N434Y F686 4.60E-08 M252Y/K288H/V308P/N434Y F687 4.90E-08 M252Y/K288I/V308P/N434Y F688 2.80E-08 M252Y/K288L/V308P/N434Y F689 4.10E-08 M252Y/K288M/V308P/N434Y F690 1.00E-07 M252Y/K288N/V308P/N434Y F691 3. 20E-07 M252Y/K288P/V308P/N434Y F692 3. 90E-08 M252Y/K2880/V308P/N434Y F693 3. 60E-08 M252Y/K288R./V308P/N434Y F694 4. 70E-08 M252Y/K288V/V308P/N434Y F695 4.00E-08 M252Y/K288W/V308P/N434Y F696 4.40E-08 M252Y/K288Y/V308P/N434Y F697 3.10E-08 S239K/M252Y/V308P/N325G/N434Y F698 2. 20E-08 M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y F699 2. 30E-08 S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y F700 5. 20E-08 M252Y/V308P/L328E/N434Y F705 7.10E-09 M252Y/N286E/V308P/M428I/N434Y F706 1.80E-08 M252Y/N286E/T3070/Q311A/M428I/N434Y F707 5.90E-09 M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/N434Y F708 4.10E-09 M252Y/N286E/T3070/V308P/Q311A/M428I/N434Y F709 2.00E-08 S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/M428I/N434Y F710 1.50E-08 P238D/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/M428I/N434Y F711 6.50E-08 S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y F712 6. 00E-08 P238D/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y F713 2. 00E-08 P238D/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y F714 2. 30E-07 P238D/M252Y/N325S/N434Y F715 2.30E-07 P238D/M252Y/N325M/N434Y F716 2.70E-07 P238D/M252Y/N325L/N434Y F717 2.60E-07 P238D/M252Y/N325丨/N434Y F718 2.80E-07 P238D/M252Y/Q295M/N434Y F719 7. 40E-08 P238D/M252Y/N325G/N434Y F720 2. 40E-08 M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y 260 表28-15係接續表28-14 【表28-15】

F721 1.50E-08 M252Y/T307Q/V308P/Q311A/M428I/N434Y F722 2.70E-07 P238D/M252Y/A327G/N434Y F723 2.80E-07 P238D/M252Y/L328D/N434Y F724 2.50E-07 P238D/M252Y/L328E/N434Y F725 4.20E-08 L235K/6237R/S239K/M252Y/V308P/N434Y F726 3.70E-08 L235K/P238K/S239K/M252Y/V308P/N434Y F729 9.20E-07 T307A/Q311A/N434Y F730 6. 00E-07 T307Q/Q311A/N434Y F731 8.50E-07 T307A/Q311H/N434Y F732 6.80E-07 T307Q/Q311H/N434Y F733 3.20E-07 M252Y/L328E/N434Y F734 3.10E-07 G236D/M252Y/L328E/N434Y F736 3.10E-07 M252Y/S267M/L328E/N434Y F737 3.10E-07 M252Y/S267L/L328E/N434Y F738 3.50E-07 P238D/M252Y/T307P/N434Y F739 2.20E-07 M252Y/T307P/Q311A/N434Y F740 2.90E-07 M252Y/T307P/Q311H/N434Y F741 3.10E-07 P238D/T250A/M252Y/N434Y F744 9.90E-07 P238D/T250F/M252Y/N434Y F745 6.60E-07 P238D/T2506/M252Y/N434Y F746 6.00E-07 P238D/T250H/M252Y/N434Y F747 2.80E-07 P238D/T250I/M252Y/N434Y F749 5.10E-07 P238D/T250L/M252Y/N434Y F750 3.00E-07 P238D/T250M/M252Y/N434Y F751 5.30E-07 P238D/T250N/M252Y/N434Y F753 1.80E-07 P238D/T250Q/M252Y/N434Y F755 3.50E-07 P238D/T250S/M252Y/N434Y F756 3.70E-07 P238D/T250V/M252Y/N434Y F757 1.20E-06 P238D/T250W/M252Y/N434Y F758 1.40E-06 P238D/T250Y/M252Y/N434Y F759 L235K/S239K F760 L235R/S239K F761 1.10E-06 P238D/N434Y F762 3.60E-08 L235K/S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y F763 3.50E-08 L235R/S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y F764 6.30E-07 P238D/T307Q/0311A/N434Y F765 8.50E-08 P238D/M252Y/T307Q/L309E/Q311A/N434Y F766 6.00E-07 T307A/L309E/Q311A/N434Y F767 4.30E-07 T3070/L309E/Q311A/N434Y F768 6.40E-07 T307A/L309E/Q311H/N434Y F769 4. 60E-07 T307Q/L309E/Q311H/N434Y F770 3.00E-07 M252Y/T256A/N434Y 261 201249871 表28-16係接續表28-15 【表28-16】

F771 4.00E-O7 M252Y/E272A/N434Y F772 3.80E-07 M252Y/K274A/N434Y F773 3.90E-07 M252Y/V282A/N434Y F774 4.00E-O7 M252Y/N286A/N434Y F775 6.20E-07 M252Y/K338A/N434Y F776 3.90E-07 M252Y/K340A/N434Y F777 3.90E-07 M252Y/E345A/N434Y F779 3.90E-07 M252Y/N361A/N434Y F780 3.90E-07 M252Y/Q362A/N434Y F781 3.70E-07 M252Y/S375A/N434Y F782 3.50E-07 M252Y/Y391A/N434Y F783 4.00E-07 M252Y/D413A/N434Y F784 5.00E-07 M252Y/L309A/N434Y F785 7.40E-07 M252Y/L309H/N434Y F786 2.80E-08 M252Y/S254T/N286E/T3070/0311A/N434Y F787 8.80E-08 M252Y/S254T/T307Q/L309E/Q311A/N434Y F788 4.10E-07 M252Y/N315A/N434Y F789 1.50E-07 M252Y/N315D/N434Y F790 2.70E-07 M252Y/N315E/N434Y F791 4.40E-O7 M252Y/N315F/N434Y F792 4. 40E-07 M252Y/N315G/N434Y F793 3.30E-07 M252Y/N315I/N434Y F794 4.10E-07 M252Y/N315K/N434Y F795 3.10E-07 M252Y/N315L/N434Y F796 3.40E-O7 M252Y/N315M/N434Y F798 3. 50E-07 M252Y/N3150/N434Y F799 4.10E-07 M252Y/N315R/N434Y F800 3. 80E-07 M252Y/N315S/N434Y F801 4.40E-07 M252Y/N315T/N434Y F802 3. 30E-07 M252Y/N315V/N434Y F803 3. 60E-07 M252Y/N315W/N434Y F804 4.00E-07 M252Y/N3I5Y/N434Y F805 3. 00E-07 M252Y/N325A/N434Y F806 3.10E-07 M252Y/N384A/N434Y F807 3. 20E-07 M252Y/N389A/N434Y F808 3.20E-07 M252Y/N389A/N390A/N434Y F809 2. 20E-07 M252Y/S254T/T256S/N434Y F810 2. 20E-07 M252Y/A378V/N434Y F811 4. 90E-07 M252Y/E380S/N434Y F812 2. 70E-07 M252Y/E382V/N434Y F813 2. 80E-07 M252Y/S424E/N434Y F814 1.20E-07 M252Y/N434Y/Y436I 262 201249871 表28-17係接續表28-16 【表28-17】

F815 5. 50E-07 M252Y/N434Y/T437R F816 3.60E-07 P238D/T250V/M252Y/T307P/N434Y F817 9. 80E-08 P238D/T250V/M252Y/T307Q/0311A/N434Y F819 1.40E-07 P238D/M252Y/N286E/N434Y F820 3.40E-07 L235K/S239K/M252Y/N434Y F821 3.10E-07 L235R/S239K/M252Y/N434Y F822 1.10E-06 P238D/T250Y./M252Y/W313Y/N434Y F823 1.10E-06 P238D/T250Y/M252Y/W313F/N434Y F828 2. 50E-06 P238D/T250V/M252Y/I253V/N434Y F831 1.60E-06 P238D/T250V/M252Y/R255A/N434Y F832 2. 60E-06 P238D/T250V/M252Y/R255D/N434Y F833 8.00E-07 P238D/T250V/M252Y/R255E/N434Y F834 8.10E-07 P238D/T250V/M252Y/R255F/N434Y F836 5. 00E-07 P238D/T250V/M252Y/R255H/N434Y F837 5. 60E-07 P238D/T250V/M252Y/R255I/N434Y F838 4. 30E-07 P238D/T250V/M252Y/R255K/N434Y F839 3. 40E-07 P238D/T250V/M252Y/R255L/N434Y F840 4. 20E-07 P238D/T250V/M252Y/R255M/N434Y F841 1.10E-06 P238D/T250V/M252Y/R255N/N434Y F843 6. 60E-07 P238D/T250V/M252Y/R255Q/N434Y F844 1.30E-06 P238D/T250V/M252Y/R255S/N434Y F847 3.40E-07 P238D/T250V/M252Y/R255W/N434Y F848 8.30E-07 P238D/T250V/M252Y/R255Y/N434Y F849 3.30E-07 M252Y/D280A/N434Y F850 2.90E-07 M252Y/D280E/N434Y F852 3. 30E-07 M252Y/D280G/N434Y F853 3.20E-07 M252Y/D280H/N434Y F855 3.20E-07 M252Y/D280K/N434Y F858 3.20E-07 M252Y/D280N/N434Y F860 3.30E-07 M252Y/D280Q/N434Y F861 3. 20E-07 M252Y/D280R./N434Y F862 3. 00E-07 M252Y/D280S/N434Y F863 2. 70E-07 M252Y/D280T/N434Y F867 2. 80E-07 M252Y/N384A/N389A/N434Y F868 2. 00E-08 G236A/S239D/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y F869 G236A/S239D F870 7. 30E-08 L235K/S239K/M252Y/T307Q/0311A/N434Y F871 7.10E-08 L235R/S239K/M252Y/T307Q/0311A/N434Y F872 1.30E-07 L235K/S239K/M252Y/N286E/N434Y F873 1.20E-07 L235R/S239K/M252Y/N286E/N434Y F875 4.80E-07 M252Y/N434Y/Y436A F877 8. 30E-07 M252Y/N434Y/Y436E 263 201249871 表28-18係接續表28-17 【表28-18】

F878 1.90E-07 M252Y/N434Y/Y436F F879 9.20E-07 M252Y/N434Y/Y436G F880 3.90E-07 M252Y/N434Y/Y436H F881 3.10E-07 M252Y/N434Y/Y436K F882 1.30E-07 M252Y/N434Y/Y436L F883 2.10E-07 M252Y/N434Y/Y436M F884 4.00E-07 M252Y/N434Y/Y436N F888 4.80E-07 M252Y/N434Y/Y436S F889 2.20E-07 M252Y/N434Y/Y436T F890 1.10E-07 M252Y/N434Y/Y436V F891 1.70E-07 M252Y/N434Y/Y436W F892 7.10E-08 M252Y/S254T/N434Y/Y436I F893 9.80E-08 L235K/S239K/M252Y/N434Y/Y436I F894 9.20E-08 L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436I F895 2.10E-08 L235K/S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N315E/N434Y F896 2.00E-08 L235R/S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N315E/N434Y F897 9.70E-08 M252Y/N315D/N384A/N389A/N434Y F898 1.70E-07 M252Y/N315E/N384A/N389A/N434Y F899 1.10E-07 M252Y/N315D/G316A/N434Y F900 1.70E-07 M252Y/N315D/G316D/N434Y F901 1.30E-07 M252Y/N315D/G316E/N434Y F902 2.20E-07 M252Y/N315D/G316F/N434Y F903 2.30E-07 M252Y/N315D/G316H/N434Y F904 1.00E-07 (W252Y/N315D/G316I/N434Y F905 1.30E-07 IM252Y/N315D/G316K/N434Y F906 1.50E-07 M252Y/N315D/G316L/N434Y F907 1.30E-07 M252Y/N315D/6316M/N434Y F908 1.50E-07 M252Y/N315D/6316N/N434Y F909 1.30E-07 M252Y/N3150/G316P/N434Y F910 1.40E-07 M252Y/N315D/G3160/N434Y F911 1.30E-07 M252Y/N315D/G316R/N434Y F912 1.20E-07 M252Y/N315D/G316S/N434Y F913 1.10E-07 M252Y/N315D/6316T/N434Y F914 1.50E-07 M252Y/N315D/6316V/N434Y F915 2. 30E-07 M252Y/N315D/G316W/N434Y F917 2. 50E-07 M252Y/N286S/N434Y F918 2. 80E-07 M252Y/D280E/N384A/N389A/N434Y F919 3. 30E-07 M252Y/D280G/N384A/N389A/N434Y F920 2. 50E-07 M252Y/N286S/N384A/N389A/N434Y F921 1.20E-07 M252Y/N286E/N384A/N389A/N434Y F922 5. 90E-08 L235K/S239K/M252Y/N286E/N434Y/Y436I F923 6.00E-08 L235R/S239K/M252Y/N286E/N434Y/Y436I 264 201249871 表28-19係接續表28-18 【表28-19】

F924 3.40E-08 L235K/S239K/M252Y/T3070/Q311A/N434Y/Y436I F925 3. 20E-08 L235R/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436I F926 1.10E-07 L235K/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436I F927 1.00E-07 L235R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436I F928 2. 90E-08 M252Y/T3070/Q311A/N434Y/Y436I F929 2. 90E-08 M252Y/S254T/T307Q/Q311A/N434Y/Y436I F930 1.40E-07 P238D/T250V/M252Y/N286E/N434Y F931 1.20E-07 P238D/T250V/M252Y/N434Y/Y436I F932 3.20E-07 T250V/M252Y/N434Y F933 3.OOE-07 L234R/P238D/T250V/M252Y/N434Y F934 3.10E-07 G236K/P238D/T250V/M252Y/N434Y F935 3.20E-07 G237K/P238D/T250V/M252Y/N434Y F936 3.20E-07 G237R/P238D/T250V/M252Y/N434Y F937 3.10E-07 P238D/S239K/T250V/M252Y/N434Y F938 1.60E-07 L235K/S239K/M252Y/N434Y/Y436V F939 1.50E-07 L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V F940 1.50E-07 P238D/T250V/M252Y/N434Y/Y436V F941 1.20E-08 M252Y/N286E/T307Q/0311A/N434Y/Y436V F942 4.20E-08 L235K/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V F943 4.00E-08 L235R/S239K/M252Y/T3070/Q311A/N434Y/Y436V F944 1.70E-07 T250V/M252Y/N434Y/Y436V F945 1.70E-08 T250V/M252Y/V308P/N434Y/Y436V F946 4.30E-08 T250V/M252Y/T307Q/0311A/N434Y/Y436V F947 1.10E-08 T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V F954 5.30E-07 M252Y/N434Y/H435K/Y436V F957 7.70E-07 M252Y/N434Y/H435N/Y436V F960 8.00E-07 M252Y/N434Y/H435R/Y436V F966 3. 10E-07 M252Y/S254A/N434Y F970 2. 50E-06 M252Y/S254G/N434Y F971 2. 60E-06 M252Y/S254H/N434Y F972 2.60E-07 M252Y/S254I/N434Y F978 1.30E-06 M252Y/S2540/N434Y F980 1.80E-07 M252Y/S254V/N434Y F987 4. 00E-08 P238D/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V F988 6. 90E-08 P238D/T250V/M252Y/N286E/N434Y/Y436V F989 1.40E-08 L235R/S239K/M252Y/V308P/N434Y/Y436V F990 9.40E-09 L235R/S239K/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V F991 1.30E-08 L235R/S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V F992 5.10E-08 L235R/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/M428I/N434Y/Y436V F993 3.80E-08 M252Y/T3070/Q311A/N434Y/Y436V F994 2. 80E-07 M252Y/N325G/N434Y F995 2.90E-07 L235R/P238D/S239K/M252Y/N434Y

S 265 201249871 表28-20係接續表28-19 【表28-20 】

F996 1.30E-07 L235R/P238D/S239K/M252Y/N434Y/Y436V F997 3. 80E-07 K248I/T250V/M252Y/N434Y/Y436V F998 8.50E-07 K248Y/T250V/M252Y/N434Y/Y436V F999 2.10E-07 T250V/M252Y/E258H/N434Y/Y436V F1005 N3256 F1008 1.70E-07 L235R/S239K/T250V/M252Y/N434Y/Y436V F1009 1.20E-08 L235R/S239K/T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y4 36V F1010 1.90E-07 L235R/S239K/M252Y/T307A/0311H/N434Y F1011 4. 50E-08 T250V/M252Y/V308P/N434Y F1012 4. 70E-08 L235R/S239K/T250V/M252Y/V308P/N434Y F1013 3. 00E-08 T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y F1014 3. 20E-08 L235R/S239K/T250V/M252Y/T3070/V308P/Q311A/N434Y F1015 2. 20E-08 L235R/S239K/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y F1016 3. 80E-09 T250V/M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V F1017 4.20E-09 L235R/S239K/T250V/M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/N4 34Y/Y436V F1018 3. 20E-09 L235R/S239K/M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y4 36V F1019 3.40E-07 P238D/T250V/M252Y/N3256/N434Y F1020 8. 50E-08 P238D/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/N325G/N434Y F1021 3.30E-07 P238D/T250V/M252Y/N325A/N434Y F1022 K326D/L328Y F1023 4.40E-08 S239D/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V F1024 4.00E-08 T250V/M252Y/T307Q/Q311A/K326D/L328Y/N434Y/Y436V F1025 3. 60E-08 S239D/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/K326D/L328Y/N434Y/Y4 36V F1026 8.40E-08 M252Y/T307A/Q311H/N434Y/Y436V F1027 8. 60E-08 L235R/S239K/M252Y/T307A/Q311H/N434Y/Y436V F1028 4. 60E-08 G236A/S239D/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V F1029 5.10E-08 T250V/M252Y/T307Q/Q311A/I332E/N434Y/Y436V F1030 I332E F1031 5.30E-08 G236A/S2390/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/I332E/N434Y/Y4 36V F1032 4.30E-08 P238D/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/N325G/N434Y/Y436V F1033 1.00E-06 P238D/N434W F1034 1.50E-08 L235K/S239K/M252Y/V308P/N434Y/Y436V F1035 1.00E-08 L235K/S23 9K/M252Y/T3070/V308P/Q311A/N434Y/Y436V Π036 1.40E-08 L235K/S239K/M252Y/N286E/T3070/Q311A/N434Y/Y436V F1037 6.10E-08 L235K/S239K/M252Y/T3070/Q311A/M428I/N434Y/Y436V F1038 2. 80E-07 L235K/P238D/S239K/M252Y/N434Y F1039 1.30E-07 L235K/P238D/S239K/M252Y/N434Y/Y436V 266 201249871 表28-21係接續表28-20 【表28-21】

F1040 2. 00E-07 L235K/S239K/T250V/M252Y/N434Y/Y436V F1041 1.40E-08 L235K/S239K/T250V/M252Y/T307Q/V308P/0311A/N434Y/Y4 36V F1042 2.00E-07 L235K/S239K/M252Y/T307A/Q311H/N434Y F1043 5.20E-08 L235K/S239K/T250V/M252Y/V308P/N434Y F1044 3.50E-08 L235K/S239K/T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y F1045 2.50E-08 L235K/S239K/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y F1046 4.50E-09 L235K/S239K/T250V/M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/N4 34Y/Y436V F1047 3.40E-09 L235K/S239K/M252Y/N286E/T307Q/V308P/0311A/N434Y/Y4 36V F1048 9.90E-08 L235K/S239K/M252Y/T307A/Q311H/N434Y/Y436V F1050 3.50E-09 T250V/M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/M428I/N434Y/Y4 36V F1051 3.90E-09 L235R/S239K/T250V/M252Y/N286E/T307Q/V308P/0311A/M4 28I/N434Y/Y436V F1052 3. 20E-09 L235R/S239K/M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/M428I/N4 34Y/Y436V

[參考例13 ]使用人類FcRn基因轉殖小鼠系統32之穩定狀態注入模型進行各種Fc變異體抗體之體内試驗將參考例12製作之Fc變異體，於使用人類FcRn基因轉殖小鼠系統32之穩定狀態注入模型，進行血漿中抗原消失能力相關之試驗。穩定狀態注入模型體内試驗，使用人類FcRn基因轉殖小鼠系統32替代系統276，並投予單株抗小鼠CD4抗體2次（埋入注入泵浦之前、與投予抗體14 曰後）或3次（埋入注入泵浦前、與投予抗體1 〇曰後及20 曰後），除此以外依實施例1記載實施。將從表28-1至28-21記載之Fc變異體選擇之以下記载之抗體Fc變異體，依參考例3記載之該技術領域之人士公知之方法表現並精製：含 VH3-IgGl 與 VL3-CK 之 Fv4-IgGl ; 267 201249871 含 VH3-IgGl-Fll 與 VL3-CK 之 Fv4_Ig(n_F11 ; 含 VH3-IgG卜F14 與 VL3-CK 之 Fv4-IgGl-F14 ; 含 VH3-IgG卜F39 與 VL3-CK 之 Fv4-IgG卜F39 ; 含 VH3-IgG卜F48 與 VL3-CK 之 Fv4-IgG卜F48 ; 含 VH3-IgGl-F140 與 VL3、CK 之 Fv4-IgGl-F140 ; 含 VH3-IgGl-F157 與 VL3〜CK 之 Fv4-IgGl-F157 ; 含 VH3-IgG卜F194 與 VL3〜CK 之 Fv4-IgGl-F194 ; 含 VH3-IgG卜F196 與 VL3'CK 之 Fv4-IgGl-F196 ; 含 VH3-IgGl-F198 與 VL3、CK 之 Fv4-IgGl-F198 ; 含 VH3-IgGl-F262 與 VL3、CK 之 Fv4-IgGl-F262 ; 含 VH3-IgGl-F264 與 VL3、ck 之 Fv4-IgGl-F264 ; 含 VH3-IgGl-F393 與 VL3、CK 之 Fv4-IgGl-F393 ; 含 VH3-IgGl-F434 與 VL3、CK 之 Fv4—IgG卜F424 ;及含 VH3-IgG卜F447 與 VL3、CK 之 Fv4_IgG1_F447 。 S玄等抗體對於人類FcRn基因轉殖小鼠系統32以1 mg/kg之用量投予。圖49顯示小鼠之血漿中hsIL_6R濃度變化。與 Fv4-IgGl相比，PH7. 0對於人類FcRn之結合親和性增大之 Fc變異體均顯示血漿中hsIL-6R濃度減少，故抗原從血衆之消失增大。抗原漢度減少之程度及持續，視Fc變異體間不同，但全部變異體一致比起IgGl，血漿中hsIL-6R濃度減少。此顯示：藉由使於pH7. 0對於人類FcRn之結合親和性增大，抗原從血聚之消失一般而言會增大。圖$ 〇顯示於小鼠之血聚中抗體濃度變化。抗體之樂物動態，於Fc變異 268 201249871 體間不同。如參考例9記栽，就备枕艚盾夕取就母抗體1分子，從血漿消失之抗原之量係於藉由投予# ^ η 7 η 妖 ^ A ^ F ' ·;人類FcRn之結合親和性抗體FC變異體以評價抗原消失效率時之重要要因。故’針對各抗體之r r t (抗原/抗體莫耳比）之變化記載於圖51。圖52顯示dH7 0制·於人#s p ptw. u對於人類FcRn之Fc變異體之結合親和性、與抗體投予1日後之e値（抗原/抗體莫耳比）之間的關係。此顯示··於該試驗中經試驗的所有抗體Fc變異體比起Fv4-IgGl且金吞I r » /、車乂小C値。本試驗中所試驗之全部

Fc變異體，比起人類A a? Λ 頰tcRn在ρΗ7. 〇具有強於KD 3. 〇/i Μ 之結合親和性，故此笼., t 此寺比起天然型人類IgGl會達成較高抗原消失效率。此點與參考例9獲得之結果一致（圖42)。圖53 薦示本试驗所試驗之fc變異體中，具卩11、『39、 F48及F264之Fc變異體之抗體顯示與igGi類似藥物動態。該試驗係使用人類FcRn基因轉殖小鼠進行，因此可預料该等Fc變異體於人類也會具有與IgG1類似之長半衰期。圖54顯示投予具有與天然型人類IgG1為類似藥物動態之抗體（Fll、F39、F48、及F264)之小鼠，其血漿中 hsIL-6R濃度變化。該等變異體比起IgG1，使血漿中 hsIL-6R濃度減少約1〇倍。故’該等抗體，使hsIL_6R濃度比起基線hsIL-6R濃度（無抗體之濃度）減少。因此、該等抗體’能使抗原從血漿長期消失，據認為能使用對於慢性疾病之抗體治療有利的長投予間隔。圖55及56各代表針對igG卜及FC變異體Fi57、F196、 269 201249871 Μ?之血漿中抗體濃度及血漿中hsIL-6R濃度變化。令人’"、外地 F1 5 7及F 2 6 2之抗體藥物動態比起天然型

IgGl顯不顯著較快從血漿之廓清，但F1 57及F262顯示從血漿大巾田且持續的hsIL —消失。具體而言於FI”之血漿中hsIL 6R濃度，從第1日至28日（不含第14曰）為榀測極限（1· 56 ng/mi)下，於F262之血漿中hsIL_6R濃度，攸第14日至28日在檢測極限（1· 56 ng/ml)下。另一 :面，關於與F157相比之抗體之廓清較慢的F196，抗原濃度於第14日開始增加，於第28日回到基線。本試驗所 5式驗之F C變里體夕由 P 1 C *7 Τ7 ΤΛ 體之中，F157及F262為血漿中hsIL-6R濃度在第28曰之時點減少到低於1.56 mg/ml的唯一 Fc變里體。 / 柷體比起天然型人類IgG1，非常快速從血漿消失故 F157及F262獲得如此的持續的長期效果，係從抗體之藥物動匕、料想之外。尤其，於F157之血漿中抗體濃度，於第 21日未能檢測到。儘管如此’血漿中hsiL_6R濃度，於第 21日及28日之時點，持續減少到低於檢測極限之1.% ng/ml為低之水平。本發明*拘於特定理論，但該料想外之效果，據認為是由於抗體以FcRn結合型存在於血管内皮、肊表面存在的原故。該等抗體在血漿中顯示低濃度，但 “等抗體也會以FcRn結合型(無法以血漿中抗體濃度的形式測定）存在於血管隔間。該等FeRn結合抗體也會與血聚中之抗原結合，並且抗原/抗體複合體藉由FcRn攝入後，抗原於核内體内游離並由溶體分解，但是抗體會以kb結 270 201249871 合型的形式回到細胞表面並再循環。如此，該等FcRn結合抗體貢獻於抗原之消失。藉此’可說明抗體濃度在血漿中降低後，該等抗體還能維持抗原消失能力的理由。【產業上利用性】依照本發明，可提供促進利用抗原結合分子使抗原攝入細胞内之方法、增加1分子之抗原結合分子對於抗原之結合次數之方法、利用抗原結合分子之投予促進血聚中之抗原濃度之減少之方法、改善抗原結合分子之血衆中滯留性之方法。藉由促進利用抗原結合分子使抗原攝入細胞内’能促進由於抗原結合分子投予所致之抗原之血漿中之抗原濃度減少’同時可改善抗原結合分子之血漿中滯留性’能增加1分子之抗原結合分子對於抗原之結合次數，月b於體内比起通常之抗原結合分子發揮更優異之效果。【圖式簡單說明】圖1顯示pH依存性結合抗體返覆結合於可溶型抗原之圖。（i)抗體與可溶型抗原結合、（i i)非專一性地利用胞飲作用攝入細胞内、（i i i)於核内體内抗體與FcRn結合’可溶型抗原從抗體解離、（i v)可溶型抗原移到溶體並被分解、（v)可溶型抗原解離之抗體，由於FcRn再循環於血漿中、（v i)再循環之抗體可再度與可溶型抗原結合。圖2顯示pH依存性結合抗體返覆結合於膜型抗原之圖。（i)抗體與膜型抗原結合、（i i)抗體與膜型抗原以 271 201249871 複合體之狀態内化到細胞内、（出）力核内體内從膜型抗原解離、（:IV) m型抗原移到溶體並被分#、（V)從膜型抗原解離之抗體再循環到血t中、（vi)再循環之抗體可再度與膜型抗原結合。圖3顯示pH依存性結合抗體於血漿中（pH74)與核内體内（pH6.0)對抗原之交互作用之模式。圖4顯示鈣依存性結合抗體於血漿中（Ca2+ 2 mM)與核内體内（Ca 3/zM)對抗原之交互作用之模式。圖5顯示pH及鈣依存性結合抗體之血漿中（pH74、Ca2 + 2禮）與核内體内（pH6.〇、CaZ+ 3//幻對抗原之交互作用之模式。圖6顯示使用Biacore之抗人類IL_6受體抗體於Ca2+ 2 mM及Ca2+ 3" Μ對於可溶型人類IL_6受體之交互作用之傳感圖。圖 7 顯示 H54/L28-IgGl 於 Ca2+ 2 mM 及 Ca2+ 3/z Μ 對於可溶型人類IL-6受體之交互作用之Biacore傳感圖。圖8顯示FH4-IgGl於Ca2+ 2 mM及Ca2+ 3 " Μ對於可浴型人類IL-6受體之交互作用之Biacore傳感圖。圖 9 顯示 6RL#9-IgGl 於 Ca2+ 2 mM 及 Ca2+ 3 μ Μ 對於可溶型人類IL-6受體之交互作用之Biacore傳感圖。圖 1〇顯示 H54/L28-IgG卜 FH4-IgG卜及、6RL#9-IgGl 於正常小鼠之血漿中抗體濃度變化。圖 11 顯示 H54/L28-IgGl、FH4-IgGl、及、6RL#9-IgGl 於正常小鼠之血漿中可溶型人類IL_6受體（hsIL-6R)濃度 272 201249871 變化。圖 12 顯示 H54/L28-N434W 、 FH4-N434W 、及、 6RL#9-N434W於正常小鼠之血漿中抗體濃度變化。圖 13 顯示 H54/L28-N434W 、 FH4-N434W 、及、 6RL#9-N434W於正常小鼠之血聚中可溶型人類il-6受體 (hs IL-6R)濃度變化。圖14顯示以X射線結晶結構解析決定之6rl#9抗體之 Fab片段之重鏈CDR3之結構。圖15顯示使用Biacore之抗人類IL-6抗體於Ca2 + 1. 2 mM及Ca2+ 3/zM對於人類IL-6之交互作用之傳感圖。圖16顯示含人類Vk5-2序列之抗體、與含人類Vk5-2 序列中之糖鏈加成序列經改變之h Vk5-2_L65序列之抗體之離子交換層析圖。實線代表含人類Vk5-2序列之抗體（重鏈：CIM_H、序列編號：48及輕鏈：hVk5-2、序列編號： 41與序列編號：28之融合分子）之層析圖、虛線代表具 hVk5-2_L65序列之抗體（重鏈：CIM_H(序列編號：48)、輕鏈：hVk5-2—L65(序列編號47))之層析圖。圖17顯示含LfVkl_Ca序列之抗體（重鏈：GC_H、序列編號：102及輕鏈：LfVkl_Ca、序列編號：61)、與含LfVkl_Ca 序列中之Asp(D)殘基改變為a 1 a(A)殘基之序列之抗體於 5 C保存後（實線）或5 0 °C保存後（虛線）之離子交換層析圖。各以5 °C保存後之離子交換層析圖中最高的峰部當做主要峰部’以主要峰部將y軸常態化。圖18顯示含LfVkl_Ca序列之抗體（重鏈：gc_h、序列 273 201249871 編號.1 02及輕鏈：LfVkl_Ca、序列編號：61)、與含Lf Vkl_Ca 序列中之30位（Kabat編號法）之Asp(D)殘基改變為Ser(S) 殘基之LfVkl_Ca6序列（重鏈：GC_H、序列編號：1 〇2及輕鏈：LfVkl_Ca6、序列編號：75)之抗體於保存後（實線）或5 0 C保存後（虛線）之離子交換層析圖。各以5。匚保存後之離子交換層析圖中最高的峰部當做主要峰部，以主要峰部將y軸常態化。圖19顯示使用Biacore之抗人類cd4抗體於Ca2+ 1. 2 mM及Ca2+ 3//M對於可溶型人類CD4之交互作用之傳感圖。圖20顯示抗人類CD4抗體之正常小鼠血漿中抗體濃度變化。圖21顯示可溶型人類CD4單獨投予群、TNX355-IgGl 抗體投予群、Q425抗體投予群及q425L9抗體投予群於正吊小鼠血漿中之可溶型人類CD4之濃度變化。圖22顯示使用Biacore之抗人類IgA抗體於Ca2 + 1. 2 mM及Ca 3 V M對於人類IgA之交互作用之傳感圖。圖23顯示GAl-IgGl抗體投予群、GA2_IgG1抗體投予群、GA3-IgGl及GA2-N434W抗體投予群之正常小鼠血漿中抗體濃度變化。圖24顯示人類1SA單獨投予群、GA卜IgGl抗體投予群、GA2-IgGl抗體投予群、GA3_IgG1抗體投予群及 GA2-N434W抗體投予群於正常小鼠血漿中人類IgA之濃度變化。 274 201249871 圖25顯示GA卜IgGl抗體投予群、GA2-IgGl抗體投予群、GA3-IgGl抗體投予群及GA2-N434W抗體投予群於正常小鼠血漿中之非結合型人類I gA之濃度變化。圖2 6顯示對於多元體抗原形成大型免疫複合體之通 ¥抗體’抗體每1分子使抗原消失之效率之例。圖27顯示包含對於多元體抗原形成大型免疫複合體之天然I gG 1之恆定區之pH/Ca依存性抗體，抗體每1分子使抗原消失之效率之例。圖28顯示認識單體抗原存在之2個以上之抗原決定基並對於形成大型免疫複合體為適當的多專一性pH/Ca依存性抗體’抗體每1分子使抗原消失之效率之例。 *"具示使用ELISA法之抗人類Glypican3抗體於

Ca 1.2 mM及Ca2+ 3// M對於重組人類Glypican3之交互作用。

^ -員示使用ELISA法之抗人類igE抗體於Ca2 + 2mM 3 3 V Μ對於重組人類I gE之交互作用。圖 31 Ms ~ 不人類FcRn基因轉殖小鼠中，抗體之血漿中濃度變化。声類FcRn基因轉殖小鼠中，可溶型人類il-6 受體之血裝中、'曹ώ 水甲/屣度變化。圖33顯示+ , 正常小鼠中，抗體之血漿中濃度變化。 Μ 3 4 δι * 不正常小鼠中，可溶型人類IL-6受體之血漿中濃度變化。圖3 5辱苜〒* τ 正常小鼠中’非結合型（unbound)可溶型人 275 201249871 類IL-6受體之血漿中濃度變化。圖36顯示人類心基 π且4黾〒，金漿中可溶刑人類IL-6受體濃度變化。 $ 圖37顯示以板爾喜低用置（0·01 mg/kg)或 i mg/kg

Fv4-IgGl-F14後，血漿中可 ^•人類IL~6受體濃度變化。圖顯不以假田旦Λ …mg/kg)或1 mg/kg 投予 Fv4-Ig(H-F14後，灰聚中抗體濃度變化。圖39顯示對於血漿中可溶 1人類IL-6受體濃度维垃穩定狀態之正常小鼠，浐；> , 又菔辰又维持 „ .· 鼠杈予抗人類IL_6受體抗體後之血製中可々51人類IL-6受體濃度變化。

圖40顯示對於人類F 同時投予hsIL,及抗人類^基因轉殖小鼠(系統叫濃度變化。 ' Li爻體抗體後之血衆中抗體圖41顯示對於人類ρ Π ^ h 11基因轉殖小鼠（系統276)，同時投予hsIL-6R及枋人相Ττ ^ , ig n . IL~6受體抗體後之血漿中可溶型人類IL-6受體濃度變化。 “谷圖42顯示於PH7. 〇對於 J ^、入頬FcRn之pv纖s胸十从人親和性、與對於人類F 支異體之、、，Q 5 ns…二:基:轉殖小鼠 hsIL-6R濃度之關係。丄日後之血漿中圖43顯示pH7. 0對於 .、人類FcRn之Fc蠻慕艚之έ士人细和性、與對於人類FcRn義支異體之、'、。σ親 hsIL-6R及浐又# ττ 土轉殖小鼠（系統276)同時投予 nsiL bK及抗人類IL_6受了仅r 之關係。几體1日後之血漿中抗體濃度 276 201249871 圖44顯示對於人類㈣基因轉殖小鼠（系統2冗）同時投予hsIL-6R及抗人類1"受體抗體後之抗原/抗體莫耳比（C値）之變化。 ' 圖45顯不PH7. 0對於人類FcRn之&變異體之結合親和性與對於人類FcRn基因轉瘦小鼠（系統276)同時投予 hsIL-6R及抗人類IL〜6受體抗體i曰後之抗原，抗體莫耳比（C値）之間的關係。圖46顯示對於血1中㈤㈣濃度維持穩枝態之人類⑽基因轉殖小鼠（系統276 )(穩定狀態注入模型）以低用里（〇.01 或〇.2 mg/kg)或1 mg/kg 投予 Fv4_IgG1_Fl4 後，血漿中hsIL-6R濃度變化。圖〇顯示對於人類FcRn基因轉殖小鼠（系統m及 32)，同時投予hsIL，及抗人類IL—6受體抗體後，於人類論基因轉料以統276及系統32^ 、濃度變化。圖4 8顯示對於人類F c R n基因轉殖小鼠（系統m及系統32)同時投予hs_及抗人類旧受體抗體後，於人 =。基因轉殖小鼠系統2?6及系統32之…抗體濃圖4 9 .,、、員不對於血锻中匕I l — 、，曾译祕水T ftSlL 6R/辰度維持穩定狀態之人 t二殖小鼠(系'统32)(穩定狀態注入模型)投予机人類IL、6受體抗體後’血聚中hsiL_6R遭度變化。圖T示對於血漿中hsIL_6R濃度維持穩定狀態之人 ' c η 土因轉殖小鼠（系統32)(穩定狀態注入模型）投予 277 201249871 抗人類IL-6受體抗體後之血漿中抗體濃度變化。圖51顯不對於血毁中，曲也认 &〒hsIL-6R浪度維持穩定狀態之人類FcRn基因轉殖小鼠（丰蛣q9、，趙—UL At 乳、乐統32)(穩定狀態注入模型）投予抗人類IL-6受體抗體後，括甩说仇原/抗體莫耳比（c値）之變化。圖52顯示pH7. 0對於人p D > r 耵於人類FcRn之Fc變異體之結合親和性、與對於血漿中h s π _ R p -曲疮秘杜你 T nsiL 6R浪度維持穩定狀態之人類

FcRn基因轉殖小鼠（系統32)(穩定狀態注入模型）投予亡人類IL-6受體抗體1日後之抗原/抗體莫耳比（c値）之: 的關係。 Μ 圖53顯示對於血漿中匕^^⑽濃度維持穩定狀態之人類FcRn基因轉殖小鼠（系統32)(穩定狀態注入模型），t 予具Fll、F39、F48、及F264之Fc變異體之抗人類汽钗受體抗體後，血漿中抗體濃度變化。圖54顯示對於血漿中hsIL_6R濃度維持穩定狀熊之類FcRn基因轉殖小鼠（系統32)(穩定狀態注入模型），& 予具Fll、F39、F48、及F264之Fc變異體之抗人類受體抗體後，血漿中hsIL-6R濃度變化。 6 圖55顯示對於血漿中hsIL-6R濃度維持穩定狀離之類FcRn基因轉殖小鼠（系統32)(穩定狀態注入模型），予具F157' F196、及F262之Fc變異體之抗人類IL〜6 ^ 體抗體後，血漿中抗體濃度變化。义圖56顯示對於血漿中hslL-6R濃度維持穩定狀離之類FcRn基因轉殖小鼠（系統32)(穩定狀態注入模型），人予具F157、F196、及F262之Fc變異體之抗人類IL〜^ 6受 278 201249871 體抗體後，血漿中hsIL-6R濃度變化。【主要元件符號說明】無。 279 201249871 序列表 <110>中外製藥股份有限公司 <120>重複結合複數個分子的抗原之抗原結合分子

<130> C1-A1009Y1-TW <150〉 JP 2010-266121 <151> 2010-11-30 <150〉 JP 2011-217886 <151> 2011-09-30 <160> 113 <170> Patentln version 3.4 <210> 1 <211〉 449 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400> 1

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 1 201249871

Gly lie lie Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Asp Pro Gly Gly Gly Glu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175

Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His 195 200 205 2 201249871

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie 325 330 335

Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val 340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser 355 360 365 201249871

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu 370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445

Pro <210〉 2 <211〉 216 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400〉 2

Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Arg Val Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Arg Ser Asn Met Gly Ala Gly 20 25 30 4 201249871

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gin Leu Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu 35 40 45

Leu lie Ser His Asn Thr His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Leu 65 70 75 80

Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser His Asp Ser Ser 85 90 95

Leu Ser Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser 100 105 110

Gin Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125

Glu Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu He Ser Asp Phe 130 135 140

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 145 150 155 160

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn Lys 165 170 175

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys Ser 180 185 190 201249871

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gin Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 195 200 205

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys 210 215 <210> 3 <211> 453 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 3

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Gly lie lie Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 6 201249871

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Arg Asp Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Asp Ala Phe 100 105 110

Asp lie Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 130 135 140

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 1B0 185 190

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys 195 200 205

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 210 215 220

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 225 230 235 240 7 201249871

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 245 250 255

Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 260 265 270

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr 290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp 305 310 315 320

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 325 330 335

Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 340 345 350

Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 355 360 365

Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 370 375 380

He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 385 390 395 400 8 201249871

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 405 410 415

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser 420 425 430

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 435 440 445

Leu Ser Leu Ser Pro 450 <210〉 4 <211> 214 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 4

Glu Thr Thr Val Thr Gin Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys lie Thr Thr Thr Asp lie Asp Asp Asp 20 25 30

Met Asn Trp Phe Gin Gin Glu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Ser Glu Gly Asn He Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser 50 55 60 201249871

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Lys Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Ser Asp Asn Leu Pro Phe 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 10 201249871 <210〉 5 <211> 447 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400> 5

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser lie Ser Asp Asp 20 25 30

Gin Ala Trp Ser Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Tyr lie Ser Tyr Ser Gly lie Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr lie Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser 65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly 100 105 110 11 201249871

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175

Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser 245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 12 201249871

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys 325 330 335

Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr 340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr 355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380

Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415

Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 13 201249871

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 <210〉 6 <211> 214 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 6

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Ser Val Thr lie Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asp lie Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Tyr Gly Ser Glu Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr He Ser Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Gly Asn Ser Leu Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Glu Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 14 201249871

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210〉 7 <211> 453 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400> 7 15 201249871

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Gly lie lie Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Arg Asp Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Asp Ala Phe 100 105 110

Asp lie Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 130 135 140

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 16 201249871

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys 195 200 205

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 210 215 220

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 225 230 235 240

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 245 250 255

Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 260 265 270

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr 290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp 305 310 315 320 17 201249871

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 325 330 335

Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 340 345 350

Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 355 360 365

Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 370 375 380 lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 385 390 395 400

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 405 410 415

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser 420 425 430

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Trp His Tyr Thr Gin Lys Ser 435 440 445

Leu Ser Leu Ser Pro 450 <210〉 8 <211〉 214 <212〉 PRT <213>人工序列 201249871 <220> <223>人工合成的序列 <400> 8

Glu Thr Thr Val Thr Gin Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys lie Thr Thr Thr Asp lie Asp Asp Asp 20 25 30

Met Asn Trp Phe Gin Gin Glu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45

Ser Glu Gly Asn lie Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser 50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Lys Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Ser Asp Asn Leu Pro Phe 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 19 201249871

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 9 <211> 449 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 9

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 20 201249871

Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly lie lie Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Asp Pro Gly Gly Gly Glu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175

Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 21 201249871

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His 195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie 325 330 335

Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val 340 345 350 22 201249871

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser 355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu 370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430

His Glu Ala Leu His Trp His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445

Pro <210> 10 <211> 216 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 10

Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gin 15 10 15 23 201249871

Arg Val Thr He Ser Cys Thr Gly Ser Arg Ser Asn Met Gly Ala Gly 20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gin Leu Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu 35 40 45

Leu lie Ser His Asn Thr His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Leu 65 70 75 80

Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser His Asp Ser Ser 85 90 95

Leu Ser Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser 100 105 110

Gin Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125

Glu Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu lie Ser Asp Phe 130 135 140

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 145 150 155 160

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn Lys 165 170 175 24 201249871

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys Ser 180 185 190

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gin Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 195 200 205

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys 210 215 <210〉 11 <211> 447 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400> 11

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser lie Ser Asp Asp 20 25 30

Gin Ala Trp Ser Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Tyr lie Ser Tyr Ser Gly lie Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 25 201249871

Lys Gly Arg Val Thr lie Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser 65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175

Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 26 201249871

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser 245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 2S0 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys 325 330 335

Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr 340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr 355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 27 201249871

Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415

Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430

Ala Leu His Trp His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 <210〉 12 <211> 214 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 12

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Ser Val Thr lie Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asp lie Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Tyr Gly Ser Glu Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 28 201249871

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Gly Asn Ser Leu Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Glu Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 29 201249871 <210〉 13 <211> 449 <212〉PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 13

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser He Thr Ser Asp 20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Tyr lie Ser Tyr Ser Gly He Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser 65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110 30 201249871

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175

Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser 245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 31 201249871

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys 325 330 335

Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr 340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr 355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380

Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415

Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 32 201249871

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445

Lys <210> 14 <211> 214 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400〉 14

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp lie Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Gly Asn Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 33 201249871

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 15 <211> 468 <212> PRT <213〉人 <400> 15 34 201249871

Met Leu Ala Val Gly Cys Ala Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Pro 15 10 15

Gly Ala Ala Leu Ala Pro Arg Arg Cys Pro Ala Gin Glu Val Ala Arg 20 25 30

Gly Val Leu Thr Ser Leu Pro Gly Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Pro 35 40 45

Gly Val Glu Pro Glu Asp Asn Ala Thr Val His Trp Val Leu Arg Lys 50 55 60

Pro Ala Ala Gly Ser His Pro Ser Arg Trp Ala Gly Met Gly Arg Arg 65 70 75 80

Leu Leu Leu Arg Ser Val Gin Leu His Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Cys 85 90 95

Tyr Arg Ala Gly Arg Pro Ala Gly Thr Val His Leu Leu Val Asp Val 100 105 110

Pro Pro Glu Glu Pro Gin Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser Pro Leu Ser 115 120 125

Asn Val Val Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser Leu Thr Thr 130 135 140

Lys Ala Val Leu Leu Val Arg Lys Phe Gin Asn Ser Pro Ala Glu Asp 145 150 155 160 35 201249871

Phe Gin Glu Pro Cys Gin Tyr Ser Gin Glu Ser Gin Lys Phe Ser Cys 165 170 175

Gin Leu Ala Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr lie Val Ser Met 180 185 190

Cys Val Ala Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr Gin Thr Phe 195 200 205

Gin Gly Cys Gly lie Leu Gin Pro Asp Pro Pro Ala Asn lie Thr Val 210 215 220

Thr Ala Val Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gin Asp 225 230 235 240

Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg 245 250 255

Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp 260 265 270

Leu Gin His His Cys Val He His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His 275 280 285

Val Val Gin Leu Arg Ala Gin Glu Glu Phe Gly Gin Gly Glu Trp Ser 290 295 300

Glu Trp Ser Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser 305 310 315 320 36 201249871

Pro Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gin Ala Leu Thr Thr 325 330 335

Asn Lys Asp Asp Asp Asn lie Leu Phe Arg Asp Ser Ala Asn Ala Thr 340 345 350

Ser Leu Pro Val Gin Asp Ser Ser Ser Val Pro Leu Pro Thr Phe Leu 355 360 365

Val Ala Gly Gly Ser Leu Ala Phe Gly Thr Leu Leu Cys lie Ala lie 370 375 380

Val Leu Arg Phe Lys Lys Thr Trp Lys Leu Arg Ala Leu Lys Glu Gly 385 390 395 400

Lys Thr Ser Met His Pro Pro Tyr Ser Leu Gly Gin Leu Val Pro Glu 405 410 415

Arg Pro Arg Pro Thr Pro Val Leu Val Pro Leu He Ser Pro Pro Val 420 425 430

Ser Pro Ser Ser Leu Gly Ser Asp Asn Thr Ser Ser His Asn Arg Pro 435 440 445

Asp Ala Arg Asp Pro Arg Ser Pro Tyr Asp lie Ser Asn Thr Asp Tyr 450 455 460

Phe Phe Pro Arg 465 37 201249871 <210> 16 <211> 1407 <212> DNA <213〉人 <400〉 16 atgctggccg tcggctgcgc gctgctggct gccctgctgg ccgcgccggg agcggcgctg 60 gccccaaggc gctgccctgc gcaggaggtg gcgagaggcg tgctgaccag tctgccagga 120 gacagcgtga ctctgacctg cccgggggta gagccggaag acaatgccac tgttcactgg 180 gtgctcagga agccggctgc aggctcccac cccagcagat gggctggcat gggaaggagg 240 ctgctgctga ggtcggtgca gctccacgac tctggaaact attcatgcta ccgggccggc 300 cgcccagctg ggactgtgca cttgctggtg gatgttcccc ccgaggagcc ccagctctcc 360 tgcttccgga agagccccct cagcaatgtt gtttgtgagt ggggtcctcg gagcacccca 420 tccctgacga caaaggctgt gctcttggtg aggaagtttc agaacagtcc ggccgaagac 480 ttccaggagc cgtgccagta ttcccaggag tcccagaagt tctcctgcca gttagcagtc 540 ccggagggag acagctcttt ctacatagtg tccatgtgcg tcgccagtag tgtcgggagc 600 aagttcagca aaactcaaac ctttcagggt tgtggaatct tgcagcctga tccgcctgcc 660 aacatcacag tcactgccgt ggccagaaac ccccgctggc tcagtgtcac ctggcaagac 720 ccccactcct ggaactcatc tttctacaga ctacggtttg agctcagata tcgggctgaa 780 cggtcaaaga cattcacaac atggatggtc aaggacctcc agcatcactg tgtcatccac 840 gacgcctgga gcggcctgag gcacgtggtg cagcttcgtg cccaggagga gttcgggcaa 900 ggcgagtgga gcgagtggag cccggaggcc atgggcacgc cttggacaga atccaggagt 960 cctccagctg agaacgaggt gtccaccccc atgcaggcac ttactactaa taaagacgat 1020 38 1080 201249871 1140 1200 1260 1320 1380 1407 gataatattc tcttcagaga ttctgcaaat gcgacaagcc tcccagtgca agattcttct tcagtaccac tgcccacatt cctggttgct ggagggagcc tggccttcgg aacgctcctc tgcattgcca ttgttctgag gttcaagaag acgtggaagc tgcgggctct gaaggaaggc aagacaagca tgcatccgcc gtactctttg gggcagctgg tcccggagag gcctcgaccc accccagtgc ttgttcctct catctcccca ccggtgtccc ccagcagcct ggggtctgac aatacctcga gccacaaccg accagatgcc agggacccac ggagccctta tgacatcagc aatacagact acttcttccc cagatag <210〉 17 <211〉 365 <212> PRT <213〉人 <400〉 17

Met Gly Val Pro Arg Pro Gin Pro Trp Ala Leu Gly Leu Leu Leu Phe 1 5 10 15

Leu Leu Pro Gly Ser Leu Gly Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr 20 25 30

His Leu Thr Ala Val Ser Ser Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp 35 40 45

Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro Gin Gin Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu 50 55 60

Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gin Val 39 201249871 65 70 75 80

Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu Thr Thr Asp Leu Arg lie Lys Glu Lys 85 90 95

Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr 100 105 110

Leu Gin Gly Leu Leu Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val 115 120 125

Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp 130 135 140

Leu Lys Gin Gly Thr Trp Gly Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala lie 145 150 155 160

Ser Gin Arg Trp Gin Gin Gin Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr 165 170 175

Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg 180 185 190

Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys 195 200 205

Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe 210 215 220

Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu Gin Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu 40 201249871 225 230 235 240

Ala Ala Gly Thr Gly Gin Gly Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser 245 250 255

Phe His Ala Ser Ser Ser Leu Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His 260 265 270

Tyr Cys Cys lie Val Gin His Ala Gly Leu Ala Gin Pro Leu Arg Val 275 280 285

Glu Leu Glu Ser Pro Ala Lys Ser Ser Val Leu Val Val Gly He Val 290 295 300 lie Gly Val Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala Val Gly Gly Ala Leu Leu 305 310 315 320

Trp Arg Arg Met Arg Ser Gly Leu Pro Ala Pro Trp lie Ser Leu Arg 325 330 335

Gly Asp Asp Thr Gly Val Leu Leu Pro Thr Pro Gly Glu Ala Gin Asp 340 345 350

Ala Asp Leu Lys Asp Val Asn Val lie Pro Ala Thr Ala 355 360 365 <210> 18 <211> 119 <212〉 PRT <213〉人 41 201249871 <400〉 18

Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser 15 10 15

Gly Leu Glu Ala lie Gin Arg Thr Pro Lys lie Gin Val Tyr Ser Arg 20 25 30

His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser 35 40 45

Gly Phe His Pro Ser Asp lie Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu 50 55 60

Arg He Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp 65 70 75 80

Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp 85 90 95

Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gin Pro Lys lie 100 105 110

Val Lys Trp Asp Arg Asp Met 115 <210〉 19 <211> 447 <212> PRT <213〉人 <400> 19 42 201249871

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser lie Ser His Asp 20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Phe lie Ser Tyr Ser Gly lie Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly loo 105 no

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 43 201249871

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175

Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser 245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 44 201249871

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys 325 330 335

Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr 340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr 355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380

Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415

Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 <210> 20 <211> 214 <212〉 PRT <213> 人 <400> 20 45 201249871

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Ser Val Thr lie Thr Cys Gin Ala Ser Thr Asp lie Ser Ser His 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Tyr Gly Ser His Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gin Gly Asn Arg Leu Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Glu Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160 46 201249871

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210〉 21 <211〉 447 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 21

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser lie Ser His Asp 20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Phe lie Ser Tyr Ser Gly lie Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 47 201249871

Gin Gly Arg Val Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175

Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 48 201249871

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr He Thr 245 250 255

Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys 325 330 335

Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr 340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr 355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 49 201249871

Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415

Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 <210> 22 <211> 447 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 22

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser lie Ser His Asp 20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp 35 40 45 50 201249871 lie Gly Phe lie Ser Tyr Ser Gly lie Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175

Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 51 201249871

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser 245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys 325 330 335

Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr 340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr 355 360 365 52 201249871

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380

Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415

Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430

Ala Leu His Trp His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 <210〉 23 <211〉 447 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400> 23

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser He Ser His Asp 20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp 35 40 45 53 201249871 lie Gly Phe lie Ser Tyr Ser Gly lie Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175

Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 54 201249871

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser 245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Phe Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys 325 330 335

Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr 340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr 355 360 365 55 201249871

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380

Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415

Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430

Ala Leu His Tyr His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 <210〉 24 <211> 443 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400〉 24

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser lie Ser His Asp 20 25 30 56 201249871

Gin Gly Arg Val Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175

Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 57 201249871

Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu 210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu Val Gin 260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300

Thr Val Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys 325 330 335

Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 58 201249871

Gin Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin 370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin 405 410 415

Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ala 420 425 430

His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 <210> 25 <211> 126 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400〉 25

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 59 201249871

Glu Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Tyr lie Ser Ser Ser Gly Ser Thr lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Ala Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Thr Asp Ala 100 105 110

Phe Asp lie Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 26 <211〉 106 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 26

Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15 60 201249871

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45

Phe Asp Ala Ser Asn Arg Ala Ala Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asp Lys Trp Val Thr 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Thr Val Glu He Arg 100 105 <210〉 27 <211〉 454 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400> 27

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 61 201249871

Glu Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Tyr lie Ser Ser Ser Gly Ser Thr He Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Ala Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Thr Asp Ala 100 105 110

Phe Asp lie Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190 62 201249871

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He 195 200 205

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 210 215 220

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255

Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 290 295 300

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin 305 310 315 320

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335

Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 340 345 350 63 201249871

Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 355 360 365

Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375 380

Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 405 410 415

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe 420 425 430

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 435 440 445

Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 <210〉 28 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 28 64 201249871

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 15 10 15

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 29 <211> 213 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 29

Glu He Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15 65 201249871

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45

Phe Asp Ala Ser Asn Arg Ala Ala Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asp Lys Trp Val Thr 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Thr Val Glu He Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110

Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140

Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 66 201249871

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210〉 30 <211〉 454 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 30

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Glu Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tr'p Val 35 40 45

Ser Tyr lie Ser Ser Ser Gly Ser Thr lie Tyr Tyr Ala Ala Ser Val 50 55 60 67 201249871

Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Ala Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Thr Asp Ala 100 105 110

Phe Asp lie Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie 195 200 205

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 210 215 220 68 201249871

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255

Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 290 295 300

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin 305 310 315 320

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335

Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 340 345 350

Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 355 360 365

Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375 380 69 201249871

Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 405 410 415

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe 420 425 430

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 435 440 445

Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 <210〉 31 <211〉 454 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400〉 31

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Glu Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 70 201249871

Ser Tyr He Ser Ser Ser Gly Ser Thr lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Ala Ala Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Thr Asp Ala 100 105 110

Phe Asp lie Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie 195 200 205 71 201249871

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 210 215 220

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255

Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 290 295 300

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin 305 310 315 320

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335

Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 340 345 350

Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 355 360 365 72 201249871

Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375 380

Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 405 410 415

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe 420 425 430

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 435 440 445

Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 <210> 32 <211> 454 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400> 32

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 73 201249871

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Glu Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Tyr lie Ser Ser Ser Gly Ser Thr lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Ala Pro Tyr Tyr Tyr Ala Ser Ser Gly Tyr Thr Asp Ala 100 105 110

Phe Asp lie Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175 74 201249871

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie 195 200 205

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 210 215 220

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255

Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 290 295 300

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin 305 310 315 320

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335 75 201249871

Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 340 345 350

Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 355 360 365

Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375 380

Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 405 410 415

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe 420 425 430

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 435 440 445

Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 <210〉 33 <211> 454 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 76 201249871 <400〉 33

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Glu Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Tyr lie Ser Ser Ser Gly Ser Thr lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Ala Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Thr Ala Ala 100 105 110

Phe Asp lie Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160 77 201249871

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie 195 200 205

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 210 215 220

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255

Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 290 295 300

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin 305 310 315 320 78 201249871

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335

Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 340 345 350

Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 355 360 365

Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375 380

Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 405 410 415

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe 420 425 430

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 435 440 445

Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 <210〉 34 <211〉 454 79 201249871 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400> 34

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Glu Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Tyr lie Ser Ser Ser Gly Ser Thr lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Ala Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Thr Asp Ala 100 105 110

Phe Ala lie Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 80 201249871

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie 195 200 205

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 210 215 220

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255

Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285 81 201249871

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 290 295 300

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin 305 310 315 320

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335

Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 340 345 350

Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 355 360 365

Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375 380

Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 405 410 415

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe 420 425 430

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 435 440 445 82 201249871

Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 <210〉 35 <211> 213 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400> 35

Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45

Phe Ala Ala Ser Asn Arg Ala Ala Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asp Lys Trp Val Thr 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Thr Val Glu lie Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 83 201249871

Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140

Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 36 <211〉 213 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400> 36 84 201249871

Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45

Phe Asp Ala Ser Asn Arg Ala Ala Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Ala Lys Trp Val Thr 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Thr Val Glu lie Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110

Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140

Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 145 150 155 160 85 201249871

Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210〉 37 <211〉 107 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400> 37

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 86 201249871

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Thr Pro Phe 85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp lie Lys 100 105 <210> 38 <211> 112 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400> 38

Asp He Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 15 10 15

Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser 20 25 30

Asn Gly Asp Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu He Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 87 201249871

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Val 85 90 95

Leu Arg Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Gin 100 105 110 <210〉 39 <211> 107 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400> 39

Glu lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 88 201249871

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 40 <211〉 112 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 40

Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Glu Ser Leu Val Leu Ser Leu Gly 15 10 15

Gly Thr Ala Thr lie Asn Cys Arg Ser Ser Gin Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30

Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45

Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Trp Ala Ser lie Arg Asp Ser Gly Val 50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 89 201249871 lie Ser Asp Leu Gin Ala Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95

Tyr Tyr Arg Ala Pro Ser Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Gin He Lys 100 105 110 <210> 41 <211> 107 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400> 41

Glu Thr Thr Leu Thr Gin Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala Thr Pro Gly 15 10 15

Asp Lys Val Asn lie Ser Cys Lys Ala Ser Gin Asp lie Asp Asp Asp 20 25 30

Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Glu Ala Ala lie Phe lie lie 35 40 45

Gin Glu Ala Thr Thr Leu Val Pro Gly lie Ser Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn Asn lie Glu Ser 65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Gin His Asp Asn Phe Pro Tyr 85 90 95 90 201249871

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210〉 42 <211〉 128 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400〉 42

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly lie lie Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 91 201249871

Ala Arg Asp Gly Thr Leu Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Ser Tyr 100 105 110

Asp Ala Phe Asp lie Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 43 <211〉 122 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 43

Gin Met Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Gly lie He Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 92 201249871

Ala Arg Asp Leu Asp Thr Gly Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp loo 105 no

Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 44 <211> 124 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 44

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Gly lie lie Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 93 201249871

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Ser Pro Val Pro Gly Val Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp loo 105 no

Val Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 45 <211〉 119 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400> 45

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15

Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Trp lie Gly Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly lie lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60

Gin Gly Gin Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 94 201249871

Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg His Arg Ala Gly Asp Leu Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 46 <211> 121 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 46

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 lie Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Pro Gin Phe 50 55 60 95 201249871

Gin Asp Arg Val Thr He Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Gly Tyr Asp Asp Gly Pro Tyr Thr Leu Glu Thr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 47 <211> 214 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400> 47

Glu Thr Thr Leu Thr Gin Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala Thr Pro Gly 15 10 15

Asp Lys Val Thr lie Ser Cys Lys Ala Ser Gin Asp lie Asp Asp Asp 20 25 30

Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Glu Ala Ala lie Phe lie lie 35 40 45

Gin Glu Ala Thr Thr Leu Val Pro Gly He Ser Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60 96 201249871

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn Asn lie Glu Ser 65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Gin His Asp Asn Phe Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 97 201249871 <210> 48 <211> 445 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 48

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Pro Gin Phe 50 55 60

Gin Asp Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Gly Tyr Asp Asp Gly Pro Tyr Thr Leu Glu Thr Trp Gly 100 105 110 98 201249871

Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175

Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190

Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys 210 215 220

Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr 245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu 260 265 270 99 201249871

Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 290 295 300

Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr lie 325 330 335

Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350

Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380

Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser 385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415

Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 100 201249871

His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 <210〉 49 <211〉 107 <212〉PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400> 49

Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp lie Asp Asp Asp 20 25 30

Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Glu Ala Thr Thr Leu Val Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Asp Asn Phe Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 101 201249871 <210〉 50 <211> 107 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 50

Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 15 10 15

Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Ala Ser Gin Asp lie Asp Asp Asp 20 25 30

Met Asn Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Glu Ala Thr Thr Leu Val Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala 65 70 75 80

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gin His Asp Asn Phe Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 102 201249871 <210> 51 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400〉 51

Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gin Asp He Asp Asp Asp 20 25 30

Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Glu Ala Thr Thr Leu Val Pro Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gin His Asp Asn Phe Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210〉 52 <211> 107 103 201249871 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 52

Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ala Ser Gin Asp lie Asp Asp Asp 20 25 30

Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Glu Ala Thr Thr Leu Val Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Ala 65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gin His Asp Asn Phe Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210〉 53 <211> 214 <212> PRT <213>人工序列 104 201249871 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 53

Glu Thr Thr Leu Thr Gin Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala Thr Pro Gly 15 10 15

Asp Lys Val Thr lie Ser Cys Lys Ala Ser Gin Asp lie Ala Asp Asp 20 25 30

Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Glu Ala Ala lie Phe lie lie 35 40 45

Gin Glu Ala Thr Thr Leu Val Pro Gly He Ser Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn Asn lie Glu Ser 65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Gin His Asp Asn Phe Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 105 201249871

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 54 <211> 214 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 54

Glu Thr Thr Leu Thr Gin Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala Thr Pro Gly 15 10 15

Asp Lys Val Thr lie Ser Cys Lys Ala Ser Gin Asp lie Asp Ala Asp 20 25 30 106 201249871

Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Glu Ala Ala lie Phe He He 35 40 45

Gin Glu Ala Thr Thr Leu Val Pro Gly lie Ser Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn Asn lie Glu Ser 65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Gin His Asp Asn Phe Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 107 201249871

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 55 <211> 214 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400> 55

Glu Thr Thr Leu Thr Gin Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala Thr Pro Gly 15 10 15

Asp Lys Val Thr lie Ser Cys Lys Ala Ser Gin Asp lie Asp Asp Ala 20 25 30

Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Glu Ala Ala lie Phe lie lie 35 40 45

Gin Glu Ala Thr Thr Leu Val Pro Gly lie Ser Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn Asn lie Glu Ser 65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Gin His Asp Asn Phe Pro Tyr 85 90 95 108 201249871

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210〉 56 <211> 214 <212> PRT <213>人工序列 109 <220〉 201249871 <223>人工合成的序列 <400〉 56

Glu Thr Thr Leu Thr Gin Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala Thr Pro Gly 15 10 15

Asp Lys Val Thr lie Ser Cys Lys Ala Ser Gin Asp lie Asp Asp Asp 20 25 30

Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Glu Ala Ala lie Phe lie lie 35 40 45

Gin Ala Ala Thr Thr Leu Val Pro Gly lie Ser Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn Asn lie Glu Ser 65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Gin His Asp Asn Phe Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 110 201249871

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 57 <211> 214 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400〉 57

Glu Thr Thr Leu Thr Gin Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala Thr Pro Gly 15 10 15

Asp Lys Val Thr lie Ser Cys Lys Ala Ser Gin Asp lie Ala Asp Ala 20 25 30

Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Glu Ala Ala lie Phe lie lie 35 40 45 111 201249871

Gin Glu Ala Thr Thr Leu Val Pro Gly lie Ser Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn Asn lie Glu Ser 65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Gin His Asp Asn Phe Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 112 201249871

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210〉 58 <211> 214 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 58

Glu Thr Thr Leu Thr Gin Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala Thr Pro Gly 1 5 10 15

Asp Lys Val Thr lie Ser Cys Lys Ala Ser Gin Asp lie Ala Asp Asp 20 25 30

Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Glu Ala Ala lie Phe He lie 35 40 45

Gin Ala Ala Thr Thr Leu Val Pro Gly lie Ser Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Asn Asn lie Glu Ser 65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Gin His Asp Asn Phe Pro Tyr 85 90 95 113 201249871

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 59 <211> 214 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成的序列 114 201249871 <400〉 59

Glu Thr Thr Leu Thr Gin Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala Thr Pro Gly 15 10 15

Asp Lys Val Thr lie Ser Cys Lys Ala Ser Gin Asp lie Ala Asp Ala 20 25 30

Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Glu Ala Ala lie Phe lie lie 35 40 45

Gin Ala Ala Thr Thr Leu Val Pro Gly lie Ser Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Asn Asn lie Glu Ser 65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Gin His Asp Asn Phe Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu G.ln Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160 115 201249871

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210〉 60 <211〉 214 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 60

Glu Thr Thr Leu Thr Gin Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala Thr Pro Gly 15 10 15

Asp Lys Val Thr lie Ser Cys Lys Ala Ser Gin Asp lie Asp Asp Asp 20 25 30

Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Glu Ala Ala lie Phe lie lie 35 40 45 116 201249871

Gin Glu Ala Thr Thr Leu Val Pro Gly lie Ser Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn Asn lie Glu Ser 65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Gin His Ala Asn Phe Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala loo 105 no

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 117 201249871

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210〉 61 <211> 214 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 61

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Asp Asp Asp 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Glu Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asp Ser Thr Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 118 201249871

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210〉 62 <211> 214 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400> 62 119 201249871

Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 ·

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160 120 201249871

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 63 <211> 214 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列' <400〉 63

Glu Thr Thr Leu Thr Gin Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala Thr Pro Gly 15 10 15

Asp Lys Val Asn He Ser Cys Lys Ala Ser Gin Asp He Asp Asp Asp 20 25 30

Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Glu Ala Ala lie Phe lie He 35 40 45

Gin Glu Ala Thr Thr Leu Val Pro Gly lie Pro Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60 121 201249871

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn Asn lie Glu Ser 65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Gin His Asp Asn Phe Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 122 201249871 <210〉 64 <211> 214 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400〉 64

Glu Thr Thr Leu Thr Gin Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala Thr Pro Gly 15 10 15

Asp Lys Val Asn lie Ser Cys Lys Ala Ser Gin Asp lie Glu Asp Asp 20 25 30

Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Glu Ala Ala lie Phe lie lie 35 40 45

Gin Glu Ala Thr Thr Leu Val Pro Gly lie Ser Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn Asn lie Glu Ser 65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Gin His Asp Asn Phe Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 123 201249871

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210〉 65 <211> 328 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400> 65

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15 124 201249871

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80

Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 125 201249871

Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255

Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 325 126 201249871 <210> 66 <211> 462 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 66

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala He Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Gly lie lie Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Leu Gly Asp lie Val Val Val Pro Ala Ala Pro Asp Met 100 105 110 127 201249871

Pro Lys Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr 115 120 125

Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 130 135 140

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 145 150 155 160

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 165 170 175

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin 180 185 190

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 195 200 205

Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 210 215 220

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 225 230 235 240

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 245 250 255

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg 260 265 270 128 201249871

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 275 280 285

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 290 295 300

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 305 310 315 320

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 325 330 335

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr 340 345 350

He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu 355 360 365

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys 370 375 380

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser 385 390 395 400

Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 405 410 415

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 420 425 430 129 201249871

Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 435 440 445

Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 455 460 <210> 67 <211> 215 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400> 67

Glu lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Asn Asp Asn 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Gin Tyr Trp Pro Pro 85 90 95 130 201249871 lie Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Asp lie Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser 115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140

Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160

Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 68 <211〉 446 <212〉 PRT <213>人工序列 131 <220〉 201249871 <223>人工合成的序列 <400〉 68

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Thr Val Lys lie Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Tyr Met His Trp Val Gin Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr lie Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Thr Ala Gly Ser Ser Ser Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 132 201249871

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin 165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg 245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 133 201249871

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr 325 330 335 lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu 340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380

Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415

Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 <210〉 69 <211〉 216 <212> PRT <213>人工序列 134 201249871 <220〉 <223>人工合成的序列 <400> 69

Gin Ser Ala Leu Thr Gin Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gin 15 10 15

Ser Val Thr lie Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gin Gin His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45

Met lie Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr lie Ser Gly Leu 65 70 75 80

Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Ser 85 90 95

Tyr Thr Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin 100 105 110

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125

Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu He Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 135 201249871

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys Ser His 180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gin Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210〉 70 <211> 452 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400〉 70

Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala He Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 136 201249871

Ser Ala Ala Trp Asn Trp lie Arg Gin Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60

Val Ser Val Lys Ser Arg lie Thr lie Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80

Gin Phe Ser Leu Gin Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Leu lie Ala Ala Ala Gly Gly Asp Phe Asp 100 105 110

Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 137 201249871

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn 195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 225 230 235 240

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 245 250 255

Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn 290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp 305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 325 330 335

Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 340 345 350 138 201249871

Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 355 360 365

Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie 370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 385 390 395 400

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 405 410 415

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 420 425 430

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 435 440 445

Ser Leu Ser Pro 450 <210〉 71 <211> 217 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400> 71

Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gin 15 10 15 139 201249871

Arg Val Thr He Ser Cys Thr Gly Ser Arg Ser Asn lie Gly Ala Gly 20 25 30

Phe Asp Val His Trp Tyr Arg Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45

Leu lie Tyr Gly lie Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Asp Thr Ser Val Ser Leu Ala lie Thr Gly Leu 65 70 75 80

Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95

Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 105 110

Gin Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125

Glu Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu He Ser Asp Phe 130 135 140

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val 145 150 155 160

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn Lys 165 170 175 140 201249871

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys Ser 180 185 190

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gin Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 195 200 205

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 72 <211> 214 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400〉 72

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser He Ala Asp Asp 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Glu Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 141 201249871

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asp Ser Thr Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 142 201249871 <210〉 73 <211> 214 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400〉 73

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Asp Ala Asp 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Glu Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asp Ser Thr Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125 143 201249871

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 74 <211> 214 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 74

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15 144 201249871

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Asp Asp Ala 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Glu Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asp Ser Thr Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 145 201249871

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210〉 75 <211> 214 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400〉 75

Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Asp Asp 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45

Tyr Glu Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 146 201249871

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asp Ser Thr Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210〉 76 <211> 383 147 201249871 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 76

Lys Lys Val Val Leu Gly Lys Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys 15 10 15

Thr Ala Ser Gin Lys Lys Ser lie Gin Phe His Trp Lys Asn Ser Asn 20 25 30

Gin lie Lys He Leu Gly Asn Gin Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro 35 40 45

Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gin 50 55 60

Gly Asn Phe Pro Leu lie lie Lys Asn Leu Lys lie Glu Asp Ser Asp 65 70 75 80

Thr Tyr lie Cys Glu Val Glu Asp Gin Lys Glu Glu Val Gin Leu Leu 85 90 95

Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn Ser Asp Thr His Leu Leu Gin Gly Gin 100 105 110

Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val 115 120 125 148 201249871

Gin Cys Arg Ser Pro Arg Gly Lys Asn lie Gin Gly Gly Lys Thr Leu 130 135 140

Ser Val Ser Gin Leu Glu Leu Gin Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr 145 150 155 160

Val Leu Gin Asn Gin Lys Lys Val Glu Phe Lys lie Asp lie Val Val 165 170 175

Leu Ala Phe Gin Lys Ala Ser Ser lie Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu 180 185 190

Gin Val Glu Phe Ser Phe Pro Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr 195 200 205

Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp Gin Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys 210 215 220

Ser Trp lie Thr Phe Asp Leu Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg 225 230 235 240

Val Thr Gin Asp Pro Lys Leu Gin Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu His 245 250 255

Leu Thr Leu Pro Gin Ala Leu Pro Gin Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu 260 265 270

Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys Thr Gly Lys Leu His Gin Glu Val Asn 275 280 285 149 201249871

Leu Val Val Met Arg Ala Thr Gin Leu Gin Lys Asn Leu Thr Cys Glu 290 295 300

Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu 305 310 315 320

Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser Lys Arg Glu Lys Ala Val Trp Val Leu 325 330 335

Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp Gin Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gin 340 345 350

Val Leu Leu Glu Ser Asn lie Lys Val Leu Pro Thr Trp Glu Gin Lys 355 360 365

Leu lie Ser Glu Glu Asp Leu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 370 375 380 <210〉 77 <211> 450 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 77

Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 150 201249871

Val lie His Trp Val Arg Gin Lys Pro Gly Gin Gly Leu Asp Trp lie 35 40 45

Gly Tyr lie Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175

Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 151 201249871

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn 195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255

Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr 290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 335 lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin 340 345 350 152 201249871

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val 355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val 370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445

Ser Pro 450 <210〉 78 <211> 219 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400> 78 153 201249871

Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15

Glu Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30

Thr Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 145 150 155 160 154 201249871

Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210〉 79 <211> 448 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400> 79

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Asp Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Thr lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Val 50 55 60 155 201249871

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg His Glu Asp Gly Asn Trp Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175

Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 · 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 156 201249871

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie 245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu 325 330 335

Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu 355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp 370 375 380 157 201249871

Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 <210〉 80 <211> 214 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 80

Glu Thr Thr Val Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ala lie Gly 15 10 15

Glu Lys Val Thr lie Arg Cys lie Thr Ser Thr Asp lie Asp Asp Asp 20 25 30

Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys Phe Phe lie 35 40 45 158 201249871

Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser 50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr He Glu Asn Met Leu Ser 65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gin Ser Asp Thr Leu Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 159 201249871

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210〉 81 <211> 448 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400> 81

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Asp Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Thr lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg His Glu Asp Gly Asn Trp Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110 160 201249871

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175

Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie 245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 161 201249871

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu 325 330 335

Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu 355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp 370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 162 201249871

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 <210〉 82 <211〉 214 <212〉PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 82

Glu Thr Thr Val Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ala He Gly 15 10 15

Glu Lys Val Thr lie Arg Cys lie Thr Ser Thr Asp lie Asp Asp Asp 20 25 30

Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys Phe Phe lie 35 40 45

Ser Asn Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser 50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr lie Glu Asn Met Leu Ser 65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gin Ser Asp Thr Leu Pro Leu 85 90 95 163 201249871

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 83 <211> 464 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成的序列 164 201249871 <400〉 83

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser lie Thr Ser Asp 20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Tyr lie Ser Tyr Ser Gly lie Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser 65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe 115 120 125

Pro Leu Ser Leu Cys Ser Thr Gin Pro Asp Gly Asn Val Val lie Ala 130 135 140

Cys Leu Val Gin Gly Phe Phe Pro Gin Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp 145 150 155 160 165 201249871

Ser Glu Ser Gly Gin Gly Val Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gin 165 170 175

Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr Thr Thr Ser Ser Gin Leu Thr Leu Pro 180 185 190

Ala Thr Gin Cys Leu Ala Gly Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His 195 200 205

Tyr Thr Asn Pro Ser Gin Asp Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Ser 210 215 220

Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser 225 230 235 240

Cys Cys His Pro Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu 245 250 255

Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg 260 265 270

Asp Ala Ser Gly Val Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser 275 280 285

Ala Val Gin Gly Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val 290 295 300

Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr 305 310 315 320 166 201249871

Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr Pro Glu Ser Lys Thr Pro Leu Thr Ala 325 330 335

Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu 340 345 350

Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr 355 360 365

Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu 370 375 380

Gin Gly Ser Gin Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser 385 390 395 400

Arg Gin Glu Pro Ser Gin Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser lie 405 410 415

Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys 420 425 430

Met Val Gly His Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gin Lys Thr lie 435 440 445

Asp Arg Leu Ala Gly Lys Glu Gin Lys Leu lie Ser Glu Glu Asp Leu 450 455 460 <210> 84 <211〉 450 167 201249871 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400> 84

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Gly lie He Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Val Ala Pro Gly Asn Trp Gly Ser Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 168 201249871

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175

Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn 195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255

Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 169 201249871

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr 290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 335 lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin 340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val 355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val 370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 170 201249871

Ser Pro 450 <210〉 85 <211> 214 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400> 85

Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Glu Asp Asp 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Glu Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Asp Ser Ser Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 171 201249871

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210〉 86 <211〉 451 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400> 86 172 201249871

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Gly lie lie Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Pro Arg Trp Glu Thr Ala lie Ser Ser Asp Ala Phe Asp lie 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 173 201249871

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175

Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val 195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255

Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser 290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu 305 310 315 320 174 201249871

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335

Pro lie Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro 340 345 350

Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin 355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala 370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser 435 440 445

Leu Ser Pro 450 <210〉 87 <211> 214 <212〉 PRT <213>人工序列 175 201249871 <220> <223>人工合成的序列 <400> 87

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Asp Asp 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45

Tyr Glu Ala Ser Asn Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin His Ser Ser Ser Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 176 201249871

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210〉 88 <211> 448 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400> 88

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 201249871

Ala lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Gly lie lie Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Asn Gly Asp Tyr Leu Glu Tyr Phe Gin His Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175

Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 178 201249871

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie 245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu 325 330 335

Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 340 345 350 179 201249871

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu 355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp 370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 <210〉 89 <211〉 214 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400> 89

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser He Ser Asp Asp 20 25 30 180 201249871

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Glu Ala Ser Asn Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Asp Ser Ser Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 181 201249871

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 90 <211> 452 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 90

Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr lie Leu Gly Gly Ser lie Ser Gly His 20 25 30

Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gin Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Tyr lie Asp Tyr Ser Gly Ser Thr His Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 65 70 75 80 182 201249871

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg Asp Asn Trp Asp Phe Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Asn Trp Phe Asp 100 105 110

Pro Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn 195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 225 230 235 240 183 201249871

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 245 250 255

Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn 290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp 305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 325 330 335

Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 340 345 350

Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 355 360 365

Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie 370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 385 390 395 4⑻ 184 201249871

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 405 410 415

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 420 425 430

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 435 440 445

Ser Leu Ser Pro 450 <210> 91 <211> 214 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400> 91

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Glu Asp Asp 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45

Tyr His Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 185 201249871

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asp Asn Ser Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 186 201249871 <210〉 92 <211> 451 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 92

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Gly lie lie Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Pro Arg Trp Glu Thr Ala lie Ser Ser Asp Ala Phe Asp lie 100 105 110 181 201249871

Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175

Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val 195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255

Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 188 201249871

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser 290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu 305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335

Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro 340 345 350

Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin 355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala 370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 189 201249871

Val Met His Glu Ala Leu His Trp His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser 435 440 445

Leu Ser Pro 450 <210〉 93 <211> 545 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400〉 93

Gin Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp Ala Thr Cys His Gin Val Arg Ser 15 10 15

Phe Phe Gin Arg Leu Gin Pro Gly Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro 20 25 30

Val Pro Gly Ser Asp Leu Gin Val Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys 35 40 45

Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys Tyr Gin Leu Thr Ala Arg Leu Asn 50 55 60

Met Glu Gin Leu Leu Gin Ser Ala Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu lie 65 70 75 80 lie Gin Asn Ala Ala Val Phe Gin Glu Ala Phe Glu lie Val Val Arg 85 90 95 190 201249871

His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser 100 105 110 .

Leu Thr Pro Gin Ala Phe Glu Phe Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val 115 120 125

Ser Leu Tyr lie Leu Gly Ser Asp lie Asn Val Asp Asp Met Val Asn 130 135 140

Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro Val lie Tyr Thr Gin Leu Met Asn 145 150 155 160

Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu Asp He Asn Glu Cys Leu Arg Gly 165 170 175

Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe Gly Asn Phe Pro Lys Leu lie Met 180 185 190

Thr Gin Val Ser Lys Ser Leu Gin Val Thr Arg lie Phe Leu Gin Ala 195 200 205

Leu Asn Leu Gly lie Glu Val lie Asn Thr Thr Asp H'is Leu Lys Phe 210 215 220

Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr 225 230 235 240

Cys Gin Gly Leu Met Met Val Lys Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val 245 250 255 191 201249871

Val Met Gin Gly Cys Met Ala Gly Val Val Glu lie Asp Lys Tyr Trp 260 265 270

Arg Glu Tyr lie Leu Ser Leu Glu Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg 275 280 285 lie Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu Leu Gly Leu Phe Ser Thr lie His 290 295 300

Asp Ser lie Gin Tyr Val Gin Lys Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr 305 310 315 320

He Gly Lys Leu Cys Ala His Ser Gin Gin Arg Gin Tyr Arg Ser Ala 325 330 335

Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe lie Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala 340 345 350

His Val Glu His Glu Glu Thr Leu Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu lie 355 360 365

Gin Lys Leu Lys Ser Phe lie Ser Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr 370 375 380 lie Cys Ser His Ser Pro Val Ala Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn 385 390 395 400

Gly Gin Glu Leu Val Glu Arg Tyr Ser Gin Lys Ala Ala Arg Asn Gly 405 410 415 192 201249871

Met Lys Asn Gin Phe Asn Leu His Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu 420 425 430

Pro Val Val Ser Gin lie lie Asp Lys Leu Lys His lie Asn Gin Leu 435 440 445

Leu Arg Thr Met Ser Met Pro Lys Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu 450 455 460

Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ala Gly Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu 465 470 475 480

Cys lie Gly Gly Ala Gly Asp Gly Met lie Lys Val Lys Asn Gin Leu 485 490 495

Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro 500 505 510

Gly Asn Ser Gin Gin Ala Thr Pro Lys Asp Asn Glu lie Ser Thr Phe 515 520 525

His Asn Leu Gly Asn Val His Ser Pro Leu Lys His His His His His 530 535 540

His 545 <210> 94 <211〉 443 193 201249871 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 94

Glu Val Gin Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Val lie Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Ala Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 194 201249871

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly 165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190

Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 195 201249871

Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300

Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr lie Ser Lys 325 330 335

Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin 370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin 405 410 415

Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430

His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 196 201249871 <210〉 95 <211〉 214 <212〉PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400> 95

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Glu Asp Asp 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Glu Ala Ser Asn Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin His Asp Ser Tyr Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125 197 201249871

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 96 <211> 459 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400〉 96

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15 198 201249871

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Val He Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Pro Ala Gly Arg His Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr 100 105 110

Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr 115 120 125

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 130 135 140

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 145 150 155 160

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 165 170 175 199 201249871

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly 180 185 190

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 195 200 205

Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 210 215 220

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 225 230 235 240

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 245 250 255

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu 260 265 270

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 275 280 285

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 290 295 300

Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 305 310 315 320

Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 325 330 335 200 201249871

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys 340 345 350

Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 355 360 365

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 370 375 380

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin 385 390 395 400

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 405 410 415

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin 420 425 430

Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 435 440 445

His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 455 <210〉 97 <211> 214 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 201 201249871 <400> 97

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Asp Asp 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Glu Ala Ser Asn Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ser Leu Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160 202 201249871

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210〉 98 <211> 451 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400> 98

Gin Val Gin Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 203 201249871

Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Asp Arg Thr Pro Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Leu Asp Tyr 100 105 110 ,

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175

Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val 195 200 205 204 201249871

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255

Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser 290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu 305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335

Pro He Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro 340 345 350

Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin 355 360 365 205 201249871

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala 370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser 435 440 445

Leu Ser Pro 450 <210〉 99 <211> 214 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 99

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Glu Asp Asp 20 25 30 206 201249871

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Glu Ala Ser Asn Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Asp Ser Ser Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 207 201249871

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 100 <211> 451 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400〉 100

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Gly lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Trp lie Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Leu 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 208 201249871

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Ser Pro Leu Leu Trp Phe Gly Glu Pro Phe Phe Asp Tyr 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175

Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val 195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 225 230 235 240 209 201249871

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255

Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser 290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu 305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335

Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro 340 345 350

Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin 355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala 370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 210 201249871

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser 435 440 445

Leu Ser Pro 450 <210〉 101 <211> 214 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 101

Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Glu Asp Asp 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr His Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 211 201249871

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asp Ser Tyr Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 212 201249871 <210〉 102 <211〉 443 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400> 102

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Glu Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gin Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 213 201249871

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly 165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190

Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 214 201249871

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300

Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr lie Ser Lys 325 330 335

Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin 370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin 405 410 415

Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 215 201249871

His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 <210> 103 <211> 219 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400> 103

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 15 10 15

Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Ser 20 25 30

Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gin Asn 85 90 95

Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 216 201249871

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 104 <211> 567 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400> 104 217 201249871

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser lie Thr Ser Asp 20 25 30

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser 65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Gin Ser Pro Ser Val Phe 115 120 125

Pro Leu Thr Arg Cys Cys Lys Asn lie Pro Ser Asn Ala Thr Ser Val 130 135 140

Thr Leu Gly Cys Leu Ala Thr Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Met Val 145 150 155 160 218 201249871

Thr Trp Asp Thr Gly Ser Leu Asn Gly Thr Thr Met Thr Leu Pro Ala 165 170 175

Thr Thr Leu Thr Leu Ser Gly His Tyr Ala Thr lie Ser 乙eu Leu Thr 180 185 190

Val Ser Gly Ala Trp Ala Lys Gin Met Phe Thr Cys Arg Val Ala His 195 200 205

Thr Pro Ser Ser Thr Asp Trp Val Asp Asn Lys Thr Phe Ser Val Cys 210 215 220

Ser Arg Asp Phe Thr Pro Pro Thr Val Lys lie Leu Gin Ser Ser Cys 225 230 235 240

Asp Gly Gly Gly His Phe Pro Pro Thr lie Gin Leu Leu Cys Leu Val 245 250 255

Ser Gly Tyr Thr Pro Gly Thr lie Asn lie Thr Trp Leu Glu Asp Gly 260 265 270

Gin Val Met Asp Val Asp Leu Ser Thr Ala Ser Thr Thr Gin Glu Gly 275 280 285

Glu Leu Ala Ser Thr Gin Ser Glu Leu Thr Leu Ser Gin Lys His Trp 290 295 300

Leu Ser Asp Arg Thr Tyr Thr Cys Gin Val Thr Tyr Gin Gly His Thr 305 310 315 320 219 201249871

Phe Glu Asp Ser Thr Lys Lys Cys Ala Asp Ser Asn Pro Arg Gly Val 325 330 335

Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe lie Arg Lys 340 345 350

Ser Pro Thr lie Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Ala Pro Ser Lys Gly 355 360 365

Thr Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His 370 375 380

Ser Thr Arg Lys Glu Glu Lys Gin Arg Asn Gly Thr Leu Thr Val Thr 385 390 395 400

Ser Thr Leu Pro Val Gly Thr Arg Asp Trp lie Glu Gly Glu Thr Tyr 405 410 415

Gin Cys Arg Val Thr His Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser 420 425 430

Thr Thr Lys Thr Ser Gly Pro Arg Ala Ala Pro Glu Val Tyr Ala Phe 435 440 445

Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu Ala Cys 450 455 460

Leu lie Gin Asn Phe Met Pro Glu Asp lie Ser Val Gin Trp Leu His 465 470 475 480 220 201249871

Asn Glu Val Gin Leu Pro Asp Ala Arg His Ser Thr Thr Gin Pro Arg 485 490 495

Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe Ser Arg Leu Glu Val Thr 500 505 510

Arg Ala Glu Trp Glu Gin Lys Asp Glu Phe lie Cys Arg Ala Val His 515 520 525

Glu Ala Ala Ser Pro Ser Gin Thr Val Gin Arg Ala Val Ser Val Asn 530 535 540

Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Leu Asn Asp lie Phe Glu Ala 545 550 555 560

Gin Lys lie Glu Trp His Glu 565 <210〉 105 <211> 438 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400〉 105

Gin Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly Thr 15 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Ser Ser Ala Tyr 20 25 30 221 201249871

Asp Met Cys Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45

Ala Cys lie Tyr Thr Gly Asp Gly Val Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu 65 70 75 80

Gin Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95

Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110

Val Ser Ser Gly Gin Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125

Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140

Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr 145 150 155 160

Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gin Ser Ser Gly 165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gin Pro 180 185 190 222 201249871

Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys 195 200 205

Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Met Cys Pro Pro Pro Glu 210 215 220

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 225 230 235 240

Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 245 . 250 255

Val Ser Gin Asp Asp Pro Glu Val Gin Phe Thr Trp Tyr lie Asn Asn 260 265 270

Glu Gin Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gin Gin Phe Asn 275 280 285

Ser Thr lie Arg Val Val Ser Thr Leu Pro lie Ala His Gin Asp Trp 290 295 300

Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro 305 310 315 320

Ala Pro He Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Arg Gly Gin Pro Leu Glu 325 330 335

Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg 340 345 350 223 201249871

Ser Val Ser Leu Thr Cys Met lie Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie 355 360 365

Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr 370 375 380

Thr Pro Thr Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys 385 390 395 400

Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gin Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys 405 410 415

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser lie 420 425 430

Ser Arg Ser Pro Gly Lys 435 <210> 106 <211〉 215 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 106

Ala lie Val Met Thr Gin Thr Pro Ser Ser Lys Ser Val Pro Val Gly 15 10 15 224 201249871

Asp Thr Val Thr He Asn Cys Gin Ala Ser Glu Ser Val Tyr Ser Asn 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Arg Leu 35 40 45 lie Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Thr Leu Thr lie Asn Asp Val Gin 65 70 75 80

Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr Lys Ser Asp Asn 85 90 95

Thr Asp Gly He Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly 100 105 110

Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu lie Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gin 115 120 125

Val Ala Thr Gly Thr Val Thr lie Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe 130 135 140

Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gin Thr Thr 145 150 155 160

Gly lie Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gin Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr 165 170 175 225 201249871

Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gin Tyr Asn Ser His 180 185 190

Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gin Gly Thr Thr Ser Val Val Gin 195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys 210 215 <210> 107 <211> 448 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 107

Gin Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 15 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp 20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp He Gly 35 40 45

Asp lie Asp Thr Thr Thr Gly Thr Thr lie Tyr Ala Thr Trp Ala Lys 50 55 60

Gly Arg Phe Thr lie Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys lie 65 70 75 80 226 201249871

Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Cys 85 90 95

Ala Gly Gly Thr Gly Tyr Cys Glu Asp Gly Leu Asp Pro Trp Gly Pro 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175

Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 227 201249871

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie 245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu 325 330 335

Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu 355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp 370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 228 201249871

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 <210> 108 <211> 217 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400> 108

Ala Phe Asp Met Thr Gin Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly 15 10 15

Gly Thr Val Thr lie Asn Cys Gin Ala Ser Gin Ser lie Gly Ser Tyr 20 25 30

Leu Thr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 229 201249871

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Asp Leu Glu Cys 65 70 75 80

Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Asp Tyr Ser Gly Ser Asn 85 90 95

Val Asp Asn lie Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Arg Thr 100 105 110

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu 115 120 125

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140

Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly 145 150 155 160

Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 230 201249871 <210> 109 <211〉 448 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 109

Gin Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp 20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie Gly 35 40 45

Asp lie Asp Thr Ala Ser Gly Thr Thr lie Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 50 55 60

Gly Arg Phe Thr lie Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys lie 65 70 75 80

Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Cys 85 90 95

Ala Gly Ser Ser Gly Tyr Cys Glu Asn Gly Leu Asp Pro Trp Gly Pro 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 231 201249871

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175

Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys 195 2⑻ 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie 245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 232 201249871

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 3⑻

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu 325 330 335

Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu 355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp 370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 233 201249871 <210> 110 <211〉 217 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 110

Ala lie Glu Met Thr Gin Thr Pro Phe Ser Val Ser Ala Thr Val Gly 15 10 15

Gly Thr Val Thr lie Asn Cys Gin Ala Ser Gin Asn lie Asn Asp Tyr 20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Asp Leu Glu Cys 65 70 75 80

Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Asp Tyr Ser Gly Ser Asp 85 90 95

Val Asp Asn lie Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Arg Thr 100 105 110 234 201249871

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu 115 120 125

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140

Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly 145 150 155 160

Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 111 <211〉 449 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成的序列 <400> 111

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15 235 201249871

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser lie Thr Ser Gly 20 25 30

Tyr Ser Trp Asn Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45

Val Ala Ser lie Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg lie Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His Trp His Phe Ala Val Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 236 201249871

Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His 195 2⑻ 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie 325 330 335 237 201249871

Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val 340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser 355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu 370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445

Pro <210〉 112 <211> 218 <212> PRT <213>人工序列 238 <220〉 201249871 <223>人工合成的序列 <400〉 112

Asp lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45

Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 65 70 75 80

Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser His 85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg 100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 239 201249871

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 145 150 155 160

Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210〉 113 <211〉 19 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成的序列 <400〉 113

Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15

Val His Ser 240

Claims

201249871 七、申請專利範圍： 1 ·—種抗原結合分子，其包含抗原結合域與人類FcRn 、° σ域’在2種不同鈣濃度條件下的抗原結合活性不同，抗原結合分子在低鈣濃度條件下的抗原結合活性比起在高又條件下的抗原結合活性為低，且於中性pH條件下對於人類FCRn具結合活性。曲2·如申請專利範圍第1項之抗原結合分子，其中低鈣濃度為離子化鈣濃度0. 1// Μ〜30y Μ。 3. 如申請專利範圍第1項之抗原結合分子，其中高鈣濃度為離子化鈣濃度100/ζΜ〜l〇mM。 4. 如申請專利範圍第1或2項之抗原結合分子，其中低鹤濃度為核内體内之離子化鈣濃度。 5. 如申請專利範圍第1或3項之抗原結合分子，其中馬詞濃度為血漿中之離子化飼濃度。 6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之抗原結合分子’其中該FcRn結合域為Fc區域。 7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項之抗原結合分子’其中’於酸性pH條件下的抗原結合活性比起於中性 PH條件下的抗原結合活性低。 8 ·如申請專利範圍第7項之抗原結合分子，其中至少 1個胺基酸經組胺酸取代、或至少有1個組胺酸插入。 9.如申請專利範圍第1至8項中任一項之抗原結合分子’其係結合於膜抗原或可溶型抗原。 1 〇·如申請專利範圍第1至9項中任一項之抗原結合分 201249871 子’其中’該抗原係選自於由iL_6R、IL_6、IgA、人類 Glypican3、及IgE構成的群組。、 …種抗原結合分子，其包含抗原結合域與人類、、·。力2種不同的飼濃度條件下的抗原結合、、舌性不合分子在刪度條件下的抗原結合活性比起在4辰度條件下的抗原結合活性為低，i 合域的輕鍵或重鍵含有來自於人類抗…結二 (motif)。 12. 如申請專利範圍第u項之抗原結合分子，其中辦 .，。〇板體包3於抗原結合域之輕鏈⑽U⑽2及/或CDR3。 13. 如申叫專利範圍第1 2項之抗原結合分子其中鈣結合模體包含於麵絲Γ Γ1P 1 _s. 鍵CDR1之以Kabat編號法表示之30 位、31位及/或32位。 14. 如申請專利範圍第12或13項之抗原結合分子其中舞結合模體包含於辦絲P仙〇 I鏈LDR2之以Kabat編號法表示之 50位。 15. 如申明專利範圍第12至μ項中任一項之抗原結合分子，其中鈣結合模體包含於輕鏈CDR3之以Kabat編號法表示之92位。 16. 如申請專利範圍第12至15項中任一項之抗原結合分子，其中抗原結合分子為IgA、或人類以”—任一者。 17·如申请專利範圍第11項之抗原結合分子，其中，鈣結合模體包含於抗原結合域之重鏈C])R1、CDR2及/或 2 201249871 CDR3。 18. 如申請專利範圍第16項之抗原結合分子其中，鈣結合模體包含於重鏈CDR3之以Kabat編號法表示之Μ 位、96位、l〇〇a位、及/或ι〇1位。 19. 如申請專利範圍第17或18項之抗原結合分子，其中抗原結合分子為IL-6R、或IL-6任一者。 20. 如申請專利範圍第丨丨至19項中任一項之抗原結合分子，其包含於pH中性域之條件下對於FcRn具結合活性之FcRn結合域。 21. 如申請專利範圍第2〇項之抗原結合分子，其中該 FcRn結合域為Fc區域。 22. 如申請專利範圍第1至1〇、2〇或21項中任一項之抗原結合分子，其中，該Fc區域之胺基酸序列當中，以 EU 編號法表示之 248、250、252、254、255、256、257、 258 、 265 、 286 、 289 、 297 、 303 、 305 、 307 、 308 、 3〇9 、 3n、312、314、315、317、332、334、360、376 ' 380、 382 、 384 、 385 、 386 、 387 、 389 、 424 、 428 、 433 、 434 、及436中任一者以上之胺基酸為與天然型Fc區域之胺基酸不同的F c區域。 23. 如申請專利範圍第22項之抗原結合分子，其中， §玄Fc區域之以EU編號法表示之胺基酸為； 237位之胺基酸為Met、 248位之胺基酸為I le、 250 位之 fe 基酸為 Ala、Phe、lie、Met、Gin、Ser、 201249871 Val 、 Trp 、或 Tyr 、 252位之胺基酸為Phe、Trp、或Tyr、 254位之胺基酸為Thr、 255位之胺基酸為giu、 256位之胺基酸為Asp、Glu、或Gin、 Met ' Asn 、 257 位之胺基酸為 Aia、Gly、lie、Leu、 Ser、Thr、或 Val、 258位之胺基酸為His、 265位之胺基酸為Ala、 286位之胺基酸為Ala或Glu、 289位之胺基酸為His、 297位之胺基酸為Aia、 303位之胺基酸為Aia、 305位之胺基酸為Aia、 His 、 lie 、 Val 、 Trp 、 Met 、 Pro ' 或 Arg、位之胺基酸為 Ala、Asp' Phe、Gly、 Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、或 Tyr、 308 位之胺基酸為 Aia、phe、lie、Leu、 Gin、或 Thr、 309 位之 fe 基酸為 Aia、Asp、Glu、Pro、 311位之胺基酸為Aia、His、或lie、 312位之胺基酸為Aia或His、 314位之胺基酸為]^5或Arg、 315位之胺基酸為Aia、Asp或His、 4 201249871 317位之胺基酸為Ala、 332位之胺基酸為vai、 334位之胺基酸為Leu、 3 6 0位之胺基酸為η丨s、 376位之胺基酸為Ala、 380位之胺基酸為Ala、 382位之胺基酸為Aia、 384位之胺基酸為Aia、 385位之胺基酸為Asp或His、 386位之胺基酸為pr〇、 387位之胺基酸為Glu、 389位之胺基酸為Ala或Ser、 424位之胺基酸為Ala、 428 位之胺基酸為 Aia、Asp、Phe、Gly、His、lie、 Lys、Leu、Asn、Pro、Gin、Ser、Thr、Val、Trp、或 Tyr、 433位之胺基酸為Lys、 434 位之胺基酸為 Ala、Phe、His、Ser、Trp、或 Tyr、或 436 位之胺基酸為 jjis、、Leu、Val，中任一者以上之組合。 24. 如申請專利範圍第1至23項中任一項之抗原結合为子’其中’該抗原結合分子為抗體。 25. —種抗原結合分子之製造方法，包含以下步驟 (a)~(e): 201249871 (a) 獲得在低鈣濃度條件下之抗原結合分子的抗原結合活性； (b) 獲得於高鈣濃度條件下之抗原結合分子的抗原結合活性； (c) 選擇在低鈣濃度條件下之抗原結合活性比起於高妈濃度條件下之抗原結合活性低的抗原結合分子； (d) 獲得編碼為該步驟（C)所選擇之抗原結合分子的基因； A (e) 使用該步驟（d)獲得之基因製造抗原結合分子；該抗原結合分子具有選自於以下至少1種機能： (i )促進抗原攝入細胞内之機能； (i i)對於抗原結合2次以上之機能； (111)促進血漿中之抗原濃度減少之機能；及 (1 v)優異的血漿中滯留性機能。 26. 種抗原結合分子之製造方法，包含以下步驟 (a)〜（e): (a) 於高鈣濃度條件下使抗原結合分子或抗原結合分子庫接觸抗原； (b) 將該步驟（a)中結合於抗原之抗原結合分子置在低詞濃度條件下； (C)取得於該步驟（b)解離之抗原結合分子； (d) 獲得編碼為該步驟（c)取得之抗原結合分子的基因； (e) 使用該步驟（d)獲得之基因製造抗原結合分子； 6 201249871 該抗原結合分子具有選自於以下至少1種機能： (i )促進抗原攝入細胞内之機能； (i i )對於抗原結合2次以上之機能； (i i i)促進血漿中之抗原濃度減少之機能；及 (i v)優異的血漿中滯留性機能。 27· —種抗原結合分子之製造方法，包含以下步驟 (a)〜⑴： (a) 在低鈣濃度條件下使抗原結合分子或抗原結合分子庫接觸抗原； (b) 選擇於該步驟（a)未結合於抗原之抗原結合分子； (c) 使該步驟（b)選擇之抗原結合分子於高鈣濃度條件下接觸抗原； (d) 取得於該步驟（c)結合於抗原之抗原結合分子； (e) 獲得編碼為該步驟（d)取得之抗原結合分子之基因； (f) 使用該步驟（e)獲得之基因產生抗原結合分子；該抗原結合分子具有選自於以下至少1種機能： (1)促進抗原攝入細胞内之機能； (i i )對於抗原結合2次以上之機能； (i i i)促進血漿中之抗原濃度減少之機能；及 (1 v)優異的血漿中滯留性機能。 28.如申請專利範圍第25至27項中任一項之抗原結合分子之製造方法，更包含以下步驟：改變抗原結合分子中之胺基酸’賦予或提高於中性pH條件下對於人類FcRn之結 201249871 合活性。 29. 如申請專利範圍第25至27項中任一項之抗原結合分子之製造方法，更包含以下步驟：改變抗原結合分子中之胺基酸，使於酸性pH條件下之抗原結合活性低於中性pH 條件下之抗原結合活性。 30. 如申請專利範圍第25至27項中任一項之抗原結合分子之製造方法，其中，低鈣濃度為離子化鈣濃度 0. 1# Μ〜30# Μ 〇 31. 如申請專利範圍第25至27項中任一項之抗原結合分子之製造方法，其中，高鈣濃度為離子化鈣濃度 1 00 // Μ〜1 OmM。 32·如申請專利範圍第25至27項中任一項之抗原結合分子之製造方法，其中，低鈣濃度為核内體内的離子化鈣濃度。 33.如申請專利範圍第25至27項中任一項之抗原結合分子之製造方法，其中，高鈣濃度為血漿中的離子化鈣濃度。 34·如申請專利範圍第29項之抗原結合分子之製造方法，其中，抗原結合分子中胺基酸的改變為，抗原結合分子中至少1個以上的胺基酸以組胺酸取代或插入至少1個組胺酸之改變。 35.如申請專利範圍第25至34項中任一項之抗原結合分子之製造方法’纟中，該抗原結合分子所結合的抗原係選自於由IL-6R、IL_6、IgA、人類以加㈣、及旧所 8 201249871 構成的群組之抗原。 36. 如申請專利範圍第25至35項中任—項之抗原結合分子之製造方法，其中，該抗原結合分子為抗體。 37. —種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第丨至項中任一項之抗原結合分子或由如申請專利範圍第2 5 至36項中任一項之抗原結合分子之製造方法所製造之抗原結合分子、及藥學上可容許之載體。 38. 如申請專利範圍第37項之醫藥組成物，為用於促進抗原攝入細胞内之醫藥組成物。 39. 如申請專利範圍第37項之醫藥組成物，為用於促進血敷中抗原濃度減少之醫藥組成物。 40 · 一種醫藥組成物，其用於促進抗原攝入細胞内或促進血漿中之抗原濃度減少，包含抗原結合分子，該抗原結合分子含有抗原結合域與人類FcRn結合域且於2種不同的鈣展度條件下的抗原結合活性不同，抗原結合分子在低鈣展度條件下之抗原肖纟活性比起⑨高辦濃度條件下之抗原結合活性為低。 41.如申請專利範圍第4〇項之醫藥組成物，其中，低鈣濃度為離子化鈣濃度〇. M。、42·如申請專利範圍第4〇項之醫藥組成物，其中，高鈣濃度為離子化鈣濃度1〇〇以M~1〇mM。 43·如申請專利範圍第4〇或41項之醫藥組成物，其中，低鈣濃度為核内體内的離子化鈣濃度。 44.如申請專利範圍帛40《42 g之醫藥組成物，其 201249871 中，高鈣濃度為血漿中的離子化鈣濃度。 45. 如申明專利範圍第4〇至44項中任一項之醫藥組成物’其中’包含於該抗原結合分子之FcRn結合域為Fc區域。 46. 如申請專利範圍第40至45項中任一項之醫藥組成物，其中，忒杬原結合分子於酸性pH條件下之抗原結合活性低於中性pH條件下之抗原結合活性。 47. 如申請專利範圍第46項之醫藥組成物，其中，該抗原結合分子之至少1個胺基酸經組胺酸取代、或至少有 1個組胺酸插入。 48. 如申請專利範圍第40至47項中任一項之醫藥組成物，其中，該抗原結合分子所結合之抗原，係選自於由 IL 6R IL 6 I、人類g 1 ypican3、及IgE構成的群組中的抗原。 49·種抗原結合分子之篩選方法，包含以下步驟 (a)~(c): (a) 獲得在低鈣濃度條件下之抗原結合分子之抗原結合活性； (b) 獲得於高鈣濃度條件下之抗原結合分子之抗原結合活性； )k擇在低妈》辰度條件下之抗原結合活性比起於高弓又條件下之抗原結合活性低的抗原結合分子； d k原結合分子具有選自於以下至少1種機能： (i)促進抗原攝入細胞内之機能； 10 201249871 (ϋ)對於抗原結合2次以上之機能； (111)促進血装中之抗原濃度減少之機能；及 (lv)優異的血漿中滯留性機能。〇.種抗原結合分子之取得方法’包含以下步驟 (a)~(c)： (a) 於局妈濃度條件下使抗原結合分子或抗原結合分子庫接觸抗原； (b) 將該步驟（a)中結合於抗原之抗原結合分子置在低鈣濃度條件下； (C)取得於該步驟（b)解離之抗原結合分子；該^原結合分子具有選自於以下至少1種機能： (I) 促進抗原攝入細胞内之機能； (II) 對於抗原結合2次以上之機能； (1 11)促進血漿中之抗原濃度減少之機能；及 (i v )優異的血漿中滯留性機能。 51. 一種抗原結合分子之取得方法，包含以下步驟 (a)〜（d): (a) 在低鈣濃度條件下使抗原結合分子或抗原結合分子庫接觸抗原； (b) 選擇於該步驟（a)未結合於抗原之抗原結合分子； (c) 使該步驟（b)選擇之抗原結合分子於高鈣濃度條件下結合於抗原； (d) 取得於該步驟（c)結合於抗原之抗原結合分子；該抗原結合分子具有選自於以下至少1種機能： 11 201249871 (1)促進抗原攝入細胞内之機能； (i i )對於抗原結合2次以上之機能； (i i i )促進企聚中之抗原濃度減少之機能；及 (iv)優異的血漿中滯留性機能。 52·如申請專利範圍第49至51項中任_項之抗原結合分子之筛選方法，其低約濃度為離子化約濃度〇. 1 # Μ〜30 β Μ。 53·如申請專利範圍第49至51項中任_項之抗原結合分子之t帛選方法，其中’高㉟濃度為離子化約濃度 100 // Μ〜l〇mM。 54. 如申請專利範圍第49至52項中任_項之抗原結合分子之筛選方法’纟中，低鈣濃度為核内體内的離子化鈣濃度。 55. 如申請專利範圍第49至51或53項中任_項之抗原結合分子之筛選方法，其中’高鈣濃度為血毁中的離: 化約濃度。 56·如申請專利_ 49至55項中任一項之抗原結合分子之_選方法，丨中，該抗原結合分子所結合之抗原為選自於由 IL-6R、IL-6、IgA、人類 Glypican3、及 IgE 所構成的群組中的抗原。 5'如申請專利範圍第49至56項中任一項之抗原結合分子之篩選方法，其中’抗原結合分子為抗體。 58. —種促進利用抗原結合分子使抗原攝入細胞内之方法，其係藉由投予如申請專利範圍第i項至24項中任— 12 201249871 項之抗原結合分子或如申請專利範圍第25至36中任一項之抗原結合分子之製造方法所製造之抗原結合分子。 5 9. —種促進血漿中之抗原濃度減少之方法，其係藉由投予如申請專利範圍第1項至24項中任一項之抗原結合分子或如申請專利範圍第25至36中任一項之抗原結合分子之製造方法所製造之抗原結合分子。 60. —種增加1分子抗原結合分子對抗原的結合次數之方法’其係藉由投予如申請專利範圍第1項至24項中任一項之抗原結合分子或如申請專利範圍第25至36中任一項之抗原結合分子之製造方法所製造之抗原結合分子。 61. —種改善抗原結合分子之血漿中滯留性之方法，其係藉由投予如申請專利範圍第丄項至24項中任一項之抗原結合分子或如申請專利範圍第25至36中任一項之抗原結合分子之製造方法所製造之抗原結合分子。 62. —種促進利用抗原結合分子使抗原攝入細胞内之 :法，其係藉由投予如下的抗原結合分子:包含抗原結合域二人類FcRn結合域，且於2種不同的名弓濃度條件下的抗原二合活性不同，抗原結合分子之㈣濃度條件下之抗原結 σ活性低於高鈣濃度條件下之抗原結合活性。種促進血毀中抗原濃度減少之方法，其係藉由投域，下的抗原結合分子:包含抗原結合域與人類FcRn結合抗用且於2種不同㈣濃度條件下的抗原結合活性不同，濃；力子之低鈣'辰度條件下之抗原結合活性低於高鈣度條件下之抗原結合活性。 13 201249871 64. —種增加丨分子抗原結合分子對抗之方法，豆你益山 ’、的結合次數，、糸藉由使用如下的抗原結合分子. 域與人類FcRng合域， .3抗原結b 原結合活性不同η 不同㈣濃度條件下的抗同抗原結合分子之低斜：農译/乞A 結合活性低於“濃度條件下之抗原結合;性'。下之抗原係葬15·:㈣善抗原結合分子之血聚中滯留性之方法，其 F; “用如下的抗原結合分子:包含抗原結合域與人頬 η :。°域’且於2種不同的鈣濃度條件下的抗原結合活 2 &原結合分子之域濃度條件下之抗原結合活性 -於尚鈣濃度條件下之抗原結合活性。 66.如申請專利範圍第62至⑼項中任一項之方法該低弼濃度為離子㈣濃度g.um〜3MM。如申請專利範圍第62至65項中任一項之方法 ’尚鈣濃度為離子化鈣濃度100"M〜l〇mM。 68·如申請專利範圍第62至66項中任一項之方法，低鈣濃度為核内體内的離子化鈣濃度。 69.如申請專利範圍第62至65或67項中任一項之： "中咼鈣濃度為血漿中的離子化鈣濃度。 70·如申請專利範圍第62至69項中任一項之方法、 l 3於該抗原結合分子之FcRn結合域為Fc區域。 ^1.如申請專利範圍第62至70項中任一項之方法、，該抗原結合分子於酸性pH條件下之抗原結合活性低；中性pH條件下之抗原結合活性。 72‘如申請專利範圍第71項之方法，其中，該抗原乂其中中法中中其其 201249871 合分子之至少1個胺基酸經組胺酸取代、或至少有1個組胺酸插入。 73. 如申請專利範圍第62至72項中任一項之方法，其中，該抗原結合分子所結合之抗原係選自於由IL-6R、 I L-6、I gA、人類G1 ypi can3、及I gE所構成的群組。 74. 如申請專利範圍第62至73項中任一項之方法，其中，該抗原結合分子為抗體。 15