FI112377B - Entsymaattinen hydrolyysimenetelmä C-10- ja C-13-asemaan liittyvän hydroksyyliryhmän sisältävien taksaanien valmistamiseksi, entsymaattinen esteröintimenetelmä C-10-asemaan liittyvän asyylioksiryhmänsisältävien taksaanien valmistamiseksi ja mainittujen yhdisteiden käyttö C13-asemaan liittyvän asyylioksiryhmän sisältävien taksaanien valmistamiseksi - Google Patents

Entsymaattinen hydrolyysimenetelmä C-10- ja C-13-asemaan liittyvän hydroksyyliryhmän sisältävien taksaanien valmistamiseksi, entsymaattinen esteröintimenetelmä C-10-asemaan liittyvän asyylioksiryhmänsisältävien taksaanien valmistamiseksi ja mainittujen yhdisteiden käyttö C13-asemaan liittyvän asyylioksiryhmän sisältävien taksaanien valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI112377B
FI112377B FI942794A FI942794A FI112377B FI 112377 B FI112377 B FI 112377B FI 942794 A FI942794 A FI 942794A FI 942794 A FI942794 A FI 942794A FI 112377 B FI112377 B FI 112377B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
nocardioides
microorganism
taxane
group
enzyme
Prior art date
Application number
FI942794A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI942794A (fi
FI942794A0 (fi
Inventor
Ronald L Hanson
Ramesh N Patel
Laszlo J Szarka
Original Assignee
Squibb Bristol Myers Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/077,980 external-priority patent/US5523219A/en
Priority claimed from US08/077,979 external-priority patent/US5516676A/en
Application filed by Squibb Bristol Myers Co filed Critical Squibb Bristol Myers Co
Publication of FI942794A0 publication Critical patent/FI942794A0/fi
Publication of FI942794A publication Critical patent/FI942794A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI112377B publication Critical patent/FI112377B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D305/00—Heterocyclic compounds containing four-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atoms
    • C07D305/14—Heterocyclic compounds containing four-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atoms condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/365—Nocardia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2407/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving terpenes
    • G01N2407/02—Taxol; Taxanes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Epoxy Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

χ 112377
Entsymaattinen hydrolyysimenetelmä C-10- ja C-13-asemaan liittyvän hydroksyyliryhmän sisältävien taksaanien valmistamiseksi, entsymaattinen esteröintimenetelmä C-10-asemaan liittyvän asyylioksiryhmän sisältävien taksaanien valmis-5 tamiseksi ja mainittujen yhdisteiden käyttö C-13-asemaan liittyvän asyylioksiryhmän sisältävien taksaanien valmistamiseksi Tämä keksintö koskee entsymaattista hydrolyysimene-10 telmää C-10-asemaan liittyvän hydroksyyliryhmän sisältävien taksaanien valmistamiseksi ja entsymaattista este-röintimenetelmää C-10-asemaan liittyvän asyylioksiryhmän sisältävien taksaanien valmistamiseksi, jolloin mainittuja yhdisteitä voidaan käyttää esimerkiksi välituotteina far-15 makologisesti aktiivisten taksaanien, kuten taksolin ja taksolianalogien, valmistamiseksi.
Tämä keksintö koskee myös entsymaattista hydrolyy-simenetelmää C-13-asemaan liittyvän hydroksyyliryhmän sisältävien taksaanien valmistamiseksi, jotka ovat käyttö-20 kelpoisia välituotteina C-13-asemaan liittyvän asyylioksiryhmän sisältävien taksaanien valmistuksessa ja erityises-ti myös taksolin ja taksolianalogien valmistuksessa.
Taksaanit ovat diterpeeniyhdisteitä, joilla on käyttöä farmaseuttisella alueella. On havaittu, että esi-25 merkiksi taksoli, eräs taksaani, jolla on rakenne: '1 t
AcO m OH
30 1
I II ä H
ph^.N O HO Ote 0Ac
o T
o • » » · » 2 112377 jossa Ph on fenyyli, Ac on asetyyli ja Bz on bentsoyyli, on tehokas syöpää vastustava aine.
Luonnossa esiintyviä taksaaneja, kuten taksolia, voidaan löytää kasvimateriaaleista, joista niitä on eris-5 tetty. Tällaisia taksaaneja voi kuitenkin olla kasvimateriaaleissa suhteellisen pieniä määriä siten, että esimerkiksi taksolin tapauksessa voidaan tarvita suuri joukko hitaasti kasvavia marjakuusia, jotka muodostavat yhdisteen lähteen. Alalla yritetään siten jatkuvasti etsiä synteet-10 tisiä, mukaan luettuna puolisynteettisiä, teitä luonnossa esiintyvien taksaanien, kuten taksolin, valmistamiseksi sekä niiden analogien valmistamiseksi.
Johtuen taksaanirenkaan rakenteen monimutkaisuudesta taksaania, joka sisältää rengasjärjestelmässä toivotut 15 substituentit, voidaan valmistaa vaivattomammin käyttämällä lähtöainetta, jolla on jo taksaanirenkaan perusrakenne. Siten esimerkiksi yhdiste, jolla on taksaanirengasrakenne ja joka sisältää hydroksyyliryhmän C-13-asemaan liittyen ja erityisesti myös halutun substituentin C-10-asemaan 20 liittyen, voidaan kytkeä välituoteyhdisteeseen taksaanin muodostamiseksi, jolla on haluttu sivuketju C-13-asemaan :· liittyen, kuten farmakologisesti aktiivinen taksaani, jol- la on C-13-asemaan liittyvä asyylioksisivuketju ja josta on esimerkkinä taksoli ja sen analogit.
: 25 Tämä keksintö tuottaa menetelmät taksaanien saami seksi, joilla on halutut substituentit liittyen C-10-ase-maan. Erityisesti tämä keksintö tuottaa menetelmät C-10- ’ asemaan liittyvän hydroksyyliryhmän sisältävien ja C-10- asemaan liittyvän asyylioksiryhmän sisältävien taksaaniyh- # t t i \* 30 disteiden valmistamiseksi, joilla on käyttöä lähtöaineina 'ti ' taksaanien, kuten taksolin ja sen analogien, valmistukses- sa.
#!..t Yhdessä suoritusmuodossa tämä keksintö tuottaa me- * » ‘1* netelmän vähintään yhden taksaanin valmistamiseksi, joka ·.’· 35 sisältää hydroksyyliryhmän suoraan C-10-asemaan sitoutu- 112377 3 neena, jolloin menetelmässä vähintään yksi taksaani, joka sisältää asyylioksiryhmän suoraan C-10-asemaan sitoutuneena, saatetaan kosketukseen entsyymin tai mikro-organismin kanssa, joka kykenee katalysoimaan mainitun asyylioksiryh-5 män hydrolyysin hydroksyyliryhmäksi, ja toteutetaan mainittu hydrolyysi.
Toisessa suoritusmuodossa tämä keksintö tuottaa menetelmän vähintään yhden taksaanin valmistamiseksi, joka sisältää asyylioksiryhmän suoraan C-10-asemaan sitoutunee-10 na, jolloin menetelmässä vähintään yksi taksaani, joka sisältää hydroksyliryhmän suoraan C-10-asemaan sitoutuneena, saatetaan kosketukseen asyloivan aineen ja entsyymin tai mikro-organismin kanssa, joka kykenee katalysoimaan mainitun hydroksyyliryhmän esteröinnin asyylioksiryhmäksi, ja 15 toteutetaan mainittu esteröinti.
Tämä keksintö tuottaa lisäksi menetelmän C-13-ase-maan liittyvän hydroksyyliryhmän sisältävien taksaanien valmistamiseksi, joilla on käyttöä lähtöaineina valmistettaessa taksaaneja, joilla on haluttu sivuketju C-13-ase-20 maan liittyen.
Erityisesti tämä keksintö tuottaa menetelmän vähin- J. tään yhden taksaanin valmistamiseksi, joka sisältää hyd roksyyliryhmän suoraan C-13-asemaan sitoutuneena, jolloin menetelmässä vähintään yksi taksaani, joka sisältää asyy-. 25 lioksiryhmän suoraan C-13-asemaan sitoutuneena, saatetaan kosketukseen entsyymin tai mikro-organismin kanssa, joka *;;; kykenee katalysoimaan mainitun asyylioksiryhmän hydrolyy- * < » '·' sin hydroksyyliryhmäksi, ja toteutetaan mainittu hydrolyy si.
• * I
• *,· 30 Tämä keksintö tuottaa tehokkaat menetelmät C-10- !i( ! asemaan liittyvän hydroksyyliryhmän sisältävien taksaanien ,··. valmistamiseksi C-10-asemaan liittyvän asyylioksiryhmän • * * !. t sisältävistä taksaaneista ja C-10-asemaan liittyvän asyy- ( | ; lioksiryhmän sisältävien taksaanien valmistamiseksi C-10- : 35 asemaan liittyvän hydroksyyliryhmän sisältävistä taksaa- , 112377 4 neista. Voidaan hydrolysoida yksi taksaani tai erilaisten taksaanien seos voidaan hydrolysoida peräkkäin tai samanaikaisesti tämän keksinnön mukaisesti; samaten yksittäinen taksaani voidaan esteröidä tai erilaisten taksaanien seos 5 voidaan esteröidä peräkkäin tai samanaikaisesti tämän keksinnön mukaisesti.
Tämä keksintö tuottaa lisäksi tehokkaan menetelmän C-13-asemaan liittyvän hydrokyyliryhmän sisältävien taksaanien valmistamiseksi C-13-asemaan liittyvän asyylioksi- 10 ryhmän sisältävistä taksaaneista. Tämän keksinnön mukaisesti voidaan hydrolysoida yksittäinen taksaani tai erilaisten taksaanien seos voidaan hydrolysoida peräkkäin tai samanaikaisesti.
Seuraavassa tätä keksintöä kuvataan edelleen.
15 C-10-asemaan liittyvä hydrolyysi
Edullisessa suoritusmuodossa tämä keksintö tuottaa menetelmän vähintään yhden C-10-asemaan liittyvän hydrok-syyliryhmän sisältävän taksaanin valmistamiseksi, jolla on seuraava kaava I: 20 , H0\_l
25 R
OH \ 0-C(0)R3 , ,t 0-C(0)R4 v ‘ jossa R1 on hydroksyyli tai asyylioksi, erityisesti kun i’·’: 30 radikaalilla R1 on jäljempänä kuvattu kaavan III mukainen • | ; rakenne; R2 on vety, hydroksyyli, fluori, R5-0-, ksylosyyli, * R6-C(0)-0- tai R6-0-C(0)-0-; • · » » i i < , 112377 5 R3 ja R4 ovat toisistaan riippumatta vety, alkyyli, alkenyyli, alkynyyli, sykloalkyyli, sykloalkenyyli, aryyli tai heterosyklo; R5 on hydroksyyliä suojaava ryhmä; ja 5 R6 on vety, alkyyli, alkenyyli, alkynyyli, sykloal kyyli, sykloalkenyyli, aryyli tai heterosyklo; tai sen suolojen valmistamiseksi, jolloin vähintään yksi C-10-asemaan liittyvän asyy-lioksiryhmän sisältävä taksaani, jolla on seuraava kaava 10 II: vJ R2 15 Ri OH \ Ö-C(0)R3 0-C(0)R4 jossa 20 R1, R2, R3 ja R4 ovat kuten edellä on määritelty ja R7 on asyylioksi; tai sen suolat, saatetaan kosketukseen entsyymin tai mikro-organismin kanssa, joka kykenee kata-lysoimaan mainitun R7-asyylioksiryhmän hydrolyysin hydrok-syyliryhmän muodostamiseksi, ja toteutetaan mainittu hyd-25 rolyysi.
Kaavojen I ja II mukaisten yhdisteiden lähemmin . !!* erittelemättömien kiraalisten keskusten kaikki stereokon- figuraatiot ovat mahdollisia tämän keksinnön hydrolyysime-netelmässä joko yksin (so. olennaisilta osin vapaina muis-’· : 30 ta stereoisomeereista) tai seoksena muiden stereoisomee- risten muotojen kanssa.
Toisessa edullisessa suoritusmuodossa tämä keksintö * ♦ « i 1 * tuottaa menetelmän vähintään yhden taksaanin valmistami-’ seksi, jolla on haluttu C-10-asemaan liittyvä asyylioksi- 35 ryhmä, vähintään yhdestä toisesta taksaanista, jolla on 112377 6 ei-haluttu C-10-asemaan liittyvä asyylioksiryhmä, hydrolysoimalla jälkimmäinen entsymaattisesti vähintään yhden C-10-asemaan liittyvän hydroksyyliryhmän sisältävän analogin tuottamiseksi tässä kuvatun menetelmän avulla ja sen 5 jälkeen kytkemällä haluttu asyyliryhmä siihen edellisen tuottamiseksi. Tässä suoritusmuodossa tämä keksintö tuottaa esimerkiksi menetelmän halutun taksaanin valmistamiseksi, jolla on erityinen C-10-asemaan liittyvä asyyliok-siryhmä, erilaisia C-10-asemaan liittyviä asyylioksiryhmiä 10 sisältävien taksaanien lähtöaineseoksesta, joka saattaa sisältää halutun taksaanin tai ei sisällä sitä, hydrolysoimalla erilaiset C-10-asemaan liittyvät ryhmät samanaikaisesti tai peräkkäin yhden tai useamman taksaanin tuottamiseksi, jolla on C-10-asemaan liittyvä hydroksyyliryh-15 mä, ja kytkemällä sitten haluttu asyyliryhmä siihen. Tämä edullinen menetelmä on erityisen käyttökelpoinen, silloin kun saadaan erilaisia C-10-asemaan liittyviä asyylioksiryhmiä sisältävien taksaanien seos, esim. uuttamalla kasvimateriaaleja, jolloin saadaan taksoli seoksessa muiden 20 luonnossa tuotettujen taksaanien kanssa ja kun lopputuotteena halutaan erityinen taksaani, kuten taksoli. •j. Asyyliryhmän kytkentä voidaan toteuttaa käyttäen ei-entsy- lit* maattisia menetelmiä asyyliryhmien muodostamiseksi. Esi- * * · ;·, merkiksi C-7-suojattu 10-desasetyylibakkatiini III (joka • * t . 25 on suojattu C-7-asemaan liittyen esimerkiksi trietyylisi- ' ,* lyylillä, mikä on saatu aikaan saattamalla 10-desasetyyli- ·;;; bakkatiini III kosketukseen trietyylisilyylikloridin ja * 4 · *·* ‘ imidatsolin kanssa dimetyyliformamidissa) voidaan asyloida C-10-asemaan liittyen saattamalla se kosketukseen litium-i ',· 30 heksametyylidisilatsidin kanssa tetrahydrofuraanissa, jos- : sa on litiumkloridia/asetyylikloridia, matalassa lämpöti- lassa, esim. -60 - 70 °C:n lämpötilassa. Vaihtoehtoisesti asyyliryhmän kytkentä voidaan toteuttaa käyttäen tässä I « kuvattua entsymaattista esteröintimenetelmää.
* 4
»II
» > * »
I t I
112377 7 Tämän keksinnön menetelmässä lähtöainetaksaanin C-10-asemaan liittyvän asyylioksiryhmän stereokonfiguraa-tio säilytetään edullisesti C-10-asemaan liittyvän hydrok-syyliryhmän sisältävässä tuotteessa.
5 Esteröinti C-10-asemaan liittyen
Toisessa edullisessa suoritusmuodossa tämä keksintö tuottaa menetelmän vähintään yhden C-10-asemaan liittyvän asyylioksiryhmän sisältävän taksaanin valmistamiseksi, jolla on seuraava kaava II: 10 2
>_J R
15 R
OH \ 0-C(0)R3 0-C(0)R4 jossa R1 on hydroksyyli tai asyylioksi, erityisesti kun 20 ryhmällä R1 on jäljempänä kuvatun kaavan III mukainen rakenne ; R2 on vety, hydroksyyli, fluori, R5-0-, ksylosyyli, R6-C(0)-0- tai R6-0-C(0)-0-; R3 ja R4 ovat toisistaan riippumatta vety, alkyyli,
< I I
. 25 alkenyyli, alkynyyli, sykloalkyyli, sykloalkenyyli, aryyli ‘ tai heterosyklo; < · 1 ;;; R5 on hydroksyyliä suojaava ryhmä; *·' 1 R6 on vety, alkyyli, alkenyyli, alkynyyli, syklo alkyyli, sykloalkenyyli, aryyli tai heterosyklo; ja I 1 30 R7 on asyylioksi; ? : tai sen suolojen valmistamiseksi; jolloin menetelmässä saatetaan kosketukseen vähin- > « » tään yksi C-10-asemaan liittyvän hydroksyyliryhmän sisäl- * » tävä taksaani, jolla on seuraava kaava I: » » I 1 · * It * t · * » * t t 8 112377 HO? R2 5 *' \Λ-Υην)<> OH \ 0-C(O)R3 0-C(0)R4 jossa 10 R1, R2, R3 ja R4 ovat kuten edellä on määritelty, tai sen suolat, asyloivan aineen ja entsyymin tai mikro-organismin kanssa, joka kykenee katalysoimaan C-10-asemaan liittyvän hydroksyyliryhmän esteröinnin mainitun R7-asyyli-oksiryhmän muodostamiseksi, ja toteutetaan mainittu este-15 röinti.
Kaavojen I ja II mukaisten yhdisteiden tarkemmin määrittelemättömien kiraalisten keskusten kaikki stereo-konfiguraatiot ovat mahdollisia tämän keksinnön esteröin-timenetelmässä joko yksin (so. olennaisilta osin vapaina 20 muista stereoisomeereista) tai seoksena muiden stereoiso-meeristen muotojen kanssa.
Voidaan käyttää mitä tahansa asyloivaa ainetta, joka saa aikaan tämän keksinnön esteröinnin. Edullisia asy- t loivia aineita ovat aineet, joilla on seuraava kaava IV: 25 ' : R11-C( 0) -L (IV) ·’ jossa R11 on alkyyli, alkenyyli, alkynyyli, aryyli, syklo-: 30 alkyyli, sykloalkenyyli tai heterosyklo, ja : L on poistuva ryhmä, joka voidaan siirtää paikal taan esteriryhmän muodostamiseksi.
Kaavan IV mukaista yhdistettä varten edullisia Ru-'·; ryhmiä ovat alkyyliryhmät, kuten C^g-alkyyliryhmät, erityi- : * ; 35 sesti metyyli. Esimerkillisiin L-ryhmiin sisältyvät halo- geeniatomit, hydroksyyli-, alkoksi- tai alkenyylioksiryh- > * i 112377 9 mät. Edullisia L-ryhmiä ovat alkenyylioksiryhmät, edullisimmin C^-alkenyylioksiryhmät, kuten CH2*CH-0- ja CH2*C-(CH3)-0-. Isopropenyyliasetaatti ja vinyyliasetaatti ovat erityisen edullisia asyloivia aineita.
5 Tämän keksinnön menetelmässä lähtöainetaksaanin C-10-asemaan liittyvän hydroksyyliryhmän stereokonfiguraa-tio säilyy edullisesti C-10-asemaan liittyvän asyylioksi-ryhmän sisältävässä tuotteessa.
C-13-asemaan liittyvä hydrolyysi 10 Edullisessa suoritusmuodossa tämä keksintö tuottaa menetelmän vähintään yhden C-13-asemaan liittyvän hydroksyyliryhmän sisältävän taksaanin valmistamiseksi, jolla on seuraava kaava V: 15 r12 II R2 20 OH \ Ö-C(0)R3 0-C(0)R4 jossa R12 on vety, hydroksyyli, R5-0-, R6-C(0)-0- tai R*-0-C(0)-0-; ’ 25 R2 on vety, hydroksyyli, fluori, R5-0-, ksylosyyli, : R6-C(0)-0- tai R6-0-C(0)-0-; . R3 ja R4 ovat toisistaan riippumatta vety, alkyyli, V * alkenyyli, alkynyyli, sykloalkyyli, sykloalkenyyli, aryyli tai heterosyklo; ' ; 30 R5 on hydroksyyliä suojaava ryhmä; ja ;'*R6 on vety, alkyyli, alkenyyli, alkynyyli, sykloalkyyli, sykloalkenyyli, aryyli tai heterosyklo; tai sen suolojen valmistamiseksi, jolloin saatetaan ·;·’ kosketukseen vähintään yksi C-13-asemaan liittyvän asyyli- : 35 oksiryhmän sisältävä taksaani, jolla on seuraava kaava VI: 112377 10
12 O
OH \ Ö-C(0)R3 0-C(0)R4 jossa R12, R2, R3 ja R4 ovat kuten edellä on määritelty ja 10 R7 on asyylioksi, tai sen suolat, entsyymin tai mikro-organismin kanssa, joka kykenee katalysoimaan mainitun R7-asyy-lioksiryhmän hydrolyysin hydroksyyliryhmän muodostamiseksi, ja toteutetaan mainittu hydrolyysi.
Kaavojen V ja VI mukaisten yhdisteiden tarkemmin 15 määrittelemättömien kiraalisten keskusten kaikki stereo-konfiguraatiot ovat mahdollisia tämän keksinnön menetelmässä joko yksin (so. olennaisilta osin vapaina muista stereoisomeereista) tai seoksena muiden stereoisomeeristen muotojen kanssa.
20 Toisessa edullisessa suoritusmuodossa tämä keksintö tuottaa menetelmän vähintään yhden taksaanin valmistamiseksi, jolla on haluttu C-13-asemaan liittyvä asyylioksi-sivuketju, vähintään yhdestä toisesta taksaanista, jolla on ei-toivottu C-13-asemaan liittyvä asyylioksisivuketju, 25 hydrolysoimalla jälkimmäinen entsymaattisesti vähintään j yhden C-13-asemaan liittyvän hydroksyyliryhmän sisältävän ;· analogin valmistamiseksi käyttäen tässä kuvattua menetel- mää ja sen jälkeen kytkemällä haluttu sivuketju siihen jälkimmäisen tuottamiseksi. Tässä suoritusmuodossa tämä 30 keksintö tuottaa esimerkiksi menetelmän halutun taksaanin .··*. valmistamiseksi, jolla on erityinen C-13-asemaan liittyvä j asyylioksisivuketju, erilaisia C-13-asemaan liittyviä asyylioksisivuketjuja sisältävien taksaanien lähtöaine-·...’ seoksesta, joka voi sisältää halutun taksaanin tai ei si- 35 säilä sitä, hydrolysoimalla samanaikaisesti tai peräkkäin 11 1 1237'/ erilaiset C-13-asemaan liittyvät ryhmät yhden tai useamman taksaanin valmistamiseksi, jolla on C-13-asemaan liittyvä hydroksyyliryhmä, ja sen jälkeen kytkemällä haluttu sivu-ketju siihen. Tämä edullinen menetelmä on erityisen käyt-5 tökelpoinen silloin, kun saadaan erilaisia C-13-asemaan liittyviä asyylioksisivuketjuja sisältävien taksaanien seos, esim. uuttamalla kasvimateriaaleja, jolloin taksoli saadaan seoksena kefalomanniinin ja muiden luonnon tuottamien taksaaninen kanssa, ja kun lopputuloksena halutaan 10 erityinen taksaani, kuten taksoli.
Tämän keksinnön menetelmässä lähtöainetaksaanin C-13-asemaan liittyvän asyylioksiryhmän stereokonfiguraa-tio säilyy edullisesti C-13-asemaan liittyvän hydroksyyli-ryhmän sisältävässä lopputuotteessa.
15 Määritelmät Tässä käytettynä termit "entsymaattinen prosessi" tai "entsymaattinen menetelmä" tarkoittaa tämän keksinnön prosessia tai menetelmää, jossa käytetään entsyymiä tai mikro-organismia. Tässä käytettynä termi "hydrolyysi" tar-20 koittaa hydroksyyliryhmän muodostamista asyylioksiryhmästä ja se voidaan toteuttaa esimerkiksi saattamalla asyyliok-siryhmä kosketukseen veden ja/tai sopivan orgaanisen alko-holin kanssa tämän keksinnön menetelmän mukaisesti. Tässä käytettynä termi "esteröinti" tarkoittaa asyylioksiryhmän . 25 muodostamista hydroksyyliryhmästä. Tässä käytettynä termi ‘ "asyloiva aine" tarkoittaa yhdistettä, joka kykenee saa- maan aikaan edellä mainitun esteröinnin tuottamalla asyy-’·’ liryhmän. "Entsyymin tai mikro-organismin" käyttö tämän keksinnön menetelmissä sisältää kahden tai useamman, sekä • 30 yksittäisen entsyymin tai mikro-organismin käytön.
: Tässä käytettynä termit "alkyyli" tai "alk" yksin .···, tai osana muuta ryhmää tarkoittavat mahdollisesti substi- tuoituja, suoraketjuisia tai haaroittuneita, tyydyttyneitä a i hiilivetyryhmiä, joilla on edullisesti 1-12 hiiliatomia · 35 normaalissa ketjussa. Esimerkkeihin tällaisista substi- • » •« » 12 112377 tuoimattomista ryhmistä sisältyvät metyyli, etyyli, pro-pyyli, isopropyyli, n-butyyli, t-butyyli, isobutyyli, pen-tyyli, heksyyli, isoheksyyli, heptyyli, 4,4-dimetyylipen-tyyli, oktyyli, 2,2,4-trimetyylipentyyli, nonyyli, dekyy-5 li, undekyyli, dodekyyli ja vastaavat. Esimerkillisiin substituentteihin voi sisältyä yksi tai useampi seuraavis-ta ryhmistä: halogeeni, alkoksi, alkyylitio, alkenyyli, alkynyyli, aryyli, sykloalkyyli, sykloalkenyyli, hydroksi tai suojattu hydroksi, karboksyyli (-COOH), alkyylioksi-10 karbonyyli, alkyylikarbonyylioksi, karbamoyyli (NH2-C0-), amino (-NH2), mono- tai dialkyyliamino tai tioli (-SH).
Tässä käytettynä termit "alempi alk" tai "alempi alkyyli" yksin tai osana muuta ryhmää tarkoittavat tällaisia mahdollisesti substituoituja ryhmiä, kuten edellä on 15 kuvattu alkyylinä, jolla on 1 - 4 hiiliatomia normaalissa ketjussa.
Tässä käytettynä termit "alkoksi" tai "alkyylitio" yksin tai osana muuta ryhmää tarkoittavat alkyyliryhmää, kuten edellä on kuvattu, sitoutuneena happisidoksen (-0-) 20 tai rikkisidoksen (-S-) kautta vastaavasti. Tässä käytettynä termi "alkyylioksikarbonyyli" yksin tai osana muuta t‘|* ryhmää tarkoittaa alkoksiryhmää, joka on sitoutunut karbo- nyyliryhmän kautta. Tässä käytettynä termi "alkyylikarbo-,nyylioksi" yksin tai osana muuta ryhmää tarkoittaa alkyy- ; | 25 liryhmää, joka on sitoutunut karbonyyliryhmän kautta, joka • » puolestaan on sitoutunut happisidoksen kautta. Tässä käy- .;*t tettynä termit "monoalkyyliamino" tai "dialkyyliamino" yk- * · · sin tai osana muuta ryhmää tarkoittavat aminoryhmää, joka on substituoitu yhdellä tai kahdella alkyyliryhmällä, ku- • ·* 30 ten edellä on kuvattu.
Tässä käytettynä termi "alkenyyli" yksin tai osana muuta ryhmää tarkoittaa mahdollisesti substituoituja ryh- i.. miä, jotka ovat kuten edellä on kuvattu alkyylin yhteydes- • t sä ja sisältävät lisäksi vähintään yhden hiili-hiili-kak-'· 35 soissidoksen. Esimerkillisiin substituentteihin sisältyvät I « » 112377 13 yksi tai useampi alkyyliryhmä, kuten edellä on kuvattu, ja/tai yksi tai useampi ryhmä, joka on kuvattu edellä al-kyylisubstituentteina. Tässä käytettynä termi "alkenyyli-oksi" yksin tai osana muuta ryhmää tarkoittaa alkenyyli-5 ryhmää, kuten dellä on kuvattu, sitoutuneena happisidoksen (-0-) kautta.
Tässä käytettynä termi "alkynyyli" yksin tai osana muuta ryhmää tarkoittaa mahdollisesti substituoituja ryhmiä, jotka ovat kuten edellä on kuvattu alkyylin yhteydes-10 sä ja sisältävät lisäksi vähintään yhden hiili-hiili-kol-moissidoksen. Esimerkillisiin substituentteihin sisältyvät yksi tai useampi alkyyliryhmä, kuten edellä on kuvattu, ja/tai yksi tai useampi ryhmä, kuten edellä on kuvattu al-kyylisubstituentteina. Tässä käytettynä termi "alkynyyli-15 oksi" yksin tai osana muuta ryhmää tarkoittaa alkynyyli-ryhmää, kuten edellä on kuvattu, sitoutuneena happisidoksen (-0-) kautta.
Tässä käytettynä termi "sykloalkyyli" yksin tai osana muuta ryhmää tarkoittaa mahdollisesti substituoituja 20 tyydyttyneitä karbosyklisiä rengasjärjestelmiä, jotka sisältävät edullisesti 1-3 rengasta ja 3 - 7 hiiliatomia ·*· rengasta kohden. Tällaisiin esimerkillisiin substituoimat- :·. torniin ryhmiin sisältyvät syklopropyyli, syklobutyyli, syklopentyyli, sykloheksyyli, sykloheptyyli, syklo-oktyy-•t . 25 li, syklodekyyli, syklododekyyli ja adamantyyli. Esimer killisiin substituentteihin sisältyvät yksi tai useampi » < · ·;;; alkyyliryhmä, kuten edellä on kuvattu, ja/tai yksi tai *·' ’ useampi ryhmä, kuten edellä on kuvattu alkyylisubstituent- teina. Tässä käytettynä termi "sykloalkyylioksi" yksin tai • * • 30 osana muuta ryhmää tarkoittaa sykloalkyyliryhmää, kuten • · · edellä on kuvattu, sitoutuneena happisidoksen (-O-) kaut-. ·: ·. ta.
Tässä käytettynä termi "sykloalkenyyli" yksin tai » · osana muuta ryhmää tarkoittaa sellaisia mahdollisesti !/*· 35 substituoituja ryhmiä, jotka ovat kuten edellä on kuvattu • » » * t 14 112377 sykloalkyylin yhteydessä ja sisältävät lisäksi vähintään yhden hiili-hiili-kaksoissidoksen muodostaen osittain tyy-dyttymättömän renkaan. Esimerkillisiin substituentteihin sisältyvät yksi tai useampi alkyyliryhmä, kuten edellä on 5 kuvattu, ja/tai yksi tai useampi ryhmä, kuten edellä on kuvattu alkyylisubstituentteina. Tässä käytettynä termi "sykloalkenyylioksi" yksin tai osana muuta ryhmää tarkoittaa sykloalkenyyliryhmää, kuten edellä on kuvattu, sitoutuneena happisidoksen (-O-) kautta.
10 Tässä käytettynä termit "ar" tai "aryyli" yksin tai osana muuta ryhmää tarkoittavat mahdollisesti substituoi-tuja, karbosyklisiä aromaattisia ryhmiä, jotka sisältävät edullisesti 1 tai 2 rengasta ja 6 - 12 renkaan hiiliatomia. Tällaisiin esimerkillisiin substituoimattomiin ryh-15 miin sisältyvät fenyyli, bifenyyli ja naftyyli. Esimerkillisiin substituentteihin sisältyvät yksi tai useampi, edullisesti kolme tai alle kolme, nitroryhmää, alkyyliryh-mää, kuten edellä on kuvattu, ja/tai ryhmää, kuten edellä on kuvattu alkyylisubstituentteina. Tässä käytettynä termi 20 "aryylioksi" yksin tai osana muuta ryhmää tarkoittaa aryy-liryhmää, kuten edellä on kuvattu, sitoutuneena happisi- ·· doksen (-0-) kautta.
* Tässä käytettynä termit "heterosyklo" tai "hetero-syklinen" yksin tai osana muuta ryhmää tarkoittavat mah- t t · ; 25 dollisesti substituoituja, täysin tyydyttyneitä tai tyy- » ? · dyttymättömiä, aromaattisia tai ei-aromaattisia syklisiä * ryhmiä, joilla on vähintään yksi heteroatomi ainakin yh- ’·' ’ dessä renkaassa, edullisesti monosyklisiä tai bisyklisiä ryhmiä, joilla on 5 tai 6 atomia kussakin renkaassa. Hete- : .·’ 30 rosykloryhmällä voi olla esimerkiksi 1 tai 2 happiatomia, 1 tai 2 rikkiatomia ja/tai 1-4 typpiatomia renkaassa.
Jokainen heterosykloryhmä voi olla sitoutunut minkä tahan- ,···, sa rengasjärjestelmän hiili- tai heteroatomin kautta. Esi- • » *!‘ merkillisiin heterosykloryhmiin sisältyvät seuraavat: tie- ’ i 35 nyyli, furyyli, pyrrolyyli, pyridyyli, imidatsolyyli, pyr- » I » „ 112377 lb rolidinyyli, piperidinyyli, atsepinyyli, indolyyli, isoin-dolyyli, kinolinyyli, isokinolinyyli, bentsotiatsolyyli, bentsoksatsolyyli, bentsimidatsolyyli, bentsoksadiatsolyy-li ja bentsofuratsanyyli. Esimerkillisiin substituenttei-5 hin sisältyvät yksi tai useampi alkyyliryhmä, kuten edellä on kuvattu, ja/tai yksi tai useampi ryhmä, kuten edellä on kuvattu alkyylisubstituentteina. Tässä käytettynä termi "heterosyklo-oksi" yksin tai osana muuta ryhmää tarkoittaa heterosykloryhmää, kuten edellä on kuvattu, sitoutuneena 10 happisidoksen (-0-) kautta.
Tässä käytettynä termit "halogeeni" tai "halo" yksin tai osana muuta ryhmää tarkoittavat klooria, bromia, fluoria tai jodia.
Tässä käytettynä termi "taksaani" tarkoittaa yhdis-15 teitä, jotka sisältävät taksaaniosuuden, kuten seuraavassa on kuvattu. Tässä käytettynä termi "taksaaniosuus" tarkoittaa osuuksia, jotka sisältävät ydinrakenteen (tässä käytetty rengasjärjestelmän asemien numerointi on esitet- 20 tY>: (n 15T ch3 s^5j : 12 CH^ # * * \ . 25 joka voi olla substituoitu ja voi olla etyleenisesti tyy- « · · * ’’ dyttymätön rengasjärjestelmässä. Edullisia ovat sellaiset • · · ·;;· osuudet, joilla on oksetaanirengas fuusioituneena 4- ja
I I I
' 5-asemiin liittyen, kuten taksolissa on havaittu olevan.
Tässä käytettynä termi "hydroksia (tai hydroksyy- t · · • *,·* 30 liä) suojaava ryhmä" tarkoittaa mitä tahansa ryhmää, joka : ; kykenee suojaamaan vapaata hydroksyyliryhmää ja joka reak tion jälkeen, jossa sitä käytetään, voidaan poistaa häi-ritsemättä molekyylin jäljellä olevaa osaa. Tällaiset ryh-mät ja niiden synteesit voidaan löytää teoksesta "Pro- I f t 112377 16 tective Groups In Organic Synthesis", T. W. Greene, John Wiley & Sons, 1981, tai Fieser & Fieser.
Tässä käytettynä termi "suola" sisältää happamat ja/tai emäksiset suolat, jotka on muodostettu epäorgaanis-5 ten ja/tai orgaanisten happojen ja emästen kanssa.
Tässä käytettynä termi "asyyli" yksin tai osana muuta ryhmää tarkoittaa osuutta, joka on muodostettu poistamalla hydroksyyliryhmä orgaanisen karboksyylihapon -COOH-ryhmästä. Tässä käytettynä termi "asyylioksi" yksin 10 tai osana muuta ryhmää tarkoittaa asyyliryhmää, kuten edellä on kuvattu, sitoutuneena happisidoksen (-0-) kautta.
Lähtöaineet C-10-asemaan liittyvää muuntamista varten 15 C-10-asemaan liittyvän asyylioksiryhmän ja C-10- asemaan liittyvän hydroksiryhmän sisältävät taksaanit, joita käytetään lähtöaineina tässä keksinnössä, voivat olla mitä tahansa yhdisteitä, jotka kykenevät läpikäymään vastaavasti tämän keksinnön entsymaattisen hydrolyysi- ja 20 esteröintimenetelmän. Lähtöaineet voivat olla synteettisesti muodostettuja taksaaneja tai edullisesti luonnol-• j. lisesti muodostettuja taksaaneja, kuten kefalomanniini, 7-ksylosyylitaksoli, taksoli, bakkatiini III, 10-desas- * * » :·. etyylibakkatiini III tai taksoli C (taksolin analogi, jos- • · · . 25 sa C-13-asemaan liittyvän taksolisivuketjun bentsoyyliryh- • « · * ,* mä on korvattu n-pentanoyyliryhmällä) yksin tai seoksena *;;; toistensa kanssa. "Luonnollisesti muodostetut" taksaani- ' lähtöaineet saadaan edullisesti taksaania tuottavien kas- vikudosten kasvisoluviljelmien avulla ja/tai uuttamalla * ’.· 30 mainituista kudoksista, jolloin mainitut kasvikudokset ί ϊ ovat erityisesti kudoksia, jotka on saatu tai ovat peräi- sin Taxus-suvun kasveista, kuten Taxus baccatasta, Taxus cuspidatasta, Taxus brevifoliasta, Taxus Wallichianasta, * · *1' Taxus mediasta, Taxus hicksiista, erityisesti Taxus x.
• t * * * > · 112377 17 media hicksiista. Esimerkillisiin kasvikudoksiin sisältyvät neulaset, kuori ja koko taimi.
Edulliset menetelmät tämän keksinnön C-10-asemaan liittyvän hydroksi- ja asyyliryhmän sisältävien taksaani-5 lähtöaineiden saamiseksi löytyvät julkaisuista Rao, Pharmaceutical Research, 10, 521 - 524 (1993); Kingston, Phar-mac. Ther., 52, 1-34 (1991) tai tässä esitetyistä esimerkeistä .
Lähtöaineet C-13-asemaan liittyvää muuntamista var- 10 ten C-13-asemaan liittyvän asyylioksiryhmän sisältävät taksaanit, joita käytetään lähtöaineina tässä keksinnössä, voivat olla mitä tahansa yhdisteitä, jotka kykenevät läpikäymään tämän keksinnön entsymaattisen hydrolyysin. Lähtö-15 aineet voivat olla synteettisesti muodostettuja taksaaneja tai edullisesti luonnollisesti muodostettuja taksaaneja, kuten kefalomanniini, 7-ksylosyylitaksoli, taksoli, 7-ksy-losyyli-10-desasetyylitaksoli, 10-desasetyylitaksoli tai taksoli C yksin tai seoksena toistensa kanssa. "Luonnolli-20 sesti muodostetut" taksaanilähtöaineet saadaan edullisesti taksaania tuottavien kasvikudosten kasvisoluviljelmien ,·♦ avulla ja/tai uuttamalla mainituista kudoksista, jolloin mainitut kasvikudokset ovat erityisesti kudoksia, jotka on saatu tai ovat peräisin Taxus-suvun kasveista, kuten Taxus ,·. · 25 baccatasta, Taxus cuspidatasta, Taxus brevifoliasta, Taxus • · *
Wallichianasta, Taxus mediasta, Taxus hicksiista, erityi-sesti Taxus x. media hicksiista. Esimerkillisiin kasviku-·’ doksiin sisältyvät neulaset, kuori ja koko taimi.
Edulliset menetelmät tämän keksinnön C-13-aseraaan : *.· 30 liittyvän asyylioksiryhmän sisältävien taksaanilähtöainei- den saamiseksi löytyvät julkaisuista Rao, Pharmaceutical Research, 10, 521 - 524 (1993); Kingston, Pharmac. Ther., ,···, 52, 1 - 34 (1991) tai tässä esitetyistä esimerkeistä.
112377 18
Entsyymit ja mikro-organismit C-10-asemaan liittyvää muuntamista varten
Entsyymi tai mikro-organismi, jota käytetään tässä keksinnössä, voi olla mikä tahansa entsyymi tai mikro-or-5 ganismi, joka kykenee katalysoimaan tässä kuvatut entsy-maattiset hydrolyysi- tai esteröintimenetelmät. Entsyymi-tai mikrobimateriaaleja, huolimatta alkuperästä ja puhtaudesta, voidaan käyttää vapaassa tilassa tai immobili- soituna alustalle esimerkiksi fysikaalisen adsorption tai 10 loukun avulla.
Esimerkillisiin mikro-organismeihin sisältyvät mikro-organismit, jotka kuuluvat seuraaviin sukuihin: Nocar-dioides, Nocardia, Rhodococcus, Micropolyspora, Saccharo-polyspora, Pseudonocardia, Oerskovia, Promicromonospora ja 15 Instrasporangium. Erityisen edullisia mikro-organismeja ovat lajit, jotka kuuluvat sukuun Nocardioides, kuten Nocardioides albus, Nocardioides flavus, Nocardioides ful-vus, Nocardioides luteus, Nocardioides simplex ja Nocar dioides thermolilacinus, erityisesti Nocardioides albus 20 ATCC 55424 (SC 13910) ja ATCC 55425 (SC 13911) ja Nocardioides luteus ATCC 55426 (SC 13912). Tässä käytettynä termi "ATCC" viittaa kysymyksessä olevan organismin talle- > t ;·, tuspaikan, American Type Culture Collectionin saantinume- roon, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852.
( · · . 25 Edellä mainitut mikro-organismit ATCC 55424, 55425 ja ‘ 55426 talletettiin toukokuun 12. päivä, 1993. Termi "SC" ·” tarkoittaa nimitystä, joka on annettu mikro-organismille ‘ osana Squibb-viljelykokoelmaa.
Biologisesti puhtaat mikro-organismit Nocardioides 30 albus ATCC 55424 (SC 13910), Nocardioides albus ATCC 55425 : ; (SC 13911) ja Nocardioides luteus ATCC 55426 (SC 13912) ovat uusia mikro-organismeja. Pitäisi ymmärtää, että näi-
t s I
den organismien mutantit luetaan myös tämän keksinnön pii- » » *;1 riin käytettäväksi tässä kuvatuissa hydrolyysi- ja este- 35 röintimenetelmissä, kuten organismit, jotka on muunnettu t · > f » » 1 112377 19 käyttämällä kemiallisia, fysikaalisia (esim. röntgensäteitä) tai biologisia keinoja (esimerkiksi molekyylibiologia-tekniikkaa ).
Mikro-organismeja Nocardioides albus ATCC 55424 5 (SC 13910) ja ATCC 55425 (SC 13911) voidaan viljellä kasvualustalla Medium A 94 [maissiliotusliemi (35 g), Cerelose (20 g), (NH4)2S04, reagenssilaatu (5 g), CaC03 (3,5 g), soijapapuöljy (5 ml) ja tislattu vesi (1 1)]. Nämä organismit eristettiin maasta (näytteestä, joka oli 10 peräisin New Brunswickista, New Jersey) ja ne ovat gram-positiivisia, liikkumattomia organismeja, jotka osoittavat aerobista kasvua erilaisilla kasvualustoilla. Kiinteällä hiiva-tärkkelys-kasvualustalla (0,2 % hiivauutetta, 1 % tärkkelystä) huovasto on vaikeahkosta vaaleankermanväri-15 seen. Kasvu on yhteydessä tumman, hajaantuvan pigmentin tuotantoon sekä kiinteässä että nestemäisessä elatusai-neessa. Mikroskooppisesta nestemäisessä viljelmässä tapahtuvalle kasvulle ovat tunnusomaisia huovastorykelmät, jotka koostuvat runsaasti haaroittuvista sienirihmoista.
20 Mikro-organismia Nocardioides luteus ATCC 55426 (SC 13912) voidaan viljellä kasvualustalla Medium A 94 [maissiliotusliemi (35 g), Cerelose (20 g), (NH4)2S04, rea-genssilaatu (5 g), CaC03 (3,5 g), soijapapuöljy (5 ml) ja tislattu vesi (1 1) ]. Tämä organismi eristettiin maasta \ , 25 (näytteestä, joka oli peräisin New Brunswickista, New Jer- ’ sey) ja se on gram-positiivinen, liikkumaton organismi, joka osoittaa aerobista kasvua erilaisilla kasvualustoil-* la. Kiinteällä hiiva-tärkkelys-kasvualustalla (0,2 % hii vauutetta, 1 % tärkkelystä) huovasto on tummankermanväris-30 tä. Mikroskooppisesti nestemäisessä viljelmässä tapahtuvalle kasvulle ovat tunnusomaisia huovastorykelmät, jotka koostuvat runsaasti haaroittuvista sienirihmoista.
Edellä mainitut organismit Nocardioides albus ATCC 55424 (SC 13910) ja ATCC 55425 (SC 13911) ja Nocardioides 35 luteus ATCC 55426 (SC 13912) identifioitiin Nocardioides 112377 20 albuksen ja Nocardioides luteuksen kannoiksi julkaisussa Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, osa 2 (toim. P. H. A. Sneath) (1986) annetun kuvauksen mukaisesti.
Esimerkillisiä entsyymejä käytettäväksi näissä hyd-5 rolyysi- tai esteröintimenetelmissä ovat hydrolaasit, erityisesti esteraasit, proteaasit tai lipaasit. Edullisiin entsyymeihin sisältyvät entsyymit, jotka ovat peräisin mikro-organismeista, erityisesti edellä kuvatuista mikro-organismeista. Entsyymit voidaan eristää esimerkiksi uut-10 to- ja puhdistusmenetelmien avulla, kuten käyttämällä hydrofobisen vuorovaikutuksen kromatografiaa, geelisuodatus-ta, ja sen jälkeen anioninvaihtopylvästä. Tämä keksintö tuottaa lisäksi entsyymit, jotka kykenevät tämän keksinnön hydrolyysi- ja esteröintimenetelmiin ja jotka voidaan 15 eristää organismeista Nocardioides albus ATCC 55424 (SC
13910) ja ATCC 55425 (SC 13911) ja Nocardioides luteus ATCC 55426 (SC 13912), esimerkiksi edellä mainitun tekniikan avulla.
Entsyymit ja mikro-organismit C-13-asemaan liitty-20 vää muuntamista varten
Entsyymi tai mikro-organismi, jota käytetään tässä *· keksinnössä, voi olla mikä tahansa entsyymi tai mikro-or ganismi, joka kykenee katalysoimaan tässä kuvatun entsy-maattisen hydrolyysin. Entsyymi- tai mikrobimateriaaleja, . . 25 riippumatta alkuperästä tai puhtaudesta, voidaan käyttää vapaassa tilassa tai immobilisoituna alustalle esimerkiksi fysikaalisen adsorption tai loukun avulla.
Edullinen menetelmä mikro-organismin valitsemiseksi, joka on sopiva lähtöaineena käytetyn C-13-asemaan ! 30 liittyvän asyylioksiryhmän sisältävän taksaanin entsymaat tista hydrolyysiä varten tämän keksinnön mukaisesti, on seuraavan uuden seulontamenetelmän käyttö, jolloin menetelmä sisältää seuraavat vaiheet: (a) valitaan kiinteä kasvualusta (i), jossa seulot-35 tava mikro-organismi kasvaa ja (ii) johon lähtöaineena 112377 21 käytettävä C-13-asemaan liittyvän asyylioksiryhmän sisältävä taksaani ei liukene ja siten sillä on seoksena kasvualustan kanssa samea ulkonäkö ja (iii) johon tämän keksinnön hydrolyysimenetelmän C-13-asemaan liittyvän hydroksyy-5 liryhmän sisältävä taksaanituote liukenee ja johon lohkaistu C-13-asemaan liittyvä sivuketju liukenee myös edullisesti ja siten niillä on seoksena kasvualustan kanssa kirkas ulkonäkö; (b) saatetaan mikro-organismi kosketukseen edellä 10 vaiheessa (a) valitun kasvualustan kanssa esimerkiksi pet-rimaljassa, jolloin kasvualustaan on sekoitettu C-13-ase-maan liittyvän asyylioksiryhmän sisältävä lähtöainetaksaa-ni, olosuhteissa, jotka sallivat mikro-organismin kasvun; ja 15 (c) tehdään havainnot siitä, ilmeneekö kirkas vyö hyke alueen ympärillä, jossa mikro-organismin kasvu tapah tuu.
Kirkkaan vyöhykkeen ilmeneminen osoittaa, että hyd-rolyysi on tapahtunut ja että siten mikro-organismi voi 20 olla sopiva käytettäväksi tässä hydrolyysimenetelmässä. Tässä käytettynä termit "kirkas" ja "samea" on tulkittava suhteessa toisiinsa. Siten C-13-asemaan liittyvän asyyli- t oksiryhmän sisältävää lähtöainetaksaania käytetään seoksena kasvualustan kanssa riittävässä määrin siten, että se , 25 näkyy suspensiossa (antaen "samean" ulkonäön) ja kirkkaus määritetään suhteessa näkyväisyyden alkuperäiseen asteeseen suspensiossa, so. tuon näkyväisyyden vähenemisenä.
. 1 Tämän keksinnön tuottama toinen edullinen seulonta menetelmä on menetelmä, joka vastaa edellä esitettyä mene- • · • ' *’ 30 telmää paitsi, että valitaan kiinteä kasvualusta, johon : : C-13-asemaan liittyvän asyylioksiryhmän sisältävä lähtöai- netaksaaani on liukoinen ja siten sillä on seoksena kasvualustan kanssa kirkas ulkonäkö, kun taas tämän keksinnön ; hydrolyysimenetelmän C-13-asemaan liittyvän hydroksyyli- : 35 ryhmän sisältävä taksaanituote on siihen liukenematon (ja 22 112377 edullisesti lohkaistu C-13-asemaan liittyvä sivuketju on myös siihen liukenematon) ja siten sillä on seoksena kasvualustan kanssa samea ulkonäkö. Samean vyöhykkeen havaitseminen alueen ympärillä, jossa mikro-organismin kasvu ta-5 pahtuu, sallii sopivan mikro-organismin valinnan.
Tämän keksinnön seulontamenetelmän erityisen edullinen suoritusmuoto on suoritusmuoto, joka esitetään tämän patenttihakemuksen esimerkeissä.
Edellä esitettyjä edullisia seulontamenetelmiä voi-10 daan käyttää sopivasti, kun lähtöaineena käytettävä C-13-asemaan liittyvän asyylioksiryhmän sisältävä taksaani ja C-13-asemaan liittyvän hydroksyyliryhmän sisältävä taksaa-nituote eroavat suhteellisessa liukoisuudessa toisistaan siinä määrin, että voidaan havaita, onko tämän keksinnön 15 mukainen hydrolyysi tapahtunut vai eikö sitä ole tapahtunut.
Esimerkillisiin mikro-organismeihin käytettäväksi C-13-asemaan liittyvässä hydrolyysissä sisältyvät seuraa- viin sukuihin sisältyvät mikro-organismit: Nocardioides, 20 Nocardia, Rhodococcus, Micropolyspora, Saccharopolyspora,
Pseudonocardia, Oerskovia, Promicromonospora ja Intraspo- ·· rangium. Erityisen edullisia mikro-organismeja ovat lajit, » jotka sisältyvät Nocardioides-sukuun, kuten Nocardioides ·, albus, Nocardioides flavus, Nocardioides fulvus, Nocar- . 25 dioides luteus, Nocardioides simplex ja Nocardioides ther- molilacinus, erityisesti Nocardioides albus ATCC 55424 * » · *;;; (SC 13910) ja ATCC 55425 (SC 13911) ja Nocardioides luteus ATCC 55426 (SC 13912).
Kuten edellä on kuvattu, biologisesti puhtaat mik- : 30 ro-organismit Nocardioides albus ATCC 55424 (SC 13910), _·* Nocardioides albus ATCC 55425 (SC 13911) ja Nocardioides luteus ATCC 55426 (SC 13912) ovat uusia mikro-organismeja, jotka ovat edelleen tämän keksinnön tuottamia. Pitäisi ym- • · märtää, että näiden organismien mutantit luetaan myös tä-35 män keksinnön piiriin käytettäväksi tässä kuvatuissa hyd- t * > 112377 23 rolyysimenetelmissä, kuten mikro-organismit, jotka on muunnettu käyttämällä kemiallisia, fysikaalisia (esimerkiksi röntgensäteitä) tai biologisia keinoja (esimerkiksi molekyylibiologian tekniikkaa).
5 Esimerkillisiä entsyymejä käytettäväksi tässä kek sinnössä ovat hydrolaasit. Edullisiin entsyymeihin sisältyvät entsyymit, jotka ovat peräisin mikro-organismeista, erityisesti niistä mikro-organismeista, jotka on kuvattu edellä. Entsyymit voidaan eristää esimerkiksi käyttäen 10 uutto- ja puhdistusmenetelmiä, kuten menetelmiä, jotka on kuvattu tässä esimerkeissä, erityisesti puhdistamalla aktiiviset fraktiot, jotka on havaittu solujen ulkopuolises-ti elatusaineessa, jossa näitä organismeja on viljelty, kuten käyttämällä anioninvaihtopylvästä ja sen jälkeen 15 hydrofobisen vuorovaikutuksen kromatografiaa ja geelisuo-datusta. Tämä keksintö tuottaa lisäksi entsyymit, jotka kykenevät tähän hydrolyysiin ja jotka voidaan eristää mikro-organismeista Nocardioides albus ATCC 55424 (SC 13910) ja ATCC 55425 (SC 13911) ja Nocardioides luteus ATCC 55426 20 (SC 13912) esimerkiksi edellä mainitun tekniikan avulla.
Entsyymien ja mikro-organismien käyttö C-10-asemaan ja C-13-asemaan liittyvässä muuntamisessa J I » t :·. Kun käytetään mikro-organismeja, soluja voidaan ·. käyttää vahingoittamattomien märkien solujen tai kuivattu- t·, ; 25 jen solujen, kuten pakkaskuivattujen, suihkukuivattujen • * · tai lämmön avulla kuivattujen solujen, muodossa tai käsi-tellyn solumateriaalin, kuten rikottujen solujen tai solu- * » · ’·’ * uutteiden, muodossa. Perintöaineksen osalta muokattujen organismien käyttö on myös mahdollista. Isäntäsolu voi ol-: 30 la mikä tahansa solu, esimerkiksi Escherichia coli, joka !t>>! on muunnettu siten, että se sisältää geenin tai geenejä, jotka ilmentävät yhden tai useamman entsyymin, joka kyke-t---t nee tässä kuvattuun katalyysiin.
Kun käytetään yhtä tai useampaa mikro-organismia, *.’! 35 tämän keksinnön entsymaattiset hydrolyysi- tai esteröinti- 112377 24 menetelmät voidaan toteuttaa mikro-organismin fermentoin-nin jälkeen (kaksivaiheinen fermentointi ja hydrolyysi tai esteröinti) tai samanaikaisesti niiden kanssa, so. jälkimmäisessä tapauksessa toteutetaan in situ fermentointi ja 5 hydrolyysi tai esteröinti (yksivaiheinen fermentointi ja hydrolyysi tai esteröinti).
Alan ammattimies voi saada aikaan mikro-organismien kasvun käyttämällä sopivaa elatusainetta. Sopivat elatus-aineet mikro-organismien kasvua varten ovat elatusaineita, 10 jotka tuottavat mikrobi solujen kasvulle välttämättömät ravinteet. Tyypillinen elatusaine kasvua varten sisältää välttämättömät hiililähteet, typpilähteet ja alkuaineet (esim. hivenainemääriä). Indusoijia voidaan myös lisätä. Tässä käytettynä termi "indusoija" sisältää minkä tahansa 15 yhdisteen, joka lisää halutun entsymaattisen aktiivisuuden muodostumista mikrobisolussa.
Hiililähteisiin voivat sisältyä sokerit, kuten maltoosi, laktoosi, glukoosi, fruktoosi, glyseroli, sorbitoli, sakkaroosi, tärkkelys, mannitoli, propyleeniglykoli ja 20 vastaavat; orgaaniset hapot, kuten natriumasetaatti, nat-riumsitraatti ja vastaavat; ja alkoholit, kuten etanoli, j. propanoli ja vastaavat.
» ·. Typpilähteisiin voivat sisältyä N-Z-amiini A, mais- siliuotusliemi, soijapapu, naudanlihauutteet, hiivauut-
» I
. 25 teet, melassi, leivontahiiva, tryptoni, ravintosoija, pep- töni, hiiva-amiini, aminohapot, kuten natriumglutamaatti I t · ja vastaavat, natriumnitraatti, ammoniumsulfaatti ja vas- ’ · ’ taavat.
Hivenaineisiin voivat sisältyä magnesium-, mangaa-
i · I
V 30 ni-, kalsium-, koboltti-, nikkeli-, rauta-, natrium- ja : : kaliumsuolat. Fosfaatteja voidaan myös lisätä pieniä mää- ,·|·( riä tai edullisesti suurempia määriä kuin hivenainemääriä.
S ) ) Käytettävään elatusaineeseen voi sisältyä enemmän
I I
kuin yksi hiili- tai typpilähde tai muun ravinteen lähde.
• > t • » * * „ 112377 25
Edullisiin elatusaineisiin kasvua varten sisältyvät vesipitoiset elatusaineet, erityisesti elatusaineet, jotka on kuvattu tässä esimerkeissä.
Reaktioseoksen sekoittaminen ja tuulettaminen saa-5 vat aikaan käytettävissä olevan hapen määrän hydrolyysi-tai esteröintiprosessin aikana, kun se toteutetaan esimerkiksi ravistettavan pullon viljelmisssä tai fermentointi-säiliöissä mikro-organismien kasvun aikana. Sekoittamisno-peus, joka on 100 - 250 rpm, on edullista, tuulettaminen, 10 joka on noin 1-10 tilavuutta ilmaa elatusaineen tilavuutta kohden minuutissa, on edullista.
Mikro-organismien kasvua ja/tai hydrolyysiä tai es-teröintiä varten tämän keksinnön mukaisesti elatusaineen pH-arvo on edullisesti noin 6 - 8,5 ja lämpötila on edul-15 lisesti noin 24-37 °C. Hydrolyysi tai esteröinti voidaan toteuttaa in vitro esimerkiksi 1-48 tunnin kuluessa tai edullisesti aikana, jolloin halutun tuotteen saanto saadaan maksimoiduksi. On edullista toteuttaa tämän keksinnön hydrolyysimenetelmät pH-arvon ollessa 6-8, erityisesti 20 ei-emäksisissä olosuhteissa.
On myös edullista, että käytetään vesipitoista nes- ·· tettä hydrolyysireaktion väliaineena, vaikka voidaan myös . käyttää orgaanista nestettä tai sekoittuvaa tai sekoittu- ;·, matonta (kaksifaasista) orgaanisen ja vesipitoisen nesteen • ‘ » . 25 seosta. On edullista käyttää orgaanista liuotinta tai kak- ' . ‘ sifaasista orgaanista/vesipitoista reaktioväliainetta es- ·;;; teröintiä varten, vaikka muitakin väliaineita voidaan ‘ ‘ ' käyttää.
C-10-asemaan liittyvää muuntamista varten on edul-• 30 lista käyttää 0,025 - 2,5 paino-% C-10-asemaan liittyvän : hydroksi- tai asyyliryhmän sisältävää taksaanilähtöainetta (-lähtöaineita) laskettuna lähtöaineen (lähtöaineiden) ja esteröinti- tai hydrolyysireaktioväliaineen yhdistetystä painosta. Tämän keksinnön esteröintimenetelmässä asyloivan V · 35 aineen ja C-10-asemaan liittyvän hydroksyyliryhmän sisäl- 26 1 12377 tävän taksaanin välinen edullinen molaarinen suhde on noin 1:1 - 1 000:1. Käytettävä entsyymin tai mikro-organismin määrä suhteessa lähtöaineeseen valitaan siten, että tämän keksinnön entsymaattisen hydrolyysin tai esteröinnin kata-5 lyysi on mahdollista. On edullista, että saadaan saanto, joka on yli 90 % (% saatua C-10-hydrolysoitua tuotetta perustuen asyylioksiryhmän sisältävään lähtöainetaksaaniin) käytettäessä tämän keksinnön hydrolyysimenetelmää tai yli 50 % (% saatua C-10-asyloitua tuotetta perustuen hydrok-10 syyliryhmän sisältävään lähtöainetaksaaniin) käytettäessä tämän keksinnön esteröintimenetelmää. Hydrolyysi tai este-röinti voidaan saavuttaa valikoivasti lähtöainetaksaanin C-10-asemaan liittyen. So. voidaan saada tuotetta (tuotteita), josta suurempi osa (kuten kaikki) on hydrolysoitu 15 tai esteröity vain C-10-asemaan liittyen ilman hydrolyysiä tai esteröintiä muissa asemissa.
C-13-asemaan liittyvää muuntamista varten on edullista käyttää 0,025 - 0,25 paino-% C-13-asemaan liittyvän asyylioksiryhmän sisältävää taksaanilähtöainetta (-lähtö-20 aineita) perustuen lähtöaineen (lähtöaineiden) ja hydro-lyysireaktioväliaineen yhdistettyyn painoon. Käytettävä j. entsyymin tai mikro-organismin määrä suhteessa lähtöainee- .· ·, seen valitaan siten, että tämän keksinnön entsymaattisen ;* hydrolyysin katalyysi on mahdollista. On edullista, että . 25 saadaan saanto, joka on yli 90 % (% saatua C-13-hydroly- ‘ soitua tuotetta perustuen asyylioksiryhmän sisältävään ·;;; lähtöainetaksaaniin) käytettäessä tämän keksinnön hydro- ’·' * lyysimenetelmää. Hydrolyysi voidaan saavuttaa valikoivasti lähtöainetaksaanin C-13-asemaan liittyen. So. voidaan saa- V 30 da tuotetta (tuotteita), josta suurempi osa (kuten kaikki) ! _ on hydrolysoitu vain C-13-asemaan liittyen ilman hydrolyy- ,···, siä muissa asemissa.
» I I
Erottaminen T Tämän keksinnön menetelmien C-10-asyylioksiryhmän *.‘i 35 tai -hydroksyyliryhmän sisältävät tuotteet ja kytketyt
* I
» I
* 4 « 27 112377 tuotteet, jollaiset on kuvattu jäljempänä, voidaan eristää ja puhdistaa esimerkiksi käyttäen menetelmiä, kuten uut-toa, tislausta, kiteyttämistä ja pylväskromatografiaa.
Samoin tämän keksinnön C-13-hydrolyysimenetelmän 5 C-13-asemaan liittyvän hydroksyyliryhmän sisältävät tuotteet ja kytketyt tuotteet, jollaiset on kuvattu jäljempänä, voidaan myös eristää ja puhdistaa esimerkiksi käyttäen menetelmiä, kuten uuttoa, tislausta, kiteyttämistä ja pylväskromatografiaa .
10 Käyttökelpoisuus
Taksaanit ovat diterpeeniyhdisteitä, jotka sisältävät taksaaniosuuden, kuten edellä on kuvattu. Erityisen mielenkiintoisia ovat taksaanit, jotka sisältävät taksaaniosuuden, jossa 11,12-asemat ovat sitoutuneet etyleenisi-15 doksen kautta ja jossa 13-asema sisältää sivuketjun, jolloin näistä taksaaneista esimerkkinä on taksoli. Farmakologisesti aktiivisia taksaaneja, kuten taksolia, voidaan käyttää kasvaimia vastustavina aineina potilaiden hoitamiseksi, jotka sairastavat syöpää, kuten rintasyöpää, muna-20 sarjasyöpää, paksusuolisyöpää tai keuhkosyöpää, melanomaa ja leukemiaa.
>* Yhdisteet, jotka on saatu C-10-asemaan liittyvän muuntamisen avulla
Yhdisteet, jotka on saatu tämän keksinnön C-10-hyd- > » . 25 rolyysi- tai -esteröintimenetelmän avulla, ovat erityisen käyttökelpoisia välituotteina valmistettaessa edellä mai- I t · ;;; nittuja farmakologisesti aktiivisia taksaaneja, jolloin ! « * ’ menetelmä sallii yhdisteiden valmistuksen, joilla on ha luttu substituentti liittyen C-10-asemaan. Siten esimer-i \* 30 kiksi kun yhdisteillä, jotka on valmistettu C-10-asemaan ί,,,ί liittyvän muuntamisen avulla tämän keksinnön menetelmien . ; . mukaisesti, on myös hydroksyyliryhmä C-13-asemaan liit-
t ! I
tyen, tällaiset yhdisteet voidaan kytkeä C-13-asyyliok- > » sisivuketjun muodostaviin välituoteyhdisteisiin, kuten · 35 β-laktaameihin, jotta saadaan C-13-asyylioksisivuketjun • « • i · 1 12377 sisältäviä taksaaneja, kuten taksolia ja sen analogeja. Tässä suhteessa muuntaminen C-13-asemaan liittyen tämän keksinnön menetelmien mukaisesti voidaan toteuttaa ennen tämän keksinnön menetelmiä C-10-aseman muuntamiseksi, sen 5 aikana tai sen jälkeen.
Asyylioksi- tai hydroksyyliryhmän sisältävät yhdisteet, jotka on valmistettu tämän keksinnön menetelmien mukaisesti, voidaan mahdollisesti muuntaa ennen kun niitä käytetään C-13-asyylioksisivuketjun kytkennässä. Esimer-10 kiksi yksi tai useampi hydroksyyliryhmä muissa kuin C-13-asemissa voidaan suojata ennen kytkentää ja sen jälkeen niistä voidaan poistaa suojaus.
C-10-asemaan liittyvän asyylioksi- ja hydroksyyliryhmän sisältävät taksaanit, jotka on saatu tämän keksin-15 nön hydrolyysi- tai esteröintimenetelmän avulla ja jotka on mahdollisesti muunnettu kuten edellä, voidaan esimerkiksi käyttää C-13-asemaan liittyvän asyylioksisivuketjun sisältävien taksaanien, kuten edellä mainittujen, valmistuksessa ja valmistus voidaan toteuttaa käyttäen menetel-20 miä, jotka on kuvattu EP-patenttijulkaisussa 400 971, US-patenttijulkaisussa 4 876 399, US-patenttijulkaisussa j· 4 857 653, US-patenttijulkaisussa 4 814 470, US-patentti- julkaisussa 4 924 012, US-patenttijulkaisussa 4 924 011 ja julkaisussa Kingston, Pharm. Ther., Voi. 52, 1-34 , 25 (1991), erityisesti US-patenttihakemuksessa sarjanumero 07/995 443, jätetty joulukuun 23. päivä, 1992, Poss et ai., (Attorney Docket No. LD60) ja US-patenttihakemukses-' sa sarjanumero 08/033 598, jätetty maaliskuun 19. päivä, 1993, Thottathil et ai. (Attorney Docket No. LD57); kaikki : * 30 nämä julkaisut liitetään tähän viittauksena.
: Yhdisteet, jotka on saatu C-13-asemaan liittyvän muuntamisen avulla ‘ Tämän keksinnön hydrolyysimenetelmän avulla saadut
i I
C-13-asemaan liittyvän hydroksyyliryhmän sisältämät yhdis-35 teet ovat erityisen käyttökelpoisia välituotteina valmis- 29 1 12 3 7 7 tettaessa edellä mainittuja C-13-asemaan liittyvän sivu-ketjun sisältäviä taksaaneja. Erityisesti tämän menetelmän mukaisesti valmistetut C-13-asemaan liittyvän hydroksyyli-ryhmän sisältämät yhdisteet voidaan kytkeä sivuketjun muo-5 dostaviin välituoteyhdisteisiin, kuten B-laktaameihin, jotta saadaan C-13-asemaan liittyvän sivuketjun sisältäviä taksaaneja. Tällaisen sivuketjun lisääminen sinänsä voi antaa taksaanituotteelle lisääntyneen tai mieluisamman farmakologisen aktiivisuuden tai se voi muodostaa taksaa-10 nituotteen, joka on helpompi muuttaa taksaaniksi, jolla on lisääntynyt tai mieluisampi farmakologinen aktiivisuus kuin lähtöyhdisteellä.
Tämän keksinnön menetelmien mukaisesti valmistettuja C-13-hydroksyyliryhmän sisältäviä yhdisteitä voidaan 15 muuntaa mahdollisesti ennen käyttöä sivuketjun muodostamisessa kytkemällä. Esimerkiksi muuntaminen C-10-asemaan liittyen tämän keksinnön menetelmien mukaisesti voidaan toteuttaa ennen tämän keksinnön C-13-hydrolyysimenetelmää, sen aikana tai sen jälkeen; ja/tai yksi tai useampi hyd-20 roksyyliryhmä muissa kuin C-13-asemassa voidaan suojata ennen kytkentää ja sen jälkeen suojaus voidaan poistaa.
Tämän keksinnön hydrolyysimenetelmän avulla saatuja ' I » C-13-asemaan liittyvän hydroksyyliryhmän sisältäviä taksaaneja, jotka on muunnettu mahdollisesti kuten edellä, 25 voidaan käyttää esimerkiksi valmistettaessa C-13-asemaan * liittyvän asyylioksisivuketjun sisältäviä taksaaneja, kuten edellä on lueteltu, ja valmistus voidaan toteuttaa käyttäen menetelmiä, jotka on kuvattu EP-patenttijulkaisussa 400 971, US-patenttijulkaisussa 4 876 399, US-pa-• 30 tentti julkaisussa 4 857 653, US-patentti julkaisussa : 4 814 470, US-patenttijulkaisussa 4 924 012, US-patentti- j. julkaisussa 4 924 011 ja julkaisussa Kingston, Pharm.
Ther., Voi. 52, 1 - 34 (1991), erityisesti US-patenttiha-; kemuksessa sarjanumero 07/995 443, jätetty joulukuun : 35 23. päivä, 1992, Poss et ai., (Attorney Docket No. LD60) t ti 30 112 3 7 7 ja US-patenttihakemuksessa sarjanumero 08/033 598, jätetty maaliskuun 19. päivä, 1993, Thottathil et ai. (Attorney Docket No. LD57); kaikki nämä julkaisut liitetään tähän viittauksena. Edullista on kaavan VI mukaisten, C-13-ase-5 maan liittyvän asyylioksiryhmän sisältävien taksaanien valmistus.
Edulliset yhdisteet C-10-asemaan liittyvää muuntamista varten
On edullista käyttää kaavan II mukaisia taksaaneja 10 tai niiden suoloja tämän keksinnön C-10-asemaan liittyvässä hydrolyysimenetelmässä, jolloin entsymaattinen hydro-lyysi tuottaa vastaavia kaavan I mukaisia yhdisteitä tai niiden suoloja. Samaten on edullista käyttää kaavan I mukaisia taksaaneja tai niiden suoloja tämän keksinnön C-10-15 asemaan liittyvässä esteröintimenetelmässä, jolloin entsymaattinen esteröinti tuottaa vastaavia kaavan II mukaisia yhdisteitä tai niiden suoloja.
Kaavoissa I ja II R7 on edullisesti Ru-C(0)-0-, erityisesti kun R11 on alkyyli, kuten metyyli; R2 on edulli-20 sesti hydroksyyli tai ksylosyyli; R3 on edullisesti alkyyli, kuten metyyli; R4 on edullisesti aryyli, kuten fenyyli; · ja R1 on edullisesti hydroksyyli tai ryhmä, jolla on seu- raava kaava III;
R8(0)CNH O
” ΛΛ,— »m ; i‘: ORlt> ’ jossa R8 ja R9 ovat toisistaan riippumatta alkyyli, alkok- • a « : 30 si, alkenyyli, alkenyylioksi, alkynyyli, alkynyylioksi, sykloalkyyli, sykloalkyylioksi, sykloalkenyyli, sykloalke-nyylioksi, aryyli, aryylioksi, heterosyklo tai heterosyk- .···, lo-oksi; ja » > • R10 on vety tai hydroksyyliä suojaava ryhmä.
• i t
t I
• · tl» „ 112377 01
Esimerkillisiä taksaaneja, joilla on kaava I ja II, ovat kefalomanniini, 10-desasetyylitaksoli, 7-ksylosyyli-taksoli, taksoli-C, 7-ksylosyyli-10-desasetyylitaksoli, taksoli, bakkatiini III, 10-desasetyylibakkatiinl III, 5 7-ksylosyylibakkatiini III ja 7-ksylosyyli-10-desasetyyli-bakkatiini III. Bakkatiini III:n entsymaattinen hydrolyysi 10-desasetyylibakkatiini III:n muodostamiseksi (esim. muodostaen etikkahappo) käyttäen esimerkiksi hydrolaasia on tämän keksinnön edullinen suoritusmuoto. Tämä reaktio voi-10 daan kääntää päinvastaiseksi tämän keksinnön entsymaatti-sen esteröintimenetelmän kautta.
Tässä kuvattujen menetelmien avulla valmistetaan lopputuotteena edullisesti taksoli.
Edulliset yhdisteet C-13-asemaan liittyvää muunta-15 mistä varten
On edullista käyttää kaavan VI mukaisia taksaaneja tai niiden suoloja tämän keksinnön menetelmässä, jolloin entsymaattinen hydrolyysi C-13-asemaan liittyen tuottaa vastaavia kaavan V mukaisia yhdisteitä tai niiden suoloja. 20 Kaavoissa V ja VI R12 on edullisesti R6-C(0)-0-, kuten ase-tyylioksi, tai hydroksyyli; R2 on edullisesti hydroksyyli tai ksylosyyli; R3 on edullisesti alkyyli, kuten metyyli; R4 on edullisesti aryyli, kuten fenyyli; ja R7 on edullisesti ryhmä, jolla on seuraava kaava III:
25 R8(0)CNH O
R9AJk0- (III) OR10 30 jossa R8, R9 ja R10 ovat kuten edellä on määritelty.
Esimerkillisiä kaavan VI mukaisia lähtöainetaksaa-’ neja ovat kefalomanniini, 10-desasetyylitaksoli, 7-ksylo-
• I
*··>' syylitaksoli, taksoli-C ja 7-ksylosyyli-10-desasetyylitak- 35 soli, yksin tai seoksena toistensa kanssa tai taksolin I 4 » 32 Λ Ί Ο 7 η η Ί Ί I Ο / / kanssa. Edullisia hydrolyysituotteita ovat bakkatiini III, 10-desasetyylibakkatiini III, 7-ksylosyylibakkatiini III ja 7-ksylosyyli-10-desasetyylibakkatiini III.
Hydrolyysin jälkeen tapahtuva kytkentä tuottaa 5 edullisesti edellä kuvatun kaavan VI mukaisia taksaani-tuotteita, joilla on kaavan III mukaiset C-13-asemaan liittyvät asyylioksiryhmät. Tässä kuvatun hydrolyysin ja kytkennän avulla valmistetaan lopputuotteena edullisesti taksoli.
10 Suoloja ja solvaatteja, kuten reagoivien aineiden tai tuotteiden hydraatteja voidaan käyttää tai niitä voidaan valmistaa, mikäli tarkoituksenmukaista, missä tahansa tämän keksinnön menetelmistä.
Tätä keksintöä kuvataan edelleen seuraavien esi-15 merkkien avulla, jotka ovat pelkästään kuvaavia eikä niitä ole tarkoitettu millään tavoin näiden patenttivaatimusten piiriä rajoittaviksi.
Esimerkki 1
Bakkatiini III:n 10-deasetylointi 20 Maasta eristettyä mikro-organismia Nocardioides lu- teus ATCC 55426 (SC 13912) kasvatettiin kolmen päivän ajan j· 28 °C:n lämpötilassa, kierrosnopeus 150 rpm, 50 ml:n , Erlenmeyer-pullossa, joka sisälsi 10 ml elatusainetta.
Elatusaine sisälsi litraa kohden tislattua vettä: 10 g
• · I
. 25 Bacto-tryptonia, 5 g Bacto-hiivauutetta, 6 ml tributy- • I · ' riinia ja 0,06 ml Tween 80:ntä elatusaineen lopullisen ·;;; pH-arvon ollessa 6,8 ± 0,2. Solut kerättiin talteen '·’ ' sentrifugoimalla, pestiin 10 ml:11a 50 mM kaliumfosfaatti- puskuria, pH-arvo 7, ja suspendoitiin uudelleen 2 ml:aan : 30 tätä puskuria. Solususpensioon lisättiin 0,5 mg bakkatiini :i t! Ill:a 20 pl:ssa metanolia ja suspensiota sekoitettiin 20 tunnin ajan ympäröivässä lämpötilassa (noin 23 °C) Fisher ... Roto-Rack-laitteen avulla. Suspensio uutettiin metyleeni- t · kloridilla ja uute haihdutettiin, liuotettiin uudelleen ja ·.' i 35 siitä tehtiin määritykset HPLC-menetelmän 2 avulla, joka 112377 33 on kuvattu jäljempänä. Näyte sisälsi 0,257 mg/ml 10-des-asetyylibakkatiini III:a (muuttuminen 100 %) ja vain jäämiä bakkatiini Ulista. Kolmella muulla kasvualustalla kasvatetut kannan ATCC 55426 pestyt solut toteuttivat myös 5 tämän muutoksen.
Esimerkki 2
Bakkatiini III:n 10-deasetylointi
Mikro-organismia Nocardioides luteus ATCC 55426 (SC 13912), jota kasvatettiin 20 ml:ssa elatusainetta, 10 joka sisälsi litraa kohden tislattua vettä: 10 g Bacto-tryptonia, 5 g Bacto-hiivauutetta ja 0,06 ml Tween 80:ntä pH-arvon ollessa 6,8 ± 0,2, käytettiin saman elatusaineen (1 1) inokuloimiseksi 4 l:n Erlenmeyer-pullossa. Pulloa ravistettiin kolmen päivän ajan 28 °C:n lämpötilassa, sit-15 ten solut kerättiin talteen sentrifugoimalla. Solupelletti pestiin 600 ml:11a 50 mM kaliumfosfaattipuskuria, pH-arvo 7, ja sentrifugoitiin jälleen, jolloin saatiin 36,6 g märkiä soluja. Solut jäädytettiin -72 °C:n lämpötilassa, pak-kaskuivattiin 2,5 g:ksi kahden päivän aikana, jauhettiin 20 käyttäen morttelia ja survinta ja varastoitiin 2 °C:n lämpötilaan. Sekoitettiin 1,98 ml:aa 50 mM kaliumfosfaatti-• j· puskuria, pH-arvo 7, 50 mg:aa kuivattuja soluja ja 0,5 «lii mg:aa bakkatiini III:a 20 pl:ssa metanolia Roto-Rack-lait- :·. teen avulla ympäröivässä lämpötilassa aika, joka ilmenee • * * \t . 25 seuraavasta taulukosta 1. Reaktiot pysäytettiin lisäämällä ' 2 ml metanolia. Sakka poistettiin mikrofugin avulla ja näytteistä tehtiin määritykset HPLC-menetelmän 1 avulla, '·' joka on kuvattu jäljempänä. Saadut tulokset esitetään tau lukossa 1.
• t » t |
* t I
t « 34 1 12 3 7 7
Taulukko 1 10-desasetyyli-
Aika bakkatiini III Bakkatiini III Muuttuminen 5 (min) mg/ml mg/ml (%) 0 0,007 0,252 30 0,051 0,143 22 60 0,106 0,106 46 10 120 0,204 0,034 88
Esimerkki 3
Taksolin 10-deasetylointi
Mikro-organismista Nocardioides luteus ATCC 55426 15 (SC 13912) saatu osittain puhdistettu uute (puhdistettu anioninvaihtokromatografian avulla käyttäen Whatman DE52:ta) sisälsi 34 milliyksikköä/ml entsyymiä. (1 milli-yksikkö on entsyymin määrä, joka kykenee hydrolysoimaan 1 nmol:n bakkatiini III:a 10-desasetyylibakkatiini III:ksi 20 minuuttia kohden 28 °C:n lämpötilassa 50 mM kaliumfosfaat- tipuskurissa, pH-arvo 7, joka sisältää 0,25 mg/ml bakka-·«· tiini III:a ja 1 % metanolia). Inkuboitiin 2 ml:aa tuotet ta, joka sisälsi 50 mM kaliumfosfaattipuskuria, pH-arvo 7, 0,5 mg taksolia, 1 % metanolia ja 34 milliyksikköä entsyy-. . 25 miä Fisher Roto-Rack-laitteella 3,5 tunnin ajan 28 °C:n lämpötilassa. Reaktio pysäytettiin uuttamalla seos 4 ;;; ml:lla metyleenikloridia. Uute kuivattiin, liuotettiin '* uudelleen metanoliin ja siitä tehtiin määritykset HPLC- menetelmän 3 avulla, joka on kuvattu jäljempänä. Näyte i * t • V 30 sisälsi 0,075 mg taksolia ja 0,186 mg/ml 10-desasetyyli- 't: taksolia (muuttuminen 78 %).
Mikro-organismin Nocardioides luteus ATCC 55426 (SC 13912) vaihtoehtoinen puhdistaminen T Mikro-organismia Nocardioides luteus ATCC 55426 V * 35 kasvatettiin käymisastiassa kasvualustalla, joka sisälsi : / 1 % tryptonia ja 0,5 % hiivauutetta. Kaikki puhdistamis- 35 112 3 7 7 vaiheet toteutettiin 4 1C:n lämpötilassa 50 mM fosfaatti-puskurissa, pH-arvo 7,2. Solut suspendoitiin puskuriin konsentraation ollessa 10 paino-%/tilavuus ja ne kuljetettiin mikrofluidisointilaitteen läpi kahdesti paineen ol-5 lessa 69 MPa (10 000 psi) hajottamista varten. Hajotettua solutuotetta selkeytettiin sitten sentrifugoimalla kier-rosnopeudella 24 000 x g 15 minuutin ajan. Lisättiin ammo-niumsulfaattia 60-%:iseen kyllästysasteeseen saakka ja tulokseksi saatu sakka suspendoitiin puskuriin, Joka sisälsi 10 1 mol/1 ammoniumsulfaattia, ja saatettiin hydrofobisen vuorovaikutuksen kromatografiaan [HlC-eetteri (Toya-hel-mi)], pylväs (5,5 x 2,6 cm) virtausnopeuden ollessa 2 ml/ min. Entsyymin aktiivisuus eluoitiin puskurilla. Aktiiviset fraktiot pantiin sitten Pharmacia Sephacryl S-200 15 -geelisuodatuspylvääseen (2,6 x 84 cm) virtauksen ollessa 0,5 ml/min. Pylväästä saadut aktiiviset fraktiot pantiin anioninvaihto (BioRad-Q2) -pylvääseen (2 ml:n pylväs, virtausnopeus 2 ml/min) ja aktiivisuus eluoitiin suolagra-dientilla 0 - 0,8 M NaCl 42 ml:ssa. Aktiiviset fraktiot 20 yhdistettiin ja pantiin Sephacryl S-200 -pylvääseen, kuten edellä on kuvattu. Entsyymin molekyylipainon arvioitiin olevan 40 000 ± 10 000 geelillä, joka sisälsi natriumdode-kyylisulfaattia. Edellä esitetyn menetelmän eri vaiheista saadut tulokset olivat seuraavat:
Spesifinen Talteen- ' ” 25 ^ Tilavuus Proteiini Aktiivisuus aktiivisuus otto
Vaihe ml ma mu mu/ma £
Solu-uute 100 450 2050 4,5 " ‘ Ammoniumsul- ;·. faatti 70 196 2830 14,4 138 HIC (eetteri) 7 24 953 39,9 46,5 30 Sephacryl S-200 7 0,7 190 271 9,.3
BioRad-Q2 3 0,09 51 567 2,5
Sephacryl S-200 8 0,03 26 867 1,3 C-10-deasetylaasin puhdistaminen: 1 milliyksikkö : 35 entsyymiä (mu) katalysoi bakkatiini lii:n 1 nmol:n/min » ·
* » I
36 112 3 7 7 muuttumisen 10-deasetyylibakkatiini Illrksi 25 °C:n lämpötilassa 50 mM kaliumfosfaattipuskurissa, pH-arvo 7, joka sisälsi 0,25 mg/ml bakkatiini III:a ja 1 % metanolia. Proteiini määritettiin reagenssin BioRad Protein Assay Rea-5 gent avulla.
Esimerkki 4 10-desasetyylibakkatiini III:n asetylointi bakkatiini III:ksi
Nocardioides luteus ATCC 55426 (SC 13912) -solut 50 10 mM kaliumfosfaattipuskurissa, pH-arvo 7,2, (10 paino-%/ti- lavuus) hajotettiin mikrofluidisointilaitteen avulla ja 10-deasetylaasientsyymi adsorboitiin uutteesta Whatman DEAE selluloosa DE52 -anioninvaihtimen avulla sekoittamalla 3 tunnin ajan (10 g uuteproteiinia/litra DE52:ta). DE52 15 kerättiin talteen suodattamalla, pestiin puskurilla ja pakkaskuivattiin, jolloin saatiin 0,091 milliyksikköä ent-syymiä/mg kiinteätä ainetta. Seosta, jossa oli 0,2 ml 1 M kaliumfosfaattipuskuria, pH-arvo 8, 100 mg immobilisoitua entsyymiä (so. immobilisoitu DE52-hartsille), 1,8 ml vet-20 tä, 2 mg 10-desasetyylibakkatiini III:a ja 0,5 ml vinyyli- asetaattia, sekoitettiin voimakkaasti magneettisauvalla 14,5 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Reaktioseos uutet-tiin metyleenikloridilla. Uute kuivattiin ja liuotettiin uudelleen raetanoliin analyysiä varten, joka toteutettiin , 25 käyttäen HPLC-menetelmää 1, joka on kuvattu jäljempänä.
’· / Näyte sisälsi 0,688 mg/ml 10-desasetyylibakkatiini III:a ja 0,203 mg/ml bakkatiini III:a (muuttuminen 19 %).
HPLC-menetelmät
Menetelmä 1
l ’ : 30 Pylväs: Hewlett Packard hypersil, 5 mikronia, ODS
: C18, 200 x 4,6 mm !. Liikkuva faasi: 55 % metanolia, 45 % vettä
Virtausnopeus: 1 ml/min ’ Pylvään lämpötila: ympäröivä ‘35 Detektion aallonpituus: 235 nm.
37 1 12377
Menetelmä 2
Pylväs: Phase Separations Inc. (Norwalk, CT), microbore spherisorb phenyl 150 x 2,0 mm, 3 mikronia
Liikkuva faasi: liuotin A: 15 mM KH2P04, säädetty 5 pH-arvoon 4 trifluorietikkahapon avulla. Liuotin B: aseto-nitriili
Aika/min Liuotin A (%) Liuotin B (%) 0 75 25 10 20 55 45 23 40 60 24 25 75 28 75 25
15 Pylvään lämpötila: 35 °C
Detektion aallonpituus: 230 nm.
Menetelmä 31
Pylväs: Hewlett Packard hypersil, 5 mikronia, ODS C18, 200 x 4,6 mm 20 Liikkuva faasi: 60 % metanolia, 40 % vettä
Virtausnopeus: 1 ml/min Pylvään lämpötila: ympäröivä *!',! Detektion aallonpituus: 235 nm.
Esimerkki 5 \ " 25 Taimiuutteen hydrolyysi i < » ’· : Taxus hicksii -taimista saatu etanoliuute väkevöi- .tiin 10 - 15-kertaisesti käyttäen nanosuodattimia. Inku-V > boitiin 0,5 ml:aa uutetta, 0,5 ml:aa 1 M kaliumfosfaatti- puskuria, pH-arvo 7, 54 milliyksikköä osittain puhdistet-30 tua entsyymiä, joka oli saatu mikro-organismista Nocar-dioides albus ATCC 55425 (SC 13911) (puhdistettu anionin-vaihtokromatografian avulla ammoniumsulfaattisaostuksen » j
Katso myös julkaisu Monsarrat et ai., Drug Metabolism and Disposition, 18, 895 - 901 (1990).
38 112377 avulla) ja 4 ml:aa vettä 28 °C:n lämpötilassa 48 tunnin ajan Fisher Roto-Rack-laitteella. (Entsyymiä, joka on saatu organismista ATCC 55425, voidaan käyttää C-13-hydrolyy-siin, kuten tässä on kuvattu). Toinen putki sisälsi samaa 5 seosta ja myös 14 milliyksikköä entsyymiä mikro-organismista Nocardioides luteus ATCC 55426 (SC 13912), joka oli immobilisoitu 500 mg:lie DE52-hartsia, kuten esimerkissä 4 on kuvattu. Inkuboitiin 23 tuntia 28 °C:n lämpötilassa, minkä jälkeen lisättiin toinen annos 14 milliyksikköä ent-10 syymiä, joka oli saatu organismista ATCC 55426 DE52:lla, 4 ml:n kanssa vettä ja inkubointia jatkettiin 22 tunnin ajan. Kontrollinäytteeseen ei lisätty entsyymejä. Näytteet uutettiin metyleenikloridilla ja haihdutetut uutteet liuotettiin metanoliin analyysiä varten, joka toteutettiin 15 käyttäen HPLC-menetelmää 2, kuten edellä on kuvattu. Saadut tulokset esitetään taulukossa 2 jäljempänä.
Tulokset osoittavat, että mikro-organismista SC 13911 saadulla C-13-deasylaasilla toteutetun käsittelyn jälkeen taksoli, kefalomanniini, 7-ksylosyyli-10-deasetyy-20 litaksoli ja 10-deasetyylitaksoli olivat hävinneet, kun taas bakkatiini III:n ja 10-deasetyylibakkatiini III: n määrä oli lisääntynyt. 10-deasetyylibakkatiini III:n plus bakkatiini III:n ja alkuperäisen taksolin välinen molaari- * * ;·, nen suhde lisääntyi 117 %:sta 436 %:iin. Kun taimiuute kä- * * · . 25 siteltiin sekä C-13-deasylaasilla, joka oli saatu organis- • > # ’ ,‘ mistä SC 13911, ja C-10-deasylaasilla, joka oli saatu or- ;;; ganismista SC 13912, bakkatiini III muuttui 10-deasetyyli- ‘ bakkatiini III:ksi ja 10-deasetyylibakkatiini III:n kon- sentraatio lisääntyi 6-kertaisesti verrattuna alkuperät- I t i j 30 seen arvoon. Siten taksaanien seoksen käsittely C-13- deasylaasilla ja C-10-deasylaasilla tuotti 10-deasetyyli- , ' , bakkatiini III:n pääasiallisena tuotteena.
» » · ' » 39 1 12 3 7 7
Taulukko 2
Taimiuutteen hydrolyysl
Entsvv- Bakkatiini 7-ksylo- Kefa- T.ak7 10-DAT
mifT- Hl. mg/ml syyli-10- loman- ^ wJmL
r-3iein Κ9ί11η;1· desase- niini 5 - lii Mfl/iPl tyyli- ma/ml taksoli ma/ml ei entsyymiä 0jl<>7 0,142 0,246 0,243 0,401 0,201 SC13911 0,400 0,771 0,027 0,000 0,000 0,014 11 +12+ 1,025 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 10
Entsyy- takso- D+B/T * mi pe- li C räisin HKI/ml ei ent- jälkiä 116,8 syymia > SC13911 0,000 436,3 15 11 + 12 0,000 400,8 10-DAT on 10-desasetyylitaksoli + SC 13911 ja SC 13912 * D + B/T on molaarinen saanto-% (10-deasetyylibak-20 katllnl III ja bakkatiini III) jaettuna alkuperäisellä taksolilla.
Esimerkki 6
Taksolin C-13-asemaan liittyvän sivuketjun poistamaan kykenevien mikro-organismikantojen valinta 25 Difco-alkoholisininenagarelatusaine (5,25 g) 150 : : mltssa tislattua vettä steriloitiin ja jäähdytettiin osit tain valmistajan ohjeiden mukaisesti. Elatusaine sisälsi . 10 g tryptonia, 5 g hiivauutetta, 20 g agaria ja 0,15 g alkoholisinistä litraa kohden. Elatusaineeseen lisättiin 30 25 mg taksolia ja 10 μΐ Tween 80:ntä 1 mltssa metanolia
* I
steriilin suodattimen läpi. Elatusainetta käytettiin 15 ml » .* petrimaljaa (100 mm x 15 mm) kohden.
Kun maljat oli jäähdytetty ja kuivattu, maanäyt-teet pantiin maljoille seuraavasti. Suspendoitiin 2 g maa-; 35 ta 40 mitään vettä. Suspensionäyte laimennettiin 100-ker- * «> 40 112377 taisesti vedellä ja 0,1 ml laimennusta levitettiin maljalle. Käytetty vesi oli suodatettu 0,22 μ:η suodattimen läpi. Maljoja inkuboitiin 28 °C:n lämpötilassa ja valittiin kirkastuneita vyöhykkeitä ympäröivät pesäkkeet. Valinta 5 perustui siihen, että taksoli on liukenematon siinä kon-sentraatiossa, jossa sitä käytettiin, elatusaineeseen antaen maljoille samean ulkonäön, kun taas hydrolyysin tuottama bakkatiini III ja sivuketju ovat liuokoisia muodostaen täten kirkkaan vyöhykkeen pesäkkeiden ympärille. Va-10 littuihin mikro-organismeihin sisältyvät: Nocardioides
albus -kannat ATCC 55424 (SC 13910) ja ATCC 55425 (SC
13911) ; ja Nocardioides luteus -kanta ATCC 55426 (SC
13912) .
Esimerkki 7 15 C-13-asemaan liittyvän sivuketjun poistaminen tak- solista Tämän esimerkin rektio eteni kuten seuraavassa kaaviossa 1 on esitetty. 50 ml:n Erlenmeyerpullot, jotka sisälsivät 10 ml elatusainetta, inokuloitiin Nocardioides 20 albus -kannoilla ATCC 55424 (SC 13910) tai ATCC 55425 (SC 13911), jotka oli eristetty maasta, kuten esimerkissä 6 on kuvattu ja pulloja ravistettiin kahden päivän ajan 28 °C:n lämpötilassa, 150 rpm. Elatusaine sisälsi litraa kohden tislattua vettä: 10 g Bacto-tryptonia, 5 g Bacto-hiivauu-25 tetta ja 0,06 ml Tween 80:ntä pH-arvon ollessa 6,8 ± 0,2. Solut poistettiin sentrifugoimalla ja päällysnesteiden pH-arvo säädettiin arvosta 8,66 arvoon 7 1 M KH2P04:n avul-’·' la.
Lisättiin 0,5 mg taksolia 20 pl:ssa metanolia 2 • V 30 ml:aan kutakin päällysnestettä ja seoksia sekoitettiin 21 : : tunnin ajan ympäröivässä lämpötilassa (noin 23 eC). Liuok set uutettiin 4 ml:11a CH2Cl2:a. Uutteet kuivattiin N2:n alla huoneenlämpötilassa, ne liuotettiin uudelleen metano-liin ja analysoitiin HPLC:n avulla (edellä kuvattu mene-:t* ; 35 telmä 3). Kannasta ATCC 55424 (SC 13910) saatu päällysnes- : te tuotti 0,008 mg/ml taksolia ja 0,163 mg/ml bakkatiini 112377 41 III:a (muuttuminen 94,9 mooli-%). Kannasta ATCC 55425 (SC 13911) saatu päällysneste tuotti 0,014 mg/ml taksolia ja 0,166 mg/ml bakkatiini III:a (muuttuminen 96,7 mooli-%). (Bakkatiini III ja lohkaistu sivuketjutuote identifioitiin 5 LC-MS:n avulla).
Kaavio 1 OAc TAKSOLI ^ HO— CH 4^r\.—t I OH I i\^0 . .CH-NH O OAc (of CO j-o 20 OAc i r ;·! 25 h
Ji / ?—OH
+ ho—CH
OH I i\^0 I
Ö OAc .CH—NH
o ” r ® Γ :7 ,. 3 <& ; · Bakkatiini-III Sivuketju „ 112377 42
Esimerkki 8 C-13-asemaan liittyvän sivuketjun poistaminen kefa-lomanniinistä
Kaksi 50 ml:n Erlenmeyerpulloa, jotka kumpikin si-5 sälsivät 10 ml elatusainetta (35 g maissiliuotuslientä, 20 g sereloosia, 5 g (NH4)2S04:a, 3,5 g CaC03:a ja 5 ml soijaöljyä laimennettuna 1 l:ksi tislatulla vedellä), inokuloitiin kumpikin 0,5 ml:11a Nocardioides albus -kantaa ATCC 55425 (SC 13911). Viljelmiä inkuboitiin kaksi 10 päivää 28 °C:n lämpötilassa, kierrosnopeus 150 rpm, minkä
jälkeen nämä kaksi viljelmää lisättiin 4 l:n pulloon, joka sisälsi 1 1 elatusainetta, jota käytettiin esimerkissä 7. Sitten 72 tunnin kuluttua 28 °C:n lämpötilassa, kierrosnopeus 200 rpm, solut poistettiin sentrifugoimalla ja pääl-15 lysnesteen pH-arvo säädettiin arvosta 8,16 arvoon 7 IM
KH2P04:n avulla.
Inkuboitiin 0,5 g kefalomanniinia 20 pl:ssa metano- lia 2 ml:n kanssa päällysnestettä 17 tunnin ajan pää-yli- pään-ravistimella (Fisher Roto-Rack). Liuos uutettiin 20 metyleenikloridilla, uute haihdutettiin, suspendoitiin uudelleen metanoliin ja analysoitiin HPLC:n avulla (edellä ·· kuvattu menetelmä 2). Kefalomanniinin konsentraatio väheni 0,175 mg:sta/ml 0 mg:aan/ml ja tuotettiin 0,110 mg/ml bak- katiini III:a (saanto 89 mooli-% perustuen alkuperäiseen ,·, : 25 analysoituun kefalomanniinin konsentraatioon).
* 1 ·
Esimerkki 9 t 2 # C-13-asemaan liittyvän sivuketjun poistaminen 7-ksylosyylitaksolista
Nocardioides albus -kannoista ATCC 55424 (SC 13910) : .* 30 ja ATCC 55425 (SC 13911) saadut entsyymit valmistettiin kuten esimerkissä 8 on kuvattu, paitsi että 1 l:n viljel-. miä inkuboitiin kahden päivän ajan kolmen päivän sijasta.
Nocardioides luteus -kantaa ATCC 55426 (SC 13912) kasva-• tettiin, kuten on kuvattu kannan Nocardioides albus ATCC
35 55425 (SC 13911) yhteydessä esimerkissä 8. Kolmen päivän * i 43 1 1237'/ kuluttua solut kerättiin talteen sentrifugoimalla, pestiin 600 miellä 50 mM kaliumfosfaattipuskuria, pH-arvo 7, ja sentrifugoitiin jälleen. Pakastettiin 36,6 g märkiä soluja -72 °C:ssa, ne pakkaskuivattiln 2,52 g:ksi kahdessa päi-5 vässä, jauhettiin morttelissa survimen avulla ja varastoitiin 2 °C:n lämpötilaan.
1,8 ml:aa päällysnestettä, joka oli saatu kannoista ATCC 55424 (SC 13910) ja ATCC 55425 (SC 13911), ja 50 mg:aa kannan ATCC 55426 (SC 13912) kuivattuja soluja 1,8 10 ml:ssa vettä inkuboitiin kumpaakin 0,5 mg:n kanssa 7-ksy-losyylitaksolia 0,2 ml:ssa metanolia 42 tunnin ajan huoneenlämpötilassa Fisher Roto-Rack-laitteella. Reaktioseok-set uutettiin metyleenikloridilla ja kuivatut uutteet liuotettiin metanoliin HPLC-analyysiä varten (edellä ku-15 vattu menetelmä 3). 7-ksylosyylitaksolin määrä väheni 0,218 mg:sta/ml 0 mg:aan/ml kummankin entsyymin kanssa. Kummassakin näytteessä päätuote identifioitiin 7-ksylo-syylibakkatiini III:ksi HPLC-massaspektrometrian avulla. Perustuen bakkatiini III:n standardiin ATCC 55424 (SC 20 13910), ATCC 55425 (SC 13911) ja ATCC 55426 (SC 13912) tuottivat 7-ksylosyylibakkatiini III-tuotteen konsentraa-*· tiot 0,112, 0,118 ja 0,120 mg/ml vastaavassa järjestyksiä sessä. Käyttäen samaa ekstinktiokerrointa aallonpituudella, la 235 nm bakkatiini III:lie ja 7-ksylosyylibakkatiini • : 25 Ulille lasketut saannot olisivat 88 %, 93 % ja 94 % vas taavassa järjestyksessä (mooli-%).
Esimerkki 10 ’ Kasvisoluseosten hydrolyysi
Uutettiin 1 g Taxus hicksii-kasvin neulasia 10 i ',· 30 ml:11a metanolin ja etikkahapon 5 000:1 -seosta. Lisättiin 10 ml:aan uutetta 10 ml veden ja etikkahapon 500:1 -seos-, ; . ta. Seosta sentrifugoitiin 10 minuutin ajan kierrosnopeu- t - t della 48 000 x g 20 °C:n lämpötilassa. Pelletti hylättiin.
I I
Ravisteltiin 4 ml:aa uutetta ja 16 ml:aa päällysnestettä, *. i 35 joka oli saatu Nocardioides albus -kannasta ATCC 55424 (SC
44 1 12 3 7 7 13910) tai ATCC 55425 (SC 13911) (valmistettu kuten esimerkissä 9 on kuvattu) 50 ml:n Erlenmeyerpullossa 28 °C:n lämpötilassa klerrosnopeudella 150 rpm 42 tunnin ajan. Näytteet uutettiin metyleenikloridilla ja haihdutetut uut-5 teet liuotettiin metanoliin HPLC-analyysiä varten (edellä kuvattu menetelmä 2). Seuraavassa taulukossa 3 esitetään taksaanikonsentraatiot ja moolisuhteet (bakkatiini III + 10-desasetyylibakkatiini III)/alkuperäinen taksoli käyttäen entsyymikäsittelyä ja ilman sitä.
10 Taulukko 3
Neulasuutteen entsymaattinen hydrolyysi
Entsyymi bakkatiini taksoli peräisin-1- III μα/ml kefalo- μα/ml 1 c 10-des- ' manniini asetyyli- desasetvv- W£l2inl eimt. ^ isss;, syymiä 0,126 jälkiä 0,012 0^153 0,392 50,4 SC13910 0 f 602 0,319 0,000 0,000 0,000 359,3 SC13911 0,959 0,294 0.000 0,000 0,000 492.8 * Arvot annettu mooli-%:eina (DAB + B)/(alkuperät-nen taksoli); DAB = 10-desasetyylibakkatiini III B bakkatiini III.
25 Esimerkki 11
Entsyymin puhdistaminen ja taksaanien hydrolyysi 100 ml elatusainetta (35 g maissiliuotuslientä, v : 20 g sereloosia, 5 g ammoniumsulfaattia, 3,5 g kalsiumkar- bonaattla ja 5 ml soijaöljyä laimennettuna 1 l:ksl tisla-; 30 tulla vedellä) 500 ml:n Erlenmeyerpullossa inokuloitiin • * 1 mlilla mikro-organismia Nocardloides albus ATCC 55425 (SC 13911) samassa elatusaineessa ja viljelmää ravisteltiin 2 päivän ajan 28 °C:n lämpötilassa. Sitten 20 ml tätä viljelmää siirrettiin 1 l:aan tislattua vettä, joka sisäl-35 si 10 g tryptonia ja 5 g hiivauutetta, pH-arvo 6,8 ± 0,2 4 • » 45 1 12 3 77 l:n Erlenraeyerpullossa. Pulloa ravistettiin 3 päivän ajan 28 eC:n lämpötilassa, solut poistettiin sentrifugoimalla ja päällysnesteen pH-arvo säädettiin arvosta 7,89 arvoon 7 1 M KH2P04:n avulla.
5 Kaikki puhdistusvaiheet toteutettiin 4 °C:n lämpö tilassa. Päällysneste pantiin 150 ml:aan Whatman DE52-anioninvaihdinta 25 mM kaliumfosfaattipuskurissa, pH-arvo 7, halkaisijaltaan 5 cm:n suuruisessa pylvässä. Pylväs pestiin 150 ml:11a puskuria, sitten 450 ml:11a puskuria, 10 joka sisälsi 0,25 M NaCl:a. Entsyymiaktiivisuus eluoitiin puskurilla + 0,45 M NaCl:lla. Virtausnopeus oli 5 ml/min. DE52-pylväästä saatuihin aktiivisimpiin fraktioihin lisättiin ammoniumsulfaattia (100 mg/ml) ja liuos pantiin 30 ml:n Pharmacia Phenyl Sepharose CL-4B-pylvääseen (hydrofo-15 bisen vuorovaikutuksen kromatografia) 50 mM kaliumfosfaattipuskurissa, pH-arvo 7, joka sisälsi 100 mg/ml ammoniumsulfaattia halkaisijaltaan 2,6 cm:n suuruisessa pylväässä virtausnopeuden ollessa 1,6 ml/min. Pylväs pestiin 150 ml:11a puskuria + 20 mg:lla/ml ammoniumsulfaattia, sitten 20 aktiivisuus eluoitiin pelkästään puskurilla. Phenyl Sepharose -pylväästä saadut aktiivisimmat fraktiot väkevöitiin j. ultrasuodattamalla 4 ml:n tilavuuteen käyttäen Amicon YM10 , -membraania ja laskettiin Pharmacia Sephacryl S-200 -gee- lisuodatuspylvään (2,6 x 84 cm) läpi virtausnopeuden ol-. 25 lessa 0,65 ml/min. Suurimman spesifisen aktiivisuuden omaavaalla fraktiolla oli molekyylipainon yksi kaista ;; 49 000 ± 10 000 natriumdodekyylisulfaattigeelillä (SDS- ' geelillä). Puhdistamisesta esitetään yhteenveto seuraavas- sa taulukossa 4. (1 milliyksikkö entsyymiä (mu) kataly- 30 soi taksolin 1 nmol:in/min muutoksen bakkatiini III:ksi : 28 °C:n lämpötilassa 50 mM kaliumfosfaattipuskurissa, joka ; sisälsi 0,25 mg/ml taksolia ja 1 % metanolia).
46 1 12 3 7 7
Taulukko 4
Tilavuus Proteiini Aktiivisuus Vaihe ml ma mu 5 elatusaine 1000 885 4664 DE52 99 104 1194
Phenyl Sepharose 16 6^45 .801
CL-4B
Sephacryl S-200 8,8 0,150 164 10 7
Spesifinen aktiivisuus Talteenotto Y3ihe mu/ma 1
Elatusaine 5727 DE52 11,5 25,6 15
Phenyl Sepharose 124 17; 2
CL-4B
Sephacryl S-200 1093 3;5
Edellä puhdistetun entsyymin aktiivisuuden osoitta-20 miseksi seuraavat kokeet toteutettiin käyttäen taksaani-substraatteja, jotka on lueteltu taulukossa 5.
Valmistettiin näytteet, jotka sisälsivät 0,5 mg > *
· taksaanisubstraattia ja 1 % metanolia 2,0 ml:ssa 50 mM
' kaliumfosfaattipuskuria, pH-arvo 7, (näytteet 1, 2, 3, 4 ! -· 25 ja 5). Valmistettiin myös näytteet, jotka sisälsivät 10 mu | entsyymiä entsyymistä, joka oli puhdistettu edellä kuva- tussa Phenyl Sepharose CL-4B-vaiheessa, sen lisäksi, että ne sisälsivät 0,5 mg taksaanisubstraattia ja 1 % metano-lia 2,0 ml:ssa 50 mM kaliumfosfaattipuskuria, pH-arvo 7, 30 (näytteet le, 2e, 3e, 4e ja 5e). Kaikkia näytteitä se- • » .···, koitettiin 16 tunnin ajan Fisher Roto Rack -laitteella [· 28 °C:n lämpötilassa. Näytteet 1, le, 2, 2e, 5 ja 5e *.‘ uutettiin 4 ml:11a metyleenikloridia. Sitten 2 ml uutetta kuivattiin, liuotettiin uudelleen 1 ml:aan metanolia ja · 35 analysoitiin HPLC-menetelmän 3 avulla. Näytteet 3, 3e, 4 47 1 12377 ja 4e laimennettiin 2 ml:11a metanolia ja analysoitiin HPLC-menetelmän 3 avulla (C-13-asemaan liittyvä sivuketju mitattiin vain näistä jälkimmäisistä näytteistä).
Taulukko 5 osoittaa taksaanisubstraatin määrän 5 (mg/ml), joka jäi jäljelle kaikkiin näytteisiin inkuboin-nin jälkeen sekä tuotetaksaanin määrän (mg/ml), joka oli läsnä inkuboinnin lopussa. Kuten taulukosta 5 voidaan nähdä (katso näytteet le, 2e, 3e, 4e ja 5e), edellä kuvatulla tavalla puhdistettu entsyymi on tehokas poistamaan C-13-10 asemaan liittyvän sivuketjun tässä lueteltujen taksaani-substraattien hydrolyysin avulla.
Taulukko 5
Taksaanien hydrolyysi puhdistetun entsyymin avulla 15
Substraatti Jäljellä Tuote
Sivu- ketju 2q Näyte ma/ml | ma /ml ma/ml 1 taksoli 0^268 I 0,003 le 0,030 I bakkatiini-ϊΙΙ 0,170 » i ·
·’ 2 kefalomanniini 0,239 I
V ' 2e 0,011 I bakkatiini-III 0,190
; ’·* 25 3 7-ksylosyyli- 0,250 I
... taksoli 7-ksylosyyli- 0 182 0 066 • · ,se > bakkatiini-III / f
4 7-ksylosyyli- 0,250 I
• 10-deasetyyli- taksoli A* 0,113 I 7-ksylosyyli- 0,108 0,044 • V ’ 10-deasetyyli- 1 >
I bakkatiini-III
V * 5 10-deasetyyli- 0,257 I
taksoli * · : 35 ςβ 0,000 | 10-deasetyyli- 0.150 ’ · ' bakkatiini-III ' • » 48 112 3 7 7
Esimerkki 12 Taimiuutteen hydrolyysi
Taxus hieksi! "kasvin taimien etanoliuute väkevöi-tiin 10 - 15-kertaisesti nanosuodattimien avulla. Sitten 5 0,5 ml:aa uutetta, 0,5 ml:aa 1 M kaliumfosfaattipuskuria, pH-arvo 7, 54 mu osittain puhdistettua entsyymiä, joka oli saatu mikro-organismista Nocardioides albus ATCC 55425 (SC 13911) (katso esimerkki 11 edellä), ja 4 ml:aa vettä sekoitettiin 28 eC:n lämpötilassa 48 tunnin ajan Fisher Roto 10 Rack -laitteen avulla. Kontrollinäytteeseen ei lisätty entsyymiä. Näytteet uutettiin metyleenikloridilla ja haihdutetut uutteet liuotettiin metanoliin analysointia varten HPLC-menetelmän 2 avulla. Saadut tulokset esitetään seu-raavassa taulukossa 6.
15 Taulukko 6
Taimiuutteen hydrolyysi
Entsyymi 10-DAB bacc-III SSPh XBX taksoli peräisin mrt/ml ma/ml ma/ml ma/ml fflfl/Pl 20 ei e?-_ 0.167 0,142 0.243 0.246 0.401 SC13911 0 j400 0^771 0,000 0,027 0^000
Entsyymi. 10-DAT taksoli C (DAB+B)/ ; (alkupe räinen * 25 taksoli) j peräisin ma/ml ma/ml mooli-% saanto ei ent- _ syymiä 0,201 Dalkia 116,8 SC13911 0 ^014 0;000 436^3 30 Taulukossa 6: • * 10-DAB on 10-desasetyylibakkatiini III bacc-III tai B on bakkatiini III eeph on kefalomanniini XDT on 7-ksylosyyli-10-desasetyylitaksoli 35 10-DAT on 10-desasetyylitaksoli.
> > > >

Claims (55)

1. Menetelmä vähintään yhden taksaanin valmistamiseksi, joka sisältää hydroksyyliryhmän suoraan sitoutuneena
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan vähintään yksi C-10-asemaan liittyvän hydroksyyliryhmän sisältävä taksaani, jolla on seuraava kaava I: 15 HO i? * oh \ Ö-C(0)R3
0-C(0)R4 jossa : R1 on hydroksyyli tai asyylioksi; R2 on vety, hydroksyyli, fluori, R5-0-, ksylosyyli, 20 Rs-C (O) -0- tai Rs-0-C (O) -O- ; R3 ja R4 ovat toisistaan riippumatta vety, alkyyli, alkenyyli, alkynyyli, sykloalkyyli, sykloalkenyyli, aryyli ,tai heterosyklo; R5 on hydroksyyliä suojaava ryhmä; ja ‘ 25 R6 on vety, alkyyli, alkenyyli, alkynyyli, sykloal- kyyli, sykloalkenyyli, aryyli tai heterosyklo; ;*·,· tai sen suola, * > 1 12377 saattamalla vähintään yksi C-10-asemaan liittyvän asyylioksiryhmän sisältävä taksaani, jolla on seuraava kaava II: R\_J R2 OH \ 0-C(0)R3
0-C(0)R4 5 jossa R1, R2, R3 ja R4 ovat kuten edellä on määritelty ja R7 on asyylioksi; tai sen suola, kosketukseen entsyymin tai mikro-organismin kanssa, joka kykenee katalysoimaan mainitun R7-asyylioksiryhmän hydrolyysin hydroksyyliryhmän muo-10 dostamiseksi.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu kaavan II mukainen taksaani on bakkatiini III ja mainittu kaavan I mukainen ,)·’ taksaani on 10-desasetyylibakkatiini III.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitussa hydrolyysimenetel-• j mässä käytetty asyylioksiryhmän sisältävä taksaanilähtöaine käsittää asyylioksiryhmän sisältävien taksaanien seoksen.
5 ATCC 55425 (SC 13911) ja Nocardioides luteus ATCC 55426 (SC 13912).
5 R2 on vety, hydroksyyli, fluori, R5-0-, ksylosyyli, Rs-C (0)-0- tai R6-0-C (0)-0-; R3 ja R4 ovat toisistaan riippumatta vety, alkyyli, alkenyyli, alkynyyli, sykloalkyyli, sykloalkenyyli, aryyli tai heterosyklo;
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, t · 20 tunnettu siitä, että mainittu taksaanien seos saa-. daan kasvikudoksen kasvisoluviljelmän avulla ja/tai uutta- :(i;' maila kasvikudoksesta, jolloin mainittu kasvi on Taxus- suvun jäsen.
5 C-10-asemaan, tunnettu siitä, että vähintään yksi taksaani, joka sisältää asyylioksiryhmän suoraan sitoutuneena C-10-asemaan, saatetaan kosketukseen entsyymin tai mikro-organismin kanssa, joka kykenee katalysoimaan mainitun asyylioksiryhmän hydrolyysin hydroksyyliryhmän muodos-10 tamiseksi, ja toteutetaan mainittu hydrolyysi.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että käytetään mikro-organismia, ,· , joka kuuluu yhteen seuraavista suvuista: Nocardioides, No- cardia, Rhodococcus, Micropolyspora, Saccharopolyspora, • t ' «·* Pseudonocardia, Oerskovia, Promicromonospora tai Intraspo- rangium. 112377 51
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään mikro-organismia, joka kuuluu Nocardioides-sukuun.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että mainittu mikro-organismi on valittu ryhmästä, joka koostuu mikro-organismeista Nocardioides albus, Nocardioides flavus, Nocardioides fulvus, Nocardioides luteus, Nocardioides simplex ja Nocardioides thermolilacinus.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu mikro-organismi on valittu ryhmästä, joka koostuu mikro-organismeista Nocardioides albus ATCC 55424 (SC 13910), Nocardioides albus ATCC 55425 (SC 13911) ja Nocardioides luteus ATCC 55426 (SC 15 13912) .
10 R5 on hydroksyyliä suojaava ryhmä; ja R6 on vety, alkyyli, alkenyyli, alkynyyli, sykloalkyyli, sykloalkenyyli, aryyli tai heterosyklo; tai sen suola, saattamalla vähintään yksi C-13-asemaan liittyvän asyylioksiryhmän sisältävä taksaani, jol-15 la on seuraava kaava VI: ♦ ac(0)R4 1*1 t t » * * « • · · » • · I jossa R12, R2, R3 ja R4 ovat kuten edellä on määri- .·. ; 20 telty ja R7 on asyylioksi, tai sen suola, kosketukseen mai- > » ,«>, nitun entsyymin tai mikro-organismin kanssa. * i 112377 57
10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi on peräisin mikro-organismista, joka kuuluu yhteen seuraavista suvuista: Nocardioides, Nocardia, Rhodococcus, Micropolyspora,
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi on peräisin l mikro-organismista, joka kuuluu Nocardioides - sukuun.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, • · ··. tunnettu siitä, että mainittu entsyymi on peräisin mikro-organismista, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu mikro-organismeista Nocardioides albus, Nocardioides . flavus, Nocardioides fulvus, Nocardioides luteus, Nocardi- *,,! 30 oides simplex ja Nocardioides thermolilacinus. » · Ί’
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, » * * ·',! ! tunnettu siitä, että mainittu entsyymi on peräisin mikro-organismista, joka on valittu ryhmästä, joka koos-C . tuu mikro-organismeista Nocardioides albus ATCC 55424 (SC *:./ 35 13910) , Nocardioides albus ATCC 55425 (SC 13911) ja Nocar- ’’·** dioides luteus ATCC 55426 (SC 13912) . 112377 52
14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saatua taksaanituotetta käytetään valmistettaessa taksaania, jossa on asyylioksiryhmä C-13-asemassa.
15. Menetelmä vähintään yhden taksaanin valmistami seksi, joka sisältää asyylioksiryhmän suoraan sitoutuneena C-10-asemaan, tunnettu siitä, että vähintään yksi taksaani, joka sisältää hydroksyyliryhmän suoraan sitoutuneena C-10-asemaan, saatetaan kosketukseen asyloivan aineen 10 ja entsyymin tai mikro-organismin kanssa, joka kykenee katalysoimaan mainitun hydroksyyliryhmän esteröinnin asyy-lioksiryhmäksi, ja toteutetaan mainittu esteröinti.
16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan vähintään yksi C-15 10-asemaan liittyvän asyylioksiryhmän sisältävä taksaani, jolla on seuraava kaava II: r7 o r2 0-C(0)R4 ;·. jossa » ·
17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu kaavan II mukainen taksaani on bakkatiini III ja mainittu kaavan I mukainen " 15 taksaani on 10-desasetyylibakkatiini III.
18. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, ” tunnettu siitä, että mainitussa esteröintimenetel- •mässä käytetty hydroksyyliryhmän sisältävä taksaanilähtöai-ne käsittää hydroksyyli ryhmän sisältävien taksaanien seok-· 2 0 sen.
19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu taksaanien seos saa-daan kasvikudoksen kasvisoluviljelmän avulla ja/tai uutta-maila kasvikudoksesta, jolloin mainittu kasvi on Taxus- ’;‘t’ 2 5 suvun jäsen. '···’ 20. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, ;*·,: tunnettu siitä, että käytetään mikro-organismia, joka kuuluu yhteen seuraavista suvuista: Nocardioides, No-cardia, Rhodococcus, Micropolyspora, Saccharopolyspora, 112377 54 Pseudonocardia, Oerskovia, Promicromonospora tai Intrasporangium.
20 R1 on hydroksyyli tai asyylioksi; R2 on vety, hydroksyyli, fluori, R5-0-, ksylosyyli, :ti;' R6-C(0)-0- tai R6-0-C (O)-O-; ’ ··' R3 ja R4 ovat toisistaan riippumatta vety, alkyyli, alkenyyli, alkynyyli, sykloalkyyli, sykloalkenyyli, aryyli 25 tai heterosyklo; .* . R5 on hydroksyyliä suojaava ryhmä; ja R6 on vety, alkyyli, alkenyyli, alkynyyli, sykloal-’···' kyyli, sykloalkenyyli, aryyli tai heterosyklo; ja R7 on asyylioksi; 112377 53 tai sen suola, saattamalla vähintään yksi C-10-asemaan liittyvän hydroksyyliryhmän sisältävä taksaani, jolla on seuraava kaava I: ho i? r1 OH \ Ö-C(0)R3
0-C(0)R4 5 j ossa R1, R2, R3 ja R4 ovat kuten edellä on määritelty; tai sen suola, kosketukseen asyloivan aineen ja entsyymin tai mikro-organismin kanssa, joka kykenee katalysoimaan C-10 10-asemaan liittyvän hydroksyyliryhmän esteröinnin mainitun R7-asyylioksiryhmän muodostamiseksi.
20 Saccharopolyspora, Pseudonocardia, Oerskovia, Promicro-monospora tai Intrasporangium.
21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään mikro-organismia, 5 joka kuuluu Nocardioides-sukuun.
22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu mikro-organismi on valittu ryhmästä, joka koostuu mikro-organismeista Nocardioides albus, Nocardioides flavus, Nocardioides fulvus, Nolo cardioides luteus, Nocardioides simplex ja Nocardioides thermolilacinus.
23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu mikro-organismi on valittu ryhmästä, joka koostuu mikro-organismeista Nocardi- 15 oides albus ATCC 55424 (SC 13910) , Nocardioides albus ATCC 55425 (SC 13911) ja Nocardioides luteus ATCC 55426 (SC 13912) .
24. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi on peräisin 20 mikro-organismista, joka kuuluu yhteen seuraavista suvuista: Nocardioides, Nocardia, Rhodococcus, Micropolyspora, ' Saccharopolyspora, Pseudonocardia, Oerskovia, Promicro- ' ·' monospora tai Intrasporangium.
; '·· 25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen menetelmä, ‘_‘.j 25 tunnettu siitä, että mainittu entsyymi on peräisin ··· mikro-organismista, joka kuuluu Nocardioides-sukuun. Pj*.
26. Patenttivaatimuksen 25 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi on peräisin mikro-organismista, joka on valittu ryhmästä, joka koos- • > 3. tuu mikro-organismeista Nocardioides albus, Nocardioides ’ * * flavus, Nocardioides fulvus, Nocardioides luteus, Nocardi- V : oides simplex ja Nocardioides thermolilacinus. ! ί
27. Patenttivaatimuksen 26 mukainen menetelmä, •j; tunnettu siitä, että mainittu entsyymi on peräisin > > i 35 mikro-organismista, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu mikro-organismeista Nocardioides albus ATCC 55424 112377 55 (SC 13910), Nocardioides albus ATCC 55425 (SC 13911) ja No-cardioides luteus ATCC 55426 (SC 13912) .
28. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu asyloiva aine on yh- 5 diste, jolla on seuraava kaava IV: Rn-C(0)-L (IV) jossa R11 on alkyyli, alkenyyli, alkynyyli, aryyli, 10 sykloalkyyli, sykloalkenyyli tai heterosyklo ja L on poistuva ryhmä, joka voidaan siirtää paikaltaan esteriryhmän muodostamiseksi.
29. Patenttivaatimuksen 28 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu asyloiva aine on vi- 15 nyyliasetaatti.
30. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saatua taksaanituotetta käytetään valmistettaessa taksaania, jossa on asyylioksiryhmä C-13-asemassa.
31. Entsyymi, joka kykenee patenttivaatimuksen 1 mukaiseen hydrolyysiin tai patenttivaatimuksen 15 mukaiseen esteröintiin, tunnettu siitä, että se on eristetty .·' · mikro-organismista Nocardioides luteus ATCC 55426 (SC i ··. 13912) . : 25
32. Menetelmä vähintään yhden taksaanin valmistami- *·· seksi, joka sisältää hydroksyy li ryhmän suoraan sitoutuneena C-13-asemaan, tunnettu siitä, että vähintään yksi taksaani, joka sisältää asyylioksiryhmän suoraan sitoutu-neena C-13-asemaan, saatetaan kosketukseen entsyymin tai 3 0 mikro-organismin kanssa, joka kykenee katalysoimaan maini- • I tun asyylioksiryhmän hydrolyysin hydroksyyliryhmän muodos-·’,· * tamiseksi, ja toteutetaan mainittu hydrolyysi.
33. Patenttivaatimuksen 32 mukainen menetelmä, > tunnettu siitä, että valmistetaan vähintään yksi C- » t I 35 13-asemaan liittyvän hydroksyylin sisältävä taksaani, jolla on seuraava kaava (V): » I 112377 56 Rv_i r2 OH \ 0-C(0)R3
0-C(0)R4 j ossa R12 on vety, hydroksyyli, Rs-0-, R6-C (0)-0- tai RS-0-C(0)-0-;
34. Patenttivaatimuksen 33 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu kaavan VI mukainen taksaani on kefalomanniini, 7-ksylosyyli-lO-desasetyyli-taksoli, 10-desasetyylitaksoli, 7-ksylosyylitaksoli, takso- 5 li-C ja/tai taksoli, ja mainittu kaavan V mukainen taksaani on bakkatiini III, 10-desasetyylibakkatiini III, 7-ksy-losyyli-10-desasetyylibakkatiini III ja/tai 7-ksylosyyli-bakkatiini III.
35. Patenttivaatimuksen 33 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että mainitussa hydrolyysimenetel- mässä käytetty asyylioksiryhmän sisältävä taksaanilähtöaine käsittää seoksen, joka koostuu asyylioksiryhmän sisältävistä taksaaneista, joilla on erilaiset sivuketjut C-13-asemaan liittyen.
36. Patenttivaatimuksen 35 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu taksaanien seos saadaan kasvikudoksen kasvisoluviljelmän avulla ja/tai uuttamalla kasvikudoksesta, jolloin mainittu kasvi on Taxus-suvun jäsen.
37. Patenttivaatimuksen 32 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään mikro-organismia, ·: joka kuuluu yhteen seuraavista suvuista: Nocardioides, No- * cardia, Rhodococcus, Micropolyspora, Saccharopolyspora, ; ’*· Pseudonocardia, Oerskovia, Promicromonospora tai Intraspo- 25 rangium.
'.’· 38. Patenttivaatimuksen 37 mukainen menetelmä, t i S 1 tunnettu siitä, että käytetään mikro-organismia, joka kuuluu Nocardioides-sukuun.
39. Patenttivaatimuksen 38 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että mainittu mikro-organismi on Ύ valittu ryhmästä, joka koostuu mikro-organismeista Nocardi- V · oides albus, Nocardioides flavus, Nocardioides fulvus, No- cardioides luteus, Nocardioides simplex ja Nocardioides ·’ · thermolilacinus. t f t * i > ,·'·! 35 t a 112377 58
40. Patenttivaatimuksen 39 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu mikro-organismi on valittu ryhmästä, joka koostuu mikro-organismeista Nocardi-oides albus ATCC 55424 (SC 13910), Nocardioides albus
41. Patenttivaatimuksen 32 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi on hydrolaa-si.
42. Patenttivaatimuksen 32 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi on peräisin mikro-organismista, joka kuuluu yhteen seuraavista suvuista: Nocardioides, Nocardia, Rhodococcus, Micropolyspora, Saccharopolyspora, Pseudonocardia, Oerskovia, Promicro-15 monospora tai Intrasporangium.
43. Patenttivaatimuksen 42 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi on peräisin mikro-organismista, joka kuuluu Nocardioides-sukuun.
44. Patenttivaatimuksen 43 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että mainittu entsyymi on peräisin mikro-organismista, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu mikro-organismeista Nocardioides albus, Nocardioides fla-v · vus, Nocardioides fulvus, Nocardioides luteus, Nocardioides ’· simplex ja Nocardioides thermolilacinus. t
45. Patenttivaatimuksen 44 mukainen menetelmä, c tunnettu siitä, että mainittu entsyymi on peräisin mikro-organismista, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu mikro-organismeista Nocardioides albus ATCC 55424 (SC 13910) , Nocardioides albus ATCC 55425 (SC 13911) ja Nocar-30 dioides luteus ATCC 55426 (SC 13912).
46. Patenttivaatimuksen 32 mukainen menetelmä, ·,·* tunnettu siitä, että mainitun hydrolyysin jälkeen • !:i‘ mainittu vähintään yksi taksaani, joka sisältää hydroksyy- ; liryhmän suoraan sitoutuneena C-13-asemaan ja jossa hydrok- 35 syyliryhmät, jotka ovat muissa asemissa kuin C-13-asemassa, ‘ · 112377 59 on mahdollisesti suojattu, kytketään yhdisteeseen, joka muodostaa asyylioksisivuketjun C-13-asemaan.
47. Patenttivaatimuksen 46 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitun hydrolyysin ja kyt- 5 kennän sisältävän menetelmän avulla valmistetaan lopputuotteena taksoli.
48. Menetelmä mikro-organismin valitsemiseksi, joka joutuessaan kosketukseen taksaanin kanssa, joka sisältää asyylioksiryhmän sitoutuneena suoraan C-13-asemaan, kykenee 10 hydrolysoimaan mainitun asyylioksiryhmän hydroksyyliryhmän muodostamiseksi, joka sitoutuu suoraan C-13-asemaan, tunnettu siitä, että (a) valitaan kiinteä kasvualusta (i), jossa seulottava mikro-organismi kasvaa ja (ii) johon lähtöaineena käy-15 tettävä C-13-asemaan liittyvän asyylioksiryhmän sisältävä taksaani ei liukene ja siten sillä on seoksena kasvualustan kanssa samea ulkonäkö ja (iii) johon haluttu C-13-asemaan liittyvän hydroksyyliryhmän sisältävä taksaanituote ja mahdollisesti haluttu, lohkaistu C-13-asemaan liittyvä sivu-20 ketju liukenevat ja siten niillä on seoksena kasvualustan kanssa kirkas ulkonäkö; , ,T (b) saatetaan mainittu mikro-organismi kosketukseen · edellä vaiheessa (a) valitun kasvualustan kanssa, jolloin ! *.. kasvualustaan on sekoitettu C-13-asemaan liittyvän asyy- 25 lioksiryhmän sisältävä lähtöainetaksaani, olosuhteissa, jotka sallivat mikro-organismin kasvun; ja (c) tehdään havainnot siitä, ilmeneekö kirkas vyö- • * t hyke, joka osoittaa, että mikro-organismi kykenee mainit-.. . tuun hydrolyysiin, alueen ympärillä, jossa mikro-organismin 3. kasvu tapahtuu. *;*’ 49. Menetelmä mikro-organismin valitsemiseksi, joka ; ; joutuessaan kosketukseen taksaanin kanssa, joka sisältää asyylioksiryhmän sitoutuneena suoraan C-13-asemaan, kykenee , hydrolysoimaan mainitun asyylioksiryhmän hydroksyyliryhmän i,* 35 muodostamiseksi, joka sitoutuu suoraan C-13-asemaan, ’ ·' tunnettu siitä, että 112377 60 (a) valitaan kiinteä kasvualusta (i), jossa seulottava mikro-organismi kasvaa ja (ii) johon lähtöaineena käytettävä C-13-asemaan liittyvän asyylioksiryhmän sisältävä taksaani liukenee ja siten sillä on seoksena kasvualustan 5 kanssa kirkas ulkonäkö ja (iii) johon haluttu C-13-asemaan liittyvän hydroksyyliryhmän sisältävä taksaanituote ja mahdollisesti haluttu C-13-asemaan liittyvä lohkaistu sivuket-jutuote eivät liukene ja siten niillä on seoksena kasvualustan kanssa samea ulkonäkö, 10 (b) saatetaan mikro-organismi kosketukseen edellä vaiheessa (a) valitun kasvualustan kanssa, johon lähtöaineena käytettävä C-13-asemaan liittyvän asyyloksiryhmän sisältävä taksaani on sekoitettu, olosuhteissa, jotka sallivat mikro-organismin kasvun; ja 15 (c) tehdään havainnot siitä, ilmeneekö samea vyöhy ke, joka osoittaa, että mainittu mikro-organismi kykenee mainittuun hydrolyysiin, alueen ympärillä, jossa mikro-organismin kasvu tapahtuu.
49 1 12377
50. Mikro-organismi Nocardioides albus ATCC 55424, 20 joka on biologisesti puhdas.
51. Mikro-organismi Nocardioides albus ATCC 55425, : joka on biologisesti puhdas. V
· 52. Mikro-organismi Nocardioides luteus ATCC 55426, > joka on biologisesti puhdas.
53. Entsyymi, tunnettu siitä, että se ky- i * -· kenee patenttivaatimuksen 32 mukaiseen hydrolyysiin ja on < t I t eristetty mikro-organismista Nocardioides albus ATCC 55424. *
54. Entsyymi, tunnettu siitä, että se ky- ..f.> kenee patenttivaatimuksen 32 mukaiseen hydrolyysiin ja on * · 30 eristetty mikro-organismista Nocardioides albus ATCC 55425. ‘I*
55. Entsyymi, tunnettu siitä, että se ky- t ) I V · kenee patenttivaatimuksen 32 mukaiseen hydrolyysiin ja on : I eristetty mikro-organismista Nocardioides luteus ATCC 55426. ' » » ; i i I 35 61 1 12377
FI942794A 1993-06-15 1994-06-13 Entsymaattinen hydrolyysimenetelmä C-10- ja C-13-asemaan liittyvän hydroksyyliryhmän sisältävien taksaanien valmistamiseksi, entsymaattinen esteröintimenetelmä C-10-asemaan liittyvän asyylioksiryhmänsisältävien taksaanien valmistamiseksi ja mainittujen yhdisteiden käyttö C13-asemaan liittyvän asyylioksiryhmän sisältävien taksaanien valmistamiseksi FI112377B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/077,980 US5523219A (en) 1993-06-15 1993-06-15 Enzymatic hydrolysis method for the preparation of C-10 hydroxyl-bearing taxanes and enzymatic esterification method for the preparation of C-10 acyloxy-bearing
US08/077,979 US5516676A (en) 1993-06-15 1993-06-15 Preparation of C-13 hydroxyl-bearing taxanes using nocardioides or a hydrolase isolated therefrom
US7798093 1993-06-15
US7797993 1993-06-15

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI942794A0 FI942794A0 (fi) 1994-06-13
FI942794A FI942794A (fi) 1994-12-16
FI112377B true FI112377B (fi) 2003-11-28

Family

ID=26759913

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI942794A FI112377B (fi) 1993-06-15 1994-06-13 Entsymaattinen hydrolyysimenetelmä C-10- ja C-13-asemaan liittyvän hydroksyyliryhmän sisältävien taksaanien valmistamiseksi, entsymaattinen esteröintimenetelmä C-10-asemaan liittyvän asyylioksiryhmänsisältävien taksaanien valmistamiseksi ja mainittujen yhdisteiden käyttö C13-asemaan liittyvän asyylioksiryhmän sisältävien taksaanien valmistamiseksi

Country Status (18)

Country Link
EP (1) EP0629701B1 (fi)
JP (1) JP3587880B2 (fi)
KR (1) KR100342624B1 (fi)
CN (1) CN1110565C (fi)
AT (1) ATE189001T1 (fi)
AU (1) AU679978B2 (fi)
CA (1) CA2125726A1 (fi)
CY (1) CY2205B1 (fi)
DE (1) DE69422662T2 (fi)
DK (1) DK0629701T3 (fi)
ES (1) ES2142890T3 (fi)
FI (1) FI112377B (fi)
GR (1) GR3032990T3 (fi)
HK (1) HK1014742A1 (fi)
HU (1) HU217218B (fi)
IL (1) IL109926A (fi)
PT (1) PT629701E (fi)
SG (1) SG54139A1 (fi)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5677470A (en) * 1994-06-28 1997-10-14 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Baccatin derivatives and processes for preparing the same
CA2162759A1 (en) * 1994-11-17 1996-05-18 Kenji Tsujihara Baccatin derivatives and processes for preparing the same
IT1275936B1 (it) * 1995-03-17 1997-10-24 Indena Spa Derivati della 10-deacetilbaccatina iii e della 10-deacetil-14b- idrossibaccatina iii loro metodo di preparazione e formulazioni
EP0875508B1 (en) * 1997-05-02 2003-10-22 Pharmachemie B.V. Method for the preparation of baccatin III and derivatives thereof from 10-deacetylbaccatin III
US7288665B1 (en) 1997-08-18 2007-10-30 Florida State University Process for selective derivatization of taxanes
DE19962204A1 (de) * 1999-12-22 2001-07-05 Cognis Deutschland Gmbh Enzym-katalysierte Modifizierung von Substanzen in biologischen Gemischen
WO2001057028A1 (en) 2000-02-02 2001-08-09 Florida State University Research Foundation, Inc. C7 carbamoyloxy substituted taxanes as antitumor agents
BR0104350A (pt) 2000-02-02 2002-01-02 Univ Florida State Res Found Taxanos de c10 acetato heterossubstituìdo como agentes antitumor
AR030188A1 (es) 2000-02-02 2003-08-13 Univ Florida State Res Found Compuestos de taxano sustituidos con esteres en el c7; composiciones farmaceuticas que los contienen y proceso para tratar un sujeto mamifero que sufre de una condicion que responde a los taxanos
US6596737B2 (en) 2000-02-02 2003-07-22 Fsu Research Foundation, Inc. C10 carbamoyloxy substituted taxanes
US6649632B2 (en) 2000-02-02 2003-11-18 Fsu Research Foundation, Inc. C10 ester substituted taxanes
PL350028A1 (en) 2000-02-02 2002-10-21 Univ Florida State Res Found C10 carbonate substituted taxanes as antitumor agents
EP1200424B1 (en) 2000-02-02 2008-11-05 Florida State University Research Foundation, Inc. C7 heterosubstituted acetate taxanes as antitumor agents
KR20010112395A (ko) 2000-02-02 2001-12-20 플로리다 스테이트 유니버시티 리서치 파운데이션, 인크 항종양제로서의 ｃ７ 카르보네이트 치환된 탁산
EP1298128B1 (en) * 2001-09-28 2005-03-02 Council Of Scientific And Industrial Research Process for the preparation of 10-deacetylbaccatin III
US6437154B1 (en) 2001-09-28 2002-08-20 Council Of Scientific And Industrial Research Process for the preparation of 10-deacetylbaccatin III
PE20050693A1 (es) 2004-02-13 2005-09-27 Univ Florida State Res Found Taxanos sustituidos con esteres de ciclopentilo en c10
JP2007527432A (ja) 2004-03-05 2007-09-27 フロリダ・ステイト・ユニバーシティ・リサーチ・ファウンデイション・インコーポレイテッド Ｃ７ラクチルオキシ置換タキサン
ES2389518T3 (es) 2008-01-18 2012-10-26 Indena S.P.A. Formas sólidas de ortataxel
JP2011517455A (ja) 2008-03-31 2011-06-09 フロリダ・ステイト・ユニバーシティ・リサーチ・ファウンデイション・インコーポレイテッド Ｃ（１０）エチルエステルおよびｃ（１０）シクロプロピルエステル置換タキサン
CN106148471A (zh) * 2015-04-08 2016-11-23 中国科学院大连化学物理研究所 一种纤维单胞菌科作为工业生物催化剂的应用
CN105541763A (zh) * 2016-03-03 2016-05-04 重庆市碚圣医药科技股份有限公司 三尖杉宁碱水解制备10-脱乙酰基巴卡丁iii的方法
CN107164422B (zh) * 2016-03-08 2021-01-22 复旦大学 续随子二萜醇衍生物的转化方法及其在制备抗肿瘤药物中的用途
CN111394270B (zh) * 2018-12-27 2022-04-05 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 一株藤黄类诺卡氏菌及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2601676B1 (fr) * 1986-07-17 1988-09-23 Rhone Poulenc Sante Procede de preparation du taxol et du desacetyl-10 taxol
FR2629819B1 (fr) * 1988-04-06 1990-11-16 Rhone Poulenc Sante Procede de preparation de derives de la baccatine iii et de la desacetyl-10 baccatine iii
FR2629818B1 (fr) * 1988-04-06 1990-11-16 Centre Nat Rech Scient Procede de preparation du taxol

Also Published As

Publication number Publication date
AU6467194A (en) 1994-12-22
HU9401767D0 (en) 1994-09-28
FI942794A (fi) 1994-12-16
IL109926A (en) 2000-02-29
FI942794A0 (fi) 1994-06-13
EP0629701B1 (en) 2000-01-19
DE69422662D1 (de) 2000-02-24
CN1110565C (zh) 2003-06-04
HUT71191A (en) 1995-11-28
HK1014742A1 (en) 1999-09-30
CY2205B1 (en) 2002-11-08
JPH0751078A (ja) 1995-02-28
IL109926A0 (en) 1994-10-07
CA2125726A1 (en) 1994-12-16
KR100342624B1 (ko) 2002-11-18
SG54139A1 (en) 1998-11-16
EP0629701A1 (en) 1994-12-21
CN1101944A (zh) 1995-04-26
JP3587880B2 (ja) 2004-11-10
DK0629701T3 (da) 2000-04-17
KR950000887A (ko) 1995-01-03
PT629701E (pt) 2000-06-30
ATE189001T1 (de) 2000-02-15
HU217218B (hu) 1999-12-28
ES2142890T3 (es) 2000-05-01
DE69422662T2 (de) 2000-07-20
GR3032990T3 (en) 2000-07-31
AU679978B2 (en) 1997-07-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI112377B (fi) Entsymaattinen hydrolyysimenetelmä C-10- ja C-13-asemaan liittyvän hydroksyyliryhmän sisältävien taksaanien valmistamiseksi, entsymaattinen esteröintimenetelmä C-10-asemaan liittyvän asyylioksiryhmänsisältävien taksaanien valmistamiseksi ja mainittujen yhdisteiden käyttö C13-asemaan liittyvän asyylioksiryhmän sisältävien taksaanien valmistamiseksi
KR100347839B1 (ko) C-7당을c-7히드록실탁산으로전환시키기위한효소적가수분해방법
RU2330069C2 (ru) Способ получения макролидного соединения и штаммы streptomyces sp., mortierella sp. и micromonosporaceae
WO1993021338A1 (en) Taxol production by a microbe
Hanson et al. Site-specific enzymatic hydrolysis of taxanes at C-10 and C-13.
US5516676A (en) Preparation of C-13 hydroxyl-bearing taxanes using nocardioides or a hydrolase isolated therefrom
KR960016874B1 (ko) 미생물에 의한 트랜스-4-히드록시-l-프롤린의 제조방법
CA2385317A1 (en) Process for the preparation of mycophenolic acid and derivatives thereof
US5523219A (en) Enzymatic hydrolysis method for the preparation of C-10 hydroxyl-bearing taxanes and enzymatic esterification method for the preparation of C-10 acyloxy-bearing
D’Antona et al. Synthesis of novel cyano-cyclitols and their stereoselective biotransformation catalyzed by Rhodococcus erythropolis A4
US6162622A (en) Preparation of 6 hydroxy-7-deoxytaxanes using nocardioides luteus
IL130621A (en) Methods for preparation of taxanes and microorganisms and enzymes utilized therein
KR100386197B1 (ko) 올레아미드를 생산하는 스트렙토미세스 속 신균주 및 그균주로부터 올레아미드를 생산하는 방법
US6348337B1 (en) Process for the preparation of C-4 deacetyltaxanes
Li et al. Biological Synthesis of Polyketides from 6-n-Pentyl-α-pyrone by Streptomyces sp.
Praveen et al. Production of actinomycin-D by a new isolate, Streptomyces sindenensis
JP2007131552A (ja) 新規抗生物質ｓｆ２８５６物質、その製造法および医薬組成物
MXPA01001459A (en) Process for the preparation of c-4 deacetyltaxanes
JPWO2005112951A1 (ja) 抗腫瘍剤、抗腫瘍剤の製造方法、抗腫瘍剤を含む医薬組成物、及び抗腫瘍剤産生菌
WO1999031127A1 (fr) Cyclopeptolides
JPH0349687A (ja) 新抗腫瘍性抗生物質レゾルチオマイシン及びその製造法