ES2313328T3 - Procedimiento para la preparacion de 42-esteres de rapamicina y 32-esteres de fk-506 con acido dicarboxilico, precursores para conjugados de rapamicina y anticuerpos. - Google Patents
Procedimiento para la preparacion de 42-esteres de rapamicina y 32-esteres de fk-506 con acido dicarboxilico, precursores para conjugados de rapamicina y anticuerpos. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para la síntesis regioespecífica de un 42-hemiéster de rapamicina o un 32-hemiéster de FK- 506 con un ácido dicarboxílico, comprendiendo dicho procedimiento la etapa que consiste en hacer reaccionar una rapamicina o un FK-506 con un anhídrido dicarboxílico en presencia de una lipasa.
Description
Procedimiento para la preparación de 42-ésteres
de rapamicina y 32-ésteres de FK-506 con ácido
dicarboxílico, precursores para conjugados de rapamicina y
anticuerpos.
La rapamicina es un antibiótico triénico
macrocíclico producido por Streptomyces hygroscopicus, que
ha demostrado tener actividad antimicótica, en particular contra
Candida albicans, tanto in vitro como in vivo.
La rapamicina está comercializada como Rapamune® (Wyeth). La
rapamicina ha demostrado ser útil también en composiciones
antineoplásicas, como agente inmunosupresor, en el tratamiento de la
artritis reumatoide, para la prevención o el tratamiento del lupus
eritematoso sistémico [Patente US nº 5.078.999],
inflamación pulmonar [Patente US nº 5.080.899], diabetes mellitus
dependiente de insulina [Fifth Int. Conf. Inflamm. Res. Assoc. 121
(Resumen), (1990)], leucemia/linfoma de células T del adulto
[Solicitud de patente europea nº 525.960 A1], y proliferación de las
células musculares lisas y engrosamiento de la íntima tras lesión
vascular [R. Morris, J. Heart Lung Transplant 11 (pt. 2): 197
(1992)].
La rapamicina y su preparación se describen en
la patente US nº 3.929.992, publicada el 30 de diciembre de 1975.
El 42-éster de rapamicina con ácido
3-hidroxi-2-(hidroximetil)-2-metilpropiónico
(CCI-779) es un éster de rapamicina que ha
demostrado tener significativos efectos inhibidores del crecimiento
de tumores tanto en modelos in vitro como in vivo. La
preparación y la utilización de hidroxiésteres de rapamicina,
incluido CCI-779, se describen en las patentes US
n^{os} 5.362.718 y 6.277.983, y la publicación de patente US nº
2005- 0033046 A1 (solicitud de patente US nº 10/903.062).
Se han sintetizado derivados de rapamicina en la
posición 42-OH, y se ha comprobado su utilidad para
generar inmunosupresión, para el tratamiento del rechazo de
trasplantes, enfermedades autoinmunitarias, tumores sólidos,
leucemia/linfoma de células T. del adulto, trastornos vasculares
hiperproliferativos, entre otros. Algunos derivados sirven de
precursores para la síntesis de conjugados de rapamicina de fórmula
general (I), presentada a continuación, que son útiles como
moléculas inmunógenas para la generación de anticuerpos específicos
para la rapamicina, así como para el aislamiento de proteínas que
se unen a la rapamicina para su uso en inmunoanálisis, y para la
detección de anticuerpos específicos para la rapamicina o para
derivados de la misma.
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En la fórmula I, el portador es un material
portador inmunógeno o un material portador detector tal como una
proteína o un polipéptido, y L es un conector que permite la unión
de la rapamicina al portador. [Publicación de patente US nº US
2004-0010920].
Se han descrito diversos
42-derivados de rapamicina que pueden utilizarse
como grupos conectores para la preparación de conjugados. Por
ejemplo, la preparación del éster fluorado de rapamicina se describe
en la patente US nº 5.100.883, la preparación de ésteres de amida
se da a conocer en la patente US nº 5.118.667, la preparación de
aminoésteres se da a conocer en la patente US nº 5.130.307, la
preparación de carbamatos de rapamicina se da a conocer en la
patente US nº 5.118.678, la preparación de sulfonatos y sulfamatos
se describe en la patente US nº 5.177.203, la preparación de
42-éster con ácido succínico y con otros ácidos dicarboxílicos
(ácido adípico, ácido glutárico, ácido diglicólico, etc.) se
describe en la publicación de patente US nº
2001-0010920 A1, patente US nº 5.378.696, y las
publicaciones de patentes internacionales nº WO 98/45333, WO
94/25072, WO 94/25022 y WO 92/05179. En una forma de realización, se
utilizan 42-ésteres con ácidos dicarboxílicos, tales como
42-hemisuccinato, 42-hemiglutarato y
42-hemiadipatos (fórmula II) para la síntesis del
conjugado de rapamicina de fórmula I:
Se ha descrito la síntesis de un compuesto de
fórmula (II) realizada mediante la esterificación directa de
42-OH con un anhídrido correspondiente en presencia
de una base débil. Debido a la sensibilidad de la rapamicina en
condiciones básicas, y a la escasa regioselectividad, el
42-hemiéster deseado se produce con un rendimiento
bajo (típicamente inferior a 20%) tras la purificación por HPLC; el
producto crudo está contaminado con 31,42-diéster,
31-éster y otros productos secundarios.
Con el objetivo de aumentar el rendimiento de
dicho procedimiento se ha un utilizado una estrategia de hidrólisis
catalizada por una lipasa en dos etapas, [M. Adamczyk, et
al., Tetrahedron Letters, 35(7):
1019-1022 (1994)], en la que el correspondiente
éster bencílico y metílico de rapamicina con
42-hemisuccinato se hidroliza utilizando una lipasa
de Pseudomonas sp. Se obtenía un rendimiento ligeramente
mejorado (29% a partir del éster bencílico, y 50% a partir del
éster metílico). Sin embargo, la síntesis del éster bencílico y
metílico de 42-hemisuccinato de rapamicina
empleando técnicas químicas convencionales también adolece de escasa
regioselectividad, bajos rendimientos y etapas laboriosas de
purificación.
Por consiguiente, hay una necesidad de encontrar
un procedimiento eficaz de síntesis de hemiésteres con rendimientos
mejorados.
El documento EP 0 464 895 A2 da a conocer un
procedimiento para la acilación selectiva de la posición
C-32 en un macrólido de tipo
FK-506, que comprende la etapa de poner en contacto
dicho macrólido de tipo FK-506 con un donador de
acilos y una enzima lipasa anclada en un soporte sólido. Como
donadores de acilos se mencionan anhídridos de ácidos carboxílicos
tales como anhídrido acético, anhídrido propiónico y anhídrido
butírico.
El documento GB 2.281.294 da a conocer un
procedimiento para la producción de hemiésteres de
FK-SOG con un ácido dicarboxílico haciendo
reaccionar una mezcla que comprende FK-506 y un
ácido dicarboxílico o un anhídrido del mismo, en presencia de
dialquilpiridina, sin ninguna otra base.
El documento WO 92/0S 179 da a conocer ésteres
de rapamicina con ácidos carboxílicos que son útiles como agentes
inmunosupresores, antiinflamatorios, y antimicóticos, así como
métodos para la preparación de los mismos.
El documento WO 94/24304 da a conocer nuevos
derivados de rapamicina activados utilizados para preparar
conjugados inmunógenos, y métodos para la preparación de los
mismos, que comprenden hacer reaccionar la rapamicina con un
anhídrido cíclico, tal como anhídrido succínico, en condiciones
adecuadas, tal como en presencia de DMAP y piridina.
La presente invención describe un procedimiento
para la síntesis de 42-hemiéster de rapamicina de
fórmula (II) a partir de una rapamicina en presencia de una lipasa,
una enzima hidrolítica. En otro aspecto, el procedimiento de la
invención proporciona la producción regioespecífica de
32-hemiéster de FK-506 a partir de
FK-506 en presencia de una lipasa. El método de la
invención proporciona una estrategia regioselectiva para la síntesis
de dichos compuestos con excelente rendimientos.
La presente invención también proporciona
métodos de utilización de los compuestos intermediarios producidos
según la presente invención para la generación de anticuerpos y
conjugados.
El método de la invención produce un
42-hemiéster de rapamicina (II) o un hemiéster de
FK-506 que es un precursor para la preparación de
un conjugado de rapamicina.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "una rapamicina" define una clase de compuestos
inmunosupresores que contienen el núcleo básico de la rapamicina
(presentado a continuación).
Una rapamicina según la presente invención
incluye compuestos que pueden modificarse por vías químicas o
biológicas para formar derivados del núcleo de rapamicina,
manteniendo al mismo tiempo las propiedades inmunosupresoras. Por
consiguiente, la expresión "una rapamicina" incluye ésteres,
éteres, oximas, hidrazonas, e hidroxilaminas de rapamicina, así
como rapamicinas en las que los grupos funcionales del núcleo han
sido modificados, por ejemplo, por reducción u oxidación, un
metabolito de rapamicina, o una rapamicina con el anillo abierto
(tal como seco-rapamicina, descrita en la patente
US nº 5.252.579). La expresión "una rapamicina" también incluye
sales, aceptables desde el punto de vista farmacéutico, de
rapamicinas que son capaces de formar dichas sales debido a que
contienen un radical ácido o un radical básico.
Sin embargo, dichos compuestos mantienen los
grupos hidroxilo en la posición 42, para permitir la producción de
42-hemiésteres regioespecíficos de la invención.
En una realización, los ésteres y éteres de
rapamicina útiles en la invención son los formados con los grupos
hidroxilo en la posición 31 del núcleo de la rapamicina, ésteres y
éteres de un grupo hidroxilo en la posición 27 (tras la reducción
química de la 27-cetona), y las oximas, hidrazonas e
hidroxilaminas se forman son derivados de una cetona del núcleo de
la rapamicina.
En otras realizaciones se describen 31-ésteres y
éteres de rapamicina útiles en la invención en las siguientes
patentes: ésteres alquílicos (Patente US nº 4.316.885), ésteres
aminoalquílicos (Patente US nº 4.650.803), ésteres fluorados
(Patente US nº 5.100.883), ésteres de amida (Patente US nº
5.118.677), ésteres de carbamato (Patente US nº 5.118.678), éteres
silílicos (Patente US nº 5.120.842), aminoésteres (Patente US nº
5.130.307), acetales (Patente US nº 5.51.413), aminodiésteres
(Patente US nº 5.162.333), ésteres de sulfonato y sulfato (Patente
US nº 5.177.203), ésteres (Patente US nº 5.221.670), alcoxiésteres
(Patente US nº 5.233.036), éteres O-arílicos,
-alquílicos, -alquenílicos y -alquinílicos (Patente US nº
5.258.389), ésteres de carbonato (Patente US nº 5.260.300),
carbamatos de arilcarbonilo y alcoxicarbonilo (Patente US nº
5.262.423), carbamatos (Patente US nº 5.302.584), hidroxiésteres
(Patente US nº 5.362.718), ésteres impedidos (Patente US nº
5.385.908), ésteres heterocíclicos (Patente US nº 5.385.909),
ésteres geminales disustituidos (Patente US nº 5.385.910), ésteres
aminoalcanoicos (Patente US nº 5.389.639), ésteres de
fosforilcarbamato (Patente US nº 5.391.730), ésteres de carbamato
(Patente US nº 5.411.967), ésteres de carbamato (Patente US nº
5.434.260), ésteres de amidinocarbamato (Patente US nº 5.463.048),
ésteres de carbamato (Patente US nº 5.480.988), ésteres de
carbamato (Patente US nº 5.480.989), ésteres de carbamato (Patente
US nº 5.489.680), ésteres N-óxido impedidos (Patente US nº
5.491.231), ésteres de biotina (Patente US nº 5.504.091), éteres
O-alquílicos (Patente US nº 5.665.772), y ésteres de
rapamicina con PEG (Patente US nº 5.780.462). La preparación de
dichos ésteres y éteres se describe en las patentes mencionadas
anteriormente.
En otras formas de realización adicionales, se
describen 27-ésteres y éteres de rapamicina útiles en la invención
en la patente US nº 5.256.790. La preparación de dichos ésteres y
éteres se describe en las patentes mencionadas anteriormente.
En otras formas de realización, las oximas, se
describen hidrazonas e hidroxilaminas de rapamicina útiles en la
invención las patentes US nº 5.373.014, nº 5.378.836, nº 5.023.264,
y nº 5.563.145. La preparación de dichas oximas, hidrazonas e
hidroxilaminas se describe en las patentes mencionadas
anteriormente.
En otras formas de realización adicionales, las
rapamicinas útiles en la invención incluyen rapamicina [Patente US
nº 3.929.992], prolina-rapamicina,
7-desmetil-rapamicina,
32-desmetil-rapamicina,
32-desmetoxi-rapamicina, y
derivados de las mismas, como se ha descrito anteriormente.
En otras formas de realización adicionales, el
método de la invención puede utilizarse para preparar 32-ésteres de
FK-506 (fórmula III) a partir de un compuesto
FK-506 que tiene la estructura presentada a
continuación.
En una forma de realización, la preparación de
fórmula (II) o del 32-éster de FK-506 (fórmula III)
mediante un esterificación catalizada por una lipasa se lleva a
cabo utilizando los correspondientes anhídridos de ácidos
carboxílicos como agentes acilantes. Dicho método de una sola etapa
proporciona un procedimiento robusto para preparar los compuestos
de fórmula (II) o fórmula (III). En otro aspecto, la preparación de
un hemiéster de la invención se lleva cabo utilizando un éster
activado bifuncional de los correspondientes ácidos
di-carboxílicos, incluidos ésteres
di(vinílicos), di(isopropenílicos),
di(N-succinimidílicos) de ácidos
dicarboxílicos como agentes acilantes en presencia de una lipasa.
El intermediario éster resultante se hidroliza a continuación con
agua en una reacción catalizada por otra lipasa, para dar lugar al
hemiéster.
El siguiente esquema ilustra la preparación de
42-hemiésteres de rapamicina (II) a partir de
rapamicina y anhídridos dicarboxílicos en presencia de una lipasa
en un disolvente adecuado.
De forma similar, puede prepararse un
32-hemiéster de FK-506 a partir de
un FK-506 y anhídridos dicarboxílicos, empleando un
FK-506 como material de partida.
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En la práctica, la siguiente discusión se
referirá a una rapamicina y 42-ésteres de rapamicina. Sin embargo,
deberá entenderse que el FK-506 y el 32-éster de
FK-506 pueden sustituirse fácilmente en toda la
descripción en lugar de una rapamicina y un
42-hemiéster de rapamicina.
Con relación a los esquemas anteriores, L es un
grupo conector. En esta realización, los grupos conectores
adecuados se seleccionan fácilmente a partir de un radical de cadena
lineal o de cadena ramificada, que tiene 1 a 6 átomos de carbono o
2 a 4 átomos de carbono. Los ejemplos de grupos conectores L
adecuados incluyen, sin limitarse a los mismos, alquilenos lineales
o ramificados tales como dimetileno, trimetileno, tetrametileno, y
2-metil-trimetileno. El experto en
la materia podrá apreciar fácilmente que pueden emplearse otros
grupos conectores adecuados.
En los esquemas anteriores el anhídrido
dicarboxílico se ilustra mediante la siguiente estructura:
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El experto en la materia puede seleccionar
fácilmente el anhídrido dicarboxílico adecuado, dada la definición
del grupo conector anterior. Los ejemplos de anhídridos
dicarboxílicos adecuados incluyen anhídrido succínico, anhídrido
glutárico, anhídrido 3-metilglutárico, y mezclas de
los mismos.
En una realización, las lipasas útiles en la
presente invención se seleccionan a partir de lipasas de origen
microbiano, denominadas "lipasas microbianas". Las lipasas
microbianas incluyen, lipasas de, por ejemplo, Candida
antarctica, Candida rugosa, Mucor miehei, Pseudomonas cepacia,
Pseudomonas fluorescens, Rhizopus delemar, y Aspergillus
niger. En otra realización, se utiliza la lipasa de Candida
antarctica de tipo B en la práctica de la presente invención.
Una lipasa de C. antarctica está comercializada, por
ejemplo, con la denominación comercial NOVO SP435 o NOVOZYM 435, de
Novo Nordisk, o CHIRAZYME L-2 de Roche Molecular
Biochemicals and BioCatalytics. En otra realización adicional, la
lipasa es la lipasa PS-C "Amano" II de Amano
Enzyme, descrita en la presente memoria. Las lipasas útiles en la
presente invención pueden utilizarse en forma cruda, parcialmente
purificada, purificada, o inmovilizada, con distintas procedencias
microbiológicas, y con diferentes nombres comerciales empleados por
varios proveedores.
La lipasa se utiliza en una cantidad eficaz
desde el punto de vista catalítico, es decir, una cantidad que
cataliza de forma eficaz la reacción de acilación a una velocidad
razonable. Los expertos en la materia apreciarán que la enzima
puede utilizarse en cantidades de aproximadamente 100 hasta
aproximadamente 800% en peso (relativo a la cantidad de
rapamicina). En una forma de realización, la enzima se utiliza en
cantidades de aproximadamente 200 hasta aproximadamente 700% en
peso, aproximadamente 250 hasta aproximadamente 600% en peso, o
aproximadamente 300 hasta aproximadamente 500% en peso.
Las reacciones de la invención se llevan a cabo
típicamente en un disolvente adecuado. El disolvente se utiliza en
una cantidad que puede disolver de forma eficaz toda o parte de la
rapamicina de partida [o del FK-506] empleada al
inicio, y permite el transcurso de la reacción a una velocidad
razonable. Los ejemplos representativos de disolventes útiles en la
presente invención incluyen tolueno, éter
ter-butil-metílico (TBME), tetrahidrofurano
(THF), acetonitrilo (MeCN), 1,4-dioxano,
CH_{2}Cl_{2}, CHCl_{3}, éter etílico, hexano, acetonitrilo
(CH_{3}CN), dimetilsulfona (DMSO), y mezclas de los mismos. En una
realización se utiliza una mezcla de
tolueno-CH_{3}CN. En otra realización adicional,
el tolueno-CH_{3}CN está presente en una relación
de aproximadamente 1:1 hasta aproximadamente 10:1 (v/v), o
aproximadamente 3:1 a 7:1 (v/v). En otra realización adicional se
utiliza tolueno como disolvente. En otra forma de realización
adicional se utiliza tolueno-CH_{3}CN (5:1
v/v).
Las reacciones de la invención se llevan a cabo
una temperatura suficientemente baja como para reducir la formación
de productos secundarios no deseados, pero no tan baja como para
requerir un tiempo de reacción demasiado prolongado. Una
temperatura adecuada para este proceso enzimático puede situarse en
el intervalo de aproximadamente 20ºC hasta aproximadamente 75ºC,
aproximadamente 25 a 27ºC hasta 75ºC, aproximadamente 30ºC a 40ºC
hasta aproximadamente 70ºC, aproximadamente 32ºC a 37ºC hasta
aproximadamente 65ºC. En una realización, la temperatura es
aproximadamente 30ºC hasta aproximadamente 65ºC, o aproximadamente
40ºC a 55ºC.
En una forma de realización, el método de la
invención se lleva a cabo con arreglo al siguiente procedimiento.
Una rapamicina [o FK-506], un anhídrido y una lipasa
se mezclan en un disolvente. La mezcla se calienta después a 40ºC
hasta 60ºC en atmósfera de argón (Ar_{2}) o nitrógeno (N_{2})
durante 1 a 7 días. La enzima se separa después de la mezcla de
reacción por filtración. El producto se purifica a continuación por
recristalización o por cromatografía en columna de gel de
sílice.
La reacción puede medirse empleando varias
técnicas tales como cromatografía en capa fina (TLC) y cromatografía
de líquidos de alta eficacia (HPLC). Como alternativa, el experto
en la materia puede utilizar otros métodos de medición. Cuando se
completa la reacción, la enzima (lipasa) se elimina por filtración y
se lava con un disolvente adecuado. El disolvente puede ser el
mismo seleccionado para su utilización en la reacción, o puede ser
distinto del disolvente utilizado en la reacción. Cuando el
disolvente es distinto, puede seleccionarse a partir de los
disolventes definidos anteriormente, u otros disolventes utilizados
habitualmente, tales como acetona, acetato de etilo, metanol,
etanol, isopropanol, entre otros. El disolvente puede después
eliminarse por evaporación en condiciones adecuadas, por ejemplo, a
baja presión.
En una forma de realización, el disolvente se
selecciona para reducir al mínimo el contenido de agua en la
reacción. Además, o como alternativa, puede aplicarse un tamiz
molecular a la reacción y/o pueden añadirse agentes de secado a la
reacción. Sin embargo, la limitación del contenido de agua de la
reacción no es crítica para este aspecto de la invención.
El residuo se purifica a continuación por medios
adecuados, por ejemplo, por cromatografía en columna de gel de
sílice, con elución con un disolvente adecuado, o recristalización
con un disolvente adecuado (por ejemplo,
hexano-acetona, hexano-acetato de
etilo, éter etílico, entre otros). Otros medios de purificación son
conocidos por los expertos en la materia y están contemplados en la
invención.
En una realización, si la reacción no acaba
después del período de tiempo concreto mencionado anteriormente,
puede añadirse más enzima, y la mezcla puede agitarse durante más
tiempo hasta que la reacción se complete, a juzgar por TLC o
HPLC.
El Ejemplo 1 presentado más adelante ilustra
este procedimiento de una sola etapa, muy regioselectivo, para la
síntesis de 42-hemisuccinato de rapamicina.
El siguiente esquema ilustra la preparación de
un 42-hemiéster de rapamicina (II) a partir de una
rapamicina y de un éster dicarboxílico bifuncional. También puede
prepararse un hemiéster de FK-506 a partir de un
FK-506 y un éster dicarboxílico bifuncional
utilizando estos métodos. Se apreciará fácilmente que aunque la
siguiente descripción se refiere a la rapamicina, puede sustituirse
por el FK-506 con el objeto de producir un 32-éster
de FK-506 .
El método de la invención comprende dos etapas.
La primera etapa se realiza mezclando rapamicina (o
FK-506) y un éster dicarboxílico bifuncional con
una lipasa de origen microbiano, como se ha definido anteriormente,
en un disolvente adecuado, como se ha definido anteriormente. La
segunda etapa es la hidrólisis del intermediario éster resultante
utilizando una lipasa, para dar lugar al compuesto deseado de
fórmula (II) (o al 32-éster de FK-506).
En lo que se refiere al éster dicarboxílico
bifuncional,
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R es cualquier grupo adecuado capaz de activar
el grupo acilo. El experto en la materia apreciará fácilmente que
pueden utilizarse una amplia gama de grupos R, incluidos, por
ejemplo, vinilo, isopropenilo, N-succinimidilo,
2,2,2-trifluoroetilo,
2,2,2-tricloroetilo, y ésteres de oximas, entre
otros. La selección del grupo activador no es una limitación en la
presente invención. L es un grupo conector, como se ha definido
anteriormente. Los ejemplos adecuados de grupos L incluyen los
identificados anteriormente, así como una cadena que incluye uno o
más átomos de oxígeno, o alquilenos tales como dimetileno
(CH_{2}CH_{2}), trimetileno (CH_{2}CH_{2}CH_{2}),
CH_{2}OCH_{2}, tetrametileno (CH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}),
2-metil-trimetileno
[CH_{2}CH(CH_{3})CH_{2}], pentametileno
(CH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}), hexametileno
(CH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}). Esto reactivos
están comercializados o pueden prepararse por métodos descritos en
la literatura.
De modo similar, puede prepararse un
32-hemiéster de FK-506 a partir de
un FK-506 y un éster dicarboxílico bifuncional
utilizando métodos idénticos. Se apreciará fácilmente que aunque la
siguiente descripción se refiere a una rapamicina, puede
sustituirse por un FK-506 con el objeto de producir
un 32-hemiéster de FK-506.
En la primera etapa, la reacción se lleva a cabo
como se describe en la parte I, con la salvedad de que se utiliza
un éster dicarboxílico bifuncional en lugar de un anhídrido
carboxílico. Exceptuando dichas salvedades, las lipasas y las
condiciones de reacción son las descritas en la parte I
anterior.
Se puede seleccionar un disolvente a partir de
los identificados en la parte I anterior. En una realización, el
disolvente puede seleccionarse a partir de los definidos
anteriormente, o a partir de tolueno, éter
ter-butil-metílico (TBME), éter etílico,
éter isopropílico, hexano, o mezclas de los mismos. En otra forma de
realización, se utiliza TBME. En una realización se utiliza TBME en
una cantidad de por lo menos 4 volúmenes por peso (es decir, un
volumen superior a 4 veces (4X) la cantidad de rapamicina) hasta
aproximadamente 15 volúmenes por peso, o aproximadamente 5 a 10
volúmenes por peso.
El agua residual puede degradar la rapamicina
para dar lugar al derivado denominado
seco-rapamicina, formando un producto con anillo
abierto de macro-lactona. Con el objeto de reducir
al mínimo esta reacción secundaria, se mantiene un bajo nivel de
humedad en el sistema de la reacción. En una realización, se utiliza
un disolvente anhidro con una preparación comercial estándar del
catalizador de lipasa. En otra realización, la humedad se controla
ajustando la cantidad de agua presente en la solución de la lipasa
añadiendo un agente desecante, tal como MgSO_{4},
Na_{2}SO_{4}, entre otros. En otra realización adicional, pueden
utilizarse tamices moleculares para controlar la humedad. Se pueden
utilizar fácilmente muchos tipos de tamices con diferentes tamaños
de poro, incluidos 5 \ring{A}, 4 \ring{A} y 3 \ring{A}, entre
otros. Pueden obtenerse tamices moleculares adecuados a partir de
diversos proveedores comerciales.
El procedimiento enzimático de la invención
puede tener lugar a una temperatura en el intervalo de
aproximadamente 20ºC hasta aproximadamente 50ºC, o aproximadamente
25ºC hasta aproximadamente 45ºC. En una realización, la reacción se
realiza en atmósfera de N_{2} para reducir al mínimo la
descomposición de la rapamicina, durante 12 horas a 48 horas. La
reacción puede medirse empleando varias técnicas tales como
cromatografía en capa fina (TLC) y cromatografía de líquidos de
alta eficacia (HPLC). Una vez completada la reacción, la enzima
(lipasa) se elimina por filtración y el producto crudo de éster se
precipita añadiendo al filtrado hexano o heptano.
El intermediario éster resultante se somete a
continuación a hidrólisis catalizada por la lipasa, para recuperar
el 42-hemiadipato de rapamicina deseado.
La segunda etapa comprende la hidrólisis del
intermediario éster crudo obtenido en la primera etapa en un
disolvente húmedo en presencia de una lipasa. La lipasa puede ser la
misma que la utilizada en la primera etapa, o puede seleccionarse
independientemente a partir de lipasas adecuadas identificadas en la
presente memoria. En una realización, la lipasa es lipasa
PS-C "Amano" II, de Amano Enzyme, que está
inmovilizada en partículas de cerámica modificadas químicamente con
un grupo metilacrilo.
El medio utilizado para esta etapa de hidrólisis
puede seleccionarse a partir de los disolventes mencionados
anteriormente, o a partir de disolventes inmiscibles en agua. En el
caso de un disolvente inmiscible en agua, el disolvente está
saturado con agua. Más preferiblemente, se selecciona un disolvente
miscible en agua, incluidos, por ejemplo, MeCN, THF, dioxano,
alcohol ter-amílico, acetona, o mezclas de los mismos, y una
cantidad adecuada de agua, por ejemplo, 0,5% v/v hasta 10% de agua
v/v, o 1% v/v hasta 5% v/v.
En una forma de realización, la temperatura de
dicha reacción se sitúa en el intervalo de aproximadamente 20ºC
hasta aproximadamente 50ºC, o de aproximadamente a temperatura
ambiente (por ejemplo, aproximadamente 25ºC) hasta 35ºC. En otra
realización, se utiliza MeCN que contienen aproximadamente 2% de
agua como medio de reacción, con aproximadamente 20% en peso de
lipasa NOVOZYM SP 435 a temperatura ambiente; la reacción se
completa en el plazo de pocas horas.
En una forma de realización, la etapa de
hidrólisis de dicho método de la invención se lleva a cabo con
arreglo al siguiente procedimiento. El producto crudo obtenido en
la primera etapa se disuelve en un disolvente húmedo. Se añade una
cantidad suficiente de lipasa y la mezcla se agita después a
temperatura ambiente hasta 40ºC en atmósfera de argón (Ar_{2}) o
nitrógeno (N_{2}) durante 1 hora a 24 horas, o hasta que todo el
material de partida se haya convertido en el producto de hemiéster
de fórmula (II). Este particular puede verificarse por métodos
convencionales, incluidos, por ejemplo, cromatografía en capa fina
(TLC) o cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC). La
enzima se separa de la mezcla de reacción, por ejemplo, por
filtración. El producto crudo se purifica después con un
rendimiento excelente utilizando métodos convencionales, por
ejemplo, cromatografía en gel de sílice, o recristalización.
En otra forma de realización, este procedimiento
en dos etapas puede realizarse en un solo recipiente, es decir: la
segunda etapa de hidrólisis se lleva a cabo sin el aislamiento del
intermediario obtenido en la primera etapa. En dicho procedimiento
de un solo recipiente la primera etapa enzimática se lleva a cabo
como se ha descrito anteriormente. Después de completarse la
reacción, se añaden un disolvente y agua. En una realización, el
disolvente es un disolvente miscible en agua, tal como MeCN, THF,
dioxano, alcohol ter-amílico, acetona, o una mezcla de los
mismos. En otra realización adicional, la cantidad de agua es de
0,5% v/v a 10% v/v, o de 1% v/v a 5% v/v. La mezcla se agita
después durante cierto tiempo, la enzima se elimina por filtración,
y el producto crudo se purifica a continuación por cromatografía en
gel de sílice. En una realización, se añade MeCN que contiene 5% de
agua a la mezcla de reacción, y la reacción se completa en el plazo
de una hora.
Este procedimiento enzimático de dos etapas para
la preparación del 42-hemiéster de rapamicina de
fórmula (II) se ilustra adicionalmente por medio de la síntesis del
42-hemiadipato de rapamicina empleando un
procedimiento de dos etapas (método 1) o un procedimiento de un
solo recipiente (método 2) como se muestra en el Ejemplo 2. La
síntesis del 42-hemisuberato se presenta en el
Ejemplo 3.
Los 42-hemiésteres de rapamicina
y 32-ésteres de FK-506 con ácidos dicarboxílicos
producidos según la invención son útiles como precursores para la
preparación de un inmunógeno, detector, y/o conjugado unido a
matriz. Estos inmunógenos, detectores y conjugados son útiles para
la generación y la detección de anticuerpos específicos para el
material de partida (por ejemplo, una rapamicina o un
FK-506) o para un derivado del mismo, para medir
los niveles del material de partida o de un derivado del mismo en
líquidos biológicos o de laboratorio, y para el aislamiento de
proteínas que se unen al material de partida o a un derivado del
mismo.
Como precursores para la preparación de
conjugados de rapamicina, el ácido carboxílico en los compuestos de
fórmula (II), preparado según la presente invención, se activa
utilizando técnicas estándar descritas en la literatura sobre
péptidos. Típicamente, este procedimiento implica hacer reaccionar
el compuesto de la invención con
N-hidroxisuccinimida, para formar un éster
N-succinimidílico activado. El éster activado puede
hacerse reaccionar después con el extremo nucleófilo de una
molécula portadora inmunógena, para formar un conjugado de
rapamicina. El siguiente esquema ilustra dicha técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
Sin embargo, la invención no se limita a dicho
procedimiento. Está prevista la utilización de dichos derivados de
rapamicina, y de otros, producidos utilizando los compuestos de la
invención.
Los anticuerpos específicos para la rapamicina o
para un derivado de la misma utilizando los conjugados inmunógenos
de rapamicina de la presente invención pueden generarse empleando
técnicas estándar conocidas en la técnica. En una realización, se
inocula a un animal hospedador en uno o más lugares con un 42-éster
de rapamicina regioespecífico, purificado, de la invención, ya sea
solo o en combinación con un adyuvante. Los anticuerpos generados a
partir de los conjugados inmunógenos de rapamicina de la presente
invención pueden utilizarse en numerosos inmunoanálisis para
determinar los niveles de rapamicina, en ensayos de ELISA,
radioinmunoanálisis, en inmunoanálisis de quimioluminiscencia, y en
inmunoanálisis de fluorescencia.
En otra forma de realización, los
42-derivados de rapamicina de la invención, o los
conjugados o anticuerpos generados mediante la utilización de los
mismos, pueden formularse empleando cualquier método adecuado
descrito en la técnica.
De modo similar, los métodos para generar
inmunógenos, anticuerpos y conjugados de FK-506 a
partir de los hemiésteres de KF-506 de la invención
serán fácilmente apreciados por el experto en la materia.
La presente invención también proporciona
materiales de acondicionamiento y equipos de reactivos que contienen
el 42-hemiéster de rapamicina regioespecífico
producido según la presente invención y/o el
32-hemiéster FK-506 producido según
la invención, y que están formulados para la utilización deseada,
por ejemplo, para la producción de anticuerpos. En otra
realización, los anticuerpos o conjugados de rapamicina generados
utilizando las composiciones de la invención pueden formularse
utilizando diversas sustancias adecuadas, como excipientes,
conservantes, o similares. Los envases adecuados, incluidos
frascos, viales, envases en blíster, etc., son conocidos por los
expertos en la materia. Dichos materiales de acondicionamiento y
equipos de reactivos pueden contener otros componentes, incluidos,
por ejemplo, instrucciones de utilización, jeringas, aplicadores,
concentraciones patrón de rapamicina (para la generación de una
curva patrón de concentración), envases, placas de microvaloración,
soporte sólidos, tubos de ensayo, bandejas, etc. Pueden incluirse
muchas variaciones de reactivos en el equipo de reactivos en
función del tipo de ensayo utilizado.
El objetivo de los siguientes ejemplos es
ilustrar la presente invención.
La acilación catalizada por la lipasa se lleva a
cabo fácilmente mezclando la rapamicina y el anhídrido succínico en
un disolvente con una lipasa.
\newpage
Método
1
Una mezcla de rapamicina (2,0 g, 2,2 mmol),
anhídrido succínico (1,0 g, 10 mmol) y NOVOZYM SP435 (4,5 g) en
tolueno (20 ml) se agitó a 45ºC en atmósfera de N_{2} durante 40
horas (40 h). La enzima se eliminó por filtración, y se lavó con
tolueno; el disolvente orgánico combinado se concentró a baja
presión. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel
de sílice, eluyendo con CH_{2}Cl_{2}-MeOH
(12:1), para dar lugar al compuesto del título en forma de sólido
blanco (2,02 g, rendimiento del 91%).
Método
2
Una mezcla de rapamicina (91,4 mg, 0,1 mmol),
anhídrido succínico (120 mg, 1,2 mmol) y NOVOZYM SP435 (400 mg) en
tolueno-CH_{3}CN (3 ml, 5:1 v/v) se agitó a 45ºC
en atmósfera de N_{2} durante 144 h. La enzima se eliminó por
filtración, y se lavó con tolueno, y el disolvente orgánico
combinado se concentró a baja presión. El residuo se purificó por
cromatografía en columna de gel de sílice, eluyendo con
CH_{2}Cl_{2}-MeOH (12:1), para dar lugar al
compuesto del título en forma de sólido blanco (87 mg), y la
rapamicina (10 mg) se recuperó. El rendimiento de
42-hemisuccinato es 96%, sobre la base de la
rapamicina recuperada (86% sobre la base de la cantidad inicial de
rapamicina).
EM: 1013 (M).
EM: 1013 (M).
Método
1
Una mezcla de rapamicina (457 mg, 0,5 mmol),
adipato divinílico (250 mg, 1,25 mmol), tamices moleculares de 4
\ring{A} (80 mg) y NOVOZYM SP435 (300 mg) en éter
t-butilmetílico (TBME) (4 ml) se agitó a 45ºC
durante 16 h. La enzima se elimina por filtración, y se lava con 2
x 1 ml TBME. El filtrado se añade después a heptano enfriado con
hielo (30 ml). El sólido se recoge en un embudo Buchner y el polvo
blanco se seca en vacío durante 2 h.
El polvo blanco se disuelve en 4 ml de
CH_{3}CN [que contiene 2% (v/v) de agua]. Se añade NOVOZYM SP435
(80 mg) y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante
1-2 h. La enzima se elimina por filtración, y se
lava con 2 x 1 ml de MeCN. El filtrado se concentra, y el residuo se
purifica por cromatografía rápida en gel de sílice, eluyendo con
CH_{2}Cl_{2}:MeOH (15:1), para dar lugar al compuesto del título
en forma de sólido blanco (470 mg, rendimiento del 90% en dos
etapas). EM: 1041 (M^{-}).
Método
2
Una mezcla de rapamicina (3,0 g, 3,28 mmol),
adipato divinílico (2,0 g, 10 mmol) y NOVOZYM SP435 (3,0 g) en éter
t-butilmetílico (TBME) anhidro (18 ml) se agitó a
40ºC durante 36 h. Se añadió MeCN (10 ml, que contenía en 5% de
H_{2}O). Después de 15 minutos (15 min), la enzima se elimina por
filtración, y se lava con TBME/MeCN (2:1). La concentración y la
purificación por cromatografía rápida en gel de sílice, eluyendo con
hexano-acetona (5:4) da lugar al compuesto del
título en forma de sólido blanco (3,05 g, rendimiento del 89%).
Una mezcla de rapamicina (3,0 g, 3,28 mmol),
suberato divinílico (2,26 g, 10 mmol) y NOVOZYM SP435 (3,0 g) en
éter t-butilmetílico (TBME) anhidro (18 ml) se agitó
a 40ºC durante 48 h. Se añadió MeCN (10 ml, que contenía 5% de
H_{2}O). Después de 15 min, la enzima se elimina por filtración, y
se lava con TBME/MeCN (2:1). La concentración y la purificación por
cromatografía rápida en gel de sílice, eluyendo con
hexano-acetona (5:4) da lugar al compuesto del
título en forma de espuma blanca (2,88 g, rendimiento del 82%).
A partir de la descripción anterior y de las
figuras adjuntas, los expertos en la materia apreciarán que son
posibles varias modificaciones de la invención además de las
descritas en la presente memoria.
Deberá entenderse, además, que los valores se
presentan a título ilustrativo.
Claims (27)
1. Procedimiento para la síntesis
regioespecífica de un 42-hemiéster de rapamicina o
un 32-hemiéster de FK-506 con un
ácido dicarboxílico, comprendiendo dicho procedimiento la etapa que
consiste en hacer reaccionar una rapamicina o un
FK-506 con un anhídrido dicarboxílico en presencia
de una lipasa.
2. Procedimiento según la reivindicación 1 para
la síntesis regioespecífica de un 42-hemiéster de
rapamicina con ácidos dicarboxílicos, comprendiendo dicho
procedimiento la etapa que consiste en hacer reaccionar la
rapamicina con un anhídrido dicarboxílico en presencia de una
lipasa.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 para
la síntesis regioespecífica de un 32-hemiéster de
FK-506 con un ácido dicarboxílico, comprendiendo
dicho procedimiento la etapa que consiste en reaccionar un
FK-506 con un anhídrido dicarboxílico en presencia
de una lipasa.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el anhídrido dicarboxílico
presenta la estructura
en la que L es un grupo conector
con una cadena lineal o una cadena ramificada que presenta 1 a 6
átomos de
carbono.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el anhídrido dicarboxílico se
selecciona de entre el grupo constituido por anhídrido succínico,
anhídrido glutárico, anhídrido 3-metilglutárico, y
mezclas de los mismos.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que la lipasa procedente es una lipasa
de un microorganismo seleccionado de entre el grupo constituido por
Candida antarctica, Candida rugosa, Mucor miehei, Pseudomonas
cepacia, Pseudomonas fluorescens, Rhizopus delemar, y
Aspergillus niger.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en
el que la lipasa utilizada es una lipasa inmovilizada de Candida
antarctica.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que la reacción se lleva cabo en un
disolvente seleccionado de entre el grupo constituido por tolueno,
éter ter-butil-metílico (TBME),
tetrahidrofurano (THF), acetonitrilo (MeCN),
1,4-dioxano, CH_{2}Cl_{2}, CHCl_{3}, éter
etílico, hexano, y mezclas de los mismos.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que la reacción se lleva cabo en el
intervalo de 20ºC a 75ºC.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que la reacción se lleva cabo en el intervalo de 35ºC a
60ºC.
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que la lipasa es la lipasa NOVOZYM
SP435, el disolvente es una mezcla de
tolueno-acetonitrilo en una relación de 5:1 v/v, y
la reacción se lleva cabo a una temperatura de aproximadamente
45ºC.
12. Procedimiento para la síntesis
regioespecífica de un 42-hemiéster de rapamicina o
un 32-hemiéster de FK-506 con
ácidos dicarboxílicos, comprendiendo dicho procedimiento las etapas
que consisten en:
- (a)
- hacer reaccionar una rapamicina o un FK-506 con un éster activado bifuncional de ácido dicarboxílico en presencia de una lipasa, para formar un éster intermediario, y
- (b)
- hidrolizar el éster intermediario con una lipasa.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Procedimiento para la síntesis
regioespecífica de un 42-hemiéster de rapamicina con
ácidos dicarboxílicos, comprendiendo dicho procedimiento las etapas
que consisten en:
- (a)
- hacer reaccionar una rapamicina con un éster activado bifuncional de ácido dicarboxílico en presencia de una lipasa, para formar un éster intermediario, y
- (b)
- hidrolizar el éster intermediario con una lipasa.
\newpage
14. Procedimiento para la síntesis
regioespecífica de un 32-hemiéster de
FK-506 con ácidos dicarboxílicos, comprendiendo
dicho procedimiento las etapas que consisten en:
- (a)
- hacer reaccionar un FK-506 con un éster activado bifuncional del ácido dicarboxílico en presencia de una lipasa, para formar un éster intermediario, y
- (b)
- hidrolizar el éster intermediario con una lipasa.
\vskip1.000000\baselineskip
15. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 14, en el que el éster bifuncional del ácido
dicarboxílico presenta la estructura
en la que R es vinilo, isopropenilo
o N-succinimidilo, y L es un grupo conector con una cadena
lineal o una cadena ramificada que presenta 1 a 6 átomos de
carbono.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en
el que L comprende además uno o más átomos de oxígeno.
17. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 16, en el que la lipasa utilizada en la etapa
(a) se selecciona de entre una lipasa procedente de un
microorganismo seleccionado de entre el grupo constituido por
Candida antarctica, Candida rugosa, Mucor miehei, Pseudomonas
cepacia, Pseudomonas fluorescens, Rhizopus delemar, y
Aspergillus niger.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, en
el que la lipasa utilizada en la etapa (a) es NOVOZYM SP435 de
Candida antarctica o Lipasa PS-C "Amano"
II de Pseudomonas cepacia.
19. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 18, en el que la reacción de la etapa (a) se
lleva cabo en un disolvente seleccionado de entre el grupo
constituido por tolueno, éter
ter-butil-metílico (TBME), tetrahidrofurano
(THF), MeCN, 1,4-dioxano, CH_{2}Cl_{2},
CHCl_{3}, éter etílico, hexano, y una mezcla de los mismos.
20. Procedimiento según la reivindicación 19,
que comprende además añadir un tamiz molecular a la reacción.
21. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 20, en el que la reacción de la etapa (a) se
lleva cabo en el intervalo de 20ºC a 75ºC.
22. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 16, en el que la lipasa utilizada en la etapa
(a) se selecciona de entre NOVOZYM SP435 o lipasa
PS-C "Amano" II, el disolvente es TBME, y la
reacción se lleva cabo a una temperatura de aproximadamente
45ºC.
23. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 22, en el que la lipasa utilizada en la etapa
(b) es una lipasa procedente de un microorganismo seleccionado de
entre el grupo constituido por Candida antarctica, Candida
rugosa, Mucor miehei, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas fluorescens,
Rhizopus delemar, y Aspergillus niger.
24. Procedimiento según la reivindicación 23, en
el que la lipasa utilizada en la etapa (b) procede de Candida
antarctica o de Pseudomonas cepacia.
25. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 24, en el que la hidrólisis de la etapa (b)
se realiza en un disolvente seleccionado de entre el grupo
constituido por tolueno, éter
ter-butil-metílico (TBME), tetrahidrofurano
(THF), MeCN, 1,4-dioxano, alcohol
ter-amílico, CH_{2}Cl_{2}, CHCl_{3}, éter etílico,
hexano, y mezclas de los mismos, conteniendo dicho disolvente o
mezcla de disolventes aproximadamente 0,5 a 10% de agua.
26. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 25, en el que la hidrólisis de la etapa (b)
se lleva cabo en el intervalo de la temperatura ambiente hasta
50ºC.
27. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 22, en el que la lipasa utilizada en la etapa
(b) es NOVOZYM SP435 o lipasa PS-C "Amano" II,
el disolvente es acetonitrilo (MeCN) que contiene 2% de agua, y la
reacción se lleva cabo a temperatura ambiente.
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