RO114451B1

RO114451B1 - Derivati o-alchilati ai rapamicinei si compozitie farmaceutica care ii contine

Info

Publication number: RO114451B1
Application number: RO95-00686A
Authority: RO
Inventors: Sylvain Cottens; Richard Sedrani
Original assignee: Sandoz Ltd
Priority date: 1992-10-09
Filing date: 1993-09-24
Publication date: 1999-04-30
Also published as: SK46595A3; ATE272063T1; HUT71232A; FR04C0012I2; RU95110053A; ES2124793T3; CZ283333B6; JP3568800B2; CY2005010I1; EP0663916A1; GB9221220D0; FI109540B; CY2125B1; CZ89995A3; FI20001943A7; BR1100353A; AU4819293A; SK286054B6; JPH08502266A; NO951312D0

Description

Prezenta invenție se referă la derivați O-alchilați ai rapamicinei , utilizați ca imunosupresanți și la compoziția farmaceutică care îi conține.

Rapamicina este un antibiotic cunoscut, din grupul macrolidelor produs de Streptomyces hygroscopus și prezintă formula următoare:

(McAlpine ș.a., J. Antibiotics (1991) 44 688; Schreiber S.L. ș.a., J. Am. Chem. Soc. (1991), 113; 7433; Brevet US 3929992).

Rapamicina este un imunosupresant extrem de puternic, dar dispune și de o activitate antitumorală și antifungică. Totuși utilizarea sa ca produs farmaceutic este restrânsă din cauza duratei de acțiune foarte redusă și variabilă, precum și toxicității ridicate. In plus, rapamicina este puternic insolubilă făcând foarte dificilă realizarea de compoziții galenice stabile.

Sunt cunoscuți derivați de rapamicină care au o grupă acetal în poziția 40 (Brevet US 5151413). Se cunosc, de asemenea, derivați de rapamicină cu o grupă silii eter în poziția 40 (Brevet US 5120842).

Prezenta invenție lărgește gama derivaților de rapamicină, cu acțiune farmacologică superioară, cu derivați alchilați ai rapamicinei care prezintă structura chimică corespunzătoare formulei generale I :

în care: X este (H,H) sau □; Y este (H,OH) sau O; R¹ este H, alchil, arilalchil, hidroxialchil, dihidroxialchil, hidroxialchilarilalchil, dihidroxialchilarilalchil, aciloxialchil, aminoalchil, alcoxicarbonilaminoalchil, acilaminoalchil, arilsulfonamidoalchil, alil, dihidroxialchilalil, dioxolanilalil și hidroxialcoxialchil; alchil se referă la alchil C-i -C6, ramificat sau linear; R² este H sau alchil C., -CB și R⁴ este metil sau R⁴și R¹ formează împreumă alchilen C₂ -Cg cu condiția ca R¹ și R² să nu fie ambii hidrogen.

Invenția constă și într-o compoziție farmaceutică care conține o cantitate eficientă dintr-un derivat cu formula generală I asociat cu un diluant sau un purtător acceptabil farmaceutic, pentru tratarea sau prevenirea oricăreia dintre următoarele afecțiuni: boli autoimune, respingerea alogrefelor, reacția grefei față de boala gazdei, astm, rezistență multimedicamentoasă, tumori sau tulburări hiperproliferative, infecții fungice, inflamații, infecție cu patogeni având factori Mip sau similari Mip.

Invenția prezintă avantaje prin aceea că sunt descoperiți noi derivați ai rapamicinei cu o acțiune farmacologică superioară acesteia, evidențiind o mai mare stabilitate și durată de acțiune și care permit realizarea de formule galenice în condiții facile.

Noua clasă de compuși include următorii derivați :

1.40-0-Benzilrapamicină

2. 4O-O-(4'-Hidroximetil]RO 114451 Bl benzilrapamicină

3. 4C>0-[4'-(1,2-Dihidroxietil)]-benzilrapamicină

4. 40-0-Alilrapamicină

5. 4CM3-[3'-(2,2-Dimetil-1,3-dioxolan-4(S)-il)-prop-2'-en-T-il]-rapamicină

6. (2'E,4'S)-4O-O-(4',5'-Dihidroxipent-2'-en-1 '-il)-rapamicină

7. 4O-O-(2-Hidroxi)-etoxicarbonilmetil-rapamicină

8. 4O-O-(3-Hidroxi)-etil-rapamicină

9. 4O-O-(6-Hidroxi)-propil-rapamicină

10. 4O-O-(6-Hidroxi]-hexil-rapaml· cină

11. 4O-O-[2-(2-Hidroxi)-etoxi]-etilrapamicină

12. 40-0-[(3S]-(2,2-Dimetildioxolan-3-il)-metil-rapamicină

13. 40-0-[(2S)-2,3-Dihidroxiprop1-il]]-rapamicină

14. 4O-O-(2-Acetoxi)-etil-rapamicină

15. 4O-O-(2-Nicotinoiloxi)-etil-rapamicină

16. 4O-O-[2-(N-morfolino]-acetoxi]etil-rapamicină

17. 4O-O-(2-N-imidazolilacetoxi)etil-rapamicină

18. 40-0-{2-N-Metil-N^,-piperazinil)acetoxi]-etil-rapamicină

19. 39-0-Desmetil-39,40-0,0etilen-rapamicină

20. (26R]-26-Dihidro-4O-O-(2-hidroxi)-etil-rapamicină

21. 28-0-Metil-rapamicină

22. 400-(2-Aminoetil]-rapamicină

23. 4O-O-(2-Acetaminoetil)-rapamicină

24. 4O-O-(2-Nicotinamidoetil)-rapamicină

25. 4O-O-[2-(N-Metil-imidazo-2'ilcarbetoxamido)-etil]-rapamicină

26. 40-0-(2-Etoxicarbonilaminoetilj-rapamicină

27. 40-0-(2-Tolilsulfonamidoetil]rapamicină

28. 4O-O-[2-(4',5'-DicarboetoxiT, 2', 3'-triazol-1 '-il]-etil]-rapamicină.

Noii compuși utilizați ca imunosupresanți sunt rapamicinele care au Q substituit în poziția 40, unde X și Y sunt

O, R₂ este H, R₄ este metil și R.] este altul decât H; cel mai preferat este noul compus, în care Rt este ales dintre hidroxialchil, hidroxialcoxialchil, acilaminoalchil și aminoalchil.

Noii compuși utilizați preferențial sunt : 40-0-(2-hidroxi)-etil-rapamicină, 4O-O-(3-hidroxi]-propil-rapamicină, 40-0[2-(2-hidroxi)-etoxi]-etil-rapamicină și 400-(2-acetaminoetil]-rapamicină.

Realizarea substituției la O se face, în special, la C40 sau disubstitutia 0,0 la 028 și 40.

Rapamicina este adusă în reacție cu un radical organic legat de o grupare activă (ca de exemplu, RX, unde R este un radical organic cum ar fi, un alchil, alil sau benzii, care se recomandă ca substituent de O și X o grupare activă, cum ar fi, CCI₃C(NH)O sau CF₃S0₃ , în condiții de reacție corespunzătoare. Se recomandă condiții de mediu acid sau neutru (de exemplu, în prezența unui acid cum ar fi, acidul trifluorometansulfonic, acid camforsulfonic, acid p-toluensulfonic sau sărurile lor cu piridiniu, cu săruri de piridiniu substitiut ,când X este CCI₃C(NH)0 sau în prezența unei baze cum ar fi piridina, piridina substitută, diizopropiletilamina, pentametilpiperidina, când X este CF₃S0₃ .

Substituirile la atomul de O numai la 028 sunt realizate în același mod, dar cu protejare prioritară la C40. Sunt posibile și modificări ulterioare, cum ar fi în cazul în care substituentul este un alil. In acest caz, compusul realizat prin monosubstituirea dublei legături a radicalului alil este foarte predispus unor modificări ulterioare.

Compușii din grupul 9-deoxorapamicină se realizează, mai ales, prin reducerea unei rapamicine utilizând H₂S, în cadrul reacției dintre rapamicină și difenildiseleniu plus tributilfosfină. Același rezultat se poate obține și printr-o altă reacție de reducere corespunzătoare.

Compușii din grupul 26-dihidrorapamicină se realizează, mai ales, prin reducerea rapamicinelor sau a grupului 9-deoxorapamicinelor, pornind de la forma ceto și ajungând la hidroxi la C26,

RO 114451 Bl printr-o reacție blândă de reducere cum ar fi, o reacție de reducere cu hidrură de bor.

Se dau, în continuare, mai multe exemple de preparare a compușilor, conform invenției.

Exemplul 1. 4O-O-Benzilrapamicina

La o soluție menținută sub agitare, constituită din rapamicină în cantitate de 183 mg (0,200 mmol) în 2,1 ml amestec 2 : 1 de ciclohexan-clorură de metilen se adaugă 75 pl (0,402 mmol) de tricloroacetimidat de benzii, urmat de 2,6 μΙ (29 μπιοΙ 15 mol %) acid trifluorometansulfonic și în scurt timp amestecul devine galben. După 3 h, amestecul este diluat cu acetat de etil și răcit brusc cu soluție apoasă 10% de bicarbonat de sodiu. Straturile sunt separate și stratul apos este extras de două ori cu acetat de etil. Soluția organică reunită este spălată cu soluție apoasă 10% de bicarbonat de sodiu, uscată peste sulfat de sodiu anhidru, filtrată și concentrată sub presiune redusă. Reziduul este purificat prin cromatografie pe coloană de silicagel (50:50 hexanacetat de etil), obținându-se 40-0-benzilrapamicină sub formă de solid amorf, alb: ¹H RMN (CDCI₃) δ 0,73 (1H, dd),

1,65 (3H, s), 1,73 (3H. s), 3,12 (4H, s și m), 3,33 (3H, s), 3,49 (3H, s), 4,15 (1H, bd), 4,65 (1H, d), 4,71 (1H, d), 7,22-7,38 (5H, m); MS (FAB) m/z 1026 ((M+Na]⁺), 972 ((M-0CH3]⁺), 954 ([M-(0CH3 + H₂0)]⁺).

MBA (rel. IC₅₀) : 1,8

IL-6 dep. prol. (rel. IC₅₀) : 10 MLR (rel. IC₅₀) : 110

Exemplul 2.4O-O-(4'-Hidroximetil}-benzilrapamicină

a). 4O-O-[4'-(terț-Butildimetilsilil)oximetil]-benzilrapamicină

La o soluție menținută sub agitare, răcită la -78°C, formată din 345 μΙ (2,0 mmol) anhidridă triflică în 5 ml clorură de metilen se adaugă o soluție de 504 mg (2,0 mmol) de alcool 4-(terțbutildimetilsilil)-oximetilbenzilic și 820 mg (4,0 mmol) de 2,6-di-terț-butil-4-metilpiridină în 5 ml clorură de metilen.

Amestecul rezultat este încălzit la -20°C și agitarea este continuată la această temperatură, timp de 0,5 h. Amestecul este apoi răcit din nou, la -78°C și este adăugată o soluție de 914 mg (1,0 mmol) de rapamicină în 5 ml clorură de metilen. Acest amestec este lăsat să se încălzească la temperatura camerei peste noapte și, apoi ,este răcit cu soluție apoasă 10% de bicarbonat de sodiu. Straturile sunt separate și stratul apos este extras cu acetat de etil. Soluția organică reunită este spălată cu o soluție saturată salină, uscată peste sulfat de sodiu, filtrată sub presiune redusă și concentrată. Reziduul este purificat prin cromatografie pe coloană pe silicagel (50:50 hexan-acetat de etil), obținându-se 40-0-( 4'-( terț-butildimetilsilil]oximetilj-benzilrapamicină sub formă de spumă albă : MS (FAB) m/z 1170 ((M+Na]⁺), 1098 ([M-(0CH₃ + H₂0)]⁺).

b). 40-0-(4 '-HidroximetilJ-benzilrapamicină

La o soluție menținută sub agitare, răcită la 0°C, formată din 98 mg (0,093 mmol) de compus obținut în exemplul 2, în 2 ml de acetonitril se adaugă 0,2 ml de HF-piridină. Amestecul rezultat este agitat, timp de 2 h și răcit cu soluție apoasă de bicarbonat de sodiu, apoi, este extras cu acetat de etil. Soluția organică este spălată cu soluție salină, uscată peste sulfat de sodiu, filtrată și concentrată. Reziduul este purificat prin cromatografie pe coloană de silicagel (20:80 hexan-acetat de etil), obținându-se compusul din titlu sub formă de spumă albă : ¹H RMN (C0CI3 ) δ 0,73 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,74 (3H, s), 3,22 (1H, m), 4,67 (4H, m), 7,35 (4H, m); MS (FAB) m/z 1056 ((M+Na]⁺), 1002 ((M-0CH3]⁺), 984 ([M-(0CH3 + H20)]⁺), 966 ([M-(0CH3 + 2H₂0]]⁺), 934 ([M-(0CH₃ + CH₃0H + 2H₂O)]⁺] .

MBA (rel. IC₅₀) : 2,7

IL-6 dep. prol. (rel. IC₅₀) : 3,9 MLR (rel. IC₅₀) : 3

Exemplul 3 . 40-0-(4-(1,2-Dihidroxietil)]-benzilrapamicină a}. 40-0-(4'-(2,2-Dimetil-1,3-dioxolan-4-il]]-benzilrapamicină

RO 114451 Bl

In 10 ml de amestec 1:1 ciclohexan-clorură de metilen se dizolvă 452 mg (1,24 mmol) de tricloroacetimidat de 4-(2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-il)benzil, urmat de 0,14 ml (0,64 mmol) de 2,6- 5 di-terț-butilpiridină și 56 pl (0,64 mmol) de acid trifluorometansulfonic. La acest amestec este adăugată o soluție de 587 mg (0,64 mmol) de rapamicină în 2 ml clorură de metilen. Masa de reacție se io agită peste noapte la temperatura camerei și se răcește cu soluție apoasă de bicarbonat de sodiu. Straturile sunt separate și stratul apos este extras de două ori cu acetat de etil. Soluția or- 15 ganică combinată este spălată cu soluție salină saturată, uscată peste sulfat de sodiu anhidru, filtrată și concentrată. Reziduul este purificat prin cromatografie pe coloană de silicagel (50 : 50) hexan - 20 acetat de etil) și se obține 40-0-(4-(2,2dimetil-1,3-dioxolan-4-il)]-benzilrapamicină sub formă de solid alb,amorf: ¹H RMN (CDCI3 ) δ 0,73 (1H, dd), 1,48 (3H, s), 1,55 (3H, s), 1,65 (3H, s), 1,74 (3H, 25 s), 3,67 (3H, m), 4,28 (1H, dd), 4,62 (1H, d), 4,69 (1H, d), 5,06 (1H, dd), 7,33 (4H, m); MS (FAB) m/z 1126 ((M+Na]⁺), 1072 ((M-0CH3]⁺), 1054 ([M-(0CH3 + H20)]⁺), 1014 ([M-(0CH3 + 3 0 CH₃C0CH₃)]⁺), 996 ([M-(0CH₃ +

H₂0+CH₃C0CH₃)r), 978 ([M-(0CH₃ + 2H₂0+CH₃C0CH₃)]⁺).

b). 4DO-[4'-(1,2-Dihidroxietil)]~benzilrapamicină 3 5

La o soluție formată din 90,7 mg (0,08 mmol) de 40-0-[4'-(2,2-dimetil-1,3dioxolan-4-il))-benzilrapamicină în 4 ml metanol se adaugă 1 ml de soluție apoasă 1N de HCI. După 2 h amestecul 40 este răcit cu soluție apoasă de bicarbonat de sodiu și extrasă de două ori cu acetat de etil. Soluția organică este spălată cu soluție salină, uscată peste sulfat de sodiu anhidru și concentrată. Reziduul 45 este purificat pe coloană cromatografică pe silicagel (acetat de etil) și este obținut compusul din titlu sub formă de spumă albă : ¹H RMN (CDCI₃ ) δ 0,73 (1H, dd),

1,65 (3H, s], 1,74 (3H, s), 3,70 (4H, 50 m), 4,63 (1H, d), 4,69 (1H, d), 4,80 (1H, dd), 7,33 (4H, m); MS (FAB) m/z

1086 ((M+Na]⁺), 1032 ((M-0CH3)⁺), 1014 ([M-(0CH3 + H₂0]⁺), 996 ([M(OCH_a + 2H₂0)]⁺).

MBA (rel. IC₅₀) : 0,92

IL-6 dep. prol. (rel. IC₅₀) : 10,5 MLR (rel. IC₅₀) : 22

Exemplul 4.4O-O-Alilrapamicină

La o soluție menținută sub agitare, răcită la -78°C, formată din 0,33 ml (2,01 mmol) anhidridă triflică în 10 ml clorură de metilen se adaugă lent o soluție de 0,14 ml (2,06 mmol) alcool alilic și 0,42 g (2,04 mmol) de 2,6-diterț-butil-4-metilpiridină în 5 ml de clorură de metilen. Soluția de culoare verzuie rezultată este agitată timp de 1,5 h și se adaugă o soluție de 915 mg (1,00 mmol) de rapamicină și 0,42 g (2,04 mmol) de 2,6-di-terț-butil-4-metilpiridină în 5 ml de clorură de metilen. Agitarea este continuată timp de 0,5 h ,la -78°C și apoi amestecul este încălzit la temperatura camerei. După încă 1 h amestecul este răcit cu soluție apoasă de bicarbonat de sodiu și straturile sunt separate. Stratul apos este extras de două ori cu acetat de etil. Soluția organică combinată este spălată cu soluție apoasă de bicarbonat de sodiu și cu soluție salină, uscată peste sulfat de sodiu anhidru, filtrată și concentrată. Uleiul de culoare verde, rezultat, este purificat prin cromatografie pe coloană de silicagel (60:40 hexan-acetat de etil), obținânduse compusul din titlu, sub formă de solid incolor, amorf: ¹H RMN (CDCI₃ ) δ 0,72 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,74 (3H, s), 3,05 (1H, m), 4,13 [2H, bd), 5,14 (2H, m), 5,27 (2H, m), 5,92 (2H, m); MS (FAB) m/z 976 ((M+Na]⁺), 922 ([M0CH3]⁺), 904 ([M-(0CH3 + H₂0]]⁺), 886 ([M-(0CH3 + 2H2D)D, 872 ([M(2CH30H+0H)]⁺), 854 ([M-(0CH3 +CH₃0H+2H₂0)]⁺).

MBA (rel. IC₅₀] : 1

IL-6 dep. prol. (rel. IC_5Q) : 8

MLR (rel. IC₅₀) : 260

Exemplul 5 .40-0-[3'-(2,2-Dimetil1,3-dioxolan-4[S)-il]-prop-21 '-il]rapamicină

La o soluție menținută sub agitare, răcită la -78°C, formată din 0,64 g

RO 114451 Bl s

(4,00 mmol) de E-(4S>4,5-0,0-izopropiliden-pent-2-en-1,4,5-triol și 1,26 g (6,00 mmol) de 2,6-di-terț-butil-4-metilpiridină în 20 ml clorură de metilen se adaugă 0,82 ml (5,00 mmol) anhidridă triflică. 5 Amestecul rezultat este agitat la această temperatură timp de 2 h și se adaugă o soluție de 1,82 g (2,00 mmol) rapamicină și 1,26 g (6,00 mmol) de 2,6-diterț-butil-4-metilpiridină în 5 ml clorură io de metilen. Amestecul este lăsat să se încălzească gradat la temperatura camerei peste noapte și este apoi răcit cu soluție apoasă de bicarbonat. Straturile sunt separate și stratul apos este extras 15 de trei ori cu acetat de etil. Soluția organică este spălată cu soluție apoasă de bicarbonat de sodiu și cu soluție salină este uscată peste sulfat de sodiu anhidru, filtrată și concentrată. Reziduul 20 este purificat prin cromatografie pe coloană de silicagel (40:60) hexan-acetat de etil) obținându-se compusul din titlu sub formă de solid alb : ¹H RMN (CDCI3) δ 0,72 (1H, dd), 1,38 (3H, s), 1,42 25 (3H, s), 1,65 (3H, s), 1,73 (3H, s], 3,06 (1H,m), 3,58 (2H, m), 4,08(1 H, dd), 4,15 (2H, m), 4,52 (1H, bdd), 5,72 (1H, m), 5,88 (1H, m); MS (FAB) m/z 1076 ([M+Na]⁺], 1022 ([M-0CH3]⁺], 3 0 1004 ([M-(0CH3 + H20]⁺), 964 ([M(0CH3 +CH₃C0CH₃))⁺), 946 ([M-(0CH3 +H20 + CH3C0CH3)]⁺) 946 ([M-(0CH3 +2H_P0 + CH₃C0CH₃)]⁺).

MBA (rel. IC₅₀) : 0,64 35

IL-6 dep. prol. (rel. IC₅₀] : 11 MLR (rel. IC₅₀) : 8

Exemplul 6 . (2Έ,43)-40^0-(4^5Dihidroxipent-2'-en-1 '-il)-rapamicina

Se aplică condițiile de reacție des- 40 criseîn exemplul 3, etapa b) la compusul obținut în exemplul precedent, urmate de purificarea printr-o coloană de cromatografie pe silicagel (95:5 acetat de etil metanol), obținându-se compusul din ti- 45 tiu, sub formă de spumă albă : ¹H RMN (CDCI3) δ 0,68 (1H, dd), 3,04 (1H, m), 4,18 (5H, m), 5,75 (1H, dd), 5,88 (1H, m); MS (FAB) m/z 1036 ([M+Na]⁺], 1013 (M⁺), 995 ((M-H20]⁺), 982 ([M- 50 0CH3]⁺), 964 ([M-(OCHg + H20)]⁺), 946 ([M-(QCH₃+2H₂0)]⁺), 914 ([M-(OCHg +CH₃0H+2H₂0 ))⁺).

MBA (rel. IC₅₀) : 1,7

IL-6 dep. prol. (rel. IC₅₀) : 12 MLR (rel. IC₅₀) : 3,5

Exemplul 7. 4O-O-(2-Hidroxi)etoxicarbonilmetil-rapamicina

a) . 40-0-(2-(terț-Butildimetilsilil)- oxij-etoxicarbonilmetil-rapamicina

La o soluție menținută sub agitare, formată din 2,74 g (3,00 mmol) de rapamicină și 30 mg (0,06 mmol) de tetraacetat de disodiu dihidrat în 30 ml clorură de metilen se adaugă o soluție de 0,38 ml (3,60 mmol) de diazoacetat de 2-(terț-butildimetilsilil]-oxietil în 10 ml clorură de metilen, timp de peste 5 h. După ce adăugarea este completă, agitarea este continuată timp de mai mult de 1 h, apoi amestecul de reacție este răcit cu soluție apoasă 1N de HCI. Straturile sunt separate și stratul apos este extras cu acetat de etil. Soluția organică combinată este spălată cu soluție apoasă de bicarbonat de sodiu și cu saramură, este uscată peste sulfat de sodiu anhidru, filtrată și concentrată. Reziduul este purificat prin cromatografie pe coloană de silicagel (40 : 60 hexan acetat de etil), obținându-se 40-0-(2(terț-Butildimetilsilil)-oxi]-etoxicarbonilmetil-rapamicina : ¹H RMN (CDCI3) δ 0,06 (6H, s),O,68 (1H, dd), 0,88 (9H, s),1,64 (3H, s), 1,73 (3H, s), 3,12 (5H,s și m), 3,81 (2H, dd], 4,19 (2H, dd], 4,32 (2H, s) ; MS (FAB) m/z 1152 ([M+Na]⁺], 1080 ([M-(0CH3 + H_a0)]⁺).

b) . 4O-O-[2-Hidroxi)-etoxicarbonilmetil-rapamicina

La o soluție menținută sub agitare, răcită la 0°C formată din 81 mg (0,07 mmol] de 400-(2-( terț-butildimetilsilil]-oxi]-etoxicarbonilmetil-rapamicină în 1,5 ml de acetonitril se adaugă 0,15 ml de HF-piridină. După 2 h, masa de reacție este răcită cu soluție apoasă de bicarbonat de sodiu. Amestecul este extras cu acetat de etil. Soluția organică este spălată cu saramură, uscată peste sulfat de sodiu anhidru, filtrată și concentrată. Reziduul este purificat prin PTLC (acetat de etil], obținându-se compusul din titlu, sub formă de solid alb :

RO 114451 Bl ¹H RMN (CDCI3) δ 0,70 (1H, dd], 1,65 (3H, s),1,75 (3H, s), 3,13 (5H,s și m), 3,85 (3H, m], 4,25 (5H, m) ; MS (FAB) m/z 1038 ([M+Na]⁺), 984 ((M-0CH3]⁺), 966 ([M-(0CH₃ + H₂0)D, 948 ([M-fOCHg +2H₂0)]⁺).

MBA (rel. IC₅₀) : 4

IL-6 dep. prol. (rel. IC₅₀) : 9,7 MLR (rel. IC₅₀) : 2,1

Exemplul 8.4O-O-[2-Hidroxi]-etil· rapamicina

a) . 40-0-[2-[terț-Butildimetilsilil]- oxi]-etil-rapamicina

O soluție de 9,14 g (10 mmol) de rapamicina și 4,70 ml (40 mmol) de 2,6-lutidină în 30 ml toluen este încălzită la 60°C și este adăugată o soluție de 6,17 g (20 mmol) triflat de 2-(terț-butildimetilsilil)-oxietil și 2,35 ml (20 mmol) de 2,6-lutidină în 20 ml toluen. Acest amestec este agitat timp de 1,5 h. Apoi se adaugă două porțiuni de soluție de 3,08 g (10 mmol) triflat și 1,2 ml (10 mmol) de 2,6-lutidină în 10 ml toluen, la un interval de 1,5 h. După adăugarea ultimei porțiuni, agitarea este continuată la 60°C, timp de 2 h și suspensia brună rezultată este filtrată. Filtratul este diluat cu acetat de etil și spălat cu soluție apoasă de bicarbonat de sodiu și cu saramură. Soluția organică este uscată peste sulfat de sodiu anhidru, filtrată și concentrată. Reziduul este purificat prin cromatografie, pe coloană de silicagel (40:60 hexan- acetat de etil), obținânduse 40-0-(2-( terț-butildimetilsilil)-oxi]-etil-rapamicina sub formă de solid alb : ¹H RMN (CDCI3) δ 0,06 (6H, s), 0,72 (1H, dd), 0,90 (9H, s),1,65 (3H, s), 3,02 (1H, m), 3,63 (3H, m), 3,72 (3H, m) ; MS (FAB) m/z 1094 ((M+Na]⁺), 1022 ([M-fDCHg +2H20)]⁺).

b] . 4O-O-[2-Hidroxi]-etil-rapamicina

La o soluție menținută sub agitare, răcită la 0°C, formată din 4,5 g (4,2 mmol) de 40-0-(2-( terț-butildimetilsilil)-oxi]-etil-rapamicină în 20 ml metanol se adaugă 2 ml de soluție 1N de HCI. Această soluție este agitată timp de 2 h și neutralizată cu soluție apoasă de bicarbonat de sodiu. Amestecul este extras cu trei porțiuni de acetat de etil.

Soluția organică este spălată cu soluție apoasă de bicarbonat de sodiu și cu saramură, uscată peste sulfat de sodiu anhidru, filtrată și concentrată. După purificarea prin cromatografie pe coloană de silicagel (acetat de etil) se obține compusul din titlu, sub formă de solid alb: ¹H RMN (CDCI₃) δ 0,72 (1H, dd),

1,65 (3H, s),1,75 (3H, s), 3,13 (5H,s și m), 3,52-3,91 (8H, m), MS (FAB) m/z 980 ((M+Na]⁺), 926 ((M-0CH3]⁺), 908 ([M-(0CH3 + H₂0]]⁺), 890 ([M-(0CH3 +2H20)]⁺), 876 ((M-(2CH30H+0H)]⁺),

858 ([M-(0CH₃ +CH₃0H+2H₂0)]⁺).

MBA (rel. IC₅₀) : 2,2

IL-6 dep. prol. (rel. IC₅₀) : 2,8 MLR (rel. IC₅₀) : 3,4

Exemplul 9.4O-O-[3-Hidroxi)-propil-rapamicina

a) . 40-0-[3-[terț-Butildimetilsilil)oxi]-propil-rapamicina

Prin același procedeu, așa cum s-a descris în exemplul 8, etapa a), utilizând triflat de 3-(terț-butildimetilsilil)-oxi)prop-1-il se obține 40-0-(3-(terț-butildimetilsilil)-oxi]-propil-rapamicina : ¹H RMN (CDCI₃) δ 0,05 (6H,s), 0,72 (1H, dd), 0,90 (9H,s), 1,65 (3H, s),1,74 (3H, s),

1,77 (2H, m), 3,03 (1H, m),3,52-3,73 (7H, m), MS (FAB) m/z 1108 ((M+Na]⁺), 1036 ([M-(0CH₃ + H₂0)]⁺).

b) . 4O-O-(3-Hidroxi]-propil-rapamicina

Prin tratarea compusului obținut în etapa a) ,în condițiile descrise în exemplul 8, etapa b) se obține compusul din titlu : ¹H RMN (CDCI₃)6 0,72 (1H, dd),

1,65 (3H, s),1,75 (3H, s), 1,80 (2H, m), 3,05 (1H, m), 3,55-3,91 (8H, m); MS (FAB) m/z 994 ((M+Na)⁺), 940 ([M0CH3]⁺), 922 ([M-(0CH3 + H₂0)]⁺), 904 ([M-(0CH3 +2H20)]⁺), 872 ([M-(0CH3 +CH₃0H+2H₂0)]⁺).

MBA (rel. IC₅₀) : 1,6 IL-6 dep. prol. (rel. IC₅₀) : 2,7 MLR (rel. IC₅₀) : 11

Exemplul 10 . 4O-0-[3-Hidroxi)hexil-rapamicina

a). 40-0-[3-{terț-Butildimetilsilil]oxi]-hexil-rapamicina

Prin același procedeu așa cum s-a descris în exemplul 8, etapa a), utili

RO 114451 Bl zând triflat de 3-(terț-butildimetilsilil)-oxi]hex-1-il se obține 40-0-(3-( terț-butildimetilsilil)-oxi]-hexil-rapamicina : MS (FAB) m/z 1150 ((M+Na]⁺).

b) .4O-O-[3-Hidroxi)-hexil-rapamicina

Prin tratarea compusului obținut în etapa a) în condițiile descrise în exemplul 8, etapa b) se obține compusul din titlu : ¹H RMN (CDCIJδ 0,72 (1H, dd), 1,38 (2H, m), 1,57 (4H, m), 1,65 (3H, s),1,74 (3H, s), 3,02 (1H, m), 3,493,72 (8H, m); MS (FAB) m/z 1036 ([M+Na]⁺], 982 ((M-0CH3]⁺), 964 ([M(0CH3 + H₂0]⁺), 946 ([M-(0CH₃ + 2H₂0)]⁺), 914 ([M-(0CH ₃ +CH₃0H+2H₂0)]⁺).

MBA (rel. IC₅₀) : 0,8

IL-6 dep. prol. (rel. IC₅₀) : 8,5

MLR (rel. IC₅₀) : 18

Exemplul 11.400-[2-(2-Hidroxi)etoxi]-etil-rapamicina a ). 4D-0-[2-(terț-Butildimetilsilil)oxietoxi]-etil-rapamicina

Prin același procedeu așa cum s-a descris în exemplul 8, etapa a), utilizând triflat de 2-[2-(terț-butildimetilsilil)oxietoxi]-etil se obține 40-0-(2-( terț-butildimetilsilil)-oxietoxi]-etil-rapamicina : ¹H RMN (CDCI3) δ 0,06 (6H, s), 0,71 (1H, dd), 0,88 (9H, s), 1,65 (3H, s),1,74 (3H, s), 3,07 (1H, m), 3,51-3,79 (11H, m); MS (FAB) m/z 1138 ((M+Na]⁺), 1115 (M⁺), 1097 ([M-H20]⁺),1084 ([M0CH3]⁺), 1066([M-(0CH3 + H₂0)D, 1048 ([M-(0CH₃ +2H₂0)]⁺), 1034 ((M(2CH30H+0H)]⁺), 1016 ([M-(0CH3 +CH₃0H+2H₂0)]⁺).

b) . 40-0-[2-(2-Hidroxi)-etoxi]-etilrapamicina

Prin tratarea compusului obținut în etapa a) în condițiile descrise în exemplul 8 etapa b) se obține compusul din titlu : Ή RMN (CDCI₃) δ 0,72 (1H, dd),1,65 (3H, s),1,74 (3H, s), 3,05 (1H, m), 3,51-3,77 (8H, m); MS (FAB) m/z 1024 ([M+Na]⁺], 1001 (M⁺), 983 ((M-H20]⁺), 970 ((M-0CH3]⁺), 952 ([M(0CH3 + H20)]⁺), 934 ([M(0CH3+2H ^0)]⁺), 920 ([M(2CH30H+0H)]⁺), 902 ((M-(0CH3 +CH₃0H+2H₂0)]⁺).

MBA (rel. IC_5O) : 1,2

IL-6 dep. prol. (rel. IC_5n) : 3,2 MLR (rel. IC₅₀) : 2

Exemplul 12 . 40-0-[(3S)-2,2Dimetildioxolan-3-il]-metil-rapamicina

Prin același procedeu descris în exemplul 8, etapa s) utilizând triflat de glicerol acetonidă se obține compusul din titlu : ¹H RMN (CDCI3) δ 0,72 (1H, dd),1,36 (3H, s),1,42 (3H, s), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, s), 3,06 (1H, m), 3,55 (2H, m), 3,69 (3H, m), 4,06 (1H, dd], 4,26 (1H, m); MS (FAB) m/z 1050 ([M+Na)⁺),996 ((M-0CH3]⁺), 978 ([M(0CH3 + H2O)]⁺), 960 ([M-(0CH3 +2Η₂0)Γ).

MBA (rel. IC₅₀) : 0,9

IL-6 dep. prol. (rel. IC₅₀) : 8

MLR (rel. IC₅₀) : 290

Exemplul 13 . 40-0-[(2S]-2,3Dihidroxiprop-1 -il]-rapamicina

Prin tratarea compusului obținut în exemplul anterior în condițiile descrise în exemplul 3 se obține compusul din titlu : ¹H RMN (CDCI3) δ 0,72 (1H, dd),1,65 (3H, s),1,75 (3H, s), 3,07 (1H, m), 3,68 (8H, m); MS (FAB) m/z 1010 ([M+Na]⁺),956 ((M-0CH3]⁺), 938 ([M-(0CH3 + H2O))⁺), 920 ([M-(0CH3 +2H₂O)]⁺).

MBA (rel. IC₅₀) : 0,67

IL-6 dep. prol. (rel. IC_5Q) : 9

MLR (rel. IC₅₀) : 10

Exemplul 14 . 40-0-(2-Acetoxi]etil-rapamicina

La o soluție menținută sub agitare, răcită la 0°C, de 53 mg (0,0055 mmol) de 30-0-hidroxietil-rapamicină în 2 ml clorură de metilen se adaugă 0,2 ml piridină, urmată de 0,02 ml (0,281 mmol) clorură de acetil. Amestecul de reacție este agitat timp de 3 h și este diluat cu acetat de etil, apoi spălat cu soluție apoasă de bicarbonat de sodiu, soluție 1N, rece de HCI și din nou cu soluție apoasă de bicarbonat de sodiu. Soluția organică este uscată peste sulfat de sodiu anhidru, filtrată și concentrată. Reziduul este purificat prin cromatografie, pe coloană de silicagel (30:70 hexan acetat de etil), obținându-se produsul din titlu, sub formă de solid alb :

RO 114451 Bl ¹H RMN (CDCIJ δ 0,72 (1H, dd),1,65 (3H, s), 1.75 (3H, s), 2,08 (3H, s), 3,07 (1H, m), 3,78 (2H, dd), 4,20 (2H, dd); MS (FAB) m/z 1022 ((M+Na]⁺), 989 (M⁺), 968 ((M-OCH3]⁺), 950 ([M(0CH3 + H₂0)]⁺), 932 ([M-(0CH₃ +2H₂0)]⁺), 918 ([M-(2CH30H +0H)]⁺), 900 ([M-iOCHg +CH30H+ 2H₂O)]⁺).

MBA (rel. IC₅₀) : 2

IL-6 dep. prol. (rel. IC₅₀) : 7,6 MLR (rel. IC₅J : 3,6

Exemplul 15 . 40-0-[2-Nicotinoiloxi]-etil-rapamicina

Prin același procedeu, așa cum s-a descris în exemplul anterior, utilizând clorură de nicotinoil clorhidrat, se obține compusul din titlu : ¹H RMN (CDCI₃) δ 0,72 (1H, dd),1,65 (3H, s), 1,75 (3H,

s) , 3,07 (1H, m), 3,94 (2H, dd), 4,49 (2H, t), 7,39 (1H, dd), 8,31 (2H, ddd),

8,78 (1H, ddd), 9,24 (1H, dd); MS (FAB) m/z 1085 ((M+Na]⁺), 1063 ([M +H]⁺), 1045 ([M-0H]⁺), 1031 ([M- □CH₃]⁺), 1013([M-(0CH₃ + H₂0)F).

MBA (rel. IC₅₀) : 1,1

IL-6 dep. prol. (rel. IC₅₀) : 6,9 MLR (rel. IC₅₀) : 5

Exemplul 16 .4O-O-[2-(N-Morfolino]-acetoxi]-etil-rapamicina

a) . 40O-(2-Bromoacetoxi)-etil-rapamicina

Prin același procedeu descris în exemplul 14, utilizând clorură de bromoacetil se obține 40-0-(2-bromoacetoxi)etil-rapamicina : ¹H RMN (CDCI₃) δ 0,72 (1H, dd),1,67 (3H, s), 1,76 (3H, s), 3,03 (1H, m), 3,82 (2H, m), 4,49 (2H,

t) , 3,87 (2H, s), 4,31 (2H, m); MS (FAB) m/z 1010, 1102 ((M+Na]⁺), 1077 (M⁺), 1061 ([Μ -H20 ]⁺), 1046, 1048 ([M-0CH3]⁺), 1028, 1030 ([M(0CH3 + HP0)]⁺), 1012 ([M-(0CH3 + 2H₂0)]⁺), 996 ([M-(2CH3 0H+ 0H)]⁺), 980 ([M-(CCH3 + CH₃0H + 2H₂0)]⁺).

b] . 4O-O-[2-[N-Morfolino}-acetoxi]etil-rapamicina

La o soluție menținută sub agitare, răcită la -45°C, de 54 mg (0,05 mmol) de 4O-O-(2-bromoacetoxi)-etil-rapamicină în 0,5 ml dimetilformamidă este adăugată o soluție de 0,022 ml (0,25 mmol) morfolinăîn 0,2 ml dimetil formamidă și amestecul rezultat este agitat la această temperatură timp de 1 h, apoi este tratat cu soluție apoasă de bicarbonat de sodiu. Acest amestec este extras de trei ori cu acetat de etil. Soluția organică este spălată cu saramură, uscată peste sulfat de sodiu anhidru, filtrată și concentrată. Reziduul este purificat prin cromatografie pe coloană de silicagel (95:5 acetat de etil - metanol), obținându-se compusul din titlu, sub formă de solid al, amorf : ¹H RMN (CDCIJ δ 0,72 (1H, dd),1,67 (3H, s), 1,76 (3H, s), 2,60 (3H, m), 3,07 (1H, m), 3,24 (2H, s), 3,78 (8H, m), 4,27 (2H, t); MS (FAB) m/z 1107 ((M+Na]⁺), 1085 (M +H)⁺), 1067 ([M-0H]⁺), 1053 ((M-OCHJ*), 1035 ([M-(0CH₃ + H₂0)]⁺).

MBA (rel. IC₅₀) : 1,3 IL-6 dep. prol. (rel. IC₅₀) : 4 MLR (rel. IC₅₀) : 3,5

Exemplul 17. 4O-O-(2-N-lmidazolilacetoxi)-etil-rapamicina

Prin același procedeu descris în exemplul 16 etapa b) ,dar utilizând imidazol, se obține compusul din titlu: ¹H RMN (CDCIJ δ'0,72 (1H, dd),1,67 (3H, s),

1,78 (3H, s),3,06 (1H, m), 3,80 (2H, m), 4,32 (2H, m), 4,73 (2H, s), 6,97 (1H, dd), 7,09 (1H, dd), 7,52 (1H, dd); MS (FAB) m/z , 1066 ([M +H]⁺), 1048 ([M-OHJJ, 1034 ([M-OCHJJ, 1016 ([M(0CH₃ + H₂0)F).

MBA (rel. IC₅J : 1 IL-6 dep. prol. (rel. IC₅J : 7,6 MLR (rel. IC₅₀) : 3,4

Exemplul 18. 40-0-[2-(Ν-Μβ^Ν’piperazinil]-acetoxi]-etil-rapamicina

Prin același procedeu descris în exemplul 16 etapa b), dar utilizând Nmetilpiperazină, se obține compusul din titlu: ¹H RMN (CDCIJ δ 0,72 (1H, dd),1,67 (3H, s), 1,77 (3H, s), 2,78 (4H, s și m), 3,02 (4H, bs), 3,08 (1H, m), 3,32 (2H, s), 3,80 (1H, dd), 4,27 (2H, t) ; MS (FAB) m/z , 1098 ([M +H]⁺), 1066 ([M-OCHJJ.

MBA (rel. IC₅₀) : 2,6 IL-6 dep. prol. (rel. IC₅J : 10,3 MLR (rel. IC₅₀) : 5

Exemplul 19 . 30 - O - DesmetilRO 114451 Bl

39,40-0,O-etilen-rapamicina

La o soluție menținută sub agitare, răcită la -2O°C, din 48 mg (0,05 mmol) de 40-0-hidroxietil-rapamicină și 0,023 ml (0,20 mmol) de 2,6-lutidină în 0,5 ml clorură de metilen se adaugă 0,008 ml (0,05 mmol) anhidridă triflică. Amestecul de reacție este agitat la această temperatură, timp de 2 h, apoi este lăsat să se încălzească la temperatura camerei și se agită timp de mai mult de o oră. Masa de reacție este răcită cu soluție apoasă de bicarbonat de sodiu și amestecul rezultat este extras cu trei porțiuni de acetat de etil. Soluția organică este spălată cu saramură, uscată peste sulfat de sodiu anhidru, filtrată și concentrată. Reziduul este purificat prin cromatografie pe coloană de silicagel (30 : 70 hexan - acetat de etil), obținându-se compusul din titlu sub formă de solid alb : ¹H RMN (CDCI₃) δ

1,66 (3H, s), 1,75 (3H, s), 3,14 (3H, s), 3,35 (3H, s), 3,76 (4H, s); MS (FAB) m/z, 948 ([M +Na]⁺), 925 (M⁺) 908 ((M-0H]⁺), 894 ((M-0CH3]⁺), 876 ([M(0CH3 + H₂0)]⁺), 858 ([M-(0CH3 +2 H20))⁺), 844 ([M-(2CH30H + 0H)]⁺), 826 ([M-(0CH₃ + CH₃0H + 2 H₂0)]⁺).

MBA (rel. IC₅₀) : 1,6

IL-6 dep. prol. (rel. IC₅₀) : 22,9 MLR (rel. IC₅₀) : 16

Exemplul 20 . (26R)-26-Dihidro4O-O-(2-hidroxi]-etil-rapamicina

a]. [26R]-26-Dihidro-4O-O-[2-(terțbutildimetilsililoxi)]-etil-rapamicina

In 4,5 ml amestec 2 : 1 acetonitril - acid acetic se dizolvă 315 g (1,2 mmol) de triacetoxiborohidrură de tetrametilamoniu. Soluția rezultată este agitată timp de 1 h, la temperatura camerei și răcită la -35°C, apoi se adaugă 161 mg (0,15 mmol) de 4OO-[2-(terțbutildimetilsilil)-oxi]-etil-rapamicină. Amestecul rezultat este agitat la aceiași temperatură, peste noapte și este răcit prin adăugare de soluție apoasă de bicarbonat de sodiu. Amestecul este extras cu trei porțiuni de acetat de etil. Soluția organică este spălată cu soluție apoasă de bicarbonat de sodiu, două porțiuni de soluție apoasă 30% sare

Rochelle și cu saramură, este uscată peste sulfat de sodiu anhidru, filtrată și concentrată. Reziduul este purificat prin cromatografie pe coloană de silicagel (40 : 60 hexan - acetat de etil) obținându-se compusul din titlu sub formă de solid alb : ¹H RMN (CDCI3) δ 0,06 (6H, s), 0,73 (1H, dd), 0,90 (9H, s), 1,64 (3H, s), 1,67 (3H, s), 3,02 (1H, m), 3,15 (1H, m), 3,64 (3H, m), 3,71 (1H, dd), 3,91 (1H, s); MS (FAB) m/z , 1096 ([M +Na]⁺), 1041 ((M-H0CH3)⁺), 1024 ([M-(0CH3 + H20)]⁺), 1006 ([M(0CH3 +2 H₂0)]⁺), 974([M-(0CH₃ + CH₃0H + 2 H₂0)]⁺).

b). [26R)-2B-Dihidro-4D-0-(2-hidroxi)-etil-rapamicina

Prin tratarea compusului obținut în etapa a) în condițiile descrise în exemplul 8, etapa b) se obține compusul din titlu : ¹H RMN (CDCI₃)0 0,75 (1H, dd),

1,66 (3H, s), 1,70 (3H, s), 3,18 (1H, m), 3,52-3,84 (7H, m); MS (FAB) m/z , 982 ([M +Na]⁺), 928 ((M-0CH3]⁺), 910 ([M-(0CH3 + H_P0)⁺), 892 ([M-(0CH₃+2H₂0)]⁺).

MBA (rel. IC₅₀) : 3,9

IL-6 dep. prol. (rel. IC₅₀) : 53

MLR (rel. IC₅₀) : 18

Exemplul 21. 28-0-Metil-rapamicina

La o soluție menținută sub agitare de 103 mg (0,1 mmol) 4O-0-TBS-rapamicină (obținută prin sililarea rapamicinei cu 1 echivalent de triflat de TBS în clorură de metilen, în prezența a 2 echivalenți de 2,6-lutidină la 0°C) în 0,5 ml clorură de metilen se adaugă 85,8 mg (0,40 mmol) de absorbant de protoni urmat de 44 mg (0,30 mmol) de tetrafluoroborat de trimetiloxoniu. Amestecul eterogen, brun, rezultat, este agitat peste noapte, răcit cu soluție apoasă de bicarbonat de sodiu și extras cu acetat de etil. Soluția organică este spălată cu soluție apoasă 1N de HCI, soluție apoasă de bicarbonat de sodiu și cu saramură, apoi este uscată peste sulfat de sodiu anhidru, filtrată și concentrată. Reziduul este purificat prin cromatografie, pe coloană de silicagel (60 : 40 hexan - acetat de etil) obținându-se 40 - □ - terț - butilRO 114451 Bl dimetilsilil-28-O-metil-rapamicină. Acest ultim compus este desililat în condițiile descrise în exemplul 10, etapa b), obținându-se, după PTLC (acetat de etil), compusul din titlu, sub formă de solid alb: ¹H RMN (CDCI3) δ 0,70 (1H, dd), 1,68 (6H, 2s), 2,95 (1H, m), 3,13 (3H, s), 3,14 (3H, s), 3,28 (3H, s), 3,41 (3H, s); MS (FAB) m/z , 950 ([M +Na]⁺), 927 (M⁺), 909 ([M-H20]⁺), 896 ((M-0CH3]⁺), 878 ([M-(0CH3 + H₂0)]⁺), 864 ([M-lOCHg +CH30H)]⁺), 846 ([M(2CH30H +OH)F), 832 ([M-(0CH₃ +2CH₃0H)]*J, 814 ([M-(3CH₃0H +0H)]⁺).

MBA (rel. IC₅₀) : 1,58

IL-6 dep. prol. (rel. IC₅₀) : 1240 MLR (rel. IC₅₀) : 1300

Exemplul 22.4O-O-[2-Aminoetil)rapamicina

a) . 4O-O-[2-bromoetil)-rapamicina □ soluție de 914 mg rapamicină în 5 ml toluen conținând 0,64 ml de 2,6lutidină și 1,28 g de triflat de 2-bromoetil este încălzită la 65°C, timp de 18 h. Amestecul de reacție este apoi răcit la temperatura camerei, este turnat în 20 ml soluție saturată de bicarbonat și extrasă cu 3 x 20 ml acetat de etil. Fazele organice sunt uscate peste carbonat de sodiu și solventul este îndepărtat la presiune redusă pe un evaporator rotativ. Reziduul este cromatografiat pe 100 g silicagel, eluând cu hexan/acetat de etil 372 și se obține 4O-O-(2-bromoetil)-rapamicina sub formă de solid amorf: MS (FAB) m/z , 1044 și 1042 (100% , M +Na), 972 si 970 (55%, M-(MeOH +H₂0)): ¹H RMN (CDCI₃) δ 0,72 (1H, q, J=12 Hz); 3,13 (3H, s); 3,33 (3H, s); 3,45 (3H, s); 3,9 (4H, m), 4,78 (1H, s).

b) . 4O-O-(2-azidoetil]-rapamicina

O soluție de 2,4 g 40-0-(2-bromoetil)-rapamicină în 40 ml dimetilformamidă este tratată cu 0,19 g azidă de sodiu, la temperatura camerei. După 2 h, amestecul este turnat în 100 ml soluție saturată de bicarbonat de sodiu și extras cu 3 x 100 ml acetat de etil. Fazele organice sunt reunite, uscate peste sulfat de sodiu și solventul este îndepărtat sub presiune redusă. Produsul brut este pu20 rificat prin cromatografie pe silicagel, eluând cu hexan/acetat de etil, obținându-se 400-(2-azidoetil)-rapamicina: MS (FAB) : 1005 (100%, M+Na); 951 (24%, M-MeOH); 933 (57%, M(MeOH+H₂O)).

c], 4O-O-(2-aminoetil)-rapamicina

La o soluție de 230 mg 40-0-(2azidoetil)-rapamicină în 3 ml THF/apă 5/1, la temperatura camerei se adaugă 307 mg de trifenilfosfină. Amestecul de reacție devine galben. După 7 h, amestecul de reacție este încărcat pe x g silicagel și cromatografiat cu acetat de etil/metanol/acid acetic 50/50/0,5, obținându-se produsul din titlu, sub formă de acetat : MS (FAB) m/z 979 (45%, M+Na); 957 (100%, MH); 925 (63%, M-Me0H); 907 (25%, M(Me0H+H₂0)).

MBA (rel. IC₅₀) : 0,7

IL-6 dep. prol. (rel. IC₅₀) : 10

Exemplul 23. 40-0-[2-Acetilaminoetilj-rapamicină

La o soluție de 101 mg de acetat de 4O-O-(2-aminoetil)-rapamicină în 2 ml tetrahidrofuran se adaugă 0,02 ml piridină și 0,07 ml clorură de acetil. Amestecul de reacție este menținut la temperatura camerei ,timp de 18 h și apoi este turnat în 7 ml soluție saturată de bicarbonat de sodiu. Faza apoasă este extrasă 3 x 5 ml acetat de etil, fazele organice sunt reunite și uscate peste sulfat de sodiu. Solventul este evaporat și reziduul este cromatografiat pe 10 g silicagel, eluând prima dată cu acetat de etil, urmat de acetat de etil/metanol/ acid acetic 50/50/0,5, obținându-se produsul din titlu : MS (FAB) m/z 1021 (20%, M+Na); 967 (28%, M-MeOH); 949 (100%, M-(Me0H + H₂0)): ¹H RMN (CDCIg) δ 0,71 (1H, q, J=12 Hz); 1,98 (3H, s); 3,13 (3H, s); 3,34 (3H, s); 3,44 (3H, s); 4,75 (1H, s).

MBA (rel. IC₅₀) : 1,1

IL-6 dep. prol. (rel. IC₅₀) : 2,3

Exemplul 24 . 4O-O-[2-Nicotinamidoetil)-rapamicină

Se dizolvă 101 mg acetat de 400-(2-aminoetil)-rapamicină în 5 ml acetat de etil și se extrage 2x cu soluție satu

RO 114451 Bl rată de bicarbonat de sodiu. Se dizolvă reziduul în 2 ml THF și se tratează apoi cu 22 mg DCC și 15 mg acid nicotinic. După menținerea masei de reacție timp de 15 h, la temperatura camerei, se realizează evaporarea, iar reziduul este cromatografiat pe silicagel, eluând cu acetat de etil, urmat de acetat de etil/ metanol 9/1, obținându-se produsul din titlu: MS (FAB) m/z 1084 (80%, M+Na); 1062 (40%, MH); 1038 (100%, M-MeOH); 1012 (50%, M(MeOH + H₂0)J: ¹H RMN (CDCI₃) δ 0,72 (1H, q, J=12 Hz); 3,13 (3H, s); 3,13 (3H, s); 3,33 (3H, s); 3,37 (3H, s); 7,39 (1H, dd; J=6 Hz, J=8Hz), 8,19 (1H, d, J=6 Hz), 8,75 (1H, d, J=6 Hz); 9,04 (1H, larg s).

MBA (rel. IC₅₀) : 1,2

IL-6 dep. prol. (rel. IC₅₀) : 2,8

Exemplul 25 . 40-0-[2-[N-Metilimidazol-2 '-ilcarboxamido)-etil]-rapamicină

La o soluție de 30 mg acid Nmetil-imidazol-2-carboxilic în 1 ml dimetilformamidă se adaugă 58 mg DCC și 58 mg HOBT. După 2 h, se adaugă 150 mg 4O-O-(2-aminoetil)-rapamicină și amestecul de reacție este agitat timp de 18 h, la temperatura camerei. Suspensia este apoi filtrată, filtratul este diluat cu 5 ml acetat de etil și spălat cu 2 x 2 ml soluție apoasă saturată de bicarbonat de sodiu. Faza organică este uscată peste sulfat de sodiu și solventul este evaporat sub presiune redusă. Reziduul este cromatografiat peste 10 g silicagel, eluând cu hexan/acetat de etil 1/4 și apoi cu acetat de etil, obținându-se produsul din titlu: MS (FAB) m/z 1087 (36%, M+Na); 1065 (57%, MH); 1033 (100%, M-MeOH); 1015 (46%, M(MeOH + H₂0J): ¹H RMN (CDCIJ δ 0,72 (1H, q, J=12 Hz); 3,13 (3H, s); 3,33 (3H, s); 3,46 (3H, s); 4,03 (3H, s),6,93 (1H, larg s), 6,98 (1H, larg s), 7,78 (1H, m).

MBA (rel. IC₅₀) : 1,1

IL-6 dep. prol. (rel. IC₅₀] : 7

Exemplul 26 . 40-0-[2-Etoxicarbonilaminoetil)-rapamicina

O soluție de 200 mg 40-0-(2azidoetilj-rapamicină în 3 ml THF/apă

5/1 este tratată cu 267 mg trifenilfosfină timp de 7 h, la temperatura camerei. Apoi se adaugă 0,4 ml piridină urmată de 194 pl cloroformiat de etil. După 2 h, amestecul de reacție este turnat peste 5 ml acetat de etil și spălat succesiv cu 10 ml soluție saturată de bicarbonat de sodiu, 5ml apă și 5 ml soluție 10% de acid citric. Faza organică este uscată peste sulfat de sodiu și solventul este evaporat. Reziduul este cromatografiat pe 20 g silicagel, eluând cu acetat de etil, urmat de acetat de etil/metanol 9/1 și se obține produsul din titlu: MS (FAB) m/z 1051 (35%, M+Na); 997 (30%, M-MeOH); 979 (100%, M-(MeOH + H₂0). ¹H RMN (CDCIg) δ 0,71 (1H, q, J=12 Hz); 1,24 (3H, t, J=8 Hz); 3,13 (3H, s); 3,34 (3H, s); 3,43 (3H, s); 4,10 (2H, q, J=8 Hz); 5,48 (1H, m).

MBA (rel. IC₅₀) : 1,1

IL-6 dep. prol. (rel. IC₅₀) : 1,7

Exemplul 27 . 4&O-[2-Tolilsulfonamidoetil)-rapamicină

O soluție de 200 mg 40-0-(2aminoetilj-rapamicină în 3 ml THF este tratată cu 0,4 ml piridină și 390 mg clorură de tosil și amestecul de reacție este agitat timp de 12 h, la temperatura camerei. Soluția este apoi turnată peste 5 ml soluție saturată de bicarbonat și faza apoasă este extrasă cu 2 x 5 ml acetat de etil. Fazele organice reunite sunt spălate cu 5 ml soluție 10% acid citric și 5 ml apă. După uscare peste sulfat de sodiu, solventul este evaporat și reziduul este cromatografiat pe 20 g silicagel, eluând cu hexan/acetat de etil 1/1 și se obține produsul din titlu, sub formă de spumă albă : MS (FAB) m/z 1133 (100%, M+Na); 1078 (25%, M-MeOH); 1061 (85%, M-(MeOH + H₂0)). ¹H RMN (CDCIg) δ 0,68 (1H, q, J=12 Hz); 2,43 (3H, s); 3,13 (3H, s); 3,35 (3H, s); 3,41 (3H, s); 4,76 (1H, s); 5,85 (1H, t, J=6 Hz); 7,30 (2H, d, J=8 Hz); 7,75 (2H, d, J=8 Hz).

MBA (rel. IC₅₀) : 15,9

IL-6 dep. prol. (rel. IC₅₀) : 14

Exemplul 28. 4O0-[2-(4', 5'-dicarboetoxi - 1',2',3' - triazol - 1'-il) - etil]RO 114451 Bl rapamicina

Se suspendă 98 mg de 40-0-(2azidoetilj-rapamicină și 32 mg dicarboxilat de dietilacetilenă în 0,5 ml toluen și se încălzește la 65°C ,timp de 5 h. Amestecul de reacție este apoi răcit la temperatura camerei, este încărcat pe 10 g silicagel și eluat cu hexan/acetat de etil 1/1, obtinându-se produsul din titlu : MS (FAB) m/z 1175 (20%, M+Na); 1121 (15%, M-MeOH); 1103 (60%, M-(MeOH + H₂0)). ¹H RMN (CDCI₃) δ 0,62 (1H, q, J=12 Hz); 1,40 (3H, t, J=8 Hz); 1,42 (3H, t, J=8 Hz); 3,13 (3H, s); 3,25 (3H, s); 3,33 (3H, s).

MBA (rel. IC₅₀) : 2,7

IL-6 dep. prol. (rel. IC₅₀) : 12

Exemplele de mai sus pot fi, de asemenea, efectuate, utilizând ca material inițial în loc de rapamicină, 9-deoxorapamicină, 26-dihidrorapamicină sau 9deoxo-, 26-dihidro-rapamicină. Alternativ și preferabil. Așa cum s-a descris, de exemplu, în exemplul 20, compușii de rapamicină din exemplele de mai sus pot fi hidrogenați sau reduși, utilizând grupări de protecție adecvate, când este necesar. Următoarele metode noi de reducere a grupării ceto la C9 sau hidrogenarea grupării ceto la C26 sunt date mai jos :

Exemplul 29. îndepărtarea grupării ceto la C9

Un curent de hidrogen sulfurat este trecut la temperatura camerei, printr-o soluție, menținută sub agitare, formată din 3,2 g (3,5 mmol) de rapamicină în 50 ml piridină și 2,5 ml dimetilformamidă. Soluția trece de la incolor la galben. După 2 h, introducerea de hidrogen sulfurat este oprită și agitarea este continuată timp de 5 zile, în care timp soluția trece gradat la portocaliu. Prin analizele TLC și HPLC se verifică consumarea completă a materialului inițial și prezența unui singur nou compus. Soluția este barbotată cu azot timp de 1 h și este concentrată sub presiune redusă. Reziduul este reluat în acetat de etil, spălat cu soluție rece 1N de HCI (3x), soluție saturată de bicarbonat de sodiu și soluție salină saturată. Stratul organic este uscat peste sulfat de sodiu și filtrat și concentrat sub presiune redusă. Reziduul este preluat în eter și sulful precipitat este îndepărtat prin filtrare. Prin concentrarea soluției eterice urmată de cromatografie pe coloană de silicagel (10:4:1 CH₂CI₂/i-Pr₂0/Me0H) se obține 9-deoxorapamicina sub formă de spumă incoloră. Identitatea produsului este confirmată prin spectroscopie de rezonanță magnetică nucleară (RMN), spectrometrie de masă (MS) și/sau spectroscopie în infraroșu (IR). 9-Deoxorapamicina prezintă următoarele caracteristici fizice : ¹H RMN (CDCI3) δ 1,61 (3H, d, J=1 Hz, C17-CH3), 1,76 (3H, d, J=1,2 Hz, C29-CH3), 2,42 (1H, d, J=14,5 Hz, H-9), 2,74 (1H, d, J=14,5 Hz, H-9), 3,13 (3H, s, C16-0CH3), 3,5 (3H, s, C27-0CH3), 3,40 (3H, s, 039□CH3], 5,40 (1H, d, J=10Hz, H-30), 5,57 (1H, dd, ^=8,6 Hz, J2=15 Hz, H22), 5,96 (1H, d, J=9 Hz, H-18), 6,09 (1H, d, J=1,7 Hz, 10-0H), 6,15 (1H, dd, J, = 10 Hz, J2 = 15Hz, H-21), 6,37 (1H, dd, ^=1,5 Hz, J2=5 Hz, H-19), 6,38 (1H, J=9,5 Hz, H-20). ¹³C RMN (CDCI3) δ 38,5 (09), 98,0 (C-10), 170,7(0-1), 173,0(0-8), 208,8 (032), 216,9 (C-26).

MS(FAB) m/z 922 8[M+Na⁺]), 899 (M⁺), 881 ((M-H20]⁺), 868 ([M-0CH3]⁺], 850 ((M-(H₂0+0CH₃)]⁺). IR (picuri majore])(cm'¹) 987, 1086. 1193,

1453, 1616, 1717, 1739, 3443.

MBA (rel. IC₅₀) : 1 MLR (rel. IC₅₀) : 14 IL-6 dep. prol. (rel. IC₅₀) : 9 Exemplul 30. Dihidrogenarea grupării ceto la C26

La o soluție menținută sub agitare formată din 421 mg (1,6 mmol) triacetoxiborohidrură de tetrametilamoniu în 2 ml acetonitril se adaugă 2 ml acid acetic. Amestecul rezultat este agitat timp de 30 min, la temperatura camerei și se răcește la -35°C. La această temperatură o soluție de 180 mg (O,2mmol) 9deoxo-rapamicină în 1 ml acetonitril este adăugată și amestecul rezultat este lăsat sub agitare timp de 24 h. Amestecul

RO 114451 Bl este răcit cu o soluție saturată de tartrat de sodiu și potasiu și se lasă să se încălzească la temperatura camerei. Agitarea este continuată până când ambele straturi sunt clare și se adaugă acetat de etil. Straturile sunt separate și stratul apos este extras de două ori cu acetat de etil. Soluția organică rezultată este spălată cu o soluție 10% de bicarbonat de sodiu și de două ori cu soluție salină saturată, apoi este uscată peste sulfat de sodiu anhidru, filtrată și concentrată sub presiune redusă. Reziduul este purificat prin cromatografie pe coloană de silicagel (90:10 acetat deetil - hexan). Ca material inițial în acest caz este 9deoxorapamicina, compusul final este 9deoxorapamicina, 26-dihidrorapamicina este produsă sub formă de spumă incoloră, având următoarele date spectroscopie caracteristice : ¹H RMN

(CDCI₃) (izomer	major) δ	0,9
(3H,d,J=6,9	Hz,	CHCH₃),	0,93
(3H,d,J=6,9	Hz,	CHCH₃),	1,00
(3H,d,J=6,9	Hz,	CHCH₃),	1,07
(3H,d,J=6,9	Hz,	CHCH₃),	1,17
(3H,d,J=6,9	Hz,	CHCHg),	1,61
(3H,d,J=6,9	Hz,	C17-CH₃),	1,73

(3H,d,J=1,2 Hz, C29-CH₃), 2,43 (1H, dd, J=4,1 și 16,0 Hz, H-33), 2,46 (1H,d,J=13,8 Hz, H-9), 2,58 (1H,m,H25), 2,77 (1H,d,J=13,8 Hz, H-9), 2,82 (1H,dd,J=8,3 și 16,0 Hz, H-33), 3,17 (1H, dd, J=4,1 și 9,2 Hz, H-27), 3,61 (2H, m, H-14 și H28), 5,19 (1H, ddd, J=4,1, 4,6 și 8,3 Hz, H-34), 5,49 (H, larg d, J=5,0 Hz, H-2), 5,56 (1 H,d,J=9,1 Hz, H-30), 5,75 (1H,dd, J=6,9 și 14,7 Hz, H-22), 5,76 (1H,s, 10-0H), 5,99 (1H, larg d, J=9,2 Hz, H18), 6,10 (1H, m, H-21), 6,36 (2H,m,H-19 si H-20). MS(FAB) m/z 924 ([M+Na]), 852 ([M-(H₂0 + CH₃0)]⁺).

MBA (rel. IC₅₀ ) : 47 MLR (rel. IC₅₀ ) : 134 IL-6 dep. prol. (rel. IC₅₀ ) : 78 26-Dihidrorapamicina este preparată în același mod, utilizând rapamicina în locul 9-deoxorapamicinei. Acest produs are următoarele date spectroscopice caracteristice : ¹³C-RMN (CDCI₃) (izomer major) d= 208,3 (C-32); 194,0 (C-9); 169,3 (C-1), 166,6 (08); 140,9 ((C-99); 136,5 (C-29); 136,2 (C-17); 133,5(020); 129,1 (021); 128,7(0 18); 126,2 ((030); 125,3 (019); 98,6 (010); 84,4 (039); 83,9 (016); 81,6 (027); 75,4 (034); 74,3 (028); 73,9 (040); 72,9 (026); 67,4 (014); 59,1 (27-0CH₃); 56,6 (39-CCH₃); 55,9 (160CH₃); 51,3 (02); 46,8 (031); 44,3 (O 6); 40,4 (033); 40,4 (025); 39,5 (O 24); 38,8 (015); 38,0 (036); 34,3 (O 23); 34,2 (038); 33,5 (O11); 33,3 (O 37); 33,2 (035); 31,5 (042); 31,3 (O 41); 30,9 (013); 27,1 (012); 27,0 (O

3) ; 25,2 (05); 21,4 (23-CH₃); 20,7 (O

4) ; 17,3 (11-CH₃); 16,1 (31-CH₃); 15,9 (35-CH₃); 14,4 (25-CH₃); 14,2 (29-CH₃); 10,3 (17-CH₃). MS(FAB) m/z 884 (M0CH₃, 35%); 866 (M-[0CH₃ + H₂0], 100%; 848 (M-[0CH₃ + 2H₂C], 40%).

MBA (rel. IC₅₀ ) : 1,7 MLR (rel. IC₅₀ ) : 1 IL-6 dep. prol. (rel. IC₅₀ ) : 7,5. Compușii noi,conform invenției, sunt utilizați, în special,în direcțiile următoare:

a) . Tratamentul și prevenirea respingerii transplantului de organe sau țesuturi de către receptorii de grefe, reprezentate de plămâni, inimă (sau combinația acestora două), ficat, rinichi, pancreas, piele sau cornee. De asemenea, se recomandă și în prevenirea sindromului de respingere a grefei manifestat în urma transplantului de măduvă osoasă.

b) . Tratamentul și prevenirea bolilor autoimune și a unor stări inflamatorii, în special, cele cu o etiologie ce implică o componentă autoimună cum ar fi, artritele (artrite reumatoide, artrita cronică progresivă și artrita deformantă) și bolile reumatismale. Compușii invenției se pot folosi și în bolile autoimune specifice, cum ar fi, tulburări hematologice autoimune (anemia hemolitică, anemia aplastică, anemia hematiilor și trombocitopenia idiopatică), lupus eritematos, policoxartritele, scleroderma, granulom Wegener, dermatomiozitele, hepatita cronică activă, miastenia gravis, psoriazisul, sindromul Steven-Johnson, psihoza idiopatică, colita ulcerativă, boala lui

RO 114451 Bl

Crohn, oftalmopatia endocrină, boala Graves, sacrodozitele, scleroza multiplă, ciroza biliară primară, diabetul juvenil, nevritele (anterioare și posterioare), cheratoconjunctivitele uscate și cele de primăvară, fibroza interstițială pulmonară, artritele psoriatice, glomerulonefritele (cu și fără sindrom nefrotic, cum ar fi, sindromul nefrotic idipoatic sau nefropatia minumului schimb) și dermatozele juvenile.

c) . Tratamentul și prevenirea astmului.

d) . Tratamentul rezistenței multiple la medicamente (MDR).

Noii compuși supresează P-glicoproteinele (Pgp) care sunt molecule de transport ale membranei și care sunt asociate în MDR. MDR constituie o problemă specială a bolnavilor de cancer și SIDA, care nu răspund pozitiv la chimioterapie din cauză că medicamentele administrate sunt pompate în afara celulelor de către acele Pgp.

Ca urmare, noii compuși sunt foarte necesari în potențarea eficienței altor agenți chimioterapeutici în tratamentul și controlul condițiilor de MDR, în cazul cancerului sau SIDA.

e) . Tratamentul tulburărilor proliferative (tumori, tulburări hiperproliferative ale pielii ).

f) . Tratamentul infecțiilor fungice.

g) . Tratamentul și prevenirea inflamației, în special, în potențarea acțiunii steroizilor.

h) . Tratamentul și prevenirea infecției și, în special ,a celei date de patogeni cu factori MIP sau asemănători MIP.

i) . Tratamentul supradozelor cu FK-5O6, rapamicina, noii compuși și alți imunosupresanți (imunosupresanți cuplați cu macrofilina).

Noii compuși, descriși în cadrul invenției, se pot utiliza ca intermediari noi sau ca substanțe farmaceutice, la prepararea unui medicament de tratare sau prevenire a tulburărilor descrise mai sus, sau a unei compoziții farmaceutice prin administrarea de cantități adecvate din noul compus la un pacient suferind de una din aceste boli, sus-menționate sau a unor compoziții farmaceutice ce implică și utilizarea unei cantități eficiente de astfel de compus în combinație sau asociat cu un diluant sau purtător acceptabil.

In plus, compușii, conform invenției, au acțiune imunosupresoare și, în special, cei care au oxigenul substituit la C40. Acești noi compuși sunt utilizați în special în indicațiile a) și b). Nu sunt recomandați pentru indicația i).

Noii compuși care sunt mai puțin imunosupresivi (în special ,cei care au substituit oxigenul numai la C28) se recomandă pentru indicațiile h) și i) și sunt mai puțin preferați pentru indicațiile a) sau b).

Noii compuși sunt utilizați prin administrarea de doze farmaceutice eficiente, la subiecții care necesită tratament, care pot varia în funcție de condițiile de tratament (tipul de boală, natura rezistenței], efectul dorit și modul de administrare.

Totuși, s-au obținut rezultate satisfăcătoare prin administrare orală [în doze de ordinul D,D5-5 sau până la 10 mg/kg/zi, de exemplu : 0,01-2 sau până la 7,5 mg/kg/zi administrat o dată sau divizat în 2-4 prize/zi); administrare parenterală (intravenos în doze de 0,1-2,5 sau până la 5 mg/kg/zi sau în doze de 0,05 sau 0,1-1,0 mg/kg/zi). Dozele zilnice corespunzătoare pentru pacienți sunt astfel de ordinul 500 mg per os (de exemplu, 5-100 mg per os); 0,5-125 sau până la 250 mg intravenos (de exemplu 2,5-50 mg intravenos).

Alternativ, ar fi preferabil, ca dozarea și stabilirea tratamentului să se facă în funcție de specificul pacientului după stabilirea nivelului circulației sanguine (cu metoda RIA).

Astfel, dozarea poate fi ajustată în funcție de pacient pentru a se atinge acel nivel măsurat cu RIA care este de ordinul 50 sau 150 sau până la 500 sau 1000 mg/ml. Acestă metodă este analoagă cu cea de dozare curentă și utilizată în terapia imunosupresivă cu ciclosporine.

RO 114451 Bl

Noii compuși pot fi administrați ca unic ingredient activ sau în combinație cu alte medicamente. De exemplu, în administrarea cu scop imunosupresiv în prevenirea și tratamentul sindromului de respingere a grefei, rejecția transplantului sau în caz de boli autoimune. Noii compuși pot fi utilizați împreună cu ciclosporinele, FK-506 sau derivații lor, corticosteroizii, azatioprena, anticorpi monoclonali imunosupresivi (CD3; CD4; CD25; CD28 sau CD45] și alți compuși imunomodulatori.

Pentru acțiune antiinflamatorie noii compuși se administrează combinați cu corticosteroizii sau alți agenți antiinflamatori. In cazul acțiunii anitiinfecțioase se pot combina cu alți agenți antiinfecțioși (medicamente autovirale sau antibiotice).

Administrarea noilor compuși se poate face prin una din căile convenționale:

- enterală (per os sub formă de soluții buvabile, tablete, capsule);

- parenterală (soluții sau suspensii injectabile intravenos).

Unitățile de doză adecvate pentru administrare orală sunt de ordinul 1-50 mg de component al invenției. Cea mai obișnuită unitate de doză este cea de 110 mg de compus.

Compozițiile farmaceutice care cuprind noii compuși pot fi preparate în mod analog cu cele conținând rapamicină (EP A 0041795).

Activitatea farmacologică a noilor compuși s-a demonstrat prin următoarele teste :

1. Reacție limfocitară combinată [MLR]

MLR a fost dezvoltată inițial o dată cu problema alogrefelor în vederea stabilirii compatibilității tisulare între donator și receptor și constituie unul dintre modelele de reacție imunitară in vitro stabilit cel mai bine. Modelul MLR pe șoarece descris de T. Meo în “Immunological Methods” L, Lefkorits și B. Peris, Eds. Academic Press, N.Y. pp. 2272349 (1979) a constituit modelul experimental utilizat în cadrul invenției, în vederea demonstrării efectului imunopresant al noilor compuși. Celule splenice (0,5 x 10⁶) de șoarece Balb/C (femele de 8-10 săptămâni) sunt coincubate timp de 5 zile cu celule splenice (0,5 x 10⁶) iradiate (cu 2000 razi) sau tratate cu mitomicina C și provenite de la un șoarece CBA (femele de 8-10 săptămâni). Celulele alogene iradiate induc celulelor splenice Balb/C un răspuns proliferativ care se poate măsura cu un precursor marcat încorporat în ADN. Deoarece, celulele stimulatoare sunt iradiate (sau tratate cu mitomicina C) ele nu dau un răspuns la celule Balb/C , dar rețin antigenitatea lor. Efectul antiproliferativ al noilor compuși asupra celulelor Balb/ C se măsoară pentru diferite diluții și se calculează concentrația la nivelul căreia se realizează o inhibiție celulară proliferativă în proporție de 50%.

Capacitatea inhibitorie a probei test se compară cu cea a rapamicinei și se consideră ca o capacitate inhibitorie relativă IC₅₀ .adică se face raportul dintre IC_5O al probei test și IC₅₀ al rapamicinei.

2. Proliferarea mediată de IL-6

Capacitatea noilor compuși de a realiza o interferență cu căile de semnalizare asociate cu factorul de creștere s-a realizat utilizând o linie celulară de hibrid de șoarece dependentă de interleukina 6 (IL-6).

Realizarea testului s-a făcut pe plăci cu 96 godeuri. S-au cultivat 5000 celule per godeu, în mediu fără ser (M.H.Schreier și R. Tees , Immunological Methods, I. Lefkovits și B. Pernis, eds. Academic Press 1981, voi. II, pp. 263275), dar suplimentat cu 1 mg de interleukină 6 (IL-6) recombinată/ml. După 66 h de incubare, în absența sau prezența unui test, s-au făcut adăugări pentru fiecare godeu de câte 1 p Ci (3-H)-timidina. S-au menținut încă 6 h după care s-au recoltat și numărat prin scintilație lichidă.

încorporarea de (3-H)-timidina în ADN s-a corelat cu creșterea numărului de celule măsurându-se astfel proliferarea acestora.

RO 114451 Bl

Seria de diluții a probei test permite calcularea concentrației ce determină inhibiția în proporție de 50% a proliferării celulare (IC₅₀).

Capacitatea inhibitorie a probei test se poate compara cu cea a rapamicinei și exprima ca IC₅₀ relativă, de exemplu (IC₅₀ a probei test /(IC₅₀) a rapamicinei).

3. Testul de cuplare a macrofilinei

Rapamicina și imunosupresantul FK-506 corelat structural cu aceasta, se pot cupla in vivo cu macrofilina -12 (cunoscută și sub numele de proteină de legare FK-506 sau FKBP-12). Această cuplare este considerată ca fiind responsabilă de activitatea imunosupresivă a acestor compuși.

Noii compuși se cuplează puternic cu macrofilina-12, fapt demonstrat întrun test competitiv de cuplare. In acest test, FK-506 cuplat la BSA s-a utilizat în vederea căptușirii godeurilor. Biot-MAP (macrofilina -12 umană recombinată) a permis cuplarea în prezența sau absența unei probe test (unui martor) la FK-50 imobilizat.

După spălare (pentru îndepărtarea macrofolinei legată nespecific) se fixează legătura biot-MAP prin incubarea în prezența unui conjugat streptadivin fosfataza alcalină după care se face o nouă spălare și apoi ,se adaugă ca substrat fosfatul de p-nitrofenil. Citirea se face la OD = 405 nm.

Cuplarea probei test la biot-MAP se traduce printr-o scădere a cantității de biot-MAP legată (cuplată) cu FK-506 și în consecință, printr-o scădere a valorii lui OD 405. Seria de diluții a probei test permite și determinarea IC₅₀ pentru biotMAP cuplată cu FK-506 (imobilizat). Capacitatea inhibitorie a probei test FK-506 liber (necuplat) se exprimă ca IC₅₀ relativ (1C_5O al probei test /IC₅₀ al lui FK-506 liber).

4. Reacția localizată de respingere a grefei de către gazdă

In vivo, eficiența noilor compuși s-a demonstrat pe un model animal corespunzător (Ford ș.a., Transplantation 10 (1970), 258). Celule splenice (1 x

10⁷) provenite de la femele de șobolan Wistar/Furth (WF) în vârstă de 6 săptămâni s-au injectat subcutanat în ziua O a experimentului, în laba piciorului posterior stâng al unei femele (F 334 x WF) F1 ce avea greutatea de 100 g. Animalele au fost tratate timp de 4 zile consecutiv, după care în ziua a 7-a s-au prelevat ganglionii limfatici popliteali și s-au cântărit.

Diferența de greutate între cei 2 noduli (ganglioni) limfatici este luată ca parametru de evaluare a reacției.

5. Reacția de alogrefă renală la șobolan Fisher 344

Se transplantează unilateral (pe partea stângă) la un receptor reprezentat de un șobolan din rasa WF nefrectomizat utilizând anastomoze cap-la-cap. Anastomoza ureterală se face și ea capla-cap. Tratamentul începe din ziua transplantării și până în ziua 14. După 7 zile de la grefă se face o nefrectomie contralaterală lăsându-se receptoriul dependent de modul de funcționare a rinichiului donat. Supraviețuirea receptorului de grefă este considerată ca parametru pentru o grefă funcțională.

6. Encefalomielita alergică indusă experimental la șobolani (EAE)

Eficiența noilor compuși în EAE s-a evaluat printr-o metodă descrisă de Levine și Wenk, Amer. J. Path. 47 (1965) 61; Mc Farlin ș.a., J. Immunol. 113 (1974) 712; Borel, Transplant and Clin. Immunol. 13 (1981), 3. EAE constituie un model foarte larg acceptat pentru sclerozele multiple. Masculi Wistar sunt injectați în labele picioarelor cu un amestec dintre măduva spinală de bovine și adjuvantul complet al lui Freund. Simptomele bolii (paralizia cozii și a ambelor membre posterioare) apar în mod obișnuit după 16 zile. Se înregistrează numărul de animale bolnave precum și timpul de apariție a bolii.

7. Artritele adjuvantului lui Freund

Eficacitatea asupra artritelor induse experimental se poate demonstra utilizând procedeul descris de Winter și Nuss, Arthritis and Rheumatism 9 (1966) 394; Billingham și Davies

RO 114451 Bl (Handbook of Experimental Pharmacol. (Vane si Ferreira Eds., Springer - Verlag, Berlin) 50/11 (1979) pp. 108-144. “Șobolani din rasa Ofa și Wistar (masculi sau femele de 150 g) au fost injectați (la baza cozii sau în laba membrului posterior) cu 0,1 ml de ulei mineral ce conținea 0,6 mg celule liofilizate și inactivate termic, aparținând lui Mycobacterium smegneatis.

în cursul instalării artritei, tratamentul se începe imediat după injectarea adjuvantului (zilele 1 -18), în perioada de stabilizare a artritei, tratamentul se începe în ziua 14 (când se dezvoltă inflamarea secundară și corespunde perioadei 14 - 20). La sfârșitul experimentului se măsoară cu un microcaliper inflamarea articulațiilor. ED₅₀ este doza orală măsurată în mg/kg, care reduce inflamarea (primară sau secundară) la jumătate față de cea determinată.

8. Acțiunea antitumorală și MDR

Acțiunea antitumorală a noilor compuși, precum și capacitatea lor de a potența performanțele agenților antitumorali prin scăderea rezistenței multiple la medicamente (MDR) s-a demonstrat prin administrarea unui agent anticanceros [Colchicina sau Etoposida], atât la celulele cu rezistență multiplă la medicamente, cât și la celule sensibile la medicamente in vitro. De asemenea, administrarea s-a făcut și la animale cu multirezistență la medicamente, cu tumori sensibile la medicamente sau cele cu infecții.

Medicamentele s-au administrat cu și fără coadministrare de noi compuși care urmau să fie testați și s-a administrat numai câte un nou compus.

Astfel, pentru testarea in vitro s-a utilizat o linie celulară rezistentă la medicamente și o linie celulară de control (parenterală) conform descrierii Ling ș.a., J. Cell. Physiol. 83, 103-116 (1974) și Bech-Hansen ș.a., J-Cell. Physiol. 88, 23-32 (1976).'

Clonele celulare alese sunt cu rezistență multiplă la medicamente (de exemplu, la Colchicina], Acestea sunt linia CH3 (subclona C5S3.2). Clona parenterală este reprezentată de linia sensibilă HUX B1 (subclona ABISII).

In vivo, activitatea antitumorală și cea anti-MDR s-a demonstrat la șoareci injectați cu celule multirezistente la medicamente și celule canceroase sensibile. Utilizând formula descrisă în metodele lui Slater ș.a., J. Clin. Invest. 70, 1131, (1982) s-au realizat sublinii celulare ale carcinomului de ascita Ehrich, rezistente la o serie de medicamente (DR, VC, AM, ET, TE sau CC) prin intermediul unui transfer secvențial de celule EA la generații următoare de șoareci din rasa Balb/C, care au jucat rol de gazdă.

Rezultate similare s-au putut obține și prin utilizarea de compuși noi, conform invenției, în cadrul unui model experimental conceput ca și cel descris mai sus (in vitro] sau prin utilizarea animalelor test infectate : cu tulpini virale (rezistente la medicamente, altele sensibile la medicamente); tulpini bacteriene sensibile sau rezistente; tulpini fungice rezistente sau sensibile la antibiotice precum și tulpini de protozoare rezistente la medicamente. Dintre acestea din urmă, s-au utilizat tulpini de Plasmodium alciparum, care manifestau o rezistență câștigată la medicamente cu acțiune antimalarică.

9. Cuplarea de FKBP

Unii dintre compușii, conform invenției, nu au acțiune imunosupresivă. Aceștia sunt, în special, cei care au substituție de O numai la C28. Un exemplu îl constituie 28-0-metil-rapamicina. In scopul demonstrării acestui lucru, s-au utilizat teste standard in vitro în cadrul cărora s-a testat acțiunea rapamicinei în comparație cu FK506. FK 506 este cunoscut ca un inhibitor puternic al transcripției interleukinei 2 (IL-2). Rapamicina deși nu activează transcripția de IL-2, inhibă puternic proliferarea celulelor T dependente de IL-6. Ambii compuși, sunt însă inhibitori foarte puternici ai reacției de aglutinare a limfocitelor.

Absența unei acțiuni imunosupresive se poate demonstra și prin modele in vivo, descrise mai sus la punctele 1 -

7. Compușii noi care nu au acțiune

RO 114451 Bl imunosupresivă, totuși prezintă avantajul că, cuplează cu macrofilina care conferă unele avantaje. De precizat că, acei noi compuși care cuplează puternic cu macrofilina nu sunt imunosupresivi prin ei înșiși (luați separat). Acest avantaj este speculat în cazul tratamentului cu supradoze de imunosupresanți cu macrofilina (FK 506, rapamicina și noii compuși cu acțiune imunosupresivă).

70. Potențarea steroizilor

Cuplarea noilor compuși cu macrofilină, conferă acestora capacitatea de potențare a acțiunii corticosteroizilor. Rezultate demonstrative ale acestei capacități s-au obținut în urma unor tratamente combinate de noi compuși ai invenției cu un corticosteroid, cum ar fi .dexamethazona. Demonstrația s-a făcut în cadrul unui model experimental descris de Ning ș.a., J. Biol. Chem. (1993) 268, 6073, prin care se realizează transcripția de cloramfenicol acetiltransferază determinată de virusul tumorii mai mare la șoarece. Acest efect de potențare al corticosteroizilor prezintă avantajul reducerii dozelor acestora, reducându-se astfel și riscul efectelor secundare în unele cazuri.

7. Inhibarea factorului MIP și a celui asemănător MIP

O altă acțiune a noilor compuși este aceea de a cupla și bloca unii factori MIP și asemănători MIP (potențiator de eficiență macrofagă) și anume aceia care sunt structural similari cu macrofilina. Factorii MIP și asemănători MIP sunt factori de virulență produși de numeroși patogeni, cum ar fi Chlamidia trachomatis, Neisseria meningitis, Legionella pneumophilia și unii membri paraziți și obligatorii ai ordinului Pickettsiales. Acești factori joacă un rol foarte important în instalarea infecției intracelulare. Eficiența noilor compuși în procesul de reducere a activității patogenilor care produc MIP și asemănători MIP s-a demonstrat în cadrul unui model experimental bazat pe metodele descrise de Lundemose ș.a., Med. Microbiol. (1993), 7:777. Acest model a utilizat culturi celulare de patogeni a căror putere de infecție s-a testat comparativ cu prezența sau absența macrolidelor.

Noii compuși se mai utilizează și în testele de detectare a prezenței sau a unor cantități de compuși cuplați cu macrofilina precum și, în unele teste de diagnostic sau sceening, astfel rezultă că noii compuși pot fi utilizați și ca instrument de determinare a prezenței compușilor cuplați cu macrofilina în soluții test (sânge, ser sanguin sau test bulion) care urmează a fi analizat.

De preferință, noul compus este imobilizat în microgodeuri unde i se crează posibilitatea să cupleze (în prezența sau absența unui soluții test) cu macrofilina-12 (FKBP-12) marcată. Alternativ, FKBP-12 este imobilizat în microgodeuri unde i se creează posibilitatea cuplării (în prezența sau absența unui soluții test] la un nou compus care a fost marcat cu fluor (enzimatic sau radioactiv). Acest nou compus poate suferi o substituire a O la C40 și/sau C28 cu grupul marcat.

Se spală plăcile și se măsoară cantitatea de compus marcat legat. Cantitatea de macrofilină existentă în soluția test este invers proporțională cu cantitate de produs marcat legat. Pentru analize cantitative se folosește o curbă standard de legare utilizând concentrații cunoscute de compus cuplat cu macrofilina.

Claims

1. Derivați O-alchilați ai rapamicinei caracterizați prin aceea că prezintă structura chimică corespunzătoare formulei generale I : (I)

RO 114451 Bl în care: X este (H,H) sau O; Y este (H,OH) sau O; R¹ este H, alchil, arilalchil, hidroxialchil, dihidroxialchil, hidroxialchilarilalchil, dihidroxialchilarilalchil, aciloxialchil, aminoalchil, alchilaminoalchil, alcoxi- 5 carbonilaminoalchil, acilaminoalchil, arilsulfonamidoalchil, alil, dihidroxialchilalil, dioxolanilalil și hidroxialcoxialchil; alchil se referă la alchil C1 -C6, ramificat sau linear; R² este H sau alchil C-j -C6 și R⁴ io este metil sau R⁴ și R¹ formează împreumă alchilen C₂ -Cg! cu condiția ca R¹și R² să nu fie ambii hidrogen.

2. Derivați, conform revendicării

1, caracterizați prin aceea că sunt 15 aleși dintre :

1. 40-0-Benzilrapamicină

2. 40-0-(4'-Hidroximetil)-benzilrapamicină

3. 40-0-(4-(1,2-Dihidroxietil)]-ben- 20 zilrapamicină

4. 40-0-Alilrapamicină

5. 4OO-[3'-(2,2-Dimetil-1,3-dioxolan-4(S)-il)-prop-2'-en-T-il]-rapamicină

6. (2'E,4'S)-40-0-(4',5'-Dihidroxi- 25 pent-2'-en-1 '-il)-rapamicină

7. 4O-O-(2-Hidroxi)-etoxicarbonilmetil-rapamicină

8. 40-0-(3-Hidroxi]-etil-rapamicină

9. 40-0-(6-Hidroxi]-propil-rapami- 30 cină

10. 4O-D-(6-Hidroxi)-hexil-rapamicină

11. 40-0-[2-(2-Hidroxi)-etoxi]-etil- rapamicină 3 5

12. 40-0-[(3S)-(2,2-Dimetildioxolan-3-il)-metil]-rapamicină

13. 40-0-[(2S)-2,3-Dihidroxiprop1-il)]-rapamicină

14. 4O-O-(2-Acetoxi)-etil-rapami- 4 0 cină

15. 4DO-(2-Nicotinoiloxi)-etil-rapamicină

16. 4O-O-[2-(N-morfolino)-acetoxi]- etil-rapamicină 45

17. 4O-O-(2-N-lmidazolilacetoxi)etil-rapamicină

18. 40-0-[2-N-Metil-N'-piperazinil)acetoxi]-etil-rapamicină

19. 39-0-Desmetil-39,40-0,0- 50 etilen-rapamicină

20. (26R)-26-Dihidro-40-0-(2hidroxi)-etil-rapamicină

21. 28-0-Metil-rapamicină

22. 4O-O-(2-Aminoetil]-rapamicină

23. 40-0-(2-Acetaminoetil)-rapamicină

24. 4O-O-(2-Nicotinamidoetil]-rapamicină

25. 40-0-[2-(N-Metil-imidazo-2'ilcarbetoxamido)-etil]-rapamicină

26. 4O-O-(2-Etoxicarbonilaminoetil)-rapamicină

27. 4O-0-(2-Tolilsulfonamidoetil]rapamicină

28. 4O-O-[2-(4',5'-Dicarboetoxi1', 2', 3'-triazol-1 '-il)-etil]-rapamicină

3. Derivați, conform revendicării 1, caracterizați prin aceea că X și Y sunt ambii 0, R² este H, R⁴ este metil și R¹ are altă semnificație decât H.

4. Derivat, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că este 400-(2-hidroxi]-etil-rapamicină.

5. Derivați, conform revendicărilor 1. 4, caracterizați prin aceea că numiții derivați se folosesc la obținerea unui medicament sau a unei compoziții farmaceutice împreună cu un diluant sau purtător acceptabil farmaceutic pentru tratarea sau prevenirea oricăreia dintre următoarele afecțiuni: boli autoimune, respingerea alogrefelor, reacția grefei față de boala gazdei, astm, rezistență multimedicamentoasă, tumori sau tulburări hiperproliferative, infecții fungice, inflamații, infecție cu patogeni având factori MIP sau similari MIP.

6. Compoziție farmaceutică, caracterizată prin aceea că conține o cantitate eficientă dintr-un derivat definit în revendicările 1 ...4, împreună cu un diluant sau purtător acceptabil farmaceutic pentru tratarea sau prevenirea oricăreia dintre următoarele afecțiuni: boli autoimune, respingerea alogrefelor, reacția grefei față de boala gazdei, astm, rezistență multimedicamentoasă, tumori sau tulburări hiperproliferative, infecții fungice, inflamații, infecție cu patogeni având factori MIP sau similari MIP.