MXPA06011882A - Procedimiento para preparar 42-esteres de rapamicina y 32-esteres de fk 506 con acido dicarboxilico, precursores para conjugados de rapamicina y anticuerpos. - Google Patents

Procedimiento para preparar 42-esteres de rapamicina y 32-esteres de fk 506 con acido dicarboxilico, precursores para conjugados de rapamicina y anticuerpos.

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MXPA06011882A
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Abstract

La presente invencion describe metodos para la sintesis de 42-hemiesteres de rapamicina regioespecificos y 32-esteres de FK-506 regioespecificos con acidos dicarboxilicos; los metodos involucran catalizar la reaccion entre una rapamicina o un FK-506 y un anhidrido dicarboxilico o un ester activado bifuncional de un acido dicarboxilico con una lipasa.

Description

significantes en el crecimiento de tumor en modelos tanto in vitro como in vivo. La preparación y uso de hidroxiésteres de rapamicina, que incluyen CCI-779, se describe en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,362,718 y 6,277,983, y Publicación de Patente Estadounidense No. US 2005-0033046 A1 (Publicación de Patente Estadounidense No. 10/903,062). Se han sintetizado y encontrado derivados de rapamicina en la posición 42-OH por ser útiles para inducir inmunosupresión, en el tratamiento de rechazo de transplante, enfermedades autoinmunes, tumores sólidos, leucemia/linfoma de células T en adulto, trastornos vasculares hiperproliferativos, entre otros. Algunos derivados sirven como los precursores para la síntesis de conjugados de rapamicina de la fórmula general (I) abajo, los cuales son empleados como moléculas ¡nmunogénicas para la preparación de anticuerpos específicos para rapamicina, así como para aislar proteínas de enlace a la rapamicina para inmunoensayos, y para detectar anticuerpos específicos para rapamicina o derivados de los mismos.
En la fórmula I, el portador es un material portador inmunogénico o material portador detector tal como una proteína o polipéptido y L es un enlazador, el cual permite a la rapamicina unirse al portador. [Publicación de Patente Estadounidense No. US 2004-0010920]. Se han descrito un número de 42-derivados de rapamicina que se pueden usar como grupos de enlace para la preparación de conjugados. Por ejemplo, se describe la preparación de éster fluorado de rapamicina en la Patente Estadounidense No. 5,100,883, se describe la preparación de ésteres de amida en la Patente Estadounidense No. 5,118,667, se describe la preparación de aminoésteres en la Patente Estadounidense No. 5,130,307, se describe la preparación de carbamatos de rapamicina en la Patente Estadounidense No. 5,118,678, se describe la preparación de sulfonatos y sulfamatos en la Patente Estadounidense No. 5,177,203, se describe la preparación de 42-éster con ácido succínico y otros ácidos dicarboxílicos (ácido adípico, ácido glutárico, ácido diglicólico, etc) en las Publicaciones de Patente Estadounidense No. US 2001-0010920 A1 , Patente Estadounidense No. 5,378,696 y Publicación de Patente Internacional Nos. WO 98/45333, WO 94/25072, WO 94/25022 y WO 92/05179. En una modalidad, se usan 42-ésteres con ácidos dicarboxílicos, tales como 42-hemisuccinato, 42-hemiglutarato y 42-hemiadipatos 42 (fórmula II) para la síntesis de conjugado de rapamicina de fórmula I.
II Se ha descrito la síntesis de un compuesto de fórmula (I) siendo portado por esterificación directa de 42-OH con un anhídrido correspondiente en la presencia de una base débil. Debido a la sensibilidad de rapamicina a condiciones básicas, y junto con la escasa regioselectividad, el 42-hemiéster deseado se produce con escaso rendimiento (típicamente por debajo de 20%) después de la purificación HPLC; el producto crudo es contaminado por 31 ,42-diéster, 31- éster y por otros productos.
En un esfuerzo para mejorar el rendimiento para este procedimiento, se usa un procedimiento de etapa de dos fases de hidrólisis catalizada por lipasa, [M. Adamczyk, et al., Tetrahedron Letters, 35(7):1019-1022 (1994)], en la cual el éster metílico o bencílico correspondiente de rapamicina de 42-hemisuccinato se hidroliza usando lipasa de Pseudomonas sp. Se obtuvo un rendimiento ligeramente mejorado (29% de éster bencílico y 50% de éster metílico). Sin embargo, la síntesis de bencil 2-hemisuccinato de rapamicina y éster metílico vía química convencional también sufre de escasa regioselectividad, bajo rendimiento y etapas de purificación tediosas.
= Me 50% Rendimiento R = Bencilo 29% Rendimiento Existe por lo tanto una necesidad de una síntesis eficiente de hemiésteres con rendimiento mejorado.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención describe un procedimiento para la síntesis de hemiéster de 42-rapamicina de fórmula (II) de una rapamicina en la presencia de una lipasa, una enzima hidrolítica. En otro aspecto, el procedimiento de la invención proporciona la producción regioespecífica de 32-hemiéster de FK 506 de un FK 506 en la presencia de una lipasa. El método de la invención proporciona un procedimiento regioselectivo hacia la síntesis de estos compuestos con excelente rendimiento. La presente invención además proporciona métodos para usar los compuestos intermediarios producidos de conformidad con la presente invención para generar anticuerpos y conjugados.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION El método de la presente Invención produce un 42-hemiéster (II) de rapamicina o un hemiéster de FK 506 el cual es un precursor para la preparación de un conjugado de rapamicina. Como se usa en este documento, "una rapamicina" define una clase de compuestos ¡nmunosupresivos los cuales contienen los núcleos de rapamicina básicos (mostrados abajo).
RAPAMICINA Una rapamicina de conformidad con esta invención, incluye compuestos los cuales pueden ser químicamente o biológicamente modificados como derivados de los núcleos de rapamicina, mientras aún retienen propiedades ¡nmunosupresivas. Por lo tanto, el término "una rapamicina" incluye ésteres, éteres, oximas, hidrazonas y una hidroxilaminas de rapamicina, así como rapamicinas en dichos grupos funcionales en los núcleos que se han modificado, por ejemplo, a través de la reducción u oxidación, un metabolito de rapamicina, o una rapamicina de anillo abierto (tal como secorapamicina, descrita en la Patente Estadounidense No. 5,252,579). El término "una rapamicina" también incluye sales de rapamicina farmacéuticamente aceptables, las cuales son capaces de formar tales sales, ya sea en virtud de contener porciones acídicas o básicas. Sin embargo, tales compuestos retienen los grupos hidroxilo en la posición 42 para permitir la producción de 42-hemiésteres regioespecíficos de la invención. En una modalidad, los ésteres y éteres de rapamicina útiles en la invención, son de los grupos hidroxilo en la posición 31 de los núcleos de rapamicina, ésteres y éteres de un grupo hidroxilo en la posición 27 (después de la reducción química de la 27-cetona), y que las oximas, hidrazonas e hidroxilaminas sean de una cetona de los núcleos de rapamicina. En otras modalidades, los 31 -ésteres y éteres de rapamicina útiles en la invención, se describe en las siguientes patentes: ésteres de alquilo (Patente Estadounidense No. 4,316,885); ésteres de aminoalquilo (Patente Estadounidense No. 4,650,803); ésteres fluorados (Patente Estadounidense No. 5,100,883); ésteres de amida (Patente Estadounidense No. 5,118,677); ésteres de carbamato (Patente Estadounidense No. 5,118,678); ésteres de sililo (Patente Estadounidense No. 5,120,842); aminoésteres (Patente Estadounidense No. 5,130,307); acétales (Patente Estadounidense No. 5,51 ,413); aminodiésteres (Patente Estadounidense No. 5,162,333); ésteres de sulfonato y sulfato (Patente Estadounidense No. 5,177,203); ésteres (Patente Estadounidense No. 5,221 ,670); alcoxiésteres (Patente Estadounidense No. 5,233,036); ésteres de O-arilo, -alquilo, -alquenilo y -alquinilo (Patente Estadounidense No. 5,258,389); ésteres de carbonato (Patente Estadounidense No. 5,260,300); carbamatos de arilcarbonilo y alcoxicarbonilo (Patente Estadounidense No. 5,262,423); carbamatos (Patente Estadounidense No. 5,302,584); hidroxiésteres (Patente Estadounidense No. 5,362,718); ésteres obstaculizados (Patente Estadounidense No. 5,385,908); ésteres heterocíclicos (Patente Estadounidense No. 5,385,909); ésteres gem disustituidos (Patente Estadounidense No. 5,385,910); ésteres amino alcanoicos (Patente Estadounidense No. 5,389,639); ésteres de fosforilcarbamato (Patente Estadounidense No. 5,391 ,730);" ésteres de carbamato (Patente Estadounidense No. 5,411,967); ésteres de carbamato (Patente Estadounidense No. 5,434,260); ésteres de amidino carbamato (Patente Estadounidense No. 5,463,048); ésteres de carbamato (Patente Estadounidense No. 5,480,988); ésteres de carbamato (Patente Estadounidense No. 5,480,989); ésteres de carbamato (Patente Estadounidense No. 5,489,680); ésteres de N-óxido obstaculizados (Patente Estadounidense No. 5,491 ,231 ); ésteres de biotina (Patente Estadounidense No. 5,504,091 ); ésteres de O-alquilo (Patente Estadounidense No. 5,665,772); y ésteres PEG de rapamicina (Patente Estadounidense No. 5,780,462). La preparación de estos ésteres se describe en las patentes listadas anteriormente. En aún otra modalidad, se describen 27-ésteres y éteres de rapamicina útiles en la invención en la Patente Estadounidense No. 5,256,790. La preparación de estos ésteres y éteres se describe en las patentes listadas anteriormente. En otras modalidades, se describen oximas, hidrazonas e hidroxilaminas de rapamicina útiles en la invención en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,373,014, 5,378,836, 5,023,264, y 5,563,145. Las preparaciones de estas oximas, hidrazonas e hidroxilaminas se describen en las patentes listadas anteriormente. En modalidades adicionales, rapamicinas útiles en la invención incluyen rapamicina [Patente Estadounidense No. 3,929,992], prolina-rapamicina, 7-desmetil rapamicina, 32-desmetil rapamicina, 32-desmetoxi rapamicina y sus derivados como se describe anteriormente. En aún otras modalidades, el método de la invención se puede usar para preparar 32-ésteres de FK 506 (fórmula III) de un compuesto FK-506 que tiene la estructura ilustrada abajo.
En una modalidad, se lleva a cabo la preparación de fórmula (II) o 32-éster de FK 506 (fórmula III) vía esterlficacion catalizada por lipasa usando anhídridos carboxílicos correspondientes como agentes de acilación. Este método de una etapa proporciona un procedimiento sólido para la fórmula (II) o fórmula (III). En otro aspecto, la preparación de un hemiéster de la invención se lleva a cabo usando éster activado bifuncíonal de ácidos dicarboxílicos correspondientes que incluyen ésteres de di(vinilo), di(isopropenilo), di(N-succinimidilo) de ácidos dicarboxílicos como donadores de acilación en la presencia de una lipasa. El intermediario de éster resultante después se hidroliza con agua catalizada por otra lipasa para proporcionar el hemiéster.
I. Anhídridos Dicarboxílicos usados como Agentes de Acilación Los siguientes esquemas de reacción ilustran la preparación de hemiésteres (II) de 42-rapamicina a partir de rapamicina y anhídridos dicarboxílicos en la presencia de una lipasa en un solvente adecuado.
Similarmente, un 32-hemiéster de FK 506 se pude preparar de un FK 506 y anhídrido dicarboxílico usando un FK-506 como el material de partida.
FK-506 Por conveniencia, la siguiente discusión se referirá a una rapamicina y ésteres de 42-rapamicina. Sin embargo, se entenderá que el FK 506 y los 32-ésteres de FK 506 pueden ser fácilmente sustituidos a lo largo de la especificación por una rapamicina y un hemiéster de 42-rapamicina.
Con referencia a los esquemas de reacción anteriores, L es un grupo enlazante. En esta modalidad, grupos enlazantes adecuados son fácilmente seleccionados de una cadena linear o cadena ramificada, que tiene 1 a 6 átomos de carbono ó 2 a 4 átomos de carbono. Ejemplos de grupos enlazantes L adecuados, incluyen sin limitación, alquelenos lineales o ramificados, tales como, dimetileno, trimetileno, tetrametileno, y 2-metil- trimetileno. Aún otros grupos enlazantes adecuados serán fácilmente aparentes por un experto en la técnica. En los esquemas anteriores, el anhídrido dicarboxílico se ilustra 1 por la siguiente estructura ^o . Un experto en la técnica puede fácilmente o seleccionar el anhídrido dicarboxílico apropiado, dando la definición del grupo enlazante anterior. Ejemplos de anhídridos dicarboxílicos adecuados incluyen anhídrido succínico, anhídrido glutárico, anhídrido metilglutárico y mezclas de los mismos. En una modalidad, las lipasas útiles en la presente invención se seleccionan de las lipasas con origen microbiano, llamadas "lipasas microbianas". Lipasas microbianas incluyen, por ejemplo, Candida antárctica, Candida rugosa, Mucor miehei, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas fluorescens, Rhizopus delemar y Aspergillus niger. En otra modalidad, la lipasa de Candida antárctica, tipo B se usa en la práctica de esta invención. La lipasa de C. antárctica es comúnmente disponible, por ejemplo, bajo la designación de producto NOVO SP435 o NOVOZYM 435 de Novo Nordisk, o CHIRAZYME L-2 de Roche Molecular Biochemicals and BioCatalytics. En aún otra modalidad, la lipasa es lipasa PS-C "Amano" II de Amano Enzyme, descrita en este documento. Las lipasas útiles en la presente invención pueden ser usadas en forma cruda, parcialmente purificada, purificada o inmovilizada de diferente origen microbiano, y bajo diferentes nombres comerciales por varios proveedores. La lipasa es usada en una cantidad catalíticamente efectiva, es decir, una cantidad la cual efectivamente cataliza la reacción de acilación a una relación razonable. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que las enzimas se pueden usar en cantidades de aproximadamente 100 hasta aproximadamente 800% en peso (con relación a la cantidad de rapamicina). En una modalidad, la enzima se usa en cantidades de aproximadamente 200 hasta aproximadamente 700% en peso, aproximadamente 250 hasta aproximadamente 600% en peso, o aproximadamente 300 hasta aproximadamente 500% en peso. Las reacciones de la invención son típicamente llevadas a cabo en un solvente adecuado. El solvente se usa en una cantidad la cual puede efectivamente disolver toda o parte de la rapamicina de partida [o FK 506] en el inicio y permite a la reacción proceder a una relación razonable. Ejemplos representativos de solventes útiles en la presente invención incluyen tolueno, éter terc-butil metílico (TBME), tetrahidrofurano (THF), acetonitrilo (MeCN), 1 ,4-dioxano, CH2CI2, CHCI3, éter de etilo, hexano, acetonitrilo (CH3CN), dimetilsulfonamida (DMSO) y mezclas de los mismos. En una modalidad, se usa una mezcla de tolueno-CH3CN. En una modalidad adicional, el tolueno-CH3CN está presente en una relación de aproximadamente 1 :1 hasta aproximadamente 10:1 (v/v), o aproximadamente 3:1 hasta 7:1 (v/v). En aún otra modalidad, se usa tolueno como solvente, En aún otra modalidad, se usa tolueno-CH3CN (5:1 v/v). Las reacciones de la invención se conducen a una temperatura bastante baja para reducir la formación no deseada del producto, pero no tan bajas como para requerir un tiempo de reacción irrazonablemente prolongado. Una temperatura adecuada para este procedimiento enzimático puede ser en la escala de aproximadamente 20°C hasta aproximadamente 75°C, aproximadamente 25 hasta 75°C hasta 75°C, aproximadamente 30°C hasta 40°C hasta aproximadamente 70°C, aproximadamente 32°C hasta 37°C hasta aproximadamente 65°C. En una modalidad, la temperatura es aproximadamente 30°C hasta aproximadamente 65°C, o aproximadamente 40°C hasta 55°C. En una modalidad, el método de la invención se conduce de conformidad con el siguiente procedimiento. Se mezclan una rapamicina [o FK 506], un anhídrido y una lipasa en un solvente. La mezcla después se calienta a 40°C hasta 60°C bajo una atmósfera de argón (Ar2) o nitrógeno (N2) por 1 a 7 días. Las enzimas después se separan de la mezcla de reacción vía filtración. El producto después se purifica vía recristalización o cromatografía en columna de gel de sílice. La reacción se puede monitorear por varias técnicas tales como cromatografía de capa delgada (TLC) y cromatografía líquida de afta resolución (HPLC). Alternativamente, se pueden usar otros métodos de monitoreo por un experto en la técnica. Cuando la reacción se completa, la enzima se filtra y se lava con un solvente adecuado. El solvente puede ser el mismo como el seleccionado para usarse en la reacción, o puede ser diferente del solvente en la reacción. En donde el solvente difiere, se puede seleccionar de entre los solventes definidos anteriormente, u otros solventes comúnmente usados, tales como acetona, acetato de etilo, metanol, etanol, isopropanol, entre otros. El solvente después se evapora bajo condiciones adecuadas, por ejemplo, presión reducida. En una modalidad, el solvente se selecciona para minimiza el contenido de agua en la reacción. Adicionalmente, o alternativamente, se puede aplicar un tamiz molecular a la reacción y/o se pueden agregar agentes de secado a la reacción. Sin embargo, la limitación de contenido de agua en la reacción no es crítica en este aspecto de la invención. El residuo es entonces purificado por medios adecuados, por ejemplo, por cromatografía en columna en gel de sílice, elución con un solvente adecuado o recristalización con un solvente adecuado (por ejemplo, hexano-acetona, hexano-acetato de etilo, éter etílico, entre otros). Otros medios de purificación se conocen por aquellos de habilidad en la técnica y se contemplan por la invención. En una modalidad, si la reacción no termina después de un cierto periodo de tiempo como se declara anteriormente, se puede agregar enzima adicional, y la mezcla se agita por un periodo de tiempo adicional hasta que la reacción se completa como se juzga por TLC o HPLC. El ejemplo 1 abajo ilustra este procedimiento altamente regioselectivo de una etapa, a través de la síntesis de 42-hemisuccinato de rapamicina.
II. Uso de Esteres Dicarboxílicos Activados Bifuncionales como Agentes Acilantes El siguiente esquema de reacción ilustra la preparación de 42-hemiésteres de rapamicina (II) de una rapamicina y un éster dicarboxílico bifuncional. También, un hemiéster de FK-506 puede ser preparado de un FK-506 y un éster dicarboxílico bifuncional usando estos métodos. Se entenderá fácilmente que en donde la siguiente especificación se refiere a rapamicina, se puede sustituir el FK-506 para producir un 32-éster de FK-506. El método de la invención involucra dos etapas. La primera etapa se realiza mezclando rapamicina (o FK-506) y un éster dicarboxílico bifuncional con una lipasa de origen microbiano, como se define anteriormente en un solvente adecuado, como se define anteriormente. La segunda etapa es hidrólisis del intermediario éster resultante usando lipasa para proporcionar el compuesto deseado de fórmula (II) (ó 32-éster de FK-506).
Con referencia al éster dicarboxílico bifuncional, · R-O-"-I— ^O-R , R es cualquier grupo adecuado que activará el grupo acilo. Uno de habilidad en la técnica fácilmente reconocerá un amplio intervalo de grupos R que pueden ser utilizados incluyendo, por ejemplo, ésteres de vinilo, isopropenilo, N-succinimiclilo, 2,2,2-trifluoroetilo, 2,2,2-tricloroetüo, y oxima, entre otros. La selección del grupo de activación no es una limitación en la presente invención. L es un grupo enlazante como se define anteriormente. Ejemplos de grupos L adecuados incluyen aquellos identificados anteriormente, así como también una cadena que incluye uno o más átomos de oxígeno o alquílenos, tales como dimetileno (CH2CH2), trimetileno (CH2CH2CH2), CH2OCH2, tetrametileno (CH2CH2CH2CH2), 2-metil-trimetileno [CH2CH(CH3)CH2], pentametileno (CH2CH2CH2CH2CH2), hexametileno (CH2CH2CH2CH2CH2CH2). Estos reactivos son comercialmente disponibles o se pueden preparar por métodos descritos en la literatura. De manera similar, un 32-hemiéster de FK-506 se puede preparar a partir de FK-506 y un éster dicarboxílico bifuncional usando métodos idénticos. Se entenderá fácilmente, que en donde la siguiente especificación se refiere a rapamicina, el FK-506 puede ser sustituido, para producir un 32-hemiéster de FK-506. En la primera etapa, la reacción se realiza como se describe en la parte I, con la excepción de que se utiliza un éster dicarboxílico bifuncional en lugar de un anhídrido carboxílíco. Se puede seleccionar un solvente de entre aquellos identificados en la parte I anterior. En una modalidad, el solvente se puede seleccionar de entre aquellos definidos anteriormente, o de tolueno, éter ferc-butil metílico (TBME), éter etílico, éter isopropílico, hexano o mezclas de los mismos. En otra modalidad, se usa el TBME. En una modalidad, el TBME se usa en una cantidad de al menos 4 volúmenes en peso (es decir, un volumen que es un exceso de 4 veces (4X) la cantidad de rapamicina) hasta aproximadamente 5 volúmenes en peso, o aproximadamente 5 a 10 volúmenes en peso. El agua residual puede descomponer la rapamicina en un derivado así llamado seco-rapamicina, para formar un producto abierto de anillo de macrolactona. Para minimizar esta reacción colateral, se mantiene una cantidad baja de humedad en el. sistema de reacción. En una modalidad, se usa un solvente anhidro con una preparación comercial estándar del catalizador de lipasa. En otra modalidad, se puede controlar la humedad a través de ajustar la cantidad de agua presente en la solución de lipasa agregando un agente de secado, tal como MgS04, Na2S0 , entre otros. En todavía otra modalidad, se pueden usar tamices moleculares para controlar la humedad. Muchas clases de tamices con diferentes tamaños de poro, que incluyen, 5Á, 4Á y 3Á, entre otros, pueden ser fácilmente utilizados. Los tamices moleculares adecuados son disponibles de una variedad de fuentes comerciales. El procedimiento enzimático de la invención puede tomar lugar a una temperatura en la escala de aproximadamente 20°C hasta aproximadamente 25°C, o hasta aproximadamente 25°C hasta aproximadamente 45°C. En una modalidad, la reacción se realiza bajo N2 para minimizar la descomposición de rapamicina por 12 horas hasta 48 horas. La reacción se puede monitorear por varias técnicas tales como cromatografía de capa delgada (TLC) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
Después de terminación de la reacción, la enzima (lipasa) se filtra y el producto de éster crudo se precipita agregando hexano, o heptano al filtrado. El intermediario éster resultante es entonces sometido a hidrólisis catalizada por lipasa para recuperar el 42-hemiadipato de rapamicina deseado. La segunda etapa comprende la hidrólisis del éster intermediario crudo de la primera etapa en un solvente húmedo en la presencia de lipasa. La lipasa puede ser la misma como la usada en la primera etapa, o puede ser independientemente elegida de entre las lipasas adecuadas identificadas en este documento. En una modalidad, la lipasa es la lipasa PS-C "Amano" II de Amano Enzyme, la cual es inmovilizada en partículas de cerámica químicamente modificadas con un grupo metilacrilo. El medio usado para esta etapa de hidrólisis se puede elegir de entre los solventes definidos anteriormente o de entre los solventes miscibles en agua. En el caso de un solvente miscible en agua, el solvente es saturado con agua. Más preferiblemente, se selecciona un solvente miscible en agua, que incluye, por ejemplo, MeCN, THF, dioxano, alcohol íerc-amílico, acetona o mezcla de los mismos y una cantidad adecuada de agua, por ejemplo, 0.5% en v/v hasta 0% agua en v/v o 1 % en v/v hasta 5% en v/v. En una modalidad, la temperatura para esta reacción está en el intervalo de aproximadamente 20°C hasta aproximadamente 50°C, o aproximadamente a temperatura ambiente (por ejemplo, aproximadamente 25°C) hasta 35°C. En otra modalidad, el MeCN que contiene aproximadamente 2% en agua se usa como el medio de reacción, con aproximadamente 20% en peso de lipasa NOVOZY SP 435 a temperatura ambiente; la reacción se termina dentro de algunas horas. En una modalidad, la etapa de hidrólisis de este método de invención, se conduce de conformidad con el siguiente procedimiento. El producto crudo de la primera etapa se disuelve en un solvente húmedo. Se agrega una cantidad suficiente de lipasa y la mezcla es entonces agitada a temperatura ambiente a 40°C bajo argón (Ar2) o nitrógeno (N2) a atmósfera por 1 hora hasta 24 horas, o hasta que todo el material de partida es convertido al producto de hemiéster de fórmula (II): Esto se puede verificar por métodos convencionales que incluyen por ejemplo, cromatografía de capa delgada (TLC) o cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). La enzima es separada de la mezcla de reacción, por ejemplo, vía filtración. El producto crudo es entonces purificado en excelente rendimiento usando métodos convencionales, por ejemplo, cromatografía en gel de sílice o recristalización. En otra modalidad, este procedimiento de dos etapas se puede realizar en forma de un recipiente, es decir, la segunda etapa de hidrólisis se lleva a cabo sin aislamiento del intermediario de la primera etapa. En este procedimiento de un recipiente, la primera etapa enzimática de conduce como se describe anteriormente. Después de la terminación de la reacción, se agregan un solvente y agua. En una modalidad, el solvente es un solvente miscible en agua, tal como MeCN, THF, dioxano, alcohol íerc-amílico, acetona o una mezcla de los mismos. En aún otra modalidad, la cantidad de agua es desde 0.5% en v/v hasta 10% en v/v, o 1 % en v/v hasta 5% en v/v. La mezcla es entonces agitada por un cierto periodo de tiempo, la enzima es filtrada y el producto crudo es entonces purificado por cromatografía en gel de sílice. En una modalidad, el MeCN que contiene 5% de agua, se agrega a la mezcla de reacción y la reacción se completa dentro de una hora. Este procedimiento enzimático de dos etapas para el 42-hemiéster de rapamicina de fórmula (II), se ilustra además a través de la síntesis de 42-hemiadipato de rapamicina vía un procedimiento de dos etapas (método 1 ) o un procedimiento de un recipiente (método 2) como se muestra en el Ejemplo 2. La síntesis de 42-hemisuberato se muestra en el Ejemplo 3.
III. Condiciones y Usos Los 42-hemiésteres de rapamicina y 32-ésteres de FK-506 con ácidos dicarboxilicos producidos de conformidad con la invención, son precursores útiles en la preparación de un inmunógeno, detector y/o conjugado unido a la matriz. Estos inmunogenos, detectores y conjugados son útiles para la generación y detección de anticuerpos específicos para el material de partida (por ejemplo, una rapamicina o un FK-506) o un derivado del mismo, para medir niveles del material de partida o un derivado del mismo, en fluidos biológicos o de laboratorio, y para aislar las proteínas de enlace al material de partida o un derivado del mismo. Como precursores para preparar conjugados de rapamicina, el ácido carboxílico en los compuestos de fórmula (II) preparado de conformidad con esta invención, se activa usando metodología estándar descrita en la literatura peptídica. Típicamente, esto implica hacer reaccionar el compuesto de la invención con N-hidroxisuccinimida para formar un éster N-succinimidilo activado. Este éster activado puede entonces hacerse reaccionar con el extremo nucleofílico de una molécula portadora inmunogénica para formar un conjugado de rapamicina. El siguiente esquema de reacción ejemplifica esta técnica.
Sin embargo, la invención no está así limitada. Se contempla el uso de estos y otros derivados de rapamicina producidos usando los compuestos de la invención. Se pueden generar anticuerpos específicos para rapamicina o un derivado del mismo usando los conjugados inmunogenos de rapamicina de esta invención, por técnicas estándares que se conocen en la técnica. En una modalidad, un animal hospedero es inoculado en uno o más sitios con un 42-éster de rapamicina regioespecífico purificado de la invención, ya sea solo o en combinación con un adyuvante. Los anticuerpos generados de los conjugados inmunogenos de rapamicina de esta invención, se pueden usar en numerosos inmunoensayos, para determinar los niveles de rapamicina, en ELISA, radioinmunoensayos, en inmunoensayos químioluminiscentes, y en inmunoensayos fluorescentes. En otra modalidad, los 42-derivados de rapamicina de la invención, o los conjugados o anticuerpos generados a través del uso del mismo, se pueden formular por cualquier método adecuado descrito en la técnica. De manera similar, métodos para generar inmunógenos de FK-506, anticuerpos y conjugados, de los hemiésteres de KF-506 de la invención, serán fácilmente aparentes para uno de habilidad en la técnica. La presente invención además proporciona envasados y kits que contienen el 42-hemiéster de rapamicina regioespecífico producido de conformidad con la presente invención y/o el 32-hemiéster de FK-506 producido de conformidad con la invención, y formulado por su uso deseado, por ejemplo, para producción de anticuerpo. En otra modalidad, los anticuerpos o conjugados de rapamicina generados usando las composiciones de la invención, se pueden formular usando una variedad de portadores, preservativos adecuados, o similares. Los recipientes adecuados, que incluyen botellas, viales, paquetes en ampollas, etc., se conocen por aquellos de habilidad en la técnica. Tales envasados y kits pueden contener otros componentes, que incluyen por ejemplo, instrucciones para uso, jeringas, aplicadores, concentraciones estándares de rapamicina (para generación de una curva de concentración estándar), recipientes, placas microtituladoras, soportes sólidos, tubos de prueba, bandejas, etc. Se pueden incluir en el kit, muchas variaciones de reactivos, dependiendo del tipo de ensayo usado. Los siguientes ejemplos están propuestos para ejemplificar la presente invención y no deben ser construidos como limitantes de la invención reivindicada.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 Síntesis de 42-hetnisuccinato de rapamicina La acilación catalizada por lipasa es fácilmente llevada a cabo mezclando rapamicina y anhídrido succínico en un solvente con una lipasa.
Método 1 : Se agitó una mezcla de rapamicina (2.0 g, 2.2 mmol), anhídrido succínico (1.0 g, 10 mmol) y NOVOZYM SP435 (4.5 g) en tolueno (20 mi), a 45°C bajo atmósfera de N2 por 40 horas (40 h). La enzima se filtró y lavó con tolueno, el solvente orgánico combinado se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice eluyendo con CH2CI2-MeOH (12:1 ) para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco (2.02 g, 91 % de rendimiento).
Método 2: Se agitó una mezcla de rapamicina (91.4 mg, 0.1 mmol), anhídrido succínico (120 mg, 1.2 mmol) y NOVOZYM SP435 (400 mg) en tolueno -CH3CN (3 mi, 5:1 v/v), a 45°C bajo atmósfera de N2 por 144 horas. La enzima se filtró y lavó con tolueno y el solvente orgánico combinado se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice eluyendo con CH2CI2-MeOH (12:1 ) para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco (87 mg), mientras se recuperó la rapamicina. El rendimiento del 42-hemisuccinato es 96%, basado en la rapamicina recuperada (86% basada en la cantidad de partida de rapamicina). EM: 1013 (M").
EJEMPLO 2 Síntesis de 42-hemiadipato de rapamicina Método 1 : Se agitó una mezcla de rapamicina (457 mg, 0.5 mmol), diviniladipato (250 mg, 1.25 mmol), tamices moleculares 4Á (80 mg) y NOVOZYM SP435 (300 mg) en éter t-butilmetílico (TBME) (4 mi) a 45°C por 16 horas. La enzima se recuperó por filtración y se lavó con TBME 2 x 1 mi. Lo filtrado entonces se agregó a heptano enfriado en hielo (30 mi). Lo sólido se colectó en un embudo Buchner y el polvo blanco se secó bajo vacío por 2 horas. El polvo blanco se disolvió en 4 mi de CH3CN [que contiene 2% (v/v) de agua]. Se agregó NOVOZYM SP435 (80 mg) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente por 1-2 horas. La enzima se removió vía filtración y se lavó con MeCN 2 x 1 mi. Lo filtrado es concentrado y el residuo es purificado por cromatografía instantánea en gel de sílice eluyendo con CH2CI2:MeOH (15:1 ) para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco (470 mg, 90% de rendimiento sobre dos etapas). EM: 1041 (M~).
Método 2: Se agitó una mezcla de rapamicina (3.0 g, 3.28 mmol), diviniladipato (2.0 g, 10 mmol), y NOVOZYM SP435 (3.0 mg) en éter t-butilmetílico anhidro. (TBME) (18 mi) a 40°C por 36 horas. Se agregó MeCN (10 mi, que contiene H20 al 5%). Después de 15 minutos (15 min), la enzima se removió por filtración y se lavó con TBME/MeCN (2:1 ). La concentración y purificación por cromatografía instantánea en gel de sílice eluyendo con hexano-acetona (5:4), proporcionó el compuesto como un sólido blanco (3.05 g, 89% de rendimiento).
EJEMPLO 3 Síntesis de 42-suberato de rapamicina Se agitó una mezcla de rapamicina (3.0 g, 3.28 mmol), divinilsuberato (2.26 g, 10 mmol) y NOVOZYM SP435 (3.0 g), en éter t- butilmetílico anhidro (TBME) (18 ML), a 40°C por 48 horas. Se agregó eCN (10 mi, que contiene H20 al 5%). Después de 15 minutos, la enzima se removió por filtración y se lavó con TBME/MeCN (2:1 ). La concentración y purificación por cromatografía instantánea en gel de sílice eluyendo con hexano-acetona (5:4) proporcionó el compuesto del título como una espuma blanca (2.88 g, 82% de rendimiento). La presente invención no está limitada en alcance por las modalidades específicas descritas en este documento. Sin embargo, varias modificaciones de la invención además de aquellas descritas en este documento, llegarán a ser aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción mencionada anteriormente. Tales modificaciones están propuestas para caer dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Además, se entiende que los valores son aproximados y son proporcionados para descripción. Las patentes, solicitudes de patente, publicaciones, procedimientos y similares, son citados a través de esta solicitud, las descripciones de los cuales están incorporadas en este documento por referencia en sus totalidades. En la magnitud que un conflicto pueda existir entre la especificación y la referencia, el lenguaje de la descripción hecho en este documento lo controla.

Claims (32)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES
1. Un método para la síntesis regioespecífica de un 42-hemiéster de rapamicina o un 32-hemiéster de FK-506 con un ácido carboxílico, caracterizado porque dicho método comprende la etapa de hacer reaccionar una rapamicina de un FK-506 con un anhídrido dicarboxílico en la presencia de una lipasa.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1 , para la síntesis regioespecífica de un 42-hemiéster de rapamicina con ácidos dicarboxílicos, caracterizado además porque dicho método comprende la etapa de hacer reaccionar rapamicina con un anhídrido dicarboxílico en la presencia de una lipasa.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1 , para la síntesis regioespecífica de un 32-hemiéster de FK-506 con un ácido dicarboxílico, caracterizado además porque dicho método comprende la etapa de hacer reaccionar un FK-506 con un anhídrido dicarboxílico en la presencia de una lipasa.
4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque el anhídrido dicarboxílico tiene la estructura en donde L es un grupo enlazante con una cadena recta o cadena ramificada que tiene 1 a 6 átomos de carbono.
5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque el anhídrido dicarboxílico se selecciona del grupo que consiste de anhídrido succínico, anhídrido glutárico, anhídrido 3-metilglutárico y mezclas de los mismos.
6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque la lipasa es una lipasa de un microorganismo seleccionado del grupo que consiste de Candida antárctica, Candida rugosa, Mucor miehei, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas fluorescens, Rhizopus delemar y Aspergillus niger.
7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque la lipasa usada es una lipasa inmovilizada de Candida antárctica.
8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado además porque la reacción se conduce en un solvente seleccionado del grupo que consiste de tolueno, éter terc-butil metílico (TBME), tetrahidrofurano (THF), acetonitrilo (MeCN), 1 ,4-dioxano, CH2CI2, CHCI3, éter etílico, hexano y mezclas de los mismos.
9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado además porque la reacción se conduce en la escala de 20°C hasta 75°C.
10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque la reacción se conduce en la escala de 35°C hasta 60°C.
11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque la lipasa es una lipasa NOVOZYM SP435, el solvente es una mezcla de tolueno-acetonitrilo a una relación de 5:1 v/v, y la reacción se conduce a una temperatura de aproximadamente 45°C.
12. Un método para la síntesis regioespecífica de un 42-hemiéster de rapamicina o un 32-hemiéster de FK-506 con ácidos dicarboxílicos, caracterizado porque dicho método comprende las etapas de (a) hacer reaccionar una rapamicina o un FK-506 con un éster activado bifuncional de ácido dicarboxílico en la presencia de una lipasa para formar un intermediario éster, y (b) hidrolizar el intermediario éster con una lipasa.
13. Un método para la síntesis regioespecífica de un 42-hemiéster de rapamicina con ácidos dicarboxílicos, caracterizado porque dicho método comprende las etapas de (a) hacer reaccionar una rapamicina con un éster activado bifuncional de ácido dicarboxílico en la presencia de una lipasa para formar un intermediario éster, y (b) hidrolizar el intermediario éster con una lipasa.
14. Un método para la síntesis regioespecífica de un 32- hemiéster de FK-506 con ácidos dicarboxílicos, caracterizado porque dicho método comprende las etapas de (a) hacer reaccionar un FK-506 con un éster activado bifuncional de ácido dicarboxílico en la presencia de una lipasa para formar un intermediario éster, y (b) hidrolizar el intermediario éster con una lipasa.
15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, caracterizado además porque el éster bifuncional del ácido dicarboxílico tiene la estructura o o en donde R es vinilo, isopropenilo o N-succinimidilo y L es un grupo enlazante con una cadena recta o una cadena ramificada que tiene 1 a 6 átomos de carbono.
16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque L comprende adicionalmente uno o más átomos de oxígeno.
17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, caracterizado además porque la lipasa usada en la etapa (a) se selecciona de una lipasa de un microorganismo seleccionado del grupo que consiste de Candida antárctica, Candida rugosa, Mucor miehei, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas fluorescens, Rhizopus delemar y Aspergillus niger.
18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque la lipasa usada en la etapa (a) es NOVOZYM SP435 de Candida antárctica o Lipasa PS-C "Amano" II de Pseudomonas cepacia.
19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 18, caracterizado además porque la reacción de la etapa (a) se conduce en un solvente seleccionado del grupo que consiste de tolueno, éter terc-butil metílico (TBME), tetrahidrofurano (THF), acetonitrilo (MeCN), 1 ,4-dioxano, CH2CI2, CHCI3, éter etílico, hexano y mezclas de los mismos.
20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque comprende adicionalmente agregar un tamiz molecular a la reacción.
21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 20, caracterizado además porque la reacción de la etapa (a) se conduce en la escala de 20°C hasta 75°C.
22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, caracterizado además porque la lipasa usada en la etapa (a) se selecciona de NOVOZYM SP435 o Lipasa PS-C "Amano" II, el solvente es TBME y la reacción se conduce a una temperatura de aproximadamente 45°C.
23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 22, caracterizado además porque la lipasa usada en la etapa (b) es una lipasa de un microorganismo seleccionado del grupo que consiste de Candida antárctica, Candida rugosa, Mucor miehei, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas fluorescens, Rhizopus delemar y Aspergillus niger.
24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la lipasa usada en la etapa (b) es Candida antárctica o de Pseudomonas cepacia.
25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 24, caracterizado además porque la hidrólisis de la etapa (b) se realiza en un solvente seleccionado del grupo que consiste de tolueno, éter íerc-butil metílico (TBME), tetrahidrofurano (THF), acetonitrilo (MeCN), 1 ,4-dioxano, CH2CI2, CHCI3, éter etílico, hexano y mezclas de los mismos, dicho solvente o mezcla de solvente contiene aproximadamente 0.5 hasta 10% de agua.
26. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 25, caracterizado además porque la hidrólisis de la etapa (b) se conduce en la escala de temperatura ambiente hasta 50°C.
27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 22, caracterizado además porque la lipasa usada en la etapa (b) se selecciona de NOVOZYM SP435 o Lipasa PS-C "Amano" II, el solvente es acetonitrilo (MeCN) que contiene agua al 2%, y la reacción se conduce a temperatura ambiente.
28. Un 42-hemiéster de rapamicina regioespecífico producido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 4 a 13 y 15 a 27.
29. Un anticuerpo de rapamicina producido usando un 42- hemiéster de rapamicina regioespecífico de conformidad con la reivindicación 28.
30. Un conjugado de rapamicina producido usando un 42-hemiéster de rapamicina regioespecífico de conformidad con la reivindicación 28.
31. Un producto que comprende un anticuerpo de rapamicina de conformidad con la reivindicación 29 o un conjugado de rapamicina de conformidad con la reivindicación 30.
32. Un 32-hemiéster de FK-506 regioespecífico producido de acuerdo con el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 12 y 14 a 27.
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