CN115151555A - 桥连型核苷和使用了该桥连型核苷的核苷酸 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了桥连型核苷和使用了该核苷的核苷酸。本发明的核苷由以下式(I)表示。本发明的桥连型核苷能够替代存在在特定脏器蓄积等顾虑的硫代磷酸酯修饰核酸，工业上的生产率也优异。
Description
技术领域
本发明涉及桥连型核苷和使用了该桥连型核苷的核苷酸。更详细而言，涉及具有良好的核酸酶耐性且能够高效地制造的桥连型核苷、以及使用了该桥连型核苷的核苷酸。
背景技術
对DNA或RNA具有优异的结合亲和性的人工核酸能够在基因诊断和核酸医药中应用，迄今为止开发多种类型的人工核酸。其中，通过桥连将核酸糖部的配齿固定于N型配齿的2',4'－BNA(2',4'－bridged nucleic acid，别名LNA)对单链RNA(ssRNA)具有优异的结合亲和性，期待着作为能够实现反义法等各种应用的核酸医药(非专利文献1和2)。但是，2',4'－BNA的酶耐受性不足，存在容易引发肝毒性的问题(非专利文献3)。
相对于此，有报导指出在2',4'－BNA的6'位导入了甲基、甲氧基甲基等取代基的人工核酸对ssRNA的结合亲和性提升并且具有优异的酶耐受性(非专利文献4)。但是，在6'位导入这些取代基时，有时会出现异构体，需要繁杂的分离操作。
另一方面，有报导指出在6'位导入了环丙基的人工核酸(scpBNA)能够通过不需要异构体分离的合成路径合成，能够维持对ssRNA的高的结合亲和性，并且具有高的酶耐受性(专利文献1和非专利文献5)。但是，在scpBNA的合成路径中得到的各种生成物的收率很难说是足够令人满意的。期望开发出能够适应工业生产、能够以更高的收率合成的人工核酸。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2015/125783号
非专利文献
非专利文献1：S.Obika等人，Tetrahedron Lett.,1997,38,8735-8738非专利文献2：S.Singh等人，Chem.Commun.,1998,455-456
非专利文献3：E.Swayze等人，Nucleic Acids Res.,2007,35,687-700
非专利文献4：P.P.Seth等人，J.Org.Chem.,2010,75,1569-1581
非专利文献5：T.Yamaguchi等人，Chem.Commun.,2015,51,9737-9740
发明内容
发明要解决的技术问题
本发明是为了解决上述技术问题而完成的，其目的在于提供一种在6'位导入了取代基、不需要异构体分离等繁杂操作、并且能够以更高收率制造的桥连型核苷、以及使用了该桥连型核苷的核苷酸。
用于解决技术问题的技术手段
本发明为以下式(I)所示的化合物或其盐，
(式中，
Base表示可以具有1个以上选自α组中的任意取代基的嘌呤－9－基或2－氧代－1,2－二氢嘧啶－1－基，其中，该α组包括羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、碳原子数1～6的直链烷基、碳原子数1～6的直链烷氧基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、碳原子数1～6的直链烷硫基、氨基、碳原子数1～6的直链烷基氨基、由核酸合成的保护基保护的氨基和卤原子，
R2和R3分别独立地表示氢原子、核酸合成的羟基的保护基、可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基、可以形成支链或环的碳原子数2～7的烯基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3～10的芳基、具有可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3～12的芳基部分的芳烷基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基的酰基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基的甲硅烷基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基的磷酸基、由核酸合成的保护基保护的磷酸基、－P(R4a)R5a[式中，R4a和R5a分别独立地表示羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、氨基、碳原子数1～6的烷氧基、碳原子数1～6的烷硫基、碳原子数1～6的氰基烷氧基或具有碳原子数1～6的烷基的二烷基氨基]，
X1为可以被碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b[其中，R4b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]或－OR5b[其中，R5b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]取代的碳原子数2～8的亚烷基；或者X1为可以被碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b[其中，R4b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]或－OR5b[其中，R5b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]取代的碳原子数2～8的亚烯基；
并且，X2为氧原子、硫原子、－NH－、－N(CH3)－或亚甲基。)
在一个实施方式中，上述式(I)由以下式表示。
(式中，
Base表示可以具有1个以上选自α组中的任意取代基的嘌呤－9－基或2－氧代－1,2－二氢嘧啶－1－基，其中，该α组包括羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、碳原子数1～6的直链烷基、碳原子数1～6的直链烷氧基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、碳原子数1～6的直链烷硫基、氨基、碳原子数1～6的直链烷基氨基、由核酸合成的保护基保护的氨基和卤原子，
R2和R3分别独立地表示氢原子、核酸合成的羟基的保护基、可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基、可以形成支链或环的碳原子数2～7的烯基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3～10的芳基、具有可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3～12的芳基部分的芳烷基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基的酰基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基的甲硅烷基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基的磷酸基、由核酸合成的保护基保护的磷酸基、－P(R4a)R5a[式中，R4a和R5a分别独立地表示羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、氨基、碳原子数1～6的烷氧基、碳原子数1～6的烷硫基、碳原子数1～6的氰基烷氧基或具有碳原子数1～6的烷基的二烷基氨基]，
X2为氧原子、硫原子、－NH－、－N(CH3)－或亚甲基，
并且，R6、R7、R8、R9、R10和R11分别独立地为氢原子、碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b[其中，R4b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]或－OR5b[其中，R5b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]。)
在一个实施方式中，上述式(I)由以下式表示。
(式中，
Base表示可以具有1个以上选自α组中的任意取代基的嘌呤－9－基或2－氧代－1,2－二氢嘧啶－1－基，其中，该α组包括羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、碳原子数1～6的直链烷基、碳原子数1～6的直链烷氧基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、碳原子数1～6的直链烷硫基、氨基、碳原子数1～6的直链烷基氨基、由核酸合成的保护基保护的氨基和卤原子，
R2和R3分别独立地表示氢原子、核酸合成的羟基的保护基、可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基、可以形成支链或环的碳原子数2～7的烯基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3～10的芳基、具有可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3～12的芳基部分的芳烷基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基的酰基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基的甲硅烷基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基的磷酸基、由核酸合成的保护基保护的磷酸基、－P(R4a)R5a[式中，R4a和R5a分别独立地表示羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、氨基、碳原子数1～6的烷氧基、碳原子数1～6的烷硫基、碳原子数1～6的氰基烷氧基或具有碳原子数1～6的烷基的二烷基氨基]，
X2为氧原子、硫原子、－NH－、－N(CH3)－或亚甲基，
并且，R6和R7分别独立地为氢原子、碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b[其中，R4b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]或－OR5b[其中，R5b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]。)
在一个实施方式中，在上述式(I)中，以上Base为6－氨基嘌呤－9－基、2,6－二氨基嘌呤－9－基、2－氨基－6－氯嘌呤－9－基、2－氨基－6－氟嘌呤－9－基、2－氨基－6－溴嘌呤－9－基、2－氨基－6－羟基嘌呤－9－基、6－氨基－2－甲氧基嘌呤－9－基、6－氨基－2－氯嘌呤－9－基、6－氨基－2－氟嘌呤－9－基、2,6－二甲氧基嘌呤－9－基、2,6－二氯嘌呤－9－基、6－巯基嘌呤－9－基、2－氧代－4－氨基－1,2－二氢嘧啶－1－基、4－氨基－2－氧代－5－氟－1,2－二氢嘧啶－1－基、4－氨基－2－氧代－5－氯－1,2－二氢嘧啶－1－基、2－氧代－4－甲氧基－1,2－二氢嘧啶－1－基、2－氧代－4－巯基－1,2－二氢嘧啶－1－基、2－氧代－4－羟基－1,2－二氢嘧啶－1－基、2－氧代－4－羟基－5－甲基－1,2－二氢嘧啶－1－基或4－氨基－5－甲基－2－氧代－1,2－二氢嘧啶－1－基。
在一个实施方式中，在上述式(I)中，以上Base是以下式所示的基团。
本发明还为包含至少1个以下式(II)所示的核苷结构的寡核苷酸或其药理学上可接受的盐。
(式中，
Base表示可以具有1个以上选自α组中的任意取代基的嘌呤－9－基或2－氧代－1,2－二氢嘧啶－1－基，其中，该α组包括羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、碳原子数1～6的直链烷基、碳原子数1～6的直链烷氧基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、碳原子数1～6的直链烷硫基、氨基、碳原子数1～6的直链烷基氨基、由核酸合成的保护基保护的氨基和卤原子，
X1为可以被碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b[其中，R4b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]或－OR5b[其中，R5b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]取代的碳原子数2～8的亚烷基；或者为X1可以被碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b[其中，R4b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]或－OR5b[其中，R5b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]取代的碳原子数2～8的亚烯基，
并且，X2为氧原子、硫原子、－NH－、－N(CH3)－或亚甲基。)
在一个实施方式中，上述式(II)由以下式表示。
(式中，
Base表示可以具有1个以上选自α组中的任意取代基的嘌呤－9－基或2－氧代－1,2－二氢嘧啶－1－基，其中，该α组包括羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、碳原子数1～6的直链烷基、碳原子数1～6的直链烷氧基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、碳原子数1～6的直链烷硫基、氨基、碳原子数1～6的直链烷基氨基、由核酸合成的保护基保护的氨基和卤原子，
X2为氧原子、硫原子、－NH－、－N(CH3)－或亚甲基，
并且，R6、R7、R8、R9、R10和R11分别独立地为氢原子、碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4[其中，R4为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]或－OR5[其中，R5为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]。)
在一个实施方式中，上述式(II)由以下式表示。
(式中，
Base表示可以具有1个以上选自α组中的任意取代基的嘌呤－9－基或2－氧代－1,2－二氢嘧啶－1－基，其中，该α组包括羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、碳原子数1～6的直链烷基、碳原子数1～6的直链烷氧基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、碳原子数1～6的直链烷硫基、氨基、碳原子数1～6的直链烷基氨基、由核酸合成的保护基保护的氨基和卤原子，
X2为氧原子、硫原子、－NH－、－N(CH3)－或亚甲基，
并且，R6和R7分别独立地为氢原子、碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b[其中，R4b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]或－OR5b[其中，R5b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]。)
本发明还为以上寡核苷酸或其药理学上可接受的盐的制造方法，包括使用以下式(I)所示的化合物或其药理学上可接受的盐合成寡核苷酸的工序。
(式中，
Base表示可以具有1个以上选自α组中的任意取代基的嘌呤－9－基或2－氧代－1,2－二氢嘧啶－1－基，其中，该α组包括羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、碳原子数1～6的直链烷基、碳原子数1～6的直链烷氧基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、碳原子数1～6的直链烷硫基、氨基、碳原子数1～6的直链烷基氨基、由核酸合成的保护基保护的氨基和卤原子，
R2和R3分别独立地表示氢原子、核酸合成的羟基的保护基、可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基、可以形成支链或环的碳原子数2～7的烯基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3～10的芳基、具有可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3～12的芳基部分的芳烷基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基的酰基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基的甲硅烷基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基的磷酸基、由核酸合成的保护基保护的磷酸基、－P(R4a)R5a[式中，R4a和R5a分别独立地表示羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、氨基、碳原子数1～6的烷氧基、碳原子数1～6的烷硫基、碳原子数1～6的氰基烷氧基或具有碳原子数1～6的烷基的二烷基氨基。]
X1为可以被碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b[其中，R4b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]或－OR5b[其中，R5b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]取代的碳原子数2～8的亚烷基；或者X1为可以被碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b[其中，R4b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]或－OR5b[其中，R5b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]取代的碳原子数2～8的亚烯基；
并且，X2为氧原子、硫原子、－NH－、－N(CH3)－或亚甲基。)发明效果
根据本发明能够提供一种对ssRNA具有高的结合亲和性、并且具有高的酶耐受性的新型的6'位被修饰的桥连型核苷以及使用了该桥连型核苷的核苷酸。本发明的桥连型核苷在其制造时无需异构体的分离工序，因而工业上的生产率也优异。
附图说明
图1是表示利用3'－核酸外切酶对5'－TTTTTTTTTX－3'序列的各种寡核苷酸进行处理时的、未切断寡核苷酸的比例的经时变化的图表。
图2是表示投予各种寡核苷酸时小鼠的各种组织中的相对的MALAT1表达水平的图表。
图3是表示投予各种寡核苷酸时小鼠的各种组织中的相对的MALAT1表达水平的图表。
具体实施方式
首先，对本说明书中使用的术语进行定义。
在本说明书中，术语“碳原子数1～6的直链烷基”是指碳原子数1～6的任意的直链烷基，具体而言，是指甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基。另外，术语“碳原子数1～3的直链烷基”是指碳原子数1～3的任意的直链烷基，具体而言，是指甲基、乙基、正丙基。另一方面，在称为术语“碳原子数1～6的烷基”时，是指碳原子数1～6的任意的直链、支链或环状的烷基。
在本说明书中，术语“碳原子数1～6的直链烷氧基”包括具有碳原子数1～6的任意的直链烷基的烷氧基。例如，可以列举甲氧基、乙氧基、正丙氧基等。另一方面，在称为术语“碳原子数1～6的烷氧基”时，是指碳原子数1～6的任意的直链、支链或环状的烷氧基。另外，在称为术语“可以被碳原子数1～6的直链烷氧基取代的碳原子数1～6的直链烷氧基”时，是指上述“碳原子数1～6的直链烷氧基”、以及构成“碳原子数1～6的直链烷氧基”的1个或1个以上的氢原子被可以相同也可以不同的其它的“碳原子数1～6的直链烷氧基”取代的烷氧基。作为这样的“可以被碳原子数1～6的直链烷氧基取代的碳原子数1～6的直链烷氧基”，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、甲氧基甲氧基、乙氧基甲氧基、正丙氧基甲氧基、甲氧基乙氧基(例如2－甲氧基乙氧基)、乙氧基乙氧基(例如2－乙氧基乙氧基)和正丙氧基乙氧基。
在本说明书中，术语“碳原子数1～6的氰基烷氧基”是指碳原子数1～6的任意的直链、支链或环状的烷氧基中的至少1个氢原子被氰基取代的基团。
在本说明书中，术语“碳原子数1～6的直链烷硫基”包括具有碳原子数1～6的任意的直链烷基的烷硫基。例如，可以列举甲硫基、乙硫基、正丙硫基等。另一方面，在称为术语“碳原子数1～6的烷硫基”时，是指碳原子数1～6的任意的直链、支链或环状的烷硫基。
在本说明书中，术语“碳原子数1～6的直链烷基氨基”包括具有1个或2个具有碳原子数1～6的任意的直链烷基的烷基氨基的烷基氨基。例如，可以列举甲氨基、二甲基氨基、乙氨基、甲基乙基氨基、二乙基氨基等。
在本说明书中，术语“可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基”包括碳原子数1～7的任意的直链烷基、碳原子数3～7的任意的支链烷基和碳原子数3～7的任意的环状烷基。有时也简称为“低级烷基”。例如，作为碳原子数1～7的任意的直链烷基，可以列举甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基和正庚基；作为碳原子数3～7的任意的支链烷基，可以列举异丙基、异丁基、叔丁基、异戊基等；另外，作为碳原子数3～7的任意的环状烷基，可以列举环丁基、环戊基、环己基等。
在本说明书中，术语“可以形成支链或环的碳原子数2～7的烯基”包括碳原子数2～7的任意的直链烯基、碳原子数3～7的任意的支链烯基和碳原子数3～7的任意的环状烯基。有时也简称为“低级烯基”。例如，作为碳原子数2～7的任意的直链烯基，可以列举乙烯基、1－丙烯基、2－丙烯基、1－丁烯基、2－丁烯基、1－戊烯基、2－戊烯基、3－戊烯基、4－戊烯基、1－己烯基等；作为碳原子数3～7的任意的支链烯基，可以列举异丙烯基、1－甲基－1－丙烯基、1－甲基－2－丙烯基、2－甲基－1－丙烯基、2－甲基－2－丙烯基、1－甲基－2－丁烯基等；另外，作为碳原子数3～7的任意的环状烯基，可以列举环丁烯基、环戊烯基、环己烯基等。
在本说明书中，术语“可以包含杂原子的碳原子数3～10的芳基”包括只由烃构成的碳原子数6～10的任意的芳基、和构成该芳基的环结构的至少1个碳原子被杂原子(例如氮原子、氧原子和硫原子以及这些原子的组合)取代的碳原子数3～12的任意的杂芳基。作为该碳原子数6～10的芳基，可以列举苯基、萘基、茚基、薁基等；另外，作为该碳原子数3～12的任意的杂芳基，可以列举吡啶基、吡咯基、喹啉基、吲哚基、咪唑基、呋喃基、噻吩基等。
在本说明书中，作为术语“具有可以包含杂原子的碳原子数3～12的芳基部分的芳烷基”的例子，可以列举苄基、苯乙基、萘甲基、3－苯基丙基、2－苯基丙基、4－苯基丁基、2－苯基丁基、吡啶基甲基、吲哚基甲基、呋喃基甲基、噻吩基甲基、吡咯基甲基、2－吡啶基乙基、1－吡啶基乙基、3－噻吩基丙基等。
在本说明书中，作为术语“酰基”的例子，可以列举脂肪族酰基和芳香族酰基。具体而言，作为脂肪族酰基的例子，可以列举甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基(pentanoyl group)、新戊酰基(pivaloyl group)、正戊酰基(valeryl group)、异戊酰基、辛酰基、壬酰基、癸酰基、3－甲基壬酰基、8－甲基壬酰基、3－乙基辛酰基、3,7－二甲基辛酰基、十一碳酰基、十二碳酰基、十三碳酰基、十四碳酰基、十五碳酰基、十六碳酰基、1－甲基十五碳酰基、14－甲基十五碳酰基、13,13－二甲基十四碳酰基、十七碳酰基、15－甲基十六碳酰基、十八碳酰基、1－甲基十七碳酰基、十九碳酰基、二十碳酰基和二十一碳酰基这样的烷基羰基；丁二酰基、戊二酰基、己二酰基这样的羧基化烷基羰基；氯乙酰基、二氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基这样的卤代低级烷基羰基；甲氧基乙酰基这样的低级烷氧基低级烷基羰基；(E)－2－甲基－2－丁烯酰基这样的不饱和烃基羰基。另外，作为芳香族酰基的例子，可以列举苯甲酰基、α－萘甲酰基、β－萘甲酰基这样的芳基羰基；2－溴苯甲酰基、4－氯苯甲酰基这样的卤代芳基羰基；2,4,6－三甲基苯甲酰基、4－甲苯酰基这样的低级烷基化芳基羰基；4－甲氧苯甲酰基这样的低级烷氧基化芳基羰基；2－羧基苯甲酰基、3－羧基苯甲酰基、4－羧基苯甲酰基这样的羧基化芳基羰基；4－硝基苯甲酰基、2－硝基苯甲酰基这样的硝基化芳基羰基；2－(甲氧基羰基)苯甲酰基这样的低级烷氧基羰基化芳基羰基；4－苯基苯甲酰基这样的芳基化芳基羰基等。优选为甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、新戊酰基、苯甲酰基。
在本说明书中，术语“碳原子数2～8的亚烷基”是指通过亚甲基(－CH2－)重复而构成的碳原子数2～8的二价基团。作为具体例，可以列举－CH2CH2－、－CH2CH2CH2CH2－和－CH2CH2CH2CH2CH2CH2－。另外，术语“可以被碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b[其中，R4b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]或－OR5b[其中，R5b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]取代的碳原子数2～8的亚烷基”是指未取代的以上的碳原子数2～8的亚烷基、即仅通过亚甲基重复而构成的碳原子数2～8的二价基团中的至少1个氢原子被碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b或－OR5b取代的基团。
在本说明书中，术语“碳原子数2～8的亚烯基”是指包括－CH＝CH－、以及由至少1个亚甲基与1个碳－碳双键(－CH＝CH－)的组合而构成的碳原子数2～8的二价基团。作为具体例，可以列举－CH＝CH2－、－CH2CH＝CHCH2－和－CH2CH2CH＝CHCH2CH2－。另外，术语“可以被碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b[其中，R4b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]或－OR5b[其中，R5b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]取代的碳原子数2～8的亚烯基”是指未取代的以上的碳原子数2～8的亚烯基中的至少1个氢原子被碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b或－OR5b取代的基团。
在本说明书中，作为术语“甲硅烷基”的例子，可以列举三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、异丙基二甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、甲基二异丙基甲硅烷基、甲基二叔丁基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基这样的三低级烷基甲硅烷基；二苯基甲基甲硅烷基、丁基二苯基丁基甲硅烷基、二苯基异丙基甲硅烷基、苯基二异丙基甲硅烷基这样的被1～2个芳基取代的三低级烷基甲硅烷基等。优选为三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基，进一步优选三甲基甲硅烷基。
在本说明书中，作为术语“卤原子”，例如可以列举氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。优选氟原子或氯原子。
在本说明书中，术语“核酸合成的氨基的保护基”、“核酸合成的羟基的保护基”、“由核酸合成的保护基保护的羟基”、“由核酸合成的保护基保护的磷酸基”、“由核酸合成的保护基保护的巯基”的“保护基”，只要是能够在核酸合成时稳定地保护氨基、羟基、磷酸基或巯基的基团即可，没有特别限制。具体而言，是指能够在酸性条件或中性条件下稳定地通过加氢分解、水解、电解和光解这样的化学方法而断开的保护基。作为这样的保护基，例如，可以列举低级烷基、低级烯基、酰基、四氢吡喃基或四氢噻喃基、四氢呋喃基或四氢硫代呋喃基、甲硅烷基、低级烷氧基甲基、低级烷氧基化低级烷氧基甲基、卤代低级烷氧基甲基、低级烷氧基化乙基、卤代乙基、被1～3个芳基取代的甲基、“被在芳基环上取代有低级烷基、低级烷氧基、卤原子或氰基的1～3个芳基取代的甲基”、低级烷氧基羰基、“被卤原子、低级烷氧基或硝基取代的芳基”、“被卤原子或三低级烷基甲硅烷基取代的低级烷氧基羰基”、烯氧基羰基、“可以在芳基环上取代有低级烷氧基或硝基的芳烷基氧基羰基”等。
进一步具体而言，作为四氢吡喃基或四氢噻喃基，可以列举四氢吡喃－2－基、3－溴四氢吡喃－2－基、4－甲氧基四氢吡喃－4－基、四氢噻喃－4－基、4－甲氧基四氢噻喃－4－基等。作为四氢呋喃基或四氢硫代呋喃基，可以列举四氢呋喃－2－基、四氢硫代呋喃－2－基。作为低级烷氧基甲基，可以列举甲氧基甲基、1,1－二甲基－1－甲氧基甲基、乙氧基甲基、丙氧基甲基、异丙氧基甲基、丁氧基甲基、叔丁氧基甲基等。作为低级烷氧基化低级烷氧基甲基，可以列举2－甲氧基乙氧基甲基等。作为卤代低级烷氧基甲基，可以列举2,2,2－三氯乙氧基甲基、双(2－氯乙氧基)甲基等。作为低级烷氧基化乙基，可以列举1－乙氧基乙基、1－(异丙氧基)乙基等。作为卤代乙基，可以列举2,2,2－三氯乙基等。作为被1～3个芳基取代的甲基，可以列举苄基、α－萘基甲基、β－萘基甲基、二苯基甲基、三苯基甲基、α－萘基二苯基甲基、9－蒽基甲基等。作为“被在芳基环上取代有低级烷基、低级烷氧基、卤原子或氰基的1～3个芳基取代的甲基”，可以列举4－甲基苄基、2,4,6－三甲基苄基、3,4,5－三甲基苄基、4－甲氧基苄基、4－甲氧基苯基二苯基甲基、4,4'－二甲氧基三苯基甲基、2－硝基苄基、4－硝基苄基、4－氯苄基、4－溴苄基、4－氰基苄基等。作为低级烷氧基羰基，可以列举甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基、异丁氧基羰基等。作为“被卤原子、低级烷氧基或硝基取代的芳基”，可以列举4－氯苯基、2－氟苯基、4－甲氧基苯基、4－硝基苯基、2,4－二硝基苯基等。作为“被卤原子或三低级烷基甲硅烷基取代的低级烷氧基羰基”，可以列举2,2,2－三氯乙氧基羰基、2－三甲基甲硅烷基乙氧基羰基等。作为烯氧基羰基，可以列举乙烯氧基羰基、芳氧基羰基等。作为“可以在芳基环上取代有低级烷氧基或硝基的芳烷基氧基羰基”，可以列举苄氧基羰基、4－甲氧基苄氧基羰基、3,4－二甲氧基苄氧基羰基、2－硝基苄氧基羰基、4－硝基苄氧基羰基等。
在一个实施方式中，作为“核酸合成的羟基的保护基”，例如可以列举脂肪族酰基、芳香族酰基、被1～3个芳基取代的甲基、“被在芳基环上取代有低级烷基、低级烷氧基、卤原子、氰基的1～3个芳基取代的甲基”和甲硅烷基。或者，在一个实施方式中，作为“核酸合成的羟基的保护基”，例如可以列举乙酰基、苯甲酰基、苄基、对甲氧基苯甲酰基、二甲氧基三苯甲基、单甲氧基三苯甲基或叔丁基二苯基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷(TBDMS)基、[(三异丙基甲硅烷基)氧]甲(TOM)基、[(2－硝基苄基)氧]甲(NBOM)基、双(乙酰氧基乙氧基)甲基醚(ACE)基、四氢－4－甲氧基－2H－吡喃－2－基(Mthp)、1－(2－氰基乙氧基)乙(CEE)基、2－氰基乙氧基甲(CEM)基、叔丁基二硫代甲(DTM)基、2－(4－甲苯磺酰基)乙氧基甲(TEM)基和4－(N－二氯乙酰基－N－甲氨基)苄氧基甲(4－MABOM)基。
在一个实施方式中，作为“由核酸合成的保护基保护的羟基”的保护基，例如可以列举脂肪族酰基、芳香族酰基、“被1～3个芳基取代的甲基”、“被卤原子、低级烷氧基或硝基取代的芳基”、低级烷基和低级烯基。或者，在一个实施方式中，作为“由核酸合成的保护基保护的羟基”的保护基，例如可以列举苯甲酰基、苄基、2－氯苯基、4－氯苯基和2－丙烯基。
在一个实施方式中，作为“核酸合成的氨基的保护基”，例如可以列举酰基、优选苯甲酰基。
在一个实施方式中，作为“由核酸合成的保护基保护的磷酸基”的“保护基”，优选可以列举低级烷基、被氰基取代的低级烷基、芳烷基、“在芳基环取代有硝基或卤原子的芳烷基”和“被低级烷基、卤原子或硝基取代的芳基”。或者，在一个实施方式中，作为“由核酸合成的保护基保护的磷酸基”的“保护基”，例如可以列举2－氰乙基、2,2,2－三氯乙基、苄基、2－氯苯基和4－氯苯基。
在一个实施方式中，作为“由核酸合成的保护基保护的巯基”的“保护基”，例如可以列举脂肪族酰基和芳香族酰基，优选苯甲酰基。
在本说明书中，－P(R4a)R5a[式中，R4a和R5a分别独立地表示羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、氨基、碳原子数1～6的烷氧基、碳原子数1～6的烷硫基、碳原子数1～6的氰基烷氧基或具有碳原子数1～6的烷基的二烷基氨基]所示的基团中，R4a为OR4c且R5a为NR5c的基团称为“亚磷酰胺基(phosphoramiditegroup)”(其中，R4c例如为碳原子数1～6的氰基烷氧基，并且R5c例如为碳原子数1～6的烷基)。作为亚磷酰胺基，优选列举式－P(OC2H4CN)(N(iPr)2)所示的基团或式－P(OCH3)(N(iPr)2)所示的基团。其中，iPr表示异丙基。
在本说明书中，术语“核苷”和“核苷类似物”是指嘌呤或嘧啶碱基与糖结合而成的“核苷”中非天然型的物质、以及利用嘌呤和嘧啶以外的芳香族杂环和芳香族烃环代替嘌呤或嘧啶碱基与糖结合而成的物质。
在本说明书中，术语“人工寡核苷酸”和“寡核苷酸类似物”是指例如2～50个相同或不同的“核苷”或“核苷类似物”通过磷酸二酯键结合而成的“寡核苷酸”的非天然型衍生物。作为那样的类似物，优选列举糖部分被修饰的糖衍生物；磷酸二酯部分被硫酯化的硫酯衍生物；末端的磷酸部分被酯化的酯体；嘌呤碱基上的氨基被酰胺化的酰胺体。
在本说明书中，术语“其盐”是指本发明的式(I)或式(II)所示的化合物的盐。作为这样的盐，例如可以列举钠盐、钾盐、锂盐这样的碱金属盐，钙盐、镁盐这样的碱土金属盐，铝盐、铁盐、锌盐、铜盐、镍盐、钴盐等金属盐；铵盐这样的无机盐、叔辛基胺盐、二苄基胺盐、吗啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、N－甲基葡糖胺盐、胍盐、二乙胺盐、三乙胺盐、二环己胺盐、N,N'－二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、N－苄基－苯乙胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐、三(羟甲基)氨基甲烷盐这样的有机盐等胺盐；氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐这样的氢卤酸盐，硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐等无机酸盐；甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐这样的低级烷磺酸盐，苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐这样的芳基磺酸盐，乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐、马来酸盐等有机酸盐；和甘氨酸盐、赖氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐这样的氨基酸盐。
在本说明书中，作为术语“其药理学上可接受的盐”，是指含有至少1个本发明的式(II)所示的核苷结构的寡核苷酸类似物的盐。作为这样的盐，例如可以列举钠盐、钾盐、锂盐这样的碱金属盐，钙盐、镁盐这样的碱土金属盐，铝盐、铁盐、锌盐、铜盐、镍盐、钴盐等金属盐；铵盐这样的无机盐、叔辛基胺盐、二苄基胺盐、吗啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、N－甲基葡糖胺盐、胍盐、二乙胺盐、三乙胺盐、二环己胺盐、N,N'－二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、N－苄基－苯乙胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐、三(羟甲基)氨基甲烷盐这样的有机盐等胺盐；氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐这样的氢卤酸盐，硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐等无机酸盐；甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐这样的低级烷磺酸盐，苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐这样的芳基磺酸盐，乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐、马来酸盐等有机酸盐；和甘氨酸盐、赖氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐这样的氨基酸盐。
下面对本发明进行详细说明。
(桥连型核苷)
本发明的桥连型核苷为以下式(I)。
(式中，
Base表示可以具有1个以上选自α组中的任意取代基的嘌呤－9－基或2－氧代－1,2－二氢嘧啶－1－基，其中，该α组包括羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、碳原子数1～6的直链烷基、碳原子数1～6的直链烷氧基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、碳原子数1～6的直链烷硫基、氨基、碳原子数1～6的直链烷基氨基、由核酸合成的保护基保护的氨基和卤原子，
R2和R3分别独立地表示氢原子、核酸合成的羟基的保护基、可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基、可以形成支链或环的碳原子数2～7的烯基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3～10的芳基、具有可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3～12的芳基部分的芳烷基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基的酰基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基的甲硅烷基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基的磷酸基、由核酸合成的保护基保护的磷酸基、－P(R4a)R5a[式中，R4a和R5a分别独立地表示羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、氨基、碳原子数1～6的烷氧基、碳原子数1～6的烷硫基、碳原子数1～6的氰基烷氧基或具有碳原子数1～6的烷基的二烷基氨基]，
X1为可以被碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b[其中，R4b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]或－OR5b[其中，R5b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]取代的碳原子数2～8的亚烷基；或者X1为可以被碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b[其中，R4b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]或－OR5b[其中，R5b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]取代的碳原子数2～8的亚烯基；
并且，X2为氧原子、硫原子、－NH－、－N(CH3)－或亚甲基。)
在上述式(I)中，“Base”例如是嘌呤碱基(即嘌呤－9－基)或嘧啶碱基(即2－氧代－1,2－二氢嘧啶－1－基)。这些碱基可以具有1个以上选自α组中的任意取代基，该α组包括羟基、碳原子数1～6的直链烷基、碳原子数1～6的直链烷氧基、巯基、碳原子数1～6的直链烷硫基、氨基、碳原子数1～6的直链烷基氨基和卤原子。
作为以上“Base”的具体例，可以列举腺嘌呤基、鸟嘌呤基、胞嘧啶基、尿嘧啶基和胸腺嘧啶基、以及6－氨基嘌呤－9－基、2,6－二氨基嘌呤－9－基、2－氨基－6－氯嘌呤－9－基、2－氨基－6－氟嘌呤－9－基、2－氨基－6－溴嘌呤－9－基、2－氨基－6－羟基嘌呤－9－基、6－氨基－2－甲氧基嘌呤－9－基、6－氨基－2－氯嘌呤－9－基、6－氨基－2－氟嘌呤－9－基、2,6－二甲氧基嘌呤－9－基、2,6－二氯嘌呤－9－基、6－巯基嘌呤－9－基、2－氧代－4－氨基－1,2－二氢嘧啶－1－基、4－氨基－2－氧代－5－氟－1,2－二氢嘧啶－1－基、4－氨基－2－氧代－5－氯－1,2－二氢嘧啶－1－基、2－氧代－4－甲氧基－1,2－二氢嘧啶－1－基、2－氧代－4－巯基－1,2－二氢嘧啶－1－基、2－氧代－4－羟基－1,2－二氢嘧啶－1－基、2－氧代－4－羟基－5－甲基－1,2－二氢嘧啶－1－基和4－氨基－5－甲基－2－氧代－1,2－二氢嘧啶－1－基。
或者，从向核酸药物导入的观点考虑，“Base”优选分别由以下的结构式所示的基团以及2－氧代－4－羟基－5－甲基－1,2－二氢嘧啶－1－基、2－氧代－4－氨基－1,2－二氢嘧啶－1－基、6－氨基嘌呤－9－基、2－氨基－6－羟基嘌呤－9－基、4－氨基－5－甲基－2－氧代－1,2－二氢嘧啶－1－基和2－氧代－4－羟基－1,2－二氢嘧啶－1－基。另外，“Base”在合成寡核苷酸时优选构成以上基团的羟基和氨基被保护基保护。
这里，在一个实施方式中，作为式(I)所示的化合物的一例，可以列举以下式(I－1)～(I－6)所示的化合物。
(式中，
Base、R2、R3和X2与上述式(I)中的定义相同，并且R6、R7、R8、R9、R10和R11分别独立地为氢原子、碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b[其中，R4b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]或－OR5b[其中，R5b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]。)这里，例如上述式(I－1)和(I－4)中的R6和R7同时为氢原子。或者，例如上述式(I－2)和(I－5)中的R6、R7、R8和R9均为氢原子。或者，例如上述式(I－3)和(I－6)中的R6、R7、R8、R9、R10和R11均为氢原子。
或者，在一个实施方式中，作为式(I)所示的化合物的其它例，可以列举以下式(I')所示的化合物。
(式中，Base、R2、R3和X1与上述式(I)中的定义相同。)
或者，在一个实施方式中，作为式(I)所示的化合物的另一例，可以列举以下式(I－1)和(I－4)所示的化合物。
(式中，Base、R2、R3和X2的与上述式(I)中的定义相同，并且，R6和R7分别独立地为氢原子、碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b[其中，R4b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]或－OR5b[其中，R5b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基])。这里，例如上述式(I－1)和(I－4)中的R6和R7同时为氢原子。
或者，在一个实施方式中，作为式(I)所示的化合物的又一例，可以列举以下式(I'－1)和(I'－4)所示的化合物。
(式中，Base、R2和R3与上述式(I)中的定义相同，并且，R6和R7分别独立地为氢原子、碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b[其中，R4b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]或－OR5b[其中，R5b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]。)这里，例如上述式(I'－1)和(I'－4)中的R6和R7同时为氢原子。
在本发明的桥连型核苷中，如上所述在式(I)的6'位导入了环状的取代基。通过具有这样的结构，本发明的核苷在该6'位不具有异构体的结构，在其合成时无需进行异构体的分离。并且，本发明的桥连型核苷通过式(I)的6'位导入的环状的取代基，能够提升后述寡核苷酸的核酸酶耐性。另外，这样的取代基所具有的环的变形直接地影响糖部的构象。因此，本发明的桥连型核苷与使用该核苷酸得到的寡核苷酸相比，与ssRNA的结合亲和性也进一步提升。
(寡核苷酸)
在本发明中，能够使用这样的式(I)的桥连型核苷，例如以该领域中公知的amidite法、或者如M.Kuwahara等人的Nucleic Acids Res.，2008年，36卷，13号，4257-4265页的记载的那样经由三磷酸化容易地制造寡核苷酸。
本发明的寡核苷酸或其药理学上可接受的盐(以下有时将它们统称为“本发明的寡核苷酸”)包含至少1个以下式(II)所示的核苷结构。
(式中，
Base表示可以具有1个以上选自α组中的任意取代基的嘌呤－9－基或2－氧代－1,2－二氢嘧啶－1－基，其中，该α组包括羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、碳原子数1～6的直链烷基、碳原子数1～6的直链烷氧基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、碳原子数1～6的直链烷硫基、氨基、碳原子数1～6的直链烷基氨基、由核酸合成的保护基保护的氨基和卤原子，
X1为可以被碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b[其中，R4b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]或－OR5b[其中，R5b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]取代的碳原子数2～8的亚烷基；或者可以被碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b[其中，R4b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]或－OR5b[其中，R5b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]取代的碳原子数2～8的亚烯基；
并且，X2为氧原子、硫原子、－NH－、－N(CH3)－或亚甲基。)
在一个实施方式中，作为本发明的寡核苷酸所包含的式(II)的核苷结构的一例，可以列举以下式(II－1)～(II－6)所示的结构。
(式中，
Base和X2与上述式(II)中的定义相同，并且，R6、R7、R8、R9、R10和R11分别独立地为氢原子、碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b[其中，R4b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]或－OR5b[其中，R5b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]。)这里，例如上述式(II－1)和(II－4)中的R6和R7同时为氢原子。或者，例如上述式(II－2)和(II－5)中的R6、R7、R8和R9均为氢原子。或者，例如上述式(II－3)和(II－6)中的R6、R7、R8、R9、R10和R11均为氢原子。
或者，在一个实施方式中，作为本发明的寡核苷酸所包含的式(II)的核苷结构的另一例，可以列举以下式(II')所示的结构。
(式中，Base和X1与上述式(II)中定义的基团相同。)
或者，在一个实施方式中，作为本发明的寡核苷酸所包含的式(II)的核苷结构的又一例，可以列举以下式(II－1)和(II－4)所示的结构。
(式中，
Base和X2与上述式(II)中定义的基团相同，并且，R6和R7分别独立地为氢原子、碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b[其中，R4b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]或－OR5b[其中，R5b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]。)这里，例如上述式(II－1)和(II－4)中的R6和R7同时为氢原子。
或者，在一个实施方式中，作为本发明的寡核苷酸所包含的式(II)的核苷结构的又一例，可以列举以下式(II'－1)和(II'－4)所示的结构。
(式中，
Base与上述式(II)中定义的基团相同，并且，R6和R7分别独立地为氢原子、碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b[其中，R4b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]或－OR5b[其中，R5b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基]。)这里，例如上述式(II'－1)和(II'－4)中的R6和R7同时为氢原子。
本发明的寡核苷酸在任意的位置具有至少1个以上核苷结构。其位置和数量没有特别限定，可以根据目的适当设计。
包含这样的核苷结构的寡核苷酸(反义分子)与使用现有的2',4'－BNA/LNA的情况相比，核酸酶耐性飞跃性地提高。还具有能够与公知的2',4'－BNA/LNA相匹敌的ssRNA结合亲和性。
根据这些内容，使用本发明的桥连型核苷合成的本发明的寡核苷酸可以期待作为以抗肿瘤剂、抗病毒剂为代表的阻碍特定基因的机能而治疗疾病的医药品(反义分子)的有用性。
特别是在反义法中，对于互补正义链RNA的结合亲和性和对生物体内DNA分解酶的耐性这两者是必须的。一般而言，已知核酸在单链状态下，糖部分的结构不断地在近似于DNA双链的形态、和近似于DNA－RNA双链或近似于RNA双链的形态之间存在“摇摆”。通过该“摇摆”预先与双链形成时的配齿固定化，能够提升对目标ssRNA的结合亲和性。另外，虽然核酸分解酶切断寡核酸的磷酸二酯部分，但通过糖部等导入大体积的取代基，能够通过立体位阻抑制寡核酸的分解。
本发明的桥连型核苷如上所述在6'位具有大体积的环状的取代基。因此，使用其所得到的寡核苷酸能够提升对以上ssRNA的结合亲和性，并且具有优异的酶耐受性。
本发明的寡核苷酸例如能够配合赋形剂、粘合剂、防腐剂、抗氧化剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂等在医药制剂技术领域中通常使用的辅助剂，制成非口服制剂或脂质体制剂。另外，例如能够配合在该技术领域通常使用的医药用载体，配制液剂、霜剂、软膏剂等局部用的制剂。
实施例
以下，利用实施例对本发明进行更加具体的说明，但本发明并不限定于这些实施例。
(实施例1：桥连型核苷的合成(1))
各工序的试剂和条件：(i)DMP，CH2Cl2，0℃至室温，1小时，94％；(ii)H2O2水溶液，NaH2PO4水溶液，NaClO2水溶液，MeCN，0℃至室温，2小时，定量；(iii)MeI，NaHCO3，DMF，室温，22小时，98％；(iv)烯丙基溴化镁，CeCl3，THF，室温，14小时，89％；(v)格拉布二代催化剂，CH2Cl2，回流下，4小时，90％；(vi)TBSOTf，2,6-二甲基吡啶，CH2Cl2，室温，20小时，94％；(vii)TFA，AcO2，AcOH，室温，2小时，86％；(viii)胸腺嘧啶，TMSOTf，BSA，MeCN，回流下，3小时，89％；(ix)K2CO3，MeOH，室温，5小时，97％；(x)MsCl，吡啶，室温，5小时，定量；(xi)TBAF，THF，室温，30小时；(xii)K2CO3，DMF，90℃，20小时(在2工序中为83％)；(xiii)H2，Pd(OH)2/C，AcOEt，室温，0.5小时，80％；(xiv)DMTrCl，吡啶，室温，8小时，定量；(xv)2-氰乙基-N,N-二异丙基磷酰氯，DIPEA，CH2Cl2，室温，8小时，58％。
(1－1)化合物5的合成
在氩气氛下，向按照Yamaguchi,T.等人在Chem.Commun.,2015年,51号,9737-9740页中记载的方法由化合物1经过i)～iii)这三个工序制得的化合物4(3.69g，8.61mmol)和无水氯化铈(III)(7.99g，32.4mmol)的无水四氢呋喃(60mL)中，在室温下加入烯丙基溴化镁(33mL，33.0mmol)，搅拌14小时。在反应结束后，加入氯化铵水溶液，将有机层浓缩。接着，利用硅藻土过滤，利用乙酸乙烯酯对滤液进行萃取。利用硅胶柱色谱(SiO2，己烷∶乙酸乙烯酯＝32∶1～6∶1)对所得到的残渣进行精制，得到作为无色透明的油状物质的化合物5(4.06g，98％)。
将所得到的化合物5的物性参数示于表1。
[表1]
(1－2)化合物6的合成
在氩气氛下，在室温下向以上所得到的化合物5(1.60g，3.54mmol)的无水二氯甲烷溶液(110mL)中加入格拉布二代催化剂(425mg，0.501mmol)，加热回流4小时。在反应结束后进行浓缩，利用硅胶柱色谱(SiO2，己烷∶乙酸乙烯酯＝32∶1～10∶1)对所得到的残渣进行精制，得到作为黄淡色的粘性油状物质的化合物6(1.35g，90％)。
将所得到的化合物6的物性参数示于表2。
[表2]
(1－3)化合物7的合成
在氩气氛下，以0℃向以上所得到的化合物6(1.21g，2.67mmol)的无水二氯甲烷溶液(31mL)中加入2,6－二甲基吡啶(2.20mL，19.0mmol)和叔丁基二甲基甲硅烷基三氟甲磺酸(3.00mL，13.1mmol)，在室温下搅拌20小时。反应结束后，加入饱和碳酸氢钠水溶液，利用乙酸乙烯酯对有机层进行萃取。利用水和饱和食盐水对有机层进行清洗后，再利用无水硫酸钠使其干燥，减压蒸馏除去溶剂。利用硅胶柱色谱(SiO2，己烷∶乙酸乙烯酯＝10∶0～9∶1)对所得到的残渣进行精制，得到作为无色透明的粘性油状物质的化合物7(1.43g，94％)。
将所得到的化合物7的物性参数示于表3。
[表3]
(1－4)化合物8的合成
在氩气氛下，以0℃向以上所得到的化合物7(911mg，1.61mmol)的醋酸溶液(1.85mL，32.3mmol)中加入醋酸酐(3.05mL，32.3mmol)和三氟乙酸(295μL，3.86mmol)，在室温下搅拌2小时。反应结束后，加入饱和碳酸氢钠水溶液，对乙酸乙烯酯对有机层进行萃取。利用水和饱和食盐水对有机层进行清洗后，再利用无水硫酸钠使其干燥，减压蒸馏除去溶剂。利用硅胶柱色谱(SiO2，己烷∶乙酸乙烯酯＝9∶1～4：1)对所得到的残渣进行精制，得到作为无色透明的粘性油状物质的化合物8(841mg，86％)。
将所得到的化合物8的物性参数示于表4。
[表4]
(1－5)化合物9的合成
在氩气氛下，向以上所得到的化合物8(389mg，0.637mmol)的无水乙腈溶液(5.6mL)中，在室温下依次加入胸腺嘧啶(242mg，1.91mmol)和N,O－双－三甲基乙酰胺(780μL，3.18mmol)，在室温下搅拌1小时。之后，在氩气氛下，以0℃加入三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸(175μl，0.969mmol)，加热回流5小时。反应结束后，加入饱和碳酸氢钠水溶液，利用乙酸乙烯酯对有机层进行萃取。利用水和饱和食盐水对有机层进行清洗后，再利用无水硫酸钠使其干燥，减压蒸馏除去溶剂。利用胶柱色谱(SiO2，己烷∶乙酸乙烯酯＝9∶1～4∶1)对所得到的残渣进行硅精制，得到作为白色固体的化合物9(385mg，89％)。
将所得到的化合物9的物性参数示于表5。
[表5]
(1－6)化合物10的合成
在氩气氛下，以0℃向以上所得到的化合物9(986mg，1.46mmol)的甲醇溶液(14.6mL)中加入碳酸钾(607mg，4.39mmol)，以室温搅拌5小时。反应结束后，加入饱和碳酸氢钠水溶液，再利用二乙醚对有机层进行萃取。利用水和饱和食盐水对有机层进行清洗后，再利用无水硫酸钠使其干燥，减压蒸馏除去溶剂。利用硅胶柱色谱(SiO2，己烷∶乙酸乙烯酯＝4∶1～1∶1)对所得到的残渣进行精制，得到作为白色固体的化合物10(895mg，97％)。
将所得到的化合物10的物性参数示于表6。
[表6]
(1－7)化合物11的合成
在氩气氛下，以0℃向以上所得到的化合物10(895mg，1.41mmol)的脱水吡啶溶液(14.5mL)中加入甲磺酰氯(170μL，2.19mmol)，以室温搅拌4小时。反应结束后，加入水，利用乙酸乙烯酯对有机层进行萃取。利用水和饱和食盐水对有机层进行清洗后，再利用无水硫酸钠使其干燥，减压蒸馏除去溶剂。利用胶柱色谱(SiO2，己烷∶乙酸乙烯酯＝9∶1～4∶1)对所得到的残渣进行精制，得到作为白色固体的化合物11(992mg，定量)。
将所得到的化合物11的物性参数示于表7。
[表7]
(1－8)化合物12的合成
在氩气氛下，以0℃向以上所得到的化合物11(992mg，1.39mmol)的脱水四氢呋喃溶液(13.9mL)中加入四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(4.18mL，4.18mmol)，以室温搅拌30小时。反应结束后，加入水，利用乙酸乙烯酯对有机层进行萃取。利用水和饱和食盐水对有机层进行清洗后，再利用无水硫酸钠使其干燥，减压蒸馏除去溶剂。不对所得到的残渣进行精制，以0℃向该残渣的N,N－二甲基甲酰胺溶液(13.9mL)中加入碳酸钾(577mg，4.17mmol)，以90℃搅拌20小时。反应结束后，加入水，再利用二乙醚对有机层进行萃取。利用水和饱和食盐水对有机层进行清洗后，再利用无水硫酸钠使其干燥，减压蒸馏除去溶剂。利用硅胶柱色谱(SiO2，己烷∶乙酸乙烯酯＝4∶1～1∶2)对所得到的残渣进行精制，得到作为白色固体的化合物12(583mg，83％(2工序))。
将所得到的化合物12的物性参数示于表8。
[表8]
(1－9)化合物13的合成
在氢气气氛下，在室温下向以上所得到的化合物12(110mg，0.219mmol)的乙酸乙烯酯溶液(2.15mL)中加入20％氢氧化钯/炭(44mg，40重量份(相对于化合物12(100重量份)))，一边利用氢气对烧瓶内进行数次置换，一边以室温搅拌0.5小时。反应结束后进行过滤，利用乙酸乙烯酯进行清洗。接着，减压蒸馏除去溶剂，利用PLC板(SiO2，氯仿∶甲醇＝7∶1)对所得到的残渣进行精制，得到作为白色固体的化合物13(57mg，80％)。
将所得到的化合物13的物性参数示于表9。
[表9]
(1－10)化合物14的合成
在氩气氛下，以0℃向以上所得到的化合物13(170mg，0.524mmol)的无水吡啶溶液(5.3mL)中加入4，4'－二甲氧基三苯甲基氯(320mg，0.944mmol)，以室温搅拌8小时。反应结束后，加入饱和碳酸氢钠水溶液，利用乙酸乙烯酯对有机层进行萃取。利用水和饱和食盐水对有机层进行清洗后，再利用无水硫酸钠使其干燥，在减压下蒸馏除去溶剂。利用硅胶柱色谱(SiO2，含1％三乙胺，己烷∶乙酸乙烯酯＝4∶1～1∶4)对所得到的残渣进行精制，得到作为白色固体的化合物14(329mg，定量)。
将所得到的化合物14的物性参数示于表10。
[表10]
(1－11)化合物15的合成
在氩气氛下，以0℃向以上所得到的化合物14(329mg，0.525mmol)的无水二氯甲烷溶液(5.3mL)中依次加入N,N－二异丙基乙胺(275μL，1.61mmol)和2－氰乙基－N,N－二异丙基磷酰氯(175μL，0.784mmol)，以室温搅拌8小时。反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，利用硅胶柱色谱(SiO2，含1％三乙胺，己烷∶乙酸乙烯酯＝4∶1～2∶1)和再沉淀(甲苯/己烷)对所得到的残渣进行精制，得到作为白色固体的化合物15(252mg，58％)。
将所得到的化合物15的物性参数示于表11。
[表11]
通过以上的得到化合物1至化合物15的一系列的合成路线，最终得到的化合物15的总收率为22％。该值比通过例如专利文献1和非专利文献5中记载的桥连型核苷(scpBNA)的合成路线得到的最终生成物的总收率(18％)高，可知本实施例的桥连型核苷能够高效地合成。(实施例2：桥连型核苷的合成(2))
工序的试剂和条件：(XVI)TESCl，吡啶，0℃至室温，4小时，72％；(XVII)1,2,4-三唑，POCl3，MeCN，0℃至室温，50分钟；NH3水溶液，1,4-二噁烷，室温，1.5小时，98％(2工序)；(XVIII)BzCl，吡啶，0℃至室温，2.5小时，62％；(XIX)TBAF，THF，0℃至室温，20分钟，定量；(XX)(iPr2N)2POC2H4CN，DCI，CH2Cl2，室温，2小时，81％。
(2－1)化合物16的合成
在氮气流下，以0℃向以上实施例1(1－10)中所得到的化合物14(626mg，999μmol)的无水吡啶溶液(10mL)中氯三乙基硅烷(0.45mL，3.0mmol)，以室温搅拌4小时。反应结束后，以0℃加入饱和碳酸氢钠水溶液，利用乙酸乙烯酯萃取，再利用水和饱和食盐水清洗。利用无水硫酸钠使其干燥后，减压蒸馏除去溶剂。利用硅胶柱色谱(Si2，正己烷∶乙酸乙烯酯＝1∶1)对所得到粗产物进行精制，得到作为白色泡状固体的化合物16(531mg，72％)。
将所得到的化合物16的物性参数示于表12。
[表12]
(2－2)化合物17的合成
在氮气流下，以0℃向以上所得到的化合物16(329mg，444μmol)和三乙胺(1.1mL，8mmol)、1,2,4－三唑(537mg，7.8mmol)的无水乙腈溶液(4.8mL)中滴加磷酰氯(136μL，1.5mmol)。在室温下搅拌1小时后，向反应溶液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，利用乙酸乙烯酯萃取，再利用水和饱和食盐水清洗。利用无水硫酸钠使其干燥后，减压蒸馏除去溶剂。以0℃向所得到的残渣的1,4－二噁烷溶液(2.0mL)中加入28重量％氨水溶液(500μL，7.3mmol)，在室温下搅拌1.5小时。反应结束后，减压蒸馏除去溶剂。利用硅胶柱色谱(SiO2，氯仿∶甲醇＝20∶1)对所得到的粗产物进行精制，得到作为白色泡状固体的化合物17(322mg，98％，2工序)。
将所得到的化合物17的物性参数示于表13。
[表13]
(2－3)化合物18的合成
在氮气流下，以0℃向以上所得到的化合物17(322mg，0.435mmol)的无水吡啶溶液(4.5mL)中加入苯甲酰氯(100μL，0.86mmol)，在室温下搅拌2.5小时。反应结束后加入饱和碳酸氢钠水溶液，利用乙酸乙烯酯萃取，再利用水和饱和食盐水清洗。利用无水硫酸钠使其干燥后，减压蒸馏除去溶剂。利用硅胶柱色谱(SiO2，正己烷∶乙酸乙烯酯＝5∶1)对所得到的粗产物进行精制，得到作为白色泡状固体的化合物18(229mg，62％)。
将所得到的化合物18的物性参数示于表14。
[表14]
(2－4)化合物19的合成
以0℃向以上所得到的化合物18(108mg，121μmol)的四氢呋喃溶液(1.2mL)中加入1M的四丁基氟化铵/四氢呋喃溶液(120μL，120μmol)，在室温下搅拌20分钟。反应结束后减压蒸馏除去溶剂。利用硅胶柱色谱(SiO2，氯仿∶甲醇＝20∶1)对所得到的粗产物进行精制，得到作为白色泡状固体的化合物19(101mg，定量)。
将所得到的化合物19的物性参数示于表15。
[表15]
(2－5)化合物20的合成
在氮气流下，以0℃向以上所得到的化合物19(71mg，97.3μmol)的无水乙腈溶液(980μL)中加入2－氰乙基－N,N,N',N'－四异丙基亚磷酰二胺(95μL，295μmol)、4,5－二氰基咪唑(35mg，290μmol)，在室温下搅拌2小时。反应结束后减压蒸馏除去溶剂。利用硅胶柱色谱(SiO2，含1％三乙胺，正己烷∶乙酸乙烯酯＝3∶1)对所得到的粗产物进行精制，得到作为白色泡状固体的化合物20(73mg，81％)。
将所得到的化合物20的物性参数示于表16。
[表16]
(实施例3)寡核苷酸的合成和精制(1)
将实施例1中制得的化合物15(scpBNA2nd－T)用作酰胺链段，如下所述操作合成寡核苷酸。关于构成寡核苷酸的化合物15以外的化合物，只要没有特别说明，由Proligo公司购入。合成以下的寡核苷酸。
ON1：5'－d(GCGTTYTTTGCT)－3'(序列编号1)
ON2：5'－d(GCGYTYTYTGCT)－3'(序列编号2)
ON3：5'－d(GCGTYYYYTGCT)－3'(序列编号3)
ON4：5'－d(GCGYYYYYYGCT)－3'(序列编号4)
ON5：5'－d(TTTTTTTTTY)－3'
ON6：5'－d(TTTTTTTTYT)－3'
Y＝化合物15(scpBNA2nd－T)
由实施例1中制得的化合物15分别制备0.1M的无水乙腈或无水二氯甲烷溶液，加入到GeneDesign公司制nS－8Oligonucleotides Synthesizer中。各合成在Trityl-on条件下进行。活化剂使用Activator－42(注册商标)(Proligo公司制)(0.25M乙腈溶液)，关于缩合时间，将化合物15延长至150秒×5。其它的操作按照通常的亚磷酰胺法进行合成。
合成结束后，使用28％氨水溶液在室温下对生成物进行1.5小时处理，进行从柱载体的洗脱，接着以55℃静置10小时，从而进行碱基部的脱保护。之后，利用简易反相柱(Waters公司制Sep－Pak(注册商标)Plus C18 Cartridges)进行精制，在利用反相HPLC进行精制。
通过MALDI－TOF MS确定经精制后的寡核苷酸的组成。在该测定时，首先，使3－羟基吡啶甲酸水溶液(10mg/mL)和柠檬酸二铵水溶液(1mg/mL)以1∶1的容量比混合而成的基质(1μL)在测定板上干燥，将寡核苷酸水溶液(50μM，1μL)放在干燥后的测定板上，再次干燥，之后进行MALDI－TOF MS测定。分子量的测定以阴离子模式进行，使用寡聚胸苷酸(7mer、9mer、11mer和13mer)作为外部标准。例如，使用吸光度测定装置(株式会社岛津制作所制SHIMADZU UV－1800)测定260nm时的紫外部吸收，由此进行所合成的寡核苷酸的定量。
将其结果示于以下的表17。
[表17]
(实施例4)双链形成能力的评价
对ON1～ON4研究双链形成能力。作为参照，还使用利用了天然DNA的5'－d(GCGTTTTTTGCT)－3'(“ON9”：序列编号5)。作为目标链，使用单链寡RNA5'－r(AGCAAAAAACGC)－3'(序列编号6)和单链寡DNA5'－d(AGCAAAAAACGC)－3'(序列编号7)。
通过对各种寡核苷酸和目标链进行退火处理形成双链后，测定Tm值来研究寡核苷酸的双链形成能力。进一步详细而言，将各寡核苷酸(最终浓度4μM)和氯化钠(最终浓度100mM)的磷酸缓冲液(10mM，pH7.2，130μL)的混合液浸入沸水中，再缓慢冷却至室温。之后，在氮气流下冷却至5℃，开始测定。以0.5℃/分钟升温至90℃或110℃，以0.5℃间隔标出260nm时的吸光度。利用中线法算出Tm值，取独立的3次测定的平均值。
将结果示于表18。表18中，将对于单链寡RNA的结果示于“ssRNA”，将对于单链寡DNA的结果示于“ssDNA”，并且表示各寡核苷酸的人工修饰核酸每1个碱基的Tm变动温度(“ΔTm/mod.”)和RNA选择性(对RNA的熔融温度与对DNA的熔融温度之差)。
[表18]
在使用化合物15的情况下，表明单链寡DNA和单链寡RNA双方的熔融温度都比天然的寡核苷酸(ON9)高。并且，在使用化合物15的情况下，特别是对于单链寡RNA，Tm值比天然的寡核苷酸(ON9)升高，由此表明对单链寡RNA具有高的结合亲和性。并且，在使用化合物15的情况下，可以看出RNA选择性。
(实施例5)核酸酶耐性的评价
合成并精制ON5和以下的10mer的序列的寡核苷酸，作为被检验寡核苷酸使用。
5'－d(TTTTTTTTTX)－3'
(1)X＝化合物15(ON5：“scpBNA2nd－T”)
(2)X＝硫代磷酸酯胸苷(“PS－T”：关于硫代磷酸酯化，使用0.05M的((二甲氨基－亚甲基)氨基)－3H－1,2,4－二噻唑－3－硫酮(DDTT)(吡啶/乙腈(3∶2)溶液、GLENRESEARCH公司)。)
(3)X＝螺环丙烷BNA(专利文献1和非专利文献5：“scpBNA－T”)
在含有7.5μM被检验寡核苷酸和10mM氯化镁的50mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)中加入1.5μg/mL的3'－核酸外切酶(Crotalus adamanteus venom phosphodiesterase，CAVP)，以37℃进行孵育。在孵育开始时(0分钟)、2.5分钟后、5分钟后、10分钟后、20分钟后、40分钟后分别各取出20μL试样，通过反相HPLC进行解析，算出未切断的寡核苷酸的比例。另外，评价通过独立的3次测定得出。
将结果示于图1。图1中，实心菱形表示以上(1)的结果，实心圆圈表示以上(2)的结果，另外黑色三角表示以上(3)的结果。根据图1可知，具有化合物15的寡核苷酸(以上(1))即使在核酸酶处理40分钟后仍有约70％未切断而残留，可以难以分解。可见在具有化合物15的寡核苷酸(以上(1))中，与硫代磷酸酯化(PS)寡核苷酸(以上(2))和具有螺环丙烯BNA的寡核苷酸(以上(3))相比，核酸酶耐性非常高。
(实施例6)寡核苷酸的合成和精制(2)
将实施例1中制得的化合物15(scpBNA2nd－T)和实施例2中制得的化合物20(scpBNA2nd－MeC)用作酰胺链段，与实施例3同样操作合成表19所示的寡核苷酸。其中，关于硫代磷酸酯化，使用0.05M的((二甲氨基－亚甲基)氨基)－3H－1,2,4－二噻唑－3－硫酮(DDTT)(吡啶/乙腈(3∶2)溶液、GLEN RESEARCH公司)。将所得到的寡核苷酸ONs21、ONs22、ONs23和ONd1的序列分别也示于序列编号8～11。
[表19]
大写字母＝2′,4′-BNA/LNA，带下划线的大写字母＝scpBNA-2nd，
小写字母＝DNA，^＝硫代磷酸酯化(PS)
(实施例7)毒性降低效果的评价
向6周龄的小鼠(C57BL/6J、雄性)的腹腔内投予表20所示的被检验寡核苷酸(20mg/kg)(5只/组)。96小时后，在吸入麻醉下(异氟烷)下采血，放血并实施安乐死。之后，利用自动分析装置(FUJIFILM制的富士DRI-CHEM 4000V)测定血清中的天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)的活性。
并且，关于表20所示的被检验寡核苷酸，ONd1(序列编号11)通过使用实施例1中制得的化合物15(scpBNA2nd－T)作为酰胺链段与实施例6同样操作来制作。ONd0(序列编号12)除了酰胺链段不含化合物15(scpBNA2nd－T)以外与ONd1同样操作来制作。
[表20]
被检验寡核苷酸：
大写字母＝2′,4′-BNA/LNA，带下划线的大写字母＝scpBNA-2nd，
小写字母＝DNA，^＝硫代磷酸酯化(PS)
表21表示投予了被检验寡核苷酸的情况以及投予了生理盐水的情况的血液中的天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)的活性。在投予了已知显示肝毒性的ONd0的组中，5只小鼠全部死亡。另一方面，本发明中的将ONd0的序列的一部分取代了的ONd1几乎不显示ALT和AST的升高，确认了毒性的降低效果。
[表21]
ALT/AST值：平均±SD.
(实施例8)反义活性的评价
对于包含实施例1中制得的化合物15(scpBNA2nd－T)和实施例2中制得的化合物20(scpBNA2nd－MeC)的寡核苷酸(ONs21、ONs22、ONs23：实施例6中制作)、和代替化合物15和化合物20而包含LNA的寡核苷酸(ONs01)，研究各组织中的反义活性。
这4个寡核苷酸的碱基序列设计为对于MALAT1的反义核酸。ONs01通过使用LNA代替化合物15和化合物20作为酰胺链段，与实施例3同样操作来合成。ONs21、ONs22、ONs23和ONs01的序列示于以下表22。
[表22]
大写字母＝2′,4′-BNA/LNA，带下划线的大写字母＝scpBNA-2nd，
小写字母＝DNA，^＝硫代磷酸酯化(PS)
向6周龄的小鼠(BALB/cAnNCrlCrlj、雌性)的尾静脉投予被检验寡核苷酸(20nmol：100μM生理盐水溶液200μL)(5只/组)。72小时后，在吸入麻醉下(异氟烷)进行采血，放血并实施安乐死。之后，取各组织，进行RNA提取(使用试剂盒：RNeasy)。利用实时PCR(使用试剂盒：One Step TB Green(注册商标)PrimeScriptTM RT-PCRKit(Perfect RealTime)、Takara Bio Inc.制)测定各组织中的MALAT1的mRNA表达量。在实时PCR中，使用以下的引物。
MALAT1 forward：acattccttgaggtcggcaa(序列编号14)
MALAT1 reverse：cacccgcaaaggcctacata(序列编号15)
GAPDHforward：tcaccaccatggagaaggc(序列编号16)
GAPDHreverse：gctaagcagttggtggtgca(序列编号17)
将结果示于图2和图3。图2和图3表示投予各种寡核苷酸时小鼠的各种组织中的相对的MALAT1表达水平(图2：肝脏、心脏、肾脏、胰脏、骨骼肌、肺和胃，另外，图3：脾脏、皮肤、大肠、脑、乳腺、眼球和软骨)。“相对的MALAT1表达水平”表示将仅投予生理盐水(无寡核苷酸)时的表达水平作为1时的相对值。在图2和图3中，表示结果的棒的图示区分为对照(仅投予生理盐水)、包含LNA代替化合物15和化合物20的寡核苷酸(ONs01)、以及包含化合物15和化合物20的寡核苷酸(ONs21、ONs22、ONs23)。
在包含化合物15和化合物20的寡核苷酸(ONs21,ONs22,ONs23)的大多组织中，与包含LNA代替化合物15和化合物20的寡核苷酸(ONs01)相比，表现出同等或更高的靶基因抑制效果。
产业上的可利用性
根据本发明，提供能够代替硫代磷酸酯修饰核酸的新型的桥连型核苷以及使用了该桥连型核苷的核苷酸。使用本发明的桥连型核苷而得到的寡核苷酸例如能够有效地用作核酸医药中的原料。
序列表
<110> 国立大学法人大阪大学
国立医药品食品卫生研究所长
<120> 桥连型核苷和使用了该桥连型核苷的核苷酸
<130> P2-22O07023
<140> PCT/JP 2021/006222
<141> 2021-02-18
<150> JP 2020-26646
<151> 2020-02-19
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ON1
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (6)..(6)
<223> t = scpBNA2nd-t
<400> 1
gcgttttttg ct 12
<210> 2
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ON2
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (4)..(4)
<223> t = scpBNA2nd-t
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (6)..(6)
<223> t = scpBNA2nd-t
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (8)..(8)
<223> t = scpBNA2nd-t
<400> 2
gcgttttttg ct 12
<210> 3
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ON3
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (5)..(8)
<223> t = scpBNA2nd-t
<400> 3
gcgttttttg ct 12
<210> 4
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ON4
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (4)..(9)
<223> t = scpBNA2nd-t
<400> 4
gcgttttttg ct 12
<210> 5
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ON9
<400> 5
gcgttttttg ct 12
<210> 6
<211> 12
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss oligoRNA
<400> 6
agcaaaaaac gc 12
<210> 7
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ss oligoDNA
<400> 7
agcaaaaaac gc 12
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ONs21
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (1)..(1)
<223> m5c
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (1)..(2)
<223> c或t = scpBNA2nd
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (1)..(16)
<223> 硫代磷酸酯化
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (3)..(3)
<223> a = 2',4'-BNA/LNA
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (14)..(14)
<223> t = scpBNA2nd
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (15)..(15)
<223> g = 2',4'-BNA/LNA
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (16)..(16)
<223> m5c
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (16)..(16)
<223> c = scpBNA2nd
<400> 8
ctagttcact gaatgc 16
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ONs22
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (1)..(1)
<223> m5c
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (1)..(2)
<223> c或t = scpBNA2nd
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (3)..(3)
<223> a = 2',4'-BNA/LNA
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (4)..(13)
<223> 硫代磷酸酯化
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (14)..(14)
<223> t = scpBNA2nd
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (15)..(15)
<223> g = 2',4'-BNA/LNA
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (16)..(16)
<223> m5c
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (16)..(16)
<223> c = scpBNA2nd
<400> 9
ctagttcact gaatgc 16
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ONs23
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (1)..(1)
<223> m5c
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (1)..(2)
<223> c or t = scpBNA2nd
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (3)..(3)
<223> a = 2',4'-BNA/LNA
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (4)..(14)
<223> 硫代磷酸酯化
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (14)..(14)
<223> t = scpBNA2nd
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (15)..(15)
<223> g = 2',4'-BNA/LNA
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (16)..(16)
<223> m5c
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (16)..(16)
<223> c = scpBNA2nd
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (16)..(16)
<223> 硫代磷酸酯化
<400> 10
ctagttcact gaatgc 16
<210> 11
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ONd1
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (1)..(1)
<223> g = 2', 4'-BNA/LNA
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (2)..(14)
<223> 硫代磷酸酯化
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (2)..(3)
<223> t = scpBNA2nd
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (12)..(12)
<223> m5c
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (12)..(12)
<223> c = 2', 4'-BNA/LNA
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (13)..(13)
<223> t = scpBNA2nd
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (14)..(14)
<223> a = 2', 4'-BNA/LNA
<400> 11
gttatgccac ccta 14
<210> 12
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ONd0
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (1)..(3)
<223> g or t = 2', 4'-BNA/LNA
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (12)..(14)
<223> c, t or a = 2', 4'-BNA/LNA
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (12)..(12)
<223> m5c
<400> 12
gttatgccac ccta 14
<210> 13
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ONs01
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (1)..(1)
<223> m5c
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (1)..(3)
<223> c, t or a = 2',4'-BNA/LNA
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (14)..(16)
<223> t, g or c = 2',4'-BNA/LNA
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (16)..(16)
<223> m5c
<400> 13
ctagttcact gaatgc 16
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MALAT1正向
<400> 14
acattccttg aggtcggcaa 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MALAT1反向
<400> 15
cacccgcaaa ggcctacata 20
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH正向
<400> 16
tcaccaccat ggagaaggc 19
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH反向
<400> 17
gctaagcagt tggtggtgca 20
Claims (9)
1.以下式(I)所示的化合物或其盐：
式中，
Base表示可以具有1个以上选自α组中的任意取代基的嘌呤－9－基或2－氧代－1,2－二氢嘧啶－1－基，其中，该α组包括羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、碳原子数1～6的直链烷基、碳原子数1～6的直链烷氧基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、碳原子数1～6的直链烷硫基、氨基、碳原子数1～6的直链烷基氨基、由核酸合成的保护基保护的氨基和卤原子，
R2和R3分别独立地表示氢原子、核酸合成的羟基的保护基、可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基、可以形成支链或环的碳原子数2～7的烯基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3～10的芳基、具有可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3～12的芳基部分的芳烷基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基的酰基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基的甲硅烷基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基的磷酸基、由核酸合成的保护基保护的磷酸基、－P(R4a)R5a，式中，R4a和R5a分别独立地表示羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、氨基、碳原子数1～6的烷氧基、碳原子数1～6的烷硫基、碳原子数1～6的氰基烷氧基或具有碳原子数1～6的烷基的二烷基氨基，
X1为可以被碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b或－OR5b取代的碳原子数2～8的亚烷基，其中，R4b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基，R5b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基；或者X1为可以被碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b或－OR5b取代的碳原子数2～8的亚烯基，其中，R4b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基，R5b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基，
并且，X2为氧原子、硫原子、－NH－、－N(CH3)－或亚甲基。
2.如权利要求1所述的化合物或其盐，其特征在于：
所述式(I)由以下式表示，
式中，
Base表示可以具有1个以上选自α组中的任意取代基的嘌呤－9－基或2－氧代－1,2－二氢嘧啶－1－基，其中，该α组包括羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、碳原子数1～6的直链烷基、碳原子数1～6的直链烷氧基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、碳原子数1～6的直链烷硫基、氨基、碳原子数1～6的直链烷基氨基、由核酸合成的保护基保护的氨基和卤原子，
R2和R3分别独立地表示氢原子、核酸合成的羟基的保护基、可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基、可以形成支链或环的碳原子数2～7的烯基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3～10的芳基、具有可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3～12的芳基部分的芳烷基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基的酰基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基的甲硅烷基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基的磷酸基、由核酸合成的保护基保护的磷酸基、－P(R4a)R5a，式中，R4a和R5a分别独立地表示羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、氨基、碳原子数1～6的烷氧基、碳原子数1～6的烷硫基、碳原子数1～6的氰基烷氧基或具有碳原子数1～6的烷基的二烷基氨基，
X2为氧原子、硫原子、－NH－、－N(CH3)－或亚甲基，
并且，R6、R7、R8、R9、R10和R11分别独立地为氢原子、碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b或－OR5b，其中，R4b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基，R5b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基。
3.如权利要求1所述的化合物或其盐，其特征在于：
所述式(I)由以下式表示，
式中，
Base表示可以具有1个以上选自α组中的任意取代基的嘌呤－9－基或2－氧代－1,2－二氢嘧啶－1－基，其中，该α组包括羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、碳原子数1～6的直链烷基、碳原子数1～6的直链烷氧基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、碳原子数1～6的直链烷硫基、氨基、碳原子数1～6的直链烷基氨基、由核酸合成的保护基保护的氨基和卤原子，
R2和R3分别独立地表示氢原子、核酸合成的羟基的保护基、可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基、可以形成支链或环的碳原子数2～7的烯基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3～10的芳基、具有可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3～12的芳基部分的芳烷基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基的酰基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基的甲硅烷基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基的磷酸基、由核酸合成的保护基保护的磷酸基、－P(R4a)R5a，式中，R4a和R5a分别独立地表示羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、氨基、碳原子数1～6的烷氧基、碳原子数1～6的烷硫基、碳原子数1～6的氰基烷氧基或具有碳原子数1～6的烷基的二烷基氨基，
X2为氧原子、硫原子、－NH－、－N(CH3)－或亚甲基，
并且，R6和R7分别独立地为氢原子、碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b或－OR5b，其中，R4b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基，R5b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基。
4.如权利要求1～3中任一项所述的化合物或其盐，其特征在于：
在所述式(I)中，所述Base为6－氨基嘌呤－9－基、2,6－二氨基嘌呤－9－基、2－氨基－6－氯嘌呤－9－基、2－氨基－6－氟嘌呤－9－基、2－氨基－6－溴嘌呤－9－基、2－氨基－6－羟基嘌呤－9－基、6－氨基－2－甲氧基嘌呤－9－基、6－氨基－2－氯嘌呤－9－基、6－氨基－2－氟嘌呤－9－基、2,6－二甲氧基嘌呤－9－基、2,6－二氯嘌呤－9－基、6－巯基嘌呤－9－基、2－氧代－4－氨基－1,2－二氢嘧啶－1－基、4－氨基－2－氧代－5－氟－1,2－二氢嘧啶－1－基、4－氨基－2－氧代－5－氯－1,2－二氢嘧啶－1－基、2－氧代－4－甲氧基－1,2－二氢嘧啶－1－基、2－氧代－4－巯基－1,2－二氢嘧啶－1－基、2－氧代－4－羟基－1,2－二氢嘧啶－1－基、2－氧代－4－羟基－5－甲基－1,2－二氢嘧啶－1－基或4－氨基－5－甲基－2－氧代－1,2－二氢嘧啶－1－基。
5.权利要求1～4中任一项所述的化合物或其盐，其特征在于：
在所述式(I)中，所述Base是以下式所示的基团，
6.一种寡核苷酸或其药理学上可接受的盐，其包含至少1个以下式(II)所示的核苷结构，
式中，
Base表示可以具有1个以上选自α组中的任意取代基的嘌呤－9－基或2－氧代－1,2－二氢嘧啶－1－基，其中，该α组包括羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、碳原子数1～6的直链烷基、碳原子数1～6的直链烷氧基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、碳原子数1～6的直链烷硫基、氨基、碳原子数1～6的直链烷基氨基、由核酸合成的保护基保护的氨基和卤原子，
X1为可以被碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b或－OR5b取代的碳原子数2～8的亚烷基，其中，R4b为氢原子碳原子数1～3的直链烷基，R5b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基；或者X1为可以被碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b或－OR5b取代的碳原子数2～8的亚烯基，其中，R4b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基，R5b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基，
并且，X2为氧原子、硫原子、－NH－、－N(CH3)－或亚甲基。
7.如权利要求6所述的寡核苷酸或其药理学上可接受的盐，其特征在于：
所述式(II)由以下式表示，
式中，
Base表示可以具有1个以上选自α组中的任意取代基的嘌呤－9－基或2－氧代－1,2－二氢嘧啶－1－基，其中，该α组包括羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、碳原子数1～6的直链烷基、碳原子数1～6的直链烷氧基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、碳原子数1～6的直链烷硫基、氨基、碳原子数1～6的直链烷基氨基、由核酸合成的保护基保护的氨基和卤原子，
X2为氧原子、硫原子、－NH－、N(CH3)－或亚甲基，
并且，R6、R7、R8、R9、R10和R11分别独立地为氢原子、碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b或－OR5b，其中，R4b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基，R5b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基。
8.如权利要求6所述的寡核苷酸或其药理学上可接受的盐，其特征在于：
所述式(II)由以下式表示，
式中，
Base表示可以具有1个以上选自α组中的任意取代基的嘌呤－9－基或2－氧代－1,2－二氢嘧啶－1－基，其中，该α组包括羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、碳原子数1～6的直链烷基、碳原子数1～6的直链烷氧基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、碳原子数1～6的直链烷硫基、氨基、碳原子数1～6的直链烷基氨基、由核酸合成的保护基保护的氨基和卤原子，
X2为氧原子、硫原子、－NH－、－N(CH3)－或亚甲基，
并且，R6和R7分别独立地为氢原子、碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b或－OR5b，其中，R4b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基，R5b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基。
9.权利要求6所述的寡核苷酸或其药理学上可接受的盐的制造方法，其特征在于：
包括使用以下式(I)所示的化合物或其药理学上可接受的盐合成寡核苷酸的工序，
式中，
Base表示可以具有1个以上选自α组中的任意取代基的嘌呤－9－基或2－氧代－1,2－二氢嘧啶－1－基，其中，该α组包括羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、碳原子数1～6的直链烷基、碳原子数1～6的直链烷氧基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、碳原子数1～6的直链烷硫基、氨基、碳原子数1～6的直链烷基氨基、由核酸合成的保护基保护的氨基和卤原子，
R2和R3分别独立地表示氢原子、核酸合成的羟基的保护基、可以形成支链或环的碳原子数1～7的烷基、可以形成支链或环的碳原子数2～7的烯基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3～10的芳基、具有可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基且可以包含杂原子的碳原子数3～12的芳基部分的芳烷基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基的酰基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基的甲硅烷基、可以具有1个以上选自该α组中的任意取代基的磷酸基、由核酸合成的保护基保护的磷酸基、－P(R4a)R5a，式中，R4a和R5a分别独立地表示羟基、由核酸合成的保护基保护的羟基、巯基、由核酸合成的保护基保护的巯基、氨基、碳原子数1～6的烷氧基、碳原子数1～6的烷硫基、碳原子数1～6的氰基烷氧基或具有碳原子数1～6的烷基的二烷基氨基，
X1为可以被碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b或－OR5b取代的碳原子数2～8的亚烷基，其中，R4b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基，R5b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基；或者X1为可以被碳原子数1～3的直链烷基、－NHR4b或－OR5b取代的碳原子数2～8的亚烯基，其中，R4b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基，R5b为氢原子或碳原子数1～3的直链烷基，
X2为氧原子、硫原子、－NH－、－N(CH3)－或亚甲基。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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