KR100342624B1 - 효소가수분해에의한c-10및c-13히드록실-함유탁산의제조방법,효소에스테르화에의한c-10아실옥시-함유탁산의제조방법,및c-13아실옥시-함유탁산제조에있어서의그들의용도 - Google Patents

효소가수분해에의한c-10및c-13히드록실-함유탁산의제조방법,효소에스테르화에의한c-10아실옥시-함유탁산의제조방법,및c-13아실옥시-함유탁산제조에있어서의그들의용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 C-10 아실옥시-함유 탁산 1종 이상을 상기 아실옥시기를 히드록실기로 가수 분해할 수 있는 효소 또는 미생물과 접촉시키는 효소 가수 분해 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 C-10 히드록실-함유 탁산 1종 이상을 아실화제 및 상기 히드록실기를 에스테르화시켜 아실옥시기를 형성할 수 있는 효소 또는 미생 물과 접촉시키는 효소 에스테르화 방법을 제공한다. 또한 C-13 아실옥시-함유 탁 산 1종 이상을 상기 아실옥시기를 히드록실기로 가수 분해할 수 있는 효소 또는 미생물과 접촉시키는 효소 가수 분해 방법을 제공한다. 본 발명의 방법들은 탁솔과 같은 탁산들의 제조에 있어서 중간체로서 사용될 수 있는 화합물들의 제조에 특히 유용하다.

Description

효소 가수 분해에 의한 C-10 및 C-13 히드록실-함유 탁산의 제조 방법, 효소 에스테르화에 의한 C-10 아실옥시-함유 탁산의 제조 방법, 및 C-13 아실옥시-함유 탁산 제조에 있어서의 그들의 용도
본 발명은 예를 들어, 탁솔 및 탁솔 유사체와 같은 약리학적 활성 탁산 제조 의 중간체로서 사용될 수 있는 화합물들인 C-10 히드록실-함유 탁산의 효소 가수 분해에 의한 제조 방법, 및 C-10 아실옥시-함유 탁산의 효소 에스테르화에 의한 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 특히 탁솔 및 탁솔 유사체의 제조에 유용할 뿐 아니라, C-13 아실옥시-함유 탁산 제조의 중간체로서 유용한 C-13 히드록실-함유 탁산의 효소 가수 분해에 의한 제조 방법에 관한 것이다.
탁산은 제약 분야에서 유용성이 밝혀진 디테르펜 화합물이다. 예를 들면, 하기 구조식을 갖는 탁산인, 탁솔은 효과적인 항암제인 것으로 밝혀졌다.
(여기서, Ph는 페닐이고, Ac는 아세틸이며, Bz는 벤조일임)
탁솔과 같은 천연 탁산은 식물에서 발견할 수 있으며, 식물로부터 단리시켜왔다. 그러나, 이러한 탁산은 식물중에 비교적 소량으로 존재하기 때문에, 예를 들어, 탁솔의 경우에는 이 화합물의 원료를 형성시키는 느린 성장성의 묘목이 다수 필요할 수 있다. 따라서, 당업계에서는 탁솔과 같은 천연 탁산을 제조하기 위한 반합성 경로를 포함한 합성법 뿐만 아니라 그의 유사체의 제법을 계속하여 연구해왔다.
탁산 고리 구조의 복잡성 때문에, 고리계에 목적 치환체를 함유하는 탁산은이미 기본 탁산 고리 구조를 갖는 출발 물질을 사용함으로써 보다 더 쉽게 제조될 수 있다. 즉, 예를 들면, 탁산 고리 구조를 갖고, C-13에 히드록실기를 갖는 화합물 및 특히 C-10에 목적 치환체를 갖는 화합물을 중간체 화합물과 커플링시켜 탁솔 및 그의 유사체에 의해 예시된 바와 같이 C-13에 아실옥시 측쇄를 갖는 약리학적 활성이 있는 탁산과 같은 C-13에 목적 측쇄를 갖는 탁산을 형성할 수 있다.
본 발명은 C-10에 목적 치환체를 갖는 탁산을 생성하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 탁솔과 같은 탁산 및 그의 유사체의 제조에 있어서 출발 물질로서유용한 화합물들인 C-10 히드록실-함유, 및 C-10 아실옥시-함유 탁산 화합물의 제조 방법을 제공한다.
한 실시태양에서, 본 발명은 C-10에 직접 결합된 아실옥시기를 함유하는 1종이상의 탁산을 상기 아실옥시기를 히드록실기로 가수 분해하는 과정을 촉매화할 수 있는 효소 또는 미생물과 접촉시키는 단계 및, 상기 가수 분해 과정을 수행하는 단계를 포함하는, C-10에 직접 결합된 히드록실기를 함유하는 1종 이상의 탁산의 제조 방법을 제공한다.
다른 실시 태양에서, 본 발명은 C-10에 직접 결합된 히드록실기를 함유하는 1종 이상의 탁산을 아실화제 및 상기 히드록실기를 아실옥시기로 에스테르화시키는 과정을 촉매화할 수 있는 효소 또는 미생물과 접촉시키는 단계, 및 상기 에스테르화를 수행하는 단계를 포함하는, C-10에 직접 결합된 아실옥시기를 함유하는 1종 이상의 탁산의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 C-13에 목적 측쇄를 갖는 탁산의 제조에 있어서 출발 물질로서 유용한 화합물들인 C-13 히드록실-함유 탁산 화합물들의 제조 방법을 제공한 다.
특히, 본 발명은 C-13에 직접 결합된 아실옥시기를 함유하는 1종 이상의 탁 산을 상기 아실옥시기를 히드록실기로 가수 분해하는 과정을 촉매화할 수 있는 효 소 또는 미생물과 접촉시키는 단계, 및 상기 가수 분해를 수행하는 단계를 포함하 는, C-13에 직접 결합된 히드록실기를 함유하는 1종 이상의 탁산의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 C-10 아실옥시-함유 탁산으로부터 C-10 히드록실-함유 탁산을 제조하는 유용한 방법, 및 C-10 히드록실-함유 탁산으로부터 C-10 아실옥시-함유 탁 산을 제조하는 유용한 방법들을 제공한다. 본 발명에 따라서, 단독 탁산이 가수 분해될 수 있거나, 또는 서로 다른 탁산들의 혼합물이 차레로 또는 동시에 가수분해 될 수 있다; 마찬가지로, 본 발명에 따라서, 단독 탁산이 에스테르화될 수 있거나, 또는 서로 다른 탁산들의 혼합물이 차례로 또는 동시에 에스테르화될 수 있다.
본 발명은 또한 C-13 아실옥시-함유 탁산으로부터 C-13 히드록실-함유 탁산을 제조하기 위한 유용한 방법을 제공한다. 본 발명에 따라서, 단독 탁산이 가수 분해될 수 있거나, 또는 서로 다른 탁산들의 혼합물이 차례로 또는 동시에 가수 분해될 수 있다.
본 발명을 이하에서 보다 상세히 설명한다.
C-10 가수분해
바람직한 실시태양에서, 본 발명은 1종 이상의 하기 식(Ⅱ)의 C-10 아실옥시-함유 탁산 또는 그의 염을 하기 식(Ⅱ)의 R7아실옥시기를 히드록실기로 가수 분해하는 과정을 촉매화할 수 있는 효소 또는 미생물과 접촉시키는 단계, 및 상기 가수 분해를 수행하는 단계를 포함하는, 1종 이상의 하기 식(I)의 C-10 히드록실-함유 탁산 또는 그의 염의 제조 방법을 제공한다.
상기 식에서,
R1은 히드록실 또는 아실옥시이고, 특히 여기서, R1은 이후에 기재되는 식(Ⅲ)의 구조를 가지며;
R2는 수소, 히드록실, 플루오로, R5-0-, 크실로실, R6-C(0)-0- 또는 R6-0-C(0)-0이며;
R3및 R4는 각각 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아릴 또는 헤테로시클로이고;
R5는 히드록실 보호기이며;
R6는 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아릴 또는 헤테로 시클로이며;
R7은 아실옥시이다.
단독(즉, 실질적으로 다른 입체 이성질체가 없음), 또는 다른 입체 이성질형태와 혼합된, 일반식 (I) 및 (Ⅱ)의 화합물들의 명시되지 않은 키랄 중심의 모든 입체 배위들이 본 발명의 가수 분해 방법에서 고려된다.
다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 목적하지 않는 아실옥시 C-10기를 갖는 1종 이상의 제2 탁산으로부터 목적 C-10 아실옥시기를 갖는 1종 이상의 제1탁산을 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 명세서에 기재된 방법으로 제2 탁산을 효소 가수 분해하여 1종 이상의 C-10 히드록실-함유 유사체를 제공하고, 이어서 거기에 목적 아실기를 커플링시켜 제1 탁산을 제공하는 것이다. 이 실시태양에서, 본 발명은, 예를 들어, 서로 다른 C-10 아실옥시기들을 함유하는 탁산들의 출발 혼합물(이 출발 혼합물은 목적 탁산을 포함할 수 있거나, 또는 포함하지 않을 수 있음)로부터 서로 다른 C-10 기들을 동시에 또는 차례로 가수 분해하여 C-10에 히드록실기를 갖는 1종 이상의 탁산을 제공하고, 이어서 상기 탁산에 목적 아실기를 커플링시킴으로써 특정 C-10 아실옥시기를 갖는 목적 탁산을 제조하는 방법을 제공한다. 이 바람직한 방법은 식물 재료를 추출하여 다른 천연 탁산과 혼합된 탁솔을 얻는 것과 같이, 다른 C-10 아실옥시기들을 갖는 탁산들의 혼합물을 얻는 경우, 및 궁극적으로, 탁솔과 같은 특정 탁산을 얻는 경우에 특히 유용하다. 아실기의 커플링은 아실기들을 형성하기 위한 비효소적 방법들로 수행될 수 있다. 예를 들면, C-7 보호된 10-데아세틸박카틴 Ⅲ(예컨대, 10-데아세틸박카틴 Ⅲ을 디메틸포름아미드 중 트리에틸실릴클로라이드 및 이미다졸과 접촉시켜 형성된 트리에틸실릴에 의해 C-7에서 보호된 것)은 -60 내지 70℃와 같은 저온에서 염화 리튬/염화아세틸의 존재하의 테트라히드로푸란 중에서 리튬 헥사메틸디실라자이드와 접촉시킴으로써 C-10에서 아실화될 수 있다. 별법으로는, 아실기의 커플링은 본 명세서에 기재된 효소 에스테르화 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 출발 탁산의 C-10 아실옥시기의 입체배위는 C-10 히드 록실기-함유 생성물에 바람직하게 유지된다.
C-10 에스테르화
다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 1종 이상의 하기 식(I)의 C-10 히드록실-함유 탁산 또는 그의 염을 아실화제 및 C-10 히드록실기를 에스테르화시켜 하기 식(Ⅱ)의 R7아실옥시기를 형성하는 과정을 촉매화할 수 있는 효소 또는 미생물과 접촉시키는 단계, 및 상기 에스테르화를 수행하는 단계를 포함하는, 1종 이상의하기 식(Ⅱ)의 C-10 아실옥시-함유 탁산 또는 그의 염의 제조 방법을 제공한다.
상기 식에서,
R1은 히드록실 또는 아실옥시이고, 특히 R1은 이후에 기재되는 식(Ⅲ)의 구조를 가지고;
R2는 수소, 히드록실, 플루오로, R5-0-, 크실로실, R6-C(0)-0- 또는 R6-0-C(0)-0-이며;
R3및 R4는 각각 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아릴 또는 헤테로시클로이고;
R5는 히드록실 보호기이고;
R6는 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아릴 또는 헤테로 시클로이며;
R7은 아실옥시이다.
단독(즉, 실질적으로 다른 입체 이성질체가 없음), 또는 다른 입체 이성질체 형태와 혼합된, 일반식(I) 및 (Ⅱ)의 화합물들의 명시되지 않은 키랄 중심의 모든 입체 배위들이 본 발명의 에스테르화 방법에서 고려된다.
본 발명의 에스테르화를 수행할 수 있는 모든 아실화제가 사용될 수 있다.
바람직한 아실화제는 하기 식(IV)의 화합물들이다.
R11-C(0)-L (IV)
여기서,
R11은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 헤테로시클로이고;
L은 치환되어 에스테르기를 형성할 수 있는 이탈기이다.
식 (IV)의 바람직한 R11기는 C1-6알킬기, 특히 메틸기와 같은 알킬기들이다. L기의 예로는 할로겐 원자, 히드록실, 알콕시, 또는 알케닐옥시기들을 들 수 있다. 바람직한 L기로는 알케닐옥시기, 가장 바람직하게는 CH2=CH-0- 및 CH2=C(CH3)-0-와 같은 C1-6알케닐옥시기들이다. 이소프로페닐 아세테이트 및 비닐 아세테이트는 특히바람직한 아실화제들이다.
본 발명의 방법에 있어서, 출발 탁산의 C-10 히드록실기의 입체 배위는 C-10아실옥시기-함유 생성물에 바람직하게 유지된다.
C-13 가수분해
바람직한 실시태양에서, 본 발명은 1종 이상의 하기 식 (VI)의 C-13 아실옥 시-함유 탁산 또는 그의 염을 하기 식 (VI)의 R7아실옥시기를 히드록실기로 가수 분해하는 과정을 촉매화할 수 있는 효소 또는 미생물과 접촉시키는 단계, 및 상기 가수 분해를 수행하는 단계를 포함하는, 1종 이상의 하기 식 (V)의 C-13 히드록실 -함유 탁산 또는 그의 염의 제조 방법을 제공한다.
여기서,
R12는 수소, 히드록실 R5-0-, R6-C(0)-0-, 또는 R6-0-C(0)-0-이고;
R2는 수소, 히드록실, 플루오로, R5-0-, 크실로실, R6-C(0)-0- 또는 R6-0-C(0)-0이며;
R3및 R4는 각각 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아릴, 또는 헤테로시클로이고;
R5는 히드록실 보호기이며;
R6는 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아릴, 또는 헤테로 시클로이고;
R7은 아실옥시이다.
단독(즉, 실질적으로 다른 입체 이성질체는 없음), 또는 다른 이성질체 형태와 혼합된 일반식 (V) 및 (VI)의 화합물들의 명시되지 않은 키랄 중심의 모든 입 체 배위들이 본 발명의 방법에서 고려된다.
다른 바람직한 실시 태양에 있어서, 본 발명은 목적하지 않는 아실옥시 C-13측쇄를 갖는 1종 이상의 제2 탁산으로부터, 목적 C-13 아실옥시 측쇄를 갖는 1종 이상의 제1 탁산을 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 명세서에 기재된 방법 으로 제2 탁산을 효소 가수 분해하여 1종 이상의 C-13 히드록실-함유 유사체를 제 공하고, 이어서 거기에 목적 측쇄를 커플링시켜 제1 탁산을 제공하는 것이다. 이실시 태양에서, 본 발명은, 예를 들어, 다른 아실옥시 C-13 측쇄를 함유하는 탁산 들의 출발 혼합물(이 출발 혼합물은 목적 탁산을 포함할 수 있거나, 또는 포함하 지 않을 수 있음)로부터 다른 C-13기들을 동시에 또는 차례로 가수 분해하여 C-13에 히드록실기를 갖는 1종 이상의 탁산을 제공하고, 이어서 상기 탁산에 목적 측 쇄를 커플링시킴으로써, 특정 C-13 아실옥시 측쇄를 갖는 목적 탁산의 제조 방법 을 제공한다. 이 바람직한 방법은 식물 재료를 추출하여 세파로만닌 및 다른 천연 탁산과 혼합된 탁솔을 얻는 것과 같이, 다른 C-13 아실옥시 측쇄를 갖는 탁산들의 혼합물을 생성하는 경우, 및 궁극적으로 탁솔과 같은 특정 탁산을 생성하는 경우에 특히 유용하다.
본 발명의 방법에서는, 출발 탁산의 C-13 아실옥시기의 입체 배위는 C-13 히드록실기-함유 생성물에서 바람직하게 유지된다.
정의
본 명세서에서 사용된 "효소적 공정" 또는 "효소적 방법"이라는 용어는 효소또는 미생물을 사용하는 본 발명의 공정 또는 방법을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 "가수 분해"라는 용어는 아실옥시기로부터 히드록실기를 형성하는 것을 의미하고, 이는 예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 물 및(또는) 적당한 유기 알코올과 접촉시킴으로써 수행할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "에스테르화"라는 용어는 히드록실기로부터 아실옥시기를 형성하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 "아실화제"이라는 용어는 아실기를 제공하여 상기한 에스테르화를 수행할 수 있는 화합물을 의미한다. 본 방법들에서 "효소 또는 미생물"의 사용은 효소 또는 미생물, 단독으로 뿐만 아니라, 2종 이상 사용하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 단독 또는 다른 기의 일부로서 사용된 "알킬" 또는 "알크" 라는 용어는 임의로 치환된, 직쇄 및 분지쇄 포화 탄화 수소기들을 의미하고, 바람직하게는 노르말 사슬 중의 탄소 원자수가 1 내지 12인 기를 의미한다. 미치환된 이러한 기의 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, 펜틸, 헥실, 이소헥실, 헵틸, 4,4-디메틸펜틸, 옥틸, 2,2,4-트리메틸펜틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실 등을 들 수 있다. 치환체의 예로는 할로, 알콕시, 알킬티오, 알케닐, 알키닐, 아릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 히드록시 또는 보호된 히드록시, 카르복실 (-COOH), 알킬옥시카르보닐, 알킬카르보닐옥시, 카르바모일 (NH2-CO-), 아미노 (-NH2), 모노 또는 디알킬아미노, 또는 티올 (-SH)중의 1종 이상의 기를 들 수 있다.
본 명세서에서 단독 또는 다른기의 일부로서 사용된 "저급 알크" 또는 "저급알킬"이라는 용어는 노르말 사슬 중의 탄소 원자수가 1 내지 4인, 알킬에 대해 상 술한 바와 같이 임의로 치환된 기를 의미한다.
본 명세서에서 단독 또는 다른기의 일부로서 사용된 "알콕시" 또는 "알킬티 오"라는 용어는 각각 산소 결합 (-O-) 또는 황 결합 (-S-)을 통해 결합된 상술한 바와 같은 알킬기를 의미한다. 본 명세서에서 단독 또는 다른기의 일부로서 사용 된 "알킬옥시카르보닐"이라는 용어는 카르보닐기를 통해 결합된 알콕시기를 의미 한다. 본 명세서에서 단독 또는 다른기의 일부로서 사용된 "알킬카르보닐옥시"라는 용어는 카르보닐기를 통해 결합되고, 이 카르보닐기가 다시 산소 결합을 통해 결합된 알킬기를 의미한다. 본 명세서에서 단독 또는 다른기의 일부로서 사용된 "모노알킬아미노" 또는 "디알킬아미노"라는 용어는 각각 상술한 바의 1 또는 2개의 알킬기로 치환된 아미노기를 의미한다.
본 명세서에서 단독 또는 다른기의 일부로서 사용된 "알케닐"이라는 용어는 1개 이상의 탄소 대 탄소 이중 결합을 함유하는, 알킬에 대해 상술한 바와 같이 임의로 치환된 기를 의미한다. 치환체의 예로는 상기 알킬기 중 1 이상 및(또는) 알킬 치환체로서 상술한 바의 기 중 1 이상을 들 수 있다. 본 명세서에서 단독 또는 다른 기의 일부로서 사용된 "알케닐옥시"라는 용어는 산소 결합(-O-)을 통해 결합된 상술한 바와 같은 알케닐기를 의미한다.
본 명세서에서 단독 또는 다른기의 일부로서 사용된 "알키닐"이라는 용어는 1개 이상의 탄소 대 탄소 삼중 결합을 함유하는, 알킬에 대해 상술한 바와 같이 임의로 치환된 기를 의미한다. 치환체의 예로는 상술한 바의 1 이상의 알킬기 및 (또는) 알킬 치환체로서 상술한 바의 1 이상의 기를 들 수 있다. 본 명세서에서 단독 또는 다른기의 일부로서 사용된 "알키닐옥시"라는 용어는 산소 결합(-O-)을 통해 결합된 상술한 바와 같은 알키닐기를 의미한다.
본 명세서에서 단독 또는 다른기의 일부로서 사용된 "시클로알킬"이라는 용어는 임의로 치환된 포화 카르보시클릭 고리계를 의미하는 것으로서, 바람직하기 로는 1 내지 3개의 고리를 함유하고, 1개의 고리당 3 내지 7개의 탄소 원자를 함 유하는 것이다. 미치환된 이러한 기의 예로는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸, 시클로데실, 시클로도데실 및 아다만 틸을 들 수 있다. 치환체의 예로는 상술한 바와 같은 1 이상의 알킬기, 및(또는) 알킬 치환체로서 상술한 바의 1 이상의 기를 들 수 있다. 본 명세서에서 단독 또는 다른기의 일부로서 사용된 "시클로알킬옥시"라는 용어는 산소 결합(-O-)을 통해 결합된 상술한 바와 같은 시클로알킬기를 의미한다.
본 명세서에서 단독 또는 다른기의 일부로서 사용된 "시클로알케닐"이라는 용어는 부분적으로 불포화된 고리를 형성하는 1개 이상의 탄소 대 탄소 이중결합 을 함유하는, 시클로알킬에 대해 상술한 바와 같이 임의로 치환된 기를 의미한다. 치환체의 예로는 상술한 바와 같은 1 이상의 알킬기 및(또는) 알킬 치환체로서 상술한 바의 1 이상의 기를 들 수 있다. 본 명세서에서 단독 또는 다른기의 일부로서 사용된 "시클로알케닐옥시"라는 용어는 산소 결합(-O-)을 통해 결합된 상술한 바와 같은 시클로알케닐기를 의미한다.
본 명세서에서 단독 또는 다른기의 일부로서 사용된 "아르" 또는 "아릴"이라는 용어는 임의로 치환된 카르보시클릭 방향족기를 의미하는 것으로서, 바람직하 기로는 1 또는 2개의 고리를 함유하고, 고리 탄소 원자수가 6 내지 12인기를 의미 한다. 미치환된 이러한 기의 예로는 페닐, 비페닐, 및 나프틸을 들 수 있다. 치환체의 예로는 니트로기, 상기 알킬기, 및(또는) 알킬 치환체에 대해 상술한 바의 기중 1 이상, 바람직하게는 3 이하를 들 수 있다. 본 명세서에서 단독 또는 다른기의 일부로서 사용된 "아릴옥시"라는 용어는 산소 결합(-O-)을 통해 결합된 상술한 바와 같은 아릴기를 의미한다.
본 명세서에서 단독 또는 다른기의 일부로서 사용된 "헤테로시클로" 또는 "헤테로시클릭"이라는 용어는 1개 이상의 고리에 1개 이상의 헤테로원자를 함유하 는 임의로 치환된 완전 포화 또는 불포화된 방향족 또는 비방향족 시클릭기로서, 바람직하게는 각각의 고리에 5 또는 6개 원자를 함유하는 모노 시클릭 또는 비시클릭기를 함유한다. 예를 들어, 헤테로시클로기는 1개의 고리당 1 또는 2개의 산소 원자, 1 또는 2개의 황원자, 및(또는) 1 내지 4개의 질소 원자를 함유할 수 있다. 각 헤테로시클로기는 고리계의 임의의 탄소 또는 헤테로원자를 통해 결합될 수 있다. 헤테로시클로기의 예로는 티에닐, 푸릴, 피롤릴, 피리딜, 이미다졸릴, 피롤리디닐, 피페리디닐, 아제피닐, 인돌릴, 이소인돌릴, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 벤조티아졸릴, 벤족사졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤족사디아졸릴, 및 벤조푸라자 닐을 들 수 있다. 치환체의 예로는 상술한 바의 1 이상의 알킬기 및(또는) 알킬 치환체로서 상술한 바의 1 이상의 기를 들 수 있다. 본 명세서에서 단독 또는 다른기의 일부로 사용된 "헤테로시클로옥시"라는 용어는 산소 결합(-O-)을 통해 결합된 상술한 바의 헤테로시클로기를 의미한다.
본 명세서에서 단독 또는 다른기의 일부로서 사용된 "할로겐" 또는 "할로"라는 용어는 염소, 브롬, 불소 및 요오드를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "탁산"이라는 용어는 하기에 기재된 바와 같은 탁산 잔기를 함유하는 화합물들을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 "탁산 잔기"라는 용어는 하기와 같은 핵심 구조(본 명세서에서 나타낸 고리계의 위치 번호를 가지는 구조)를 함유하는 잔기를 의미하는데, 이 핵심 구조는 치환될 수 있으며, 그의 고리계 중에 에틸렌성 불포화 부분을 함유할 수 있다. 탁솔에서와 같이 4- 및 5-위치에 융합된 옥세탄 고리를 갖는 잔기가 바람직하다.
본 명세서에서 사용된 "히드록시(또는 히드록실) 보호기"라는 용어는 반응에사용된 후, 분자의 나머지 부분을 파괴시키지 않고 제거될 수 있는, 유리 히드록 실기를 보호할 수 있는 임의의 기를 의미한다. 이들 기, 및 그들의 합성은 문헌 (T.W. Greene의 "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, 1981, 또는 Fieser & Fieser)에 기재되어 있다.
본 명세서에서 사용된 "염"이라는 용어는 무기 및(또는) 유기 산 및 염기로 형성된 산 및(또는) 염기의 염을 포함한다.
본 명세서에서 단독 또는 다른기의 일부로서 사용된 "아실"이라는 용어는 유기 키르복실산의 -COOH 기로부터 히드록실기를 제거하여 형성된 잔기를 의미한다. 본 명세서에서 단독 또는 다른기의 일부로서 사용된 "아실옥시"라는 용어는 산소 결합(-O-)을 통해 결합된 상술한 바와 같은 아실기를 의미한다.
C-10 개질을 위한 출발 물질
본 발명의 출발물질로서 사용된 C-10 아실옥시-함유, 및 C-10 히드록실-함유 탁산들은 각각 본 발명의 효소 가수 분해 및 에스테르화 방법을 수행할 수 있는 임의의 화합물일 수 있다. 출발 물질은 합성 탁산이거나, 또는 바람직하게는, 단독또는 서로 혼합된, 세팔로만닌, 7-크실로실탁솔, 탁솔, 박카틴 Ⅲ, 10-데아세틸박카틴 Ⅲ, 또는 탁솔 C(C-13 탁솔 측쇄의 벤조일기가 n-펜타노일기로 치환되는 탁솔 유사체)와 같은 천연 탁산일 수 있다. "천연" 탁산 출발 물질은 바람직하게는 탁산-생성 식물 조직을, 특히 유럽주목(Taxus baccata), 가라목(Taxus cuspidata), 택수스 브레비폴리아(Taxus brevifolia), 택수스 왈리키아나(Taxus wallichiana), 택수스 메디아(Taxus media), 택수스 히크시(Taxus hicksii, 특히 택수스 엑스. 메디아 히크시(Taxus x. media hicksii)와 같은 주목(Taxus)과의 식물로부터의 조직, 또는 그로부터 유래한 조직을 식물 세포 배양, 및(또는) 추출시킴으로써 얻는다. 식물 조직의 예로는 침엽, 나무 껍질, 및 전체 묘목을 들 수 있다.
본 방법의 C-10 히드록시- 및 아실옥시-함유 탁산 출발 물질을 생성하는 바 람직한 방법에 대해서는 문헌(Rao, Pharmaceutical Research, 10, 521-524(1993); Kingston, Pharmac. Ther., 52, 1-34 (1991)) 또는 본 명세서의 실시예를 참조한다.
C-13 개질을 위한 출발물질
본 발명의 출발 물질로서 사용되는 C-13 아실옥시-함유 탁산은 본 발명의 효소 가수 분해를 수행할 수 있는 임의의 화합물일 수 있다. 출발 물질은 합성 탁산이거나, 또는 바람직하게는, 단독 또는 서로 혼합된, 세팔로만닌, 7-크실로실탁 솔, 탁솔, 7-크실로실-10-데아세틸탁솔, 10-데아세틸탁솔, 또는 탁솔 C와 같은 천 연 탁산일 수 있다. "천연" 탁산 출발 물질은 바람직하게는 탁산-생성 식물 조직 을, 특히 유럽주목, 가라목, 택수스 브레비폴리아, 택수스 왈리키아나, 택수스 메디아, 택수스 히크시, 특히 택수스 엑스. 메디아 히크시와 같은 택수스 속의 식물 로부터의 조직, 또는 그로부터 유래한 조직을 식물 세포 배양, 및(또는) 추출시킴 으로써 얻는다. 식물 조직의 예로는 침엽, 나무 껍질, 및 전체 묘목을 들 수 있 다.
본 방법의 C-13 아실옥시-함유 탁산 출발 물질을 생성하는 바람직한 방법에 대해서는 문헌(Rao, Pharmaceutical Research, 10, 521-524 (1993) ; Kingston, Pharmac. Ther., 52, 1-34 (1991)) 또는 본 발명의 실시예를 참조한다.
C-10 개질을 위한 효소 및 미생물
본 발명에 사용되는 효소 또는 미생물은 본 명세서에 기재된 효소 가수 분해 또는 에스테르화 방법을 촉매화할 수 있는 임의의 효소 또는 미생물일 수 있다. 출처나 순도에 관계없이, 효소 또는 미생물은 유리상태로 또는 물리적 흡착 또는 포획에 의한 것과 같이 지지체에 고정화된 상태로 사용될 수 있다.
미생물의 예로는 노카르디오이데스(Nocardioides), 노카르디아(Nocardia), 로도코쿠스(Rhodococcus), 마이크로폴리스포라(Micropolyspora), 사카로폴리스포 라(Saccharopolyspora), 슈도노카르디아(Pseudonocardia), 에르스코비아 (Oerskovia), 프로마이크로모노스포라(Promicromonospora) 및 인트라스포랭귐 (Intrasporangium)등의 속에 속하는 것들을 들 수 있다. 특히 바람직한 미생물은 노카르디오이데스 앨부스(Nocardioides albus), 노카르디오이데스 플래부스 (Nocardioides flavus), 노카르디오이데스 풀부스(Nocardioides fulvus), 노카르디오이데스 루테우스(Nocardioides luteus), 노카르디오이데스 심플렉스(Nocardioides simplex), 및 노카르디오이데스 더몰릴랙시누스(Nocardioides thermolilacinus), 특히 노카르디오이데스 앨부스(Nocardioides albus) ATCC 55424 (SC 13910) 및 ATCC 55425 (SC 13911) 및 노카르디오이데스 루테우스 (Nocardioides luteus) ATCC 55426 (SC 13912)와 같은 노카르디오이데스 속에 속 하는 종들이다. 본 명세서에서 사용된 "ATCC"라는 용어는 어메리칸 타입 컬쳐 콜 렉션(American Type Culture Collection; 미합중국 20852 메릴랜드주 로크빌 파크 로운 드라이브 12301 소재)에 상기 미생물의 기탁 번호를 의미한다. 상기 미생물 ATCC 55424, 55425 및 55426은 1993년 5월 12일에 기탁되었다. "SC"라는 용어는 스퀴브 컬쳐 콜렉션(Squibb culture collection)의 약자로서 미생물에 부여된 이름을 의미한다.
생물학적으로 순수한 미생물인 노카르디오이데스 앨부스 ATCC 55424 (SC 13910), 노카르디오이데스 앨부스 ATCC 55425 (SC 13911), 및 노카르디오이데스 루테우스 ATCC 55426 (SC 13912)는 신규한 미생물이다. 본 명세서에 기재된 가수분해 또는 에스테르화 방법에 사용하기 위해서, 화학적, 물리적(예를 들어, x-선) 또는 생물학적 방법들(예를 들어, 분자 생물학적 기술들)을 사용하여 개질된 것들과 같이 이들 미생물들의 돌연변이체가 또한 본 발명에서 고려된다는 것을 이해하여야 한다.
노카르디오이데스 앨부스 ATCC 55424 (SC 13910) 및 ATCC 55425 (SC 13911)은 배지 A 94(옥수수 침지액(35g), 세렐로우스(Cerelose)(20g), (NH4)2SO4시약 등급품(5g), CaCO3(3.5g), 콩기름(5ml) 및 중류수(1ℓ)에서 배양될 수 있다. 이들 미생물들은 토양(미합중국 뉴저지주 뉴 브룬스위크의 시료)으로부터 단리되었고, 다양한 배지에 호기성 성장을 나타내는 그램 양성, 비-운동성 미생물이다. 고체 YS 배지 (0.2% 이스트 추출물, 1% 녹말)상에서, 균사체는 희끄무레한 밝은 크림 색이다. 성장성은 고체 및 액체 배지에서 확산성의 어두운 색소의 생성과 관계가 있다. 미시적으로, 액체 배지에서의 성장성은 풍부한 분기 균사로 이루 어진 균사 집합체로 특징화된다.
노카르디오이데스 루테우스 ACTT 55426 (SC 13912)는 배지 A 94(옥수수 침지액(35g), 세렐로우스(20g), (NH4)2SO4시약등급품(5g), CaCO3(3.5g), 콩기 름(5 ml) 및 중류수(1 ℓ)에서 배양될 수 있다. 이 미생물은 토양(미합중국 뉴저 지주 뉴 브룬스위크의 시료)으로부터 단리되었고, 다양한 배지에 호기성 성장을 나타내는 그램 양성, 비-운동성 미생물이다. 고체 YS 배지(0.2% 이스트 추출물, 1% 녹말)에서, 균사체는 어두운 크림 색이다. 미시적으로, 액체 배지에서의 성장성은 풍부한 분기 균사로 이루어진 균사 집합체로 특징화된다.
상기 미생물 노카르디오이데스 앨부스 ATCC 55424 (SC 13910), 및 ATCC 55425 (SC 13911), 및 노카르디오이데스 루테우스 ATCC 55426 (SC 13912)는 각각 문헌[Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Volumn 2 (Ed. P.H.A.Sneath)(1986)]에 기재된 바에 따라, 노카르디오이데스 앨부스 및 노카르디 오이데스 루테우스의 균주로 확인되었다.
본 발명의 가수 분해 또는 에스테르화 방법에 사용되는 효소의 예로는 히드 로라아제, 특히 에스테라아제, 프로테아제 또는 리파아제를 들 수 있다. 바람직한 효소는 미생물, 특히 상기 미생물들부터 유래한 것들이다. 효소는 예를 들어, 소수성 상호작용 크로마토그래피법, 겔 여과법, 이어서 음이온 교환 칼럼법을 사용하는 것과 같은 추출 및 정제법들로 단리시킬 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 가수 분해 또는 에스테르화 방법을 가능케하는 효소를 제공하는데, 이 효소는 예를 들어, 상기 기술을 사용하여 노카르디오이데스 앨부스 ATCC 55424 (SC 13910) 및 ATCC 55425 (SC 13911), 및 노카르디오이데스 루테우스 ATCC 55426 (SC 13912)로부터 단리시킬 수 있다.
C-13 개질을 위한 효소 및 미생물
본 발명에 사용된 효소 또는 미생물은 본 명세서에 기재된 효소 가수 분해를 촉매화할 수 있는 임의의 효소 또는 미생물일 수 있다. 출처 또는 순도에 관계없 이, 효소 또는 미생물은 유리상태로, 또는 물리적 흡착 또는 포획에 의한 것과 같 이 지지체에 고정화된 상태로 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 따른 출발 C-13 아실옥시-함유 탁산의 효소 가수분해에 적합한 미생물을 선택하는 바람직한 방법은,
(a) (i) 선별하고자 하는 미생물이 성장할 수 있고, (ii) 출발 C-13 아실옥시-함유 탁산이 난용성이어서, 성장 배지와 혼합될 때 혼탁한 외양을 나타내며,
(iii) 본 발명의 가수 분해 방법의 C-13 히드록실-함유 탁산 생성물이 가용성이고, 바람직하게는, 분열된 C-13 측쇄 또한 가용성이어서, 성장 배지와 혼합될때 투명한 외양을 나타내는 고체 성장 배지를 선택하는 단계;
(b) 예를 들어, 페트리 접시안에서, 출발 C-13 아실옥시-함유 탁산이 혼합되어있고, 미생물의 성장이 일어날 수 있는 조건하에 있는, 상기 (a) 단계에서 선택된 성장 배지와 미생물을 접촉시키는 단계; 및
(c) 미생물의 성장이 일어나는 영역의 주변에 투명한 대역이 나타나는지를 관찰하는 단계를 포함하는 신규한 선별 방법을 사용하는 것이다.
투명한 대역의 형성은 가수 분해가 일어났다는 것을 의미하고, 그리하여 그 미생물이 본 가수 분해 방법에 사용되는데 적당할 수 있다는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 "투명한", 및 "혼탁한"이라는 용어는 서로 상대적인 의미를 나타내는 것으로 이해하여야한다. 즉, 출발 C-13 아실옥시-함유 탁산은 현탁액("혼탁한" 외양을 나타냄)에서 보이도록 충분한 양의 성장 배지와 혼합하여 사용되고, 투명도는 즉, 가시성이 감소함에 따라서, 현탁액의 상기 초기 가시도와 비교하여 결정한다.
본 발명에 의해 제공된 다른 바람직한 선별 방법은, 출발 C-13 아질옥시-함 유 탁산이 가용성이어서, 성장 배지와 혼합될 때 투명한 외양을 나타내고, 또한, 본 발명의 가수 분해 방법의 C-13 히드록실-함유 탁산 생성물은 난용성(바람직하게는 분열된 C-13 측쇄 또한 난용성임)이어서, 성장 배지와 혼합될 때 혼탁한 외양을 나타내는 고체 성장 배지를 선택하는 것을 제외하고는 상술한 방법에 상응하는 방법이다. 미생물의 성장이 일어나는 주변에 혼탁한 대역이 관찰되면 적당한 미생물이 선택되었음을 의미한다.
본 발명의 선별법의 특히 바람직한 실시 태양은 본 명세서의 실시예에 기재 되어 있다.
상기 바람직한 선별 방법은 출발 C-13 아실옥시-함유 탁산 및 C-13 히드록 실-함유 탁산 생성물이 본 발명에 따른 가수 분해가 일어나는지 또는 일어나지 않 는지를 관찰할 수 있는 정도까지 상대 용해도가 서로 다른 경우에 적절하게 사용 될 수 있다.
C-13 가수분해에 사용되는 미생물의 예로는 노카르디오이데스, 노카르디아,로도코쿠스, 마이크로폴리스포라, 사카로폴리스포라, 슈도노카르디아, 에르스코비 아, 프로마이크로모노스포라 및 인트라스포랭귐등의 속에 속하는 것들을 들 수 있다. 특히 바람직한 미생물은 노카르디오이데스 앨부스, 노카르디오이데스 플래부 스, 노카르디오이데스 풀부스, 노카르디오이데스 루테우스, 노카르디오이데스 심 플렉스, 및 노카르디오이데스 더몰릴랙시누스, 특히 노카르디오이데스 앨부스 ATCC 55424 (SC 13910) 및 ATCC 55425 (SC 13911) 및 노카르디오이데스 루테우스 ATCC 55426 (SC 13912)와 같은 노카르디오이데스 속에 속하는 종들이다.
상기한 바와 같이, 생물학적으로 순수한 미생물인 노카르디오이데스 앨부스 ATCC 55424 (SC 13910), 노카르디오이데스 앨부스 ATCC 55425 (SC 13911), 및 노카르디오이드 루테우스 ATCC 55426 (SC 13912)은 또한 본 발명에 의해 제공된 신규한 미생물이다. 본 명세서에 기재된 가수 분해 방법에 사용하기 위해서, 화학적, 물리적(예를 들어, x-선) 또는 생물학적 방법(예를 들어, 분자 생물학적 기술들)을 사용하여 개질된 것들과 같이, 이들 생물들의 돌연변이체가 본 발명에 고려 된다는것을 이해하여야 한다.
본 발명에 사용되는 효소의 예로는 히드로라아제를 들 수 있다. 바람직한 효소는 미생물로부터, 특히 상술한 미생물들로부터 유래한 효소들을 들 수 있다. 효소는 예를 들어, 본 명세서의 실시예에 기재된 것과 같은 추출법 및 정제법, 특히 이들 미생물들이 배양되는 배지의 세포외에 있는 활성 부분을 음이온 교환 칼럼, 이어서 소수성 상호작용 크로마토그래피법 및 겔 여과법을 사용하는 것과 같은 정제법으로 단리시킬 수 있다. 본 발명은 또한 예를 들어, 상기 기술들에 의하여, 노카르디오이데스 앨부스 ATCC 55424 (SC 13910) 및 ATCC 55425 (SC13911), 및 노카르디오이데스 루테우스 ATCC 55426 (SC 13912)로부터 단리될 수 있는 본 발명의 가수 분해를 가능하게 하는 효소를 제공한다.
C-10 및 C-13 개질에 있어서 효소 및 미생물의 사용
미생물을 사용할 경우, 세포는 무손상 습윤 세포의 형태, 또는 동결건조, 분무-건조 또는 가열건조된 세포와 같은 건조된 세포의 형태, 또는 파열된 세포 또 는 세포 추출물과 같은 처리된 세포 물질의 형태로 사용될 수 있다. 또한 유전공 학적으로 조작된 생물을 사용하는 것도 고려된다. 숙주 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같이 촉매화를 가능하게 하는 1종 이상의 효소를 나타내는 1개 유전자 또는 유전자들을 함유하도록 개질된 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)와 같은 임의의 세포일 수 있다.
1종 이상의 미생물이 사용되면, 본 발명의 효소 가수 분해 또는 에스테르화 방법은 미생물의 발효에 이어서 수행될 수 있거나 (2-단계 발효 및 가수 분해 또는 에스테르화), 또는 그와 동시에, 즉, 후자의 경우에 있어서, 발효 및 가수 분 해 또는 에스테르화는 동일 반응계에서 수행될 수 있다(1-단계 발효 및 가수 분해 또는 에스테르화).
미생물의 성장은 적절한 배지를 사용하여 당업자가 달성할 수 있다. 미생물 을 성장시키기 위한 적절한 배지로는 미생물 세포의 성장에 필요한 영양분을 제공 하는 배지를 예시할 수 있다. 성장을 위한 전형적인 배지는 필수 탄소원, 질소원, 및 원소들(예를 들어, 미량 원소)을 포함한다. 또한 유도질이 첨가될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "유도질"이라는 용어는 미생물 세포내의 목적 효소 활성의 형성을 향상시키는 임의의 화합물을 의미한다.
탄소원으로는 말토오즈, 락토오즈, 글루코오즈, 프럭토오즈, 글리세롤, 소르 비톨, 슈크로오즈, 녹말, 만니톨, 프로필렌 글리콜 둥과 같은 당; 아세트산 나트 륨, 시트르산 나트륨 둥과 같은 유기산; 및 에탄올, 프로판올 등과 같은 알코올을 예시할 수 있다.
질소원으로는 N-Z 아민 A, 옥수수 침지액, 콩죽, 쇠고기 추출물, 이스트 추 출물, 당밀, 빵효모, 트립톤, 누트리소이(nutrisoy), 펩톤, 이스타민, 글루타민산 나트륨등과 같은 아미노산, 질산 나트륨, 황산 암모늄 등을 예시할 수 있다.
미량 원소로는 마그네슘, 망간, 칼슘, 코발트, 니켈, 철, 나트륨 및 칼륨염 들을 예시할 수 있다. 또한 인산염도 미량으로 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 미량보다 다소 많이 첨가될 수 있다.
사용되는 배지는 1종 이상의 탄소 또는 질소원 또는 다른 영양소를 함유할수 있다.
성장을 위한 바람직한 배지는 수용성 배지, 특히 본 명세서의 실시예에 기재 된 배지를 들 수 있다.
반응 혼합물의 교반 및 통기는, 예를 들어, 미생물이 성장하는 동안 진탕-플 라스크 형태의 배양 또는 발효 탱크내에서 수행되는 가수 분해 또는 에스테르화공 정 동안에 필요한 산소의 양에 영향을 준다. 교반은 100 내지 250 RPM이 바람직하며, 1 분당, 배지의 부피당, 약 1 내지 10 배 부피의 통기가 바람직하다.
본 발명의 방법에 따른 미생물의 성장 및(또는) 가수 분해 또는 에스테르화 를 위한 배지의 pH는 약 6 내지 약 8.5가 바람직하고, 온도는 약 24℃ 내지 약 37℃가 바람직하다. 가수 분해 또는 에스테르화는 예를 들어, 1 내지 48시간 이상, 또는 바람직하게는 목적 생성물의 수득량이 최대가 될 때까지 시험관 내에서 수행할 수 있다. 6 내지 8의 pH에서, 특히 비-염기성 조건하에서 본 발명의 가수 분해 방법을 수행하는 것이 바람직하다.
가수 분해 반응 배지로는 유기 액상, 또는 혼화성 또는 비혼화성 (2상) 유기/수성 액상 혼합물이 사용될 수 있지만, 수성 액상을 사용하는 것이 바람직하다. 다른 배지가 사용될 수 있지만, 에스테르화를 위해서는 유기 용매 또는 2상의 유기/수성 반응 배지를 사용하는 것이 바람직하다.
C-10 개질을 위해서, 출발 물질(들) 및 에스테르화 또는 가수 분해 반응 배 지의 배합량에 기초하여 C-10 히드록시- 또는 아실옥시-함유 탁산 출발 물질(들)을 0.025 내지 2.5 중량%로 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 에스테르화 방법에서 아실화제 대 C-10 히드록실-함유 탁산의 바람직한 몰비는 약 1:1 내지 약 1000:1이다. 출발 물질에 대한 사용된 효소 또는 미생물의 양은 본 발명의 효소 가수 분해 또는 에스테르화의 촉매화 여부에 따라 선택된다. 본 발명의 가수 분해 또는 에스테르화 방법을 각각 수행할 때, 90% (출발 아실옥시-함유 탁산에 기초한 C-10 가수분해된 생성물의 수득 %) 또는 50% (출발 히드록실-함유 탁산에 기초한 C-10 아실화된 생성물의 수득 %)를 초과하는 수득률을 얻는 것이 바람직하다. 가수 분해 또는 에스테르화는 출발 탁산의 C-10 위치에 선택적으로 생성될 수 있다. 즉, 다른 위치에 가수 분해 또는 에스테르화되지 않고 오직 C-10에 가수 분해 또는 에스테르화된 다량의 생성물(들)(단독 생성되는 것과 마찬가지)을 얻을 수 있다.
C-13 개질을 위해서, 출발 물질(들) 및 가수 분해 반응 배지의 배합량에 기초하여 C-13 아실옥시-함유 탁산 출발 물질(들)을 0.025 내지 0.25 중량 %로 사용 하는 것이 바람직하다. 출발 물질에 대한 사용된 효소 또는 미생물의 양은 본 발 명의 효소 가수 분해를 촉매화할 수 있도록 선택된다. 본 발명의 가수 분해 방법 을 수행할 때, 90%(출발 아실옥시-함유 탁산에 기초한 C-13 가수 분해된 생성물의 수득 %)를 초과하는 수득률을 얻는 것이 바람직하다. 가수 분해는 출발 탁산의 C-13 위치에 선택적으로 생성될 수 있다. 즉, 다른 위치에 가수 분해되지 않고 오직 C-13에서 가수 분해된 다량의 생성물(들)(단독 생성되는 것과 마찬가지)을 얻을 수 있다.
분리
본 발명의 방법의 C-10 아실옥시- 또는 히드록실-함유 생성물 및 하기 기재된 바와 같이 커플링된 생성물은 예를 들어, 추출법, 증류법, 결정화법, 및 칼럼 크로마토그래피법에 의하여 단리 및 정제시킬 수 있다.
유사하게, 본 발명의 C-13 가수 분해 방법의 C-13 히드록실-함유 생성물, 및하기 기재된 바와 같이 커플링된 생성물은 또한 예를 들어, 추출법, 증류법, 결정 화법, 및 칼럼 크로마토그래피법에 의하여 단리 및 정제시킬 수 있다.
유용성
탁산은 상술한 바의 탁산 잔기를 포함하는 디테르펜 화합물이다. 특히 흥미 로운 것은 탁솔로 예시되는 바와 같이, 11, 12-위치가 에틸렌 결합을 통해 결합되 고, 13-위치는 측쇄를 포함하는 탁산 잔기를 함유하는 탁산이다. 탁솔과 같은 약 리학적으로 활성인 탁산은 유방암, 난소암, 결장암, 폐암과 같은 암, 흑종 및 백 혈병으로 고생하는 환자를 치료하기 위한 항암제로서 사용될 수 있다.
C-10 개질로 생성된 화합물
본 발명의 C-10 가수 분해 또는 에스테르화 방법으로 생성된 화합물은 C-10에 목적 치환체를 갖는 화합물을 제조하므로 상술한 바의 약리학적으로 활성인 탁 산 제조의 중간체로서 특히 유용하다. 즉, 예를 들면, 본 발명의 방법에 따른 C-10 개질에 의해 제조된 화합물이 또한 C-13에 히드록실기를 함유하는 경우, 그러한 화합물을 β-락탐과 같은 C-13 아실옥시 측쇄-형성 중간체 화합물과 커플링시켜, 탁솔 또는 그의 유사체와 같은 C-13 아실옥시 측쇄-함유 탁산을 수득할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 방법에 따른 C-13의 개질은 C-10의 개질을 위한 본 발명의 방법이 수행되기 전, 중, 또는 그 후에 수행될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 제조된 아실옥시 또는 히드록실-함유 화합물은 C-13아실옥시 측쇄 커플링에 사용되기 전에 임의로 개질될 수 있다. 예를 들어, C-13이외의 위치의 1개 이상의 히드록실기는 커플링 전에 보호되고, 그 후에 보호기 제거될 수 있다.
상기와 같이 임의로 개질된 본 발명의 가수 분해 및 에스테르화 방법에 의해생성된 C-10 아실옥시- 및 히드록실-함유 탁산은 예를 들어, 열거된 것과 같은 C-13 아실옥시 측쇄-함유 탁산의 제조에 사용될 수 있고, 유럽 특허 공고 제400,971호, 미합중국 특허 제4,876,399호, 동 제4,857,653호, 동 제4,814,470호, 동 제4,924,012호, 동 제4,924,011호 및 문헌(Kingston, Pharm. Ther., Vol. 52, 1-34 (1991)), 특히 포스(Poss) 등에 의해 1992년 12월 23일에 출원된 미합중국 특허 출원 제07/995,443호 (대리인 사건번호 LD6O), 및 토타딜(Thottattil) 등에 의해 1993년 3월 19일에 출원된 미합중국 특허 출원 제08/033,598호 (대리인 사건 번호 LD57)에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있고, 이들은 모두 본 명세서에서 참고 문헌으로 채택한다.
C-13 개질로 생성된 화합물
본 발명의 가수 분해 방법에 의해 생성된 C-13 히드록실 함유 화합물은 상기 C-13 측쇄-함유 탁산 제조의 중간체로서 특히 유용하다. 특히, 본 방법에 따라 제조된 C-13 히드록실-함유 화합물은 β-락탐과 같은 측쇄-형성 중간체 화합물과 커플링시켜 C-13 측쇄-함유 탁산을 수득할 수 있다. 그러한 측쇄의 첨가에 의해 본래적으로 및 자연적으로, 탁산 생성물에 증대된 또는 더 바람직한 약리학적 활성을부여하거나, 또는 출발 물질 보다 증대된 또는 더 바람직한 약리학적 활성을 갖는 탁산으로 쉽게 전환되는 탁산 생성물을 형성할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 제조된 C-13 히드록실-함유 화합물은 커플링에 의한 측쇄 형성에 사용되기 전에 임의로 개질시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 따른 C-10의 개질은 본 발명의 C-13 가수 분해 방법이 수행되기 전, 중, 또는 그 후에 수행될 수 있고(있거나) C-13 이외의 위치의 1개 이상의 히드록실기는 커플링 전에 보호되고, 그 후에 보호기 제거될 수 있다.
상기와 같이 임의로 개질된 본 발명의 가수 분해 방법에 의해 얻은 C-13 히 드록실-함유 탁산은 예를 들어, 열거된 것과 같은 C-13 아실옥시 측쇄-함유 탁산 의 제조에 사용될 수 있고, 유럽 특허 공고 제400,971호, 미합중국 특허 제 4,876,399호, 동 제4,857,653호, 동 제4,814,470호, 동 제4,924,012호, 동 제 4,924,011호 및 문헌(Kingston, Pharm. Ther., Vol. 52, 1-34 (1991)), 특히 포스 등에 의해 1992년 12월 23일에 출원된 미합중국 특허 출원 제07/995,443호 (대리인 사건번호 LD60), 및 토타딜 등에 의해 1993년 3월 19일에 출원된 미합중국 특허 출원 제08/033,598호 (대리인 사건번호 LD57)에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 상기 문헌들은 모두 본 명세서에서 참고 문헌으로 채택한다. 식 (VI)의 C-13 아실옥시-함유 탁산을 제조하는 것이 바람직하다.
C-10 개질을 위한 바람직한 화합물
본 발명의 C-10 가수 분해 방법에서 식 (Ⅱ)의 탁산 또는 그의 염을 사용하여, 효소 가수 분해하여 대웅하는 식 (I)의 화합물 또는 그의 염을 제공하도록 하는 것이 바람직하다. 마찬가지로, 본 발명의 C-10 에스테르화 방법에서 식 (I)의 탁산 또는 그의 염을 사용하여, 효소 에스테르화하여 대응하는 식 (Ⅱ)의 화합물 또는 그의 염을 제공하도록 하는 것이 바람직하다.
식 (I) 및 (Ⅱ)에서, 특히 R11이 메틸과 같은 알킬기인 경우, R7은 R11-C(O)-O-이 바람직하고, R2는 히드록실 또는 크실로실이 바람직하며, R3는 메틸과 같은 알킬기가 바람직하고, R4는 페닐과 같은 아릴이 바람직하고, R1는 히드록실 또는 하기 식 (Ⅲ)의 기가 바람직하다.
여기서,
R8및 R9는 각각 알킬, 알콕시, 알케닐, 알케닐옥시, 알키닐, 알키닐옥시, 시클로알킬, 시클로알킬옥시, 시클로알케닐, 시클로알케닐옥시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로시클로 또는 헤테로시클로옥시이고,
R10은 수소 또는 히드록실 보호기이다.
식 (I) 및 (Ⅱ)의 탁산의 예로는 세팔로만닌, 10-데아세틸탁솔, 7-크실로실 탁솔, 탁솔-C, 7-크실로실-10-데아세틸탁솔, 탁솔, 박카틴 Ⅲ, 10-데아세틸박카 틴 Ⅲ, 7-크실로실박카틴 Ⅲ 및 7-크실로실-10-데아세틸박카틴 Ⅲ을 예시할 수 있다.예를 들어, 히드로라아제를 사용하여 박카틴 Ⅲ을 효소 가수 분해하여 10-데아세틸박카틴 Ⅲ을 형성(예컨대, 아세트산의 형성과 함께)하는 것은 본 발명의 바람직한 실시 태양이다. 이 반응은 본 발명의 효소 에스테르화 방법을 이용하여 전환할 수 있다.
탁솔은 궁극적으로 본 명세서에 기재된 방법으로 제조하는 것이 바람직하다.
C-13 개질을 위한 바람직한 화합물
본 발명의 방법에서 식 (VI)의 탁산 또는 그의 염을 사용하여, C-13에서 효 소 가수 분해하여 대응하는 식 (V)의 화합물 또는 그의 염을 제공하는 것이 바람 직하다. 식 (V) 및 (VI)에서, R12는 아세틸옥시와 같은 R6-C(O)-O-, 또는 히드록실이 바람직하고, R2는 히드록실 또는 크실로실이 바람직하며, R3는 메틸과 같은 알킬이 바람직하고, R4는 페닐과 같은 아릴이 바람직하며 R7은 하기 식 (Ⅲ)의 기가 바람직하다.
여기서, R8, R9, 및 R10은 상기 정의한 바와 같다.
식 (VI)의 출발 탁산의 예로는 단독 또는 서로 혼합되거나 또는 탁솔과 혼합한, 세팔로만닌, 10-데아세틸탁솔, 7-크실로실탁솔, 탁솔-C, 및 7-크실로실-10-데아세틸탁솔을 들 수 있다. 바람직한 가수 분해 생성물로는 박카틴 Ⅲ, 10-데아세틸박카틴 Ⅲ, 7-크실로실박카틴 Ⅲ, 및 7-크실로실-10-데아세틸박카틴 Ⅲ을 예시할 수 있다.
가수 분해에 이은 커플링은 바람직하게는 상기 식 (Ⅲ)의 C-13 아실옥시기 를 갖는 상술한 바의 상기 식 (VI)의 탁산 생성물을 제공한다. 탁솔은 바람직하게는 궁극적으로 본 명세서에서 기재된 바의 가수 분해 및 커플링에 의해 제조된다.
반응물 또는 생성물의 수화물과 같은 용매화물 또는 염은 본 발명의 임의의 방법 중 적절한 방법에 따라 사용되거나, 제조될 수 있다.
본 발명을 단지 예시적일 뿐인 하기 실시예로 보다 상세히 설명하며, 결코 본 발명의 특허 청구 범위를 이들 실시예에 한정하려는 의도는 아니다.
실시예 1
박가틴 Ⅲ의 10-틸아세틸화
토양으로부터 단리시킨 노카르디오이데스 루테우스 ATCC 55426(SC 13912)를배지 10 ml를 함유하는 50 ml 삼각 플라스크에서 150 rpm으로 28 ℃에서 3일 동안 배양시켰다. 배지는 최종 pH 6.8±0.2에서, 1 ℓ 증류수 당 박토 트립톤 10 g, 박토 이스트 추출물 5 g, 트리부티린 6 ml, 및 트윈(Tween) 80 0.06 ml를 함유하도록 하였다. 세포를 원심분리기로 수확하고, 50 mM 인산 칼륨 완충액(pH 7) 10ml로 세척하고, 이 완충액 2 ml에 재현탁시켰다. 메탄올 20 ㎕ 중의 박카틴 Ⅲ 0.5 mg을 상기 세포 현탁액에 가하고, 그 현탁액을 피셔 로토-래크로 주변 온도(약 23 ℃)에서 20시간 동안 교반하였다. 상기 현탁액을 염화 메틸렌으로 추출하고, 추출물을증발시키고, 재용해시키고, 하기 기재된 HPLC 방법 2로 분석하였다. 시료는 10-데아세틸박카틴 Ⅲ 0.257 mg/ml(100% 전환율) 및 박카틴 Ⅲ 미량을 포함하였다. 또한, 다른 세개 배지에서 배양된 균주 ATCC 55426의 세척된 세포들로 상기 변환을 수행하였다.
실시예 2
박가틴 Ⅲ의 10-틸아세틸화
pH 6.8±0.2에서 중류수 1 ℓ당 박토 트립톤 10 g, 박토 이스트 추출물 5 g, 및 트윈 80 0.06 ml를 함유하는 배지 20 ml에서 배양된 노카르디오데스 루테우스 ATCC 55426(SC 13912)을 4 ℓ 삼각 플라스크 중의 같은 배지 1 ℓ에 접종시켰다. 플라크를 28 ℃에서 3일 동안 진탕시킨 후, 세포를 원심 분리하여 수확하였다. 세포 펠릿을 50 mM 인산 칼륨 완충액(pH 7) 600 ml로 세척하고 다시 원심분리하여 습윤 세포 36.6 g을 얻었다. 그 세포를 -72℃로 냉각하고, 2일 동안 2.5g까지 동결건조하고, 모르타르 및 막자로 분마하고, 2℃에서 저장하였다. 메탄올 20㎕ 중의 50 mM 인산 칼륨 완충액(pH 7) 1.98 ml, 건조 세포 50 mg, 및 박카틴 Ⅲ 0.5 mg을 하기 표 1에 나타낸 시간 동안 실온에서 로토-래크로 혼합하였다. 반응을 메탄올 2 ml를 가하여 정지시켰다. 침전물을 마이크로퓨즈(microfuse)로 제거하고, 시료를 하기에 기재된 HPLC 방법 1로 분석하였다. 얻은 결과를 표 1에 나타낸다.
표 1
실시예 3
탁솔의 10-탈아세틸화
노카르디오이데스 루테우스 ATCC 55426(SC 13912)로 부터 부분 정제된 추출 물(와트만(Whatman) DE52 상에서 음이온 교환 크로마토그래피법에 의해 정제됨)은 효소 34 mU/ml를 함유하였다(1 mU는 1 분당, 28 ℃에서 0.25 mg/ml의 박카틴 Ⅲ 및 1 % 메탄올을 함유하는 50 mM 인산 칼륨 완충액(pH 7) 중에서 1 nmole의 박카 틴 Ⅲ을 10-데아세틸박카틴 Ⅲ으로 가수 분해할 수 있는 효소의 양이다.). 50mM 인산 칼륨 완충액(pH 7) 2 ml, 탁솔 0.5 mg, 1 % 메탄올 및 효소 34 mU를 28℃에서 3시간 30분동안 피셔 로토 래크에서 배양하였다. 반응을 염화메틸렌 4ml로 추출하여 정지시켰다. 추출물을 건조시키고, 메탄올중에 재용해시켜 하기에 기재된 HPLC 방법 3으로 분석하였다. 시료는 탁솔 0.075 mg 및 10-데아세틸탁솔 : (78 % 전환율) 0.186 mg/ml를 함유하였다.
노카르디오이데스 루테우스 ATCC 55426(SC 13912)의 다른 정제법
노카르디오이데스 루테우스 ATCC 55426을 1% 트립톤 및 0.5% 이스트 추출 물을 함유하는 배지상의 발효기 중에서 배양시켰다. 모든 정제 단계를 4 ℃에서 50 mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.2) 중에서 수행하였다. 세포를 완충액 중에서 10% w/v로 현탁시키고 분해시키기 위해 680.5 기압(10,000 psi)에서 2회 마이크로-유동기를 통과시켰다. 이어서 세포 분해질을 24,000 × g에서 15분 동안 원심분리시켜 청정화시켰다. 황산 암모늄을 60 % 포화되도록 가하고 생성된 침전물을 1 M 황산 암모늄을 함유하는 완충액 중에 현탁시키고 2 ml/min의 유속으로 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC-에테르(토야-펄)) 칼럼(5.5 × 2.6 cm)을 거치도록 하였다. 효소 활성을 완충액으로 용출하였다. 이어서 활성 분획은 0.5ml/min 유속의 파마시아 세파크릴(Pharmacia Sephacryl) S-200 겔 여과 칼럼 (2.6×84 cm)상에 채웠다. 상기 칼럼으로부터 얻은 활성 성분을 음이온 교환(바이오 라드-Q2) 칼럼(2 ml 칼럼, 유속 2 ml/min)에 채우고, 0 내지 0.8 M NaCl 42 ml의 염 성분으로 용출하였다. 그 활성 성분을 혼주시키고, 상술한 바의 세파크릴 S-200 칼럼에 배치하였다. 효소의 분자량은 황산 도데실 나트륨을 함유하는 겔 상에서 40,000±10,000인 것으로 측정되었다. 상기 방법의 몇가지 단계에서 얻은 결과는 하기와 같았다.
*C-10-데아세틸라아제의 정제: 1 mU의 효소가 25 ℃에서, 0.25 mg/ml 박카틴-Ⅲ 및 1 % 메탄올을 함유하는 50 mM 인산 칼륨 완충액(pH 7) 중에서 박카틴-Ⅲ이 10-데아세틸박카틴-Ⅲ으로 1 nmole/min으로 전환하는 것을 촉매화한다. 단백 질은 바이오라드 단백질 정량 시약으로 분석되었다.
실시예 4
10-데아세틸박가틴 Ⅲ의 박가틴 Ⅲ으로의 아세틸화
50 mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.2) (10 % w/v) 중의 노카르디오이데스 루테우스 ATCC 55426(SC 13912) 세포를 마이크로유동기로 파열하고 와트만 DEAE 셀룰로 오스 DE52 음이온 교환기에서 3시간 동안 교반시켜 추출물(DE 52 1 ℓ당 추출 단백 질 10g)로부터 10-데아세틸라아제 효소를 흡수시켰다.
DE 52를 여과하여 수집하고, 완충액으로 세척하고 동결 건조시켜 고체 1 mg당 0.091 mU의 효소를 얻었다. 1M 인산 칼륨 완충액(pH 8) 0.2 ml, 고정화 효소100 mg(즉, DE 52 수지에 고정화됨), 물 1.8 ml, 10-데아세틸박카틴 Ⅲ 2 mg 및 비닐 아세테이트 0.5 ml를 실온에서 14시간 30분 동안 자기막대로 격렬히 교반하 였다. 반응혼합물을 염화메틸렌으로 추출하였다. 추출물을 건조시키고 메탄올에 재용해시켜 하기 기재된 HPLC 방법 1로 분석하였다. 시료는 10-데아세틸박카틴 Ⅲ 0.688 mg/ml 및 박카틴 Ⅲ 0.203 mg/ml(19 % 전환율)을 함유하였다.
HPLC 방법
방법 1
칼럼 : 휴렛 패카드 하이퍼실 5 마이크론 ODS C18 200 × 4.6 mm
이동상 : 55 % 메탄올, 45 % 물
유속 : 1 ml/min
칼럼 온도 : 실온
탐지 파장 : 235 nm
방법 2
칼럼 : 페이스 세퍼레이션스 인크. (Phase Separations Inc.) (노르워크, CT) 마이크로보어 스페리솔브 페닐 150 × 2.0 mm, 3 마이크론
이동상 : 용매 A : 트리플루오로아세트산으로 pH 4로 조정한 15 mM KH2PO4,용매 B : 아세토니트릴
칼럼 온도 : 35℃
탐지 파장 : 230 nm.
방법 3 1
칼럼 : 휴렛 패카드 하이퍼실 5 마이크론 ODS C18 200 × 4.6 mm
이동상 : 60 % 메탄올, 40 % 물
유속 : 1 ml/min
칼럼 온도 : 실온
탐지 파장 : 235 nm
1또한 문헌(Monsarrat 등, Drug Metabolism and Disposition, 18, 895-901(1990).) 참조
실시예 5
묘목 추출물의 가수 분해
택수스 히크시(Taxus hicksii) 묘목의 에탄올 추출물을 나노필터로 10- 내지 15배로 농축시켰다. 추출물 0.5 ml, 1M 인산 칼륨 완충액(pH 7) 0.5 ml, 노카 르디오이데스 앨부스 ATCC 55425(SC 13911)로부터 부분 정제된 54 mU의 효소(음이온 교환 크로마토그래피법 및 황산 암모늄 침전법으로 정제됨), 및 물 4 ml를 피셔 로토 래크상에서 48시간 동안 28 ℃에서 배양시켰다. (ATCC 55425로부터 얻은 효소는 본 명세서에서 상술한 바와 같이 C-13을 가수분해하는 데에 사용될 수 있다). 두번째 시험관은 같은 혼합물 및 또한 실시예 4에서 기재한 바와 같은 500mg DE52에 고정화된 노카르디오이데스 루테우스 ATCC 55426(SC 13912)로 부터 얻은 14 mU의 효소를 함유하였다. 28 ℃에서 23시간 배양시킨 후, DE52상의 ATCC 55426으로부터 얻은 14 mU의 효소의 2번째 분획에 물 4 ml를 가하고 22시간 동안 계속해서 배양하였다. 대조 시료에는 효소를 가하지 않았다. 시료를 염화 메틸렌으로 추출하고, 증발된 추출물을 메탄올 중에 용해시켜 상술한 HPLC 방법 2로 분석하였다. 얻은 결과를 하기 표 2에 나타낸다.
SC 13911로부터 얻은 C-13 데아실라아제로 처리한 후에 탁솔, 세팔로만닌, 7-크실로실-10-데아세틸탁솔 및 10-데아세틸탁솔은 없어지고, 또한 박카틴 Ⅲ 및 10-데아세틸박카틴 Ⅲ의 양은 증가되는 결과를 나타낸다. 초기 탁솔에 대한 10-데아세틸박카틴 Ⅲ과 박카틴 Ⅲ를 합한 몰 비는 117 %에서 436 %로 증가하였다. 묘목 추출물을 SC 13911로부터 얻은 C-13 데아실라아제 및 SC 13912로부터 얻은 C-10 데아실라아제로 처리하였을 때, 박카틴 Ⅲ은 10-데아세틸박카틴 Ⅲ으로 전환되고 10-데아세틸박카틴 Ⅲ의 농도는 초기값과 비교하여 6배 증가하였다.
그리하여, C-13 데아실라아제 및 C-10 데아실라아제로 탁산 혼합물을 처리하여 주 생성물로서 10-데아세틸 박카틴 Ⅲ을 얻었다.
표 2
실시예 6
탁솔의 C-13 측쇄를 제거할 수 있는 미생물 균주의 선택
증류수 150 ml 중의 디프코 주정 블루 한천(Difco spirit blue agar) 배지 (5.25g)를 살균하고 제조자의 지시에 따라 부분 냉각시켰다. 배지는 1 ℓ당 트립톤10 g, 이스트 추출물 5 g, 한천 20 g 및 주정 블루(blue) 0.15 g을 함유하였다. 메탄올 1 ml 중의 탁솔 25 mg 및 트윈 80 10 ㎕를 살균 여과기를 통해 배지에 가하였다. 100 mm ×15 mm페트리 접시마다 배지 15 ml를 사용하였다.
평판을 냉각시키고 건조시킨 후, 토양 시료를 다음과 같이 채웠다. 토양 2 g을 물 40 ml 중에 현탁시켰다. 현탁액의 시료를 물로 100배 희석시키고 각 평판에 0.1 ml 뿌렸다. 사용된 물을 0.22 μ 여과기를 통해 여과시켰다. 평판을 28 ℃에서 배양하고, 투명한 대역으로 둘러싸인 군락(colony)을 선택하였다. 선택할 수 있는 근거는 탁솔이 사용된 배지의 농도에서는 난용성 이어서 혼탁한 외양을 나타내는 반면, 가수 분해에 의해 제조된 박카틴 Ⅲ 및 측쇄는 가용성이어서 군락 주위에 투명한 대역을 형성한다는 것이었다. 선택된 미생물로는 노카르디오데스 앨부스 균주 ATCC 55424(SC 13910) 및 ATCC 55425 (SC 13911) 및 노카르디오이데스 루테우스 균주 ATCC 55426(SC 13912)이 있다.
실시예 7
탁솔로부터 C-13 측쇄의 제거
본 실시예의 반응은 하기 도식 1에 기재된 바와 같이 수행되었다. 배지 10ml를 함유하는 50 ml 삼각플라스크에 실시예 6에 기재된 토양에서 단리시킨 노카르디오이데스 앨부스 균주 ATCC 55425(SC 13910) 또는 ATCC 55425(SC 13911)를 접종시키고 28 ℃, 150 RPM에서 2일 동안 진탕하였다. 배지는 pH 6.8±0.2에서 증류수 1 ℓ당 박토 트립톤 10 g, 박토 이스트 추출물 5 g 및 트윈 80 0.06 ml를 함유하였다. 세포를 원심분리하여 제거하고 상징액의 pH를 1M KH2PO4로 8.66 내지 7로 조절하였다.
메탄올 20 ㎕ 중의 탁솔 0.5 mg을 각각의 상징액 2 ml에 가하고 그 혼합물을 주변 온도(약 23 ℃)에서 21시간 동안 교반하였다. 용액을 CH2Cl24 ml로 추출하였다. 추출물을 실온에서 질소(N2) 분위기하에서 건조시키고 메탄올 중에 재용해시키고 HPLC(상술한 방법 3)로 분석하였다. 균주 ATCC 55424(SC 13910)로부터의 상징액은 탁솔 0.008 mg/ml 및 박카틴 Ⅲ(94.9 mol % 전환율) 0.163mg/ml를 함유하였다. 균주 ATCC 55425(SC 13911)로 부터의 상징액은 탁솔 0.014mg/ml 및 박카틴 Ⅲ(96.7 mol % 전환율) 0.166 mg/ml를 함유하였다. (박카틴 Ⅲ 및 분열된 측쇄 생성물을 LC-MS로 동정하였다).
도식 Ⅰ
실시예 8
세팔로만닌으로부터 C-13 측쇄의 제거
각각 배지 10 ml(옥수수 침지액 35 g, 세렐로오즈 20 g, (NH4)2SO45 g, CaCO3, 3.5 g 및 콩기름 5 ml를 중류수 1 ℓ에 가하였다)를 함유하는 두개의 50 ml삼각 플라스크에 노카르디오이데스 앨부스 균주 ATCC 55425(SC 13911)를 각각 접 종시켰다. 28 ℃, 150 RPM에서 이틀 동안 배양시킨 후, 이들 두 배양액을 실시예 7에서 사용한 배지 1 ℓ를 함유하는 4 ℓ 플라스크에 가하였다. 28 ℃, 200 RPM에서 72시간 동안 배양시킨 후, 세포를 원심분리하여 제거하고 상징액을 1M KH2PO4로 pH 8.16 내지 pH 7로 조정하였다.
메탄올 20 ㎕ 중의 세팔로만닌 0.5 mg을 엔드-오버-엔드(end-over-end) 진탕기(피셔 로토-래크)에서 17시간 동안 상징액 2 ml와 함께 배양시켰다. 용액을 염화 메틸렌으로 추출하고, 추출액을 증발시키고, 메탄올 중에서 재현탁시키고 HPLC(상기한 방법 2)로 분석하였다. 세팔로만닌의 농도는 0.175 mg/ml에서 0으로 감소하였고 박카틴 Ⅲ 0.110 mg/ml가 제조되었다. (분석된 초기 세팔로만닌 농도에 기초하여 89 몰%를 수득하였다)
실시예 9
7-크실로실탁솔로 부터 C-13 측쇄의 제거
배양물 1 ℓ를 3일 대신에 2일 동안 배양시킨 것을 제외하고는 실시예 8에 기재한 바와 같이 노카르디오이데스 앨부스 균주 ATCC 55424(SC 13910) 및 ATCC 55425(SC 13911)로부터 효소를 제조하였다. 노카르디오이데스 루테우스 균주 ATCC 55426(SC 13912)는 실시예 8에서의 노카르디오이데스 앨부스 균주 ATCC 55425(SC 13911)에 대해 기재한 바와 같이 성장시켰다. 3일 후에, 세포를 원심 분리하여 수확하고 50 mM 인산 칼륨 완충액(pH 7) 600 ml로 세척하고 다시 원심분리시켰다. 습윤 세포 36.6 g을 -72℃로 냉동시키고, 2일 내에 2.52 g이 되도록 동결건조시키고, 모르타르 및 막자로 분마시키고, 2℃에서 저장하였다.
균주 ATCC 55424(SC 13910) 및 ATCC 55425(SC 13911)로 부터의 상징액 1.8ml, 및 물 1.8 ml 중의 균주 ATCC 55426(SC 13912)의 건조된 세포 50 mg를 각각 피셔 로토-래크 상의 실온에서 42시간 동안 메탄올 0.2 ml 중의 7-크실로실탁솔 0.5 mg과 함께 배양시켰다. 반응물을 염화 메틸렌으로 추출하고, 건조 추출물을 메탄올 중에 용해시켜 HPLC 분석하였다(상술한 방법 3). 7-크실로실탁솔의 농도는 각 효소에 있어서 0.218 mg/ml에서 0으로 감소하였다. 각각의 시료중의 주요 생성물은 HPLC-질량 분광 분석법에 의해 7-크실로실 박카틴 Ⅲ인 것으로 동정되었다. 표준 박카틴 Ⅲ을 기준으로 하여, ATCC 55424(SC 13910), ATCC 55425(SC 13911), 및 ATCC 55426(SC 13912)는 각각 0.112, 0.118 및 0.120 mg/ml 농도의 7-크실로실 박카틴 Ⅲ을 생성하였다. 박카틴 Ⅲ 및 7-크실로실 박카틴 Ⅲ에 대해 파장 235 nm에서 같은 흡광 계수(extinction coefficient)를 사용하여 계산한 수득률은 각각 88 %, 93 % 및 94 %(몰 %)로 밝혀졌다.
실시예 10
식물 세포 혼합물의 가수 분해
택수스 히크시(Taxus hicksii) 침엽을 10 ml 메탄올:아세트 산(5000:1)으로추출하였다. 추출물 10 ml에 10 ml 물:아세트산(500:1)을 가하였다. 혼합물을 48,000 × g 및 20 ℃에서 10분 동안 원심 분리시켰다. 펠릿은 폐기하였다. 노카르디오이데스 앨부스 균주 ATCC 55424(SC 13910) 또는 ATCC 55425(SC 13911)(실시예9에 기재한 바와 같이 제조됨)로 부터의 추출물 4 ml 및 상징액 16 ml를 50 ml 삼각 플라스크에 넣고 28 ℃, 150 RPM에서 42시간 동안 진탕하였다. 시료를 염화 메틸렌으로 추출하고 증발된 추출물을 메탄올 중에 용해시켜 HPLC(상기한 방법 2)로 분석하였다. 탁산의 농도 및 효소로 처리된 및 효소 처리되지 않은 (박카틴 Ⅲ + 10-데아세틸박카틴 Ⅲ)/ 초기 탁솔의 몰비를 다음 표 3에 나타낸 다.
표 3
실시예 11
효소의 정제 및 탁산의 가수 분해
500 ml 삼각 플라스크 중의 배지 100 ml(옥수수 침지액 35g, 세렐로오스 20g, 황산 암모늄 5g, 탄산 칼슘 3.5g, 및 콩기름 5 ml를 넣고 증류수로 1 ℓ를 채움)에 같은 배지 중의 노카르디오이데스 앨부스 ATCC 55425(SC 13911) 1 ml를 접종시키고 28 ℃에서 2일동안 진탕하였다. 이 배양액 20 ml를 pH 6.8 ± 0.2에서 트립톤 10 g 및 이스트 추출물 5 g을 함유하는 4 ℓ삼각 플라스크내의 증류수 1 ℓ에옮겨 넣었다. 플라스크를 28 ℃에서 3일 동안 진탕하고 세포를 원심분리하여 제거하고 상징액을 1M KH2PO4로 pH 7.89 내지 pH 7로 조정하였다.
모든 정제 단계들은 4 ℃에서 수행하였다. 상징액을 지름 5 cm 칼럼중에서 25 mM 인산 칼륨 완충액(pH 7) 중의 150 ml 와트만(Whatman) DE52 음이온 교환기에 가하였다. 칼럼을 완충액 150 ml로 세척한 후, 0.25 M NaCl을 함유하는 완충액 450 ml로 세척하였다. 효소 활성은 완충액과 0.45M NaCl로 용출하였다. 유속은 5 ml/min이었다. 황산 암모늄(100 mg/ml)을 DE52 칼럼으로부터 얻은 가장 활성이 큰 부분에 가하고, 용액을 유속 1.6 ml/min으로 직경 2.6 cm의 칼럼안에서 100 mg/ml 황산 암모늄을 함유하는 50 mM 인산 칼륨 완충액(pH 7) 중에서 30ml 파마시아(pharmacia) 페닐 세파로오스(Sepharose) CL-4B(소수성 상호작용 크로마토래피)에 가하였다. 칼럼을 완충액 150 ml와 20 mg/ml 황산 암모늄으로 세척한 후 활성 성분을 완충액만으로 용출하였다. 페닐 세파로스 칼럼으로부터 가장 활성이 큰 부분을 아미콘(Amicaon) YM 10막을 이용하여 4 ml까지 한외여과하여 농축시키고 0.65 ml/min의 유속으로 파마시아 세파크릴 S-200 겔 여과 칼럼 (2.6 x 84 cm)을 통해 통과시켰다. 가장 큰 고유 활성도를 갖는 부분은 황산 도데실 나트륨(SDS) 겔 상에서 분자량 49,000±10,000의 단일 밴드를 가졌다. 정제 단계는 하기 표 4에 요약하였다. (1 mU의 효소는 0.25 mg/ml 탁솔 및 1 % 메탄올을 함유하는 50 mM 인산 칼륨 완충액 중 28 ℃에서 탁솔이 박카틴-Ⅲ으로 1 nmole/min으로 전환하는 것을 촉매화한다.)
표 4
상기 정제된 효소의 활성을 동정하기 위해서, 표 5에 기재된 탁산 기질을 사 용하여 하기 실험을 수행하였다.
50 mH 인산 칼륨 완충액(pH 7) 2.0 ml 중에 탁산 기질 0.5 mg 및 1 % 메탄올을 함유하는 시료들(시료 1, 2, 3, 4 및 5)을 제조하였다. 또한 50 mM 인산 칼륨 완충액(pH 7) 2.0 ml 중의 탁산 기질 0.5 mg 및 1 % 메탄올 이외에 상술한 페닐 세파로오스 CL-4B 단계를 통해 정제된 효소 10 mU를 첨가하여 시료들(시료 1e, 2e, 3e, 4e 및 5e)을 제조하였다. 모든 시료들을 28 ℃에서 피셔 로토 래크로 16시간 동안 혼합하였다. 시료 1, 1e, 2, 2e, 5 및 5e를 염화 메틸렌 4 ml로 추출하였다.추출물 2 ml를 건조시키고, 메탄올 1 ml 중에 재용해시키고 HPLC 방법 3으로 분석하였다. 시료 3, 3e, 4 및 4e를 메탄올 2 ml로 희석하고 HPLC 방법 3으로 분석하였다(C-13 측쇄는 이들 중 나중의 시료들에서만 측정되었다).
표 5는 배양 말기에 존재하는 탁산 생성물의 양(mg/ml) 뿐만 아니라, 배양후 의 각각의 시료들에 남아있는 탁산 기질의 양(mg/ml)을 나타낸다. 표 5(시료 1e, 2e, 3e, 4e 및 5e를 참조)에 나타낸 바와 같이, 상기와 같이 정제된 효소는 본 명세서에 기재된 탁산 기질의 가수 분해에 의하여 C-13 측쇄를 제거하는데에 유용하다.
표 5
실시예 12
묘목 추출물의 가수 분해
택수스 히크시 묘목의 에탄올 추출물을 나노필터로 10- 내지 15배 농축시켰 다. 추출물 0.5 ml, 1M 인산 칼륨 완충액(pH 7) 0.5 ml, 노카르디오이데스 앨부스 ATCC 55425(SC 13911)(상기 실시예 11 참조)로 부터 부분 정제된 효소 54 mU 및 물 4 ml를 피셔 로토 래크상의 28 ℃에서 48시간 동안 혼합하였다. 대조 시료에는 효소를 넣지 않았다. 시료들을 염화 메틸렌으로 추출하고, 증발된 추출물을 메탄올 중에 용해시켜 HPLC 방법 2로 분석하였다. 얻은 결과를 하기 표 6에 나타낸다.
표 6
표 6에서 :
10-DAB는 10-데아세틸박카틴 Ⅲ
bacc-Ⅲ 또는 B는 박카틴 Ⅲ
ceph는 세팔로만닌
XDT는 7-크실로실-10-데아세틸탁솔
10-DAT는 10-데아세틸탁솔

Claims (43)

  1. C-10에 직접 결합된 아실옥시기를 함유하는 1종 이상의 탁산을 상기 아실옥시기를 히드록실기로 가수 분해하는 과정을 촉매화할 수 있는 노카르 디오이데스(Nocrdioides), 노카르디아(Nocardia), 로도코쿠스(Rhodococcus), 마이크로폴리스포라(Micropolyspora), 시카로폴리스포라(Saccharopolyspora), 슈도노카르디아(Pseudonocardia), 에르스코비아(Oerskovia), 프로마이크로모노스포라(Promicromonospora), 또는 인트라스포랭귐(Intrasporangium) 속으로 이루어지는군으로부터 선택되는 미생물 또는 그로부터 유도되는 효소와 접촉시키는 단계, 및 상기 가수 분해 과정을 수행하는 단계를 포함하는, C-10에 직접 결합된 히드록실 기를 함유하는 1종 이상의 탁산의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 1종 이상의 하기 식 (Ⅱ)의 C-10 아실옥시-함유 탁산 또는 그의 염을 하기 식(Ⅱ)의 R7아실옥시기를 히드록실기로 가수 분해 하는 과정을 촉매화할 수 있는 노카르디오이데스(Nocardioides), 노카르디아(Nocardia), 로도코쿠스(Rhodococcus), 마이크로폴리스포라(Micropolyspora), 사카로폴리스포라(Saccharopolyspora), 슈도노카르디아(Pseudonocardia), 에르스코비아(Oerskovia), 프로마이크로모노스포라(Promicromonospora), 또는 인트라스포랭귐(Intrasporangium) 속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물 또는 그로부터 유도되는 효소와 접촉시켜 1종 이상의 하기 식 (I)의 C-10 히드록실-함유 탁산 또 그의 염을 제조하는 방법.
    여기서,
    R1은 히드록실 또는 아실옥시이고;
    R2는 수소, 히드록실, 플루오로, R5-O-, 크실로실, R6-C(O)-O- 또는 R6-O-C(O)-O-이며;
    R3및 R4는 각각 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아릴 또는 헤테로시클로이고,
    R5는 히드록실 보호기이며;
    R6는 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아릴 또는 헤테로시클로이고;
    R7은 아실옥시이다.
  3. 제2항에 있어서, 식 (Ⅱ)의 탁산이 박카틴 Ⅲ이고, 식 (I)의 탁산이 10-데 아세틸박카틴 Ⅲ인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 가수 분해 방법에서 사용되는 아실옥시-함유 탁산 출 발 물질이 아실옥시-함유 탁산의 혼합물로 이루어진 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 탁산 혼합물이 주목과(Taxus)에 속하는 식물의 조직으 로부터 식물 세포 배양법 및(또는) 추출법에 의해 수득한 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 미생물이 노카르디오이데스 앨부스 (Nocardioides albus), 노카르디오이데스 플래부스(Nocardioides flavus), 노카르 디오이데스 풀부스(Nocardioides fulvus), 노카르디오이데스 루테우스 (Nocardioides luteus), 노카르디오이데스 심플렉스(Nocardioides simplex), 및 노카르디오이데스 더몰릴랙시누스(Nocardioides thermolilacinus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 미생물이 노카르디오이데스 앨부스(Nocardioides albus) ATCC 55424 (SC 13910), 노카르디오이데스 앨부스(Nocardioides albus) ATCC 55425 (SC 13911) 및 노카르디오이데스 루테우스(Nocardioides luteus), ATCC 55426 (SC 13912)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 효소가 노카르디오이데스 앨부스(Nocardioides albus), 노카르디오이데스 플래부스(Nocardioides flavus), 노카르디오이데스 풀 부스(Nocardioides fulvus), 노카르디오이데스 루테우스(Nocardioides luteus), 노카르디오이데스 심플렉스(Nocardioides simplex), 및 노카르디오이데스 더몰릴 랙시누스(Nocardioides thermolilacinus)로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물로 부터 유도된 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 효소가 노카르디오이데스 앨부스(Nocardioides albus), ATCC 55424 (SC 13910), 노카르디오이데스 앨부스(Nocardioides albus) ATCC, 5542S (SC 13911) 및 노카르디오이데스 루테우스(Nocardioides luteus) ATCC 55426 (SC 13912)로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물로부터 유도된 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 수득된 탁산 생성물을 C-13 아실옥시기를 함유하는 탁산의 제조에 사용하는 방법.
  11. C-10에 결합된 히드록실기를 함유하는 1종 이상의 탁산을 상기 히드록실기를 아실옥시기로 에스테르화하는 과정을 촉매화할 수 있는 노카르디오이데스(Nocardioides), 노카르디아(Nocardia), 로도코쿠스(Rhodococcus), 마이크로폴리스포라(Micropolyspora), 사카로폴리스포라(Saccharopolyspora), 슈도노카르디아(Pseudonocardia), 에르스코비아(Oerskovia), 프로마이크로모노스포라(Promicromonospora), 또는 인트라스포랭귐(Intrasporangium) 속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물 또는 그로부터 유도되는 효소 및 아실화제와 접촉시키는 단계, 및 상기 에스테르화를 수행하는 단계를 포함하는, C-10에 직접 결합된 아실옥시기를 함유하는 1종 이상의 탁산의 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서, 1종 이상의 하기 식 (I)의 C-10 히드록실-함유 탁산 또는 그의 염을 C-10 히드록실기를 하기 식 (Ⅱ)의 R7아실옥시로 에스테르화하는 과정을 촉매화할 수 있는 노카르디오이데스(Nocardioides), 노카르디아(Nocardia), 로도코쿠스(Rhodococcus), 마이크로폴리스포라(Micropolyspora), 사카로폴리스포라(Saccharopolyspora), 슈도노카르디아(Pseudonocardia), 에르스코비아(Oerskovia), 프로마이크로모노스포라(Promicromonospora), 또는 인트라스포랭귐(Intrasporangium) 속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물 또는 그로부터 유도되는 효소 및 아실화제와 접촉시켜 1종 이상의 하기 식 (Ⅱ)의 C-10 아실옥시-함유 탁산 또는 그의 염을 제조하는 방법.
    여기서,
    R1은 히드록실 또는 아실옥시이고;
    R2는 수소, 히드록실, 플루오로, R5-O-, 크실로실, R6-C(O)-O- 또는 R6-O-C(O)-O- 이며;
    R3및 R4는 각각 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아릴 또는 헤테로시클로이고;
    R5는 히드록실 보호기이며;
    R6는 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아릴 또는 헤테로 시클로이고;
    R7은 아실옥시이다.
  13. 제12항에 있어서, 식(Ⅱ)의 탁산이 박가틴 Ⅲ이고, 식(I)의 탁산이 10-데아세틸박카틴 Ⅲ인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 에스테르화 방법에서 사용되는 히드록시-함유 탁산 출발 물질이 히드록시-함유 탁산의 혼합물로 이루어진 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 탁산 혼합물이 주목과(Taxus)에 속하는 식물의 조직 으로부터 식물 세포 배양법 및(또는) 추출법에 의해 수득한 것인 방법.
  16. 제11항에 있어서, 상기 미생물이 노카르디오이데스 앨부스(Nocardioides albus), 노카르디오이데스 플래부스(Nocardioides flavus), 노카르디오이데스 풀부스(Nocardioides fulvus), 노카르디오이데스 루테우스 (Nocardioides luteus), 노카르디오이데스 심플렉스(Nocardioides simplex), 및 노카르디오이데스 더몰릴랙시누스(Nocardioides thermolilacinus)로 이루어진 군으로터 선택되는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 미생물이 노카르디오이데스 앨부스(Nocardioides albus) ATCC 55424 (SC 13910), 노카르디오이데스 앨부스(Nocardioides albus) ATCC 55425 (SC 13911) 및 노카르디오이데스 루테우스(Nocardioides luteus), ATCC 55426 (SC 13912)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  18. 제11항에 있어서, 상기 효소가 노카르디오이데스 앨부스(Nocardioides albus), 노카르디오이데스 플래부스(Nocardioides flavus), 노카르디오이데스 풀부스(Nocardioides fulvus), 노카르디오이데스 루테우스(Nocardioides luteus), 노카르디오이데스 심플렉스(Nocardioides simplex), 및 노카르디오이데스 더몰릴랙시누스(Nocardioides thermolilacinus)로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물로부터 유도된 것인 방법.
  19. 제18항에서 있어서, 상기 효소가 노카르디오이데스 앨부스(Nocardioides albus) ATCC 55424 (SC 13910), 노카르디오이데스 앨부스(Nocardioides albus) ATCC 555425 (SC 13911) 및 노카르디오이데스 루테우스(Nocardioides luteus) ATCC 55426 (SC 13912)로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물로부터 유도된 것인 방법.
  20. 제11항에 있어서, 상기 아실화제가 하기 식(IV)의 화합물인 방법.
    R11-C(O)-L (IV)
    여기서,
    R11은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 헤테로시클로이고;
    L은 치환되어 에스테르기를 형성할 수 있는 이탈기이다.
  21. 제20항에 있어서, 상기 아실화제가 비닐 아세테이트인 방법.
  22. 제11항에 있어서, 수득된 탁산 생성물을 C-13에 아실옥시기를 함유하는 탁산 의 제조에 사용하는 방법.
  23. 노카르디오이데스 루테우스(Nocardioides luteus) ATCC 55426 (SC13912)로부터 단리되는, C-10에 직접 결합된 아실옥시기를 함유하는 1종 이상의 탁산의 아실옥시기를 가수 분해시켜 C-10에 직접 결합된 히드록실기를 함유하는 탁산을 제조하거나 또는 C-10에 직접 결합된 히드록실기를 함유하는 1종 이상의 탁산의 히드록실기를 에스테르화하여 C-10에 직접 결합된 아실옥시기를 함유하는 탁산을 제조할 수 있는 효소.
  24. C-13에 직접 결합된 아실옥시기를 함유하는 1종 이상의 탁산을 상기 아실옥시기를 히드록실기로 가수 분해하는 과정을 촉매화할 수 있는노카르디오이데스(Nocardioides), 노카르디아(Nocardia), 로도코쿠스(Rhodococcus), 마이크로폴리스포라(Micropolyspora), 사카로폴리스포라(Saccharopolyspora), 슈도노카르디아(Pseudonocardia), 에르스코비아(Oerskovia), 프로마이크로모노스포라(Promicromonospora), 또는 인트라스포랭귐(Intrasporangium) 속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물 또는 그로부터 유도되는 효소와 접촉시키는 단계, 및 상기 가수 분해 과정을 수행하는 단계를 포함하는, C-13에 직접 결합된 히드록실기를 함유하는 1종 이상의 탁산의 제조 방법.
  25. 제24항에 있어서, 1종 이상의 하기 식(VI)의 C-13 아실옥시-함유 탁산 또는 그의 염을 노카르디오이데스(Nocardioides), 노카르디아(Nocardia), 로도코쿠스(Rhodococcus), 마이크로폴리스포라(Micropolyspora), 사카로폴리스포라(Saccharopolyspora), 슈도노카르디아(Pseudonocardia), 에르스코비아(Oerskovia), 프로마이크로모노스포라(Promicromonospora), 또는 인트라스포랭귐(Intrasporangium) 속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물 또는 그로부터 유도되는 효소와 접촉시켜 1종 이상의 하기 식 (V)의 C-13 히드록실-함유 탁산또는 그의 염을 제조하는 방법.
    여기서,
    R12는 수소, 히드록실, R5-O-, R6-C(O)-O-, 또는 R6-O-C(O)-O-이고;
    R2는 수소, 히드록실, 플루오로, R5-O-, 크실로실, R6-C(O)-O- 또는 R6-O-C(O)-O-이며;
    R3및 R4는 각각 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아릴, 또는 헤테로시클로이고;
    R5는 히드록실 보호기이며;
    R6는 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아릴, 또는 헤테로시클로이고;
    R7은 아실옥시이다.
  26. 제25항에 있어서, 상기 식 (VI)의 탁산이 세팔로만닌, 7-크실로실-10-데아세 틸탁솔, 10-데아세틸탁솔, 7-크실로실탁솔, 탁솔-C 및(또는) 탁솔이고, 상기 식 (V)의 탁산이 박카틴 Ⅲ, 10-데아세틸박카틴 Ⅲ, 7-크실로실-10-데아세틸박카틴 Ⅲ 및, (또는) 7-크실로실 박카틴 Ⅲ인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 가수 분해 방법에서 사용되는 아실옥시-함유 탁산 출 발 물질이 C-13에 서로 다른 측쇄를 갖는 아실옥시-함유 탁산의 혼합물로 이루어 진 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 탁산 혼합물이 주목과(Taxus)에 속하는 식물의 조직 으로부터 식물 세포 배양법 및(또는) 추출법에 의해 수득한 것인 방법.
  29. 제24항에 있어서, 상기 미생물이 노카르디오이데스 앨부스 (Nocardioides albus), 노카르디오이데스 플래부스(Nocardioides flavus), 노카르디오이데스 풀부스(Nocardioides fulvus), 노카르디오이데스 루테우스 (Nocardioides luteus), 노카르디오이데스 심플렉스(Nocardioides simplex), 및 노카르디오이데스 더몰릴랙시누스(Nocardioides thermolilacinus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 미생물이 노카르디오이데스 앨부스(Nocardioides albus) ATCC 55424 (SC 13910), 노카르디오이데스 앨부스(Nocardioides albus) ATCC 55425 (SC 13911) 및 노카르디오이데스 루테우스(Nocardioides luteus) ATCC 55426 (SC 13912)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  31. 제24항에 있어서, 상기 효소가 히드로라아제인 방법.
  32. 제24항에 있어서, 상기 효소가 노카르디오이데스 앨부스 (Nocardioides albus), 노카르디오이데스 플래부스(Nocardioides flavus), 노카르 디오이데스 풀부스(Nocardioides fulvus), 노카르디오이데스 루테우스 (Nocardioides luteus), 노카르디오이데스 심플렉스(Nocardioides simplex), 및 노카르디오이데스 더몰릴랙시누스(Nocardioides thermolilacinus)로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물로부터 유도된 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서 상기 효소가 노카르디오이데스 앨부스(Nocardioides albus) ATCC 55424 (SC 13910), 노카르디오이데스 앨부스(Nocardioides albus) ATCC 55425 (SC 13911) 및 노카르디오이데스 루테우스(Nocardioides luteus) ATCC 55426 (SC13912)로 이루어진 군으부터 선택된 미생물로부터 유도된 것인 방법.
  34. 제24항에 있어서, 상기 가수 분해에 이어서, C-13에 직접 결합된 히드록실기 (C-13 이외의 위치의 히드록실기들은 임의로는 보호되어 있음)를 함유하는 1종 이 상의 탁산을 C-13에 아실옥시 측쇄를 형성하는 화합물과 커플링시키는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 가수 분해 및 커플링을 포함하는 상기 방법에 의하여 궁극 적으로 탁솔이 제조되는 방법.
  36. (a) (i) 선별하고자 하는 미생물이 성장할 수 있고, (ii) 출발 C-13 아실 옥시-함유 탁산이 난용성이어서, 성장 배지와 혼합될 때 혼탁한 외양을 나타내며, (iii) 목적 C-13 히드록실-함유 탁산 생성물, 및 임의로는 목적하는 분열된 C-13 측쇄 생성물이 가용성이어서, 성장 배지와 혼합될 때 투명한 외양을 나타내는 고체 성장 배지를 선택하는 단계;
    (b) 출발 C-13 아실옥시-함유 탁산이 혼합되어 있고, 미생물의 성장이 일어날 수 있는 조건하에 있는, 상기 (a)단계에서 선택된 성장 배지와 미생물을 접촉시키는 단계; 및
    (c) 미생물의 성장이 일어나는 영역의 주변에, 상기 미생물이 상기 가수 분해를 일으킬 수 있다는 것을 의미하는 투명한 대역이 나타나는지를 관찰하는 단계를 포함하는, C-13에 직접 결합된 아실옥시기를 함유하는 탁산과 접촉될 때, 상기아실옥시기를 가수 분해하여 C-13에 직접 결합된 히드록실기를 형성할 수 있는 미생물의 선택 방법.
  37. (a) (i) 선별하고자 하는 미생물이 성장할 수 있고, (ii) 출발 C-13 아실 옥시-함유 탁산이 가용성이어서, 성장 배지와 혼합될 때 투명한 외양을 나타내며, (iii) 목적 C-13 히드록실-함유 탁산 생성물, 및 임의로는 목적하는 분열된 C-13 측쇄 생성물이 난용성이어서, 성장 배지와 혼합될때 혼탁한 외양을 나타내는 고체 성장 배지를 선택하는 단계;
    (b) 출발 C-13 아실옥시-함유 탁산이 혼합되어 있고, 미생물의 성장이 일어날 수 있는 조건하에 있는, 상기 (a) 단계에서 선택된 성장 배지와 미생물을 접촉시키는 단계; 및
    (c) 미생물의 성장이 일어나는 영역의 주변에, 상기 미생물이 상기 가수 분해를 일으킬 수 있다는 것을 의미하는 혼탁한 대역이 나타나는지를 관찰하는 단계를 포함하는, C-13에 직접 결합된 아실옥시기를 함유하는 탁산과 접촉될 때, 상기 아실옥시기를 가수 분해하여 C-13에 직접 결합된 히드록실기를 형성할 수 있는 미생물의 선택 방법.
  38. 생물학적으로 순수한 미생물 노카르디오이데스 앨부스(Nocardioides albus) ATCC 55424.
  39. 생물학적으로 순수한 미생물 노카르디오이데스 앨부스(Nocardioides albus) ATCC 55425.
  40. 생물학적으로 순수한 미생물 노카르디오이데스 루테우스(Nocardioides luteus) ATCC 55426.
  41. 노카르디오이데스 앨부스(Nocardioides albus) ATCC 55424로부터 단리되는, C-13에 직접 결합된 아실옥시기를 함유하는 1종 이상의 탁산의 아실옥시기를 가수 분해시켜 C-13에 직접 결합된 히드록실기를 함유하는 탁산을 제조할 수 있는 효소.
  42. 노카르디오이데스 앨부스(Nocardioides albus) ATCC 55425로부터 단리되는, C-13에 직접 결합된 아실옥시기를 함유하는 1종 이상의 탁산의 아실옥시기를 가수 분해시켜 C-13에 직접 결합된 히드록실기를 함유하는 탁산을 제조할 수 있는 효소.
  43. 노카르디오이데스 루테우스(Nocardioides luteus) ATCC 55426로부터 단리되는, C-13에 직접 결합된 아실옥시기를 함유하는 1종 이상의 탁산의 아실옥시기를 가수 분해시켜 C-13에 직접 결합된 히드록실기를 함유하는 탁산을 제조할 수 있는 효소.
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