FI109540B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen 40-0-(2-hydroksietyyli) -rapamysiinin valmistamiseksi - Google Patents

Description

109540 MENETELMÄ TERAPEUTTISESTI KÄYTTÖKELPOISEN 40-0-(2-hydroksietyyli) -rapamysiinin valmistamiseksi

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää uuden 5 alkyloidun rapamysiinijohdannaisen, joka on farmaseuttisesti hyödyllinen erityisesti immunosuppressoivana aineena, valmistamiseksi.

Rapamysiini on tunnettu makrolidiantibiootti, jota tuottaa Streptomyces hygroscopicus ja jolla on 10 kaavan A mukainen rakenne: 41 37 15 *· 3 S# y^° ° ,Ο^ΟΗ 25 25 f f 18 20 22 y 24 13 15 19 21 • · · · » * · ,·, : 30 Ks. esim. julkaisut, McAlpine, J.B. et ai., J. Anti- • · · \ biotics (1991) 44: 688; Schreiber, S.L., et ai., J. Am.

;* Chem. Soc. (1991) 113: 7433; patenttijulkaisu US 3 929 992. Rapamysiini on erittäin tehokas immunosuppressoiva aine ja sen on myös osoitettu omaavan antituumori- ja . \ 3 5 antifungaalista aktiivisuutta. Sen käyttökelpoisuutta * · · ”* ; farmaseuttisena aineena kuitenkin rajoittaa sen erit- ’· täin alhainen ja vaihteleva hyötyosuus sekä sen korkea 2 109540 toksisuus. Edelleen, rapamysiini on erittäin liukenematon, joten siitä on vaikea formuloida stabiileja ga-leenisia koostumuksia.

Nyt on yllättäen keksitty, että tietyllä uu-5 della rapamysiinijohdannaisella (uusi yhdiste) on parantunut farmakologinen profiili rapamysiiniin verrattuna, suurempi stabiilisuus ja hyötyosuus sekä siitä on helpompi valmistaa galeenisia valmisteita. Uusi yhdiste on rapamysiinin alkyloitu johdannainen, jolla on kaavan 10 I mukainen rakenne: 41 R*0 42 J J37 15 R40^39^^V 33 4 35 S3 f 2 0 5 OR' 0 \ ·127 γ {Ι) ZLo0 χ°~ :··; 12^ A 17 ,β 20 22 24 . . ,3 15 5 ^

ι» 21 I

• · · · • * · " , 30 jossa » · · *· *: X on 0; ...· Υ on Ο;

R1 on -CHzCHz-OHx R2 on H

> · 35 R4 on metyyli.

» » · ·'·· : Edullisesti, O-substituutio C40-paikkaan, suo- *.·* ritetaan seuraavan yleisen menetelmän mukaisesti: rapa- i 3 109540 mysiinin annetaan reagoida orgaanisen radikaalin kanssa, joka on liittynyt lohkeavaan ryhmään (esim. RX, jossa R on orgaaninen radikaali, esim. alkyyli, joka halutaan O-substituentiksi, ja X on lohkeava ryhmä, 5 esim. CC13C (NH) O tai CF3S03) sopivissa reaktio-olosuhteissa, edullisesti happamissa tai neutraaleissa olosuhteissa, esim. hapon läsnä ollessa, kuten trif-luorimetaanisulfonihapon, kamforsulfonihapon, p- tolueenisulfonihapon tai niiden vastaavan pyridiini-10 tai substituoitujen pyridiinisuolojen läsnä ollessa, kun X on CC13C(NH)0, tai emäksen läsnä ollessa, kuten pyridiinin, substituoidun pyridiinin, di- isopropyylietyyliamiinin tai pentametyylipiperidiinin läsnä ollessa, kun X on CF3S03.

15 Uusi yhdiste on erityisen käyttökelpoinen seu- raaviin tiloihin: (a) Hoitamaan ja estämään elin- tai kudossiir-rännäisen hylkimistä, esim. hoitamaan esim. sydämen, keuhkon, yhdistetyn sydän-keuhkon, maksan, munuaisen, 20 haiman, ihon tai sarveiskalvon siirrännäisen vastaanot tajia. Niitä ehdotetaan käytettäväksi myös estämään graft-versus-host-tautia, jota esim. esiintyy luuydin-·:*.· siirron jälkeen.

• (b) Hoitamaan ja estämään autoimmuunitautia ja . 25 inflammatorisia tiloja, erityisesti inflammatorisia ti- loja, joiden etiologiaan kuuluu autoimmuunikomponentti, : kuten niveltulehdusta (esim. nivelreuma, arthritis _·;·] chronica progediente ja arthritis deformans) ja reu- < · · maattisia sairauksia. Spesifisiin autoimmuunisairauk-30 siin, joihin keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan "· '* käyttää, kuuluu autoimmuuniset hematologiset häiriöt ...· (mukaan lukien esim. hemolyytinen anemia, aplastinen anemia, puhdas punasoluanemia ja idiopaattinen trombo-.···, sytopenia) , systeeminen lupus erytematosus, polykond- 35 riitti, sklerodoma, Wegenerin granulamatoosi, dermato- : myosiitti, krooninen aktiivinen hepatiitti, myastenia gravis, psoriasis, Steven-Johnson syndrooma, idiopaat- 4 109540 tinen spruutauti, autoimmuninen inflammatorinen suolistosairaus (käsittäen esim. haavaisen koliitin ja Croh-nin taudin), endokriininen oftalmopatia, Gravesin tauti, sarkoidoosi, multippeli skleroosi, primaarinen bi-5 liaarinen kirroosi, nuoruusiän diabetes (diabetes mel-litus, tyyppi I) , uveitiitti (anteriorinen ja poste-riorinen), kuiva keratokonjunktiviitti ja vernaali ke-ratokonjunktiviltti, välikeuhkofibroosi, psoriaattinen artriitti, glomerulonefriitti (nefroottisen syndrooman 10 kanssa ja ilman sitä, esim. mukaan lukien idiopaattinen nefroottinen syndrooma tai minimaalismuutoksinen nefro-patia) ja nuoruusiän dermatomyosiitti.

(c) Hoitamaan ja estämään astmaa.

(d) Hoitamaan monilääkeresistenssiä (MDR). Uu- 15 si yhdiste suppressor P-glykoproteiineja (Pgp), jotka ovat MDR:ään liittyviä kalvon kuljetusmolekyylejä. MDR on erityisen ongelmallinen syöpäpotilailla ja AIDS-potilailla, joille konventionaalinen kemoterapia ei anna vastetta, sillä Pgp pumppaa lääkityksen soluista 20 ulos. Uusi yhdiste on siten käyttökelpoinen lisäämään muiden kemoterapeuttisten aineiden vaikutusta hoidetta-! essa ja kontrolloitaessa monilääkeresistenssitiloja, kuten monilääkeresistenttiä syöpää tai monilääkeresis- • tenttiä AIDS:a.

. 25 (e) Hoitamaan proliferatiivisia häiriöitä, • · · esim. kasvaimia, hyperproliferatiivisia ihohäiriöitä ja .* vastaavia.

(·|·’ (f) Hoitamaan sieni-infektioita.

I f · (g) Hoitamaan ja estämään inflammaatiota, eri- ( t 30 tyisesti voimistamaan steroidien vaikutusta.

• · · ‘· '·' (h) Hoitamaan ja estämään infektiota, erityi- sesti sellaisten patogeenien infektiota, joilla on Mip tai Mip-kaltaisia tekijöitä.

*·, Keksintö tuo siten esiin hakemuksessa kuvatun ·' 35 uuden yhdisteen käytettäväksi uutena välituotteena tai farmaseuttisena aineena, menetelmiä edellä mainittujen ;/·. häiriöiden hoitamiseksi tai estämiseksi, jolloin täi- 5 109540 laista hoitoa tarvitsevalle potilaalle annetaan vaikuttava määrä uutta yhdistettä, uuden yhdisteen käytön edellä mainittujen häiriöiden hoitoon tai estoon tarkoitettujen lääkkeiden valmistuksessa sekä farmaseutti-5 siä koostumuksia, jotka sisältävät uutta yhdistettä yhdistelmänä tai yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän laimennusaineen tai kantajan kanssa.

Hakemuksessa kuvattu uusi yhdiste on erittäin immunosupressiivinen, ja se on erityisen käyttökelpoi-10 nen indikaatioihin (a) ja (b).

Uusi yhdiste hyödynnetään antamalla farmaseuttisesti tehokas annos farmaseuttisesti hyväksyttävässä muodossa sitä tarvitsevalle kohteelle. Uuden yhdisteen asianmukainen annos voi luonnollisesti vaihdella esim. 15 riippuen hoidettavasta tilasta (esim. sairauden tyyppi tai resistenssin luonne), halutusta vaikutuksesta ja antotavasta.

Yleensä saadaan kuitenkin tyydyttäviä tuloksia annettaessa oraalisesti annoksina, jotka ovat suuruus-2 0 luokkaa 0,05 - 5 tai aina 10 mg/kg/päivä saakka, esim. suuruusluokkaa 0,1 - 2 tai aina 7,5 mg/kg/päivä saakka, annettuna kerran tai jaettuina annoksina 2 - 4 x päi- « · vässä; tai annettaessa parenteraalisesti, esim. intra-; ’·· venoosisesti, esimerkiksi i.v. tipparuiskeena tai in- . 25 fuusiona, annoksina suuruusluokkaa 0,01 - 2,5 - aina 5 mg/kg/päivä saakka, esim. suuruusluokkaa 0,05 tai 0,1 -: aina 1,0 mg/kg/päivä saakka. Sopivat päiväannokset po- tilaita varten ovat siten suuruusluokkaa 500 mg p.o., • · · esim. suuruusluokkaa 5 - 100 mg p.o., tai suuruusluok-30 kaa 0,5 - 125 - aina 250 mg i.v. saakka, esim. suuruus- • · · ’ '·* luokkaa 2,5 - 50 mg i.v.

...‘ Vaihtoehtoisesti, ja jopa edullisemmin, annos- tus järjestetään potilaskohtaisesti tuottamaan ennalta ,···. määrätyt minimiveritasot, esim. jotka määritetään RIA- * · ·* 35 menetelmällä. Siten potilaan annostus voidaan sovittaa : siten, että saavutetaan tasaiset meneillään olevat mi- ·.’*· nimi veritasot (on-going trough blood levels), esim.

6 109540 RIA:lla määritettynä, jotka ovat suuruusluokkaa 50 tai 150 - aina 500 tai 1000 ng/ml saakka, so. analogisesti annostusmenetelmien kanssa, joita on viime aikoina käytetty siklosporiinin immunosuppressiivisessa hoidossa.

5 Uusi yhdiste voidaan antaa ainoana aktiivisena aineosana tai yhdessä toisten lääkkeiden kanssa. Esimerkiksi immunosuppressiivisissa sovellutuksissa, kuten graft-versus-host -taudin, siirrännäisen hylkimisen tai autoimmuunitaudin estoa ja hoitoa varten uutta yhdis-10 tettä voidaan käyttää yhdessä siklosporiinin, FK-506 tai niiden immunosuppressiivisten johdannaisten; korti-kosteroidien; atsatiopreenin; immunosuppressiivisten monoklonaalisten vasta-aineiden, esim. CD3:lle, CD4:lle, CD25:lle, CD28:lle tai CD45:lle kohdistettujen 15 monoklonaalisten vasta-aineiden; ja/tai muiden immuno- modulatoristen yhdisteiden kanssa. Anti- inflammatrorisia sovellutuksia varten uutta yhdistettä voidaan käyttää yhdessä anti-inflammatoristen aineiden, esim. kortikosteroidien, kanssa. Anti-infektiivisia so-20 vellutuksia varten uutta yhdistettä voidaan käyttää yhdessä muiden anti-infektiivisten aineiden kanssa, esim.

I antiviraalisten lääkkeiden tai antibioottien kanssa.

•;v Uusi yhdiste annetaan mitä tahansa konventio- : ·.. naalista reittiä, erityisesti enteraalisesti, kuten . 25 oraalisesti, esim. juotavien liuosten, tablettien tai ....: kapselien muodossa, tai parenteraalisesti, esim. injek- : ,·. toitavien liuosten tai suspensioiden muodossa. Sopivat yksikköannosmuodot oraalista antoa varten sisältävät • * · esim. 1 - 50 mg keksinnön mukaista yhdistettä, tavaili-30 sesti 1 - 10 mg. Uutta yhdistettä sisältävät farmaseut- ’· tiset koostumukset voidaan valmistaa analogisesti rapa- ’...· mysiiniä sisältävien farmaseuttisten koostumusten kans- sa, esim. julkaisussa EPÄ 0 041 7 95 kuvatun mukaisesti, ,>··, kuten on ilmeistä alan ammattilaiselle.

35 Uuden yhdisteen farmakologinen aktiivisuus on ; osoitettu esim. seuraavilla kokeilla: * * » 7 109540 1. Seoslymfosyyttireaktio (Mixed lymphocyte reaction, MLR)

Seoslymfosyyttireaktio kehitettiin alunperin allograftisten siirrännäisten yhteydessä arvioimaan 5 mahdollisten elimen luovuttajien ja vastaanottajien välistä kudosyhteensopivuutta, ja se on yksi parhaista vakiintuneista in vitro -immuunireaktiomalleista. Käytetään hiiren MLR-mallia, esim. T. Meo, julkaisussa, "Immunological Methods", L. Lefkovits ja B. Peris, 10 toim. Academic Press, N.Y. ss. 227 - 239 (1979), kuvaaman mukaista mallia, osoittamaan uusien yhdisteiden immunosuppressiivinen teho. Balb/c-hiiristä (naaras, 8 -10 viikkoa) saatuja pernasoluja (0,5 x 106) inkuboidaan 5 päivän ajan yhdessä 0,5 x 106 säteilytettyjen (2000 ! 15 rad) tai mitomysiinillä C käsiteltyjen pernasolujen kanssa, jotka on saatu CBA-hiiriltä (naaras, 8-10 viikkoa). Säteilytetyt allogeeniset solut indusoivat proliferatiivisen vasteen Balb/c-pernasoluissa, jota voidaan mitata DNArhan sisältyneiden leimattujen pre-20 kursoreiden avulla. Koska stimulaattorisolut säteilyte-tään (tai käsitellään mitomysiinillä C) , ne eivät muodosta vastetta Balb/c-soluille ja proliferoidu, mutta •:v ne säilyttävät antigeenisyytensä. Uusien yhdisteiden j antiproliferatiivinen teho Balb/c-soluihin mitataan eri . 25 laimennuksilla ja pitoisuus, joka tuottaa soluprolife- raation 50 % eston (IC50) , lasketaan. Koeaineen estoky-: .·. kyä voidaan verrata rapamysiiniin ja se voidaan ilmais- ta suuhteellisena IC50-arvona (so. IC50 koeaine/IC50 ra- * c · pamysiini).

30 '· ’· 2. IL-6 välitteinen proliferaatio » · · —

Uuden yhdisteen kyky häiritä kasvutekijää, jo-ka liittyy signaalireitteihin, arvioidaan käyttäen in-.·*, terleukiini-6 (IL-6) -riippuvaista hiiren hybrido- ·* 35 masolulinjaa. Määritys suoritetaan 96-kuopan mikrotiit- : terilevyillä. 5000 solua/kuoppa kasvatetaan seerumiva-

' I

V·: paassa väliaineessa (kuten ovat kuvanneet M. H. Schrei- 8 109540 er ja R. Tees, julkaisussa, Immunological Methods, I. Lefkovits ja B. Pernis, toim. Academic Press 1981, vol. II, ss. 263 - 275), jota on täydennetty 1 ng yhdistel-mä-IL-6/ml. Sen jälkeen, kun on inkuboitu 66 tuntia 5 koeaineen poissa tai läsnä ollessa, soluja käsitellään sykäyksittäin 1 μ(3ί (3-H)-tymidiiniä/kuoppa seuraavat 6 tuntia, ne otetaan talteen ja lasketaan nestetuikelas-kennalla. (3-H)-tymidiinin sisältyminen DNA:han korreloi solulukumäärän lisääntymisen kanssa ja toimii siten 10 soluproliteraation mittana. Koeaineen laimennussarja mahdollistaa soluproliferaation 50 % eston (IC50) tuottavan pitoisuuden laskemisen. Koeaineen estokykyä voidaan verrata rapamysiiniin ja se voidaan ilmaista suhteellisena IC50-arvona (so. IC50 koeaine/lC50 rapamysii-15 ni) .

3. Makrofiliinin sitomismääritys Rapamysiinin ja rakenteellisesti läheisen im-munosupressoivan aineen, joka on FK-506, tiedetään mo-20 lempien sitoutuvan in vivo makrofiliiniin-12 (macrophi-lin-12, tunnetaan myös FK-506-sitoutuvana proteiinina tai FKBP-12:na) ja tämän sitoutumisen ajatellaan liit-tyvän näiden yhdisteiden immunosuppressiiviseen aktii-visuuteen. Uusi yhdiste sitoutuu myös voimakkaasti mak-25 rofiliini-12:een, kuten osoitetaan kompetetiivisella sitoutumismäärityksellä.

, , Tässä määrityksessä BSA:han kytkettyä FK- I ’ 506:ta käytetään mikrotiitterikuoppien päällystämiseen.

• Il *.* * Biotinyloidun yhdistelmä-ihmisen makrof iliini-12 :n 30 (biot-MAP) annetaan sitoutua koeaineen poissa tai läsnä I * * • ollessa immobilisoituun FK-506:een. Pesun (ei- spesifisesti sitoutuneen makrofiliinin poistamiseksi) » « » ‘ . jälkeen sitoutunut biot-MAP määritetään inkuboimalla ’ ’ streptavidiini-emäksinen fosfataasi -konjugaatin kans- '·*·' 35 sa, sitten pesemällä ja sen jälkeen lisäämällä p- • nitrofenyylifosfaattia substraattina. Luetaan OD arvos- : sa 405 nm. Koeaineen sitoutuminen biot-MAP:iin aiheut- 9 109540 taa FK-506:een sitoutuneen biot-MAP:n määrän pienenemisen ja siten laskun OD405:ssa. Koeaineen laimennussarja mahdollistaa biot-MAP:n immobilisoituun FK-506:een sitoutumisen 50 % eston (IC50) tuottavan pitoisuuden mää-5 rittämisen. Koeaineen estokykyä verrataan standardina olevan vapaan FK-506:n IC50-arvoon ja se ilmaistaan suhteellisena IC50-arvona (so. IC5o-koaine/IC5o-vapaa FK-506) .

10 4. Paikallinen graf-versus-host (GvH)-reaktio

Uuden yhdisteen in vivo teho osoitetaan sopivalla eläinmallilla, esim. Ford et ai., julkaisussa Transplantation _10 (1970) 258, kuvaaman mukaisesti.

Pernasoluja (1 x 107) , jotka on saatu 6 viikkoa vanhoil-15 ta Wistar/Furth (WF) -naarasrotilta, injektoidaan sub- kutaanisesti päivänä 0 n. 100 g painavien (F344 x WF)Fi-naarasrottien vasempaan takakäpälään. Eläimiä käsitellään 4 seuraavan päivän ajan ja päivänä 7 poistetaan popliteaaliset imusolmukkeet ja punnitaan. Kahden 20 imusolmukkeen painoero otetaan parametriksi reaktiota arvioitaessa.

·.·’,*' 5. Allograftisen munuaissiirränäisen reaktio : ·.. rotassa . 25 Fisher 344 -naarasrotan yksi munuainen siirre- tään unilateraalisesti (vasen puoli) nefrektomoidun WF-: vastaanottajarotan munuaistiehyeeseen käyttäen päästä päähän anastomosiaa. Virtsanjohdinanastomosia on myös * · · päästä päähän. Käsittely aloitetaan siirtopäivänä ja 30 sitä jatketaan 14 päivänajan. Kontralateraalinen nef- rektomia suoritetaan seitsemän päivän kuluttua siirros-ta, jolloin vastaanottaja jää luovuttajan munuaisen toiminnan varaan. Siirrännäisen vastaanottajan eloon-,···. jääminen otetaan parametriksi toimivalle siirränäisel- 35 le.

10 109540 6. Kokeellisesti indusoitu allerginen enkefa-lomyeliitti (EAE) rotassa

Uuden yhdisteen teho EAErssa määritetään esim. menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Levine & Wenk, jul-5 kaisussa, Amer J Path, 47 (1965) 61; McFarlin et ai., julkaisussa, J Immunol, 113 (1974) 712,- Borel, julkai sussa, Transplant. & Clin. Immunol, 13 (1981) 3. EAE on laajasti hyväksytty malli multippelille skleroosille. Wistar-urosrottien takakäpäliin injektoidaan seosta, 10 joka sisältää naudan selkäydintä ja täydellistä Freun-din adjuvanttia. Sairauden oireet (hännän ja molempien takajalkojen halvaantuminen) kehittyvät tavallisesti 16 päivän kuluessa. Sairastuneiden eläinten lukumäärä sekä sairauden alkamisajankohta rekisteröidään.

15 7. Freundin adjuvantti -artriitti

Teho kokeellisesti indusoitua artriittia vastaan osoitetaan käyttäen menetelmää, joka on esim. Winter & Nuss, julkaisussa, Arthritis & Rheumatism, 9 20 (1966) 394; Billingham & Davies, julkaisussa, Handbook of Experimental Pharmacol., (Vane & Ferreira toim., Springer-Verlag, Berliini) 50/11 (1979) 108 - 144, ku- :v vaarnan mukainen. OFA- ja Wistar-rottiin (uros tai naa- ' ·.. ras, 150 g kehonpaino) injektoidaan i.c. hännän juureen ! i , :\· 2 5 tai takakäpälään 0,1 ml mineraaliöljyä, joka sisältää ! 0,6 mg lyofilisoitua lämpötapettua Mycobacterium smeg- ;matista. Kehittyvässä artriittimallissa käsittely aloi-tetaan välittömästi adjuvantti-injektion jälkeen (päi- ti· vinä 1 - 18) ; vakiintuneessa artriittimallissa, käsit-30 tely aloitetaan päivänä 14, kun sekundaarinen tulehdus . ·: on hyvin kehittynyt (päivinä 14 - 2 0) . Kokeen lopussa /,/ nivelten turpoamista mitataan mikrokaliiperin avulla.

ED50 on oraalinen annos mg/kg, joka vähentää turpoamista (primaarista tai sekundaarista) puoleen kontrollien /' 35 turpoamiseen verrattuna.

.: 8. Antituumori- ja MDR-aktiivisuus j i f | 11 109540

Uuden yhdisteen antituumoriaktiivisuus ja niiden kyky lisätä antituumoriaineiden suorituskykyä vähentämällä monilääkeresistenssiä osoitetaan esim. antamalla antisyöpäainetta, esim. kolkisiinia tai eto-5 posidia, monilääkeresistenteille soluille ja lääkeher-kille soluille in vitro tai eläimille, joilla on moni-lääkeresistenssi tai lääkeherkkyys tuumoreille tai infektioille, yhdessä tai ilman samanaikaisesti testattavan uuden yhdisteen annon kanssa, sekä antamalla pel-10 kästään uutta yhdistettä.

Tällainen in vitro -koe suoritetaan käyttäen mitä tahansa sopivaa lääkeresistenttiä solulinjaa ja kontrolli (parentaali) -solulinjaa, joka on muodostettu esim. Ling et ai., julkaisussa, J. Cell. Physiol., 83, 15 103 - 116 (1974), ja Bech-Hansen et ai., julkaisussa, J. Cell. Physiol. 88, 23 - 32 (1976), kuvaaman mukai sesti. Edullisia valittuja klooneja ovat monilääke-resistentti (esim. kolkisiiniresistentti) CHR-linja (alaklooni C5S3.2) ja parentaali, herkkä AUX B1 -linja 20 (alaklooni ABI Sll).

In vivo antituumori- ja anti-MDR-aktiivisuus osoitetaan esim. hiirillä, joihin on injektoitu moni-lääkerasistenttejä ja lääkeherkkiä syöpäsoluja. Ehr-!*·., lich-askiittikarsinooma (EA) -solulinjat, jotka ovat 25 herkkiä lääkeaineelle DR, VC, AM, ET, TE tai CC, kehi- tetään EA-solujen peräkkäisellä siirrolla BALB/c-: ,·, hiirten seuraaviin sukupolviin käyttäen menetelmiä, joita ovat kuvanneet Slater et ai., J. Clin. Invest.

» » · 70, 1131 (1982) .

30 Samanlaiset tulokset voidaan saada käyttämällä : » · | '. *: uuden yhdisteen kokeita vertailevina kokeina, esim. in ‘,.,·' vitro, tai käyttämällä koe-eläimiä, jotka on infektoitu lääkeresistenteillä ja lääkeherkillä viruskannoilla, ·.·_ antibiootti (esim. pensisilliini) -resistenteillä ja - Ί" 35 herkillä bakteerikannoilla, antimykoottiresistenteillä :, · j ja -herkillä sienikannoilla sekä lääkeresistenteillä prototsoakannoilla, esim. Plasmodiaalikannoilla, kuten 12 109540 luonnossa esiintyvillä Plasmodium falciparum-alakannoilla, joilla on hankittu kemoterapeuttinen, an-ti-malarialääkeresistenssi.

5 9. Steroidivahvistus

Uuden yhdisteen makrofiliinia sitova aktiivisuus tekee siitä käyttökelpoisen kortikosteroidien vaikutuksen lisäykseen ja vahvistukseen. Yhdistetty käsittely keksinnön mukaisella yhdisteellä ja kortikostero-10 ideilla, kuten deksamatasonilla, tuottaa suuresti lisääntyneen steroidisen aktiivisuuden. Tämä voidaan osoittaa esim. hiiren nisäkasvainviruksen kloramfeniko-liasetyylitransferääsi (MMTV-CAT) -reportterin geeni-määrityksellä, esim. Ning et ai., julkaisussa, J. Biol. 15 Chem. (1993) 268; 6073, kuvaaman mukaisesti. Mainitun synergistinen vaikutuksen ansiosta kortikosteroideja voidaan käyttää pienennettyinä annoksina, mikä eräissä tapauksissa vähentää sivuvaikutusten riskiä.

20 10. Mip- ja Mip-kaltaisen tekijän esto j Lisäksi, uusi yhdiste sitoo ja salpaa erilai sia Mip- (makrophage infectivity potentiator) ja Mip-: : kaltaisia tekijöitä, jotka muistuttavat rakenteellises- j ti makrof iliinia. Mip- ja Mip-kaltaiset tekijät ovat f f 25 mitä erilaisempien patogeenien, mukaan lukien patogee- nit suvuista Chlamidia, esim. Chlamidia trachomatis; • » - : Neisseria, esim. Neisseria meiningitidis; ja Legionel- * * · '!!.* la, esim. Legionella pneumophilia; ja myös Rickett- • ' siales-luokan ehdottomien loisjäsenten tuottamia viru- I 30 lenssitekijöitä. Näillä tekijöillä on kriittinen osa I ► » j ·: intrasellulaarisen infektion aikaansaamisessa. Uuden yhdisteen teho vähentää Mip- ja Mip-kaltaisia tekijöitä tuottavien patogeenien infektiivisyyttä voidaan osoit- ♦ · taa vertaamalla tiettyjen patogeenien infektiivisyyttä 35 soluviljelmissä, makrolidien läsnä tai poissa ollessa, ,ί * esim. käyttäen menetelmiä, joita ovat kuvanneet Lunde- /.j mose et ai., julkaisussa, Mol. Microbiol. (1993) 7:777.

| | 13 109540

Uusi yhdiste on myös käyttökelpoinen määrityksissä, jotka on tarkoitettu makrofiliiniin sitoutuvien yhdisteiden läsnäolon tai määrän toteamista varten, esim. kompetetiivisissa määrityksissä diagnostisia tai 5 seulovia tarkoituksia varten. Siten keksintö tuo eräänä sovellutuksena esiin uuden yhdisteen käytön seulontavä-lineenä makrofiliiniin sitoutuvien yhdisteiden läsnäolon määrittämiseksi näyteliuoksesta, esim. verestä, veriseerumista tai seulottavasta koealustasta. Edulli-10 sesti, uusi yhdiste immobilisoidaan mikrotiitterikuop-piin ja sitten annetaan sitoutua näyteliuoksen läsnä tai poissa ollessa leimattuun makrofiliini-12:een (FKBP-12). Vaihtoehtoisesti, FKBP-12 immobilisoidaan mikrotiitterikuoppiin ja annetaan sitoutua näyteliuok-15 sen läsnä tai poissa ollessa uuteen yhdisteeseen, joka on leimattu, esim. fluoro-, entsyymi- tai radio-leimattu, esim. uuteen yhdisteeseen, jonka C40-paikka on O-substituoitu leimaavalla ryhmällä. Levyt pestään ja sitoutuneen leimatun yhdisteen määrä mitataan. Mak-20 rofiliiniin sitoutuvan aineen määrä näyteliuoksessa on i karkeasti kääntäen verrannollinen leimatun yhdisteen määrään. Kvantitatiivista analyysia varten tehdään < * · standardisitoutumiskuvaaja käyttäen makrofiliiniin si-toutuvan yhdisteen tunnettuja pitoisuuksia.

25 t · · i · ·

Esimerkit . . Seuraavissa esimerkeissä annetaan tunnusomai-

! * I

set spektroskooppiset tiedot tunnistamisen helpottami- ·' ’ seksi. Piikkejä, jotka eivät eroa merkittävästi rapamy- 30 siinistä, ei ole esitetty. Biologiset tiedot on annettu ,’·* suhteellisena IC50-arvoina, verrattuna rapamysiiniin seoslymfosyyttireaktion (MLR) ja IL-6-riippuvaisen pro-j liferaation (IL-6 riipp. prol.) määrityksissä sekä FK- i » j ... 506:een makrofiliinin sitoutumisen määrityksessä (MBA).

3 5 Suurempi IC50-arvo korreloi alemman sitoutumisaffinitee-· tin kanssa.

109540 14

Esimerkki_1: 40-0- (2-hydroksi)etyyli - rapamysiini (a) 40-0-[2-(t-butyylidimetyylisilyy- li)oksi)etyyli-rapamysiini 5 Liuosta, joka sisältää 9,14 g (10 mmol) rapa- mysiiniä ja 4,70 ml (40 mmol) 2,6-lutidiinia 30 ml to-lueenissa, lämmitetään 60 °C lämpötilaan ja joukkoon lisätään liuos, joka sisältää 6,17 g (20 mmol) 2-(t-butyylidimetyylisilyyli)oksietyylitriflaattia ja 2,35 10 ml (20 mmol) 2,6-lutidiinia 20 ml tolueenissa. Tätä seosta sekoitetaan 1,5 tunnin ajan. Sitten lisätään kaksi annosta liuosta, joka sisältää 3,08 g (10 mmol) trif laattia ja 1,2 ml (10 mmol) 2,6-lutidiinia 10 ml tolueenissa, 1,5 tunnin välein. Viimeisen annoksen li-15 säyksen jälkeen sekoitusta jatketaan 60 °C lämpötilassa 2 tunnin ajan ja saatu ruskea suspensio suodatetaan. Suodos laimennetaan etyyliasetaatilla ja sitä pestään natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja suolaliuoksella, Orgaaninen liuos kuivataan vedettömällä natriumsulfaa-20 tiliä, suodatetaan ja konsentroidaan. Jäännös puhdistetaan pylväskromatografisesti silikageelillä (40:60 hek-saani:etyyliasetaatti), jolloin saadaan 40-0-[2-(t-1: ’ ϊ butyylidimetyylisilyyli)oksi]etyyli-rapamysiiniä val- koisena kiintoaineena: 1H-NMR (CDC13) δ 0,06 (6H, s), .\ 25 0,72 (1H, dd) , 0,90 (9H, s), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, s), 3,02 (1H, m), 3,63 (3H, m), 3,72 (3H, m); MS (FAB) , . m/z 1094 ( [M+Na] +) , 1022 ( [M-(0CH3+H20) ]+) .

» · ♦ f * * • » ► · • * · ’·’ (b) 40-0-(2-hydroksi) etyyli-rapamysiini 30 Sekoitettuun, jäähdytettyyn (0 °C) liuokseen, * · .’·· joka sisältää 4,5 g (4,2 mmol) 40-0-[2-(t- ‘ butyylidimetyylisilyyli) oksi] etyyli-rapamysiiniä 20 ml metanolissa, lisätään 2 ml 1 N HCl-liuosta. Tätä liuosta sekoitetaan 2 tunnin ajan ja se neutraloidaan natri-"* 35 umbikarbonaatin vesiliuoksella. Seosta uutetaan kolmel- ; : : la erällä etyyliasetaattia. Orgaanista liuosta pestään ,‘\j natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja suolaliuoksella, * » 15 109540 se kuivataan vedettömällä natriumsulfaatilla, suodatetaan ja konsentroidaan. Puhdistus pylväskromatografi-

sesti silikageelillä (etyyliasetaatti) tuotti otsikon mukaista tuotetta valkoisena kiintoaineena: ^-NMR

5 (CDC13) δ 0,72 (1H, dd) , 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, s), 3,13 (5H, s ja m), 3,52 - 3,91 (8H, m); MS (FAB) m/z 980 ( [M+Na] +) , 926 ([M-OCH3]+), 908 ( [M- (0CH3+H20) ] +) , 890 ( [M-(0CH3+2H20) ]+) , 876 ( [M-(2CH3OH+OH) ]+) , 858 ( [M- (OCH3+CH3OH+2H20) ] +) .

10 MBA (suht. IC50) 2,2 IL-6 riipp. prol. (suht. IC50) 2,8 MLR (suht. IC50) 3,4 j • · • · > · · · 1 « > · < ·

* · I

• · I · · 4 4 · • MM »

• I

» » • * · 1 » · ' * » · • > » f I · I · 4 · » · * ( t il· » ' » I * · » »

> I I

• I · I » t » » »

Claims (5)

109540

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen 40-0-(2-hydroksietyyli)-rapamysiinin, jolla on kaava I 5 38 '37 ί n 3° f 4 ,c S3 , ! L35 /V 32y\ go 5 f 3Γ ä T || J l! I 6 o .V^ TT U , (I> 15!^-0H yX1 ” ' ? 50 22 y 24 : ! 18 20 22 / 20 13 15 19 21 f ί · jossa \ 25 X on O, Y on O, : : : R1 on -CH2CH2-OH · R2 on H ja R4 on metyyli, ;1· : 30 valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) annetaan rapamysiinin reagoida : X' -0-CH2-CH2-0S02CF3:n tai I X'-O-CH2-CH2-0 (NH)C-CCl3:n kanssa, 35 jossa X' on hydroksisuojaryhmä ja : b) poistetaan vaiheessa a) muodostuneesta yhdisteestä * 1 hydroksisuoj aryhmä. 109540

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että a) annetaan rapamysiinin reagoida 2-(t.butyylidimetyylisilyyli)oksi-etyyli-5 0S02CF3:n kanssa ja b) poistetaan vaiheessa a) muodostuneesta yhdis teestä t.butyylidimetyylisilyyli-ryhmä.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaihe a) suorite- 10 taan emäksen läsnäollessa.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaihe a) suoritetaan sub-stituoidun pyridiinin, di-isopropyylietyyliamiinin tai pentametyylipiperidiinin läsnäollessa.

5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaihe a) suoritetaan 2,6-lutidiinin läsnäollessa. r l t « » »ti 1 » 109540