KR100308598B1

KR100308598B1 - O-알킬화된라파미신유도체및면역억제제로서의용도

Info

Publication number: KR100308598B1
Application number: KR1019950701346A
Authority: KR
Inventors: 실바인 코텐즈; 리하르트 세트라니
Original assignee: 더블류. 하링, 지. 보이롤; 노바티스 아게
Priority date: 1992-10-09
Filing date: 1993-09-24
Publication date: 2001-11-30
Also published as: NO307053B1; CY2125B1; CZ283333B6; BR1100353A; JPH08502266A; CZ89995A3; HUT71232A; JP3568800B2; RO114451B1; WO1994009010A1; FI951678A; SK285256B6; HU9501016D0; FI109540B; DE122004000033I2; EP0663916A1; NO2017067I2; DE122004000033I1; CA2145383C; JPH11240884A

Abstract

본 발명은 신규한, 하기 일반식(Ⅰ)의 O-알킬화된 라파미신 유도체, 특히 40-0-알킬화된 유도체, 및 그것의 약학적 용도 특히, 면역 억제 물질에 관한 것이다.

Description

O-알킬화된 라파미신 유도체 및 면역 억제제로서의 용도

본 발명은 약학적 용도, 특히 면역 억제제로서의 용도를 갖는 라파미신의 신규한 알킬화된 유도체에 관한 것이다.

라파미신은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)에 의해 생산되는 공지된 마크로라이드계 항생 물질로서, 하기 일반식 A의 구조를 갖는다 :

[참고 문헌; McAlpine, J.B., 등, J. Antibiotics (1991) 44:688; Schreiber, S. L., 등. J. Am. Chem. Soc. (1991) 113: 7433; 미국 특허 제3 929 992호]. 라파미신은 매우 우수한 면역 억제제이며 또한 항종양 활성 및 항진균활성을 갖는다. 그러나, 그 약학적 용도는 그것의 높은 독성 및 매우 낮고 다양한 생체내 이용성으로 인해 제한되고 있다. 또한, 라파미신은 매우 불용성이므로 안정한 갈레누스류 조성물로 제형화하기가 어렵다.

놀랍게도, 현재 라파미신에 비해 개선된 약물학적 프로파일을 가지며 훨씬 높은 안정성 및 생체내이용성을 보여주며 갈레누스 제제의 제조를 매우 용이하게 하는 신규한 라파미신 유도체(신규 화합물)를 발견하게 되었다. 그 신규 화합물은 하기 화학식(Ⅰ)을 갖는 라파미신의 알킬화된 유도체이다 :

상기 식 중, X는 (H, H) 또는 0이며; Y는 (H, 0H) 또는 0이며; R¹및 R²는 각각, H, 알킬, 티오알킬, 아릴알킬, 히드록시알킬, 디히드록시알킬, 히드록시알킬아릴알킬, 디히드록시알킬아릴알킬, 알콕시알킬, 아실옥시알킬, 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 알콕시카르보닐아미노알킬, 아실아미노알킬, 아릴설폰아미도알킬, 알릴, 디히드록시알킬알릴, 디옥솔아닐알릴, 카르브알콕시알킬 및 (R³)₃Si(여기서, 각각의 R³는 H, 메틸, 에틸, 이소프로필, t-부틸 및 페닐 중에서 선택됨) 중에서 선택되며, 여기서 "알크-" 또는 "알킬"은 분지쇄형 또는 직쇄형인 C_1-6알킬이며 바람직하게는 C_1-3이고, 이 때 탄소사슬에는 임의로, 에테르(-O-)연결이 삽입될 수 있고, R⁴는 메틸이거나 또는 R⁴와 R¹은 함께 C_2-6알킬렌을 형성하고, 단, R¹과 R²는 동시에 수소가 아니며, 또한, R¹이 (R³)₃Si 또는 카르브알콕시알킬인 경우, X 및 Y는 동시에 0가 아니다.

바람직한 신규 화합물은 다음과 같다:

1. 40-0-벤질-라파미신

2. 40-0-(4'-히드록시메틸)벤질-라파미신

3. 40-0-[4'-(1,2-디히드록시에틸)]벤질-라파미신

4. 40-0-알릴-라파미신

5. 40-0-[3'-(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-(S)-일)-프로프-2'-엔-1'-일]-라파미신

6. (2'E, 4'S)-40-0-(4',5'-디히드록시펜트-2'-엔-1'-일)-라파미신

7. 40-0-(2-히드록시)에톡시카르보닐메틸-라파미신

8. 40-0-(2-히드록시)에틸-라파미신

9. 40-0-(3-히드록시)프로필-라파미신

10. 40-0-(6-히드록시)헥실-라파미신

11. 40-0-[2-(2-히드록시)에톡시]에틸-라파미신

12. 40-0-[(3S)-2,2-디메틸디옥솔란-3-일]메틸-라파미신

13. 40-0-[(2S)-2,3-디히드록시프로프-1-일]-라파미신

14. 40-0-(2-아세톡시)에틸-라파미신

15, 40-0-(2-니코티노일옥시)에틸-라파미신

16. 40-0-[2-(N-모르폴리노)아세톡시]에틸-라파미신

17, 40-0(2-N-이미다졸일아세톡시)에틸-라파미신

18. 40-0-[2-(N-메틸-N'-피페라지닐)아세톡시]에틸-라파미신

19. 39-0-데스메틸-39,40-0,0-에틸렌-라파미신

20. (26R)-26-디히드로-40-0-(2-히드록시)에틸-라파미신

21. 28-0-메틸-라파미신

22. 40-0-(2-아미노에틸)-라파미신

23. 40-0(2-아세트아미노에틸)-라파미신

24. 40-0-(2-니코틴아미도에틸)-라파미신

25. 40-0-(2-(N-메틸-이미다조-2'-일카르브에톡스아미도)에틸)-라파미신

26. 40-0-(2-에톡시카르보닐아미노에틸)-라파미신

27. 40-0-(2-톨릴설폰아미도에틸)-라파미신

28. 40-0-[2-(4',5'-디카르보에톡시-1',2',3'-트리아졸-1'-일)-에틸]-라파미신.

면역 억제제로서의 신규 화합물들로는 X 및 Y가 모두 0이고, R²가 H이고 R⁴가 메틸이고, R¹이 H가 아닌, 40-O-치환된 라파미신이 바람직하며, R¹이 히드록시알킬, 히드록시알콕시알킬, 아실아미노알킬 및 아미노알킬로부터 선택되는 것이 가장 바람직한 데, 특히 40-0-(2-히드록시)에틸-라파미신, 40-0-(3-히드록시)프로필-라파미신, 40-0-[2-(2-히드록시)에톡시]에틸-라파미신 및 40-0-(2-아세트아미노에틸)-라파미신이 바람직하다.

하기 일반적인 과정에 따라 C40에서 O-치환되거나 또는 C28 및 C40에서 0 ,0-이치환되는 것이 바람직하다. 적당한 반응 조건, 바람직하게는 산성 또는 중성조건, 예를 들면, X가 CCl₃C(NH)O인 경우, 트리플루오로메탄설폰산, 캄포르설폰산, p-톨루엔설폰산 또는 그 각각의 피리디늄 염 또는 치환된 피리디늄 염과 같은 산 존재하에, 또는 X가 CF₃SO₃인 경우 피리딘, 치환된 피리딘, 디이소프로필에틸아민 또는 펜타메틸피페리딘과 같은 염기의 존재하에서, 라파미신(또는 디히드로라파미신 또는 데옥소라파미신)을 이탈기에 부착된 유기 라디칼, 예컨대 RX(여기서, R은 유기 라디칼, 예컨대 알킬, 알릴, 또는 벤질기로서 O-치환체로 바람직하고, X는 이탈기로서, 예컨대 CCl₃C(NH)O 또는 CF₃SO₃)와 반응시킨다. C28에서만의 O-치환은 동일한 방법으로 이루어지나, C40을 미리 보호하여야 한다. 추가의 변형도 가능하다. 예를 들면, 치환체가 알릴인 경우, 알릴기의 분리된, 일치환된 이중 결합은 또 다른 변형을 가능하게 한다.

9-데옥소라파미신 화합물은 라파미신을 디페닐디셀레나이드 및 트리부틸포스핀과 반응시키거나, 기타 적당한 환원 반응에 의해, 황화수소를 사용하여 라파미신을 환원시킴으로써 제조하는 것이 바람직하다.

26-디히드로-라파미신은 라파미신 또는 9-데옥소라파미신을, 보로하이드라이드 환원 반응과 같은 완화한 환원 반응에 의해 C26에서 케토를 히드록시로 환원시킴으로써 제조하는 것이 바람직하다.

그 신규 화합물들은 하기 증상에 특히 유용하다:

a) 예컨대, 심장, 허파 결합된 심장-허파, 간, 신장, 췌장, 피부 또는 각막이식편 수용자를 치료하기 위한, 기관 또는 조직 이식 거부 반응의 치료 및 예방. 이는 또한, 하기한 골수 이식과 같은 이식편-대-숙주 질환의 예방에 사용된다.

b) 자가 면역 질환 및 염증, 특히 관절염(예, 류마티스성 관절염, 만성 진행성 관절염 및 변형성 관절염) 및 류마티스성 질환과 같은 자가 면역 성분을 포함하는 병인을 갖는 염증에 대한 치료 및 예방. 본 발명 화합물들이 사용될 수 있는 구체적인 자가면역 질환은 자가면역성 혈액학적 질환(예, 용혈성 빈혈, 재생불량성 빈혈, 진정적혈구성 빈혈 및 특발성 혈소판 감소증), 전신성 홍반성루푸스, 다연골염, 공피증, 바그너 그래뉼라메이토시스, 피부근염, 만성활성 간염, 중증근무력증, 건선, 스티븐스-존슨 증후군, 특발성 스프루우, 자가면역성 염증성 장질환(예, 궤양성 대장염 및 크론병), 내분비 안질, 그레이브스병, 유육종증, 다 중 경화증, 원발성 담즙성 간경변, 연소성 당뇨병(진성당뇨병 유형 Ⅰ), 포도막염(전포도막염 및 후포도막염), 건성각결막염 및 춘계의 각결막염, 간질성 허파 섬유증, 건선성 관절염, (특발성 신증 증후군 또는 최소변화 신장병증과 같은 신증 증후군을 갖거나 갖지 않는) 사구체신염 및 연소성 피부근염이 있다.

c) 천식의 치료 및 예방.

d) 다중-약물 내성(MDR)의 치료. 상기 신규 화합물은 MDR와 관련한 막수송 분자들인 P-당단백질(Pgp)을 억제한다. MDR은 특히 약물이 Pgp에 의해 세포들 밖으로 펌프되기 때문에 종래의 화학요법에는 응답하지 않을 수 있는 암환자 및 AIDS 환자에게는 문제가 된다. 그러므로, 신규 화합물들은 다중 약물내성을 갖는 암 또는 AIDS와 같은 다중 약물 내성 증상을 치료하고 조절하는 데 있어서 기타 화학요법 약제의 효능을 강화시키기에 유용하다.

e) 종양, 과증식성 피부 질환등과 같은 증식성 질환의 치료.

f) 진균성 감염의 치료.

g) 염증의 치료 및 예방 특히, 스테로이드 작용을 강화하는 데 있어서의 염증의 치료 및 예방.

h) 감염, 특히 밉(Mip) 또는 유사 밉 인자들을 갖는 병원원에 의한 감염의 치료 및 예방.

i) FK-506, 라파미신, 면역 억제성 신규 화합물 및 기타 마크로필린 결합면역 억제제 과잉 복용의 치료.

그러므로, 본 발명은 전술한 신규 화합물을 신규한 중간체로서 또는 약제로서, 환자에게 신규 화합물의 유효량을 투여하여 전술한 질환들을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 그리고 약학적 허용 가능한 희석제 또는 담체와 함께 신규 화합물을 포함하는 약학적 조성물로서 제공한다.

전술한 신규한 화합물의 대부분은 면역 억제성이 큰 데, 특히 C40에서 O-치환된 신규 화합물들이 면역 억제성이 크며 이 신규 화합물은 i) 항을 제외한 a) 및 b)항에서 특히 유용하다. 이에 비해 면역 억제성이 낮은 신규 화합물들, 특히 C28에서 O-치환된 것들은 h) 및 i)항에서 특히 유용하나, a) 또는 b)항에서는 덜 바람직하다.

상기 신규 화합물은, 치료를 요하는 환자에게 약학적 허용 가능한 양을 약학적으로 허용 가능한 형태로 투여함으로써 사용된다. 물론 상기 신규 화합물의 적정 투여량은, 예를 들면 치료하고자 하는 증세(예, 질병 유형 또는 내성의 종류), 원하는 효과 및 투여 유형에 따라 다양할 것이다.

그러나, 일반적으로 경구 투여시에는 0.05 ㎎/㎏/일 내지 5 ㎎/㎏/일 또는 최대 10 ㎎/㎏/일의 용량으로, 예를 들면 하루에 1회 또는 2회 내지 4회로 나누어서 0.1 ㎎/㎏/일 내지 2 ㎎/㎏/일 또는 최대 7.5 ㎎/㎏/일의 용량으로 투여하거나 또는 비경구 투여시에는, 예를 들면 정맥내 투여시에는 정맥내 점적식 또는 주입식으로 0.01 ㎎/㎏/일 내지 2.5 ㎎/㎏/일에서 최대 5 ㎎/㎏/일의 용량, 예를 들면 0.05 ㎎/㎏/일 또는 0.1 ㎎/㎏/일 내지 최대 1.0 ㎎/㎏/일의 용량으로 만족할 만한 결과를 얻을 수 있다. 따라서, 환자에게 적당한 일일 투여량은 500 ㎎ 경구 투여, 예를 들어 5 ㎎ 내지 100 ㎎의 경구 투여 또는 0.5 ㎎ 내지 125 ㎎, 즉 250 ㎎이하의 정맥내 투여, 예를 들면 2.5 ㎎ 내지 50 ㎎의 정맥내 투여이다.

선택적으로 그리고 더욱 바람직하게는 RIA 기법에 의해 결정되는 것과 같은 예정된 골 혈액 농도를 제공하기 위해 환자 특이적 방법으로 투여량을 결정한다. 그러므로 RIA에 의해 측정된 바와 같이 50 ng/㎖ 또는 150 ng/㎖, 최대 500 ng/㎖ 또는 1000 ng/㎖, 즉 시클로스포린 면역 억제 요법에서 통상 사용하는 투여법과 유사한 규칙적인 진행성 골 혈액 농도를 얻기 위해서는 환자에 따라 투여량을 조절할 수 있다.

상기 신규 화합물들을 단일 활성 성분으로서 또는 기타 약물과 함께 투여할 수 있다. 예를 들면, 이식편-대-숙주 질환, 이식 거부 반응 또는 자가 면역성 질환의 예방 및 치료와 같은 면역 억제를 위해서는, 상기 신규 화합물을 시클로스포린, FK-506 또는 그 면역억제 유도체, 코르티코스테로이드, 아자티오프렌, 면역억제 단일클론 항체(예, CD3, CD4, CD25, CD28 또는 CD45에 대한 단일 클론 항체) 및/또는 기타 면역 조절 화합물과 함께 사용할 수 있다. 항염증 용법을 위해서는, 상기 신규 화합물을 코르티코스테로이드와 같은 항염증제와 함께 사용할 수 있다. 항-감염 용법으로 상기 신규 화합물을 항바이러스제 또는 항생제와 같은 기타 항감염제와 배합하여 사용할 수 있다.

신규 화합물은 종래 임의의 경로에 의하여 투여되는 바, 특히 소장 예를 들어 경구적으로는 드링크, 정제 또는 캡슐에 사용되는 용액의 형태로 또는 비경구적으로는 주입식 용액 또는 현탁액의 형태로서 투여된다. 경구 투여를 위한 적당한 단위 투여형은 본 발명의 화합물을 예로 1 ㎎ 내지 50 ㎎, 대개는 1 ㎎ 내지 10 ㎎을 포함한다. 상기 신규 화합물을 포함하는 약학 조성물들은 EPA 0 041 795에 기술된 것과 같이 라파미신을 포함하는 약학적 조성물로 유사하게 제조될 수 있으며 이는 당업자에게는 자명한 것이다.

신규 화합물의 약학적 활성은, 예컨대 하기 시험들에서 입증된다.

1. 혼합된 림프구 반응(MLR)

혼합된 림프구 반응을 동종 이식편과 관련하여 처음으로 발전시킴으로써 유효한 기관 공여체와 수용체간의 조직 수용능(compatibility)을 평가하였다. 이혼 합된 림프구 반응은 시험관내 면역 반응의 최상으로 수립된 모델들 중 하나이다. 예를 들면, T. Meo의 문헌["Immunological Methods", L. Lefkovits 및 B. Peris Eds., Academic Press, N. Y. pp. 227-239(1979)]에 개시된 것과 같이 마우스 모델 MLR을 사용하여 신규 화합물의 면역 억제 효과를 입증하였다. Balb/c 마우스(암컷, 주령 8~10주)로부터 얻은 비장 세포(0.5 × 10⁶)를 CBA 마우스(암컷, 주령 8~10주)로 부터 얻은, 조사(2000 rad)되거나 또는 미토마이신 C 처리된 비장 세포들 (0.5 × 10⁶)과 함께 5 일간 동시에 항온시켰다. 그 조사된 동종 이계의 세포들은 Balb/c 비장 세포들내에서 증식성 응답을 유도하는데, 이는 표지된 전구체를 DNA 내로 혼입함으로써 측정될 수 있다. 자극체 세포들이 조사되기 때문에(또는 미토마이신 C 처리되기 때문에), 그것들은 증식으로 Balb/c 세포에 대해 응답하지 않으나 그것의 항원성은 유지된다. Balb/c 세포들 상에서의 신규 화합물의 항증식 효과를 다양한 희석 농도에서 측정하고, 세포 증식의 50% 억제 농도(IC₅₀)를 계산하였다. 상기 시험 샘플의 억제능을 라파미신과 비교하고 IC₅₀상대값으로 표현하였다(즉, IC₅₀시험 샘플/IC₅₀라파미신).

2. IL-6 매개된 증식

인터루킨-6(IL-6)의존성 마우스 히브리도마 세포주를 사용하여 성장 인자와 관련된 신호 경로를 방해하는 신규 화합물의 성능을 평가하였다. 이 분석은 96-웰미량 역가 평판에서 수행하였다. 5000개 세포/웰을 혈청을 함유하지 않은 배지에서 배양하였으며(M. H. Schreier 및 R. Tees in Immunological Methods, I. Lefkovits 및 B. Pernis, eds., Academic Press 1981, Vo1. Ⅱ, pp. 263-275에 개시됨) 1 ng의 재조합 IL-6/㎖으로 보충하였다. 시험 샘플이 있는 것과 없는 것에서 66 시간 항온처리한 후 세포들을 추가로 6 시간 동안 1μCi(3-H)-티미딘/웰로 펄스하고, 수확하여 액체 섬광에 의해 계수하였다. DNA내로의 (3-H)-티미딘 혼입이 세포수 증가와 서로 관련있으며, 이에 따라 세포 증식을 측정하였다. 희석된 일련의 시험 샘플의 농도를 계산하여 세포증식의 50% 억제 농도(IC₅₀)를 계산하였다. 시험 샘플의 억제성능을 라파미신과 비교하여 IC₅₀상대값으로 표현하였다(즉, 시험 샘플 IC₅₀/라파미신 IC₅₀).

3. 마크로필린 결합 분석

라파미신 및 구조적으로 연관된 면역 억제 물질, FK-506은 모두 생체내에서 마크로필린-12(또한 FK-506 결합 단백질 또는 FKBP-12로 공지됨)에 결합하는 것으로 알려져 있으며, 이들 결합은 이 화합물들의 면역 억제 활성에 관여하는 것으로 생각된다. 신규 화합물 또한 경쟁적 결합 분석에서 입증되는 바와 같이 마크로필린-12에 강하게 결합한다.

이 분석에서는, BSA와 짝을 이루는 FK-506을 사용하여 미량 역가 웰들을 피복한다. 비오틴화한 재조합 인체 마크로필린-12(바이오트-MAP)는 시험 샘플의 존재 여부에 무관하게 고정화된 FK-506에 결합할 수 있다. (비특이적으로 결합한 마크로필린을 제거하기 위해)세척한 후, 스트렙타비딘-알칼리 포스파타아제 접합체와 함께 배양한 후, 세척하고, 이어서 기질로서 p-니트로페닐 인산염을 첨가함으로써 결합된 바이오트-MAP를 평가한다. 405 ㎚에서 OD를 판독한다. 시험 샘플이 바이오트-MAP에 결합하여 FK-506에 결합된 바이오트-MAP의 양을 감소시키므로 OD405도 감소된다. 희석된 일련의 시험 샘플에 의하여 고정된 FK-506에 결합하는 바이오트-MAP의 50% 억제 농도를 결정하였다. 시험 샘플의 억제능을 유리 FK-506 표준물의 IC₅₀과 비교하여 IC₅₀상대값을 표현하였다(즉, IC₅₀-시험 샘플/IC₅₀-유리 FK-506)

4. 편재된 이식편-대-숙주(GvH) 반응

Ford 등의 문헌[TRANSPLANTATION 10 (1970)258]에 기술된 바와 같이, 신규 화합물의 생체내 효능을 적당한 동물 모델에서 입증하였다. 6주된 암컷 Wistar/Furth(WF) 래트에서 취한 비장 세포(1 × 10⁷)를 약 100 g의 암컷(F344 × WF) F₁래트의 왼쪽 뒷발내로 피하 주입하였다(0일). 연속하여 4일간 동물들을 치료하고 슬와부의 림프 결절을 제거하여 7일째에 무게를 달았다. 두 림프 결절들간의 무게 차를 반응을 평가하기 위한 변수로서 간주한다.

5. 래트에서의 신장 동종이식 반응

암컷 피셔(fisher) 344 래트로부터 취한 하나의 신장을 말단-대-말단 문합을 사용하여 편측성(왼편) 신절제된 WF 수용체 래트의 신장 혈관 위에 이식하였다. 또한 외관 문합도 말단-대-말단이다. 이식한 날 치료를 시작하여 14일간 지속하였다. 이식 후 7일째에 반대쪽 신장을 절개하여 수용자를 공여자의 신장 기능에 따르도록놓아두었다. 이식편 수용자의 생존 여부를 기능성 이식편에 대한 매개 연수로 간주하였다.

6. 래트의 실험적으로 유도된 알레르기성 뇌척수염(EAE)

EAE에 대한 신규 화합물의 효능을 측정하였다. 그 방법은 참고 문헌[Levine & Wenk, AMER J PATH 47 (1965) 61; McFarlin 등, J IMMUNOL 113 (1974) 712; Borel, TRANSPLANT. & CLIN IMMUNOL 13 (1981)3]에 기술된 바에 의한다. EAE는 다발성 경화증에 대한 보편적인 허용 모델이다. 수컷 Wistar 래트들의 뒷발에 소의 척수와 완성된 프로인트 보조액의 혼합물을 주입하였다. 질환의 증상(꼬리 및 양 뒷다리의 마비)은 대개 16일내에 발현하였다. 발병 시간 뿐 아니라 병에 걸린 동물의 숫자를 기록하였다.

7. 프로인트(Freund's)보조액 관절염

실험적으로 유발된 관절염에 대한 효능을 문헌[Winter & Nuss, ARTHRITIS & RHEUMATISM 9 (1966)394: Billingham & Davies, HANDB00K 0F EXPERIMENTAL PHARMACOL(Vane & Ferreira Eds, Springer-Verlag, Belin) 50/Ⅱ(1979) 108-144]에 개시된 방법을 통해 입증하였다. OFA 및 Wistar 래트(수컷 또는 암컷, 체중 150 g)의 꼬리하부 또는 뒷발에 동결 건조 및 열 치사시킨 0.6 ㎎의 마이코박테륨 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis)를 함유한 미네랄 오일 0.1 ㎖를 연골내로 주입하였다. 발전하는 관절염 모델에서, 상기 보조액을 주입한 직후부터 치료를 시작하였다(치료일수 1~18 일). 확립된 관절염 모델에서는 14일째에 치료를 시작하였으며, 이 때 2차 염증이 더욱 진전되었다(14일~20일). 실험 말기에 관절들의 종창이 마이크로캘리퍼에 의해 측정되었다. ED₅₀은 대조군의 1/2까지 종창(일차 또는 이차)을 감소시키는 경구 투여량(㎎/㎏)이다.

8. 항종양 및 MDR 활성

신규 화합물의 항종양 활성 및 다중 약물 내성을 완화시킴으로써 항종양제의 성능을 강화시키는 성능을 시험하고자 하는 신규 화합물을 함께 투여하는 경우 및 함께 투여하지않는 경우에 대하여, 시험관내의 다중 약물 내성이 있는 세포 및 약물 민감성이 있는 세포에 또는 다중 약물 내성 및 약물 민감성이 있는 종양 또는 감염체를 갖는 동물에게 콜히친 또는 에토포사이드와 같은 항암제를 투여하는 것에 의해, 그리고 신규 화합물만을 단독으로 투여하는 것에 의해 입증하였다.

상기 시험관내 시험은 Ling 등의 문헌[J. Cell. Physiol. 83, 103-116(1974) 및 Bech-Hansen 등, J. Cell. Physiol. 88, 23-32(1976)]에 개시된 바에 따라 임의의 적당한 내약물성 세포주 및 대조 (어버이의)세포주를 사용하여 수행하였다. 특히 선택된 클론들은 다중 약물 내성이 있는(예, 콜히친 내성이 있는) 주 CHR(서브 클론 C5S3.2) 및 어버이의, 민감성 주 AUX B1(서브 클론 ABl Sll)이다.

생체내 항종양 및 항-MDR 활성은 예컨대 다중 약물 내성 및 약물에 민감한 암세포를 주입한 마우스에서 입증되었다. Slater 등의 문헌[J. Clin. Invest, 70, 1131(1982)]에 의해 기술된 방법에 따라 BALB/c 숙주 마우스의 후속 세대에 EA 세포들을 계속 전달시키므로써 약물질 DR, VC, AM, ET, TE 또는 CC에 내성이 있는 Ehrlich ascites 암종(EA) 서브-라인들을 전개하였다.

시험관내에서 비교 가능한 디자인의 신규 화합물 시험 모델을 사용하거나 또는 약물 내성 및 약물 민감성의 바이러스 균주, 항생물질(예, 페니실린)에 내성 및 민감한 박테리아 균주, 항진균에 내성 및 민감한 진균주 뿐만 아니라 약물 내성이 있는 원생생물 균주, 예컨대 원충 균주로서 예를 들어, 획득된 화학요법의 항말라리아 약물 내성을 보여주는 열대 열원충(Plasmodium falciparum)의 천연산 아주로 감염된 시험 동물을 사용하여 동일한 결과를 얻을 수 있었다.

9. FKBP 결합

신규 화합물 중 어떤 것은 면역 억제성이 없는데, 특히 28-0-메틸-라파미신과 같이 C28에만 O-치환된 것이 그렇다. 이는 FK506 및 라파미신파 비교하는 표준 시험관내 분석으로 알 수 있다. FK506은 예로, IL-2 리포터 유전자 분석에서 볼 수 있는 바와 같이 IL-2 전사의 유능한 억제제로 공지되어 있다. 라파미신은 IL-2 리포터 유전자 분석에서는 활성을 나타내지 않으나 IL-6 의존성 T-세포 증식을 강력히 억제한다. 두 화합물 모두 혼합된 림프구 반응의 매우 유능한 억제제이다. 비면역 억제성은 또한 전술한 생체내 모델 1 내지 7에서 볼 수 있다. 면역 억제성이 없으나 마크로필린에 결합하는 상기 신규 화합물들은 비 면역억제성이 유리한 특정 용도에 사용된다.

마크로필린에 강하게 결합하나 그 자체로는 면역 억제성이 없는 신규 화합물들은 FK506, 라파미신 및 면역억제성 신규 화합물들과 같은 마크로필린-결합 면역 억제 물질의 과잉 복용 치료에 사용할 수 있다,

10. 스테로이드 강화

신규 화합물의 마크로필린 결합 활성은 또한 코르티코스테로이드의 작용을 강화하는데 유용하다. 본 발명의 화합물과 코르티코스테로이드, 예컨대 덱사메타손을 병용하여 치료하면 매우 강화된 스테로이드 활성을 얻는다. 이것은, 예컨대 마우스의 포유류 종양 바이러스-클로람페니콜 아세틸 전이 효소(MMTV-CAT) 리포터 유전자 분석, 예로 Ning 둥의 문헌[J. Biol. Chem. (1993) 268: 6073]에도 개시되어 있다. 이러한 상승 효과는 코르티코스테로이드의 투여량을 감소시킬 수 있으므로 몇몇 경우에 부작용의 위험을 감소시킨다.

11. 밉(Mip) 및 유사 밉 인자 억제

또한, 신규 화합물은 마크로필린과 구조적으로 유사한, 다양한 밉(대식 세포 감염 상승 인자; macrophage infectivity potentiator) 및 유사 밉 인자들에 결합하여 이들을 차단한다. 밉 및 유사 밉 인자들은 클라미디아(예, 클라미디아 트라코마티스(Chlamidia trachomatis)), 네세리아(예, 네세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis)) 및 레지오넬라(예, 레지오넬라 뉴모필리아(Legionella pneumophilia)) 속을 포함하는 다양한 병원균 및 또한 기타 리켓치아목의 편성 기생체에 의해 생산되는 독성 인자이다. 이 인자들은 세포내 감염의 확립에서 중요한 역할을 담당한다. 밉 또는 유사 밉 인자들을 생성하는 병원균의 감염을 줄이는 데 있어서 상기 신규 화합물의 효능은, 예로 Lundemose 등의 문헌[Mol. Microbiol(1993) 7:777]에 기술된 방법을 사용하여 마크로라이드계 항생물질이 존재하는 것과 존재하지 않는 세포 배양액들에서의 병원균의 감염과 비교함으로써 알 수 있게 된다. 본 발명의 비면역 억제성 화합물들은 그것들이 면역 억제성이 없기 때문에 이 항목에서 사용되는 것이 바람직하다. 그러므로 인체 자연 면역 물질이 병원균을 방어한다는 주장을 수용하지 않는다.

또한 신규 화합물은, 예컨대 진단 또는 분류 목적을 위한 비교 분석에서 마크로필린-결합 화합물의 존재 또는 양을 감지하는 분석에서 유용하다. 그러므로 또 다른 실시 태양에서, 본 발명은 시험 용액, 예로 혈액, 혈청 또는 분리되어질 시험 브로쓰(broth) 중 마크로필린 결합 화합물의 존재를 결정하기 위한 검색 도구로서 신규 화합물을 사용한다. 바람직하게는, 신규 화합물을 미량 역가 웰에 고정시킨 후 시험 용액의 존재 및 부재하에, 표지된 마크로필린-12(FKBP-12)에 결합시킨다. 선택적으로, FKBP-12를 미량 역가 웰에 고정시키고 시험 용액의 존재 및 부재하에, 예컨대 플루오로-표지, 효소-표지 또는 방사능-표지된 신규 화합물에 결합시키는 데, 상기 신규 화합물의 예는 표지용 기들을 갖는 C40 및/또는 C28에서 O-치환된 것이다. 그 평판을 세척하고 결합된 표지 화합물의 양을 측정하였다. 상기 시험 용액 중 마크로필린-결합 물질의 양은 결합된 표지 화합물의 양에 대략 반비례한다. 정량 분석에서는 공지된 마크로필린 결합 화합물을 사용하여 표준 결합 곡선이 만들어진다.

하기 실시예들에서는 동정을 용이하게 하기 위해 분광 데이타를 사용하였다. 라파미신과 현저히 다르지 않은 피크들은 제외하였다. 혼합된 림프구 반응(MLR) 및 IL-6 의존성 증식(IL-6 dep. prol.) 분석시, 라파미신에 대한 것과 마크로필린 결합 분석(MBA)에서의 FK-506에 대한 것들의 IC₅₀상대값으로서 생물학적 데이타를 표현하였다. IC₅₀값이 높을 수록 더 낮은 결합 친화성과 연관되었다.

[실시예 1] 40-0-벤질-라파미신

2:1의 시클로헥산-염화메틸렌 2.1 ㎖ 중의 라파미신 183 ㎎ (0.200 mmol) 교반 용액에 75 μL(0.402 mmol)의 벤질-트리클로로아세트이미데이트를 가하고 2.6 μL(29 μmol 15mol%)의 트리플루오로메탄설폰산을 첨가하였다. 이 때 혼합물은 즉시 황색으로 변했다. 3 시간 후 그 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고 10% 수성 중탄산나트륨으로 반응을 중단시켰다. 그 층을 분리하여 수성층을 에틸아세테이트로 2회 추출하였다. 결합된 유기 용액을 10% 수성 중탄산나트륨으로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과한 후, 감압하에서 농축하였다. 그 잔사를 실리카겔 상의 컬럼 크로마토그래피(50:50 헥산-에틸 아세테이트)로 정제하여 흰색 무정형 고체로서 40-0-벤질-라파미신을 얻었다:¹H NMR(CDC1₃) δ0.73(1H, dd), 1.65(3H, s), 1.73(3H, s), 3.12(4H, s 및 m), 3.33(3H, s), 3.49(3H, s), 4.15(1H, bd), 4.65(1H, d), 4.71(1H, d), 7.22-7.38(5H, m); MS(FAB)m/z 1026([M+Na]⁺), 972([M-OCH₃)]⁺, 954([M-(OCH₃+H₂O)]⁺).

MBA(상대값 IC₅₀) 1.8

IL-6 의존성 증식(상대값 IC₅₀) 10

MLR(상대값 IC₅₀) 110

[실시예 2] 40-0-(4'-히드록시메틸)벤질-라파미신

a) 40-0-[4'-(t-부틸디메틸실릴)옥시메틸]벤질-라파미신

염화메틸렌 5㎖ 중의 트리플릭(triflic) 무수물로 이루어진 교반하고, 냉각시킨(-78℃) 용액 345μL(2.0mmol)에 염화메틸렌 5㎖ 중의 4-(t-부틸디메틸실릴)옥시메틸-벤질 알코올 504 ㎎ (2.0mmol) 및 2,6-디-t-부틸-4-메틸-피리딘 820 ㎎(4.0mmol) 용액을 첨가하였다. 얻어진 화합물을 -20℃로 가온하고 이 온도에서 0.5시간 동안 교반하였다. 그후, 그 혼합물을 -78℃로 다시 냉각하고 염화메틸렌 5 ㎖ 중의 라파미신 914 ㎎(1.0mmol) 용액을 첨가하였다. 이 혼합물을 하룻밤 동안 실온으로 가온시킨 후 10% 수성 중탄산나트륨으로 반응을 정지시켰다. 그 층을 분리하고 수성층을 에틸아세테이트로 추출하였다. 결합된 유기 용액을 포화된 염수로 세척하고 황산나트륨으로 건조시킨 후, 감압하에서 여과하고 농축하였다. 그 잔사를 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피(50:50 헥산-에틸아세테이트)에 의해 정제하여 흰색 포옴의 40-0-[4'-(t-부틸디메틸 실릴)옥시메틸]벤질-라파미신을 얻었다: MS(FAB) m/z 1170([M+Na]⁺), 1098([M-(0CH₃+H₂0)]⁺).

b)40-0-(4'-히드록시메틸)벤질-라파미신

아세토니트릴 2㎖ 중의 실시예 2에서 얻은 화합물 98 ㎎ (0.093mmol)로 이루어진 교반하고, 냉각시킨(0℃) 용액에 0.2㎖의 HF-피리딘을 첨가하였다. 얻은 혼합물을 2시간 동안 교반하고 수성 중탄산나트륨으로 반응을 정지시킨 후 에틸 아세테이트로 추출하였다. 그 유기층을 염수로 세척하고 황산나트륨으로 건조시킨 후, 여과하여 농축시켰다. 그 잔사를 실리카겔 상에서의 컬럼 크로마토그래피(20:80 헥산-에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 흰색 포옴의 표제 화합물을 얻었다:¹H NMR(CDCL₃) δ 0.73(1H, dd), 1.65(3H, s), 1.74(3H, s), 3.22(1H, m), 4.67(4H, m), 7.35(4H, m); MS(FAB) m/z 1056([M+Na]⁺), 1002([M-OCH₃]⁺) 984([M-(OCH₃+H₂O)]⁺), 966([M-(OCH₃+2H₂O)]⁺), 934([M-(OCH₃+CH₃OH+2H₂O)]⁺).

MBA(상대값 IC₅₀) 2.7

IL-6 의존성 증식(상대값 IC₅₀) 3.9

MLR(상대값 IC₅₀) 3

[실시예 3] 40-0-[4'-(1,2-디히드록시에틸)]벤질-라파미신

a) 40-0-[4'-(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)]벤질-라파미신

1:1 시클로헥산-염화메틸렌 10㎖ 중에 4-(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)벤질 트리클로로아세트이미데이트 452 ㎎(1.24mmol)을 용해하고, 2,6-디-t-부틸피리딘 0.14㎖(0.64mmol) 및 트리플루오로메탄설폰산 56μL(0.64mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 염화메틸렌 2㎖ 중의 라파미신 587 ㎎ (0.64mmol)의 용액을 첨가하였다. 그 반응물을 실온에서 하룻밤동안 교반하고 수성 중탄산나트륨으로 반응을 정지시켰다. 그 층을 분리하고 수성층을 에틸아세테이트로 2회 추출하였다. 유기 용액을 합하여 포화 염수로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조시킨 후 여과하고 농축하였다. 그 잔사를 실리카겔 상에서의 컬럼 크로마토그래피(50:50 헥산-에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 흰색 결정 고체인 40-0-[4'-(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)]벤질-라파미신을 얻었다:¹H NMR(CDCl₃) δ 0.73(1H, dd), 1.48(3H, s), 1.55(3H, s), 1.65(3H, s), 1.74(3H, s), 3.67(3H, m), 4.28(1H, dd), 4.62(1H, d), 4.69(1H, d), 5.06(1H, dd), 7.33(4H, m); MS(FAB) m/z 1126([M+Na]⁺), 1072([M-OCH₃]⁺), 1054([M-(OCH₃+H₂O)]⁺), 1014([M-OCH₃+CH₃COCH₃)]⁺), 996([M-OCH₃+H₂O+CH₃COCH₃)]⁺), 978([M-(OCH₃+2H₂O+CH₃COCH₃)]⁺).

b) 40-0-[4'-(1,2-디히드록시에틸)]벤질-라파미신

메탄올 4㎖ 중의 40-0-[4'-(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)]벤질-라파미신 90.7 ㎎ (0.08mmol)의 용액에 1N 수성 HCl 1㎖를 첨가하였다. 2시간 후 그 혼합물을 수성 중탄산나트륨으로 반응을 정지시키고 에틸아세테이트로 2회 추출하였다. 그 유기 용액을 염수로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조시킨 후, 농축하였다. 그 잔사를 실리카겔 상의 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 흰색 포옴인 표제 화합물을 얻었다 :¹H NMR(CDCl₃) δ 0.73(1H, dd), 1.65(3H, s), 1.74(3H, s), 3.70(4H, m), 4.63(1H, d), 4.69(1H, d), 4.80(1H, dd), 7.33(4H, m); MS(FAB) m/z 1086([M+Na]⁺), 1032([M-OCH₃]⁺), 1014([M-(OCH₃+H₂O)]⁺), 996([M-(OCH₃+2H₂O)]⁺).

MBA(상대값 IC₅₀) 0.92

IL-6 의존성 증식(상대값 IC₅₀) 10.5

MLR(상대값 IC₅₀) 22

[실시예 4] 40-0-알릴-라파미신

염화메틸렌 10 ㎖ 중의 트리플릭 무수물 0.33㎖(2.01mmol)로 이루어진 교반하고 냉각시킨(-78℃) 용액에 알릴 알콜 0.14㎖(2.06mmol) 및 5㎖ 염화메틸렌 중의 2,6-디-t-부틸-4-메틸-피리딘 0.42g(2.04mmol) 용액을 서서히 첨가하였다. 얻은 녹색빛의 용액을 1.5 시간 동안 교반하고 라파미신 915 ㎎ (1.00mmol) 및 2,6-디-t-부틸-4-메틸-피리딘 0.42g(2.04mmol)을 5㎖의 염화메틸렌에 용해한 용액을 첨가하였다. -78℃에서 0.5 시간 동안 교반한 후 그 혼합물을 실온으로 가온하였다, 1 시간 이상 후에 그 혼합물을 수성 중탄산나트륨으로 반응을 중단시키고 그 층을 분리하였다. 그 수성층을 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 유기 용액을 합하여 수성 중탄산나트륨 및 염수로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조시킨 후, 여과하고 농축하였다. 얻은 녹색 오일을 실리카겔 상의 컬럼크로마토그래피(60:40 헥산-에틸아세테이트)에 의해 정제하여 무색 결정 고체로서 표제 화합물을 얻었다:¹H NMR(CDCl₃) δ 0.72(1H, dd), 1.65(3H, s), 1.74(3H, s), 3.05(1H, m), 4.13(2H, bd), 5.14(2H, m), 5.27(2H, m), 5.92(2H, m); MS(FAB) m/z 976([M+Na]⁺), 922([M-OCH₃]⁺), 904([M-(OCH₃+H₂O)]⁺), 886([M-(OCH₃+2H₂O)]⁺), 872([M-(2CH₃OH+OH)]⁺), 854([M-(OCH₃+CH₃OH+2H₂O)]⁺).

MBA(상대값 IC₅₀) 1

IL-6 의존성 증식(상대값 IC₅₀) 8

MLR(상대값 IC₅₀) 260

[실시예 5] 40-0-[3'-(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4(S)-일)프로프-2'-엔-1'-일]-라파미신

20 ㎖의 염화-메틸렌 중의 E-(4S)-4,5-0,0-이소프로필리덴-펜트-2-엔-1,4,5-트리올 0.64 g(4.00 mmol) 및 2,6-디-t-부틸-4-메틸-피리딘 1.26 g(6.00 mmol)로 이루어진 교반하고, 냉각시킨(-78℃) 용액에 0.82㎖(5.00 mmol)의 트리플릭 무수물을 첨가하였다. 얻은 혼합물을 이 온도에서 2 시간 동안 교반하고 라파미신 1.82 g(2.00 mmol) 및 2,6-디-t-부틸-4-메틸-피리딘 1.26 g(6.00mmol)을 염화메틸렌 5 ㎖에 용해한 용액을 첨가하였다. 그 혼합물을 하룻밤 동안 실온까지 점차 가온한 후 수성 중탄산나트륨으로 반응을 정지시켰다. 그 층을 분리하고 수성층을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 유기 용액을 수성 중탄산나트륨 및 염수로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조시킨 후, 여과하고 농축하였다. 그 잔사를 실리카겔상에서 컬럼 크로마토그래피(40:60 헥산-에틸아세테이트)에 의해 정제하여 흰색 고체인 표제 화합물을 얻었다 :¹H NMR(CDCl₃) δ 0.72(1H, dd), 1.38(3H, s), 1.42(3H, s), 1.65(3H, s), 1.73(3H, s), 3.06(1H, m), 3.58(2H, m), 4.08(1H, dd), 4.15(2H, m), 4.52(1H, bdd), 5.72(1H, m), 5.88(1H, m); MS(FAB) m/z 1076([M+Na]⁺), 1022 ([M-OCH₃]⁺), 1004([M-OCH₃+H₂O)]⁺), 964([M-(OCH₃+CH₃COCH₃)]⁺), 946([M-(OCH₃+H₂O+CH₃COCH₃)]⁺).

MBA(상대값 IC₅₀) 0.64

IL-6 의존성 증식(상대값 IC₅₀) 11

MLR(상대값 IC₅₀) 8

[실시예 6] (2'E, 4'S)-40-0-(4',5'-디히드록시펜트-2'-엔-1'-일)-라파미신

전술한 실시예에서 얻은 화합물에 대해 적용한 실시예 3의 단계 b)에 기술한 조건들을 사용한 후, 실리카 겔 상에서의 컬럼 크로마토그래피(95:5 에틸아세테이트-메탄올)를 통해 정제하여 희색 포옴의 표제 화합물을 얻었다 :¹H NMR(CDCl₃) δ 0.68(1H, dd), 3.04(1H, m), 4.18(5H, m), 5.75(1H, dd), 5.88(1H, m); MS(FAB) m/z 1036([M+Na]⁺), 1013(M⁺), 995([M-H₂O]⁺), 982([M-OCH₃]⁺), 964([M-OCH₃+H₂O)]⁺, 946([M-(OCH₃+2H₂O)]⁺, 832([M-(2CH₃OH+OH)]⁺), 914([M-(OCH₃+CH₃OH+2H₂O)]⁺).

MBA(상대값 IC₅₀) 1.7

IL-6 의존성 증식(상대값 IC₅₀) 12

MLR(상대값 IC₅₀) 3.5

[실시예 7] 40-0-(2-히드록시)에톡시카르보닐메탈-라파미신

a) 40-0-[2-(t-부틸디메틸실릴)옥시]에톡시카르보닐메틸-라파미신

30㎖의 염화메틸렌 중의 라파미신 2.74g(3.00mmol) 및 디로듐 테트라아세테이트 디히드레이트 30 ㎎(0.06mmol)의 교반한 용액에 염화메틸렌 10㎖ 중의 2-(t-부틸디메틸실릴)옥시에틸 디아조아세테이트 0.38㎖(3.60mmol) 용액을 5 시간에 걸쳐 첨가하였다. 첨가를 완료한 후 1 시간 이상 동안 교반하고나서 그 반응을 1N HCl 수용액으로 정지시켰다. 층들을 분리하고 수성층을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 용액을 합하여 중탄산나트륨 수용액 및 염수로 세척하고 무수 황산나트륨으로서 건조시켜 여과한 후, 농축하였다. 그 잔사를 실리카겔 상의 컬럼 크로마토그래피(40:60 헥산-에틸아세테이트)에 의해 정제하여 40-0-[2-(t-부틸디메틸실릴)옥시]에톡시 카르보닐메틸-라파미신을 얻었다 :¹H NMR(CDCDl₃) δ 0.06(6H, s), 0.68(1H, dd), 0.88(9H, s), 1.64(3H, s), 1.73(3H, s), 3.12(5H, s 및 m), 3.81(2H, dd), 4.19(2H, dd), 4.32(2H, s), MS(FAB) m/z 1152([M+Na]⁺), 1080([M-(OCH₃+H₂O)]⁺).

b) 40-0-(2-히드록시)에톡시카르보닐메틸-라파미신

1.5㎖의 아세토니트릴 중의 40-0-[2-(t-부틸디메틸실릴)옥시]에톡시카르보닐 메틸-라파미신 81 ㎎ (0.07mmol)의 교반되고 냉각시킨(0℃) 용액에 0.15㎖의 HF-피리딘을 첨가하였다. 2 시간 후 중탄산나트륨 수용액으로 그 반응을 중단시켰다. 그 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 용액을 염수로 세척하고 무수 황산나트륨으로서 건조시켜 여과한 후 농축하였다. 그 잔사를 PTLC(에틸아세테이트)에 의해 정제하여 흰색 고체인 표제 화합물을 얻었다 :¹H NMR(CDCl₃) δ 0.70(1H, dd), 1.65(3H, s), 1.75(3H, s), 3.13(5H, s 및 m) 3.85(3H, m), 4.25(5H, m); MS(FAB) m/z 1038([M+Na]⁺), 984([M-OCH₃]⁺), 966([M-(OCH₃+H₂O)]⁺), 948([M-OCH₃+2H₂O)]⁺).

MBA(상대값 IC₅₀) 4

IL-6 의존성 증식(상대값 IC₅₀) 9.7

MLR(상대값 IC₅₀) 2.1

[실시예 8] 40-0-(2-히드록시)에틸-라파미신

a) 40-0-[2-(t-부틸디메틸실릴)옥시]에틸-라파미신

톨루엔 30 ㎖ 중의 라파미신 9.14 g(10 mmol) 및 2,6-루티딘 4.70㎖ (40mmol) 용액을 60℃로 가온하고 톨루엔 20㎖ 중의 2-(t-부틸디메틸실릴)옥시에틸 트리플레이트 6.17 g(20 mmol) 및 2,6-루티딘 2.35 ㎖ (20 mmol)의 용액을 첨가하였다. 이 혼합물을 1.5 시간 동안 교반하였다. 그 후, 톨루엔 10 ㎖ 중의 트리플레이트 3.08 g(10 mmol) 및 2,6-루티딘 1.2 ㎖ (10 mmol)의 용액으로 이루어진 두개의 배치들을 1.5 시간 간격으로 첨가하였다. 나 중 배치를 첨가한 후 60℃ 에서 2 시간 동안 교반하여 얻은 갈색 현탁액을 여과했다. 그 여과액을 에틸 아세테이트로 희석하고 중탄산나트륨 수용액 및 염수로 세척하였다. 유기 용액을 무수 황산나트륨으로서 건조시키고 여과한 후 농축하였다. 그 잔사를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피(40:60 헥산-에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 흰색 고체인 40-0-[2-(t-부틸디메틸실릴)옥시] 에틸-라파미신을 얻었다 :¹H NMR(CDCl₃) δ 0.06(6H, s), 0.72(1H, dd), 0.90(9H, s), 1.65(3H, s), 1.75(3H, s), 3.02(1H, m), 3.63(3H, m), 3.72(3H, m) ; MS(FAB) m/z 1094([M+Na]⁺), 1022([M-(OCH₃+H₂O)]⁺).

b) 40-0-(2-히드록시)에틸-라파미신

메탄올 20 ㎖ 중의 40-0-[2-(t-부틸디메틸실릴)옥시]에틸-라파미신 4.5 g (4.2 mmol)으로 이루어진 교반하고, 냉각시킨(0℃) 용액에, 2 ㎖ 의 1 N HCl을 첨가하였다. 이 용액을 2 시간 동안 중탄산나트륨 수용액으로 중화시켰다. 그 혼합물을 에틸 아세테이트 분획으로 3회 추출하였다. 유기 용액을 중탄산나트륨 수용액 및 염수로 세척하고 무수 황산나트륨 상에서 건조시켜 여과한 후, 농축하였다. 실리카겔 상의 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 흰색 고체인 표제 화합물을 얻었다 :¹H NMR(CDCl₃) δ 0.72(1H, dd), 1.65(3H, s), 1.75(3H, s), 3.13(5H, s 및 m), 3.52-3.91(8H, m) ; MS(FAB) m/z 980([M+Na]⁺), 926([M-OCH₃]⁺), 908([M-(OCH₃+ H₂O)]⁺), 890([M-(OCH₃+2H₂O)]⁺), 876([M-(2CH₃OH+OH)]⁺), 858([M-(OCH₃+CH₃OH+2H₂O)]⁺).

MBA (상대값 IC₅₀) 2.2

IL-6 의존성 증식(상대값 IC₅₀) 2.8

MLR (상대값 IC₅₀) 3.4

[실시예 9] 40-0-(3-히드록시)프로필-라파미신

a) 40-0-[3-(t-부틸디메틸실릴)옥시]프로필-라파미신

3-(t-부틸디메틸실릴)옥시프로프-1-일 트리플레이트를 사용하여 실시예 8의 단계 a)에 기술된 과정에 따라 40-0-[3-(t-부틸디메틸실릴)옥시]프로필-라파미신을 얻었다 :¹H NMR(CDCl₃) δ 0.05(6H, s), 0.72(1H, dd), 0.90(9H, s), 1.65(3H, s), 1.74(3H, s), 1.77(2H, m), 3.03(1H, m), 3.52-3.73(7H, m) ; MS(FAB) m/z 1108([M+Na]⁺), 1036([M-(OCH₃+ H₂O)]⁺).

b) 40-0-(3-히드록시)프로필-라파미신

단계 a)에서 얻은 화합물을 실시예 8의 단계 b)에 기술된 조건으로 처리하여 표제 화합물을 얻었다 :¹H NMR(CDCl₃) δ 0.72(1H, dd), 1.65(3H, s), 1.75(3H, s), 1.80(2H, m), 3.05(1H, m), 3.55-3.91(8H, m) ; MS(FAB) m/z 994([M+Na]⁺), 940([M-OCH₃]⁺), 922([M-(OCH₃+ H₂O)]⁺, 904([M-(OCH₃+2H₂O)]⁺), 872([M-(OCH₃+CH₃OH+2H₂O)]⁺).

MBA (상대값 IC₅₀) 1.6

IL-6 의존성 증식(상대값 IC₅₀) 2.7

MLR (상대값 IC₅₀) 11

[실시예 10] 40-0-(6-히드록시)헥실-라파미신

a) 40-0-[6-(t-부틸디메틸실릴)옥시]헥실-라파미신

6-(t-부틸디메틸실릴)옥시헥실-일 트리플레이트를 사용하여 실시예 8, 단계 a)에 기재된 것과 같은 과정에 따라 40-0-[6-(t-부틸디메틸실릴)옥시]헥실-라파미신을 제조했다 : MS(FAB) m/z 1150([M+Na]⁺).

b) 40-0-(6-히드록시)헥실-라파미신

실시예 8의 단계 b)에 기재된 조건으로 단계 a)에서 얻은 화합물을 처리하여 표제 화합물을 얻었다 :¹H NMR(CDCl₃) δ 0.72(1H, dd), 1.38(2H, m), 1,57(4H, m), 1.65(3H, s), 1.74(3H, s), 3.02(1H, m), 3.49-3.72(8H, m) ; MS(FAB) m/z 1036([M+Na]⁺), 982([M-OCH₃)⁺), 964([M-(OCH₃+H₂O)]⁺), 946([M-(OCH₃+2H₂O)]⁺), 914([M-(OCH₃+CH₃OH+2H₂O)]⁺).

MBA (상대값 IC₅₀) 0.8

IL-6 의존성 증식(상대값 IC₅₀) 8.5

MLR (상대값 IC₅₀) 18

[실시예 11] 40-0-[2-(2-히드록시)에톡시]에틸-라파미신

a) 40-0-[2-(t-부틸디메틸실릴)옥시에톡시]에틸-라파미신

2-[2-(t-부틸디메틸실릴)옥시-에톡시]에틸 트리플레이트를 사용하여 실시예 8의 단계 a)에 기재된 과정에 따라 40-0-[2-(t-부틸디메틸실릴)옥시에톡시] 에틸-라파미신을 얻었다 :¹H NMR(CDCl₃) δ 0.06(6H, s), 0.71(1H, dd), 0.88(9H, s), 1.65(3H, s), 1.74(3H, s), 3.07(1H, m), 3.51-3.79(11H, m) ; MS(FAB) m/z 1138([M+Na]⁺), 1115(M⁺), 1097([M-H₂O]⁺), 1084(M-OCH₃]⁺) 1066 ([M-(OCH₃+H₂O)]⁺), 1048([M-(OCH₃+2H₂O)]⁺), 1034([M-(2CH₃OH+OH)]⁺), 1016([M-(OCH₃+CH₃OH+2H₂O)]⁺).

b) 40-0-[2-(2-히드록시)에톡시]에틸-라파미신

단계 a)에서 얻은 화합물을 실시예 8의 단계 b)에 기재된 조건으로 처리하여 표제 화합물을 얻었다 :¹H NMR(CDCl₃) δ 0.72(1H, dd), 1.65(3H, s), 1.74(3H, s), 3.05(1H, m), 3.51-3.77(11H, m) ; MS(FAB) m/z 1024([M+Na]⁺), 1001(M⁺), 983([M-H₂O]⁺), 970([M-OCH₃)⁺), 952([M-(OCH₃+H₂O)]⁺), 934([M-(OCH₃+2H₂O)]⁺), 920([M-(2CH₃OH+OH)]⁺), 902([M-(OCH₃+CH₃OH+2H₂O)]⁺).

MBA (상대값 IC₅₀) 1.2

IL-6 의존성 증식(상대값 IC₅₀) 3.2

MLR (상대값 IC₅₀) 2

[실시예 12] 40-0-[(3S)-2.2-디메틸디옥솔란-3-일]메탈-라파미신

글리세롤 아세토나이드의 트리플레이트를 사용하여 실시예 8의 단계 a)에 기재된 과정에 따라 표제 화합물을 얻었다 :¹H NMR(CDCl₃) δ 0.72(1H, dd), 1.36(3H, s), 1.42(3H, s), 1.65(3H, s), 1.75(3H, s), 3.06(1H, m), 3.55(2H, m) 3.69(3H, m), 4.06(1H, dd), 4.26(1H, m) ; MS(FAB) m/z 1050([M+Na]⁺), 996([M-OCH₃]⁺), 978([M-(OCH₃+H₂O)]⁺), 960([M-(OCH₃+2H₂O)]⁺).

MBA (rel. IC50) 0.9

IL-6 dep. prol. (rel. IC50) 8

MLR (rel. IC50) 290

[실시예 13] 40-0-[(2S)-2,3-디히드록시프로프-1-일]-라파미신

전술한 실시예에서 얻은 화합물을 실시예 3에 기술한 조건에서 처리하여 표제 화합물을 얻었다 :¹H NMR(CDCl₃) δ 0.72(1H, dd), 1.65(3H, s), 1.75(3H, s), 3.07(1H, m), 3.68(8H, m) ; MS(FAB) m/z 1010([M+Na]⁺), 956(M-OCH₃]⁺), 938([M-(OCH₃+H₂O)]⁺), 920([M-(OCH₃+2H₂O)]⁺), 888([M-(OCH₃+ CH₃OH+2H₂O)]⁺).

MBA (상대값 IC₅₀) 0.67

IL-6 의존성 증식(상대값IC₅₀) 9

MLR (상대값 IC₅₀) 10

[실시예 14] 40-0-(2-아세톡시)에틸-라파미신

염화메틸렌 2 ㎖ 중의 40-0-히드록시에틸-라파미신 53 ㎎(0.055 mmol)으로 이루어진 교반한, 냉각한(0℃) 용액에 0.2 ㎖의 피리딘을 첨가한 후 0.02 ㎖(0.281 mmol)의 염화아세틸을 첨가하였다. 그 혼합물을 3 시간 동안 교반하고 에틸 아세테이트로 희석한 후, 중탄산나트륨 수용액 및 차가운 1N HCl의 순으로 세척하고 다시 중탄산나트륨 수용액으로 세척했다. 그 유기 용액을 무수 황산나트륨으로서 건조하고 여과하여 농축하였다. 그 잔사를 실리카겔 칼럼 상의 컬럼 크로마토그래피(30:70 헥산-에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 희색 고체인 표제 화합물을 얻었다 :¹H NMR(CDCl₃) δ 0.72(1H, dd), 1.65(3H, s), 1.75(3H, s), 2.08(3H, s), 3.07(1H, m), 3.78(2H, dd), 4.20(2H, dd) ; MS(FAB) m/z 1022([M+Na]⁺), 999(M⁺), 982([M-OH]⁺), 968(M-OCH₃]⁺), 950([M-(OCH₃+ H₂O)]⁺), 932([M-(OCH₃+2H₂O)]⁺), 918([M-(2CH₃OH+OH)]⁺), 900([M-(OCH₃+CH₃OH+ 2H₂O)]⁺).

MBA (상대값 IC₅₀) 2

IL-6 의존성 증식(상대값 IC₅₀) 7.6

MLR (상대값 IC₅₀) 3.6

[실시예 15] 40-0-(2-니코티노일옥시)에틸-라파미신

니코티노일 염화수소산염을 사용하여 전술한 실시예와 같은 과정에 따라 표제 화합물을 얻었다 :¹H NMR(CDCl₃) δ 0.72(1H, dd), 1.65(3H, s), 1.75(3H, s), 3.07(1H, m), 3.94(2H, dd), 4.49(2H, t), 7.39(1H, dd), 8.31(1H, ddd), 8.79(1H, ddd), 9.24(1H, dd) ; MS(FAB) m/z 1085([M+Na]⁺), 1063(M+H]⁺), 1045([M-OH]⁺), 1031(M-OCH₃]⁺), 1013([M-(OCH₃+H₂O)]⁺).

MBA (상대값 IC₅₀) 1.1

IL-6 의존성 증식(상대값 IC₅₀) 6.9

MLR (상대값 IC₅₀) 5

[실시예 16] 40-0-[2-(N-모르폴리노)아세톡시]에틸-라파미신

a) 40-0-(2-브로모아세톡시)에틸-라파미신

실시예 14에 기술한 과정에 따라 염화브로모아세틸을 사용하여 40-0-(2-브로모아세톡시)에틸-라파미신을 얻었다 :¹H NMR(CDCl₃) 0.72(1H, dd), 1.67(3H, s), 1.76(3H, s), 3.03(1H, m), 3.82(2H, m), 3.87(2H, s), 4.31(2H, m) ; MS(FAB) m/z 1100, 1102([M+Na]⁺), 1077(M⁺), 1061([M-H₂O]⁺), 1046, 1048(M-OCH₃]⁺), 1028, 1030([M-(OCH₃+H₂O)]⁺), 1012([M-(OCH₃+2H₂O)]⁺), 996([M-(2CH₃OH+0H)]⁺), 980([M-(OCH₃+CH₃OH+2H₂O)]⁺).

b) 40-0-[2-(N-모르폴리노)아세톡시]에틸-라파미신

0.5 ㎖ DMF 중의 40-0-(2-브로모아세톡시)에틸-라파미신 54 ㎎ (0.05mmol)로 이루어진, 냉각된(-45℃) 용액에 0.2 ㎖ DMF 중의 0.022 ㎖(0.25mmol)의 모르폴린 용액을 가하여 얻은 혼합물을 그 온도에서 1 시간 동안 교반한 후 중탄산나트륨 수용액으로 처리하였다. 이 혼합물을 에틸 아세테이트로 3 회 추출하였다. 그 유기 용액을 염수로 세척하고 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과한 후 농축하였다. 그 잔사를 실리카켈 상의 컬럼 크로마토그래피 (95:5 에틸아세테이트-메탄올)에 의해 정제하여 백색 결정 고체인 표제 화합물을 얻었다 :¹H NMR(CDCl₃) δ 0.72(1H, dd), 1.67(3H, s), 1.76(3H, s), 2.60(3H, m), 3.07(1H, m), 3.24(2H, s), 3.78(8H, m), 4.27(2H, t) ; MS(FAB) m/z 1107 ([M+Na]⁺), 1085(M+H]⁺), 1067([M-OH]⁺), 1053 ([M-OCH₃)⁺), 1035([M-(OCH₃+H₂O)]⁺).

MBA (상대값 IC₅₀) 1.3

IL-6 의존성 증식(상대값 IC₅₀) 4

MLR (상대값 IC₅₀) 3.5

[실시예 17] 40-0-(2-N-이미다졸일아세톡시)에틸-라파미신

실시예 16의 단계 b)에서 기술된 과정에 따라 이미다졸을 사용하여 표제 화합물을 얻었다 :¹H NMR(CDCl₃) δ 0.72(1H, dd), 1.67(3H, s), 1.78(3H, s), 3.06(1H, m), 3.80(2H, m), 4.32(2H, m), 4.73(2H, s), 6.97(1H, dd), 7.09(1H, dd), 7.52(1H, dd) ; MS(FAB) m/z 1066([M+H]⁺), 1048([M-OH]⁺), 1034([M-OCH₃]⁺), 1016([M-(OCH₃+ H₂O)]⁺).

MBA (상대값 IC₅₀) 1

IL-6 의존성 증식(상대값 IC₅₀) 7.6

MLR (상대값 IC₅₀) 3.4

[실시예 18] 40-0-[2-(N-메틸-N'-피페라지닐)아세톡시]에틸-라파미신

실시예 16 의 단계 b) 에서 기술된 과정에 따라 N-메틸피페라진을 사용하여 표제 화합물을 얻었다 :¹H NMR(CDCl₃) δ 0.72(1H, dd), 1.67(3H, s), 1.77(3H, s), 2.78(4H, s 및 m), 3.02(4H, bs), 3.08(1H, m), 3.32(2H, s), 3.80(2H, dd), 4.27(2H, t) ; MS(FAB) m/z 1098([M+H]⁺), 1066([M-OCH₃]⁺).

MBA (rel. IC₅₀) 2.6

IL-6 dep. prol. (reℓ. IC₅₀) 10.3

MLR (rel. IC₅₀) 5

[실시예 19] 39-0-데스메틸-39,40-0,0-에틸렌-라파미신

0.5 ㎖ 의 염화메틸렌 중의 40-0-히드록시에틸-라파미신 48 ㎎(0.05mmol) 및 2,6-루티딘 0.023 ㎖(0.20 mmol)로 이루어진 교반한, 냉각된(-20℃) 용액에 0.008 ㎖(0.05 mmol)의 트리플릭 무수물을 첨가하였다. 그 혼합물을 이 온도에서 2 시간 동안 교반한 후 실온으로 가온하고 1 시간 이상 교반하였다. 그 반응을 중탄산나트륨 수용액으로 정지시켜 얻은 혼합물을 에틸 아세테이트 분획으로 3 회 추출하였다. 그 유기 용액을 염수로 세척하고 무수 황산나트륨으로서 건조시켜 여과한 후 농축하였다. 그 잔사를 실리카겔 상의 컬럼 크로마토그래피(30:70 헥산-에틸 아세테이트)에 의해 정제하고 백색 고체인 표제 화합물을 얻었다 :¹H NMR(CDCl₃) δ 1.66(3H, s), 1.75(3H, s), 3.14(3H, s), 3.35(3H, s), 3.76(4H, s) ; MS(FAB) m/z 948([M+Na]⁺), 925(M⁺), 908 ([M-OH]⁺), 894 ([M-OCH₃]⁺), 876([M-(OCH₃+H₂O)]⁺), 858([M-(OCH₃+2H₂O)]⁺), 844([M-(2CH₃OH+OH)]⁺), 826([M-(OCH₃+CH₃OH+ 2H₂O)]⁺).

MBA (상대값 IC₅₀) 1.6

IL-6 dep. prol. (상대값 IC₅₀) 22.9

MLR (상대값 IC₅₀) 16

[실시예 20] (26R)-26-디히드로-40-0-[2-(히드록시)]에틸-라파미신

a) (26R)-26-디히드로-40-0-[2-(t-부틸디메틸실릴옥시)]에틸-라파미신

2:1 아세토니트릴-아세트산 4.5 ㎖ 중에 테트라메틸암모늄-트리아세톡시 보로하이드라이드 315 ㎎ (1.2 mmol)을 용해하였다. 얻은 용액을 실온에서 1 시간 동안 교반하고 -35℃ 로 냉각한 후 40-0-[2-(t-부틸디메틸실릴)옥시]에틸 -라파미신 161 ㎎ (0.15 mmol)을 첨가하였다. 얻은 혼합물을 같은 온도에서 하룻밤 교반하고 중탄산나트륨 수용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 그 혼합물을 에틸 아세테이트 분획으로 3 회 추출하였다. 그 유기 용액을 중탄산나트륨 수용액, 30% 수성 로셀 염 및 염수 2 분획으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로서 건조시켜 여과한 후 농축하였다. 그 잔사를 실리카겔 상의 컬럼 크로마토그래피(40:60 헥산-에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 흰색 고체인 표제 화합물을 얻었다:¹H NMR(CDCl₃) δ 0.06(6H, s), 0.73(1H, dd), 0.90(9H, s), 1.64(3H, s), 1.67(3H, s), 3.02(1H, m), 3.15(1H, m), 3.64(3H, m), 3.71(2H, dd), 3.91(1H, s) ; MS(FAB) m/z 1096([M+Na]⁺), 1041([M-HOCH₃]⁺), 1024([M-(OCH₃+H₂O)]⁺, 1006([M-(OCH₃+2H₂O)]⁺), 974([M-(OCH₃+CH₃OH+2H₂O)]⁺).

b) (26R)-26-디히드로-40-0-(2-히드록시)에틸-라파미신

단계 a)에서 얻은 화합물을 실시예 8의 단계 b)에 기술된 조건으로 처리하여 표제 화합물을 얻었다 :¹H NMR(CDCl₃) δ 0.75(1H, dd), 1.66(3H, s), 1.70(3H, s), 3.18(1H, m), 3.52-3.84(7H, m) ; MS(FAB) m/z 982([M+Na]⁺), 928([M-OCH₃)⁺), 910([M-(OCH₃+H₂O)]⁺), 892([M-(OCH₃+2H₂O)]⁺).

MBA (상대값 IC₅₀) 3.9

IL-6 dep. prol. (상대값 IC₅₀) 53

MLR (상대값 IC₅₀) 18

[실시예 21] 28-0-메틸-라파미신

0.5 ㎖의 염화메틸렌 중의 40-0-TBS-라파미신(0℃에서 2,6-루티딘 2 당량 존재 하에 염화메틸렌 중의 TBS 트리플레이트 1 당량과 라파미신을 실릴화하여 제조함) 103 ㎎ (0.1 mmol)로 이루어진 교반한 용액에 트리메틸옥소늄 테트라플루오로보레이트 44 ㎎ (0.30 mmol)을 첨가하였다. 얻은 갈색의 비균질 혼합물을 하룻밤 동안 교반하고 중탄산나트륨 수용액으로 반응을 정지시킨 후, 에틸아세테이트로 추출하였다. 그 유기 용액을 1 N HCl, 중탄산나트륨 수용액 및 염수로 세척하고나서 무수 황산나트륨으로서 건조시키고, 여과한 후 농축하였다. 그 잔사를 실리카겔 상의 컬럼 크로마토그래피(60:40 헥산-에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 40-0-t-부틸 디메틸실릴-28-0-메틸-라파미신을 얻었다. 그 화합물을 실시예 10의 단계 b)에 기술된 조건으로 탈실릴화하여 PTLC(에틸 아세테이트)후 흰색 고체의 표제 화합물을 얻었다 :¹H NMR(CDCl₃) δ 0.70(1H, dd), 1.68(6H, 2s), 2.95(1H, m), 3.13(3H, s), 3.14(3H, s), 3.28(3H, s), 3.41(3H, s); MS(FAB) m/z 950([M+Na]⁺), 927(M⁺), 909([M-H₂O]⁺), 896([M-OCH₃)⁺), 878([M-(OCH₃+H₂O)]⁺), 864([M-(OCH₃+CH₃OH)]⁺), 846([M-(2CH₃OH+OH)]⁺), 832([M-(OCH₃+2CH₃OH)]⁺), 814([M-(3CH₃OH+OH)]⁺).

MBA (상대값 IC₅₀) 1.58

IL-6 의존성 증식 (상대값 IC₅₀) 1240

MLR (상대값 IC₅₀) 1300

[실시예 22] 40-0-(2-아미노에틸)-라파미신

a) 40-0-(2-브로모에틸)-라파미신

0.64 ㎖의 2,6-루티딘 및 1.28 g의 2-브로모에틸 트리플레이트를 함유하는 5 ㎖ 톨루엔 중의 914 ㎎ 라파미신 용액을 65℃ 에서 18 시간 동안 가열하였다. 그 후 그 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고 포화 중탄산염 용액 20 ㎖ 에 부은 후, 에틸 아세테이트 20 ㎖ 분획으로 3 회 추출하였다. 그 유기상들을 탄산나트륨 상에서 건조시키고 감압하의 회전식 증발기에서 용매를 제거하였다. 그 잔사를 100 g 실리카겔 상의 크로마토그래피에 의해 3/2 헥산/에틸 아세테이트로 용출하여 무정형 고체인 40-0-(2-브로모에틸)-라파미신을 얻었다 : MS(FAB) m/z 1044 및 1042(100% : M+Na) : 972 및 970(55%, M-(MeOH+H2O)).

H-NMR (CDCl3) d: 0.72(1H, q, J=12㎐) ; 3.13(3H, s) ; 3.33(3H, s) ; 3.45(3H, s) ; 3.9(4H, m) ; 4.78(1H, s)

b) 40-0-(2-아지도에틸)-라파미신

40 ㎖의 DMF 중의 40-0-(2-브로모에틸)-라파미신 2.4 g의 용액을 실온에서 0.19 g의 아지드화 나트륨으로 처리하였다. 2 시간 후, 그 혼합물을 포화 중탄산나트륨 100 ㎖에 붓고 에틸 아세테이트 100 ㎖ 분획으로 3회 추출했다. 그 유기상들을 결합시키고 황산나트륨으로서 건조시키고 그 용매를 감압하에서 제거했다. 그 미정제 생성물을 헥산/에틸 아세테이트로 용출하는 실리카겔 상의 크로마토그래피에 의해 정제하여 40-0-(2-아지도에틸)-라파미신을 얻었다. ; MS(FAB) : 1005(100%, M+Na) ; 951(24%, M-MeOH) ; 933(57%, M-(MeOH+H2O)

c) 40-0-(2-아미노에틸)-라파미신

실온에서 THF/물(5/1) 3 ㎖ 중의 40-0-(아지도에틸)-라파미신 230 ㎎의 용액에 트리페닐포스핀 307 ㎎을 첨가하였다. 그 반응 혼합물은 황색이 되었다. 7 시간후 반응 혼합물을 xg 의 실리카겔에 적재하고 에틸 아세테이트/ 메탄올/아세트산(50/50/0.5)을 용출물로 하는 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 아세테이트 형태로 얻었다 : MS(FAB) m/z 979(45%, M+Na) ; 957(100%, MH) ; 925(63%, M-MeOH) ; 907(25%, M-(MeOH+H2O)

MBA (상대값 IC₅₀) : 0.7

IL-6 의존성 증식 (상대값 IC₅₀) : 10

[실시예 23] 40-0-(2-아세트아미노에틸)-라파미신

THF 2 ㎖ 중의 40-0-(2-아미노에틸)-라파미신의 아세테이트 101 ㎎ 의 용액에 0.02 ㎖의 피리딘 및 0.07 ㎖의 염화 아세틸을 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 실온에서 18 시간 동안 유지한 후 7 ㎖의 포화 중탄산나트륨에 부었다. 그 수성상을 5 ㎖ 에틸 아세테이트로 3회 추출하고 유기상들을 합한 후, 황산나트륨으로서 건조시켰다. 용매를 증발시키고 그 잔사를 10 g 실리카겔 상에서 에틸 아세테이트로 먼저 용출한 후 에틸 아세테이트/메탄올/아세트산(50/50/0.5)으로 용출하는 크로마토그래피에 의해 표제 화합물을 얻었다 : MS(FAB) m/z 1021(20%, M+Na) ; 967(28%, M-MeOH) ; 949(100%, M-(MeOH+H2O)

H-NMR (CDCl3) d : 0.71(1H, q, J=12㎐) ; 1.98(3H, s) ; 3.13(3H, s) ; 3.34(3H, s) ; 3.44(3H, s) ; 4.75(1H, s)

MBA (상대값 IC₅₀) : 1.1

IL-6 의존성 증식 (상대값 IC₅₀) : 2.3

[실시예 24] 40-0-(2-니코틴아미도에틸)-라파미신

5 ㎖의 에틸 아세테이트 중에 40-(2-아미노에틸)-라파미신 아세테이트 101 ㎎을 용해하고 포화 중탄산나트륨으로 2회 추출하였다. 그 유기상을 황산나트륨으로서 건조하고 용매를 증발시켰다. 그 잔사를 2 ㎖ THF 중에 용해하고 22 ㎎ DCC 및 15 ㎎ 니코틴산으로 처리하였다. 15 시간 후, 실온에서 그 반응 혼합물을 증발시키고 그 잔사를 에틸 아세테이트로 먼저 용출한 후 에틸 아세테이트/메탄올 9:1 로 용출하는 실리카겔상에서 크로마토그래피하여 표제 생성물을 얻었다 : MS(FAB) m/z 1084(80%, M+Na) ; 1062(40%, MH) ; 1038 (100%, M-MeOH) ; 1012(50%, M-(MeOH+H2O)

H-NMR (CDCl3) d ; 0.72(1H, q, J=12㎐) ; 3.13(3H, s) ; 3.33(3H, s) ; 3.37 (3H, s) ; 7.39(1H, dd ; J=6㎐, J=8㎐), 8.19(1H, d, J=8㎐) ; 8.75(1H, d, J=6㎐), 9.04(1H, 넓은 s)

MBA (상대값 IC₅₀): 1.2

IL-6 의존성 증식 (상대값 IC₅₀) : 2.8

[실시예 25] 40-0-(2-(N-메틸-이미다조-2'-일카르브에톡스아미도)에틸)-라파미신

1 ㎖의 DMF 중의 N-메틸-이미다졸-2-카르복실산 30 ㎎ 용액에 DCC 58 ㎎ 및 H0BT 58 ㎎을 첨가하였다. 2 시간 후, 150 ㎎의 40-0-(2-아미노에틸)-라파미신을 첨가하고 그 반응 혼합물을 실온에서 18 시간 동안 교반하였다. 그 후 그 현탁액을 여과하고 여과액을 5 ㎖의 에틸 아세테이트로 희석하고 포화 중탄산나트륨 수용액 2×2 ㎖으로 세척했다. 그 유기상을 황산나트륨 상에서 건조하고 감압하에 용매를 제거했다. 그 잔사를 10 g의 실리카겔 상에서 헥산/에틸아세테이트 1/4로 용출하는 크로마토그래피에 의해 표제 생성물을 얻었다 : MS(FAB) m/z 1087(36%, M+Na) ; 1065(57%, MH) ; 1033(100%, M-MeOH) ; 1015(46%, M-(MeOH+H2O))

H-NMR (CDCl3) d : 0.72(1H, q, J=12Hz) ; 3.13(3H, s) ; 3.33(3H, s) ; 3.46(3H, s) ; 4.03(3H, s), 6.93(1H, 넓은 s) ; 6.98(1H, 넓은 s), 7.78(1H, m)

MBA (상대값 IC₅₀) : 1.1

IL-6 의존성 증식 (상대값 IC₅₀) : 7

[실시예 26] 40-0-(2-에톡시카르보닐아미노에틸)-라파미신

3 ㎖의 THF/물(5/1) 중의 40-0-(2-아지도에틸)-라파미신 200 ㎎ 의 용액을 실온에서 7 시간 동안 트리페닐 포스핀 267 ㎎으로 처리하였다. 이어서, 0.4 ㎖의 피리딘을 첨가한 후 194 μL의 에틸 클로로포르미에이트를 첨가하였다. 2 시간 후, 그 반응 혼합물을 5 ㎖의 에틸 아세테이트 상에 붓고 포화 중탄산나트륨 10 ㎖, 물 5 ㎖ 및 10% 시트르산 5 ㎖의 순으로 세척하였다. 그 유기상을 황산나트륨 상에서 건조시킨 후 용매를 증발시켰다. 그 잔사를 20 g 실리카겔 상에서 에틸 아세테이트로 용출한 후 에틸 아세테이트/메탄올(9/1)로 용출하는 크로마토그래피에 의해 표제 생성물을 얻었다 : MS(FAB) m/z 1051(35%, M+Na) ; 997(30%, M-MeOH) ; 979(100%, M-(MeOH+H2O)

H-NMR (CDCl3) d ; 0.71(1H, q, J=12㎐) ; 1.24(3H, t, J=8㎐) ; 3.13(3H, s) ; 3.34(3H, s) ; 3.43(3H, s) ; 4.10(2H, q, J=8㎐) ; 548(1H, m)

MBA (상대값 IC₅₀) : 1.1

IL-6 의존성 증식 (상대값 IC₅₀) : 1.7

[실시예 27] 40-0-(2-톨릴설폰아미도에틸)-라파미신

THF 3 ㎖ 중의 40-0-(2-아미노에틸)-라파미신 200 ㎎ 용액을 0.4 ㎖ 피리딘 및 390 ㎎ 염화토실로 처리하고 그 반응 혼합물을 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 그 후 그 용액을 5 ㎖의 포화 중탄산염 용액에 붓고 수성상을 에틸 아세테이트 2×5 ㎖ 로 추출하였다. 황산나트륨 상에서 건조시킨 후 그 용매를 증발하고, 그 잔사를 20 g 실리카겔 상의 헥산/에틸 아세테이트(1/1)로 용출하는 크로마토그래피에 의해 정제하여 흰색 포옴의 표제 화합물을 얻었다 : MS(FAB) m/z 1133(100%, M+Na) ; 1078(25%, M-MeOH) ; 1061(85%, M-(MeOH+H2O))

H-NMR (CDCl3) d ; 0.68(1H, q, J=12㎐) ; 2.43(3H, s) ; 3.13(3H, s) ; 3.35(3H, s) ; 3.41(3H, s) ; 4.76(1H, s) ; 5.85(1H, t, J=6㎐) ; 7.30(2H, d, J=8㎐) ; 7.75(2H, d, J=8㎐).

MBA (상대값 IC₅₀) : 15.9

IL-6 의존성 증식 (상대값 IC₅₀) : 14

[실시예 28] 40-0-[2-(4',5'-디카르브에톡시-1',2',3'-트리아졸-1'-일)-에틸]-라파미신

톨루엔 0.5 ㎖ 중에 40-0-(2-아지도에틸)-라파미신 98 ㎎ 및 디에틸아세틸렌 디카르복실레이트 32 ㎎ 을 현탁시키고 5 시간 동안 65℃에서 가열하였다. 그 후 그 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고 10 g 실리카겔 상에 적재하여 헥산/에틸 아세테이트 1/1 로 용출함으로써 표제 화합물을 얻었다 : MS(FAB) m/z 1175(20%, M+Na) ; 1121(15%, M-MeOH) ; 1103(60%, M-(MeOH+H2O))

H-NMR (CDCl3) d ; 0.62(1H, q, J=12㎐) ; 1.40(3H, t, J=8㎐); 1.42(3H, t, J=8㎐) ; 3.13(3H, s) ; 3.25(3H, s) ; 3.33(3H,s)

MBA (상대값 IC₅₀) : 2.7

IL-6 의존성 증식 (상대값 IC₅₀) : 12

또한, 라파미신 대신 출발 물질로서 9-데옥소-라파미신, 26-디히드로 라파미신 또는 9-데옥소-26-디히드로-라파미신을 사용하여 전술한 실시예들을 수행하였다. 선택적으로, 그리고 바람직하게, 예컨대 실시예 20에서 전술한 바와 같이 상기 실시예들의 라파미신 화합물을 필요에 따라 적당한 보호기들을 사용하여 수소화 또는 환원시킬 수 있다. C9에서 케토를 환원시키거나 C26에서 케토를 수소화시키는 신규한 방법들은 이하에 제공된다.

[실시예 29] C9에서의 케토 제거

실온에서, 50 ㎖ 피리딘 및 2.5 ㎖ DMF 중의 라파미신 3.2 g(3.5 mmol)으로 이루어진 교반한 용액에 황화수소 스트림을 통과시켰다. 그 용액은 무색에서 황색으로 변했다. 2 시간후 황화수소의 주입을 중지하고 5 일간 교반하였다. 교반하는도 중 그 용액은 점차 오렌지 색으로 변했다. TLC 및 HPLC 분석을 통해 출발 물질의 완전한 소모 및 단일한 신규 화합물의 존재를 입증하였다. 그 용액을 질소로 1 시간 동안 퍼즈하고 감압하에서 농축하였다. 그 잔사를 에틸 아세테이트 중에 취하고, 차가운 1 N HCl 용액(3 회), 포화 중탄산나트륨 용액 및 포화 염수로 세척하였다. 그 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과한 후, 감압하에 농축하였다. 그 잔사를 에테르 중에 취하고 침전된 황을 여과 제거하였다. 그 에테르성 용액을 농축하고 실리카겔 상의 컬럼 크로마토그래피(10:4:1 CH₂Cl₂/i-Pr₂0/Me0H)에 의해 무색 포옴인 9-데옥소라파미신을 얻었다. 그 생성물을 핵자기 공명 분광분석법(NMR), 질량분석법(MS) 및/또는 적외선 분광법(IR)에 의해 감정하였다. 9-데옥소라파미신은 하기 특징적인 물리적 데이타를 보이는 것으로 밝혀졌다 :¹H NMR(CDCl₃) δ 1.61(3H, d, J=1㎐, C17-CH₃), 1.76(3H, d, J=1.2㎐, C29-CH₃), 2.42(1H, d, J=14.5㎐, H-9), 2.74(1H, d, J=14.5㎐, H-9), 3.13(3H, s, C16-OCH₃), 3.5(3H, s , C27-OCH₃), 3.40(3H, s , C39-OCH₃), 5.40(1H, d, J=10㎐, H-30), 5.57(1H, dd, J₁=8.6㎐, J₂=15㎐, H-22), 5.96(1H, d, J=9㎐, H-18), 6.09(1H, d, J=1.7㎐, 10-OH), 6.15(1H, dd, J₁=10㎐, J₂=15㎐, H-21), 6.37(1H, dd, J₁=1.5㎐, J₂=5㎐, H-19), 6.38(1H, J=9.5㎐, H-20).

¹³C NMR(CDCl₃) δ 38.5(C-9), 98.0(C-10), 170.7(C-1), 173.0(C-8), 208.8(C-32), 216.9(C-26).

MS(FAB) m/z 922 8([M+Na]⁺), 899(M⁺), 881([M-H₂O]⁺), 868([M-OCH₃]⁺), 850([M-(H₂O+OCH₃)]⁺).

IR (주 피크)(㎝^-1) 987, 1086, 1193, 1453, 1616, 1717, 1739, 3443.

MBA (상대값 IC₅₀) 1

MLR (상대값 IC₅₀) 14

IL-6 의존성 증식 (상대값 IC₅₀) 9

[실시예 30] C26 에서 케토의 이수소화 반응

아세토니트릴 2 ㎖ 중의 테트라메틸암모늄 트리아세톡시보로하이드라이드 421 ㎎(1.6 mmol)의 교반한 용액에 아세트산 2 ㎖을 첨가하였다. 얻은 혼합물을 실온에서 30 분간 교반하고 -35℃로 냉각하였다. 이 온도에서 아세토니트릴 1 ㎖ 중의 9-데옥소-라파미신 180 ㎎(0.2 mmol) 용액을 첨가하고 얻은 혼합물을 24 시간 동안 교반시켰다. 그 혼합물을 포화 나트륨 칼륨 타르트레이트 용액으로 반응을 정지시키고 실온으로 가온했다. 모든 층들이 투명해질 때까지 교반한 후 에틸 아세테이트를 첨가하였다. 층들을 분리하고 수성층을 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 얻은 유기 용액을 10% 중탄산나트륨 용액으로 1회 세척하고 포화 염수로 2회 세척한 뒤 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과한 후 감압 하에서 농축하였다. 그 잔사를 실리카겔 상에서 크로마토그래피에 의해 정제하였다(90:10 AcOEt-헥산). 이 경우 출발 물질이 9-데옥소라파미신이고 최종 화합물은 9-데옥소라파미신이므로, 26-디히드로라파미신이 무색 포옴으로서 제조되었으며, 다음과 같은 특징적인 분광 분석 데이타를 갖는다 :¹H NMR(CDCl₃) (주된 이성질체) δ 9(3H, d , J=6.9㎐, CHCH₃), 0.93(3H, d, J=6.9㎐, CHCH₃), 1.00(3H, d, J=6.9㎐ CHCH₃), 1.07(3H, d, J=6.9㎐, CHCH₃), 1.17(3H, d, J=6.9㎐ , CHCH₃), 1.61(3H, d, J=1㎐, C17-CH₃), 1.73(3H, d, J=1.2㎐, C29-CH₃), 2.43(1H, dd, J=4.1 및 16.0㎐, H-33), 2.46(1H, d, J=13.8 ㎐, H-9) 2.58(1H, m, H-25), 2.77(1H, d, J=13.8㎐, H-9), 2.82(1H, dd, J=8.3 및 16.0㎐, H-33), 3.17(1H, dd, J=4.1 및 9.2㎐, H-27), 3.61(2H, m, H-14 및 H28), 5.19(1H, ddd, J=4.1 4.6 및 8.3㎐, H-34), 5.49(1H, 넓은 d, J=5.0㎐, H-2), 5.56(1H, d, J=9.1㎐, H-30), 5.75(1H, dd, J=6.9 및 14.7㎐, H-22), 5.76(1H, s , 10-0H), 5.99(1H, 넓은 d, J=9.2㎐, H-18), 6.10(1H, m, H-21), 6.36(2H, m, H-19 및 H-20) ;

MS(FAB) m/z 924([M+Na]), 852([M-(H₂O+OCH₃)]⁺).

MBA (상대값 IC₅₀): 47

MLR (상대값 IC₅₀): 134

IL-6 의존성 증식 (상대값 IC₅₀): 78

9-데옥소라파미신 대신 라파미신을 사용하여 같은 방법으로 26-디히드로 라파미신을 제조하였다. 이 생성물은 다음과 같은 특징적인 분광 분석 데이타를 갖는다 :¹³C-NMR(CDCl₃) (주된 이성질체) d = 208.3(C-32) ; 194.0(C-9) ; 169.3(C-1) ; 166.6(C-8) ; 140.9(C-22) ; 136.5(C-29) ; 136.2(C-17) ; 133.5(C-20) ; 129.1(C-21) ; 128.7(C-18) ; 126.2(C-30) ; 125.3(C-19) ; 98.6(C-10) ; 84.4(C-39) ; 83.9(C-16) ; 81.6(C-27) ; 75.4(C-34) ; 74.3(C-28) ; 73.9(C-40) ; 72.9(C-26) ; 67.4(C-14) ; 59.1(27-OCH₃) ; 56.6(39-OCH₃) ; 55.9(16-OCH₃) ; 51.3(C-2) ; 46.8(C-31) ; 44.3(C-6) ; 40.4(C-33) ; 40.4(C-25) ; 39.5(C-24) ; 38.8(C-15) ; 38.0(C-36) ; 34.3(C-23) ; 34.2(C-38) ; 33.5(C-11) ; 33.3(C-37) ; 33.2(C-35) ; 31.5(C-42) ; 31.3(C-41) ; 30.9(C-13) ; 27.1(C-12) ; 27.0(C-3) ; 25.2(C-5) ; 21.4(23-CH₃) ; 20.7(C-4) ; 17.3(11-CH₃) ; 16.1(31-CH₃) ; 15.9(35-CH₃) ; 14.4(25-CH₃) ; 14.2(29-CH₃) ; 10.3(17-CH₃).

MS(FAB) m/z 884(M-OCH₃, 35%) ; 866(M-[OCH₃+H₂O], 100% ; 848(M-[OCH₃+2H₂O], 40%).

MBA (상대값 IC₅₀) 1.7

MLR (상대값 IC₅₀) 1

IL-6 의존성 증식 (상대값 IC₅₀) 7.5

Claims

하기 화학식(Ⅰ)의 40-0-(2-히드록시)에틸-라파미신:
약학적으로 허용 가능한 희석제 또는 담체와 함께 40-0-(2-히드록시)에틸-라파미신을 포함하는 면역 억제 성질을 갖는 약학 조성물.
제2항에 있어서, 자가 면역성 질환을 치료하기 위한 약학 조성물.
제2항에 있어서, 동족 이식 거부 반응 또는 이식편 대 숙주 질환을 치료하거나 예방하기 위한 약학 조성물.
제4항에 있어서, 시클로스포린 또는 FK506과 배합하여 사용하기 위한 약학 조성물.
a) 2-(t-부틸디메틸실릴)옥시-에틸-OSO₂CF₃과 라파미신을 반응시키는 단계 및

b) 단계 a)에서 생성된 화합물에서 t-부틸디메틸실릴기을 제거하는 단계를 포함하는 40-0-(2-히드록시에틸)-라파미신을 제조하는 방법.