KR100347839B1 - C-7당을c-7히드록실탁산으로전환시키기위한효소적가수분해방법 - Google Patents

C-7당을c-7히드록실탁산으로전환시키기위한효소적가수분해방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100347839B1
KR100347839B1 KR1019950000453A KR19950000453A KR100347839B1 KR 100347839 B1 KR100347839 B1 KR 100347839B1 KR 1019950000453 A KR1019950000453 A KR 1019950000453A KR 19950000453 A KR19950000453 A KR 19950000453A KR 100347839 B1 KR100347839 B1 KR 100347839B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
taxane
bacillus
microorganism
hydrolysis
atcc
Prior art date
Application number
KR1019950000453A
Other languages
English (en)
Other versions
KR950032632A (ko
Inventor
로날드엘.핸슨
라메쉬엔.페이텔
라즐로제이.스자르카
Original Assignee
브리스톨-마이어스스퀴브컴파니
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 브리스톨-마이어스스퀴브컴파니 filed Critical 브리스톨-마이어스스퀴브컴파니
Publication of KR950032632A publication Critical patent/KR950032632A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100347839B1 publication Critical patent/KR100347839B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/09—Bacillus circulans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/265—Micrococcus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2407/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving terpenes
    • G01N2407/02—Taxol; Taxanes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 1종 이상의 C-7 당 함유 탁산, 바람직하게는 C-7 크실로실 함유 탁산을, 이 당기를 히드록실기로 가수분해시킬 수 있는 효소 또는 미생물과 접촉시키는 것으로 이루어지는 효소적 가수분해 방법에 관한 것이다.

Description

C-7 당을 C-7 히드록실 탁산으로 전환시키기 위한 효소적 가수분해 방법
본 발명은 C-7 당 함유 탁산, 특히 C-7 크실로실 함유 탁산을 C-7 히드록실 함유 탁산으로 전환시키기 위한 효소적 가수분해 방법에 관한 것이다. 생성 화합물은 팩클리탁셀 및 팩클리탁셀 동족체와 같은 약리학적 활성 탁산이거나, 또는 이러한 약리학적 활성 탁산의 제조시에 중간체로서 유용한 화합물일 수 있다.
탁산은 제약 분야에서 효용성을 발견할 수 있는 디테르펜 화합물이다. 예를들면, 다음 구조를 갖는 탁산인 팩클리탁셀(Taxol?)은 유효한 항암제인 것으로 밝혀졌다.
상기 식들 중, Ph는 페닐이고, Ac는 아세틸이고, Bz는 벤조일이다.
팩클리탁셀과 같은 천연 탁산은 식물 재료에서 발견될 수 있으며, 그로부터 단리되어 왔다. 그러나, 이러한 탁산은 식물 재료에 비교적 소량으로 존재하기 때문에, 예들 들어 팩클리탁셀의 경우에는 이 화합물의 공급원을 형성하는 서서히 성장하는 주목속 나무가 다량 필요할 수도 있다. 따라서, 당업계에서는 팩클리탁셀과 같은 천연 탁산뿐만 아니라 이들의 합성 동족체를 제조하는 반합성적 방법을 포함하여 합성 방법을 끊임없이 찾아왔다.
C-7 위치에 히드록실기를 갖는 탁산은, 약리학적으로 활성인 최종 생성물(예, 팩클리탁셀)과 이러한 약리학적으로 활성인 최종 생성물의 반합성적 제조를 위한 중간체(예, 배카민 Ⅲ 및 10-데스아세틸배카틴 Ⅲ)로서 모두 특별한 관심의 대상이 되고 있다. 그러나, 탁산은 예를 들어 C-7 위치에서 히드록실기가 아닌 글리코시드 결합을 통해 결합되어 있는 크실로실기를 함유하는 식물 재료를 추출하는 방법 등에 의해 얻을 수도 있다. 따라서, 당 함유 탁산, 특히 크실로실 함유 탁산을 C-7 위치에 히드록실기를 함유하는 탁산으로 전환시키는 방법은 상기한 바람직한 히드록실 화합물의 생산을 증강시키는데 유용할 것이다.
본 발명은 대응하는 C-7 당 함유 탁산, 특히 C-7 크실로실 함유 탁산으로부터 C-7 히드록실 함유 탁산을 제조하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 C-7 위치에 직접 결합된 당기를 함유하는 1종 이상의 탁산을 이 당기를 히드록실기로 가수분해시키는데 촉매 작용을 할 수 있는 효소 또는 미생물과 접촉시키는 단계 및 상기 가수분해를 수행하는 단계로 이루어지는, C-7 위치에 직접 결합된 히드록실기를 함유하는 1종 이상의 탁산의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 C-7 당 함유 탁산으로부터 C-7 히드록실 함유 탁산을 제조하는 효과적인 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 따르면, 하나의 탁산이 가수분해되거나, 또는 상이한 탁산의 혼합물이 순차적으로 또는 동시에 가수분해될 수 있다. 바람직한 태양에서, 예를 들어 식물 재료의 추출에 의해 얻을 수 있는 탁산의 혼합물은 본 발명 방법에 따라 가수분해될 수 있다. 출발 물질로서 사용될 상기한 혼합물은 가수분해될 1종 이상의 C-7 당 함유 탁산이외에, C-7 위치에 당기가 아닌 히드록실기와 같은 다른 기들을 함유하는 탁산으로 이루어질 수 있다. 본 발명을 이하에서 보다 상세히 설명한다.
바람직한 태양에서, 본 발명은 하기 일반식(Ⅱ)를 갖는 1종 이상의 C-7 당함유 탁산 또는 그의 염을 이 C-7 당기를 히드록실기로 가수분해시키는데 촉매 작용을 할 수 있는 효소 또는 미생물과 접촉시켜 가수분해를 수행하는 것으로 이루어지는, 하기 일반식(I)을 갖는 1종 이상의 C-7 히드록실 제공 탁산 또는 그의 염의 제조 방법을 제공한다.
상기 식들 중,
R1은 히드록실 또는 아실옥시이고, 여기서 특히 Rl은 이후에 기재되는 일반식(Ⅲ)의 구조를 갖고,
R2는 아실옥시(특히, 알킬카르보닐옥시) 또는 히드록실이고,
R3및 R4는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아릴 또는 헤테로시클로이고,
"sugar"는 C-7 위치에 직접 결합된 당기이다.
본 발명의 가수분해 방법에서는 일반식(Ⅰ) 및 (Ⅱ)의 화합물의 불특정 키랄 중심의 모든 입체배치가, 단독으로(즉, 실질적으로 다른 입체이성질체없이) 또는 다른 형태의 입체이성질체와의 혼합물로서 고려된다.
상기한 바와 같이, 본 발명 방법은 탁산의 혼합물이, 예를 들어 탁산의 1종 이상이 C-7 위치에 당기를 함유하는 다른 탁산과의 혼합물로서 팩클리탁셀을 제공하는 식물 재료의 추출에 의해 얻어지고, 여기서 최종적으로 목적하는 것이 팩클리탁셀과 같은 C-7 히드록실 탁산인 경우 특히 유용하다.
본 발명의 방법에서, 출발 물질인 탁산의 C-7기의 입체배치는 바람직하게는 그 생성물에 보유된다. C-7 치환체는 바람직하게는 팩클리탁셀의 C-7 히드록실기와 동일한 절대적 입체배치를 갖는다.
정의
본 명세서에서, "효소적 공정" 또는 "효소적 방법"이란 효소 또는 미생물을 사용하는 본 발명의 공정 또는 방법을 의미한다. 또한, 본 명세서에서 "가수분해"란 당기를 히드록실기로 전환시키는 것을 의미하며, 예를 들어 본 발명 방법에 따라 물 및(또는) 적합한 유기 알코올과 접촉시킴으로써 행할 수 있다. 본 발명 방법에서 "효소 또는 미생물"의 사용은 1종뿐만 아니라 2종 이상의 효소 또는 미생물의 사용을 포함한다.
본 명세서에서 "당"이란 단당류, 이당류, 올리고당류 또는 다당류, 특히 갈락토오스, 글루코오스, 만노스, 아라비노스, 리보오스, 바람직하게는 크실로오스, 또는 크실로실-크실로오스 등의 이들의 이당류와 같은 5- 및 6원 고리 당류를 의미한다. "C-7 위치에 직접 결합된 당기"란 탁산 잔기의 C-7 위치에 대한 글리코시드 결합을 통하여 직접 결합된 당을 의미한다. 바람직한 당기는 다음 구조를 갖는 크실로실기들이다.
상기 식 중, 파상 선은 α 또는 바람직하게는 β 배치를 의미한다.
본 명세서에서 단독으로 또는 다른 기의 일부로서 사용된 "알킬" 또는 "알크"는 바람직하게는 통상의 사슬에 1 내지 12개의 탄소 원자를 함유하는, 임의로 치환된 직쇄 및 분지쇄 포화 탄화수소기를 의미한다. 이러한 비치환 기의 일례를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, 펜틸, 헥실, 이소헥실, 헵틸, 4,4-디메틸펜틸, 옥틸, 2,2,4-트리메틸펜틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실 등이 있다. 이러한 치환체의 일례를 들면, 할로, 알콕시, 일킬티오, 알케닐, 알키닐, 아릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 히드록시 또는 보호된 히드록시, 카르복실(-COOH), 알콕시카르보닐, 알킬카르보닐옥시, 카르바모일(NH2-CO-), 아미노(-NH2), 모노- 또는 디알킬아미노, 또는 티올(-SH)이 있다.
본 명세서에서 단독으로 또는 다른 기의 일부로서 사용된 "저급 알크" 또는 "저급 알킬"은 통상의 사슬에 1 내지 4개의 탄소 원자를 함유하는 알킬에 대해 상기한 바와 같이 임의로 치환된 기를 의미한다.
본 명세서에서 단독으로 또는 다른 기의 일부로서 사용된 "알콕시" 또는 "알킬티오"는 각각 산소 결합(-O-) 또는 황 결합(-S-)을 통해 결합된 상기한 알킬기를 의미한다. 본 명세서에서 단독으로 또는 다른 기의 일부로서 사용된 "알킬옥시카르보닐"은 카르보닐기를 통해 결합된 알콕시기를 의미한다. 본 명세서에서 단독으로 또는 다른 기의 일부로서 사용된 "알킬카르보닐옥시"는 산소 결합을 통해 결합되어 있는 카르보닐기를 통해 결합된 알킬기를 의미한다. 본 명세서에서 단독으로 또는다른 기의 일부로서 사용된 "모노알킬아미노" 또는 "디알킬아미노"는 상기한 바와 같이 1 또는 2개의 알킬기로 각각 치환된 아미노기를 의미한다.
본 명세서에서 단독으로 또는 다른 기의 일부로서 사용된 "알케닐"은 1개 이상의 탄소 대 탄소 이중 결합을 추가로 함유하는, 알킬에 대해 상기한 바와 같이 임의로 치환된 기를 의미한다. 이러한 치환체의 일례를 들면, 상기한 바와 같은 1 이상의 알킬기 및(또는) 알킬 치환체로서 상기한 1 이상의 기가 있다. 본 명세서에서 단독으로 또는 다른 기의 일부로서 사용된 "알케닐옥시"는 산소 결합(-O-)을 통해 결합된 상기한 바와 같은 알케닐기를 의미한다.
본 명세서에서 단독으로 또는 다른 기의 일부로서 사용된 "알키닐"은 1개 이상의 탄소 대 탄소 삼중 결합을 추가로 함유하는, 알킬에 대해 상기한 바와 같이 임의로 치환된 기를 의미한다. 이러한 치환체의 일례를 들면, 상기한 바와 같은 1 이상의 알킬기 및(또는) 알킬 치환체로서 상기한 1 이상의 기가 있다. 본 명세서에서 단독으로 또는 다른 기의 일부로서 사용된 "알키닐옥시"는 산소 결합(-O-)을 통해 결합된 상기한 바와 같은 알키닐기를 의미한다.
본 명세서에서 단독으로 또는 다른 기의 일부로서 사용된 "시클로알킬"은 바람직하게는 1 내지 3개의 고리와 한 고리당 3 내지 7개의 탄소 원자를 함유하는, 임의로 치환된 포화 카르보시클릭 고리계를 의미한다. 이러한 비치환 기의 일례를 들면, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸, 시클로데실, 시클로도데실 및 아다만틸이 있다. 이러한 치환체의 일례를 들면, 상기한 바와 같은 1 이상의 알킬기 및(또는) 알킬 치환체로서 상기한 1 이상의 기가 있다. 본 명세서에서 단독으로 또는 다른 기의 일부로서 사용된 "시클로알킬옥시"는 산소 결합(-O-)을 통해 결합된 상기한 바와 같은 시클로알킬기를 의미한다.
본 명세서에서 단독으로 또는 다른 기의 일부로서 사용된 "시클로알케닐"은 부분적으로 불포화 고리를 형성하는 1개 이상의 탄소 대 탄소 이중 결합을 추가로 함유하는, 시클로알킬에 대해 상기한 바와 같이 임의로 치환된 기를 의미한다. 이러한 치환체의 일례를 들면, 상기한 바와 같은 1 이상의 알킬기 및(또는) 알킬 치환체로서 상기한 1 이상의 기가 있다. 본 명세서에서 단독으로 또는 다른 기의 일부로서 사용된 "시클로알케닐옥시"는 산소 결합(-O-)을 통해 결합된 상기한 바와 같은 시클로알케닐기를 의미한다.
본 명세서에서 단독으로 또는 다른 기의 일부로서 사용된 "아르" 또는 "아릴"은 바람직하게는 1 또는 2개의 고리와 6 내지 12개의 고리 탄소 원자를 함유하는, 임의로 치환된 포화 카르보시클릭 방향족 기를 의미한다. 이러한 비치환 기의 일례를 들면, 페닐, 비페닐 및 나프틸이 있다. 치환체의 일례를 들면, 상기한 바와 같은 1개 이상, 바람직하게는 3개 이하의 니트로기, 알킬기 및(또는) 알킬 치환체로서 상기한 기들이 있다. 본 명세서에서 단독으로 또는 다른 기의 일부로서 사용된 "아릴옥시"는 산소 결합(-O-)을 통해 결합된 상기한 바와 같은 아릴기를 의미한다.
본 명세서에서 단독으로 또는 다른 기의 일부로서 사용된 "헤테로시클로" 또는 "헤테로시클릭"은 적어도 하나의 고리에 1개 이상의 헤테로 원자를 갖는, 임의로 치환된 완전 포화 또는 불포화, 방향족 또는 비방향족 시클릭기, 바람직하게는각 고리에 5 또는 6개의 원자를 갖는 모노시클릭 또는 비시클릭기를 의미한다. 헤테로시클로기는 예를 들면, 고리에 1 또는 2개의 산소 원자, 1 또는 2개의 항원자 및(또는) 1 내지 4개의 질소 원자를 갖는다. 각 헤테로시클로기는 고리계의 임의의 탄소 또는 헤테로원자를 통해 결합될 수 있다. 이러한 헤테로시클로기의 일례를 들면, 티에닐, 푸릴, 피롤릴, 피리딜, 이미다졸릴, 피롤리디닐, 피페리디닐, 아제피닐, 인돌릴, 이소인돌닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 벤조티아졸릴, 벤족사졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤족사디아졸릴, 및 벤조푸라자닐이 있다. 치환체의 일례를 들면, 상기한 바와 같은 1개 이상의 알킬기 및(또는) 알킬 치환체로서 상기한 1 이상의 기들이 있다. 본 명세서에서 단독으로 또는 다른 기의 일부로서 사용된 "헤테로시클로옥시"는 산소 결합(-O-)을 통해 결합된 상기한 바와 같은 헤테로시클로기를 의미한다.
본 명세서에서 단독으로 또는 다른 기의 일부로서 사용된 "할로겐" 또는 "할로"는 염소, 브롬, 불소 및 요오드를 의미한다.
본 명세서에서 "탁산"이란 후술되는 바와 같이 탁산 잔기를 함유하는 화합물을 의미한다. 본 명세서에서 "탁산 잔기"란 치환될 수 있고 그 고리계가 에틸렌성 불포화될 수 있는, 다음의 코어 구조(본 명세서에서 사용된 고리계의 위치를 수로나타냄)를 함유하는 잔기를 의미한다.
팩클리탁셀에서 발견된 바와 같이, 제4 및 5위치에 융합된 옥세탄 고리를 갖고 C-11위치와 C-12 위치 사이에 에틸렌성 이중 결합을 갖는 이러한 잔기가 바람직하다.
명세서에서 "히드록시(또는 히드록실) 보호기"란 그것이 사용되는 반응 이후에 그 분자의 잔부를 방해하지 않고서 제거할 수 있는, 유리 히드록실기를 보호할 수 있는 임의의 기를 의미한다. 이러한 기들의 일례와 이들의 합성법은 문헌["Protective Groups in Organic Synthesis," 그린(T. W. Greene), John Wiley and Sons, 1981 또는 Fieser & Fieser]에서 찾아볼 수 있다.
본 명세서에서 "염"이란 무기 및(또는) 유기 산 및 염기로 형성된 산성 및 (또는) 염기성 염을 의미한다.
본 명세서에서 단독으로 또는 다른 기의 일부로서 사용된 "아실"은 유기 카르복실산의 -COOH기로부터 히드록실기를 제거함으로써 형성된 잔기를 의미한다. 본 명세서에서 단독으로 또는 다른 기의 일부로서 사용된 "아실옥시"는 산소 결합 (-O-)을 통해 결합된 상기한 바와 같은 아실기를 의미한다.
출발 물질
본 발명에 대한 출발 물질로서 사용되는 C-7 당 함유 탁산은 상기한 효소적 가수분해 방법을 수행할 수 있는 그러한 임의의 화합물이다. 이러한 출발 물질은 바람직하게는 단독 또는 서로 다른 탁산 또는 다른 탁산들과의 혼합물로서, 천연적으로 형성될 수 있는 크실로실 함유 탁산, 예컨대 7-크실로실탁솔, 7-크실로실-10-데스아세틸탁솔, 7-크실로실배카틴 Ⅲ, 7-크실로실-10-데스아세틸배카틴 Ⅲ, 7-크실로실세팔로만닌, 7-크실로실-10-데아세틸세팔로만닌, 7-크실로실탁솔 C 또는 7-크실로실-10-데아세틸탁솔 C이다. "천연적으로 형성된" 탁산 출발 물질은 바람직하게는 탁산 생성 식물 조직, 특히 탁수스(Taxus)속 식물, 예컨대 탁수스 배카타(Taxus baccata), 탁수스 쿠스피다타(Taxus cuspidata), 탁수스 브레비 폴리아(Taxus brevifolia), 탁수스 왈리키아나(Taxus wallichiana), 탁수스 미디아(Taxus media), 탁수스 히크시이(Taxus hicksii), 특히 탁수스 엑스, 미디아 히크시이(Taxus x, media hicksii) 조직의 식물 세포 배양물 및(또는) 이들의 추출물에 의해 얻어지거나 또는 상기 탁수스속 식물로부터 유도된다. 이러한 식물 조직의 일례를 들면, 뿌리, 잎, 껍질 및 전체 묘목(seedling)이 포함된다. 본 발명 방법의 C-7 크실로실 함유 탁산 출발 물질을 얻기 위한 바람직한 방법 및 이에 대한 설명들은, 예를 들어 문헌[킹스톤(D.G.I. Kingston, Pharmac. Ther., 제52권, 제1-34 페이지(1991); 라오(K.V. Rao), Pharmaceutical Research, 제10권, 4호, 제521-524 페이지(1993); 및 세닐(V. Senilh) 외 공저, J. Nat, Prod., 47, 제 131-137페이지(1984)]을 참조할 수 있다.
본 발명의 가수분해 방법을 위한 C-7 당 함유 탁산 출발 물질은 또한 탁산의C-7 위치에 당기를 첨가하여 얻을 수도 있다. 이러한 물질을 제공하는 한 방법은 C-7 히드록실 함유 탁산을 C-7 위치에 당기를 제공하는 대응 탁산으로 효소적으로 전환시키는 것이며, 이 방법은 신규하다. 따라서, 본 발명은 C-7 위치에 직접 결합된 히드록실기를 함유하는 1종 이상의 탁산(바람직하게는 상기 일반식(I)의 탁산)을 당 존재하에 C-7 위치에서 상기 히드록실기를 당기로 전환시키는데 촉매 작용을 할 수 있는 효소 또는 미생물과 접촉시키는 단계 및 이러한 전환을 수행하는 단계로 이루어지는, C-7 위치에 직접 결합된 당기를 함유하는 1종 이상의 탁산(바람직하게는 상기 일반식(Ⅱ)의 탁산)의 제조 방법을 추가로 제공한다. 사용된 효소 또는 미생물은 상기한 당기로의 전환에 있어서 촉매 작용을 할 수 있는 임의의 효소 또는 미생물일 수 있고, 바람직하게는 본 발명의 가수분해 방법에서 사용하기 위한 것이되, 역 반응에 유리한 조건 하에서 사용되는 후술되는 효소 또는 미생물이다. 반응 매질, 온도, pH 등의 반응 조건들은 본 발명의 효소적 가수분해 방법을 위한 것으로 후술된 조건들 중에서 선택될 수도 있으나, 이들 조건들은 당 기의 첨가를 유리하게 하기 위해 물의 존재량을 최소화시키는 것과 같이 변화시킬 수도 있다.
일 태양에서, C-7 당 함유 탁산은 상기한 효소적 방법에 의해 대응하는 C-7 히드록실 함유 탁산으로부터 제조할 수 있으며, 이렇게 제조된 탁산은 당기가 히드록실 보호기로 작용하는 동안에 C-7 이외의 위치에서 필요에 따라 하기 유용성 부분에서 후술하는 바와 같이 변형되고, 이어서 본 발명의 방법에 따른 효소적 가수분해에 의해 최종적으로 C-7 위치에 직접 결합된 히드록실기를 함유하는 탁산을 생성한다.
효소 및 미생물
본 발명의 가수분해 방법에서 사용된 효소 또는 미생물은 본 발명의 효소적 가수분해 방법에 었어서 촉매 작용을 할 수 있는 임의의 효소 또는 미생물일 수 있다. 효소 또는 미생물 물질은 그 기원 또는 순도와는 무관하게 유리 상태로 또는 물리적 흡착 또는 포착에 의한 방법과 같은 지지체 상의 부동화 상태로 사용될 수 있다.
이러한 미생물의 일례를 들면, 플라보박테리움(Flavobacterium), 아시네토박터(Acinetobactar), 모락셀라(Moraxella), 바실루스(Baci1lus), 스포롤락토바실루스(Sporolactobaci1lus), 클로스트리디움(Clostridium), 데술포토마쿨룸(Desulfotomaculum), 스포로사르시나(Sporosarcina), 오실로스피라(Osci1lospira), 플라노코쿠스(Planococcus), 락토바실루스(Lactobaci1lus), 쿠르리아(Kurthia), 마이크로코쿠스(Micrococcus), 스토마토코쿠스(Stomatococcus), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 아르트로박터(Arthrobacter), 네이쎄리아(Neisseria) 또는 킹겔라(Kingella)속에 포함되는 것들이 있다. 바람직한 미생물은 마이크로코쿠스(Micrococcus)속에 포함되는 종들, 예컨대 마이크로코쿠스 루테우스(Micrococcus luteus), 마이크로코쿠스 일라에(Micrococcus Iylae), 마이크로코쿠스 바리안스(Micrococcus varians), 마이코로코쿠스 로세우스(Micrococcus roseus), 마이크로코쿠스 아길리스(Micrococcus agilis), 마이크로코쿠스 크리스티나에(Micrococcus kristinae), 마이크로코쿠스 니시노미야엔시스(Micrococcus nishinomiyaensis), 마이크로코쿠스세덴타리우스(Micrococcus sedentarius) 또는 마이크로코쿠스 할로비우스(Micrococcus halobius); 바실루스(Bacillus)속에 포함되는 종들, 예컨대 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실루스 투링기엔시스(Bacillus thuringiensis), 바실루스 마이코이데스(Bacillus mycoides), 바실루스 패스티디오수스(Bacillus fastidiosus), 바실루스 서큘란스(Bacillus circulans), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 바실루스 인솔리투스(Bacillus insolitus), 바실루스 렌투스(Bacillus lentus), 바실루스 팬토덴티쿠스(Bacillus pantothenticus), 바실루스 알칼로필루스(Bacillus alcalophilus), 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실루스 스파에리쿠스(Bacillus sphaericus), 바실루스 마리누스(Bacillus marinus), 바실루스 렌티모르부스(Bacillus lentimorbus), 바실루스 파스퇴리이(Bacillus pasteurii), 바실루스 아조토포르만스(Bacillus azotoformans), 바실루스 맥콰리엔시스(Bacillus macquariensis), 바실루스 글로비스포루스(Bacillus globisporus), 바실루스 라테로스포루스(Bacillus laterosporus), 바실루스 포필리아에(Bacillus popilliae), 바실루스 피르무스(Bacillus firmus), 바실루스 푸밀루스(Bacillus pumilus), 바실루스 숩틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 바디우스(Bacillus badius), 바실루스 폴리믹사(Bacillus polymyxa), 바실루스 알베이(Bacillus alvei), 바실루스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실루스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실루스 브레비스(Bacillus brevis), 바실루스 스테아로더모필루스(Bacillus stearothermophilus), 바실루스 마세란스(Bacillus macerans), 바실루스 아시도칼다리우스(Baci1lus acidocaldarius), 바실루스 슐레젤리이(Baci1lus schlegelii) 또는 바실루스 라바에(Bacillus larvae); 플라보박테리움(Flavobacterium)속에 포함되는 종들, 예컨대 플라보박데리움 악쿠아틸레(Flavobacterium acquatile), 플라보박테리움 브레베((Flavobacterium breve), 플라보박테리움 발루스티눔(Flavobacterium balustinum), 플라보박테리움 메닝고셉티쿰(Flavobacterium meningosepticum), 플라보박테리움 오도라툼(Flavobacterium odoratum), 플라보박테리움 멀티보룸(Flavobacterium multivorum) 또는 플라보박테리움 스피리티보룸(Flavobacterium spiritivorum); 및 특히 모락셀라(Moraxella)속에 포함되는 종들, 예컨대 모락셀라 (모락셀라) 라쿠나타(Moraxella (Moraxella) lacunata), 모락셀라 (모락셀라) 보비스(Moraxella (Moraxella) bovis), 모락셀라 (모락셀라) 논리쿠에파시엔스(Moraxella (Moraxella) nonliquefaciens), 모락셀라 (모락셀라) 아틀란타에(Moraxella (Moraxella) atlantae), 모락셀라 (모락셀라) 페닐피루비카(Moraxella (Moraxella) phenylpyruvica) 또는 모락셀라 (모락셀라) 오슬로엔시스(Moraxella (Moraxella) osloensis)와 같은 모락셀라 아속의 종, 또는 모락셀라 (브라나멜라) 카타랄리스(Moraxella (Branhamella) catarrhalis), 모락셀라 (브라나멜라) 카비아에(Moraxella (Branhamella) caviae), 모락셀라 (브라나멜라) 오비스(Moraxella (Branhamella) ovis) 또는 모락셀라 (브라나멜라) 쿠니쿨리(Moraxella (Branhamella) cuniculi)와 같은 브라나멜라 아속의 종에 포함되는 그러한 종들이다.
특히 바람직한 미생물은 모락셀라(Moraxella) sp. ATCC 55475, 바실루스 마세란스(Bacillus macerans) ATCC 55476, 바실루스 서큘란스(Bacillus circulans) ATCC 55477 및 마이크로코쿠스(Micrococcus) sp. ATCC 55478이다. 본 명세서에서 사용된 "ATCC"는 기탁된 미생물에 대한 수탁 기관인, 미합중국 20852 매릴랜드주 록크빌 파크로운 드라이브 12301 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션의 입수 번호를 의미한다. 상기 미생물은 1993년 9월 30일자로 기탁되었다.
생물학적으로 순수한 미생물인 모락셀라 sp. ATCC 55475, 바실루스 마세란스 ATCC 55476, 바실루스 서큘란스 ATCC 55477 및 마이크로코쿠스 sp. ATCC 55478은 신규한 미생물이다. 이러한 미생물의 돌연변이체 역시 화학적, 물리적(예컨대, 자외선 방사) 또는 생물학적 수단(예컨대, 분자 생물 기술에 의해)을 사용하여 변형시킨 것들과 같은, 본 명세서에서 설명한 가수분해 방법에 사용하기 위한 본 발명의 대상으로 고려된다는 것을 이해해야만 한다.
모락셀라 sp. ATCC 55475는 쇠고기 추출물 3.0g, 펩톤 10.0g, 염화나트륨 5.0g을 함유하고, pH 7.0으로 조정되며 121℃에서 20분간 무균화시킨 브로쓰(broth) 영양 배지 상에서 배양할 수 있다. 이러한 미생물의 특성은 다음과 같다: 그램 음성 로드(rod)형(1 내지 2 ㎛): 비운동성: 비포자 형성: 각종 배지 상에서의 호기성 성장; 테트라메틸-p-페닐렌디아민(미합중국 뉴저지주 델라웨어 갭 내셔날 레크리에이셔널 에어리어로 부터 입수한 토양 시료로부터 단리함)이 사용될 때에만 캐탈라제-양성 및 옥시다제-양성임.
바실루스 마세란스 ATCC 55476은 쇠고기 추출물 3.0g, 펩톤 10.0g, 염화나트륨 5.0g을 함유하고, pH 7.0으로 조정되며 121℃에서 20분간 무균화시킨 브로쓰 영양 배지 상에서 배양할 수 있다. 이러한 미생물의 특성은 다음과 같다: 그램 양성 로드형: 운동성: 포자 형성: 각종 배지 상에서의 호기성 성장: 캐탈라제-양성 및 옥시다제-양성, 약한 글루코오스 활용성, 젤라틴(미합중국 텍사스주 알링톤에서 입수한 토양 시료로부터 단리함)을 액화시킴.
바실루스 서큘란스 ATCC 55477은 쇠고기 추출물 3.0g, 펩톤 10.0g, 염화나트륨 5.0g을 함유하고, pH 7.0으로 조정되며 121℃에서 20분간 무균화시킨 브로쓰 영양 배지 상에 배양할 수 있다. 이러한 미생물의 특성은 다음과 같다: 그램 양성 로드형: 운동성, 포자 형성; 각종 배지 상에서의 호기성 성장: 캐탈라제-양성 및 옥시다제-양성; 약한 글루코오스 활용성: 젤라틴(미합중국 뉴저지주 헤밀톤 스퀘어에서 입수한 목재 시료로부터 단리함)을 액화시키지 않음.
마이크로코쿠스 sp. ATCC 55478은 쇠고기 후출물 3.0g, 펩톤 10.0g, 염화나트륨 5.0g을 함유하고, pH 7.0으로 조정되며 121℃에서 20분간 무균화시킨 브로쓰 영양 배지 상에서 배양할 수 있다. 이러한 미생물의 특성은 다음과 같다: 그램 양성 구형 코쿠스(직경 0.5 내지 1.5 ㎛); 세포들이 쌍 또는 덩어리로존재함; 비운동성; 비포자 형성; 각종 배지 상에서의 호기성 성장; 캐탈라제-양성 및 옥시다제-양성, 글루코오스가 발효됨(미합중국 뉴욕주 툭세도 헤리만 파크에서 입수한 토양 시료로부터 단리함).
또한, 본 발명은 본 발명의 효소적 가수분해를 일으킬 수 있는 미생물을 선택하기 위한 선별법을 제공한다. 본 발명의 방법에 따라 C-7 당 함유 탁산 출발 물질의 효소적 가수분해를 일으킬 수 있는 미생물을 선택하기 위한 바람직한 방법은
(i) 선별하고자 하는 미생물의 성장을 지지할 수 있는 성장 배지를 선택하는 단계,
(ii) 지시 화합물 글리코시드를 선택하는 단계,
(iii) 미생물의 성장이 일어나도록 미생물을 단계 (i)의 성장 배지와 접촉시키고, 이어서 단계 (ii)의 지시 화합물 글리코시드와 접촉시키는 단계,
(iv) 지시 화합물 글리코시드의 존재 하에서 미생물을 관찰하여 가수분해가 일어나는지 여부를 결정하는 단계, 및
(ⅴ) 상기 C-7 당 함유 탁산의 가수분해에 대해 미생물을 시험하는 단계로 이루어지는, 신규한 선별법을 이용하는 것이다.
본 명세서에서, "글리코시드"란 당의 알데히드 또는 케톤기를 알코올(이 알코올은 역시 당일 수 있음)의 히드록실기와 반응하여 글리코시드 결합(-O-)을 형성함으로써 형성될 수 있는 화합물을 의미하며, 이 화합물은 가수분해적으로 절단될 때 생성물로서 당 및 아글리콘(즉, 분해 알코올)을 형성한다. 본 명세서에서 "지시 화합물 글리코시드"란 미생물이 지시 화합물 글리코시드와 접촉하고 있는 것을 관찰함으로써, 아글리콘이 가수분해시 자외선 하에서 형광을 발하거나(예컨대, 4-메틸룸벨리페릴-베타-D-크실로피라노시드) 또는 변색(예컨대, p-니트로페닐-β-D-크실로시드)하여 소정의 미생물이 효소적 가수분해를 일으킬 수 있는가에 대한 결정을 가능하게 하는 글리코시드를 의미한다. 바람직하게는, 지시 화합물 글리코시드는 지시 화합물 크실로시드이다. 큰 아글리콘을 함유하는 지시 화합물 크실로시드는 C-7 크실로실탁산을 가수분해시킬 수 있는 미생물의 선택을 위해 바람직하다.
상기 단계 (i)에서, 성장 배지는 바람직하게는, 탄소원으로서 글리코시드 결합에서 가수분해될 수 있는 크실란 또는 다른 크실로시드와 같은 글리코시드를 함유하고, 따라서 배지가 크실로시드 결합을 가수분해시킬 수 있는 생물로 풍부해짐으로써 그의 선택을 용이하게 한다. 단계 (iii)에서, 미생물은 예를 들어 미생물을 함유하는 수중 희석 토양 현탁액을 한천 성장 배지상에 착상시킴으로써 성장 배지와 접촉시킬 수 있다. 미생물은 예를 들어 지시 화합물 글리코시드를 함유하는 연질 한천을 미생물 콜로니가 성장하도록 되어 있는 성장 배지 플레이트상에 적상하거나 또는 미생물이 성장 배지와 접촉하도록 배치하기 전에 지시 화합물 글리코시드를 성장 배지에 첨가함으로써 성장 배지와 접촉시킬 수도 있다.
본 발명의 선별법의 급속하고 효율적인 단계 (i) 내지 (iv)를 수행한 후, 단계 (v)에서 성장하고 있거나 또는 이미 성장된 미생물의 콜로니를 당기의 가수분해를 증명하기에 적합한 배양 기간동안 C-7 당 함유 탁산과 접촉시킬 수 있다. 예를 들어, 개개의 콜로니는 한천 플레이트로부터 제거하여 7-코실로실탁산과 소규모의 쉐이크 플라스크에서 성장시키고, 이어서 세포들을 제거하고, 생성물을 HPLC와 같은 방법에 의해 분석하여 당기의 가수분해를 증명할 수 있다.
본 발명의 가수분해 방법에 사용하기 위한 효소의 일례를 들면, 히드롤라제, 특히 글리코시다제 또는 글리카나제가 있다. 바람직한 효소에는 미생물, 특히 상기한 미생물들로부터 유도된 것들이 포함된다. 이러한 효소는 예를 들어 추출 및 정제 방법에 의해 단리시킬 수 있다.
미생물을 사용하는 경우에, 세포들은 동결 건조, 분무 건조 또는 가열건조된 세포와 같은 손상되지 않는 습윤 세포 또는 건조된 세포의 형태로, 또는 파열된 세포 또는 세포 추출물과 같은 처리된 세포 물질의 형태로 사용될 수 있다. 또한 유전 공학적 생물체의 사용도 고려해 볼 수 있다. 숙주 세포는 본 명세서에서 상기한 효소적 분해을 일으킬 수 있는 1종 이상의 효소를 발현시키는 유전자 또는 유전자들을 함유하도록 변형된 임의의 세포, 예컨대 에스케리키아 콜리일 수 있다.
1종 이상의 미생물을 사용하는 경우에, 본 발명의 효소적 가수분해 방법은 미생물의 발효에 이어서 행하거나(2단계 발효 및 가수분해), 또는 그것과 동시에, 즉 이 경우에는 현장에서 발효 및 가수분해함으로써(1단계 발효 및 가수분해) 행할 수 있다.
미생물은 적절한 배지를 사용함으로써 당업계의 통상적인 기술 중의 하나에 의해 성장시킬 수 있다. 미생물을 성장시키기 위한 적절한 배지는 미생물 세포의 성장에 필요한 영양분을 제공하는 것들을 포함한다. 성장을 위한 대표적인 배지는 필수 탄소원, 질소원 및 여러 원소(예를 들면, 미량으로)를 포함한다. 또한 유도체가 첨가될 수도 있다. 본 명세서에서, "유도체"란 미생물 세포내에서 목적하는 효소적 활성의 형성을 강화시키는 임의의 화합물을 포함한다.
상기한 탄소원으로는 말토스, 락토스, 글루코스, 프룩토스, 글리세롤, 소르비톨, 수크로스, 전분, 만니톨, 프로필렌 글리콜, 크실란 등과 같은 당; 아세트산 나트륨, 시트르산나트륨 등의 유기산의 염; 및 에탄올, 프로판올 등과 같은 알코올을 포함할 수 있다.
상기한 질소원으로는 N-Z 아민 A, 옥수수 담금액, 대두분, 쇠고기 추출물, 효모 추출물, 당밀, 제빵용 효모, 트립톤, 누트리소이(nutrisoy), 펩톤, 이스트아민, 글루탐산나트륨 등과 같은 아미노산, 니트르산나트륨, 황산암모늄 등을 포함할 수 있다.
미량 원소에는 마그네슘, 망간, 칼슘, 코발트, 몰리브덴, 구리, 니켈, 철, 나트륨 및 칼륨염을 포함할 수 있다. 인산염도 미량으로 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 미량 이상의 양으로 첨가될 수 있다.
사용되는 배지는 1종 이상의 탄소 또는 질소원 또는 다른 영양분을 포함할 수 있다.
성장에 바람직한 배지는 본 명세서의 실시예에 기재된 것들과 같은 수성 배지를 포함한다.
반응 혼합물의 진탕 및 통기는 성장하는 동안 이용할 수 있는 산소의 양에 영향을 미친다. 100 내지 250rpm의 진탕 범위가 바람직하고, 1분당 배지 1부피에 대해 약 1 내지 10부피의 공기를 통기시키는 것이 바람직하다.
본 발명 방법에 따른 미생물의 성장 및(또는) 가수분해를 위해서는, 배지의 pH를 약 4 내지 약 8.5로 하는 것이 바람직하고, 그 온도를 약 24℃ 내지 약 37℃로 하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 가수분해는 시험관내에서 1 내지 72시간과 같은 기간동안 행하거나, 또는 바람직하게는 목적 생성물의 수율이 최대화될 때까지 행할 수 있다. 바람직하게는, 가수분해하는 동안, C-7 위치에서 에피머화를 최소화할 것이 요구되는 경우(예를 들어, 10-데아세틸탁솔 또는 10-데아세틸배카린Ⅲ가 존재하는 경우)에서와 같이 pH를 7이하로 유지시킨다. 본 발명의 가수분해는 4 내지 7의 pH에서, 특히 비염기성 조건하에서 행하는 것이 바람직하다.
또한, 가수분해 반응 매질로서는 액상 수용액을 사용하는 것이 바람직하나, 유기 용매, 또는 혼화성 또는 비혼화성 (2상계) 유기/액상 수용액 혼합물을 사용할 수도 있다. 출발 물질(들)과 가수분해 반응 매질을 합한 중량을 기준으로 C-7당 함유 탁산 출발 물질을 0.0025 내지 2.5중량% 사용하는 것이 바람직하다.
출발 물질에 대해 사용된 효소 또는 미생물의 양은 본 발명의 효소적 가수분해의 촉매적 분해를 가능하기 위하여 선택된다. 본 발명의 가수분해 방법을 사용할 때에는 90% 초과의 수율(C-7 당 함유 탁산 출발 물질을 기준으로 얻은 C-7 가수분해 생성물의 백분율)을 얻는 것이 바람직하다. 가수분해는 출발 물질인 탁산의 C-7 위치에서 선택적으로 얻을 수 있다. 즉, 그것의 보다 큰 부분이 C-7 위치에서만 가수분해되는 생성물(들)은 다른 위치에서의 가수분해 없이 얻을 수도 있다.
분리
본 발명 방법의 C-7 히드록실 함유 생성물 및 후술되는 바와 같은 다른 탁산 생성물들은 예를 들어 추출, 증류, 결정화 및 컬럼 크로마토그래피와 같은 방법에 의해 단리 및 정제할 수 있다.
유용성
탁산은 상기한 바와 같이 탁산 잔기를 함유하는 디테르펜 화합물이다. 특히 관심을 끄는 것은 제13 위치에 측쇄를 함유하는 탁산 잔기를 갖는 탁산이며, 이들 탁산의 예를 들면 팩클리탁셀이 있다. 팩클리탁셀과 같은 약리학적 활성 탁산은 유방, 난소, 결장 또는 폐암과 같은 암, 흑색종 및 백혈병 환자를 치료하기 위한 항종양제로 사용될 수 있다.
본 발명 가수분해 방법에 의해 얻어진 화합물은 팩클리탁셀과 같은 약리학상 활성 탁산 그 자체로서 또는 상기한 약리학상 활성 탁산의 제조에 사용되는 중간체로서 특히 유용하다. 따라서, 예를 들면, 본 발명 방법에 의해 제조되는 화합물이 C-13 위치에서도 히드록실기를 제공하는 경우(예컨대, 배카틴 Ⅲ 및 10-데스아세틸배카틴 Ⅲ)에, 이러한 화합물들은 β-락탐과 같은 C-13 아실옥시 측쇄 형성 중간체 화합물과 커플링되어 팩클리탁셀 또는 이들의 동족체와 같은 C-13 아실옥시 측쇄 함유 탁산을 얻을 수 있다. 본 발명 방법에 따라 제조된 C-7 히드록실 함유 화합물은 상기와 같은 C-13 아실옥시 측쇄 커플링에 사용하기 전에 임의로 변형시킬 수도 있다. 예를 들어, C-13 이외의 위치에서 1개 이상의 히드록실기는 커플링되기 전에 보호되고, 그런 다음에 탈보호될 수 있다. 또한, 1993년 6월 15일자로 출원된 핸슨(Hanson) 등의 미합중국 특허 출원 제08/077,979호(대리인 서류 번호 제LD58호)(C-13 위치에서 아실옥시기의 히드록실기로의 효소적 가수분해)에 따른 C-13 위치에서의 변형, 및(또는) 1993년 6월 15일자로 출원된 핸슨 등의 미합중국 특허 출원 제08/077,980호(대리인 서류 번호 제LD59호)(C-10 위치에서 아실옥시기의 히드록실기로의 효소적 가수분해 또는 이 위치에서 히드록실기의 아실옥시기로의 효소적 에스테르화)에 따른 C-10 위치에서의 변형은 본 발명의 방법이 사용되기 전, 도중 또는 그 이후에 수행될 수 있으며 상기 두 문헌은 본 명세서에 참고 문헌으로 인용된다.
임의로 상기한 바와 같이 변형된, 본 발명의 가수분해 방법에 따라 얻어진 C-7 히드록실 함유 탁산은, 예를 들면 유럽 특허 공고 제400,971호, 미합중국 특허 제4,876,399호, 동 제4,857,653호, 동 제4,814,470호, 동 제4,924,012호, 동 제4,924,011호 및 킹스톤의 문헌[Pharm. Ther., 제52권, 1-34페이지 (1991)], 특히 1992년 12월 23일자로 출원된 포스(Poss) 등의 미합중국 특허 출원 제07/995, 443호(대리인 서류 번호 제LD6O호), 1993년 3월 19일자로 출원된 도타틸(Thottathil) 등의 동 제08/033,598호(대리인 서류 번호 제LD57호) 및 1993년 11월 24일자로 출원된 동 제08/154,840호에 언급되어 있고, 이들 문헌에 기술된 방법에 따라 제조된 것들과 같은 C-13 아실옥시 측쇄 함유 탁산의 제조에 사용될 수 있으며, 상기 문헌들은 모두 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되어 있다.
바람직한 화합물
본 발명의 가수분해 방법에서는 상기 일반식 Ⅱ의 탁산 또는 그의 염을 사용하는 것이 바람직하며, 이로써 효소적 가수분해에 의해 상기 일반식 I의 대응하는 화합물 또는 그의 염이 제공된다.
일반식 Ⅰ 및 일반식 Ⅱ에서, R2는 히드록실 또는 R5-C(O)-O-인 것이 바람직하고, 특히 R5가 메틸과 같은 알킬인 경우에 R3는 메틸과 같은 알킬인 것이 바람직하고, R4는 페닐과 같은 아릴인 것이 바람직하고, R1은 히드록실 또는 하기 일반식Ⅲ의 기인 것이 바람직하다.
상기 식 중,
R6및 R7는 독립적으로 알킬, 알콕시, 알케닐, 알케닐옥시, 알키닐, 알키닐 옥시, 시클로알킬, 시클로알킬옥시, 시클로알케닐, 시클로알케닐옥시, 아릴, 아릴 옥시, 헤테로시클로 또는 헤테로시클로옥시이고,
R8은 수소, 알콕시카르보닐 또는 히드록실 보호기이다.
일반식 Ⅱ의 탁산의 일례를 들면, 7-크실로실탁솔, 7-크실로실-10-데스아세틸탁솔, 7-크실로실배카틴 Ⅲ, 7-크실로실-10-데스아세틸배카틴 Ⅲ, 7-크실로실세팔로만닌, 7-크실로실-10-데아세틸세팔로만닌, 7-크실로실탁솔 C 또는 7-크실로실-10-데아세틸탁솔 C가 있다. 일반식 I의 탁산의 일례를 들면, 팩클리탁셀, 10-데스아세틸탁솔, 배카틴 Ⅲ, 10-데스아세틸배카틴 Ⅲ, 세팔로만닌, 10-데아세틸세팔로만닌, 탁솔 C 또는 10-데아세틸탁솔 C가 있다.
팩클리탁셀은 바람직하게는 본 발명의 방법에 의해 최종적으로 제조된다.
본 발명의 방법중 어느 한 방법에서는 적절하게는 반응물 또는 생성물의 수화물과 같은 염 또는 용매화물이 사용되거나 또는 제조될 수 있다.
본 발명은 단지 예시의 목적을 가지며, 본 발명의 청구 범위의 범위를 제한하지 않는 방식으로 된 하기 실시예에 의해 추가로 설명된다.
실시예 1
크실로시다제의 선택
자작나무로부터 얻은 1% 크실란, 0.1% 효모 추출물, 0.1% 트립톤 및 1.5% 한천을 함유하는 한천 플레이트를 제조하였다. 2g의 토양 시료 또는 롯팅 우드(rotting wood) 시료를 물 40㎖에 현탁시키고, 1:200으로 희석시킨 용액 0.1㎖를 플레이트 상에 도포시켰다. 이 플레이트를 실온(약 22℃)에서 1주간 배양하고, 이어서 4℃에서 2주간 저장하였다. 이 플레이트에 ImM 4-메틸룸벨리페릴-베타-D-크실로피라노시드를 함유하는 (약 40℃) 0.8% 아가로스 4㎖를 적상하였다. 장시간의 UV광 하에서 형광 발색하는 125개의 콜로니를 선택하여 28℃의 플레이트상에서 3일간 배양하였다.
자작나무로부터 얻은 1% 크실란, 0.2% 트립톤, 0.2% 효모 추출물 및 충분량의 인산칼륨을 함유하는 쉐이크 플라스크를 pH 7로 조정하였다. 이 플라스크를 플레이트로부터 취한 고리 모양의 배양물로 접종시키고, 28℃, 175rpm에서 배양하였다. 이틀후에, 메탄올 0.2㎖ 중의 7-크실로실-10-데스아세틸탁솔 1㎎을 첨가하고, 계속하여 이틀간 배양하였다. 또다른 군의 단리물을 1일간 배양한 후, 7-크실로실-10-데스아세틸탁솔을 첨가하고, 3일간 배양하였다. 각 플라스크에 메탄올 10㎖를 첨가하고, 시료들을 HPLC 방법 1(후술한 바와 같은)에 의해 7-크실로실-10-데스아세틸탁솔 및 10-데스아세틸탁솔에 대해 분석하였다. 스크리닝한 86개의 단리물중 9개가 검출가능 양의 10-데스아세틸탁솔을 생성하였다. 10-데스아세틸탁솔의 최고 농도는 모락셀라 sp. ATCC 55475로 얻었으며, 이것을 리스트리킹(restreaking)에 의해 정제하여 하기 실시예에서 사용하였다.
실시예 2
7-크실로실-10-데스아세틸탁솔의 가수분해
자작나무로부터 얻은 1% 크실란, 0.2% 트립톤, 0.2% 효모 추출물, 0.1% KH2PO4및 0.1% K2HPO4를 함유하는 pH 7의 배지 1리터를 4리터들이 얼렌메이어 플라스크 중에서 모락셀라 sp. ATCC 55475의 배양물 10㎖로 접종하고 28℃에서 3일간 진탕하였다. 원심분리에 의해 세포들을 수집하고, pH 7의 50mM 인산칼륨 완충액 50㎖로 세척하고, 원심분리하고, 이 완충액 30㎖(1㎖당 습윤 세포 0.122g)에 재현탁시켰다. 세포 현탁액 1.5㎖에 메탄올 0.2㎖ 및 물 0.3㎖중의 7-크실로실-10-데스아세틸탁솔 0.5㎎을 첨가하였다. 이 현탁액을 28℃에서 21시간동안 12rpm에서 철저하게 혼합하고, 이어서 이 반응을 메탄올 2㎖로 중지시키고, 시료를 HPLC 방법 1로 분석하였다. 7-크실로실-10-데스아세틸탁솔은 전혀 남지 않않으며, 10-데스아세틸탁솔 0.230㎎/㎖ (107% 수율)가 발견되었다.
이 실시예의 반응은 다음과 같이 예시된다.
실시예 3
7-크실로실탁솔의 가수분해
실시예 2에서와 같이 제조한 세포 현탁액 1.5㎖에 메탄올 0.2㎖ 및 물 0.3㎖ 중의 7-크실로실탁솔 0.5㎎을 첨가하였다. 이 현탁액을 28℃에서 21시간동안 12rpm에서 철저하게 혼합하고, 이어서 이 반응을 메탄올 2㎖로 중지시키고, 시료를 HPLC 방법 1로 분석하였다. 7-크실로실탁솔 0.011㎎/㎖가 잔류하였으며, 탁솔 0.167 ㎎/㎖(77% 수율)가 발견되었다.
HPLC 방법 1 1
컬럼: 휴렛 팩커드 하이퍼실 5마이크론 ODS Cl8 200 × 4.6㎜
이동 상: 60% 메탄올, 40% 물
유속: 1㎖/분
컬럼 온도: 주변 온도
검출 파장: 235㎚
11: B. Monsarrat, E. Mariel, S. Cros, M. Cares, D. Guenard, F. Gueritte-Voegelin, 및 M. Wright의 문헌, "Drug Metabolism and Disposition,"18,895-901 (1990).
실시예 4
7-크실로실배카틴 Ⅲ의 가수분해
모락셀라 sp. ATCC 55475를 pH 7에서 2% 글리세롤, 0.2% 트립톤, 0.2% 효모 추출물, 0.1% K2HPO4및 0.1% KH2PO4, 0.02% MgSO4·7H2O, 0.001% NaCl, 0.001% FeSO4·7H2O, 및 0.001% MnSO4·4H2O를 함유하는 배지에서 28℃의 쉐이크 플라스크에서 성장시켰다. 1㎖ 바이알을 사용하여 배지 100㎖를 접종시켰다. 4일후에, 이 배양물 15㎖ 분획을 사용하여 4리터들이 얼렌메이어 플라스크 중의 1리터 배지를 접종시켰다. 3일후에, 세포들을 원심분리에 의해 수확하고, pH 7의 50mM 인산칼륨 완충액으로 세척하고 다시 원심분리하고 냉동 저장하였다.
7-크실로실탁솔 1㎎, 노카르디오이데스 알부스 ATCC 55425(상기한 미합중국 특허 제08/077,979호에 기재되어 있음)로부터 얻은 C-13 디아실라제 200㎎(108 밀리유니트), 메탄올 0.2㎖, pH 7의 1M 인산칼륨 완충액 0.2㎖, 및 물 3.6㎖를 24℃에서 17시간동안 48rpm에서 철저하게 혼합하였다. 15시간후에, 상기한 방법 1에 의한 lHPLC 분석을 한 결과 기질로부터 C-13 측쇄가 완전히 제거된 것으로 나타났다. 이어서, 7-코실로실배카틴 Ⅲ를 함유하는 용액 2㎖를 pH 7의 50mM 인산칼륨 완충액중의 상기한 모락셀라 sp. 세포 1㎖(습윤 세포 중량 0.24g)에 첨가하고, 48rpm에서 24시간동안 철저하게 혼합하였다. 반응 혼합물을 CH2Cl26㎖로 추출하였다. 추출물을 건조시키고, 방법 1에 의한 HPLC 분석을 위해 메탄올에 재용해시켰다. 배카틴 Ⅲ 0.101㎎/㎖(초기 7-크실로실탁솔 농도를 기준으로 한 수율 102%)가 발견되었다.
실시예 5
7-크실로실-10-디아세틸배카틴-Ⅲ의 가수분해
세포들을 실시예 4에서와 같은 방법으로 제조하였다. 7-크실로실-10-데아세틸탁솔 1㎎, 실시예 4의 C-13 데아실라제 200㎎(108 밀리유니트), 메탄올 0.2㎖, pH 7의 1M 인산칼륨 완충액 0.2㎖, 및 물 3.6㎖를 24℃에서 17시간동안 48rpm에서 철저하게 혼합하였다. 15시간후에, 상기한 방법 1에 의한 HPLC 분석을 한 결과 기질로부터 C-13 측쇄가 완전히 제거된 것으로 나타난다. 이어서, 7-크실로실-10-데아세틸배카틴 Ⅲ를 함유하는 용액 2㎖를 pH 7의 50mM 인산칼륨 완충액중의 상기한모락셀라 sp. 세포 1㎖(습윤 세포 중량 0.24g)에 첨가하고, 48rpm에서 24시간동안 철저하게 혼합하였다. 반응 혼합물을 CH2Cl26㎖로 추출하였다. 추출물을 건조시키고, 방법 1에 의한 HPLC 분석을 위해 메탄올에 재용해시켰다. 10-데아세틸배카틴 Ⅲ 0.099㎎/㎖(초기 7-크실로실-10-데아세틸탁솔 농도를 기준으로 한 수율 103%)가 발견되었다.
실시예 6
하위세포 분획에 의한 7-크실로실-10-데아세틸탁솔의 가수분해
모락셀라 sp. ATCC 55475를 실시예 2에 기재된 배지 1리터를 각각 함유하는 6개의 4리터들이 얼렌메이어 플라스크에서 28℃에서 3일간 진탕하였다. 이 배지를 28℃에서 2일간 2㎖/L Novo SP431 크실라나제로 처리하여 접종전에 크실란을 부분적으로 소화시켰다. 세포들을 원심분리에 의해 수집하고, pH 7의 50mM 인산칼륨 완충액으로 세척하고, 다시 원심분리하고, 상기 완충액으로 부피가 210㎖가 되게 하였다. 세포들을 초음파 분해를 이용하여 붕괴하고, 27504 x g에서 20분간 원심분리하고, 이어서 상징액을 47807 x g에서 20분간 원심분리하였다. 47807 x g 상징액 17㎖를 100,100 x g에서 1시간동안 원심분리하고, 100,100 x g 펠릿을 pH 7의 50mM 인산칼륨 완충액 17㎖중에 재현탁시켰다. 100,100 x g 상징액중의 단백질 농도는 4.72㎎/㎖이었고, 재현탁된 펠릿 중의 단백질 농도는 1.65㎎/㎖이었다. 메탄올 0.1㎖중의 7-크실로실-10-데아세틸탁솔 0.5㎎을 펠릿 또는 상징액 분획 1.9㎖에 첨가하고, 이 튜브를 25℃에서 15시간동안 배양하였다. 이 반응을 메탄올 2㎖를 첨가하여 중지시키고, HPLC 방법 1로 분석하였다.
이로부터 얻어진 결과는 다음과 같다:
실시예 7
주목(Yew) 추출물의 가수분해
모락셀라 sp. ATCC 55475를 실시예 4에서와 같이 쉐이크 플라스크에서 성장 시켰다. 세포들을 수집하고, 실시예 5에 기재된 대로 세척한 후, 12,000psi에서 미세유동화기를 2회 통과시켜 붕괴시켰다. 와해되지 않은 세포들을 27504 x g에서 20분간 원심분리하여 제거하였다. 상징액을 100,100 x g에서 1시간동안 윈심분리하고, 100,100 x g 펠릿을 단백질 농도 17㎎/㎖에서 pH 7의 50mM 인산칼륨 완충액 17㎖에 재현탁시킨다. pH 7의 1M 인산칼륨 완충액 0.05㎖, 탁수스 히크시이 식물의 에탄올성 추출물 0.2㎖, 폴리비닐폴리피롤리돈(억제 식물 페놀성 화합물을 제거하기 위한) 20㎎, 물 0.75㎖를 25℃, 12rpm에서 1시간동안 혼합하였다. 여기에 펠릿 현탁액 1㎖ 또는 pH 7의 50mM 인산칼륨 완충액 1㎖를 첨가하고, 25℃, 12rpm에서 3일간 계속 배양하였다.
시료를 하기 HPLC 방법 2로 분석하였고, 얻어진 결과는 다음과 같다.
HPLC 방법 2
컬럼: 페이즈 세퍼레이션스 인크. (Phase Separations Inc. : 미합중국 커넥티컷트 주 노르와크 소재), 마이크로보어 스피어리소르브 페닐 150 × 2.0㎜, 3마이크론.
이동상: 용매 A: 트리플루오로아세트산으로 pH 4로 조정된 15mM KH2PO4. 용매 B: 아세토니트릴.
컬럼 온도 : 35℃
검출 파장 : 230㎚

Claims (19)

  1. C-7 위치에 직접 결합된 당기를 함유하는 1종 이상의 탁산을, 이 당기를 히드록실기로 가수분해시키는데 촉매 작용을 할 수 있는플라보박테리움(Flavobacterium), 아시네토박터(Acinetobacter), 모락셀라(Moraxella), 바실루스(Bacillus), 스포롤락토바실루스(Sporolactobacillus), 클로스트리디움(Clostridium), 데술포토마쿨룸(Desulfotomaculum), 스포로사르시나(Sporosarcina), 오실로스피라(Oscillospira), 플라노코쿠스(Planococcus), 락토바실루스(Lactobacillus), 쿠르티아(Kurthia), 마이크로코쿠스(Micrococcus), 스토마토코쿠스(Stomatococcus), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 아르트로박터(Arthrobacter), 네이쎄리아(Neisseria) 또는 킹겔라(Kingella) 속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는미생물또는 그로부터 유도되는 효소와접촉시켜 가수분해를 수행하는 것을 포함하는, C-7 위치에 직접 결합된 히드록실기를 함유하는 1종 이상의 탁산의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 당기가 크실로실기인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 하기 일반식 (Ⅱ)를 갖는 1종 이상의 C-7 당 함유 탁산 또는 그의 염을, 이 C-7 당기를 히드록실기로 가수분해시키는데 촉매 작용을 할 수있는플라보박테리움(Flavobacterium), 아시네토박터(Acinetobacter), 모락셀라(Moraxella), 바실루스(Bacillus), 스포롤락토바실루스(Sporolactobacillus), 클로스트리디움(Clostridium), 데술포토마쿨룸(Desulfotomaculum), 스포로사르시나(Sporosarcina), 오실로스피라(Oscillospira), 플라노코쿠스(Planococcus), 락토바실루스(Lactobacillus), 쿠르티아(Kurthia), 마이크로코쿠스(Micrococcus), 스토마토코쿠스(Stomatococcus), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 아르트로박터(Arthrobacter), 네이쎄리아(Neisseria) 또는 킹겔라(Kingella) 속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는미생물또는 그로부터 유도되는 효소와접촉시켜 가수분해를 수행하는 것을 포함하는, 하기 일반식 (Ⅰ)을 갖는 1종 이상의 C-7 히드록실 함유 탁산 또는 그의 염의 제조 방법.
    상기 식들 중,
    R1은 히드록실 또는 아실옥시이고,
    R2는 아실옥시 또는 히드록실이고,
    R3및 R4는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아릴 또는 헤테로시클로이고,
    "Sugar"는 C-7 위치에 직접 결합된 당기이다.
  4. 제3항에 있어서, 상기 당기가 크실로실기인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 일반식 (Ⅱ)의 탁산이 7-크실로실탁솔, 7-크실로실-10-데스아세틸탁솔, 7-크실로실배카틴 Ⅲ, 7-크실로실-10-데스아세틸배카틴 Ⅲ, 7-크실로실세팔로만닌, 7-크실로실-10-데아세틸세팔로만닌, 7-크실로실탁솔 C 및(또는) 7-크실로실-10-데아세틸탁솔 C이고, 상기 일반식 (I)의 탁산이 팩클리탁셀, 10-데스아세틸탁솔, 배카틴 Ⅲ, 10-데스아세틸배카틴 Ⅲ, 세팔로만닌, 10-데아세틸세팔로만닌, 탁솔 C 및(또는) 10-데아세틸탁솔 C인 방법.
  6. 제2항에 있어서, 상기 가수분해 방법에서 사용되는 크실로실 함유 탁산 출발 물질이 크실로실 함유 탁산들의 혼합물을 포함하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 탁산의 혼합물이 식물 조직의 식물 세포 배양물 및(또는) 이들의 추출물에 의해 얻어지며, 이 식물이 탁수스 (Taxus) 속의 일원인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 플라보박테리움(Flavobacterium), 모락셀라(Moraxella), 마이크로코쿠스(Micrococcus) 또는 바실루스(Bacillus)속에 포함되는 미생물이 사용되는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 미생물이 모락셀라 (Moraxella) sp. ATCC 55475, 바실루스 마세란스 (Bacillus macerans) ATTC 55476, 바실루스 서큘란스 (Bacillus circulans) ATTC 55477 및 마이크로코쿠스 (Micrococcus) sp. ATCC 55478로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 효소가 플라보박데리움(flavobacterium), 모락셀라 (Moraxella), 마이크로코쿠스 (Micrococcus) 또는 바실루스(Bacillus)속에 포함되는 미생물로부터 유도되는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 효소가 모락셀라 (Moraxella) sp. ATCC 55475, 바실루스 마세란스 (Bacillus macerans) ATCC 55476, 바실루스 서큘란스 (Bacillus circulans) ATCC 55477 및 마이크로코쿠스 (Micrococcus) sp. ATCC 55478로 이루어지는 군 중에서 션택되는미생물로부터 유도되는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 얻어진 탁산 생성물이 팩클리탁셀이거나 또는 이후에 팩클 리탁셀로 전환되는 탁산인 방법.
  13. (i) 선별하고자 하는 미생물의 성장을 지지할 수 있는 성장 배지를 선택하는 단계,
    (ii) 지시 화합물 글리코시드를 선택하는 단계,
    (iii) 미생물을 단계 (i)의 성장 배지와 접촉시켜 미생물을 성장시키고, 이어서 단계(ii)의 지시 화합물 글리코시드와 접촉시키는 단계,
    (iv) 지시 화합물 글리코시드의 존재 하에서 미생물을 관찰하여 가수분해가 일어나는지 여부를 결정하는 단계, 및
    (v) C-7 당 함유 탁산의 가수분해에 대해 미생물을 시험하는 단계를 포함하는, C-7 당 함유 탁산 출발 물질의 효소적 가수분해를 일으켜 대응하는 C-7 히드록실 함유 탁산을 형성할 수 있는 미생물의 선별 방법.
  14. 생물학적으로 순수한 모락셀라(Moraxella) sp. ATTC 55475 미생물.
  15. 생물학적으로 순수한 바실루스 마세란스(Bacillus Macerans) ATTC 55476 미생물.
  16. 생물학적으로 순수한 바실루스 서큘란스 (Bacillus circulans) ATCC 55477미생물.
  17. 생물학적으로 순수한 마이크로코구스 (Micrococcus) sp. ATCC 55478 미생물.
  18. 모락셀라 (Moraxella) sp. ATCC 55475, 바실루스 마세란스 (Bacillus Macerans) ATCC 55476, 바실루스 서큘란스 (Bacillus circulans) ATCC 55477 또는 마이크로코쿠스 (Micrococcus) sp. ATCC 55478로부터 단리되고, C-7 위치에 직접 결합된 당기를 함유하는 1종 이상의 탁산을, 이 당기를 히드록실기로 가수분해시켜 C-7 위치에 직접 결합된 히드록실기를 함유하는 1종 이상의 탁산을 제조할 수 있는 효소.
  19. C-7 위치에 직접 결합된 히드록실기를 함유하는 1종 이상의 탁산을, 당 존재하에 C-7 위치의 이 히드록실기를 당기로 전환시키는데 촉매 작용을 할 수 있는플라보박테리움(Flavobacterium), 아시네토박터(Acinetobacter), 모락셀라(Moraxella), 바실루스(Bacillus), 스포롤락토바실루스(Sporolactobacillus), 클로스트리디움(Clostridium), 데술포토마쿨룸(Desulfotomaculum), 스포로사르시나(Sporosarcina), 오실로스피라(Oscillospira), 플라노코쿠스(Planococcus), 락토바실루스(Lactobacillus), 쿠르티아(Kurthia), 마이크로코쿠스(Micrococcus), 스토마토코쿠스(Stomatococcus), 스타필로코쿠스(Staphylococcus),아르트로박터(Arthrobacter), 네이쎄리아(Neisseria) 또는 킹겔라(Kingella) 속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는미생물또는 그로부터 유도되는 효소와접촉시키는 단계, 및 이러한 전환을 수행하는 단계를 포함하는, C-7 위치에 직접 결합된 당기를 함유하는 1종 이상의 탁산의 제조 방법.
KR1019950000453A 1994-01-13 1995-01-12 C-7당을c-7히드록실탁산으로전환시키기위한효소적가수분해방법 KR100347839B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18163394A 1994-01-13 1994-01-13
US08/181,633 1994-01-13

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR950032632A KR950032632A (ko) 1995-12-22
KR100347839B1 true KR100347839B1 (ko) 2002-11-29

Family

ID=22665116

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019950000453A KR100347839B1 (ko) 1994-01-13 1995-01-12 C-7당을c-7히드록실탁산으로전환시키기위한효소적가수분해방법

Country Status (17)

Country Link
US (1) US5700669A (ko)
EP (1) EP0668360B1 (ko)
JP (1) JPH07203981A (ko)
KR (1) KR100347839B1 (ko)
CN (1) CN1061097C (ko)
AT (1) ATE178945T1 (ko)
AU (1) AU693827B2 (ko)
CA (1) CA2138674A1 (ko)
CY (1) CY2162B1 (ko)
DE (1) DE69508987T2 (ko)
DK (1) DK0668360T3 (ko)
ES (1) ES2130527T3 (ko)
FI (1) FI950137A (ko)
GR (1) GR3030573T3 (ko)
HK (1) HK1002013A1 (ko)
HU (1) HU217423B (ko)
IL (1) IL112061A (ko)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1477178A3 (en) * 1992-05-19 2005-02-16 KELLY, Graham Edmund Health supplements containing phyto-oestrogens, analogues or metabolites thereof
AUPO203996A0 (en) * 1996-08-30 1996-09-26 Novogen Research Pty Ltd Therapeutic uses
US6146668A (en) * 1997-04-28 2000-11-14 Novogen, Inc. Preparation of isoflavones from legumes
CA2287965C (en) * 1997-05-01 2009-10-20 Graham Edmund Kelly Treatment or prevention of menopausal symptoms and osteoporosis
US6030818A (en) * 1997-12-22 2000-02-29 Bcm Developpement, Inc. Bacterial mass production of taxanes and paclitaxel
AUPP112497A0 (en) * 1997-12-24 1998-01-22 Novogen Research Pty Ltd Compositions and method for protecting skin from UV induced immunosupression and skin damage
AUPP260798A0 (en) * 1998-03-26 1998-04-23 Novogen Research Pty Ltd Treatment of medical related conditions with isoflavone containing extracts of clover
AUPQ266199A0 (en) * 1999-09-06 1999-09-30 Novogen Research Pty Ltd Compositions and therapeutic methods involving isoflavones and analogues thereof
US20090233999A1 (en) * 1999-09-06 2009-09-17 Novogen Research Pty Ltd Compositions and therapeutic methods involving isoflavones and analogues thereof
CA2385528C (en) 1999-10-01 2013-12-10 Immunogen, Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
AUPQ520300A0 (en) * 2000-01-21 2000-02-17 Novogen Research Pty Ltd Food product and process
AUPR363301A0 (en) * 2001-03-08 2001-04-05 Novogen Research Pty Ltd Dimeric isoflavones
US6437154B1 (en) 2001-09-28 2002-08-20 Council Of Scientific And Industrial Research Process for the preparation of 10-deacetylbaccatin III
DE60109165T2 (de) * 2001-09-28 2006-02-16 Council Of Scientific And Industrial Research Verfahren zur Herstellung von 10-Desacetylbaccatin III
US7776574B2 (en) 2004-05-20 2010-08-17 National Research Development Corporation Thrombolytic enzyme and a process for its preparation
CN101381708A (zh) * 2007-09-04 2009-03-11 中国科学院大连化学物理研究所 纤维化纤维单胞菌、水解酶及其在紫杉烷转化方面的用途
CN102296053B (zh) 2010-06-25 2015-03-11 中国医学科学院药物研究所 一种7-木糖紫杉烷糖基水解酶、其基因的核苷酸序列及其应用
CN103864729A (zh) * 2014-03-03 2014-06-18 无锡紫熙生物科技有限公司 一种10-去乙酰基巴卡亭iii的制备方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5832593B2 (ja) * 1975-10-09 1983-07-14 株式会社トクヤマ Ｌ− シユセキサンノセイゾウホウホウ
US5200534A (en) * 1992-03-13 1993-04-06 University Of Florida Process for the preparation of taxol and 10-deacetyltaxol
US5322779A (en) * 1992-04-16 1994-06-21 The Research And Development Institute, Inc. At Montana State University Taxol production by taxomyces andreanae

Also Published As

Publication number Publication date
CY2162B1 (en) 2002-08-23
DE69508987D1 (de) 1999-05-20
HK1002013A1 (en) 1998-07-24
CN1111229A (zh) 1995-11-08
IL112061A0 (en) 1995-03-15
KR950032632A (ko) 1995-12-22
ATE178945T1 (de) 1999-04-15
DE69508987T2 (de) 1999-09-30
US5700669A (en) 1997-12-23
CN1061097C (zh) 2001-01-24
GR3030573T3 (en) 1999-10-29
ES2130527T3 (es) 1999-07-01
JPH07203981A (ja) 1995-08-08
CA2138674A1 (en) 1995-07-14
DK0668360T3 (da) 1999-10-25
HUT70987A (en) 1995-11-28
FI950137A0 (fi) 1995-01-12
EP0668360B1 (en) 1999-04-14
EP0668360A1 (en) 1995-08-23
IL112061A (en) 1999-10-28
FI950137A (fi) 1995-07-14
AU1015695A (en) 1995-07-27
HU217423B (hu) 2000-01-28
AU693827B2 (en) 1998-07-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100347839B1 (ko) C-7당을c-7히드록실탁산으로전환시키기위한효소적가수분해방법
EP0629701B1 (en) Enzymatic hydrolysis methods for the preparation of C-10 and C-13 hydroxyl-bearing taxanes, enzymatic esterification method for the preparation of C-10 acyloxy-bearing taxanes, and use thereof in the preparation of C-13 acyloxy-bearing taxanes
RU2330069C2 (ru) Способ получения макролидного соединения и штаммы streptomyces sp., mortierella sp. и micromonosporaceae
US6528301B1 (en) Paclitaxel production by actinomycetes
US5516676A (en) Preparation of C-13 hydroxyl-bearing taxanes using nocardioides or a hydrolase isolated therefrom
KR960016874B1 (ko) 미생물에 의한 트랜스-4-히드록시-l-프롤린의 제조방법
Patel et al. Enzymatic acetylation of 10-deacetylbaccatin III to baccatin III by C-10 deacetylase from Nocardioides luteus SC 13913
Watanabe et al. Actinosynnema mirum, a new producer of nocardicin antibiotics
US5523219A (en) Enzymatic hydrolysis method for the preparation of C-10 hydroxyl-bearing taxanes and enzymatic esterification method for the preparation of C-10 acyloxy-bearing
CN100595270C (zh) 紫杉烷木糖苷去糖微生物及其应用
Songsumanus et al. Characterization and screening of antimicrobial activity of Micromonospora strains from Thai soils
US4686308A (en) Novel physiologically active substance MH435
US6162622A (en) Preparation of 6 hydroxy-7-deoxytaxanes using nocardioides luteus
KR100386197B1 (ko) 올레아미드를 생산하는 스트렙토미세스 속 신균주 및 그균주로부터 올레아미드를 생산하는 방법
IL130623A (en) Methods for preparation of taxanes and microorganisms and enzymes utilized therein
US5202258A (en) Immunosuppressant-producing culture
KR100427411B1 (ko) 아스퍼질러스 속 Ｆ７０６０９（ＫＣＴＣ１８０５５Ｐ）와 β－글루코시다제 저해제
JPH0625277A (ja) 新規テストステロン−５α−レダクターゼ阻害物質ＳＮＡ−４６０６産生菌、新規テストステロン−５α−レダクターゼ阻害物質ＳＮＡ−４６０６及びその製造法
JPH0331195B2 (ko)
JP3327982B2 (ja) 新規な抗生物質ｍｉ４８１−４２ｆ４−ａ関連物質
JPH0515385A (ja) 新規な抗生物質アリサマイシンおよびその製法
CN116445317A (zh) 一种产嘌呤霉素的白色链霉菌属新菌种及其应用
JP2849460B2 (ja) 新規化合物ａ―７０６１５物質及びその製造法
KR20010072758A (ko) Ｃ-4 데아세틸탁산의 제조 방법
JPH03240791A (ja) 新規免疫抑制抗生物質ｍ１９５１―６２ｆ２物質およびその製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee