CN105566348A - 一种依维莫司的制备方法 - Google Patents
一种依维莫司的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105566348A CN105566348A CN201511030109.0A CN201511030109A CN105566348A CN 105566348 A CN105566348 A CN 105566348A CN 201511030109 A CN201511030109 A CN 201511030109A CN 105566348 A CN105566348 A CN 105566348A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- everolimus
- oxygen
- sirolimus
- purifying
- obtains
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D498/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
- C07D498/12—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains three hetero rings
- C07D498/18—Bridged systems
Abstract
本发明涉及一种依维莫司的制备方法，属于医药技术领域。该方法包括侧链的合成及侧链与作为起始原料的西罗莫司发生取代反应、水解反应、两次正相制备液相纯化共5个工艺步骤，得到依维莫司。本发明方法成本低、收率高、操作简便、有利于实现产业化的依维莫司制备工艺。
Description
技术领域
本发明涉及一种依维莫司的制备方法，属于医药技术领域。
背景技术
依维莫司化学名为：
(3S,6R,7E,9R,10R,12R,14S,15E,17E,19E,21S,23S,26R,27R,34aS)-9,10,12,13,14,21,22,23,24,25,26,27,32,33,34,34a-十六氢-9,27-二羟基-3-[(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-羟基乙氧基)-3-甲氧环己基]-1-甲基乙基]-10,21-二甲氧-6,8,12,14,20,26-六甲基-23,27-环氧-3H-吡啶并[2,1-c][1,4]氧杂氮杂三十一环烯-1,5,11,28,29(4H,6H,31H)-戊酮
结构式
分子式：C53H83NO14
分子量：958.22
依维莫司是PI3K/AKt信号通道上的一种多功能细胞内激酶mTOR的抑制剂PI3K/AKt信号通道在人体内作用很多，包括调节蛋白质合成、细胞新陈代谢、生长、增殖以及新血管的形成。mTOR功能失调会导致多种疾病，包括肿瘤TSC1或TSC2基因突变会影响其抑制mTOR活性的功能，从而导致mTOR活性增加。而mTOR活性增加会增强细胞生长和增殖，最终导致肿瘤的形成。
与其他mTOR抑制剂类似，依维莫司进入细胞后能与immunophilinFK506结合蛋白FKBP12结合，形成依维莫司FKBP12复合物。该复合物通过与mTOR紧密结合而抑制mTOR的下游S6核糖体蛋白激酶(S6K1)及真核延伸因子4E结合蛋白(4E-BP1)的活性。动物实验还表明依维莫司能通过降低缺氧诱导因子(如HIF-1)及血管内皮生长因子(VEGF)的表达，从而抑制与肿瘤增殖"扩散紧密相关的血管的形成。
美国FDA于2009年3月30日批准Novartis(诺华)公司的依维莫司片(EverolimusTablets，商品名：Afinitor。)用于已采用舒尼替尼或索拉非尼治疗无效的晚期肾细胞癌患者。该药于2003年首次在瑞典上市，2007年10月14日在欧洲被批准用于治疗胃肠胰腺神经分泌瘤。2013年6月22日在中国批准用于治疗晚期肾细胞癌患者。目前国内尚无获得生产批文的公司，良好的市场前景引起了很多企业对该品种的关注，加大了对该产品研发的力度。
目前依维莫司的合成路线都是通过西罗莫司为起始原料经过2步化学合成制得。再合成方面由于起始原料西罗莫司的价格过高，导致合成依维莫司的合成成本过高。目前依维莫司的纯化方法主要是通过制备液相纯化获得，但今年报道的专利文献，对依维莫司粗品的纯化逐渐考虑使用柱层析纯化，我们尝试过用柱层析的方法对产品纯化，但只能针对有关物质进行良好控制，若想将异构体含量控制在原研药水平，只通过柱层析纯化是无法实现的。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了一种依维莫司的制备方法，采用的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种依维莫司的制备方法，该方法包括侧链的合成及侧链与作为起始原料的西罗莫司发生取代反应、水解反应、制备液相纯化共5个工艺步骤，得到依维莫司。
本发明方法包含下列步骤：
本发明提供一种依维莫司的制备方法，该方法包括下列步骤：
1)以三乙胺为缚酸剂，将乙二醇在叔丁基二甲基氯硅烷反应，获得叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷；
2)将步骤1)获得的叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷和三氟乙酸酐反应，获得叔丁基二甲硅氧基三氟甲磺酸乙酯；
3)将西罗莫司和步骤2)获得的叔丁基二甲硅基三氟甲磺酸乙酯反应，获得40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司；
4)将步骤3)获得的40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司在稀盐酸的作用下获得依维莫司粗品；
5)将步骤4)获得的依维莫司粗品经过制备液相纯化获得依维莫司；所述制备液相纯化为两次正相制备色谱纯化。
该方法，包括如下步骤：
1)将乙二醇和三乙胺用溶剂溶解，在-5℃±5℃下滴加叔丁基二甲基氯硅烷，升温至20℃±5℃进行反应，经萃取、减压蒸馏和纯化获得叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷；反应式为：
本反应中采用的溶剂选自正己烷、正庚烷、石油醚、环己烷中的一种或一种以上的混合物，更优选正己烷。本反应中选择滴加叔丁基二甲基氯硅烷的温度为-5±5℃。本反应选择的反应温度为20±5℃。本反应选择的萃取温度控制在-5～10℃。本步骤采用减压蒸馏的方式对产品进行纯化。
2)将步骤1)获得的叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷和缚酸剂溶解，然后与三氟乙酸酐在-20℃±5℃下进行反应，纯化获得叔丁基二甲硅氧基三氟甲磺酸乙酯；反应式为：
本反应采用溶剂选自：正己烷、正庚烷、石油醚、环己烷中的一种或一种以上的混合液。本反应选择的反应温度为-20±5℃。本反应选择的缚酸剂选自：N,N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶、2,6-二甲基吡啶中的一种或一种以上的混合液。本反应选择对产品的柱层析纯化温度为10±5℃。本反应中叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷、N,N-二异丙基乙胺和三氟甲磺酸酐的投料比例为1:1.3:1.1。
3)将西罗莫司和缚酸剂溶解，然后将步骤2)获得的叔丁基二甲硅基三氟甲磺酸乙酯和缚酸剂溶解后滴加至反应液中，升温至60℃～65℃进行反应，经萃取、减压蒸馏和纯化获得40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司；反应式为：
本反应中溶解选用的试剂选自：苯、甲苯、二甲苯、氯苯中的一种或一种以上的混合物。本反应中选择的反应温度为60℃。本反应中所选用的缚酸剂选自：N,N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶、2,6-二甲基吡啶中的一种或一种以上的混合液本反应中后处理蒸馏时选择加入2,6-二甲基吡啶来控制体系酸碱度，所述2,6-二甲基吡啶与西罗莫司的摩尔比为3:1。本步骤中对产品纯化采用柱层析纯化，温度为10±5℃。本反应中西罗莫司、叔丁基二甲基硅氧基三氟甲磺酸乙酯及N,N-二异丙基乙胺的投料比例为1:6:10。
4)将步骤3)获得的40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司溶解，然后在-25℃±5℃下滴加稀盐酸，在-15℃±5℃下进行反应，初步纯化后获得依维莫司粗品；反应式为：
本反应中所选用的试剂选自：甲醇、乙醇、异丙醇、四氢呋喃中的一种或一种以上的混合液。本反应中选择的反应温度为-15±5℃。本反应中滴加稀盐酸的温度为-25±5℃。本步骤的后处理温度为5±5℃。所述40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司和稀盐酸的摩尔投料比例为1:2。
5)将步骤4)获得的依维莫司粗品进行第一次正相制备液相纯化，收集杂质含量符合要求的依维莫司，对杂质含量不合格部分的依维莫司再次进行浓缩，在相同条件下对杂质含量不符合要求的样品进行第二次正相制备液相纯化，将最终符合质量标准的样品进行混合，重结晶后获得依维莫司。
步骤5)所述正相制备液相纯化，采用的洗脱剂为正庚烷、正己烷、环己烷中的一种或几种与乙酸乙酯的混合溶液，优选为：体积比为16:14正庚烷和乙酸乙酯的混合溶液(正庚烷：乙酸乙酯＝16:14)，采用规格为10μm、的硅球作为色谱柱填料，洗脱方式为等度洗脱。
优选地，所述方法，步骤为：
1)将乙二醇和三乙胺用正己烷溶解，在-5℃±5℃下滴加叔丁基二甲基氯硅烷，升温至20℃±5℃进行反应，控制在-5～10℃下进行萃取，经减压蒸馏和纯化后获得叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷；
2)将步骤1)获得的叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷和N,N-二异丙基乙胺用正己烷溶解，然后与三氟乙酸酐在-20℃±5℃进行反应，在10℃±5℃下进行柱层析纯化后获得叔丁基二甲硅氧基三氟甲磺酸乙酯；所述叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷、N,N-二异丙基乙胺和三氟甲磺酸酐的摩尔投料比例依次为1:1.3:1.1；
3)将西罗莫司和N,N-二异丙基乙胺用甲苯溶解，然后将步骤2)获得的叔丁基二甲硅基三氟甲磺酸乙酯和N,N-二异丙基乙胺用甲苯溶解后在滴加至反应液中，升温至60℃进行反应，经萃取、减压蒸馏和纯化获得40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司；所述西罗莫司、叔丁基二甲基硅氧基三氟甲磺酸乙酯及N,N-二异丙基乙胺的摩尔投料比例依次为1:6:10；所述减压蒸馏时加入2,6-二甲基吡啶来控制体系酸碱度；
4)将步骤3)获得的40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司用甲醇溶解，然后在-25℃±5℃下滴加稀盐酸，在-15℃±5℃下反应，初步纯化后获得依维莫司粗品；所述40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司和稀盐酸的摩尔投料比例为1:2；
5)将步骤4)获得的依维莫司粗品采用体积比为16:14的正庚烷和乙酸乙酯混合溶液作为洗脱剂，采用规格为10μm、的硅球作为色谱柱填料，以等度洗脱的方式进行第一次正相制备液相纯化，浓缩收集符合要求的部分，对不符合要求的部分进行第二次正相制备液相纯化，浓缩收集后将两次产物合并，重结晶后获得依维莫司。
更优选地，所述方法，步骤为：
1)将乙二醇和三乙胺用正己烷溶解，在-5℃下滴加叔丁基二甲基氯硅烷，升温至20℃进行反应，控制在-5～10℃下进行萃取，经减压蒸馏和纯化后获得叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷；所述纯化，方式为减压蒸馏；
2)将步骤1)获得的叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷和N,N-二异丙基乙胺用正己烷溶解，然后与三氟乙酸酐在-20℃进行反应，在10℃下进行柱层析纯化后获得叔丁基二甲硅氧基三氟甲磺酸乙酯；所述叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷、N,N-二异丙基乙胺和三氟甲磺酸酐的摩尔投料比例依次为1:1.3:1.1；
3)将西罗莫司和N,N-二异丙基乙胺用甲苯溶解，然后将步骤2)获得的叔丁基二甲硅基三氟甲磺酸乙酯和N,N-二异丙基乙胺用甲苯溶解后在滴加至反应液中，升温至60℃进行反应，经萃取、减压蒸馏和纯化获得40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司；所述西罗莫司、叔丁基二甲基硅氧基三氟甲磺酸乙酯及N,N-二异丙基乙胺的摩尔投料比例依次为1:6:10；所述减压蒸馏时加入2,6-二甲基吡啶来控制体系酸碱度；
4)将步骤3)获得的40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司用甲醇溶解，然后在-25℃下滴加稀盐酸，在-15℃下反应，初步纯化后获得依维莫司粗品；所述40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司和稀盐酸的摩尔投料比例为1:2；
5)将步骤4)获得的依维莫司粗品采用体积比为16:14的正庚烷和乙酸乙酯混合溶液作为洗脱剂，采用规格为10μm、的硅球作为色谱柱填料，以等度洗脱的方式进行第一次正相制备液相纯化，浓缩收集符合要求的部分，对不符合要求的部分进行第二次正相制备液相纯化，浓缩收集后将两次产物合并，重结晶后获得依维莫司。
最优选地，所述方法，具体步骤为：
1)在氮气保护下，依次加入三乙胺，乙二醇和正己烷，快速搅拌后冷却至-5℃，然后将叔丁基二甲基氯硅烷溶于正己烷，控温-5℃，在1h内，滴至上述反应液中，在0℃反应1h，然后升至20℃，反应16h，在-5℃下进行萃取，减压蒸馏纯化后获得叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷；
2)在氮气保护下，氮气保护下加入叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷、正己烷和N，N-二异丙基乙胺，然后冷却到-20℃，将三氟甲磺酸酐用正己烷稀释，然后滴加到上述反应液中，控制内温度在-20℃，在-20℃反应2h，反应完全后在10℃下进行柱层析纯化后获得叔丁基二甲硅氧基三氟甲磺酸乙酯；所述叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷、N,N-二异丙基乙胺和三氟甲磺酸酐的摩尔投料比例依次为1:1.3:1.1；
3)在氮气保护下，加入西罗莫司、N，N-二异丙基乙胺和甲苯，升温至65℃，将叔丁基二甲硅氧基三氟甲磺酸乙酯、N，N-二异丙基乙胺、甲苯混合，混合后快速滴加至上述反应液中，升温至60℃，反应80min，步骤重复3次，叔丁基二甲硅氧基三氟甲磺酸乙酯每次的添加量按照与西罗莫司的摩尔比分别为3:1、2:1、1:1进行添加，当HPLC监控产物含量大于65％时，停止反应，经后处理和纯化获得40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司；所述西罗莫司、叔丁基二甲基硅氧基三氟甲磺酸乙酯及N,N-二异丙基乙胺的摩尔投料比例依次为1:6:10；所述减压蒸馏时加入2,6-二甲基吡啶来控制体系酸碱度；所述2,6-二甲基吡啶与西罗莫司的摩尔比为3:1；
4)在氮气保护下，依次加入甲醇，40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司，冷却至-25±5℃，并控温-25℃滴加1mol/L的盐酸溶液，滴加完毕后在-15℃下搅拌至反应完全，初步纯化，获得依维莫司粗品；所述40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司和稀盐酸的摩尔投料比例为1:2；
5)将步骤4)获得的依维莫司粗品采用体积比为16:14的正庚烷和乙酸乙酯混合溶液作为洗脱剂，采用规格为10μm、的硅球作为色谱柱填料，以等度洗脱的方式进行第一次正相制备液相纯化，浓缩收集符合要求的部分，对不符合要求的部分进行第二次正相制备液相纯化，浓缩收集后将两次产物合并，重结晶后获得依维莫司。
以上所述任一方法在制备依维莫司中的应用。
本发明有益效果：
现有技术多采用反相制备色谱加正相色谱进行纯化，依维莫司的特点是在反相色谱中稳定性极差，对少量实验级别样品是比较合适的，对于生产级别来说是不现实的，而本发明采用纯正相的制备色谱纯化方法进行纯化，避开了反相色谱条件对产品造成不稳定因素的弊端，适合于生产量较大的情况。本发明对现有的依维莫司合成路线及纯化技术进行优化，解决了依维莫司制备工艺中存在的技术问题，提供一种成本低、收率高、操作简便、有利于实现产业化的依维莫司制备工艺。
附图说明
图1为依维莫司反相检测色谱图。
图2为西罗莫司反相检测色谱图。
图3为西罗莫司正向检测色谱图。
图4为依维莫司正向检测色谱图。
图5为西罗莫司和依维莫司正向检测色谱图。
图6为依维莫司反相制备纯化图谱。
图7为反相放置0.5h色谱图。
图8为反相放置1.5h色谱图。
图9为反相放置2.5h色谱图。
图10为反相放置4.5h色谱图。
图11为反相放置5.5h色谱图。
图12为依维莫司反正相制备纯化图谱。
图13为正相放置0.5h色谱图。
图14为正相放置1.5h色谱图。
图15为正相放置2.5h色谱图。
图16为正相放置3.5h色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
实施例1
1)叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷的制备
氮气保护下，依次向50L反应瓶中加入三乙胺(5640g)，乙二醇(3450g)，正己烷(9.1L)。体系快速搅拌，并冷却至-5±5℃。将叔丁基二甲基氯硅烷(1400g)溶于正己烷(4.9L)中，配置后的正己烷溶液平均分为五次，控温-5℃，在0.5～1h内，滴至上述反应液中；滴加完毕，反应液0±5℃反应1h，后升至20℃，反应16h。
反应液降温至-5±5℃，加入纯化水(10L)，搅拌5～10min，静置5～10min，分液。有机相冷却至0±5℃，加入10％乙酸水溶液(10L)，搅拌5～10min，静置5～10min，分液，有机相重复以上操作两次。有机相冷却至0±5℃，加入0～10℃的饱和NaHCO3溶液(10L)，搅拌5～10min，静置5～10min，分液，有机相重复以上操作两次。有机相冷却至0±5℃，加入0～10℃的饱和NaCl溶液(10L)，搅拌5～10min，静置5～10min，分液。向有机相中加入无水硫酸钠(2.5kg)，搅拌干燥1.5h，抽滤。滤液在30±5℃减压浓缩至干的粗品(1.5±0.15kg)。
粗品经刺型分馏柱，在约35℃，真空度≤-0.090MPa，减压蒸馏除去正己烷。撤去刺型分馏柱缓慢升温至60℃，在真空度≤-0.090MPa下，收集37～41℃馏分(真空度不同，馏分接收温度略有差异)，得叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷(1.4±0.14kg)，质量收率为90.0～110.0％。
2)叔丁基二甲硅氧基三氟甲磺酸乙酯的合成
氮气保护下，依次向10L反应釜中加入叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷(1.4kg，1eq)、正己烷(2.5L)、DIPEA(133g，1.3eq)，将体系冷却到-20±5℃。三氟甲磺酸酐(246.4g，1.1eq)用正己烷(280mL，2eq)稀释，滴加到上述反应液，控内温-20±5℃(白色固体析出)。2.5h内滴加完毕，在-20℃反应2h。TLC检测，反应完全。
将体系升温到约0℃，用玻璃砂芯漏斗抽滤(漏斗垫滤纸和适量硅藻土)，滤饼用正己烷(约1L×3)洗涤至点滤液中无明显依维莫司中间体2为止。滤液在25±5℃进行浓缩，浓缩液利用湿法进行柱层析纯化，洗脱剂选择正己烷：二氯甲烷＝10:1(v/v)对产品进行洗脱，柱层析过程始终保持柱温在10℃。将收集的含有产品的洗脱液在25±5℃减压浓缩至干，得叔丁基二甲硅氧基三氟甲磺酸乙酯(1.750±0.175g)。
3)40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司的合成
氮气保护下，依次向10L反应釜中加入西罗莫司(700g)、DIPEA(396g)，甲苯(2.59L)，升温至65℃，搅拌5min。将依维莫司中间体2(710g)、DIPEA(297g)、甲苯(1.12L)进行混合，混合后快速滴加至上述反应液(3min内)，升温至60℃，并在此温度下反应80min。将依维莫司叔丁基二甲硅氧基三氟甲磺酸乙酯(472.5g)、DIPEA(198g)、甲苯(770ml)进行混合，混合后快速滴加至上述反应液中(3min内)，升温至60℃，并在此温度下反应80min。将叔丁基二甲硅氧基三氟甲磺酸乙酯(237.5g)、DIPEA(99g)、甲苯(420ml)进行混合，混合后快速滴加至上述反应液(3min内)，升温至60℃，并在此温度下反应至HPLC监控产物含量大于65％(约1.5h)，停止反应。
将反应液快速冷却至30℃以下，向反应液加入2,6-二甲基吡啶(492g)，过滤，用乙酸乙酯(约1L)洗涤至滤饼中无明显产物。滤液在25±5℃，真空度≤-0.080MPa下，减压浓缩至干。浓缩液用正己烷：乙酸乙酯＝5:1(v/v，约500ml)稀释，洗脱剂选择正己烷：乙酸乙酯＝10:1，7:1，5:1，3:1，2:1(v/v)，对混合液进行梯度洗脱，柱层析过程始终保持柱温在10±5℃。将收集的含有洗脱液的产品在25±5℃减压浓缩至干(纯度不够产品重复以上过程重新进行纯化)，得40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司(420±42g)，质量收率54.0～66.0％。
4)依维莫司粗品的合成
氮气保护下，依次向20L反应釜中加入甲醇(8.4L)、依维莫司40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司(420g)。将体系冷却至-25±5℃，并控温-25℃滴加1mol/L的盐酸溶液(783ml)，滴加完毕(约0.5h)，反应液在-15℃，搅拌至反应完全(约1h)，停止反应。
将碳酸氢钠(66g)溶解于纯化水中(3.2L)，将上述液体缓慢加入反应液中，控温5±5℃，搅拌5min。向体系中加入加乙酸乙酯(9.7L)、饱和碳酸氢钠溶液(6.5L)，搅拌5min，静置分液，水层用乙酸乙酯(6.5L)萃取一遍，合并有机层，有机层用饱和碳酸氢钠溶液(9.7L)、纯化水(9.7L)、饱和氯化钠溶液(9.7L)洗涤一次，无水硫酸钠(2kg)搅拌干燥1h。过滤，滤液在25±5℃、真空度≤-0.080MPa下，减压浓缩至干，得到依维莫司粗品(390±39g)，质量收率81.4～99.5％。
5)依维莫司粗品的纯化
将依维莫司粗品(10g)溶解于乙酸乙酯(50ml)中，将溶液注入正相制备液相系统中(10μm硅球填料)，使用液相监控，采用体积比为16:14的正庚烷和乙酸乙酯混合溶液作为洗脱剂，采用规格为10μm、的硅球作为色谱柱填料，以等度洗脱的方式进行第一次正相制备液相纯化，收集符合要求的混合液，将符合要求的溶液在25±5℃、真空度≤-0.080MPa下，减压浓缩至干，得白色无定型粉末依维莫司(5.13g)。将剩余50％不合格产品再次进行浓缩，依照以上纯化方法进行二次纯化，经浓缩得白色无定型粉末依维莫司(2.57g)，将两次纯化样品混合，得依维莫司制备品(7.7g)，两次制备液相纯化质量收率77％。
依次向反应瓶中加入乙醇(30ml)、BHT(0.01g)，控温0～15℃至溶液澄清。将依维莫司制备品(5g)加入至体系中，保持上述温度继续搅拌至澄清。将混合液滴加至0～5℃的水(50ml，30min内加入)中，控温0～5℃搅拌析晶30min。过滤，滤饼用纯化水(约10ml)进行洗涤。将滤饼均匀铺在托盘中，在25±5℃、真空度≤0.090MPa下，减压干燥48h，得依维莫司(4.4g)，质量收率88％。实施例2
1)叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷的制备
氮气保护下，依次向50L反应瓶中加入三乙胺(5640g)，乙二醇(3450g)，正庚烷(9.1L)。体系快速搅拌，并冷却至-5±5℃。将TBSCl(1400g)溶于正庚烷(4.9L)中，配置后的正庚烷溶液平均分为五次，控温0℃，在0.5～1h内，滴至上述反应液中；滴加完毕，反应液0±5℃反应1h，后升至25℃，反应16h。
反应液降温至-5±5℃，加入纯化水(10L)，搅拌5～10min，静置5～10min，分液。有机相冷却至0±5℃，加入10％乙酸水溶液(10L)，搅拌5～10min，静置5～10min，分液，有机相重复以上操作两次。有机相冷却至0±5℃，加入0～10℃的饱和NaHCO3溶液(10L)，搅拌5～10min，静置5～10min，分液，有机相重复以上操作两次。有机相冷却至0±5℃，加入0～10℃的饱和NaCl溶液(10L)，搅拌5～10min，静置5～10min，分液。向有机相中加入无水硫酸钠(2.5kg)，搅拌干燥1.5h，抽滤。滤液在30±5℃减压浓缩至干的粗品(1.5±0.15kg)。
反应液降温至-5±5℃，加入纯化水(10L)，搅拌5～10min，静置5～10min，分液。有机相冷却至0±5℃，加入10％乙酸水溶液(10L)，搅拌5～10min，静置5～10min，分液，有机相重复以上操作两次。有机相冷却至0±5℃，加入0～10℃的饱和NaHCO3溶液(10L)，搅拌5～10min，静置5～10min，分液，有机相重复以上操作两次。有机相冷却至0±5℃，加入0～10℃的饱和NaCl溶液(10L)，搅拌5～10min，静置5～10min，分液。向有机相中加入无水硫酸钠(2.5kg)，搅拌干燥1.5h，抽滤。滤液在30±5℃减压浓缩至干的粗品(1.5±0.15kg)。
粗品经刺型分馏柱，在约35℃，真空度≤-0.090MPa，减压蒸馏除去正庚烷。撤去刺型分馏柱缓慢升温至60℃，在真空度≤-0.090MPa下，收集37～41℃馏分(真空度不同，馏分接收温度略有差异)，得叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷(1.4±0.14kg)，质量收率为90.0～110.0％。
2)叔丁基二甲硅氧基三氟甲磺酸乙酯的合成
氮气保护下，依次向10L反应釜中加入叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷(1.4kg，1eq)、正庚烷(2.5L)、三乙胺(1.3eq)，将体系冷却到-20±5℃。三氟甲磺酸酐(246.4g，1.1eq)用正庚烷(280mL，2eq)稀释，滴加到上述反应液，控内温-20±5℃(白色固体析出)。2.5h内滴加完毕，在-15℃反应2h。TLC检测，反应完全。
将体系升温到约0℃，用玻璃砂芯漏斗抽滤(漏斗垫滤纸和适量硅藻土)，滤饼用正庚烷(约1L×3)洗涤至点滤液中无明显依维莫司中间体2为止。滤液在25±5℃进行浓缩，浓缩液利用湿法进行柱层析纯化，洗脱剂选择正庚烷：二氯甲烷＝10:1(v/v)对产品进行洗脱，柱层析过程始终保持柱温在10±5℃。将收集的含有产品的洗脱液在25±5℃减压浓缩至干，得叔丁基二甲硅氧基三氟甲磺酸乙酯(1.750±0.175g)。
3)40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司的合成
氮气保护下，依次向10L反应釜中加入西罗莫司(700g)、三乙胺(309g)，苯(2.59L)，升温至65℃，搅拌5min。将依维莫司中间体2(710g)、三乙胺(232g)、苯(1.12L)进行混合，混合后快速滴加至上述反应液(3min内)，升温至65℃，并在此温度下反应80min。将依维莫司叔丁基二甲硅氧基三氟甲磺酸乙酯(472.5g)、三乙胺(154.7g)、苯(770ml)进行混合，混合后快速滴加至上述反应液中(3min内)，升温至60℃，并在此温度下反应80min。将叔丁基二甲硅氧基三氟甲磺酸乙酯(237.5g)、三乙胺(77.3g)、苯(420ml)进行混合，混合后快速滴加至上述反应液(3min内)，升温至60℃，并在此温度下反应至HPLC监控产物含量大于65％(约1.5h)，停止反应。
将反应液快速冷却至30℃以下，向反应液加入2,6-二甲基吡啶(492g)，过滤，用乙酸乙酯(约1L)洗涤至滤饼中无明显产物。滤液在25±5℃，真空度≤-0.080MPa下，减压浓缩至干。浓缩液用正庚烷：乙酸乙酯＝5:1(v/v，约500ml)稀释，洗脱剂选择正庚烷：乙酸乙酯＝10:1，7:1，5:1，3:1，2:1(v/v)，对混合液进行梯度洗脱，柱层析过程始终保持柱温在10±5℃。将收集的含有洗脱液的产品在25±5℃减压浓缩至干(纯度不够产品重复以上过程重新进行纯化)，得40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司(420±42g)，质量收率54.0～66.0％。
4)依维莫司粗品的合成
氮气保护下，依次向20L反应釜中加入乙醇(8.4L)、依维莫司40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司(420g)。将体系冷却至-25±5℃，并控温-20℃滴加1mol/L的盐酸溶液(783ml)，滴加完毕(约0.5h)，反应液在-10℃，搅拌至反应完全(约1h)，停止反应。
将碳酸氢钠(66g)溶解于纯化水中(3.2L)，将上述液体缓慢加入反应液中，控温5±5℃，搅拌5min。向体系中加入加乙酸乙酯(9.7L)、饱和碳酸氢钠溶液(6.5L)，搅拌5min，静置分液，水层用乙酸乙酯(6.5L)萃取一遍，合并有机层，有机层用饱和碳酸氢钠溶液(9.7L)、纯化水(9.7L)、饱和氯化钠溶液(9.7L)洗涤一次，无水硫酸钠(2kg)搅拌干燥1h。过滤，滤液在25±5℃、真空度≤-0.080MPa下，减压浓缩至干，得到依维莫司粗品(390±39g)，质量收率81.4～99.5％。
5)依维莫司粗品的纯化
将依维莫司粗品(10g)溶解于乙酸乙酯(50ml)中，将溶液注入正相制备液相系统中(10μm硅球填料)，使用液相监控，采用乙酸乙酯和正己烷混合溶液作为洗脱剂，采用规格为10μm、的硅球作为色谱柱填料，以等度洗脱的方式进行第一次正相制备液相纯化，收集符合要求的混合液，将符合要求的溶液在25±5℃、真空度≤-0.080MPa下，减压浓缩至干，得白色无定型粉末依维莫司(5g)，将剩余50％不合格产品再次进行浓缩，依照以上纯化方法进行二次纯化，经浓缩得白色无定型粉末依维莫司(2.5g)，将两次纯化样品混合，得依维莫司制备品(7.5g)，质量收率75％。
依次向反应瓶中加入乙醇(30ml)、BHT(0.01g)，控温0～15℃至溶液澄清。将依维莫司制备品(4.8g)加入至体系中，保持上述温度继续搅拌至澄清。将混合液滴加至0～5℃的水(50ml，30min内加入)中，控温0～5℃搅拌析晶30min。过滤，滤饼用纯化水(约10ml)进行洗涤。将滤饼均匀铺在托盘中，在25±5℃、真空度≤0.090MPa下，减压干燥48h，得依维莫司(4.2g)，质量收率88％。
实施例3
1)叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷的制备
氮气保护下，依次向50L反应瓶中加入三乙胺(5640g)，乙二醇(3450g)，石油醚(9.1L)。体系快速搅拌，并冷却至-5℃。将叔丁基二甲基氯硅烷(1400g)溶于石油醚(4.9L)中，配置后的石油醚溶液平均分为五次，控温-10℃，在0.5～1h内，滴至上述反应液中；滴加完毕，反应液0±5℃反应1h，后升至15℃，反应16h。
反应液降温至-5±5℃，加入纯化水(10L)，搅拌5～10min，静置5～10min，分液。有机相冷却至0±5℃，加入10％乙酸水溶液(10L)，搅拌5～10min，静置5～10min，分液，有机相重复以上操作两次。有机相冷却至0±5℃，加入0～10℃的饱和NaHCO3溶液(10L)，搅拌5～10min，静置5～10min，分液，有机相重复以上操作两次。有机相冷却至0±5℃，加入0～10℃的饱和NaCl溶液(10L)，搅拌5～10min，静置5～10min，分液。向有机相中加入无水硫酸钠(2.5kg)，搅拌干燥1.5h，抽滤。滤液在30±5℃减压浓缩至干的粗品(1.5±0.15kg)。
粗品经刺型分馏柱，在约35℃，真空度≤-0.090MPa，减压蒸馏除去石油醚。撤去刺型分馏柱缓慢升温至60℃，在真空度≤-0.090MPa下，收集37～41℃馏分(真空度不同，馏分接收温度略有差异)，得叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷(1.4±0.14kg)，质量收率为90.0～110.0％。
2)叔丁基二甲硅氧基三氟甲磺酸乙酯的合成
氮气保护下，依次向10L反应釜中加入叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷(1.4kg，1eq)、石油醚(2.5L)、吡啶(81.2g，1.3eq)，将体系冷却到-20±5℃。三氟甲磺酸酐(246.4g，1.1eq)用石油醚(280mL，2eq)稀释，滴加到上述反应液，控内温-20±5℃(白色固体析出)。2.5h内滴加完毕，在-25℃反应2h。TLC检测，反应完全。
将体系升温到约0℃，用玻璃砂芯漏斗抽滤(漏斗垫滤纸和适量硅藻土)，滤饼用石油醚(约1L×3)洗涤至点滤液中无明显依维莫司中间体2为止。滤液在25±5℃进行浓缩，浓缩液利用湿法进行柱层析纯化，洗脱剂选择石油醚：二氯甲烷＝10:1(v/v)对产品进行洗脱，柱层析过程始终保持柱温在10±5℃。将收集的含有产品的洗脱液在25±5℃减压浓缩至干，得叔丁基二甲硅氧基三氟甲磺酸乙酯(1.750±0.175g)。
3)40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司的合成
氮气保护下，依次向10L反应釜中加入西罗莫司(700g)、吡啶242g)，甲苯(2.59L)，升温至65℃，搅拌5min。将依维莫司中间体2(710g)、吡啶(181.5g)、甲苯(1.12L)进行混合，混合后快速滴加至上述反应液(3min内)，升温至60℃，并在此温度下反应80min。将依维莫司叔丁基二甲硅氧基三氟甲磺酸乙酯(472.5g)、吡啶(121g)、甲苯(770ml)进行混合，混合后快速滴加至上述反应液中(3min内)，升温至60℃，并在此温度下反应80min。将叔丁基二甲硅氧基三氟甲磺酸乙酯(237.5g)、吡啶(60.5g)、甲苯(420ml)进行混合，混合后快速滴加至上述反应液(3min内)，升温至60℃，并在此温度下反应至HPLC监控产物含量大于65％(约1.5h)，停止反应。
将反应液快速冷却至30℃以下，向反应液加入2,6-二甲基吡啶(492g)，过滤，用乙酸乙酯(约1L)洗涤至滤饼中无明显产物。滤液在25±5℃，真空度≤-0.080MPa下，减压浓缩至干。浓缩液用正己烷：乙酸乙酯＝5:1(v/v，约500ml)稀释，洗脱剂选择正己烷：乙酸乙酯＝10:1，7:1，5:1，3:1，2:1(v/v)，对混合液进行梯度洗脱，柱层析过程始终保持柱温在10±5℃。将收集的含有洗脱液的产品在25±5℃减压浓缩至干(纯度不够产品重复以上过程重新进行纯化)，得40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司(420±42g)，质量收率54.0～66.0％。
4)依维莫司粗品的合成
氮气保护下，依次向20L反应釜中加入异丙醇(8.4L)、依维莫司40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司(420g)。将体系冷却至-25±5℃，并控温-15℃滴加1mol/L的盐酸溶液(783ml)，滴加完毕(约0.5h)，反应液在-20℃，搅拌至反应完全(约1h)，停止反应。
将碳酸氢钠(66g)溶解于纯化水中(3.2L)，将上述液体缓慢加入反应液中，控温5±5℃，搅拌5min。向体系中加入加乙酸乙酯(9.7L)、饱和碳酸氢钠溶液(6.5L)，搅拌5min，静置分液，水层用乙酸乙酯(6.5L)萃取一遍，合并有机层，有机层用饱和碳酸氢钠溶液(9.7L)、纯化水(9.7L)、饱和氯化钠溶液(9.7L)洗涤一次，无水硫酸钠(2kg)搅拌干燥1h。过滤，滤液在25±5℃、真空度≤-0.080MPa下，减压浓缩至干，得到依维莫司粗品(390±39g)，质量收率81.4～99.5％。
5)依维莫司粗品的纯化
将依维莫司粗品(10g)溶解于乙酸乙酯(50ml)中，将溶液注入正相制备液相系统中(10μm硅球填料)，使用液相监控，采用正庚烷和乙酸乙酯混合溶液作为洗脱剂，采用规格为10μm、的硅球作为色谱柱填料，以等度洗脱的方式进行第一次正相制备液相纯化，收集符合要求的混合液，将符合要求的溶液在25±5℃、真空度≤-0.080MPa下，减压浓缩至干，得白色无定型粉末依维莫司(4.9g)，将剩余50％不合格产品再次进行浓缩，依照以上纯化方法进行二次纯化，经浓缩得白色无定型粉末依维莫司(2.45g)，将两次纯化样品混合，得依维莫司制备品(7.35g)，质量收率73.5％。
依次向反应瓶中加入乙醇(30ml)、BHT(0.01g)，控温0～15℃至溶液澄清。将依维莫司制备品(4.5g)加入至体系中，保持上述温度继续搅拌至澄清。将混合液滴加至0～5℃的水(50ml，30min内加入)中，控温0～5℃搅拌析晶30min。过滤，滤饼用纯化水(约10ml)进行洗涤。将滤饼均匀铺在托盘中，在25±5℃、真空度≤0.090MPa下，减压干燥48h，得依维莫司(3.96g)，质量收率88％。
实施例4
1)叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷的制备
氮气保护下，依次向50L反应瓶中加入三乙胺(5640g)，乙二醇(3450g)，环己烷(9.1L)。体系快速搅拌，并冷却至-5℃。将叔丁基二甲基氯硅烷(1400g)溶于环己烷(4.9L)中，配置后的环己烷溶液平均分为五次，控温-5℃，在0.5～1h内，滴至上述反应液中；滴加完毕，反应液0±5℃反应1h，后升至20℃，反应16h。
反应液降温至-5±5℃，加入纯化水(10L)，搅拌5～10min，静置5～10min，分液。有机相冷却至0±5℃，加入10％乙酸水溶液(10L)，搅拌5～10min，静置5～10min，分液，有机相重复以上操作两次。有机相冷却至0±5℃，加入0～10℃的饱和NaHCO3溶液(10L)，搅拌5～10min，静置5～10min，分液，有机相重复以上操作两次。有机相冷却至0±5℃，加入0～10℃的饱和NaCl溶液(10L)，搅拌5～10min，静置5～10min，分液。向有机相中加入无水硫酸钠(2.5kg)，搅拌干燥1.5h，抽滤。滤液在30±5℃减压浓缩至干的粗品(1.5±0.15kg)。
粗品经刺型分馏柱，在约35℃，真空度≤-0.090MPa，减压蒸馏除去环己烷。撤去刺型分馏柱缓慢升温至60℃，在真空度≤-0.090MPa下，收集37～41℃馏分(真空度不同，馏分接收温度略有差异)，得叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷(1.4±0.14kg)，质量收率为90.0～110.0％。
2)叔丁基二甲硅氧基三氟甲磺酸乙酯的合成
氮气保护下，依次向10L反应釜中加入叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷(1.4kg，1eq)、环己烷(2.5L)、2,6-二甲基吡啶(110g，1.3eq)，将体系冷却到-20±5℃。三氟甲磺酸酐(246.4g，1.1eq)用环己烷(280mL，2eq)稀释，滴加到上述反应液，控内温-20±5℃(白色固体析出)。2.5h内滴加完毕，在-20℃反应2h。TLC检测，反应完全。
将体系升温到约0℃，用玻璃砂芯漏斗抽滤(漏斗垫滤纸和适量硅藻土)，滤饼用环己烷(约1L×3)洗涤至点滤液中无明显依维莫司中间体2为止。滤液在25±5℃进行浓缩，浓缩液利用湿法进行柱层析纯化，洗脱剂选择环己烷：二氯甲烷＝10:1(v/v)对产品进行洗脱，柱层析过程始终保持柱温在10±5℃。将收集的含有产品的洗脱液在25±5℃减压浓缩至干，得叔丁基二甲硅氧基三氟甲磺酸乙酯(1.750±0.175g)。
3)40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司的合成
氮气保护下，依次向10L反应釜中加入西罗莫司(700g)、2,6-二甲基吡啶(327.8g)，甲苯(2.59L)，升温至65℃，搅拌5min。将依维莫司中间体2(710g)、2,6-二甲基吡啶(245.8g)、甲苯(1.12L)进行混合，混合后快速滴加至上述反应液(3min内)，升温至60℃，并在此温度下反应80min。将依维莫司叔丁基二甲硅氧基三氟甲磺酸乙酯(472.5g)、2,6-二甲基吡啶(164g)、甲苯(770ml)进行混合，混合后快速滴加至上述反应液中(3min内)，升温至62℃，并在此温度下反应80min。将叔丁基二甲硅氧基三氟甲磺酸乙酯(237.5g)、2,6-二甲基吡啶(82g)、甲苯(420ml)进行混合，混合后快速滴加至上述反应液(3min内)，升温至60℃，并在此温度下反应至HPLC监控产物含量大于65％(约1.5h)，停止反应。
将反应液快速冷却至30℃以下，向反应液加入2,6-二甲基吡啶(492g)，过滤，用乙酸乙酯(约1L)洗涤至滤饼中无明显产物。滤液在25±5℃，真空度≤-0.080MPa下，减压浓缩至干。浓缩液用正己烷：乙酸乙酯＝5:1(v/v，约500ml)稀释，洗脱剂选择正己烷：乙酸乙酯＝10:1，7:1，5:1，3:1，2:1(v/v)，对混合液进行梯度洗脱，柱层析过程始终保持柱温在10±5℃。将收集的含有洗脱液的产品在25±5℃减压浓缩至干(纯度不够产品重复以上过程重新进行纯化)，得40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司(420±42g)，质量收率54.0～66.0％。
4)依维莫司粗品的合成
氮气保护下，依次向20L反应釜中加入四氢呋喃(8.4L)、依维莫司40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司(420g)。将体系冷却至-25±5℃，并控温-20℃滴加1mol/L的盐酸溶液(783ml)，滴加完毕(约0.5h)，反应液在-15℃，搅拌至反应完全(约1h)，停止反应。
将碳酸氢钠(66g)溶解于纯化水中(3.2L)，将上述液体缓慢加入反应液中，控温5±5℃，搅拌5min。向体系中加入加乙酸乙酯(9.7L)、饱和碳酸氢钠溶液(6.5L)，搅拌5min，静置分液，水层用乙酸乙酯(6.5L)萃取一遍，合并有机层，有机层用饱和碳酸氢钠溶液(9.7L)、纯化水(9.7L)、饱和氯化钠溶液(9.7L)洗涤一次，无水硫酸钠(2kg)搅拌干燥1h。过滤，滤液在25±5℃、真空度≤-0.080MPa下，减压浓缩至干，得到依维莫司粗品(390±39g)，质量收率81.4～99.5％。
5)依维莫司粗品的纯化
将依维莫司粗品(10g)溶解于乙酸乙酯(50ml)中，将溶液注入正相制备液相系统中(10μm硅球填料)，使用液相监控，采用乙酸乙酯和环己烷混合溶液作为洗脱剂，采用规格为10μm、的硅球作为色谱柱填料，以等度洗脱的方式进行第一次正相制备液相纯化，收集符合要求的混合液，将符合要求的溶液在25±5℃、真空度≤-0.080MPa下，减压浓缩至干，得白色无定型粉末依维莫司(4.8g)，将剩余50％不合格产品再次进行浓缩，依照以上纯化方法进行二次纯化，经浓缩得白色无定型粉末依维莫司(2.4g)，将两次纯化样品混合，得依维莫司制备品(7.2g)，质量收率72％。。
依次向反应瓶中加入乙醇(30ml)、BHT(0.01g)，控温0～15℃至溶液澄清。将依维莫司制备品(4.2g)加入至体系中，保持上述温度继续搅拌至澄清。将混合液滴加至0～5℃的水(50ml，30min内加入)中，控温0～5℃搅拌析晶30min。过滤，滤饼用纯化水(约10ml)进行洗涤。将滤饼均匀铺在托盘中，在25±5℃、真空度≤0.090MPa下，减压干燥48h，得依维莫司(3.7g)，质量收率88％。
实施例5
以下通过实验数据进一步说明本发明的有益效果。
1.为了优化中间体1反应参数，设计的实验方案对反应溶剂、叔丁基二甲基氯硅烷的滴加温度、后处理(萃取、减压蒸馏)温度等三个参数进行了考察。实验结果表明：
(1)反应溶剂的选择
正己烷、正庚烷、石油醚、环己烷作为反应溶剂时均能获得较好收率，且达反应平衡时收率基本一致。从运营成本考虑，正己烷与石油醚的成本相对更低，从残留溶剂考虑，石油醚为混合物，且沸点过低不易保存，故不选择乙醚作为反应溶剂，最终选择使用正己烷作为最佳反应溶剂。
(2)叔丁基二甲基氯硅烷滴加温度的选择
加入叔丁基二甲基氯硅烷的作用是将乙二醇其中一个羟基取代，但在加入叔丁基二甲基氯硅烷时，体系会迅速升温，局部温度过高会造成部分乙二醇的双羟基都被取代的产物产生。此工序产品的纯化是经过减压蒸馏完成的，虽然双取代的产物不影响此步中间体的纯度，但直接影响此步产品的收率，因此选择较低温度-5±5℃进行滴加。
(3)后处理温度的选择
由于硅基保护基较不稳定，该产品在室温条件及水存在的条件下，硅基保护会被水解，因此需选择相对低温的条件进行后处理。因后处理时有水的存在，故选择在0～10℃进行后处理(萃取、减压蒸馏)，既不能让水结冰，又不能造成硅基被水解。
2.为了优化中间体2反应参数，设计的实验方案对反应溶剂、反应温度、后处理温度
及湿度等三个参数进行了考察。实验结果表明：
(1)反应溶剂的选择
正己烷、正庚烷、石油醚、环己烷作为反应溶剂时均能获得较好收率，且正己烷收率最高。从运营成本看，正己烷与石油醚均可控制较低成本，但使用正己烷收率更高，因此选择正己烷作为该步的最佳反应溶剂。
(2)反应温度的选择
乙二醇的2位羟基被OTf取代时属放热反应，由于叔丁基二甲硅氧基三氟甲磺酸乙酯在温度偏高的情况下也会发生分解，因此从滴加三氟甲磺酸酐到反应结束，一直控制反应温度在-20±5℃。在此温度下，反应的副产物三氟甲磺酸与缚酸剂可有效的结合并析出，为后处理做好铺垫，直接过滤即可有效将产生的三氟甲磺酸盐去除掉。若反应温度高于-10℃，反应体系，中间体1的转化率偏低，并产生多于-20±5℃反应条件下生成的盐，说明三氟甲磺酸酐没有充分利用，取代反应过程中直接被缚酸剂成盐。
(3)后处理(过滤及减压蒸馏)温度及湿度的选择
因中间体2极易被亲核，所以后处理温度计湿度要求严格。当后处理温度高于15℃时，由于硅胶显弱酸性，中间体2在柱层析纯化过程中会降解为中间体1。若后处理湿度高于65％RH，中间体2极易被水分子亲核，并转化为中间体1。温度及湿度的影响对中间体1的转化极为重要，因此选择10±5℃的反应条件、湿度低于65％RH的湿度条件下进行后处理。
3.为了优化中间体3反应参数，设计的实验方案对反应溶剂、反应温度等两个参数进
行了考察。实验结果表明：
(1)反应溶剂的选择
苯、甲苯、二甲苯、氯苯作为反应溶剂，均能有效的溶解西罗莫司及产品，但使用二甲苯时，反应收率比使用其他三种溶剂的条件要低5个百分点。这大大抬高了产品成本，因此选用苯、甲苯或氯苯作为反应溶剂。由于苯高度致癌，在后续试验阶段将其剔除，氯苯的沸点高于甲苯，对后处理蒸馏的能耗要求较高，最终确定使用甲苯作为反应溶剂。
(2)反应温度的选择
此步反应为碱性条件下的取代反应，由于西罗莫司属于大环内酯类类化合物，使用的碱性试剂不能太强，因此选择用N,N-二异丙基乙胺作为缚酸剂，弱碱条件对大环内酯类不会造成破坏。由于碱性若，所提供反应的能量不足，因此需要通过加热的方式将完成此步反应，又因大环内酯类化合物具有热不稳定性，因此反应温度不易过高，通过对20℃、40℃、60℃及80℃等四种温度条件下的工艺筛选，确定60～65℃条件下，西罗莫司的转化率最高；温度在20～40℃下，有大量西罗莫司未参与反应；温度在80℃时，加速了反应进程，但杂质数量明显增加，影响产品质量，最终选择在60～65℃的温度，作为该步取代反应的反应温度。
4.为了优化中间体4(依维莫司粗品)反应参数，设计的实验方案对反应溶剂、反应温度等两个参数进行了考察。实验结果表明：
(1)反应溶剂的选择
甲醇、乙醇作为反应溶剂时均能获得较好收率，单后处理时涉及到减压蒸馏，乙醇的沸点高于甲醇，从运营成本考虑，优选甲醇作为此步反应溶剂。
(2)反应温度的选择
此步反应为水解反应，由于中间体3与依维莫司同为大环内酯类化合物，具有酸不稳定性，因此选择反应温度要及其苛刻。当反应温度高于0℃时，反应杂质明显增加，反应温度在-10℃时，反应速度适中，无明显杂质产生，故选择-15℃±5℃，-15℃作为该步反应的最佳反应温度，又因滴加盐酸时会产生热量，因此滴加盐酸的温度控制在-25℃±5℃，避免了因滴加时温度过高造成杂质的增加。
5.为了优化依维莫司的纯化方法，设计了多组试验，针对正相、反相制备纯化以及流动相的配比进行了严格的筛选。实验内容如下：
(1)关于正反相两体系分离西罗莫司与依维莫司的研究：
①反相检测
I.样品：4.9mg依维莫司溶于1ml乙腈中
进样：10ul
依维莫司反相检测色谱图如图1所示。
II.样品：西罗莫司，西罗莫司反相检测色谱图如图2所示。
小结：反相上，西罗莫司保留时间与依维莫司相同。
②正相检测：
I.样品：西罗莫司粗品4.6mg溶于1ml乙腈中
进样：10ul
西罗莫司正向检测色谱图如图3所示。
II.样品：依维莫司粗品49mg溶于1ml乙腈中
进样：10ul
依维莫司正向检测色谱图如图4所示。
III.样品：西罗莫司粗品4.6mg溶于1ml乙腈中，依维莫司粗品4.9mg溶于1ml乙腈，各取100ul混合。
进样：10ul，结果如图5所示。
小结：在正相体系中，西罗莫司与依维莫司可有效的分离，但在正相体系中依维莫司与7-环异构体不能有效的分离。
(2)关于正反相两体系中依维莫司稳定性的研究：
①反相制备收集的样品稳定性考察
样品：依维莫司粗品80mg溶于1ml乙腈，过滤，上样量：1ml(纯化图谱如图6)
收集：90.2-93.8min组分。
收集样品在常温下每隔1小时进1针检测，检测图谱如图7-11所示，检验数据如表1-5所示：
表1反相放置0.5h样品分析
| 时间 | 峰面积 | 含量 | |
| 1 | 14.450 | 12106 | 0.08 |
| 2 | 18.004 | 15357614 | 99.92 |
表2反相放置1.5h样品分析
| 时间 | 峰面积 | 含量％ | |
| 1 | 14.507 | 2284 | 0.02 |
| 2 | 18.078 | 12324283 | 99.18 |
| 3 | 20.100 | 100217 | 0.81 |
表3反相放置2.5h样品分析
表4反相放置4.5h样品分析
| 时间 | 峰面积 | 含量％ | |
| 1 | 14.584 | 4007 | 0.03 |
| 2 | 18.207 | 12595476 | 98.95 |
| 3 | 20.037 | 129033 | 1.01 |
表5反相放置5.5h样品分析
| 时间 | 峰面积 | ％含量 | |
| 1 | 14.618 | 2984 | 0.02 |
| 2 | 18.283 | 12527124 | 98.93 |
| 3 | 20.103 | 132544 | 1.05 |
②正相制备收集的样品稳定性考察
色谱柱：HederaSi，9um，10mm*250mm
检测波长：277nm流速：3.0ml/min
柱温：15℃样品：100mg溶于1ml乙酸乙酯中
使用正庚烷：乙酸乙酯(v/v)＝16:14的等度洗脱
进样：1ml(纯化图谱如图12)
收集：62.653-69.383min组分
收集样品在常温下每隔1小时进1针检测：检测图谱如图13-16所示，检验数据如表6-9所示：
表6正相放置0.5h样品分析
表7正相放置1.5h样品分析
表8正相放置2.5h样品分析
表9正相放置3.5h样品分析
小结：
样品在正反相溶剂中，稳定性均较差。在正相溶剂中与反相体系中，目标组分均会转化为保留时间靠后的7-环异构体，且产品在反相体系的转化速度大于在正相体系的转化速度。
综合以上纯化数据及产品稳定性数据总结得出，可完全通过正相制备纯化获得符合质量标准的依维莫司，但通过一次正相制备可获得的产品质量收率仅50％。后又尝试对部分未符合质量标准的产品进行了二次纯化，又可获得20％的产品。
最终选择使用正庚烷：乙酸乙酯(v/v)＝16:14的正相洗脱方法，作为最终的制备纯化方法，对未符合标准的产品再进行二次纯化。
本发明在优化过程中主要针对依维莫司的7-环异构体含量进行控制。柱层析法是目前最简便的纯化方法，但无法控制7-环异构体含量，基本所有的柱层析法只能将7-环异构体含量控制在0.5％以内，无法达到国外原研药水平控制情况。而目前所用的最流行的纯化方法为制备色谱纯化法，普遍情况可将7-环异构体含量控制在0.2％以内，也无法达到原研药所控制的标准。而利用本发明的纯化工艺，可将依维莫司7-环异构体含量控制在0.1％以内，达到原研药的同等甚至更有水平。
本发明的突出效益亦体现在大生产上，目前所能查阅到的相关资料中显示，普遍纯化量在5g/次的上样量，无法满足生产需求，而本发明的优势在于每批粗品的上样量可达到20-30g，能够满足工业化生产使用。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种依维莫司的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：
1)以三乙胺为缚酸剂，将乙二醇在叔丁基二甲基氯硅烷反应，获得叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷；
2)将步骤1)获得的叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷和三氟乙酸酐反应，获得叔丁基二甲硅氧基三氟甲磺酸乙酯；
3)将西罗莫司和步骤2)获得的叔丁基二甲硅基三氟甲磺酸乙酯反应，获得40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司；
4)将步骤3)获得的40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司在稀盐酸的作用下获得依维莫司粗品；
5)将步骤4)获得的依维莫司粗品经过制备液相纯化获得依维莫司；所述制备液相纯化为两次正相制备色谱纯化。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括下列步骤：
1)将乙二醇和三乙胺用溶剂溶解，在-5℃±5℃下滴加叔丁基二甲基氯硅烷，升温至20℃±5℃进行反应，经萃取、减压蒸馏和纯化获得叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷；
2)将步骤1)获得的叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷和缚酸剂溶解，然后与三氟乙酸酐在-20℃±5℃下进行反应，纯化获得叔丁基二甲硅氧基三氟甲磺酸乙酯；
3)将西罗莫司和缚酸剂溶解，然后将步骤2)获得的叔丁基二甲硅基三氟甲磺酸乙酯和缚酸剂溶解后滴加至反应液中，升温至60℃～65℃进行反应，经萃取、减压蒸馏和纯化获得40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司；
4)将步骤3)获得的40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司溶解，然后在-25℃±5℃下滴加稀盐酸，在-15℃±5℃下进行反应，初步纯化后获得依维莫司粗品；
5)将步骤4)获得的依维莫司粗品进行第一次正相制备液相纯化，收集杂质含量符合要求的依维莫司，对杂质含量不合格部分的依维莫司再次进行浓缩，在相同条件下对杂质含量不符合要求的样品进行第二次正相制备液相纯化，将最终符合质量标准的样品进行混合，重结晶后获得依维莫司。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述溶剂，选自正己烷、正庚烷、石油醚、环己烷中的一种或一种以上的混合液；步骤1)所述萃取，温度控制在-5℃～10℃。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)所述溶解，采用的溶剂选自正己烷、正庚烷、石油醚、环己烷中的一种或一种以上的混合液；步骤2)所述缚酸剂选自N,N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶、2,6-二甲基吡啶中的一种或一种以上的混合液；步骤2)所述叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷、缚酸剂和三氟甲磺酸酐的摩尔投料比例依次为1:1.3:1.1。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)所述溶解，采用的溶剂选自苯、甲苯、二甲苯、氯苯中的一种或一种以上的混合物；步骤3)所述缚酸剂，选自N,N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶、2,6-二甲基吡啶中的一种或一种以上的混合液；步骤3)所述西罗莫司、叔丁基二甲基硅氧基三氟甲磺酸乙酯及缚酸剂的摩尔投料比例依次为1:6:10。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4)所述溶解，采用的试剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、四氢呋喃中的一种或一种以上的混合液；步骤4)所述40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司和稀盐酸的摩尔投料比例为1:2。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤5)所述正相制备液相纯化，采用的洗脱剂为正庚烷、正己烷、环己烷中的一种或几种与乙酸乙酯的混合溶液，采用规格为10μm、的硅球作为色谱柱填料，洗脱方式为等度洗脱。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤5)所述正相制备液相纯化，采用的洗脱剂为正庚烷和乙酸乙酯的混合溶液；所述正庚烷和乙酸乙酯的体积比为16:14。
9.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤为：
1)将乙二醇和三乙胺用正己烷溶解，在-5℃下滴加叔丁基二甲基氯硅烷，升温至20℃进行反应，控制在-5℃～10℃下进行萃取，经减压蒸馏和纯化后获得叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷；所述纯化，方式为减压蒸馏；
2)将步骤1)获得的叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷和N,N-二异丙基乙胺用正己烷溶解，然后与三氟乙酸酐在-20℃进行反应，在10℃下进行柱层析纯化后获得叔丁基二甲硅氧基三氟甲磺酸乙酯；所述叔丁基二甲基羟乙氧基硅烷、N,N-二异丙基乙胺和三氟甲磺酸酐的摩尔投料比例依次为1:1.3:1.1；
3)将西罗莫司和N,N-二异丙基乙胺用甲苯溶解，然后将步骤2)获得的叔丁基二甲硅基三氟甲磺酸乙酯和N,N-二异丙基乙胺用甲苯溶解后在滴加至反应液中，升温至60℃进行反应，经萃取、减压蒸馏和纯化获得40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司；所述西罗莫司、叔丁基二甲基硅氧基三氟甲磺酸乙酯及N,N-二异丙基乙胺的摩尔投料比例依次为1:6:10；所述减压蒸馏时加入2,6-二甲基吡啶来控制体系酸碱度；
4)将步骤3)获得的40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司用甲醇溶解，然后在-25℃下滴加稀盐酸，在-15℃下反应，初步纯化后获得依维莫司粗品；所述40-氧-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧]乙基西罗莫司和稀盐酸的摩尔投料比例为1:2；
5)将步骤4)获得的依维莫司粗品采用体积比为16:14的正庚烷和乙酸乙酯混合溶液作为洗脱剂，采用规格为10μm、的硅球作为色谱柱填料，以等度洗脱的方式进行第一次正相制备液相纯化，浓缩收集符合要求的部分，对不符合要求的部分进行第二次正相制备液相纯化，浓缩收集后将两次产物合并，重结晶后获得依维莫司。
10.权利要求1-9所述任一方法在制备依维莫司中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201511030109.0A CN105566348A (zh) | 2015-12-31 | 2015-12-31 | 一种依维莫司的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201511030109.0A CN105566348A (zh) | 2015-12-31 | 2015-12-31 | 一种依维莫司的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105566348A true CN105566348A (zh) | 2016-05-11 |
Family
ID=55877037
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201511030109.0A Pending CN105566348A (zh) | 2015-12-31 | 2015-12-31 | 一种依维莫司的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105566348A (zh) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107561170A (zh) * | 2016-07-02 | 2018-01-09 | 山东新时代药业有限公司 | 一种坦西莫司中间体的分析检测方法 |
| CN108047265A (zh) * | 2017-11-24 | 2018-05-18 | 成都海创药业有限公司 | 一种依维莫司中间体的制备纯化方法 |
| CN108676014A (zh) * | 2018-06-15 | 2018-10-19 | 国药集团川抗制药有限公司 | 纯化依维莫司中间体的方法以及制备依维莫司的方法 |
| CN109406650A (zh) * | 2018-10-25 | 2019-03-01 | 美康生物科技股份有限公司 | 用于准确测定人全血中四种免疫抑制剂类药物浓度的试剂盒及检测方法 |
| CN114539288A (zh) * | 2020-11-24 | 2022-05-27 | 鲁南制药集团股份有限公司 | 一种高效的依维莫司制备方法 |
| CN116813641A (zh) * | 2023-06-09 | 2023-09-29 | 杭州华东医药集团康润制药有限公司 | 一种依维莫司的制备方法 |
| CN116813642A (zh) * | 2023-06-29 | 2023-09-29 | 杭州华东医药集团康润制药有限公司 | 一种依维莫司纯化方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994009010A1 (en) * | 1992-10-09 | 1994-04-28 | Sandoz Ltd. | O-alkylated rapamycin derivatives and their use, particularly as immunosuppressants |
| CN1649551A (zh) * | 2002-04-24 | 2005-08-03 | 太阳生物医学有限公司 | 药物释放型血管内支架和治疗再狭窄的方法 |
| CN102464668A (zh) * | 2010-11-17 | 2012-05-23 | 浙江海正药业股份有限公司 | 雷帕霉素或其衍生物的制备色谱纯化方法 |
| WO2012066502A1 (en) * | 2010-11-19 | 2012-05-24 | Biocon Limited | Processes for preparation of everolimus and intermediates thereof |
| CN103360411A (zh) * | 2013-07-17 | 2013-10-23 | 成都雅途生物技术有限公司 | 依维莫司结晶提纯方法 |
| US20150147378A1 (en) * | 2008-05-30 | 2015-05-28 | Rutgers, The State University Of New Jersy | Copolymer-xerogel nanocomposites useful for drug delivery |
| CN104892632A (zh) * | 2015-06-03 | 2015-09-09 | 道中道（菏泽）制药有限公司 | 一种晶体形式的依维莫司及其制备方法 |
-
2015
- 2015-12-31 CN CN201511030109.0A patent/CN105566348A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994009010A1 (en) * | 1992-10-09 | 1994-04-28 | Sandoz Ltd. | O-alkylated rapamycin derivatives and their use, particularly as immunosuppressants |
| CN1649551A (zh) * | 2002-04-24 | 2005-08-03 | 太阳生物医学有限公司 | 药物释放型血管内支架和治疗再狭窄的方法 |
| US20150147378A1 (en) * | 2008-05-30 | 2015-05-28 | Rutgers, The State University Of New Jersy | Copolymer-xerogel nanocomposites useful for drug delivery |
| CN102464668A (zh) * | 2010-11-17 | 2012-05-23 | 浙江海正药业股份有限公司 | 雷帕霉素或其衍生物的制备色谱纯化方法 |
| WO2012066502A1 (en) * | 2010-11-19 | 2012-05-24 | Biocon Limited | Processes for preparation of everolimus and intermediates thereof |
| CN103360411A (zh) * | 2013-07-17 | 2013-10-23 | 成都雅途生物技术有限公司 | 依维莫司结晶提纯方法 |
| CN104892632A (zh) * | 2015-06-03 | 2015-09-09 | 道中道（菏泽）制药有限公司 | 一种晶体形式的依维莫司及其制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 中国农业百科全书编辑部编: "《中国农业百科全书 农药卷》", 31 October 1993, 农业出版社 * |
| 刘飞等，: ""依维莫司合成路线综述"", 《国外医药抗生素分册》 * |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107561170A (zh) * | 2016-07-02 | 2018-01-09 | 山东新时代药业有限公司 | 一种坦西莫司中间体的分析检测方法 |
| CN107561170B (zh) * | 2016-07-02 | 2021-07-30 | 山东新时代药业有限公司 | 一种坦西莫司中间体的分析检测方法 |
| CN108047265A (zh) * | 2017-11-24 | 2018-05-18 | 成都海创药业有限公司 | 一种依维莫司中间体的制备纯化方法 |
| CN108676014A (zh) * | 2018-06-15 | 2018-10-19 | 国药集团川抗制药有限公司 | 纯化依维莫司中间体的方法以及制备依维莫司的方法 |
| CN109406650A (zh) * | 2018-10-25 | 2019-03-01 | 美康生物科技股份有限公司 | 用于准确测定人全血中四种免疫抑制剂类药物浓度的试剂盒及检测方法 |
| CN114539288A (zh) * | 2020-11-24 | 2022-05-27 | 鲁南制药集团股份有限公司 | 一种高效的依维莫司制备方法 |
| CN114539288B (zh) * | 2020-11-24 | 2024-01-30 | 鲁南制药集团股份有限公司 | 一种依维莫司的制备方法 |
| CN116813641A (zh) * | 2023-06-09 | 2023-09-29 | 杭州华东医药集团康润制药有限公司 | 一种依维莫司的制备方法 |
| CN116813642A (zh) * | 2023-06-29 | 2023-09-29 | 杭州华东医药集团康润制药有限公司 | 一种依维莫司纯化方法 |
| CN116813642B (zh) * | 2023-06-29 | 2024-04-19 | 浙江康润制药有限公司 | 一种依维莫司纯化方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105566348A (zh) | 一种依维莫司的制备方法 | |
| CN102766138B (zh) | 一种阿齐沙坦的制备方法 | |
| CN111961018B (zh) | 一种高纯度丁苯酞的制备方法 | |
| CN110372609B (zh) | 一种噁拉戈利钠盐的纯化方法 | |
| CN103086926A (zh) | 一种益母草碱及其衍生物的制备方法 | |
| CN106749446B (zh) | 一种盐酸表柔比星中间体化合物ⅴ | |
| CN103435532B (zh) | 波普瑞韦中间体的合成方法 | |
| CN103936715A (zh) | 一种埃索美拉唑钠的精制方法及合成方法 | |
| CN105294624B (zh) | 一种达格列净的制备方法 | |
| CN105152980A (zh) | N-叔丁氧羰基-（4s）-（对苯基苯基甲基）-4-氨基-（2r）-甲基丁酸的手性制备方法 | |
| CN112812107B (zh) | 一种sglt-2抑制剂及中间体的制备方法 | |
| EP2956439B1 (en) | Process for preparing atazanavir sulphate | |
| CN102952131B (zh) | 一种盐酸莫西沙星的制备方法 | |
| CN107337684B (zh) | 一种法罗培南钠的制备方法 | |
| CN107043362B (zh) | 一种盐酸表柔比星中间体化合物ⅳ | |
| CN102993135B (zh) | 一种奥利司他的纯化方法 | |
| CN108610316B (zh) | 达格列净的制备方法 | |
| CN104557845A (zh) | 一种鲁比前列酮化合物的制备方法 | |
| CN102190647A (zh) | 一种奈比洛尔的中间体的制备方法 | |
| CN102180914A (zh) | 一种2-脱氧-d-葡萄糖的制备方法 | |
| CN106608853B (zh) | 二肽基肽酶ⅳ抑制剂的制备方法 | |
| CN102249937A (zh) | 1-(s)-4,5-二甲氧基-1-甲胺基甲基-苯并环丁烷的制备方法 | |
| CN110423257A (zh) | 一种索菲布韦合成工艺 | |
| CN102414200A (zh) | 奥美沙坦酯的制备方法 | |
| CN101845010B (zh) | 一种制备伊替米贝的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160511 |