CZ283333B6 - O-alkylované deriváty rapamycinu, farmaceutický prostředek a jejich použití, zejména jako imunosupresiv - Google Patents

Abstract

Jsou popsány O-alkylovanové deriváty rapamycinu obecného vzorce I, ve kterém X je (H,H) nebo O, Y je (H, OH) nebo O, R.sup.1.n. a R.sup.2.n. jsou nezávisle na sobě zvoleny z H, alkylu, thioalkylu, arylalkylu, hydroxyalkylu, dihydroxyalkylu,. hydroxyalkylarylalkylu, dihydroxyalkylarylalkylu, alkoxyalkylu, acyloxyalkylu, aminoal-kylu, alkylaminoalkylu, alkoxykarbonylaminoalkylu, acylaminoalkylu, arylsulfonamidoalkylu, allylu, dihydroxyalkylallylu, dioxolanylallylu, karbalkoxyalkylu a (R.sup.3.n.).sub.3.n.Si, kde každý R.sup.3.n. je nezávisle zvolen z H, methylu, ethylu, isopropylu, terc. butylu a fenylu, přičemž "alk-" nebo "alkyl" je C.sub.1-6.n.-alkyl, rozvětvený nebo přímý, s výhodou C.sub.1-3.n.-alkyl, ve kterém může být uhlíkový řetězec popřípadě přerušen etherovou (-O-) vazbou, a R.sup.4.n. je methyl nebo R.sup.4.n. a R.sup.1.n. tvoří dohromady C.sub.2-6.n.-alkylen, s výhradou, že R.sup.1.n. a R.sup.2.n. nejsou oba H a s výhradou, že když R.sup.1.n. je karbalkoxyalkyl nebo (R.sup.3ŕ

Description

Vynález se týká nových alkylovaných derivátů rapamycinu, které jsou farmaceuticky použitelné, zejména jako imunosupresiva.

Dosavadní stav techniky

Rapamycin je známé makrolidové antibiotikum, které produkuje Streptomyces hygroscopicus, o struktuře znázorněné vzorcem A:

Viz např. McAlpine, J. B. s spol., J. Antibiotics (1991) 44, 688, Schreiber, S. L. a spol., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113, 7433, US patent č. 3 929 992. Rapamycin je neobyčejně silné imunosupresivum a bylo též prokázáno, že má protinádorovou a protiplísňovou účinnost. Jeho použitelnost jako farmaceutický prostředek je však omezena jeho velmi nízkou a variabilní biologickou dostupností jakož i jeho vysokou toxicitou. Kromě toho je rapamycin velmi nerozpustný, což ztěžuje přípravu stabilních lékových forem.

- 1 CZ 283333 B6

Podstata vynálezu

Nyní bylo neočekávaně zjištěno, že určité nové deriváty rapamycinu (nové sloučeniny) mají lepší farmakologický profil než rapamycin, mají lepší stabilitu a biologickou dostupnost a umožňují snadnější výrobu lékových forem. Nové sloučeniny jsou alkylované deriváty rapamycinu o struktuře odpovídající obecnému vzorci I:

(I) ve kterém

X je (Η, H) nebo atom kyslíku,

Y je (H, OH) nebo atom kyslíku, symboly R¹ a R² jsou nezávisle na sobě vybrány ze souboru zahrnujícího atom vodíku, alkylové skupiny, arylalkylové skupiny, hydroxyalkylové skupiny, dihydroxyalkylové skupiny, hydroxyalkylarylalkylové skupiny, dihydroxyalkylarylalkylové skupiny, acyloxyalkylové skupiny, aminoalkylové skupiny, alkylaminoalkylové skupiny, alkoxykarbonylaminoalkylové skupiny, acylaminoalkylové skupiny, arylsulfonamidoalkylové skupiny, allylovou skupinu, dihydroxyalkylallylové skupiny, dioxolanylallylovou skupinu a hydroxyalkoxyalkylové skupiny, přičemž alk- nebo alkyl představuje alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, která má přímý nebo rozvětvený řetězec, acyl představuje zbytek odvozený od karboxylové kyseliny, vybraný ze souboru zahrnujícího alkylkarbonylové skupiny s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, nikotinoylovou, 2-(N-morfolino)acetylovou, 2-(Nimidazolyl)acetylovou a 2-(N-methyl-N-piperazinyl)acetylovou skupinu, a aryl znamená fenyl nebo tolyl, a

-2CZ 283333 B6

R⁴ znamená methylovou skupinu, nebo symboly R⁴ a R¹ tvoří dohromady alkylenovou skupinu se 2 až 6 atomy uhlíku, s tím, že symboly R¹ a R² neznamenají oba vždy atom vodíku.

Výhodné nové sloučeniny zahrnují následující:

1.40- O-benzylrapamycin

2. 40-O-(4^,-hydroxymethyl)benzylrapamycin

3. 40-O-(4'-( 1,2-dihydroxyethyl))benzylrapamycin

4. 40-O-allylrapamycin

5. 40-O-(3'-(2,2-dimethyl-l ,3-dioxolan-4(S)-yl)prop-2'-en-l '-yl)rapamycin

6. (2'E,4'S)-40-O-(4',5'-dihydroxypent-2'-en-r-yl)rapamycin

7. 40-O-(2-hydroxy)ethoxykarbonylmethylrapamycin

8. 40-O-(2-hydroxy)ethylrapamycin

9. 40-O-(3-hydroxy)propylrapamycin

10. 40-O-(6-hydroxy)hexylrapamycin

11.40- O-(2-(2-hydroxy)ethoxy)ethylrapamycin

12. 40-0-((3 S)-2,2-dimethyldioxolan-3-yl)methylrapamyc in

13.40- O-((2S)-2,3-dihydroxyprop-l-yl)rapamycin

14. 40-O-(2-acetoxy)ethylrapamycin

15. 40-O-(2-nikotinoyloxy)ethylrapamycin

16. 40-O-(2-(N-morfolino)acetoxy)ethylrapamycin

17. 40-O-(2-N-imidazolylacetoxy)ethylrapamycin

18. 40-O-(2-(N-methyl-N'-piperazinyl)acetoxy)ethylrapamycin

19. 39-0-desmethyl-39,40-0,0-ethylenrapamycin

20. (26R)-26-dihydro-40-0-(2-hydroxy)ethylrapamycin

21. 28-O-methylrapamycin

22. 40-O-(2-aminoethyl)rapamycin

23.40- O-(2-acetaminoethyl)rapamycin

24. 40-O-(2-nikotinamidoethyl)rapamycin

25. 40-O-(2-(N-methylimidazo-2'-ylkarboxamido)ethyl)rapamycin

26. 40-O-(2-ethoxykarbonylaminoethyl)rapamycin

27. 40-O-(2-tolylsulfonamidoethyl)rapamycin

28. 40-O-(2-(4',5'-dikarboethoxy-r,2',3^,-triazol-r-yl)ethyl)rapamycin

Novými sloučeninami pro imunosupresivní použití jsou s výhodou 40-O-substituované rapamyciny, ve kterých jak X tak Y představuje atom kyslíku. R² znamená atom vodíku. R⁴ znamená methylovou skupinu a R¹ má jiný význam než atom vodíku, nejvýhodněji ve kterých R¹

-3 CZ 283333 B6 je zvolen z hydroxyalkylové skupiny, hydroxyalkoxyalkylové skupiny, acylaminoalkylové skupiny a aminoalkylové skupiny, zejména 40-O-(2-hydroxy)ethylrapamycin, 40-0-(3hydroxy)propylrapamycin, 40-O-(2-(2-hydroxy)ethoxy)ethylrapamycin a 40-O-(2-acetaminoethyl)rapamycin).

O-substituce na C40 nebo Ο,Ο-disubstituce na C28 a C40 se provádí s výhodou následujícím obecným postupem: Rapamycin (nebo dihydro- nebo deoxorapamycin) se nechá reagovat s organickým zbytkem, připojeným k eliminované skupině (například RX, kde R je organický zbytek, např. alkylová skupina, allylová skupina nebo benzylová skupina, který je požadován jako O-substituent, a X je eliminovaná skupina, například CC1₃C(NH)O nebo CF₃SO₃), za vhodných reakčních podmínek, s výhodou kyselých nebo neutrálních podmínek, například za přítomnosti kyseliny jako kyseliny trifluormethansulfonové, kyseliny kafrosulfonové, kyseliny p-toluensulfonové nebo jejich příslušných pyridiniových nebo substituovaných pyridiniových solí, když X znamená CC1₃C(NH)O, nebo v přítomnosti báze jako pyridinu, substituovaného pyridinu, diisopropylethylaminu nebo pentamethylpiperidinu, když X znamená CF₃SO₃. Osubstitucí pouze na C28 se dosahuje stejným způsobem, avšak s předběžným chráněním na C40. Přicházejí v úvahu i další modifikace. Například, když substituentem je allylová skupina, je izolovaná, monosubstituovaná dvojná vazba allylové skupiny vysoce přístupná další modifikaci.

9-deoxorapamycinové sloučeniny se s výhodou připravují redukcí rapamycinu použitím sirovodíku, reakcí rapamycinu s difenyldiselenidem atributylfosfinem nebo jinou vhodnou redukční reakcí.

26-dihydrorapamiciny se připravují s výhodou redukcí rapamicinů nebo deoxorapamicinů z ketoskupiny na hydroxyskupinu na C26 mírnou redukční reakcí, například borohydridovou redukční reakcí.

Nové sloučeniny jsou zvláště vhodné pro následující účely:

a) Léčení a prevence odhojení transplantovaných orgánů nebo tkání, například pro léčení příjemců např. transplantovaného srdce, transplantovaných plic, společně transplantovaného srdce a plic, transplantovaných jater, ledvin, slinivky břišní, transplantované kůže nebo rohovky. Jsou též indikovány pro prevenci reakce štěpu vůči hostiteli, například po transplantaci kostní dřeně.

b) Léčení a prevence autoimunního onemocnění a zánětlivých stavů, zejména zánětlivých stavů setiologií zahrnující autoimunní složku, jako arthritidy (například revmatoidní arthritidy, chronické progresivní arthritidy a deformující arthritidy) a revmatických chorob. Specifické autoimunní nemoci, pro které mohou být sloučeniny podle vynálezu použity, zahrnují autoimunní hematologické poruchy (včetně například hemolytické anémie, aplastické anémie, anémie z nedostatku červených krvinek a idiopathické thrombocytopenie), systémový lupus erythematosus, polychondritidu, sklerodermii. Wegenerovu granulomatózu, dermatomyositózu, chronickou aktivní hepatitidu, myasthenii gravis, psoriasu. Steven-Johnsonův syndrom, idiopathickou sprue, autoimunní zánětlivé onemocnění střev (včetně např. ulcerózní kolitidy a Crohnovy nemoci), endokrinní ofitalmopathii. Gravesovu nemoc, sarkoidózu, roztroušenou sklerózu, primární biliámí cirhózu, juvenilní diabetes (diabetes mellitus typ I), uveitidu (přední a zadní), suchou keratokonjunktivitidu, vemální keratokonjunktivitidu, intersticiální fibrózu plic, psoriatickou arthritidu, glomerulonefritidu (s nebo bez nefrotického syndromu), např. včetně idiopathického nefrotického syndromu nebo nefropathie s minimálními změnami) a juvenilní dermatomyositózu.

c) Léčení a prevence astmatu.

-4CZ 283333 B6

d) Léčení vícelékové rezistence (MDR). Nové sloučeniny potlačují P-glykoproteiny (Pgp), což jsou molekuly účastnící se na membránovém transportu ve spojitosti s MDR. MDR je zvláště problémová u nemocných postižených rakovinou a AIDS, kteří nereagují na obvyklou chemoterapii, protože chemoterapeutická léčiva jsou z buněk odčerpána Pgp. Nové sloučeniny jsou proto užitečné pro potencování jiných chemoterapeutických prostředků při léčbě a zvládání stavů vícelékové rezistence, jako rakoviny rezistentní vůči kombinované chemoterapii nebo AIDS rezistentního vůči kombinované chemoterapii.

e) Léčení proliferačních poruch, např. nádorů, hyperproliferačních kožních chorob a podobně.

f) Léčení plísňových infekcí.

g) Léčení a prevence zánětů, zejména potencováním účinku steroidů.

h) Léčení a prevence infekcí, zejména infekcí způsobených patogeny s faktory Mip nebo s faktory podobnými Mip.

i) Léčení předávkování FK-506, rapamycinu, imunosupresivních nových sloučenin a jiných imunosupresiv vázajících makrofilín.

Předmětem vynálezu jsou tedy zde popsané nové sloučeniny pro použití jako nové meziprodukty nebo jako farmaceutické prostředky, způsoby léčby nebo prevence shora uvedených poruch podáním účinného množství nové sloučeniny nemocnému, který ji potřebuje, použití nové sloučeniny při výrobě léčiva pro léčbu nebo prevenci shora uvedených poruch a farmaceutické prostředky obsahující novou sloučeninu v kombinaci nebo ve spojení s farmaceuticky přijatelným ředidlem nebo nosičem.

Většina zde popsaných nových sloučenin je vysoce imunosupresivní, zejména nové sloučeniny, které jsou O-substituovány na C40, a tyto nové sloučeniny jsou zvláště užitečné pro indikace aab, ale nikoliv pro indikaci i. Nové sloučeniny, které jsou méně imunosupresivní, zejména ty, které jsou O-substituovány pouze na C28, jsou zvláště užitečné pro indikace h a i, ale jsou méně vhodné pro indikace a nebo b.

Nové sloučeniny se používají podáním farmaceuticky přijatelné formy nemocnému, který potřebuje léčbu. Příslušné dávky nových sloučenin budou samozřejmě různé např. v závislosti na stavu, který má být léčen (například na typu nemoci nebo povaze rezistence), na požadovaném účinku a způsobu aplikace.

Obecně se však dosahuje vyhovujících výsledků po orálním podání dávek řádově od 0,05 do 5 nebo až do 10 mg/kg/den, například od 0,1 do 2 nebo do 7,5 mg/kg/den podaných najednou nebo v rozdělených dávkách 2 až 4x za den, nebo po parenterálním podání, např. intravenózně, například i. v. infuzí, v dávkách řádově od 0,01 do 2,5 až do 5 mg/kg/den, například od 0,05 nebo 0,1 do 1 mg/kg/den. Vhodné denní dávkování pro nemocné činí tedy řádově 500 mg p.o., např. řádově 5 až 100 mg p. o., nebo řádově od 0,5 do 125 až 250 mg i.v., např. řádově 2,5 až 50 mg

i.v.

Alternativně a dokonce s výhodou se dávkování upraví pro nemocného specifickým způsobem tak, aby byly zajištěny předem stanovené nejnižší účinné hladiny v krvi, např. tak, jak se určí technikou RIA. Dávkování nemocnému se tedy může upravit tak, aby bylo dosaženo rovnoměrných průběžných nejnižších účinných hladin, změřených technikou RIA, řádově od 50 nebo 150 do 500 nebo 1000 ng/ml, tj. analogicky s metodami dávkování běžně používanými pro cyklosporinovou imunosupresivní léčbu.

Nové sloučeniny se mohou podávat jako jediná účinná složka nebo společně s jinými léky. Například při imunosupresivních aplikacích jako je prevence a léčba reakce štěpu vůči příjemci, odhojení transplantátu nebo autoimunní onemocnění se nové sloučeniny mohou použít v kombinaci s cyklosporinem. FK-506 nebo jejich imunosupresivními deriváty, kortikosteroidy, azathioprinem, imunosupresivními monoklonálními protilátkami, např. monoklonálními protilátkami vůči CD3, CD4, CD25, CD28 nebo CD45 a 7 nebo jinými imunomodulačními sloučeninami. Pro protizánětové aplikace se mohou nové sloučeniny používat v kombinaci s jinými protizánětovými prostředky, např. protivirovými léky nebo antibiotiky.

Nové sloučeniny se aplikují libovolnou obvyklou cestou, zejména enterálně, např. orálně, například ve formě roztoků pro vypití, tablet nebo tobolek, nebo parenterálně, například ve formě injekčních roztoků nebo suspenzí. Vhodné formy dávkovačích jednotek pro orální aplikaci obsahují např. 1 až 50 mg sloučeniny podle vynálezu, obvykle 1 až 10 mg. Farmaceutické prostředky obsahující nové sloučeniny se mohou připravit analogicky jako farmaceutické prostředky obsahující rapamycin, např. jak je popsáno v EPA 0 041 795, což bude zřejmé odborníkům v tomto oboru.

Farmakologická účinnost nových sloučenin je demonstrována např. následujícími testy:

1. Reakce na smíšené lymfocyty (MLR)

Reakce na smíšené lymfocyty byla původně vyvinuta v souvislosti s alotransplantáty, ke stanovení tkáňové kompatibility mezi potenciálními dárci orgánů ajejich příjemci, aje jedním z nejlépe vypracovaných modelů imunitní reakce in vitro. Myší model MLR, např. jak je popsán v Immunological Methods, L. Lefkovits a B. Peris, Eds., Academie Press, Μ. Y. str. 227 až 239 (1979), se používá k demonstrování imunosupresivního účinku nových sloučenin. Slezinné buňky (0,5 x 10⁶) z myši Balb/c (samice, 8 až 10 týdnů) se inkubují 5 dní společně s 0,5 x 10⁶ ozářenými (2000 rad) nebo mitomycinem C zpracovanými slezinnými buňkami myši CBA (samice, 8 až 10 týdnů). Ozářené alogenní buňky vyvolávají proliferační odpověď v slezinných buňkách myši Balb/c, která se může změřit inkorporací značeného prekursoru do DNA. Protože stimulátorové buňky jsou ozářeny (nebo mitomycinem C zpracované), nereagují na buňky myši Balb/c proliferací, ale zachovávají si svou antigenecitu. Antiproliferační účinek nových sloučenin na buňky myši Balb/c se měří při různých ředěních a vypočte se koncentrace, při které se dosahuje 50 % inhibice proliferace buněk (IC50). Inhibiční schopnost testovaného vzorku se může srovnat s rapamycinem a vyjádřit jako relativní IC50 (tj. IC₅otestovaného vzorku/IC₅o rapamycinu).

2. Proliferace zprostředkovaná IL-6

Schopnost nových sloučenin zasahovat do signálních cest ve spojitosti s růstovým faktorem se stanoví s použitím buněčné linie myšího hybridomu závislé na interleukinu-6 (IL-6). Pokus se provede na mikrotitračních destičkách s 96 jamkami. Kultivuje se 5000 buněk/jamka v prostředí prostém séra (jak je popsali Μ. H. Schreier a R. Tees v Immunological Methods, I. Lefkovits a B. Pemis, Academie Press 1981, sv. II, str. 263 až 275), doplněného 1 ng rekombinantního IL6/ml. Po 66 hodinách inkubace za přítomnosti nebo nepřítomnosti testovaného vzorku se buňky pulzují 1 pCi (3-H)thymidinu/buňka dalších 6 hodin, odeberou se a spočítají kapalným scintilátorem. Inkorporace (3-H)thymidinu do DNA je ve vzájemném vztahu se zvýšením počtu buněk aje tedy měřítkem proliferace buněk.

Série ředění testovaných vzorků umožňuje vypočítat koncentraci, při které dochází k 50 % inhibici proliferace buněk (IC₅₀). Inhibiční schopnost testovaného vzorku se může srovnat s rapamycinem a vyjádřit jako relativní IC50 (tj· IC₅₀ testovaného vzorku/IC₅o rapamycinu).

-6CZ 283333 B6

3. Zkouška na vázání makrofilinu

O rapamycinu a strukturně příbuzném imunosupresivu FK-506 je známo, že se váží in vivo na makrofilin-12 (známý také jako protein vázající FK-506 nebo FKBP-12) a o této vazbě se má zato, že souvisí s imunosupresivní účinností těchto sloučenin. Nové sloučeniny se také silně váží na makrofilin-12, jak je demonstrováno kompetitivním testem vázání.

Při tomto testu se použije FK-506 vázaný na BSA k pokrytí mikrotitračních jamek. Biotinovaný rekombinantní lidský makrofilin-12 (biot-MAP) se nechá vázat v přítomnosti nebo nepřítomnosti testovaného vzorku na imobilizovaný FK-506. Po promytí (k odstranění nespecificky vázaného makrofilinu) se vázaný biot-MAP vyhodnotí inkubací s konjugátem streptavidinu a alkalické fosfatásy, následované promytím a následujícím přídavkem pnitrofenylfosfátu jako substrátu. Odečtená hodnota je OD při 405 nm. Vazba testovaného vzorku na biot-MAP má za následek snížení množství biot-MAP vázaného na FK-506 a tedy snížení OD405. Série ředění testovaného vzorku umožňuje stanovit koncentraci poskytující 50 % inhibici vazby biot-MAP na imobilizovaný FK-506 (IC50). Inhibiční schopnost testovaného vzorku se srovná s IC₅₀ volného FK-506 jako standardu a vyjádří se jako relativní IC₅₀ (tj. IC₅₀ testovaného vzorku/IC₅₀ volného FK-506).

4. Lokalizovaná reakce štěpu vůči příjemci (GvH)

Účinnost nových sloučenin in vivo je prokázána na vhodném zvířecím modelu, jak popsáno např. ve Ford a spol. Transpantation 10 (1970) 258. Slezinné buňky (1 x 10⁷) z 6 týdnů starých krysích samic Wistar/Furth (WF) se aplikují injekčně subkutánně v den 0 do levé zadní tlapky krysích samic (F344 x WF)Fi o hmotnosti přibližně 100 g. V této aplikaci zvířatům se pokračuje po 4 následující dny a 7. den se jim odeberou podkolenní lymfatické uzliny a zváží. Rozdíl mezi hmotností obou lymfatických uzlin se vezme za základ pro vyhodnocení reakce.

5. Reakce ledvinného alotransplantátů v kryse

Jedna ledvina ze samice krysy físher 344 se transplantuje do ledvinné cévy krysího příjemce WF po jednostranné (levostranné) nefrektomii koncem ke konci. Spojení močovodu je též koncem ke konci. Léčba začíná v den transplantace a pokračuje 14 dní. Sedm dnů po transplantaci se provede kontralaterální nefrektomie, takže příjemce transplantované ledviny zůstává výhradně na funkci této ledviny. Přežití příjemce štěpu se bere za kriterium funkčnosti štěpu.

6. Experimentálně vyvolaná alergická encefalomyelitida (EAE) u krys

Účinnost nových sloučenin při EAE se změří např. postupem popsaným v Levine and Wenk, Amer. J. Path 47 (1965) 61, McFarlin a spol. J. Immunol. 113 (1974) 712, Borel, Transplant. and Clin. Immunol. 13 (1981) 3. EAE je široce zavedený model pro roztroušenou sklerózu. Samcům krys Wistar se podá injekčně do zadních tlapek směs hovězí míchy a kompletního Freundova adjuvantu. Symptomy nemoci (ochrnutí ocasu a obou zadních nohou) se obvykle vyvinou během 16 dnů. Zaznamená se počet onemocnělých zvířat jakož i doba počátku nemoci.

7. Arthritida vyvolaná pomocí Freundova adjuvantu

Účinnost proti experimentálně vyvolané arthritidě je demonstrována za použití postupu popsaného např. ve Winter and Nuss. Arthrithis and Rheumatism 9 (1966) 394, Billingham and Davies. Handbook of Experimental Pharmacol. (Vane and Ferreira Eds. Springer-Verlag, Berlín) 50/11 (1979) 108 až 144. Krysám OFA a Wistar (samci nebo samice, 150 g tělesné hmotnosti) se podá podkožní injekcí do kořene ocasu nebo do zadní tlapky 0,1 ml minerálního oleje obsahujícího 0,6 mg lyofilizovaných, teplem usmrcených Mycobacterií smegmatis. Při vyvíjení modelu arthritidy se s léčbou začne ihned po injekci adjuvantu (1. až 18. den), vjiž rozvinutém

-7CZ 283333 B6 modelu arthritidy se s léčbou začne 14. den, když je dobře vyvinut sekundární zánět (14. až 20.

den). Na konci pokusu se změří otok kloubů pomocí posuvného mikroměřítka. ED₅₀ je orální dávka v mg/kg, která zmenšuje otok (primární nebo sekundární) na polovinu oproti kontrolám.

8. Účinnost protinádorová a proti MDR

Protinádorová účinnost nových sloučenin ajejich schopnost zvýšit funkci protinádorových prostředků zmenšením vícelékové rezistence je demonstrována např. aplikací protinádorového prostředku, např. kolchicinu nebo etoposidu, vícelékově rezistentním buňkám a buňkám citlivým na léky in vitro nebo zvířatům, která mají nádory nebo infekce rezistentní proti kombinované chemoterapii, s nebo bez společné aplikace nových sloučenin, které mají být testovány, a aplikací samotné nové sloučeniny.

Při provádění těchto testů se používá libovolná vhodná buněčná linie a kontrolní (parentální) buněčná linie, vytvořená např., jak popsali Ling a spol., J. Cell. Physiol. 83, 103 až 116 (1974) a Bech-Hansen a spol. J. Cell. Physiol. 88, 23 až 32 (1976). Konkrétními zvolenými klony jsou linie CHR (subklon C553, 2), rezistentní vůči více lékům (např. rezistentní vůči kolchicinu) a parentální, senzitivní linie AUX 81 (subklon ABI Sil).

Protinádorová účinnost a účinnost proti MDR in vivo je demonstrována např. u myši injekční aplikací rakovinových buněk rezistentních vůči více lékům a rakovinových buněk senzitivních na léky. Sublinie Ehrlichova ascitického karcinomu (EA) rezistentní vůči léčivé substanci DR, VC, AM, ET, TE nebo CC se vyvinou sekvenčním transferem buněk EA na následující generace hostitelské myši BALB/c metodami popsanými v Slater a spol., J. Clin. Invest. 70, 1131 (1982).

Podobných výsledků může být dosaženo použitím testovacích modelů nových sloučenin srovnatelného typu, např. in vitro, nebo použitím testovacích zvířat infikovaných virovými kmeny rezistentními vůči lékům a virovými kmeny senzitivními na léky, bakteriálními kmeny rezistentními na antibiotika (např. penicilín) a bakteriálními kmeny senzitivními na antibiotika, plísňovými kmeny antimykoticky rezistentními a senzitivními jakož i protozoálními kmeny rezistentními vůči lékům, např. Plasmodiálními kmeny, například v přírodě se vyskytujícími podkmeny Plasmodia falciparum, které mají získanou rezistenci vůči chemoterapeutickým, antimalarickým lékům.

9. Vázání FKBP

Některé z nových sloučenin nejsou imunosupresivní, zejména ty, které jsou O-substituované pouze na C28, jako například 28-O-methylrapamycin. To může být demonstrováno standardními testy in vitro ve srovnání s FK506 a rapamycinem. Například o FK506 je známo, že je silným inhibitorem transkripce IL-2, jak může být demonstrováno testem pomocí IL-2 reportér genu. Rapamycin, ačkoliv není aktivní v testu pomocí IL-2 reportér genu, působí silně inhibičně na proliferaci T buněk odvislé na IL-6. Obě sloučeniny jsou velmi silnými inhibitory reakce smíšených lymfocytů. Neimunosupresivita může být též demonstrována na shora uvedených in vivo medelech 1 až 7. I ty nové sloučeniny, které nejsou imunosupresivní, se však vážou na makrofilin, který má určitá použití, pro která je neimunosupresivita výhodná.

Ty nové sloučeniny, které se váží silně na makrofilin a které samy o sobě nejsou imunosupresivní, se mohou používat při léčbě předávkování imunosupresivy vázajícími makrofilin, jako je FK506, rapamycin a imunosupresivní nové sloučeniny.

10. Potencování steroidů

Schopnost nových sloučenin vázat makrofilin je též činí užitečnými pro potencování účinku kortikosteroidů. Kombinovanou léčbou sloučeninami podle vynálezu a kortikosteroidy, jako

-8CZ 283333 B6 dexametazonem, se dosáhne velmi zvýšené steroidní účinnosti. To může být demonstrováno testem pomocí MMTV-CAT (virus nádoru myší prsní žlázy - chloramfenikolacetyltransferasa) reportér genu, např. jak je popsán vNING A SPOL., J. Biol. Chem. (1993) 268:6073. Tento synergický účinek umožňuje snížit dávky kortikosteroidů, čímž se sníží nebezpečí vedlejších účinků v některých případech.

11. Inhibice faktorů Mip a faktorů podobných Mip

Nové sloučeniny dále váží a blokují řadu faktorů Mip (potenciátor infekčnosti makrofágů) a faktorů podobných Mip, které jsou strukturně podobné s makrofilinem. Faktory Mip a jim podobné faktory jsou virulentní faktory produkované širokou paletou patogenů včetně těch zrodů Chlamidia, např. Chlamidia trachomatis, Neisseria, např. Neisseria meningitidis, aLegionella, např. Legionella pneumophilia, a také obligátně parazitickými členy řádu Rickettsiales. Tyto faktory hrají kritic kou úlohu při vývinu intracelulámí infekce. Účinnost nových sloučenin při snížení infekčnosti patogenů, které produkují faktory Mip nebo jim podobné faktory, může být znázorněna srovnáním infekčnosti patogenů v buněčné kultuře za přítomnosti nebo za nepřítomnosti makrolidů, např. použitím metod popsaných v Lundmose a spol., Mol. Mikrobiol. (1993), 7, 777. Těmto neimunosupresivním sloučeninám podle vynálezu se dává přednost při použití pro tuto indikaci z toho důvodu, že nejsou imunosupresivní, takže neohrožují přirozenou imunitní obranu těla proti patogenům.

Nové sloučeniny jsou také užitečné při pokusech zjistit přítomnost nebo množství sloučenin vázajících makrofilin, např. v konkurenčních pokusech pro diagnostické nebo skríningové účely. Předmětem vynálezu je tedy též použití nových sloučenin jako skríningového prostředku ke zjištění přítomnosti sloučenin vázajících makrofilin v testovaném roztoku, např. krvi, krevním séru nebo zkušební živné půdě, která má být zkontrolována. S výhodou se nová sloučenina imobilizuje v mikrotitračních jamkách a pak se nechá navázat v přítomnosti nebo nepřítomnosti testovacího roztoku na značený makrofilin-12 (FKBP-12). Alternativně se v mikrotitračních jamkách imobilizuje FKBP-12 a nechá se vázat v přítomnosti a nepřítomnosti testovaného roztoku na novou sloučeninu, která byla značena, např. fluorem, enzymaticky nebo radioaktivním izotopem, například na novou sloučeninu, která byla O-substituována na C-40 nebo/a C28 značící skupinou. Destičky se omyjí a změří se množství vázané značené sloučeniny. Množství látky vázající makrofilin v testovaném roztoku je zhruba nepřímo úměrné množství vázané značené sloučeniny. Pro kvantitativní analýzu se sestrojí standardní vazební křivka s použitím známých koncentrací sloučeniny vázané na makrofilin.

Příklady provedení vynálezu

V následujících příkladech jsou uvedeny charakteristické spektroskopické údaje pro usnadnění identifikace. Píky, které se významně neliší od rapamycinu, zahrnuty nejsou. Biologické údaje jsou vyjádřeny jako relativní IC₅o ve srovnání s rapamycinem v případě testů reakce na smíšené lymfocyty (MLR) a proliferace závislé na IL-6 a ve srovnání s FK-506 v testu na vázání makrofilinu (MBA). Vyšší IC₅o odpovídá nižší vazební afinitě.

Příklad 1

40-O-benzylrapamycin

K míchanému roztoku 183 mg (0,200 mmol) rapamycinu v 2,1 ml směsi cyklohexanu s methylenchloridem v poměru 2:1 se přidá 75 μΐ (0,402 mmol) benzyltrichloracetimidátu, následované 2,6 μΐ (29 μιηοΐ, 15 mol %) trifluormethansulfonové kyseliny, počemž směs ihned

-9CZ 283333 B6 zežloutne. Po 3 hodinách se směs zředí ethylacetátem a rychle se ochladí 10 % vodným roztokem uhličitanu sodného. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje dvakrát ethylacetátem. Spojený organický roztok se promyje 10 % roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vysuší se nad bezvodým síranem sodným, zfíltruje se a odpaří za sníženého tlaku. Odparek se vyčistí sloupcovou chromatografií na silikagelu s použitím směsi hexanu s ethylacetátem v poměru 50:50 jako elučního činidla, čímž se získá 40-O-benzylrapamycin ve formě bílého amorfního produktu:

'H NMR (CDC1₃)Ó 0,73 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,73 (3H, s), 3,12 (4H, s a m), 3,33 (3H, s), 3,49 (3H, s), 4,15 (1H, šd), 4,65 (1H, d), 4,71 (1H, d), 7,22-7,38 (5H, m); MS (FAB) m/z 1026 ((M+Na*)), 972 ((M-OCH₃)*), 954 ((M-(OCH₃+H₂O))*).

MBA (rel. IC50)1,8

IL-6 dep. prol. (rel. IC50)10

MLR (rel. IC50)110

Příklad 2

40-O-(4'-hydroxymethyl)benzylrapamycin

a) 40-O-(4'-(terc.butyldimethylsilyl)oxymethyl)benzylrapamycin

Do míchaného roztoku 345 μΐ (2,0 mmol) anhydridu kyseliny triflové v 5 ml methylenchloridu, chlazeného na -78 °C, se přidá roztok 504 mg (2,0 mmol) 4-(terc.butyldimethylsilyl)oxymethylbenzylalkoholu a 820 mg (4,0 mmol) 2,6-di-terc.butyl—4-methylpyridinu v 5 ml methylenchloridu. Výsledná směs se zahřeje na -20 °C a v míchání se pokračuje při této teplotě 0,5 hodiny. Směs se pak ochladí znovu na -78 °C a přidá se roztok 914 mg (1,0 mmol) rapamycinu v 5 ml methylenchloridu. Tato směs se nechá přes noc ohřát na teplotu místnosti a pak se prudce ochladí 10% roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje ethylacetátem. Spojený organický roztok se promyje nasycenou solankou, vysuší se nad síranem sodným, přefiltruje se za sníženého tlaku a odpaří. Odparek se vyčistí sloupcovou chromatografií na silikagelu s použitím směsi hexanu s ethylacetátem v poměru 50:50 jako elučního činidla, čímž se získá 40-O-(4^,-(terc.butyldimethylsilyl)oxymethyl)benzylrapamycin ve formě bílé pěny:

MS (FAB) m/z 1170 ((M+Na)*) , 1098 ((M-(OCH₃+H₂O))*).

b) 40-O-(4'-hydroxymethyl)benzylrapamycin

Do míchaného roztoku 98 mg (0,093 mmol) sloučeniny, získané v příkladu 2, v 2 ml acetonitrilu, chlazeného na 0 °C, se přidá 0,2 ml HF-pyridinu. Výsledná směs se míchá 2 hodiny a ochladí se prudce roztokem hydrogenuhličitanu sodného, načež se extrahuje ethylacetátem. Organický roztok se promyje solankou, vysuší se nad síranem sodným, zfíltruje se a odpaří. Odparek se vyčistí sloupcovou chromatografií na silikagelu s použitím směsi hexanu s ethylacetátem v poměru 20:80 jako elučního činidla, čímž se získá v nadpisu uvedená sloučenina ve formě bílé pěny:

'H NM (CDC1₃) δ 0,73 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,74 (3H, s), 3,22 (1H, m), 4,67 (4H, m), 7,35 (4H, m), MS (FAB) m/z 1056 ((M+Na)*), 1002 ((M-OCH₃)*), 984 ((M-(OCH₃+ H₂O))*), 966 ((M-(OCH₃+2 H₂O))*), 934 ((M-(OCH₃+CH₃OH+2 H₂O))*).

- 10CZ 283333 B6

MBA (rel. IC50)2,7

IL-6 dep. prol. (rel. IC50)3,9

MLR (rel. IC50)3

Příklad 3

40-O-(4'-( 1,2-dihydroxyethyl))benzy Irapamycin

a) 40-O-(4'-(2,2-dimethyl-l ,3-dioxolan-4-yl))benzylrapamycin

V 10 ml směsi cyklohexanu s methylenchloridem v poměru 1:1 se rozpustí 452 mg (1, 24 mmol) 4-(2,2-dimethyI-l,3-dioxolan-4-yl)benzyltrichloracetamidátu, následované 0,14 ml (0,64 mmol) 2,6-di-terc.butylpyridinu a 56 μΐ (0,64 mmol) trifluormethansulfonové kyseliny. K této směsi se přidá roztok 587 mg (0,64 mmol) rapamycinu ve 2 ml methylenchloridu. Reakční směs se míchá přes noc při teplotě místnosti a prudce se ochladí roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje dvakrát ethylacetátem. Spojený organický roztok se promyje nasycenou solankou, vysuší se nad bezvodým síranem sodným, zfiltruje se a odpaří. Odparek se vyčistí sloupcovou chromatografií na silikagelu s použití směsi hexanu s ethylacetátem v poměru 50:50 jako elučního činidla, čímž se získá 40-O-(4'-(2,2-dimethyll,3-dioxolan-4-yl))benzylrapamycin ve formě bílého, amorfního, pevného produktu:

'H NMR (CDCfi) δ 0,73 (1H, dd), 1,48 (3H, s), 1,55 (3H, s), 1,65 (3H, s), 1,74 (3H, s), 3,67 (3H, m), 4,28 (1H, dd), 4,62 (1H, d), 4,69 (1H, d), 5,06 (1H, dd), 7,33 (4H, m); MS (FAB) m/z 1126 ((M+Na)*), 1072 ((M-OCH₃)*), 1054 ((M-(OCH₃+H₂O))*), 1014 ((M-(OCH₃+CH₃COCH₃))*), 996 ((M-(OCH₃+H₂O+ CH₃COCH₃))*), 978 ((M-(OCH₃+2 H₂O+CH₃COCH₃))*).

b) 40-O-(4'-( 1,2-dihydroxyethyl))benzylrapamycin

K. roztoku 90,7 mg (0,08 mmol) 40-O-(4'-(2,2-dimethyl-l,3-dioxolan-4-yl))benzylrapamycinu v 4 ml methanolu se přidá 1 ml IN vodné HC1. Po 2 hodinách se směs prudce ochladí vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a extrahuje se dvakrát ethylacetátem. Organický roztok se promyje solankou, vysuší se nad bezvodým síranem sodným a odpaří se. Odparek se vyčistí sloupcovou chromatografií na silikagelu s použitím ethylacetátu jako elučního činidla. Získá se tak v nadpisu uvedená sloučenina ve formě bílé pěny:

'HNM (CDCfi) δ 0,73 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,74 (3H, s), 3,70 (4H, m), 4,63 (1H, d), 4,69 (1H, d), 4,80 (1H, dd), 7,33 (4H, m); MS (FAB) m/z 1086 ((M+Na)*), 1032 ((M-OCH₃)*), 1014 ((M-(OCH₃+H₂O))*), 996 ((M-(OCH₃+2 H₂O))*).

MBA (rel. IC50)0,92

IL-6 dep. prol. (rel. IC50)10,5

MLR (rel. IC50)22

Příklad 4

40-O-allylrapamycin

K míchanému roztoku 0,33 ml (2,01 mmol) anhydridu kyseliny triflové v 10 ml methylenchloridu, chlazenému na -78 °C, se pomalu přidá roztok 0,14 ml (2,06 mmol) allylalkoholu a 0,42 g (2,04 mmol) 2,6-di-terc.butyl-4-methylpyridinu v 5 ml methylenchloridu. Výsledný zelenavý roztok se míchá po dobu 1,5 hodiny a přidá se roztok 915 mg (1,00 mmol) rapamycinu

- 11 CZ 283333 B6 a 0,42 g (2,04 mmol) 2,6-di-terc.butyl-4-methylpyridinu v 5 ml methylenchloridu. V míchání se pokračuje 0,5 hodiny při -78 °C a pak se směs ohřeje na teplotu místnosti. Za další 1 hodinu se směs prudce ochladí vodným roztokem hydrcgenuhličitanu sodného a vrstvy se oddělí. Vodná vrstva se extrahuje dvakrát ethylacetátem. Spojený organický roztok se promyje vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a solankou, vysuší se nad bezvodým síranem sodným, zfiltruje se a odpaří. Výsledný zelený olej se vyčistí sloupcovou chromatografií na silikagelu s použitím směsi hexanu s ethylacetátem v poměru 60:40, čímž se získá v nadpisu uvedená sloučenina ve formě bezbarvého amorfního pevného produktu:

*H NMR (CDC1₃) δ 0,72 (IH, dd), 1,65 (3H, s), 1,74 (3H, s), 3,05 (IH, m), 4,13 (2H, šd), 5,14 (2H, m), 5,27 (2H, m), 5,92 (2H, m); MS (FAB) m/z 976 ((M+Na)*), 922 ((M-OCH₃)*), 904 ((M-(OCH₃+H₂O))*), 886 ((M-(OCH₃+2 H₂O))*), 872 ((M-(2CH₃OH+OH))*), 854 ((M(OCH₃+CH₃OH+2 H₂O))*).

MBA rel. IC501

IL-6. prol. (rel. IC50)8

MLR (rel. IC50)260

Příklad 5

40-O-(3'-(2,2-dimethyl-l,3-dioxolan-4(S)-yl-prop-2'-en-r-yl)rapamycin

K míchanému roztoku 0,64 g (4,00 mmol) E-(4S)-4,5-O,O-isopropylidenpent-2-en-l,4,5triolu a 1,26 g (6,00 mmol) 2,6-di-terc.butyl—4-methylpyridinu v 20 ml methylenchloridu, chlazenému na -78 °C, se přidá 0,82 ml (5 mmol) anhydridu kyseliny triflové. Výsledná směs se míchá při této teplotě po dobu 2 hodin a přidá se roztok 1,82 g (2,00 mmol) rapamycinu a 1,26 g (6,00 mmol) 2,6-di-terc.butyM--methylpyridinu v 5 ml methylenchloridu. Směs se nechá přes noc postupně ohřát na teplotu místnosti a pak se prudce ochladí vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje třikrát ethylacetátem. Organický roztok se promyje vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a solankou, vysuší se nad bezvodým síranem sodným, zfiltruje se a odpaří. Odparek se vyčistí sloupcovou chromatografií na silikagelu s použitím směsi he xanu s ethylacetátem v poměru 40:60, čímž se získá v nadpisu uvedená sloučenina ve formě bílého pevného produktu:

’HNMR(CDC1₃) δ 0,72 (IH, dd), 1,38 (3H, s), 1,42 (3H, s), 1,65 (3H, s), 1,73 (3H, s), 3,06 (IH, m), 3,58 (2H, m) , 4,08 (IH, dd), 4,15 (2H, m), 4,52 (IH, šdd), 5,72 (IH, m), 5,88 (IH, m); MS (FAB) m/z 1076 ((M+Na)*), 1022 ((M-CH₃)*), 1004 ((M-OCH₃+H₂O))*), 964 ((MOCH₃+CH₃COCH₃))*), 946 ((M-OCH₃+2 H₂O+CH₃COCH₃))*).

MBA (rel. IC50)0,64

IL-6 dep. prol. (rel. IC50)11

MLR (rel. IC50)8

Příklad 6 (2'E,4'S)-40-O-(4,5'-dihydroxypent-2'-en-r-yl)rapamycin

Podmínky popsané v příkladu 3, stupeň b), aplikované na sloučeninu získanou v předcházejícím příkladu, následované čištěním sloupcovou chromatografií na silikagelu s použitím směsi ethylacetátu s methanolem jako elučního činidla, poskytují v nadpisu uvedenou sloučeninu ve formě bílé pěny:

- 12CZ 283333 B6 ’Η NMR (CDC1₃) δ 0,68 (1H, dd), 3,04 (1H, m), 4,18 (5H, m), 5,75 (1H, dd), 5,88 (1H, m); MS (FAB) m/z 1036 ((M+Na)*), 1013 (M*), 995 ((M-H₂O)*, 982 ((M-OCH₃)*), 964 ((M(OCH₃3+H₂O))*), 946 ((M-(OCH₃+2 H₂O))*), 832 ((M-(2CH₃OH+OH))*), 914 ((M(OCH3+CH3OH+2 H₂O))*).

MBA (rel. IC50)1,7

11-6 dep. prol. (rel. IC50)12

MLR (rel. IC50)3,5

Příklad 7

40-O-(2-hydroxy)ethoxykarbonylmethylrapamycin

a) 40-O-(2-(terc.butyldimethylsilyl)oxy)ethoxykarbonylmethylrapamycin

K míchanému roztoku 2,74 g (3,00 mmol) rapamycinu a 30 mg (0,06 mmol) dihydrátu octanu rhodnatého v 30 ml methylenchloridu se přidá roztok 0,38 ml (3,60 mmol) 2-(terc.butyldimethyl silyl)oxyethyldiazoacetátu v 10 ml methylenchloridu v průběhu 5 hodin. Po ukončeném přidávání se pokračuje v míchání další jednu hodinu, načež se reakce ukončí IN vodným roztokem HC1. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje ethylacetátem. Spojený organický roztok se promyje vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a solankou, vysuší se nad bezvodým síranem sodným, zfiltruje se a odpaří. Odparek se vyčistí sloupcovou chromatografii na silikagelu s použitím směsi hexanu s ethylacetátem v poměru 40:60 jako elučního činidla, čímž se získá 4Q-O-(2-(terc.butyldimethylsilyl)oxy)ethoxykarbonylmethy!rapamycin:

’H NMR (CDClj) δ 0,06 (6H, s), 0,68 (1H, dd), 0,88 (9H, s), 1,64 (3H, s), 1,73 (3H, s), 3,12 (5H, s a m), 3,81 (2H, dd), 4,19 (2H, dd), 4,32 (2H, s); MS (FAB) m/z 1152 ((M+Na)*), 1080 ((M(OCH₃+H₂O))*).

b) 40-O-(2-hydroxy)ethoxykarbonylmethylrapamycin

K míchanému roztoku 81 mg (0,07 mmol) 40-O-(2-(terc.butyldimethylsilyl)oxy)ethoxykarbonylmethylrapamycinu v 1,5 ml acetonitrilu, chlazenému na 0 °C, se přidá 0,15 ml HFpyridinu. Po 2 hodinách se reakce ukončí vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Směs se extrahuje ethylacetátem. Organický roztok se promyje solankou, vysuší se nad bezvodým síranem sodným, zfiltruje se a odpaří. Odparek se vyčistí chromatografícky s použitím ethylacetátu jako elučního činidla, čímž se získá v nadpisu uvedená sloučenina ve formě bílého pevného produktu:

*H NMR (CDCI3) δ 0,70 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, s), 3,13 (5H, s a m), 3,85 (3H, m), 4,25 (5H, m); MS (FAB) m/z 1038 ((M+Na)*), 984 ((M-OCH₃)*), 966 ((M-(OCH₃+H₂O))*, 948 ((M-(OCH₃+2 H₂O))*).

MBA (rel. IC50)4

IL-6 dep. prol. (rel. IC50)9,7

MLR (rel. IC50)2,1

- 13CZ 283333 B6

Příklad 8

40-O-(2-hydroxy)ethylrapamycin

a) 40-O-(2-(terc.butyldimethylsilyl)oxy)ethylrapamycin

Roztok 9,14 g (10 mmol) rapamycinu a 4,7 ml (40 mmol) 2,6-lutidinu v 30 ml toluenu se zahřeje na 60 °C a přidá se k němu roztok 6,17 g (20 mmol) 2-(terc.butyldimethylsilyl)oxyethyltriflátu a 2,35 ml (20 mmol) 2,6-lutidinu v 20 ml toluenu. Tato směs se míchá po dobu 1,5 hodiny. Pak se přidají v intervalu 1,5 hodiny dvě dávky roztoku 3, 08 g (10 mmol) triflátu a 1,2 ml (10 mmol) 2,6-lutidinu v 10 ml toluenu. Po přidání poslední dávky se pokračuje po dobu 2 hodin v míchání při 60 °C a výsledná hnědá suspenze se zfiltruje. Filtrát se zředí ethylacetátem a promyje se vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a solankou. Organický roztok se vysuší nad bezvodým síranem sodným, zfiltruje se a odpaří. Odparek se vyčistí sloupcovou chromatografií na silikagelu s použitím směsi hexanu s ethylacetátem v poměru 40:60 jako elučním činidlem, čímž se získá 40-O-(2-(terc.butyldimethylsilyl)oxy)ethylrapamycin ve formě bílého pevného produktu:

'H NMR (CDCIj) δ 0,06 (6H, s), 0,72 (1H, dd), 0,90 (9H, s), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, s), 3,02 (1H, m), 3,63 (3H, m), 3,72 (3H, m); MS (FAB) m/z 1094 ((M+Na)*) , 1022 ((M-(OCH₃+H₂O))*).

b) 40-O-(2-hydroxy)ethylrapamycin

K míchanému roztoku 4,5 g (4,2 mmol) 40-O-(2-(terc.butyldimethylsilyl)oxy)ethylrapamycinu v 20 ml methanolu, chlazenému na 0 °C, se přidají 2 ml IN HC1. Tento roztok se míchá 2 hodiny a zneutralizuje se vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Směs se extrahuje třemi díly ethylacetátu. Organický roztok se promyje vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a solankou, vysuší se nad bezvodým síranem sodným, zfiltruje se a odpaří. Po vyčištění sloupcovou chromatografií na silikagelu s použitím ethylacetátu jako elučního činidla se získá v nadpisu uvedená sloučenina ve formě bílého pevného produktu:

’H NMR (CDClj) δ 0,72 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, s), 3,13 (5H, s a m), 3,52 - 3,91 (8H, m); MS (FAB) m/z 980 ((M+Na)*) , 926 ((M-OCH₃)*), 908 ((M-(OCH₃+H₂O))*, 890 ((M(OCH₃+2 H₂O))*), 876 (M-(2CH₃OH+OH))*), 858 ((M-(OCH₃+ CH₃OH+2 H₂O))*).

MBA rel. IC50)2,2

IL-6 dep. prol. (rel. IC50)2,8

MLR (rel. IC50)3,4

Příklad 9

40-O-(3-hydroxy)propylrapamycin

a) 40-O-(3-(terc.butyldimethylsilyl)oxypropylrapamycin

Stejným postupem, jaký je popsán v příkladu 8, stupeň a), použitím 3-(terc.butyldimethylsilyl)oxyprop-l-yltriflátu se získá 40-O-(3-(terc.butylmethylsilyl)oxy)propylrapamycin:

'H NMR (CDC1₃ δ 0,05 (6H, s), 0,72 (1H, dd), 0,90 (9H, s), 1,65 (3H, s), 1,74 (3H, s), 1,77 (2H, m), 3,03 (1H, m), 3,52 3,73 (7 H, m); MS (FAB) m/z 1108 ((M+Na)*), 1036 ((M(OCH₃+H₂O))*).

- 14CZ 283333 B6

b) 40-O-(3-hydroxy)propylrapamycin

Zpracováním sloučeniny připravené ve stupni a) za podmínek popsaných v příkladu 8, stupeň b, se získá v nadpisu uvedená sloučenina:

’H NM (CDC1₃) δ 0,72 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, s), 1, 80 (2H, m), 3,05 (1H, m), 3,55 3,91 (8H, m), MS (FAB) m/z 994 ((M+Na)*), 940 ((M-OCHj)*), 922 ((M-(OCH₃+ H₂O))*), 904 ((M-(OCH₃+2 H₂O))*), 872 ((M-(OCH₃+CH₃OH+2 H₂O))*).

MBA (rel. IC50)1,6

IL-6 dep. prol. (rel. IC50)2,7

MLR (rel. IC50)11

Příklad 10

40-O-(6-hydroxy)hexylrapamycin

a) 40-O-(6-(terc.butyldimethylsilyl)oxy)hexylrapamycin

Stejným postupem, jaký je popsán v příkladu 8, stupeň a), použitím 6-(terc.butyldimethylsilyl)oxyhex-l-yltriflátu se získá 40-(6-(terc.butyldimethylsilyl)oxy)hexylrapamycin:

MS (FAB) m/z 1150 ((M-Na)*).

b) 40-O-(6-hydroxy)hexylrapamycin

Zpracováním sloučeniny připravené ve stupni a) za podmínek popsaných v příkladu 8, stupeň b, se získá v nadpisu uvedená sloučenina:

’H NMR (CDC1₃) δ 0,72 (1H, dd), 1,38 (2H, m), 1,57 (4H, m), 1,65 (3H, s), 1,74 (3H, s), 3,02 (1H, m), 3,49 3,72 (8H, m): MS (FAB) m/z 1036 ((M+Na)*), 982 ((M-OCH₃)*), 964 ((M(OCH₃+H₂O)*),946((M-(OCH₃+2 H₂O))*),914((M-(OCH₃+CH₃OH+2 H₂O))*).

MBA (rel. IC50)0,8

IL-6 dep. prol. (rel. IC50)8,5

MLR (rel. IC50)18

Příklad 11

40-O-(2-(2-hydroxy)ethoxy)ethylrapamycin

a) 40-O-(2-(terc.butyldimethylsilyl)oxyethoxy)ethylrapamycin

Stejným postupem, jaký je popsán v příkladu 8, stupeň a), za použití 2-(2-(terc. Butyldimethylsilyl)oxyethoxy)ethyltriflátu se získá 40-O-(2-(terc.butyldimethylsilyl)okyothoxy)ethylrapamycin:

'HNMR (CDC1₃) δ 0,06 (6H, s), 0,71 (1H, dd), 0,88 (9H, s), 1,65 (3H, s), 1,74 (3H, s), 3,07 (1H, m), 3,51-3,79 (11H, m); MS (FAB) m/z 1138 ((M+Na)*), 1115 (M*), 1097 ((M-H₂O)*), 1084 ((M-OCH₃)*), 1066 ((M-(OCH₃+H₂O))*), 1048 ((M-(OCH₃+2 H₂O))*), 1034 ((M(2CH₃OH+OH))*), 1016 ((M-(OCH₃+ CH₃OH+2 H₂O))*).

- 15CZ 283333 B6

b) 40-O-(2-(2-hydroxy)ethoxy)ethylrapamycin

Zpracováním sloučeniny připravené ve stupni a) za podmínek popsaných v příkladu 8, stupeň b) se získá v nadpisu uvedená sloučenina:

'H NMR (CDC1₃) δ 0,72 (IH, dd),l,65 (3H, s), 1,74 (3H, s), 3,05 (IH, m), 3,51 - 3,77 (1 IH, m); MS (FAB) m/z 1024 ((M+Na)*), 1001 (M*), 983 ((M-H₂O)*), 970 ((M-OCH3)*) 952 ((M(OCH₃+H₂O))*, 934 ((M-COCH₃+2 H₂O))*), 920 ((M-(2CH₃OH+ OH))*), 902 ((M(OCH3+CH3OH+2 H₂O))*).

MB A (rel. IC50)1,2

IL-6 dep. prol. (rel. IC50)3,2

MLR (rel. IC50)2

Příklad 12

40-O-((3S)-2,2-dimethyldioxolan-3-yl)methylrapamycin

Stejným postupem, jaký je popsán v příkladu 8, stupeň a), se za použití triflátu glycerolacetonidu získá v nadpisu uvedená sloučenina:

’H NMR (CDCI3) δ 0,72 (IH, dd), 1,36 (3H, s), 1,42 (3H, s), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, s), 3,06 (IH, m), 3,55 (2H, m), 3,69 (3H, m), 4,06 (IH, dd), 4,26 (IH, m); MS (FAB) m/z 1050 ((M+Na)*), 996 ((M-OCH3)*), 978 ((M-(OCH₃+H₂O))*), 960 ((M-(OCH₃+2 H₂O))*).

MBA (rel. IC50)0,9

IL-6 dep. prol. (rel. IC50)8

MLR (rel. IC50)290

Příklad 13

40-0-((2 S)-2,3-dihydroxyprop-1 -y l)rapamyc in

Zpracováním sloučeniny připravené v předchozím příkladu za podmínek popsaných v příkladu 3 se získá v nadpisu uvedená sloučenina:

’H NMR (CDCI3) δ 0,72 (IH, dd), 1,65 (3H, s), 1,75 (3 H, s), 3,07 (IH, m), 3,68 (8H, m); MS (FAB) m/z 1010 ((M+ Na)*), 956 ((M-OCH3)*) , 938 ((M-(OCH3+H₂O)*), 920 ((M-(OCH₃+ 2 H₂O))*), 888 (( M4OCH3+CH3OH+2 H₂O))*).

MBA (rel. IC50)0,67

IL-6 dep. prol. (rel. IC50)9

MLR (rel. IC50)10

Příklad 14

40-O-(2-acetoxy)ethylrapamycin

K. míchanému roztoku 53 mg (0,055 mmol) 40-O-hydroxyethylrapamycinu v 2 ml methylenchloridu, chlazenému na 0 °C, se přidá 0,2 ml pyridinu, následované 0,02 ml (0,281 mmol)

- 16CZ 283333 B6 acetylchloridu. Směs se míchá 3 hodiny a zředí se ethylacetátem, načež se promyje vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, studenou IN HCI a znovu vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Organický roztok se vysuší nad bezvodým síranem sodným, zfiltruje se a odpaří. Odparek se vyčistí sloupcovou chromatografii na silikagelu s použitím směsi hexanu s ethylacetátem v poměru 30:70, čímž se získá v nadpisu uvedená sloučenina ve formě bílého pevného produktu:

’H NMR (CDC1₃) δ 0,72 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, s), 2,08 (3H, s), 3,07 (1H, m), 3,78 (2H, dd), 4,20 (2H, dd); MS (FAB) m/z 1022 ((M+Na)*), 999 (M*) , 982 ((M-OH)*), 968 ((MOCH₃)*), 950 ((M(OCH₃+H₂O))*), 932 ((M-(OCH₃+2 H₂O))*), 918 ((M-(2CH₃OH+OH))*), 900 ((M-(OCH₃+CH₃OH+2 H₂O))*).

MBA (rel. IC50)2

IL-6 dep. prol. (rel. IC50)7,6

MLR (rel. IC50)3,6

Příklad 15

40-O-(2-nikotinoyloxy)ethylrapamycin

Stejným postupem, jaký je popsán v předchozím příkladu, s použitím nikotinoylchloridhydrochloridu se získá v nadpisu uvedená sloučenina:

‘H NMR (CDC1₃) δ 0,72 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, s), 3,07 (1H, m), 3,94 (2H, dd), 4,49 (2H, t), 7,39 (1H, dd), 8,31 (1H, ddd)), 8,78 (1H, ddd) 9,24 (1H, dd), MS (FAB) m/z 1085 ((M+Na)*), 1063 ((M+H)*), 1045 ((M+OH)*), 1031 ((M-OCH₃+H₂O))*.

MBA (rel. IC50)11

IL-6 dep. prol. (rel. IC50)6,9

MLR (rel. IC50)5

Příklad 16

40-O-(2-(N-morfolino)acetoxy)ethylrapamycin

a) 40-O-(2-bromacetoxy)ethy lrapamyc in

Stejným postupem, jaký je popsán v příkladu 14, s použitím bromacetylchloridu se získá 40-0(2-bromacetoxy)ethy lrapamyc in:

'H NMR (CDC1₃) δ 0,72 (1H, dd), 1,67 (3H, s), 1,76 (3H, s), 3,03 (1H, m), 3,82 (2H, m), 3,87 (2H, s), 4,31 (2H, m); MS (FAB) m/z 1100, 1102 ((M+Ma)*), 1077 (M*), 1061 ((M-H₂0)*), 1046, 1048 ((M-OCH₃)*), 1028, 1030 ((M-(OCH₃+H₂O))*), 1012 ((M-(OCH₃+H₂O))*), 996 ((M-(2CH₃OH+OH))*), 980 ((M(OCH₃+CH₃OH+2 H₂O))*.

b) 40-O-(2-(N-morfolino)acetoxy)ethylrapamycin

K míchanému roztoku 54 mg (0,05 mmol) 40-O-(2-bromacetoxy)ethylrapamycinu v 0,2 N,Ndimethylformamidu, ochlazenému na -45 °C, se přidá roztok 0,022 ml (0,25 mmol) morfolinu v 0,2 ml Ν,Ν-dimethylformamidu a výsledná směs se míchá při této teplotě po dobu 1 hodiny, načež se přidá vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného. Tato směs se extrahuje třikrát

- 17CZ 283333 B6 ethylacetátem. Organický roztok se promyje solankou, vysuší se nad bezvodým síranem sodným, přefiltruje se a odpaří. Odparek se vyčistí sloupcovou chromatografií na silikagelu s použitím směsi ethylacetátu s methanolem v poměru 95:5 jako elučního činidla, čímž se získá v nadpisu uvedená sloučenina ve formě amorfního bílého produktu:

‘H NMR (CDClj) δ 0,72 (1H, dd), 1,67 (3H, s), 1,76 (3H, s), 2,60 (3H, m), 3,07 (1H, m), 3,24 (2H, s), 3,78 (8H, m), 4,27 (2H, t); MS (FAB) m/z 1107 ((M+Na*), 1085 ((M+H)*), 1067 ((MOH)*), 1053 ((M-OCH₃)*), 1035 ((M-(OCH₃+H₂O))*).

MBA (rel. IC50)1,3

IL-6 dep. prol. (rel. IC50)4

MLR (rel. IC50)3,5

Příklad 17

40-O-(2-N-imidazolylacetoxy)ethylrapamycin

Stejným způsobem, jaký je popsán v příkladu 16, stupeň b), se za použití imidazolu získá v nadpisu uvedená sloučenina:

'H NMR (CDC1₃) δ 0,72 (1H, dd), 1,67 (3H, s), 1,78 (3H, s), 3,06 (1H, m), 3,80 (2H, m), 4,32 (2H, m), 4,73 (2H, s), 6,97 (1H, dd), 7,09 (1H, dd), 7,52 (1H, dd); MS (FAB) m/z 1066 ((M+H)*), 1048 ((M-OH)*, 1034 ((M-OCH₃)*), 1016 ((M-(OCH₃+ H₂O))*).

MBA (rel. IC50)1

IL-6 dep. prol. (rel. IC50)7,6

MLR (rel. IC50)3,4

Příklad 18

40-O-(2-(N-methyl-N'-piperazinyl)acetoxy)ethylrapamycin

Stejným postupem, jaký je popsán v příkladu 16, stupeň b), s použitím N-methylpiperazinu se získá v nadpisu uvedená sloučenina:

'H NMR (CDClj) δ 0,72 (1H, dd), 1,67 (3H, s), 1,77 (3H, s), 2,78 (4H, s a m), 3,02 (4H, šs), 3,08 (1H, m), 3,32 (2H, s), 3,80 (2H, dd), 4,27 (2H, t); MS (FAB) m/z 1098 ((M+H)*), 1066 ((MOCH₃)*).

MBA (rel. IC50)2,6

IL-6 dep. prol. (rel. IC50)10,3

MLR (rel. IC50)5

Příklad 19

39-0-desmethyl-39,40-0,0-ethylenrapamycin

K. míchanému roztoku 48 mg (0,05 mmol) 40-O-hydroxyethylrapamycinu a 0,023 ml (0,20 mmol) 2,6-lutidinu v 0,5 ml methylenchloridu, ochlazenému na -20 °C, se přidá 0,008 ml (0,05 mmol) anhydridu kyseliny triflové. Směs se míchá při této teplotě 2 hodiny, načež se nechá

- 18CZ 283333 B6 ohřát na teplotu místnosti a míchá se další hodinu. Reakce se ukončí přídavkem vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a výsledná směs se extrahuje třemi díly ethylacetátu. Organický roztok se promyje solankou, vysuší se nad bezvodým síranem sodným, zfiltruje se a odpaří. Odparek se vyčistí sloupcovou chromatografií na silikagelu s použitím směsi hexanu s ethylacetátem v poměru 30:70 jako elučního činidla, čímž se získá v nadpisu uvedená sloučenina ve formě bílého pevného produktu:

‘H NMR (CDClj) δ 1,66 (3H, s), 1,75 (3H, s), 3,14 (3H, s), 3,35 (3H, s), 3,76 (4H, s); MS (FAB) m/z 948 ((M+Na)*), 925 (M*), 908 ((M-OH)*), 894 ((M-OCH₃)*), 876 ((M-(OCH₃+H₂O)*), 858 ((M-(OCH₃+2 H₂O))*), 844 ((M-(2CH₃OH+OH))*) , 826 (M-(OCH₃+CH₂OH+2 H₂O))*).

MBA(rel.IC50)1,6

IL-6 dep. prol. (rel. IC50)22,9

MLR (rel. IC50)16

Příklad 20 (26R)-26-dihydro-40-O-(2-hydroxy)ethylrapamycin

a) (26R)-26-dihydro-40-O-(2-(terc.butyldimethylsilyloxy))ethylrapamycin

V 4,5 ml směsi acetonitrilu s kyselinou octovou v poměru 2:1 se rozpustí 315 mg (1,2 mmol) tetramethylamoniumtriacetoxyborohydridu. Výsledný roztok se míchá 1 hodinu při teplotě místnosti a ochladí se na -35 °C, načež se přidá 161 mg (0,15 mmol) 40-O-(2-(terc. butyldimethylsilyl)oxy)ethylrapamycinu. Výsledná směs se míchá přes noc při stejné teplotě a reakce se ukončí přídavkem vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Směs se extrahuje třemi díly ethylacetátu. Organický roztok se promyje vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, dvěmi dávkami 30 % vodného roztoku Rochellovy soli a solankou, vysuší se nad bezvodým síranem sodným, zfiltruje se a odpaří. Odparek se vyčistí sloupcovou chromatografií na silikagelu s použitím směsi hexanu s ethylacetátem v poměru 40:60 jako elučního činidla, čímž se získá v nadpisu uvedená sloučenina ve formě bílého pevného produktu:

'H NMR (CDC1₃) δ 0,06 (6H, s), 0,73 (1H, dd), 0,90 (9H, s), 1,64 (3H, s), 1,67 (3H, s), 3,02 (1H, m), 3,15 (1H, m), 3,64 (3H, m), 3,71 (2H, dd), 3,91 (1H, s); MS (FAB) m/z 1096 ((M+Na)*), 1041 ((M-HOCH₃)*), 1024 ((M-(OCH₃+H₂O))*), 1006 ((M-(OCH₃+2 H₂O))*), 974 ((M(OCH₃+CH₃OH+2 H₂O))*).

b) (26R)-26-dihydro-40-O-(2-hydroxy)ethylrapamycin

Zpracováním sloučeniny připravené ve stupni a) za podmínek popsaných v příkladu 8, stupeň b) se získá v nadpisu uvedená sloučenina:

'H NMR (CDC1₃) δ 0,75 (1H, dd), 1,66 (3H, s), 1,70 (3H, s), 3,18 (1H, m), 3,52 - 3,84 (7H, m), MS (FAB) m/z 982 ((M+Na)*), 928 ((M-OCH₃)*), 910 ((M-(OCH₃+ H₂O))*), 892 ((M(OCH₃+2 H₂O))*).

MBA (rel. IC50)3,9

IL-6 dep. prol. (rel. IC50)53

MLR (rel. IC50)18

- 19CZ 283333 B6

Příklad 21

8-O-methy lrapamyc in

K míchanému roztoku 103 mg (0,1 mmol) 40-O-TBS-rapamycinu (získaného silylací rapamycinu 1 ekvivalentem TBS-triflátu v methylenchloridu za přítomnosti 2 ekvivalentů 2,6lutidinu při 0 °C) v 0,5 ml methylenchloridu se přidá 85,8 mg (0,40 mmol) protonové houby, následované 44 mg (0,30 mmol) trimethyloxoniumtetrafluorborátu. Výsledná hnědá heterogenní směs se míchá přes noc, reakce se ukončí přídavkem vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a extrahuje se ethylacetátem. Organický roztok se promyje IN HC1, vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a solankou, načež se vysuší nad bezvodým síranem sodným, zfiltruje se a odpaří. Odparek se vyčistí sloupcovou chromatografií na silikagelu s použitím směsi hexanu s ethylacetátem v poměru 60:40 jako elučního činidla, čímž se získá 40-0terc.butyldimethylsilyl-28-O-methylrapamycin. Tato sloučenina se desilyluje za podmínek popsaných v příkladu 10, stupeň b), čímž se získá po PTLC s ethylacetátem v nadpisu uvedená sloučenina ve formě bílého pevného produktu:

’H NMR (CDC1₃) δ 0,70 (IH, dd), 1,68 (6H, 2s), 2,95 (IH, m), 3,13 (3H, s), 3,14 (3H, s), 3,28 (3H, s), 3,41 (3H, s); MS (FAB) m/z 950 ((M+Na)*), 927 (M*), 909 ((M-H₂O)*), 896 ((MOCH₃)*), 878 ((M-(OCH₃+H₂O))*), 864 ((M-(OCH₃+CH₃OH))*), 846 ((M-(2CH₃OH+OH))*), 832 ((M-(OCH₃+2CH₃OH))*), 814 ((M-(3CH₃OH+OH))*).

MBA (rel. IC50)1,58

IL-6 dep. prol. (rel. IC50)1240

MLR (rel. IC50)1300

Příklad 22

40-O-(2-aminoethyl)rapamycin

a) 40-O-(2-bromethyl)rapamycin

Roztok 914 mg rapamycinu v 5 ml toluenu, obsahující 0,64 ml 2,6-lutidinu a 1,28 g 2bromethyltriflátu, se zahřívá 18 hodin na 65 °C. Reakční směs se pak ochladí na teplotu místnosti, vleje na 20 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a extrahuje 3 x 20 ml ethylacetátu. Organické fáze se vysuší nad uhličitanem sodným a rozpouštědlo se oddestiluje za sníženého tlaku na rotační odparce. Odparek se chromatografuje na 100 g silikagelu, přičemž se eluuje směsí hexanu s ethylacetátem v poměru 3:2. Získá se tak 40-O-(2-bromethyl)rapamycin ve formě amorfního pevného produktu:

MS (FAB) m/z 1044 a 1042 (100%, M+Na); 972 a 970 (55 %, M-(MeOH+H₂O)). HNMR(CDC1₃) d: 0,72 (IH, q, J=12 Hz); 3,13 (3H, s); 3,33 (3H, s); 3,45 (3H, s); 3,9 (4H, m); 4,78 (IH, s)

b) 40-O-(2-azidoethyl)rapamycin

Roztok 2,4 g 40-O-(2-bromethyl)rapamycinu v 40 ml Ν,Ν-dimethylformamidu se nechá reagovat s 0,19 g azidu sodného při teplotě místnosti. Po 2 hodinách se směs vleje na 100 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a extrahuje se 3 x 100 ml ethylacetátu. Organické fáze se spojí, vysuší se nad síranem sodným a rozpouštědlo se oddestiluje za sníženého tlaku. Surový produkt se vyčistí chromatograficky na silikagelu, přičemž se eluuje směsí hexanu s ethylacetátem. Získá se tak 40-O-(2-azidoethyl)rapamycin:

-20CZ 283333 B6

MS (FAB) : 1005 (100 %, Ma+Na); 951 (24 %, M-MeOH); 933 (57 %, M-(MeOH+H₂O)

c) 40-O-(2-aminoethyl)rapamycin

K roztoku 230 mg 40-O-(azidoethyl)rapamycinu v 3 ml směsi tetrahydrofuranu s vodou v poměru 5:1 se při teplotě místnosti přidá 307 mg trifenylfosfinu. Reakční směs zežloutne. Po 7 hodinách se reakční směs chromatografuje na silikagelu, přičemž se eluuje směsí ethylacetátu, methanolu a kyseliny octové v poměru 50:50:0,5. Získá se tak v nadpisu uvedený produkt ve formě acetátu:

MS (FAB) m/z 979 (45 %, M+Na); 957 (100 %, M); 925 (63 %, M-MeOH); 907 (25 %, M(MeOH+H₂O)

MBA (rel. IC50) 0,7

IL-6 dep. prol. (rel. IC50) 10

Příklad 23

40-O-(2-acetaminoethyl)rapamycin

K. roztoku 101 mg acetátu 40-O-(2-aminoethyl)rapamycinu v 2 ml tetrahydrofuranu se přidá 0,02 pyridinu a 0,07 ml acetylchloridu. Reakční směs se udržuje 18 hodin na teplotě místnosti a pak se vleje na 7 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Vodná fáze se extrahuje třikrát 5 ml ethylacetátu, organické fáze se spojí a vysuší nad síranem sodným. Rozpouštědlo se odpaří a odparek se chromatografuje na 10 g silikagelu, přičemž se eluuje nejdříve ethylacetátem a potom směsí ethylacetátu, methanolu a kyseliny octové v poměru 50:50:0,5. Získá se tak v nadpisu uvedený produkt:

MS (FAB) m/z 1021 (20 %, M+Na); 967 (28 %, M-MeOH); 949(100 %, M-(MeOH+H₂O) H-NMR(CDC1₃) d: 0,71 (IH, q, J=12 Hz); 1,98 (3H, s); 3,13 (3H, s); 3,34 (3H, s); 3,44 (3H, s); 4,75 (IH, s)

MBA (rel. IC50) 1,1

IL-6 dep. prol. (rel. IC50) : 2,3

Příklad 24

40-O-(2-nikotinamidoethyl)rapamycin

101 mg acetátu 40-O-(2-aminoethyl)rapamycinu se rozpustí v 5 ml ethylacetátu a extrahuje se dvakrát nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Organická fáze se vysuší nad síranem sodným a rozpouštědlo se oddestiluje. Odparek se rozpustí ve 2 ml tetrahydrofuranu a nechá se reagovat s 22 mg Ν,Ν'-dicyklohexylkarbodiimidu a 15 mg kyseliny nikotinové. Po 15 hodinách při teplotě místnosti se reakční směs odpaří a odparek se chromatografuje na silikagelu, přičemž se eluuje ethylacetátem následovaným směsí ethylacetátu s methanolem v poměru 9:1. Získá se tak v nadpisu uvedený produkt:

MS (FAB) m/z 1084 (80 %, M+Na); 1062 (40 %, MH); 1038 (100 %, M-MeOH); 1012 (50 %, M-(MeOH+H₂O)

H-NM (CDClj) d: 0,72 (IH, q, J=12 Hz); 3,13 (3H, s); 3,33 (3H, s); 3,37 (3H, s); 7,39 (IH, dd; J=6 Hz, J=8 Hz), 8,19 (IH, d, J=8 Hz); 8,75 (IH, d, J=6 Hz); 9,04 (IH, široký s)

-21 CZ 283333 B6

MBA (rel. IC50) 1,2

IL-6 dep. prol. (rel. IC50) 2,8

Příklad 25

40-O-(2-(N-methylimidazo-2'-ylkarboxamido)ethyl)rapamycin

K roztoku 30 mg N-methylimidazol-2-karboxylové kyseliny v 1 ml dimethylformamidu se přidá 58 mg Ν,Ν’-dicyklohexylkarbodiimidu a 58 mg hydroxybenztriazolu. Po 2 hodinách se přidá 150 mg 40-O-(2-aminoethyl)rapamycinu a reakční směs se míchá 18 hodin při teplotě místnosti. Suspenze se pak zfiltruje, filtrát se zředí 5 ml ethylacetátu a promyje se dvakrát 2 ml nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Organická fáze se vysuší nad síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku. Odparek se chromatografuje na silikagelu, přičemž se eluuje směsí hexanu s ethylacetátem v poměru 1:4 a pak ethylacetátem. Získá se tak v nadpisu uvedený produkt:

MS (FAB) m/z 1087 (36 %, M+Na); 1065 (57 %,MH); 1033 (100 %, M-MeOH); 1015 (46 %, M-(MeOH+H₂O))

H-NMR (CDC1₃) d: 0,72 (1H, q, J=12 Hz); 3,13 (3H, s); 3,33 (3H, s); 3,46 (3H, s); 4,03 (3H, s); 6,93 (1H, široký s); 7,78 (1H, m)

MBA (rel. IC50) 1,1

IL-6 dep. prol. (rel. IC50) 7

Příklad 26

40-O-(2-ethoxykarbonylaminoethyl)rapamycin

Roztok 200 mg 40-O-(2-azidoethyl)rapamycinu v 3 ml směsi tetrahydrofuranu s vodou v poměru 5 : 1 se nechá reagovat s 267 mg trifenylfosfinu 7 hodin při teplotě místnosti. Pak se přidá 0,4 ml pyridinu následovaného 194 μΐ ethylchlormravenčanu. Po 2 hodinách se reakční směs vleje na 5 ml ethylacetátu a promyje se postupně 10 ml nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného, 5 ml vody a 5 ml 10 % kyseliny citrónové. Organická fáze se vysuší nad síranem sodným a rozpouštědlo se oddestiluje. Odparek se chromatografuje nad 20 g silikagelu, přičemž se eluuje ethylacetátem a potom směsí ethylacetátu s methanolem v poměru 9:1. Získá se tak v nadpisu uvedený produkt:

MS (FAB) m/z 1051 (35 %, M+Na); 997 (30 %, M-MeOH); 979 (100 %, M-(MeOH+H₂O)) H-NMR(CDC1₃) d: 0,71 (1H, q, J=12 Hz); 1,24 (3H, t, J=8 Hz); 3,13 (3H, s); 3,34 (3H, s); 3,43 (3H, s); 4,10 (2H, q, J= 8 Hz); 5,48 (1H, m)

MBA (rel. IC50) 1,1

IL-6 dep. prol. (rel. IC50) 1,7

-22CZ 283333 B6

Příklad 27

40-O-(2-tolylsulfonamidoethyl)rapamycin

Roztok 200 mg 40-O-(2-aminoethyl)rapamycinu v 3 ml tetrahydrofuranu se nechá reagovat s 0,4 ml pyridinu a 390 mg tosylchloridu, přičemž se reakční směs míchá 12 hodin při te plotě místnosti. Roztok se pak vleje na 5 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu a vodná fáze se extrahuje dvakrát 5 ml ethylacetátu. Spojené organické fáze se promyjí 5 ml 10% kyseliny citrónové a 5 ml vody. Po vysušení nad síranem sodným se rozpouštědlo oddestiluje a odparek se chromatografuje na 20 g silikagelu, přičemž se jako eluční činidlo použije směs hexanu s ethylacetátem v poměru 1:1. Získá se tak v nadpisu uvedený produkt ve formě bílé pěny:

MS (FAB) m/z 1133 (100 %, M+Na); 1078 (25 %, M-MeOH); 1061 (85 %, M-(MeOH+ H₂O)) H-NM(CDC1₃) d: 0,68 (1H, q, J=12Hz); 2,43 (3H, s); 3,13 (3H, s); 3,35 (3H, s); 3,41 (3H, s); 4,76 (1H, s); 5,85 (1H, t, J=6Hz); 7,30 (2H, d, J=8 Hz); 7,75 (2H, d, J=8Hz).

MBA (rel. IC50) 15,9

IL-6 dep. prol. (rel. IC50) 14

Příklad 28

40-O-(2-(4',5'-dikarboethoxy-r,2,3'-triazol-r-yl)ethyl)rapamycin mg 40-O-(2-azidoethyl)rapamycinu a 32 mg diethylacetylendikarboxylátu se suspenduje v 0,5 ml toluenu a zahřívá se 5 hodin na 65 °C. Reakční směs se pak ochladí na teplotu místnosti, vnese se na 10 g silikagelu a eluuje se směsí hexanu s ethylacetátem v poměru 1:1. Získá se tak v nadpisu uvedený produkt:

MS (FAB) m/z 1175 (20 %, M+Na); 1121 (15 %, M-MeOH); 1103 (60 %, M-(MeOH+H₂O)) H-NMR(CDC1₃) d: 0,62 (1H, q, J=12 Hz); 1,40 (3H, t, J=8 Hz); 1,42 (3H, t, J=8 Hz); 3,13 (3H, s); 3,25 (3H, s); 3,33 (3H, s)

MBA (rel. IC50) 2,7

IL-6 dep. prol. (rel. IC50) 12

Předcházející příklady mohou být též provedeny tak, že se jako výchozího materiálu použije místo rapamycinu 9-deoxorapamycin, 26-dihydrorapamycin nebo 9-deoxo-, 26-dihydrorapamycin. Alternativně a s výhodou, jak je popsáno např. v příkladu 20, se rapamycinové sloučeniny ze shora uvedených příkladů mohou hydrogenovat nebo redukovat, popřípadě za použití vhodných chránících skupin. Dále jsou popsány nové způsoby redukce ketoskupiny na C9 nebo hydrogenace ketoskupiny na C26.

Příklad 29

Odstranění ketoskupiny na C9

Při teplotě místnosti je veden proud sirovodíku míchaným roztokem 3,2 g (3,5 mmol) rapamycinu v 50 ml pyridinu a 2,5 ml Ν,Ν-dimethylformamidu. Původně bezbarvý roztok zežloutne. Po dvou hodinách se přívod sirovodíku zastaví a v míchání se pokračuje pět dní. Během této doby roztok postupně zoranžoví. Chromatografie na tenké vrstvě a vysokoúčinná kapalinová chromatografie potvrzují úplné spotřebování výchozího materiálu a přítomnost jediné nové sloučeniny. Roztok se promývá jednu hodinu dusíkem a odpaří se za sníženého tlaku.

-23 CZ 283333 B6

Odparek se vyjme do ethylacetátu, promyje se třikrát studeným roztokem IN HC1, nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a nasycenou solankou. Organická vrstva se vysuší nad bezvodým síranem sodným, zfiltruje se a odpaří za sníženého tlaku. Odparek se vyjme do etheru a vysrážená síra se odfiltruje. Po odpaření etherového roztoku, následovaného chromatografii na silikagelu (10:4:lCH₂Cl₂/i-Pr₂O/MeOH) se získá 9-deoxorapamycin ve formě bezbarvé pěny. Identita produktu je potvrzena jadernou magnetickou rezonanční spektroskopií (NMR), hmotnostní spektrometrií (MS) nebo/a infračervenou spektroskopií (IČ). U 9-deoxorapamycinu byly zjištěny následující charakteristické fyzikální hodnoty:

’H NMR(CDC1₃)61,61 (3H, d, J=1 Hz, C17-CH3), 1,76 (3H, d, J=l,2 Hz, C29-CH₃), 2,42 (1H, d, J=14,5 Hz, H-9), 2,74 (1H, d, J=14,5 Hz, H-9), 3,13 (3H, s, CI6-OCH₃), 3,5 (3H, s, C27-OCH₃), 3,40 (3H, s, C39-OCH₃), 5,40 (1H, d, J= 10Hz, H-30), 5,57 (1H, dd, £=8,6 Hz, J₂=l5 Hz, H-22), 5,96 (1H, d, J=9 Hz, H-18), 6,09 (1H, d, J= 1,7 Hz, 10-OH), 6,15 (1H, dd, £= 10 Hz, J₂=l5 Hz, H-21), 6,37 (1H, dd, £=1,5 Hz, J₂=5 Hz, H19), 6,38 (1H, J=9,5 Hz, H-20), ¹³C NM (CDC1₃) δ 38,5 (C-9), 98,0 (C-10), 170,7 (C-l), 173,0 C-8), 208,8 (C-32), 216,9 (C-26) MS (FAB) m/z 922 8(M+Na*)), 899 (M*), 881 ((M-H₂O)*), 868 ((M-OCH₃)*), 850 ((M(H₂O+OCH₃))*)

IČ (hlavní píky) (cm’¹) 987, 1086, 1193, 1453, 1616, 1717, 1739, 3443

MBA (rel. IC50)1

MLR (rel. IC50)14

IL-6 dep. prol. (rel. IC50)9

Příklad 30

Dihydrogenace ketoskupiny na C26

K míchanému roztoku 421 mg (1,6 mmol) tetramethylamoniumtriacetoxyborohydridu ve 2 ml acetonitrilu se přidají 2 ml kyseliny octové. Výsledná směs se míchá 30 minut při teplotě místnosti, načež se ochladí na -35 °C. Při této teplotě se přidá roztok 180 mg (0,2 mmol) 9deoxorapamycinu v 1 ml acetonitrilu a výsledná směs se míchá 24 hodin. Ke směsi se přidá nasycený vodný roztok vínanu sodnodraselného a nechá se ohřát na teplotu místnosti. V míchání se pokračuje, až jsou obě vrstvy čiré, načež se přidá ethylacetát. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje dvakrát ethylacetátem. Výsledný organický roztok se promyje jednou 10% roztokem hydrogenuhličitanu sodného a dvakrát nasycenou solankou, načež se vysuší nad bezvodým síranem sodným, zfiltruje se a odpaří za sníženého tlaku. Odparek se vyčistí sloupcovou chromatografii na silikagelu (90:10 AcOEt-hexan). Výchozím materiálem v tomto případě byl 9-deoxorapamycin, výslednou sloučeninou je deoxorapamycin, 26-dihydrorapamycin se získá ve formě bezbarvé pěny s následujícími charakteristickými spektroskopickými hodnotami:

'H NMR(CDCl₃(hlavní izomer) δ 9 (3H, d, J=6,9 Hz, CHCH₃), 0,93 (3H, d, J=6,9 Hz, CHCH₃), 1,00 (3H, d, J=6,9 Hz,CHCH₃), 1,07 (3H, d, J=6,9 Hz, CHCH₃), 1,17 (3H, d, J=6,9 Hz, CHCH₃), 1,61 (3H, d, J=1 Hz, C17-CH₃), 1,73 (3H, d, J=l,2 Hz, C29-CH₃), 2,43 (1H, dd, J=4,l a 16,0 Hz, H-33), 2,46 (1H, d, J=13,8 Hz, H-9), 2,58 (1H, m, H-25), 2,77 (1H, d, J=13,8 Hz, H-9), 2,82 (1H, dd, J=8,3 a 16,0 Hz, H-33), 3,17 (1H, dd, J=4,l a 9,2 Hz, H-27), 3,61 (2H, m, H-14 aH28), 5,19 (1H, ddd, J=4,l, 4,6 a 8,3 Hz, H-34), 5,49 (1H, široký d, J=5,0 Hz, H-2), 5,56 (1H, d, J=9,l Hz, H-30), 5,75 (1H, dd, J=6,9 a 14,7 Hz, H-22), 5,76 (1H, s, 10-OH), 5,99 (1H, široký d, J=9,2 Hz, H-18), 6,10 (1H, m, H-21), 6,36 (2H, m, H-19 a H-20);

-24CZ 283333 B6

MS (FAB) m/z 924 ((M + Na)) , 852 ((M-(H₂O + CH₃O))*)

MBA (rel. IC50)47

MLR (rel. IC50)134

IL-6 dep. prol. (rel. IC50)78

26-dihydrorapamycin se připraví stejným způsobem použitím rapamycinu místo 9-deoxorapamycinu. Tento produkt má následující charakteristické hodnoty:

^I3C-NMR(CDCI₃) (hlavní izomer) d = 208,3 (C-32), 194,0 (C-9), 169,3 (C-l), 166,6 (C-8), 140,9 (C-22), 136,5 (C-29), 136,2 (C-17), 133,5 (C-20), 129,1 (C-21), 128,7 (C-18), 126,2 (C-30), 125,3 (C-19), 98,6 (C-10), 84,4 (C-39), 83,9 (C-16), 81,6 (C-27), 75,4 (C-34), 74,3 (C-28), 73,9 (C-40), 72,9 (C-26), 67,4 (C-l4) , 59,1 (27-OCH₃), 56,6 (39-OCH₃), 55,9 (16-OCH₃), 51,3 (C2), 46,8 (C-31), 44,3 (C-6), 40,4 (C-33), 40,4 (C-25), 39,5 (C-24), 38,8 (C-15), 38,0 (C-36), 34,3 (C-23), 34,2 (C-38), 33,5 (C-l 1), 33,3 (C-37), 33,2 (C-35), 31,5 (C-42), 31,3 (C-41), 30,9 (C-13), 27,1 (C-12), 27,0 (C-3), 25,2 (C-5), 21,4 (23-CH₃), 20,7 (C-4), 17,3 (11-CH₃),16,1 (31-CH₃), 15,9 (35-CH₃), 14, 4 (25-CH₃), 14, 2 (29-CH₃), 10, 3 (17-CH₃).

MS (FAB) m/z: 884 (M-OCH₃,35 %) , 866 (M-(OCH₃+H₂O), 100 %), 848 (M-(OCH₃+ 2H₂O), 40 %)

MBA (rel. IC50)1,7

MLR (rel. IC50)1

IL-6 dep. prol. (rel. IC50)7,5

Claims (28)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. O-alkylované deriváty rapamycinu obecného vzorce I (I)

   -25CZ 283333 B6 ve kterém

   X je (Η, H) nebo atom kyslíku,

   Y je (H, OH) nebo atom kyslíku, symboly R¹ a R² jsou nezávisle na sobě vybrány ze souboru zahrnujícího atom vodíku, alkylové skupiny, arylalkylové skupiny, hydroxyalkylové skupiny, dihydroxyalkylové skupiny, hydroxyalkylarylalkylové skupiny, dihydroxyalkylarylalkylové skupiny, acyloxyalkylové skupiny, aminoalkylové skupiny, alkylaminoalkylové skupiny, alkoxykarbonylaminoalkylové skupiny, acylaminoalkylové skupiny, arylsulfonamidoalkylové skupiny, allylovou skupinu, dihydroxyalkylallylové skupiny, dioxolanylallylovou skupinu a hydroxyalkoxyalkylové skupiny, přičemž alk- nebo alkyl představuje alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, která má přímý nebo rozvětvený řetězec, acyl představuje zbytek odvozený od karboxylové kyseliny, vybraný ze souboru zahrnujícího alkylkarbonylové skupiny s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, nikotinoylovou, 2-(N-morfolino)acetylovou, 2-(Nimidazolyl)acetylovou a 2-(N-methyl-N-piperazinyl)acetylovou skupinu, a aryl znamená fenyl nebo tolyl, a

   R⁴ znamená methylovou skupinu, nebo symboly R⁴ a R¹ tvoří dohromady alkylenovou skupinu se 2 až 6 atomy uhlíku, s tím, že symboly R¹ a R² neznamenají oba vždy atom vodíku.
2. 2. O-alkylované deriváty rapamycinu obecného vzorce I podle nároku 1, vybrané ze skupiny zahrnující

   1.40- O-benzylrapamycin,

   2. 40-O-(4-hydroxyrnethyl)benzylrapamycin,
3. 3. 40-O-[4'-( 1,2-dihydroxyethyl)]benzylrapamycin,
4. 4. 40-O-allylrapamycin,
5. 5. 40-O-[3'-(2,2-dimethyl-l,3-dioxolan—4(S)-yl)prop-2'-en-r-yl]rapamycin,
6. 6. (2'E,4'S)-40-O-(4',5'-dihydroxypent-2'-en-l'-yl)rapamycin,
7. 7. 40-O-(2-hydroxy)ethoxykarbonylmethylrapamycin,
8. 8. 40-O-(2-hydroxy)ethylrapamycin,
9. 9. 40-O-(3-hydroxy)propylrapamycin,
10. 10. 40-0-(6-hydroxy)hexylrapamycin,
11. 11.40- O-[2-(2-hydroxy)ethoxy]ethyirapamycin,
12. 12. 40-O-[(3S)-2,2-dimethyldioxolan-3-yl]methylrapamycin,
13. 13. 40-O-[(2S)-2,3-dihydroxyprop-l-yl]rapamycin,
14. 14. 40-O-(2-acetoxy)ethylrapamycin,
15. 15. 40-O-(2-nikotinoyloxy)ethylrapamycin,
16. 16. 40-O-[2-(N-morfolino)acetoxy]ethylrapamycin,

    -26CZ 283333 B6
17. 17. 40-O-(2-N-imidazolylacetoxy)ethylrapamycin,
18. 18. 40-O-[2-(N-methyl-N'-piperazinyl)acetoxy]ethylrapamycin,
19. 19. 39-0-desmethyl-39,40-0,0-ethylenrapamycin,
20. 20. (26R)-26-dihydro-40-O-(2-hydiOxy)ethylrapamycin,
21. 21.28-O-methylrapamycin,
22. 22. 40-O-(2-aminoethyl)rapamycin,
23. 23.40- O-(2-acetaminoethyl)rapamycin,
24. 24.40- O-(2-nikotinamidoethyl)rapamycin,
25. 25.40- O-(2-(N-methylimidazo-2'-ylkarboxamido)ethyl)rapamycin,
26. 26. 40-O-(2-ethoxykarbonylaminoethyl)rapamycin,
27. 27. 40-O-(2-tolylsulfonamidoethyl)rapamycin a
28. 28. 40-O-[2-(4',5'-diethoxykarbonyl-r,2',3'-triazol-r-yl)ethyl]rapamycin.

    3. O-alkylované deriváty rapamycinu obecného vzorce I podle nároku 1, ve kterých oba symboly X aY představují vždy atom kyslíku, R² znamená atom vodíku, R⁴ představuje methylovou skupinu a R¹ má jiný význam než atom vodíku.

    4. O-alkylované deriváty rapamycinu obecného vzorce I podle nároku 3, ve kterých R¹ je vybrán ze souboru zahrnujícího hydroxyalkylové skupiny, hydroxyalkoxyalkylové skupiny, acylaminoalkylové skupiny a aminoalkylové skupiny, kde acyl a alkyl mají výše uvedený význam.

    5. O-alkylovaný derivát rapamycinu obecného vzorce I podle nároku 4, kterým je 40-0-(2hydroxy)ethy lrapamyc in.

    6. Způsob výroby O-alkylovaných derivátů rapamycinu obecného vzorce I podle libovolného z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že zahrnuje (i) reakci rapamycinu, deoxorapamycinu nebo dihydrorapamycinu, popřípadě v O-chráněné formě, s organickým zbytkem s R¹ nebo R² ve významu definovaném v nároku 1, popřípadě v chráněné formě, navázaným na odstupující skupinu (X) tak že, (a) X je CC1₃(NH)O- a reakce se provádí za přítomnosti kyseliny, nebo (b) X je CF₃SO₃- a reakce se provádí za přítomnosti báze, a (ii) případnou redukci nebo/a, pokud je to zapotřebí, odstranění chránící skupiny z produktu.

    7. O-alkylovaný derivát rapamycinu obecného vzorce I podle libovolného z nároků 1 až 5 pro použití jako léčivo.

    8. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje O-alkylovaný derivát rapamycinu obecného vzorce I podle libovolného z nároků 1 až 5 spolu s farmaceuticky přijatelným ředidlem nebo nosičem.

    9. O-alkylované deriváty rapamycinu obecného vzorce I podle libovolného z nároků 1 až 5 pro použití k výrobě léčiva pro léčbu nebo prevenci libovolného z následujících stavů:

    -27CZ 283333 B6 (i) autoimunního onemocnění, (ii) odhojení allotransplantátu, (iii) reakce štěpu vůči hostiteli, (iv) astmatu, (v) vícelékové rezistence, (vi) nádorů nebo hyperproliferativních poruch, nebo (vii) plísňových infekcí, (viii) zánětu, (ix) infekce patogeny s faktory Mip nebo faktory podobnými Mip nebo (x) předávkování imunosupresivy vázajícími makrofilin.