JP3587880B2 - Ｃ−１０またはｃ−１３ヒドロキシル含有タキサンの酵素加水分解製造法、ｃ−１０アシルオキシ含有タキサンの酵素エステル化製造法、並びにｃ−１３アシルオキシ含有タキサンの製造用途 - Google Patents
Ｃ−１０またはｃ−１３ヒドロキシル含有タキサンの酵素加水分解製造法、ｃ−１０アシルオキシ含有タキサンの酵素エステル化製造法、並びにｃ−１３アシルオキシ含有タキサンの製造用途 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、Ｃ−１０またはＣ−１３ヒドロキシル含有タキサン（ｔａｘａｎｅ）の酵素加水分解製造法、Ｃ−１０アシルオキシ含有タキサンの酵素エステル化製造法、並びにＣ−１３アシルオキシ含有タキサンの製造用途に関する。
更に詳しくは、本発明は、Ｃ−１０ヒドロキシル含有タキサンの製造の酵素加水分解法、およびＣ−１０アシルオキシ含有タキサンの製造の酵素エステル化法に関し、これらの化合物はたとえば、タキソル（ｔａｘｏｌ）およびタキソル類縁体などの薬理学的活性タキサンの製造の中間体として使用しうる。
また本発明は、Ｃ−１３アシルオキシ含有タキサンの製造の中間体として有用な、特にタキソルおよびタキソル類縁体の製造にも有用な、Ｃ−１３ヒドロキシ含有タキサンの製造の酵素加水分解法にも関係する。
【０００２】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】
タキサンは、医薬分野での有用性が認められているジテルペン化合物である。たとえば、式：
【化７】
（式中、Ｐｈはフェニル、ＡｃはアセチルおよびＢｚはベンゾイルである）
のタキサン、すなわちタキソルは、有効な抗癌剤であることが知られている。
天然産生タキサン、たとえばタキソルは植物中に見つけることができ、植物から単離されている。しかしながら、このようなタキサンは植物中に比較的少量でしか存在しないため、タキソルの場合、たとえば、該化合物源を形成する生長の遅いイチイの木が多数要求される。従って、この分野では、タキソルなどの天然産生タキサンの製造、並びにその類縁体の製造の半合成法を含む合成法の探索が続けられている。
【０００３】
タキサン環構造の複雑さのために、既に基本タキサン環構造を有する出発物質の使用によって、環系上に所定の置換基を含有するタキサンをより容易に製造しうる。すなわち、たとえば、タキサン環構造を有し、かつＣ−１３にヒドロキシル基を含有し、および特にＣ−１０に所定の置換基をも含有する化合物を中間体化合物とカップリング反応させて、Ｃ−１３に所定の側鎖を有するタキサン、たとえばタキソルあるいはその類縁体で例示される、Ｃ−１３にアシルオキシ側鎖を有する薬理学的活性タキサンを形成することができる。
【０００４】
本発明は、Ｃ−１０に所定の置換基を持つタキサンを得る方法を提供する。特に本発明は、Ｃ−１０ヒドロキシル含有およびＣ−１０アシルオキシ含有タキサン化合物の製造法を提供し、これらの化合物は、タキソルおよびその類縁体などのタキサンの製造の出発物質としての有用性が認められる。
１つの具体例において、本発明は、Ｃ−１０に直接結合したヒドロキシル基を含有する少なくとも１種のタキサンの製造法であって、Ｃ−１０に直接結合したアシルオキシ基を含有する少なくとも１種のタキサンを、上記アシルオキシ基のヒドロキシル基への加水分解を触媒しうる、ノカルジオイデス属に属する微生物もしくは該微生物から誘導される酵素と接触させて加水分解を行う工程から成ることを特徴とする製造法を提供する。
【０００５】
他の具体例において、本発明は、Ｃ−１０に直接結合したアシルオキシ基を含有する少なくとも１種のタキサンの製造法であって、Ｃ−１０に直接結合したヒドロキシル基を含有する少なくとも１種のタキサンを、アシル化剤および上記ヒドロキシル基のアシルオキシ基へのエステル化を触媒しうる、ノカルジオイデス属に属する微生物もしくは該微生物から誘導される酵素と接触させて加水分解を行う工程から成ることを特徴とする製造法を提供する。
さらに本発明は、Ｃ−１３ヒドロキシル含有タキサン化合物の製造法を提供し、かかる化合物はＣ−１３に所定の側鎖を有するタキサンの製造の出発物質としての有用性が認められる。
特に本発明は、Ｃ−１３に直接結合したヒドロキシル基を含有する少なくとも１種のタキサンの製造法であって、Ｃ−１３に直接結合したアシルオキシ基を含有する少なくとも１種のタキサンを、上記アシルオキシ基のヒドロキシル基への加水分解を触媒しうる、ノカルジオイデス属に属する微生物もしくは該微生物から誘導される酵素と接触させ加水分解を行う工程から成ることを特徴とする製造法を提供する。
【０００６】
本発明は、Ｃ−１０アシルオキシ含有タキサンからＣ−１０ヒドロキシル含有タキサンへの、またＣ−１０ヒドロキシル含有タキサンからＣ−１０アシルオキシ含有タキサンへの有効な製造法を提供する。本発明によれば、単一のタキサンを加水分解するか、あるいは異種のタキサン混合物を連続的にまたは同時に加水分解することができ、また同様に、本発明によれば、単一のタキサンをエステル化するか、あるいは異種のタキサン混合物を連続的にまたは同時にエステル化することができる。
さらに本発明は、Ｃ−１３アシルオキシ含有タキサンからＣ−１３ヒドロキシル含有タキサンへの有効な製造法を提供する。本発明によれば、単一のタキサンを加水分解するか、あるいは異種のタキサン混合物を連続的にまたは同時に加水分解することができる。
【０００７】
以下、本発明についてより詳しく説明する。
Ｃ−１０の加水分解
好ましい具体例において、本発明は、式Ｉ：
【化８】
（式中、Ｒ１はヒドロキシルまたはアシルオキシ、特にＲ１は後記式ＩＩＩの構造を有する；
Ｒ２は水素、ヒドロキシル、フルオロ、Ｒ５−Ｏ−、キシロシル、Ｒ６−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−またはＲ６−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリールまたはヘテロシクロ；
Ｒ５はヒドロキシル保護基；および
Ｒ６は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリールまたはヘテロシクロである）
の少なくとも１種のＣ−１０ヒドロキシル含有タキサン（Ｉ）またはその塩の製造法であって、式ＩＩ：
【化９】
（式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４は前記と同意義；およびＲ７はアシルオキシである）の少なくとも１種のＣ−１０アシルオキシ含有タキサンまたはその塩を、上記Ｒ７アシルオキシ基のヒドロキシル基への加水分解を触媒しうる酵素もしくは微生物と接触させて加水分解を行うことを特徴とする製造法を提供する。
本発明の加水分解法において、式ＩおよびＩＩの化合物の明記されていないキラル中心の全ての立体配置は、単独（すなわち、他の立体異性体が実質的に存在しない）または他の立体異性体と混合状態のいずれかにあることが意図される。
【０００８】
他の好ましい具体例において、本発明は、望ましくないアシルオキシＣ−１０基を有する少なくとも１種の第２タキサンから、望ましいＣ−１０アシルオキシ基を有する少なくとも１種の第１タキサンの製造法を提供するものであり、該製造法は、第２タキサンの酵素加水分解により少なくとも１種のＣ−１０ヒドロキシル含有類縁体を得た後、所望のアシル基をカップリング反応させて第１タキサンを得ることによる。この具体例において、本発明は、たとえば、異なるアシルオキシＣ−１０基を含有する出発タキサン混合物から、特定Ｃ−１０アシルオキシ基を有する所望タキサンの製造法を提供し、なお、出発混合物は所望のタキサンを含有しまたは含有してなくてもよく、該製造法は、異なるＣ−１０基の同時または連続的加水分解により、Ｃ−１０にヒドロキシル基を有する１種以上のタキサンを得た後、所望のアシル基をカップリング反応させることによる。この好ましい方法は特に、たとえばタキソルを産出する植物の抽出により、異なるＣ−１０アシルオキシ基を有するタキサン混合物を、他の天然産生タキサンと混合して得る場合、および最終的にタキソルなどの特定タキサンが望まれる場合に有用である。アシル基のカップリング反応は、アシル基形成用の非酵素法で行ってもよい。たとえば、Ｃ−７保護１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩ（たとえば１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩを、ジメチルホルムアミド中のトリエチルシリルクロリドおよびイミダゾールと接触させて形成される、Ｃ−７がトリエチルシリルで保護されたもの）を、低温（たとえば−６０〜＋７０℃）で、塩化リチウム／塩化アセチルと共にリチウムヘキサメチルジシラジド／テトラヒドロフランと接触させることにより、Ｃ−１０をアシル化することができる。別法として、アシル基のカップリング反応は、本明細書に記載の酵素エステル化法で行ってもよい。本発明の方法において、出発タキサンのＣ−１０アシルオキシ基の立体配置は、Ｃ−１０ヒドロキシル基含有生成物に保留されていることが好ましい。
【０００９】
Ｃ−１０のエステル化
他の好ましい具体例において、本発明は、式ＩＩ：
【化１０】
（式中、Ｒ１はヒドロキシルまたはアシルオキシ、特にＲ１は後記式ＩＩＩの構造を有する；
Ｒ２は水素、ヒドロキシル、フルオロ、Ｒ５−Ｏ−、キシロシル、Ｒ６−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−またはＲ６−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリールまたはヘテロシクロ；
Ｒ５はヒドロキシル保護基；
Ｒ６は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリールまたはヘテロシクロ；および
Ｒ７はアシルオキシである）
の少なくとも１種のＣ−１０アシルオキシ含有タキサン（ＩＩ）、またはその塩の製造法を提供するものであり、該製造法は、式Ｉ：
【化１１】
（式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４は前記と同意義である）
の少なくとも１種のＣ−１０ヒドロキシル含有タキサン（Ｉ）またはその塩を、アシル化剤およびＣ−１０ヒドロキシル基のエステル化を触媒しうる酵素もしくは微生物と接触させて上記Ｒ７アシルオキシ基を形成し、該エステル化を行う工程から成る。
【００１０】
本発明のエステル化法において、式ＩおよびＩＩの化合物の明記されていないキラル中心の全ての立体配置は、単独（すなわち、他の立体異性体が実質的に存在しない）または他の立体異性体と混合状態のいずれかにあることが意図される。 本発明のエステル化を行う任意のアシル化剤が使用されてよい。好ましいアシル化剤は、式ＩＶ：
Ｒ１１−Ｃ（Ｏ）−Ｌ （ＩＶ）
（式中、Ｒ１１はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはヘテロシクロ；および
Ｌはエステル基を形成するため置換しうる脱離可能基である）
の化合物である。
式ＩＶの好ましいＲ１１基は、Ｃ１ 〜 ６アルキル基などのアルキル基、特にメチルである。Ｌ基の具体例としては、ハロゲン原子、ヒドロキシル、アルコキシまたはアルケニルオキシ基が包含される。好ましいＬ基はアルケニルオキシ基で、最も好ましくは、ＣＨ２＝ＣＨ−Ｏ−やＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−Ｏ−などのＣ１−６アルケニルオキシである。酢酸イソプロペニルおよび酢酸ビニルが特に好ましいアシル化剤である。
本発明の方法において、出発タキサンのＣ−１０ヒドロキシル基の立体配置は、Ｃ−１０アシルオキシ基含有生成物に保留されていることが好ましい。
【００１１】
Ｃ−１３の加水分解
好ましい具体例において、本発明は、式Ｖ：
【化１２】
（式中、Ｒ１２は水素、ヒドロキシル、Ｒ５−Ｏ−、Ｒ６−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、またはＲ６−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−；
Ｒ２は水素、ヒドロキシル、フルオロ、Ｒ５−Ｏ−、キシロシル、Ｒ６−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、またはＲ６−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリールまたはヘテロシクロ；
Ｒ５はヒドロキシル保護基；および
Ｒ６は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリールまたはヘテロシクロである）
の少なくとも１種のＣ−１３ヒドロキシル含有タキサン（Ｖ）またはその塩の製造法を提供するものであり、該製造法は、式ＶＩ：
【化１３】
（式中、Ｒ１２，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４は前記と同意義；およびＲ７はアシルオキシである）
の少なくとも１種のＣ−１３アシルオキシ含有タキサン（ＶＩ）またはその塩を、上記Ｒ７アシルオキシ基のヒドロキシル基への加水分解を触媒しうる酵素もしくは微生物と接触させて加水分解を行う工程から成る。
本発明の方法において、式Ｖおよび式ＶＩの化合物の明記されていないキラル中心の全ての立体配置は、単独（すなわち、他の立体異性体が実質的に存在しない）または他の立体異性体と混合状態のいずれかにあることが意図される。
【００１２】
他の好ましい具体例において、本発明は、望ましくないアシルオキシＣ−１３側鎖を有する少なくとも１種の第２タキサンから、望ましいＣ−１３アシルオキシ側鎖を有する少なくとも１種の第１タキサンの製造法を提供するものであり、該製造法は、第２タキサンの酵素加水分解により少なくとも１種のＣ−１３ヒドロキシル含有類縁体を得た後、所望の側鎖をカップリング反応させて第１タキサンを得ることによる。この具体例において、本発明は、たとえば、異なるアシルオキシＣ−１３側鎖を有する出発タキサン混合物から、特定Ｃ−１３アシルオキシ側鎖を有する所望タキサンの製造法を提供し、なお、出発混合物は所望のタキサンを含有しまたは含有してなくてもよく、該製造法は、異なるＣ−１３基の同時または連続的加水分解により、Ｃ−１３にヒドロキシル基を有する１種以上のタキサンを得た後、所望の側鎖をカップリング反応させることによる。この好ましい方法は特に、たとえばタキソルを産生する植物の抽出により、異なるＣ−１３アシルオキシ側鎖を有するタキサン混合物を、セファロマニン（ｃｅｐｈａｌｏｍａｎｎｉｎｅ）および他の天然産生タキサンと混合して得る場合、および最終的にタキソルなどの特定タキサンが望まれる場合に有用である。
本発明の方法において、出発タキサンのＣ−１３アシルオキシ基の立体配置は、Ｃ−１３ヒドロキシル基含有生成物に保留されていることが好ましい。
【００１３】
定義
本明細書において、単独または他の基の一部として用いる各種語句の定義は、以下の通りである。
「酵素法」とは、酵素もしくは微生物を用いる本発明の方法を意味する。「加水分解」とは、アシルオキシ基からヒドロキシ基への形成を意味し、たとえば本発明の方法に従って、水および／または適当な有機アルコールとの接触によって行うことができる。「エステル化」とは、ヒドロキシル基からアシルオキシ基への形成を意味する。「アシル化剤」とは、アシル基の付与によって上記エステル化を行うことができる化合物を意味する。本発明方法における「酵素もしくは微生物」の使用には、２種以上の、並びに単一の酵素もしくは微生物の使用が含まれる。
【００１４】
「アルキル」または［ａｌｋ］とは、好ましくはノルマル鎖に１〜１２個の炭素を有する、任意に置換された直鎖および分枝鎖飽和炭化水素基を意味する。非置換のアルキル基としては、たとえば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、４，４−ジメチルペンチル、オクチル、２，２，４−トリメチルペンチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル等が挙げられる。置換基の具体例としては、ハロ、アルコキシ、アルキルチオ、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヒドロキシもしくは保護ヒドロキシ、カルボキシル（−ＣＯＯＨ）、アルキルオキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、カルバモイル（ＮＨ２−ＣＯ−）、アミノ（−ＮＨ２）、モノもしくはジアルキルアミノ、およびチオール（−ＳＨ）の群からの１個以上が含まれてよい。
【００１５】
「低級ａｌｋ」または「低級アルキル」とは、上述のノルマル鎖の炭素数１〜４の、任意に置換されたアルキル基を意味する。
「アルコキシ」または「アルキルチオ」とは、上述のアルキル基がそれぞれ酸素（−Ｏ−）または硫黄（−Ｓ−）に結合したものを意味する。「アルキルオキシカルボニル」とは、アルコキシ基がカルボニル基に結合したものを意味する。「アルキルカルボニルオキシ」とは、アルキル基がカルボニル基に結合し、次いで酸素に結合したものを意味する。「モノアルキルアミノ」または「ジアルキルアミノ」とは、それぞれ１または２個の上記アルキル基で置換されたアミノ基を意味する。
【００１６】
「アルケニル」とは、上述のアルキルの場合に定義した任意に置換された基で、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有するものを意味する。置換基の具体例としては、上述の１個以上のアルキル基、および／またはアルキル置換基として１個以上の上記基が含まれる。「アルケニルオキシ」とは、上記アルケニル基が酸素（−Ｏ−）に結合したものを意味する。
「アルキニル」とは、上述のアルキルの場合に定義した任意に置換された基で、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有するものを意味する。置換基の具体例としては、上述の１個以上のアルキル基、および／またはアルキル置換基として１個以上の上記基が含まれる。「アルキニルオキシ」とは、上記アルキニル基が酸素（−Ｏ−）に結合したものを意味する。
【００１７】
「シクロアルキル」とは、好ましくは１〜３つの環および環１つ当り３〜７個の炭素を有する、任意に置換された飽和炭素環式環基を意味する。非置換のシクロアルキル基としては、たとえばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロデシル、シクロドデシル、およびアダマンチルが挙げられる。置換基の具体例としては、上述の１個以上のアルキル基、および／またはアルキル置換基として１個以上の上記基が含まれる。「シクロアルキルオキシ」とは、上記シクロアルキル基が酸素（−Ｏ−）に結合したものを意味する。
【００１８】
「シクロアルケニル」とは、上述のシクロアルキルの場合に定義した任意に置換された基で、部分的に不飽和の環を構成する少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有するものを意味する。置換基の具体例としては、上述の１個以上のアルキル基、および／またはアルキル置換基として１個以上の上記基が含まれる。「シクロアルケニルオキシ」とは、上記シクロアルケニル基が酸素（−Ｏ−）に結合したものを意味する。
【００１９】
「ａｒ」または「アリール」とは、好ましくは１または２つの環および６〜１２個の環炭素を有する、任意に置換された炭素環式芳香族基を意味する。非置換のアリール基としては、たとえば、フェニル、ビフェニルおよびナフチルが挙げられる。置換基の具体例としては、１個以上、好ましくは３個以下のニトロ基、上述のアルキル基および／またはアルキル置換基として上記基が含まれる。「アリールオキシ」とは、上記アリール基が酸素（−Ｏ−）に結合したものを意味する。
【００２０】
「ヘテロシクロ」または「複素環式基」とは、少なくとも１つの環に少なくとも１個のヘテロ原子を有する、任意に置換された完全飽和または不飽和の芳香族または非芳香族環式基、好ましくは各環に５または６個の原子を有するモノ環式またはジ環式基を意味する。ヘテロシクロ基は、たとえば環中に１または２個の酸素原子、１または２個の硫黄原子、および／または１〜４個の窒素原子を有してよい。各ヘテロシクロ基は、環系の炭素またはヘテロ原子のいずれかを介して結合しうる。ヘテロシクロ基の具体例としては、チエニル、フリル、ピロリル、ピリジル、イミダゾリル、ピロリジニル、ピペリジニル、アゼピニル、インドリル、イソインドリル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾキサゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾキサジアゾリル、およびベンゾフラザニルが挙げられる。置換基の具体例としては、上述の１個以上のアルキル基および／またはアルキル置換基として１個以上の上記基が含まれる。「ヘテロシクロオキシ」とは、上記ヘテロシクロ基が酸素（−Ｏ−）に結合したものを意味する。
「ハロゲン」または「ハロ」とは、塩素、臭素、フッ素および沃素を意味する。
【００２１】
「タキサン」とは、下記タキサン成分を含有する化合物を意味する。「タキサン成分」とは、式：
【化１４】
の骨格構造（本明細書で用いる環系位置を数字で表示）を有する成分を意味し、該骨格構造は置換されていてもよく、またその環系にエチレン性不飽和結合を含有していてもよい。たとえばタキソルに見られるように、４位および５位にオキセタンが縮合した成分が好ましい。
【００２２】
「ヒドロキシ（またはヒドロキシル）保護基」とは、遊離のヒドロキシル基を保護することができ、かつその保護反応の後で、分子残基を妨害せずに脱離しうる基を意味する。かかる基、およびその合成は、Ｔ．Ｗ．グリーンの“有機合成における保護基”（ジョン・ワイレイ・アンド・サンズ、１９８１年）、またはフィザー・アンド・フィザーに記載されている。
「塩」としては、無機および／または有機酸および塩基によって形成される酸性および／または塩基性塩が包含される。
「アシル」とは、有機カルボン酸の−ＣＯＯＨ基からヒドロキシル基を除去して形成される成分を意味する。「アシルオキシ」とは、上記アシル基が酸素（−Ｏ−）に結合したものを意味する。
【００２３】
Ｃ−１０変性用の出発物質
本発明の出発物質として用いる、Ｃ−１０アシルオキシ含有、およびＣ−１０ヒドロキシ含有タキサンは、それぞれ本発明の酵素加水分解法またはエステル化法を受けることができる化合物であってよい。出発物質として、合成形成タキサン、あるいは好ましくは天然形成タキサン、たとえばセファロマニン、７−キシロシルタキソル、タキソル、バッカチンＩＩＩ、脱アセチルバッカチンＩＩＩ、またはタキソルＣ（Ｃ−１３タキソル側鎖のベンゾイル基がｎ−ペンタノイル基で置換されたタキソル類縁体）が挙げられ、これらの１種または混合物が使用されてよい。“天然形成”タキサン出発物質は好ましくは、タキサン産生植物組織、特にタキサス（Ｔａｘｕｓ）属の植物、たとえばタキサス・バッカタ（Ｔａｘｕｓ ｂａｃｃａｔａ）、タキサス・カスビダタ（Ｔａｘｕｓ ｃｕｓｐｉｄａｔａ）、タキサス・ブレビホリア（Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）、タキサス・ウオリチアナ（Ｔａｘｕｓ ｗａｌｌｉｃｈｉａｎａ）、タキサス・メディア（Ｔａｘｕｓ ｍｅｄｉａ）、タキサス・ヒックジィ（Ｔａｘｕｓ ｈｉｃｋｓｉｉ）、特にタキサスｘ．メディア・ヒックジィの組織または誘導組織の植物細胞培養および／または抽出によって得られる。植物組織の具体例としては、針状葉、樹皮および全実生が含まれる。
本発明方法のＣ−１０ヒドロキシおよびアシルオキシ含有タキサン出発物質を得る好ましい方法については、ラオの「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」（１０、５２１〜５２４頁、１９９３年）；キングストンの「Ｐｈａｒｍａｃ． Ｔｈｅｒ．」（５２、１〜３４頁、１９９１年）；またはこれらの実例を参照。
【００２４】
Ｃ−１３変性用の出発物質
本発明の出発物質として用いるＣ−１３アシルオキシ含有タキサンは、本発明の酵素加水分解を受けることができる化合物であってよい。出発物質として、合成形成タキサン、あるいは好ましくは天然形成タキサン、たとえばセファロマニン、７−キシロシルタキソル、タキソル、７−キシロシル−１０−脱アセチルタキソル、１０−脱アセチルタキソル、またはタキソルＣが挙げられ、これらの１種または混合物が使用されてよい。“天然形成”タキサン出発物質は好ましくは、タキサン産生植物組織、特にＴａｘｕｓ属の植物、たとえばＴａｘｕｓ ｂａｃｃａｔａ、Ｔａｘｕｓ ｃｕｓｐｉｄａｔａ、Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ、Ｔａｘｕｓ ｗａｌｌｉｃｈｉａｎａ、Ｔａｘｕｓ ｍｅｄｉａ、Ｔａｘｕｓ ｈｉｃｋｓｉｉ、特にＴａｘｕｓ ｘ．ｍｅｄｉａ ｈｉｃｋｓｉｉの組織または誘導組織の植物細胞培養および／または抽出によって得られる。植物組織の具体例としては、針状葉、樹皮および全実生が含まれる。
本発明方法のＣ−１３アシルオキシ含有タキサン出発物質を得る好ましい方法については、ラオの「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」（１０、５２１〜５２４頁、１９９３年）；キングストンの「Ｐｈａｒｍａｃ． Ｔｈｅｒ．」（５２、１〜３４頁、１９９１年）；またはこれらの実例を参照。
【００２５】
Ｃ−１０変性用の酵素および微生物
本発明で用いる酵素もしくは微生物は、本明細書に記載の酵素加水分解法またはエステル化法を触媒しうる酵素もしくは微生物であってよい。酵素もしくは微生物物質は、起源または純度にかかわらず、自由状態、またはたとえば物理的吸着または閉じ込めによる支持体への固定状態で使用しうる。
微生物の具体例としては、ノカルジオイデス(Ｎocardioides) 属に属する微生物が挙げられる。好ましい微生物は、ノカルジオイデス・アルブス(albus)、ノカルジオイデス・フラブス(flavus)、ノカルジオイデス・フルブス(fluvus)、ノカルジオイデス・ルテウス(luteus)、ノカルジオイデス・シンプレックス(simplex)およびノカルジオイデス・サーモリラシナス(thermolilacinus)、特にノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２４(ＳＣ１３９１０)、ノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２５(ＳＣ１３９１１)およびノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６(ＳＣ１３９１２)である。本明細書で用いる「ＡＴＣＣ」とは、言及する微生物の寄託所である、メリーランド州２０８５２、ロックビル、パークラウン・ドライブ１２３０１のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection)の受入番号を指称する。上記微生物ＡＴＣＣ５５４２４、５５４２５および５５４２６は１９９３年５月１２日に寄託されている。「ＳＣ」とは、スクイブ・カルチャー・コレクション(Ｓquibb culture collection)の一員として微生物に付与される呼称を意味する。
【００２６】
生物学的に純粋な微生物のノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２４（ＳＣ１３９１０）、ノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ１３９１１）およびノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ１３９１２）は、新規な微生物である。また本発明によれば、これら微生物のミュータントも、本明細書に記載の加水分解法またはエステル化法での使用、たとえば化学的手段、物理的手段（たとえばＸ線）または生物学的手段（たとえば分子生物学法による）による変性したものの使用が意図されていることを理解すべきである。
【００２７】
ノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２４（ＳＣ１３９１０）およびＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ１３９１１）は、培地Ａ９４［コーン浸漬リカー（ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ）（３５ｇ）、セレロース（２０ｇ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４試薬級（５ｇ）、ＣａＣＯ３（３．５ｇ）、大豆油（５ｍｌ）および蒸留水（１ｌ）］で培養されてよい。これらの微生物は、土壌（ニューブランズウイック州、ニュージャージー州の試料より）から単離されたもので、かつ種々の培地において好気性生長を示すグラム陽性の不動生物である。固形ＹＳ培地（酵母エキス０．２％、スターチ１％）において、菌糸体は白味乃至明クリーム色を呈する。生長は両固形および液体媒地において、暗拡散性色素の生成に関係する。微視的に、液体培養での生長は、多量分枝菌糸からなる菌糸集合体によって特徴づけられる。
【００２８】
ノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ１３９１２）は、培地Ａ９４［コーン浸漬リカー（３５ｇ）、セレロース（２０ｇ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４試薬級（５ｇ）、ＣａＣＯ３（３．５ｇ）、大豆油（５ｍｌ）および蒸留水（１ｌ）］で培養されてよい。この微生物は、土壌（ニューブランズウイック州、ニュージャージー州の試料より）から単離されたもので、かつ種々の培地において好気性生長を示すグラム陽性の不動生物である。固形ＹＳ培地（酵母エキス０．２％、スターチ１％）において、菌糸体は暗クリーム色を呈する。微視的に、液体培養での生長は、多量分枝菌糸からなる菌糸集合体によって特徴づけられる。
上記微生物のノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２４（ＳＣ１３９１０）およびＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ１３９１１）、およびノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ１３９１２）は、「Ｂｅｒｇｅｙｓ’ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」（Ｖｏｌ．２、Ｐ．Ｈ．Ａ．スニース著、１９８６年）の記載に従って、ノカルジオイデス・アルブスおよびノカルジオイデス・ルテウスの菌株として同定される。
【００２９】
本発明の加水分解またはエステル化法で用いる酵素の具体例は、加水分解酵素、特にエステラーゼ、プロテアーゼまたはリパーゼである。好ましい酵素としては、微生物、特に上述の微生物から誘導されるものが包含される。これらの酵素は、たとえば疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過、次いでアニオン交換カラムの使用といった抽出および精製法によって単離することができる。本発明はさらに、当該加水分解法またはエステル化法を行うことができ、かつたとえば上述の方法によって、ノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２４（ＳＣ１３９１０）およびＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ１３９１１）、およびノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ１３９１２）から単離しうる酵素を提供するものである。
【００３０】
Ｃ−１３変性用の酵素および微生物
本発明で用いる酵素もしくは微生物は、本明細書記載の酵素加水分解を触媒しうる酵素もしくは微生物であってよい。酵素もしくは微生物物質は、起源または純度にかかわらず、自由状態、またはたとえば物理的吸着または閉じ込めによる支持体への固定状態で使用しうる。
【００３１】
本発明方法による、出発Ｃ−１３アシルオキシ含有タキサンの酵素加水分解に好適な微生物を選択する好ましい方法は、新規なスクリーニング法の使用によるもので、該スクリーニング法は、
（ａ）固形の生長培地として、（ｉ）スクリーニングされる微生物が生長し、（ｉｉ）出発Ｃ−１３アシルオキシ含有タキサンを混和すると、溶解しないため濁り外観を呈し、および（ｉｉｉ）本発明加水分解法のＣ−１３ヒドロキシル含有タキサン生成物および必要に応じて開裂Ｃ−１３側鎖生成物を混和すると、溶解するため透明外観を呈する生長培地を選択し、
（ｂ）上記工程（ａ）で選択した、たとえばペトリ皿内の生長培地に予め出発Ｃ−１３アシルオキシ含有タキサンを混和しておき、かつ微生物の生長を発生せしめる条件下で、該生長培地に上記微生物を入れて接触せしめ、次いで
（ｃ）上記微生物による加水分解が可能であることを示す透明ゾーンが、微生物の生長が起こる領域付近で出現するかどうかを観察する
工程から成る。
【００３２】
透明ゾーンの形成は、加水分解が起こったこと、すなわち、微生物が本発明加水分解法での使用に好適となりうることを示す。本明細書で用いる語句「透明」および「濁り」とは、互いに相対的なものとして解釈すべきである。従って、出発Ｃ−１３アシルオキシ含有タキサンを、懸濁状態で見ることができるよう十分な量で、生長培地と混和して使用し（この場合、“濁り”外観を呈する）、そして透明度は、懸濁状態の可視性の初期程度に相対させて、すなわち、初期可視性の低下度として判定する。
【００３３】
本発明によって提供される他の好ましいスクリーニング法は、以下の点を除いて上記方法に相当する。すなわち、選択される固形の生長培地では、出発Ｃ−１３アシルオキシ含有タキサンを混和すると、溶解するため透明外観を呈し、一方、本発明の加水分解法のＣ−１３ヒドロキシル含有タキサン生成物を混和すると、溶解しないため（および必要に応じて好ましくは開裂Ｃ−１３側鎖も溶解しないため）、濁り外観を呈する。微生物の生長が起る領域付近での濁りゾーンの観察は適当な微生物の選定を可能ならしめる。
【００３４】
本発明のスクリーニング法の特に好ましい具体例は、後記実施例に記載する。
かかる好ましいスクリーニング法は、出発Ｃ−１３アシルオキシ含有タキサンとＣ−１３ヒドロキシル含有タキサン生成物において、本発明による加水分解が起こったか否かを観察しうる限界まで、その相対的溶解性が異なる場合に好適に使用することができる。
Ｃ−１３加水分解で用いる微生物の具体例としては、ノカルジオイデス(Ｎocardioides) 属に属する微生物が挙げられる。好ましい微生物は、ノカルジオイデス・アルブス(albus)、ノカルジオイデス・フラブス(flavus)、ノカルジオイデス・フルブス(fluvus)、ノカルジオイデス・ルテウス(luteus)、ノカルジオイデス・シンプレックス(simplex)およびノカルジオイデス・サーモリラシナス(thermolilacinus)、特にノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２４(ＳＣ１３９１０)およびＡＴＣＣ５５４２５(ＳＣ１３９１１)、およびノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６(ＳＣ１３９１２)である。
【００３５】
上述の如く、生物学的に純粋な微生物のノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２４（ＳＣ１３９１０）、ノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ１３９１１）およびノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ１３９１２）は、さらに本発明によって提供される新規な微生物である。また本発明によれば、これら微生物のミュータントも、本明細書記載の加水分解法での使用、たとえば化学的手段、物理的手段（たとえばＸ線）または生物学的手段（たとえば分子生物学法による）による変性したものの使用が意図されていることを理解すべきである。
本発明方法で用いる酵素の具体例は、加水分解酵素である。好ましい酵素としては、微生物、特に上述の微生物から誘導されるものが包含される。これらの酵素は、たとえば後記実施例に記載されるような抽出および精製法により単離、特にこれらの微生物が培養されている培地において、たとえばアニオン交換カラム、次いで疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびゲル濾過の使用による、細胞外に見られる活性画分の精製により単離することができる。本発明はさらに、当該加水分解法を行うことができ、かつたとえば上述の方法によって、ノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２４（ＳＣ１３９１０）およびＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ１３９１１）、およびノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ１３９１２）から単離しうる酵素を提供するものである。
【００３６】
Ｃ−１０およびＣ−１３変性における酵素および微生物の使用
微生物を用いる場合、細胞は、元のままの湿潤細胞あるいは凍結乾燥、噴霧乾燥もしくは加熱乾燥細胞などの乾燥細胞の状態で、または破壊細胞もしくは細胞抽出物などの処理細胞物質の形状で使用されてよい。また遺伝学的設計微生物の使用も意図されている。宿主細胞はいずれの細胞であってもよく、たとえば上述の触媒作用を行うことができる１種以上の酵素を発現する１または複数の遺伝子を含有するよう変性された、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が挙げられる。
１種以上の微生物を用いる場合、本発明の酵素加水分解法またはエステル化法は、微生物の発酵の後に（発酵および加水分解またはエステル化の２段階で）またはそれと同時に行ってよく、すなわち、後者の場合、発酵と加水分解またはエステル化をその場で（発酵と加水分解またはエステル化を１段階で）行うことができる。
【００３７】
微生物の生長は、適当な培地の使用により通常の技術によって達成しうる。生長する微生物の適当な培地としては、微生物細胞の生長に必要な栄養素を付与するものが含まれる。生長用培地はたとえば、必要な炭素源、窒素源、および要素（たとえば痕跡量）を包含する。また誘導物質を加えてもよい。本明細書で用いる語句「誘導物質」としては、微生物細胞内で所望の酵素活性の形成を増大する化合物が含まれる。
【００３８】
炭素源としては、シュガー類、たとえばマルトース、ラクトース、グルコース、フラクトーズ、グリセロール、ソルビトール、スクロース、スターチ、マンニトール、プロピレングリコール等；有機酸類、たとえば酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等；およびアルコール類、たとえばエタノール、プロパノール等が包含される。
窒素源としては、Ｎ−ＺアミンＡ、コーン浸漬リカー、大豆ミール、ビーフエキス、酵母エキス、糖蜜、ベーカー酵母、トリプトン、ヌトリゾイ（ｎｕｔｒｉｓｏｙ）、ペプトン、イースタミン（ｙｅａｓｔａｍｉｎ）、アミノ酸類（たとえばグルタミン酸ナトリウム等）、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等が包含される。
痕跡要素としては、マグネシウム、マンガン、カルシウム、コバルト、ニッケル、鉄、ナトリウムおよびカリウム塩が包含される。またホスフェート類を痕跡量または好ましくはそれ以上の量で添加してもよい。
【００３９】
使用する培地に、１種以上の炭素もしくは窒素源または他の栄養素を含ませてよい。
生長用の好ましい培地としては、水性培地、特に後記実施例に記載のものが包含される。
反応混合物の撹拌およびエアレーションは、加水分解またはエステル化工程を、たとえば微生物の生長段階でのフラスコ振盪培養または発酵タンクで行うとき、その工程中の有効な酸素の量に影響を及ぼす。撹拌の回転数は１００〜２５０ＲＰＭが好ましく、また１分当り１〜１０容量部の空気／培地１容量のエアレーションが好ましい。
【００４０】
微生物の生長および／または本発明に係る加水分解またはエステル化の場合、培地のｐＨは約６〜８．５が好ましく、また温度は約２４〜３７℃が好ましい。加水分解またはエステル化はたとえば、１〜４８時間といった期間にわたりインビトロで行うか、あるいは好ましくは所望生成物の収量が最大になるまで行うことができる。本発明の加水分解法は、６〜８のｐＨで、特に非塩基性条件下で行うことが好ましい。
また加水分解反応培地として水性液体の使用が好ましいが、有機液体、または相溶性もしくは非相溶（二相）有機液体／水性液体混合物も使用しうる。エステル化の場合、有機溶媒または二相有機／水性反応培地の使用が好ましいが、他の培地を使用してもよい。
【００４１】
Ｃ−１０変性の場合、出発物質（Ｃ−１０ヒドロキシまたはアシルオキシ含有タキサン）とエステル化または加水分解反応培地の合計重量に対し、０．０２５〜２．５重量％の出発物質を用いることが好ましい。本発明のエステル化法において、アシル化剤とＣ−１０ヒドロキシル含有タキサンの好ましいモル比は、約１：１〜１０００：１である。出発物質に対して使用する酵素もしくは微生物の量は、本発明の酵素加水分解またはエステル化の触媒作用を可能ならしめるように選定する。本発明の加水分解法またはエステル化法を採用するとき、それぞれ９０％（出発アシルオキシ含有タキサンに対して得られるＣ−１０加水分解生成物の％）以上の収率、または５０％（出発ヒドロキシル含有タキサンに対して得られるＣ−１０アシル化生成物の％）以上の収率を得ることが好ましい。加水分解またはエステル化は、出発タキサンのＣ−１０で選択的に行うことができる。すなわち、その大部分が（たとえば単独で）Ｃ−１０のみ加水分解またはエステル化されている生成物を、他の位置での加水分解またはエステル化を伴なわずに得ることができる。
【００４２】
Ｃ−１３変性の場合、出発物質（Ｃ−１３アシルオキシ含有タキサン）と加水分解反応培地の合計重量に対し、０．０２５〜０．２５重量％の出発物質を用いることが好ましい。出発物質に対して使用する酵素もしくは微生物の量は、本発明の酵素加水分解の触媒作用を可能ならしめるように選定する。本発明の加水分解法を採用するとき、９０％（出発アシルオキシタキサンに対して得られるＣ−１３加水分解生成物の％）以上の収率を得ることが好ましい。すなわち、その大部分が（たとえば単独で）Ｃ−１３のみ加水分解されている生成物を、他の位置での加水分解を伴なわずに得ることができる。
【００４３】
分離
本発明方法のＣ−１０アシルオキシまたはヒドロキシル含有生成物、および以下に記載の如きカップリング反応生成物（ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）は、たとえば抽出、蒸留、結晶化、およびカラムクロマトグラフィーなどの方法によって、単離および精製することができる。
同様に、本発明のＣ−１３加水分解法のＣ−１３ヒドロキシル含有生成物、および以下に記載の如きカップリング反応生成物も、たとえば抽出、蒸留、結晶化、およびカラムクロマトグラフィーなどの方法によって、単離および精製することができる。
【００４４】
実用性
タキサンは、上述のタキサン成分を含有するジテルペン化合物である。特に興味のあるタキサンは、１１，１２−位がエチレン性結合を介して結合し、かつ１３−位が側鎖を有するタキサン成分を含有するタキサンであって、かかるタキサンはタキソルで例示される。薬理学的活性なタキサン、たとえばタキソルは、乳癌、卵巣癌、結腸癌または肺癌などの癌、黒色腫および白血病に苦しむ患者を治療する抗腫瘍剤として使用しうる。
【００４５】
Ｃ−１０変性によって得られる化合物
本発明のＣ−１０加水分解法またはエステル化法によって得られる化合物は特に、Ｃ−１０に所望の置換基を有する化合物の製造を可能ならしめることにより、上述の薬理学的活性タキサンの製造の中間体として有用である。従って、たとえば、本発明方法に従いＣ−１０変性によって製造される化合物がまたＣ−１３にヒドロキシル基を有する場合、該化合物をＣ−１３アシルオキシ側鎖形成中間体化合物、たとえばβ−ラクタムとカップリング反応させて、タキソルまたはその類縁体などのＣ−１３アシルオキシ側鎖含有タキサンを得ることができる。この点について、Ｃ−１０の変性のための本発明方法を採用する前に、あるいはその途中に、あるいはその後に、本発明方法に係るＣ−１３の変性を行うことができる。
【００４６】
本発明方法に従って製造されるアシルオキシまたはヒドロキシル含有化合物は、必要に応じて、Ｃ−１３アシルオキシ側鎖カップリング反応に使用する前に変性してもよい。たとえば、Ｃ−１３以外の位置の１個以上のヒドロキシル基を、カップリング反応の前に保護し、後に脱保護することができる。
本発明の加水分解法およびエステル化法によって得られ、上記の如く任意に変性したＣ−１０アシルオキシおよびヒドロキシル含有タキサンは、たとえば、列挙したものなどのＣ−１３アシルオキシ側鎖含有タキサンの製造に使用されてよく、またヨーロッパ特許公開Ｎｏ．４００９７１、Ｕ．Ｓ．特許Ｎ４８７６３９９、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．４８５７６５３、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．４８１４４７０、Ｕ．Ｓ．特Ｎｏ．４９２４０１２、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．４９２４０１１、およびキングストンの「Ｐｈａｒｍ． Ｔｈｅｒ．」、（Ｖｏｌ．５２、１〜３４頁、１９９１年）、特にポスらのＵ．Ｓ．特許出願Ｎｏ．０７／９９５４４３（１９９２年１２月２３日出願）（代理人ドケットＮｏ．ＬＤ６０）およびソッタシル（Ｔｈｏｔｔａｔｈｉｌ）らのＵ．Ｓ．特許出願Ｎｏ．０８／０３３５９８（１９９３年３月１９日出願）（代理人ドケットＮｏ．ＬＤ５７）に記載の方法で製造しうる。
【００４７】
Ｃ−１３変性によって得られる化合物
本発明の加水分解法によって得られるＣ−１３ヒドロキシル含有化合物は特に、上記Ｃ−１３側鎖含有タキサンの製造の中間体として有用である。特に、当該方法に従って製造されるＣ−１３ヒドロキシル含有化合物は、側鎖形成中間体化合物、たとえばβ−ラクタムとカップリング反応させて、Ｃ−１３側鎖含有タキサンを得ることができる。かかる側鎖の付加は本質的に、タキサン生成物に対し増大もしくはより望ましい薬理学的活性を付与し、あるいは出発化合物に比べて、増大もしくはより望ましい薬理学的活性を有するタキサンへより容易に変換されるタキサン生成物を形成しうる。
【００４８】
本発明方法に従って製造されるＣ−１３ヒドロキシル含有化合物は任意に、カップリング反応による側鎖形成での使用前に変性することができる。たとえば、本発明方法に係るＣ−１０の変性は、本発明のＣ−１３加水分解法の前、その途中または後に行うことができ、および／またはＣ−１３以外の位置の１個以上のヒドロキシル基をカップリング反応の前に保護し、後に脱保護してもよい。
本発明の加水分解法によって得られ、上記の如く任意に変性したＣ−１３ヒドロキシル含有タキサンは、たとえば、列挙したものなどのＣ−１３アシルオキシ側鎖含有タキサンの製造に使用されてよく、またヨーロッパ特許公開Ｎｏ．４００９７１、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．４８７６３９９、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．４８５７６５３、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．４８１４４７０、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．４９２４０１２、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．４９２４０１１、およびキングストンの「Ｐｈａｒｍ． Ｔｈｅｒ．」（Ｖｏｌ．５２、１〜３４頁、１９９１年）、特にポスらのＵ．Ｓ．特許出願Ｎｏ．０７／９９５４４３（１９９２年１２月２３日出願）（代理ドケットＮｏ．ＬＤ６０）およびソッタシルらのＵ．Ｓ．特許出願Ｎｏ．０８／０３３５９８（１９９３年３月１９日出願）（代理人ドケットＮｏ．ＬＤ５７）に記載の方法で製造しうる。式ＶＩのＣ−１３アシルオキシ含有タキサンの製造が好ましい。
【００４９】
Ｃ−１０変性用の好ましい化合物
本発明のＣ−１０加水分解法において、式ＩＩのタキサンまたはその塩を用いることが好ましく、これにより、酵素加水分解は、式Ｉの対応化合物またはその塩を付与する。本発明のＣ−１０エステル化法において、同様に、式Ｉのタキサンまたはその塩を用いることが好ましく、これにより、酵素エステル化は式ＩＩの対応化合物またはその塩を付与する。
【００５０】
式ＩおよびＩＩにおいて、Ｒ７はＲ１１−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（特にＲ１１はメチルなどのアルキル）が好ましく；Ｒ２はヒドロキシまたはキシロシルが好ましく；Ｒ３はメチルなどのアルキルが好ましく；Ｒ４はフェニルなどのアリールが好ましく；およびＲ１はヒドロキシルまたは下記式ＩＩＩの基が好ましい。
【化１５】
（式中、Ｒ８およびＲ９はそれぞれ独立して、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルケニルオキシ、アルキニル、アルキニルオキシ、シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、シクロアルケニル、シクロアルケニルオキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロシクロまたはヘテロシクロオキシ；および
Ｒ１０は水素またはヒドロキシル保護基である）
式ＩおよびＩＩのタキサンの具体例としては、セファロマニン、１０−脱アセチルタキソル、７−キシロシルタキソル、タキソル−Ｃ、７−キシロシル−１０−脱アセチルタキソル、タキソル、バッカチンＩＩＩ、１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩ、７−キシロシルバッカチンＩＩＩ、および７−キシロシル−１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩである。１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩの形成（たとえば酢酸の形成を伴う）のため、たとえば加水分解酵素を用いるバッカチンＩＩＩの酵素加水分解は、本発明の好ましい具体例である。この反応は、本発明の酵素エステル化法によって逆にすることができる。
最終的に、本明細書記載の方法でタキソルを製造することが好ましい。
【００５１】
Ｃ−１３変性用の好まし化合物
本発明方法において、式ＶＩのタキサンまたはその塩を用いることが好ましく、これにより、Ｃ−１３の酵素加水分解は、式Ｖの対応化合物またはその塩を付与する。式ＶおよびＶＩにおいて、Ｒ１２はアセチルオキシなどのＲ６−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−またはヒドロキシルが好ましく；Ｒ２はヒドロキシルまたはキシロシルが好ましく；Ｒ３はメチルなどのアルキルが好ましく；Ｒ４はフェニルなどのアリールが好ましく；およびＲ７は下記式ＩＩＩの基が好ましい。
【化１６】
（式中、Ｒ８，Ｒ９およびＲ１０は前記と同意義である）
式ＶＩの出発タキサンの具体例は、セファロマニン、１０−脱アセチルタキソル、７−キシロシルタキソル、タキソル−Ｃ、および７−キシロシル−１０−脱アセチルタキソルの１種もしくは混合物またはタキソルである。好ましい加水分解生成物は、バッカチンＩＩＩ、１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩ、７−キシロシルバッカチンＩＩＩ、および７−キシロシル−１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩである。
【００５２】
加水分解後のカップリング反応は、式ＩＩＩのＣ−１３アシルオキシ基を有する上記式ＶＩのタキサン生成物を付与することが好ましい。本明細書記載の加水分解およびカップリング反応によって、最終的にタキソルを製造することが好ましい。
本発明方法のいずれにおいても、反応体または生成物の水和物などの塩または溶媒化合物を使用したりあるいは適宜に製造することができる。
【００５３】
【実施例】
次に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、これらの実施例は単に例示であって、本発明の技術的範囲を制限するものでは決してない。
【００５４】
実施例１
バッカチンＩＩＩの１０−脱アセチル化：−
土壌から単離したノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ １３９１２）を、１０ｍｌ培地を含有する５０ｍｌ三角フラスコで、２８℃、１５０ｒｐｍにて３日間生長させる。培地は蒸留水１Ｌ当り最終ｐＨ６．８±０．２で、バクト（Ｂａｃｔｏ）・トリプトン１０ｇ、バクト・酵母エキス５ｇ、トリブチリン６ｍｌ、および０．０６ｍｌのツィーン（Ｔｗｅｅｎ）８０を含有する。細胞を遠心分離で採取し、１０ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７）で洗い、２ｍｌの同緩衝剤に再懸濁する。かかる細胞懸濁液に、２０μｌのメタノール中の０．５ｍｇのバッカチンＩＩＩを加え、懸濁液を周囲温度（約２３℃）にて、フィッシャー・ロト−ラック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｒｏｔｏ−Ｒａｃｋ）で２０時間混合する。懸濁液を塩化メチレンで抽出し、抽出物を蒸発し、再溶解し、以下に記載のＨＰＬＣ方法２で検定する。サンプルは、０．２５７ｍｇ／ｍｌの１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩおよびほんの痕跡量のバッカチンＩＩＩを含有する（変換率１００％）。また、他の３つの培地で生長した菌株ＡＴＣＣ５５４２６の洗った細胞も、この形質変換を行った。
【００５５】
実施例２
バッカチンＩＩＩの脱アセチル化：−
蒸留水１Ｌ当り最終ｐＨ６．８±０．２で、１０ｇのバクト・トリプトン、５ｇのバクト・酵母エキスおよび０．０６ｍｌのツィーン８０を含有する２０ｍｌ培地で生長したノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ １３９１２）を用い、これを４Ｌ三角フラスコ内の１Ｌの同培地に接種する。フラスコを２８℃で３日間振とうし、次いで遠心分離で細胞を採取する。細胞ペレットを６００ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７）で洗い、再び遠心分離して、３６．６ｇの湿潤細胞を得る。細胞を−７２℃で冷凍し、２日で２．５ｇに凍結乾燥し、乳鉢と乳棒で粉砕し、２℃で貯蔵する。１．９８ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７）、５０ｍｇの乾燥細胞および０．５ｍｇのバッカチンＩＩＩを２０μｌのメタノール中、ロト−ラックを用い周囲温度にて下記表１に示す時間（分）で混合する。反応は２Ｌのメタノールを加えて停止する。沈澱物をマイクロフュージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）で除去し、サンプルを以下に記載のＨＰＬＣ方法１で検定する。得られる結果を表１に示す。
【表１】
１０−脱アセチル
時間 バッカチンＩＩＩ バッカチンＩＩＩ 変換率
（ 分 ） （ ｍｇ／ｍｌ） （ ｍｇ／ｍｌ） （ ％ ）
０ ０．００７ ０．２５２ −
３０ ０．０５１ ０．１４３ ２２
６０ ０．１０６ ０．１０６ ４６
１２０ ０．２０４ ０．０３４ ８８
【００５６】
実施例３
タキソルの１０−脱アセチル化：−
ノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ １３９１２）の部分的精製抽出物［ウオットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）ＤＥ５２にてアニオン交換クロマトグラフィーにより精製）は、３４ミリユニット／酵素（ｍｌ）を含有する。（なお、１ミリユニットは、０．２５ｍｇ／ｍｌのバッカチンＩＩＩおよび１％のメタノールを含有する５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７）中、２８℃にて１分当り、１ｎモルのバッカチンＩＩＩを１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩに加水分解できる酵素の量である。）５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７）、０．５ｍｇのタキソル、１％のメタノールおよび３４ミリユニットの酵素を含有する２ｍｌを、フィッシャー・ロト−ラックにて２８℃で３．５時間培養する。塩化メチレン４ｍｌによる抽出で、反応を停止する。抽出物を乾燥し、メタノールに再溶解し、以下に記載のＨＰＬＣ方法３で検定する。サンプルは０．０７５ｍｇのタキソルおよび０．１８６ｍｇ／ｍｌの１０−脱アセチルタキソルを含有する（変換率７８％）。
【００５７】
ノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ１３９１２）の他の精製：−
１％のトリプトンおよび０．５％の酵母エキスを含有する培地にて、発酵器内でノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６を生長させる。全ての精製ステップは、５０ｍＭリン酸塩緩衝剤（ｐＨ７．２）中、４℃で行う。細胞を緩衝剤中１０％Ｗ／Ｖで懸濁し、溶解（ｌｙｓｉｓ）のため１００００ｐｓｉで、ミクロ−流動化装置へ２回通す。次いで細胞溶解産物を、２４０００×ｇで１５分間遠心分離して透明にする。硫酸アンモニウムを６０％飽和まで加え、生成する沈澱物を、１Ｍ硫酸アンモニウムを含有する緩衝剤に懸濁し、疎水性相互作用クロマトグラフィー［ＨＩＣ−エーテル（トーヤ（Ｔｏｙａ）−パール）］カラム（５．５×２．６ｃｍ）に、流速２ｍｌ／分で適用する。酵素活性を緩衝剤で溶離する。次いで活性画分を、ファーマシア・セファクリル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−２００ゲル濾過カラム（２．６×８４ｃｍ）に０．５ｍｌ／分で装填する。カラムからの活性画分を、アニオン交換（ＢｉｏＲａｄ−Ｑ２）カラム（２ｍｌカラム、流速２ｍｌ／分）に装填し、活性を０〜０．８Ｍ−ＮａＣｌ／４２ｍｌの塩勾配で溶離する。活性画分をプールし、上述のセファクリルＳ−２００カラムに適用する。ドデシル硫酸ナトリウム含有のゲルにおける、酵素の分子量は４００００±１００００と推定される。上記方法の各種ステップで得られる結果は、以下の通りである。
１ミリユニット（ｍｕ）の酵素は、０．２５ｍｇ／ｍｌのバッカチンＩＩＩおよび１％のメタノールを含有する５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７）中２５℃にて、１ｎモル／分のバッカチンＩＩＩの１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩへの変換を触媒する。蛋白質は、ＢｉｏＲａｄ プロテイン・エッセイ・リエーゼント（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ）で測定した。
【００５８】
実施例４
１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩのバッカチンＩＩＩへのアセチル化：−
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７．２）中のノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ １３９１２）（１０％Ｗ／Ｖ）を、ミクロ流動化装置で破壊し、１０−デアセチラーゼ酵素を抽出物から、３時間の撹拌によりウオットマンＤＥＡＥセルロースＤＥ５２アニオン交換体に吸着せしめる（１０ｇ抽出蛋白質／ＤＥ５２（ｌ））。ＤＥ５２を濾取し、緩衝剤で洗い、凍結乾燥して０．０９１ミリユニット酵素／固体（ｍｇ）を得る。０．２ｍｌの１Ｍリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ８）、１００ｍｇの固定酵素（すなわち、ＤＥ５２レジンに固定）、１．８ｍｌの水、２ｍｇの１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩおよび０．５ｍｌの酢酸ビニルを、室温にて磁気棒で１４．５時間激しく撹拌する。反応混合物を塩化メチレンで抽出する。抽出物を乾燥し、メタノールに再溶解して、以下に記載のＨＰＬＣ方法１で分析する。サンプルは０．６８８ｍｇ／ｍｌの１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩおよび０．２０３ｍｇ／ｍｌのバッカチンＩＩＩを含有する（変換率１９％）。
【００５９】
ＨＰＬＣ方法
方法１
カラム：ヒュレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ）ハイパージル５ミクロンＯＤＳ Ｃ１８、２００×４．６ｍｍ
移動相：５５％メタノール、４５％水
流速：１ｍｌ／分
カラム温度：周囲
検出波長：２３０ｎｍ
方法２
カラム：フェース・セパレーションズ・インコーポレイテッド（コネチカット州ノルウオーク）のミクロボア・スフェリソーブ・フェニル（ｍｉｃｒｏｂｏｒｅ ｓｏｐｈｅｒｉｓｏｒｂ ｐｈｅｎｙｌ）１５０×２．０ｍｍ、３ミクロン
移動相：溶剤Ａ：１５ｍＭ−ＫＨ２ＰＯ４（トリフルオロ酢酸でｐＨ４に調整）、溶剤Ｂ：アセトニトリル
時間 （ 分 ） 溶剤Ａ （ ％ ） 溶剤Ｂ （ ％ ）
０ ７５ ２５
２０ ５５ ４５
２３ ４０ ６０
２４ ２５ ７５
２８ ７５ ２５
カラム温度：３５℃
検出波長：２３０ｎｍ
方法３＊
カラム：Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄハイパージル５ミクロンＯＤＳ Ｃ１８、２００×４．６ｍｍ
移動相：６０％メタノール、４０％水
流速：１ｍｌ／分
カラム温度：周囲
検出波長：２３５ｎｍ
注＊）モンサラットらの「Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ」（１８、８９５−９０１頁、１９９０年）も参照。
【００６０】
実施例５
実生エキスの加水分解：−
タキサス属ヒックジイ実生のエタノール抽出物を、ナノフィルターで１０〜１５倍に濃縮する。０．５ｍｌの抽出物、０．５ｍｌの１Ｍリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７）、ノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ １３９１１）からの５４ミリユニットの部分精製酵素（アニオン交換クロマトグラフィーおよび硫酸アンモニウム沈澱で精製）および水４ｍｌを、フィッシャー・ロト−ラックにて２８℃で４８時間培養する。（なお、ＡＴＣＣ５５４２５からの酵素は、本明細書記載のＣ−１３の加水分解に使用しうる。）第２チューブは同じ混合物を含有し、またノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ １３９１２）からの１４ミリユニット酵素が実施例４に記載の如く５００ｍｇのＤＥ５２に固定されている。２８℃にて２３時間の培養後、ＤＥ５２におけるＡＴＣＣ５５４２６からの第２部分の１４ミリユニット酵素を、４ｍｌの水と共に加え、培養を２２時間続ける。対照サンプルは酵素を受容せず。サンプルを塩化メチレンで抽出し、蒸発した抽出物をメタノールに溶解して、上記ＨＰＬＣ方法２で分析する。得られる結果を、下記表２に示す。
【００６１】
表２の結果から、ＳＣ １３９１１からのＣ−１３デアシラーゼによる処理後、タキソル、セファロマニン、７−キシロシル−１０−脱アセチルタキソルおよび１０−脱アセチルタキソルが枯渇し、一方、バッカチンＩＩＩおよび１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩの量の増大が認められる。（１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩ＋バッカチンＩＩＩ）と初期タキソルのモル比は、１１７％から４３６％増大した。実生エキスを、ＳＣ １３９１１からのＣ−１３デアシラーゼとＳＣ １３９１２からのＣ−１０デアシラーゼの両方で処理すると、バッカチンＩＩＩは１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩに変換し、１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩの濃度は、初期値に比べて６倍増大した。このように、タキサン混合物をＣ−１３デアシラーゼおよびＣ−１０デアシラーゼで処理すると、原理生成物（ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔ）として１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩが得られる。
【００６２】
【表２】
【００６３】
実施例６
タキソルのＣ−１３側鎖を除去しうる微生物の菌株の選択：−
蒸留水１５０ｍｌ中の（Ｄｉｆｃｏ）スピリット・ブル−寒天培地（５．２５ｇ）を、製造業者の指示に従い、殺菌し、部分的に冷却する。培地は１ｌ当り、１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母エキス、２０ｇの寒天、および０．１５ｇスピリット・ブルーを含有する。かかる培地に殺菌フィルターを介して、メタノール１ｍｌ中のタキソル２５ｍｇおよびツィーン８０（１０μｌ）を加える。１００ｍｍ×１５ｍｍのペトリ皿に、１５ｍｌ培地を用いる。
平板（ｐｌａｔｅ）を冷却および乾燥した後、土壌サンプルを以下の如くプレートアウトする。２ｇの土壌を４０ｍｌの水に懸濁する。懸濁液のサンプルを水で１００倍に希釈し、平板１つ当り０．１ｍｌを散布する。使用する水は、０．２２μフィルターで濾過した。平板を２８℃で培養し、透明なゾーンで囲まれたコロニーを選択する。選択の基準は、タキソルが培地における使用濃度で溶解せず、平板に濁り外観を付与し、これに対し、バッカチンＩＩＩおよび加水分解で生成する側鎖は溶解することにより、コロニーの周囲に透明ゾーンを形成することである。選択した微生物は、ノカルジオイデス・アルブス菌株ＡＴＣＣ５５４２４（ＳＣ １３９１０）およびＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ １３９１１）、およびノカルジオイデス・ルテウス菌株ＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ １３９１２）である。
【００６４】
実施例７
タキソルからＣ−１３側鎖の除去：−
本例の反応は、後記反応工程Ｉに従って進行する。１０ｍｌ培地含有の５０ｍｌ三角フラスコに、実施例６に記載の如く土壌から単離したノカルジオイデス・アルブス菌株ＡＴＣＣ５５４２４（ＳＣ １３９１０）またはＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ１３９１１）を接種し、２８℃、１５０ＲＰＭで２日間振とうする。培地は蒸留水１ｌ当り、ｐＨ６．８±０．２で、１０ｇのバクト・トリプトン、５ｇのバクト・酵母エキスおよび０．０６ｍｌのツイーン８０を含有する。遠心分離で細胞を除去し、上層液のｐＨを１Ｍ−ＫＨ２ＰＯ４で８．６６から７へ調整する。
【００６５】
各上層液２ｍｌにタキソル０．５ｍｇ／メタノール２０μｌを加え、混合物を周囲温度（約２３℃）で２１時間撹拌する。溶液を４ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。抽出物をＮ２下室温にて乾燥し、メタノールに再溶解し、ＨＰＬＣ（上記方法３）で分析する。菌株ＡＴＣＣ５５４２４（ＳＣ １３９１０）からの上層液は、０．００８ｍｇ／ｍｌのタキソルおよび０．１６３ｍｇ／ｍｌのバッカチンＩＩＩを付与する（変換率９４．９モル％）。菌株ＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ１３９１１）からの上層液は、０．０１４ｍｇ／ｍｌのタキソルおよび０．１６６ｍｇ／ｍｌのバッカチンＩＩＩを付与する（変換率９６．７モル％）。（なお、バッカチンＩＩＩおよび開裂した側鎖生成物は、ＬＣ−ＭＳで同定した。）
反応工程１
【化１７】
【００６６】
実施例８
セファロマニンからＣ−１３側鎖の除去：−
それぞれ１０ｍｌの培地（コーン浸漬リカー３５ｇ、セレロース２０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４５ｇ、ＣａＣＯ３３．５ｇ、および大豆油５ｍｌ、蒸留水で１ｌに調整）を含有する２つの５０ｍｌ三角フラスコにそれぞれ、０．５ｍｌのノカルジオイデス・アルブス菌株ＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ １３９１１）を接種する。２８℃、１５０ＲＰＭでの２日培養後、これら２つの培養物を、実施例７で用いた１ｌの培地を含有する４ｌフラスコに加える。２８℃、２００ＲＰＭで７２時間後、遠心分離で細胞を除去し、上層液を１Ｍ−ＫＨ２ＰＯ４でｐＨ８．１６からｐＨ７に調整する。
セファロマニン０．５ｍｇ／メタノール２０μｌを、転倒型振盪器（フィッシャー・ロト−ラック）にて、上層液２ｍｌと共に１７時間培養する。溶液を塩化メチレンで抽出し、抽出物を蒸発し、メタノールに再懸濁し、ＨＰＬＣ（上記方法２）で分析する。セファロマニン濃度は、０．１７５ｍｇ／ｍｌから０に減少し、０．１１０ｍｇ／ｍｌのバッカチンＩＩＩが生成した（分析した初期セファロマニン濃度に対して８９モル％収率）。
【００６７】
実施例９
７−キシロシルタキソルからＣ−１３側鎖の除去：−
実施例８において、１ｌ培地を３日の代わりに２日間培養する以外は、同様にして、ノカルジオイデス・アルブス菌株ＡＴＣＣ５５４２４（ＳＣ １３９１０）およびＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ １３９１１）からの酵素を製造する。ノカルジオイデス・ルテウス菌株ＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ １３９１２）を実施例８のノカルジオイデス・アルブス菌株ＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ １３９１１）の場合と同様に生長させる。３日後、遠心分離で細胞を採取し、６００ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７）で洗い、再び遠心分離する。３６．６ｇの湿潤細胞を−７２℃で冷凍し、２日で２．５２ｇに凍結乾燥し、乳鉢と乳棒で粉砕し、２℃で貯蔵する。
菌株ＡＴＣＣ５５４２４（ＳＣ １３９１０）およびＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ １３９１１）からの１．８ｍｌ上層液と、菌株ＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ １３９１２）からの５０ｍｇ乾燥細胞をそれぞれ１．８ｍｌ水中で、フィッシャー・ロト−ラックにて、室温で０．５ｍｇの７−キシロシルタキソル／０．２ｍｌのメタノールと共に４２時間培養する。反応液を塩化メチレンで抽出し、乾燥した抽出物をメタノールに溶解し、ＨＰＬＣ（上記方法３）で分析する。各酵素の場合、７−キシロシルタキソルは０．２１８ｍｇ／ｍｌから０に減少した。各サンプルの主要生成物は、ＨＰＬＣ−マススペクトロメトリーにより同定したところ、７−キシロシルバッカチンＩＩＩであった。バッカチンＩＩＩ標準に対して、ＡＴＣＣ５５４２４（ＳＣ １３９１０）、ＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ １３９１１）、およびＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ １３９１２）はそれそれ、０．１１２、０．１１８、および０．１２０ｍｇ／ｍｌの７−キシロシルバッカチンＩＩＩ生成物濃度を付与した。バッカチンＩＩＩおよび７−キシロシルバッカチンＩＩＩに対し２３５ｎｍで同じ吸光係数を用いると、計算収率は８８％、９３％、および９４％（それぞれモル％）となる。
【００６８】
実施例１０
植物細胞混合物の加水分解：−
１ｇのタキサス属ヒックジイ針状葉を、メタノール／酢酸（５０００：１）１０ｍｌで抽出する。１０ｍｌ抽出物に、水／酢酸（５００：１）１０ｍｌを加える。混合物を４８０００×ｇ、２０℃で１０分間遠心分離する。ペレットを捨てる。４ｍｌ抽出物とノカルジオイデス・アルブス菌株ＡＴＣＣ５５４２４（ＳＣ１３９１０）またはＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ１３９１１）からの１６ｍｌ上層液（実施例９の記載に準じ製造）を、２８℃、１５０ＲＰＭにて５０ｍｌ三角フラスコ内で、４２時間振とうする。サンプルを塩化メチレンで抽出し、蒸発した抽出物をメタノールに溶解し、ＨＰＬＣ（上記方法２）で分析する。酵素処理および該処理せずの場合の、タキサン濃度および（バッカチンＩＩＩ＋１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩ）／初期タキソルのモル比を、下記表３に示す。
【表３】
【００６９】
実施例１１
酵素の精製およびタキサンの加水分解：−
５００ｍｌ三角フラスコ内の１００ｍｌの培地（コーン浸漬リカー３５ｇ、セレロース２０ｇ、硫酸アンモニウム５ｇ、炭酸カルシウム３．５ｇ、および大豆油５ｍｌ、蒸留水で１ｌに調整）に、同培地中のノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ １３９１１）１ｍｌを接種し、２８℃で２日間振とうする。この培養物２０ｍｌを、４ｌ三角フラスコ内のトリプトン１０ｇおよび酵母エキス５ｇ含有の蒸留水１ｌ（ｐＨ６．８±０．２）へ移す。フラスコを２８℃で３日間振とうし、遠心分離で細胞を除去し、上層液を１Ｍ−ＫＨ２ＰＯ４でｐＨ７．８９からｐＨ７に調整する。
【００７０】
全ての精製ステップは４℃で行う。上層液を、５ｃｍ直径カラム内の１５０ｍｌウオットマンＤＥ５２アニオン交換体／２５ｍＭリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７）に適用する。カラムを１５０ｍｌ緩衝剤、次いで０．２５Ｍ−ＮａＣｌ含有の４５０ｍｌ緩衝剤で洗う。酵素活性を緩衝剤＋０．４５Ｍ−ＮａＣｌで溶離する。流速は５ｍｌ／分である。ＤＥ５２カラムからの最も活性な画分に、硫酸アンモニウム（１００ｍｇ／ｍｌ）を加え、溶液を、２．６ｃｍ直径カラム内の１００ｍｇ／ｍｌ硫酸アンモニウム含有の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７）中、３０ｍｌファーマシア・フェニル・セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ−４Ｂ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）に流速１．６ｍｌ／分で適用する。カラムを１５０ｍｌ緩衝剤＋２０ｍｇ／ｍｌ硫酸アンモニウムで洗い、次いで活性を緩衝剤のみで溶離する。フェニル・セファロースカラムからの最も活性な画分を、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）ＹＭ１０膜を用いる限外濾過で４ｍｌまで濃縮し、次いでファーマシア・セファクリル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−２００ゲル濾過カラム（２．６×８４ｃｍ）へ流速０．６５ｍｌ／分で通す。比活性の最も高い画分は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲルにおいて分子量４９０００±１００００のシングルバンドを有した。精製について下記表４に要約する。（なお、１ミリユニット（ｍｕ）の酵素は、０．２５ｍｇ／ｍｌタキソルおよび１％メタノール含有の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤中、２８℃にて１ｎモル／分のタキソルのバッカチンＩＩＩへの変換を触媒する。）
【００７１】
【表４】
上記精製した酵素の活性を証明するため、下記表５に挙げるタキサン物質を用いて、以下に示す実験を行った。
【００７２】
２．０ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７）に、０．５ｍｇタキサン基質および１％メタノールを含有するサンプル（サンプル１，２，３，４および５）を調製する。また、２．０ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７）に、０．５ｍｇタキサン基質および１％メタノールに加えて、上記フェニル・セファロースＣＬ−４Ｂステップで精製した酵素の１０ｍｕ酵素を含有するサンプル（サンプル１ｅ，２ｅ，３ｅ，４ｅおよび５ｅ）も調製する。全てのサンプルは、フィッシャー・ロト−ラックを用い２８℃にて１６時間混合する。サンプル１，１ｅ，２，２ｅ，５および５ｅは、４ｍｌの塩化メチレンで抽出する。２ｍｌの抽出物を乾燥し、１ｍｌのメタノールに再溶解し、ＨＰＬＣ方法３で分析する。サンプル３，３ｅ，４および４ｅは、２ｍｌのメタノールで希釈し、ＨＰＬＣ方法３で分析する（これら後者のサンプルのみ、Ｃ−１３側鎖を測定した）。
【００７３】
表５に、培養後に各サンプルに残留するタキサン基質の量（ｍｇ／ｍｌ）、並びに培養の終りに存在する生成物タキサンの量（ｍｇ／ｍｌ）を表記する。表５から明らかなように（サンプル１ｅ，２ｅ，３ｅ，４ｅおよび５ｅ参照）、上述の如く精製した酵素は、列挙したタキサン基質の加水分解によって、Ｃ−１３側鎖の除去に有効であることが認められる。
【表５】
【００７４】
実施例１２
実生エキスの加水分解：−
タキサス属ヒックジイ実生のエタノール抽出物を、ナノフィルターで１０〜１５倍に濃縮する。０．５ｍｌの抽出物、０．５ｍｌの１Ｍリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７）、ノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ１３９１１）からの５４ミリユニットの部分精製酵素（上記実施例１１参照）および水４ｍｌを、フィッシャー・ロト−ラックにて２８℃で４８時間混合する。対照サンプルは酵素を受容せず。サンプルを塩化メチレンで抽出し、蒸発した抽出物をメタノールに溶解し、ＨＰＬＣ方法２で分析する。得られる結果を下記表６に示す。
【表６】
【産業上の利用分野】
本発明は、Ｃ−１０またはＣ−１３ヒドロキシル含有タキサン（ｔａｘａｎｅ）の酵素加水分解製造法、Ｃ−１０アシルオキシ含有タキサンの酵素エステル化製造法、並びにＣ−１３アシルオキシ含有タキサンの製造用途に関する。
更に詳しくは、本発明は、Ｃ−１０ヒドロキシル含有タキサンの製造の酵素加水分解法、およびＣ−１０アシルオキシ含有タキサンの製造の酵素エステル化法に関し、これらの化合物はたとえば、タキソル（ｔａｘｏｌ）およびタキソル類縁体などの薬理学的活性タキサンの製造の中間体として使用しうる。
また本発明は、Ｃ−１３アシルオキシ含有タキサンの製造の中間体として有用な、特にタキソルおよびタキソル類縁体の製造にも有用な、Ｃ−１３ヒドロキシ含有タキサンの製造の酵素加水分解法にも関係する。
【０００２】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】
タキサンは、医薬分野での有用性が認められているジテルペン化合物である。たとえば、式：
【化７】
のタキサン、すなわちタキソルは、有効な抗癌剤であることが知られている。
天然産生タキサン、たとえばタキソルは植物中に見つけることができ、植物から単離されている。しかしながら、このようなタキサンは植物中に比較的少量でしか存在しないため、タキソルの場合、たとえば、該化合物源を形成する生長の遅いイチイの木が多数要求される。従って、この分野では、タキソルなどの天然産生タキサンの製造、並びにその類縁体の製造の半合成法を含む合成法の探索が続けられている。
【０００３】
タキサン環構造の複雑さのために、既に基本タキサン環構造を有する出発物質の使用によって、環系上に所定の置換基を含有するタキサンをより容易に製造しうる。すなわち、たとえば、タキサン環構造を有し、かつＣ−１３にヒドロキシル基を含有し、および特にＣ−１０に所定の置換基をも含有する化合物を中間体化合物とカップリング反応させて、Ｃ−１３に所定の側鎖を有するタキサン、たとえばタキソルあるいはその類縁体で例示される、Ｃ−１３にアシルオキシ側鎖を有する薬理学的活性タキサンを形成することができる。
【０００４】
本発明は、Ｃ−１０に所定の置換基を持つタキサンを得る方法を提供する。特に本発明は、Ｃ−１０ヒドロキシル含有およびＣ−１０アシルオキシ含有タキサン化合物の製造法を提供し、これらの化合物は、タキソルおよびその類縁体などのタキサンの製造の出発物質としての有用性が認められる。
１つの具体例において、本発明は、Ｃ−１０に直接結合したヒドロキシル基を含有する少なくとも１種のタキサンの製造法であって、Ｃ−１０に直接結合したアシルオキシ基を含有する少なくとも１種のタキサンを、上記アシルオキシ基のヒドロキシル基への加水分解を触媒しうる、ノカルジオイデス属に属する微生物もしくは該微生物から誘導される酵素と接触させて加水分解を行う工程から成ることを特徴とする製造法を提供する。
【０００５】
他の具体例において、本発明は、Ｃ−１０に直接結合したアシルオキシ基を含有する少なくとも１種のタキサンの製造法であって、Ｃ−１０に直接結合したヒドロキシル基を含有する少なくとも１種のタキサンを、アシル化剤および上記ヒドロキシル基のアシルオキシ基へのエステル化を触媒しうる、ノカルジオイデス属に属する微生物もしくは該微生物から誘導される酵素と接触させて加水分解を行う工程から成ることを特徴とする製造法を提供する。
さらに本発明は、Ｃ−１３ヒドロキシル含有タキサン化合物の製造法を提供し、かかる化合物はＣ−１３に所定の側鎖を有するタキサンの製造の出発物質としての有用性が認められる。
特に本発明は、Ｃ−１３に直接結合したヒドロキシル基を含有する少なくとも１種のタキサンの製造法であって、Ｃ−１３に直接結合したアシルオキシ基を含有する少なくとも１種のタキサンを、上記アシルオキシ基のヒドロキシル基への加水分解を触媒しうる、ノカルジオイデス属に属する微生物もしくは該微生物から誘導される酵素と接触させ加水分解を行う工程から成ることを特徴とする製造法を提供する。
【０００６】
本発明は、Ｃ−１０アシルオキシ含有タキサンからＣ−１０ヒドロキシル含有タキサンへの、またＣ−１０ヒドロキシル含有タキサンからＣ−１０アシルオキシ含有タキサンへの有効な製造法を提供する。本発明によれば、単一のタキサンを加水分解するか、あるいは異種のタキサン混合物を連続的にまたは同時に加水分解することができ、また同様に、本発明によれば、単一のタキサンをエステル化するか、あるいは異種のタキサン混合物を連続的にまたは同時にエステル化することができる。
さらに本発明は、Ｃ−１３アシルオキシ含有タキサンからＣ−１３ヒドロキシル含有タキサンへの有効な製造法を提供する。本発明によれば、単一のタキサンを加水分解するか、あるいは異種のタキサン混合物を連続的にまたは同時に加水分解することができる。
【０００７】
以下、本発明についてより詳しく説明する。
Ｃ−１０の加水分解
好ましい具体例において、本発明は、式Ｉ：
【化８】
Ｒ２は水素、ヒドロキシル、フルオロ、Ｒ５−Ｏ−、キシロシル、Ｒ６−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−またはＲ６−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリールまたはヘテロシクロ；
Ｒ５はヒドロキシル保護基；および
Ｒ６は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリールまたはヘテロシクロである）
の少なくとも１種のＣ−１０ヒドロキシル含有タキサン（Ｉ）またはその塩の製造法であって、式ＩＩ：
【化９】
本発明の加水分解法において、式ＩおよびＩＩの化合物の明記されていないキラル中心の全ての立体配置は、単独（すなわち、他の立体異性体が実質的に存在しない）または他の立体異性体と混合状態のいずれかにあることが意図される。
【０００８】
他の好ましい具体例において、本発明は、望ましくないアシルオキシＣ−１０基を有する少なくとも１種の第２タキサンから、望ましいＣ−１０アシルオキシ基を有する少なくとも１種の第１タキサンの製造法を提供するものであり、該製造法は、第２タキサンの酵素加水分解により少なくとも１種のＣ−１０ヒドロキシル含有類縁体を得た後、所望のアシル基をカップリング反応させて第１タキサンを得ることによる。この具体例において、本発明は、たとえば、異なるアシルオキシＣ−１０基を含有する出発タキサン混合物から、特定Ｃ−１０アシルオキシ基を有する所望タキサンの製造法を提供し、なお、出発混合物は所望のタキサンを含有しまたは含有してなくてもよく、該製造法は、異なるＣ−１０基の同時または連続的加水分解により、Ｃ−１０にヒドロキシル基を有する１種以上のタキサンを得た後、所望のアシル基をカップリング反応させることによる。この好ましい方法は特に、たとえばタキソルを産出する植物の抽出により、異なるＣ−１０アシルオキシ基を有するタキサン混合物を、他の天然産生タキサンと混合して得る場合、および最終的にタキソルなどの特定タキサンが望まれる場合に有用である。アシル基のカップリング反応は、アシル基形成用の非酵素法で行ってもよい。たとえば、Ｃ−７保護１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩ（たとえば１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩを、ジメチルホルムアミド中のトリエチルシリルクロリドおよびイミダゾールと接触させて形成される、Ｃ−７がトリエチルシリルで保護されたもの）を、低温（たとえば−６０〜＋７０℃）で、塩化リチウム／塩化アセチルと共にリチウムヘキサメチルジシラジド／テトラヒドロフランと接触させることにより、Ｃ−１０をアシル化することができる。別法として、アシル基のカップリング反応は、本明細書に記載の酵素エステル化法で行ってもよい。本発明の方法において、出発タキサンのＣ−１０アシルオキシ基の立体配置は、Ｃ−１０ヒドロキシル基含有生成物に保留されていることが好ましい。
【０００９】
Ｃ−１０のエステル化
他の好ましい具体例において、本発明は、式ＩＩ：
【化１０】
Ｒ２は水素、ヒドロキシル、フルオロ、Ｒ５−Ｏ−、キシロシル、Ｒ６−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−またはＲ６−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリールまたはヘテロシクロ；
Ｒ５はヒドロキシル保護基；
Ｒ６は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリールまたはヘテロシクロ；および
Ｒ７はアシルオキシである）
の少なくとも１種のＣ−１０アシルオキシ含有タキサン（ＩＩ）、またはその塩の製造法を提供するものであり、該製造法は、式Ｉ：
【化１１】
の少なくとも１種のＣ−１０ヒドロキシル含有タキサン（Ｉ）またはその塩を、アシル化剤およびＣ−１０ヒドロキシル基のエステル化を触媒しうる酵素もしくは微生物と接触させて上記Ｒ７アシルオキシ基を形成し、該エステル化を行う工程から成る。
【００１０】
本発明のエステル化法において、式ＩおよびＩＩの化合物の明記されていないキラル中心の全ての立体配置は、単独（すなわち、他の立体異性体が実質的に存在しない）または他の立体異性体と混合状態のいずれかにあることが意図される。 本発明のエステル化を行う任意のアシル化剤が使用されてよい。好ましいアシル化剤は、式ＩＶ：
Ｒ１１−Ｃ（Ｏ）−Ｌ （ＩＶ）
（式中、Ｒ１１はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはヘテロシクロ；および
Ｌはエステル基を形成するため置換しうる脱離可能基である）
の化合物である。
式ＩＶの好ましいＲ１１基は、Ｃ１ 〜 ６アルキル基などのアルキル基、特にメチルである。Ｌ基の具体例としては、ハロゲン原子、ヒドロキシル、アルコキシまたはアルケニルオキシ基が包含される。好ましいＬ基はアルケニルオキシ基で、最も好ましくは、ＣＨ２＝ＣＨ−Ｏ−やＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−Ｏ−などのＣ１−６アルケニルオキシである。酢酸イソプロペニルおよび酢酸ビニルが特に好ましいアシル化剤である。
本発明の方法において、出発タキサンのＣ−１０ヒドロキシル基の立体配置は、Ｃ−１０アシルオキシ基含有生成物に保留されていることが好ましい。
【００１１】
Ｃ−１３の加水分解
好ましい具体例において、本発明は、式Ｖ：
【化１２】
Ｒ２は水素、ヒドロキシル、フルオロ、Ｒ５−Ｏ−、キシロシル、Ｒ６−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、またはＲ６−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリールまたはヘテロシクロ；
Ｒ５はヒドロキシル保護基；および
Ｒ６は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリールまたはヘテロシクロである）
の少なくとも１種のＣ−１３ヒドロキシル含有タキサン（Ｖ）またはその塩の製造法を提供するものであり、該製造法は、式ＶＩ：
【化１３】
の少なくとも１種のＣ−１３アシルオキシ含有タキサン（ＶＩ）またはその塩を、上記Ｒ７アシルオキシ基のヒドロキシル基への加水分解を触媒しうる酵素もしくは微生物と接触させて加水分解を行う工程から成る。
本発明の方法において、式Ｖおよび式ＶＩの化合物の明記されていないキラル中心の全ての立体配置は、単独（すなわち、他の立体異性体が実質的に存在しない）または他の立体異性体と混合状態のいずれかにあることが意図される。
【００１２】
他の好ましい具体例において、本発明は、望ましくないアシルオキシＣ−１３側鎖を有する少なくとも１種の第２タキサンから、望ましいＣ−１３アシルオキシ側鎖を有する少なくとも１種の第１タキサンの製造法を提供するものであり、該製造法は、第２タキサンの酵素加水分解により少なくとも１種のＣ−１３ヒドロキシル含有類縁体を得た後、所望の側鎖をカップリング反応させて第１タキサンを得ることによる。この具体例において、本発明は、たとえば、異なるアシルオキシＣ−１３側鎖を有する出発タキサン混合物から、特定Ｃ−１３アシルオキシ側鎖を有する所望タキサンの製造法を提供し、なお、出発混合物は所望のタキサンを含有しまたは含有してなくてもよく、該製造法は、異なるＣ−１３基の同時または連続的加水分解により、Ｃ−１３にヒドロキシル基を有する１種以上のタキサンを得た後、所望の側鎖をカップリング反応させることによる。この好ましい方法は特に、たとえばタキソルを産生する植物の抽出により、異なるＣ−１３アシルオキシ側鎖を有するタキサン混合物を、セファロマニン（ｃｅｐｈａｌｏｍａｎｎｉｎｅ）および他の天然産生タキサンと混合して得る場合、および最終的にタキソルなどの特定タキサンが望まれる場合に有用である。
本発明の方法において、出発タキサンのＣ−１３アシルオキシ基の立体配置は、Ｃ−１３ヒドロキシル基含有生成物に保留されていることが好ましい。
【００１３】
定義
本明細書において、単独または他の基の一部として用いる各種語句の定義は、以下の通りである。
「酵素法」とは、酵素もしくは微生物を用いる本発明の方法を意味する。「加水分解」とは、アシルオキシ基からヒドロキシ基への形成を意味し、たとえば本発明の方法に従って、水および／または適当な有機アルコールとの接触によって行うことができる。「エステル化」とは、ヒドロキシル基からアシルオキシ基への形成を意味する。「アシル化剤」とは、アシル基の付与によって上記エステル化を行うことができる化合物を意味する。本発明方法における「酵素もしくは微生物」の使用には、２種以上の、並びに単一の酵素もしくは微生物の使用が含まれる。
【００１４】
「アルキル」または［ａｌｋ］とは、好ましくはノルマル鎖に１〜１２個の炭素を有する、任意に置換された直鎖および分枝鎖飽和炭化水素基を意味する。非置換のアルキル基としては、たとえば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、４，４−ジメチルペンチル、オクチル、２，２，４−トリメチルペンチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル等が挙げられる。置換基の具体例としては、ハロ、アルコキシ、アルキルチオ、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヒドロキシもしくは保護ヒドロキシ、カルボキシル（−ＣＯＯＨ）、アルキルオキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、カルバモイル（ＮＨ２−ＣＯ−）、アミノ（−ＮＨ２）、モノもしくはジアルキルアミノ、およびチオール（−ＳＨ）の群からの１個以上が含まれてよい。
【００１５】
「低級ａｌｋ」または「低級アルキル」とは、上述のノルマル鎖の炭素数１〜４の、任意に置換されたアルキル基を意味する。
「アルコキシ」または「アルキルチオ」とは、上述のアルキル基がそれぞれ酸素（−Ｏ−）または硫黄（−Ｓ−）に結合したものを意味する。「アルキルオキシカルボニル」とは、アルコキシ基がカルボニル基に結合したものを意味する。「アルキルカルボニルオキシ」とは、アルキル基がカルボニル基に結合し、次いで酸素に結合したものを意味する。「モノアルキルアミノ」または「ジアルキルアミノ」とは、それぞれ１または２個の上記アルキル基で置換されたアミノ基を意味する。
【００１６】
「アルケニル」とは、上述のアルキルの場合に定義した任意に置換された基で、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有するものを意味する。置換基の具体例としては、上述の１個以上のアルキル基、および／またはアルキル置換基として１個以上の上記基が含まれる。「アルケニルオキシ」とは、上記アルケニル基が酸素（−Ｏ−）に結合したものを意味する。
「アルキニル」とは、上述のアルキルの場合に定義した任意に置換された基で、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有するものを意味する。置換基の具体例としては、上述の１個以上のアルキル基、および／またはアルキル置換基として１個以上の上記基が含まれる。「アルキニルオキシ」とは、上記アルキニル基が酸素（−Ｏ−）に結合したものを意味する。
【００１７】
「シクロアルキル」とは、好ましくは１〜３つの環および環１つ当り３〜７個の炭素を有する、任意に置換された飽和炭素環式環基を意味する。非置換のシクロアルキル基としては、たとえばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロデシル、シクロドデシル、およびアダマンチルが挙げられる。置換基の具体例としては、上述の１個以上のアルキル基、および／またはアルキル置換基として１個以上の上記基が含まれる。「シクロアルキルオキシ」とは、上記シクロアルキル基が酸素（−Ｏ−）に結合したものを意味する。
【００１８】
「シクロアルケニル」とは、上述のシクロアルキルの場合に定義した任意に置換された基で、部分的に不飽和の環を構成する少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有するものを意味する。置換基の具体例としては、上述の１個以上のアルキル基、および／またはアルキル置換基として１個以上の上記基が含まれる。「シクロアルケニルオキシ」とは、上記シクロアルケニル基が酸素（−Ｏ−）に結合したものを意味する。
【００１９】
「ａｒ」または「アリール」とは、好ましくは１または２つの環および６〜１２個の環炭素を有する、任意に置換された炭素環式芳香族基を意味する。非置換のアリール基としては、たとえば、フェニル、ビフェニルおよびナフチルが挙げられる。置換基の具体例としては、１個以上、好ましくは３個以下のニトロ基、上述のアルキル基および／またはアルキル置換基として上記基が含まれる。「アリールオキシ」とは、上記アリール基が酸素（−Ｏ−）に結合したものを意味する。
【００２０】
「ヘテロシクロ」または「複素環式基」とは、少なくとも１つの環に少なくとも１個のヘテロ原子を有する、任意に置換された完全飽和または不飽和の芳香族または非芳香族環式基、好ましくは各環に５または６個の原子を有するモノ環式またはジ環式基を意味する。ヘテロシクロ基は、たとえば環中に１または２個の酸素原子、１または２個の硫黄原子、および／または１〜４個の窒素原子を有してよい。各ヘテロシクロ基は、環系の炭素またはヘテロ原子のいずれかを介して結合しうる。ヘテロシクロ基の具体例としては、チエニル、フリル、ピロリル、ピリジル、イミダゾリル、ピロリジニル、ピペリジニル、アゼピニル、インドリル、イソインドリル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾキサゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾキサジアゾリル、およびベンゾフラザニルが挙げられる。置換基の具体例としては、上述の１個以上のアルキル基および／またはアルキル置換基として１個以上の上記基が含まれる。「ヘテロシクロオキシ」とは、上記ヘテロシクロ基が酸素（−Ｏ−）に結合したものを意味する。
「ハロゲン」または「ハロ」とは、塩素、臭素、フッ素および沃素を意味する。
【００２１】
「タキサン」とは、下記タキサン成分を含有する化合物を意味する。「タキサン成分」とは、式：
【化１４】
【００２２】
「ヒドロキシ（またはヒドロキシル）保護基」とは、遊離のヒドロキシル基を保護することができ、かつその保護反応の後で、分子残基を妨害せずに脱離しうる基を意味する。かかる基、およびその合成は、Ｔ．Ｗ．グリーンの“有機合成における保護基”（ジョン・ワイレイ・アンド・サンズ、１９８１年）、またはフィザー・アンド・フィザーに記載されている。
「塩」としては、無機および／または有機酸および塩基によって形成される酸性および／または塩基性塩が包含される。
「アシル」とは、有機カルボン酸の−ＣＯＯＨ基からヒドロキシル基を除去して形成される成分を意味する。「アシルオキシ」とは、上記アシル基が酸素（−Ｏ−）に結合したものを意味する。
【００２３】
Ｃ−１０変性用の出発物質
本発明の出発物質として用いる、Ｃ−１０アシルオキシ含有、およびＣ−１０ヒドロキシ含有タキサンは、それぞれ本発明の酵素加水分解法またはエステル化法を受けることができる化合物であってよい。出発物質として、合成形成タキサン、あるいは好ましくは天然形成タキサン、たとえばセファロマニン、７−キシロシルタキソル、タキソル、バッカチンＩＩＩ、脱アセチルバッカチンＩＩＩ、またはタキソルＣ（Ｃ−１３タキソル側鎖のベンゾイル基がｎ−ペンタノイル基で置換されたタキソル類縁体）が挙げられ、これらの１種または混合物が使用されてよい。“天然形成”タキサン出発物質は好ましくは、タキサン産生植物組織、特にタキサス（Ｔａｘｕｓ）属の植物、たとえばタキサス・バッカタ（Ｔａｘｕｓ ｂａｃｃａｔａ）、タキサス・カスビダタ（Ｔａｘｕｓ ｃｕｓｐｉｄａｔａ）、タキサス・ブレビホリア（Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）、タキサス・ウオリチアナ（Ｔａｘｕｓ ｗａｌｌｉｃｈｉａｎａ）、タキサス・メディア（Ｔａｘｕｓ ｍｅｄｉａ）、タキサス・ヒックジィ（Ｔａｘｕｓ ｈｉｃｋｓｉｉ）、特にタキサスｘ．メディア・ヒックジィの組織または誘導組織の植物細胞培養および／または抽出によって得られる。植物組織の具体例としては、針状葉、樹皮および全実生が含まれる。
本発明方法のＣ−１０ヒドロキシおよびアシルオキシ含有タキサン出発物質を得る好ましい方法については、ラオの「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」（１０、５２１〜５２４頁、１９９３年）；キングストンの「Ｐｈａｒｍａｃ． Ｔｈｅｒ．」（５２、１〜３４頁、１９９１年）；またはこれらの実例を参照。
【００２４】
Ｃ−１３変性用の出発物質
本発明の出発物質として用いるＣ−１３アシルオキシ含有タキサンは、本発明の酵素加水分解を受けることができる化合物であってよい。出発物質として、合成形成タキサン、あるいは好ましくは天然形成タキサン、たとえばセファロマニン、７−キシロシルタキソル、タキソル、７−キシロシル−１０−脱アセチルタキソル、１０−脱アセチルタキソル、またはタキソルＣが挙げられ、これらの１種または混合物が使用されてよい。“天然形成”タキサン出発物質は好ましくは、タキサン産生植物組織、特にＴａｘｕｓ属の植物、たとえばＴａｘｕｓ ｂａｃｃａｔａ、Ｔａｘｕｓ ｃｕｓｐｉｄａｔａ、Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ、Ｔａｘｕｓ ｗａｌｌｉｃｈｉａｎａ、Ｔａｘｕｓ ｍｅｄｉａ、Ｔａｘｕｓ ｈｉｃｋｓｉｉ、特にＴａｘｕｓ ｘ．ｍｅｄｉａ ｈｉｃｋｓｉｉの組織または誘導組織の植物細胞培養および／または抽出によって得られる。植物組織の具体例としては、針状葉、樹皮および全実生が含まれる。
本発明方法のＣ−１３アシルオキシ含有タキサン出発物質を得る好ましい方法については、ラオの「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」（１０、５２１〜５２４頁、１９９３年）；キングストンの「Ｐｈａｒｍａｃ． Ｔｈｅｒ．」（５２、１〜３４頁、１９９１年）；またはこれらの実例を参照。
【００２５】
Ｃ−１０変性用の酵素および微生物
本発明で用いる酵素もしくは微生物は、本明細書に記載の酵素加水分解法またはエステル化法を触媒しうる酵素もしくは微生物であってよい。酵素もしくは微生物物質は、起源または純度にかかわらず、自由状態、またはたとえば物理的吸着または閉じ込めによる支持体への固定状態で使用しうる。
微生物の具体例としては、ノカルジオイデス(Ｎocardioides) 属に属する微生物が挙げられる。好ましい微生物は、ノカルジオイデス・アルブス(albus)、ノカルジオイデス・フラブス(flavus)、ノカルジオイデス・フルブス(fluvus)、ノカルジオイデス・ルテウス(luteus)、ノカルジオイデス・シンプレックス(simplex)およびノカルジオイデス・サーモリラシナス(thermolilacinus)、特にノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２４(ＳＣ１３９１０)、ノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２５(ＳＣ１３９１１)およびノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６(ＳＣ１３９１２)である。本明細書で用いる「ＡＴＣＣ」とは、言及する微生物の寄託所である、メリーランド州２０８５２、ロックビル、パークラウン・ドライブ１２３０１のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection)の受入番号を指称する。上記微生物ＡＴＣＣ５５４２４、５５４２５および５５４２６は１９９３年５月１２日に寄託されている。「ＳＣ」とは、スクイブ・カルチャー・コレクション(Ｓquibb culture collection)の一員として微生物に付与される呼称を意味する。
【００２６】
生物学的に純粋な微生物のノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２４（ＳＣ１３９１０）、ノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ１３９１１）およびノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ１３９１２）は、新規な微生物である。また本発明によれば、これら微生物のミュータントも、本明細書に記載の加水分解法またはエステル化法での使用、たとえば化学的手段、物理的手段（たとえばＸ線）または生物学的手段（たとえば分子生物学法による）による変性したものの使用が意図されていることを理解すべきである。
【００２７】
ノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２４（ＳＣ１３９１０）およびＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ１３９１１）は、培地Ａ９４［コーン浸漬リカー（ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ）（３５ｇ）、セレロース（２０ｇ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４試薬級（５ｇ）、ＣａＣＯ３（３．５ｇ）、大豆油（５ｍｌ）および蒸留水（１ｌ）］で培養されてよい。これらの微生物は、土壌（ニューブランズウイック州、ニュージャージー州の試料より）から単離されたもので、かつ種々の培地において好気性生長を示すグラム陽性の不動生物である。固形ＹＳ培地（酵母エキス０．２％、スターチ１％）において、菌糸体は白味乃至明クリーム色を呈する。生長は両固形および液体媒地において、暗拡散性色素の生成に関係する。微視的に、液体培養での生長は、多量分枝菌糸からなる菌糸集合体によって特徴づけられる。
【００２８】
ノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ１３９１２）は、培地Ａ９４［コーン浸漬リカー（３５ｇ）、セレロース（２０ｇ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４試薬級（５ｇ）、ＣａＣＯ３（３．５ｇ）、大豆油（５ｍｌ）および蒸留水（１ｌ）］で培養されてよい。この微生物は、土壌（ニューブランズウイック州、ニュージャージー州の試料より）から単離されたもので、かつ種々の培地において好気性生長を示すグラム陽性の不動生物である。固形ＹＳ培地（酵母エキス０．２％、スターチ１％）において、菌糸体は暗クリーム色を呈する。微視的に、液体培養での生長は、多量分枝菌糸からなる菌糸集合体によって特徴づけられる。
上記微生物のノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２４（ＳＣ１３９１０）およびＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ１３９１１）、およびノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ１３９１２）は、「Ｂｅｒｇｅｙｓ’ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」（Ｖｏｌ．２、Ｐ．Ｈ．Ａ．スニース著、１９８６年）の記載に従って、ノカルジオイデス・アルブスおよびノカルジオイデス・ルテウスの菌株として同定される。
【００２９】
本発明の加水分解またはエステル化法で用いる酵素の具体例は、加水分解酵素、特にエステラーゼ、プロテアーゼまたはリパーゼである。好ましい酵素としては、微生物、特に上述の微生物から誘導されるものが包含される。これらの酵素は、たとえば疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過、次いでアニオン交換カラムの使用といった抽出および精製法によって単離することができる。本発明はさらに、当該加水分解法またはエステル化法を行うことができ、かつたとえば上述の方法によって、ノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２４（ＳＣ１３９１０）およびＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ１３９１１）、およびノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ１３９１２）から単離しうる酵素を提供するものである。
【００３０】
Ｃ−１３変性用の酵素および微生物
本発明で用いる酵素もしくは微生物は、本明細書記載の酵素加水分解を触媒しうる酵素もしくは微生物であってよい。酵素もしくは微生物物質は、起源または純度にかかわらず、自由状態、またはたとえば物理的吸着または閉じ込めによる支持体への固定状態で使用しうる。
【００３１】
本発明方法による、出発Ｃ−１３アシルオキシ含有タキサンの酵素加水分解に好適な微生物を選択する好ましい方法は、新規なスクリーニング法の使用によるもので、該スクリーニング法は、
（ａ）固形の生長培地として、（ｉ）スクリーニングされる微生物が生長し、（ｉｉ）出発Ｃ−１３アシルオキシ含有タキサンを混和すると、溶解しないため濁り外観を呈し、および（ｉｉｉ）本発明加水分解法のＣ−１３ヒドロキシル含有タキサン生成物および必要に応じて開裂Ｃ−１３側鎖生成物を混和すると、溶解するため透明外観を呈する生長培地を選択し、
（ｂ）上記工程（ａ）で選択した、たとえばペトリ皿内の生長培地に予め出発Ｃ−１３アシルオキシ含有タキサンを混和しておき、かつ微生物の生長を発生せしめる条件下で、該生長培地に上記微生物を入れて接触せしめ、次いで
（ｃ）上記微生物による加水分解が可能であることを示す透明ゾーンが、微生物の生長が起こる領域付近で出現するかどうかを観察する
工程から成る。
【００３２】
透明ゾーンの形成は、加水分解が起こったこと、すなわち、微生物が本発明加水分解法での使用に好適となりうることを示す。本明細書で用いる語句「透明」および「濁り」とは、互いに相対的なものとして解釈すべきである。従って、出発Ｃ−１３アシルオキシ含有タキサンを、懸濁状態で見ることができるよう十分な量で、生長培地と混和して使用し（この場合、“濁り”外観を呈する）、そして透明度は、懸濁状態の可視性の初期程度に相対させて、すなわち、初期可視性の低下度として判定する。
【００３３】
本発明によって提供される他の好ましいスクリーニング法は、以下の点を除いて上記方法に相当する。すなわち、選択される固形の生長培地では、出発Ｃ−１３アシルオキシ含有タキサンを混和すると、溶解するため透明外観を呈し、一方、本発明の加水分解法のＣ−１３ヒドロキシル含有タキサン生成物を混和すると、溶解しないため（および必要に応じて好ましくは開裂Ｃ−１３側鎖も溶解しないため）、濁り外観を呈する。微生物の生長が起る領域付近での濁りゾーンの観察は適当な微生物の選定を可能ならしめる。
【００３４】
本発明のスクリーニング法の特に好ましい具体例は、後記実施例に記載する。
かかる好ましいスクリーニング法は、出発Ｃ−１３アシルオキシ含有タキサンとＣ−１３ヒドロキシル含有タキサン生成物において、本発明による加水分解が起こったか否かを観察しうる限界まで、その相対的溶解性が異なる場合に好適に使用することができる。
Ｃ−１３加水分解で用いる微生物の具体例としては、ノカルジオイデス(Ｎocardioides) 属に属する微生物が挙げられる。好ましい微生物は、ノカルジオイデス・アルブス(albus)、ノカルジオイデス・フラブス(flavus)、ノカルジオイデス・フルブス(fluvus)、ノカルジオイデス・ルテウス(luteus)、ノカルジオイデス・シンプレックス(simplex)およびノカルジオイデス・サーモリラシナス(thermolilacinus)、特にノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２４(ＳＣ１３９１０)およびＡＴＣＣ５５４２５(ＳＣ１３９１１)、およびノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６(ＳＣ１３９１２)である。
【００３５】
上述の如く、生物学的に純粋な微生物のノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２４（ＳＣ１３９１０）、ノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ１３９１１）およびノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ１３９１２）は、さらに本発明によって提供される新規な微生物である。また本発明によれば、これら微生物のミュータントも、本明細書記載の加水分解法での使用、たとえば化学的手段、物理的手段（たとえばＸ線）または生物学的手段（たとえば分子生物学法による）による変性したものの使用が意図されていることを理解すべきである。
本発明方法で用いる酵素の具体例は、加水分解酵素である。好ましい酵素としては、微生物、特に上述の微生物から誘導されるものが包含される。これらの酵素は、たとえば後記実施例に記載されるような抽出および精製法により単離、特にこれらの微生物が培養されている培地において、たとえばアニオン交換カラム、次いで疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびゲル濾過の使用による、細胞外に見られる活性画分の精製により単離することができる。本発明はさらに、当該加水分解法を行うことができ、かつたとえば上述の方法によって、ノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２４（ＳＣ１３９１０）およびＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ１３９１１）、およびノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ１３９１２）から単離しうる酵素を提供するものである。
【００３６】
Ｃ−１０およびＣ−１３変性における酵素および微生物の使用
微生物を用いる場合、細胞は、元のままの湿潤細胞あるいは凍結乾燥、噴霧乾燥もしくは加熱乾燥細胞などの乾燥細胞の状態で、または破壊細胞もしくは細胞抽出物などの処理細胞物質の形状で使用されてよい。また遺伝学的設計微生物の使用も意図されている。宿主細胞はいずれの細胞であってもよく、たとえば上述の触媒作用を行うことができる１種以上の酵素を発現する１または複数の遺伝子を含有するよう変性された、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が挙げられる。
１種以上の微生物を用いる場合、本発明の酵素加水分解法またはエステル化法は、微生物の発酵の後に（発酵および加水分解またはエステル化の２段階で）またはそれと同時に行ってよく、すなわち、後者の場合、発酵と加水分解またはエステル化をその場で（発酵と加水分解またはエステル化を１段階で）行うことができる。
【００３７】
微生物の生長は、適当な培地の使用により通常の技術によって達成しうる。生長する微生物の適当な培地としては、微生物細胞の生長に必要な栄養素を付与するものが含まれる。生長用培地はたとえば、必要な炭素源、窒素源、および要素（たとえば痕跡量）を包含する。また誘導物質を加えてもよい。本明細書で用いる語句「誘導物質」としては、微生物細胞内で所望の酵素活性の形成を増大する化合物が含まれる。
【００３８】
炭素源としては、シュガー類、たとえばマルトース、ラクトース、グルコース、フラクトーズ、グリセロール、ソルビトール、スクロース、スターチ、マンニトール、プロピレングリコール等；有機酸類、たとえば酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等；およびアルコール類、たとえばエタノール、プロパノール等が包含される。
窒素源としては、Ｎ−ＺアミンＡ、コーン浸漬リカー、大豆ミール、ビーフエキス、酵母エキス、糖蜜、ベーカー酵母、トリプトン、ヌトリゾイ（ｎｕｔｒｉｓｏｙ）、ペプトン、イースタミン（ｙｅａｓｔａｍｉｎ）、アミノ酸類（たとえばグルタミン酸ナトリウム等）、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等が包含される。
痕跡要素としては、マグネシウム、マンガン、カルシウム、コバルト、ニッケル、鉄、ナトリウムおよびカリウム塩が包含される。またホスフェート類を痕跡量または好ましくはそれ以上の量で添加してもよい。
【００３９】
使用する培地に、１種以上の炭素もしくは窒素源または他の栄養素を含ませてよい。
生長用の好ましい培地としては、水性培地、特に後記実施例に記載のものが包含される。
反応混合物の撹拌およびエアレーションは、加水分解またはエステル化工程を、たとえば微生物の生長段階でのフラスコ振盪培養または発酵タンクで行うとき、その工程中の有効な酸素の量に影響を及ぼす。撹拌の回転数は１００〜２５０ＲＰＭが好ましく、また１分当り１〜１０容量部の空気／培地１容量のエアレーションが好ましい。
【００４０】
微生物の生長および／または本発明に係る加水分解またはエステル化の場合、培地のｐＨは約６〜８．５が好ましく、また温度は約２４〜３７℃が好ましい。加水分解またはエステル化はたとえば、１〜４８時間といった期間にわたりインビトロで行うか、あるいは好ましくは所望生成物の収量が最大になるまで行うことができる。本発明の加水分解法は、６〜８のｐＨで、特に非塩基性条件下で行うことが好ましい。
また加水分解反応培地として水性液体の使用が好ましいが、有機液体、または相溶性もしくは非相溶（二相）有機液体／水性液体混合物も使用しうる。エステル化の場合、有機溶媒または二相有機／水性反応培地の使用が好ましいが、他の培地を使用してもよい。
【００４１】
Ｃ−１０変性の場合、出発物質（Ｃ−１０ヒドロキシまたはアシルオキシ含有タキサン）とエステル化または加水分解反応培地の合計重量に対し、０．０２５〜２．５重量％の出発物質を用いることが好ましい。本発明のエステル化法において、アシル化剤とＣ−１０ヒドロキシル含有タキサンの好ましいモル比は、約１：１〜１０００：１である。出発物質に対して使用する酵素もしくは微生物の量は、本発明の酵素加水分解またはエステル化の触媒作用を可能ならしめるように選定する。本発明の加水分解法またはエステル化法を採用するとき、それぞれ９０％（出発アシルオキシ含有タキサンに対して得られるＣ−１０加水分解生成物の％）以上の収率、または５０％（出発ヒドロキシル含有タキサンに対して得られるＣ−１０アシル化生成物の％）以上の収率を得ることが好ましい。加水分解またはエステル化は、出発タキサンのＣ−１０で選択的に行うことができる。すなわち、その大部分が（たとえば単独で）Ｃ−１０のみ加水分解またはエステル化されている生成物を、他の位置での加水分解またはエステル化を伴なわずに得ることができる。
【００４２】
Ｃ−１３変性の場合、出発物質（Ｃ−１３アシルオキシ含有タキサン）と加水分解反応培地の合計重量に対し、０．０２５〜０．２５重量％の出発物質を用いることが好ましい。出発物質に対して使用する酵素もしくは微生物の量は、本発明の酵素加水分解の触媒作用を可能ならしめるように選定する。本発明の加水分解法を採用するとき、９０％（出発アシルオキシタキサンに対して得られるＣ−１３加水分解生成物の％）以上の収率を得ることが好ましい。すなわち、その大部分が（たとえば単独で）Ｃ−１３のみ加水分解されている生成物を、他の位置での加水分解を伴なわずに得ることができる。
【００４３】
分離
本発明方法のＣ−１０アシルオキシまたはヒドロキシル含有生成物、および以下に記載の如きカップリング反応生成物（ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）は、たとえば抽出、蒸留、結晶化、およびカラムクロマトグラフィーなどの方法によって、単離および精製することができる。
同様に、本発明のＣ−１３加水分解法のＣ−１３ヒドロキシル含有生成物、および以下に記載の如きカップリング反応生成物も、たとえば抽出、蒸留、結晶化、およびカラムクロマトグラフィーなどの方法によって、単離および精製することができる。
【００４４】
実用性
タキサンは、上述のタキサン成分を含有するジテルペン化合物である。特に興味のあるタキサンは、１１，１２−位がエチレン性結合を介して結合し、かつ１３−位が側鎖を有するタキサン成分を含有するタキサンであって、かかるタキサンはタキソルで例示される。薬理学的活性なタキサン、たとえばタキソルは、乳癌、卵巣癌、結腸癌または肺癌などの癌、黒色腫および白血病に苦しむ患者を治療する抗腫瘍剤として使用しうる。
【００４５】
Ｃ−１０変性によって得られる化合物
本発明のＣ−１０加水分解法またはエステル化法によって得られる化合物は特に、Ｃ−１０に所望の置換基を有する化合物の製造を可能ならしめることにより、上述の薬理学的活性タキサンの製造の中間体として有用である。従って、たとえば、本発明方法に従いＣ−１０変性によって製造される化合物がまたＣ−１３にヒドロキシル基を有する場合、該化合物をＣ−１３アシルオキシ側鎖形成中間体化合物、たとえばβ−ラクタムとカップリング反応させて、タキソルまたはその類縁体などのＣ−１３アシルオキシ側鎖含有タキサンを得ることができる。この点について、Ｃ−１０の変性のための本発明方法を採用する前に、あるいはその途中に、あるいはその後に、本発明方法に係るＣ−１３の変性を行うことができる。
【００４６】
本発明方法に従って製造されるアシルオキシまたはヒドロキシル含有化合物は、必要に応じて、Ｃ−１３アシルオキシ側鎖カップリング反応に使用する前に変性してもよい。たとえば、Ｃ−１３以外の位置の１個以上のヒドロキシル基を、カップリング反応の前に保護し、後に脱保護することができる。
本発明の加水分解法およびエステル化法によって得られ、上記の如く任意に変性したＣ−１０アシルオキシおよびヒドロキシル含有タキサンは、たとえば、列挙したものなどのＣ−１３アシルオキシ側鎖含有タキサンの製造に使用されてよく、またヨーロッパ特許公開Ｎｏ．４００９７１、Ｕ．Ｓ．特許Ｎ４８７６３９９、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．４８５７６５３、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．４８１４４７０、Ｕ．Ｓ．特Ｎｏ．４９２４０１２、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．４９２４０１１、およびキングストンの「Ｐｈａｒｍ． Ｔｈｅｒ．」、（Ｖｏｌ．５２、１〜３４頁、１９９１年）、特にポスらのＵ．Ｓ．特許出願Ｎｏ．０７／９９５４４３（１９９２年１２月２３日出願）（代理人ドケットＮｏ．ＬＤ６０）およびソッタシル（Ｔｈｏｔｔａｔｈｉｌ）らのＵ．Ｓ．特許出願Ｎｏ．０８／０３３５９８（１９９３年３月１９日出願）（代理人ドケットＮｏ．ＬＤ５７）に記載の方法で製造しうる。
【００４７】
Ｃ−１３変性によって得られる化合物
本発明の加水分解法によって得られるＣ−１３ヒドロキシル含有化合物は特に、上記Ｃ−１３側鎖含有タキサンの製造の中間体として有用である。特に、当該方法に従って製造されるＣ−１３ヒドロキシル含有化合物は、側鎖形成中間体化合物、たとえばβ−ラクタムとカップリング反応させて、Ｃ−１３側鎖含有タキサンを得ることができる。かかる側鎖の付加は本質的に、タキサン生成物に対し増大もしくはより望ましい薬理学的活性を付与し、あるいは出発化合物に比べて、増大もしくはより望ましい薬理学的活性を有するタキサンへより容易に変換されるタキサン生成物を形成しうる。
【００４８】
本発明方法に従って製造されるＣ−１３ヒドロキシル含有化合物は任意に、カップリング反応による側鎖形成での使用前に変性することができる。たとえば、本発明方法に係るＣ−１０の変性は、本発明のＣ−１３加水分解法の前、その途中または後に行うことができ、および／またはＣ−１３以外の位置の１個以上のヒドロキシル基をカップリング反応の前に保護し、後に脱保護してもよい。
本発明の加水分解法によって得られ、上記の如く任意に変性したＣ−１３ヒドロキシル含有タキサンは、たとえば、列挙したものなどのＣ−１３アシルオキシ側鎖含有タキサンの製造に使用されてよく、またヨーロッパ特許公開Ｎｏ．４００９７１、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．４８７６３９９、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．４８５７６５３、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．４８１４４７０、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．４９２４０１２、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．４９２４０１１、およびキングストンの「Ｐｈａｒｍ． Ｔｈｅｒ．」（Ｖｏｌ．５２、１〜３４頁、１９９１年）、特にポスらのＵ．Ｓ．特許出願Ｎｏ．０７／９９５４４３（１９９２年１２月２３日出願）（代理ドケットＮｏ．ＬＤ６０）およびソッタシルらのＵ．Ｓ．特許出願Ｎｏ．０８／０３３５９８（１９９３年３月１９日出願）（代理人ドケットＮｏ．ＬＤ５７）に記載の方法で製造しうる。式ＶＩのＣ−１３アシルオキシ含有タキサンの製造が好ましい。
【００４９】
Ｃ−１０変性用の好ましい化合物
本発明のＣ−１０加水分解法において、式ＩＩのタキサンまたはその塩を用いることが好ましく、これにより、酵素加水分解は、式Ｉの対応化合物またはその塩を付与する。本発明のＣ−１０エステル化法において、同様に、式Ｉのタキサンまたはその塩を用いることが好ましく、これにより、酵素エステル化は式ＩＩの対応化合物またはその塩を付与する。
【００５０】
式ＩおよびＩＩにおいて、Ｒ７はＲ１１−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（特にＲ１１はメチルなどのアルキル）が好ましく；Ｒ２はヒドロキシまたはキシロシルが好ましく；Ｒ３はメチルなどのアルキルが好ましく；Ｒ４はフェニルなどのアリールが好ましく；およびＲ１はヒドロキシルまたは下記式ＩＩＩの基が好ましい。
【化１５】
Ｒ１０は水素またはヒドロキシル保護基である）
式ＩおよびＩＩのタキサンの具体例としては、セファロマニン、１０−脱アセチルタキソル、７−キシロシルタキソル、タキソル−Ｃ、７−キシロシル−１０−脱アセチルタキソル、タキソル、バッカチンＩＩＩ、１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩ、７−キシロシルバッカチンＩＩＩ、および７−キシロシル−１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩである。１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩの形成（たとえば酢酸の形成を伴う）のため、たとえば加水分解酵素を用いるバッカチンＩＩＩの酵素加水分解は、本発明の好ましい具体例である。この反応は、本発明の酵素エステル化法によって逆にすることができる。
最終的に、本明細書記載の方法でタキソルを製造することが好ましい。
【００５１】
Ｃ−１３変性用の好まし化合物
本発明方法において、式ＶＩのタキサンまたはその塩を用いることが好ましく、これにより、Ｃ−１３の酵素加水分解は、式Ｖの対応化合物またはその塩を付与する。式ＶおよびＶＩにおいて、Ｒ１２はアセチルオキシなどのＲ６−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−またはヒドロキシルが好ましく；Ｒ２はヒドロキシルまたはキシロシルが好ましく；Ｒ３はメチルなどのアルキルが好ましく；Ｒ４はフェニルなどのアリールが好ましく；およびＲ７は下記式ＩＩＩの基が好ましい。
【化１６】
式ＶＩの出発タキサンの具体例は、セファロマニン、１０−脱アセチルタキソル、７−キシロシルタキソル、タキソル−Ｃ、および７−キシロシル−１０−脱アセチルタキソルの１種もしくは混合物またはタキソルである。好ましい加水分解生成物は、バッカチンＩＩＩ、１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩ、７−キシロシルバッカチンＩＩＩ、および７−キシロシル−１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩである。
【００５２】
加水分解後のカップリング反応は、式ＩＩＩのＣ−１３アシルオキシ基を有する上記式ＶＩのタキサン生成物を付与することが好ましい。本明細書記載の加水分解およびカップリング反応によって、最終的にタキソルを製造することが好ましい。
本発明方法のいずれにおいても、反応体または生成物の水和物などの塩または溶媒化合物を使用したりあるいは適宜に製造することができる。
【００５３】
【実施例】
次に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、これらの実施例は単に例示であって、本発明の技術的範囲を制限するものでは決してない。
【００５４】
実施例１
バッカチンＩＩＩの１０−脱アセチル化：−
土壌から単離したノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ １３９１２）を、１０ｍｌ培地を含有する５０ｍｌ三角フラスコで、２８℃、１５０ｒｐｍにて３日間生長させる。培地は蒸留水１Ｌ当り最終ｐＨ６．８±０．２で、バクト（Ｂａｃｔｏ）・トリプトン１０ｇ、バクト・酵母エキス５ｇ、トリブチリン６ｍｌ、および０．０６ｍｌのツィーン（Ｔｗｅｅｎ）８０を含有する。細胞を遠心分離で採取し、１０ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７）で洗い、２ｍｌの同緩衝剤に再懸濁する。かかる細胞懸濁液に、２０μｌのメタノール中の０．５ｍｇのバッカチンＩＩＩを加え、懸濁液を周囲温度（約２３℃）にて、フィッシャー・ロト−ラック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｒｏｔｏ−Ｒａｃｋ）で２０時間混合する。懸濁液を塩化メチレンで抽出し、抽出物を蒸発し、再溶解し、以下に記載のＨＰＬＣ方法２で検定する。サンプルは、０．２５７ｍｇ／ｍｌの１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩおよびほんの痕跡量のバッカチンＩＩＩを含有する（変換率１００％）。また、他の３つの培地で生長した菌株ＡＴＣＣ５５４２６の洗った細胞も、この形質変換を行った。
【００５５】
実施例２
バッカチンＩＩＩの脱アセチル化：−
蒸留水１Ｌ当り最終ｐＨ６．８±０．２で、１０ｇのバクト・トリプトン、５ｇのバクト・酵母エキスおよび０．０６ｍｌのツィーン８０を含有する２０ｍｌ培地で生長したノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ １３９１２）を用い、これを４Ｌ三角フラスコ内の１Ｌの同培地に接種する。フラスコを２８℃で３日間振とうし、次いで遠心分離で細胞を採取する。細胞ペレットを６００ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７）で洗い、再び遠心分離して、３６．６ｇの湿潤細胞を得る。細胞を−７２℃で冷凍し、２日で２．５ｇに凍結乾燥し、乳鉢と乳棒で粉砕し、２℃で貯蔵する。１．９８ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７）、５０ｍｇの乾燥細胞および０．５ｍｇのバッカチンＩＩＩを２０μｌのメタノール中、ロト−ラックを用い周囲温度にて下記表１に示す時間（分）で混合する。反応は２Ｌのメタノールを加えて停止する。沈澱物をマイクロフュージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）で除去し、サンプルを以下に記載のＨＰＬＣ方法１で検定する。得られる結果を表１に示す。
【表１】
１０−脱アセチル
時間 バッカチンＩＩＩ バッカチンＩＩＩ 変換率
（ 分 ） （ ｍｇ／ｍｌ） （ ｍｇ／ｍｌ） （ ％ ）
０ ０．００７ ０．２５２ −
３０ ０．０５１ ０．１４３ ２２
６０ ０．１０６ ０．１０６ ４６
１２０ ０．２０４ ０．０３４ ８８
【００５６】
実施例３
タキソルの１０−脱アセチル化：−
ノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ １３９１２）の部分的精製抽出物［ウオットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）ＤＥ５２にてアニオン交換クロマトグラフィーにより精製）は、３４ミリユニット／酵素（ｍｌ）を含有する。（なお、１ミリユニットは、０．２５ｍｇ／ｍｌのバッカチンＩＩＩおよび１％のメタノールを含有する５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７）中、２８℃にて１分当り、１ｎモルのバッカチンＩＩＩを１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩに加水分解できる酵素の量である。）５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７）、０．５ｍｇのタキソル、１％のメタノールおよび３４ミリユニットの酵素を含有する２ｍｌを、フィッシャー・ロト−ラックにて２８℃で３．５時間培養する。塩化メチレン４ｍｌによる抽出で、反応を停止する。抽出物を乾燥し、メタノールに再溶解し、以下に記載のＨＰＬＣ方法３で検定する。サンプルは０．０７５ｍｇのタキソルおよび０．１８６ｍｇ／ｍｌの１０−脱アセチルタキソルを含有する（変換率７８％）。
【００５７】
ノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ１３９１２）の他の精製：−
１％のトリプトンおよび０．５％の酵母エキスを含有する培地にて、発酵器内でノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６を生長させる。全ての精製ステップは、５０ｍＭリン酸塩緩衝剤（ｐＨ７．２）中、４℃で行う。細胞を緩衝剤中１０％Ｗ／Ｖで懸濁し、溶解（ｌｙｓｉｓ）のため１００００ｐｓｉで、ミクロ−流動化装置へ２回通す。次いで細胞溶解産物を、２４０００×ｇで１５分間遠心分離して透明にする。硫酸アンモニウムを６０％飽和まで加え、生成する沈澱物を、１Ｍ硫酸アンモニウムを含有する緩衝剤に懸濁し、疎水性相互作用クロマトグラフィー［ＨＩＣ−エーテル（トーヤ（Ｔｏｙａ）−パール）］カラム（５．５×２．６ｃｍ）に、流速２ｍｌ／分で適用する。酵素活性を緩衝剤で溶離する。次いで活性画分を、ファーマシア・セファクリル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−２００ゲル濾過カラム（２．６×８４ｃｍ）に０．５ｍｌ／分で装填する。カラムからの活性画分を、アニオン交換（ＢｉｏＲａｄ−Ｑ２）カラム（２ｍｌカラム、流速２ｍｌ／分）に装填し、活性を０〜０．８Ｍ−ＮａＣｌ／４２ｍｌの塩勾配で溶離する。活性画分をプールし、上述のセファクリルＳ−２００カラムに適用する。ドデシル硫酸ナトリウム含有のゲルにおける、酵素の分子量は４００００±１００００と推定される。上記方法の各種ステップで得られる結果は、以下の通りである。
【００５８】
実施例４
１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩのバッカチンＩＩＩへのアセチル化：−
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７．２）中のノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ １３９１２）（１０％Ｗ／Ｖ）を、ミクロ流動化装置で破壊し、１０−デアセチラーゼ酵素を抽出物から、３時間の撹拌によりウオットマンＤＥＡＥセルロースＤＥ５２アニオン交換体に吸着せしめる（１０ｇ抽出蛋白質／ＤＥ５２（ｌ））。ＤＥ５２を濾取し、緩衝剤で洗い、凍結乾燥して０．０９１ミリユニット酵素／固体（ｍｇ）を得る。０．２ｍｌの１Ｍリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ８）、１００ｍｇの固定酵素（すなわち、ＤＥ５２レジンに固定）、１．８ｍｌの水、２ｍｇの１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩおよび０．５ｍｌの酢酸ビニルを、室温にて磁気棒で１４．５時間激しく撹拌する。反応混合物を塩化メチレンで抽出する。抽出物を乾燥し、メタノールに再溶解して、以下に記載のＨＰＬＣ方法１で分析する。サンプルは０．６８８ｍｇ／ｍｌの１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩおよび０．２０３ｍｇ／ｍｌのバッカチンＩＩＩを含有する（変換率１９％）。
【００５９】
ＨＰＬＣ方法
方法１
カラム：ヒュレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ）ハイパージル５ミクロンＯＤＳ Ｃ１８、２００×４．６ｍｍ
移動相：５５％メタノール、４５％水
流速：１ｍｌ／分
カラム温度：周囲
検出波長：２３０ｎｍ
方法２
カラム：フェース・セパレーションズ・インコーポレイテッド（コネチカット州ノルウオーク）のミクロボア・スフェリソーブ・フェニル（ｍｉｃｒｏｂｏｒｅ ｓｏｐｈｅｒｉｓｏｒｂ ｐｈｅｎｙｌ）１５０×２．０ｍｍ、３ミクロン
移動相：溶剤Ａ：１５ｍＭ−ＫＨ２ＰＯ４（トリフルオロ酢酸でｐＨ４に調整）、溶剤Ｂ：アセトニトリル
時間 （ 分 ） 溶剤Ａ （ ％ ） 溶剤Ｂ （ ％ ）
０ ７５ ２５
２０ ５５ ４５
２３ ４０ ６０
２４ ２５ ７５
２８ ７５ ２５
カラム温度：３５℃
検出波長：２３０ｎｍ
方法３＊
カラム：Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄハイパージル５ミクロンＯＤＳ Ｃ１８、２００×４．６ｍｍ
移動相：６０％メタノール、４０％水
流速：１ｍｌ／分
カラム温度：周囲
検出波長：２３５ｎｍ
注＊）モンサラットらの「Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ」（１８、８９５−９０１頁、１９９０年）も参照。
【００６０】
実施例５
実生エキスの加水分解：−
タキサス属ヒックジイ実生のエタノール抽出物を、ナノフィルターで１０〜１５倍に濃縮する。０．５ｍｌの抽出物、０．５ｍｌの１Ｍリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７）、ノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ １３９１１）からの５４ミリユニットの部分精製酵素（アニオン交換クロマトグラフィーおよび硫酸アンモニウム沈澱で精製）および水４ｍｌを、フィッシャー・ロト−ラックにて２８℃で４８時間培養する。（なお、ＡＴＣＣ５５４２５からの酵素は、本明細書記載のＣ−１３の加水分解に使用しうる。）第２チューブは同じ混合物を含有し、またノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ １３９１２）からの１４ミリユニット酵素が実施例４に記載の如く５００ｍｇのＤＥ５２に固定されている。２８℃にて２３時間の培養後、ＤＥ５２におけるＡＴＣＣ５５４２６からの第２部分の１４ミリユニット酵素を、４ｍｌの水と共に加え、培養を２２時間続ける。対照サンプルは酵素を受容せず。サンプルを塩化メチレンで抽出し、蒸発した抽出物をメタノールに溶解して、上記ＨＰＬＣ方法２で分析する。得られる結果を、下記表２に示す。
【００６１】
表２の結果から、ＳＣ １３９１１からのＣ−１３デアシラーゼによる処理後、タキソル、セファロマニン、７−キシロシル−１０−脱アセチルタキソルおよび１０−脱アセチルタキソルが枯渇し、一方、バッカチンＩＩＩおよび１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩの量の増大が認められる。（１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩ＋バッカチンＩＩＩ）と初期タキソルのモル比は、１１７％から４３６％増大した。実生エキスを、ＳＣ １３９１１からのＣ−１３デアシラーゼとＳＣ １３９１２からのＣ−１０デアシラーゼの両方で処理すると、バッカチンＩＩＩは１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩに変換し、１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩの濃度は、初期値に比べて６倍増大した。このように、タキサン混合物をＣ−１３デアシラーゼおよびＣ−１０デアシラーゼで処理すると、原理生成物（ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔ）として１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩが得られる。
【００６２】
【表２】
実施例６
タキソルのＣ−１３側鎖を除去しうる微生物の菌株の選択：−
蒸留水１５０ｍｌ中の（Ｄｉｆｃｏ）スピリット・ブル−寒天培地（５．２５ｇ）を、製造業者の指示に従い、殺菌し、部分的に冷却する。培地は１ｌ当り、１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母エキス、２０ｇの寒天、および０．１５ｇスピリット・ブルーを含有する。かかる培地に殺菌フィルターを介して、メタノール１ｍｌ中のタキソル２５ｍｇおよびツィーン８０（１０μｌ）を加える。１００ｍｍ×１５ｍｍのペトリ皿に、１５ｍｌ培地を用いる。
平板（ｐｌａｔｅ）を冷却および乾燥した後、土壌サンプルを以下の如くプレートアウトする。２ｇの土壌を４０ｍｌの水に懸濁する。懸濁液のサンプルを水で１００倍に希釈し、平板１つ当り０．１ｍｌを散布する。使用する水は、０．２２μフィルターで濾過した。平板を２８℃で培養し、透明なゾーンで囲まれたコロニーを選択する。選択の基準は、タキソルが培地における使用濃度で溶解せず、平板に濁り外観を付与し、これに対し、バッカチンＩＩＩおよび加水分解で生成する側鎖は溶解することにより、コロニーの周囲に透明ゾーンを形成することである。選択した微生物は、ノカルジオイデス・アルブス菌株ＡＴＣＣ５５４２４（ＳＣ １３９１０）およびＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ １３９１１）、およびノカルジオイデス・ルテウス菌株ＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ １３９１２）である。
【００６４】
実施例７
タキソルからＣ−１３側鎖の除去：−
本例の反応は、後記反応工程Ｉに従って進行する。１０ｍｌ培地含有の５０ｍｌ三角フラスコに、実施例６に記載の如く土壌から単離したノカルジオイデス・アルブス菌株ＡＴＣＣ５５４２４（ＳＣ １３９１０）またはＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ１３９１１）を接種し、２８℃、１５０ＲＰＭで２日間振とうする。培地は蒸留水１ｌ当り、ｐＨ６．８±０．２で、１０ｇのバクト・トリプトン、５ｇのバクト・酵母エキスおよび０．０６ｍｌのツイーン８０を含有する。遠心分離で細胞を除去し、上層液のｐＨを１Ｍ−ＫＨ２ＰＯ４で８．６６から７へ調整する。
【００６５】
各上層液２ｍｌにタキソル０．５ｍｇ／メタノール２０μｌを加え、混合物を周囲温度（約２３℃）で２１時間撹拌する。溶液を４ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。抽出物をＮ２下室温にて乾燥し、メタノールに再溶解し、ＨＰＬＣ（上記方法３）で分析する。菌株ＡＴＣＣ５５４２４（ＳＣ １３９１０）からの上層液は、０．００８ｍｇ／ｍｌのタキソルおよび０．１６３ｍｇ／ｍｌのバッカチンＩＩＩを付与する（変換率９４．９モル％）。菌株ＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ１３９１１）からの上層液は、０．０１４ｍｇ／ｍｌのタキソルおよび０．１６６ｍｇ／ｍｌのバッカチンＩＩＩを付与する（変換率９６．７モル％）。（なお、バッカチンＩＩＩおよび開裂した側鎖生成物は、ＬＣ−ＭＳで同定した。）
反応工程１
【化１７】
実施例８
セファロマニンからＣ−１３側鎖の除去：−
それぞれ１０ｍｌの培地（コーン浸漬リカー３５ｇ、セレロース２０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４５ｇ、ＣａＣＯ３３．５ｇ、および大豆油５ｍｌ、蒸留水で１ｌに調整）を含有する２つの５０ｍｌ三角フラスコにそれぞれ、０．５ｍｌのノカルジオイデス・アルブス菌株ＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ １３９１１）を接種する。２８℃、１５０ＲＰＭでの２日培養後、これら２つの培養物を、実施例７で用いた１ｌの培地を含有する４ｌフラスコに加える。２８℃、２００ＲＰＭで７２時間後、遠心分離で細胞を除去し、上層液を１Ｍ−ＫＨ２ＰＯ４でｐＨ８．１６からｐＨ７に調整する。
セファロマニン０．５ｍｇ／メタノール２０μｌを、転倒型振盪器（フィッシャー・ロト−ラック）にて、上層液２ｍｌと共に１７時間培養する。溶液を塩化メチレンで抽出し、抽出物を蒸発し、メタノールに再懸濁し、ＨＰＬＣ（上記方法２）で分析する。セファロマニン濃度は、０．１７５ｍｇ／ｍｌから０に減少し、０．１１０ｍｇ／ｍｌのバッカチンＩＩＩが生成した（分析した初期セファロマニン濃度に対して８９モル％収率）。
【００６７】
実施例９
７−キシロシルタキソルからＣ−１３側鎖の除去：−
実施例８において、１ｌ培地を３日の代わりに２日間培養する以外は、同様にして、ノカルジオイデス・アルブス菌株ＡＴＣＣ５５４２４（ＳＣ １３９１０）およびＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ １３９１１）からの酵素を製造する。ノカルジオイデス・ルテウス菌株ＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ １３９１２）を実施例８のノカルジオイデス・アルブス菌株ＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ １３９１１）の場合と同様に生長させる。３日後、遠心分離で細胞を採取し、６００ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７）で洗い、再び遠心分離する。３６．６ｇの湿潤細胞を−７２℃で冷凍し、２日で２．５２ｇに凍結乾燥し、乳鉢と乳棒で粉砕し、２℃で貯蔵する。
菌株ＡＴＣＣ５５４２４（ＳＣ １３９１０）およびＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ １３９１１）からの１．８ｍｌ上層液と、菌株ＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ １３９１２）からの５０ｍｇ乾燥細胞をそれぞれ１．８ｍｌ水中で、フィッシャー・ロト−ラックにて、室温で０．５ｍｇの７−キシロシルタキソル／０．２ｍｌのメタノールと共に４２時間培養する。反応液を塩化メチレンで抽出し、乾燥した抽出物をメタノールに溶解し、ＨＰＬＣ（上記方法３）で分析する。各酵素の場合、７−キシロシルタキソルは０．２１８ｍｇ／ｍｌから０に減少した。各サンプルの主要生成物は、ＨＰＬＣ−マススペクトロメトリーにより同定したところ、７−キシロシルバッカチンＩＩＩであった。バッカチンＩＩＩ標準に対して、ＡＴＣＣ５５４２４（ＳＣ １３９１０）、ＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ １３９１１）、およびＡＴＣＣ５５４２６（ＳＣ １３９１２）はそれそれ、０．１１２、０．１１８、および０．１２０ｍｇ／ｍｌの７−キシロシルバッカチンＩＩＩ生成物濃度を付与した。バッカチンＩＩＩおよび７−キシロシルバッカチンＩＩＩに対し２３５ｎｍで同じ吸光係数を用いると、計算収率は８８％、９３％、および９４％（それぞれモル％）となる。
【００６８】
実施例１０
植物細胞混合物の加水分解：−
１ｇのタキサス属ヒックジイ針状葉を、メタノール／酢酸（５０００：１）１０ｍｌで抽出する。１０ｍｌ抽出物に、水／酢酸（５００：１）１０ｍｌを加える。混合物を４８０００×ｇ、２０℃で１０分間遠心分離する。ペレットを捨てる。４ｍｌ抽出物とノカルジオイデス・アルブス菌株ＡＴＣＣ５５４２４（ＳＣ１３９１０）またはＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ１３９１１）からの１６ｍｌ上層液（実施例９の記載に準じ製造）を、２８℃、１５０ＲＰＭにて５０ｍｌ三角フラスコ内で、４２時間振とうする。サンプルを塩化メチレンで抽出し、蒸発した抽出物をメタノールに溶解し、ＨＰＬＣ（上記方法２）で分析する。酵素処理および該処理せずの場合の、タキサン濃度および（バッカチンＩＩＩ＋１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩ）／初期タキソルのモル比を、下記表３に示す。
【表３】
実施例１１
酵素の精製およびタキサンの加水分解：−
５００ｍｌ三角フラスコ内の１００ｍｌの培地（コーン浸漬リカー３５ｇ、セレロース２０ｇ、硫酸アンモニウム５ｇ、炭酸カルシウム３．５ｇ、および大豆油５ｍｌ、蒸留水で１ｌに調整）に、同培地中のノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ １３９１１）１ｍｌを接種し、２８℃で２日間振とうする。この培養物２０ｍｌを、４ｌ三角フラスコ内のトリプトン１０ｇおよび酵母エキス５ｇ含有の蒸留水１ｌ（ｐＨ６．８±０．２）へ移す。フラスコを２８℃で３日間振とうし、遠心分離で細胞を除去し、上層液を１Ｍ−ＫＨ２ＰＯ４でｐＨ７．８９からｐＨ７に調整する。
【００７０】
全ての精製ステップは４℃で行う。上層液を、５ｃｍ直径カラム内の１５０ｍｌウオットマンＤＥ５２アニオン交換体／２５ｍＭリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７）に適用する。カラムを１５０ｍｌ緩衝剤、次いで０．２５Ｍ−ＮａＣｌ含有の４５０ｍｌ緩衝剤で洗う。酵素活性を緩衝剤＋０．４５Ｍ−ＮａＣｌで溶離する。流速は５ｍｌ／分である。ＤＥ５２カラムからの最も活性な画分に、硫酸アンモニウム（１００ｍｇ／ｍｌ）を加え、溶液を、２．６ｃｍ直径カラム内の１００ｍｇ／ｍｌ硫酸アンモニウム含有の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７）中、３０ｍｌファーマシア・フェニル・セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ−４Ｂ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）に流速１．６ｍｌ／分で適用する。カラムを１５０ｍｌ緩衝剤＋２０ｍｇ／ｍｌ硫酸アンモニウムで洗い、次いで活性を緩衝剤のみで溶離する。フェニル・セファロースカラムからの最も活性な画分を、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）ＹＭ１０膜を用いる限外濾過で４ｍｌまで濃縮し、次いでファーマシア・セファクリル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−２００ゲル濾過カラム（２．６×８４ｃｍ）へ流速０．６５ｍｌ／分で通す。比活性の最も高い画分は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲルにおいて分子量４９０００±１００００のシングルバンドを有した。精製について下記表４に要約する。（なお、１ミリユニット（ｍｕ）の酵素は、０．２５ｍｇ／ｍｌタキソルおよび１％メタノール含有の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤中、２８℃にて１ｎモル／分のタキソルのバッカチンＩＩＩへの変換を触媒する。）
【００７１】
【表４】
【００７２】
２．０ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７）に、０．５ｍｇタキサン基質および１％メタノールを含有するサンプル（サンプル１，２，３，４および５）を調製する。また、２．０ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７）に、０．５ｍｇタキサン基質および１％メタノールに加えて、上記フェニル・セファロースＣＬ−４Ｂステップで精製した酵素の１０ｍｕ酵素を含有するサンプル（サンプル１ｅ，２ｅ，３ｅ，４ｅおよび５ｅ）も調製する。全てのサンプルは、フィッシャー・ロト−ラックを用い２８℃にて１６時間混合する。サンプル１，１ｅ，２，２ｅ，５および５ｅは、４ｍｌの塩化メチレンで抽出する。２ｍｌの抽出物を乾燥し、１ｍｌのメタノールに再溶解し、ＨＰＬＣ方法３で分析する。サンプル３，３ｅ，４および４ｅは、２ｍｌのメタノールで希釈し、ＨＰＬＣ方法３で分析する（これら後者のサンプルのみ、Ｃ−１３側鎖を測定した）。
【００７３】
表５に、培養後に各サンプルに残留するタキサン基質の量（ｍｇ／ｍｌ）、並びに培養の終りに存在する生成物タキサンの量（ｍｇ／ｍｌ）を表記する。表５から明らかなように（サンプル１ｅ，２ｅ，３ｅ，４ｅおよび５ｅ参照）、上述の如く精製した酵素は、列挙したタキサン基質の加水分解によって、Ｃ−１３側鎖の除去に有効であることが認められる。
【表５】
実施例１２
実生エキスの加水分解：−
タキサス属ヒックジイ実生のエタノール抽出物を、ナノフィルターで１０〜１５倍に濃縮する。０．５ｍｌの抽出物、０．５ｍｌの１Ｍリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７）、ノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２５（ＳＣ１３９１１）からの５４ミリユニットの部分精製酵素（上記実施例１１参照）および水４ｍｌを、フィッシャー・ロト−ラックにて２８℃で４８時間混合する。対照サンプルは酵素を受容せず。サンプルを塩化メチレンで抽出し、蒸発した抽出物をメタノールに溶解し、ＨＰＬＣ方法２で分析する。得られる結果を下記表６に示す。
【表６】
Claims (39)
- Ｃ−１０に直接結合したヒドロキシル基を含有する少なくとも１種のタキサンの製造法であって、Ｃ−１０に直接結合したアシルオキシ基を含有する少なくとも１種のタキサンを、上記アシルオキシ基のヒドロキシル基への加水分解を触媒しうる、ノカルジオイデス属に属する微生物もしくは該微生物から誘導される酵素と接触させて加水分解を行う行程から成ることを特徴とする製造法。
- 式Ｉ：
Ｒ２は水素、ヒドロキシル、フルオロ、Ｒ５−Ｏ−、キシロシル、Ｒ６−Ｃ(Ｏ)−Ｏ−またはＲ６−Ｏ−Ｃ(Ｏ)−Ｏ−；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリールまたはヘテロシクロ；
Ｒ５はヒドロキシル保護基；および
Ｒ６は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリールまたはヘテロシクロである)
の少なくとも１種のＣ−１０ヒドロキシル含有タキサン(Ｉ)またはその塩の製造法であって、式II：
の少なくとも１種のＣ−１０アシルオキシ含有タキサン(II)またはその塩を、上記Ｒ７アシルオキシ基のヒドロキシル基への加水分解を触媒しうる酵素もしくは微生物と接触させることによる請求項１に記載の製造法。 - 式IIのタキサンがバッカチンIIIで、式Ｉのタキサンが１０−脱アセチルバッカチンIIIである請求項２に記載の製造法。
- 加水分解法に用いる出発物質のアシルオキシ含有タキサンが、アシルオキシ含有タキサンの混合物である請求項１に記載の製造法。
- タキサン混合物が、植物組織の植物細胞培養および／または抽出によって得られ、かつ植物がタキサス属の１種である請求項４に記載の製造法。
- 微生物が、ノカルジオイデス・アルブス(albus)およびノカルジオイデス・ルテウス(luteus)からなる群から選ばれる請求項１に記載の製造法。
- 微生物が、ノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６(ＳＣ１３９１２)である請求項６に記載の製造法。
- 酵素が、ノカルジオイデス・アルブスおよびノカルジオイデス・ルテウスからなる群から選ばれる微生物から誘導される請求項１に記載の製造法。
- 酵素が、ノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６(ＳＣ１３９１２)である微生物から誘導される請求項８に記載の製造法。
- 得られるタキサン生成物を、Ｃ−１３にアシルオキシ基含有のタキサンの製造に用いる請求項１に記載の製造法。
- Ｃ−１０に直接結合したアシルオキシ基を含有する少なくとも１種のタキサンの製造法であって、Ｃ−１０に直接結合したヒドロキシル基を含有する少なくとも１種のタキサンを、アシル化剤および上記ヒドロキシル基のアシルオキシ基へのエステル化を触媒しうる、ノカルジオイデス属に属する微生物もしくは該微生物から誘導される酵素と接触させてエステル化を行う行程から成ることを特徴とする製造法。
- 式II：
Ｒ２は水素、ヒドロキシル、フルオロ、Ｒ５−Ｏ−、キシロシル、Ｒ６−Ｃ(Ｏ)−Ｏ−またはＲ６−Ｏ−Ｃ(Ｏ)−Ｏ−；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリールまたはヘテロシクロ；
Ｒ５はヒドロキシル保護基；
Ｒ６は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリールまたはヘテロシクロ；および
Ｒ７はアシルオキシである)
の少なくとも１種のＣ−１０アシルオキシ含有タキサン(II)またはその塩の製造法であって、式Ｉ：
の少なくとも１種のＣ−１０ヒドロキシル含有タキサン(Ｉ)またはその塩を、アシル化剤およびＣ−１０ヒドロキシル基のエステル化を触媒しうる酵素もしくは微生物と接触させて、上記Ｒ７アシルオキシ基を形成することによる請求項１１に記載の製造法。 - 式IIのタキサンがバッカチンIIIで、式Ｉのタキサンが１０−脱アセチルバッカチンIIIである請求項１２に記載の製造法。
- エステル化法に用いる出発物質のヒドロキシル含有タキサンが、ヒドロキシル含有タキサンの混合物である請求項１１に記載の製造法。
- タキサン混合物が、植物組織の植物細胞培養および／または抽出によって得られ、かつ植物がタキサス属の１種である請求項１４に記載の製造法。
- 微生物が、ノカルジオイデス・アルブスおよびノカルジオイデス・ルテウスからなる群から選ばれる請求項１１に記載の製造法。
- 微生物が、ノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６(ＳＣ１３９１２)である請求項１６に記載の製造法。
- 酵素が、ノカルジオイデス・アルブスおよびノカルジオイデス・ルテウスからなる群から選ばれる微生物から誘導される請求項１１に記載の製造法。
- 酵素が、ノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６(ＳＣ１３９１２)である微生物から誘導される請求項１８に記載の製造法。
- アシル化剤が、式IV：
Ｒ１１−Ｃ(Ｏ)−Ｌ (IV)
(式中、Ｒ１１はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはヘテロシクロ；および
Ｌは置換されてエステル基を形成しうる脱離可能基である)
の化合物(IV)である請求項１１に記載の製造法。 - アシル化剤が酢酸ビニルである請求項２０に記載の製造法。
- 得られるタキサン生成物を、Ｃ−１３にアシルオキシ基含有のタキサンの製造に用いる請求項１１に記載の製造法。
- Ｃ−１３に直接結合したヒドロキシル基を含有する少なくとも１種のタキサンの製造法であって、Ｃ−１３に直接結合したアシルオキシ基を含有する少なくとも１種のタキサンを、上記アシルオキシ基のヒドロキシル基への加水分解を触媒しうる、ノカルジオイデス属に属する微生物もしくは該微生物から誘導される酵素と接触させて加水分解を行う行程から成ることを特徴とする製造法。
- 式Ｖ：
Ｒ２は水素、ヒドロキシル、フルオロ、Ｒ５−Ｏ−、キシロシル、Ｒ６−Ｃ(Ｏ)−Ｏ−またはＲ６−Ｏ−Ｃ(Ｏ)−Ｏ−；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリールまたはヘテロシクロ；
Ｒ５はヒドロキシル保護基；および
Ｒ６は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリールまたはヘテロシクロである)
の少なくとも１種のＣ−１３ヒドロキシル含有タキサン(Ｖ)またはその塩の製造法であって、式VI：
の少なくとも１種のＣ−１３アシルオキシ含有タキサン(VI)またはその塩を、上記酵素もしくは微生物と接触させることによる請求項２３に記載の製造法。 - 式VIのタキサンが、セファロマニン、７−キシロシル−１０−脱アセチルタキソル、１０−脱アセチルタキソル、７−キシロシルタキソル、タキソル−Ｃ、および／またはタキソル、および式Ｖのタキサンが、バッカチンIII、１０−脱アセチルバッカチンIII、７−キシロシル−１０−脱アセチルバッカチンIII、および／または７−キシロシルバッカチンIIIである請求項２４に記載の製造法。
- 加水分解法に用いる出発物質のアシルオキシ含有タキサンが、Ｃ−１３に異なる側鎖を有するアシルオキシ含有タキサンの混合物である請求項２４に記載の製造法。
- タキサン混合物が、植物組織の植物細胞培養および／または抽出によって得られ、かつ植物がタキサス属の１種である請求項２６に記載の製造法。
- 微生物が、ノカルジオイデス・アルブスおよびノカルジオイデス・ルテウスからなる群から選ばれる請求項２３に記載の製造法。
- 微生物が、ノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２４(ＳＣ１３９１０)およびノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２５(ＳＣ１３９１１) からなる群から選ばれる請求項２８に記載の製造法。
- 酵素が、加水分解酵素である請求項２３に記載の製造法。
- 酵素が、ノカルジオイデス・アルブスおよびノカルジオイデス・ルテウスからなる群から選ばれる微生物から誘導される請求項２３に記載の製造法。
- 酵素が、ノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２４(ＳＣ１３９１０)およびノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２５(ＳＣ１３９１１) から選ばれる微生物から誘導される請求項３１に記載の製造法。
- 加水分解を行った後、Ｃ−１３以外の位置のヒドロキシル基が任意に保護された、Ｃ−１３に直接結合したヒドロキシル基を含有する少なくとも１種のタキサンを、Ｃ−１３にアシルオキシ側鎖を形成する化合物とカップリング反応させる請求項２３に記載の製造法。
- 加水分解およびカップリング反応からなる方法によって、最終的にタキソルを製造する請求項３３に記載の製造法。
- Ｃ−１３に直接結合したアシルオキシ基を含有するタキサンと接触させたときに、上記アシルオキシ基を加水分解してＣ−１３に直接結合するヒドロキシル基を形成しうる、ノカルジオイデス属に属する微生物を選択する方法であって、
(ａ) 固形の生長培地として、(i) スクリーニングされる微生物が生長し、(ii) 出発Ｃ−１３アシルオキシ含有タキサンを混和すると、溶解しないため濁り外観を呈し、および (iii) 所定のＣ−１３ヒドロキシル含有タキサン生成物および必要に応じて所定の開裂Ｃ−１３側鎖生成物を混和すると、溶解するため透明外観を呈する生長培地を選択し、
(ｂ) 上記行程(ａ)で選択した生長培地に予め出発Ｃ−１３アシルオキシ含有タキサンを混和しておき、かつ微生物の生長を発生せしめる条件下で、該生長培地に上記微生物を入れて接触せしめ、次いで
(ｃ) 上記微生物による加水分解が可能であることを示す透明ゾーンが、微生物の生長が起こる領域付近で出現するかどうかを観察する
工程から成ることを特徴とする微生物の選択法。 - Ｃ−１３に直接結合したアシルオキシ基を含有するタキサンと接触させたときに、上記アシルオキシ基を加水分解してＣ−１３に直接結合するヒドロキシル基を形成しうる、ノカルジオイデス属に属する微生物を選択する方法であって、
(ａ) 固形の生長培地として、(i) スクリーニングされる微生物が生長し、(ii) 出発Ｃ−１３アシルオキシ含有タキサンを混和すると、溶解するため透明外観を呈し、および (iii) 所定のＣ−１３ヒドロキシル含有タキサン生成物および必要に応じて所定の開裂Ｃ−１３側鎖生成物を混和すると、溶解しないため濁り外観を呈する生長培地を選択し、
(ｂ) 上記行程(ａ)で選択した生長培地に予め出発Ｃ−１３アシルオキシ含有タキサンを混和しておき、かつ微生物の生長を発生せしめる条件下で、該生長培地に上記微生物を入れて接触せしめ、次いで
(ｃ) 上記微生物による加水分解が可能であることを示す濁りゾーンが、微生物の生長が起こる領域付近で出現するかどうかを観察する
工程から成ることを特徴とする微生物の選択法。 - 生物学的に純粋な微生物ノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２４。
- 生物学的に純粋な微生物ノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２５。
- 生物学的に純粋な微生物ノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６。
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