PT629701E - Aco inoxidavel austenitico de elevada resistencia a corrosao por meios cloretados e sulfuricos e suas utilizacoes - Google Patents

Description

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Descrição “Métodos de hidrólise enzimátíca para a preparação de taxanos portadores de grupos hidroxilo em C-10 e C-13, método de esterificação enzimátíca para a preparação de taxanos portadores de grupos aciloxi em C-10 e sua utilização para a preparação de taxanos portadores de grupos aciloxi em C-13” A presente invenção refere-se a um método de hidrólise enzimátíca para a preparação de taxanos portadores de grupos hidroxilo em C-10 e a um método de esterificação enzimátíca para a preparação de taxanos portadores de grupos aciloxi em C-10, podendo estes compostos ser utilizados, por exemplo, como intermediários para a preparação de taxanos farmacologicamente activos, tais como o taxol e os análogos de taxol. A presente invenção também diz respeito a um método de hidrólise enzimática para a preparação de taxanos portadores de grupos hidroxilo em C-13 úteis como intermediários para a preparação de taxanos portadores de grupos aciloxi em C-13, sendo também particularmente úteis para a preparação de taxol e análogos de taxol.

Os taxanos são compostos diterpénicos utilizáveis no campo farmacêutico. Por exemplo, descobriu-se que o taxol, o qual é um taxano que satisfaz à fórmula estrutural:

2 em que o símbolo Ph representa um grupo fenilo, o símbolo Ac representa um grupo acetilo e o símbolo Bz representa um grupo benzoílo, é um agente anticancerígeno eficaz.

Os taxanos que ocorrem naturalmente, tal como o taxol, podem ser encontrados em materiais vegetais, sendo isolados a partir deles. No entanto, tais taxanos podem estar presentes nos materiais vegetais em quantidades relativamente pequenas, de modo que é necessário, tal como sucede no caso do taxol, por exemplo, um grande número de teixos, de crescimento lento, para se ter uma fonte do composto. Prosseguiu-se por isso a pesquisa sobre vias de síntese, incluindo as semi-sintéticas, para a preparação de taxanos que ocorrem naturalmente, tal como o taxol, e bem assim para a preparação dos seus análogos.

Devido à complexidade da estrutura anelar do taxano, prepara-se mais facilmente um taxano que contenha os substituintes desejados no sistema anelar recorrendo à utilização de um material de partida que já possua a estrutura anelar básica do taxano. Assim, por exemplo, é possível acoplar um composto que possua a estrutura anelar do taxano, que contenha um grupo hidroxilo em C-13 e particularmente que contenha também um substituinte desejado em C-10, com um composto intermediário para formar um taxano que possua a cadeia lateral desejada em C-13, tal como um taxano farmacologicamente activo que possua uma cadeia lateral aciloxi em C-13, exemplificado pelo taxol ou seus análogos. A presente invenção proporciona métodos para a obtenção de taxanos com os substituintes desejados em C-10. Em particular, a presente invenção proporciona métodos para a preparação de compostos taxano portadores de grupos hidroxilo em C-10 e também portadores de grupos aciloxi em C-10, sendo estes compostos úteis como materiais de partida para a preparação de taxanos tais como o taxol e os seus análogos.

De acordo com uma das suas variantes, a presente invenção proporciona um método para preparar pelo menos um taxano que contenha um grupo hidroxilo ligado directamente em C-10, o qual consiste em fazer contactar pelo menos um taxano, que contenha um grupo aciloxi ligado directamente em C-10, com uma enzima ou com um microrganismo, capaz de catalisar a hidrólise do referido grupo aciloxi para gerar um grupo hidroxilo, e em efectuar depois a referida hidrólise.

De acordo com outra das suas variantes, a presente invenção proporciona um método para preparar pelo menos um taxano que contenha um grupo aciloxi ligado directamente em C-10, o qual consiste em fazer contactar pelo menos um taxano, que contenha um grupo hidroxilo ligado directamente em C-10, com um agente de acilação e uma enzima ou um microrganismo, capaz de catalisar a esterificação do referido grupo hidroxilo para gerar um grupo aciloxi, e em efectuar depois a referida esterificação. A presente invenção também proporciona um método para a preparação de compostos taxano portadores de grupos hidroxilo em C-13, sendo estes compostos úteis como materiais de partida para a preparação de taxanos que possuam uma cadeia lateral desejada em C-13.

Em particular, a presente invenção proporciona um método para preparar pelo menos um taxano que contenha um grupo hidroxilo ligado directamente em C-13, o qual consiste em fazer contactar pelo menos um taxano, que contenha um grupo aciloxi ligado directamente em C-13, com uma enzima ou com um microrganismo, capaz de catalisar a hidrólise do referido grupo aciloxi para gerar um grupo hidroxilo, e em efectuar depois a referida hidrólise. A presente invenção proporciona métodos eficazes para a preparação de taxanos portadores de grupos hidroxilo em C-10 a partir de taxanos portadores de grupos aciloxi em C-10 e para a preparação de taxanos portadores de grupos aciloxi em C-10 a partir de taxanos portadores de grupos hidroxilo em C-10. É possível efectuar a hidrólise de um único taxano ou então efectuar a hidrólise sequencial ou simultânea de uma mistura de diferentes taxanos, em 4 conformidade com a presente invenção; de igual modo, é possível efectuar a esterificação de um único taxano ou então efectuar a esterificação sequencial ou simultânea de uma mistura de diferentes taxanos, em conformidade com a presente invenção. A presente invenção também proporciona métodos eficazes para a preparação de taxanos portadores de grupos hidroxilo em C-13 a partir de taxanos portadores de grupos aciloxi em C-13. É possível efectuar a hidrólise de um único taxano ou então efectuar a hidrólise sequencial ou simultânea de uma mistura de diferentes taxanos, em conformidade com a presente invenção. A presente invenção é descrita mais minuciosamente conforme se segue.

Hidrólise em C-10

De acordo com uma variante preferencial, a presente invenção proporciona um método para preparar pelo menos um taxano portador de um grupo hidroxilo em C-10 e que satisfaz à fórmula estrutural I seguinte:

em que o símbolo R1 representa um grupo hidroxilo ou aciloxi, em especial no caso de o subs-tituinte Rl possuir a estrutura da fórmula ΠΙ adiante descrita; o símbolo R2 representa um átomo de hidrogénio ou de flúor ou um grupo hidroxilo ou xilosilo ou um grupo de uma das fórmulas gerais R6-C(0)-0 ou R6-0-C(0)-0-; 5 cada um dos símbolos R3 e R4 representa independentemente um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo, alcenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalcenilo, arilo ou um heterociclo; o símbolo R5 representa um grupo de protecção do radical hidroxilo; e o símbolo R6 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo, alcenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalcenilo, arilo ou um heterociclo, ou um dos seus sais, o qual consiste em fazer reagir pelo menos um taxano portador de um grupo aciloxi em C-10 e que satisfaz à fórmula estrutural Π seguinte:

em que os símbolos R1, R2, R3 e R4 possuem as significações definidas antes; e o símbolo R7 representa um grupo aciloxi, ou os seus sais, com uma enzima ou um microrganismo capaz de catalisar a hidrólise do referido grupo aciloxi R7 para gerar um grupo hidroxilo, e efectuar depois a referida hidrólise.

Todas as configurações espaciais dos centros quirais não especificados dos compostos de fórmulas estruturais I e II estão contempladas no método de hidrólise da presente invenção, quer por si sós (isto é, praticamente isentas de outros estereoisómeros) quer em mistura com outras formas estereoisoméricas. 6

De acordo com uma outra variante preferida, a presente invenção proporciona um método para preparar pelo menos um primeiro taxano, que possui um grupo aciloxi desejado em C-10, a partir pelo menos de um segundo taxano, que possui um grupo aciloxi indesejado em C-10, por hidrólise enzimática deste último para proporcionar pelo menos um análogo que contenha um grupo hidroxilo em C-10 pelo método aqui descrito, seguindo-se o acoplamento do grupo acilo desejado para se obter o primeiro taxano. De acordo com esta variante, a presente invenção proporciona, por exemplo, um método para a preparação de um taxano desejado, que possua um determinado grupo aciloxi em C-10, a partir de uma mistura de partida, constituída por taxanos que contenham diferentes grupos aciloxi em C-10, podendo essa mistura de partida compreender ou não o taxano desejado, por hidrólise simultânea ou sequencial de grupos diferentes em C-10 para se obter um ou vários taxanos que possuam um grupo hidroxilo em C-10, seguindo-se o acoplamento do grupo acilo desejado. Este método preferencial é particularmente útil no caso de se obter uma mistura de taxanos com grupos aciloxi diferentes em C-10, tal como sucede na extracção de materiais vegetais que proporcionam taxol misturado com outros taxanos produzidos naturalmente, e no caso de se desejar fundamentalmente um determinado taxano, tal como o taxol. O acoplamento do grupo acilo pode ser realizado por métodos não enzimáticos para a formação de grupos acilo. Por exemplo, o composto 10-desacetilbacatina ΙΠ protegido em C-7 (v.g. protegido em C-7 por um grupo tri-etilsililo, preparado fazendo contactar 10-desacetilbacatina III com cloreto de trietilsililo e imidazol em dimetilformamida) pode ser acilado em C-10 por contacto com hexametil-dissilazida de lítio em tetra-hidrofurano com cloreto de lítio/cloreto de acetilo a temperaturas baixas, v.g. entre -60°C e 70°C. Em alternativa, é possível realizar o acoplamento do grupo acilo pelo método de esterificação enzimática aqui descrito. 7

De acordo com o método da presente invenção, a configuração espacial do grupo aciloxi em C-10 do taxano de partida é preferencialmente mantida no produto que contém um grupo hidroxilo em C-10.

Esterifícacão em C-10

De acordo com outra variante preferida, a presente invenção proporciona um método para preparar pelo menos um taxano portador de um grupo aciloxi em C-10 e que satisfaz à fórmula estrutural Π seguinte:

em que o símbolo R1 representa um grupo hidroxilo ou aciloxi, em especial no caso de o subs-tituinte R1 possuir a estrutura da fórmula ΙΠ adiante descrita; o símbolo R2 representa um átomo de hidrogénio ou de flúor ou um grupo hidroxilo ou xilosilo ou um grupo de uma das fórmulas gerais R5-0-, R6-C(0)-0 ou R6-0-C(0)-0-; cada um dos símbolos R3 e R4 representa independentemente um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo, alcenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalcenilo, arilo ou um heterociclo; o símbolo R3 representa um grupo de protecção do radical hidroxilo; o símbolo R6 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo, alcenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalcenilo, arilo ou um heterociclo, e o símbolo R7 representa um grupo aciloxi, 8 ou um dos seus sais, o qual consiste em fazer contactar pelo menos um taxano portador de um grupo hidroxilo em C-10 e que satisfaz à fórmula estrutural I seguinte:

em que os símbolos R1, R2, R3 e R4 possuem as significações definidas antes, ou os seus sais, com um agente de acilação e uma enzima ou um microrganismo capaz de catalisar a esterificação do grupo hidroxilo em C-10 para formar o referido grupo aciloxi R7, e efectuar depois a referida esterificação.

Todas as configurações espaciais dos centros quirais não especificados dos compostos de fórmulas estruturais I e Π estão contempladas no método de esterificação da presente invenção, quer por si sós (isto é, praticamente isentos de outros estereoisómeros) quer misturadas com outras formas estereoisoméricas.

Pode ser utilizado qualquer agente de acilação que efectue a esterificação de acordo com a presente invenção. Como agentes de acilação preferidos refere-se os que satisfazem à fórmula geral IV seguinte:

Rn-C(0)-L (IV) em que 9 o símbolo R11 representa um grupo alquilo, alcenilo, alquinilo, arilo, cicloalquilo, ci-cloalcenilo ou um heterociclo, e o símbolo L representa um grupo removível que pode ser deslocado para formar um grnpo éster.

Os substituintes Rl 1 preferíveis para os compostos de fórmula geral IV são os grupos alquilo, tais como os grupos alquilo(Ci-C6) e em especial o grnpo metilo. Como exemplos de substituintes L refere-se os átomos de halogénio e os grupos hidroxilo, alcoxi ou alceniloxi. Os substituintes L preferidos são os grupos alceniloxi e mais preferencialmente os grupos alceniloxi(Ci-C6), tais como CH2=CH-0- e CH2=C(CH3)-0-. O acetato de isopropenilo e o acetato de vinilo são agentes de acilação partícularmente preferidos.

De acordo com o método da presente invenção, a configuração espacial do grupo hidroxilo em C-10 do taxano de partida é preferencialmente mantida no produto que contém um grupo aciloxi em C-10.

Hidrólise em C-13

De acordo com uma variante preferencial, a presente invenção proporciona um método para preparar pelo menos um taxano portador de um grupo hidroxilo em C-13 e que satisfaz à fórmula estrutural V seguinte:

'f ίο em que o símbolo R12 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo hidroxilo ou um grupo de uma das fórmulas gerais R3-0-, R6-C(0)-0 ou R6-0-C(0)-0-; o símbolo R2 representa um átomo de hidrogénio ou de flúor ou um grupo hidroxilo ou xilosilo ou um grupo de uma das fórmulas gerais R3-0-, R6-C(0)-0 ou R6-0-C(0)-0-; cada um dos símbolos R3 e R4 representa independentemente um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo, alcenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalcenilo, arilo ou um heterociclo; o símbolo R5 representa um grupo de protecção do radical hidroxilo; e o símbolo R6 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo, alcenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalcenilo, arilo ou um heterociclo, ou um dos seus sais, o qual consiste em fazer reagir pelo menos um taxano portador de um grupo aciloxi em C-13 e que satisfaça à fórmula estrutural VI seguinte:

em que os símbolos R12, R2, R3 e R4 possuem as significações definidas antes; e o símbolo R representa um grupo acilòxi, ou os seus sais, com uma enzima ou um microrganismo capaz de catalisar a hidrólise do referido grupo aciloxi R7 para gerar um grupo hidroxilo, 11 e efectuar depois a referida hidrólise.

Todas as configurações espaciais dos centros quirais não especificados dos compostos de fórmulas estruturais V e IV estão contempladas no método de hidrólise da presente invenção, quer por si sós (isto é, praticamente isentas de outros estereoisómeros) quer misturadas com outras formas estereoisoméricas.

De acordo com uma outra variante preferida, a presente invenção proporciona um método para preparar pelo menos um primeiro taxano, que possui uma cadeia lateral aciloxi desejada em C-13, a partir pelo menos de um segundo taxano, que possui uma cadeia lateral aciloxi indesejada em C-13, por hidrólise enzimática deste último para proporcionar pelo menos um análogo que contenha um grupo hidroxilo em C-13 pelo método aqui descrito, seguindo-se o acoplamento da cadeia lateral desejada para se obter o primeiro taxano. De acordo com esta variante, a presente invenção proporciona, por exemplo, um método para a preparação de um taxano desejado, que possua uma determinada cadeia lateral aciloxi em C-13, a partir de uma mistura de partida, constituída por taxanos que contenham diferentes cadeias laterais aciloxi em C-13, podendo essa mistura de partida compreender ou não o taxano desejado, por hidrólise simultânea ou sequencial de grupos diferentes em C-13 para se obter um ou vários taxanos que possuam um grupo hidroxilo em C-13, seguindo-se o acoplamento da cadeia lateral desejada. Este método preferencial é particularmente útil no caso de se obter uma mistura de taxanos com cadeias laterais aciloxi diferentes em C-13, tal como sucede na extracção de materiais vegetais que proporcionam taxol misturado com cefalomanina e outros taxanos produzidos naturalmente, e no caso de se desejar fundamentalmente um determinado taxano, tal como o taxol. 12

De acordo com o método da presente invenção, a configuração espacial do grupo aciloxi em C-13 do taxano de partida é preferencialmente mantida no produto que contém um grupo hidroxilo em C-13.

Definições

Tal como aqui utilizadas, as expressões “processo enzimático” ou “método enzimático” designam um processo ou um método de acordo com a presente invenção, segundo o qual se utiliza uma enzima ou um microrganismo. O termo “hidrólise”, tal como aqui utilizado, designa a formação de um grupo hidroxilo a partir de um grupo aciloxi e essa formação pode ser conseguida, por exemplo, por contacto com água e/ou com um álcool orgânico adequado, em conformidade com o método da presente invenção. O termo “esterificação”, tal como aqui utilizado, designa a formação de um grupo aciloxi a partir de um grupo hidroxilo. Tal como aqui utilizada, a expressão “agente de acilação” designa um composto capaz de efectuar a esterificação referida antes, proporcionando um grupo acilo. A utilização de “uma enzima ou um microrganismo” nos métodos da presente invenção inclui a utilização de um só, dois ou vários microrganismos ou enzimas.

Tal como aqui utilizados, os termos “alquilo” ou “alq”, por si sós ou como parte integrante de outro grupo, designam grupos hidrocarbonados saturados, de cadeia linear ou ramificada, facultativamente substituídos, de preferência com 1 a 12 átomos de carbono na cadeia normal. Como exemplos de grupos insubstituídos deste tipo refere-se os seleccionados entre metílo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, pentilo, hexilo, iso-hexilo, heptilo, 4,4-dimetilpentilo, octilo, 2,2,4-trimetilpentilo, nonilo, decilo, undecilo, dodecilo e semelhantes. Como exemplos de substituintes é possível referir um ou vários dos seleccionados entre átomos de halogénio ou grupos alcoxi, alquiltio, alcenilo, alquinilo, arilo, cicloalquilo, 13 cicloalcenilo, hidroxi ou hidroxi protegido, carboxilo (-COOH), alquiloxicarbonilo, alquil-carboniloxi, carbamoílo (NH2-CO-), amino (-NH2), mono- ou di-alquilamino ou tiol (-SH).

Tal como aqui utilizadas, as expressões “alq inferior” ou “alquilo inferior”, por si sós ou como parte integrante de outro grupo, designam grupos tais como os definidos antes a propósito do termo alquilo, facultativamente substituídos e que possuam entre 1 e 4 átomos de carbono na cadeia normal.

Tal como aqui utilizados, os termos “alcoxi” ou “alquiltio”, por si sós ou como parte integrante de outro grupo, designam um grupo alquilo, tal como definido antes, ligado através de uma ponte oxigénio (-0-) ou de uma ponte enxofre (-S-), respectivamente. Tal como aqui utilizado, o termo “alquiloxicarbonilo”, por si só ou como parte integrante de outro grupo, designa um grupo alquilo ligado através de um grupo carbonilo o qual é, por sua vez, ligado através de uma ponte oxigénio. Tal como aqui utilizados, os termos “monoalquilamino” ou “dialquilamino”, por si sós ou como partes integrantes de outros grupos, designam um grupo amino substituído respectivamente com um ou dois grupos alquilo, conforme definido antes.

Tal como aqui utilizado, o termo “alcenilo”, por si só ou como parte integrante de outro grupo, designa grupos tais como os definidos antes a propósito do termo alquilo, facultativamente substituídos e contendo ainda pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono. Como exemplos de substituintes refere-se um ou vários dos grupos alquilo descritos antes e/ou um ou vários dos grupos descritos antes como substituintes para o grupo alquilo. Tal como aqui utilizado, o termo “alceniloxi”, por si só ou como parte integrante de outro grupo, designa um grupo alcenilo, conforme descrito antes, ligado através de uma ponte oxigénio (-0-).

Tal como aqui utilizado, o termo “alquinilo”, por si só ou como parte integrante de outro grupo, designa grupos tais como os definidos antes a propóstio do termo alquilo, fa- 14 cultativamente substituídos e contendo ainda pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono. Como exemplos de substituintes refere-se um ou vários dos grupos alquilo descritos antes e/ou um ou vários dos grupos descritos antes como substituintes para o grupo alquilo. Tal como aqui utilizado, o termo “alquiniloxi”, por si só ou como parte integrante de outro grupo, designa um grupo alquinilo, conforme descrito antes, ligado através de uma ponte oxigénio (-0-).

Tal como aqui utilizado, o termo “cicloalquilo”, por si só ou como parte integrante de outro grupo, designa sistemas anelares carbocíclicos saturados, facultativamente substituídos, e que contenham de preferência entre 1 e 3 anéis e entre 3 e 7 átomos de carbono por anel. Como exemplos de grupos insubstituídos deste tipo refere-se os seleccionados entre ciclo-propilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo, ciclo-heptilo, ciclooctilo, ciclodecilo, ciclodo-decilo e adamantilo. Como exemplos de substituintes refere-se um ou vários dos grupos alquilo descritos antes e/ou um ou vários dos grupos descritos antes como substituintes para o grupo alquilo. Tal como aqui utilizado, o termo “cicloalquiloxi”, por si só ou como parte integrante de outro grupo, designa um grupo cicloalquilo, conforme descrito antes, ligado através de uma ponte oxigénio (-O-).

Tal como aqui utilizado, o termo “cicloalcenilo”, por si só ou como parte integrante de outro grupo, designa grupos tais como ps definidos antes a propósito do termo cicloalquilo, facultativamente substituídos, e contendo ainda pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono que forme um anel parcialmente insaturado. Como exemplos de substituintes refere-se um ou vários dos grupos alquilo descritos antes e/ou um ou vários dos grupos descritos antes como lsubstituintes para o grupo alquilo. Tal como aqui utilizado, o termo “cicloalceniloxi”, por si só ou como parte integrante de outro grupo, designa um grupo cicloalcenilo, conforme descrito antes, ligado através de uma ponte oxigénio (-0-). 15

Tal como aqui utilizados, os termos “aT’ ou “arilo”, por si sós ou como partes integrantes de outros grupos, designam grupos aromáticos carbocíclicos, facultativamente substituídos, que contêm de preferência 1 ou 2 anéis e entre 6 e 12 átomos de carbono. Como exemplos de grupos insubstituídos deste tipo refere-se os seleccionados entre fenilo, bifenilo e naftilo. Como exemplos de substituintes refere-se um ou vários, de preferência três ou menos, dos grupos nitro, dos grupos alquilo, tal como descritos antes, e/ou dos grupos descritos antes como substituintes para o grupo alquilo. Tal como aqui utilizado, o termo “ariloxi”, por si só ou como parte integrante de outro grupo, designa um grupo arilo, conforme descrito antes, ligado através de uma ponte oxigénio (-0-).

Tal como aqui utilizados, os termos “heterociclo” ou “heterocíclico”, por si sós ou como partes integrantes de outros grupos, designam grupos cíclicos, aromáticos ou não aromáticos, facultativamente substituídos e totalmente saturados ou insaturados, que possuam pelo menos um heteroátomo pelo menos num anel, e de preferência grupos monocíclicos ou bicíclicos com 5 ou 6 átomos em cada anel. Por exemplo, o grupo heterociclo pode possuir 1 ou 2 átomos de oxigénio, 1 ou 2 átomos de enxofre e/ou entre 1 e 4 átomos de azoto no anel. Cada grupo heterociclo pode estar ligado através de qualquer átomo de carbono ou heteroátomo do sistema anelar. Como exemplos de grupos heterociclos refere-se os seleccionados entre tienilo, furilo, pirrolilo, piridilo, imidazolilo, pirrolidinilo, piperidinilo, azepinilo, indolilo, isoindolilo, quinolinilo, isoquinolinilo, benzotiazolilo, benzoxazolilo, benzimidazolilo, benzo-xadiazolilo e benzofurazanilo. Como exemplos de substituintes refere-Se um ou vários dos grupos alquilo descritos antes e/ou um ou vários dos grupos descritos antes como substituintes para o grupo alquilo. Tal como aqui utilizado, o termo “heterociclooxi”, por si só ou como parte integrante de outro grupo, designa um grupo heterocíclico, conforme descrito antes, ligado através de uma ponte oxigénio (-0-). 16

Tal como aqui utilizados, os termos “halogénio” ou “halo”, por si sós ou como partes integrantes de outros grupos, designam os átomos de cloro, bromo, flúor e iodo. O termo “taxano”, tal como aqui utilizado, designa os compostos que contêm um radical taxano, conforme adiante descritos. A expressão “radical taxano”, tal como aqui utilizada, designa os radicais que contêm a estrutura central (sendo apresentada seguidamente a numeração aqui utilizada das posições do sistema anelar):

etilénica no seu sistema anelar. São preferíveis os radicais que possuam um anel oxetano fundido nas posições 4 e 5, tal como se encontra no taxol.

Tal como aqui utilizada, a expressão “grupo de protecção do radical hidroxi (ou hidroxilo)” designa qualquer grupo capaz de proteger um radical hidroxilo livre, o qual, a seguir à reacção em que foi utilizado, pode ser removido sem perturbar a parte restante da molécula. Tais grupos, e a sua síntese, podem ser encontrados em “Protective Groups in Organic Synthesis” por T.W. Greene, John Wiley and Sons, 1981, ou Fieser & Fieser.

Tal como aqui utilizado, o termo “sal” compreende os sais acídicos e/ou básicos formados com bases e ácidos inorgânicos e/ou orgânicos.

Tal como aqui utilizado, o termo “acilo”, por si só ou como parte integrante de outro grupo, designa o radical formado removendo o grupo hidroxilo do grupo -COOH de um ácido carboxílico orgânico. Tal como aqui utilizado, o termo “aciloxi”, por si só ou como parte integrante de outro grupo, designa um grupo acilo, tal como descrito antes, ligado através de uma ponte oxigénio (-0-).

Materiais de partida para a modificação em C-10

Os taxanos portadores de grupos aciloxi em C-10 e também portadores de grupos hidroxi em C-10, utilizados como materiais de partida na presente invenção, podem ser quaisquer compostos susceptíveis de experimentarem respectivamente, hidrólise ou esterificação enzimática, de acordo com a presente invenção. Os materiais de partida podem ser taxanos preparados por via sintética ou, de preferência, taxanos formados naturalmente, tais como a cefalomanina, o 7-xilosiltaxol, o taxol, a bacatina III, a 10-desacetilbacatina ΙΠ ou o taxol C (um análogo de taxol em que o grupo benzoílo da cadeia lateral do taxol em C-13 é substituído por um grupo n-pentanoílo), por si sós ou misturados entre si. Os taxanos “formados naturalmente”, utilizados como materiais de partida, são obtidos preferencialmente por cultura de células vegetais e/ou por extracção a partir de tecidos de plantas produtoras de taxano, em particular tecidos de plantas ou derivados de plantas do género Taxus, tais como Taxus baccata, Taxus cuspidata, Taxus brevifolia, Taxus wallichiana, Taxus media, Taxus hicksii e em especial Taxus x. media hicksii. Como exemplos de tecidos vegetais refere-se as agulhas, as cascas do tronco e os rebentos inteiros.

Como referências literárias sobre os métodos preferidos para se obter os taxanos portadores de grupos hidroxi em C-10 e também portadores de grupos aciloxi em C-10, utilizáveis como materiais de partida nos métodos da presente invenção, veja-se Rao, Pharmaceutical Research, 10, 521-524 (1993); Kingston, Pharm. Ther., 52, 1-34 (1991); ou os exemplos aqui apresentados. 18

Materiais de partida para a modificação em C-13 Os taxanos portadores de grupos aciloxi em C-13, utilizados como materiais de partida na presente invenção, podem ser quaisquer compostos susceptíveis de experimentarem a hidrólise enzimática de acordo com a presente invenção. Os materiais de partida podem ser taxanos preparados por via sintética ou, de preferência, taxanos formados naturalmente, tais como a cefalomanina, o 7-xilosiltaxol, o taxol, o 7-xilosil-lO-desacetiltaxol, o 10-desacetiltaxol ou o taxol C, por si sós ou misturados entre si. Os taxanos “formados naturalmente”, utilizáveis como materiais de partida, são obtidos preferencialmente por cultura de células vegetais e/ou por extracção a partir de tecidos de plantas produtoras de taxano, em particular tecidos de plantas ou derivados de plantas do género Taxus, tais como Taxus baccata, Taxus cuspidata, Taxus brevifolia, Taxus wallichiana, Taxus media, Taxus hicksii e em especial Taxus x. media hicksii. Como exemplos de tecidos vegetais refere-se as agulhas, as cascas do tronco e os rebentos inteiros.

Como referências literárias sobre os métodos preferidos para se obter os taxanos portadores de grupos aciloxi em C-13, utilizáveis como materiais de partida nos métodos da presente invenção, veja-se Rao, Pharmaceutical Research, 10, 521-524 (1993); Kingston, Pharm. Ther., 52, 1-34 (1991); ou os exemplos aqui apresentados.

Enzimas e microrganismos para a modificação em C-10 A enzima ou o microrganismo utilizado na presente invenção pode ser qualquer enzima ou microrganismo capaz de catalisar os métodos de hidrólise ou esterificação enzimática aqui descritos. Os materiais enzimáticos ou microbianos, independentemente da sua origem ou pureza, podem ser utilizados no seu estado livre ou imobilizados sobre um suporte, por exemplo, por adsorção física ou por retinência. 19

Como exemplos de microrganismos refere-se os pertencentes aos géneros seguintes: Nocardioides, Nocardia, Rhodococcus, Micropolyspora, Saccharopotyspora, Pseudonocardia, Oerskovia, Promicromonospora e Intrasporangium. Como microrganismos particularmente preferidos refere-se os pertencentes às espécies dos géneros Nocardioides, tais como Nocardioides albus, Nocardioides flavus, Nocardioides fulvus, Nocardioides luteus, Nocardioides simplex e Nocardioides thermolilacinus, em especial Nocardioides albus ATCC 55424 (SC 13910) e ATCC 55425 (SC 13911) e Nocardioides luteus ATCC 55426 (SC 13912). Tal como aqui utilizado, o termo “ATCC” refere-se ao número de acesso da Colecção Americana de Culturas Tipo (o mesmo que “American Type Culture Collection”), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maiyland 20852, que é o depositário do microrganismo designado. Os microrganismos referidos antes com os n- ATCC 55424, 55425 e 55426 foram depositados a 12 de Maio de 1993. O termo “SC” é a designação atribuída ao microrganismo enquanto parte integrante da colecção Squibb de culturas (o mesmo que Squibb culture collection).

Os microrganismos biologicamente puros Nocardioides albus ATCC 55424 (SC 13910), Nocardioides albus ATCC 55425 (SC 13911) e Nocardioides luteus ATCC 55426 (SC 13912) são microrganismos novos. Faz-se observar que os mutantes destes organismos também são contemplados na presente invenção para utilização nos métodos de hidrólise ou esterificação aqui descritos, tais como os modificados por meios químicos, físicos (por exemplo, raios X) ou biológicos (por exemplo, por técnicas de biologia molecular).

Os microrganismos Nocardioides albus ATCC 55424 (SC 13910) e ATCC 55425 (SC 13911) podem ser criados em cultura em Meio A 94 (licor de infusão de milho (35 g), ‘Cerelose’ (20 g), (NH4)2S04 com qualidade de reagente (5 g), CaC03 (3,5 g), óleo de soja (5 mL) e água destilada (1 L)). Estes organismos foram isolados a partir do solo (a partir de uma amostra de New Brunswick, New Jersey) e são organismos Gram-positivos e sem motilidade, com crescimento aeróbio em diversos meios. Em meio LA (o mesmo que YS) sólido (0,2% de extracto de levedura, 1% de amido) o micélio tem uma coloração entre esbranquiçada e bege ténue. O crescimento está associado à produção de um pigmento escuro difusível, em meios tanto em fase líquida como em fase sólida. Em termos microscópicos, o crescimento em cultura em fase líquida é caracterizado por agregados miceliais constituídos por hifas com ramificações abundantes. O microrganismo Nocardioides luteus ATCC 55426 (SC 13912) pode ser criado em cultura em Meio A 94 (licor de infusão de milho (35 g), ‘Cerelose’ (20 g), (NH4)2S04 com qualidade de reagente (5 g), CaCC>3 (3,5 g), óleo de soja (5 mL) e água destilada (1 L)). Este organismo foi isolado a partir do solo (a partir de uma amostra de New Brunswick, New Jersey) e é um organismo Gram-positivo e sem motilidade, com crescimento aeróbio em diversos meios. Em meio LA sólido (0,2% de extracto de levedura, 1% de amido) o micélio tem uma coloração bege escuro. Em termos microscópicos, o crescimento em cultura em fase líquida é caracterizado por agregados miceliais constituídos por hifas com ramificações abundantes.

Os organismos referidos antes, Nocardioides albus ATCC 55424 (SC 13910) e ATCC 55425 (SC 13911) e Nocardioides luteus ATCC 55426 (SC 13912), foram identificados como estirpes respectivamente de Nocardioides albus e Nocardioides luteus, em conformidade com a descrição apresentada em Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Volume 2 (Ed. P.H.A. Sneath) (1986).

Como exemplos de enzimas utilizáveis nos métodos de hidrólise ou esterificação da presente invenção refere-se as hidrolases e em particular as esterases, as proteases ou as lipases. Como enzimas preferidas refere-se as que derivam de microrganismos, em particular dos microrganismos descritos antes. As enzimas podem ser isoladas por métodos de extracção e purificação, por exemplo, recorrendo à cromatografia por interacção hidrofóbica, filtração através de gel e subsequente passagem por uma coluna de permuta aniónica. A presente invenção proporciona ainda as enzimas capazes de intervirem nos métodos de hidrólise ou esterificação da presente invenção, as quais podem ser isoladas a partir de Nocardioides albus ATCC 55424 (SC 13910) e ATCC 55425 (SC 13911) e Nocardioides luteus ATCC 55426 (SC 13912), por exemplo, recorrendo às técnicas anteriormente descritas.

Enzimas e microrganismos para a modificação em C-13 A enzima ou o microrganismo utilizado na presente invenção pode ser qualquer enzima ou microrganismo capaz de catalisar a hidrólise enzimática aqui descrita. Os materiais enzimáticos ou microbianos, independentemente da sua origem ou pureza, podem ser utilizados no seu estado livre ou imobilizados sobre um suporte, por exemplo, por adsorção física ou por retinência.

Um dos métodos preferidos para escolher um microrganismo adequado para a hidrólise enzimática de um taxano de partida portador de um grupo aciloxi em C-13, de acordo com o método da presente invenção, consiste na utilização do novo método de pesquisa, adiante apresentado, compreendendo os passos seguintes: (a) seleccionar um meio de crescimento em fase sólida (i) no qual se desenvolva o microrganismo que se pretende pesquisar, (ii) no qual o taxano de partida, portador de um grupo aciloxi em C-13, seja insolúvel e por esse motivo, quando misturado com o meio de crescimento, este tenha um aspecto turvo, e (fii) no qual o taxano portador de um grupo hidroxilo em C-13, enquanto produto do método de hidrólise da presente invenção, seja solúvel e de 22 t preferência no qual a cadeia lateral clivada em C-13 também seja solúvel e por isso, quando misturado com o meio de crescimento, este tenha um aspecto límpido; (b) fazer contactar o microrganismo com o meio de crescimento seleccionado no passo (a) anterior, por exemplo, num prato de Petri, no qual se misturou o taxano de partida portador de um grupo aciloxi em C-13, em condições que permitam o crescimento do microrganismo; e (c) observar se surge uma zona límpida em tomo da área onde tem lugar o crescimento do organismo. A formação de uma zona límpida indica que ocorreu a hidrólise e logo indica que o microrganismo pode ser adequado para utilização no método de hidrólise da presente invenção. Tal como aqui utilizados, os termos “límpido” e “turvo” têm de ser interpretados em relação um ao outro. Sendo assim, o taxano de partida, portador de um grupo aciloxi em C-13, é utilizado em mistura com o meio de crescimento numa quantidade suficiente para que seja visível na suspensão (atribuindo-lhe uma coloração “turva”) e a limpidez é determinada relativamente a esse grau inicial de visibilidade em suspensão, isto é, como uma diminuição de tal visibilidade. A presente invenção proporciona ainda outro método preferencial de pesquisa que corresponde ao método descrito antes, com a excepção de se seleccionar um meio de crescimento em fase sólida no qual o taxano de partida, portador de um grupo aciloxi em C-13, é solúvel e por isso, quando misturado com o meio de crescimento, adquire um aspecto límpido, ao passo que o taxano portador de um grupo hidroxilo em C-13, enquanto produto do método de hidrólise da presente invenção, é insolúvel (e de preferência no qual a cadeia lateral clivada em C-13 também é insolúvel) e por isso, quando misturado com o meio de crescimento, adquire um aspecto turvo. A observação de uma zona turva em tomo da área onde tem lugar o crescimento do microrganismo permite seleccionar um microrganismo adequado. 23

Constitui uma variante particularmente preferencial do método de pesquisa de acordo com a presente invenção aquele que aqui se descreve nos Exemplos.

Os anteriores métodos de pesquisa preferíveis podem ser adequadamente utilizados no caso de o taxano de partida portador de um grupo aciloxi em C-13 e o produto de taxano portador de um grupo hidroxilo em C-13 diferirem em solubilidade relativa até ao ponto em que se possa observar se teve ou não lugar a hidrólise de acordo com a presente invenção.

Como exemplos de microrganismos utilizáveis para a hidrólise em C-13 refere-se os pertencentes aos géneros seguintes: Nocardioides, Nocardia, Rhodococcus, Micropolyspora, Saccharopolyspora, Pseudonocardia, Oerskovia, Promicromonospora e Intrasporangium. Como microrganismos particularmente preferidos refere-se os das espécies pertencentes aos géneros Nocardioides, tais como Nocardioides albus, Nocardioides flavus, Nocardioides fulvus, Nocardioides luteus, Nocardioides simplex e Nocardioides thermolilacinus, em especial Nocardioides albus ATCC 55424 (SC 13910) e ATCC 55425 (SC 13911) e Nocardioides luteus ATCC 55426 (SC 13912).

Tal como descrito antes, os microrganismos biologicamente puros Nocardioides albus ATCC 55424 (SC 13910), Nocardioides albus ATCC 55425 (SC 13911) e Nocardioides luteus ATCC 55426 (SC 13912) são microrganismos novos que a presente invenção proporciona. Faz-se observar que os mutantes destes organismos também são contemplados pela presente invenção, para utilização nos métodos de hidrólise aqui descritos, tais como os modificados por meios químicos, físicos (por exemplo, raios X) ou biológicos (por exemplo, por técnicas de biologia molecular).

Como exemplos de enzimas utilizáveis no método da presente invenção refere-se as hidrolases. Como enzimas preferidas refere-se as que derivam de microrganismos, em particular 24 dos microrganismos descritos antes. As enzimas podem ser isoladas, por exemplo, por métodos de extracção e purificação, tais como os descritos nos exemplos da presente invenção, em especial por purificação das fracções activas que se encontrem extracelularmente no meio em que os microrganismos foram criados, por exemplo, utilizando uma coluna de permuta aniónica, seguindo-se a cromatografia por interacção hidrofóbica e a filtração através de gel. A presente invenção proporciona ainda as enzimas capazes de intervirem no método de hidrólise agora descrito, as quais podem ser isoladas a partir de Nocardioides albus ATCC 55424 (SC 13910) e ATCC 55425 (SC 13911) e Nocardioides luteus ATCC 55426 (SC 13912), por exemplo, recorrendo às técnicas anteriormente descritas.

Utilização de enzimas e microrganismos para as modificações em C-10 e em C-13 No caso de se recorrer aos microrganismos, as células podem ser utilizadas sob a forma de células intactas húmidas ou células intactas secas, tais como as células liofilizadas, secas por aspersão ou secas a quente, ou então sob a forma de material celular tratado, tais como células rebentadas ou extractos celulares. Também está contemplada a utilização de organismos sujeitos a modificações da engenharia genética. A célula hospedeira pode ser uma célula qualquer, v.g. de Escherichia coli, modificada para conter um gene ou genes para a expressão de uma ou várias enzimas capazes de efectuar a catálise aqui descrita.

No caso de se utilizar um ou vários microrganismos, os métodos de hidrólise ou esterificação enzimática da presente invenção podem ser realizados a seguir à fermentação do microrganismo (fermentação em duas fases e hidrólise ou esterificação) ou então de forma concomitante, isto é, neste último caso, por fermentação in situ e hidrólise ou esterificação (fermentação em fase única e hidrólise ou esterificação). 25

Qualquer especialista na matéria consegue criar os microrganismos utilizando um meio adequado. Como meios adequados para o crescimento dos microrganismos refere-se aqueles que subministram os nutrientes necessários para o crescimento das células microbianas. Um meio típico para o crescimento compreende as necessárias fontes de carbono, fontes de azoto e oligoelementos (v.g. em quantidades diminutas). Também podem ser adicionados indutores. O termo “indutor, tal como aqui utilizado, designa qualquer composto que aumente a formação da desejada actividade enzimática dentro da célula microbiana.

As fontes de carbono podem compreender açúcares, tais como os seleccionados entre maltose, lactose, glicose, frutose, glicerol, sorbitol, sacarose, amido, manitol, propileno-glicol e semelhantes; ácidos orgânicos, tais como acetato de sódio, citrato de sódio e não só; e álcoois, tais como etanol, propanol e semelhantes.

As fontes de azoto podem compreender ‘N-Z amina A’, licor de infusão de milho, farinha de soja, extractos de carne, extractos de levedura, melaço, fermento-de-padeiro, triptona, soja nutriente, peptona, aminas de leveduras, aminoácidos, tais como o glutamato de sódio e não só, nitrato de sódio, sulfato de amónio e semelhantes.

Como oligoelementos refere-se os seleccionados entre sais de magnésio, manganês, cálcio, cobalto, níquel, ferro, sódio e potássio. Também é possível acrescentar fosfatos em quantidades diminutas ou, de preferência, em quantidades ligeiramente elevadas. O meio utilizado pode conter mais de uma fonte de carbono ou de azoto ou outro nutriente.

Como meios preferíveis para o crescimento refere-se os meios aquosos, em particular os descritos nos exemplos da presente invenção. 26 A agitação e o arejamento da mistura de reacção afecta a quantidade de oxigénio disponível durante o processo de hidrólise ou esterificação no caso de este ser realizado, por exemplo, em culturas em balões agitados ou em tanques de fermentação durante o crescimento dos microrganismos. É preferível efectuar a agitação no intervalo entre 100 e 250 r.p.m.; de preferência, o arejamento é efectuado com cerca de 1 e 10 volumes de ar por volume do meio e por minuto.

Para o crescimento dos microrganismos e/ou para a hidrólise ou esterificação de acordo com o método da presente invenção, trabalha-se com valores de pH compreendidos preferencialmente entre cerca de 6 e cerca de 8,5 e com valores de temperatura compreendidos de preferência entre cerca de 24°C e cerca de 37°C. Por exemplo, a hidrólise ou esterificação pode ser efectuada in vitro durante intervalos de tempo compreendidos entre 1 e 48 horas ou de preferência até se maximizar o rendimento do produto desejado. É preferível efectuar os métodos de hidrólise da presente invenção a um valor de pH entre 6 e 8, em particular sob condições não alcalinas.

Também é preferível utilizar um líquido aquoso como meio de reacção para a hidrólise, embora também seja possível utilizar um líquido orgânico ou uma mistura líquida orgânica/aquosa (bifásica), miscível ou imiscível. Para a esterificação utiliza-se, de preferência, um solvente orgânico ou um meio de reacção bifásico orgânico/aquoso, embora seja possível utilizar outros meios.

Para a modificação em C-10 é preferível utilizar entre 0,025% e 2,5% em peso do(s) material(is) de partida, isto é, os taxanos portadores de grupos aciloxi ou hidroxilo em C-10, com base no peso combinado do(s) material(is) de partida e do meio de reacção de esterificação ou hidrólise. No método de esterificação da presente invenção, as proporções molares prefe- 27 renciais entre o agente de acilação e o taxano portador de um grupo hidroxilo em C-10 estão compreendidas entre cerca de 1:1 e cerca de 1000:1. A quantidade de enzima ou de microrganismo utilizada em relação à do material de partida é seleccionada de modo a permitir a catálise da hidrólise ou da esterificação enzimática de acordo com a presente invenção. É preferível obter rendimentos superiores a 90% (percentagem de produto hidrolisado em C-10 obtido com base no taxano de partida portador de um grupo aciloxi) ou superiores a 50% (percentagem de produto acilado em C-10 obtido com base no taxano de partida portador de um grupo hidroxilo) no caso de se recorrer aos métodos respectivamente de hidrólise ou de esterificação de acordo com a presente invenção. A hidrólise ou a esterificação pode ser realizada selectivamente na posição C-10 do taxano de partida. Dito de outra forma, é possível obter produtos em que a sua maior parte (ou a sua totalidade) é hidrolisada ou esterificada apenas em C-10, sem hidrólise nem esterificação noutras posições.

Para a modificação em C-13 é preferível utilizar entre 0,025% e 0,25% em peso do(s) material(is) de partida, isto é, os taxanos portadores de grupos aciloxi em C-13, com base no peso combinado do(s) material(is) de partida e do meio de reacção de hidrólise. A quantidade de enzima ou de microrganismo utilizada em relação à do material de partida é seleccionada de modo a permitir a catálise da hidrólise enzimática de acordo com a presente invenção. E preferível obter rendimentos superiores a 90% (percentagem de produto hidrolisado em C-13 obtido com base no taxano de partida portador de um grupo aciloxi) no caso de se recorrer ao método de hidrólise de acordo com a presente invenção. A hidrólise pode ser realizada selectivamente na posição C-13 do taxano de partida. Dito de outra forma, é possível obter produtos em que a sua maior parte (ou a sua totalidade) é hidrolisada apenas em C-13, sem hidrólise noutras posições. 28

Separação

Os produtos portadores de grupos hidroxilo ou aciloxi em C-10, obtidos pelos processos da presente invenção, e os produtos acoplados, tais como os adiante descritos, podem ser isolados e purificados, por exemplo, por métodos tais como os seleccionados entre extracção, destilação, cristalização e cromatografia em coluna.

De um modo idêntico, os produtos portadores de grupos hidroxilo em C-13, obtidos pelo processo de hidrólise em C-13 de acordo com a presente invenção, e os produtos acoplados, tais como os adiante descritos, também podem ser isolados e purificados, por exemplo, por métodos tais como os seleccionados entre extracção, destilação, cristalização e cromatografia em coluna.

Utilidade

Os taxanos são compostos diterpénicos que possuem um radical taxano, conforme descrito antes. São particularmente interessantes os taxanos que contêm um radical taxano, em que as posições 11 e 12 estão ligadas através de uma ponte etilénica e em que a posição C-13 contém uma cadeia lateral, sendo tais taxanos exemplificados pelo taxol. Os taxanos farmacologicamente activos, tais como o taxol, podem ser utilizados como agentes antitumorais para o tratamento de pacientes que padeçam de cancros, tais como o cancro da mama, dos ovários, do cólon ou dos pulmões, o melanoma e a leucemia.

Compostos obtidos por modificação em C-10

Os compostos obtidos pelos métodos de hidrólise ou esterificação em C-10 de acordo com a presente invenção são particularmente úteis como intermediários para a preparação dos taxanos farmacologicamente activos referidos antes, devido ao facto de permitirem preparar 29 compostos que possuem um substituinte desejado em C-10. Assim, por exemplo, no caso de os compostos preparados por modificação em C-10, de acordo com os métodos da presente invenção, também serem portadores de um grupo hidroxilo em C-13, então tais compostos podem ser acoplados com compostos intermediários que formam cadeias laterais aciloxi em C-13, tais como as β-lactamas, para se obter taxanos portadores de uma cadeia lateral aciloxi em C-13, tais como o taxol ou os seus análogos. Sendo assim, a modificação em C-13, em conformidade com os métodos da presente invenção, pode ser realizada antes, durante ou após a utilização dos métodos da presente invenção para a modificação em C-10.

Os compostos portadores de grupos aciloxi ou hidroxilo, preparados de acordo com os métodos da presente invenção, podem ser facultativamente modificados antes da sua utilização na reacção de acoplamento da cadeia lateral em C-13. Por exemplo, é possível proteger um ou vários dos grupos hidroxilo existentes em posições diferentes de C-13 antes do acoplamento e desprotegê-los depois.

Os taxanos portadores de grupos aciloxi e hidroxilo em C-10, obtidos pelos métodos de hidrólise e esterificação da presente invenção e facultativamente modificados conforme descrito antes, podem ser utilizados, por exemplo, para a preparação de taxanos portadores de uma cadeia lateral aciloxi em C-13, tais como os descritos e preparados pelos métodos também descritos na patente de invenção europeia n° 400 971, na patente de invenção norte--americana n° 4 876 399, na patente de invenção norte-americana n° 4 857 653, na patente de invenção norte-americana n° 4 814 470, na patente de invenção norte-americana n° 4 924 012, na patente de invenção norte-americana n° 4 924 011 e em Kingston, Pharm. Ther., Vol. 52, 1-34 (1991), e em especial na patente de invenção norte-americana com o n° de série 07/995 443 depositada a 23 de Dezembro de 1992 por Poss et al. (Processo do mandatário com o n° LD60) e 30 patente de invenção norte-americana com o n° de série 08/033 598 depositada a 19 de Março de 1993 por Thottathil et al. (Processo do mandatário com o n° LD57), estando todas estas obras aqui incorporadas por referência.

Compostos obtidos por modificação em C-13

Os compostos que possuem grupos hidroxilo em C-13, obtidos pelo método de hidrólise de acordo com a presente invenção, são particularmente úteis como intermediários para a preparação dos taxanos portadores de cadeias laterais em C-13 referidos antes. Em particular, os compostos portadores de grupos hidroxilo em C-13, preparados em conformidade com o método da presente invenção, podem ser acoplados com compostos intermediários que formam cadeias laterais, tais como as β-lactamas, para se obter taxanos portadores de uma cadeia lateral aciloxi em C-13. A adição de uma tal cadeia lateral por si só pode conferir uma actividade farmacológica mais elevada ou mais desejável ao produto taxano ou então pode formar um produto taxano que seja mais facilmente convertido num taxano com uma actividade farmacológica mais elevada ou mais desejável do que a do composto de partida.

Os compostos portadores de grupos hidroxilo em C-13, preparados de acordo com o método da presente invenção, podem ser facultativamente modificados antes da sua utilização na formação da cadeia lateral por acoplamento. Por exemplo, a modificação em C-10, de acordo com os métodos da presente invenção, pode ser realizada antes, durante ou após a utilização do método da presente invenção de hidrólise em C-13; e/ou é possível proteger um ou vários dos grupos hidroxilo, existentes em posições diferentes de C-13, antes do acoplamento e desprotegê-los depois. 31

Os taxanos portadores de grupos hidroxilo em C-13, obtidos pelo método de hidrólise da presente invenção e facultativamente modificados conforme descrito antes, podem ser utilizados, por exemplo, para a preparação de taxanos portadores de uma cadeia lateral aciloxi em C-13, tais como os descritos e preparados pelos métodos também descritos na patente de invenção europeia n° 400 971, na patente de invenção norte-americana n° 4 876 399, na patente de invenção norte-americana n° 4 857 653, na patente de invenção norte-americana n° 4 814 470, na patente de invenção norte-americana n° 4 924 012, na patente de invenção norte-americana n° 4 924 011 e em Kingston, Pharm. Ther., Vol. 52, 1-34 (1991), e em especial na patente de invenção norte-americana com o n° de série 07/995 443 depositada a 23 de Dezembro de 1992 por Poss et al. (Processo do mandatário com o n° LD60) e na patente de invenção norte-americana com o n° de série 08/033 598 depositada a 19 de Março de 1993 por Thottathil et al. Processo do mandatário com o n° LD57), estando todas estas obras aqui incorporadas por referência. É preferível a preparação de taxanos portadores de grupos aciloxi em C-13 de fórmula estrutural VI.

Compostos preferidos para a modificação em C-10 No método de hidrólise em C-10, de acordo com a presente invenção, é preferível utilizar os taxanos de fórmula estrutural Π, ou os seus sais, pelo que a hidrólise enzimática proporciona os correspondentes compostos de fórmula estrutural I ou os seus sais. De igual modo, é preferível utilizar taxanos de fórmula estrutural I, ou os seus sais, no método de esterificação em C-10 de acordo com a presente invenção, pelo que a esterificação enzimática proporciona os correspondentes compostos de fórmula estrutural Π ou os seus sais. 32

Nas fórmulas estruturais I e Π o símbolo R7 representa preferencialmente um grupo de fórmula geral Rn-C(0)-O, em especial no caso de o símbolo R11 representar um grupo alquilo, tal como o grupo metilo; de preferência, o símbolo R2 representa um grupo hidroxilo ou xilosilo; o símbolo R3 representa preferencialmente um grupo alquilo, tal como o grupo metilo; de preferência, o símbolo R4 representa um grupo arilo, tal como o grupo fenilo; e o símbolo R1 representa preferencialmente um grupo hidroxilo ou um grupo que satisfaz à fórmula estrutural ΙΠ seguinte:

32 Re(0)CNH O

em que cada um dos símbolos R e R representa independentemente um grupo alquilo, alcoxi, alcenilo, alceniloxi, alquinilo, alquiniloxi, cicloalquilo, cicloalquiloxi, cicloalcenilo, cicloalce-niloxi, arilo, ariloxi, um heterociclo ou heterociclooxi; e o símbolo R10 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo de protecção do radical hidroxilo.

Como exemplos de taxanos de fórmulas estruturais I e Π refere-se os seleccionados entre cefalomanina, 10-desacetiltaxol, 7-xilosiltaxol, taxol-C, 7-xilosil-10-desacetiltaxol, taxol, bacatina ΙΠ, 10-desacetilbacatina ΙΠ, 7-xilosilbacatina III e 7-xilosil-10-desacetilbacatina ΙΠ. A hidrólise enzimática da bacatina ΙΠ para formar 10-desacetilbacadna UI (v.g. com a formação de ácido acético), por exemplo, utilizando uma hidrolase, constitui uma variante preferencial da presente invenção. Esta reacção pode ser invertida pelo método de esterificação enzimática da presente invenção.

Compostos preferidos para a modificação em C-13

No método da presente invenção é preferível utilizar os taxanos de fórmula estrutural VI, ou os seus sais, pelo que a hidrólise enzimática em C-13 proporciona os correspondentes compostos de fórmula estrutural V ou os seus sais. Nas fórmulas estruturais I e VI o símbolo R representa preferencialmente um grupo de fórmula geral R -C(0)-0-, tal como o grupo acetiloxi, ou um grupo hidroxilo; de preferência, o símbolo R2 representa um grupo hidroxilo ou xilosilo; o símbolo R3 representa preferencialmente um grupo alquilo, tal como o grupo metilo; de preferência, o símbolo R4 representa um grupo arilo, tal como o grupo fenilo; e o símbolo R7 representa preferencialmente um grupo que satisfaz à fórmula estrutural EH seguinte:

Ra(0)CNH O

em que os símbolos R8, R9 e R10 possuem as significações definidas antes.

Como exemplos de taxanos de partida de fórmula estrutural VI refere-se os seleccionados entre cefalomanina, 10-desacetiltaxol, 7-xilosiltaxol, taxol-C e 7-xilosil-10-desacetiltaxol, por si sós ou misturados entre si ou com taxol. Os produtos preferidos da hidrólise são a bacatina III, a 10-desacetilbacatina ΙΠ, a 7-xilosilbacatina ΙΠ e a 7-xilosil-10-desacetilbacatina ΙΠ. O acoplamento subsequente à hidrólise proporciona preferencialmente produtos taxano de fórmula estrutural VI, descritos antes, que possuem grupos aciloxi de fórmula estrutural ΙΠ em C-13. De preferência, o taxol é preparado fundamentalmente por hidrólise e acoplamento, conforme aqui descrito. 34 9

Os sais ou os solvatos, tais como os hidratos, dos reagentes ou dos produtos podem ser utilizados ou preparados conforme for adequado em qualquer dos métodos da presente invenção. A presente invenção é ainda ilustrada pelos exemplos seguintes cuja finalidade é meramente ilustrativa, não se pretendendo, de modo algum, limitar o âmbito das reivindicações anexas.

Exemplo 1 10-Desacetilacão de bacatina ΙΠ

Criou-se em cultura Nocardioides luteus ATCC 55426 (SC 13912), isolada a partir do solo, durante 3 dias à temperatura de 28°C e a 150 r.p.m. num balão de Erlenmeyer com a capacidade de 50 mL que continha 10 mL de meio. Por cada litro de água destilada o meio continha: 10 g de triptona da ‘Bacto’, 5 g de extracto de levedura da ‘Bacto’, 6 mL de tributirina e 0,06 mL de ‘Tween 80’ para um valor final de pH de 6,8 ± 0,2. As células foram recolhidas por centrifugação, lavadas com 10 mL de tampão de fosfato de potássio 50 mM, a pH 7, e novamente colocadas em suspensão em 2 mL deste tampão. Adicionou-se à suspensão celular 0,5 mg de bacatina ΙΠ em 20 pL de metanol e agitou-se a suspensão durante 20 horas à temperatura ambiente (cerca de 23°C), utilizando para tal um aparelho ‘Fisher Roto-Rack’. Extraiu-se a suspensão com cloreto de metileno, evaporou-se o extracto, dissolveu-se novamente e analisou-se pelo método 2 de CLER adiante descrito. A amostra continha 10-desacetilbacatina ΙΠ na concentração de 0,257 mg/mL (conversão a 100%) e somente vestígios de bacatina ΠΙ. As células lavadas da estirpe ATCC 55426, criada em três meios diferentes, também sofreram esta transformação. 35

Exemplo 2

10-Desacetilacão de bacatina III

Utilizou-se Nocardioides luteus ATCC 55426 (SC 13912), criado em 20 mL de meio que continha por cada litro de água destilada: 10 g de triptona da ‘Bacto’, 5 g de extracto de levedura da ‘Bacto’ e 0,06 mL de ‘Tween 80’, para um valor final de pH de 6,8 ± 0,2, para inocular 1 L do mesmo meio num balão de Erlenmeyer com a capacidade de 4 L. Agitou-se o balão durante 3 dias à temperatura de 28°C e depois recolheu-se as células por centrifugação. Lavou-se o agregado celular com 600 mL de tampão de fosfato de potássio 50 mM, a pH 7, e centrifugou-se novamente para se obter 36,6 g de células húmidas. As células foram congeladas a -72°C, liofilizadas para se obter 2,5 g ao fim de 2 dias, trituradas com almofariz e pilão e depois foram guardadas a 2°C. Misturou-se 1,98 mL de tampão de fosfato de potássio 50 mM, a pH 7, 50 mg de células secas e 0,5 mg de bacatina fH em 20 pL de metanol, utilizando para tal um aparelho ‘Fisher Roto-Rack’, à temperatura ambiente durante os períodos indicados no quadro 1 seguinte. As reacções foram interrompidas por adição de 2 mL de metanol. Removeu-se o precipitado com uma microcentrifugadora e procedeu-se à análise das células pelo método 2 de CLER adiante descrito. Os resultados obtidos estão agrupados no quadro 1.

Quadro 1

Tempo 10-desacetilbacatina ΠΙ Bacatina ΙΠ Conversão (minutos) mg/mL mg/mL (%) 0 0,007 0,252 - 30 0,051 0,143 22 60 0,106 0,106 46 120 0,204 0,034 88

Exemplo 3 10-Desacetilação de taxol

Um extracto parcialmente purificado de Nocardioides luíeus ATCC 55426 (SC 13912) (purificado por cromatógrafia de permuta aniónica num aparelho ‘Whatman DE52’) continha a enzima na concentração de 34 miliunidades/mL. (1 miliunidade é a quantidade capaz de hidrolisar por minuto 1 nmole de bacatina ΙΠ para formar 10-desacetilbacatina ΙΠ, à temperatura de 28°C, em tampão de fosfato de potássio 50 mM, a pH 7, contendo bacatina ΠΙ na concentração de 0,25 mg/mL e 1% de metanol). Efectuou-se a incubação de 2 mL de meio contendo tampão de fosfato de potássio 50 mM, a pH 7, 0,5 mg de taxol, 1% de metanol e 34 miliunidades de enzima num aparelho ‘Fisher RotoRack’ durante 3,5 horas e à temperatura de 28°C. Interrompeu-se a adição por extracção com 4 mL de cloreto de metileno. Secou-se o extracto, dissolveu-se novamente em metanol e analisou-se pelo método 3 de CLER adiante descrito. A amostra continha 0,075 mg de taxol e 10-desacetiltaxol na concentração de 0,186 mg/mL (conversão a 78%).

Purificação alternativa de Nocardioides luteus ATCC 55426 (SC 13912)

Criou-se em cultura, numa fermentadora, Nocardioides luteus ATCC 55426 (SC 13912), num meio que continha 1% de triptona e 0,5% de extracto de levedura. Todos os passos de purificação foram efectuados à temperatura de 4°C em tampão de fosfato de potássio 50 mM, a pH 7,2. Preparou-se uma suspensão das células a 10% p/v em tampão e fez-se passar duas vezes através de um microfluidificador a 10000 psi para que realizar a citólise. Depois purificou--se o lisado celular por centrifugação a 24000 x g durante 15 minutos. Adicionou-se sulfato de amónio até se obter um grau de saturação de 60%, preparou-se uma suspensão do precipitado 37 resultante em tampão que continha sulfato de amónio 1M e aplicou-se a uma coluna (5,5 x 2,6 cm) de cromatografia de interacção hidrofóbica (CIH-éter (‘Toya-pearl’)) com um débito de 2 mL/ /minuto. Eluiu-se a actividade enzimáticã com tampão. Depois» com as fracções activas procedeu--se ao carregamento de uma coluna (2,6 x 84 cm) de filtração através de gel ‘Sephacryl S-200’ de “Pharmacia”, a 0,5 mL/minuto. As fracções activas da coluna foram carregadas numa coluna (2 mL, débito de 2 mL/minuto) de permuta iónica (‘BioRad-Q2’) e eluiu-se a actividade com um gradiente salino de NaCl, variando entre 0 e 0,8 M em 42 mL. Reuniu-se as fracções activas e aplicou-se a uma coluna de ‘Sephacryl S-200’, conforme descrito antes. O peso molecular da enzima foi calculado em 40000 ± 10000, em geles que continham dodecil-sulfato de sódio. Os resultados obtidos nos diversos passos do método anterior foram os seguintes:

Passo* Volume Proteína Actividade Actividade específica Recuperação mL mg mu mu/me % Extracto celular 100 450 2050 4,5 - Sulfato de amónio 70 196 2830 14,4 138 CIH (éter) 7 24 953 39,9 46,5 ‘Sephacryl S-200’ 7 0,7 190 271 9,3 ‘BioRad-Q2’ 3 0,09 51 567 2,5 ‘Sephactyl S-200’ 8 0,03 26 867 1,3 * Purificação de C-10-desacetilase: 1 miliunidade (mu) de enzima catalisa a conversão de bacatina UI à razão de 1 nmol/minuto para formar 10-desacetilbacatina III, à temperatura de 25°C, em tampão de fosfato de potássio 50 mM, a pH 7, contendo bacatina ΙΠ na concentração de 0,25 mg/mL e 1% de metanol. A proteína foi determinada com Reagente de Ensaio de Proteínas da ‘BioRad’.

Exemplo 4

Acetilacão de 10-desacetilbacatina ΠΙ para formar bacatina ΠΙ Provocou-se a ruptura das células de Nocardioides luteus ATCC 55426 (SC 13912) em tampão de fosfato de potássio 50 mM, a pH 7,2 (10% peso/volume) num microfluidificador e 38 fez-se adsorver a enzima 10-desacetilase, a partir do extracto, num pennutador aniónico de resina DE52 celulósica ‘Whatman DEAE’, por agitação durante 3 horas (10 g de proteína do extracto por litro de DE52). Recolheu-se a DE52 por filtração, lavou-se com tampão e liofílizou-se para se obter 0,091 miliunidades de enzima por mg de sólido. Agitou-se vigorosamente, com uma vareta magnética, 0,2 mL de tampão de fosfato de potássio 1 M, a pH 8, 100 mg de enzima imobilizada (isto é, imobilizada sobre a resina DE52), 1,8 mL de água, 2 mg de 10-desacetil-bacatina ΠΙ e 0,5 mL de acetato dé vinilo, durante 14,5 horas à temperatura ambiente. Extraiu-se a mistura de reacção com cloreto de metileno. Secou-se o extracto e dissolveu-se novamente em metanol para se efectuar a análise pelo método 1 de CLER adiante descrito. A amostra continha 10-desacetilbacatina ΙΠ na concentração de 0,688 mg/mL e bacatina ΙΠ na concentração de 0,203 mg/mL (conversão a 19%).

Métodos de CLER Método 1

Coluna: ‘Hewlett Packard hypersil’ 5 pm ODS Cl8; 200 x 4,6 mm

Fase móvel: 55% de metanol, 45% de água Débito: 1 mL/minuto

Temperatura da coluna: ambiente

Comprimento de onda de detecção: 235 nm Método 2

Coluna: ‘Phase Separations Inc.’ (Norwalk, CT) ‘microbore spherisorb phenyl’; 150 x 2,0 mm, 3 μτη Fase móvel: Solvente A: KH2P04 15 mM, ajustado para pH 4 com ácido trifluoroacético. Solvente B: acetonitrilo 39

Tempo/minutos 0 20 23 24 28

Solvente A (%) 75 55 40 25 75

Solvente B (%) 25 45 60 75 25

Temperatura da coluna: 35°C

Comprimento de onda de detecção: 230 nm Método 31

Coluna: ‘Hewlett Packard hypersil’ 5 pm ODS C18; 200 x 4,6 mm

Fase móvel: 60% de metanol, 40% de água Débito: 1 mL/minuto

Temperatura da coluna: ambiente

Comprimento de onda de detecção: 235 nm

Exemplo 5

Hidrólise de extracto de rebentos

Concentrou-se 10 a 15 vezes um extracto etanólico de rebentos de Taxus hicksii, utilizando para tal nanofiltros. Efectuou-se a incubação de 0,5 mL de extracto, 0,5 mL de tampão de fosfato de potássio 1 M, a pH 7, 54 miliunidades de enzima parcialmente purificada de Nocardioides albus ATCC 55425 (SC 13911) (purificada por cromatografia de permuta aniónica e precipitação com sulfato de amónio) e 4 mL de água à temperatura de 28°C durante 48 horas, utilizando para tal um aparelho ‘Fisher Roto Rack’. (É possível utilizar uma enzima de ATCC 55425 para a hidrólise em C-13, conforme aqui descrito). Havia um segundo tubo que 1

Ver também Monsarrat et ai, Drug Metabolism and Disposition, 18, 895-901 (1990) 40 continha a mesma mistura e também 14 miliunidades de enzima de Nocardioides albiis ATCC 55426 (SC 13912) imobilizada sobre 500 mg de DE52, conforme descrito no exemplo 4. Ao fim de 23 horas de incubação à temperatura de 28°C, adicionou-se uma segunda porção de 14 miliunidades de enzima de ATCC 55426 sobre DE52 conjuntamente com 4 mL de água, tendo a incubação prosseguido durante 22 horas. Preparou-se uma amostra de contraprova que não recebeu nenhumas enzimas. Extraiu-se as amostras com cloreto de metileno e dissolveu-se em metanol os extractos evaporados, para se realizar a análise pelo método 2 de CLER anteriormente descrito. Os resultados obtidos estão agrupados no quadro 2 seguinte.

Os resultados indicam que as substâncias taxol, cefalomanina, 7-xilosil- 10-desacetiltaxol e 10-desacetiltaxol após o tratamento com a desacilase de SC 13911 em C-13 estavam esgotadas, ao passo que as quantidades de bacatina ΙΠ e de 10-desacetilbacatina ΙΠ tinham aumentado. A proporção molar entre 10-desacetilbacatina ΠΙ mais bacatina ΙΠ e o taxol inicial aumentou de 117% para 436%. Quando se tratou o extracto de rebentos com a desacilase de SC 13911 em C-13 e com a desacilase de SC 13912 em C-10, a bacatina ΙΠ foi convertida em 10-de-sacetilbacatina III e a concentração de 10-desacetilbacatina ΙΠ aumentou 6 vezes em comparação com o valor inicial. Assim, o tratamento de uma mistura de taxanos com a desacilase em C-13 e com a desacilase em C-10 permitiu obter 10-desacetilbacatina ΠΙ como produto principal.

Quadro 2

Hidrólise de extracto de rebentos

Enzima 10-desacetilbacatina ΙΠ bacatina ΙΠ 7-xilosil-10-desacetiltaxol cefalomanina taxol 10-DAT de me/mL me/mL me/mL me/mL me/mL me/mL Nenhuma 0,167 0,142 0,246 0,243 0,401 0,201 SC13911 0,400 0,771 0,027 0,000 0,000 0,014 11 + 12" 1,025 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 41

Enzima taxol C D+B/T* de mg/mL mg/mL Nenhuma vestígios 116,8 SC13911 0,000 436,3 11 + 12 0,000 400,8 10-DAT é 10-desacetiltaxol "SC13911 eSC13912 * D+B/T é o rendimento molar percentual (%) seguinte: quantidade obtida de (10-desacetilbacatina ΙΠ e bacatina ΠΙ) a dividir por (taxol inicial)

Exemplo 6

Selecção de estirpes de microrganismos capazes de remover a cadeia lateral em C-13 do taxol Esterilizou-se 5,25 g de meio de gelose de azul-de-anilina solúvel em álcool da ‘Difco’ em 150 mL de água destilada e arrefeceu-se parcialmente, em conformidade com as instruções do fabricante. O meio continha 10 g de triptona, 5 g de extracto de levedura, 20 g de gelose e 0,15 g de azul-de-anilina solúvel em álcool, por litro. Adicionou-se ao meio 25 mg de taxol e 10 pL de ‘Tween 80’ em 1 mL de metanol através de um filtro estéril. Utilizou-se 15 mL de meio por cada placa de Petri com as dimensões de 100 mm x 15 mm.

Após o arrefecimento e a secagem das placas, as amostras de solo foram aplicadas às placas do modo a seguir indicado. Colocou-se 2 g de solo em suspensão em 40 mL de água. Diluiu-se uma amostra da suspensão 100 vezes com água e pulverizou-se cada placa com 0,1 mL. A água utilizada tinha sido filtrada através de um filtro de 0,22 pm. Realizou-se a incubação das placas a 28°C e depois efectuou-se a selecção das colónias que estavam circundadas por uma zona límpida. A base para a selecção foi o facto de o taxol ser insolúvel à concentração utilizada no meio, conferindo um aspecto turvo às placas, ao passo que a bacatina ΠΙ e a cadeia lateral produzida por hidrólise são solúveis, pelo que formam uma zona límpida 42 em tomo das colónias. Os microrganismos seleccionados compreendem: estirpes ATCC 55424 (SC 13910) e ATCC 55425 (SC 13911) de Nocardioides albus e estirpe ATCC 55426 (SC 13912) de Nocardioides luteus.

Exemplo 7

Remoção da cadeia lateral em C-13 do taxol A reacção deste exemplo ocorreu tal como ilustrado no esquema 1 seguinte. Introduziu-se 10 mL de meio em balões de Erlenmeyer com a capacidade de 50 mL e realizou-se a inoculação com as estirpes ATCC 55424 (SC 13910) ou ATCC 55425 (SC 13911) de Nocardioides albus, isoladas a partir do solo, conforme descrito no exemplo 6, e agitou-se durante 2 dias à temperatura de 28°C a 150 r.p.m.. Por cada litro de água destilada o meio continha: 10 g de triptona da ‘Bacto’, 5 g de extracto de levedura da ‘Bacto’ e 0,06 mL de ‘Tween 80’ a pH 6,8 ± 0,2. As células foram removidas por centrifugação e o pH dos sobrenadantes foi ajustado de 8,66 para 7 com KH2PO41M.

Adicionou-se 0,5 mg de taxol em 20 pL de metanol a 2 mL de cada um dos sobrenadantes e agitou-se as misturas durante 21 horas à temperatura ambiente (cerca de 23°C). Extraiu-se as soluções com 4 mL de CH2CI2. Secou-se os extractos sob uma atmosfera de N2 e à temperatura ambiente, dissolveu-se novamente em metanol e efectuou-se a análise por CLER (método 3, descrito antes). O sobrenadante da estirpe ATCC 55424 (SC 13910) permitiu obter taxol à razão de 0,008 mg/mL e bacatina m à razão de 0,163 mg/mL (conversão a 94,9%). O sobrenadante da estirpe ATCC 55425 (SC 13911) permitiu obter taxol à razão de 0,014 mg/mL e bacatina ΙΠ à razão de 0,166 mg/mL (conversão a 96,7%). (A bacatina ΙΠ e o produto de cadeia lateral clivada foram identificados por CL-EM). 43

Esauema 1 43

QAc HO1"·*

+

Cadeia lateral

Exemplo 8

Remoção da cadeia lateral em C-13 da cefalomanina

Inoculou-se cada um de dois balões de Erlenmeyer, com a capacidade de 50 mL, contendo 10 mL de meio (35 g de licor de infusão de milho, 20 g de cerelose, 5 g de (NEL^SCL, 3,5 g de CaCC>3 e 5 mL de óleo de soja, tendo o volume sido ajustado para 1 litro com água destilada) com 0,5 mL de ATCC 55425 (SC 13911) de Nocardioides albus. Após dois dias de incubação a 28°C e 150 r.p.m., introduziu-se estas duas culturas num balão com a capacidade de 4 L contendo 1 L do meio utilizado no exemplo 7. Decorridas 72 horas a 28°C e 200 r.p.m., as células foram removidas por centrifugação e o valor do pH do sobrenadante foi ajustado de 8,16 para 7 com KH2PO4 1M.

Incubou-se 0,5 mg de cefalomanina em 20 pL de metanol com 2 mL de sobrenadante durante 17 horas num aparelho equipado com um mecanismo de agitação de topo a topo (‘Fisher Roto-Rack’). Extraiu-se a solução com cloreto de metileno, evaporou-se o extracto, preparou-se nova suspensão em metanol e efectuou-se a análise por CLER (método 2, descrito antes). A concentração de cefalomanina diminuiu de 0,175 mg/mL para 0 mg/mL e a bacatina ΙΠ foi produzida numa concentração de 0,110 mg/mL (rendimento molar de 89% com base na concentração inicial de cefalomanina analisada).

Exemplo 9

Remoção da cadeia lateral em C-13 do 7-xilosiltaxol Procedeu-se à preparação de enzimas das estirpes ATCC 55424 (SC 13910) e ATCC 55425 (SC 13911) de Nocardioides albus conforme descrito no exemplo 8, com a excepção de se ter incubado 1 L de culturas durante dois dias em vez de três. Criou-se em cultura a estirpe ATCC 55426 (SC 13912) de Nocardioides luteus) tal como descrito no exemplo 8 para a estirpe ATCC 55425 (SC 13911) de Nocardioides albus. Ao fim de três dias, recolheu-se as células por centrifugação, lavou-se com 600 mL de tampão de fosfato de potássio 50 mM, a pH 7, e centrifiigou-se novamente. Congelou-se à temperatura de -72°C uma quantidade de 45 1 36,6 g de células húmidas, liofilizou-se para se obter 2,52 g em dois dias, triturou-se com almofariz e pilão e guardou-se à temperatura de 2°C.

Cada preparação de 1,8 mL dos sobrenadantes das estirpes ATCC 55424 (SC 13910) e ATCC 55425 (SC 13911) e também 50 mg de células secas da estirpe ATCC 55426 (SC 13912) em 1,8 mL de água foi inoculada com 0,5 mg de 7-xilosiltaxol em 0,2 mL de metanol, durante 42 horas à temperatura ambiente, utilizando para tal um aparelho de agitação ‘Fisher Roto-Rack’. Extraiu-se as misturas de reacção com cloreto de metileno e dissolveu-se os extractos secos em metanol para subsequente análise por CLER (método 3, descrito antes). A concentração de 7-xilosiltaxol diminuiu de 0,218 mg/mL para 0 mg/mL com cada uma das enzimas. Por espectrometria de massa e CLER identificou-se o produto principal em cada amostra e concluiu-se que era 7-xilosilbacatina ΕΠ. Com base num padrão de referência de bacatina III, as estirpes ATCC 55424 (SC 13910), ATCC 55425 (SC 13911) e ATCC 55426 (SC 13912) deram origem a concentrações de 7-xilosilbacatina III respectivamente de 0,112 mg/mL, 0,118 mg/mL e 0,120 mg/mL. Utilizando o mesmo coeficiente de extinção a 235 nm para a bacatina ΙΠ e para a 7-xilosilbacatina ΙΠ, os rendimentos calculados seriam respectivamente de 88%, 93% e 94% (percentagens molares).

Exemplo 10

Hidrólise de misturas de células vegetais

Extraiu-se 1 g de agulhas de Taxus hicksii com 10 mL de uma mistura a 5000:1 de metanohácido acético. A 10 mL deste extracto adicionou-se 10 mL de uma mistura a 500:1 de água:ácido acético. Centrifúgou-se a mistura durante 10 minutos a 48000 x g e à temperatura de 20°C. Deitou-se fora a massa agregada. Colocou-se 4 mL do extracto e 16 mL do sobrenadante

46 de uma das estirpes ATCC 55424 (SC 13910) ou ATCC 55425 (SC 13911) de Nocardioides albus (preparada conforme descrito no exemplo 9) num balão de Erlenmeyer com a capacidade de 50 mL e agitou-se à temperatura de 28°C e a 150 r.p.m. durante 42 horas. Extraiu--se as amostras com cloreto de metileno e dissolveu-se em metanol os extractos evaporados para se efectuar a sua análise por CLER (método 2, descrito antes). No quadro 3 seguinte estão indicadas as concentrações de taxano e as proporções molares de (bacatina III + 10-desacetilbacatina ni)/taxol inicial, com e sem tratamento enzimático.

Quadro 3

Hidrólise enzimática de extractos de agulhas

Enzima 10-desacetilbacatina ΠΙ bacatina ΙΠ 7-xilosil- 10-desacetiltaxol cefalomanina taxol ÍDAB+Bf de" ume/mL us/mL us/mL us/mL us/mL (taxol) Nenhuma 0,126 vestígios 0,012 0,153 0,392 50,4 SC13910 0,602 0,319 0,000 0,000 0,000 359,3 SC13911 0,959 0,294 0,000 0,000 0,000 492,8 * Valores indicados em percentagem molar de (DAB + B) + (taxol inicial) DAB = 10-desacetilbacatina ΠΙ B = bacatina ΠΙ

Exemplo 11

Purificação de enzimas e hidrólise de taxanos Inoculou-se 100 mL de meio (35 g de licor de infusão de milho, 20 g de cerelose, 5 g de sulfato de amónio, 3,5 g de carbonato de cálcio e 5 mL de óleo de soja, tendo o volume sido ajustado com água destilada até perfazer 1 L) contido num balão de Erlenmeyer, com a capacidade de 500 mL, com 1 mL de Nocardioides albus ATCC 55425 (SC 13911) no mesmo meio e agitou-se durante 2 dias à temperatura de 28°C. Transferiu-se 20 mL desta cultura 47 para 1 L de água destilada que continha 10 g de triptona e 5 g de extracto de levedura, a pH 6,8 ± 0,2, num balão de Erlenmeyer com a capacidade de 4 L. Agitou-se o balão durante 3 dias a 28°C, removeu-se as células por centrifugação e ajustou-se o valor do pH do sobrenadante de 7,89 para 7 com KH2P04 1M.

Todos os passos de purificação foram realizados a 4°C. Aplicou-se o sobrenadante a 150 mL de resina de permuta aniónica DE52 da ‘Whatman’ em tampão de fosfato de potássio 25 mM, a pH 7, numa coluna de 5 cm. Lavou-se a coluna com 150 mL de tampão e depois com 450 mL de tampão que continha NaCl 0,25 M. Efectuou-se a eluição da actividade enzimática com tampão mais NaCl 0,45 Μ. O débito foi de 5 mL/minuto. Adicionou-se sulfato de amónio (100 mg/mL) às fracções mais activas que saíram da coluna de DE52 e aplicou-se a solução a 30 mL de ‘Fenil-Sepharose CL-4B’ de “Pharmacia” em tampão de fosfato de potássio 50 mM, a pH 7, contendo sulfato de amónio na concentração de 100 mg/mL, numa coluna com o diâmetro de 2,6 cm e com um débito de 1,6 mL/minuto. Lavou-se a coluna com 150 mL de tampão mais sulfato de amónio na concentração de 20 mg/mL e depois eluiu-se a actividade só com tampão. Concentrou-se por ultrafiltração as fracções mais activas da coluna de ‘Phenyl--Sepharose’ até se obter 4 mL, utilizando para tal uma membrana ‘Amicon YM10’, e fez-se passar através de uma coluna (2,6 x 84 cm) de filtração em gel ‘Sephacryl S-200’ de “Pharmacia”, com um débito de 0,65 mL/minuto. A fracção de actividade específica mais elevada tinha uma única banda com um peso molecular de 49000 ± 10000 sobre um gel de dodecilsulfato de sódio (DSS, o mesmo que SDS). A purificação está resumida no quadro 4 seguinte. (Faz-se observar que 1 miliunidade (mu) de enzima catalisa a conversão do taxol em bacatina ΙΠ à razão de 1 nmol/minuto, à temperatura de 28°C e em tampão de fosfato de potássio 50 mM contendo taxol na concentração de 0,25 mg/mL e 1% de metanol). 48

Quadro 4

Passo Volume Proteína Actividade mL mg mu meio 1000 885 4664 DE52 99 104 1194 ‘Phenyll-Sepharose CL-4B’ 16 6,45 801 ‘Sephacryl S-200’ 8,8 0,150 164 Passo Actividade específica Recuperação mu/mg % meio 5,27 DE52 H,5 25,6 ‘Phenyl-Sepharose CL-4B’ 124 17,2 ‘Sephacryl S-200’ 1093 3,5

Para demonstrar a actividade da enzima anteriormente purificada foram realizadas as experiências a seguir descritas, utilizando os substratos de taxano enumerados no quadro 5.

Procedeu-se à preparação de amostras contendo 0,5 mg de substrato de taxano e 1% de metanol em 2,0 mL de tampão de fosfato de potássio 50 mM, a pH 7 (amostras 1,2, 3, 4 e 5). Procedeu-se também à preparação de amostras contendo 10 mu da enzima purificada através do passo em que se utiliza ‘Phenyl-Sepharose CL-4B’, descrito antes, e ainda 0,5 mg de substrato de taxano e 1% de metanol em 2,0 mL de tampão de fosfato de potássio 50 mM, a pH 7 (amostras le, 2e, 3e, 4e e 5e). Todas as amostras foram misturadas durante 16 horas num aparelho ‘Fisher Roto Rack’ à temperatura de 28°C. Extraiu-se as amostras 1, le, 2, 2e, 5 e 5e com 4 mL de cloreto de metileno. Secou-se 2 mL do extracto, dissolveu-se novamente em 1 mL de metanol e efectuou-se a sua análise pelo método 3 de CLER. As amostras 3, 3e, 49 4 e 4e foram diluídas com 2 mL de metanol e analisadas pelo método 3 de CLER (a cadeia lateral em C-13 foi medida unicamente nestas últimas amostras).

No quadro 5 está indicada a quantidade de substrato de taxano (mg/mL) que restou em cada uma das amostras após a incubação e bem assim a quantidade de taxano produzido (mg/mL) presente no final da incubação. Conforme se pode observar a partir do quadro 5 (ver as amostras le, 2e, 3e, 4e e 5e), a enzima purificada, tal como descrito antes, é eficaz para remover a cadeia lateral em C-13 por hidrólise dos substratos de taxano aí enumerados.

Quadro 5

Hidrólise de taxanos por enzimas purificadas

Substrato Restante Produto Cadeia lateral Amostra mg/mL mg/mL mg/mL 1 taxol 0,268 0,003 le 0,030 bacatínam 0,170 2 cefàlomanina 0,239 2e 0,011 bacatmaffl 0,190 3 7-xilosiltaxol 0,250 3e 0,016 7-xilosiIbacatina ΠΙ 0,182 0,066 4 7-xilosil- 10-desacetiltaxol 0,250 4e 0,113 7-xilosil-10- 0,108 0,044 -desacetilbacatina 1Π 5 10-desacetiltaxol 0,257 5e 0,000 10-desacetilbacatina ΠΙ 0,150

Exemplo 12

Hidrólise de extracto de rebentos

Concentrou-se um extracto etanólico de Taxus hicksii 10 a 15 vezes com nanofiltros. Misturou-se 0,5 mL de extracto, 0,5 mL de tampão de fosfato de potássio 1 M, a pH 7, 54 mu de enzima parcialmente purificada de Nocardioides albus ATCC 55425 (SC 13911) (ver o exemplo 11 anterior) e 4 mL de água, durante 48 horas e à temperatura de 28°C, utilizando um aparelho ‘Fisher Roto Rack’. Preparou-se uma amostra de contraprova que não recebeu nenhuma enzima. Extraiu-se as amostras com cloreto de metileno e dissolveu-se em metanol os extractos evaporados para se efectuar a análise pelo método 2 de CLER. Os resultados obtidos estão agrupados no quadro 6 seguinte.

Quadro 6

Hidrólise de extracto de rebentos

Enzima de 10-DAB bac-III cef XDT taxol mg/mL mg/mL mg/mL mg/mL mg/mL Nenhuma 0,167 0,142 0,243 0,246 0,401 SC13911 0,400 0,771 0,000 0,027 0,000 Enzima de 10-DAT taxolC (DAB+BVftaxol inicial·) mg/mL mg/mL rendimento molar % Nenhuma 0,201 vestígios 116,8 SC 13911 0,014 0,000 436,3

No quadro 6: 10-DAB designa a 10-desacetilbacatina Π1, bac-ΙΠ ou B designa a bacatina ΙΠ; cef designa a cefalomanina; XDT designa o 7-xilosil-10-desacetiltaxol; 10-DAT designa o 10-desacetiltaxol.

Lisboa, 05 de Abril de 2000

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Claims (35)

1 1> Reivindicações 1. Método para preparar pelo menos um taxano que possua um grupo hidroxilo ligado directamente em C-10, o qual compreende os passos que consistem em fazer contactar pelo menos um taxano que possua um grupo aciloxi ligado directamente em C-10 com uma enzima ou com um microrganismo capaz de catalisar a hidrólise do referido grupo aciloxi para gerar um grupo hidroxilo e em efectuar depois a referida hidrólise.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que se prepara pelo menos um taxano portador de um grupo hidroxilo em C-10 que satisfaça à fórmula estrutural I seguinte:

em que o símbolo R1 representa um grupo hidroxilo ou aciloxi; o símbolo R representa um átomo de hidrogénio ou de flúor ou um grupo hidroxilo ou xilosilo ou um grupo de uma das fórmulas gerais R6-C(0)-0 ou R6-0-C(0)-0-; cada um dos símbolos R3 e R4 representa independentemente um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo, alcenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalcenilo, arilo ou um heterociclo; o símbolo R5 representa um grupo de protecção do radical hidroxilo; e o símbolo R6 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo, alcenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalcenilo, arilo ou um heterociclo, 2 ou um seu sal, fazendo reagir pelo menos um taxano portador de um grupo aciloxi em C-10 e que satisfaz à fórmula estrutural 11 seguinte:

em que 12 3 4 os símbolos R , R , R e R possuem as significações definidas antes; e o símbolo R1 2 3 4 representa um grupo aciloxi, ou um seu sal, com uma enzima ou um microrganismo capaz de catalisar a hidrólise do referido grupo aciloxi R4 para gerar um grupo hidroxilo.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o taxano portador de um grupo aciloxi, utilizado como material de partida no referido método de hidrólise, é constituído por uma mistura de taxanos portadores de grupos aciloxi. 1 Método para preparar pelo menos um taxano que possua um grupo aciloxi ligado di- 2 rectamente em C-10, o qual compreende os passos que consistem em fazer contactar 3 pelo menos um taxano que possua um grupo hidroxilo ligado directamente em C-10 4 com um agente de acilação e com uma enzima ou com um microrganismo capaz de 3 catalisar a esterificação do referido grupo hidroxilo para gerar um grupo aciloxi e em efectuar depois a referida esterificação.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que se prepara pelo menos um taxano portador de um grupo aciloxi em C-10 que satisfaça à fórmula estrutural Π seguinte:

em que o símbolo R1 representa um grupo hidroxilo ou aciloxi; o símbolo R2 representa um átomo de hidrogénio ou de flúor ou um grupo hidroxilo ou xilosilo ou um grupo de uma das fórmulas gerais R5-0-, R6-C(0)-0 ou R6-0-C(0)-0-; cada um dos símbolos R3 e R4 representa independentemente um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo, alcenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalcenilo, arilo ou um heterociclo; o símbolo R5 representa um grupo de protecção do radical hidroxilo; o símbolo R6 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo, alcenilo, alqui-nilo, cicloalquilo, cicloalcenilo, arilo ou um heterociclo, e o símbolo R7 representa um grupo aciloxi, ou um seu sal, fazendo contactar pelo menos um taxano portador de um grupo hidroxilo em C-10 e que satisfaz à fórmula estrutural I seguinte: 4

em que os símbolos R1, R2, R3 e R4 possuem as significações definidas antes, ou um seu sal, com um agente de acilação e com uma enzima ou um microrganismo capaz de catalisar a esterificação do grupo hidroxilo em C-10 para formar o referido grupo aciloxi R7.

6. Método de acordo com a reivindicação 4, em que o taxano portador de um grupo hidroxilo, utilizado como material de partida no referido método de esterificação, é constituído por uma mistura de taxanos portadores de grupos hidroxilo.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a referida mistura de taxanos é obtida criando em cultura células vegetais de tecidos de plantas, e/ou por extracção a partir de tais tecidos, pertencendo a referida planta ao género Taxus.

8. Método de acordo com a reivindicação 4, em que o referido agente de acilação é um composto que satisfaz à fórmula estrutural IV seguinte: Rn-C(0)-L (IV) em que 5 o símbolo R11 representa um grupo alquilo, alcenilo, alquinilo, arilo, cicloalquilo, ciclo-alcenilo ou um heterociclo, e o símbolo L representa um grupo removível que pode ser deslocado para formar um grupo éster.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que o referido agente de acilação é o acetato de vinilo.

10. Enzima capaz de catalisar a hidrólise do referido grupo aciloxi no método de acordo com a reivindicação 1, ou capaz de catalisar a esterificação do referido grupo hidroxilo para gerar um grupo aciloxi no método de acordo com a reivindicação 4, sendo a referida enzima isolada a partir de Nocardioides luíeus ATCC 55426 (SC 13912).

11. Método para preparar pelo menos um taxano que possua um grupo hidroxilo ligado di-rectamente em C-13, o qual compreende os passos que consistem em fazer contactar pelo menos um taxano que possua um grupo aciloxi ligado directamente em C-13 com uma enzima ou com um microrganismo capaz de catalisar a hidrólise do referido grupo aciloxi para gerar um grupo hidroxilo e em efectuar depois a referida hidrólise.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que se prepara pelo menos um taxano portador de um grupo hidroxilo em C-13 que satisfaça à fórmula estrutural V seguinte: 6

em que o símbolo R12 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo hidroxilo ou um grupo de uma das fórmulas gerais R3-0-, R6-C(0)-0 ou R6-0-C(0)-0-; o símbolo R2 representa um átomo de hidrogénio ou de flúor ou um grupo hidroxilo ou xilosilo ou um grupo de uma das fórmulas gerais R5-0-, R6-C(0)-0 ou R6-0-C(0)-0-; cada um dos símbolos R3 e R4 representa independentemente um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo, alcenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalcenilo, arílo ou um heterociclo; o símbolo R3 representa um grupo de protecção do radical hidroxilo; e o símbolo R6 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo, alcenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalcenilo, arílo ou um heterociclo, ou um seu sal, fazendo reagir pelo menos um taxano portador de um grupo aciloxi em C-13 e que satisfaça à fórmula estrutural VI seguinte:

em que 7 os símbolos R12, R2, R3 e R4 possuem as significações definidas antes; e o símbolo R7 representa um grupo aciloxi, ou um seu sal, com a referida enzima ou microrganismo.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que o referido taxano de fórmula estrutural VI é seleccionado entre cefalomanina, 7-xilosil-10-desacetiltaxol, 10-desacetiltaxol, 7--xilosiltaxol, taxol-C e/ou taxol e o referido taxano de fórmula estrutural V é seleccionado entre bacatina ΙΠ, 10-desacetilbacatina ΠΙ, 7-xilosil-10-desacetilbacatina ΙΠ, 7-xilosil-lO-desacetilbacatina ΙΠ e/ou 7-xilosilbacatina ΙΠ.

14. Método de acordo com a reivindicação 12, em que o taxano portador de um grupo aciloxi, utilizado como material de partida no referido método de hidrólise, é constituído por uma mistura de taxanos portadores de grupos aciloxi que possuem diferentes cadeias laterais em C-Í3.

15. Método de acordo com a reivindicação 11, em que a referida enzima é uma hidrolase.

16. Método de acordo com a reivindicação 11, em que, a seguir à referida hidrólise, o referido taxano eventualmente único que possui um grupo hidroxilo ligado directamente em C-13, no qual os grupos hidroxilo em posições diferentes de C-13 são facultativamente protegidos, é acoplado com um composto que foima uma cadeia lateral aciloxi em C-13. 8 1

17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o taxol é preparado fundamentalmente pelo referido método que compreende a hidrólise e o acoplamento.

18. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o referido taxano de fórmula estrutural II é a bacatina ΙΠ e em que o referido taxano de fórmula estrutural I é a 10-desacetilbacatina m.

19. Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 3 ou 14, em que a referida mistura de taxanos é obtida criando em cultura células vegetais de tecidos de plantas, e/ou por extracção a partir de tais tecidos, pertencendo a referida planta ao género Taxus.

20. Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 1,4 e 11, em que se utiliza um microrganismo pertencente a um dos géneros seguintes: Nocardioides, Nocardia, Rhodococcus, Micropolyspora, Saccharopolyspora, Pseudonocardia, Oerskovia, Promicromonospora e Intrasporangium.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que se utiliza um microrganismo pertencente ao género Nocardioides.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o referido microrganismo é seleccionado entre o conjunto constituído por Nocardioides albus, Nocardioides flavus, Nocardioides fiilvus, Nocardioides luteus, Nocardioides simplex e Nocardioides thermolilacinus. 9

23. Método de acordo com a reivindicação 22, em que o referido microrganismo é seleccionado entre o conjunto constituído por Nocardioides albus ATCC 55424 (SC 13910), Nocardioides albus ATCC 55425 (SC 13911) e Nocardioides luteus ATCC 55426 (SC 13912).

24. Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 1,4 e 11, em que a referida enzima deriva de um microrganismo pertencente a um dos géneros seguintes: Nocardioides, Nocardia, Rhodococcus,Micropolyspora, Saccharopolyspora, Pseudonocardia, Oerskovia, Promicromonospora e Intrasporangium.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, em que a referida enzima é obtida a partir de um microrganismo pertencente ao género Nocardioides.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que a referida enzima é obtida a partir de um microrganismo seleccionado entre o conjunto constituído por Nocardioides albus, Nocardioides flavus, Nocardioides fulvus, Nocardioides luteus, Nocardioides simplex e Nocardioides thermolilacinus.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, em que a referida enzima é obtida a partir de um microrganismo seleccionado entre o conjunto constituído por Nocardioides albus ATCC 55424 (SC 13910), Nocardioides albus ATCC 55425 (SC 13911) e Nocardioides luteus ATCC 55426 (SC 13912). 10

28. Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 4, em que o produto de taxano obtido é utilizado para a preparação de um taxano portador de um grupo aciloxi em C-13.

29. Método para seleccionar um microrganismo que seja capaz, ao contactar com um taxano que possui um grupo aciloxi ligado directamente em C-13, de hidrolisar o referido grupo aciloxi para formar um grupo hidroxilo directamente ligado a C-13, o qual consiste nos passos seguintes: (a) seleccionar um meio de crescimento em fase sólida (i) no qual o microrganismo que se pretende pesquisar possa crescer, (ii) no qual o taxano de partida, portador de um grupo aciloxi em C-13, seja insolúvel e por esse motivo, em mistura com o meio de crescimento, tenha um aspecto turvo e (iii) no qual o taxano, portador de um grupo hidroxilo em C-13, e facultativamente o desejado produto clivado de cadeia lateral em C-13, sejam solúveis, e por isso, em mistura com o meio de crescimento, tenha um aspecto límpido; (b) fazer contactar o referido microrganismo com o meio de crescimento seleccionado no passo (a) anterior, com o qual se misturou o taxano de partida portador de um grupo aciloxi em C-13, em condições que permitam o crescimento do microrganismo; e (c) verificar se aparece uma zona límpida a circundar a área em que tem lugar o crescimento do microrganismo, significando isso que o referido microrganismo é capaz de realizar a referida hidrólise.

30. Método para seleccionar um microrganismo que seja capaz, ao contactar com um taxano que possui um grupo aciloxi ligado directamente em C-13, de hidrolisar o referido grupo aciloxi para formar um grupo hidroxilo directamente ligado a C-13, o qual consiste nos passos seguintes: 11 (a) seleccionar um meio de crescimento em fase sólida (i) no qual o microrganismo que se pretende pesquisar possa crescer, (ii) no qual o taxano de partida, portador de um grupo aciloxi em C-13, seja solúvel, e por esse motivo, em mistura com o meio de crescimento, tenha um aspecto límpido e (iii) no qual o taxano, portador de um grupo hidroxilo em C-13, e facultativamente o desejado produto clivado de cadeia lateral em C-13, sejam insolúveis, e por isso, em mistura com o meio de crescimento, tenha um aspecto turvo; (b) fazer contactar o referido microrganismo com o meio de crescimento seleccionado no passo (a) anterior, com o qual se misturou o taxano de partida portador de um grupo aciloxi em C-13, em condições que permitam o crescimento do microrganismo; e (c) verificar se aparece uma zona turva a circundar a área em que tem lugar o crescimento do microrganismo, significando isso que o referido microrganismo é capaz de realizar a referida hidrólise.

31. Microrganismo Nocardioides albus ATCC 55424, o qual é biologicamente puro.

32. Microrganismo Nocardioides albus ATCC 55425, o qual é biologicamente puro.

33. Microrganismo Nocardioides luíeus ATCC 55426, o qual é biologicamente puro.

34. Enzima capaz de catalisar a hidrólise do referido grupo aciloxi para gerar um grupo hidroxilo no método de acordo com a reivindicação 11, em que a referida enzima é isolada a partir de Nocardioides albus ATCC 55424. 12

35. Enzima capaz de catalisar a hidrólise do referido grupo aciloxi para gerar um grupo hidroxilo no método de acordo com a reivindicação 11, em que a referida enzima é isolada a partir de Nocardioides albus ATCC 55425.

36. Enzima capaz de catalisar a hidrólise do referido grupo aciloxi para gerar um grupo hidroxilo no método de acordo com a reivindicação 11, em que a refenda enzima é isolada a partir de Nocardioides luteus ATCC 55426. Lisboa, 05 de Abril de 2000 0 AGENTE OFICIAL DE PROPRIEDADE INDUSTRIAL

JOÃO CARLOS SARB1NA W BARROS IgenU OJicluí ie Ρτορπ?ίαώ hyiuslml Pr aço Qocufc u j tf ceira, il-ol 2 j'J dSCQA Telefone: 213424504 - F ax: 213424531 ;ítíqI .(SBOA 1 Resumo “Métodos de hidrólise enzimática para a preparação de taxanos portadores de grupos hidroxilo em C-10 e C-13, método de esterificação enzimática para a preparação de taxanos portadores de grupos aciloxi em C-10 e sua utilização para a preparação de taxanos portadores de grupos aciloxi em C-13” A invenção proporciona um método de hidrólise enzimática em que se faz contactar um ou vários taxanos portadores de grupos aciloxi em C-10 com uma enzima ou um microrganismo capaz de catalisar a hidrólise dos referidos grupos aciloxi para gerar grupos hidroxilo. A invenção também proporciona um método de esterificação enzimática em que se faz contactar um ou vários taxanos portadores de grupos hidroxilo em C-10 com um agente de acilação ou com uma enzima ou um microrganismo capaz de esterificar os referidos grupos hidroxilo para formar grupos aciloxi. A invenção proporciona ainda um método de hidrólise enzimática em que se faz contactar um ou vários taxanos portadores de grupos aciloxi em C-13 com uma enzima ou um microrganismo capaz de catalisar a hidrólise dos referidos grupos aciloxi para gerar hidroxilo. Os métodos são especialmente úteis para a preparação de compostos que podem ser utilizados como intermediários para a preparação de taxanos tais como o taxol.