CN101796062A

CN101796062A - 6-双取代双环核酸类似物

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Publication number: CN101796062A
Application number: CN200880105715A
Authority: CN
Inventors: 埃里克·E·斯威兹; 普内特·P·塞思
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2007-07-05
Filing date: 2008-07-01
Publication date: 2010-08-04
Anticipated expiration: 2028-07-01
Also published as: WO2009006478A3; CN101796062B; ES2376507T5; AU2008272918A1; ES2376507T3; CA2692579C; EP2176280B1; ATE538127T1; EP2176280B2; US20110053881A1; WO2009006478A2; DK2176280T3; DK2176280T4; CA2692579A1; AU2008272918B2; US8278283B2; EP2176280A2

Abstract

本发明描述了6-双取代双环核苷、从其中制备的寡聚化合物和利用所述寡聚化合物的方法。更特别地，每个6-双取代双环核苷包含2’-O-C(R₁)(R₂)-4’或2’-O-C＝(R₃)(R₄)-4’桥，其中每个R分别为取代基团并且R₁和R₂包括H。6-双取代双环核苷可用于增强寡聚化合物的性质包括核酸酶耐受性。在某些实施方案中，本发明提供的寡聚化合物与靶标RNA的一部分杂交而导致靶标RNA丧失正常功能。

Description

6-双取代双环核酸类似物

相关申请的交叉引用

本申请要求于2007年7月5日提交的题为“6-双取代或不饱和双环核酸类似物(6-Disubstituted or Unsaturated Bicyclic Nucleic Acid Analogs)”的美国临时申请60/948,134的优先权，其全文在此作为参考并入本发明中。

序列表

本申请随同提交了电子格式的序列表。所提供的该序列表文件名为CHEM0039WOSEQ.txt，创建于2008年7月1日，大小为6kb。序列表的电子格式中的信息在此全文作为参考并入本发明中。

发明领域

本发明提供了6-双取代的双环核苷、由其制备的寡聚化合物和使用所述寡聚化合物的方法。更具体而言，每个所述6-双取代的双环核苷包含2’-O-C(R₁)(R₂)-4’或2’-O-C＝(R₃)(R₄)-4’桥，其中每个R分别为取代基团并且R₁和R₂包括H。在某些实施方案中，所述寡聚化合物与靶标RNA的一部分杂交以使该靶标RNA丧失正常的功能。

发明背景

反义技术是用于降低一种或多种特定基因产物表达的有效手段，因而被证明在治疗、诊断和研究应用中具有独特的用途。化学修饰的核苷常用于整合入反义序列以增强一种或多种属性，例如核酸酶抗性、结合亲和力或降低的毒性方面。一类这样的化学修饰基团包括双环核苷，其中该核苷的呋喃糖部分包含了连接呋喃糖上两个原子以形成双环状环系统的桥。所述双环核苷具有各种名称，包括对于双环核酸或锁核酸分别具有BNA和LNA的名称。

已制备得到各种BNA，并报道于专利文献和科技文献中，例如参见：Singh等人，Chem.Commun.，1998，4，455-456；Koshkin等人，Tetrahedron，1998，54，3607-3630；Wahlestedt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2000，97，5633-5638；Kumar等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1998，8，2219-2222；Wengel等人，PCT国际申请WO 98-DK393 19980914；Singh等人，J.Org.Chem.，1998，63，10035-10039，各文献的全文在此作为参考并入本文中。已授权的美国专利和公开的申请文件的实例包括，例如：美国专利7,053,207、6,770,748、6,268,490和6,794,499以及公开的美国申请20040219565、20040014959、20030207841、20040192918、20030224377、20040143114和20030082807；各文献的全文在此作为参考并入本文中。

许多LNA具有毒性。参见例如，Swayze，E.E.；Siwkowski，A.M.；Wancewicz，E.V.；Migawa，M.T.；Wyrzykiewicz，T.K.；Hung，G.；Monia，B.P.；Bennett，C.F.，Antisense oligonucleotides containing locked nucleic acidimprove potency but cause significant hepatotoxicity见于animals.Nucl.AcidsRes.，doi：10.1093/nar/gkll071(2006年12月，提前在线出版)。

因此，对通过反义机制特异性调节基因表达的药剂仍有着长期需求。本发明公开了可用于调节基因表达途径的6-双取代的或不饱和的BNA和由其制备得到的反义化合物，包括那些依赖于RNA酶H、RNAi和dsRNA酶等作用机制以及基于靶标降解或靶标占用的其它反义机制的6-双取代的或不饱和的BNA和由其制备得到的反义化合物。本领域的技术人员在获知本发明公开内容后将能够在不进行过度实验的情况下鉴定、制备和利用用于这些用途的反义化合物。

发明简述

本发明提供了6-双取代的双环核苷、包含这些双环核苷的寡聚化合物和所述寡聚化合物的使用方法。在某些实施方案中，所述双环核苷使整合了它们的寡聚化合物的性质增强。

所述变量分别在此更详细地定义。可以理解的是本发明提供的所述双环核苷、寡聚体化合物和其使用方法包括本发明公开的实施方案和所定义的变量的所有组合。

在某些实施方案中，提供的双环核苷具有通式I：

其中：

B_x为杂环碱基部分；

T₁和T₂中的一个为H或羟基保护基团并且另一个为H、羟基保护基团或活性磷基团；

q₁和q₂各自独立地为卤素、C₁-C₁₂烷基、取代的C₁-C₁₂烷基、C₂-C₁₂烯基、取代的C₂-C₁₂烯基、C₂-C₁₂炔基、取代的C₂-C₁₂炔基、C₁-C₁₂烷氧基、取代的C₁-C₁₂烷氧基、OJ₁、SJ₁、SOJ₁、SO₂J₁、NJ₁J₂、N₃、CN、C(＝O)OJ₁、C(＝O)NJ₁J₂、C(＝O)J₁、O-C(＝O)NJ₁J₂、N(H)C(＝NH)NJ₁J₂、N(H)C(＝O)NJ₁J₂或N(H)C(＝S)NJ₁J₂；

或q₁和q₂一起为＝C(q₃)(q₄)；

q₃和q₄各自独立地为H、卤素、C₁-C₁₂烷基或取代的C₁-C₁₂烷基；每个取代的基团各自独立地被独立地选自卤素、C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、OJ₁、SJ₁、NJ₁J₂、N₃、CN、C(＝O)OJ₁、C(＝O)NJ₁J₂、C(＝O)J₁、O-C(＝O)NJ₁J₂、N(H)C(＝O)NJ₁J₂或N(H)C(＝S)NJ₁J₂的取代基团单或多取代；并且每个J₁和J₂各自独立地为H、C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、C₁-C₆氨烷基或保护基团。

在某些实施方案中，q₁和q₂的至少一个为C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基。在某些实施方案中，q₁和q₂各自独立地为C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基。在某些实施方案中，q₁和q₂各自独立地为甲基、乙基或丙基。在某些实施方案中，q₁和q₂分别为甲基。在某些实施方案中，q₁和q₂的至少一个为取代的C₁-C₆烷基。

在某些实施方案中，q₁和q₂的至少一个为取代的C₁-C₆烷基。在某些实施方案中，q₁和q₂的至少一个为取代的C₁-C₆烷基，其中所述取代基团选自OJ₁、SJ₁、NJ₁J₂、N₃、CN、C(＝O)OJ₁、C(＝O)NJ₁J₂、C(＝O)J₁或O-C(＝O)NJ₁J₂，其中每个J₁和J₂各自独立地为H、C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、C₁-C₆氨烷基或保护基团。在某些实施方案中，q₁和q₂的至少一个为取代的C₁-C₆烷基，其中所述取代基团选自OJ₁、NJ₁J₂或CN，其中J₁和J₂各自独立地为H、C₁-C₆烷基或保护基团。

在某些实施方案中，q₁和q₂一起为＝C(q₃)(q₄)。在某些实施方案中，q₃和q₄分别为H。在某些实施方案中，q₃和q₄的至少一个为卤素、C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基。在某些实施方案中，q₃和q₄的至少一个为甲基。在某些实施方案中，q₃和q₄分别为甲基。

在某些实施方案中，T₁和T₂的分别为羟基保护基团。在某些实施方案中，所述羟基保护基团各自独立地选自乙酰基、叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氢吡喃基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、2-三甲基甲硅烷乙基、对氯苯基、2，4-二硝基苯基、苄基、苯甲酰基、对苯基苯甲酰基、2，6-二氯苄基、二苯基甲基、对硝基苄基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、苯甲酰基甲酸酯、氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、新戊酰基、9-芴基甲基碳酸脂、甲磺酸盐、甲苯磺酸盐、三氟甲磺酸盐、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧三苯甲基、三甲氧基三苯甲基或取代的9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixy1)。在某些实施方案中，T₁为乙酰基、苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基以及4，4’-二甲氧三苯甲基。在某些实施方案中，T₁为4，4’-二甲氧三苯甲基。

在某些实施方案中，T₂为活性磷基团。在某些实施方案中，T₂为选自二异丙基氰基乙氧基亚磷酰胺和H-磷酸酯的活性磷基团。在某些实施方案中，T₂为二异丙基氰基乙氧基亚磷酰胺。在某些实施方案中，T₂为二异丙基氰基乙氧基亚磷酰胺并且q₁和q₂分别为甲基。在某些实施方案中，T₂为二异丙基氰基乙氧基亚磷酰胺并且q₁和q₂一起为＝C(q₃)(q₄)，q₃和q₄分别为H。

在某些实施方案中，B_x为嘧啶、取代的嘧啶、嘌呤或取代的嘌呤。在某些实施方案中，B_x为尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-噻唑-尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-噻唑-胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤或2，6-二氨基嘌呤。

在某些实施方案中，J₁和J₂各自独立地为H或C₁-C₃烷基。

在某些实施方案中，本发明提供具有通式II的双环核苷：

在某些实施方案中，本发明提供包含至少一个具有通式III的双环核苷的寡聚化合物：

其中，对于所述至少一个具有通式III的双环核苷，各自独立地：

B_x为杂环碱基部分；

T₃和T₄各自独立地为将具有通式III的双环核苷连接至所述寡聚化合物的核苷间连接基团，或T₃和T₄中的一个为将具有通式III的双环核苷连接至所述寡聚化合物的核苷间连接基团而T₃和T₄中的另一个为H、羟基保护基团、连接的偶联物基团或5’或3’-末端基团；

或q₁和q₂一起为＝C(q₃)(q₄)；

q₃和q₄各自独立地为H、卤素、C₁-C₁₂烷基或取代的C₁-C₁₂烷基；取代的基团各自独立地被独立地选自卤素、C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、OJ₁、SJ₁、NJ₁J₂、N₃、CN、C(＝O)OJ₁、C(＝O)NJ₁J₂、C＝O)J₁、O-C(＝O)NJ₁J₂、N(H)C(＝O)NJ₁J₂或N(H)C(＝S)NJ₁J₂的取代基团单或多取代；并且J₁和J₂各自独立地为H、C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、C₁-C₆氨烷基或保护基团。

在某些实施方案中，提供包含至少一个具有通式III的双环核苷的寡聚化合物，其中q₁和q₂的至少一个为C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基。在某些实施方案中，q₁和q₂各自独立地为C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基。在某些实施方案中，q₁和q₂各自独立地为甲基、乙基或丙基。在某些实施方案中，每个q₁和q₂为甲基。

在某些实施方案中，提供包含至少一个具有通式III的双环核苷的寡聚化合物，其中至少每个q₁或每个q₂为C₁-C₆烷基。在某些实施方案中，至少每个q₁或每个q₂为取代的C₁-C₆烷基，其中所述取代基团选自OJ₁、SJ₁、NJ₁J₂、N₃、CN、C(＝O)OJ₁、C(＝O)NJ₁J₂、C(＝O)J₁或O-C(＝O)NJ₁J₂，其中每个J₁和J₂各自独立地为H、C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、C₁-C₆氨烷基或保护基团。在某些实施方案中，至少每个q₁或每个q₂为取代的C₁-C₆烷基，其中所述取代基团选自OJ₁、NJ₁J₂或CN，其中每个J₁和J₂各自独立地为H、C₁-C₆烷基或保护基团。

在某些实施方案中，本发明提供包含至少一个具有通式III的双环核苷的寡聚化合物，其中对于每个双环核苷，q₁和q₂一起为＝C(q₃)(q₄)。在某些实施方案中，每个q₃和每个q₄为H。在某些实施方案中，至少每个q₃或每个q₄为卤素、C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基。在某些实施方案中，至少每个q₃或每个q₄为甲基。在某些实施方案中，每个q₃和每个q₄为甲基。

在某些实施方案中，本发明提供包含至少一个具有通式III的双环核苷并且进一步包含至少一个3’或5’-末端基团的寡聚化合物。

在某些实施方案中，本发明提供包含至少一个具有通式III的双环核苷并且进一步包含连续序列的连接的核苷的寡聚化合物，其中每个核苷间连接基团分别为磷酸二酯或硫代磷酯。在某些实施方案中，每个核苷间连接基团为硫代磷酯。

在某些实施方案中，本发明提供包含至少一个具有通式IV的双环核苷的寡聚化合物：

在某些实施方案中，本发明提供包含至少一个下述区域的寡聚化合物，所述区域为至少两个连续的具有通式III的双环核苷。在某些实施方案中，所述至少两个连续的具有通式III的双环核苷组成的至少一个区域位于所述寡聚化合物的3’或5’-末端。在某些实施方案中，所述至少两个连续的具有通式III的双环核苷组成的至少一个区域位于所述寡聚化合物的3’或5’-末端并且至少一个具有通式III的双环核苷位于所述寡聚化合物的3’或5’-末端的另一端。

在某些实施方案中，本发明提供每个具有约6至约14个单体亚单位的内部区域的有间隙寡聚化合物，所述内部区域亚单位分开两个外部区域，所述外部区域分别将独立地包含具有通式III的1至约5个连续的双环核苷的两个外部区域分开。在某些实施方案中，基本上所述内部区域中的每个单体亚单位为β-D-2’-脱氧核糖基核苷。在某些实施方案中，所述内部区域包含约8至约14个β-D-2’-脱氧核糖基核苷。在某些实施方案中，所述内部区域包含约10至约14个β-D-2’-脱氧核糖基核苷。在某些实施方案中，所述内部区域包含约10至约12个β-D-2’-脱氧核糖基核苷。在某些实施方案中，所述内部区域包含约10至约12个β-D-2’-脱氧核糖基核苷，并且所述外部区域各自独立地分别包含2至约3个具有通式III的双环核苷。在某些实施方案中，所述内部区域包含约10至约12个β-D-2’-脱氧核糖基核苷，并且所述外部区域各自独立地包含2个具有通式III的双环核苷。在某些实施方案中，所述内部区域包含10个β-D-2’-脱氧核糖基核苷，并且所述外部区域各自独立地包含2个具有通式III的双环核苷。在某些实施方案中，所述外部区域各自独立地分别包含2至约3个具有通式III的双环核苷，并且所述内部区域包含14个β-D-2’-脱氧核糖基核苷。在某些实施方案中，所述外部区域各自独立地包含2个具有通式III的双环核苷，并且所述内部区域14个β-D-2’-脱氧核糖基核苷。

在某些实施方案中，本发明提供具有约6至约14个单体亚单位的内部区域的有间隙寡聚化合物，所述内部区域分开两个外部区域，所述外部区域独立地包含1至约5个连续的具有通式IV的双环核苷：

在某些实施方案中，本发明提供包含至少一个具有通式III的双环核苷的寡聚化合物，其在长度上包含约8至约40个单体亚单位。在某些实施方案中，提供包含至少一个具有通式III的双环核苷的寡聚化合物，其在长度上包含约8至约20个单体亚单位。在某些实施方案中，提供包含至少一个具有通式III的双环核苷的寡聚化合物，其在长度上包含约10至约16个单体亚单位。在某些实施方案中，提供包含至少一个具有通式III的双环核苷的寡聚化合物，其在长度上包含约10至约14个单体亚单位。

在某些实施方案中，本发明提供抑制基因表达的方法，其包括将一种或多种细胞、组织或动物与包含至少一个具有通式III的双环核苷的寡聚化合物接触。

在某些实施方案中，本发明提供包括将细胞与包含至少一个通式III双环核苷的寡聚化合物接触的方法：

其中，对于所述具有通式III的至少一个双环核苷，各自独立地：

B_x为杂环碱基部分；

或q₁和q₂一起为＝C(q₃)(q₄)；

q₃和q₄各自独立地为H、卤素、C₁-C₁₂烷基或取代的C₁-C₁₂烷基；

取代的基团各自独立地被独立地选自卤素、C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、OJ₁、SJ₁、NJ₁J₂、N₃、CN、C(＝O)OJ₁、C(＝O)NJ₁J₂、C(＝O)J₁、O-C(＝O)NJ₁J₂、N(H)C(＝O)NJ₁J₂或N(H)C(＝S)NJ₁J₂的取代基团单或多取代；

J₁和J₂各自独立地为H、C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、C₁-C₆氨烷基或保护基团；并且

其中所述寡聚化合物包含约8至约40个单体亚单位并且与靶标RNA互补。

在某些实施方案中，所述细胞来源于动物。在某些实施方案中，所述细胞来源于人。在某些实施方案中，所述靶标RNA选自mRNA、pre-mRNA和microRNA。在某些实施方案中，所述靶标RNA为mRNA。在某些实施方案中，所述靶标RNA为人mRNA。在某些实施方案中，所述靶标RNA被裂解从而抑制其功能。在某些实施方案中，所述方法进一步包括评估所述寡聚化合物对所述细胞的反义活性。在某些实施方案中，所述评估包括检测所述靶标RNA的水平。在某些实施方案中，所述评估包括检测蛋白质的水平。在某些实施方案中，所述评估包括一种或多种表型结果的检测。

在某些实施方案中，本发明提供具有以下通式的双环核苷：

其中：

B_x为杂环碱基部分；

T₁和T₂中的一个为H或羟基保护基团并且T₁和T₂中的另一个为H、羟基保护基团或活性磷基团；

或q₁和q₂一起为＝C(q₃)(q₄)；

J₁和J₂各自独立地为H、C₁-C₆烷基、取代的C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、取代的C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、取代的C₂-C₆炔基、C₁-C₆氨烷基、取代的C₁-C₆氨烷基或保护基团；每个J₁和J₂各自独立地为H、C₁-C₆烷基、取代的C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、取代的C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、取代的C₂-C₆炔基、C₁-C₆氨烷基、取代的C₁-C₆氨烷基或保护基团；并且

其中取代的基团各自独立地被独立地选自卤素、C₁-C₆烷基、取代的C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、取代的C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、取代的C₂-C₆炔基、OJ₁、SJ₁、NJ₁J₂、N₃、CN、C(＝O)OJ₁、C(＝O)NJ₁J₂、C(＝O)J₁、O-C(＝O)NJ₁J₂、N(H)C(＝O)NJ₁J₂或N(H)C(＝S)NJ₁J₂的取代基团单或多取代；

在一个实施方案中，q₁和q₂中的至少一个为C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基。在另一个实施方案中，q₁和q₂均为C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基。另外的实施方案中，q₁和q₂均为甲基。在另一个实施方案中，q₁和q₂中的至少一个为取代的C₁-C₆烷基。另外的实施方案中，q₁和q₂中的至少一个为(CH₂)_n-N(H)C(＝O)(CH₂)_n-NJ₁J₂、(CH₂)_n-N(H)C(＝S)NJ₁J₂、(CH₂)_n-O-C(＝O)NJ₁J₂或(CH₂)_n-C(＝O)NJ₁J₂，其中优选的n为1。

本发明还提供对桥的不饱和取代，其中q₁和q₂与将其附着至所述桥的6-碳原子的键一起为＝C(q₃)(q₄)。在一个实施方案中，q₃和q₄各自独立地为H。在另一个实施方案中，q₃和q₄的至少一个为卤素、C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基。在另外的实施方案中，q₃和q₄的至少一个为甲基。在另一个实施方案中，q₃和q₄均为甲基。

在一个实施方案中，T₁和T₂分别为羟基保护基团，其中优选的羟基保护基团包括乙酰基、叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氢吡喃基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、2-三甲基甲硅烷乙基、对氯苯基、2，4-二硝基苯基、苄基、苯甲酰基、对苯基苯甲酰基、2，6-二氯苄基、二苯基甲基、对硝基苄基、三苯甲基(trityl)、4，4’-二甲氧三苯甲基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、苯甲酰基甲酸酯、氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、新戊酰基、9-芴基甲基碳酸脂、甲磺酸盐、甲苯磺酸盐、三氟甲磺酸盐、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)以及9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。

在一个实施方案中，T₁为乙酰基、苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基以及4，4’-二甲氧三苯甲基，其中优选的基团为4，4’-二甲氧三苯甲基。在某些实施方案中，T₁为4，4’-二甲氧三苯甲基并且T₂为二异丙基氰基乙氧基亚磷酰胺。

在一个实施方案中，T₂为活性磷基团，其中优选的活性磷基团包括二异丙基氰基乙氧基亚磷酰胺和H-磷酸酯。

在一个实施方案中，B_x为嘧啶、取代的嘧啶、嘌呤或取代的嘌呤。在某些实施方案中，B_x为尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑-尿嘧啶、5-噻唑-胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤或2，6-二氨基嘌呤。

在一个实施方案中，J₁和J₂各自独立地为H或C₁-C₃烷基。

在一个实施方案中，所述双环核苷具有构型：

本发明还提供包含至少一个具有通式I的双环核苷的寡聚化合物：

其中：

B_x为杂环碱基部分；

T₃为羟基、保护羟基、连接的偶联基团或附着于核苷的核苷间连接基团、核苷酸、寡聚核苷、寡核苷酸、单体亚单位或寡聚化合物；

T₄为羟基、保护羟基、连接的偶联基团或附着于核苷的核苷间连接-基团、核苷酸、寡聚核苷、寡核苷酸、单体亚单位或寡聚化合物；

其中T₃和T₄的至少一个为附着于核苷的核苷间连接基团、核苷酸、寡聚核苷、寡核苷酸、单体亚单位或寡聚化合物；q₁和q₂各自独立地为卤素、C₁-C₁₂烷基、取代的C₁-C₁₂烷基、C₂-C₁₂烯基、取代的C₂-C₁₂烯基、C₂-C₁₂炔基、取代的C₂-C₁₂炔基、C₁-C₁₂烷氧基、取代的C₁-C₁₂烷氧基、OJ₁、SJ₁、SOJ₁、SO₂J₁、NJ₁J₂、N₃、CN、C(＝O)OJ₁、C(＝O)NJ₁J₂、C(＝O)J₁、O-C(＝O)NJ₁J₂、N(H)C(＝NH)NJ₁J₂、N(H)C(＝O)NJ₁J₂或N(H)C(＝S)NJ₁J₂；

或q₁和q₂一起为＝C(q₃)(q₄)；

q₃和q₄各自独立地为H、卤素、C₁-C₁₂烷基或取代的C₁-C₁₂烷基；每个J₁和J₂各自独立地为H、C₁-C₆烷基、取代的C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、取代的C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、取代的C₂-C₆炔基、C₁-C₆氨烷基、取代的C₁-C₆氨烷基或保护基团；每个J₁和J₂各自独立地为H、C₁-C₆烷基、取代的C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、取代的C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、取代的C₂-C₆炔基、C₁-C₆氨烷基、取代的C₁-C₆氨烷基或保护基团；并且

在一个实施方案中，q₁和q₂中的至少一个为C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基。在一个实施方案中，q₁和q₂均为C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基。在另外的实施方案中，q₁和q₂均为甲基。在另一个实施方案中，q₁和q₂中的至少一个为取代的C₁-C₆烷基。在另外的实施方案中，q₁和q₂中的至少一个为(CH₂)_n-N(H)C(＝O)(CH₂)_n-NJ₁J₂、(CH₂)_n-N(H)C(＝S)NJ₁J₂、(CH₂)_n-O-C(＝O)NJ₁J₂或(CH₂)_n-C(＝O)NJ₁J₂，其中优选的n为1。

本发明还提供具有至少一个双环核苷的寡聚化合物，该双环核苷包含对桥的不饱和取代，其中q₁和q₂与将其附着至所述桥的6-碳原子的键一起为＝C(q₃)(q₄)。在一个实施方案中，q₃和q₄每个分别为H。在另一个实施方案中，q₃和q₄的至少一个为卤素、C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基。在另外的实施方案中，q₃和q₄的至少一个为甲基。在另一个实施方案中，q₃和q₄均为甲基。

在一个实施方案中，T₃为H或羟基保护基团。在另一个实施方案中T₃为附着于核苷、核苷酸或单体亚单位的核苷间连接基团。另外的实施方案中，T₃为附着于寡聚核苷或寡核苷酸的核苷间连接基团。在另一个实施方案中，T₃为附着于寡聚化合物的核苷间连接基团。

在一个实施方案中，T₄为H或羟基保护基团。在另一个实施方案中T₄为附着于核苷、核苷酸或单体亚单位的核苷间连接基团。另外的实施方案中，T₄为附着于寡聚核苷或寡核苷酸的核苷间连接基团。在另一个实施方案中，T₄为附着于寡聚化合物的核苷间连接基团。

在一个实施方案中，T₃和T₄中的至少一个包含选自磷酸二酯或硫代磷酯的核苷间连接基团。

在一个实施方案中，还提供具有至少一个具有以下构型的双环核苷的寡聚化合物：

在一个实施方案中，提供了具有至少一个通式I双环核苷的寡聚化合物，其包含连续序列的连接的核苷，其中每个核苷间连接基团分别为磷酸二酯或硫代磷酯。

在一个实施方案中，寡聚化合物包含由至少两个连续的具有通式I的双环核苷组成的至少一个区域。在另一个实施方案中，所述由至少两个连续的具有通式I的双环核苷的区域位于所述寡聚化合物的3’或5’-末端。在另外的实施方案中，至少一个由至少两个连续的具有通式I的双环核苷组成的区域位于所述寡聚化合物的3’或5’-末端，并且至少一个具有通式I的双环核苷位于所述寡聚化合物的3’或5’-末端的另一端。在某些实施方案中，提供有间隙寡聚化合物，其具有位于所述寡聚化合物的3’或5’-末端的由至少两个连续的具有通式I的双环核苷组成的一个区域，以及位于所述寡聚化合物的3’或5’-末端另一端的至少一个具有通式I的双环核苷。

在某些实施方案中，本发明提供包含位于5’-末端的一个或两个具有通式I的双环核苷和位于3’-末端的两个或三个具有通式I的双环核苷的有间隙寡聚化合物。在某些实施方案中，提供有间隙寡聚化合物，其包含位于5’-末端的一个或两个具有通式I的双环核苷，位于3’-末端的两个或三个具有通式I的双环核苷，以及约10至约16个β-D-脱氧核糖基核苷的内部区域。在某些实施方案中，所述有间隙寡聚化合物的内部区域包含约10至约14个β-D-脱氧核糖基核苷。在某些实施方案中，提供在长度上包含10至16个核苷和/或经修饰的核苷或模拟物的有间隙寡聚化合物。

在一个实施方案中，本发明提供在长度上包含约8至约40个核苷和/或经修饰的核苷或模拟物的寡聚化合物。在另一个实施方案中，本发明提供在长度上包含约8至约20个核苷和/或经修饰的核苷或模拟物的寡聚化合物。在另外的实施方案中，本发明提供在长度上包含约10至约16个核苷和/或经修饰的核苷或模拟物的寡聚化合物。在另一个实施方案中，本发明提供在长度上包含约10至约14个核苷和/或经修饰的核苷或模拟物的寡聚化合物。

此外本发明提供抑制基因表达的方法，包括将一种或多种细胞、组织或动物与本发明的寡聚化合物接触。

发明详述

本发明提供6-双取代双环核苷、从中制备的寡聚化合物和所述寡聚化合物的应用方法。更具体地，每个6-双取代双环核苷包含具有式2’-O-C(q₁)(q₂)-4’或2’-O-C[＝(q₃)(q₄)]-4’之一的核糖部分4’和2’位之间的桥。在某些实施方案中，寡聚化合物和组合物经设计与靶标RNA的一部分杂交。在某些实施方案中，寡聚化合物可用于设计适配子，该适配子是能够在体内环境中结合异常蛋白的寡聚化合物。

6-双取代的双环核苷通常被制备成具有正交保护的活性基团并进一步包含活性磷基团。所述双环核苷可作为合成寡聚体的单体亚单位。在某些实施方案中，本发明提供的所述单体亚单位的一个例证性的例子具有通式：

其中由虚线框围绕的基团是可变的。所显示的双环核苷单体一般被称为二甲氧基三苯甲基亚磷酰胺，或者更正式地采用IUPAC系统命名法命名为(1S，3R，4R，7S)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦酰基]-1-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲基-2，5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(当q₁和q₂均为甲基时)。

在某些实施方案中，本发明提供的6-双取代的双环核苷由通式Ia表示：

其中星号各自独立地为羟基、保护的羟基、任选连接的偶联基团、报道基团、末端基团、活性磷基团、连接一种或多种核苷的核苷间键合或者此处讨论的或可用于反义技术的其它基团。

B_x为杂环碱基部分；

或q₁和q₂一起为＝C(q₃)(q₄)；

取代的基团各自独立地被独立地选自卤素、C₁-C₆烷基、取代的C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、取代的C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、取代的C₂-C₆炔基、OJ₁、SJ₁、NJ₁J₂、N₃、CN、C(＝O)OJ₁、C(＝O)NJ₁J₂、C(＝O)J₁、O-C(＝O)NJ₁J₂、N(H)C(＝O)NJ₁J₂或N(H)C(＝S)NJ₁J₂的取代基团单或多取代；并且

J₁和J₂各自独立地为H、C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、C₁-C₆氨烷基或保护基团。

在某些实施方案中，本发明提供的6-双取代的双环核苷具有通式Ia并且进一步具有如通式IIa所示的构型：

在某些实施方案中，本发明提供将细胞与至少一种本发明提供的寡聚化合物接触的方法，其中所述寡聚化合物与靶标RNA互补。所述细胞可以存在于动物中，优选人中。靶标RNA选自将产生一定益处的任何RNA，但优选mRNA、pre-mRNA或microRNA。在某些实施方案中，所述靶标RNA由于与所述寡聚化合物相互作用而被裂解，从而抑制其功能。本发明提供的所述方法的效率可通过各种标准或终点来评估，例如通过检测所述靶标RNA的水平、检测所述蛋白质的水平、或通过检测一种或多种表型结果来评估所述反义活性。

本发明提供的6-双取代的双环核苷可用于在一个或多个位置修饰寡聚化合物。经这样修饰的寡聚化合物可描述为具有特定的基序。所述术语“基序”指寡聚化合物中的核苷模式。所述模式由寡聚化合物内具有未修饰的(β-D-核糖核苷和/或β-D-脱氧核糖基核苷)和/或修饰的糖基团的核苷的定位来决定。每个位点的杂环碱基和核苷间键合的类型是可变的，不是决定寡聚化合物基序的因素。一种或多种其他基团的存在(包括但不限于加帽基团和偶联基团)也不是决定基序的因素。

用本发明提供的修饰的核苷来制备的某些基序包括但不限于：有间隙的基序、半修饰(hemimer)基序、阻断修饰(blockmer)基序、全修饰基序、定点修饰基序以及交替基序。结合这些基序，还可采用多种核苷间接头，包括但不限于单一或联合使用磷酸二酯和硫代磷酸酯键合。本发明提供的经修饰的核苷的定位和联接策略的使用可以容易地被优化，以使针对选定靶标的寡聚化合物的活性最大化。

教导了代表性基序的制备的代表性美国专利包括但不限于：5,013,830、5,149,797、5,220,007、5,256,775、5,366,878、5,403,711、5,491,133、5,565,350、5,623,065、5,652,355、5,652,356；以及5,700,922，其中的某些与本申请被共同拥有，其全文分别在此作为参考并入本发明中。基序在2005年6月2日提交并于2005年12月22日公开为WO 2005/121371的国际申请PCT/US2005/019219以及于2005年6月2日提交并于2005年12月22日公开为WO 2005/121372的PCT/US2005/019220中也有公开，其全文分别在此作为参考并入本发明中。

如此处所用的术语“gapmer”或“有间隙的寡聚化合物”指包含由具有3个区域的连续核苷序列组成的寡聚化合物，该序列具有内部区域并在5’和3’末端上各有一个外部区域。内部区域与外部区域通过具有不同的糖基团而加以区别。通常用于区分有间隙的寡聚化合物的各区域的核苷类型包括β-D-核糖核苷、β-D-2’-脱氧核糖基核苷、2’-经修饰的核苷、4’-硫代经修饰的核苷、4’-硫代-2’-经修饰的核苷和双环糖修饰的核苷。有间隙的寡聚化合物的每个区域基本上是均匀修饰的，例如至少内部区域的糖基团是一样的，但不同于每个外部区域。所述内部区域(间隙)通常包含β-D-脱氧核糖基核苷，但也可以是糖修饰的核苷序列。如本发明提供的优选的有间隙寡聚化合物包含由β-D-脱氧核糖基核苷组成的内部区域，每个外部区域包含具有通式III的双环核苷。

在某些实施方案中，有间隙的寡聚化合物的每个区域基本上为均匀修饰的，例如内部区域的糖基团基本是一样的，但不同于每个外部区域。所述内部区域(间隙)通常包含β-D-脱氧核糖基核苷，但也可以是糖修饰的核苷序列。所述内部区域或间隙通常包含β-D-脱氧核糖基核苷，但也可以是糖修饰的核苷序列。在某些实施方案中，有间隙的寡聚化合物包含具有由β-D-脱氧核糖基核苷组成的内部区域，以及包含经修饰的核的两个外部区域。有间隙寡聚化合物的例子在实施例部分举例说明。

在某些实施方案中，本发明提供包含位于5’-末端的一个或两个具有通式I的双环核苷、位于3’-末端的两个或三个具有通式I的双环核苷、以及由约10至约16个核苷组成的内部区域的有间隙寡聚化合物。在某些实施方案中，本发明提供包含位于5’-末端的一个具有通式I的双环核苷、位于3’-末端的两个具有通式I的双环核苷、以及由约10至约16个核苷组成的内部区域的有间隙寡聚化合物。在某些实施方案中，本发明提供包含位于5’-末端的一个具有通式I的双环核苷、位于3’-末端的两个具有通式I的双环核苷、以及由约10至约14个核苷组成的内部区域的有间隙寡聚化合物。在某些实施方案中，所述内部区域基本上为连续的β-D-脱氧核糖基核苷序列。在另一个实施方案中，本发明提供的寡聚化合物进一步包含一种或多种末端基团，其包括但不限于进一步修饰的或未修饰的核苷或连接的偶联基团。

在某些实施方案中，本发明提供的有间隙寡聚化合物的长度为约10至约21个核苷。在另一个实施方案中，本发明提供的有间隙寡聚化合物的长度为约12至约16个核苷。在某些实施方案中，本发明提供的有间隙寡聚化合物的长度为约12至约14个核苷。

此处所用的术语“取代基”和“取代基团”包括通常加至其它基团或母体化合物以增强所需属性或产生所需效果的基团。取代基团可以是被保护或未被保护的，并可加至母体化合物的一个或多个可用位点。取代基团还可进一步被其它取代基团所取代并且可以直接或通过连接基团(例如烷基或烃基基团)连接至母体化合物。所述基团包括但不限于：卤素、羟基、烷基、烯基、炔基、酰基(-C(O)R_aa)、羧基(-C(O)O-R_aa)、脂肪族基团、脂环族基团、烷氧基、取代的氧基(-O-R_aa)、芳基、芳烷基、杂环、杂芳基、杂芳基烷基、氨基(-NR_bbR_cc)、亚氨基(＝NR_bb)、酰氨基(-C(O)N-R_bbR_cc或-N(R_bb)C(O)R_aa)、叠氮基(-N₃)、硝基(-NO₂)、氰基(-CN)、脲基(-OC(O)NR_bbR_cc或-N(R_bb)C(O)OR_aa)、脲基(-N(R_bb)C(O)NR_bbR_cc)、硫脲基(-N(R_bb)C(S)NR_bbR_cc)、胍基(-N(R_bb)C(＝NR_bb)NR_bbR_cc)、脒基(-C(＝NR_bb)NR_bbR_cc或-N(R_bb)C(NR_bb)R_aa)、硫醇(-SR_bb)、亚磺酰(-S(O)R_bb)、磺酰(-S(O)₂R_bb)、磺胺基(-S(O)₂NR_bbR_cc或-N(R_bb)-S(O)₂R_bb)以及偶联基团。其中R_aa、R_bb和R_cc各自独立地为H、任选连接的化学官能团或其它取代基团，所述其它取代基团优选包括但不限于H、烷基、烯基、炔基、脂肪族、烷氧基、酰基、芳基、芳烷基、杂芳基、脂环族、杂环和杂芳基烷基。此处描述的化合物内选定的取代基团以递归度表示。

上下文中的“递归取代基”指取代基可以引用其本身的另一实例。由于该种取代基的递归性，理论上，在任意给定权利要求中可存在大量取代基。医药化学和有机化学领域的普通技术人员可理解所述取代基的总数受目标化合物的预期属性的合理限制。所述属性包括例如但不限于：分子量、溶解性或log P等物理属性，针对目标靶标的活性等应用属性，以及合成容易度等实施属性。

递归取代基为本发明的一个方面。医药和有机化学领域的普通技术人员可以理解该种取代基的多功能性。根据在本发明的权利要求所示的递归取代基的程度，可根据上文所述确定其总数。

此处所用的术语“酰基”指从有机酸去除羟基基团形成的并具有通式-C(O)-X的基团，其中X通常为脂肪族、脂环族或芳香族。例子包括脂肪族羰基、芳香羰基、脂肪磺酰、芳香磺酰、脂肪族亚磺酰、芳香磷酸盐、脂肪族磷酸盐等。此处所用的酰基基团任选地包括其它取代基团。

术语“脂环族的”或“脂环基”指环状的环系统，其中该环为脂肪族环。该环系统可包含一个或多个环，其中至少一个环为脂肪族环。优选的脂肪环包括环中具有约5至约9个碳原子的环。此处所用的脂肪环任选地包括其它取代基团。

此处所用的术语“脂肪族”指最多包含二十四个碳原子的直链或支链烃基，其中任意两个碳原子之间的饱和度为单、双或三键。脂肪族基团优选包含1至约24个碳原子，更通常包含1至约12个碳原子，更优选包含1至约6个碳原子。脂肪族基团的直链或支链可被一个或多个杂原子包括氮、氧、硫和磷等所中断。所述被杂原子中断的脂肪族基团包括但不限于聚烷氧基，例如聚亚烷基二醇、聚胺和聚亚胺。此处所用的脂肪族基团任选地包括其它取代基团。

此处所用的术语“烷氧基”指在烷基基团和氧原子之间形成的基团，其中该氧原子用于连接该烷氧基基团和母体分子。烷氧基基团的例子包括但不限于：甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、新戊氧基、正己氧基等。此处所用的烷氧基团任选地包括其它取代基团。

此处所用的术语“烷基”指含有最多二十四个碳原子的饱和直链或支链烃基。烷基基团的例子包括但不限于：甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、正己基、辛基、癸基、十二烷基等。烷基基团通常包含1至约24个碳原子，更通常包含1至约12个碳原子(C₁-C₁₂烷基)，更优选包含1至约6个碳原子。此处所用的术语“低级烷基”包含1至约6个碳原子。此处所用的烷基任选包含一个或多个进一步的取代基团。

此处所用的术语“烯基”指含有最多二十四个碳原子并至少具有一个碳-碳双键的直链或支链烃基。烯基基团的例子包括但不限于：乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基、二烯如1，3-丁二烯等。烯基基团通常包含2至约24个碳原子，更通常包含2至约12个碳原子，更优选包含2至约6个碳原子。此处所用的烯基任选地包含一个或多个进一步的取代基团。

此处所用的术语“炔基”指含有最多二十四个碳原子并至少具有一个碳-碳三键的直链或支链烃基。炔基基团的例子包括但不限于：乙炔基、1-丙炔基、1-丁炔基等。炔基基团通常包含2至约24个碳原子，更通常包含2至约12个碳原子，更优选包含2至约6个碳原子。此处所用的炔基任选地包含一个或多个进一步的取代基团。

此处所用的术语“氨烷基”指氨基取代的烷基。该术语包括在任何位置具有氨基取代基的C₁-C₁₂烷基基团，其中该烷基基团将该氨烷基连接至母体分子。氨烷基基团的烷基和/或氨基部分可以被取代基团进一步取代。

此处所用的术语“芳烷基”和“芳基烷基”指在烷基基团和芳基基团之间形成的基团，其中该烷基基团用于连接该芳烷基基团和母体分子。例子包括但不限于：苄基、苯乙基等。此处所用的芳烷基基团任选地包括与烷基、芳基或两者连接以形成基团的取代基团。

此处所用的术语“芳基”和“芳香族的”指具有一个或多个芳环的单或多环碳环系统基。芳基基团的实例包括但不限于：苯基、萘基、四氢化萘基、茚满基、茚基等。优选的芳基环系统在一个或多个环中具有约5至约20个碳原子。此处所用的芳基基团任选地包括其它取代基团。

此处所用的术语“卤素”指选自氟、氯、溴和碘的原子。

如此处所用的术语“卤代烷基”是指具有如上定义的烷基，其中一个或多个氢被卤素替代。具体包括单卤代烷基、二卤代烷基和多卤代烷基。单卤代烷基，例如，在该基团内可具有一个碘、溴、氯或氟原子。二卤代烷基和多卤代烷基可具有两个或更多个相同的卤原子或不同的卤代基团的组合。卤代烷基的实例包括氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、五氟乙基、七氟丙基、二氟氯甲基、二氯氟甲基、二氟乙基、二氟丙基、二氯乙基和二氯丙基。如此处所用的术语“全卤烷基”指其中所有氢原子为卤原子所取代的烷基。“卤代亚烷基”是指在两个或更多个位置连接的卤代烷基。实例包括氟亚甲基(-CFH-)、二氟亚甲基(-CF₂-)、氯亚甲基(-CHCl-)等。

此处所用的术语“杂芳基”和“杂芳香族的”指包含单或多环芳香环、环状系统或稠环系统的基团，其中至少一个环为芳香族的，并且包含一个或多个杂原子。杂芳基还包括稠环系统，其中一个或多个稠环不包含杂原子。杂芳基通常包含一个选自硫、氮或氧的环原子。杂芳基基团的例子包括但不限于：吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、苯硫基、呋喃基、四氢喹啉基、异四氢喹啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、喹喔啉基等。杂芳基基团可直接或通过脂肪族基团或杂原子等连接部分连接至母体分子。此处所用的杂芳基基团任选地包括其它取代基。

此处所用的术语“杂芳基烷基”指具有如前文所定义的杂芳基基团具有将其连接至母体分子的烷基基团。例子包括但不限于：吡啶甲基、嘧啶乙基、萘啶丙基(napthyridinylpropyl)等。此处所用的杂芳基烷基基团任选地包括杂芳基或烷基部分的一个或两个上的其它取代基团。

此处所用的术语“杂环基”指包含至少一个杂原子并且是不饱和、部分饱和或完全饱和的单或多环的环系统，包括杂芳基基团。杂环还包括稠环系统，其中一种或多种稠环包含至少一个杂原子而其它环可包含一个或多个杂原子或任选地不包含杂原子。杂环基团通常包含至少一个选自硫、氮或氧的原子。杂环基团的例子包括[1，3]二氧戊环、吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、四氢噻唑基、异四氢噻唑基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基等。

此处所用的杂环基任选地包含其它取代基团。

术语“烃基”包括包含C、O、H的基团。包括具有任意饱和度的直链、支链和环状基团。这样的烃基基团可包括一个或多个选自N、O和S的杂原子并可进一步被一或多个取代基单或多取代。

本发明中采用的术语“单或多环结构”包括具有稠和或连接的环的单或多环环系统，并包括单独选自脂肪族、脂环族、芳基、杂芳基、芳烷基、芳基烷基、杂环、杂芳基、杂芳香基、杂芳基烷基的单独和混合环系统。所述单或多环结构包含均一或变化的饱和度(包括完全饱和、部分包含或完全不饱和)的环。各个环可包含选自C、N、O和S的环原子以形成杂环以及存在于混合基序中的仅含有C环原子的环，所述混合基序例如苯并咪唑，其中一个环仅具有碳环原子而稠合的环具有两个氮原子。单或多环结构可进一步被取代基团取代，例如，具有连接至其中一个环的两个＝O的邻苯二甲酰亚胺。在其它方面，单或多环结构可直接通过环原子、通过取代基团或双功能连接部分连接至母体分子。

术语“氧代”指基团(＝O)。

术语“双环核酸”或”BNA”或“双环核苷”或“双环核苷酸”指这样的核苷或核苷酸，其中核苷的呋喃糖部分包含连接呋喃糖环上两个碳原子的桥基，从而形成双环环状系统。

术语“嵌合的寡聚化合物”或“嵌合的寡核苷酸”指具有至少一个糖、核酸碱基或核苷间键合的寡聚化合物或寡核苷酸，其相对于天然存在的连接的核苷为经修饰的。其他糖、核酸碱基和核苷间键合可以独立地为修饰的或未修饰的，其中每个核苷和键合可以相同或不同。

术语“稳定的化合物”和“稳定的结构”指具有足够稳固性而可从反应混合物分离至有用的纯度，并制成有效的治疗剂的化合物。此处仅涉及稳定的化合物。

连接基团或双功能连接部分，如本领所知的那些连接基团或双功能连接部分可与本发明提供的寡聚化合物一起使用。连接基团可用于将化学官能团、偶联基团、报道基团和其它基团连接至母化合物(例如寡聚化合物)的选定位点。一般而言，双功能连接部分包含具有两个官能团的烃部分。选择一个官能团结合母体分子或目标化合物，选择另一基团结合几乎任意选定的基团，例如化学官能团或偶联基团。在一些实施方式中，该接头包含链结构或重复单元如乙二醇或氨基酸单元的寡聚体。在双功能连接部分中常用的官能团的例子包括但不限于：用于与亲核基团反应的亲电子试剂以及用于与亲电子反应的亲核试剂。在一些实施方式中，双功能连接部分包括氨基、羟基、羧酸、硫醇、不饱和键(例如，双或三键)等。双功能连接部分的部分非限制性例子包括：8-氨基-3，6-二氧杂辛酸(ADO)、琥珀酰亚胺4-[N-甲基马来酸]-1-羧环己烷(SMCC)、以及6-氨基己酸(AHEX或AHA)。其它的连接基团包括但不限于：取代的C₁-C₁₀烷基、取代的或未取代的C₂-C₁₀烯基、或取代的或未取代的C₂-C₁₀炔基，其中优选取代基团的非限制性列表包括：羟基、氨基、烷氧基、羧基、苯甲基、苯基、硝基、硫醇、硫烷氧基、卤素、烷基、芳基、烯基、以及炔基。

在某些实施方案中，寡聚化合物通过一个或多个5’或3’-末端基团的共价附着而修饰。如此处所用的术语“末端基团”指包括本领域技术人员所知的有用基团，其为了不同的目的如能够追踪所述寡聚化合物(荧光标记或其他的报道基团)、提高所述寡聚化合物的药物动力学或药效(用于增强摄取和递送的基团)或提高所述寡聚化合物的一种或多种其他的目标性质(用于提高核酸酶稳定性或结合亲和力的基团)而可位于寡聚化合物的3’和5’-末端的一端或两端。在某些实施方案中，3’和5’-末端基团包括但不限于，一种或多种经修饰的或未经修饰的核苷、偶联基团、加帽基团、磷酸盐部分和保护基团。

在某些实施方案中，寡聚化合物通过一种或多种偶联基团的共价附着而修饰。通常，偶联基团修饰所附着的寡聚化合物的一种或多种性质，包括但不限于药效动力学、药代动力学、结合、吸收、细胞分布、细胞摄取、储存和清除。偶联基团通常用于化学领域并且直接或通过任选的连接部分或连接基团连接至母体化合物如寡聚化合物。优选的偶联基团包括但不限于：嵌入剂、报道分子、聚胺、聚酰胺、聚乙烯乙二醇、硫醚、聚醚、胆固醇、硫胆固醇、胆酸部分、叶酸、脂、磷脂、生物素、吩嗪、菲啶、蒽醌、金刚烷、吖啶、荧光素、若丹明、香豆素和染料。

此处所用的术语“保护基团”指本领域中已知的在合成过程中保护反应性基团以避免发生不需要的反应的不稳定化学部分，包括但不限于：羟基、氨基和硫醇基团。保护基团通常可以选择性地和/或正交地使用以在其它位点的反应中保护位点，并可随后去除以留下未保护基团或供进一步反应。本领域已知的保护基团一般地描述于Greene和Wuts，Protective Groups in OrganicSynthesis，第三版，John Wiley&Sons，New York(1999)。

基团可作为前体选择性地结合至本发明的寡聚化合物。例如，氨基基团可以作为叠氮基团结合至本发明的化合物，该叠氮基团可在合成的目标位点上化学转化为氨基基团。一般来说，基团可被保护或作为对反应惰性的前体存在，该反应修饰母体分子其它部位的反应以在适当的时间转化成为其最终基团。其它对代表性保护或前体基团的讨论参见Agrawal，等人，Protocols forOligonucleotide Conjugates，Eds，Humana Press；New Jersey，1994；Vol.26第1-72页。

羟基保护基团的例子包括但不限于：乙酰基、叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氢吡喃基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、对氯苯基、2，4-二硝基苯基、苄基、2，6-二氯苄基、二苯基甲基、对硝基苄基、双(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、2-三甲基甲硅烷乙基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、三苯甲硅烷基、[(三异丙基甲硅烷基)氧基]甲基(TOM)、苯甲酰甲酸盐、氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、特戊酰基、苯甲酰基、对苯基苯甲酰基、9-芴甲基碳酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、三苯甲基(trityl)、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基(DMT)、三甲氧基三苯甲基、1(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(FPMP)和取代的9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)。其中更优选的羟基保护基团包括但不限于，苯甲基、2，6-二氯苯甲基、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基、苯甲酰基、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、二甲氧基三苯甲基(DMT)和取代的9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)。

氨基保护基团的实例包括但不限于：氨基甲酸盐保护基团，例如，2-三甲基硅烷基乙氧基羰基(Teoc)、1-甲基-1-(4-联苯基)-乙氧基羰基(Bpoc)、叔丁氧基羰基(BOC)、烯丙氧基羰基(Alloc)、9-芴甲基甲基氧基羰基(Fmoc)、以及苯甲基氧基羰基(Cbz)；酰胺保护基团，例如甲酰基、乙酰基、三卤代乙酰基、苯甲酰基、以及硝基苯基乙酰基；磺酰胺保护基团，例如2-硝基苯磺酰基；以及亚胺和环状酰亚胺保护基团，例如苯二甲酰亚胺和二硫琥珀酰基。硫醇保护基团的实例包括但不限于，三苯甲基(trityl)、苯甲基(Bn)等。

在某些实施方案中，通过用任选保护的含磷核苷间键合来连接核苷以制备低聚化合物。含磷核苷间键合(例如磷酸二酯和硫代磷酸酯键合)的代表性保护基团包括：β-氰乙基、二苯基硅乙基、δ-氰丁烯基、氰对二甲苯基(CPX)、N-甲基-N-三氟乙酰乙基(META)、乙酰氧基苯氧基乙基(APE)以及丁烯-4-基基团。例如参见美国专利4,725,677以及Re.34，069(β-氰乙基)；Beaucage，S.L.和Iyer，R.P.，Tetrahedron，49No.10，第1925-1963页(1993)；Beaucage，S.L.和Iyer，R.P.，Tetrahedron，49 No.46，第10441-10488页(1993)；Beaucage，S.L.和Iyer，R.P.，Tetrahedron，48No.12，第2223-2311页(1992)。

此处所用的术语“正交地保护”指以不同类别的保护基团保护的功能基团，其中各类别的保护基团可以以任意顺序并在所有其它类别存在的情况下去除(参见，Barany，G.和Merrifield，R.B.，J.Am.Chem.Soc，1977，99，7363；idem，1980，102，3084)。正交保护已在自动寡核苷酸合成等领域得到广泛应用。在一种或多种不受去阻断过程影响的其它保护功能基团的存在下，将功能基团去阻断。该去阻断的功能基团以某种形式反应，在某一时点其它的正交保护基团在不同的反应条件组合下被去除。这使得可以采用选择性化学方法以产生目标化合物或寡聚化合物。

在某些实施方案中，本发明提供了具有可用于形成核苷间键合(包括例如磷酸二酯和硫代磷酸酯核苷间键合)的活性磷基团的化合物。所述活性磷基团已为本领域所知并包含处于P^III或P^V价态的磷原子，包括但不限于：亚磷酰胺、H-磷酸酯、磷酸三酯和含磷手性助剂。优选的合成的固相合成采用亚磷酰胺(P^III化学剂)作为反应性亚磷酸。在优选的实施方案中，中间体亚磷酸化合物随后通过已知的方法被氧化至P^V状态以获得磷酸二酯或硫代磷酸酯核苷酸间键合。其它的活性磷酸酯和亚磷酸披露于Tetrahedron Report Number309(Beaucage和Iyer，Tetrahedron，1992，48，2223-2311)。

如此处所用的术语“核苷间键合”或“核苷间连接基团”指包括本领域已知的所有方式的核苷间连接基团，其包括但不限于含有核苷间连接基团的磷如磷酸二酯和硫代磷酯、含有核苷间连接基团如乙酰基和亚甲基亚氨基的非-磷、以及中性非离子的核苷间连接基团如酰胺-3(3’-CH₂-C(＝O)-N(H)-5’)、酰胺-4(3’-CH₂-N(H)-C(＝O)-5’)。

可用于本发明的寡聚化合物的特定例子包括含有修饰的(例如，非天然存在的)核苷间键合的寡核苷酸。通过磷原子的存在或缺失可定义核苷间键合的两个主要类别。具有磷原子的修饰的核苷间键合包括但不限于：硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基磷酸酯(包括3’-亚烃基磷酸酯、5’-亚烃基磷酸酯以及手性磷酸酯)、亚磷酸酯、磷酰胺(包括3’-氨基磷酰胺和氨烷基磷酰胺)、硫羰基磷酰胺、硫羰基烷基磷酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、具有正常3’-5’键合的硒代磷酸酯和硼代磷酸酯及其2’-5’连接的类似物、以及具有反转极性的硒代磷酸酯和硼代磷酸酯，其中一种或多种核苷酸间键合为3’至3’、5’至5’或2’至2’键合。具有反转极性的寡核苷酸可在3’-最末端键合处包含单个3’至3’键合，即可以是无碱基(核碱基缺失或该位置被羟基取代)的单个反转核苷残基。包括多种盐、混合盐和游离酸的形式。

教导上述含磷键合的代表性美国专利包括但不限于：U.S.：3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361、5,194,599、5,565,555、5,527,899、5,721,218、5,672,697以及5,625,050，其中的一些与本申请被共同拥有，其全文分别在此作为参考并入本发明中。

不具有磷原子的修饰的核苷间键合包括但不限于：由短链烷基或环烷基核苷间键合构成的核苷间键合、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键合构成的核苷间键合、或者一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键合构成的核苷间键合。其包括具有硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲缩醛和硫甲缩醛主链；亚甲基甲缩醛和硫甲缩醛主链；核糖乙酰主链；含烯烃主链；氨基磺酸盐主链；亚甲基亚胺和亚甲基肼基主链；磺酸盐和磺酰胺主链；酰胺主链；和其它具有混合的N、O、S和CH₂的组成部分的核苷间键合。在本发明的上下文中，术语“寡核苷”指由不带磷原子的核苷间键合连接的核苷序列。

教导了上述寡核苷的制备的代表性美国专利包括但不限于：U.S.：5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,264,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,610,289、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437、5,792,608、5,646,269以及5,677,439，其中的一些与本申请被共同拥有，其全文分别在此作为参考并入本发明中。

核苷间连接基团还包括含有或不含有磷原子的中性核苷间连接基团。如此处所用的短语“中性核苷间键合”指包括非离子的核苷间键合。所述中性核苷间键合包括但不限于：磷酸三酯、甲基膦酸酯、MMI(3’-CH₂-N(CH₃)-O-5’)、酰胺-3(3’-CH₂-C(＝O)-N(H)-5’)、酰胺-4(3’-CH₂-N(H)-C(＝O)-5’)、甲缩醛(3’-O-CH₂-O-5’)和硫代甲缩醛(3’-S-CH₂-O-5’)。另外的中性核苷间键合包括非电离的键合，其包括硅氧烷(二烷基硅氧烷)、羧酸酯、羧酰胺、硫化物、磺酸酯和酰胺(参见例如：Carbohydrate Modifications in Antisense Research；Y.S.Sanghvi和P.D.CookEds.ACS Symposium Series 580；第3和4章，(第40-65页))。另外的中性核苷间键合包括非电离的键合，其包括混合的N、O、S和CH₂组成部分。

此处描述的化合物包含一个或多个不对称中心，并因此形成了对映体、非对映体、以及其它立体异构形式，其从绝对立体化学而言可定义为(R)-或(S)-，α或β，或是(D)-或(L)-(如针对氨基酸和核苷时)。所有这些可能的异构体，以及它们的外消旋形式和光学纯的形式均适用于本发明提供的寡聚化合物。光学异构体可通过上述的步骤由其相应的光学活性前体制备，或通过拆分外消旋混合物进行制备。所述拆分可在拆分剂的存在下，通过色谱或重复结晶或这些本领域技术人员已知技术的组合进行。有关拆分进一步的细节可参见Jacques，等人，Enantiomers，Racemates，and Resolutions(John Wiley&Sons，1981)。当此处所述的化合物包含烯烃双键、其它不饱和性、或其它几何不对称中心时，除非另行指明，该化合物意在同时包括E和Z几何异构体或顺式(cis-)和反式(trans-)异构体。同样地，同样意在包括所有的互变异构形式。此处所示的任意碳-碳双键的构型仅为方便目的被选择，若非文中指明，并非意在指定特定的构型；因此，此处任意描述为反式的碳-碳双键或碳-杂原子双键可以是顺式、反式或任意比例的两者的混合物。

本发明的上下文中的术语“寡聚化合物”指至少具有一个区域能与核酸分子杂交的聚合物。术语“寡聚化合物”包括寡核苷酸、寡核苷酸类似物和寡核苷以及核苷酸模拟物和/或包含核酸和非核酸成分的混合聚合物。术语“寡聚化合物”还包括包含连接的单体亚单位的聚合物，其中所述单体亚单位包括核苷、修饰的核苷、核苷类似物、核苷模拟物以及非-核酸组分如偶联基团。在某些实施方案中，单体亚单位的混合物(例如但不限于所列的那些)提供下述寡聚化合物，所述寡聚化合物对于如治疗和诊断的应用具有增强的性质。由于仍然存在碱基和核糖，本发明提供的双环核苷被归类为修饰的核苷。所述单体亚单位可通过天然存在的磷酸二酯核苷间键合或者通过此处公开的任何多个核苷间键合连接，核苷间键合例如但不限于硫代磷酯核苷间键合或其混合物。

通常，寡聚化合物包含连接的单体亚单位的主链，其中每个连接的单体亚单位直接或间接附着于杂环碱基部分。寡聚化合物还可包含不连接至杂环碱基部分的单体亚单位从而提供非碱基位点。所述连接单体亚单位、糖部分或替代物和杂环碱基部分的键合可被独立地修饰。所述键合-糖单元，其可能包含或不包含杂环碱基，可以用模拟物例如肽核酸单体代替。在寡聚化合物每个位点进行修饰或取代部分或全部单体的能力可产生大量可能的基序。

寡聚化合物通常可常规线性制备，也可被连接或以其它方式制备成环状，并且还可包含分支。寡聚化合物可形成双链构建体，例如，杂交形成双链组合物的双链。该双链组合物可被连接或分离并可在末端包含突出(overhangs)。

如本领域所知，核苷是碱基-糖组合。核苷的碱基部分通常为杂环碱基部分。所述杂环碱基最常见的两种类别为嘌呤和嘧啶。核苷酸为进一步包含共价连接至核苷糖部分的磷酸基团的核苷。对于包含了呋喃戊糖的核苷，该磷酸基团可被联接至糖的2’、3’或5’羟基部分。在形成寡核苷酸时，该磷酸基团共价连接彼此相邻的核苷以形成线性聚合化合物。可以连接该线性聚合结构的相应末端以通过杂交或通过形成共价键得到环状结构，然而，通常希望开放的线性结构。在寡核苷酸结构中，磷酸基团通常形成寡核苷酸的核苷间连接。RNA和DNA的常见核苷间连接为3’至5’磷酸二酯联接。

如此处所用的，术语“寡核苷酸”指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)的寡聚体或聚合物。该术语包括由天然存在的核苷碱基、糖和共价核苷间连接构成的寡核苷酸。术语“寡核苷酸类似物”指具有一个或多个非天然存在部分的寡核苷酸。该种非天然存在的寡核苷酸由于其具有理想的性质而通常比天然存在的形式更理想，例如，细胞摄取提高，对核酸靶标的亲和力增强以及在核酸酶存在下的稳定性提高。

如此处所用的，术语“寡核苷”指由不带磷原子的核苷间键合连接的核苷序列。该种类型的核苷间键合包括短链烷基、环烷基、混合杂原子烷基、混合杂原子环烷基、一或多种短链杂原子以及一或多种短链杂环。这些核苷间键合包括但不限于：硅氧烷、硫化物、亚砜、砜、乙酰基、甲缩醛、硫甲缩醛、亚甲基甲缩醛、硫甲缩醛、烯基、氨基磺酸盐、亚甲基亚胺基、亚甲基肼基、磺酸盐、磺酰胺、酰胺和其它具有混合的N、O、S和CH₂的组成部分的核苷间键合。

教导制备上述寡核苷的代表性美国专利包括但不限于：U.S.：5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,264,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,610,289、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437、5,792,608、5,646,269以及5,677,439，其中的一些与本申请被共同拥有，其全文分别在此作为参考并入本发明中。

如此处所用的术语“核苷碱基”或“杂环碱基部分”意在与“核酸碱基或其模拟物”同义。一般而言，核苷碱基为含有一个或多个能与核酸碱基氢联接结合的单个或多个杂环部分。

如此处所用的术语“未修饰的核苷碱基”或是“天然的核苷碱基”包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。如此处所用的术语“修饰的核苷碱基”包括其它合成的和天然的核苷碱基，例如：5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH₃)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其它炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-去氮鸟嘌呤和7-去氮腺嘌呤、3-去氮鸟嘌呤和3-去氮腺嘌呤、通用碱基、疏水碱基、混杂碱基、大小扩增的碱基以及此处定义的氟化碱基。其它修饰的核苷碱基包括三环嘧啶如吩噁嗪胞啶(1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞啶(1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G型夹(G-clamps)例如取代的吩噁嗪胞啶(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞啶(2H-嘧啶并[4，5-b]吲哚-2-酮)、吡啶吲哚胞啶(H-吡啶[3’，2’：4，5]吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-酮)。修饰的核苷碱基还可包括以其它杂环取代嘌呤或嘧啶碱基的核苷碱基，例如7-去氮-腺嘌呤、7-去氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。其它的核苷碱基包括披露于美国专利3,687,808的核苷碱基，披露于The Concise Encyclopedia Of PolymerScience And Engineering，第858-859页，Kroschwitz，J.I.编，John Wiley&Sons，1990的核苷碱基；披露于Englisch等人，Angewandte Chemie，InternationalEdition，1991，30，613的核苷碱基；以及披露于Sanghvi，Y.S.，第15章，Antisense Research and Applications，第289-302页，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编，CRC Press，1993的核苷碱基。

修饰的核苷碱基包括但不限于，此处定义的通用碱基、疏水碱基、混杂碱基、大小扩增碱基以及氟化碱基。这些核苷碱基中的一些可特别用于提高本发明的寡聚化合物的结合亲和力。这些核苷碱基包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代基已显示可以提高核酸双链稳定性0.6-1.2℃(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编，Antisense Research andApplications，CRC Press，Boca Raton，1993，第276-278页)并且是目前优选的碱基取代基，特别是在与2’-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。

教导制备某些上述提到的修饰核苷碱基以及其它修饰的核苷碱基的代表性美国专利包括但不限于，上述美国专利3,687,808以及美国专利：4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,830,653；5,763,588；6,005,096；以及5,681,941，其中某些专利为与本申请共同拥有的专利，各专利全文在此作为参考并入本发明中；以及美国专利5,750,692，其为与本申请共同拥有的专利，并在此作为参考并入本发明中。

本发明的寡聚化合物还可包含一种或多种具有修饰糖部分的核苷。呋喃基糖环可以多种方式修饰，包括以取代基取代(2’、3’、4’或5’)，桥连形成BNA以及以S或N(R)等杂原子取代4’-O。教导制备这种修饰糖的的部分代表性美国专利包括但不限于，美国专利：4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；5,700,920；6,600,032以及于2005年6月2日提交并于2005年12月22日公开为WO 2005/121371的国际申请PCT/US2005/019219，其中一部分为与本申请共同拥有的申请或专利，各文献全文在此作为参考并入本发明中。优选的修饰糖的代表性列表包括但不限于：具有2’-F、2’-OCH₂或2’-O(CH₂)₂-OCH₃取代基(2’-MOE或仅为MOE)的取代糖；4’-硫代修饰的糖以及双环修饰的糖。

此处所用的术语“核苷模拟物”意在包括那些用于替换寡聚化合物的一个或多个位点的糖或非联接的糖和碱基的结构，例如，具有吗啉或双环[3.1.0]己基糖模拟物(例如，具有磷酸二酯联接的非呋喃糖)的核苷模拟物。术语“糖替代物”与含义更广的术语“核苷模拟物”重叠，但意指糖单元(仅呋喃糖环)的替换。术语“核苷酸模拟物”意在包括用于替换寡聚化合物的核苷和一个或多个位点键合的结构，例如，肽核酸或吗啉(被-N(H)-C(＝O)-O-或其它非-磷酸二酯键合的吗啉)。在某些实施方案中，本发明提供的寡聚化合物可在长度上包含约8至约80个的核苷和/或修饰核苷或模拟物。本领域的普通技术人员将可理解本发明包含8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个或其中任意范围的核苷和/或修饰核苷或模拟物长度的寡聚化合物。

在某些实施方案中，本发明提供的寡聚化合物为8至40个的核苷和/或修饰核苷或模拟物的长度。本领域普通技术人员将可理解其可具体为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个或其中任意范围的核苷和/或修饰核苷或模拟物长度的寡聚化合物。

在某些实施方案中，本发明的寡聚化合物为8至20个的核苷和/或修饰核苷或模拟物长度。本领域普通技术人员将可理解其可具体为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或其中任意范围的核苷和/或修饰核苷或模拟物长度的寡聚化合物。

在某些实施方案中，本发明的寡聚化合物为10至16个的核苷和/或修饰核苷或模拟物的长度。本领域普通技术人员将可理解其可具体为10、11、12、13、14、15或16或其中任意范围的核苷和/或修饰核苷或模拟物长度的寡聚化合物。

在某些实施方案中，本发明的寡聚化合物为12至16个的核苷和/或修饰核苷或模拟物的长度。本领域普通技术人员将可理解其可具体为12、13、14、15或16或其中任意范围的核苷和/或修饰核苷或模拟物长度的寡聚化合物。

在某些实施方案中，本发明的寡聚化合物为10至14个的核苷和/或修饰核苷或模拟物的长度。本领域普通技术人员将可理解其可具体为10、11、12、13或14个或其中任意范围的核苷和/或修饰核苷或模拟物长度的寡聚化合物。

在某些实施方案中，本发明提供的所述寡聚化合物具有任何长度范围的连接的单体亚单位。在某些实施方案中，本发明提供由X-Y连接的单体亚单位组成的寡聚化合物，其中X和Y分别独立地选自8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50；条件是X＜Y。例如，在某些实施方案中，本发明提供的寡聚化合物包含8-9、8-10、8-11、8-12、8-13、8-14、8-15、8-16、8-17、8-18、8-19、8-20、8-21、8-22、8-23、8-24、8-25、8-26、8-27、8-28、8-29、8-30、9-10、9-11、9-12、9-13、9-14、9-15、9-16、9-17、9-18、9-19、9-20、9-21、9-22、9-23、9-24、9-25、9-26、9-27、9-28、9-29、9-30、10-11、10-12、10-13、10-14、10-15、10-16、10-17、10-18、10-19、10-20、10-21、10-22、10-23、10-24、10-25、10-26、10-27、10-28、10-29、10-30、11-12、11-13、11-14、11-15、11-16、11-17、11-18、11-19、11-20、11-21、11-22、11-23、11-24、11-25、11-26、11-27、11-28、11-29、11-30、12-13、12-14、12-15、12-16、12-17、12-18、12-19、12-20、12-21、12-22、12-23、12-24、12-25、12-26、12-27、12-28、12-29、12-30、13-14、13-15、13-16、13-17、13-18、13-19、13-20、13-21、13-22、13-23、13-24、13-25、13-26、13-27、13-28、13-29、13-30、14-15、14-16、14-17、14-18、14-19、14-20、14-21、14-22、14-23、14-24、14-25、14-26、14-27、14-28、14-29、14-30、15-16、15-17、15-18、15-19、15-20、15-21、15-22、15-23、15-24、15-25、15-26、15-27、15-28、15-29、15-30、16-17、16-18、16-19、16-20、16-21、16-22、16-23、16-24、16-25、16-26、16-27、16-28、

16-30、17-18、17-19、17-20、17-21、17-22、17-23、17-24、17-25、17-26、17-27、17-28、17-29、17-30、18-19、18-20、18-21、18-22、18-23、18-24、18-25、18-26、18-27、18-28、18-29、18-30、19-20、19-21、19-22、19-23、19-24、19-25、19-26、19-29、19-28、19-29、19-30、20-21、20-22、20-23、20-24、20-25、20-26、20-27、20-28、20-29、20-30、21-22、21-23、21-24、21-25、21-26、21-27、21-28、21-29、21-30、22-23、22-24、22-25、22-26、22-27、22-28、22-29、22-30、23-24、23-25、23-26、23-27、23-28、23-29、23-30、24-25、24-26、24-27、24-28、24-29、24-30、25-26、25-27、25-28、25-29、25-30、26-27、26-28、26-29、26-30、27-28、27-29、27-30、28-29、28-30或者29-30个连接的单体亚单位。

在某些实施方案中，所述寡聚化合物的长度范围包括8-16、8-20、8-40、10-12、10-14、10-16、10-18、10-20、10-21、12-14、12-16、12-18、12-20和12-24个连接的单体亚单位。

在某些实施方案中，修饰和未修饰的核苷及其模拟物的寡聚可参照文献描述的针对DNA(Protocols for Oligonucleotides and Analogs，Ed.Agrawal(1993)，Humana Press)和/或RNA(Scaringe，Methods(2001)，23，206-217；Gait等人，Applications of Chemically synthesized RNA in RNA：ProteinInteractions，Ed.Smith(1998)，1-36；Gallo等人，Tetrahedron(2001)，57，5707-5713)合成的适当方法来进行。固相合成的其它方法可参见Caruthers的美国专利4,415,732、4,458,066、4,500,707、4,668,777、4,973,679、和5,132,418以及Koster的美国专利4,725,677和Re.34,069。

常规用于基于支持基质合成寡聚化合物和相关化合物的的市售设备已由多家供应商出售，包括，例如Applied Biosystems(Foster City，CA)。本领域已知的任何其它该类合成方法均可另外或替代性采用。适用的固相技术(包括自动合成技术)的描述可见F.Eckstein(编)，Oligonucleotides and Analogues，aPractical Approach，Oxford University Press，New York(1991)。

随着对RNAi研究的深入，RNA和相关类似物的合成相对于DNA和相关类似物的合成也逐渐增加。目前在商业上采用的初级RNA合成策略包括5’-O-DMT-2’-O-叔丁基二甲基硅烷基(TBDMS)、5’-O-DMT-2’-O-[1(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基](FPMP)、2’-O-[(三异丙基硅烷基)氧基]甲基(2’-O-CH₂-O-Si(iPr)₃(TOM)、以及5’-O-硅醚-2’-ACE(5’-O-二(三甲基硅氧基)环十二烷氧基硅醚(DOD)-2’-O-二(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)。目前提供RNA产品的主要的公司包括Pierce Nucleic Acid Technologies、DharmaconResearch公司、Ameri Biotechnologies公司和Integrated DNA Technologies公司。Princeton Separations公司正在推广RNA合成活化剂，该活化剂据宣传可以特别针对TOM和TBDMS化学法减少偶联次数。

用于商业RNA合成的初级基团为：

TBDMS＝5’-O-DMT-2’-O-叔丁基二甲基硅烷基；

TOM＝2’-O-[(三异丙基硅烷基)氧基]甲基；

DOD/ACE＝(5’-O-二(三甲基硅氧基)环十二烷氧基硅醚-2’-O-二(2-乙酰氧基乙氧基)甲基；

FPMP＝5’-O-DMT-2’-O-[1(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基]。

在某些实施方案中，前述的RNA合成策略以及上述策略的混合(例如，采用一种策略中的5’-保护基团和另一策略中的2’-O-保护基团)均包括在本发明可适用的制备寡聚体的方法中。

在本发明的上下文中，“杂交”指寡聚化合物互补链的配对。在某些实施方案中，一种配对机制涉及寡聚化合物链的互补核苷或核苷酸碱基(核苷碱基)之间的氢键结合，其可以是Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键结合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶为通过形成氢键进行配对的互补核苷碱基。杂交可在多种条件下进行。

如果化合物与目标核酸的结合干扰该目标核酸的正常功能而导致活性丧失，且具有足够的互补性程度，从而避免在需要特异性结合的情况下(即在体内测定或治疗的生理条件下和在进行体外测定的条件下)该寡聚化合物与非目标核酸序列发生非特异性结合，则该寡聚化合物是可特异性地杂交的。

此处所用的“互补”指两个碱基核苷在任意位置下精确配对的能力。例如，如果在寡聚化合物某一位置的核苷碱基能够与目标核酸(该目标核酸为DNA、RNA或寡核苷酸分子)的某一位置的核苷碱基氢键结合，则该寡核苷酸和目标核酸之间的氢键结合的位置被认为是互补位置。当各分子中的互补位置被可以彼此氢键结合的核苷碱基占据时，该寡聚化合物和其它DNA、RNA或寡核苷酸分子彼此是互补的。因此，术语“可特异性杂交”和“互补”用于表明足量核苷碱基精确配对或互补的程度足以使寡核苷酸和目标核酸之间形成稳定且特异性的结合。

在本领域中可以理解，寡聚化合物的序列不需要与其目标核酸的序列具有100％的互补性以达到可特异性可杂交。此外，寡核苷酸可在一个或多个片段上杂交从而使中间的或邻近的片段不参与杂交(例如，环结构或发夹结构)。本发明提供的寡聚化合物与其靶向的目标核酸序列中的目标区域具有至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％的序列互补性。例如，当寡聚化合物20个核苷中有18个与目标区域互补时，该寡聚化合物应该是可特异性杂交的，且表示具有90％互补性。在该例子中，剩余的非互补核苷碱基可以成簇或散布在互补核苷碱基中，不需要彼此邻近或与互补核苷碱基邻近。同样地，如果长度为18个核苷碱基的寡聚化合物具有4个非互补性核苷碱基，其中所述4个非互补性核苷碱基侧翼连接两个与目标核酸完全互补的区域，则该寡聚化合物与目标核酸具有77.8％的总体互补性，并因而包含在本发明的范围之内。寡聚化合物与目标核酸的互补性百分比可通过本领域已知的BLAST程序(基本的局部对比排列搜索工具)和PowerBLAST程序常规地测定(Altschul等人，J.Mol.Biol.，1990，215，403-410；Zhang和Madden，GenomeRes.，1997，7，649-656)。

本发明提供的寡聚化合物还包括但不限于：反义寡聚化合物、反义寡核苷酸、核酶、外源指导序列(EGS)寡核苷酸、选择性剪切体、引物、探针，以及与目标核酸的至少一个部分杂交的其它寡聚化合物。因此，这些寡聚化合物可以以单链、双链、环状或发夹寡聚化合物的形式引入，并可包含内部或末端突起或环等结构元件。本发明的寡聚化合物一旦引入系统后，就可引发一种或多种酶或结构蛋白的作用以实现对目标核酸的修饰。

所述酶的非限制性例子之一为RNAse H，一种裂解RNA:DNA双链的RNA链的细胞核酸内切酶。本领域已知“类DNA”单链寡聚化合物引发RNAseH。RNAse H的激活可导致RNA靶标的裂解，从而大大增强寡核苷酸-介导的基因表达抑制的效率。其它的核糖核酸酶(例如属于RNAse RII和核糖核酸酶L酶家族的核糖核酸酶)也推定具有类似的作用。

尽管寡聚化合物的一种形式为单链反义寡核苷酸，但已经表明在许多物种中引入双链结构，例如双链RNA(dsRNA)分子可导致基因或其相关基因产物反义-介导功能的强且特异性降低。该现象同时存在于植物和动物，并被认为与病毒防御和转座子沉默具有进化性联系。

在某些实施方案中，在筛选调节选定蛋白表达的其它寡聚化合物中可采用“适当的目标片段”。“调节剂”为降低或提高编码蛋白的核酸分子的表达，且至少包含一个与适当的目标片段互补的8-核苷碱基部分的寡聚化合物。该筛选方法包括如下步骤：将编码蛋白的核酸分子的适当目标片段与一种或多种候选调节剂接触，和选择一种或多种提高或降低编码蛋白的核酸分子的表达的候选调节剂。一旦显示候选调节剂能够调节(例如，提高或降低)编码肽的核酸分子的表达，则该调节剂就可用于该肽的功能的进一步考察研究，或用作研究、诊断、或治疗剂。

在某些实施方案中，适当的目标片段还可与其各自的互补性反义寡聚化合物组合形成稳定的双链寡核苷酸。本领域已显示所述双链寡核苷酸部分可调节目标表达并通过反义机制调节翻译和RNA加工。此外，该双链部分还可进行化学修饰(Fire等人，Nature，1998，391，806-811；Timmons和Fire，Nature1998，395，854；Timmons等人，Gene，2001，263，103-112；Tabara等人，Science，1998，282，430-431；Montgomery等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95，15502-15507；Tuschl等人，Genes Dev.，1999，13，3191-3197；Elbashir等人，Nature，2001，411，494-498；Elbashir等人，Genes Dev.2001，15，188-200)。例如，已经表明所述双链部分可通过双链的反义链与靶标进行的经典杂交来抑制该靶标，从而引发靶标的酶降解(Tijsterman等人，Science，2002，295，694-697)。

在某些实施方案中，本发明提供的寡聚化合物还可用于药物发现和靶标验证领域。此处鉴定的寡聚化合物和靶标还可以用于药物发现过程中以阐明蛋白与疾病状态、表型或症状之间存在的关系。这些方法包括检测或调节目标肽，包括将样本、组织、细胞或生物体与本发明的寡聚化合物接触，检测在处理一定时间后靶标的核酸或蛋白水平和/或相关的表型或化学终点，并任选地将测量值与未处理样本或以本发明的其它寡聚化合物处理的样本进行比较。这些方法还可平行地或与其它实验组合地进行，以确定靶标验证过程使用的未知基因的功能，或者确定特定基因产物作为治疗或预防特定疾病、症状或表型的靶标的效果。

如此处所用的术语“剂量”指提供于单次给药的药学制剂的指定量。在某些实施方案中，剂量可以以两个或更多大丸剂、片剂或注射给药。例如，在某些实施方案中需要皮下给药，目标剂量需要的体积通过单次注射不容易供给。所述实施方案中，两次或多次注射可用于实现目标剂量。在某些实施方案中，剂量可以两次或多次注射施用以将个体注射部位的反应降到最低。

在某些实施方案中，本发明的化学-修饰寡聚化合物对目标RNA比未-修饰的DNA具有更高的亲和力。在某些所述实施方案中，更高的亲和力随后提供增强的效力，使得可以施用较低剂量所述化合物，从而降低可能的毒性以及改善治疗指数和降低总治疗花费。

核苷修饰对RNAi活性的作用参照现有文献进行了评估(Elbashir等人，Nature(2001)，411，494-498；Nishikura等人，Cell(2001)，107，415-416；以及Bass等人，Cell(2000)，101，235-238)。

本发明提供的寡聚化合物可用于诊断、治疗、预防并可作为研究试剂和试剂盒。此外，本领域的普通技术人员通常使用能够以超强特异性抑制基因表达的反义寡核苷酸来阐明特定基因的功能或区分生物途径各种组分的功能。单独或与其它寡聚化合物或治疗剂联合使用的本发明提供的寡聚化合物可用作差异分析和/或组合分析中的工具来阐明细胞和组织内表达的基因的一部分或整个互补的表达模式。寡聚化合物也可在有利于基因扩增或检测的条件下分别被有效地用作引物和探针。这些引物和探针可用于需要特异性检测编码蛋白的核酸分子的方法中，并可用于核酸分子扩增以供检测或在进一步研究中使用。本发明的反义寡核苷酸，特别是引物和探针与核酸的杂交可通过本领已知的方法进行检测。该种方法可包括将酶结合至寡核苷酸，对该寡核苷酸进行放射性标记或任何其它适用的检测手段。还可制备使用这种检测手段的试剂盒以检测样本中选定的蛋白水平。

作为一个非限制性例子，将用一种或多种寡聚化合物处理的细胞或组织中的表达模式与未用寡聚化合物处理的对照细胞或组织进行比较，根据基因的差异表达水平分析所形成的模式，因为这些模式涉及例如所检测基因的疾病相关性、信号转导途径、细胞定位、表达水平、大小、结构或功能。这些分析可在影响表达模式的其它化合物或寡聚化合物存在或不存在的情况下对刺激的或未刺激的细胞进行。

本领域已知的基因表达分析方法的例子包括：DNA阵列或微阵列(Brazma和Vilo，FEBS Lett.，2000，480，17-24；Celis，等人，FEBS Lett.，2000，480，2-16)、SAGE(基因表达系列分析)(Madden，等人，DrugDiscov.Today，2000，5，415-425)、READS(消化的cDNA的限制性酶扩增)(Prashar和Weissman，Methods Enzymol.，1999，303，258-72)、TOGA(总基因表达分析)(Sutcliffe，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2000，97，1976-81)、蛋白阵列和蛋白组学(Celis，等人，FEBS Lett.，2000，480，2-16；Jungblut，等人，Electrophoresis，1999，20，2100-10)、表达序列标签(EST)测序(Celis，等人，FEBS Lett.，2000，480，2-16；Larsson，等人，J.Biotechnol.，2000，80，143-57)、消减RNA指纹(SuRF)(Fuchs，等人，Anal.Biochem.，2000，286，91-98；Larson，等人，Cytometry，2000，41，203-208)、消减克隆、差异展示(DD)(Jurecic and Belmont，Curr.Opin.Microbiol.，2000，3，316-21)、比较基因组杂交(Carulli，等人，J.Cell Biochem.Suppl.，1998，31，286-96)、FISH(荧光原位杂交)技术(Going andgusterson，Eur.J.Cancer，1999，35，1895-904)以及质谱方法(To，Comb.Chem.High Throughput Screen，2000，3，235-41)。

虽然已根据某些实施方式具体地描述了本发明提供的单体、寡聚体和方法，以下实施例仅用于阐述本发明，并非意在对其进行限制。

实施例1

方案1

A)化合物1

将氢化钠(2.39g，59.8mmol)小心添加至可从市场购得的1，2：5，6-二-O-异亚丙基-α-D-呋喃阿洛糖1(12.0g，46mmol)的DMF冷(0℃)溶液(75mL)中。搅拌20分钟后，向反应中添加溴化萘(11.12g，50.8mmol)并继续搅拌2小时。以水小心淬灭反应并将其倒入EtOAc，以水、盐水洗涤有机层，干燥并浓缩。柱层析(SiO₂，以10％至33％的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体醇化合物2(18.1g，98％)。

B)化合物5

将化合物2(18g，46mmol)溶解于冰醋酸(150mL)和水(60mL)。在室温下搅拌反应物16小时，然后将其真空浓缩。然后将残留物溶解于EtOAc，以饱和NaHCO₃、盐水洗涤有机层，干燥并浓缩得到粗品化合物3，其在不作进一步纯化下使用。

将高碘酸钠(48mmol，10g)水溶液(350mL)添加至上面获得的化合物3的1，4-二恶烷的溶液(140mL)。室温搅拌90分钟后，以EtOAc萃取反应物，以水、盐水进一步洗涤有机层，干燥(Na₂SO₄)并浓缩得到醛化合物4，其可不作进一步纯化下使用。

将由前面获得的粗品化合物4溶解于THF∶H₂O(1∶1，100mL)混合物，并将反应物在冰浴中冷却。向反应中添加甲醛(25mL，35％w/w)和1NNaOH(100mL)。室温搅拌16小时后，向反应添加甲醛(5mL)并继续搅拌32小时。将反应物浓缩至干燥，在EtOAc和水之间分配残留物。分层并以另外的1N NaOH、水、盐水洗涤有机相，干燥并浓缩得到白色固体二醇化合物5(12.96g，80％，三步)。

C)化合物6

将叔丁基二苯基硅烷基氯(0.75mL，2.9mmol)添加至化合物5(1g，2.8mmol)和三乙胺(0.45mL，3.2mmol)的冷(0℃)溶液。室温搅拌16小时后，将反应物倒入EtOAc，并依次用5％HCl、饱和NaHCO₃、盐水洗涤有机相，干燥(Na₂SO₄)并浓缩。柱层析(SiO₂，以10％至40％的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供油状的醇化合物6(1.02g，61％)(还分离得到0.42g区域异构硅保护的二醇)。

D)化合物7

将二甲基亚砜(1.6mL，22.4mmol)逐滴加入草酰氯(0.98mL，11.2mmol)的CH₂Cl₂冷(-78℃)溶液(70mL)。搅拌30分钟后，向反应中添加化合物6(4.8g，8.0mmol)的CH₂Cl₂溶液(20mL)。在-78℃继续搅拌45分钟并向反应中添加三乙胺(4.72mL，33.7mmol)。在-78℃下将反应物搅拌15分钟，随后取走冰浴，并在45分钟内对反应物逐渐加温。然后将反应物倒入CH₂Cl₂，依次以5％HCl水溶液、饱和NaHCO₃、盐水洗涤，干燥(Na₂SO₄)并真空浓缩以提供醛化合物7，其可在不作进一步纯化下使用。

E)核苷8

向三苯基溴化磷(3.88g，10.9mmol)的干THF冷(0℃)搅拌溶液(60mL)逐滴添加nBuLi(2.5M，4.34mL，10.9mmol)。搅拌1小时后，将红色溶液冷却至-78℃，并逐滴向反应中添加由前面获得的醛7(8.4mmol)的干THF溶液(15mL)。将反应物逐渐加热至室温，继续搅拌16小时。使用饱和NH₄Cl小心淬灭反应，且反应物在EtOAc和水之间分配。然后以盐水洗涤有机层，干燥(Na₂SO₄)并浓缩。柱层析(SiO₂，以10％EtOAc的己烷溶液洗脱)纯化提供无色油状的烯烃化合物8(4.84g，97％来自26)。

F)核苷9

将氟化四丁基铵(THF中的1M溶液，10.00mL，10.0mmol)添加至化合物8(4.83g，8.1mmol)的THF溶液(35mL)。室温搅拌反应物16小时后，真空去除溶剂并将残留物溶解于EtOAc。然后以水、盐水洗涤有机层，干燥(Na₂SO₄)并浓缩。柱层析(SiO₂，以40％EtOAc的己烷溶液洗脱)纯化提供无色油状的醇化合物9(2.79g，97％)。

G)核苷10

将氢化钠(60％w/w存在于矿物油中，0.4g，10mmol)添加入化合物9(1.44g，4.1mmol)和苯甲基溴(0.71mL，6.0mmol)的DMF冷(0℃)溶液(16mL)。在0℃下搅拌1小时后，用水小心淬灭反应并在EtOAc和水之间分配。以盐水分离并洗涤有机相，干燥(Na₂SO₄)并浓缩。柱层析(SiO₂，以10至25％EtOAc的己烷溶液洗脱)纯化提供无色油状的烯烃化合物10(1.84g，定量)。

H)核苷11

将四氧化锇(25％OsO₄的iPrOH溶液，1mL)添加至化合物10(1.80g，4.0mmol)和N-甲基吗啉-N-氧化物(NMO，0.94g，8.0mmol)的95％丙酮/水(25mL)溶液。在室温下搅拌16小时后，向反应中再度添加OsO₄溶液(0.5mL)和NMO(0.40g)。搅拌总计48小时后，以EtOAc稀释反应物并以10％NaHSO₃、盐水洗涤，干燥(Na₂SO₄)并浓缩。柱层析(SiO₂，以40％至50％EtOAc的己烷溶液洗脱)纯化提供无色油状的二醇化合物11(1.68g，87％，约1∶1的异构体混合物)。

I)核苷12a和12b

将TBSCl(0.66g，4.4mmol)添加至化合物11(1.63g，3.4mmol)的嘧啶冷(0℃)溶液(17mL)。在0℃下搅拌4小时后，以EtOAc稀释反应物，以水、盐水洗涤有机层，干燥并浓缩。柱层析(SiO₂，以10％至20％EtOAc的己烷溶液洗脱)纯化提供无色油状的醇化合物12a和12b(0.90g和1.117g，未指定绝对立体构型)。

实施例2

方案2

(a)ET₃N₃HF、ET₃N、THF、84％(b)MsCl、ET₃N、DMAP、CH₂Cl₂、79％(c)AcOH、Ac₂O、H₂SO₄、44％(d)尿嘧啶、BSA、TMSOTf、CH₃CN(e)K₂CO₃、MeOH、51％来自154(f)TBAF、THF、80℃、16h(g)BCl₃、CH₂Cl₂(h)TBDPSC1、咪唑、DMF(i)DDQ、CH₂Cl₂、H₂O(j)Et₃N 3HF、Et₃N、THF(k)DMTCl、吡啶(l)(iPR₂N)₂POCH₂CH₂CN、四唑、NMI、DMF。

化合物13

向化合物12a(0.95g，1.6mmol，羟基未指定的绝对构型)和三乙胺(0.56mL，4.0mmol)的THF溶液(16mL)添加三乙胺三氟化氢(1.56mL，9.6mmol)。在室温下搅拌16小时后，在真空下蒸发THF并将残留物溶于EtOAc中。用饱和的NaHCO₃溶液、盐水洗涤有机层，干燥(Na₂SO₄)并且浓缩。柱层析(SiO₂，用40至50％的己烷EtOAc洗脱)纯化提供二醇化合物13(0.65g，84％)。

化合物14

向化合物13(0.65g，1.4mmol)、三乙胺(0.57mL，4.1mmol)和二甲基氨基吡啶(49mg，0.4mmol)的二氯甲烷溶液(4mL)添加甲磺酰氯化物(0.32mL，4.1mmol)。反应逐步加温至室温并且搅拌16小时，其后用EtOAc稀释。用5％HCl、饱和的NaHCO₃、盐水按顺序洗涤有机层，干燥(Na₂SO₄)并且浓缩。柱层析(SiO₂，用40％的己烷EtOAc洗脱)纯化提供二甲磺酸盐化合物14(0.68g，79％)。

化合物154

将浓硫酸(3滴)加入化合物14(0.68g，1.1mmol)、乙酸(2mL)和醋酸酐(0.4mL)溶液中。室温搅拌2小时后将反应物在高度真空下浓缩。将残留物溶解于EtOAc，以饱和NaHCO₃溶液、盐水小心洗涤有机层，干燥(Na₂SO₄)并浓缩。柱层析(SiO₂，以40至50％己烷EtOAc洗脱)纯化提供双醋酸盐化合物15(0.32g，44％)。

化合物17

将O-双(三甲基甲硅烷)乙酰胺(0.58mL，2.4mmol)加入化合物15(0.32g，0.5mmol)和尿嘧啶(0.11g，0.9mmol)的CH₃CN(3mL)悬浮液。40℃加热15分钟以获得透明溶液，将三甲硅烷基三氟甲磺酸酯(0.13mL，0.7mmol)加入所述反应物。回流2小时后，将反应冷却至室温并倒入EtOAc。以饱和NaHCO₃、盐水洗涤有机层，干燥(Na₂SO₄)并真空浓缩以提供粗制核苷化合物16，其可在不作任何纯化下使用。

向粗制的核苷化合物16(由前面获得)的MeOH溶液(5mL)添加K₂CO₃(0.14mg，1.0mmol)。室温下搅拌16小时后，真空下除去溶剂并将残留物在EtOAc和盐水之间分配。收集有机相，干燥(Na₂SO₄)并真空浓缩提供6(未确定绝对构型)。柱层析(SiO₂，用25％CHCl₃丙酮洗脱)纯化提供核苷化合物17(0.14g，来自4的产率为51％)。

化合物18

将氟化四丁基铵(1M存在于THF中，0.10mL，0.1mmol)添加至化合物17的THF溶液(0.05mL)。100℃加热反应16小时提供核苷化合物18。LCMS：保留时间3.81分钟；M+H计算值499.18，测定值499.0。

化合物24

利用BCl₃二氯甲烷在-78℃和0℃温度之间除去化合物18中的苯甲基保护基团以提供化合物19。化合物19的初级醇作为TBDPS醚被保护以提供化合物20。随后利用二氯甲烷和水中的DDQ除去3’O-Nap保护基团以提供化合物21。除去5’O-TBDPS保护基团提供化合物22。利用DMTC1吡啶保护5’-羟基以提供化合物23，其经己醇磷酸化以提供亚磷酰胺化合物24。

实施例3

方案3

实施例4

方案4

R、R₁和R₂各自独立地为H、卤素、烷基、烯基、炔基、取代的烷基、取代的烯基、取代的炔基或保护基团。

实施例5

方案5

R和R₁各自独立地为H、卤素、烷基、烯基、炔基、取代的烷基、取代的烯基、取代的炔基或保护基团。

实施例6

方案6

A)化合物43

将氯化铈III(2.96g，12.0mmol)的THF悬浮液(50mL)在室温下搅拌90分钟。在冰浴中冷却反应物，历经5分钟添加甲基溴化镁(8.6mL的1.4M甲基溴化镁的THF溶液，12mmol)，继续搅拌90分钟，然后将反应冷却至-78℃。将化合物78的THF溶液(20mL)加入反应物。继续搅拌90分钟后，以饱和NH₄Cl溶液淬灭反应并倒入EtOAc。依次以5％HCl水溶液、饱和NaHCO₃、盐水洗涤有机层，干燥(Na₂SO₄)并真空浓缩。柱层析(SiO₂，以20％的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供醇化合物43(4.37g)。

B)化合物44

将二甲基亚砜(1.41mL，19.9mmol)逐滴加入草酰氯(0.87mL，10.0mmol)的CH₂Cl₂冷(-78℃)溶液(70mL)。搅拌30分钟后，向反应中添加化合物43(4.35g，7.1mmol)的CH₂Cl₂溶液(20mL)。在-78℃继续搅拌45分钟并向反应中添加三乙胺(4.20mL，30.0mmol)。在-78℃下将反应物搅拌15分钟，随后取走冰浴，并在45分钟内对反应物逐渐加温。然后将反应物倒入CH₂Cl₂，先后以5％HCl水溶液、饱和NaHCO₃、盐水洗涤有机相，干燥(Na₂SO₄)并真空浓缩以提供酮化合物44，其可在不作进一步纯化下使用。

C)化合物45

将氯化铈III(543mg，2.2mmol)的THF悬浮液(120mL)在室温下搅拌90分钟。在冰浴中冷却反应物，历经15分钟添加甲基溴化镁(3M甲基溴化镁的14.7mL二乙醚溶液，44mmol)，继续搅拌90分钟，然后将反应冷却至-78℃。将化合物44(自上)的THF溶液(100mL)加入反应物。继续搅拌90分钟后，以饱和NH₄Cl溶液淬灭反应并倒入EtOAc。依次以5％HCl水溶液、饱和NaHCO₃、盐水洗涤有机层，干燥(Na₂SO₄)并真空浓缩。用EtOAc洗脱和SiO₂凝胶过滤提供醇化合物45(11.8g)。¹H NMR和LCMS光谱与结构一致。

D)化合物46

化合物45(11.8g，18.8mmol)溶于吡啶(94mL)和亚硫酰氯化物(2.75mL，37.6mmol)中，随后60℃加热1小时。反应冷却至室温并且倒入EtOAc和盐水。用盐水洗涤有机层，干燥(Na₂SO₄)并且真空浓缩。用EtOAc洗脱和SiO₂过滤提供烯烃化合物46(9.8g)。¹H NMR和LCMS光谱与结构一致。

E)化合物47

浓H₂SO₄(2滴)加入化合物46(自上)的冰醋酸(100mL)和醋酸酐(9.8mL)溶液中。在室温下搅拌1小时后反应物倒入EtOAc，并且用水、饱和NaHCO₃、盐水洗涤有机层，干燥(Na₂SO₄)并且真空浓缩提供双醋酸盐化合物47(10.38g)，其直接用于下一步骤。¹H NMR和LCMS光谱与结构一致。

F)化合物48

将N，O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(16.4mL，66.8mmol)加入到化合物47(10.38g，15.9mmol)和尿嘧啶(3.6g，31.8mmol)的CH₃CN悬浮液(100mL)中。在40℃下加热15分钟以获得澄清溶液，反应冷却至0℃且向反应物中添加三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯(5.8mL，31.8mmol)。70℃加热4小时后，将反应物冷却至室温并倒入EtOAc。以饱和NaHCO₃、盐水洗涤有机层，干燥(Na₂SO₄)并真空浓缩提供作为单乙酸酯的粗制核苷，其可在不作任何纯化下使用。

所述粗制核苷单乙酸酯用7N NH₃/MeOH(300mL)处理12小时，随后真空浓缩反应物。SiO₂凝胶过滤且用5％meOH/EtOAc洗脱提供核苷化合物48(8.46g，80％来自化合物47)。¹H NMR和LCMS光谱与结构一致。

G)化合物49

化合物48(7.46g，11.3mmol)用汞(II)乙酸盐(7.9g，24.8mmol)的二氯甲烷(125mL)在室温下处理16小时。此时添加饱和的NaCl(aq)(30mL)搅拌15分钟。随后添加另外的饱和NaCl(aq)并且分离有机层，干燥(Na₂SO₄)且真空浓缩提供粗制的氯化汞。生成的泡沫溶于甲苯(125mL)中且用AIBN(100mg)和三丁基锡氢化物(Bu₃SnH，7.6mL，28.3mmol)处理。反应在室温下进行1小时并且加热至50℃，继续搅拌1小时。随后添加四氯化碳(30mL)，搅拌1小时。添加二氯甲烷，并且滗析有机层，用水、盐水洗涤，干燥(Na₂SO₄)且真空浓缩。柱层析(SiO₂，以30％EtOAc/己烷至50％EtOAc/己烷洗脱)纯化提供核苷化合物49(5.08g，68％来自化合物48)。¹H NMR和LCMS光谱与结构一致。

H)化合物50

向化合物49(4.7g，7.9mmol)的二氯甲烷(50mL)和H₂O溶液(3mL)添加2，3-二氯-5，6-二氰-1，4-苯醌(DDQ)(2.4g，10.6mmol)。搅拌16小时后真空浓缩反应物并将残留物溶解于EtOAc。依次以水、水∶饱和NaHCO₃(1∶1)、盐水洗涤有机层，干燥(Na₂SO₄)并浓缩。柱层析(SiO₂，利用2％至5％的EtOAc/meOH/CH₂Cl₂梯度)纯化提供白色固体核苷化合物50(4.1g，99％)。¹HNMR和LCMS光谱与结构一致。

I)化合物51

在聚丙烯管中向化合物50(3.8g，7.27mmol)和三乙胺(2.5mL)的THF(20mL)溶液添加三乙胺三氢氟酸盐(6mL)。室温搅拌24小时后，真空浓缩反应物并剧烈搅拌添加水(30mL)。通过过滤收集生成的白色固体并且真空干燥提供白色固体核苷化合物51(1.73g，84％)。¹H NMR、¹C NMR和LCMS光谱与结构一致。

J)化合物52

向化合物51(1.62g，5.7mmol)的嘧啶溶液(30mL)添加二甲氧基三苯甲基氯(2.5g，7.4mmol)。室温搅拌4小时后，将反应物倒入EtOAc，以盐水洗涤有机层，干燥并浓缩。柱层析(SiO₂，以30％丙酮/二氯甲烷洗脱)纯化提供固体核苷化合物52(3.03g，91％)。¹HNMR和LCMS光谱与结构一致。

K)化合物53

将2-氰乙基四异丙基亚磷二酰胺(1.1mL，3.5mmol)加入化合物52(1.35g，2.3mmol)、四唑(129mg，1.8mmol)和N-甲基咪唑(46μl，0.58mmol)的DMF溶液(18mL)。室温搅拌6小时后，将反应物倒入EtOAc，依次以90％盐水、盐水洗涤有机层，干燥(Na₂SO₄)并浓缩。柱层析(SiO₂，以60％的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体亚磷酰胺化合物53(1.6g，94％)。¹H NMR和LCMS光谱与结构一致。³¹P NMR(CDCl₃)δ：150.08，149.22。

实施例7

方案7

方案6(a)TESC1、Et₃N、DMAP、CH₂Cl₂，rt；(b)POCl₃、1，2，4-三唑、Et₃N、CH₃CN，rt；(c)NH₃水溶液、1，4-二氧杂环己烷，rt；(d)Bz₂O、DMF，rt；(e)Et₃N.3HF、Et₃N、THF，rt；(f)CNCH₂CH₂OP(N-iPR₂)₂、四唑、NMI、DMF。

A)化合物54

将三乙基甲硅烷基氯化物(868μl，5.17mmol)添加至化合物52(1.52g，2.6mmol)和咪唑(0.74g，10.3mmol)的DMF溶液(25mL)中。室温搅拌16小时后，将反应物注入EtOAc，以盐水连续萃取，干燥(Na₂SO₄)并真空浓缩。柱层析(SiO₂，用25％至50％EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体核苷化合物54。¹HNMR和LCMS光谱与结构一致。

B)化合物57

将三氯氧磷(1.8mL，19.4mmol)添加至1，2，4-三唑(4g，58mmol)的CH₃CN冷(0℃)悬浮液(25mL)中。搅拌15分钟后，向反应中添加三乙胺(13.4mL，97mmol)，继续搅拌30分钟。在0℃下向反应中添加化合物54(1.7g，2.4mmol)的CH₃CN溶液(20mL)。搅拌10分钟后，去除冰浴并在室温下搅拌反应物4小时。真空去除溶剂，在EtOAc和水之间分配残留物。然后以饱和NaHCO₃、盐水洗涤有机层，干燥(Na₂SO₄)并真空浓缩以提供粗产物化合物55，其可在不作任何纯化下使用。

将氨水(5mL)添加至化合物55(由前面获得)的二恶烷溶液(20mL)中。在室温下搅拌16小时，真空浓缩反应物并在高度真空下干燥8小时以提供核苷化合物56，其可在不作任何纯化下使用。

向化合物56(由前面获得)的DMF溶液(10mL)添加苯甲酸酐(0.814g，3.6mmol)。室温搅拌16小时后，将反应物倒入EtOAc，以饱和NaHCO₃、盐水萃取有机层，干燥(Na₂SO₄)并真空浓缩。柱层析(SiO₂，以40％至60％的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体的化合物57(1.57g，来自化合物54的产率为81％)。¹H NMR和LCMS光谱与结构一致。

C)化合物58

在聚丙烯管中向化合物57(1.57g，1.95mmol)和三乙胺(0.7mL)的THF溶液添(8mL)加三乙胺三氢氟酸盐(1.6mL)。室温搅拌16小时后，真空浓缩反应物并将残留物溶解于EtOAc，依次以水、饱和NaHCO₃、盐水洗涤有机层，干燥(Na₂SO₄)并真空浓缩。柱层析(SiO₂，以含有1％Et₃N的10％MeOH/CHCl₃洗脱)纯化提供白色固体核苷化合物58(1.2g，89％)。¹H NMR和LCMS光谱与结构一致。

D)化合物59

将2-氰乙基四异丙基亚磷二酰胺(0.83mL，2.6mmol)加入含有化合物58(1.2g，1.7mmol)、四唑(91mg，1.4mmol)和N-甲基咪唑(34μl，0.43mmol)的DMF溶液(9mL)中。室温搅拌6小时后，将反应物倒入EtOAc，依次以90％盐水、盐水洗涤有机层，干燥(Na₂SO₄)并浓缩。柱层析(SiO₂，以60％的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体亚磷酰胺化合物59(0.83g，54％)。¹H NMR和LCMS光谱与结构一致。³¹P NMR(CDCl₃)δ：150.29，129.51。

实施例8

化合物66的制备

方案8

方案8(a)6-N-苯甲酰基酰嘌呤、BSA、TMSOTf、CH₃CN、回流8小时；(b)NH₃/MeOH；(c)Hg(OAc)₂；AIBN、Bu₃SnH；(d)DDQ、CH₂Cl₂、H₂O，rt；(e)Et₃N.3HF、Et₃N、THF，rt，16小时；(f)DMTC1、吡啶，rt，16小时；(g)CNCH₂CH₂OP(N-iPR₂)₂、四唑、NMI、DMF。

化合物47按照实施例6中举例说明的流程制备。

实施例9

化合物73的制备

方案9

方案9(a)2-氨基-6-氯嘌呤、BSA、TMSOTf、CH₃CN，回流2小时；(b)3-羟基丙睛、NaH、THF、4小时；Hg(OAc)₂；AIBN、Bu₃SnH(c)异丁酸酐、DMAP、DMF，60℃24小时；(d)DDQ、CH₂Cl₂、H₂O，rt 16小时；(e)Et₃N.3HF、Et₃N、THF，rt；(f)DMTCl、吡啶，rt；(g)CNCH₂CH₂OP(N-iPR₂)₂、四唑、NMI、DMF。

化合物47按照实施例6中举例说明的流程制备。

实施例10

核苷亚磷酰胺的合成

核苷亚磷酰胺的制备根据本发明举例说明的和本领域的方法进行，例如但不限于美国专利6,426,220和公开的PCT WO 02/36743。

实施例11

寡核苷酸和寡核苷的合成

如本发明所述的寡聚化合物可通过公知的固相合成技术进行常规制备。进行该种合成的设备已由多家销售商出售，例如，Applied Biosystems(FosterCity，CA)。本领域已知的任何其它该类合成方法均可额外或替代性采用。使用类似技术制备寡核苷酸如硫代磷酸酯和烷基化衍生物已众所周知。

寡核苷酸：未取代和取代的磷酸二酯(P＝O)寡核苷酸可在自动化DNA合成仪(Applied Biosystems 394型)上采用被碘氧化的标准亚磷酰胺化学法合成得到。

除以下区别外，硫代磷酸酯(P＝S)的合成类似于磷酸二酯寡核苷酸：采用0.2M的50％3-甲基吡啶苯乙酰二硫化物的乙腈溶液氧化亚磷酸键合以产生硫杂化。该硫杂化反应步骤的时间提高至180秒且在此之前进行常规的带帽步骤。从CPG柱裂解并在55℃下于浓氨水中去封闭(12-16小时)后，以大于3倍体积的乙醇从1M NH₄OAc溶液中沉淀回收寡核苷酸。亚磷酸酯寡核苷酸可参照美国专利5,508,270的描述进行制备。

烷基磷酸酯寡核苷酸可参照美国专利4,469,863的描述进行制备。

3’-脱氧-3’-亚甲基磷酸酯寡聚核苷酸可参照美国专利5,610,289或5,625,050的描述进行制备。

亚磷酰胺寡核苷酸可参照美国专利5,256,775或5,366,878的描述进行制备。

烷基硫代磷酸酯寡核苷酸可参照公开的PCT申请PCT/US94/00902和PCT/US93/06976(分别公开为WO94/17093和WO94/02499)的描述进行制备。

3’-脱氧-3’-氨基磷酰胺酯寡核苷酸可参照美国专利5,476,925的描述进行制备。

磷酸三酯寡核苷酸可参照美国专利5,023,243的描述进行制备。

硼烷磷酸酯寡核苷酸可参照美国专利5,130,302和5,177,198的描述进行制备。

寡核苷：亚甲基甲亚胺基连接的寡核苷(也被称为MMI连接的寡核苷)、亚甲基二甲基肼连接的寡核苷(也被称为MDH连接的寡核苷)、和亚甲基羰基氨基连接的寡核苷(也被称为酰胺-3连接的寡核苷)、和亚甲基氨基羰基连接的寡核苷(也被称为酰胺-4连接的寡核苷)，以及具有例如交替的MMI和P＝O或P＝S键合的混合主链寡聚化合物可参照美国专利5,378,825、5,386,023、5,489,677、5,602,240和5,610,289的描述进行制备。

甲缩醛和硫甲缩醛连接的寡核苷可参照美国专利5,264,562和5,264,564的描述进行制备。

环氧乙烷连接的寡核苷可参照美国专利5,223,618的描述进行制备。

实施例12

寡核苷酸的分离

从可控孔玻璃固相载体上裂解寡核苷酸或寡核苷，在55℃的浓氨水中去封闭12-16小时后，以大于3倍体积的乙醇从1M NH₄OAc溶液中沉淀回收寡核苷酸或寡核苷。合成的寡核苷酸可通过电喷雾质谱(分子量测定)和毛细管凝胶电泳进行分析。在合成中获得的硫代磷酸酯和磷酸二酯键合的相对数量可通过正确分子量相对-16amu产品(+/-32+/-48)的比例进行确定。在某些研究中寡核苷酸通过HPLC进行纯化，例如描述于Chiang等人，J.Biol.Chem.1991，266，18162-18171。

HPLC-纯化材料所得的结果通常类似于从非-HPLC纯化材料获得的结果。

实施例13

寡核苷酸的合成-96孔平板形式

寡核苷酸可在能够以96-孔形式同时装配96个序列的自动化合成器中通过固相P(III)亚磷酰胺化学法合成得到。磷酸二酯核苷酸间键合可通过碘水溶液氧化得到。硫代磷酸酯核苷酸间键合可通过使用无水乙腈中的3，H-1，2苯并二硫醇-3-酮1，1-二氧化物(Beaucage试剂)硫化得到。标准的碱基被保护的β-氰乙基-二异丙基亚磷酰胺可从销售商(例如PE-Applied Biosystems，Foster City，CA或Pharmacia，Piscataway，NJ)处购得。非标准核苷可参照标准和专利方法进行合成。它们可作为碱基保护的β-氰乙基-二异丙基亚磷酰胺来使用。

寡核苷酸从载体上裂解并在升高的温度(55-60℃)下在浓NH₄OH中保护12-16小时，在真空下干燥所释放的产品。将干燥的产品重悬于无菌水中以提供主平板，从该平板上使用机械移液管稀释得到所有的分析和测试平板样本。

实施例14

利用96-孔平板形式的寡核苷酸分析

各微孔中的寡核苷酸浓度可通过稀释样本和UV吸收光谱测定。单个产品的全长完整性可以96-孔形式(Beckman P/ACE^TM MDQ)或针对单独制备的样本在商用毛细管电泳设备(例如，Beckman P/ACE^TM 5000，ABI 270)上通过毛细管电泳(CE)进行评估。碱基和主链组成可采用电喷雾质谱对寡聚化合物进行质谱分析确定。所有的测试平板均从主平板上采用单和多道机械移液器稀释得到。如果平板上至少85％的寡聚化合物具有至少85％全长，则可认为该平板可接受。

实施例15

细胞培养和寡核苷酸处理

寡聚化合物对靶标核酸表达的作用可在各种细胞类型中进行测试，只要该靶标核酸以可测水平在该细胞类型中存在。这可通过使用，例如PCR或Northern印迹分析等方法常规测定。来自多种组织和物种的细胞系可从美国菌种保藏中心(ATCC，Manassas，VA)获得。

下列提供的细胞类型仅供阐述目的，也可常规采用其它细胞类型，只要靶标在选定的细胞类型中表达。这可通过本领域常规的方法，例如，Northern印迹分析、核糖核酸酶保护测定或RT-PCR等进行简便的测定。

B.END细胞：小鼠脑内皮细胞系b.END由Max Plank研究所(Bad Nauheim，Germany)的Werner Risau博士提供。b.END细胞常规培养于添加了10％胎牛血清(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)的高糖DMEM中(Invitrogen LifeTechnologies，Carlsbad，CA)。在汇合度达到约90％时，通过胰蛋白酶化和稀释进行常规的细胞传代。将细胞以大约3000细胞/微孔的密度接种至96-孔板(Falcon-Primaria#353872，BD Biosciences，Bedford，MA)，从而用于包括但不限于寡聚化合物转染实验。

实验包括用寡聚化合物处理细胞：当细胞达到适当的汇合度时，采用所述的转染方法以寡聚化合物对其进行处理。

LIPOFECTIN^TM

当细胞达到65-75％汇合度时，以寡核苷酸对其进行处理。

将寡核苷酸与LIPOFECTIN^TM(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)在Opti-MEM^TM-1低血清培养基(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)中混合，以达到寡核苷酸的理想浓度，且LIPOFECTIN^TM的浓度为每100nM寡核苷酸2.5或3μg/mL。将该转染混合物在室温下孵育约0.5小时。细胞生长于96-孔板时，以100μL OPTI-MEM^TM-1洗涤微孔一次，然后以130μL转染混合物处理。类似地，用适当体积的培养基和寡核苷酸处理生长于24-孔板或其它标准组织培养板中的细胞。重复两次或三次处理细胞并取得数值。在37℃下处理约4-7小时后，以新鲜培养基替换含转染混合物的培养基。寡核苷酸处理后16-24小时采集细胞。

本领域已知的其它适用转染试剂包括但不限于：CYTOFECTIN^TM、LIPOFECTAMINE^TM、OLIGOFECTAMINE^TM和FUGENE^TM。本领域已知的其它适用的转染方法包括但不限于电穿孔法。

实施例16

寡核苷酸抑制靶标表达的分析

靶标表达的反义调节可通过本领域已知的多种方法进行测定。例如，靶标mRNA水平可通过，例如，Northern印迹分析、竞争性聚合酶链式反应(PCR)或实时PCR进行定量。目前希望采用实时定量PCR。可对总细胞RNA或poly(A)+mRNA进行RNA分析。本发明的一种RNA分析方法采用总细胞RNA，如本文其它实施例中所描述。RNA分离的方法已为本领域公知。Northern印迹分析也是本领域的常规方法。实时定量(PCR)通过使用来自PE-AppliedBiosystems，Foster City，CA的ABIPRISM^TM 7600、7700或7900序列检测系统并参照生产商说明得以便利地实现。

靶标蛋白水平可通过本领域公知的多种方法进行定量，例如免疫沉淀、Western印迹分析(免疫印迹)、酶联免疫吸附测定(ELISA)或荧光激活细胞分类(FACS)。针对靶标的抗体可从多种来源例如抗体的MSRS目录(AerieCorporation，Birmingham，MI)鉴定并获得，或者可通过本领域公知的常规单克隆或多克隆抗体生成方法制备得到。制备多克隆抗血清的方法可参见，例如，Ausubel，F.M.等人，Current Protocols inmolecular Biology，第2卷，第11.12.1-11.12.9页，John Wiley&Sons，Inc.，1997。单克隆抗体的制备可参见，例如，Ausubel，F.M.等人，Current Protocols inmolecular Biology，第2卷，第11.4.1-11.11.5页，John Wiley&Sons，Inc.，1997。

免疫沉淀法是本领域的标准方法，并可参见例如，Ausubel，F.M.等人，Current Protocols inmolecular Biology，第2卷，第10.16.1-10.16.11页，John Wiley&Sons，Inc.，1998。Western印迹(免疫印迹)分析是本领域的标准方法，并可参见例如，Ausubel，F.M.等人，Current Protocols inmolecular Biology，第2卷，第10.16.1-10.80.21页，John Wiley&Sons，Inc.，1997。酶联免疫吸附测定(ELISA)是本领域的标准方法，并可参见例如，Ausubel，F.M.等人，Current Protocolsinmolecular Biology，第2卷，第11.4.1-11.2.22页，John Wiley&Sons，Inc.，1991。

实施例17

为靶标抑制剂用途设计表型测定和体内研究

表型测定

一旦通过此处披露的方法鉴定靶标抑制剂，可在一个或多个表型测定中进一步考察该寡聚化合物，其中每个测定具有预示对特定疾病状态或症状的治疗效力的可测端点。

表型测定、用于表型测定的试剂盒和试剂已为本领域技术人员公知，并在此处用于考察靶标在健康和疾病中的作用和/或关联。代表性的表型测定(可从多个销售商中购得)包括测定细胞活性、细胞毒性、扩增或细胞存活的测定(Molecular Probes，Eugene，OR；PerkinElmer，Boston，MA)，基于蛋白的测定包括酶法测定(Panvera，LLC，Madison，WI；BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ；Oncogene Research Products，San Diego，CA)、细胞调节、信号转导、炎症、氧化过程以及凋亡(Assay Designs Inc.，Ann Arbor，MI)、甘油三酯积累(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、血管生成测定、管道形成测定、细胞因子和激素测定以及代谢测定(Chemicon International Inc.，Temecula，CA；Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。

在一个非限制性实例中，经测定适用于特定表型测定的细胞(即，选择MCF-7细胞用于乳腺癌研究；用于肥胖研究的脂肪细胞)用经体外研究鉴定的靶标抑制剂和对照化合物在最佳浓度下(通过上述方法确定的)处理。在处理末期，用一种或多种对测定特定的方法来分析经处理和未经处理的细胞从而确定表型结果和终点。

表型终点包括随时间或处理剂量的细胞形态变化以及细胞成分如蛋白、脂质、核酸、激素、糖或金属等的水平变化。细胞状态(包括pH、细胞周期阶段、细胞对生物指示剂的摄取或排除)的测量值通常也是感兴趣的终点。

对处理后的细胞中一种或多种基因表达的检测同样可用作靶标抑制剂效力或功效的指标。同时检测经处理和未经处理的细胞中的标志基因或怀疑与特定疾病状态、症状或表型有关的那些基因。

体内研究

本文所述的体内研究中的个体对象为温血脊椎动物，包括人。

实施例18

RNA分离

Poly(A)+mRNA分离

在某些实施方案中，Poly(A)+mRNA的分离可参照Miura等人的方法(Clin.Chem.，1996，42，1758-1764)。其它的poly(A)+mRNA分离方法为本领域的常规方法。简言之，对于生长于96-孔板的细胞，从细胞去除生长培养基并以200μL冷PBS洗涤每个微孔。向每个微孔添加60μL裂解缓冲液(10mMTris-HCl，pH 7.6，1mM EDTA，0.5m NaCl，0.5％NP-40，20mM氧钒-核糖核苷复合物)，轻柔摇动平板并在室温下孵育五分钟。将55μL裂解产物转移至涂覆了寡聚d(T)包被的96-孔板(AGCT Inc.，Irvine CA)。将平板在室温下孵育60分钟，以200μL洗涤缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.6，1mM EDTA，0.3m NaCl)洗涤3次。末次洗涤后，以纸巾吸去多余的洗涤缓冲液，然后空气干燥5分钟。将预热至70℃的60μL洗脱缓冲液(5mM Tris-HCl pH 7.6)添加至各微孔，将平板在90℃热板上孵育5分钟，然后将洗脱物转移至新鲜的96-孔板。

生长于100mm或其它标准平板的细胞也可采用适当体积的所有溶液进行类似处理。

总RNA分离

总RNA可采用由Qiagen Inc.(Valencia，CA)购得的RNEASY 96^TM试剂盒和缓冲液并参照生产商的推荐方法进行分离。简言之，对于生长于96-孔板的细胞，从细胞去除生长培养基并分别以200μL冷PBS洗涤每个微孔。向每个微孔添加150μLRLT缓冲液并将平板剧烈摇动20秒。将150μL的70％乙醇添加至各微孔，然后通过上下吹吸三次混合内含物。随后将样本转移至装配了废物收集盘并连接至真空源的QIAVAC^TM集流腔所连接的RNEASY 96^TM孔板上。抽真空1分钟。将500μLRW1缓冲液添加至RNEASY 96^TM板的各微孔中并孵育15分钟，再次抽真空1分钟。再次将500μLRW1缓冲液添加至RNEASY 96^TM板的各微孔中并再次抽真空2分钟。然后将1mL的RPE缓冲液添加至RNEASY96^TM板的各微孔中并抽真空90秒钟。重复用RPE缓冲液洗涤，再次吸真空3分钟。然后从QIAVAC^TM集流腔取走平板并用纸巾吸干。重新将平板连接至装配了含1.2mL采集管的采集管架的QIAVAC^TM集流腔。然后通过向各微孔中移入140μL无RNA酶的水，孵育1分钟，抽真空3分钟洗脱RNA。

重复移液和洗脱步骤可通过QIAGEN Bio-Robot 9604(Qiagen，Inc.，Valencia CA)自动完成。简言之，裂解培养平板上的细胞之后，将平板转移至进行移液、DNA酶处理和洗脱步骤的机械平台上。

实施例19

靶标mRNA水平的实时定量PCR分析

在某些实施方案中，靶标mRNA水平可采用ABI PRISM ^M7600、7700或7900序列检测系统(PE-Applied Biosystems，Foster City，CA)并参照生产商的说明通过实时定量PCR实现定量。这是一个闭管、非凝胶式荧光检测系统，其允许对聚合酶链式反应(PCR)产物进行实时高通量定量。与扩增产物在PCR完成后定量的标准PCR不同，在实时定量PCR中的产物在其积累时定量。这一点可通过在PCR反应中包含在正向和反向PCR引物之间特异性退火并包含两个荧光染料的寡核苷酸探针来实现。报告染料(例如，FAM或JOE，来自PE-Applied Biosystems，Foster City，CA，Operon Technologies Inc.，Alameda，CA或Integrated DNA Technologies Inc.，Coralville，IA)被连接至探针的5’端而淬火染料(例如，TAMRA，来自PE-Applied Biosystems，Foster City，CA，OperonTechnologies Inc.，Alameda，CA或Integrated DNA Technologies Inc.，Coralville，IA)被连接至探针的3’端。当探针和染料完整时，报告染料的发射被邻近的3’端淬火染料所淬灭。在扩增过程中，探针与靶标序列的退火生成能被Taq聚合酶的5’-核酸外切酶活性裂解的底物。在PCR扩增周期的延伸阶段，Taq聚合酶对探针的裂解从探针的剩余部分(并从而由淬火部分)释放了报告染料，从而生成了序列特异性荧光信号。在每一个周期中，附加的报告染料分子从其相应的探针中裂解，并可通过整合在ABI PRISM^TM序列检测系统中的激光镜头定期监测荧光强度。在每一个测定中，一系列包含来自未处理对照样本的mRNA系列稀释物的平行反应生成标准曲线，它可用于对测试样本进行反义寡核苷酸处理后的抑制百分比进行定量。

在定量PCR分析之前，对被测靶标基因特异性的引物-探针组与GAPDH扩增反应的“多重性(multiplexed)”能力进行评估。在多重化中，靶标基因和内标基因GAPDH在单个样本中同时扩增。在该分析中，从未处理细胞中分离的mRNA被连续稀释。各稀释物可在仅特异性靶向GAPDH、仅特异性靶向靶标基因(“单重”)或对两者都特异(多重)的引物-探针组的存在下扩增。PCR扩增之后，可同时从单重和多重样本生成作为稀释函数的GAPDH和靶标mRNA信号的标准曲线。如果从多重样本中生成的GAPDH和靶标信号的斜率和相关联系数均小于从单重样本所得相应数值的10％之内，则可认为该靶标特异性的引物-探针组具有多重性。其它PCR方法已为本领域所知。

RT和PCR试剂可从Invitrogen Life Technologies(Carlsbad，CA)获得。RT，实时PCR可通过向含有30μL总RNA溶液(20-200ng)的96-孔板添加20μLPCR混合物(2.5×无MgCl₂PCR缓冲液，6.6Mm MgCl₂，dATP、dCTP、dCTP和dGTP各375μM，正向引物和反向引物各375nM，125nM探针，4单位RNA酶抑制剂，1.25单位Taq，5单位MuLV逆转录酶以及2.5×ROX染料)得以实现。RT反应可通过在48℃下孵育30分钟得以实现。在95℃下孵育10分钟以激活

Taq后，进行40个循环的两步PCR法：95℃下进行15秒(变性)后在60℃下进行1.5分钟(退火/延伸)。

在某些实施方案中，通过RT，实时PCR得到的基因目标量通过GAPDH(一种表达恒定的基因)的表达水平或通过以RIBOGREEN^TM(Molecular Probes，Inc.Eugene，OR)定量总RNA来进行规范化(normalize)。GAPDH表达可通过与靶标同时多重或单独运行实时RT-PCR来定量。总RNA可采用RiboGreen^TMRNA定量试剂(Molecular Probes，Inc.Eugene，OR)进行定量。通过RIBOGREEN^TM进行RNA定量的方法可参见Jones，L.J.，等人，(AnalyticalBiochemistry，1998，265，368-374)。

在该测定中，170μL的RiBOGREEN^TM工作试剂(RIBOGREEN^TM试剂以1∶350稀释于10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.5)通过移液管移入含有30μL纯化细胞RNA的96-孔板中。在CytoFluor 4000(PE Applied Biosystems)中读板，激发波长为485nm，发射波长为530nm。

实施例20

靶标-特异性引物和探针

可采用公开的序列信息设计探针和引物，与靶标序列杂交。

例如，对于人PTEN，可使用公开的序列信息(GENBANK^TM登录号U92436.1，SEQ ID NO：01)设计下列引物-探针组。

正向引物：AATGGCTAAGTGAAGATGACAATCAT(SEQ ID NO：02)

反向引物：TGCACATATCATTACACCAGTTCGT(SEQ ID NO：03)和PCR探针：

FAM-TTGCAGCAATTCACTGTAAAGCTGGAAAGG-TAMRA(SEQ IDNO：04)，其中FAM为荧光染料而TAMRA为淬火染料。

实施例21

靶标蛋白水平的Western印迹分析

Western印迹分析(免疫印迹分析)可采用标准方法进行。在寡核苷酸处理后16-20小时采集细胞，以PBS洗涤一次，悬浮于Laem mLi缓冲液(100μl/微孔)，煮沸5分钟并上样至16％SDS-PAGE凝胶。在150V下跑胶1.5小时，并转移到膜上进行western印迹。采用适当的针对靶标的一抗，以及针对该一抗的放射标记或荧光标记的二抗。采用PHOSPHORIMAGER ^TM(MolecularDynamics，Sunnyvale CA)显示条带。

实施例22

靶向PTEN的反义化合物的体内研究结果

向六周大的雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)注射一次剂量为3.2、10、32和100mg/kg的靶向PTEN的修饰的寡聚体。在施用后64小时处死小鼠。将肝组织匀浆化并按照标准方法利用实时PCR和

RNA定量试剂(Molecular Probes，Inc.Eugene，OR)对PTENmRNA水平进行定量。在用盐水-处理对照进行规范化之前测定相对于总RNA(利用Ribogreen)的PTENmRNA水平。所述反义化合物的相对活性以每个反义化合物的mRNA抑制的平均％结果而呈现，其中盐水-注射的对照来进行规范化。

每个核苷间连接基团为硫代磷酯，不另外指明的每个核苷为2’-脱氧核糖基核苷，每个MeC为5-CH₃C，并且脚注i或1的核苷定义如下：

脚注i 脚注1

测定用反义寡聚体394425、411001和425453处理的小鼠中的ALT和AST水平。通过LabCorp检测设备(San Diego，CA)分析血清并且相对于盐水注射的小鼠测定血清中ALT和AST的水平。ALT和AST大致水平列于下列表中。

本文所引用的所有出版物、专利和专利申请均作为参考并入本文中。尽管在前述的说明书中通过某些优选实施方案对本发明进行了描述，且为了阐述的目的列举了许多细节，本领域技术人员显然理解本发明可采用其它的实施方案，且此处所述的某些细节可在不悖离本发明基本原则的情况下进行相当的改变。

序列表

<110>Isis药物公司

SETH，Punit P.

SWAYZE，Eric E.

<120>6-双取代的双环核酸类似物

<130>CHEM0039WO

<150>60/948,134

<151>2007-07-05

<160>6

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>3160

<212>DNA

<213>人

<400>1

cctcccctcg cccggcgcgg tcccgtccgc ctctcgctcg cctcccgcct cccctcggtc 60

ttccgaggcg cccgggctcc cggcgcggcg gcggaggggg cgggcaggcc ggcgggcggt 120

gatgtggcag gactctttat gcgctgcggc aggatacgcg ctcggcgctg ggacgcgact 180

gcgctcagtt ctctcctctc ggaagctgca gccatgatgg aagtttgaga gttgagccgc 240

tgtgaggcga ggccgggctc aggcgaggga gatgagagac ggcggcggcc gcggcccgga 300

gcccctctca gcgcctgtga gcagccgcgg gggcagcgcc ctcggggagc cggccggcct 360

gcggcggcgg cagcggcggc gtttctcgcc tcctcttcgt cttttctaac cgtgcagcct 420

cttcctcggc ttctcctgaa agggaaggtg gaagccgtgg gctcgggcgg gagccggctg 480

aggcgcggcg gcggcggcgg cggcacctcc cgctcctgga gcggggggga gaagcggcgg 540

cggcggcggc cgcggcggct gcagctccag ggagggggtc tgagtcgcct gtcaccattt 600

ccagggctgg gaacgccgga gagttggtct ctccccttct actgcctcca acacggcggc 660

ggcggcggcg gcacatccag ggacccgggc cggttttaaa cctcccgtcc gccgccgccg 720

caccccccgt ggcccgggct ccggaggccg ccggcggagg cagccgttcg gaggattatt 780

cgtcttctcc ccattccgct gccgccgctg ccaggcctct ggctgctgag gagaagcagg 840

cccagtcgct gcaaccatcc agcagccgcc gcagcagcca ttacccggct gcggtccaga 900

gccaagcggc ggcagagcga ggggcatcag ctaccgccaa gtccagagcc atttccatcc 960

tgcagaagaa gccccgccac cagcagcttc tgccatctct ctcctccttt ttcttcagcc 1020

acaggctccc agacatgaca gccatcatca aagagatcgt tagcagaaac aaaaggagat 1080

atcaagagga tggattcgac ttagacttga cctatattta tccaaacatt attgctatgg 1140

gatttcctgc agaaagactt gaaggcgtat acaggaacaa tattgatgat gtagtaaggt 1200

ttttggattc aaagcataaa aaccattaca agatatacaa tctttgtgct gaaagacatt 1260

atgacaccgc caaatttaat tgcagagttg cacaatatcc ttttgaagac cataacccac 1320

cacagctaga acttatcaaa cccttttgtg aagatcttga ccaatggcta agtgaagatg 1380

acaatcatgt tgcagcaatt cactgtaaag ctggaaaggg acgaactggt gtaatgatat 1440

gtgcatattt attacatcgg ggcaaatttt taaaggcaca agaggcccta gatttctatg 1500

gggaagtaag gaccagagac aaaaagggag taactattcc cagtcagagg cgctatgtgt 1560

attattatag ctacctgtta aagaatcatc tggattatag accagtggca ctgttgtttc 1620

acaagatgat gtttgaaact attccaatgt tcagtggcgg aacttgcaat cctcagtttg 1680

tggtctgcca gctaaaggtg aagatatatt cctccaattc aggacccaca cgacgggaag 1740

acaagttcat gtactttgag ttccctcagc cgttacctgt gtgtggtgat atcaaagtag 1800

agttcttcca caaacagaac aagatgctaa aaaaggacaa aatgtttcac ttttgggtaa 1860

atacattctt cataccagga ccagaggaaa cctcagaaaa agtagaaaat ggaagtctat 1920

gtgatcaaga aatcgatagc atttgcagta tagagcgtgc agataatgac aaggaatatc 1980

tagtacttac tttaacaaaa aatgatcttg acaaagcaaa taaagacaaa gccaaccgat 2040

acttttctcc aaattttaag gtgaagctgt acttcacaaa aacagtagag gagccgtcaa 2100

atccagaggc tagcagttca acttctgtaa caccagatgt tagtgacaat gaacctgatc 2160

attatagata ttctgacacc actgactctg atccagagaa tgaacctttt gatgaagatc 2220

agcatacaca aattacaaaa gtctgaattt ttttttatca agagggataa aacaccatga 2280

aaataaactt gaataaactg aaaatggacc tttttttttt taatggcaat aggacattgt 2340

gtcagattac cagttatagg aacaattctc ttttcctgac caatcttgtt ttaccctata 2400

catccacagg gttttgacac ttgttgtcca gttgaaaaaa ggttgtgtag ctgtgtcatg 2460

tatatacctt tttgtgtcaa aaggacattt aaaattcaat taggattaat aaagatggca 2520

ctttcccgtt ttattccagt tttataaaaa gtggagacag actgatgtgt atacgtagga 2580

attttttcct tttgtgttct gtcaccaact gaagtggcta aagagctttg tgatatactg 2640

gttcacatcc tacccctttg cacttgtggc aacagataag tttgcagttg gctaagagag 2700

gtttccgaaa ggttttgcta ccattctaat gcatgtattc gggttagggc aatggagggg 2760

aatgctcaga aaggaaataa ttttatgctg gactctggac catataccat ctccagctat 2820

ttacacacac ctttctttag catgctacag ttattaatct ggacattcga ggaattggcc 2880

gctgtcactg cttgttgttt gcgcattttt ttttaaagca tattggtgct agaaaaggca 2940

gctaaaggaa gtgaatctgt attggggtac aggaatgaac cttctgcaac atcttaagat 3000

ccacaaatga agggatataa aaataatgtc ataggtaaga aacacagcaa caatgactta 3060

accatataaa tgtggaggct atcaacaaag aatgggcttg aaacattata aaaattgaca 3120

atgatttatt aaatatgttt tctcaattgt aaaaaaaaaa 3160

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

aatggctaag tgaagatgac aatcat 26

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

tgcacatatc attacaccag ttcgt 25

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>4

ttgcagcaat tcactgtaaa gctggaaagg 30

<210>5

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)...(12)

<223>这些位点的碱基为RNA

<400>5

cutagcactg gccu 14

<210>6

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>6

cttagcactg gcct 14

Claims

1.具有通式I的双环核苷：

其中：

B_x为杂环碱基部分；

或q₁和q₂一起为＝C(q₃)(q₄)；

每个取代的基团各自独立地被独立地选自卤素、C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、OJ₁、SJ₁、NJ₁J₂、N₃、CN、C(＝O)OJ₁、C(＝O)NJ₁J₂、C(＝O)J₁、O-C(＝O)NJ₁J₂、N(H)C(＝O)NJ₁J₂或N(H)C(＝S)NJ₁J₂的取代基团单或多取代；并且

每个J₁和J₂各自独立地为H、C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、C₁-C₆氨烷基或保护基团。

2.权利要求1所述的双环核苷，其中q₁和q₂中的至少一个为C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基。

3.权利要求1或2任何一项所述的双环核苷，其中q₁和q₂每个分别为C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基。

4.权利要求1-3的任何一项所述的双环核苷，其中q₁和q₂每个分别为甲基、乙基或丙基。

5.权利要求1-4的任何一项所述的双环核苷，其中q₁和q₂均为甲基。

6.权利要求1-3的任何一项所述的双环核苷，其中q₁和q₂的至少一个为取代的C₁-C₆烷基。

7.权利要求1-3或6的任何一项所述的双环核苷，其中所述取代的C₁-C₆烷基包含选自OJ₁、SJ₁、NJ₁J₂、N₃、CN、C(＝O)OJ₁、C(＝O)NJ₁J₂、C(＝O)J₁或O-C(＝O)NJ₁J₂的至少一个取代基团，其中每个J₁和J₂各自独立地为H、C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、C₁-C₆氨烷基或保护基团。

8.权利要求1-3、6或7的任何一项所述的双环核苷，其中所述取代的C₁-C₆烷基包含选自OJ₁、NJ₁J₂或CN的至少一个取代基团，其中每个J₁和J₂各自独立地为H、C₁-C₆烷基或保护基团。

9.权利要求1所述的双环核苷，其中q₁和q₂一起为＝C(q₃)(q₄)。

10.权利要求9的双环核苷，其中q₃和q₄分别为H。

11.权利要求1或9任何一项所述的双环核苷，其中q₃和q₄的至少一个为卤素、C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基。

12.权利要求1、9或11任何一项所述的双环核苷，其中q₃和q₄的至少一个为甲基。

13.权利要求1、9、11或12任何一项所述的双环核苷，其中q₃和q₄分别为甲基。

14.权利要求1-13任何一项所述的双环核苷，其中T₁和T₂的分别为羟基保护基团。

15.权利要求1-14任何一项所述的双环核苷，其中所述羟基保护基团各自独立地选自：乙酰基、叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氢吡喃基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、2-三甲基甲硅烷乙基、对氯苯基、2，4-二硝基苯基、苄基、苯甲酰基、对苯基苯甲酰基、2，6-二氯苄基、二苯基甲基、对硝基苄基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、苯甲酰基甲酸酯、氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、新戊酰基、9-芴基甲基碳酸脂、甲磺酸盐、甲苯磺酸盐、三氟甲磺酸盐、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧三苯甲基、三甲氧基三苯甲基或取代的9-苯基黄嘌呤9-基。

16.权利要求1-15任何一项所述的双环核苷，其中T₁为乙酰基、苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或4，4’-二甲氧三苯甲基。

17.权利要求1-16任何一项所述的双环核苷，其中T₁为4，4’-二甲氧三苯甲基。

18.权利要求1-13和15-17任何一项所述的双环核苷，其中T₂为活性磷基团。

19.权利要求18任一所述的双环核苷，其中所述活性磷基团为二异丙基氰基乙氧基亚磷酰胺或H-磷酸盐。

20.权利要求1-13和15-19任何一项所述的双环核苷，其中T₂为二异丙基氰基乙氧基亚磷酰胺。

21.权利要求20所述的双环核苷，其中q₁和q₂分别为甲基。

22.权利要求20所述的双环核苷，其中q₁和q₂一起为＝C(q₃)(q₄)并且q₃和q₄分别为H。

23.权利要求1-22任何一项所述的双环核苷，其中Bx为嘧啶、取代的嘧啶、嘌呤或取代的嘌呤。

24.权利要求1-23任何一项所述的双环核苷，其中Bx为尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-噻唑-尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-噻唑-胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤或2，6-二氨基嘌呤。

25.权利要求1-3、6-9、11、12、14-20、23或24任何一项所述的双环核苷，其中每个J₁和J₂各自独立地为H或C₁-C₃烷基。

26.权利要求1-25任何一项所述的双环核苷，具有通式II：

27.寡聚化合物，其包含至少一个具有通式III的双环核苷：

其中对于具有通式III的所述至少一个双环核苷，各自独立地：

B_x为杂环碱基部分；

T₃和T₄各自独立地为将具有通式III的双环核苷连接至所述寡聚化合物的核苷酸间连接基团，或T₃和T₄中的一个为将具有通式III的双环核苷连接至所述寡聚化合物的核苷酸间连接基团，而T₃和T₄中的另一个为H、羟基保护基团、连接的偶联物基团或5’或3’-末端基团；

q₁和q₂各自独立地为卤素、C₁-C₁₂烷基、经取代的C₁-C₁₂烷基、C₂-C₁₂烯基、经取代的C₂-C₁₂烯基、C₂-C₁₂炔基、经取代的C₂-C₁₂炔基、C₁-C₁₂烷氧基、经取代的C₁-C₁₂烷氧基、OJ₁、SJ₁、SOJ₁、SO₂J₁、NJ₁J₂、N₃、CN、C(＝O)OJ₁、C(＝O)NJ₁J₂、C(＝O)J₁、O-C(＝O)NJ₁J₂、N(H)C(＝NH)NJ₁J₂、N(H)C(＝O)NJ₁J₂或N(H)C(＝S)NJ₁J₂；

或q₁和q₂均为＝C(q₃)(q₄)；

q₃和q₄各自独立地为H、卤素、C₁-C₁₂烷基或经取代的C₁-C₁₂烷基；

28.权利要求27所述的寡聚化合物，其中对于具有通式III的所述双环核苷，各自独立地，至少一个q₁和q₂为C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基。

29.权利要求27或28任何一项所述的寡聚化合物，其中q₁和q₂各自独立地为C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基。

30.权利要求27-29的任何一项所述的寡聚化合物，其中q₁和q₂各自独立地为甲基、乙基或丙基。

31.权利要求27-30的任何一项所述的寡聚化合物，其中q₁和q₂均为甲基。

32.权利要求27-29的任何一项所述的寡聚化合物，其中至少每个q₁和q₂为取代的C₁-C₆烷基。

33.权利要求27-29或32的任何一项所述的双环核苷，其中至少每个q₁或每个q₂为取代的C₁-C₆烷基，其中所述取代基团选自OJ₁、SJ₁、NJ₁J₂、N₃、CN、C(＝O)OJ₁、C(＝O)NJ₁J₂、C(＝O)J₁或O-C(＝O)NJ₁J₂，其中每个J₁和J₂各自独立地为H、C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、C₁-C₆氨烷基或保护基团。

34.权利要求27-29、32或33的任何一项所述的寡聚化合物，其中至少每个q₁或每个q₂为取代的C₁-C₆烷基，其中所述取代基团选自OJ₁、NJ₁J₂或CN，其中每个J₁并J₂各自独立地为H、C₁-C₆烷基或保护基团。

35.权利要求27所述的寡聚化合物，其中对于具有通式III的所述双环核苷，各自独立地，q₁和q₂一起为＝C(q₃)(q₄)。

36.权利要求35的寡聚化合物，其中q₃和q₄分别为H。

37.权利要求35所述的寡聚化合物，其中至少每个q₃或每个q₄均为卤素、C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基。

38.权利要求35或37任何一项所述的寡聚化合物，其中至少每个q₃或每个q₄均为甲基。

39.权利要求35、37或38任何一项所述的寡聚化合物，其中每个q₃和每个q₄均为甲基。

40.权利要求27-39任何一项所述的寡聚化合物，其包含至少一个3’或5’-末端基团。

41.权利要求27-40任何一项所述的寡聚化合物，其包含连续序列的连接的核苷，其中核苷间连接基团各自独立地为磷酸二酯或硫代磷酯。

42.权利要求27-41任何一项所述的寡聚化合物，其包含连续序列的连接的核苷，其中每个核苷间连接基团为硫代磷酯。

43.权利要求27-42任何一项所述的寡聚化合物，其中每个双环核苷具有通式IV：

44.权利要求27-43任何一项所述的寡聚化合物，其包含至少两个连续的具有通式III的双环核苷组成的至少一个区域。

45.权利要求44所述的寡聚化合物，其中至少两个连续的具有通式III的双环核苷组成的至少一个区域位于所述寡聚化合物的3’或5’-末端。

46.权利要求45所述的寡聚化合物，进一步包含位于所述寡聚化合物的3’或5’-末端另一端的至少一个具有通式III的双环核苷。

47.权利要求27-43任何一项所述的寡聚化合物，其包含有间隙的寡聚化合物，该有间隙的寡聚化合物具有由约6至约14个单体亚单位组成的内部区域以分开两个外部区域，其中所述外部区域独立地包含1至约5个具有通式III的连续的双环核苷。

48.权利要求47所述的寡聚化合物，其中所述内部区域中基本上每个单体亚单位为β-D-2’-脱氧核糖基核苷。

49.权利要求47或48任何一项所述的寡聚化合物，其中所述内部区域包含约8至约14个β-D-2’-脱氧核糖基核苷。

50.权利要求47-49任何一项所述的寡聚化合物，其中所述内部区域包含约10至约14个β-D-2’-脱氧核糖基核苷。

51.权利要求47-50任何一项所述的寡聚化合物，其中所述内部区域包含约10至约12个β-D-2’-脱氧核糖基核苷。

52.权利要求47-51任何一项所述的寡聚化合物，其中所述外部区域各自独立地包含2至约3个具有通式III的双环核苷。

53.权利要求47-51任何一项所述的寡聚化合物，其中所述外部区域各自独立地包含2个具有通式III的双环核苷。

54.权利要求47-53任何一项所述的寡聚化合物，其中所述内部区域包含10个β-D-2’-脱氧核糖基核苷。

55.权利要求47-50、52或53任何一项所述的寡聚化合物，其中所述内部区域包含14个β-D-2’-脱氧核糖基核苷。

56.权利要求47-52、54或55任何一项所述的寡聚化合物，其中所述外部区域各自独立地包含2个具有通式III的双环核苷。

57.权利要求47-56任何一项所述的寡聚化合物，其中每个双环核苷具有通式IV：

58.权利要求27-57任何一项所述的寡聚化合物，其在长度上包含约8至约40个单体亚单位。

59.权利要求27-57任何一项所述的寡聚化合物，其在长度上包含约8至约20个单体亚单位。

60.权利要求27-57任何一项所述的寡聚化合物，其在长度上包含约10至约16个单体亚单位。

61.权利要求27-57任何一项所述的寡聚化合物，其在长度上包含约10至约14个单体亚单位。

62.抑制基因表达的方法，该方法包括将一种或多种细胞、组织或动物与权利要求27至61任何一项的寡聚化合物相接触。

63.一种方法，其包括将细胞与寡聚化合物接触，所述寡聚化合物包含至少一个通式III的双环核苷：

其中所述至少一个双环核苷各自独立地具有通式III：

B_x为杂环碱基部分；

或q₁和q₂均为＝C(q₃)(q₄)；

取代的基团各自独立地被独立地选自卤素、C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、OJ₁、SJ₁、NJ₁J₂、N₃、CN、C(＝O)OJ₁、C(＝O)NJ₁J₂、C(＝O)J₁、O-C(＝O)J₁J₂、N(H)C(＝O)NJ₁J₂或N(H)C(＝S)NJ₁J₂的取代基团单或多取代；

64.权利要求63所述的方法，其中所述细胞为动物。

65.权利要求63-64任何一项所述的方法，其中所述细胞为人。

66.权利要求63-65任何一项所述的方法，其中所述靶标RNA选自mRNA、pre-mRNA和micro RNA。

67.权利要求63-66任何一项所述的方法，其中所述靶标RNA为mRNA。

68.权利要求63-67任何一项所述的方法，其中所述靶标RNA为人mRNA。

69.权利要求63-68任何一项所述的方法，其中所述靶标RNA被裂解从而抑制其功能。

70.权利要求63-69任何一项所述的方法，进一步包括评估所述寡聚化合物对所述细胞的反义活性。

71.权利要求70所述的方法，其中所述评估包括检测所述靶标RNA的水平。

72.权利要求70所述的方法，其中所述评估包括检测所述蛋白质的水平。

73.权利要求70所述的方法，其中所述评估包括检测一种或多种表型的结果。