JP7227331B2 - Ｃｄ２０療法、ｃｄ２２療法、およびｃｄ１９キメラ抗原受容体（ｃａｒ）発現細胞との併用療法 - Google Patents

Ｃｄ２０療法、ｃｄ２２療法、およびｃｄ１９キメラ抗原受容体（ｃａｒ）発現細胞との併用療法 Download PDF

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Description

本出願は、２０１５年４月８日付けで出願された米国特許出願第６２／１４４，６１５号、２０１５年４月８日付けで出願された米国特許出願第６２／１４４，４９７号、２０１５年４月８日付けで出願された米国特許出願第６２／１４４，６３９号、２０１５年８月１９日付けで出願された米国特許出願第６２／２０７，２５５号、２０１５年１２月４日付けで出願された米国特許出願第６２／２６３，４２３号の優先権を主張するものであり、これらの出願の内容は、それら全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、一般に、表面抗原分類１９タンパク質（ＣＤ１９）の発現に関連する疾患を処置するための、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように加工されたＴ細胞の、適宜、Ｂ細胞阻害剤、例えばＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａの１つまたは複数の阻害剤と組み合わせての使用に関する。
Ｂ細胞悪性腫瘍を有する多くの患者は、標準治療では治らない。加えて、旧来の処置の選択肢は、重篤な副作用を有することが多い。様々な試みががんの免疫療法において行われてきたが、数々の障害があるため、これは、臨床効果の達成が非常に困難な目標である。何百ものいわゆる腫瘍抗原が同定されたが、これらは一般に自己に由来し、それゆえに免疫原性が低い。さらに、腫瘍は、数々のメカニズムを使用して、免疫攻撃の開始および伝播に敵対する。
Ｂ細胞悪性腫瘍などのがん細胞上の好適な細胞表面分子へのＴ細胞の再指向化に依存する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で改変された自己Ｔ細胞（ＣＡＲＴ）療法を使用する最近の発展は、免疫系の力を利用してＢ細胞悪性腫瘍および他のがんを処置することに関して有望な結果を示している［例えば、Sadelain et al., Cancer Discovery 3:388-398 (2013)を参照されたい］。マウス由来のＣＡＲＴ１９（すなわち、「ＣＴＬ０１９」）の臨床結果は、ＣＬＬに罹患している患者ではもちろん小児ＡＬＬにおいても完全応答の達成に効果を発揮した［例えば、Kalos et al., Sci Transl Med 3:95ra73 (2011)、Porter et al., NEJM 365:725-733 (2011)、Grupp et al., NEJM 368:1509-1518 (2013)を参照されたい］。遺伝子改変されたＴ細胞上のキメラ抗原受容体の、標的細胞を認識し、破壊する能力に加えて、白血病再発を調査するために長い期間にわたって増殖し、持続する能力が、治療的Ｔ細胞療法成功には必要である。アネルギー、抑制または消耗に起因するＴ細胞のばらつきのある質は、ＣＡＲで形質転換されたＴ細胞の性能に影響を与えることになり、現時点では当業者によるその制御には限界がある。効果的であるために、ＣＡＲで形質転換された患者Ｔ細胞は、同種抗原に応答して増殖する能力を持続し、維持する必要がある。マウスｓｃＦｖを含むＣＡＲＴ１９を用いてＡＬＬ患者のＴ細胞がこれを実行できることは証明されている［例えば、Grupp et al., NEJM 368:1509-1518 (2013)参照されたい］。
本開示は、少なくとも一部は、表面抗原分類１９タンパク質（ＣＤ１９）（例えば、ＯＭＩＭ受託番号１０７２６５、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ．受託番号Ｐ１５３９１）の発現に関連する障害を処置する方法を特徴とする。ある特定の実施形態において、障害は、がん、例えば血液がんである。一部の実施形態において、方法は、ＣＤ１９に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子をＢ細胞阻害剤、例えば１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ以上）のＢ細胞阻害剤と組み合わせて投与することを含む。一部の実施形態において、Ｂ細胞阻害剤は、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３もしくはＲＯＲ１の阻害剤、またはそれらの組合せから選ばれる。一部の実施形態において、組合せは、いずれかの治療単独と比較して良好な臨床的有効性を維持するか、または有する。一部の実施形態において、本明細書における方法は、ＣＤ１９の発現に関連する障害を処置するために、ＣＤ１９に結合するＣＡＲ分子を発現するように加工された細胞、例えばＴ細胞を、Ｂ細胞阻害剤［例えば、第二のＢ標的、例えばＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３もしくはＲＯＲ１）に対する抗体（例えば、単一特異性もしくは二重特異性抗体）］、もしくは第二のＢ細胞標的と結合するＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞、またはそれらの組合せと組み合わせて使用することを含む。本開示は、ＣＤ２０およびＣＤ２２に向けられた新規の抗原結合ドメインおよびＣＡＲ分子、ならびに例えば単剤療法としてのまたは併用療法における使用をさらに特徴とする。
したがって、一態様において、本発明は、ＣＤ１９の発現に関連する疾患を有する対象（例えば、哺乳動物）を処置する方法に関する。方法は、ＣＤ１９阻害剤、例えば、本明細書で説明されるＣＤ１９に結合するＣＡＲ分子を、Ｂ細胞阻害剤と組み合わせて対象に投与することを含む。例えば、方法は、ＣＤ１９に結合するＣＡＲ分子、例えば、本明細書で説明されるＣＤ１９（例えば、野生型または突然変異ＣＤ１９）に結合するＣＡＲ分子を発現する１つまたは複数の細胞の有効な数をＢ細胞阻害剤と組み合わせて対象に投与することを含む。ある特定の実施形態において、Ｂ細胞阻害剤は、ＣＤ１０阻害剤、例えば、本明細書で説明される１つもしくは複数のＣＤ１０阻害剤；ＣＤ２０阻害剤、例えば、本明細書で説明される１つもしくは複数のＣＤ２０阻害剤；ＣＤ２２阻害剤、例えば、本明細書で説明される１つもしくは複数のＣＤ２２阻害剤；ＣＤ３４阻害剤、例えば、本明細書で説明される１つもしくは複数のＣＤ３４阻害剤；ＣＤ１２３阻害剤、例えば、本明細書で説明される１つもしくは複数のＣＤ１２３阻害剤；ＦＬＴ－３阻害剤、例えば、本明細書で説明される１つもしくは複数のＦＬＴ－３阻害剤；ＲＯＲ１阻害剤、例えば、本明細書で説明される１つもしくは複数のＲＯＲ１阻害剤；ＣＤ７９ｂ阻害剤、例えば、本明細書で説明される１つもしくは複数のＣＤ７９ｂ阻害剤；ＣＤ１７９ｂ阻害剤、例えば、本明細書で説明される１つもしくは複数のＣＤ１７９ｂ阻害剤；ＣＤ７９ａ阻害剤、例えば、本明細書で説明される１つもしくは複数のＣＤ７９ａ阻害剤、またはそれらのあらゆる組合せから選ばれる。ある特定の態様において、Ｂ細胞白血病またはＢ細胞リンパ腫を有する対象を処置する方法であって、ＣＤ１９に結合するＣＡＲ分子を発現する１つまたは複数の細胞の有効な数をＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａの１つまたは複数の阻害剤と組み合わせて対象に投与することを含む方法を開示する。
関連する態様において、本開示は、ＣＤ１９発現細胞の増殖を低減させる方法であって、例えば、対象、例えばそれを必要とする患者に、本明細書で説明されるような併用療法を投与すること、例えば、ＣＤ１９阻害剤をＢ細胞阻害剤、例えば本明細書で説明されるような１つまたは複数のＢ細胞阻害剤と組み合わせて投与することによる方法を提供する。別の態様において、本開示は、ＣＤ１９発現細胞を選択的に死滅させる方法であって、例えば、対象、例えばそれを必要とする患者に、本明細書で説明されるような併用療法を投与すること、例えば、ＣＤ１９阻害剤をＢ細胞阻害剤、例えば本明細書で説明されるような１つまたは複数のＢ細胞阻害剤と組み合わせて投与することによる方法を提供する。ある特定の態様において、本開示は、対象、例えば哺乳動物において抗腫瘍免疫を提供する方法であって、本明細書で説明されるような組合せ（例えば、１種または複数のＣＡＲ発現細胞）の有効量を前記哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。
ある態様において、本開示は、哺乳動物におけるＣＤ１９陰性の再発を予防する方法であって、１つまたは複数のＢ細胞阻害剤を前記哺乳動物に投与することを含み、前記Ｂ細胞阻害剤が、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａの１つまたは複数の阻害剤を含む、方法を提供する。
別の態様では、本開示は、ＣＤ１９の発現に関連する疾患、例えばＤＬＢＣＬ（例えば、原発性ＤＬＢＣＬ）を有する対象を処置する方法を提供する。方法は、ＣＤ１９に結合するＣＡＲ分子、例えばＣＤ１９ ＣＡＲを発現する１つまたは複数の細胞の有効な数を、適宜、ＰＤ１阻害剤と組み合わせて、対象に投与することを含む。対象は、ＣＤ３＋／ＰＤ１＋であるがん細胞、例えばＤＬＢＣＬ細胞、少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を有してもよく、またはこれを有するものとして同定されてもよい。
ある態様では、本開示は、ＣＤ１９の発現に関連する疾患、例えばＤＬＢＣＬを有する対象を処置する方法を提供する。方法は、ＣＤ１９に結合するＣＡＲ分子、例えばＣＤ１９ ＣＡＲを発現する１つまたは複数の細胞の有効な数をＰＤ－Ｌ１阻害剤と組み合わせて対象に投与することを含む。対象は、がん、例えばがん微小環境、において、ＣＤ１９およびＰＤ－Ｌ１に関して二重陽性である細胞（cells in the cancer, e.g., cancer microenvironment, are double positive for CD19 and PD-L1）２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％未満を有してもよく、またはこれを有するものとして同定されてもよい。
ある態様では、本開示は、ＣＤ１９の発現に関連する疾患を有する対象の処置において使用するための１つまたは複数のＢ細胞阻害剤であって、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａの１つまたは複数の阻害剤を含み、前記対象が、ＣＤ１９に結合するＣＡＲ分子、例えばＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞を受けたことがあるか、受けているか、または受ける予定である、１つまたは複数のＢ細胞阻害剤を提供する。
併用投与のタイミングおよび投与量
本明細書で説明される１つまたは複数の治療を実質的に同時にまたは任意の順序で対象に投与することができる。例えば、ＣＤ１９阻害剤、例えば、本明細書で説明されるＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、１つまたは複数のＢ細胞阻害剤、および／または、適宜、少なくとも１種の追加の治療剤を、同じまたは別の組成物で同時に投与してもよいし、または逐次的に投与してもよい。
逐次的な投与の場合、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、ＣＤ２０ ＣＡＲ発現細胞、またはＣＤ２２ ＣＡＲ発現細胞）を最初に投与し、２番目に追加の薬剤を投与してもよいし、または投与順はその逆でもよい。一部の実施形態において、最初の治療（例えば、ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＤ１９ ＣＡＲＴ細胞、ＣＤ２０ ＣＡＲＴ細胞、またはＣＤ２２ ＣＡＲＴ細胞）は、２番目の治療が導入されるとき継続しており、他の実施形態において、最初の治療は、２番目の治療が導入される前、導入された後、または導入されるのと同時に中止される。逐次的な投与の場合、一部の実施形態において、２番目の治療は、所定の時間の後、または対象が、再発が起こったもしくは起こる可能性がある１つもしくは複数の徴候を示した後、開始される。徴候は、例えば、最初の治療、例えばＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２、の標的に障害が認められるがん細胞の存在であり得る。障害は、例えば、フレームシフト突然変異および／または未成熟終止コドンであってもよい。
他の実施形態において、２種以上の治療（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞およびＢ細胞阻害剤）は、同時に投与される。理論に縛られることは望まないが、一部の実施形態において、治療の同時投与は、再発の尤度を低下させることができ、および／または再発を遅延させることができる。
組み合わせて投与する場合、最初の治療（例えば、ＣＡＲ療法、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０もしくはＣＤ２２に対して向けられたＣＡＲ発現細胞）および追加の薬剤（例えば、第二もしくは第三の薬剤、例えばＢ細胞阻害剤）、または全ては、個別に、例えば、単剤療法として使用される各薬剤の量または投与量より高量または高用量で投与することもでき、これより低量または低用量で投与することもでき、これと同量または同用量で投与することもできる。ある特定の実施形態において、最初の治療、２番目の治療、適宜３番目の治療、または全ての投与される量または投与量は、個別に、例えば単剤療法として使用される各薬剤の量または投与量より低量または低投与量（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％の量または投与量）である。他の実施形態において、所望の効果（例えば、がんの処置）を結果としてもたらす、最初の治療、２番目の治療、適宜３番目の治療、または全ての量または投与量は、同じ治療効果を達成するのに必要とされる個別に、例えば単剤療法として使用される各薬剤の量または投与量より低量または低投与量（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％低量または低投与量）である。ある特定の実施形態において、より低用量は、常用量（単剤療法の用量）が投与されたときに見られるものと比較して副作用の低減をもたらす。
ある実施形態において、治療は、細胞の集団を含む。実施形態において、細胞は、免疫エフェクター細胞、例えば、ＣＡＲ発現細胞である。
代替的に、または本明細書で説明される方法と組み合わせて、診断工程または患者選択工程、例えば以下で説明されるような工程を含む方法を開示する。
一態様において、本発明は、再発例ステータス（例えば、ＣＡＲ療法後の再発例または非再発例）について対象、例えば患者を評価する方法を提供する。一実施形態において、方法は、ＣＡＲ療法（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲＴ療法、例えば本明細書で説明されるＣＤ１９ ＣＡＲＴ療法、例えばＣＴＬ０１９療法）での処置後、再発した対象、例えば患者（「再発例」）、または再発する可能性がある対象、例えば患者、または再発していない対象、例えば患者（「非再発例」）、または再発する可能性がない対象、例えば患者を同定する。ある実施形態において、再発例ステータス（例えば、ＣＡＲＴ療法後の再発例または非再発例）は、ＣＤ１９の１つまたは複数の特徴についてアッセイすることによって決定される。
一実施形態において、ＣＤ１９の１つまたは複数の特徴としては、核酸配列の変化（例えば、挿入、欠失もしくは置換またはこれらの組合せなどの、突然変異）、核酸レベルの変化、タンパク質配列の変化、もしくはタンパク質レベルの変化、またはそれらの組合せが挙げられる。一実施形態において、再発例は、ＣＤ１９における１つまたは複数の突然変異、例えば、ＣＤ１９のエキソン２における１つまたは複数の突然変異（例えば、挿入または欠失）を有する。ある実施形態において、再発例は、ＣＤ１９のエキソン１、エキソン２、エキソン３、エキソン４、エキソン５、エキソン６またはエキソン７における１つまたは複数の突然変異を有する。ある実施形態において、突然変異は、例えばＣＤ１９のエキソン２において、例えば、フレームシフトに至る挿入または欠失によって、未成熟終止コドンを生成する。ある実施形態において、突然変異は、表３１の突然変異である。
ある実施形態において、ＣＤ１９の特徴は、参照特徴と比較される。例えば、特徴が配列（例えば、生体試料からのタンパク質または核酸配列）である場合、参照特徴は、ＣＤ１９の野生型配列（例えば、タンパク質または核酸配列）であり得る。特徴は、突然変異配列を有する試料中の細胞のパーセントであってもよい。特徴がレベル（例えば、タンパク質または核酸レベル）である場合、参照特徴は、ＣＤ１９の野生型レベル（例えば、タンパク質または核酸レベル）であり得る。特徴は、試料中のタンパク質または核酸のレベルであってもよい。特徴は、所与の閾値を超えるタンパク質または核酸のレベルを有する試料中の細胞のパーセンテージであってもよい。
ある実施形態において、がん、例えば、血液がん、例えばＣＬＬまたはＡＬＬなどを有する対象を、ＣＡＲ療法、例えばＣＤ１９ ＣＡＲＴ療法を含む処置後に再発例または非再発例であるとして同定する方法を提供する。方法は、（１）対象から試料（例えば、対象の血液から得られるアフェレーシス試料；および／または例えば、製造された生成物試料、例えば、対象の血液から得られる遺伝子加工されたＴ細胞）を得ること；（２）ＣＤ１９の特徴、例えば配列またはレベルを本明細書で説明されるように決定すること；および（３）決定されたＣＤ１９の特徴を基準特徴と（適宜）比較すること（この場合、参照特徴と比較して決定された特徴との差、例えば、統計学的に有意な差は、ＣＡＲ療法に対して再発することを予示する）；および（４）対象を、例えば、決定されたＣＤ１９の特徴に基づき、ＣＡＲ療法に対する再発例または非再発例として同定することを含む。一実施形態において、ＣＤ１９の特徴の存在または非存在は、例えばフレームシフトに至る挿入または欠失による、未成熟終止コドンの存在または非存在である。ある実施形態において、ＣＤ１９の特徴の存在は、表３１の突然変異である。
ある実施形態において、提供する方法は、（１）対象から試料（例えば、対象の血液から得られるアフェレーシス試料；および／または例えば、製造された生成物試料、例えば、対象の血液から得られる遺伝子加工されたＴ細胞、例えば製造されたＣＡＲＴ１９生成物）を得ること；（２）ＣＤ１９の特徴、例えば配列またはレベルを本明細書で説明されるように決定すること；および（３）決定されたＣＤ１９の特徴を基準特徴と（適宜）比較することを含み、ＣＤ１９の特徴の存在（例えば、参照特徴と比較して決定された特徴との差、例えば、統計学的に有意な差）は、ＣＡＲ療法に対して再発することを予示する。一実施形態において、ＣＤ１９の特徴の存在は、例えばフレームシフトに至る挿入または欠失による、未成熟終止コドンの存在である。ある実施形態において、ＣＤ１９の特徴の存在は、表３１の突然変異である。
ある実施形態において、がん、例えば、ＣＬＬまたはＡＬＬなどの血液がんを有する対象の再発を、ＣＡＲ療法、例えば、本明細書で説明されるＣＤ１９ ＣＡＲ療法を含む処置後に決定する方法を提供する。方法は、再発前に得た試料中のＣＤ１９の特徴を決定することを含む。ある実施形態において、ＣＤ１９の特徴の存在（例えば、参照特徴と比較して決定された特徴との差、例えば、統計学的に有意な差）は、ＣＡＲ療法後の再発を示す。一実施形態において、ＣＤ１９の特徴の存在は、例えばフレームシフトに至る挿入または欠失による、未成熟終止コドンの存在である。ある実施形態において、ＣＤ１９の特徴の存在は、表３１の突然変異である。
ある実施形態において、がん、例えば、ＣＬＬまたはＡＬＬなどの血液がんを有する対象を評価する方法を提供する。方法は、ＣＤ１９の１つまたは複数の特徴（one or characteristics）、例えば本明細書で説明されるようなＣＤ１９の特徴の１つまたは複数の測度を含む、対象の再発例ステータスの値を得ることによって前記対象を評価することを含む。
ある実施形態において、がんを有する対象におけるＣＡＲ療法、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲＴ療法の有効性を評価またはモニタリングする方法であって、ＣＤ１９の１つまたは複数の特徴、例えば本明細書で説明されるようなＣＤ１９の特徴の１つまたは複数の測度を含む、前記対象の再発例ステータスの値を得ることによって前記対象におけるＣＡＲ療法の有効性を評価またはモニタリングすることを含む方法を提供する。
ある実施形態において、がんを有する対象におけるＣＡＲ療法、例えばＣＤ１９ ＣＡＲＴ療法、例えば、本明細書で説明されるＣＤ１９ ＣＡＲＴ療法の成功率の予測を提供する方法であって、前記対象からの生体試料を用意する工程；ＣＤ１９の１つまたは複数の特徴、例えば、本明細書で説明されるようなＣＤ１９の特徴の１つまたは複数を決定する工程、および決定された特徴に基づき、前記対象に予後を提供する工程を含む方法を提供する。
一部の態様において、本開示は、例えば、がんを有する対象を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）療法を含む処置に応答する尤度増加もしくは減少を有すると同定する方法、またはそれを同定するためのアッセイを提供し、前記方法は、
（１）対象から試料を得ること；
（２）（ｉ）試料中の表２９に列挙した１つまたは複数のマーカーのレベル、
（ｉｉ）ＣＤ１９の特徴、例えば、突然変異、例えば、フレームシフトもしくは未成熟終止コドンまたは両方を引き起こす突然変異、あるいは
（ｉｉｉ）ＴＲＥＧ細胞のレベルもしくは活性
の１つまたは複数についての値を決定すること；
（３）決定された値、例えば、（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）またはそれらの組合せのレベル、活性もしくは特徴を基準値と（適宜）比較すること（この場合、参照値と比較して決定された値との差、例えば、統計学的に有意な差は、ＣＡＲ療法に対する対象の応答性を予示する）；および
（４）前記対象を決定された値に基づいてＣＡＲ療法に対する完全応答例、部分応答例もしくは非応答例、または再発例もしくは非再発例として同定すること
を含む。
ある特定の実施形態において、前述の方法のいずれかもが、以下のことをさらに包含し得る：
（ｉ）（ｉ）表２９に列挙した１つまたは複数のマーカーのレベルまたは活性、（ｉｉ）ＣＤ１９の特徴、例えば突然変異、例えばフレームシフトもしくは未成熟終止コドンまたは両方を引き起こす突然変異、あるいは（ｉｉｉ）生体試料中のＴＲＥＧ細胞のレベル、の１つ、２つ以上（全て）の値に関して差が検出されなかった、例えば、統計学的に有意な差が検出されなかった場合、ＣＡＲ療法、例えば、ＣＤ１９発現細胞を含む治療の治療有効用量を対象に投与すること；
（ｉｉ）（ｉ）表２９に列挙した１つまたは複数のマーカーのレベルまたは活性、（ｉｉ）ＣＤ１９の特徴、例えば突然変異、例えばフレームシフトもしくは未成熟終止コドンまたは両方を引き起こす突然変異、あるいは（ｉｉｉ）生体試料中のＴＲＥＧ細胞のレベル、の１つ、２つ以上（全て）の値に関して差、例えば統計学的に有意な差が検出された場合、ＣＡＲ療法、例えば、ＣＤ１９発現細胞を含む治療、および１つまたは複数のＢ細胞阻害剤（例えば、本明細書で説明されるようなＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１の１つまたは複数の阻害剤）の治療有効用量を対象に投与すること；あるいは
（ｉｉｉ）（ｉ）表２９に列挙した１つまたは複数のマーカーのレベルまたは活性、（ｉｉ）ＣＤ１９の特徴、例えば突然変異、例えばフレームシフトもしくは未成熟終止コドンまたは両方を引き起こす突然変異、あるいは（ｉｉｉ）生体試料中のＴＲＥＧ細胞のレベル、の１つ、２つ以上（または全て）の値に関して差、例えば統計学的に有意な差が検出された場合、最初の治療、例えば、ＣＤ１９発現細胞を含む治療を中止して、２番目の治療、例えば、１つまたは複数のＢ細胞阻害剤（例えば、本明細書で説明されるようなＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１の１つまたは複数の阻害剤）を投与すること。
投与工程（ｉ）～（ｉｉｉ）は、下記の例示的な実施形態で説明されるように、患者評価工程の前に実施してもよく、またはその後に実施してもよい。
ある特定の態様において、がんを有する対象を処置する方法を開示する。方法は、
（ａ）対象が、
（ｉ）表２９に列挙した１つまたは複数のマーカーのレベル、
（ｉｉ）ＣＤ１９の特徴、例えば、フレームシフトもしくは未成熟終止コドンまたは両方を引き起こす突然変異、あるいは
（ｉｉｉ）生体試料中のＴＲＥＧ細胞のレベルまたは活性
の１つ、２つ以上（全て）の値を有した場合、それを得ること、例えば決定することを含み、
（ｂ）前記値に応じて、以下のことをさらに包含する：
（ｉ）（ｉ）表２９に列挙した１つまたは複数のマーカーのレベルまたは活性、（ｉｉ）ＣＤ１９の特徴、例えば突然変異、例えばフレームシフトもしくは未成熟終止コドンまたは両方を引き起こす突然変異、あるいは（ｉｉｉ）生体試料中のＴＲＥＧ細胞のレベル、の１つ、２つ以上（または全て）に関して差が検出されなかった、例えば、統計学的に有意な差が検出されなかった場合、ＣＡＲ療法、例えば、ＣＤ１９発現細胞を含む治療の治療有効用量を対象に投与すること；
（ｉｉ）（ｉ）表２９に列挙した１つまたは複数のマーカーのレベルまたは活性、（ｉｉ）ＣＤ１９の特徴、例えば突然変異、例えばフレームシフトもしくは未成熟終止コドンまたは両方を引き起こす突然変異、あるいは（ｉｉｉ）生体試料中のＴＲＥＧ細胞のレベル、の１つ、２つ以上（または全て）に関して差、例えば、統計学的に有意な差が検出された場合、ＣＡＲ療法、例えば、ＣＤ１９発現細胞を含む治療、および１つまたは複数のＢ細胞阻害剤（例えば、本明細書で説明されるようなＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１の１つまたは複数の阻害剤）の治療有効用量を対象に投与すること；あるいは
（ｉｉｉ）（ｉ）表２９に列挙した１つまたは複数のマーカーのレベルまたは活性、（ｉｉ）ＣＤ１９の特徴、例えば突然変異、例えばフレームシフトもしくは未成熟終止コドンまたは両方を引き起こす突然変異、あるいは（ｉｉｉ）生体試料中のＴＲＥＧ細胞のレベル、の１つまたは複数に関して差、例えば、統計学的に有意な差が検出された場合、最初の治療、例えば、ＣＤ１９発現細胞を含む治療を中止して、２番目の治療、例えば、１つまたは複数のＢ細胞阻害剤（例えば、本明細書で説明されるようなＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１の１つまたは複数の阻害剤）を投与すること。
別の態様において、がんを有する対象を処置する方法を提供する。方法は、以下のことを包含する：
（ａ）ＣＡＲ療法、例えば、ＣＤ１９発現細胞を含む治療の治療有効用量を対象に投与すること、
（ｂ）（Ｉ）表２９に列挙した１つまたは複数のマーカーのレベル、
（ＩＩ）ＣＤ１９の特徴、例えば、突然変異、例えば、フレームシフトもしくは未成熟終止コドンまたは両方を引き起こす突然変異、あるいは
（ＩＩＩ）生体試料中のＴＲＥＧ細胞のレベルまたは活性、
の１つ、２つ以上（全て）についての値を得ること（例えば、対象がそれを有する場合、それを決定すること）、および
（ｃ）工程（ｂ）（Ｉ～ＩＩＩ）における値または決定に応じて、以下の１つまたは複数を実施すること：
（ｉ）（Ｉ）表２９に列挙した１つまたは複数のマーカーのレベルまたは活性、（ＩＩ）ＣＤ１９の特徴、例えば突然変異、例えばフレームシフトもしくは未成熟終止コドンまたは両方を引き起こす突然変異、あるいは（ＩＩＩ）生体試料中のＴＲＥＧ細胞のレベル、の１つまたは複数に関して差が検出されなかった、例えば、統計学的に有意な差が検出されなかった場合、ＣＡＲ療法、例えば、ＣＤ１９発現細胞を含む治療の治療有効用量を対象に投与すること；
（ｉｉ）（Ｉ）表２９に列挙した１つまたは複数のマーカーのレベルまたは活性、（ＩＩ）ＣＤ１９の特徴、例えば突然変異、例えばフレームシフトもしくは未成熟終止コドンまたは両方を引き起こす突然変異、あるいは（ＩＩＩ）生体試料中のＴＲＥＧ細胞のレベル、の１つまたは複数に関して差、例えば、統計学的に有意な差が検出された場合、ＣＡＲ療法、例えば、ＣＤ１９発現細胞を含む治療、および１つまたは複数のＢ細胞阻害剤（例えば、本明細書で説明されるようなＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１の１つまたは複数の阻害剤）の治療有効用量を対象に投与すること；あるいは
（ｉｉｉ）（Ｉ）表２９に列挙した１つまたは複数のマーカーのレベルまたは活性、（ＩＩ）ＣＤ１９の特徴、例えば突然変異、例えばフレームシフトもしくは未成熟終止コドンまたは両方を引き起こす突然変異、あるいは（ＩＩＩ）生体試料中のＴＲＥＧ細胞、のレベルの１つまたは複数に関して差、例えば、統計学的に有意な差が検出された場合、最初の治療、例えば、ＣＤ１９発現細胞を含む治療を中止して、２番目の治療、例えば、１つまたは複数のＢ細胞阻害剤（例えば、本明細書で説明されるようなＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１の１つまたは複数の阻害剤）を投与すること。
前述の方法のいずれかについての一部の実施形態において、試料は、血液、血漿または血清試料から選択される生体試料である。特定の実施形態において、生体試料は、血液試料である。一実施形態において、試料は、アフェレーシス試料、例えば、対象の血液から得られるＴ細胞である。ある実施形態において、試料は、製造された生成物試料、例えば、対象の血液から得られる遺伝子加工されたＴ細胞、例えば、製造されたＣＡＲ生成物、例えば、製造されたＣＡＲＴ１９生成物である。
ある実施形態において、本明細書における方法は、患者が、ＣＡＲ療法（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲＴ）に応答する可能性があるかどうか、例えば、ＣＡＲ療法を受けたことがない患者が、ＣＡＲ療法に応答する可能性があるかどうか、またはＣＡＲ療法を受けたことがある患者が、継続的なＣＡＲ療法に応答する可能性があるかどうかを決定するために使用することができる。一般に、再発を予示する同じＣＤ１９の特徴が、患者がＣＤ１９ ＣＡＲ療法に応答する可能性が低いことを予示する。ＣＤ１９ ＣＡＲ療法に応答する可能性が低いと同定される患者には、異なるタイプの治療、例えば、Ｂ細胞阻害剤（例えば、本明細書で説明されるようなＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ１７９ａの１つまたは複数の阻害剤）を投与することができる。
別の態様において、がん、例えば血液がんを有する対象を処置する方法を提供する。ある実施形態において、方法は、対象が、参照特徴と比べてＣＤ１９の特徴の差、例えば統計学的に有意な差を有するかどうかを決定すること、および決定された特徴と参照特徴間に差、例えば統計学的に有意な差があった場合、ＣＡＲ療法、例えばＣＡＲＴの治療有効用量を対象に投与することによって対象を処置することを包含する。ある実施形態において、特徴は、ＣＤ１９配列、例えば、タンパク質または核酸配列である。ある実施形態において、方法は、フレームシフトしたＣＤ１９、例えば、未成熟終止コドンを含むＣＤ１９の存在または非存在についてアッセイすることを含む。
前述の方法のいずれかについての実施形態において、処置は、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞を、適宜、１つまたは複数のＢ細胞阻害剤と組み合わせて、投与することを含む。ある実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲ療法は、１つまたは複数のＢ細胞阻害剤（例えば、本明細書で説明されるようなＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ１７９ａの１つまたは複数の阻害剤）と同時に投与される。ある実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲ療法は、Ｂ細胞阻害剤の１つまたは複数の前に投与される。ある実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲ療法は、Ｂ細胞阻害剤の１つまたは複数の後に投与される。
ある実施形態において、決定された特徴と参照特徴間に差があった場合、方法は、対象への注入前にＣＡＲ生成物を改変することを含む。ある実施形態において、決定された特徴と参照特徴間に差があった場合、方法は、対象への注入前にＣＡＲ生成物の製造を改変することを含む。ある実施形態において、決定された特徴と参照特徴間に差があった場合、方法は、抗がん作用を達成するようにＣＡＲ注入用量を調整することを含む。
ある実施形態において、処置の方法は、参照特徴に対して対象からの試料中のＣＤ１９の特徴を比較することによって、対象が、ＣＡＲ療法、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲＴ療法、例えば本明細書で説明されるようなＣＤ１９ ＣＡＲＴ療法に応答する尤度増加を有するかどうかを決定すること（この場合、参照特徴に対する特徴の差は、応答の尤度増加を示す）、およびＣＡＲ療法の治療有効用量を対象に投与することによって、対象を処置することを含む。
ある実施形態において、処置の方法は、対象から試料を得ること、参照特徴と比べてＣＤ１９の特徴（例えば、フレームシフトまたは未成熟終止コドンの存在または非存在）を決定すること；および対象が、試料のＣＤ１９特徴と試料における参照特徴との統計学的に有意な差を有するものとして同定された場合、ＣＡＲ発現細胞の治療有効用量を投与することを含む。
ＣＤ１９特徴は、患者の処置を設計するために使用することができる。例えば、ある実施形態において、患者試料が野生型ＣＤ１９を含んでいた場合、患者にＣＤ１９阻害剤、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲＴを投与する。ある実施形態において、患者試料が突然変異ＣＤ１９、例えばフレームシフトしたＣＤ１９、例えば、未成熟終止コドンを含むＣＤ１９を含んでいた場合、患者にＣＤ１９阻害剤以外の治療を投与する、例えば、患者に別のＢ細胞阻害剤を投与する。ある実施形態において、患者試料が少なくとも正常レベルのＣＤ１９を含んでいた場合、患者にＣＤ１９阻害剤、例えばＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＤ１９ ＣＡＲＴを投与する。ある実施形態において、患者試料が正常レベル未満のＣＤ１９を含んでいた場合、患者にＣＤ１９阻害剤以外の治療を投与する、例えば、患者に別のＢ細胞阻害剤（例えば、本明細書で説明されるようなＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａの１つまたは複数の阻害剤）を投与する。
ある実施形態において、処置の方法は、ＣＤ１９特徴の測度を含む、対象の再発例ステータスの値を得ること、および再発例ステータスの決定に応じて、次の１つ、２つ、３つ、４つ以上（three four or more）を実施することを含む：（１）対象を再発例または非再発例として同定すること；（２）ＣＡＲ療法を投与すること；（３）ＣＡＲ療法の投与を選択または変更すること；（４）ＣＡＲ療法のスケジュールまたは時間経過を選択または変更すること；（５）例えば再発例に、ＣＡＲ療法と組み合わせて追加の薬剤を投与すること、例えば、１つもしくは複数のＢ細胞阻害剤、またはチェックポイント阻害剤、例えば本明細書で説明されるチェックポイント阻害剤、もしくはキナーゼ阻害剤、例えば、本明細書で説明されるキナーゼ阻害剤を投与すること；（６）ＣＡＲ療法での処置の前に対象におけるナイーブＴ細胞の数を増加させる治療を再発例に投与すること；ＣＡＲ療法の製造工程を改変すること、例えば、ＣＡＲをコードする核酸を導入する前に、例えば再発例として同定された対象について、ナイーブＴ細胞を濃縮すること；あるいは（７）例えば再発例のための代替治療、例えば特定のがんの標準治療（例えば、本明細書で説明される通り）を選択すること；それによって対象のがんを処置すること。
一部の実施形態において、方法は、１つ、２つ、３つ以上のＢ細胞阻害剤（例えば、本明細書で説明されるようなＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１の１つまたは複数の阻害剤）を投与することを含む。例えば、ある実施形態において、方法は、ＣＤ１９阻害剤、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞を、Ｃ１０阻害剤と組み合わせて、またはＣ１０阻害剤と本明細書で説明されるようなＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３もしくはＲＯＲ１の阻害剤との任意の組合せと組み合わせて、投与することを包含する。別の実施形態において、方法は、ＣＤ１９阻害剤、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞を、Ｃ２０阻害剤と組み合わせて、またはＣ２０阻害剤と本明細書で説明されるようなＣＤ１０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３もしくはＲＯＲ１の阻害剤との任意の組合せと組み合わせて、投与することを包含する。別の実施形態において、方法は、ＣＤ１９阻害剤、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞を、Ｃ２２阻害剤と組み合わせて、またはＣ２２阻害剤と本明細書で説明されるようなＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３もしくはＲＯＲ１の阻害剤との任意の組合せと組み合わせて、投与することを包含する。別の実施形態において、方法は、ＣＤ１９阻害剤、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞を、ＣＤ３４阻害剤と組み合わせて、またはＣＤ４阻害剤と本明細書で説明されるようなＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３もしくはＲＯＲ１の阻害剤との任意の組合せと組み合わせて、投与することを包含する。別の実施形態において、方法は、ＣＤ１９阻害剤、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞を、ＣＤ１２３阻害剤と組み合わせて、またはＣＤ１２３阻害剤と本明細書で説明されるようなＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ２２、ＦＬＴ－３もしくはＲＯＲ１の阻害剤との任意の組合せと組み合わせて、投与することを包含する。別の実施形態において、方法は、ＣＤ１９阻害剤、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞を、ＦＬＴ－３阻害剤と組み合わせて、またはＦＬＴ－３阻害剤と本明細書で説明されるようなＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ１２３もしくはＲＯＲ１の阻害剤との任意の組合せと組み合わせて、投与することを包含する。別の実施形態において、方法は、ＣＤ１９阻害剤、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞を、ＲＯＲ１阻害剤と組み合わせて、またはＲＯＲ１阻害剤と本明細書で説明されるようなＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ１２３もしくはＦＬＴ－３の阻害剤との任意の組合せと組み合わせて、投与することを包含する。一部の実施形態において、方法は、１つ、２つ、３つ以上のＢ細胞阻害剤（例えば、本明細書で説明されるようなＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａの１つまたは複数の阻害剤）を投与することを含む。
一部の実施形態において、本明細書で説明される処置の方法は、患者試料中の免疫チェックポイント分子（例えば、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１、ＬＡＧ３またはＴＩＭ３）のレベルを決定すること、および免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１、ＬＡＧ３およびＴＩＭ３の１つまたは複数の阻害剤）を患者に投与することの一方または両方をさらに含む。例えば、方法は、本明細書で説明される１つまたは複数のＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｂ細胞阻害剤、ＣＤ２０ ＣＡＲまたはＣＤ２２ ＣＡＲと組み合わせたＣＤ１９ ＣＡＲ）で患者を処置すること、および前記処置の前にまたはその後に患者における免疫チェックポイント分子のレベルを決定することを含んでもよい。一部の実施形態において、方法は、参照レベルと比較して上昇した免疫チェックポイント分子レベルを有する患者に免疫チェックポイント阻害剤を投与すること、例えば、上昇したＰＤ－Ｌ１レベルに応じてＰＤ－Ｌ１阻害剤を投与すること、上昇したＰＤ１レベルに応じてＰＤ１阻害剤を投与すること、上昇したＬＡＧ３レベルに応じてＬＡＧ３阻害剤を投与すること、または上昇したＴＩＭ３レベルに応じてＴＩＭ３阻害剤を投与することを含む。一部の実施形態において、方法は、本明細書で説明される１つまたは複数のＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｂ細胞阻害剤と組み合わせたＣＤ１９ ＣＡＲ、ＣＤ２０ ＣＡＲ、またはＣＤ２２ ＣＡＲ）での治療を受けたことがあるか、受けているか、または受ける予定である患者であって、参照レベルと比較して上昇した免疫チェックポイント分子レベルを有するか、または有するものとして同定される患者に、免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含む。
組成物
一部の態様において、本開示は、例えば、次のものを含む組成物を提供する：（ｉ）ＣＤ１９に結合するＣＡＲ分子、例えば、本明細書で説明されるＣＤ１９に結合するＣＡＲ分子、例えばＣＤ１９ ＣＡＲを発現する１つまたは複数の細胞、および（ｉｉ）Ｂ細胞阻害剤、例えば、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１の１つまたは複数の阻害剤。実施形態において（ｉ）および（ｉｉ）は別々に提供され、実施形態において（ｉ）および（ｉｉ）は混合される。
一部の態様において、本開示は、例えば、次のものをコードする核酸を提供する：（ｉ）ＣＤ１９に結合するＣＡＲ分子、例えば、本明細書で説明されるＣＤ１９に結合するＣＡＲ分子、例えばＣＤ１９ ＣＡＲ、および（ｉｉ）１つまたは複数のＢ細胞阻害剤、例えば、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１の１つまたは複数の阻害剤。一部の態様において、本開示は、例えば、次のものをコードする核酸を提供する：（ｉ）ＣＤ１９に結合するＣＡＲ分子、例えば、本明細書で説明されるＣＤ１９に結合するＣＡＲ分子、例えばＣＤ１９ ＣＡＲ、および（ｉｉ）Ｂ細胞抗原、例えばＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１の１つまたは複数、に結合するＣＡＲ分子。実施形態において、核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡを含む。
一部の態様において、本開示は、例えば、次のものをコードする核酸を提供する：（ｉ）ＣＤ１９に結合するＣＡＲ分子、例えば、本明細書で説明されるＣＤ１９に結合するＣＡＲ分子、例えばＣＤ１９ ＣＡＲ、および（ｉｉ）Ｂ細胞抗原、例えばＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａの１つまたは複数、に結合するＣＡＲ分子。実施形態において、核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡを含む。実施形態において、（ｉ）および（ｉｉ）をコードする核酸配列は、同じ配置で位置し、例えば、（ｉ）および（ｉｉ）をコードする核酸配列の転写は、同じ方向に進行する。実施形態において、（ｉ）および（ｉｉ）をコードする核酸配列は、異なる配置で位置する。実施形態において、単一のプロモーターが、（ｉ）および（ｉｉ）をコードする核酸配列の発現を制御する。実施形態において、プロテアーゼ切断部位（例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡまたはＦ２Ａ切断部位）をコードする核酸が、（ｉ）および（ｉｉ）をコードする核酸配列間に位置する。実施形態において、プロテアーゼ切断部位は、細胞が、（ｉ）および（ｉｉ）を含む融合タンパク質を発現することができるように配置され、後に前記タンパク質はタンパク質切断によって２つのペプチドにプロセシングされる。一部の実施形態において、（ｉ）をコードする核酸配列は、（ｉｉ）をコードする核酸配列の上流にあり、または（ｉｉ）をコードする核酸配列は、（ｉ）をコードする核酸配列の上流にある。実施形態において、第一のプロモーターは、（ｉ）をコードする核酸配列の発現を制御し、第二のプロモーターは、（ｉｉ）をコードする核酸配列の発現を制御する。実施形態において、核酸はプラスミドである。実施形態において、核酸は、ウイルスパッケージング要素を含む。一部の態様において、本開示は、本明細書で説明される核酸、例えば上記の（ｉ）および（ｉｉ）を含む核酸、を含む細胞、例えば免疫エフェクター細胞を提供する。細胞は、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡまたはＦ２Ａ切断部位を切断するプロテアーゼ（例えば、内因性または外因性）を含むこともある。
一部の態様において、本開示は、例えば、次のものを含む組成物を提供する：（ｉ）ＣＤ１９に結合するＣＡＲ分子、例えば、本明細書で説明されるＣＤ１９に結合するＣＡＲ分子、例えばＣＤ１９ ＣＡＲ、をコードする第一の核酸、および（ｉｉ）１つまたは複数のＢ細胞阻害剤、例えば、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１の１つまたは複数の阻害剤、をコードする第二の核酸。一部の態様において、本開示は、例えば、次のものを含む組成物を提供する：（ｉ）ＣＤ１９に結合するＣＡＲ分子、例えば、本明細書で説明されるＣＤ１９に結合するＣＡＲ分子、例えばＣＤ１９ ＣＡＲ、をコードする第一の核酸、および（ｉｉ）Ｂ細胞抗原、例えば、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１の１つまたは複数、に結合するＣＡＲ分子。実施形態において、第一の核酸および第二の核酸は、各々、ＲＮＡまたはＤＮＡを含む。
一部の態様において、本開示は、例えば、本明細書で説明されるよう核酸（単数または複数）を含むベクターを提供する。本開示は、ある特定の態様において、本明細書で説明されるようなベクターまたは核酸を含む細胞も提供する。
本開示は、ある特定の態様において、１種または複数の免疫エフェクター細胞、および（ｉ）ＣＤ１９に結合するＣＡＲ分子、例えば、本明細書で説明されるＣＤ１９に結合するＣＡＲ分子、例えばＣＤ１９ ＣＡＲ、をコードする第一の核酸、またはそのようなＣＡＲ分子を含む第一のポリペプチド、および（ｉｉ）Ｂ細胞抗原、例えばＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａの１つまたは複数、に結合するＣＡＲ分子をコードする第二の核酸、またはそのようなＣＡＲ分子を含む第二のポリペプチドを含む、組成物も提供する。実施形態において、第一の核酸または第一のポリペプチド、および第二の核酸または第二のポリペプチドは、各々、第一の免疫エフェクター細胞内に含有される、例えば、第一の免疫エフェクター細胞によって発現される。実施形態において、組成物は、第一の核酸または第一のポリペプチドを含有する、例えば発現する、第一の免疫エフェクター細胞、および前記第二の核酸または第二のポリペプチドを含有する、例えば発現する、第二の免疫エフェクター細胞を含む。実施形態において、組成物は、第一の核酸または第一のポリペプチドと第二の核酸または第二のポリペプチドの両方を含有する、例えば発現する、細胞を含まない。
製造
ある特定の態様において、本開示は、細胞を作製する方法であって、本明細書で説明されるようなベクター、例えば、ＣＡＲをコードするベクターで免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に形質導入することを含む方法を提供する。ある特定の態様において、本開示は、細胞を作製する方法であって、本明細書で説明されるような核酸（例えば、ＣＡＲをコードする核酸）を免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に導入することを含む方法を提供する。ある特定の態様において、本開示は、ＲＮＡが加工された細胞の集団を生成する方法であって、インビトロ（in vitro）で転写されたＲＮＡまたは合成ＲＮＡを細胞に導入することを含み、ここで該ＲＮＡが本明細書で説明されるような核酸、例えば、ＣＡＲをコードする核酸を含む、方法を提供する。
一部の実施形態において、本明細書で開示される作製方法は、細胞（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、ＣＤ２０ ＣＡＲ発現細胞、ＣＤ２２ ＣＡＲ発現細胞、Ｂ細胞阻害剤細胞、またはＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞とＢ細胞阻害剤細胞の両方）の集団と、テロメラーゼサブユニット、例えばｈＴＥＲＴ、をコードする核酸とを接触させることをさらに含む。テロメラーゼサブユニットをコードする核酸は、ＤＮＡであり得る。
一部の実施形態において、本明細書で開示される作製方法は、２％ｈＡＢ血清を含む血清中で、細胞（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、ＣＤ２０ ＣＡＲ発現細胞、ＣＤ２２ ＣＡＲ発現細胞、Ｂ細胞阻害剤細胞、またはＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞とＢ細胞阻害剤細胞の両方）の集団を培養することをさらに含む。
徴候
一実施形態において、ＣＤ１９発現に関連する疾患は、がんもしくは悪性腫瘍などの増殖性疾患、または脊髄形成異常、骨髄異形成症候群もしくは前白血病状態などの前がん状態から選択されるか、あるいはＣＤ１９の発現に関連する非がん関連の徴候である。一実施形態において、疾患は、固形または液性腫瘍である。一実施形態において、がんは、膵臓がんである。一実施形態では、疾患は、血液がんである。一実施形態において、血液がんは、白血病である。一実施形態において、がんは、これらに限定されないがＢ細胞急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）（例えば、再発性および難治性ＡＬＬ）を包含する１種または複数の急性白血病；これらに限定されないが慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を包含する１種または複数の慢性白血病からなる群より選択される。追加の血液がんまたは血液学的状態としては、これらに限定されないが、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞の新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリーセル白血病、小細胞型または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性のリンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、脊髄形成異常および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞リンパ腫、形質細胞様樹状細胞の新生物、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、ならびに「前白血病状態」が挙げられる。前白血病状態は、骨髄の血液細胞の無効な産生（または異形成）を併せもつ血液学的な状態の多様な集合体を包含する。実施形態において、ＣＤ１９発現に関連する疾患としては、これらに限定されないが、ＣＤ１９を発現する非定型的および／または非典型的ながん、悪性腫瘍、前がん状態または増殖性疾患、ならびにそれらのあらゆる組合せが挙げられる。
一実施形態において、ＣＤ１９発現に関連する疾患は、リンパ腫、例えば、ＭＣＬまたはホジキンリンパ腫である。一実施形態において、ＣＤ１９発現に関連する疾患は、白血病、例えば、ＳＬＬ、ＣＬＬおよび／またはＡＬＬである。
一実施形態において、腫瘍抗原、例えば本明細書で説明される腫瘍抗原に関連する疾患は、がんもしくは悪性腫瘍などの増殖性疾患、または脊髄形成異常、骨髄異形成症候群もしくは前白血病状態などの前がん状態から選択されるか、あるいは本明細書で説明される腫瘍抗原の発現に関連する非がん関連の徴候である。ある実施形態において、本明細書で説明される腫瘍抗原に関連する疾患は、固形腫瘍、例えば、本明細書で説明される固形腫瘍、例えば、前立腺、結腸直腸、膵臓、子宮頸、胃、卵巣、頭部または肺がんである。
ある実施形態において、がんは、ＡＭＬ、ＡＬＬ、Ｂ－ＡＬＬ、Ｔ－ＡＬＬ、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、ＣＭＬ、ヘアリーセル白血病、ホジキンリンパ腫、マスト細胞障害、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性新生物、形質細胞性骨髄腫、形質細胞様樹状細胞の新生物、またはそれらの組合せから選ばれる。
ある実施形態において、対象（例えば、ＰＤ１阻害剤またはＰＤ－Ｌ１阻害剤などの第二の薬剤と適宜組み合わせてＣＤ１９ ＣＡＲで処置される対象）は、ＣＤ３＋／ＰＤ１＋であるがん細胞、例えばＤＬＢＣＬ細胞、少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を有するか、または有するものとして同定される。
ある実施形態において、対象は、ＣＤ１９に結合するＣＡＲ分子、例えばＣＤ１９ ＣＡＲ、を発現する１つまたは複数の細胞での処置後に再発したか、または再発したものとして同定される。ある実施形態において、対象は、完全応答の後、血液、骨髄（＞５％）または任意の髄外部位における１つまたは複数の芽球再出現に基づき、再発したか、または再発したものとして同定される。ある実施形態において、対象は、所定の閾値より高い、例えば、１％、２％、３％、４％、５％または１０％上回るＣＤ１９－芽球の検出に基づき、再発したか、または再発したものとして同定される。
ＣＡＲ療法
ある特定の実施形態において、処置の方法は、ＣＡＲ療法、例えば、１つまたは複数のＣＡＲ分子を発現する１つまたは複数の細胞の投与を含む。１つまたは複数のＣＡＲ分子を発現する細胞は、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞であり得る。ある実施形態において、対象はヒトである。
一実施形態において、ＣＡＲ分子を発現する細胞は、ＣＡＲ分子をコードする核酸配列を包含するベクターを含む。一実施形態において、ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群より選択される。一実施形態において、ベクターは、レンチウイルスベクターである。一実施形態において、ベクターは、プロモーターをさらに含む。一実施形態において、プロモーターは、ＥＦ－１プロモーターである。一実施形態において、ＥＦ－１プロモーターは、配列番号１００の配列を含む。一実施形態において、ベクターは、インビトロで転写されたベクター、例えば、本明細書で説明される核酸分子のＲＮＡを転写するベクターである。一実施形態において、インビトロベクター中の核酸配列は、ポリ（Ａ）テール、例えば、本明細書で説明されるポリＡテール、例えば、約１５０個のアデノシン塩基を含むポリＡテールをさらに含む。一実施形態において、インビトロベクター中の核酸配列は、３’ＵＴＲ、例えば、本明細書で説明される３’ＵＴＲ、例えば、ヒトベータグロブリン由来の３’ＵＴＲの少なくとも１つの反復を含む３’ＵＴＲをさらに含む。一実施形態において、インビトロベクター中の核酸配列は、プロモーターをさらに含む。一実施形態において、核酸配列は、Ｔ２Ａ配列を含む。
一実施形態において、ＣＡＲ分子を発現する細胞は、本明細書で説明される細胞、例えば、ヒトＴ細胞またはヒトＮＫ細胞、例えば、本明細書で説明されるヒトＴ細胞または本明細書で説明されるヒトＮＫ細胞である。一実施形態において、ヒトＴ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。一実施形態において、ヒトＴ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。一実施形態において、ヒトＴ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞である。一実施形態において、ヒトＴ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞の混合物である。一実施形態において、細胞は、自己Ｔ細胞である。一実施形態において、細胞は、同種異系のＴ細胞である。一実施形態において、細胞はＴ細胞であり、該Ｔ細胞は、ジアシルグリセロールキナーゼ（ＤＧＫ）欠損である。一実施形態において、細胞はＴ細胞であり、該Ｔ細胞は、イカロス欠損である。一実施形態において、細胞はＴ細胞であり、該Ｔ細胞は、ＤＧＫとイカロス両方欠損である。
別の実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば本明細書で説明されるようなＣＡＲ分子を発現する細胞は、別の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤をさらに発現することができる。
一実施形態において、方法は、本明細書で説明されるようなＣＡＲ分子を発現する細胞を、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤と組み合わせて投与することを包含し、前記薬剤は、サイトカイン、例えば、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、またはそれらの組合せである。サイトカインは、ＣＡＲ発現細胞の投与と組み合わせて、例えば、その投与と同時に、またはその投与の直後にデリバリーすることができる。代替的に、サイトカインは、ＣＡＲ発現細胞の投与後、長期間の後に、例えば、ＣＡＲ発現細胞に対する対象の応答の査定の後にデリバリーすることができる。
例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、免疫阻害分子を阻害する薬剤であってもよい。免疫阻害分子の例としては、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータが挙げられる。一実施形態において、免疫阻害分子を阻害する薬剤は、細胞に正のシグナルを提供する第二のポリペプチド、例えば本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメインと会合している第一のポリペプチド、例えば阻害分子を含む。一実施形態において、薬剤は、例えば免疫阻害分子の第一のポリペプチド、例えば、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３および／もしくはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４もしくはＴＧＦＲベータ、またはこれらのいずれかのフラグメント（例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部）と、本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメイン［例えば、共刺激ドメイン（例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７もしくはＣＤ２８）および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で説明されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）を含む］である第二のポリペプチドとを含む。一実施形態において、薬剤は、ＰＤ１またはそれらのフラグメントの第一のポリペプチド（例えば、ＰＤ１の細胞外ドメインの少なくとも一部）、および本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメインの第二のポリペプチド（例えば、本明細書で説明されるＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／または本明細書で説明されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）を含む。
一実施形態において、リンパ球輸液、例えば、同種異系リンパ球輸液であって、本明細書で説明される少なくとも１種のＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞を含み、Ｂ細胞抗原に対して向けられたＣＡＲを発現する少なくとも１種の細胞を含んでいてもよい、リンパ球輸液が、がんの処置に使用される。一実施形態において、自己リンパ球輸液であって、少なくとも１種のＣＤ１９発現細胞を含み、Ｂ細胞抗原に対して向けられたＣＡＲを発現する少なくとも１種の細胞を含んでいてもよい、自己リンパ球輸液が、がんの処置に使用される。
一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞、例えばＴ細胞は、事前の幹細胞移植、例えば、自己幹細胞移植を受けた対象、または事前のメルファラン用量を受けた対象に投与される。
一実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば本明細書で説明されるＣＡＲ分子、を発現する細胞は、ＣＡＲ分子を発現する細胞の投与またはＢ細胞阻害剤の投与に関連する１つもしくは複数の副作用を改善する薬剤、例えば、本明細書で説明される薬剤と組み合わせて投与される。
一実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば本明細書で説明されるＣＤ１９ ＣＡＲ分子を発現する細胞、およびＢ細胞阻害剤は、ＣＤ１９に関連する疾患を処置する追加の薬剤、例えば、本明細書で説明される追加の薬剤と組み合わせて投与される。
一実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ分子を発現する細胞は、本明細書で説明される用量および／または投与スケジュールで投与される。
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、例えばインビトロ転写を使用して、Ｔ細胞に導入され、対象（例えば、ヒト）は、ＣＡＲ分子を含む細胞の初回投与、およびＣＡＲ分子を含む細胞の１回または複数回の後続投与を受け、前記１回または複数回の後続投与は、先行投与の１５日未満後、例えば、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２日後に行われる。一実施形態において、ＣＡＲ分子を含む細胞の１回を超える投与が対象（例えば、ヒト）に毎週行われ、例えば、ＣＡＲ分子を含む細胞の２、３、または４回の投与が毎週行われる。一実施形態において、対象（例えば、ヒト対象）は、ＣＡＲ分子を含む細胞の１回を超える毎週の投与（例えば、２、３、または４回にわたる毎週の投与）（本明細書ではまた、サイクルとも称する）を受け、続いて１週間にわたり、ＣＡＲ分子を含む細胞を投与がなく、次いで、ＣＡＲ分子を含む細胞の１回または複数回のさらなる投与（例えば、ＣＡＲ分子を含む細胞の１回を超える毎週の投与）が対象に対して行われる。別の実施形態において、対象（例えば、ヒト対象）は、１つを超えるサイクルの、ＣＡＲ分子を含む細胞を受け、各サイクルの間の時間は、１０、９、８、７、６、５、４、または３日間未満である。一実施形態において、ＣＡＲ分子を含む細胞は、隔日で、毎週３回投与される。一実施形態において、ＣＡＲ分子を含む細胞は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８週間、またはこれを超えて投与される。
一実施形態において、本明細書で説明される治療（例えば、ＣＤ２０ ＣＡＲ療法、ＣＤ２２ ＣＡＲ療法、またはＢ細胞阻害剤とＣＤ１９ ＣＡＲ分子、例えば本明細書で説明されるＣＤ１９ ＣＡＲ分子を発現する細胞との組合せ）は、疾患、例えば、がん、例えば本明細書で説明されるがんの第一選択の処置として投与される。別の実施形態において、本明細書で説明される治療（例えば、ＣＤ２０ ＣＡＲ療法、ＣＤ２２ ＣＡＲ療法、またはＢ細胞阻害剤とＣＤ１９ ＣＡＲ分子、例えば本明細書で説明されるＣＤ１９ ＣＡＲ分子を発現する細胞との組合せ）は、疾患、例えば、がん、例えば本明細書で説明されるがんの第二、第三、第四選択の処置として投与される。
一実施形態において、本明細書で説明される細胞の集団が投与される。一部の実施形態において、細胞の集団は、単離または精製されている。
一実施形態において、方法は、その大多数が本明細書で説明されるＣＡＲ分子を含む、細胞の集団を投与することを包含する。一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、異なるＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む。例えば、一実施形態において、ＣＡＲを発現する細胞の集団は、本明細書で説明される抗ＣＤ１９結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第一の細胞、および異なるＢ細胞抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第二の細胞を包含し得る。実施形態において、第一および第二の細胞集団は、Ｔ細胞である。実施形態において、Ｔ細胞の第一および第二の集団は、同じアイソタイプであり、例えば、両方ともＣＤ４＋Ｔ細胞であるか、または両方ともＣＤ８＋Ｔ細胞である。他の実施形態において、Ｔ細胞の第一および第二の集団は、異なるアイソタイプであり、例えば、第一の集団はＣＤ４＋Ｔ細胞を含み、第二の集団はＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。実施形態において、Ｔ細胞の第一および第二の集団は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるＷＯ２０１２／１２９５１４に記載されている細胞型である。別の例として、細胞の集団は、本明細書で説明される抗ＣＤ１９結合ドメインを有するＣＡＲと異なるＢ細胞抗原結合ドメインを有するＣＡＲの両方を発現する、単一の細胞型を含むことができる。別の例として、細胞の集団は、２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つ）のＢ細胞抗原結合ドメインを有するＣＡＲ、例えば、二重特異性ＣＡＲ、例えば、本明細書で説明されるような二重特異性ＣＡＲを発現する単一の細胞型を含むことができる。別の例として、ＣＡＲ発現細胞の集団は、抗ＣＤ１９結合ドメイン、例えば本明細書で説明されるような抗ＣＤ１９結合ドメイン、を包含するＣＡＲを発現する第一の細胞、およびＣＤ１９以外の標的（例えば、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、ＣＤ７９ａ、またはメソセリン）に対する抗原結合ドメインを包含するＣＡＲを発現する第二の細胞を、包含し得る。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを包含する第一のＣＡＲ発現細胞、および二次シグナル伝達ドメインを包含する第二のＣＡＲ発現細胞を包含する。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、第一の二次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第一の細胞、および前記第一の二次シグナル伝達ドメインとは異なる二次シグナル伝達ドメインを包含するＣＡＲを発現する第二の細胞を包含する。
例として、第一のＢ細胞阻害剤がＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞であり、第二のＢ細胞阻害剤がＣＤ１０ ＣＡＲ発現細胞である場合、第一のＣＡＲおよび第二のＣＡＲは、同じ細胞型によって発現されることもあり、または異なる型によって発現されることもある。例えば、一部の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞であり、ＣＤ１０ ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞であるか、またはＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞であり、ＣＤ１０ ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。他の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＴ細胞であり、ＣＤ１０ ＣＡＲを発現する細胞はＮＫ細胞であるか、またはＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＮＫ細胞であり、ＣＤ１０ ＣＡＲを発現する細胞はＴ細胞である。他の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞およびＣＤ１０ ＣＡＲを発現する細胞は、両方ともＮＫ細胞であるか、または両方ともＴ細胞であり、例えば、両方ともＣＤ４＋Ｔ細胞であり、もしくは両方ともＣＤ８＋Ｔ細胞である。さらに他の実施形態において、単一の細胞がＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ１０ ＣＡＲを発現し、この細胞は、例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞である。第一のＣＡＲおよび第二のＣＡＲは、同じ細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよく、または異なる細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。例えば、一部の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含み、ＣＤ１０ ＣＡＲは、共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８共刺激ドメインを含み、その一方で、一部の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８共刺激ドメインを含み、ＣＤ１０ ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。他の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ１０ ＣＡＲの各々は、同じタイプの一次シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むが、ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ１０ ＣＡＲは、異なる共刺激ドメインを含み、例えば、（１）ＣＤ１９ ＣＡＲは、４１ＢＢ共刺激ドメインを含み、ＣＤ１０ ＣＡＲは、異なる共刺激ドメイン、例えばＣＤ２７共刺激ドメインを含むか、（２）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２７共刺激ドメインを含み、ＣＤ１０ ＣＡＲは、異なる共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ共刺激ドメインを含むか、（３）ＣＤ１９ ＣＡＲは、４１ＢＢ共刺激ドメインを含み、ＣＤ１０ ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むか、（４）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含み、ＣＤ１０ ＣＡＲは、異なる共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ共刺激ドメインを含むか、（５）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２７共刺激ドメインを含み、ＣＤ１０ ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むか、または（６）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含み、ＣＤ１０ ＣＡＲは、ＣＤ２７共刺激ドメインを含む。別の実施形態において、細胞は、ＣＤ１９抗原結合ドメインとＣＤ１０抗原結合ドメインの両方を含むＣＡＲ、例えば、二重特異性抗体を含む。
別の例として、第一のＢ細胞阻害剤がＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞であり、第二のＢ細胞阻害剤がＣＤ２０ ＣＡＲ発現細胞である場合、第一のＣＡＲおよび第二のＣＡＲは、同じ細胞型によって発現されることもあり、または異なる型よって発現されることもある。例えば、一部の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞であり、ＣＤ２０ ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞であるか、またはＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞であり、ＣＤ２０ ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。他の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＴ細胞であり、ＣＤ２０ ＣＡＲを発現する細胞はＮＫ細胞であるか、またはＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＮＫ細胞であり、ＣＤ２０ ＣＡＲを発現する細胞はＴ細胞である。他の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞およびＣＤ２０ ＣＡＲを発現する細胞は、両方ともＮＫ細胞であるか、または両方ともＴ細胞であり、例えば、両方ともＣＤ４＋Ｔ細胞であり、もしくは両方ともＣＤ８＋Ｔ細胞である。さらに他の実施形態において、単一の細胞がＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ２０ ＣＡＲを発現し、この細胞は、例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞である。第一のＣＡＲおよび第二のＣＡＲは、同じ細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよく、または異なる細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。例えば、一部の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含み、ＣＤ２０ ＣＡＲは、共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８共刺激ドメインを含み、その一方で、一部の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８共刺激ドメインを含み、ＣＤ２０ ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。他の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ２０ ＣＡＲの各々は、同じタイプの一次シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むが、ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ２０ ＣＡＲは、異なる共刺激ドメインを含み、例えば、（１）ＣＤ１９ ＣＡＲは、４１ＢＢ共刺激ドメインを含み、ＣＤ２０ ＣＡＲは、異なる共刺激ドメイン、例えばＣＤ２７共刺激ドメインを含むか、（２）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２７共刺激ドメインを含み、ＣＤ２０ ＣＡＲは、異なる共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ共刺激ドメインを含むか、（３）ＣＤ１９ ＣＡＲは、４１ＢＢ共刺激ドメインを含み、ＣＤ２０ ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むか、（４）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含み、ＣＤ２０ ＣＡＲは、異なる共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ共刺激ドメインを含むか、（５）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２７共刺激ドメインを含み、ＣＤ２０ ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むか、または（６）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含み、ＣＤ２０ ＣＡＲは、ＣＤ２７共刺激ドメインを含む。別の実施形態において、細胞は、ＣＤ１９抗原結合ドメインとＣＤ２０抗原結合ドメインの両方を含むＣＡＲ、例えば、二重特異性抗体を含む。
別の例として、第一のＢ細胞阻害剤がＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞であり、第二のＢ細胞阻害剤がＣＤ２２ ＣＡＲ発現細胞である場合、第一のＣＡＲおよび第二のＣＡＲは、同じ細胞型によって発現されることもあり、または異なる型によって発現されることもある。例えば、一部の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞であり、ＣＤ２２ ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞であるか、またはＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞であり、ＣＤ２２ ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。他の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＴ細胞であり、ＣＤ２２ ＣＡＲを発現する細胞はＮＫ細胞であるか、またはＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＮＫ細胞であり、ＣＤ２２ ＣＡＲを発現する細胞はＴ細胞である。他の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞およびＣＤ２２ ＣＡＲを発現する細胞は、両方ともＮＫ細胞であるか、または両方ともＴ細胞であり、例えば、両方ともＣＤ４＋Ｔ細胞であり、もしくは両方ともＣＤ８＋Ｔ細胞である。さらに他の実施形態において、単一の細胞がＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ２２ ＣＡＲを発現し、この細胞は、例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞である。第一のＣＡＲおよび第二のＣＡＲは、同じ細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよく、または異なる細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。例えば、一部の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含み、ＣＤ２２ ＣＡＲは、共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８共刺激ドメインを含み、その一方で、一部の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８共刺激ドメインを含み、ＣＤ２２ ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。他の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ２２ ＣＡＲの各々は、同じタイプの一次シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むが、ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ２２ ＣＡＲは、異なる共刺激ドメインを含み、例えば、（１）ＣＤ１９ ＣＡＲは、４１ＢＢ共刺激ドメインを含み、ＣＤ２２ ＣＡＲは、異なる共刺激ドメイン、例えばＣＤ２７共刺激ドメインを含むか、（２）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２７共刺激ドメインを含み、ＣＤ２２ ＣＡＲは、異なる共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ共刺激ドメインを含むか、（３）ＣＤ１９ ＣＡＲは、４１ＢＢ共刺激ドメインを含み、ＣＤ２２ ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むか、（４）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含み、ＣＤ２２ ＣＡＲは、異なる共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ共刺激ドメインを含むか、（５）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２７共刺激ドメインを含み、ＣＤ２２ ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むか、または（６）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含み、ＣＤ２２ ＣＡＲは、ＣＤ２７共刺激ドメインを含む。別の実施形態において、細胞は、ＣＤ１９抗原結合ドメインとＣＤ２２抗原結合ドメインの両方を含むＣＡＲ、例えば、二重特異性抗体を含む。
別の例として、第一のＢ細胞阻害剤がＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞であり、第二のＢ細胞阻害剤がＣＤ３４ ＣＡＲ発現細胞である場合、第一のＣＡＲおよび第二のＣＡＲは、同じ細胞型によって発現されることもあり、または異なる型によって発現されることもある。例えば、一部の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞であり、ＣＤ３４ ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞であるか、またはＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞であり、ＣＤ３４ ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。他の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＴ細胞であり、ＣＤ３４ ＣＡＲを発現する細胞はＮＫ細胞であるか、またはＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＮＫ細胞であり、ＣＤ３４ ＣＡＲを発現する細胞はＴ細胞である。他の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞およびＣＤ３４ ＣＡＲを発現する細胞は、両方ともＮＫ細胞であるか、または両方ともＴ細胞であり、例えば、両方ともＣＤ４＋Ｔ細胞であり、もしくは両方ともＣＤ８＋Ｔ細胞である。さらに他の実施形態において、単一の細胞がＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ３４ ＣＡＲを発現し、この細胞は、例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞である。第一のＣＡＲおよび第二のＣＡＲは、同じ細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよく、または異なる細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。例えば、一部の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含み、ＣＤ３４ ＣＡＲは、共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８共刺激ドメインを含み、その一方で、一部の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８共刺激ドメインを含み、ＣＤ３４ ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。他の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ３４ ＣＡＲの各々は、同じタイプの一次シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むが、ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ３４ ＣＡＲは、異なる共刺激ドメインを含み、例えば、（１）ＣＤ１９ ＣＡＲは、４１ＢＢ共刺激ドメインを含み、ＣＤ３４ ＣＡＲは、異なる共刺激ドメイン、例えばＣＤ２７共刺激ドメインを含むか、（２）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２７共刺激ドメインを含み、ＣＤ３４ ＣＡＲは、異なる共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ共刺激ドメインを含むか、（３）ＣＤ１９ ＣＡＲは、４１ＢＢ共刺激ドメインを含み、ＣＤ３４ ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むか、（４）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含み、ＣＤ３４ ＣＡＲは、異なる共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ共刺激ドメインを含むか、（５）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２７共刺激ドメインを含み、ＣＤ３４ ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むか、または（６）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含み、ＣＤ３４ ＣＡＲは、ＣＤ２７共刺激ドメインを含む。別の実施形態において、細胞は、ＣＤ１９抗原結合ドメインとＣＤ３４抗原結合ドメインの両方を含むＣＡＲ、例えば、二重特異性抗体を含む。
別の例として、第一のＢ細胞阻害剤がＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞であり、第二のＢ細胞阻害剤がＣＤ１２３ ＣＡＲ発現細胞である場合、第一のＣＡＲおよび第二のＣＡＲは、同じ細胞型によって発現されることもあり、または異なる型によって発現されることもある。例えば、一部の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞であり、ＣＤ１２３ ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞であるか、またはＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞であり、ＣＤ１２３ ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。他の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＴ細胞であり、ＣＤ１２３ ＣＡＲを発現する細胞はＮＫ細胞であるか、またはＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＮＫ細胞であり、ＣＤ１２３ ＣＡＲを発現する細胞はＴ細胞である。他の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞およびＣＤ１２３ ＣＡＲを発現する細胞は、両方ともＮＫ細胞であるか、または両方ともＴ細胞であり、例えば、両方ともＣＤ４＋Ｔ細胞であり、もしくは両方ともＣＤ８＋Ｔ細胞である。さらに他の実施形態において、単一の細胞がＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ１２３ ＣＡＲを発現し、この細胞は、例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞である。第一のＣＡＲおよび第二のＣＡＲは、同じ細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよく、または異なる細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。例えば、一部の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含み、ＣＤ１２３ ＣＡＲは、共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８共刺激ドメインを含み、その一方で、一部の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８共刺激ドメインを含み、ＣＤ１２３ ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。他の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ１２３ ＣＡＲの各々は、同じタイプの一次シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むが、ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ１２３ ＣＡＲは、異なる共刺激ドメインを含み、例えば、（１）ＣＤ１９ ＣＡＲは、４１ＢＢ共刺激ドメインを含み、ＣＤ１２３ ＣＡＲは、異なる共刺激ドメイン、例えばＣＤ２７共刺激ドメインを含むか、（２）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２７共刺激ドメインを含み、ＣＤ１２３ ＣＡＲは、異なる共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ共刺激ドメインを含むか、（３）ＣＤ１９ ＣＡＲは、４１ＢＢ共刺激ドメインを含み、ＣＤ１２３ ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むか、（４）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含み、ＣＤ１２３ ＣＡＲは、異なる共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ共刺激ドメインを含むか、（５）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２７共刺激ドメインを含み、ＣＤ１２３ ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むか、または（６）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含み、ＣＤ１２３ ＣＡＲは、ＣＤ２７共刺激ドメインを含む。別の実施形態において、細胞は、ＣＤ１９抗原結合ドメインとＣＤ１２３抗原結合ドメインの両方を含むＣＡＲ、例えば、二重特異性抗体を含む。
別の例として、第一のＢ細胞阻害剤がＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞であり、第二のＢ細胞阻害剤がＦＬＴ－３ ＣＡＲ発現細胞である場合、第一のＣＡＲおよび第二のＣＡＲは、同じ細胞型によって発現されることもあり、または異なる型によって発現されることもある。例えば、一部の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞であり、ＦＬＴ－３ ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞であるか、またはＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞であり、ＦＬＴ－３ ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。他の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＴ細胞であり、ＦＬＴ－３ ＣＡＲを発現する細胞はＮＫ細胞であるか、またはＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＮＫ細胞であり、ＦＬＴ－３ ＣＡＲを発現する細胞はＴ細胞である。他の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞およびＦＬＴ－３ ＣＡＲを発現する細胞は、両方ともＮＫ細胞であるか、または両方ともＴ細胞であり、例えば、両方ともＣＤ４＋Ｔ細胞であり、もしくは両方ともＣＤ８＋Ｔ細胞である。さらに他の実施形態において、単一の細胞がＣＤ１９ ＣＡＲおよびＦＬＴ－３ ＣＡＲを発現し、この細胞は、例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞である。第一のＣＡＲおよび第二のＣＡＲは、同じ細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよく、または異なる細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。例えば、一部の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含み、ＦＬＴ－３ ＣＡＲは、共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８共刺激ドメインを含み、その一方で、一部の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８共刺激ドメインを含み、ＦＬＴ－３ ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。他の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＦＬＴ－３ ＣＡＲの各々は、同じタイプの一次シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むが、ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＦＬＴ－３ ＣＡＲは、異なる共刺激ドメインを含み、例えば、（１）ＣＤ１９ ＣＡＲは、４１ＢＢ共刺激ドメインを含み、ＦＬＴ－３ ＣＡＲは、異なる共刺激ドメイン、例えばＣＤ２７共刺激ドメインを含むか、（２）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２７共刺激ドメインを含み、ＦＬＴ－３ ＣＡＲは、異なる共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ共刺激ドメインを含むか、（３）ＣＤ１９ ＣＡＲは、４１ＢＢ共刺激ドメインを含み、ＦＬＴ－３ ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むか、（４）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含み、ＦＬＴ－３ ＣＡＲは、異なる共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ共刺激ドメインを含むか、（５）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２７共刺激ドメインを含み、ＦＬＴ－３ ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むか、または（６）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含み、ＦＬＴ－３ ＣＡＲは、ＣＤ２７共刺激ドメインを含む。別の実施形態において、細胞は、ＣＤ１９抗原結合ドメインとＦＬＴ－３抗原結合ドメインの両方を含むＣＡＲ、例えば、二重特異性抗体を含む。
別の例として、第一のＢ細胞阻害剤がＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞であり、第二のＢ細胞阻害剤がＲＯＲ１ ＣＡＲ発現細胞である場合、第一のＣＡＲおよび第二のＣＡＲは、同じ細胞型によって発現されることもあり、または異なる型によって発現されることもある。例えば、一部の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞であり、ＲＯＲ１ ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞であるか、またはＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞であり、ＲＯＲ１ ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。他の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＴ細胞であり、ＲＯＲ１ ＣＡＲを発現する細胞はＮＫ細胞であるか、またはＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＮＫ細胞であり、ＲＯＲ１ ＣＡＲを発現する細胞はＴ細胞である。他の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞およびＲＯＲ１ ＣＡＲを発現する細胞は、両方ともＮＫ細胞であるか、または両方ともＴ細胞であり、例えば、両方ともＣＤ４＋Ｔ細胞であり、もしくは両方ともＣＤ８＋Ｔ細胞である。さらに他の実施形態において、単一の細胞がＣＤ１９ ＣＡＲおよびＲＯＲ１ ＣＡＲを発現し、この細胞は、例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞である。第一のＣＡＲおよび第二のＣＡＲは、同じ細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよく、または異なる細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。例えば、一部の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含み、ＲＯＲ１ ＣＡＲは、共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８共刺激ドメインを含み、その一方で、一部の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８共刺激ドメインを含み、ＲＯＲ１ ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。他の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＲＯＲ１ ＣＡＲの各々は、同じタイプの一次シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むが、ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＲＯＲ１ ＣＡＲは、異なる共刺激ドメインを含み、例えば、（１）ＣＤ１９ ＣＡＲは、４１ＢＢ共刺激ドメインを含み、ＲＯＲ１ ＣＡＲは、異なる共刺激ドメイン、例えばＣＤ２７共刺激ドメインを含むか、（２）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２７共刺激ドメインを含み、ＲＯＲ１ ＣＡＲは、異なる共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ共刺激ドメインを含むか、（３）ＣＤ１９ ＣＡＲは、４１ＢＢ共刺激ドメインを含み、ＲＯＲ１ ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むか、（４）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含み、ＲＯＲ１ ＣＡＲは、異なる共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ共刺激ドメインを含むか、（５）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２７共刺激ドメインを含み、ＲＯＲ１ ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むか、または（６）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含み、ＲＯＲ１ ＣＡＲは、ＣＤ２７共刺激ドメインを含む。別の実施形態において、細胞は、ＣＤ１９抗原結合ドメインとＲＯＲ１抗原結合ドメインの両方を含むＣＡＲ、例えば、二重特異性抗体を含む。
より一般的に、第一のＢ細胞阻害剤がＣＤ１９ ＣＡＲを含み、第二のＢ細胞阻害剤、例えば第二のＣＡＲを含む第二のＢ細胞阻害剤がある場合、第一のＣＡＲおよび第二のＢ細胞阻害剤は、同じ細胞型によって発現されることもあり、または異なる型よって発現されることもある。例えば、一部の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞であり、第二のＢ細胞阻害剤を発現する細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞であるか、またはＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞であり、第二のＢ細胞阻害剤を発現する細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。他の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＴ細胞であり、第二のＢ細胞阻害剤を発現する細胞はＮＫ細胞であるか、またはＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞はＮＫ細胞であり、第二のＢ細胞阻害剤を発現する細胞はＴ細胞である。他の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞および第二のＢ細胞阻害剤を発現する細胞は、両方ともＮＫ細胞であるか、または両方ともＴ細胞であり、例えば、両方ともＣＤ４＋Ｔ細胞であり、もしくは両方ともＣＤ８＋Ｔ細胞である。さらに他の実施形態において、単一の細胞がＣＤ１９ ＣＡＲおよび第二のＢ細胞阻害剤を発現し、この細胞は、例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞である。第一のＣＡＲおよび第二のＣＡＲは、同じ細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよく、または異なる細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。例えば、一部の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含み、第二のＢ細胞阻害剤（またはＣＡＲ）は、共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８共刺激ドメインを含み、その一方で、一部の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８共刺激ドメインを含み、第二のＢ細胞阻害剤（または第二のＣＡＲ）は、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。他の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲおよび第二のＢ細胞阻害剤（または第二のＣＡＲ）の各々は、同じタイプの一次シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むが、ＣＤ１９ ＣＡＲおよび第二のＢ細胞阻害剤は、異なる共刺激ドメインを含み、例えば、（１）ＣＤ１９ ＣＡＲは、４１ＢＢ共刺激ドメインを含み、第二のＢ細胞阻害剤（もしくは第二のＣＡＲ）は、異なる共刺激ドメイン、例えばＣＤ２７共刺激ドメインを含むか、（２）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２７共刺激ドメインを含み、第二のＢ細胞阻害剤（もしくは第二のＣＡＲ）は、異なる共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ共刺激ドメインを含むか、（３）ＣＤ１９ ＣＡＲは、４１ＢＢ共刺激ドメインを含み、第二のＢ細胞阻害剤（もしくは第二のＣＡＲ）は、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むか、（４）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含み、第二のＢ細胞阻害剤（もしくは第二のＣＡＲ）は、異なる共刺激ドメイン、例えば４１ＢＢ共刺激ドメインを含むか、（５）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２７共刺激ドメインを含み、第二のＢ細胞阻害剤（もしくは第二のＣＡＲ）は、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むか、または（６）ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含み、第二のＢ細胞阻害剤（もしくは第二のＣＡＲ）は、ＣＤ２７共刺激ドメインを含む。別の実施形態において、細胞は、ＣＤ１９抗原結合ドメインと第二の抗原に向けられた抗原結合ドメインの両方を含むＣＡＲ、例えば、二重特異性抗体を含む。
一実施形態において、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号１６の配列を含む。一実施形態において、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列、または配列番号１６のアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２または３個の改変（例えば、置換）であるが２０、１０または５個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号６０の核酸配列、またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列によってコードされる。
一実施形態において、ＣＤ２７共刺激ドメインは、配列番号１６の配列を含む。一実施形態において、ＣＤ２７共刺激ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列、または配列番号１６のアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２または３個の改変（例えば、置換）であるが２０、１０または５個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ＣＤ２７共刺激ドメインは、配列番号１７の核酸配列、またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列によってコードされる。
一実施形態において、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号１３１７の配列を含む。一実施形態において、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号１３１７のアミノ酸配列、または配列番号１３１７のアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２または３個の改変（例えば、置換）であるが２０、１０または５個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号１３１８の核酸配列、またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列によってコードされる。
一実施形態において、野生型ＩＣＯＳ共刺激ドメインは、配列番号１３１９の配列を含む。一実施形態において、野生型ＩＣＯＳ共刺激ドメインは、配列番号１３１９のアミノ酸配列、または配列番号１３１９のアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２または３個の改変（例えば、置換）であるが２０、１０または５個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、野生型ＩＣＯＳ共刺激ドメインは、配列番号１３２０の核酸配列、またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列によってコードされる。
一実施形態において、Ｙ→Ｆ突然変異ＩＣＯＳ共刺激ドメインは、配列番号１３２１の配列を含む。一実施形態において、Ｙ→Ｆ突然変異ＩＣＯＳ共刺激ドメインは、配列番号１３２１のアミノ酸配列、または配列番号１３２１のアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２または３個の改変（例えば、置換）であるが２０、１０または５個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、Ｙ→Ｆ突然変異ＩＣＯＳ共刺激ドメインは、配列番号１３２０（ここで配列番号１３２０は野生型ＩＣＯＳをコードする）の核酸配列と９５～９９％の同一性を有する核酸配列によってコードされる。
実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの機能的なシグナル伝達ドメインを含む。実施形態において、ＣＤ３ゼータの機能的なシグナル伝達ドメインは、配列番号１７（突然変異ＣＤ３ゼータ）または配列番号４３（野生型ヒトＣＤ３ゼータ）を含む。
一実施形態において、方法は、集団中の少なくとも１種の細胞がＣＡＲ、例えば本明細書で説明される抗ＣＤ１９ドメインを有するＣＡＲを発現する、細胞の集団と、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を発現する第二の細胞とを投与することを包含する。例えば、一実施形態において、薬剤は、免疫阻害分子を阻害する薬剤であってもよい。免疫阻害分子の例としては、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータが挙げられる。一実施形態において、免疫阻害分子を阻害する薬剤は、細胞に正のシグナルを提供する第二のポリペプチド、例えば本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメインと会合している第一のポリペプチド、例えば阻害分子を含む。一実施形態において、薬剤は、阻害分子の第一のポリペプチド、例えば、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３および／もしくはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４もしくはＴＧＦＲベータ、またはこれらのいずれかのフラグメント（例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部）と、本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメイン［例えば、共刺激ドメイン（例えば、本明細書で説明されるような４１ＢＢ、ＣＤ２７もしくはＣＤ２８）および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で説明されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）を含む］である第二のポリペプチドとを含む。一実施形態において、薬剤は、ＰＤ１の第一のポリペプチドまたはそれらのフラグメント（例えば、ＰＤ１の細胞外ドメインの少なくとも一部）、ならびに本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で説明されるＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／または本明細書で説明されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）の第二のポリペプチドを含む。
ある実施形態において、Ｂ細胞阻害剤は、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１の１つまたは複数の阻害剤を含む。ある実施形態において、Ｂ細胞阻害剤は、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａの１つまたは複数に結合するＣＡＲ分子を発現する１つまたは複数の細胞の有効な数を含む。ある実施形態において、Ｂ細胞阻害剤は、ＣＤ１２３ ＣＡＲを含む。ある実施形態において、Ｂ細胞阻害剤は、ＣＤ１２３に結合するＣＡＲ分子を発現する１つまたは複数の細胞を含む。ある実施形態において、疾患は、ＣＤ１９陰性のがん、例えば、ＣＤ１９陰性の再発がんである。ある実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞は、１つまたは複数のＢ細胞阻害剤と同時に、その前に、またはその後に投与される。
ある実施形態において、方法は、ＣＤ１９阻害剤、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞を投与することをさらに含む。ある実施形態において、ＣＤ１９阻害剤は、ＣＤ１９ ＣＡＲを含み、Ｂ細胞阻害剤は、ＣＤ１２３ ＣＡＲを含む。ある実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲまたはＣＤ１２３ ＣＡＲは、ＣＤ１９ ＣＡＲとＣＤ１２３ ＣＡＲの両方が標的細胞、例えば標的ＣＤ１９＋ＣＤ１２３＋細胞（例えば、Ｂ－ＡＬＬ芽球細胞）と結合したときに、ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ１２３ ＣＡＲがＣＤ１９またはＣＤ１２３（例えば、造血幹細胞）の一方を発現する標的細胞と結合したときの活性化と比較して、細胞、例えば免疫エフェクター細胞集団、の完全な活性化が起こるような、分割された細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある実施形態において、ＣＤ１２３ＣＡＲは、４－１ＢＢシグナル伝達ドメインを含み、ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。ある実施形態において、ＣＤ１２３ＣＡＲは、共刺激ドメイン、例えば４－１ＢＢシグナル伝達ドメインを含み、ＣＤ１９ ＣＡＲは、一次シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。ある実施形態において、ＣＤ１２３ＣＡＲは、一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含み、ＣＤ１９ ＣＡＲは、共刺激ドメイン、例えば４－１ＢＢシグナル伝達ドメインを含む。ある実施形態において、Ｂ細胞阻害剤は、共刺激ドメインを含むＣＡＲ（例えば、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａに対して向けられたＣＡＲ）を含み、ＣＤ１９ ＣＡＲは、一次シグナル伝達ドメインを含む。ある実施形態において、Ｂ細胞阻害剤は、一次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ（例えば、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａに対して向けられたＣＡＲ）を含み、ＣＤ１９ ＣＡＲは、共刺激ドメインを含む。ある実施形態において、Ｂ細胞阻害剤は、ＣＤ１２３に結合するＣＡＲ分子を発現する１つまたは複数の細胞を含み、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞は、Ｂ細胞阻害剤と同時に投与される。ある実施形態において、ＣＤ１２３ＣＡＲは、４－１ＢＢシグナル伝達ドメインを含み、ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。
ある実施形態において、方法は、細胞、例えば造血幹細胞、または骨髄を、哺乳動物に移植することをさらに含む。
別の態様において、本発明は、Ｂ細胞阻害剤、例えば本明細書で説明されるＢ細胞阻害剤と組み合わせて医薬品として使用するための、本明細書で説明されるＣＡＲ分子、例えばＣＤ１９ ＣＡＲ分子、を発現する細胞に関する。別の態様において、本発明は、本明細書で説明されるＣＡＲ分子、例えばＣＤ１９ ＣＡＲ分子、を発現する細胞と組み合わせて医薬品として使用するための、本明細書で説明されるＢ細胞阻害剤に関する。
別の態様において、本発明は、ＣＤ１９を発現する疾患の処置において、Ｂ細胞阻害剤、例えば本明細書で説明されるＢ細胞阻害剤と組み合わせて使用するための、本明細書で説明されるＣＡＲ分子、例えばＣＤ１９ ＣＡＲ分子、を発現する細胞に関する。別の態様において、本発明は、ＣＤ１９を発現する疾患の処置において、本明細書で説明されるＣＡＲ分子、例えばＣＤ１９ ＣＡＲ分子、を発現する細胞と組み合わせて使用するための、本明細書で説明されるＢ細胞阻害剤に関する。別の態様において、本発明は、がん、例えば本明細書で説明されるがんの処置における、Ｂ細胞阻害剤、例えば本明細書で説明されるＢ細胞阻害剤と組み合わせて使用するための、本明細書で説明されるＣＡＲ分子、例えばＣＤ１９ ＣＡＲ分子、を発現する細胞に関する。
一実施形態において、方法は、集団中の少なくとも１種の細胞が本明細書における治療薬（例えば、ＣＤ２０ ＣＡＲ、ＣＤ２２ ＣＡＲ、またはＢ細胞阻害剤と組み合わせた本明細書で説明される抗ＣＤ１９ドメインを有するＣＡＲ）を発現する、細胞の集団、およびＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を投与することを包含し、前記薬剤は、サイトカイン、例えば、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、またはそれらの組合せである。サイトカインは、ＣＡＲ発現細胞の投与と組み合わせて、例えば、その投与と同時に、またはその投与の直後にデリバリーすることができる。代替的に、サイトカインは、ＣＡＲ発現細胞の投与後、長期間の後に、例えば、ＣＡＲ発現細胞に対する対象の応答の査定の後にデリバリーすることができる。医薬品を作製する使用のための関連組成物、および医薬品を作製する方法も提供する。
一実施形態において、本明細書で説明される細胞（例えば、ＣＤ２０ ＣＡＲ分子を発現する細胞、ＣＤ２２ ＣＡＲ分子を発現する細胞、またはＣＤ１９ ＣＡＲ分子、例えば本明細書で説明されるＣＤ１９ ＣＡＲ分子、を発現する細胞、Ｂ細胞阻害剤との組合せ）は、ＣＡＲ分子を発現する細胞の効能または阻害剤の１つの効能を増加させる薬剤、例えば、本明細書で説明される薬剤と組み合わせて投与される。
一実施形態において、本明細書で説明される細胞（例えば、ＣＤ２０ ＣＡＲ分子を発現する細胞、ＣＤ２２ ＣＡＲ分子を発現するか、またはＣＤ１９ ＣＡＲ分子、例えば本明細書で説明されるＣＤ１９ ＣＡＲ分子、をＢ細胞阻害剤と組み合わせて発現する細胞）は、ＣＡＲ分子を発現する細胞の投与、または阻害剤の１つの投与に関連する１つもしくは複数の副作用を改善する薬剤、例えば、本明細書で説明される薬剤と組み合わせて投与される。
一実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲ分子、例えば本明細書で説明されるＣＤ１９ ＣＡＲ分子を発現する細胞は、Ｂ細胞阻害剤、およびホジキンリンパ腫を処置する薬剤、例えば本明細書で説明される薬剤と組み合わせて投与される。
一部の態様において、本開示は、ＣＤ１９阻害剤、例えばＣＤ１９ ＣＡＲ療法に対する非応答例、部分応答例または再発例である患者を処置する方法であって、Ｂ細胞阻害剤、例えば本明細書で説明されるＢ細胞阻害剤、例えば、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａの１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは全て）の阻害剤を前記患者に投与することを含む方法を提供する。一実施形態において、Ｂ細胞阻害剤は、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１の１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または全て）の阻害剤である、ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）である。実施形態において、患者は、ＣＤ１９陰性がん細胞、およびＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂもしくはＣＤ７９ａの１つもしくは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つもしくは全て）に関して陽性であるがん細胞を有するか、またはこれらを有するものとして同定される。実施形態において、方法は、がん細胞が陽性であるＢ細胞阻害剤、例えば、がん細胞が陽性であるＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂもしくはＣＤ７９ａの１つもしくは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つもしくは全て）の阻害剤を患者に投与することをさらに含む。実施形態において、方法は、患者が、ＣＤ１９陰性がん細胞を有するかどうかを判定する工程、および患者が、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂもしくはＣＤ７９ａの１つもしくは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つもしくは全て）に関して陽性であるがん細胞を有するかどうか判定する工程の一方または両方をさらに含む。実施形態において、対象は、抗ＣＤ１９抗体、例えば、表２または表３中のＣＡＲ分子のいずれかと同じ特異性を有する抗体との結合によって測定される検査でＣＤ１９発現に関して陰性を示す腫瘍またはがん細胞の集団を有するか、またはこれを有するものとして同定される。
別の態様において、本発明は、Ｂ細胞阻害剤、例えば、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂもしくはＣＤ７９ａの阻害剤から選ばれるＢ細胞阻害剤またはそれらの組合せと組み合わせて、ＣＤ１９に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子を発現する細胞を含む、組成物を特徴とする。ＣＡＲ発現細胞およびＢ細胞阻害剤は、単一の剤形で存在してもよく、または２つ以上剤形として存在してもよい。
ある実施形態において、組成物は、薬学的に許容される組成物である。
実施形態において、本明細書で開示される組成物（例えば、核酸、ベクターまたは細胞）は、医薬品として使用するためのものである。
実施形態において、本明細書で開示される組成物は、Ｂ細胞抗原（例えば、ＣＤ１９）の発現に関連する疾患、例えば、Ｂ細胞白血病またはリンパ腫の処置において使用するためのものである（are use）。
ＣＤ１９阻害剤
実施形態において、ＣＤ１９阻害剤は、小分子、抗体、抗体のフラグメント、または細胞治療薬である。
一部の実施形態において、ＣＤ１９阻害剤（例えば、細胞治療薬または抗体）は、Ｂ細胞阻害剤、例えば、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａの１つまたは複数の阻害剤と組み合わせて投与されるか、そのようなＢ細胞阻害剤と一緒に組成物中に存在する。
一実施形態において、細胞は、抗ＣＤ１９結合ドメイン（例えば、ＣＤ１９と特異的に結合するマウスまたはヒト化抗体または抗体フラグメント）と、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン）とを含むＣＡＲ分子を発現する。一実施形態において、ＣＡＲ分子は、本明細書で説明される抗ＣＤ１９結合ドメイン（例えば、本明細書で説明されるＣＤ１９と特異的に結合するマウスまたはヒト化抗体または抗体フラグメント）と、本明細書で説明される膜貫通ドメインと、本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で説明される共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン）とを包含する、抗体または抗体フラグメントを含む。
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、本明細書で説明される抗ＣＤ１９結合ドメインの、１つまたは複数（例えば、３つ全て）の、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）、ならびに本明細書で説明される抗ＣＤ１９結合ドメインの１つまたは複数（例えば、３つ全て）の、重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含む、抗ＣＤ１９結合ドメイン、例えば、１つまたは複数、例えば３つ全て、のＬＣ ＣＤＲおよび１つまたは複数、例えば３つ全て、のＨＣ ＣＤＲを含む抗ＣＤ１９結合ドメインを含む。一実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、本明細書で説明される抗ＣＤ１９結合ドメインの、１つまたは複数（例えば、３つ全て）の、重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含み、例えば、抗ＣＤ１９結合ドメインは、本明細書で説明されるＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を各々が含む２つの可変重鎖領域を有する。一実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、本明細書で（例えば表３で）説明されるマウス軽鎖可変領域、および／または本明細書で（例えば表３で）説明されるマウス重鎖可変領域を含む。一実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、表３のアミノ酸配列のマウス軽鎖およびマウス重鎖を含むｓｃＦｖである。ある実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、表３において提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列もしくは表３のアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２もしくは３個の改変（例えば、置換）であるが３０、２０もしくは１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／または表３において提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列もしくは表３のアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２もしくは３個の改変（例えば、置換）であるが３０、２０もしくは１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号５９の配列、またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインはｓｃＦｖであり、本明細書で、例えば表３で説明されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、リンカー、例えば本明細書で説明されるリンカーを介して、本明細書で、例えば表３で説明されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に付着している。一実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）ｎリンカーを包含し、ここでｎは、１、２、３、４、５または６、例えば３または４（配列番号５３）である。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、以下の配置：軽鎖可変領域－リンカー－重鎖可変領域または重鎖可変領域－リンカー－軽鎖可変領域のいずれであってもよい。
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、本明細書で説明されるヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインの、１つまたは複数（例えば、３つ全て）の、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）、ならびに本明細書で説明されるヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインの、１つまたは複数（例えば、３つ全て）の、重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を包含する、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメイン、例えば、１つまたは複数、例えば３つ全て、のＬＣ ＣＤＲおよび１つまたは複数、例えば３つ全て、のＨＣ ＣＤＲを含むヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインを含む。一実施形態において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインは、少なくともＨＣ ＣＤＲ２を含む。一実施形態において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインは、本明細書で説明されるヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインの、１つまたは複数（例えば、３つ全て）の、重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含み、例えば、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインは、本明細書で説明されるＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を各々が含む２つの可変重鎖領域を有する。一実施形態において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインは、少なくともＨＣ ＣＤＲ２を含む。一実施形態において、軽鎖可変領域は、ＶＫ３＿Ｌ１２５生殖系由来配列の１つ、２つ、３つまたは４つ全てのフレームワーク領域を含む。一実施形態において、軽鎖可変領域は、改変（例えば置換、例えば、配列番号５８のマウス軽鎖可変領域内の対応する位置において見出される１つまたは複数のアミノ酸の置換、例えば、７１および８７位の１つまたは複数における置換）を有する。一実施形態において、重鎖可変領域は、ＶＨ４＿４－５９生殖系由来配列の１つ、２つ、３つまたは４つ全てのフレームワーク領域を含む。一実施形態において、重鎖可変領域は、改変（例えば置換、例えば、配列番号５８のマウス重鎖可変領域内の対応する位置において見出される１つまたは複数のアミノ酸の置換、例えば、７１、７３および７８位の１つまたは複数における置換）を有する。一実施形態において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインは、本明細書で（例えば表２で）説明される軽鎖可変領域、および／または本明細書で（例えば表２で）説明される重鎖可変領域を含む。一実施形態において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインは、表２のアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むｓｃＦｖである。ある実施形態において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、表２において提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列もしくは表２のアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２もしくは３個の改変（例えば、置換）であるが３０、２０もしくは１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／または表２において提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列もしくは表２のアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２もしくは３個の改変（例えば、置換）であるが３０、２０もしくは１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群より選択される配列、またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインはｓｃＦｖであり、本明細書で、例えば表２で説明されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、リンカー、例えば本明細書で説明されるリンカーを介して、本明細書で、例えば表２で説明されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に付着している。一実施形態において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインは、（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）ｎリンカーを包含し、ここでｎは、１、２、３、４、５または６、例えば３または４（配列番号５３）である。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、以下の配置：軽鎖可変領域－リンカー－重鎖可変領域または重鎖可変領域－リンカー－軽鎖可変領域のいずれであってもよい。
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、表４および５のコンストラクト、例えば、マウス＿ＣＡＲＴ１９、ヒト化＿ＣＡＲＴ１９ａ、ヒト化＿ＣＡＲＴ１９ｂまたはヒト化＿ＣＡＲＴ１９ｃの、１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つ）の、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、ＬＣ ＣＤＲ３、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を包含する、抗ＣＤ１９結合ドメインを含む。
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、リーダー配列、例えば本明細書で説明されるリーダー配列、例えば、配列番号１３の、またはそれと９５～９９％同一性を有する、リーダー配列；本明細書で説明される抗ＣＤ１９結合ドメイン、例えば、本明細書で説明されるＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、ＬＣ ＣＤＲ３、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を含む抗ＣＤ１９結合ドメイン、例えば、表３に記載のマウス抗ＣＤ１９結合ドメイン、表２に記載のヒト化抗ＣＤ１９結合ドメイン、またはそれらと９５～９９％の同一性を有する配列；ヒンジ領域、例えば本明細書で説明されるヒンジ領域、例えば、配列番号１４の、またはそれと９５～９９％の同一性を有する、ヒンジ領域；膜貫通ドメイン、例えば本明細書で説明される膜貫通ドメイン、例えば、配列番号１５の配列またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列を有する、膜貫通ドメイン；細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む、細胞内シグナル伝達ドメイン）を含む。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン、例えば本明細書で説明される共刺激ドメイン、例えば、配列番号１６もしくは配列番号５１の配列、またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列を有する、４－１ＢＢ共刺激ドメイン；および／あるいは一次シグナル伝達ドメイン、例えば本明細書で説明される一次シグナル伝達ドメイン、例えば、配列番号１７もしくは配列番号４３の配列、またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列を有する、ＣＤ３ゼータ刺激ドメインを含む。
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、配列番号５８、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１または配列番号４２のアミノ酸配列、または配列番号５８、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１または配列番号４２のアミノ酸配列の、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、１５、２０もしくは３０個の改変（例えば、置換）であるが６０、５０もしくは４０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、または配列番号５８、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１または配列番号４２のアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む（例えば、からなる）。
本発明は、一般に、一部の態様において、表面抗原分類１９タンパク質（ＣＤ１９）の発現に関連する疾患を処置するために、１つまたは複数のＢ細胞阻害剤と組み合わせての、ＣＡＲを発現するように加工された細胞、例えばＴ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を使用することに関する。一部の実施形態において、Ｂ細胞阻害剤は、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａの１つまたは複数の阻害剤である。
一部の実施形態において、ＣＤ１９阻害剤は、抗体分子、例えば、本明細書で説明されるようなＣＤ１９結合配列を有する抗体分子を含む。例えば、抗体分子は、表２、３、４および５のいずれかに記載のＣＤＲもしくはＶＨおよびＶＬ、またはそれらとの相同性を有する、例えばそれらと９５～９９％の同一性を有する配列を含んでいてもよい。抗体分子は、このセクションにおいて例えばＣＡＲに関連して説明される配列を有するＣＤ１９結合領域を含んでいてもよい。
実施形態において、Ｂ細胞阻害剤は、１つまたは複数のＢ細胞抗原、例えば、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａの１つまたは複数と結合する、阻害核酸、可溶性リガンド、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、ＣＡＲまたはＣＡＲ発現細胞から選ばれる。
ＣＤ２０結合ドメインおよび阻害剤
一部の態様において、本開示は、ＣＤ２０阻害剤または結合ドメイン、例えば、本明細書で説明されるようなＣＤ２０阻害剤または結合ドメインを提供する。本開示は、ＣＤ２０結合ドメインをコードする、例えば、ＣＤ２０結合ドメインを含むＣＡＲをコードする核酸も提供する。組成物は、第二の薬剤、例えば、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞またはＣＤ１９結合ドメインも含むことがある。薬剤は、例えば、単一の核酸によってコードされていてもよく、または異なる核酸によってコードされていてもよい。
一部の態様において、ＣＤ２０阻害剤または結合ドメインは、単剤療法として投与される。一部の態様において、ＣＤ２０阻害剤または結合ドメインは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞などの第二の薬剤と組み合わせて投与される。
ＣＤ２０阻害剤は、例えば、小分子、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、ＣＡＲまたはＣＡＲ発現細胞であってもよい。一実施形態において、ＣＤ２０阻害剤は、抗ＣＤ２０抗体またはそのフラグメントである。ある実施形態において、抗体は、単一特異性抗体であり、別の実施形態において、抗体は、二重特異性抗体である。ある実施形態において、ＣＤ２０阻害剤は、キメラマウス／ヒトモノクローナル抗体、例えばリツキシマブである。ある実施形態において、ＣＤ２０阻害剤は、オファツムマブなどのヒトモノクローナル抗体である。ある実施形態において、ＣＤ２０阻害剤は、オクレリズマブ、ベルツズマブ、オビヌツズマブ、オカラツズマブ、またはＰＲＯ１３１９２１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）などの、ヒト化抗体である。ある実施形態において、ＣＤ２０阻害剤は、ＴＲＵ－０１５（Ｔｒｕｂｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）などの、抗ＣＤ２０抗体の一部を含む融合タンパク質である。
一実施形態において、ＣＤ２０阻害剤は、抗ＣＤ２０発現細胞、例えば、ＣＤ２０ ＣＡＲＴまたはＣＤ２０発現ＮＫ細胞である。
一部の実施形態において、ＣＤ２０－ＣＡＲは、任意のリーダー配列（例えば、本明細書で説明される任意のリーダー配列）、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ（例えば、本明細書で説明されるヒンジ）、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書で説明される膜貫通ドメイン）、および細胞内刺激ドメイン（例えば、本明細書で説明される細胞内刺激ドメイン）を含む。一実施形態において、典型的なＣＤ２０ ＣＡＲコンストラクトは、任意のリーダー配列（例えば、本明細書で説明されるリーダー配列）、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメイン（例えば、本明細書で説明される細胞内共刺激ドメイン）および細胞内刺激ドメインを含む。
一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、本明細書で説明されるＣＤ２０結合ドメインの、１つもしくは複数（例えば、３つ全て）の、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）、ならびに／または本明細書で説明されるＣＤ２０結合ドメインの、１つもしくは複数（例えば、３つ全て）の、重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含み、例えば、１つまたは複数、例えば３つ全て、のＬＣ ＣＤＲおよび１つまたは複数、例えば３つ全て、のＨＣ ＣＤＲを含むＣＤ２０結合ドメインを含む。これらのＣＤＲは、例えば、表１２Ａ、１２Ｂ、および／または表１３のものであってもよい。一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、本明細書で説明されるＣＤ２０結合ドメインの、１つまたは複数（例えば、３つ全て）の、重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含み、例えば、ＣＤ２０結合ドメインは、本明細書で説明されるＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を各々が含む２つの可変重鎖領域を有する。一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、本明細書で（例えば、表１５Ａもしくは１５Ｂで）説明される軽鎖可変領域、および／または本明細書で（例えば、表１４Ａもしくは１４Ｂで）説明される重鎖可変領域を含む。一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、本明細書で（例えば、表１４Ａもしくは１４Ｂで）説明される重鎖可変領域、例えば、本明細書で（例えば、表１４Ａもしくは１４Ｂで）説明される少なくとも２つの重鎖可変領域を含む。一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、表１４Ａまたは１４Ｂまたは１５Ａまたは１５Ｂのアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むｓｃＦｖである。ある実施形態において、ＣＤ２０結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、表１５Ａもしくは１５Ｂにおいて提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列または表１５Ａもしくは１５Ｂのアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２または３個の改変（例えば、置換）であるが３０、２０または１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／あるいは表１４Ａもしくは１４Ｂにおいて提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列または表１４Ａもしくは１４Ｂのアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２または３個の改変（例えば、置換）であるが３０、２０または１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。ＣＤ２０結合ドメインは、例えば、抗体分子またはＣＡＲ分子の一部であってもよい。
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、表１２Ａ、１２Ｂおよび／または１３のコンストラクト、例えば、ＣＡＲ２０－１、ＣＡＲ２０－２、ＣＡＲ２０－３、ＣＡＲ２０－４、ＣＡＲ２０－５、ＣＡＲ２０－６、ＣＡＲ２０－７、ＣＡＲ２０－８、ＣＡＲ２０－９、ＣＡＲ２０－１０、ＣＡＲ２０－１１、ＣＡＲ２０－１２、ＣＡＲ２０－１３、ＣＡＲ２０－１４、ＣＡＲ２０－１５、またはＣＡＲ２０－１６の、１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つ）の、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、ＬＣ ＣＤＲ３、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を包含する、抗ＣＤ２０結合ドメインを含む。
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、表１４Ａまたは１４Ｂおよび１５Ａまたは１５Ｂのコンストラクト、例えば、ＣＡＲ２０－１、ＣＡＲ２０－２、ＣＡＲ２０－３、ＣＡＲ２０－４、ＣＡＲ２０－５、ＣＡＲ２０－６、ＣＡＲ２０－７、ＣＡＲ２０－８、ＣＡＲ２０－９、ＣＡＲ２０－１０、ＣＡＲ２０－１１、ＣＡＲ２０－１２、ＣＡＲ２０－１３、ＣＡＲ２０－１４、ＣＡＲ２０－１５、またはＣＡＲ２０－１６の、ＶＬおよび／またはＶＨを包含する、抗ＣＤ２２結合ドメインを含む。
ＣＤ２０ ｓｃＦｖの前に、配列番号１３で提供されるもののような任意のリーダー配列、それに続いて、配列番号１４または配列番号４５または配列番号４７または配列番号４９で提供されるもののような任意のヒンジ配列、配列番号１５で提供されるもののような膜貫通領域、配列番号１６または配列番号５１を包含する細胞内シグナル伝達ドメイン、および配列番号１７または配列番号４３を包含するＣＤ３ゼータ配列が存在していてもよく、例えば、前記ドメインは連続しており同じリーディングフレーム内にあり、単一の融合タンパク質を形成する。
さらなる実施形態は、表１１Ａ～１５Ｂのいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する。さらなる実施形態は、表１１Ａ～１５Ｂのいずれかのポリペプチドならびに配列番号１３、１４、１５、１６、１７および適宜５１のドメインの各々をコードする、ヌクレオチド配列を包含する。
一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、抗体または抗体フラグメントの特定の機能的な特徴または特性を特徴とする。例えば、一実施形態において、抗原結合ドメインを含む本発明のＣＡＲ組成物の一部は、ヒトＣＤ２０またはそのフラグメントに特異的に結合する。
一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、フラグメント、例えば、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、または二重機能性（例えば、二重特異的）ハイブリッド抗体［例えば、Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)］である。一態様において、本発明の抗体およびそれらのフラグメントは、野生型の、または増強された親和性でＣＤ２０タンパク質またはそのフラグメントに結合する。いくつかの場合において、ヒトｓｃＦｖは、ディスプレイライブラリーに由来し得る。
一実施形態において、突然変異したｓｃＦｖによってＣＡＲＴ２０コンストラクトに安定性の向上が付与されるように、ＣＤ２０結合ドメイン、例えばｓｃＦｖは、少なくとも１つの突然変異を含む。別の実施形態において、突然変異したｓｃＦｖによってＣＡＲＴ２０コンストラクトに安定性の向上が付与されるように、ＣＤ２０Ａ結合ドメイン、例えばｓｃＦｖは、例えばヒト化プロセスから生じる少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の突然変異を含む。
一部の実施形態において、ＣＤ２０阻害剤は、抗体分子、例えば、本明細書で説明されるようなＣＤ２０結合配列を有する抗体分子を含む。例えば、抗体分子は、表１１Ａ～１５Ｂのいずれかに記載のＣＤＲもしくはＶＨおよびＶＬ、またはそれらとの相同性を有する、例えばそれらと９５～９９％の同一性を有する配列を含んでいてもよい。抗体分子は、このセクションにおいて例えばＣＡＲに関連して説明される配列を有するＣＤ２０結合領域を含んでいてもよい。
一態様において、本開示は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞とＣＤ２０ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞、の集団を提供する。例えば、一実施形態において、ＣＡＲＴ細胞の集団は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する第一の細胞、およびＣＤ２０ ＣＡＲを発現する第二の細胞を包含し得る。
一部の態様において、本明細書で説明される結合ドメインまたは抗体分子は、ＣＤ２０に対する第二の抗体分子と同じ（または実質的に同じ）またはオーバーラップしている（または実質的にオーバーラップしている）エピトープに結合し、前記第二の抗体分子は、本明細書で説明される抗体分子、例えば、表１１Ａ～１５Ｂから選ばれる抗体分子である。一部の実施形態において、本明細書で説明される結合ドメインまたは抗体分子は、ＣＤ２０に対する第二の抗体分子と、同じ（または実質的に同じ）またはオーバーラップしている（または実質的にオーバーラップしている）エピトープへの結合について競合し、および／またはそのようなエピトープに結合し、前記第二の抗体分子は、本明細書で説明される抗体分子、例えば、表１１Ａ～１５Ｂから選ばれる抗体分子、例えば、実施例２５で説明される方法によって決定されるような抗体分子である。一部の実施形態において、バイパラトピック（biparatopic）ＣＤ２０結合ドメインは、第一のエピトープ、例えば、表１１Ａ～１５Ｂから選ばれる抗体分子によって結合されるエピトープに結合し、前記バイパラトピック結合ドメインは、第二のエピトープ、例えば、表１１Ａ～１５Ｂから選ばれる抗体分子によって結合される第二のエピトープにも結合する。一部の態様において、本開示は、第一のエピトープ、例えば、表１１Ａ～１５Ｂから選ばれる抗体分子によって結合されるエピトープに結合する第一のＣＤ２０結合ドメイン、および第二のエピトープ、例えば、表１１Ａ～１５Ｂから選ばれる抗体分子によって結合される第二のエピトープに結合する第二のＣＤ２０結合ドメインを投与することを含む処置の方法を提供する。一部の実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、例えばＣＡＲ発現細胞によって発現される、ＣＡＲ分子の一部である。
ＣＤ２２結合ドメインおよび阻害剤
一部の態様において、本開示は、ＣＤ２２阻害剤または結合ドメイン、例えば、本明細書で説明されるようなＣＤ２２阻害剤または結合ドメインを提供する。本開示は、ＣＤ２２結合ドメインをコードする、例えば、ＣＤ２２結合ドメインを含むＣＡＲをコードする核酸も提供する。組成物はまた、第二の薬剤、例えば、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞またはＣＤ１９結合ドメインを含んでいてもよい。薬剤は、例えば、単一の核酸によってコードされていてもよく、または異なる核酸によってコードされていてもよい。
一部の態様において、ＣＤ２２阻害剤または結合ドメインは、単剤療法として投与される。一部の態様において、ＣＤ２２阻害剤または結合ドメインは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞などの第二の薬剤と組み合わせて投与される。
ＣＤ２２阻害剤は、例えば、小分子、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、ＣＡＲまたはＣＡＲ発現細胞であってもよい。一実施形態において、ＣＤ２２阻害剤は、抗ＣＤ２２抗体またはそのフラグメントである。ある実施形態において、抗体は、単一特異性抗体であり、別の実施形態において、抗体は、二重特異性抗体である。ある実施形態において、抗体は、化学療法剤などの第二の薬剤にコンジュゲートしていてもよい、単一特異性抗体である。例えば、ある実施形態において、抗体は、抗ＣＤ２２モノクローナル抗体－ＭＭＡＥコンジュゲート（例えば、ＤＣＤＴ２９８０Ｓ）である。ある実施形態において、抗体は、抗ＣＤ２２抗体のｓｃＦｖ、例えば、抗体ＲＦＢ４のｓｃＦｖである。このｓｃＦｖは、緑膿菌外毒素－Ａ（例えば、ＢＬ２２）の全てまたはフラグメントに融合していてもよい。ある実施形態において、抗体は、ヒト化抗ＣＤ２２モノクローナル抗体（例えば、エプラツズマブ）である。ある実施形態において、抗体またはそのフラグメントは、緑膿菌外毒素－Ａ（例えば、モキセツモマブパスドトクス（moxetumomab pasudotox））の全てまたはフラグメント（もしくは３８ｋＤａフラグメント）に共有結合で融合していてもよい、抗ＣＤ２２抗体のＦｖ部分を含む。ある実施形態において、抗ＣＤ２２抗体は、毒素にコンジュゲートしていてもよい、抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性抗体である。例えば、一実施形態において、抗ＣＤ２２抗体は、ジフテリア毒素（ＤＴ）の全てまたは一部に、例えば、ジフテリア毒素（ＤＴ）、ＤＴ ３９０、例えば、リガンド指向型毒素、例えばＤＴ２２１９ＡＲＬ、の最初の３８９アミノ酸に連結されていてもよい、抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性部分（例えば、ヒトＣＤ１９およびＣＤ２２を認識する、２つのｓｃＦｖリガンド）を含む。別の実施形態において、二重特異性部分（例えば、抗ＣＤ１９／抗ＣＤ２２）は、脱グリコシル化リシンＡ鎖（例えば、Ｃｏｍｂｏｔｏｘ）などの毒素に連結されている。
一実施形態において、ＣＤ２２阻害剤は、抗ＣＤ２２発現細胞、例えば、ＣＤ２２ ＣＡＲＴまたはＣＤ２２発現ＮＫ細胞である。
一態様において、本開示は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞とＣＤ２２ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む、ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞、の集団を提供する。例えば、一実施形態において、ＣＡＲＴ細胞の集団は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する第一の細胞、およびＣＤ２２ ＣＡＲを発現する第二の細胞を包含し得る。別の例として、ＣＡＲ Ｔ細胞の集団は、１つより多くの、例えば２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ以上のＣＡＲ、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ２２ ＣＡＲを発現する、単一の集団を包含し得る。
一部の実施形態において、ＣＤ２２－ＣＡＲは、任意のリーダー配列（例えば、本明細書で説明される任意のリーダー配列）、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ（例えば、本明細書で説明されるヒンジ）、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書で説明される膜貫通ドメイン）、および細胞内刺激ドメイン（例えば、本明細書で説明される細胞内刺激ドメイン）を含む。一実施形態において、典型的なＣＤ２２ ＣＡＲコンストラクトは、任意のリーダー配列（例えば、本明細書で説明されるリーダー配列）、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメイン（例えば、本明細書で説明される細胞内共刺激ドメイン）および細胞内刺激ドメインを含む。
一実施形態において、ＣＤ２２結合ドメインは、本明細書で説明されるＣＤ２２結合ドメインの、１つもしくは複数（例えば、３つ全て）の、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）、ならびに／または本明細書で説明されるＣＤ２２結合ドメインの、１つもしくは複数（例えば、３つ全て）の、重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含み、例えば、１つまたは複数、例えば３つ全て、のＬＣ ＣＤＲおよび１つまたは複数、例えば３つ全て、のＨＣ ＣＤＲを含むＣＤ２２結合ドメインを含む。これらのＣＤＲは、例えば、表７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８Ａ、および／または表８Ｂの１つまたは複数のＣＤＲであってもよい。一実施形態において、ＣＤ２２結合ドメインは、本明細書で説明されるＣＤ２２結合ドメインの、１つまたは複数（例えば、３つ全て）の、重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含み、例えば、ＣＤ２２結合ドメインは、本明細書で説明されるＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を各々が含む２つの可変重鎖領域を有する。一実施形態において、ＣＤ２２結合ドメインは、本明細書で（例えば、表１０Ａもしくは１０Ｂで）説明される軽鎖可変領域、および／または本明細書で（例えば、表９Ａもしくは９Ｂで）説明される重鎖可変領域を含む。一実施形態において、ＣＤ２２結合ドメインは、本明細書で（例えば、表９Ａもしくは９Ｂで）説明される重鎖可変領域、例えば、本明細書で（例えば、表９Ａもしくは９Ｂで）説明される少なくとも２つの重鎖可変領域を含む。一実施形態において、ＣＤ２２結合ドメインは、表９Ａまたは９Ｂおよび１０Ａまたは１０Ｂのアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むｓｃＦｖである。ある実施形態において、ＣＤ２２結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、表１０Ａもしくは１０Ｂにおいて提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列または表１０Ａもしくは１０Ｂのアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２または３個の改変（例えば、置換）であるが３０、２０または１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／あるいは表９Ａもしくは９Ｂにおいて提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列または表９Ａもしくは９Ｂのアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２または３個の改変（例えば、置換）であるが３０、２０または１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。ＣＤ２２結合ドメインは、例えば、抗体分子またはＣＡＲ分子の一部であってもよい。
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、表７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８Ａ、および／または８Ｂのコンストラクト、例えば、ｍ９７１、ＣＡＲ２２－１、ＣＡＲ２２－２、ＣＡＲ２２－３、ＣＡＲ２２－４、ＣＡＲ２２－５、ＣＡＲ２２－６、ＣＡＲ２２－７、ＣＡＲ２２－８、ＣＡＲ２２－９、ＣＡＲ２２－１０、ＣＡＲ２２－１１、ＣＡＲ２２－１２、ＣＡＲ２２－１３、ＣＡＲ２２－１４、ＣＡＲ２２－１５、ＣＡＲ２２－１６、ＣＡＲ２２－１７、ＣＡＲ２２－１８、ＣＡＲ２２－１９、ＣＡＲ２２－２０、ＣＡＲ２２－２１、ＣＡＲ２２－２２、ＣＡＲ２２－２３、ＣＡＲ２２－２４、ＣＡＲ２２－２５、ＣＡＲ２２－２６、ＣＡＲ２２－２７、ＣＡＲ２２－２８、ＣＡＲ２２－２９、ＣＡＲ２２－３０、ＣＡＲ２２－３１、ＣＡＲ２２－３２、ＣＡＲ２２－３３、ＣＡＲ２２－３４、ＣＡＲ２２－３５、ＣＡＲ２２－３６、ＣＡＲ２２－３７、またはＣＡＲ２２－３８の、１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つ）の、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、ＬＣ ＣＤＲ３、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を包含する、抗ＣＤ２２結合ドメインを含む。
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、表９Ａ、９Ｂ、１０Ａおよび／または１０Ｂのコンストラクト、例えば、ｍ９７１、ＣＡＲ２２－１、ＣＡＲ２２－２、ＣＡＲ２２－３、ＣＡＲ２２－４、ＣＡＲ２２－５、ＣＡＲ２２－６、ＣＡＲ２２－７、ＣＡＲ２２－８、ＣＡＲ２２－９、ＣＡＲ２２－１０、ＣＡＲ２２－１１、ＣＡＲ２２－１２、ＣＡＲ２２－１３、ＣＡＲ２２－１４、ＣＡＲ２２－１５、ＣＡＲ２２－１６、ＣＡＲ２２－１７、ＣＡＲ２２－１８、ＣＡＲ２２－１９、ＣＡＲ２２－２０、ＣＡＲ２２－２１、ＣＡＲ２２－２２、ＣＡＲ２２－２３、ＣＡＲ２２－２４、ＣＡＲ２２－２５、ＣＡＲ２２－２６、ＣＡＲ２２－２７、ＣＡＲ２２－２８、ＣＡＲ２２－２９、ＣＡＲ２２－３０、ＣＡＲ２２－３１、ＣＡＲ２２－３２、ＣＡＲ２２－３３、ＣＡＲ２２－３４、ＣＡＲ２２－３５、ＣＡＲ２２－３６、ＣＡＲ２２－３７、またはＣＡＲ２２－３８、またはそれらと９５～９９％の同一性を有する配列の、ＶＬおよび／またはＶＨを包含する、抗ＣＤ２２結合ドメインを含む。
ｓｃＦｖの前に、配列番号１３で提供されるもののような任意のリーダー配列、それに続いて、配列番号１４または配列番号４５または配列番号４７または配列番号４９で提供されるもののような任意のヒンジ配列、配列番号１５で提供されるもののような膜貫通領域、配列番号１６または配列番号５１を包含する細胞内シグナル伝達ドメイン、および配列番号１７または配列番号４３を包含するＣＤ３ゼータ配列が存在していてもよく、例えば、前記ドメインは連続しており同じリーディングフレーム内にあり、単一の融合タンパク質を形成する。
さらなる実施形態は、表６Ａ～１０Ｂのいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する。さらなる実施形態は、表６Ａ～１０Ｂのいずれかのポリペプチドならびに配列番号１３、１４、１５、１６、１７および適宜５１のドメインの各々をコードする、ヌクレオチド配列を包含する。
一実施形態において、ＣＤ２２結合ドメインは、抗体または抗体フラグメントの特定の機能的な特徴または特性を特徴とする。例えば、一実施形態において、抗原結合ドメインを含む本発明のＣＡＲ組成物の一部は、ヒトＣＤ２２またはそのフラグメントに特異的に結合する。
一実施形態において、ＣＤ２２結合ドメインは、フラグメント、例えば、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。一実施形態において、ＣＤ２２結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、または二重機能性（例えば、二重特異的）ハイブリッド抗体［例えば、Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)］である。一態様において、本発明の抗体およびそれらのフラグメントは、野生型の、または増強された親和性でＣＤ２２タンパク質またはそのフラグメントに結合する。いくつかの場合において、ヒトｓｃＦｖは、ディスプレイライブラリーに由来し得る。
一実施形態において、突然変異したｓｃＦｖによってＣＡＲＴ２２コンストラクトに安定性の向上が付与されるように、ＣＤ２２結合ドメイン、例えばｓｃＦｖは、少なくとも１つの突然変異を含む。別の実施形態において、突然変異したｓｃＦｖによってＣＡＲＴ２２コンストラクトに安定性の向上が付与されるように、ＣＤ２２結合ドメイン、例えばｓｃＦｖは、例えばヒト化プロセスから生じる少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の突然変異を含む。
一部の実施形態において、ＣＤ２２阻害剤は、抗体分子、例えば、本明細書で説明されるようなＣＤ２２結合配列を有する抗体分子を含む。例えば、抗体分子は、表６Ａ～１０Ｂのいずれかに記載のＣＤＲもしくはＶＨおよびＶＬ、またはそれらとの相同性を有する、例えばそれらと９５～９９％の同一性を有する配列を含んでいてもよい。抗体分子は、このセクションにおいて例えばＣＡＲに関連して説明される配列を有するＣＤ２２結合領域を含んでいてもよい。
一実施形態において、本開示は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞とＣＤ２２ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞、の集団を提供する。例えば、一実施形態において、ＣＡＲＴ細胞の集団は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する第一の細胞、およびＣＤ２２ ＣＡＲを発現する第二の細胞を包含し得る。
一部の態様において、本明細書で説明される結合ドメインまたは抗体分子は、ＣＤ２２に対する第二の抗体分子と同じ（または実質的に同じ）またはオーバーラップしている（または実質的にオーバーラップしている）エピトープに結合し、前記第二の抗体分子は、本明細書で説明される抗体分子、例えば、表６Ａ～１０Ｂから選ばれる抗体分子である。一部の実施形態において、本明細書で説明される結合ドメインまたは抗体分子は、ＣＤ２２に対する第二の抗体分子と、同じ（または実質的に同じ）またはオーバーラップしている（または実質的にオーバーラップしている）エピトープへの結合について競合し、および／またはそのようなエピトープに結合し、前記第二の抗体分子は、本明細書で説明される抗体分子、例えば、表６Ａ～１０Ｂから選ばれる抗体分子、例えば、実施例２５で説明される方法によって決定されるような抗体分子である。一部の実施形態において、バイパラトピックＣＤ２２結合ドメインは、第一のエピトープ、例えば、表６Ａ～１０Ｂから選ばれる抗体分子によって結合されるエピトープに結合し、前記バイパラトピック結合ドメインは、第二のエピトープ、例えば、表６Ａ～１０Ｂから選ばれる抗体分子によって結合される第二のエピトープにも結合する。一部の態様において、本開示は、第一のエピトープ、例えば、表６Ａ～１０Ｂから選ばれる抗体分子によって結合されるエピトープに結合する第一のＣＤ２２結合ドメイン、および第二のエピトープ、例えば、表６Ａ～１０Ｂから選ばれる抗体分子によって結合される第二のエピトープに結合する第二のＣＤ２２結合ドメインを投与することを含む処置の方法を提供する。一部の実施形態において、ＣＤ２２結合ドメインは、例えばＣＡＲ発現細胞によって発現される、ＣＡＲ分子の一部である。
一部の実施形態において、ＣＤ２２結合ドメインは、ＣＤ２２のＩｇ様ドメイン１、２、３、４、５、６または７の１つまたは複数と結合する。一部の実施形態において、ＣＤ２２結合ドメインは、ドメイン１および２と結合するか、ドメイン３および４と結合するか、またはドメイン５、６および７と結合する。
一部の態様において、本開示は、ＣＤ１９陰性のがん、例えば白血病、例えばＡＬＬ、例えばＢ－ＡＬＬを処置する方法であって、ＣＤ２２阻害剤、例えば本明細書で説明されるＣＤ２２結合ドメインまたはＣＤ２２ ＣＡＲ発現細胞、を投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、がんがＣＤ１９陰性であるかどうかを判定する工程を含む。一部の態様において、対象は、ＣＤ１９阻害剤、例えばＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞を受けたことがあり、ＣＤ１９阻害剤に対して耐性であるか、再発するか、またはＣＤ１９阻害剤が無効である。
ＲＯＲ１阻害剤
ＲＯＲ１阻害剤は、例えば、小分子、抗体、またはそのフラグメントであってもよい。一実施形態において、ＲＯＲ１阻害剤は、抗ＲＯＲ１抗体またはそのフラグメントである。一実施形態において、抗ＲＯＲ１抗体またはそのフラグメントは、モノクローナル抗体、例えばシルムツズマブ（cirmtuzumab）である。
一実施形態において、ＲＯＲ１阻害剤は、抗ＲＯＲ１発現細胞、例えば、ＲＯＲ１ ＣＡＲＴまたはＲＯＲ１発現ＮＫ細胞である。
一部の実施形態において、ＲＯＲ１－ＣＡＲは、任意のリーダー配列（例えば、本明細書で説明される任意のリーダー配列）、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ（例えば、本明細書で説明されるヒンジ）、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書で説明される膜貫通ドメイン）、および細胞内刺激ドメイン（例えば、本明細書で説明される細胞内刺激ドメイン）を含む。一実施形態において、典型的なＲＯＲ１ ＣＡＲコンストラクトは、任意のリーダー配列（例えば、本明細書で説明されるリーダー配列）、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメイン（例えば、本明細書で説明される細胞内共刺激ドメイン）および細胞内刺激ドメインを含む。
一実施形態において、ＲＯＲ１結合ドメインは、ｓｃＦｖ部分、例えばヒトｓｃＦｖ部分を含む。ｓｃＦｖの前に、配列番号１３で提供されるもののような任意のリーダー配列、それに続いて、配列番号１４または配列番号４５または配列番号４７または配列番号４９で提供されるもののような任意のヒンジ配列、配列番号１５で提供されるもののような膜貫通領域、配列番号１６または配列番号５１を包含する細胞内シグナル伝達ドメイン、および配列番号１７または配列番号４３を包含するＣＤ３ゼータ配列が存在していてもよく、例えば、これらのドメインは連続しており同じリーディングフレーム内にあり、単一の融合タンパク質を形成する。
一部の態様において、本開示は、ＲＯＲ１ ＣＡＲをコードする核酸分子を含む組換え核酸コンストラクトを包含し、前記核酸分子は、ＲＯＲ１結合ドメイン、例えば、本明細書で説明される、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と連続しておりそれと同じリーディングフレーム内にあるＲＯＲ１結合ドメイン、をコードする核酸配列を含む。ＣＡＲにおいて使用することができる典型的な細胞内シグナル伝達ドメインとしては、例えば、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、および同種のものの１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合において、ＣＡＲは、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ２８、４－１ＢＢおよび同種のもののあらゆる組合せを含んでいてもよい。
一実施形態において、ＲＯＲ１結合ドメインは、抗体または抗体フラグメントの特定の機能的な特徴または特性を特徴とする。例えば、一実施形態において、抗原結合ドメインを含む本発明のＣＡＲ組成物の一部は、ヒトＲＯＲ１またはそのフラグメントに特異的に結合する。ある特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、リーダー配列と連続しており同じリーディングフレーム内にある。一態様において、リーダー配列は、配列番号１３として提供されるポリペプチド配列である。
一実施形態において、ＲＯＲ１結合ドメインは、フラグメント、例えば、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。一実施形態において、ＲＯＲ１結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、または二重機能性（例えば、二重特異的）ハイブリッド抗体［例えば、Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)］である。一態様において、本発明の抗体およびそれらのフラグメントは、野生型の、または強化された親和性でＲＯＲ１タンパク質またはそのフラグメントに結合する。いくつかの場合において、ヒトｓｃＦｖは、ディスプレイライブラリーに由来し得る。
一実施形態において、突然変異したｓｃＦｖによってＲＯＲ１ ＣＡＲＴコンストラクトに安定性の向上が付与されるように、ＲＯＲ１結合ドメイン、例えばｓｃＦｖは、少なくとも１つの突然変異を含む。別の実施形態において、突然変異したｓｃＦｖによってＲＯＲ１ ＣＡＲＴコンストラクトに安定性の向上が付与されるように、ＲＯＲ１結合ドメイン、例えばｓｃＦｖは、ヒト化プロセスから生じる少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の突然変異を含む。
一実施形態において、本開示は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞とＲＯＲ１ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞、の集団を提供する。例えば、一実施形態において、ＣＡＲＴ細胞の集団は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する第一の細胞、およびＲＯＲ１ ＣＡＲを発現する第二の細胞を包含し得る。
ＣＤ１２３阻害剤
ＣＤ１２３阻害剤は、例えば、小分子、抗体もしくはそのフラグメント（例えば、単一特異性もしくは二重特異性抗体、またはそのフラグメント）；ＣＤ１２３と結合する組換えタンパク質、例えば融合タンパク質；阻害核酸；またはＣＤ１２３ ＣＡＲを発現する細胞、例えばＣＤ１２３ ＣＡＲＴであってもよい。
一実施形態において、ＣＤ１２３阻害剤は、例えばＣＤ１２３受容体の天然リガンド（またはフラグメント）、例えばＳＬ－４０１［ＤＴ３８８ＩＬ３とも呼ばれる；テキサス大学サウスウエスタンメディカルセンター（University of Texas Southwestern Medical Center）］を含む、組換えタンパク質である。
別の実施形態において、ＣＤ１２３阻害剤は、抗ＣＤ１２３抗体またはそのフラグメント、例えば、モノクローナル抗体（例えば、単一特異性もしくは二重特異性抗体、またはそのフラグメント）、例えばＣＳＬ３６０（ＣＳＬ Ｌｉｍｉｔｅｄ）、ＣＳＬ ３６２（ＣＳＬ Ｌｉｍｉｔｅｄ）またはＭＧＤ００６（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）である。
一実施形態において、ＣＤ１２３阻害剤は、抗ＣＤ１２３ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＤ１２３ ＣＡＲＴまたはＣＤ１２３ ＣＡＲ発現ＮＫ細胞である。
一部の実施形態において、ＣＤ１２３－ＣＡＲは、任意のリーダー配列（例えば、本明細書で説明される任意のリーダー配列）、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ（例えば、本明細書で説明されるヒンジ）、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書で説明される膜貫通ドメイン）、および細胞内刺激ドメイン（例えば、本明細書で説明される細胞内刺激ドメイン）を含む。一実施形態において、典型的なＣＤ１２３ ＣＡＲコンストラクトは、任意のリーダー配列（例えば、本明細書で説明されるリーダー配列）、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメイン（例えば、本明細書で説明される細胞内共刺激ドメイン）および細胞内刺激ドメインを含む。
一実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、本明細書で説明されるＣＤ２０結合ドメインの、１つもしくは複数（例えば、３つ全て）の、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）、ならびに／または本明細書で説明されるＣＤ１２３結合ドメインの、１つもしくは複数（例えば、３つ全て）の、重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含み、例えば、１つまたは複数、例えば３つ全て、のＬＣ ＣＤＲおよび１つまたは複数、例えば３つ全て、のＨＣ ＣＤＲを含むＣＤ１２３結合ドメインを含む。これらのＣＤＲは、例えば、表１７、１８、２６または２７のいずれかのものであってもよい。一実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、本明細書で説明されるＣＤ１２３結合ドメインの、１つまたは複数（例えば、３つ全て）の、重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含み、例えば、ＣＤ１２３結合ドメインは、本明細書で説明されるＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を各々が含む２つの可変重鎖領域を有する。一実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、本明細書で説明される軽鎖可変領域、および／または本明細書で説明される重鎖可変領域を含む。一実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、本明細書で説明される重鎖可変領域、例えば、本明細書で説明される少なくとも２つの重鎖可変領域を含む。一実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、表１６または２５のアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むｓｃＦｖである。ある実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、表１６もしくは２５における軽鎖可変領域のアミノ酸配列または表１６もしくは２５における軽鎖可変領域と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２または３個の改変（例えば、置換）であるが３０、２０または１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／あるいは表１６もしくは２５における重鎖可変領域のアミノ酸配列または表１６もしくは２５における重鎖可変領域と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２または３個の改変（例えば、置換）であるが３０、２０または１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、表１７および１８のコンストラクト、例えば、ＣＡＲ１２３－１、ＣＡＲ１２３－２、ＣＡＲ１２３－３またはＣＡＲ１２３－４の、１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つ）の、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、ＬＣ ＣＤＲ３、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を包含する、抗ＣＤ１２３結合ドメインを含む。一実施形態において、ＣＡＲ分子は、表２６および２７のコンストラクト、例えばｈｚＣＡＲ１２３の、１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つ）の、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、ＬＣ ＣＤＲ３、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を包含する、抗ＣＤ１２３結合ドメインを含む。
ＣＤ１２３ ｓｃＦｖの前に、配列番号１３で提供されるもののような任意のリーダー配列、それに続いて、配列番号１４または配列番号４５または配列番号４７または配列番号４９で提供されるもののような任意のヒンジ配列、配列番号１５で提供されるもののような任意の膜貫通領域、配列番号１６または配列番号５１を包含する細胞内シグナル伝達ドメイン、および配列番号１７または配列番号４３を包含するＣＤ３ゼータ配列が存在していてもよく、例えば、前記ドメインは連続しており同じリーディングフレーム内にあり、単一の融合タンパク質を形成する。
さらなる実施形態は、表１６～２７のいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する。さらなる実施形態は、表１６～２７のいずれかのポリペプチドならびに配列番号１３、１４、１５、１６、１７および適宜５１のドメインの各々をコードする、ヌクレオチド配列を包含する。
一実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、抗体または抗体フラグメントの特定の機能的な特徴または特性を特徴とする。例えば、一実施形態において、抗原結合ドメインを含む本発明のＣＡＲ組成物の一部は、ヒトＣＤ１２３またはそのフラグメントに特異的に結合する。
一実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、フラグメント、例えば、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。一実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、または二重機能性（例えば、二重特異的）ハイブリッド抗体［例えば、Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)］である。一態様において、本発明の抗体およびそれらのフラグメントは、野生型の、または増強された親和性でＣＤ１２３タンパク質またはそのフラグメントに結合する。いくつかの場合において、ヒトｓｃＦｖは、ディスプレイライブラリーに由来し得る。
一実施形態において、突然変異したｓｃＦｖによってＣＡＲＴ１２３コンストラクトに安定性の向上が付与されるように、ＣＤ１２３結合ドメイン、例えばｓｃＦｖは、少なくとも１つの突然変異を含む。別の実施形態において、突然変異したｓｃＦｖによってＣＡＲＴ１２３コンストラクトに安定性の向上が付与されるように、ＣＤ１２３結合ドメイン、例えばｓｃＦｖは、例えばヒト化プロセスから生じる少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の突然変異を含む。
一部の実施形態において、ＣＤ１２３阻害剤は、抗体分子、例えば、本明細書で説明されるようなＣＤ１２３結合配列を有する抗体分子を含む。例えば、抗体分子は、表１６～２７のいずれかに記載のＣＤＲもしくはＶＨおよびＶＬ、またはそれらとの相同性を有する、例えばそれらと９５～９９％の同一性を有する配列を含んでいてもよい。抗体分子は、このセクションにおいて例えばＣＡＲに関連して説明される配列を有するＣＤ１２３結合領域を含んでいてもよい。
一実施形態において、本開示は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞とＣＤ１２３ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞、の集団を提供する。例えば、一実施形態において、ＣＡＲＴ細胞の集団は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する第一の細胞、およびＣＤ１２３ ＣＡＲを発現する第二の細胞を包含し得る。
ＣＤ１０阻害剤
ＣＤ１０阻害剤は、例えば、小分子、抗体もしくはそのフラグメント（例えば、単一特異性もしくは二重特異性抗体、またはそのフラグメント）；ＣＤ１０と結合する組換えタンパク質、例えば融合タンパク質；阻害核酸；またはＣＤ１０ ＣＡＲを発現する細胞、例えばＣＤ１０ ＣＡＲＴであってもよい。
ある実施形態において、ＣＤ１０阻害剤は、小分子、例えばサクビトリル（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、バルサルタン／サクビトリル（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、オマパトリラート（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＲＢ－１０１、ＵＫ－４１４，４９５（Ｐｆｉｚｅｒ）、またはそれらの薬学的に許容される塩もしくは誘導体を含む。
一実施形態において、ＣＤ１０阻害剤は、抗ＣＤ１０ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＤ１０ ＣＡＲＴ、またはＣＤ１０ ＣＡＲ発現ＮＫ細胞である。
一実施形態において、本開示は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞とＣＤ１０ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞、の集団を提供する。例えば、一実施形態において、ＣＡＲＴ細胞の集団は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する第一の細胞、およびＣＤ１０ ＣＡＲを発現する第二の細胞を包含し得る。
ＣＤ３４阻害剤
ＣＤ３４阻害剤は、例えば、小分子、抗体もしくはそのフラグメント（例えば、単一特異性もしくは二重特異性抗体、またはそのフラグメント）；ＣＤ３４と結合する組換えタンパク質、例えば融合タンパク質；阻害核酸；またはＣＤ３４ ＣＡＲを発現する細胞、例えばＣＤ３４ ＣＡＲＴであってもよい。
ある実施形態において、ＣＤ３４阻害剤は、ＣＤ３４を標的とするモノクローナル抗体もしくはそのフラグメント、または抗ＣＤ３４モノクローナル抗体もしくはそのフラグメントを含むイムノリポソームを含む。
一実施形態において、ＣＤ３４阻害剤は、抗ＣＤ３４ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＤ３４ ＣＡＲＴ、またはＣＤ３４ ＣＡＲ発現ＮＫ細胞である。
一実施形態において、本開示は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞とＣＤ３４ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞、の集団を提供する。例えば、一実施形態において、ＣＡＲＴ細胞の集団は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する第一の細胞、およびＣＤ３４ ＣＡＲを発現する第二の細胞を包含し得る。
ＦＬＴ－３阻害剤
ＦＬＴ－３阻害剤は、例えば、小分子、抗体もしくはそのフラグメント（例えば、単一特異性もしくは二重特異性抗体、またはそのフラグメント）；ＦＬＴ－３と結合する組換えタンパク質、例えば融合タンパク質；阻害核酸；またはＦＬＴ－３ ＣＡＲを発現する細胞、例えばＦＬＴ－３ ＣＡＲＴであってもよい。
一部の実施形態において、ＦＬＴ－３阻害剤は、小分子、例えば、キザルチニブ（Ａｍｂｉｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ミドスタウリン（Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ Ｄｒｅｓｄｅｎ）、ソラフェニブ（ＢａｙｅｒおよびＯｎｙｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、スニチニブ（Ｐｆｉｚｅｒ）、レスタウルチニブ（Ｃｅｐｈａｌｏｎ）、またはそれらの薬学的に許容される塩もしくは誘導体を含む。
一実施形態において、ＦＬＴ－３阻害剤は、抗ＦＬＴ－３ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＦＬＴ－３ ＣＡＲＴ、またはＦＬＴ－３ ＣＡＲ発現ＮＫ細胞である。
一実施形態において、本開示は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞とＦＬＴ－３ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞、の集団を提供する。例えば、一実施形態において、ＣＡＲＴ細胞の集団は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する第一の細胞、およびＦＬＴ－３ ＣＡＲを発現する第二の細胞を包含し得る。
ＣＤ７９ｂ阻害剤
ある特定の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ７９ｂ阻害剤とともに投与される。ＣＤ７９ｂ阻害剤は、例えば、小分子、抗体もしくはそのフラグメント（例えば、単一特異性もしくは二重特異性抗体、またはそのフラグメント）；ＣＤ７９ｂと結合する組換えタンパク質、例えば融合タンパク質；阻害核酸；またはＣＤ７９ｂ ＣＡＲを発現する細胞、例えば、ＣＤ７９ｂ ＣＡＲ発現Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞であってもよい。一実施形態において、ＣＤ７９ｂ阻害剤は、抗ＣＤ７９ｂ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＤ７９ｂ ＣＡＲＴ、またはＣＤ７９ｂ ＣＡＲ発現ＮＫ細胞である。典型的なＣＤ７９ｂ阻害剤は、以下でより詳細に説明される。
ある実施形態において、本開示は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞とＣＤ７９ｂ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞、の集団を提供する。例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する第一の細胞、およびＣＤ７９ｂ ＣＡＲを発現する第二の細胞を包含する。
ＣＤ１７９ｂ阻害剤
ある特定の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ１７９ｂ阻害剤とともに投与される。ＣＤ１７９ｂ阻害剤は、例えば、小分子、抗体もしくはそのフラグメント（例えば、単一特異性もしくは二重特異性抗体、またはそのフラグメント）；ＣＤ１７９ｂと結合する組換えタンパク質、例えば融合タンパク質；阻害核酸；またはＣＤ１７９ｂ ＣＡＲを発現する細胞、例えば、ＣＤ１７９ｂ ＣＡＲ発現Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞であってもよい。一実施形態において、ＣＤ７９ｂ阻害剤は、抗ＣＤ１７９ｂ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＤ１７９ｂ ＣＡＲＴ、またはＣＤ１７９ｂ ＣＡＲ発現ＮＫ細胞である。典型的なＣＤ１７９ｂ阻害剤は、以下でより詳細に説明される。
ある実施形態において、本開示は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞とＣＤ１７９ｂ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞、の集団を提供する。例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ２０ ＣＡＲを発現する第一の細胞、およびＣＤ１７９ｂ ＣＡＲを発現する第二の細胞を包含する。
ＣＤ７９ａ阻害剤
ある特定の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ７９ａ阻害剤とともに投与される。ＣＤ７９ａ阻害剤は、例えば、小分子、抗体もしくはそのフラグメント（例えば、単一特異性もしくは二重特異性抗体、またはそのフラグメント）；ＣＤ７９ａと結合する組換えタンパク質、例えば融合タンパク質；阻害核酸；またはＣＤ７９ａ ＣＡＲを発現する細胞、例えば、ＣＤ７９ａ ＣＡＲ発現Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞であってもよい。一実施形態において、ＣＤ７９ａ阻害剤は、抗ＣＤ７９ａ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＤ７９ａ ＣＡＲＴ、またはＣＤ７９ａ ＣＡＲ発現ＮＫ細胞である。典型的なＣＤ７９ａ阻害剤は、以下でより詳細に説明される。
ある実施形態において、本開示は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞とＣＤ７９ａ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞、の集団を提供する。例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する第一の細胞、およびＣＤ７９ａ ＣＡＲを発現する第二の細胞を包含する。
ＣＡＲ分子
本明細書で説明される結合ドメイン（例えば、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａの１つまたは複数に対する結合ドメイン）は、１つまたは複数の追加のアミノ酸配列をさらに含んでいてもよい。
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群より選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む。一実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号１５の配列を含む。一実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列、または配列番号１５のアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２または３個の改変（例えば、置換）であるが２０、１０または５個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、結合ドメインは、ヒンジ領域、例えば本明細書で説明されるヒンジ領域によって膜貫通ドメインに接続されている。一実施形態において、コードされたヒンジ領域は、配列番号１４もしくは配列番号４５、またはそれらと９５～９９％の同一性を有する配列を含む。
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、共刺激ドメイン、例えば本明細書で説明される共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む。一実施形態において、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群より選択されるタンパク質の機能的なシグナル伝達ドメインを含む。一実施形態において、共刺激ドメインは、配列番号１６の配列を含む。一実施形態において、共刺激ドメインは、配列番号５１の配列を含む。一実施形態において、共刺激ドメインは、配列番号１６もしくは配列番号５１のアミノ酸配列、または配列番号１６もしくは配列番号５１のアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２もしくは３個の改変（例えば、置換）であるが２０、１０または５個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、共刺激ドメインは、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群より選択されるタンパク質の機能的なシグナル伝達ドメインを含む。実施形態において、共刺激ドメインは、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８またはＩＣＯＳを含む。
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメイン、をコードする配列をさらに含む。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢの機能的なシグナル伝達ドメイン、および／またはＣＤ３ゼータの機能的なシグナル伝達ドメインを含む。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１６の配列、および／または配列番号１７の配列を含む。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１６の配列、および／または配列番号４３の配列を含む。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７の機能的なシグナル伝達ドメイン、および／またはＣＤ３ゼータの機能的なシグナル伝達ドメインを含む。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号５１の配列、および／または配列番号１７の配列を含む。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号５１の配列、および／または配列番号４３の配列を含む。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１６もしくは配列番号５１のアミノ酸配列および／または配列番号１７もしくは配列番号４３のアミノ酸配列、あるいは配列番号１６もしくは配列番号５１のアミノ酸配列、および／または配列番号１７もしくは配列番号４３のアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２または３個の改変（例えば、置換）であるが２０、１０または５個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１６または配列番号５１の配列、および配列番号１７または配列番号４３の配列を含み、前記細胞内シグナル伝達ドメインを構成する前記配列は、同じフレーム内で単一のポリペプチド鎖として発現される。
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、リーダー配列、例えば、本明細書で説明されるリーダー配列をさらに含む。一実施形態において、リーダー配列は、配列番号１３のアミノ酸配列、または配列番号１３のアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列を含む。
一態様において、ＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ＣＤ２０ ＣＡＲ、ＣＤ２２ ＣＡＲ、ＣＤ１２３ ＣＡＲ、ＣＤ１０ ＣＡＲ、ＣＤ３４ ＣＡＲ、ＦＬＴ－３ ＣＡＲ、ＣＤ７９ｂ ＣＡＲ、ＣＤ１７９ｂ ＣＡＲまたはＣＤ７９ａ ＣＡＲ）は、任意のリーダー配列（例えば、本明細書で説明される任意のリーダー配列）、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ（例えば、本明細書で説明されるヒンジ）、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書で説明される膜貫通ドメイン）、および細胞内刺激ドメイン（例えば、本明細書で説明される細胞内刺激ドメイン）を含む。一態様において、例示的なＣＡＲコンストラクトは、任意のリーダー配列（例えば、本明細書で説明される任意のリーダー配列）、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメイン（例えば、本明細書で説明される細胞内共刺激ドメイン）、および細胞内刺激ドメインを含む。
二重特異性抗体
二重特異性抗体分子（例えば、単独で、またはＣＡＲの一部として、投与することができる）は、２つのＶＨ領域および２つのＶＬ領域を含むことができる。一部の実施形態において、上流の抗体またはその一部（例えば、ｓｃＦｖ）は、全体的な二重特異性抗体分子がＶＨ１－ＶＬ１－ＶＬ２－ＶＨ２のアレンジメントを有するように、そのＶＬ（ＶＬ１）の上流にそのＶＨ（ＶＨ１）があるようにアレンジされ、下流の抗体またはその一部（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ２）の上流にそのＶＬ（ＶＬ２）があるようにアレンジされる。他の実施形態において、上流の抗体またはその一部（例えば、ｓｃＦｖ）は、全体的な二重特異性抗体分子がＶＬ１－ＶＨ１－ＶＨ２－ＶＬ２のアレンジメントを有するように、そのＶＨ（ＶＨ１）の上流にそのＶＬ（ＶＬ１）があるようにアレンジされ、下流の抗体またはその一部（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ２）の上流にそのＶＨ（ＶＨ２）があるようにアレンジされる。
二重特異性ＣＤ２２／ＣＤ１９阻害剤
ある実施形態において、Ｂ細胞阻害剤は、二重特異性ＣＡＲ１９／ＣＡＲ２２抗体分子を含む。例えば、一部の実施形態において、Ｂ細胞阻害剤は、表２８の１つもしくは複数のアミノ酸配列、またはそれらと９５～９９％の同一性を有する配列を含む。表２８に従って核酸を、またはそれらと９５～９９％の同一性を有する配列を、さらに提供する。ある実施形態において、Ｂ細胞阻害剤は、表２または３のＣＤ１９特異的抗体分子（またはそれらと９５～９９％の同一性を有する配列）および表６Ａまたは６ＢのＣＤ２２特異的抗体分子（またはそれらと９５～９９％の同一性を有する配列）を含む。ある実施形態において、Ｂ細胞阻害剤は、表４または５の１つまたは複数のＣＤＲ（またはそれに対する１、２、３、４、５または６個の変更、例えば置換を有する配列）を有するＣＤ１９特異的抗体分子、および表７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８Ａまたは８ＢのＣＤＲ（またはそれに対する１、２、３、４、５または６個の変更、例えば置換を有する配列）を有するＣＤ２２特異的抗体分子を含む。
ｍＴＯＲ阻害剤
一実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ分子、ＣＤ２０ ＣＡＲ分子またはＣＤ２２ ＣＡＲ分子、例えば本明細書で説明されるＣＡＲ分子、を発現する細胞であって、適宜、Ｂ細胞阻害剤と組み合わせて投与される前記細胞は、免疫を増強する低い用量のｍＴＯＲ阻害剤と共投与される。理論に縛られることは望まないが、免疫を増強する低い用量（例えば、免疫系を完全に抑制するには不十分であるが免疫機能を向上させるには十分な用量）での処置は、ＰＤ－１陽性Ｔ細胞の減少、またはＰＤ－１陰性細胞の増加を伴うと考えられる。ＰＤ－１陰性Ｔ細胞ではなくＰＤ－１陽性Ｔ細胞は、ＰＤ－１リガンド、例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２を発現する細胞との接触によって排除することができる。
一実施形態において、このアプローチは、対象における本明細書で説明されるＣＡＲ細胞の性能を最適化するのに使用できる。理論に縛られることは望まないが、一実施形態において、内因性の非改変免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の性能が、向上すると考えられる。理論に縛られることは望まないが、一実施形態において、ＣＡＲを発現する細胞の性能が、向上すると考えられる。他の実施形態において、ＣＡＲを発現するように加工された、または加工されると予想される細胞、例えば、Ｔ細胞は、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の数を増加させるか、またはＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞に対するＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の比率を増加させる量のｍＴＯＲ阻害剤と接触させることによって、エクスビボで処置され得る。
一実施形態において、免疫を増強する低い用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１、または触媒性阻害剤の投与は、本明細書で説明されるＣＡＲを発現する細胞、例えば、Ｔ細胞の投与の前に開始される。一実施形態において、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞のレベル、またはＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞に対するＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の比率が、少なくとも一時的に増加するように、ＣＡＲ細胞は、十分な時間、または十分なｍＴＯＲ阻害剤投与の後に投与される。
一実施形態において、ＣＡＲを発現するように加工される細胞、例えば、Ｔ細胞は、対象における、または対象から回収された、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞のレベル、またはＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞に対するＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の比率が少なくとも一時的に増加するように、十分な時間の後に、または十分な免疫を増強する低い用量のｍＴＯＲ阻害剤投与の後に回収される。
本明細書で説明される組成物または方法のさらなる特徴または実施形態は、下記の１つまたは複数を包含する。
実施形態において、Ｂ細胞阻害剤は、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１の１つまたは複数の阻害剤を含む。実施形態において、前記Ｂ細胞阻害剤は、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１の１つまたは複数に結合するＣＡＲ分子を発現する１つまたは複数の細胞の有効な数を含む。
実施形態において、ＣＤ１９に結合するＣＡＲ分子を発現する１つまたは複数の細胞は、１つまたは複数のＢ細胞阻害剤と同時に、その前に、またはその後に投与される。
実施形態において、対象は、生体試料中の表２９に列挙した１つまたは複数のマーカーの参照レベルと比較して決定されたレベルとの差、例えば統計学的に有意な差を有するか、またはこれを有するものとして同定される。
実施形態において、対象は、生体試料において、ＣＤ１９の特徴、例えば、フレームシフトもしくは未成熟終止コドンまたは両方を引き起こす突然変異に関して、参照特徴と比較して決定された特徴との差を有するか、またはこれを有するものとして同定される。
実施形態において、対象は、生体試料中のＴｒｅｇ細胞の参照レベルと比較して決定されたレベルとの差、例えば統計学的に有意な差を有するか、または有するものとして同定される。
ある実施形態において、方法は、対象が、（ｉ）表２９に列挙した１つまたは複数のマーカーのレベルまたは活性、（ｉｉ）ＣＤ１９の特徴、例えば突然変異、例えば、フレームシフトもしくは未成熟終止コドンまたは両方を引き起こす突然変異、あるいは（ｉｉｉ）生体試料中のＴＲＥＧ細胞のレベル、の１つまたは複数に関して、参照レベルと比較して決定されたレベルとの、または参照特徴と比較して決定された特徴との差、例えば統計学的に有意な差を有するものとして同定された場合、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）療法、例えば本明細書で説明されるようなＣＡＲ療法、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞を含む治療および適宜１つまたは複数のＢ細胞阻害剤の、治療有効用量を前記対象に投与することを含む。ある実施形態において、方法は、対象が、（ｉ）表２９に列挙した１つまたは複数のマーカーのレベル、（ｉｉ）ＣＤ１９の特徴、例えば突然変異、例えば、フレームシフトもしくは未成熟終止コドンまたは両方を引き起こす突然変異、あるいは（ｉｉｉ）生体試料中のＴＲＥＧ細胞のレベルまたは活性、の１つまたは複数に関して、参照レベルと比較して決定されたレベルとの、または参照特徴と比較して決定された特徴との差、例えば統計学的に有意な差を有するかどうかを判定すること、およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）療法、例えば本明細書で説明されるようなＣＡＲ療法、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞を含む治療および適宜１つまたは複数のＢ細胞阻害剤の、治療有効用量を前記対象に投与することを含む。ある実施形態において、方法は、対象が、（ｉ）表２９に列挙した１つまたは複数のマーカーのレベル、（ｉｉ）ＣＤ１９の特徴、例えば突然変異、例えば、フレームシフトもしくは未成熟終止コドンまたは両方を引き起こす突然変異、あるいは（ｉｉｉ）生体試料中のＴＲＥＧ細胞のレベルまたは活性、の１つまたは複数に関して、参照レベルと比較して決定されたレベルとの、または参照特徴と比較して決定された特徴との差、例えば統計学的に有意な差を有するかどうかを判定すること、およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）療法、例えば本明細書で説明されるようなＣＡＲ療法、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞を含む治療および適宜１つまたは複数のＢ細胞阻害剤の、治療有効用量を前記対象に投与することを含む。ある実施形態において、方法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）療法、例えば本明細書で説明されるＣＡＲ療法、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞を含む治療の、治療有効用量を前記対象に投与すること；対象が、（ｉ）表２９に列挙した１つまたは複数のマーカーのレベル、（ｉｉ）ＣＤ１９の特徴、例えば突然変異、例えば、フレームシフトもしくは未成熟終止コドンまたは両方を引き起こす突然変異、あるいは（ｉｉｉ）生体試料中のＴＲＥＧ細胞のレベルまたは活性、の１つまたは複数に関して、参照レベルと比較して決定されたレベルとの、または参照特徴と比較して決定された特徴との差、例えば統計学的に有意な差を有するかどうかを判定すること；および差が存在した場合、１つまたは複数のＢ細胞阻害剤の治療有効用量を対象に投与することを含む。
実施形態において、対象は、生体試料中のＴｒｅｇ細胞の決定されたレベルと参照レベル間に増加、例えば統計学的に有意な増加を有するか、または有するものとして同定される。
実施形態において、対象は、ＣＤ１９に結合するＣＡＲ分子、例えばＣＤ１９ ＣＡＲを発現する１つまたは複数の細胞での処置後に再発したか、または再発したものとして同定される。
実施形態において、前記Ｂ細胞阻害剤は、ＣＤ１０に結合するＣＡＲ分子、例えば本明細書で説明されるようなＣＤ１０ ＣＡＲ；ＣＤ２０に結合するＣＡＲ分子、例えば本明細書で説明されるようなＣＤ２０ ＣＡＲ；ＣＤ２２に結合するＣＡＲ分子、例えば本明細書で説明されるようなＣＤ２２ ＣＡＲ；ＣＤ３４に結合するＣＡＲ分子、例えば本明細書で説明されるようなＣＤ３４ ＣＡＲ；ＣＤ１２３に結合するＣＡＲ分子、例えば本明細書で説明されるようなＣＤ１２３ ＣＡＲ；ＦＬＴ－３に結合するＣＡＲ分子、例えば本明細書で説明されるようなＦＬＴ－３ ＣＡＲ；またはＲＯＲ１に結合するＣＡＲ分子、例えば本明細書で説明されるようなＲＯＲ１ ＣＡＲ、を発現する１つまたは複数の細胞の有効な数を含む。
実施形態において、ＣＤ１９阻害剤は、ＣＤ１９結合ドメインと、膜貫通ドメインと、刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む抗体または抗体フラグメントを含み、前記ＣＤ１９結合ドメインは、表２または３に列挙したいずれかのＣＤ１９軽鎖結合ドメインアミノ酸配列の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）の１つまたは複数（例えば、３つ全て）、ならびに表２または３に列挙したいずれかのＣＤ１９重鎖結合ドメインアミノ酸配列の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）の１つまたは複数（例えば、３つ全て）を含む。
実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、表２または３に列挙した軽鎖可変領域、および表２または３に列挙したいずれかの重鎖可変領域を含む。
実施形態において、ＣＤ１９阻害剤は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群より選択される配列またはそれらと９５～９９％の同一性を有する配列を含む、ＣＤ１９結合ドメインを含む。実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号５８のポリペプチドを含む。
実施形態において、Ｂ細胞阻害剤は、ＣＤ２０ ＣＡＲを含み、前記ＣＤ２０ ＣＡＲは、ＣＤ２０結合ドメインと、膜貫通ドメインと、刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む抗体または抗体フラグメントを含み、前記ＣＤ２０結合ドメインは、表１３に列挙したいずれかのＣＤ２０軽鎖結合ドメインアミノ酸配列の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）の１つまたは複数、ならびに表１２Ａまたは１２Ｂに列挙したいずれかのＣＤ２０重鎖結合ドメインアミノ酸配列の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）の１つまたは複数を含む。
実施形態において、Ｂ細胞阻害剤は、ＣＤ２２ ＣＡＲを含み、前記ＣＤ２２ ＣＡＲは、ＣＤ２２結合ドメインと、膜貫通ドメインと、刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む抗体または抗体フラグメントを含み、前記ＣＤ２２結合ドメインは、表８Ａ、８Ｂ、１０Ａおよび／または１０Ｂに列挙したいずれかのＣＤ２２軽鎖結合ドメインアミノ酸配列の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）の１つまたは複数、ならびに表７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、９Ａおよび／または９Ｂに列挙したいずれかのＣＤ２２重鎖結合ドメインアミノ酸配列の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）の１つまたは複数を含む。
実施形態において、ＣＤ２２ ＣＡＲは、表１０Ａまたは１０Ｂに列挙したいずれかの軽鎖可変領域を含む。実施形態において、ＣＤ２２ ＣＡＲは、表９Ａまたは９Ｂに列挙したいずれかの重鎖可変領域を含む。実施形態において、ＣＤ２２ ＣＡＲは、表１０Ａまたは１０Ｂに列挙したいずれかの軽鎖可変領域、および表９Ａまたは９Ｂに列挙したいずれかの重鎖可変領域を含む。
実施形態において、Ｂ細胞阻害剤はＣＡＲを含み、前記ＣＡＲは、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む抗体または抗体フラグメントを含み、前記抗原結合ドメインは、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）の１つまたは複数（例えば全て）、ならびに重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）の１つまたは複数（例えば全て）を含む。
実施形態において、Ｂ細胞阻害剤は、ｓｃＦｖを含むＣＡＲを含む。実施形態において、Ｂ細胞阻害剤は、膜貫通ドメインを含むＣＡＲを含み、前記膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群より選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む。実施形態において、抗原結合ドメインは、ヒンジ領域によって膜貫通ドメインに接続されている。実施形態において、ヒンジ領域は、配列番号１４、またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列を含む。実施形態において、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群より選択されるタンパク質から得られる機能的なシグナル伝達ドメインである。実施形態において、共刺激ドメインは、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群より選択されるタンパク質から得られる機能的なシグナル伝達ドメインである。実施形態において、共刺激ドメインは、配列番号１６または配列番号５１の配列を含む。実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢの機能的なシグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的なシグナル伝達ドメインを含む。
実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１６の配列、および／または配列番号１７もしくは配列番号４３の配列を含む。実施形態において、ＣＡＲは、リーダー配列をさらに含む。実施形態において、リーダー配列は、配列番号１３を含む。
実施形態において、ＣＡＲ分子を発現する細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を含む。
実施形態において、ＣＤ１９発現に関連する疾患は、がんもしくは悪性腫瘍などの増殖性疾患、または脊髄形成異常、骨髄異形成症候群もしくは前白血病状態などの前がん状態から選択されるか、またはＣＤ１９発現に関連する非がん関連の徴候である。実施形態において、疾患は、血液がん、急性白血病、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性白血病、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）または慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）の１つまたは複数である。
実施形態において、方法は、ＣＡＲ分子を発現する細胞の効能を増加させる薬剤を投与することをさらに含む。実施形態において、方法は、ＣＡＲ分子を発現する細胞の投与に関連する１つまたは複数の副作用を改善する薬剤を投与することをさらに含む。実施形態において、ＣＡＲ分子を発現する細胞は、ＣＤ１９に関連する疾患を処置する薬剤と組み合わせて投与される。
本明細書で説明される方法、例えば、哺乳動物に抗腫瘍免疫を提供する方法、または哺乳動物を処置する方法による、実施形態において、哺乳動物は、以前に投与されたがん治療、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ療法、またはＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞以外のがん治療に対する、非応答例、部分応答例または完全応答例である。実施形態において、哺乳動物は、以前に投与されたがん治療、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ療法、またはＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞以外のがん治療に対する、非再発例、部分再発例または完全再発例である。実施形態において、哺乳動物は、ＣＤ１９陰性がん細胞またはＣＤ１９陽性がん細胞を有し、前記哺乳動物は、ＣＤ２２陽性、ＣＤ１２３陽性、ＦＬＴ－３陽性、ＲＯＲ－１陽性、ＣＤ７９ｂ陽性、ＣＤ１７９ｂ陽性、ＣＤ７９ａ陽性、ＣＤ１０陽性、ＣＤ３４陽性および／またはＣＤ２０陽性がん細胞をさらに有してもよい。実施形態において、哺乳動物は、再発ＡＬＬがんを有する。実施形態において、哺乳動物は、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞を以前に投与されており、ＣＤ１９ ＣＡＲ処置が無効である。
実施形態において、薬剤は、ｍＴＯＲ阻害剤であり、対象は、免疫を増強する低い用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えばＲＡＤ００１またはラパマイシンを投与される。実施形態において、ｍＴＯＲ阻害剤は、ＲＡＤ００１である。実施形態において、用量は、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤および触媒性ｍＴＯＲ阻害剤を含む。実施形態において、ｍＴＯＲ阻害剤は、対象の末梢血中の、または対象から単離されたＴ細胞の製剤中の、ＰＤ－１陽性Ｔ細胞の比率を減少させる、ＰＤ－１陰性Ｔ細胞の比率を増加させる、またはＰＤ－１陰性Ｔ細胞／ＰＤ－１陽性Ｔ細胞の比率を増加させるのに十分な時間にわたり投与される。
実施形態において、ＣＡＲを発現するように加工される免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞は、十分な時間の後に、または免疫を増強する低い用量のｍＴＯＲ阻害剤の十分な投与の後に回収され、その結果、対象における、または対象から回収された、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞のレベル、またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の比率は、少なくとも一時的に増加した。実施形態において、ｍＴＯＲ阻害剤の前記用量は、例えばｐ７０ Ｓ６ Ｋ阻害によって測定して、少なくとも５％であるが９０％以下のｍＴＯＲ阻害を伴う。実施形態において、ｍＴＯＲ阻害剤の前記用量は、例えばｐ７０ Ｓ６ Ｋ阻害によって測定して、少なくとも１０％であるが４０％以下のｍＴＯＲ阻害を伴う。
ある実施形態において、方法は、チェックポイント阻害剤を投与することをさらに含む。実施形態において、対象は、ＣＡＲＴ療法の開始前に、薬剤、例えば、ｍＴＯＲ阻害剤および／またはチェックポイント阻害剤での前処置を受ける。実施形態において、対象は、薬剤、例えば、ｍＴＯＲ阻害剤および／またはチェックポイント阻害剤での同時処置を受ける。実施形態において、対象は、ＣＡＲＴ療法後、薬剤、例えば、ｍＴＯＲ阻害剤および／またはチェックポイント阻害剤での処置を受ける。
実施形態において、決定されたレベルまたは決定された特徴は、ＣＡＲＴ療法の前に、それと同時に、またはその過程で得られる。
実施形態において、方法は、対象が再発する可能性があるかどうか、または再発したかどうかを示す、遺伝子シグネチャーをアッセイすることを含む。実施形態において、方法は、ＣＡＲ発現細胞での処置、例えばＣＡＲＴ処置（例えば、ＣＡＲＴ１９処置、例えばＣＴＬ０１９治療）での処置の前に、ＣＡＲ処置に対する再発を予示する対象における遺伝子シグネチャーをアッセイすることを含む。実施形態において、１つまたは複数のマーカーのレベルは、表２９に列挙した少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０のマーカーのレベルである。実施形態において、マーカーのレベルは、ｍＲＮＡレベルまたは可溶性タンパク質のレベルを含む。
実施形態において、ＣＤ１９の特徴は、エキソン２における突然変異、例えば、フレームシフトもしくは未成熟終止コドンまたは両方を引き起こす突然変異である。実施形態において、ＴＲＥＧ細胞のレベルは、ＴＲＥＧ細胞によって発現されるマーカーについて試料を染色することによって決定される。実施形態において、ＴＲＥＧ細胞のレベルは、対象の体内の関連位置における、例えば、がん微小環境におけるＴｒｅｇ細胞のレベルである。
実施形態において、方法は、アフェレーシスの前に対象におけるＴＲＥＧシグネチャーを減少させることをさらに含む。実施形態において、方法は、例えば、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体または両方を対象に投与することによって、対象におけるＴＲＥＧシグネチャーを減少させることをさらに含む。実施形態において、方法は、ＣＡＲ発現細胞生成物製造のための細胞の収集前に、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体または両方で対象を前処置することを含む。実施形態において、方法は、対象から試料を得ることをさらに含み、前記試料は、細胞画分（例えば、血液を含む）、組織画分、アフェレーシス試料、または骨髄試料を含む。
実施形態において、細胞は、細胞内シグナル伝達ドメインからの正のシグナルを含む第二のポリペプチドと会合している、阻害分子の少なくとも一部を含む第一のポリペプチドを含む阻害分子を発現する。実施形態において、阻害分子は、ＰＤ１の少なくとも一部を含む第一のポリペプチドと、共刺激ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む第二のポリペプチドとを含む。
実施形態において、方法は、細胞で処置された対象が、再発する可能性があるかどうか、または再発したかどうかを示す、遺伝子シグネチャーをアッセイすることを含む。実施形態において、方法は、対象への注入の前に細胞における遺伝子シグネチャーをアッセイすることを含む。実施形態において、方法は、形質導入された細胞を含む細胞集団のＴＲＥＧシグネチャーを減少させることをさらに含む。実施形態において、ＴＲＥＧシグネチャーを減少させることは、細胞集団に対してＣＤ２５枯渇を実施することを含む。
実施形態において、対象は、哺乳動物、例えばヒトである。
特に他の定義がない限り、本明細書において使用される全ての専門用語や科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。以下で好適な方法および材料を説明するが、本発明の実施または試験において、本明細書で説明したものに類似した、または同等な方法および材料を使用することができる。本明細書の中で（例えば、配列データベース参照番号に関して）言及される全ての公報、特許出願、特許および他の参考文献は、参照によりそれら全体が組み入れられる。例えば、本明細書において、例えば本明細書のいずれかの表の中で参照される全てのＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉｇｅｎｅおよびＥｎｔｒｅｚ配列は、参照により組み入れられる。特に他の明記がない限り、本明細書に明記される配列受託番号は、本明細書におけるあらゆる表中のものを含めて、２０１５年４月８日現在のデータベースエントリーを指す。１つの遺伝子またはタンパク質について複数の配列受託番号が参照用に記載されている場合、それらの配列変異体の全てが包含される。
加えて、材料、方法、および実施例は単なる例示にすぎず、限定することを意図しない。
見出し、小見出しまたは番号付けもしくは文字で分類された要素、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｉ）などは、単に読解しやすくするために示されたにすぎない。この文書における見出しまたは番号付けもしくは文字で分類された要素の使用は、工程または要素をアルファベット順に実行すること、または工程または要素が必ずしも互いに不連続であることを必要としない。
本発明の他の特色、目的、および利点は、説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかであると予想される。
図１および図１Ｂは、代表的なＣＡＲの模式図である。 図２は、腫瘍に存在するＣＤ１９発現細胞を示すホジキンリンパ腫の免疫組織化学的分析の画像を含む。左側パネルは倍率１倍であり、右側パネルは倍率２０倍である。 図３は、ホジキンリンパ腫を有する患者におけるＣＡＲＴ１９治療の治療効率を評価するための研究の実験構成の模式図である。 図４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄは、Ｔ細胞におけるＰＤ１およびＣＡＲ１９発現のフローサイトメトリー分析を示す。図４Ａおよび４Ｂは、ＣＡＲＴ療法に対する完全応答例（ＣＲ）または非応答例（ＮＲ）である対象由来のＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＰＤ－１およびＣＡＲ１９発現の分布を実証する代表的なフローサイトメトリープロファイルである。図４Ｃは、ＣＡＲＴ療法に対する異なる応答を有する対象群由来のＣＤ４＋Ｔ細胞集団におけるＰＤ１細胞のパーセントを示すグラフである。図４Ｄは、ＣＡＲＴ療法に対する異なる応答を有する対象群由来のＣＤ８＋Ｔ細胞集団におけるＰＤ１細胞のパーセントを示すグラフである。 図５Ａおよび５Ｂは、ＣＡＲＴ療法に対する異なる応答を有する対象群由来のＣＤ４およびＣＡＲ１９発現細胞（図５Ａ）またはＣＤ８およびＣＡＲ１９発現細胞（図５Ｂ）におけるＰＤ１発現の分布を示す。 図６は、ＣＡＲＴ療法に対する完全応答例（ＣＲ）または非応答例（ＮＲ）である対象由来のＴ細胞におけるＰＤ１、ＣＡＲ１９、ＬＡＧ３およびＴＩＭ３発現のフローサイトメトリー分析を示す。 図７Ａおよび７Ｂは、ＣＡＲＴ療法に対する異なる応答を有する対象群由来のＰＤ１およびＬＡＧ３発現（図７Ａ）またはＰＤ１およびＴＩＭ３発現（図７Ｂ）の分布を示す。 図８は、ＣＡＲＴ１９を受けた骨髄腫患者由来の形質細胞ＩｇＡ免疫表現型解析を示し、ＣＡＲＴ１９療法に対する応答を実証する。 図９Ａおよび９Ｂは、癌細胞株およびＣＡＲＴ細胞上のＩＬ－７受容体（ＣＤ１２７）発現を示す。ＣＤ１２７発現は、３つの癌細胞株：ＲＬ（マントル細胞リンパ腫）、ＪＥＫＯ（Ｊｅｋｏ－１としても知られている、マントル細胞リンパ腫）、およびＮａｌｍ－６（Ｂ－ＡＬＬ）におけるフローサイトメトリー分析によって測定された（図９Ａ）。ＣＤ１２７の発現は、ＮＳＧマウスに注入され、循環していたＣＤ３陽性（ＣＡＲＴ）細胞についてフローサイトメトリー分析によって測定された（図９Ｂ）。 図１０Ａ、図１０Ｂ、および図１０Ｃは、ＣＡＲＴ１９治療、およびその後のＩＬ－７治療後の抗腫瘍応答を示す。０日目にルシフェラーゼを発現するマントルリンパ腫細胞株（ＲＬ－ｌｕｃ）を生着させたＮＳＧマウスは、６日目に様々な用量のＣＡＲＴ１９細胞で処置され、腫瘍負荷をモニターされた。マウスは４群に分けられ、ＣＡＲＴ１９細胞を受けず、０．５×１０6個のＣＡＲＴ１９細胞（ＣＡＲＴ１９ ０．５Ｅ６）、１×１０6個ＣＡＲＴ１９細胞（ＣＡＲＴ１９ １Ｅ６）、または２×１０6個ＣＡＲＴ１９細胞（ＣＡＲＴ１９ ２Ｅ６）を受けた。ＣＡＲＴ処置後の腫瘍負荷は、生物発光（平均ＢＬＩ）の検出によって測定された（図１０Ａ）。０．５×１０6個のＣＡＲＴ１９細胞（ＣＡＲＴ１９ ０．５Ｅ６）または１×１０6個のＣＡＲＴ１９細胞（ＣＡＲＴ１９ １Ｅ６）を受けるマウスは無作為化され、組換えヒトＩＬ－７（ｒｈＩＬ－７）を受けたか、または受けなかった。ここでは平均生物発光（ＢＬＩ）によって表される腫瘍負荷は、８５日目に開始されたＩＬ－７を用いて処置された、図１０Ａからの３匹のマウス（＃３８２７、＃３８２９および＃３８１５、示された初期ＣＡＲＴ１９用量を受けた）についてモニターされた（図１０Ｂ）。ＩＬ－７は、週に３回、ＩＰ注射により投与された。ここでは８５日前（ＰＲＥ）および１１５日後（ＰＯＳＴ）の平均生物発光（ＢＬＩ）によって表される腫瘍負荷は、ＩＬ－７（ＣＴＲＬ）を受けなかったマウスとＩＬ－７処置を受けたマウス（ＩＬ－７）の間で比較された（図１０Ｃ）。 図１１Ａおよび１１Ｂは、ＩＬ－７処置後のＴ細胞動態を示す。血液中に検出されるヒトＴ細胞のレベルは、ＩＬ－７を受けたマウスまたは対照マウスのそれぞれについてモニターされた（図１１Ａ）。血液中で検出されるＣＡＲＴ１９細胞（ＣＤ３＋細胞）のレベルは、ＩＬ－７処置の開始前（ＰＲＥ）および１４日後（１４日目）に測定された（図１１Ｂ）。 図１２は、２つの例となるＲＣＡＲ配置の構造を描いている。抗原結合メンバーは抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびスイッチドメインを含む。細胞内結合メンバーは、スイッチドメイン、共刺激シグナル伝達ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む。２つの配置は、本明細書で説明される第１および第二のスイッチドメインが、抗原結合メンバーおよび細胞内結合メンバーに関して異なる方向付けで可能であることを示している。他のＲＣＡＲ配置は本明細書にさらに記載されている。 図１３は、抗Ｃ２２および抗ＣＤ１９結合ドメインを有する二重特異性ＣＡＲについての２つのコンストラクトを示す。「４Ｇ４Ｓ」は、リンカー配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３１１）を表す。 図１４は、ＮＦＡＴアッセイにおける二重特異性ＣＤ１９／ＣＤ２２ ＣＡＲコンストラクトの活性を示すグラフである。 図１５Ａ、１５Ｂ、および１５Ｃは、様々な腫瘍標的細胞株の存在下でのＣＡＲ Ｔ細胞活性化の程度（相対発光によって測定される）を示すグラフである。図１５Ａは、ＣＤ２０を発現する標的細胞株であるＤａｕｄｉの存在下でのＣＡＲ Ｔ細胞活性化を示す。図１５Ｂは、ＣＤ２０を発現する標的細胞株であるＲａｊｉの存在下でのＣＡＲ Ｔ細胞活性化を示す。図１５Ｃは、ＣＤ２０を発現しない陰性対照であるＫ５６２の存在下でのＣＡＲ Ｔ細胞活性化を示す。 図１６は、遺伝子シグネチャー分析の概要を示す例示的な模式図である。略述すると、各遺伝子セットについて、２群統計モデルを適用して、メタ遺伝子がＣＲ、ＰＲおよびＮＲの間で統計的に異なるかどうかを決定した。ＣＲは、休止ＴEFF細胞によく似ているが、ＮＲは、活性化ＴEFF細胞によく似ている。活性化ＴEFF細胞と休止ＴEFF細胞において上方調節された遺伝子はまたＮＲにおいても上方調節される。 再発しなかった完全応答例（ＣＲ）と比較して、再発例（Ｒ）となった完全応答例である小児患者由来の試料において、ＴＲＥＧ遺伝子が高発現レベルを有する例示的な結果を示す（ｐ＝０．０００２１５）。ｘ軸は、レスポンス群による試料であり、ＣＲ＝再発のない完全応答例であり、Ｒ＝応答例である。ｙ軸は、標準化されたメタ遺伝子発現スコアである。 図１８Ａ、図１８Ｂ、および図１８Ｃは、腫瘍標的細胞株の存在下でのＣＡＲ Ｔ細胞活性化を示すグラフである。図１８Ａにおいて、ＣＡＲを発現するＪＮＬ細胞は、示されたＥ対Ｔ比でＤａｕｄｉ ＣＤ２２を発現する標的細胞株と混合された。図１８Ｂにおいて、ＣＡＲを発現するＪＮＬ細胞は、示されたＥ対Ｔ比でＲａｊｉ ＣＤ２２を発現する標的細胞株と混合された。図１８Ｃにおいて、ＣＡＲを発現するＪＮＬ細胞は、示されたＥ対Ｔ比で陰性対照であるＫ５６２細胞株と混合された。 図１９は、細胞表面上のキメラ抗原受容体の原発性Ｔ細胞発現を示すグラフである。タンパク質－Ｌ－ビオチン／ＳＡ－ＰＥ（図１９－１および図１９－２）およびｒｈＣＤ２２－Ｆｃ／抗Ｆｃ４８８（図１９－３および１９－４）を使用して、ＣＡＲ表面発現レベルを決定した。ＣＡＲを有さない細胞を陰性対照として使用した。 同上 同上 同上 図２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ、２０Ｄ、２０Ｅ、および２０Ｆは、原発性Ｔ細胞腫瘍標的死滅アッセイを示すグラフである。ＣＤ２２ ＣＡＲで活性化され形質導入された原発性Ｔ細胞は、示された比率でルシフェラーゼを安定に発現する標的細胞株と混合され、標的細胞死滅を測定した。死滅率は、ｈＣＤ２２－８（２８．８％形質導入）に対して標準化された。ＣＤ２２を発現する細胞株であるＲａｊｉ（図２０Ａ）、ＳＥＭ（図２０Ｂ）、Ｋ５６２－ｈＣＤ２２（図２０Ｃ）、Ｄａｕｄｉ（図２０Ｄ）、およびＮａｌｍ６（図２０Ｅ）を使用し、陽性対照ＣＤ２２ ＣＡＲ ｍ９７１（ｍ９７１－ＨＬ）、陰性対照ＣＡＲ ｍ９７１－ＬＨ、および陰性対照としての非形質導入Ｔ細胞と比較して、機能ＣＤ２２ ＣＡＲクローンを試験した。Ｋ５６２細胞株はＣＤ２２を発現せず、陰性対照として使用された（図２０Ｆ）。 図２１Ａ、図２１Ｂ、図２１Ｃ、図２１Ｄ、図２１Ｅ、および図２１Ｆは、ＣＤ２２ ＣＡＲクローンによる有意な炎症促進性サイトカイン応答の誘導を示すグラフである。原発性Ｔ細胞死滅アッセイを用いて、炎症促進性サイトカインであるＩＦＮ－ｇ、ＩＬ－２およびＴＮＦａを産生するＣＤ２２ ＣＡＲクローンの能力を決定した。エフェクター細胞は、異なる標的細胞株のそれぞれと２０時間共培養され、２８．８％の形質導入に対して標準化された。上清は、Ｒａｊｉ ＣＤ２２を発現する標的細胞（図２１Ａ）、Ｎａｌｍ６ ＣＤ２２を発現する標的細胞（図２１Ｂ）、Ｄａｕｄｉ ＣＤ２２を発現する標的細胞（図２１Ｃ）、ＳＥＭ ＣＤ２２を発現する標的細胞（図２１Ｄ）、Ｋ５６２－ｈＣＤ２２ ＣＤ２２を発現する標的細胞（図２１Ｅ）、およびＫ５６２非ＣＤ２２発現細胞（陰性対照）（図２１Ｆ）から、２．５対１および１０対１のＥ対Ｔ比を変化させて異なる培養物から採取された。 同上 同上 図２２は、フローサイトメトリーによって検出された再発したＡＬＬにおける様々なＢ細胞抗原の発現を示すグラフである。１６ｒ／ｒ患者由来の試料は、以下のマーカー：ＣＤ１９（１６ｐｔｓ）、ＣＤ２２（１６ｐｔｓ）、ＣＤ１２３（１６ｐｔｓ）、ＦＬＴ－３（９ｐｔｓ）、ＲＯＲ－１（３ｐｔｓ）、ＣＤ７９ｂ（１５ｐｔｓ）、ＣＤ１７９ｂ（８ｐｔｓ）、ＣＤ７９ａ（１６ｐｔｓ）、ＣＤ１０（１６ｐｔｓ）、ＣＤ３４（１６ｐｔｓ）、およびＣＤ２０（１６ｐｔｓ）についてマルチパラメトリックフローサイトメトリーによりスクリーニングされた。ＣＤ２２およびＣＤ１２３は、ｒ／ｒ ＡＬＬ患者の芽球において、高く（＞６０％）および均一に発現した（バーは発現％中央値を示し、それぞれ９９．５０％、９８．８０％、９５．７０％、７２．００％、４７．００％、１５．００％、１３．４５％、４．２００％、９８．００％、８７．６５％、および７．００％である）。各患者について、示されたマーカーを発現する細胞のパーセンテージは、単一のデータポイントとして示される。 図２３は、ＣＡＲＴ１９処置前（ベースライン）と処置後（ＣＤ１９陰性再発）の両方で、ＣＤ１９陰性白血病で再発した６人の患者におけるＣＤ２２およびＣＤ１２３の発現を示す一連のグラフである。全ての分析において、目的とする集団に順方向対側方散乱特性、続くシングレットゲーティングに基づいてゲートをかけ、生存細胞にＬｉｖｅ Ｄｅａｄ Ａｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてゲートをかけた。タイムゲーティングが、品質管理のために含まれた。ゲーティング戦略は、タイムゲーティング→ＳＳＣ低→シングレット→生存→ＣＤ４５ｄｉｍ→ＣＤ１０＋を含む。 図２４は、ＣＡＲＴ１９処置後のＣＤ１９陰性疾患で再発した患者由来の芽球におけるＣＤ２２の発現を示す一連のグラフである（臨床試験ＵＰＣＣ０４４０９／ＣＨＰ９５９、患者ＵＰＮは四角のボックスに示されている）。一番上の列は、ＣＡＲＴ１９処置前の芽球におけるＣＤ１９およびＣＤ２２発現を示し、一方、一番下の列は、再発時の疾患表現型を示す。ＣＤ２２発現はまた、ＣＤ１９発現が失われた場合、再発時に維持された。 図２５は、ＣＡＲＴ１９処置後のＣＤ１９陰性疾患で再発した患者由来の芽球におけるＣＤ１２３の発現を示す１セットのグラフである（臨床試験ＵＰＣＣ０４４０９／ＣＨＰ９５９、患者ＵＰＮは四角のボックスに示される）。一番上の列は、ＣＡＲＴ１９処置前の芽球におけるＣＤ１９およびＣＤ１２３発現を示し、一方、一番下の列は、再発時の疾患表現型を示す。ＣＤ１２３発現は、ほとんどの患者において再発時に維持されたが、一方、ＣＤ１９発現は失われた。 図２６は、ＣＤ１９陰性疾患で再発した患者におけるＣＡＲＴ１９処置の前後のＣＤ１９、ＣＤ２２、およびＣＤ１２３の発現中央値を示すグラフである。ＣＤ１９発現は再発時に失われたが（９４．２５％対０％、ｐ＝０．０００９）、ＣＤ２２（９９．２０％対９７．３０％、ｐ＝ｎｓ）およびＣＤ１２３（６３．００％対４８．７５％、ｐ＝ｎｓ）は依然として発現した。各患者について、示されたマーカーを発現する細胞のパーセンテージは、単一のデータポイントとして示される。 図２７Ａおよび図２７Ｂは、１６人のｒ／ｒ患者由来の試料、およびＣＡＲＴ１９治療後のＣＤ１９陰性疾患で再発した４人の患者由来の試料におけるＣＤ２２発現を示す一連のグラフである。試料は、Ｂ細胞マーカーであるＣＤ２２についてマルチパラメトリックフローサイトメトリーによりスクリーニングされた。ＣＤ２２は、１５人中１１人のｒ／ｒ ＡＬＬ患者の芽球において高く（＞６０％）および均一に発現した（図２７Ａ）。ＣＤ２２は、ＣＤ１９陰性白血病で再発した４人中４人の患者において、ＣＡＲＴ１９処置前（ベースライン）と処置後（ＣＤ１９陰性再発）の両方で陽性であった（２ｐｔｓを示す）（図２７Ｂ）。ゲーティング戦略：ＳＳＣ低→シングレット→生存→ＣＤ４５ｄｉｍ。 図２８Ａ、２８Ｂ、および２８Ｃは、ＣＤ１９およびＣＤ２２発現におけるＣＤ２２ ＣＡＲＴの効果を示す一連のグラフである。異なる鎖配向（ＨからＬおよびＬからＨ）を用いて生成された２つのＣＡＲ２２コンストラクトの概要を示す（図２８Ａ）。抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖ（ｍ９７１）をコドン最適化し、ＣＤ８ヒンジ、４１－ＢＢ共刺激およびＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含有するマウスＣＡＲ１９ベクターにクローニングした（図２８Ａ）。ＮＡＬＭ６ ＡＬＬ細胞株におけるＣＤ１９、ＣＤ２２およびアイソタイプ対照の発現は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）（図２８Ｂ）および抗体結合能（ＡＢＣ）として示される（図２８Ｃ）。ＮＡＬＭ－６において、ＣＤ１９の発現はＣＤ２２より高かった。しかしながら、ほとんどの原発性ＡＬＬ試料において、ＣＤ１９およびＣＤ２２発現は同様であった（図２７Ａ参照）。 図２９Ａ、図２９Ｂおよび図２９Ｃは、（ＵＴＤ細胞とともに）ＣＡＲＴ２２およびＣＡＲＴ１９を生成するための正常なドナーＴ細胞の増殖を示す一連のグラフである。集団倍加（ＰＤ）対培養の日数：増殖の終了時（１１日目）に、ＣＡＲＴ２２および対照Ｔ細胞は約４．５ＰＤに達し、ＣＡＲＴ１９またはＵＴＤ細胞と比較して有意差はなかった（図２９Ａ）。Ｔ細胞容量（ｆｌ）対培養日数：６日目にはピーク容量（約４５０ｆｌ）であり、一方、翌日、容量は、細胞が回収され、凍結されたときには３００ｆｌに減少した。ＣＡＲＴ１９またはＵＴＤ細胞と比較して、有意な差異は観察されなかった（図２９Ｂ）。増殖の１１日目のＣＤ４陽性およびＣＤ８陽性Ｔ細胞のＣＡＲ発現を図２９Ｃに示す。ＣＡＲ発現についてのゲーティングは、ＵＴＤに基づいている。ゲーティング戦略：ＦＳＳ対ＳＳＣリンパ球→シングレット→生存→ＣＤ３＋。 図３０は、細胞質内サイトカイン産生を伴うＣＤ１０７ａ脱顆粒アッセイを示す一連のグラフである。ＣＡＲＴ１９、ＣＡＲＴ２２ ＨｔｏＬおよびＬｔｏＨを異なる標的（単独、ＰＭＡ／イオノマイシン、ＭＯＬＭ－１４およびＮＡＬＭ－６）と共培養した。ＣＡＲＴ１９およびＣＡＲＴ２２ ＨｔｏＬは、ＡＬＬ細胞株（ＮＡＬＭ－６）と共培養し、陰性対照と共培養しなかった場合には、高レベルのＣＤ１０７ａ脱顆粒、ＩＬ－２、ＩＦＮｇおよびＴＮＦａ産生を示す。ＵＴＤおよびＣＡＲＴ２２ ＬｔｏＨは、脱顆粒およびサイトカイン産生を示さなかった。ゲーティング戦略：ＦＳＳ対ＳＳＣリンパ球→シングレット→生存→ＣＤ３＋。 図３１は、ルシフェラーゼに基づく死滅アッセイを示すグラフである。ＵＴＤ細胞ではなく、ＣＡＲＴ２２およびＣＡＲＴ１９ ＨｔｏＬは、２４時間共培養した場合にＮＡＬＭ－６細胞を溶解することができた。細胞毒性活性とＥ対Ｔ比の間の直接相関が観察され、２対１のＥ対Ｔ比（ＣＡＲＴ１９およびＣＡＲＴ２２について７８％および７５％の死滅）でより良好な抗白血病効果であった。 図３２Ａおよび３２Ｂは、ＣＦＳＥベースの増殖アッセイを示す一連のグラフである。ＡＬＬ細胞株であるＮＡＬＭ－６を用いたＣＡＲＴ２２およびＣＡＲＴ１９の５日間の共培養は、有意なＴ細胞増殖（それぞれ９４％および９２．９％）をもたらした。また、対照が示されている（ＴＣＭ＝培地のみ、Ｐ－Ｉ＝ＰＭＡ／イオノマイシン、ＭＯＬＭ－１４）（図３２Ａ）。ＣＡＲＴ１９およびＣＡＲＴ２２におけるＣＦＳＥ希釈の動態を示すヒストグラムにおいて、ほとんどのＴ細胞が複数の増殖サイクルを経た（図３２Ｂ）。ゲーティング戦略：ＦＳＳ対ＳＳＣリンパ球→シングレット→生存→ＣＤ３＋。 図３３は、サイトカイン産生を示す一連のグラフである。ＣＡＲＴ２２、ＣＡＲＴ１９およびＵＴＤを異なる照射標的（単独、ＰＭＡ／イオノマイシン、ＭＯＬＭ－１４およびＮＡＬＭ－６）とともに２４時間インキュベートした。ＡＬＬ細胞株であるＮＡＬＭ－６と共培養した場合、ＣＡＲＴ２２およびＣＡＲＴ１９ＨｔｏＬのみが複数のサイトカイン（ここでは、ＩＦＮｇ、ＩＬ－２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦαおよびＭＩＰ１ｂを示す）を放出することができた。結果は、平均強度蛍光（ＭＦＩ）として示される。 図３４Ａおよび３４Ｂは、原発性ＡＬＬ芽球を伴うＴ細胞脱顆粒を示す一連のグラフである。ＣＡＲＴ２２、ＣＡＲＴ１９およびＵＴＤ細胞は、ベースライン時、および患者がＣＤ１９陰性疾患で再発した場合のＣＡＲＴ１９処置後、ＡＬＬ患者由来の芽球（ＣＨＰ－９５９－１０１）と４時間、同時インキュベートされた。ＣＡＲＴ１９とＣＡＲＴ２２の両方は、ベースライン時（芽細胞がＣＤ１９＋およびＣＤ２２＋である場合）に脱顆粒することができたが、再発時にはＣＡＲＴ２２のみが脱顆粒していた（疾患がＣＤ１９陰性の場合）（図３４Ａ）。再発時にＣＨＰ１０１試料とともにインキュベートした後、ＣＤ８陽性およびＣＤ８陰性ＣＡＲＴ１９およびＣＡＲＴ２２エフェクターにおけるＣＤ１０７ａ脱顆粒を示すドットプロットは、ＣＤ８とＣＤ４ Ｔ細胞の両方において脱顆粒を示したＣＡＲＴ２２のみを実証した（図３４Ｂ）。ゲーティング戦略：ＦＳＳ対ＳＳＣリンパ球→シングレット→生存→ＣＤ３＋。 図３５Ａ、図３５Ｂ、図３５Ｃ、および図３５Ｄは、ＮＡＬＭ－６に対するインビボでのＣＡＲＴ２２の有効性を示す一連のグラフである。Ａ．実験の概要：１００万個のＮＡＬＭ－６ルシフェラーゼ＋細胞／マウスをＮＳＧマウスにおいてｉ．ｖ．注射した。６日後、腫瘍の生着を生物発光によって評価した。次に、マウスは、無作為化され、非形質導入Ｔ細胞または異なる用量のＣＡＲＴ２２（１．２５～５００万個の総細胞／マウス、７５％のＣＡＲ発現）を受けた。その後、マウスは、腫瘍負荷、ＰＢ Ｔ細胞増殖、および生存についてモニターされた（図３５Ａ）。生物発光（ＢＬＩ）による腫瘍負荷は、用量関連の抗白血病反応を検出した。５ｅ6個のＣＡＲＴ２２細胞を受けたマウスは、より良好な腫瘍制御を示した（図３５Ｂ）。ＣＡＲＴ２２で処置されたマウスは、ＵＴＤ細胞で処置したマウスと比較して、統計的に有意に良好な全生存（ＯＳ）を示した。ＯＳについて、より高用量のＣＡＲＴ２２と良好なＯＳの間に有意な相関があった（図３５Ｃ）。Ｔ細胞のインビボ増殖は、眼窩後出血により毎週モニターされた。Ｔ細胞注入の１週間後、高用量のＣＡＲＴ２２を受けたマウスは、より良好なＣＡＲＴ拡張（中央値１２Ｔ細胞／μｌ）を示した（図３５Ｄ）。 同上 図３６Ａおよび図３６Ｂは、ＮＡＬＭ－６に対するＣＡＲＴ２２とＣＡＲＴ１９の間インビボ比較を示す一連のグラフである。実験の概要：１００万個のＮＡＬＭ－６ルシフェラーゼ＋細胞／マウスは、ＮＳＧマウスにおいてｉ．ｖ．注射された。６日後、腫瘍の生着を生物発光によって評価した。次に、マウスは、無作為化され、非形質導入Ｔ細胞、ＣＡＲＴ１９またはＣＡＲＴ２２（５００万個の総細胞、７５％のＣＡＲ発現）を受けた。その後、マウスは、腫瘍負荷、ＰＢ Ｔ細胞増殖、および生存についてモニターされた（図３６Ａ）。生物発光（ＢＬＩ）による腫瘍負荷は、ＣＡＲＴ２２とＣＡＲＴ１９の両方で処置されたマウスにおいて抗白血病応答を示したが、一方、ＵＴＤマウスは急速に進行した（図３６Ｂ）。おそらくＮＡＬＭ－６（ＣＤ１９＞＞ＣＤ２２）における異なる標的発現のために、ＣＡＲＴ１９処置されたマウスは、ＣＡＲＴ２２と比較してより良好な全生存（ＯＳ）を示した（図３６Ｃ）。 同上 図３７Ａおよび図３７Ｂは、原発性ＡＬＬのモデルにおけるＣＡＲＴ２２とＣＡＲＴ１９の間のインビボ比較を示す一連のグラフである。初回ＡＬＬ患者の芽球（ＪＨ３３１）をインビボで継代し、ルシフェラーゼで形質導入して腫瘍負荷を追跡した。実験の概要：１００万個のＪＨ３３１ルシフェラーゼ＋細胞／マウスをＮＳＧマウスにｉ．ｖ．注射した。１４日後、腫瘍の生着を生物発光によって評価した。その後、マウスは、無作為化され、非形質導入Ｔ細胞、ＣＡＲＴ１９またはＣＡＲＴ２２（５００万個の全細胞、７５％のＣＡＲ発現）を受けた。マウスは、腫瘍負荷、ＰＢ Ｔ細胞増殖、および生存についてモニターされた（図３７Ａ）。生物発光（ＢＬＩ）による腫瘍負荷は、ＣＡＲＴ２２とＣＡＲＴ１９の両方で処置されたマウスにおいて抗白血病応答を検出したが、一方、ＵＴＤマウスは急速に進行した（図３７Ｂ）。 同上 図３８Ａ、図３８Ｂ、および図３８Ｃは、免疫組織化学染色により、２８個のヒト正常組織におけるＣＤ２２発現の組織マイクロアレイを示す一連の画像である。リンパ器官は、ＣＤ２２発現（扁桃、リンパ節、脾臓および胸腺）について陽性であった（図３８Ａ）。非リンパ様器官は、ＣＤ２２の発現を示さなかった（図３８Ｂ）。ＣＤ２２陽性の常在性Ｂ細胞は、複数の組織において観察された（図３８Ｃ）。*＝非特異的染色。 同上 同上 図３９は、ＧｅｎｅＡｔｌａｓ Ｕ１３３ＡからのＣＤ２２ ＲＮＡ発現データを示すグラフである。ＣＤ２２発現は、Ｂ細胞、扁桃およびリンパ節において高レベルで観察された。Ｂリンパ芽球および白血病／リンパ腫細胞株もまた高い陽性であった。 同上 同上 同上 図４０は、ＣＡＲＴ２２毒性について５１－クロム放出アッセイを示す一連のグラフである。ＵＴＤ細胞ではなく、ＣＡＲＴ２２とＣＡＲＴ１９の両方は、ＡＬＬ細胞株であるＮＡＬＭ－６の溶解を誘発した。ＣＡＲＴ２２の細胞毒性効果は、いずれの正常組織（ＣＤ３４＋、ヒトニューロン前駆体もしくはニューロンおよびケラチノサイト）または対照（Ｋ５６２細胞株）において観察されなかった。 図４１は、ＦＡＣＳによって評価され、検出試薬としてタンパク質Ｌを使用して非形質導入（ＣＡＲ陰性）細胞におけるシグナルのレベルを超えるシグナルを示す細胞のパーセントとして報告される、抗ＣＤ１２３ ＣＡＲコンストラクトを用いて形質導入されたＪＮＬ細胞におけるＣＡＲ発現のグラフ表示を示す。 図４２Ａ、４２Ｂ、および４２Ｃは、ＪＮＬ細胞におけるＣＤ１２３ ＣＡＲ活性のグラフ表示を示す。抗ＣＤ１２３ ＣＡＲコンストラクトは、ＮＦＡＴプロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーターを含有するＪｕｒｋａｔ細胞株（ＪＮＬ細胞と称する）を用いて活性について評価された。ＣＡＲ活性は、このＮＦＡＴ駆動レポーターの活性化として測定される。 図４３Ａおよび４３Ｂは、ＣＤ１２３発現および活性を示す。図４３Ａは、原発性Ｔ細胞におけるＣＤ１２３ ＣＡＲ発現のグラフ表示を示す。形質導入された細胞のパーセンテージ（細胞表面上の抗ＣＤ１２３ ＣＡＲを発現する）およびそれらの発現の相対蛍光強度は、検出試薬としてタンパク質Ｌを使用するＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａまたはＢＤ－ＦＡＣＳＣａｎｔｏにおけるフローサイトメトリー分析によって決定された。非染色細胞上のシグナルに対するそのＦＡＣＳからの相対蛍光強度のゲーティングヒストグラムプロットは、形質導入されたＴ細胞のパーセンテージを示す。形質導入は、１２～４２％のＣＡＲ陽性細胞の範囲をもたらした。図４３Ｂは、ＣＤ１２３－ＣＡＲＴ媒介性の細胞死滅のグラフ表示を示す。Ｔ細胞死滅は、ルシフェラーゼを安定的に発現するＣＤ１２３発現ＭＯＬＭ１３急性骨髄性白血病細胞に向けられた。非形質導入Ｔ細胞を使用して、非特異的なバックグラウンド死滅レベルを決定した。ＣＡＲＴ－ＣＤ１２３の細胞溶解活性は、エフェクター対標的細胞比が４対１であり、およびＴ細胞の２倍下方希釈の範囲にわたって測定され、この場合、抗ＣＤ１２３キメラ受容体を発現するＴ細胞としてエフェクターが定義された。アッセイは、適切な数のＴ細胞を一定数の標的細胞と混合することによって開始された。２０時間後、ルシフェラーゼシグナルは、ＥｎＶｉｓｉｏｎ装置のＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイを用いて測定された。 図４４Ａおよび４４Ｂは、ＣＤ１２３－ＣＡＲを用いたＴ細胞の形質導入効率を示す。図４４Ａは、１１７２および１１７６を用いたＴ細胞の形質導入効率を示す。図４４Ｂは、ＣＤ１２３ ＣＡＲｓ ２－４を用いたＴ細胞の形質導入効率を示す。 図４５は、ＣＤ４対ＣＤ８比を決定するためのＣＤ１２３ ＣＡＲｓ ２－４ならびに１１７２および１１７６のフローサイトメトリーを示す。 図４６は、ＣＤ１２３＋腫瘍細胞への曝露時のＣＤ１２３ ＣＡＲｓ ２－４ならびに１１７２および１１７６の脱顆粒を示す。 図４７は、腫瘍標的細胞（ＭＯＬＭ１４）に対するＣＡＲＴ細胞（ＮＶＳ ２－４、１１７２および１１７６クローン）の細胞毒性を評価するためのルシフェラーゼアッセイのグラフ表示を示す。 図４８は、Ｄ６（ＣＡＲＴ注射前）および１３日目（ＮＶＳ ２－４、１１７２または１１７６クローンによる注射後６日）または２０日目に、ルシフェラーゼを発現するＭＯＬＭ１４細胞を注射されたＮＳＧマウスにおける腫瘍負荷の比較を示す。 図４９Ａ、図４９Ｂ、図４９Ｃ、図４９Ｄ、図４９Ｅ、および図４９Ｆは、ＣＤ１２３が、ＣＡＲＴ１９処置後に生じるＣＤ１９陰性Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病の再発において高度に発現されることを示す。図４９Ａは、４２人の再発性／難治性ＡＬＬ試料における、ＣＤ１９と比較したＣＤ１２３の発現を示す。図４９Ｂは、Ｂ－ＡＬＬ芽球におけるＣＤ１２３およびＣＤ１９同時発現を示す。芽球にゲートをかける（ＳＳＣ低、シングレット、生存、ＣＤ４５ｄｉｍ）。図４９Ｃは、白血病幹細胞（ＬＳＣ）のゲーティング戦略を示す。ＣＤ１２３は、このサブセットにおいて高度に発現される。図４９Ｄは、ＣＤ１２３およびＣＤ１９の同時発現およびＦＩＳＨ分析の結果を示す。図４９Ｅおよび４９Ｆは、ベースライン時または再発後のＣＤ１９およびＣＤ１２３発現の比較を示す。 同上 同上 図５０Ａ、５０Ｂ、５０Ｃ、５０Ｄ、５０Ｅ、および５０Ｆは、ＣＤ１９ ＣＡＲ（ＣＡＲ１９）またはＣＤ１２３ ＣＡＲ（ＣＡＲ１２３）を発現するＴ細胞を用いた様々なインビトロアッセイの結果を示す。図５０Ａは、ＣＤ１９およびＣＤ１２３の発現を示す；図５０Ｂは、ＣＤ１０７ａ脱顆粒アッセイを示す；図５０Ｃは、標的化された細胞死滅の能力を示す；図５０Ｄおよび５０Ｅは、増殖能を示す；図５０Ｆは、示されたサイトカインについてのサイトカイン産生を示す。 同上 図５１Ａ、図５１Ｂ、および図５１Ｃは、ＣＤ１９ ＣＡＲ（ＣＡＲ１９）またはＣＤ１２３ ＣＡＲ（ＣＡＲ１２３）を発現するＣＡＲＴ細胞が、インビボマウスモデルにおいて抗腫瘍効果を有することを示す。図５１Ａは、生物発光イメージングによって表される腫瘍負荷を示す；図５１Ｂは、ＣＡＲＴ療法を受けたマウスの全生存曲線を示す；図５１Ｃは、末梢血中のＣＡＲＴ１２３細胞の増殖を示す。 図５２Ａ、図５２Ｂ、図５２Ｃ、図５２Ｄ、図５２Ｅ、および図５２Ｆは、ＣＡＲＴ１２３が抗原欠損再発のインビボマウスモデルにおいて活性であることを示す。図５２Ａは、実験概要を示す；図５２Ｂは、ＣＤ１９発現についてベースラインと再発疾患（上のグラフ）、およびＣＡＲＴ１９療法による治療に対する応答（下のグラフ）における生物発光イメージングによって表される疾患の進行を示す；図５２Ｃは、非形質導入Ｔ細胞またはＣＡＲＴ１９細胞を投与したマウスの生物発光画像を示す；図５２Ｄは、ＣＡＲＴ１９またはＣＡＲＴ１２３を用いて治療するための実験概要を示す；図５２Ｅは、疾患の進行を示す；図５２Ｆは、処置されたマウスの全生存率を示す。 同上 同上 同上 図５３Ａ、５３Ｂ、および５３Ｃは、異種移植マウスの頭骨骨髄におけるＡＬＬ－ＣＡＲＴ相互作用を示す。図５３Ａは実験概要を示す；図５３Ｂは、ＣＤ１９およびＣＤ１２３またはＣＤ１２３単独のいずれかを発現するように遺伝子操作された、ＡＬＬ腫瘍と相互作用するＣＡＲＴ１９細胞およびＣＡＲＴ１２３細胞の代表的な多光子ＸＹ平面画像を示す（運動細胞は破線の円で示され、非運動細胞は矢印で示される）；図５３Ｃは、顕微鏡画像のグラフ表現である。 同上 図５４Ａ、５４Ｂ、および５４Ｃは、ＣＡＲＴ１９およびＣＡＲＴ１２３を用いたＣＤ１９陰性再発の予防を示す。図５４Ａは、実験概要を示す；図５４Ｂは、非形質導入Ｔ細胞（上のグラフ）、ＣＡＲＴ１９（中央のグラフ）、またはＣＡＲＴ１９およびＣＡＲＴ１２３の組合せ（下のグラフ）で処置されたマウスの疾患進行（ＢＬＩに代表される腫瘍負荷）を示す；図５４Ｃは、この実験からの全生存率を示す。 同上 図５５Ａおよび５５Ｂは、ＣＡＲ１９とＣＡＲ１２３の両方を発現するＴ細胞（図５５Ａ）および脱顆粒アッセイの結果（図５５Ｂ）を示す。 図５６Ａおよび５６Ｂは、ＡＬＬ芽球の特徴付けを示す。図５６Ａは、様々なマーカーであるＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ１０、ＣＤ３４、およびＣＤ２０の発現を示す；図５６Ｂは、ＣＤ１９－ＣＤ１２３＋細胞を選別するためのゲーティング戦略を示す。 図５７Ａ、図５７Ｂ、図５７Ｃ、および図５７Ｄは、ＣＡＲＴ１２３の抗白血病活性を示す。図５７Ａは、ＮＡＬＭ６細胞におけるＣＤ１９およびＣＤ１２３の発現を示す；図５７Ｂは、ＣＡＲＴ１９またはＣＡＲＴ１２３療法に応答する腫瘍負荷（ＢＬＩに代表される）を示す；図５７Ｃは、ＣＡＲＴ１９またはＣＡＲＴ１２３を投与されたマウスの全生存率を示す；図５７Ｄは、様々な用量のＣＡＲＴ１２３を投与されたマウスの全生存率を示す。 図５８Ａおよび５８Ｂは、抗原損失再発のインビボモデルの特徴付けを示す。図５８Ａは、ＣＤ１９陰性再発疾患におけるＣＤ１２３の発現を示す；図５８Ｂは、インビトロでのベースライン細胞または再発細胞とともに培養した場合のＣＡＲＴ１９またはＣＡＲＴ１２３細胞の脱顆粒アッセイを示す。 図５９は、ＣＡＲ発現形質導入されたＴ細胞の増殖が細胞培養系において低用量のＲＡＤ００１により増強されることを示している。ＣＡＲＴは異なる濃度のＲＡＤ００１（ｎＭ）の存在下でＮＡＬＭ６（Ｎａｌｍ－６）細胞と共培養された。ＣＡＲ陽性ＣＤ３陽性Ｔ細胞（黒色）および全Ｔ細胞（灰色）の数は共培養の４日後に評価された。 図６０は、０．３、１、３、および１０ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）での毎日ＲＡＤ００１投与またはビヒクル投与でのＮＡＬＭ６－ｌｕｃ細胞の腫瘍成長測定を描いている。丸形はビヒクルを表し、四角形は１０ｍｇ／ｋｇ用量のＲＡＤ００１を表し、三角形は３ｍｇ／ｋｇ用量のＲＡＤ００１を表し、逆三角形は１ｍｇ／ｋｇ用量のＲＡＤ００１を表し、ダイアモンド形は０．３ｍｇ／ｋｇ用量のＲＡＤ００１を表す。 図６１Ａおよび６１Ｂは、ＮＡＬＭ６腫瘍を有するＮＳＧマウスの血液中のＲＡＤ００１の量を示す薬物動態曲線を示す。図６１ＡはＲＡＤ００１の最初の投与に続く０日目のＰＫを示す。図６１Ｂは最終ＲＡＤ００１投与に続く１４日目のＰＫを示す。ダイアモンド形は１０ｍｇ／ｋｇ用量のＲＡＤ００１を表し、四角形は１ｍｇ／ｋｇ用量のＲＡＤ００１を表し、三角形は３ｍｇ／ｋｇ用量のＲＡＤ００１を表し、ｘは１０ｍｇ／ｋｇ用量のＲＡＤ００１を表す。 図６２Ａおよび６２Ｂは、ＲＡＤ００１投与する、およびしないヒト化ＣＤ１９ ＣＡＲＴ細胞のインビボ増殖を示している。毎日の低用量のＲＡＤ００１（０．００３ｍｇ．ｋｇ）により、ｈｕＣＡＲ１９増殖の正常レベルを超えて、ＣＡＲ Ｔ細胞増殖は増強される。図６２ＡはＣＤ４＋ＣＡＲ Ｔ細胞を示す；図６２ＢはＣＤ８＋ＣＡＲ Ｔ細胞を示す。丸形はＰＢＳを表し、四角形はｈｕＣＴＬ０１９を表し、三角形は３ｍｇ／ｋｇ ＲＡＤ００１でのｈｕＣＴＬ０１９を表し、逆三角形は０．３ｍｇ／ｋｇ ＲＡＤ００１でのｈｕＣＴＬ０１９を表し、ダイアモンド形は０．０３ｍｇ／ｋｇ ＲＡＤ００１でのｈｕＣＴＬ０１９を表し、黒色の丸形は０．００３ｍｇ／ｋｇ ＲＡＤ００１でのｈｕＣＴＬ０１９を表す。 図６３は、原発性および続発性ヒトＤＬＢＣＬ患者試料におけるＣＤ３＋／ＰＤ－１＋細胞集団間の有意差を示す多重ＦＩＨＣ ＡＱＵＡ分析を示す。 図６４は、ＤＬＢＣＬ試料の原発性および続発性部位における種々のレベルのＣＤ１９（下段パネル）およびＰＤ－Ｌ１（上段パネル）を示すＡＱＵＡ分析を示す。総数４０人のヒトＤＬＢＣＬ患者試料、２５個の原発性部位および１５個の続発性部位を多重ＦＩＨＣに供され、続いてＡＱＵＡ分析を行い、ＣＤ１９およびＰＤ－Ｌ１タンパク質の発現レベルを同定した。 図６５は、ＣＡＲ発現細胞の２つの集団の模式図を示す。左側の集団（プールされた）において、各細胞は１種類のＣＡＲを発現する。右側の集団（２シストロン性ＣＡＲ）において、各細胞は２種類のＣＡＲを発現する。 図６６は、バイシストロン性ＣＡＲの図を示す。上段ＣＡＲは、Ｐ２Ａプロテアーゼ切断部位によって分離されたＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ２２ ＣＡＲを有する。下段ＣＡＲは、Ｐ２Ａプロテアーゼ切断部位によって分離されたＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ１２３ ＣＡＲを有する。 図６７は、バイシストロン性ベクターからのＣＤ１９およびＣＤ２２ ＣＡＲの同時発現を示す。 図６８は、バイシストロン性ベクターからのＣＤ１９およびＣＤ１２３ ＣＡＲの同時発現を示す。図６８下のパネルは、これらの細胞の抗白血病効果を示す。 図６９は、ＵＴＤ対照、ＣＡＲＴ１９、またはＣＡＲＴ２２による処置後のＣＤ１９陰性Ｂ－ＡＬＬ異種移植片を有するマウスにおける腫瘍負荷を示す。 図７０は、５人のＣＲ患者、１人の未分類の患者、および６人のＰＤ患者由来のリンパ節および骨髄試料におけるＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１、ＬＡＧ３、およびＴＩＭ３（４つのバーの各セットにおいて左から右）の発現を示す 図７１は、ｍ９７１競合物質の存在下および非存在下におけるいくつかのＣＤ２２ ＣＡＲコンストラクトの活性化（ＲＬＵ）を示すグラフである。 図７２は、追加のＣＤ２２ ＣＡＲコンストラクトの活性化（ＲＬＵ）を示すグラフである。 図７３は、ＩＦＮ－γアッセイにおけるＣＤ２２ ＣＡＲ活性を示す３つの棒グラフを示す。 図７４は、ＣＤ２２－６４およびＣＤ２２－６５ ＣＡＲの結合活性を示す。 図７５は、様々なＣＤ２２ ｓｃＦｖによって結合されたエピトープをマッピングする図である。
定義
特に他の指定がない限り、本明細書において使用される全ての専門用語や科学用語は、本発明が関連する当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、文法上の目的語である物品が１つであるか、または１つより多く（すなわち、少なくとも１つの）であることを指す。一例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または１つより多くの要素を意味する。
用語「約」は、量、一時的な持続時間、および同種のものなどの測定可能な値を指す場合、規定された値から、±２０％の変動、またはいくつかの場合において±１０％の変動、またはいくつかの場合において±５％の変動、またはいくつかの場合において±１％の変動、またはいくつかの場合において±０．１％の変動を包含することを意味しており、これはなぜなら、このような変動は開示された方法を行うのに適切であるためである。
用語「アフェレーシス」は、本明細書で使用される場合、当業界で認識されている体外プロセスであって、ドナーまたは患者の血液を、そのドナーまたは患者から除去し、選択された特定の成分を分離除去する装置を通過させ、残りを、ドナーまたは患者の循環に、例えば返血によって戻すプロセスを指す。したがって、「アフェレーシス試料」は、アフェレーシスを使用して得られた試料を指す。
用語「生物学的に同等な」は、参照化合物（例えば、ＲＡＤ００１）の参照用量または参照量によって生産された作用と同等な作用を生産するのに必要な、参照化合物（例えば、ＲＡＤ００１）以外の薬剤の量を指す。一実施形態において、作用は、例えば、Ｐ７０Ｓ６キナーゼ阻害によって測定される場合の、例えば、インビボ（in vivo）またはインビトロでのアッセイで評価される場合の、例えば、本明細書で説明されるアッセイ、例えばＢｏｕｌａｙアッセイ、またはウェスタンブロットによるリン酸化されたＳ６のレベルの測定によって測定される場合のｍＴＯＲ阻害のレベルである。一実施形態において、作用は、セルソーティングによって測定される場合のＰＤ－１陽性／ＰＤ－１陰性Ｔ細胞の比率の変更である。一実施形態において、ｍＴＯＲ阻害剤の生物学的に同等な量または用量は、参照化合物の参照用量または参照量が達成するのと同じレベルのＰ７０Ｓ６キナーゼ阻害を達成する量または用量である。一実施形態において、ｍＴＯＲ阻害剤の生物学的に同等なもの量または用量は、参照化合物の参照用量または参照量が達成するのと同じレベルの、ＰＤ－１陽性／ＰＤ－１陰性Ｔ細胞の比率における変更を達成する量または用量である。
用語「阻害」または「阻害剤」は、ある特定のパラメーターの低下、例えば、所与の分子、例えばＣＤ２０、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａ、の活性の低下を包含する。例えば、活性の阻害、例えばＣＤ２０、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａの活性の、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％以上阻害が、この用語によって包含される。したがって、阻害が１００％である必要はない。阻害剤の活性は、本明細書で説明されるように判定してもよく、または当業界公知のアッセイによって判定してもよい。「Ｂ細胞阻害剤」は、Ｂ細胞のある特定のパラメーター、例えば活性、例えば成長もしくは増殖の低下を引き起こす、またはＢ細胞に関連する分子のある特定のパラメーター、例えば活性の低下を引き起こす分子、例えば、小分子、抗体、ＣＡＲ、またはＣＡＲを含む細胞である。Ｂ細胞に関連する分子の非限定的な例としては、Ｂ細胞の表面で発現されるタンパク質、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａが挙げられる。
用語「キメラ抗原受容体」またはその代わりに「ＣＡＲ」は、免疫エフェクター細胞中にあるとき、標的細胞、典型的にはがん細胞への特異性および細胞内シグナルの生成をその細胞にもたらすポリペプチドのセット、最も簡単な実施形態では典型的には２つのポリペプチドのセットを指す。一部の実施形態において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、下記で定義されるような刺激分子および／または共刺激分子由来の機能的なシグナル伝達ドメインを含む細胞質内シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称される）とを少なくとも含む。一部の実施形態において、ポリペプチドのセットは、同じポリペプチド鎖中にあり、例えば、キメラ融合タンパク質を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドのセットは、互いに連続しておらず、例えば、異なるポリペプチド鎖中にある。一部の実施形態において、ポリペプチドのセットは、二量体化分子の存在下でポリペプチドを互いにカップリングすることができ、例えば抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインにカップリングすることができる、二量体化スイッチを包含する。一態様において、ＣＡＲの刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体と会合しているゼータ鎖（例えば、ＣＤ３ゼータ）である。一態様において、細胞質内のシグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３－ゼータの一次シグナル伝達ドメイン）を含む。一態様において、細胞質内シグナル伝達ドメインは、以下で定義されるような少なくとも１つの共刺激分子由来の１つまたは複数の機能的なシグナル伝達ドメインをさらに含む。一態様において、共刺激分子は、本明細書で説明される共刺激分子、例えば、４－１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７および／またはＣＤ２８から選ばれる。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、刺激分子由来の機能的なシグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、共刺激分子由来の機能的なシグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的なシグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、１つまたは複数の共刺激分子由来の２つの機能的なシグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的なシグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、１つまたは複数の共刺激分子由来の少なくとも２つの機能的なシグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的なシグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様において、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ－ｔｅｒ）に任意のリーダー配列を含む。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＮ末端におけるリーダー配列をさらに含み、ここでリーダー配列は、細胞内プロセシングおよび細胞膜へのＣＡＲの局在化の間に、抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）から切断されてもよい。
成句「ＣＤ２０の発現に関連する疾患」は、本明細書で使用される場合、例えば、がんもしくは悪性腫瘍などの増殖性疾患、または脊髄形成異常、骨髄異形成症候群もしくは前白血病状態などの前がん状態を包含する、ＣＤ２０（例えば、野生型または突然変異ＣＤ２０）の発現に関連する疾患、またはＣＤ２０（例えば、野生型または突然変異ＣＤ２０）を発現するか、もしくはいずれかの時点で発現していた、細胞に関連する状態；あるいはＣＤ２０（例えば、野生型または突然変異ＣＤ２０）を発現する細胞に関連する非がん関連の徴候を包含するが、これらに限定されない。誤解を避けるために言えば、ＣＤ２０の発現に関連する疾患は、例えば、ＣＤ２０発現が、例えば、ＣＤ２０を標的とする分子、例えばＣＤ２０ ＣＡＲでの処置のため、下方調節されているために現時点ではＣＤ２０を発現しないが、かつてはＣＤ２０を発現していた細胞に関連する状態を包含し得る。一態様において、ＣＤ２０の発現に関連するがんは、血液がんである。一態様において、血液がんとしては、ＡＭＬ、骨髄異形成症候群、ＡＬＬ、ヘアリーセル白血病、前リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、芽球性形質細胞様樹状細胞の新生物および同種のものが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ＣＤ２０発現の発現に関連する疾患としては、例えば、ＣＤ２０の発現に関連する非定型的および／または非典型的ながん、悪性腫瘍、前がん状態または増殖性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＤ２０の発現に関連する非がん関連の徴候も挙げることができる。一部の実施形態において、ＣＤ２０発現細胞は、ＣＤ２０ ｍＲＮＡを発現するか、またはいずれかの時点で発現していた。ある実施形態において、ＣＤ２０発現細胞は、ＣＤ２０タンパク質（例えば、野生型または突然変異）を産生し、そのＣＤ２０タンパク質が正常なレベルで存在することもあり、または低下したレベルで存在することもある。ある実施形態において、ＣＤ２０発現細胞は、ある時点で検出可能なレベルのＣＤ２０タンパク質を産生したが、その後、実質的に検出可能なＣＤ２０タンパク質を産生しなかった。
成句「ＣＤ２２の発現に関連する疾患」は、本明細書で使用される場合、例えば、がんもしくは悪性腫瘍などの増殖性疾患、または脊髄形成異常、骨髄異形成症候群もしくは前白血病状態などの前がん状態を包含する、ＣＤ２２（例えば、野生型または突然変異ＣＤ２２）の発現に関連する疾患、またはＣＤ２２（例えば、野生型または突然変異ＣＤ２２）を発現するか、もしくはいずれかの時点で発現していた、細胞に関連する状態；あるいはＣＤ２２（例えば、野生型または突然変異ＣＤ２２）を発現する細胞に関連する非がん関連の徴候を包含するが、これらに限定されない。誤解を避けるために言えば、ＣＤ２２の発現に関連する疾患は、例えば、ＣＤ２２発現が、例えば、ＣＤ２２を標的とする分子、例えばＣＤ２２ ＣＡＲでの処置のため、下方調節されているために現時点ではＣＤ２２を発現しないが、かつてはＣＤ２２を発現していた細胞に関連する状態を包含し得る。一態様において、ＣＤ２２の発現に関連するがんは、血液がんである。一態様において、血液がんとしては、ＡＭＬ、骨髄異形成症候群、ＡＬＬ、ヘアリーセル白血病、前リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、芽球性形質細胞様樹状細胞の新生物および同種のものが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ＣＤ２２発現の発現に関連する疾患としては、例えば、ＣＤ２２の発現に関連する非定型的および／または非典型的ながん、悪性腫瘍、前がん状態または増殖性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＤ２２の発現に関連する非がん関連の徴候も挙げることができる。一部の実施形態において、ＣＤ２２発現細胞は、ＣＤ２２ ｍＲＮＡを発現するか、またはいずれかの時点で発現していた。ある実施形態において、ＣＤ２２発現細胞は、ＣＤ２２タンパク質（例えば、野生型または突然変異）を産生し、そのＣＤ２２タンパク質が正常なレベルで存在することもあり、または低下したレベルで存在することもある。ある実施形態において、ＣＤ２２発現細胞は、ある時点で検出可能なレベルのＣＤ２２タンパク質を産生したが、その後、実質的に検出可能なＣＤ２２タンパク質を産生しなかった。
本明細書で使用される場合、特に他の指定がない限り、用語「予防する」、「予防すること」および「予防」は、対象が前記状態に苦しみ始める前にまたは前記状態の再発前に行われる行為を指す。予防は、前記状態の完全な予防をもたらす必要がなく、前記状態または前記状態の症状の部分的予防もしくは軽減、または前記状態を発症するリスクの低下が、この用語に包含される。
「組み合わせて」投与されるとは、本明細書で使用される場合、対象が障害に罹っている間に、２種の（またはそれより多くの）異なる処置が対象にデリバリーされることを意味し、例えば、対象が障害を有すると診断された後、かつ障害が治癒もしくは除去されたり、または他の理由で処置が中止されたりする前に、２種以上の処置がデリバリーされる。いくつかの実施形態において、投与に関して重複があるように、１種の処置のデリバリーが、第二のデリバリーが始まるときもなお行われている。これは、本明細書では「同時」または「並列デリバリー」とも称されることもある。他の実施形態において、１つの処置のデリバリーは、他の処置のデリバリーが始まる前に終わる。いずれのケースのいくつかの実施形態において、投与を組み合わせることによって、処置はより有効である。例えば、第二の処置を行わなかった場合と等しい作用が見られるか、または第一の処置の非存在下で第二の処置が投与された場合に見られると予想される程度、もしくは第一の処置を用いて類似の状況が見られる程度より大きい程度に、第二の処置が症状を低減する場合、例えば、第二の処置はより有効である。いくつかの実施形態において、デリバリーは、症状、または障害に関する他のパラメーターの低減が、他方の非存在下でデリバリーされた一方の処置で観察されると予想されるパラメーターの低減より大きくなるようなデリバリーである。２つの処置の作用は、部分的に相加的、全体的に相加的、またはそれより大きく相加的であってもよい。デリバリーは、デリバリーされた第一の処置の作用が、第二がデリバリーされたときもなお検出可能になるようなデリバリーであってもよい。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、本明細書で説明される用量および／または投与スケジュールで投与され、Ｂ細胞阻害剤、またはＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、本明細書で説明される用量および／または投与スケジュールで投与される。
「由来の」は、この用語が本明細書で使用される場合、第一の分子と第二の分子との関係を示す。これは一般的に、第一の分子と第二の分子との構造的な類似性を指し、第二の分子由来の第一の分子におけるプロセスまたは源の限定を意味したりまたは包含したりしない。例えば、ＣＤ３ゼータ分子由来の細胞内シグナル伝達ドメインのケースにおいて、細胞内シグナル伝達ドメインは、必要な機能、すなわち、適切な条件下でシグナルを生成する能力を有するのに十分なＣＤ３ゼータ構造を保持する。これは、細胞内シグナル伝達ドメインを生産する特定のプロセスへの限定を意味したりまたは包含したりすることはなく、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインを提供するために、ＣＤ３ゼータ配列から開始して不要な配列を欠失させたりまたは突然変異を付与したりして、細胞内シグナル伝達ドメインを得なければならないことを意味しない。
用語「シグナル伝達ドメイン」は、第２メッセンジャーを生成したり、またはこのようなメッセンジャーに応答してエフェクターとして機能化したりすることにより規定のシグナル伝達経路を介して細胞活性を調節するために、細胞内の情報を伝えることによって作用するタンパク質の機能的な部分を指す。
本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ１９」は、白血病前駆細胞上で検出可能な抗原決定基である、表面抗原分類１９タンパク質を指す。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔおよびＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔなどの公開データベースで見出すことができる。例えば、ヒトＣＤ１９のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ１５３９１として見出すことができ、ヒトＣＤ１９をコードする（encoding of）ヌクレオチド配列は、受託番号ＮＭ＿００１１７８０９８で見出すことができる。本明細書で使用される場合、「ＣＤ１９」は、完全長野生型ＣＤ１９の突然変異、例えば点突然変異、フラグメント、挿入、欠失およびスプライス変異体を含むタンパク質を包含する。ＣＤ１９は、例えば、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病および非ホジキンリンパ腫を包含する、ほとんどのＢ系統のがんにおいて発現される。ＣＤ１９を発現する他の細胞（Other cells with express CD19）は、下記の「ＣＤ１９の発現に関連する疾患」の定義において提供される。これは、Ｂ細胞前駆体の初期マーカーでもある。例えば、Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)を参照されたい。一態様において、ＣＡＲＴの抗原結合部分は、ＣＤ１９タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、それに結合する。一態様において、ＣＤ１９タンパク質は、がん細胞上で発現される。
用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子由来のタンパク質またはポリペプチド配列を指す。抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナルの、複数もしくは単一の鎖の、または無傷の免疫グロブリンであってもよく、自然源由来でもよいし、または組換え源由来でもよい。抗体は、免疫グロブリン分子の四量体であってもよい。
用語「抗体フラグメント」は、抗原のエピトープと（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布によって）特異的に相互作用する能力を保持する、抗体の少なくとも一部を指す。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；線形抗体；単一ドメイン抗体、例えばｓｄＡｂ（ＶＬまたはＶＨのいずれか）；ラクダ化ＶＨＨドメイン；ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントなどの抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体；および抗体の単離されたＣＤＲまたは他のエピトープ結合フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。抗原結合フラグメントはまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ－ＮＡＲおよびビス－ｓｃＦｖに取り込まれていてもよい（例えば、Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005を参照）。抗原結合フラグメントは、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）などのポリペプチドをベースとした足場にグラフト化することもできる（フィブロネクチンポリペプチドのミニボディを説明している米国特許第６，７０３，１９９号を参照）。
用語「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメントと重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメントとを含む融合タンパク質であって、軽鎖および重鎖可変領域が、例えば合成リンカー、例えば短いフレキシブルなポリペプチドリンカーを介して連続的に連結されており、単一鎖のポリペプチドとして発現することができ、さらにｓｃＦｖが、その元となった無傷の抗体の特異性を保持している、上記融合タンパク質を指す。特段の規定がなければ、ｓｃＦｖは、本明細書で使用される場合、ＶＬおよびＶＨ可変領域をいずれの順番で有していてもよく、例えばポリペプチドのＮ末端およびＣ末端の終端に関して、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含んでいてもよいし、またはＶＨ－リンカー－ＶＬを含んでいてもよい。
用語「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、本明細書で使用される場合、抗原特異性と結合親和性を付与する抗体可変領域内のアミノ酸配列を指す。例えば、一般的に、各重鎖可変領域中に３つのＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）および各軽鎖可変領域中に３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）がある。所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列の境界は、Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）によって説明されたもの、またはそれらの組合せなどの多数の周知のスキームのいずれかを使用して決定することができる。Ｋａｂａｔ番号付けスキームによれば、一部の実施形態において、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）におけるＣＤＲのアミノ酸残基は、３１～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）、および９５～１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けされ、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）におけるＣＤＲのアミノ酸残基は、２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）、および８９～９７（ＬＣＤＲ３）と番号付けされる。Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームによれば、一部の実施形態において、ＶＨにおけるＣＤＲのアミノ酸は、２６～３２（ＨＣＤＲ１）、５２～５６（ＨＣＤＲ２）、および９５～１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けされ、ＶＬにおけるＣＤＲのアミノ酸残基は、２６～３２（ＬＣＤＲ１）、５０～５２（ＬＣＤＲ２）、および９１～９６（ＬＣＤＲ３）と番号付けされる。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームの組合せでは、一部の実施形態において、ＣＤＲは、ＫａｂａｔのＣＤＲ、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ、またはその両方の一部であるアミノ酸残基に相当する。例えば、一部の実施形態において、ＣＤＲは、ＶＨ、例えば哺乳動物のＶＨ、例えばヒトＶＨにおいて、アミノ酸残基２６～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）、および９５～１０２（ＨＣＤＲ３）；ならびにＶＬ、例えば哺乳動物のＶＬ、例えばヒトＶＬにおいて、アミノ酸残基２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）、および８９～９７（ＬＣＤＲ３）に相当する。
本明細書で使用される場合、用語「結合ドメイン」または「抗体分子」は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質、例えば免疫グロブリン鎖またはそのフラグメントを指す。用語「結合ドメイン」または「抗体分子」は、抗体および抗体フラグメントを包含する。ある実施形態において、抗体分子は、多重特異性抗体分子であり、例えば、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、前記複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列の第一の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第一のエピトープへの結合特異性を有し、前記複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列の第二の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第二のエピトープへの結合特異性を有する。一実施形態において、多重特異性抗体分子は、二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体は、２つ以下の抗原に特異性を有する。二重特異性抗体分子は、第一のエピトープに結合特異性を有する第一の免疫グロブリンの可変ドメイン配列および第二のエピトープに結合特異性を有する第二の免疫グロブリンの可変ドメイン配列を特徴とする。用語「抗体重鎖」は、それらの天然に存在するコンフォメーションの抗体分子中に存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうち大きい方を指し、通常これが抗体が属するクラスを決定する。
抗体またはそれらの抗体フラグメントを含む本発明のＣＡＲの一部は、様々な形態で存在していてもよく、その場合、抗原結合ドメインは、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント（ｓｄＡｂ）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体、二重特異性抗体などの連続的ポリペプチド鎖の一部として発現される（Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426）。一態様において、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインは、抗体フラグメントを含む。さらなる態様において、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。
用語「抗体重鎖」は、それらの天然に存在するコンフォメーションの抗体分子中に存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうち大きい方を指し、通常これが抗体が属するクラスを決定する。
用語「抗体軽鎖」は、それらの天然に存在するコンフォメーションの抗体分子中に存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうち小さい方を指す。カッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
用語「組換え抗体」は、例えばバクテリオファージまたは酵母発現系によって発現される抗体などの、組換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体を指す。この用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子（このＤＮＡ分子は抗体タンパク質を発現する）、または抗体を指定するアミノ酸配列の合成によって生成された抗体も意味すると解釈されるものとし、この場合、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当業界で利用可能であり周知の組換えＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を使用して得られたものである。
用語「抗原」または「Ａｇ」は、免疫反応を惹起する分子を指す。この免疫反応は、抗体産生または特異的な免疫担当細胞の活性化のいずれか、またはその両方を含み得る。当業者であれば、実質的に全てのタンパク質またはペプチドを包含するあらゆる高分子が抗原として役立つ可能性があることを理解しているものと予想される。さらに抗原は、組換えまたはゲノムＤＮＡ由来であってもよい。当業者であれば、免疫反応を惹起するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的なヌクレオチド配列を含むあらゆるＤＮＡが、結果的に本明細書において抗原という用語が使用される場合と同様の「抗原」をコードすることを理解しているものと予想される。さらに当業者であれば、抗原は、必ずしも遺伝子の全長ヌクレオチド配列によってのみコードされるわけではないことを理解しているものと予想される。本発明は、これらに限定されないが、１つより多くの遺伝子の部分的なヌクレオチド配列の使用を包含すること、さらに望ましい免疫反応を惹起するポリペプチドがコードされるように、これらのヌクレオチド配列は様々な組合せで配置されることが容易に理解される。さらに当業者であれば、抗原は、必ずしも「遺伝子」によってコードされていなくてもよいことを理解しているものと予想される。抗原は、生成されるか合成されてもよく、または生体試料由来であってもよく、またはポリペプチド以外にも高分子であってもよいことが容易に理解される。このような生体試料としては、これらに限定されないが、組織試料、腫瘍試料、細胞または他の生物学的成分を含む流体を挙げることができる。
用語「競合する」または「交差競合する」は、抗体分子、例えば本明細書において提供される抗ＣＤ２０またはＣＤ２２抗体分子の、標的、例えばヒトＣＤ２０またはＣＤ２２への結合に干渉する抗体分子の能力を指すために、本明細書において同義的に使用される。結合への干渉は、直接的であってもよく、または間接的（例えば、抗体分子もしくは標的のアロステリックな改変によって）であってもよい。抗体分子が別の抗体分子の標的への結合に干渉することができる程度および、したがって、それを競合すると言うことができるかどうかは、例えば本明細書で説明されるような、競合結合アッセイを使用して判定することができる。一部の実施形態において、競合結合アッセイは、定量的競合アッセイである。一部の実施形態において、競合結合アッセイ（例えば、本明細書で説明される競合アッセイ）において、第一の抗体分子の標的への結合が１０％以上、例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、低減された場合、第一の抗体分子は、標的への結合について第二の抗体分子と競合すると言われる。
本明細書で使用される場合、用語「エピトープ」は、抗体分子と特異的に相互作用する抗原（例えば、ヒトＣＤ２０またはＣＤ２２）の成分を指す。このような成分は、本明細書ではエピトープ決定基と称され、典型的には、アミノ酸側鎖もしくは糖側鎖などの要素を含むか、またはそのような要素の一部である。エピトープ決定基（determinate）は、例えば、当業界公知のまたは本明細書で開示される方法によって、例えば、結晶学によって、または水素－重水素交換によって定義することができる。エピトープ決定基と特異的に相互作用する、抗体分子上の成分の少なくとも１つまたはいくつかは、典型的には、ＣＤＲ内に位置する。典型的に、エピトープは、特異的な三次元構造の特徴を有する。典型的に、エピトープは、特異的な電荷の特徴を有する。直線状エピトープであるエピトープもあり、その一方で、立体構造エピトープであるエピトープもある。
用語「抗がん作用」は、これらに限定されないが、例えば、腫瘍容積の減少、がん細胞の数の減少、転移の数の減少、期待寿命の増加、がん細胞増殖の減少、がん細胞生存の減少、またはがん性状態に関連する様々な生理学的な症状の改善などの、様々な手段によって証明することができる生物学的作用を指す。「抗がん作用」はまた、最初の場所でのがん発生の予防における、本明細書で説明されるペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力によって証明することもできる。用語「抗腫瘍効果」は、これらに限定されないが、例えば、腫瘍容積の減少、腫瘍細胞の数の減少、腫瘍細胞増殖の減少、または腫瘍細胞生存の減少などの、様々な手段によって証明することができる生物学的作用を指す。
用語「自己」は、後でそれが再導入されることになる個体と同じ個体由来のあらゆる材料を指す。
用語「同種異系」は、材料が導入される個体と同じ種の異なる動物由来のあらゆる材料を指す。２以上の個体は、１つまたは複数の遺伝子座における遺伝子が同一ではない場合、互いに同種異系といわれる。いくつかの態様において、同じ種の個体からの同種異系材料は、抗原的に相互作用するのに十分な程度、遺伝学的に異なっていてもよい。
用語「異種」は、異なる種の動物由来の移植片を指す。
用語「がん」は、異常な細胞の制御不能な成長を特徴とする疾患を指す。がん細胞は、局所的に、または血流およびリンパ系を介して体の他の部分に蔓延する可能性がある。様々ながんの例が本明細書で説明されており、これらに限定されないが、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、結腸直腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がんおよび同種のものが挙げられる。用語「腫瘍」および「がん」は、本明細書において同義的に使用され、例えば、どちらの用語も、固体および液性、例えば、びまん性または循環性の腫瘍を包含する。用語「がん」または「腫瘍」は、本明細書で使用される場合、前がん性の、同様に悪性のがんおよび腫瘍を包含する。
用語「がん関連抗原」または「腫瘍抗原」または「増殖性障害抗原」または「増殖性障害に関連する抗原」は、全体的にまたはフラグメントとして（例えば、ＭＨＣ／ペプチド）のいずれかで、正常細胞と比較してがん細胞の表面で優先的に発現され、がん細胞への医薬物質の優先的な標的化に有用である、分子（典型的にはタンパク質、炭水化物または脂質）を同義的に指す。一部の実施形態において、腫瘍抗原は、正常細胞とがん細胞の両方によって発現されるマーカー、例えば系統マーカー、例えば、Ｂ細胞上のＣＤ１９である。ある特定の態様において、本発明の腫瘍抗原は、原発性または転移性黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺がん、肝臓がん、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎臓がん、および腺癌、例えば乳がん、前立腺がん、卵巣がん、膵臓がんおよび同種のものを包含するがこれらに限定されない、がんに由来する。一部の実施形態において、腫瘍抗原は、特定の増殖性障害に共通である抗原である。一部の実施形態において、がん関連抗原は、正常細胞と比較してがん細胞において過剰発現される、例えば、正常細胞と比較して、１倍の発現、２倍の過剰発現、３倍の過剰発現またはそれ以上である細胞表面分子である。一部の実施態様において、がん関連抗原は、がん細胞において不適切に合成される細胞表面分子、例えば、正常細胞で発現された分子と比較して欠失、付加または突然変異を含有する分子である。一部の実施形態において、がん関連抗原は、全体が、またはフラグメント（例えば、ＭＨＣ／ペプチド）として、排他的にがん細胞の細胞表面で発現され、正常細胞の表面では合成も発現もされない。一部の実施形態において、本発明のＣＡＲは、ＭＨＣによって提示されるペプチドに結合する抗原結合ドメイン（例えば、抗体または抗体フラグメント）を含むＣＡＲを包含する。通常、内因性タンパク質由来のペプチドは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子のポケットを満たし、ＣＤ８＋Ｔリンパ球上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって認識される。ＭＨＣクラスＩ複合体は、全ての有核細胞によって構成的に発現される。がんにおいて、ウイルス特異的および／または腫瘍特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体は、免疫療法のための細胞表面標的の特有なクラスの代表である。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）－Ａ１またはＨＬＡ－Ａ２の状況においてウイルスまたは腫瘍抗原由来のペプチドを標的とするＴＣＲ様抗体が、説明されている［例えば、Sastry et al., J Virol.2011 85(5):1935-1942；Sergeeva et al., Bood, 2011 117(16):4262-4272；Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165；Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21):1601-1608；Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176):176ra33；Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100を参照されたい］。例えば、ＴＣＲ様抗体は、ヒトｓｃＦｖファージ提示型ライブラリーなどのライブラリーをスクリーニングすることにより同定することができる。
成句「ＣＤ１９の発現に関連する疾患」は、例えば、がんもしくは悪性腫瘍などの増殖性疾患、または脊髄形成異常、骨髄異形成症候群もしくは前白血病状態などの前がん状態を包含する、ＣＤ１９（例えば、野生型または突然変異ＣＤ１９）の発現に関連する疾患、またはＣＤ１９（例えば、野生型または突然変異ＣＤ１９）を発現するか、もしくはいずれかの時点で発現していた、細胞に関連する状態；あるいはＣＤ１９を発現する細胞に関連する非がん関連の徴候を包含するが、これらに限定されない。誤解を避けるために言えば、ＣＤ１９の発現に関連する疾患は、例えば、ＣＤ１９発現が、例えばＣＤ１９を標的とする分子、例えばＣＤ１９ ＣＡＲ、での処置のため、下方調節されているために現時点ではＣＤ１９を発現しないが、かつてはＣＤ１９を発現していた細胞に関連する状態を包含する。一態様において、ＣＤ１９の発現に関連するがんは、血液がんである。一態様において、血液がんは、白血病またはリンパ腫である。一態様において、ＣＤ１９発現に関連するがんは、例えば、これらに限定されないが、例えば、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）などの１つまたは複数の急性白血病；これらに限定されないが、例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）などの１種または複数の慢性白血病などのがんおよび悪性腫瘍を包含するが、これらに限定されない。ＣＤ１９の発現に関連する追加のがんまたは血液学的な状態としては、これらに限定されないが、例えば、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞の新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリーセル白血病、小細胞型または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性のリンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、脊髄形成異常および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞リンパ腫、形質細胞様樹状細胞の新生物、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、および骨髄の血液細胞の無効な生産（または異形成）を併せもつ血液学的な状態の多様な集合体である「前白血病状態」、および同種のものが挙げられる。さらに、ＣＤ１９発現の発現に関連する疾患としては、例えば、ＣＤ１９の発現に関連する非定型的および／または非典型的ながん、悪性腫瘍、前がん状態または増殖性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＤ１９の発現に関連する非がん関連の徴候としては、例えば、自己免疫疾患（例えば、狼瘡）、炎症性障害（アレルギーおよび喘息）および移植が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、ＣＤ１９発現細胞は、ＣＤ１９ ｍＲＮＡを発現するか、またはいずれかの時点で発現していた。ある実施形態において、ＣＤ１９発現細胞は、ＣＤ１９タンパク質（例えば、野生型または突然変異）を産生し、そのＣＤ１９タンパク質が正常なレベルで存在することもあり、または低下したレベルで存在することもある。ある実施形態において、ＣＤ１９発現細胞は、ある時点で検出可能なレベルのＣＤ１９タンパク質を産生したが、その後は実質的に検出可能なＣＤ１９タンパク質を産生しなかった。
用語「保存的配列改変」は、そのアミノ酸配列を含有する抗体または抗体フラグメントの結合特徴に有意に影響を与えたりまたは変更したりしないアミノ酸改変を指す。このような保存的改変としては、アミノ酸の置換、付加および欠失が挙げられる。改変は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ介在変異誘発などの当業界公知の標準的な技術によって本発明の抗体または抗体フラグメントに導入することができる。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当業界において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を包含する。したがって、本発明のＣＡＲ内の１つまたは複数のアミノ酸残基が、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基で置き換えられていてもよく、変更されたＣＡＲは、本明細書で説明される機能アッセイを使用してテストすることができる。
用語「刺激」は、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＡＲ）とその同起源のリガンド（またはＣＡＲの場合は腫瘍抗原）との結合により誘導される一次応答を指し、それによって、これらに限定されないが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達、またはＣＡＲの適切なＮＫ受容体もしくはシグナル伝達ドメインを介したシグナル伝達などの、シグナル伝達事象が媒介される。刺激は、ある特定の分子の変更された発現を媒介することもある。
用語「刺激分子」は、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくとも一部の態様に関して、刺激の形で免疫細胞の活性化を調節する細胞質内シグナル伝達配列をもたらす免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞またはＢ細胞によって発現される分子を指す。一態様において、シグナルは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とペプチドを提示したＭＨＣ分子との結合によって始動する一次シグナルであり、それにより、これらに限定されないが、増殖、活性化、分化、および同種のものなどのＴ細胞応答の媒介が起こる。刺激の形態で作用する一次細胞質内シグナル伝達配列（また、「一次シグナル伝達ドメイン」とも称される）は、シグナル伝達モチーフを含有していてもよく、これは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られている。本発明において特定の用途を有する細胞質内シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例としては、これらに限定されないが、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲ１ｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２由来のものが挙げられる。本発明の特定のＣＡＲにおいて、本発明のいずれか１つまたは複数のＣＡＲにおける細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達配列、例えばＣＤ３－ゼータの一次シグナル伝達配列を含む。本発明の特定のＣＡＲにおいて、ＣＤ３－ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号１７として提供される配列であるか、または非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿および同種のものからの等価の残基である。本発明の特定のＣＡＲにおいて、ＣＤ３－ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号４３で提供される配列であるか、または非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿および同種のものからの等価の残基である。
用語「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」は、その表面上に主要組織適合複合体（ＭＨＣ）と複合体化した外来抗原を提示するアクセサリー細胞（例えば、Ｂ細胞、樹状細胞、および同種のもの）などの免疫系細胞を指す。Ｔ細胞は、それらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用してこれらの複合体を認識する可能性がある。ＡＰＣは抗原をプロセシングし、それらをＴ細胞に提示させる。
「免疫エフェクター細胞」は、この用語が本明細書において使用される場合、免疫応答、例えば、免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞を指す。免疫エフェクター細胞の例としては、Ｔ細胞、例えば、アルファ／ベータＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫ－Ｔ）細胞、肥満細胞、ならびに骨髄系由来の食細胞が挙げられる。
「免疫エフェクター機能または免疫エフェクター応答」は、この用語が本明細書において使用される場合、例えば、免疫エフェクター細胞の、標的細胞の免疫攻撃を増強または促進する機能または応答を指す。例えば、免疫エフェクター機能または応答は、標的細胞の成長または増殖の殺滅または阻害を促進するＴまたはＮＫ細胞の特性を指す。Ｔ細胞のケースにおいて、一次刺激および副刺激が、免疫エフェクター機能または応答の例である。
用語「エフェクター機能」は、細胞の特殊化した機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性またはサイトカイン分泌などのヘルパー活性であり得る。
「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、この用語が本明細書において使用される場合、分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを含有する細胞、例えばＣＡＲＴ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成することができる。例えばＣＡＲＴ細胞における、免疫エフェクター機能の例としては、細胞溶解活性およびヘルパー活性、例えばサイトカイン分泌などが挙げられる。実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊化した機能を実行させる、タンパク質の部分である。細胞内シグナル伝達ドメイン全体が採用される場合もあるが、多くの場合において鎖全体を使用することは必ずしも必要ではない。細胞内シグナル伝達ドメインのトランケートされた部分が使用される限りにおいて、このようなトランケートされた部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達しさえすれば無傷の鎖の代わりに使用することができる。したがって細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインのあらゆるトランケートされた部分を包含することを意味する。
ある実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。典型的な一次細胞内シグナル伝達ドメインとしては、一次刺激、または抗原依存性刺激（antigen dependent simulation）に関与する分子由来のものが挙げられる。ある実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含んでいてもよい。典型的な共刺激細胞内シグナル伝達ドメインとしては、共刺激シグナル、または抗原非依存性刺激に関与する分子由来のものが挙げられる。例えば、ＣＡＲＴの場合において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体の細胞質内配列を含んでいてもよいし、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、補助受容体または共刺激分子からの細胞質内配列を含んでいてもよい。
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして公知のシグナル伝達モチーフを含んでいてもよい。ＩＴＡＭを含有する一次細胞質内シグナル伝達配列の例としては、これらに限定されないが、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、共通ＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲ１ｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（「ＩＣＯＳ」）、ＦｃεＲＩ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ３２、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２由来のものが挙げられる。
用語「ゼータ」またはその代わりに「ゼータ鎖」、「ＣＤ３－ゼータ」もしくは「ＴＣＲ－ゼータ」は、ＧｅｎＢａｎ受託番号ＢＡＧ３６６６４．１として提供されるタンパク質、または非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿および同種のものからの等価の残基と定義され、「ゼータ刺激ドメイン」またはその代わりに「ＣＤ３－ゼータ刺激ドメイン」もしくは「ＴＣＲ－ゼータ刺激ドメイン」は、Ｔ細胞の活性化に必要な最初のシグナルを機能的に伝えるのに十分な、ゼータ鎖の細胞質内ドメインからのアミノ酸残基、またはその機能的誘導体と定義される。一態様において、ゼータの細胞質内ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ３６６６４．１の残基５２から１６４、またはそれらの機能的なオーソログである非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿および同種のものからの等価の残基を含む。一態様において、「ゼータ刺激ドメイン」または「ＣＤ３－ゼータ刺激ドメイン」は、配列番号１７として提供される配列である。一態様において、「ゼータ刺激ドメイン」または「ＣＤ３－ゼータ刺激ドメイン」は、配列番号４３として提供される配列である。
用語「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合することにより、これらに限定されないが増殖などのＴ細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の同起源の結合パートナーを指す。共刺激分子は、効率的な免疫反応の一因となる、抗原受容体以外の細胞表面分子またはそれらのリガンドである。共刺激分子としては、これらに限定されないが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドが挙げられる。
共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内の部分全体、もしくはそれが得られた分子の天然型細胞内シグナル伝達ドメインの全体、またはそれらの機能的なフラグメントまたは誘導体を含んでいてもよい。
用語「４－１ＢＢ」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８．２として提供される配列アミノ酸配列を有するＴＮＦＲスーパーファミリーの一員、または非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿および同種のものからの等価の残基を指し、「４－１ＢＢ共刺激ドメイン」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸残基２１４～２５５、または非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿および同種のものからの等価の残基と定義される。一態様において、「４－１ＢＢ共刺激ドメイン」は、配列番号１６として提供される配列または非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿および同種のものからの等価の残基である。
用語「コード（すること）」は、ヌクレオチド（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）の規定の配列またはアミノ酸の規定の配列のいずれかを有する、生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として役立つ、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特異的配列の固有の特性、およびそれにより生じる生物学的な特性を指す。したがって、細胞または他の生物系中で、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳によりタンパク質が産生される場合、その遺伝子、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡは、タンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表に示されるコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖はどちらも、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の生成物をコードすると称することができる。
特に他の規定がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重型であるヌクレオチド配列や同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列全てを包含する。また、タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という成句は、いくつかの場合においてそのタンパク質をコードするヌクレオチド配列がイントロンを含有し得る程度にイントロンを包含していてもよい 。
用語「有効量」または「治療有効量」は、本明細書では同義的に使用され、本明細書で説明されているような化合物、調合物、材料、または組成物の、特定の生物学的な結果を達成するのに有効な量を指す。
用語「内因性」は、生物、細胞、組織または系由来の材料、またはそれらの内部で産生されたあらゆる材料を指す。
用語「外因性」は、生物、細胞、組織または系の外部から導入された材料、またはそれらの外部で産生されたあらゆる材料を指す。
用語「発現」は、プロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を指す。
用語「トランスファーベクター」は、単離された核酸を含み、細胞内部に単離された核酸をデリバリーするのに使用できるものの組成物を指す。多数のベクターが当業界公知であり、これらに限定されないが、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスなどが挙げられる。したがって、用語「トランスファーベクター」は、自律複製型プラスミドまたはウイルスを包含する。この用語はまた、例えばポリリジン化合物、リポソーム、および同種のものなどの、細胞への核酸のトランスファーを容易にする非プラスミドおよび非ウイルス化合物をさらに包含するとも解釈されるものとする。ウイルストランスファーベクターの例としては、これらに限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、および同種のものが挙げられる。
用語「発現ベクター」は、発現しようとするヌクレオチド配列に機能するように連結した発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用性要素を含み、発現のための他の要素は、宿主細胞によって供給されてもよいし、またはインビトロでの発現系中に供給されてもよい。発現ベクターは、当業界公知のあらゆるものを包含し、例えば、組換えポリヌクレオチドを取り込んでいる、コスミド、プラスミド（例えば、裸の状態の、またはリポソーム中に含有された）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）が挙げられる。
用語「レンチウイルス」は、レトロウイルス科の属の１つを指す。レンチウイルスは、レトロウイルスのなかでも非分裂細胞に感染することができるという点で独特であり、これらは、宿主細胞のＤＮＡに相当な量の遺伝情報をデリバリーすることができることから、遺伝子デリバリーベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、およびＦＩＶが、レンチウイルスの全ての例である。
用語「レンチウイルスベクター」は、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターを指し、特に、Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)で示されるような自己不活性化レンチウイルスベクターが挙げられる。診療施設で使用される可能性があるレンチウイルスベクターの他の例としては、これらに限定されないが、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａ製のＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（登録商標）遺伝子デリバリー技術、Ｌｅｎｔｉｇｅｎ製のＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクター系および同種のものが挙げられる。非臨床タイプのレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者公知であると予想される。
用語「相同」または「同一性」は、２つの高分子間の、例えば２つの核酸分子間の、例えば２つのＤＮＡ分子もしくは２つのＲＮＡ分子間の、または２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列の同一性を指す。２つの分子の両方におけるサブユニットの位置が同じモノマーのサブユニットで占められている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子それぞれにおける位置がアデニンで占められている場合、それらは、その位置において相同または同一である。２つの配列間の相同性は、マッチした位置または相同な位置の数の一次関数であり、例えば、２つの配列中の位置の半分（例えば、ポリマーの長さが１０個のサブユニット中の５個の位置）が相同である場合、２つの配列は５０％相同であり、位置の９０％（例えば、１０個のうち９個）がマッチしているかまたは相同である場合、２つの配列は９０％相同である。
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化された」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント［例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合部分配列］である。大抵の場合、ヒト化抗体およびそれらの抗体フラグメントは、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、望ましい特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基で置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエントの抗体または抗体フラグメント）である。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基で置き換えられている。さらに、ヒト化抗体／抗体フラグメントは、レシピエント抗体でも移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列でも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの改変は、抗体または抗体フラグメントの性能をさらに洗練させて最適化する可能性がある。一般的に、ヒト化抗体またはそれらの抗体フラグメントは、ＣＤＲ領域の全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に相当し、ＦＲ領域の全部のまたはかなりの部分がヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含むと予想される。ヒト化抗体または抗体フラグメントはまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含んでいてもよい。さらなる詳細に関しては、Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992を参照されたい。
「完全にヒト」は、分子全体がヒト由来であるか、または抗体もしくは免疫グロブリンのヒト形態に同一なアミノ酸配列からなる場合の、免疫グロブリン、例えば抗体または抗体フラグメントを指す。
用語「単離された」は、天然状態から変更された、または天然状態から除去されたことを意味する。例えば、生きた動物中に自然に存在する核酸またはペプチドは「単離されていない」が、同じ核酸またはペプチドでもその天然状態において共存する材料から部分的または完全に分離されていれば、「単離されている」。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在していてもよいし、または例えば宿主細胞などの非天然の環境中に存在していてもよい。
本発明の内容では、以下に示す通常存在する核酸塩基の略語が使用される。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」は、シトシンを指し、「Ｇ」は、グアノシンを指し、「Ｔ」は、チミジンを指し、「Ｕ」は、ウリジンを指す。
用語「機能するように連結した」または「転写制御」は、調節配列と異種核酸配列とが機能的に連結されて、結果として後者の発現をもたらすことを指す。例えば、第一の核酸配列が第二の核酸配列と機能的な関係で配置される場合、第一の核酸配列は第二の核酸配列と機能するように連結している。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合、プロモーターはコード配列に機能するように連結している。機能するように連結したＤＮＡ配列は、互いに連続していてもよく、例えば２つのタンパク質のコード領域を合体させることが必要な場合、同じリーディングフレーム内にあってもよい。
免疫原性組成物の「非経口」投与という用語は、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）もしくは胸骨内注射、腫瘍内、または点滴技術を包含する。
用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、および一本鎖または二本鎖いずれかの形態のそれらのポリマーを指す。用語「核酸」は、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを包含する。一実施形態において、核酸分子は、合成（例えば、化学的に合成された）核酸分子または組換え核酸分子である。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似の方式で代謝される天然ヌクレオチドの類似体または誘導体を含有する核酸を包含する。特に他の指定がない限り、特定の核酸配列はまた、それらの保存的に改変された変異体（例えば、縮重コドンの置換）、対立遺伝子、オーソログ、ＳＮＰ、および相補配列、加えて明確に提示された配列も事実上包含する。具体的に言えば、縮重コドンの置換は、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第三の位置が混成の塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成される可能性がある［Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)］。
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、同義的に使用され、ペプチド結合により共有結合で連結されたアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有していなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、互いにペプチド結合で合体した２つ以上のアミノ酸を含むあらゆるペプチドまたはタンパク質を包含する。この用語は、本明細書で使用される場合、当業界では一般的に例えばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称される短鎖と、当業界では一般的に多くのタイプが存在するタンパク質と称されるそれより長い鎖との両方を指す。「ポリペプチド」としては、例えば、なかでも生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、改変されたポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が挙げられる。ポリペプチドとしては、天然ペプチド、組換えペプチド、またはそれらの組合せが挙げられる。
用語「プロモーター」は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始させるのに必要な、細胞の合成機構によって認識されるＤＮＡ配列、または導入された合成機構を指す。
用語「プロモーター／調節配列」は、プロモーター／調節配列に機能するように連結した遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を指す。いくつかの場合において、この配列はコアプロモーター配列であってもよく、他の例において、この配列はまた、遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列および他の調節因子を包含していてもよい。プロモーター／調節配列は、例えば、組織特異的な方式で遺伝子産物を発現するプロモーター／調節配列であってもよい。
用語「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードするかまたは遺伝子産物を指定するポリヌクレオチドと機能するように連結している場合、細胞のほとんどまたは全ての生理学的条件下において細胞中で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列を指す。
用語「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードするかまたは遺伝子産物を指定するポリヌクレオチドと機能するように連結している場合、実質的にプロモーターに対応する誘導物質が細胞中に存在するときだけ、細胞中で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列を指す。
用語「組織特異的」プロモーターは、遺伝子をコードするかまたは遺伝子によって指定されたポリヌクレオチドと機能するように連結されている場合、実質的に細胞がプロモーターに対応する組織タイプの細胞であるときだけ、細胞中で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列を指す。
用語「フレキシブルなポリペプチドリンカー」または「リンカー」は、ｓｃＦｖの状況で使用される場合、可変重鎖領域と可変軽鎖領域を一緒に連結するために、単独で、または組み合わせて使用されるグリシンおよび／またはセリン残基などのアミノ酸からなるペプチドリンカーを指す。一実施形態において、フレキシブルなポリペプチドリンカーは、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎを含み、式中ｎは、１に等しいかまたは１より大きい正の整数である。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５、ｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９およびｎ＝１０（配列番号１０５）である。一実施形態において、フレキシブルなポリペプチドリンカーとしては、これらに限定されないが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号１０６）または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１０７）が挙げられる。別の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）、（ＧｌｙＳｅｒ）または（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）の複数の反復を包含する（配列番号１０８）。参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１２／１３８４７５で説明されているリンカーも本発明の範囲内に包含される。
５’キャップ（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ７－メチルグアノシンキャップまたはＲＮＡｍ７Ｇキャップともいう）は、本明細書で使用される場合、転写開始直後に真核性メッセンジャーＲＮＡの「前部」または５’末端に付加された改変されたグアニンヌクレオチドである。５’キャップは、最初に転写されるヌクレオチドに連結される末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識およびＲＮアーゼからの保護にとって重要である。キャップの付加は転写とカップリングされ、それぞれ他方に影響を与えるようにともに転写されることによって実行される。転写開始直後、合成されているｍＲＮＡの５’末端は、ＲＮＡポリメラーゼと会合したキャップを合成する複合体に結合される。この酵素的な複合体は、ｍＲＮＡのキャッピングに必要な化学反応を触媒する。合成は、多段階の生化学反応として進行する。キャッピング成分を改変して、その安定性または翻訳効率などのｍＲＮＡの機能性を調節してもよい。
「インビトロで転写されたＲＮＡ」は、本明細書で使用される場合、インビトロで合成されたＲＮＡ、例えばｍＲＮＡを指す。一般的に、インビトロで転写されたＲＮＡは、インビトロの転写ベクターから生成される。インビトロの転写ベクターは、インビトロで転写されたＲＮＡを生成するのに使用される鋳型を含む。
本明細書で使用される場合、「ポリ（Ａ）」は、ポリアデニル化によってｍＲＮＡに付着した一連のアデノシンである。一過性発現のためのコンストラクトの一部の実施形態において、ポリＡは、５０から５０００個の間（配列番号２８）であり、例えば６４個より多く、例えば１００個より多く、例えば３００または４００個より多い。ポリ（Ａ）配列を化学的または酵素的に改変して、局在化、安定性または翻訳効率などのｍＲＮＡの機能性を調節してもよい。
「ポリアデニル化」は、本明細書で使用される場合、ポリアデニリル成分またはその改変された変異体をメッセンジャーＲＮＡ分子に共有結合で連結させることを指す。真核生物において、ほとんどのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子は、３’末端でポリアデニル化されている。３’ポリ（Ａ）テールは、酵素のポリアデニル酸ポリメラーゼの作用を介してプレ－ｍＲＮＡに付加されたアデニンヌクレオチドの長い配列（しばしば数百にもなる）である。より高次の真核生物において、ポリ（Ａ）テールは、特異的配列であるポリアデニル化シグナルを含有する転写物上に付加される。ポリ（Ａ）テールとそれに結合したタンパク質は、エキソヌクレアーゼによる分解からｍＲＮＡを保護するのに役立つ。またポリアデニル化は、転写終結、細胞核外へのｍＲＮＡ輸送、および翻訳にとっても重要である。ポリアデニル化は、ＲＮＡへのＤＮＡ転写直後に細胞核で起こるが、それに加えて後に細胞質内でも起こる可能性がある。転写が終結した後、ｍＲＮＡ鎖は、ＲＮＡポリメラーゼと会合したエンドヌクレアーゼ複合体の作用を介して切断される。切断部位は通常、切断部位付近における塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在を特徴とする。ｍＲＮＡが切断された後、切断部位において遊離の３’末端にアデノシン残基が付加される。
「一過性」は、本明細書で使用される場合、数時間、数日または数週間にわたり統合されていない導入遺伝子が発現されることを指し、ここで発現期間は、宿主細胞中でゲノムに統合されているかまたは安定なプラスミドレプリコン内に含有されている場合の遺伝子の発現期間より短い。
用語「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナル伝達において役割を果たす様々なシグナル伝達分子間の生化学的な関係を指す。成句「細胞表面受容体」は、シグナルを受けて細胞膜を通過してシグナルを伝えることができる分子および分子複合体を包含する。
用語「対象」は、免疫反応を惹起させることができる生物（例えば、哺乳動物、ヒト）を包含することが意図される。
用語「実質的に精製された」細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。また実質的に精製された細胞は、通常その天然に存在する状況で共存する他の細胞型から分離された細胞も指す。いくつかの場合において、実質的に精製された細胞の集団は、細胞の同種の集団を指す。他の例において、この用語は単に、それらの天然の状態において自然に共存する細胞から分離された細胞を指す。いくつかの態様において、このような細胞は、インビトロで培養される。他の態様において、このような細胞は、インビトロで培養されない。
用語「治療」は、本明細書で使用される場合、処置を意味する。治療効果は、病状の回復、抑制、寛解、または根絶により得られる。
用語「予防」は、本明細書で使用される場合、疾患または病状の予防または予防的処置を意味する。
本発明の内容において、「腫瘍抗原」または「過剰増殖性障害抗原」または「過剰増殖性障害に関連する抗原」は、特定の過剰増殖性障害に共通する抗原を指す。ある特定の態様において、本発明の過剰増殖性障害抗原は、これらに限定されないが、原発性もしくは転移性黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺がん、肝臓がん、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎臓がんおよび腺癌、例えば乳がん、前立腺がん、卵巣がん、膵臓がん、および同種のもの、などのがん由来である。
用語「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」は、宿主細胞に外因性核酸を移入または導入させるプロセスを指す。「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」された細胞は、外因性核酸でトランスフェクトされた、形質転換した、または形質導入された細胞である。細胞は、対象の初代細胞およびその後代を包含する。
対象におけるがんのパラメーター（例えば血液がん、例えば、がん細胞成長、増殖および／または生存期間）が、いずれかの適切な尺度によって、例えば、質量、細胞数または容積によって判定して、検出可能な量、例えば、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上遅延または低減される場合、対象は、処置に「応答する」。一例において、対象が、処置が投与されない場合に予測される期待寿命を約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％以上を超えて延長された期待寿命を経験する場合、対象は、処置に応答する。別の例において、対象が、増加した無病生存期間、全生存期間、または増加した無憎悪期間を有する場合、対象は、処置に応答する。例えば、ＮＣＣＮ腫瘍学臨床診療ガイドライン［ＮＣＣＮ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ（登録商標）］によって提供されている基準をはじめとする、いくつかの方法を使用して、患者が処置に応答するかどうかを判定することができる。例えば、Ｂ－ＡＬＬの状況において、完全応答または完全応答例は、次の１つまたは複数を含み得る：＜５％ＢＭ芽球、＞１０００好中球／ＡＮＣ（／μＬ）。＞１００，０００血小板（／μＬ）で循環芽球も髄外疾患もなし（リンパ節腫大、巨脾症、皮膚／歯肉浸潤／精巣腫瘤／ＣＮＳ病変なし）、三血球系造血、および４週間にわたり再発なし。部分応答例は、次の１つまたは複数を含み得る：ＢＭ芽球の＞５０％低減、＞１０００好中球／ＡＮＣ（／μＬ）。＞１００，０００血小板（／μＬ）。非応答例は、疾患進行、例えば、ＢＭ芽球に関して＞２５％を示し得る。
「難治性」は、本明細書で使用される場合、疾患、例えば処置に応答しないがんを指す。実施形態において、難治性がんは、処置の前または開始時に、処置に対して耐性である可能性がある。他の実施形態において、難治性がんは、処置中に耐性になる可能性がある。難治性がんはまた、耐性がんとも呼ばれる。
用語「再発」は、本明細書で使用される場合、初期応答（例えば、完全応答または部分応答）期間後のがんの再出現を指す。初期応答期間は、がん細胞のレベルが、ある特定の閾値未満、例えば、２０％、１％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％未満に低下することを含み得る。再出現は、がん細胞のレベルが、ある特定の閾値より高く、例えば、２０％、１％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％より高く上昇することを含み得る。例えば、例えばＢ－ＡＬＬの状況において、再出現は、例えば、完全応答後の血液、骨髄（＞５％）またはいずれかの髄外部位における芽球の再出現を含み得る。この文脈での完全応答は、＜５％ＢＭ芽球を含み得る。より一般的には、ある実施形態において、応答（例えば、完全応答または部分応答）は、検出可能なＭＲＤの非存在（最小の残留疾患）を含み得る。ある実施形態において、初期応答期間は、少なくとも１、２、３、４、５もしくは６日、少なくとも１、２、３もしくは４週間、少なくとも１、２、３、４、６、８、１０もしくは１２カ月、または少なくとも１、２、３、４もしくは５年続く。
一部の実施形態において、ＣＤ１９阻害剤を包含する治療、例えばＣＤ１９ ＣＡＲ療法は、再発することもあり、または処置が無効であることもある。再発または耐性は、ＣＤ１９欠損（例えば、抗原欠損突然変異）によって引き起こされることもあり、またはＣＤ１９レベルを低下させる他のＣＤ１９の変化（例えば、ＣＤ１９陰性クローンのクローン選択によって引き起こされる）によって引き起こされることもある。このようなＣＤ１９欠損または変化を保有するがんは、本明細書では「ＣＤ１９陰性のがん」または「ＣＤ１９陰性の再発がん」と称される。ＣＤ１９陰性のがんは、ＣＤ１９の１００％欠損でなく、がんが再発するまたは難治性になるようなＣＤ１９療法の有効性を低下させるのに十分な低減を有する必要があると理解されるものとする。一部の実施形態において、ＣＤ１９陰性のがんは、ＣＤ１９ ＣＡＲ療法の結果として生じる。
用語「特異的に結合する」は、試料中に存在する結合パートナー（例えば、刺激腫瘍抗原）タンパク質を認識してそれと結合する抗体またはリガンドを指すが、これらの抗体またはリガンドは、試料中の他の分子を実質的に認識したりまたはそれと結合したりしない。
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される塩」は、健全な医学的判断の範囲内で、対象の組織と接触して使用することに好適であり、過度の毒性、刺激作用、アレルギー反応および同種のものがなく、かつ妥当な損益比に見合っている塩を指す。薬学的に許容される塩は、当業界周知である。例えば、Ｂｅｒｇｅらは、J. Pharmaceutical Sciences (1977) 66:1-19において薬学的に許容される塩を詳細に説明している。
「調節可能なキメラ抗原受容体（ＲＣＡＲ）」は、この用語が本明細書で使用される場合、ＲＣＡＲＸ細胞中にあるとき、標的細胞、典型的にはがん細胞への特異性、および調節可能な細胞内シグナルの生成または増殖を、そのＲＣＡＲＸ細胞にもたらし、それによってそのＲＣＡＲＸ細胞の免疫エフェクター特性を最適化することができる、ポリペプチドのセット、最も簡単な実施形態では典型的には２つのポリペプチドのセットを指す。ＲＣＡＲＸ細胞は、抗原結合ドメインによって結合された抗原を含む標的細胞に特異性を提供するのに、抗原結合ドメインに少なくとも部分的に依存する。ある実施形態において、ＲＣＡＲは、二量体化分子の存在下で細胞内シグナル伝達ドメインを抗原結合ドメインにカップリングすることができる二量体化スイッチを包含する。
「膜アンカー」または「膜係留ドメイン」は、この用語が本明細書において使用される場合、細胞外または細胞内ドメインを原形質膜に固定するのに十分なポリペプチドまたは部分、例えばミリストイル基を指す。
「スイッチドメイン」は、この用語が本明細書において使用される場合、例えばＲＣＡＲについて述べられる場合、二量体化分子の存在下で別のスイッチドメインと会合する物体、典型的にはポリペプチドベースの物体を指す。会合は、第一のスイッチドメインに連結された、例えば融合した第一の物体と、第二のスイッチドメインに連結された、例えば融合した第二の物体との機能的なカップリングを引き起こす。第一および第二のスイッチドメインは、集合的に二量体化スイッチと称される。実施形態において、第一および第二のスイッチドメインは、互いに同じであり、例えばそれらは同じ一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、集合的にホモ二量体化スイッチと称される。実施形態において、第一および第二のスイッチドメインは、互いに異なっており、例えばそれらは異なる一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、集合的にヘテロ二量体化スイッチと称される。実施形態において、スイッチは、細胞内である。実施形態において、スイッチは、細胞外である。実施形態において、スイッチドメインは、ポリペプチドベースの物体、例えば、ＦＫＢＰまたはＦＲＢベースの物体であり、二量体化分子は、小分子、例えば、ラパログ（rapalogue）である。実施形態において、スイッチドメインは、ポリペプチドベースの物体、例えばｍｙｃペプチドと結合するｓｃＦｖであり、二量体化分子は、ポリペプチド、それらのフラグメント、またはポリペプチドの多量体、例えば、１つまたは複数のｍｙｃ ｓｃＦｖに結合するｍｙｃリガンドまたはｍｙｃリガンドの多量体である。実施形態において、スイッチドメインは、ポリペプチドベースの物体、例えばｍｙｃ受容体であり、二量体化分子は、抗体またはそれらのフラグメント、例えば、ｍｙｃ抗体である。
「二量体化分子」は、この用語が本明細書において使用される場合、例えばＲＣＡＲについて述べられる場合、第一のスイッチドメインと第二のスイッチドメインとの会合を促進する分子を指す。実施形態において、二量体化分子は、対象において天然に存在しないか、または有意な二量体化を引き起こすと予想される濃度で存在しない。実施形態において、二量体化分子は、小分子、例えばラパマイシンまたはラパログ、例えばＲＡＤ００１である。
用語「免疫を増強する低い用量」は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えばアロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えばＲＡＤ００１もしくはラパマイシン、または触媒性ｍＴＯＲ阻害剤とともに使用される場合、例えばＰ７０Ｓ６キナーゼ活性阻害によって測定した場合に、ｍＴＯＲ活性を、完全ではないが部分的に阻害するｍＴＯＲ阻害剤の用量を指す。例えばＰ７０Ｓ６キナーゼ阻害によるｍＴＯＲ活性を評価するための方法が、本明細書で論じられている。この用量は、完全な免疫抑制を引き起こすには不十分であるが、免疫応答を増強するには十分である。一実施形態において、免疫を増強する低い用量のｍＴＯＲ阻害剤は、ＰＤ－１陽性Ｔ細胞の数の減少、および／またはＰＤ－１陰性Ｔ細胞の数の増加、またはＰＤ－１陰性Ｔ細胞／ＰＤ－１陽性Ｔ細胞の比率の増加を引き起こす。一実施形態において、免疫を増強する低い用量のｍＴＯＲ阻害剤は、ナイーブＴ細胞の数の増加を引き起こす。一実施形態において、免疫を増強する低い用量のｍＴＯＲ阻害剤は、以下：
例えばメモリーＴ細胞、例えばメモリーＴ細胞前駆体における、以下のマーカー：ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ、ＣＤ１２７ｈｉｇｈ、ＣＤ２７＋、およびＢＣＬ２の１つまたは複数の発現の増加；
例えばメモリーＴ細胞、例えばメモリーＴ細胞前駆体におけるＫＬＲＧ１発現の減少；および
メモリーＴ細胞前駆体、例えば、以下の特徴：ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈの増加、ＣＤ１２７ｈｉｇｈの増加、ＣＤ２７＋の増加、ＫＬＲＧ１の減少、およびＢＣＬ２の増加のいずれか１つのまたは組合せを有する細胞の数の増加
の１つまたは複数を引き起こし、ここで上述した変化はいずれも、例えば未処置の対象と比較して、例えば少なくとも一時的に起こる。
範囲：本開示全体にわたり、本発明の様々な態様は、範囲の様式で示される場合がある。範囲の様式での記載は、単に利便性および簡潔さのためであり、本発明の範囲における柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことが理解されるものとする。したがって、範囲の記載は、全ての可能性のある部分範囲、加えてその範囲内の個々の数値を具体的に開示しているとみなされるものとする。例えば、１から６などの範囲の記載は、例えば１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６などの具体的に開示された部分範囲、加えてその範囲内の個々の数値、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、および６を有するとみなされると予想される。別の例として、９５～９９％の同一性などの範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する何かを包含し、さらに、９６～９９％、９６～９８％、９６～９７％、９７～９９％、９７～９８％および９８～９９％の同一性などの部分範囲を包含する。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
説明
ＣＤ１９阻害剤および結合ドメイン
ＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を使用するがんなどの疾患を処置するための、物の組成物および使用方法が本明細書において提供される。方法は、とりわけ、本明細書で説明されるＣＤ１９ ＣＡＲをＢ細胞阻害剤などの別の薬剤と組み合わせて投与することを包含する。方法は、例えば、ホジキンリンパ腫などのリンパ腫を処置するために本明細書で説明されるＣＤ１９ ＣＡＲを投与することも包含する。
一態様において、本発明は、ＣＤ１９タンパク質と特異的に結合するように加工された抗体または抗体フラグメントを含む、多数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。一態様において、本発明は、ＣＡＲを発現するように加工された細胞（例えば、Ｔ細胞）を提供し、ここでＣＡＲ Ｔ細胞（「ＣＡＲＴ」）は抗がん特性を示す。一態様において、細胞はＣＡＲで形質転換され、ＣＡＲは細胞表面上に発現される。いくつかの実施形態において、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ＣＡＲをコードするウイルスベクターで形質導入される。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかのこのような実施形態において、細胞は、ＣＡＲを安定して発現することができる。別の実施形態において、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ＣＡＲをコードする、核酸、例えばｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡでトランスフェクトされる。いくつかのこのような実施形態において、細胞は、ＣＡＲを一過性発現することができる。
一態様において、ＣＡＲの抗ＣＤ１９タンパク質結合部分は、ｓｃＦｖ抗体フラグメントである。一態様において、このような抗体フラグメントは、それらが等価の結合親和性を保持する、例えばそれらがその元となったＩｇＧ抗体と同等の親和性で同じ抗原に結合するという点において、機能的である。一態様において、このような抗体フラグメントは、それらが、これらに限定されないが、当業者によって理解されると予想されるような免疫反応の活性化、その標的抗原からのシグナル伝達開始の阻害、キナーゼ活性の阻害、および同種のものなどの生体反応をもたらす点で機能的である。一態様において、ＣＡＲのＣＤ１９抗原結合ドメインは、その元となったｓｃＦｖのマウス配列と比較してヒト化されたｓｃＦｖ抗体フラグメントである。一態様において、親マウスｓｃＦｖ配列は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／０７９０００において提供されているおよび本明細書において配列番号５９として提供されるＣＡＲ１９コンストラクトである。一実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、ＷＯ２０１２／０７９０００において説明されているおよび配列番号５９で提供されるｓｃＦｖ、またはこれと少なくとも９５％、例えば、９５～９９％同一の配列である。ある実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／０７９０００において提供されているおよび本明細書において配列番号５８で提供されるＣＡＲコンストラクトの一部、またはこれと少なくとも９５％、例えば、９５％～９９％同一の配列である。ある実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、表４および／または表５から選択される少なくとも１つ（例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ）のＣＤＲを含む。
一部の態様において、本発明の抗体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に取り込まれている。一態様において、ＣＡＲは、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／０７９０００において配列番号１２として提供されているおよび本明細書において配列番号５８として提供されるポリペプチド配列であって、ｓｃＦｖドメインが、配列番号１～１２から選択される１つまたは複数の配列によって置換されている、ポリペプチド配列を含む。一態様において、配列番号１～１２のｓｃＦｖドメインは、ヒトＣＤ１９と特異的に結合するマウス由来のｓｃＦｖフラグメントである、配列番号５９のｓｃＦｖドメインのヒト化変異体である。このマウスｓｃＦｖのヒト化は、ＣＡＲＴ１９処置、例えば、ＣＡＲ１９コンストラクトが形質導入されたＴ細胞での処置を受けている患者において、マウス特異的な残基がヒト抗マウス抗原（ＨＡＭＡ）応答を誘導することが可能な臨床条件にとって望ましい場合がある。
一態様において、抗ＣＤ１９結合ドメイン、例えば本発明のＣＡＲの一部であるヒト化ｓｃＦｖは、その配列のコドンが哺乳動物細胞での発現に最適化された導入遺伝子によってコードされている。一態様において、本発明のＣＡＲコンストラクト全体は、その配列全体のコドンが哺乳動物細胞での発現に最適化された導入遺伝子によってコードされている。コドンの最適化は、コードＤＮＡ中の同義コドン（すなわち、同じアミノ酸をコードするコドン）の出現頻度が異なる種で偏っているという発見を指す。このようなコドンの縮重は、同一なポリペプチドを様々なヌクレオチド配列でコードすることを可能にする。様々なコドン最適化方法が当業界公知であり、例えば、少なくとも米国特許第５，７８６，４６４号および６，１１４，１４８号で開示された方法が挙げられる。
一態様において、ヒト化ＣＡＲ１９は、配列番号１で提供されるｓｃＦｖ部分を含む。一態様において、ヒト化ＣＡＲ１９は、配列番号２に示されるｓｃＦｖ部分を含む。一態様において、ヒト化ＣＡＲ１９は、配列番号３に示されるｓｃＦｖ部分を含む。一態様において、ヒト化ＣＡＲ１９は、配列番号４に示されるｓｃＦｖ部分を含む。一態様において、ヒト化ＣＡＲ１９は、配列番号５に示されるｓｃＦｖ部分を含む。一態様において、ヒト化ＣＡＲ１９は、配列番号６に示されるｓｃＦｖ部分を含む。一態様において、ヒト化ＣＡＲ１９は、配列番号７に示されるｓｃＦｖ部分を含む。一態様において、ヒト化ＣＡＲ１９は、配列番号８に示されるｓｃＦｖ部分を含む。一態様において、ヒト化ＣＡＲ１９は、配列番号９に示されるｓｃＦｖ部分を含む。一態様において、ヒト化ＣＡＲ１９は、配列番号１０に示されるｓｃＦｖ部分を含む。一態様において、ヒト化ＣＡＲ１９は、配列番号１１に示されるｓｃＦｖ部分を含む。一態様において、ヒト化ＣＡＲ１９は、配列番号１２に示されるｓｃＦｖ部分を含む。
一態様において、本発明のＣＡＲは、特異的な抗体抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達分子と組み合わせている。例えば、いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達分子としては、これらに限定されないが、ＣＤ３－ゼータ鎖、４－１ＢＢおよびＣＤ２８シグナル伝達モジュールならびにそれらの組合せが挙げられる。一態様において、ＣＤ１９ＣＡＲは、配列番号３１～４２の１つまたは複数で提供される配列から選択されるＣＡＲを含む。一態様において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号３１で提供される配列を含む。一態様において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号３２で提供される配列を含む。一態様において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号３３で提供される配列を含む。一態様において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号３４で提供される配列を含む。一態様において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号３５で提供される配列を含む。一態様において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号３６で提供される配列を含む。一態様において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号３７で提供される配列を含む。一態様において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号３８で提供される配列を含む。一態様において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号３９で提供される配列を含む。一態様において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号４０で提供される配列を含む。一態様において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号４１で提供される配列を含む。一態様において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号４２で提供される配列を含む。
したがって、一態様において、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体または抗体フラグメントを含む。一実施形態において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインは、本明細書で説明されるマウスまたはヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインの、１つまたは複数（例えば、３つ全て）の、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）、ならびに／または本明細書で説明されるマウスまたはヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインの、１つまたは複数（例えば、３つ全て）の、重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）含み、例えば、１つまたは複数、例えば３つ全て、のＬＣ ＣＤＲおよび１つまたは複数、例えば３つ全て、のＨＣ ＣＤＲを含むヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインを含む。一実施形態において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインは、本明細書で説明されるマウスまたはヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインの、１つまたは複数（例えば、３つ全て）の、重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含み、例えば、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインは、本明細書で説明されるＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を各々が含む２つの可変重鎖領域を有する。一実施形態において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインは、本明細書で（例えば表２で）説明されるヒト化軽鎖可変領域、および／または本明細書で（例えば表２で）説明されるヒト化重鎖可変領域を含む。一実施形態において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインは、本明細書で（例えば表２で）説明されるヒト化重鎖可変領域、例えば、本明細書で（例えば表２で）説明される少なくとも２つのヒト化重鎖可変領域を含む。一実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、表２のアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むｓｃＦｖである。ある実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、表２において提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列もしくは表２のアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２もしくは３個の改変（例えば、置換）であるが３０、２０もしくは１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／または表２において提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列もしくは表２のアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２もしくは３個の改変（例えば、置換）であるが３０、２０もしくは１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２からなる群より選択される配列、またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインをコードする核酸配列は、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１および配列番号７２からなる群より選択される配列、またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインはｓｃＦｖであり、本明細書で、例えば表２で説明されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、リンカー、例えば本明細書で説明されるリンカーを介して、本明細書で、例えば表２で説明されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に付着している。一実施形態において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインは、（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）ｎリンカーを包含し、ここでｎは、１、２、３、４、５または６、例えば３または４（配列番号５３）である。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、以下の配置：軽鎖可変領域－リンカー－重鎖可変領域または重鎖可変領域－リンカー－軽鎖可変領域のいずれであってもよい。
一態様において、抗原結合ドメイン部分は、配列番号１～１２から選択される１つまたは複数の配列を含む。一態様において、ヒト化ＣＡＲは、配列番号３１～４２から選択される１つまたは複数の配列から選択される。一部の態様において、非ヒト化抗体は、ヒト化され、前記抗体の特異的な配列または領域は、ヒトにおいて自然に産生された抗体またはそのフラグメントに対する類似性が増加するように改変される。
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、本明細書で説明される抗ＣＤ１９結合ドメインの、１つまたは複数（例えば、３つ全て）の、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）、ならびに本明細書で説明される抗ＣＤ１９結合ドメインの１つまたは複数（例えば、３つ全て）の、重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含む、抗ＣＤ１９結合ドメイン、例えば、１つまたは複数、例えば３つ全て、のＬＣ ＣＤＲおよび１つまたは複数、例えば３つ全て、のＨＣ ＣＤＲを含む抗ＣＤ１９結合ドメインを含む。一実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、本明細書で説明される抗ＣＤ１９結合ドメインの、１つまたは複数（例えば、３つ全て）の、重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含み、例えば、抗ＣＤ１９結合ドメインは、本明細書で説明されるＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を各々が含む２つの可変重鎖領域を有する。
一態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、抗体または抗体フラグメントの特定の機能的な特徴または特性を特徴とする。例えば、一態様において、抗原結合ドメインを含む本発明のＣＡＲ組成物の一部は、ヒトＣＤ１９に特異的に結合する。一態様において、本発明は、抗体または抗体フラグメントを含む抗原結合ドメインであって、抗体結合ドメインがＣＤ１９タンパク質またはそのフラグメントと特異的に結合し、前記抗体または抗体フラグメントが、配列番号１～１２または配列番号５９のアミノ酸配列を包含する可変軽鎖および／または可変重鎖を含む、抗原結合ドメインに関する。一態様において、抗原結合ドメインは、配列番号１～１２または配列番号５９から選択されるｓｃＦｖのアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、リーダー配列と連続しており同じリーディングフレーム内にある。一態様において、リーダー配列は、配列番号１３として提供されるポリペプチド配列である。
一態様において、抗原結合ドメインを含むＣＡＲの部分は、ＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメインを含む。一態様において、抗原結合ドメインは、ヒトＣＤ１９を標的とする。一態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)において説明されているＦＭＣ６３ ｓｃＦｖフラグメントと同じもしくは類似した結合特異性を有し、またはそのようなＦＭＣ６３ ｓｃＦｖフラグメントを含む。一態様において、抗原結合ドメインを含むＣＡＲの部分は、Ｂ細胞抗原、例えば、ヒトＢ細胞抗原を標的とする抗原結合ドメインを含む。ＣＤ１９抗体分子は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるＷＯ２０１４／１５３２７０において説明されている抗体分子（例えば、ヒト化抗ＣＤ１９抗体分子）であってもよい。ＷＯ２０１４／１５３２７０では、様々なＣＡＲＴコンストラクトの結合および効能をアッセイする方法も説明されている。
一実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、本明細書で（例えば表３で）説明されるマウス軽鎖可変領域、および／または本明細書で（例えば表３で）説明されるマウス重鎖可変領域を含む。一実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、表３のアミノ酸配列のマウス軽鎖およびマウス重鎖を含むｓｃＦｖである。ある実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、表３において提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列もしくは表３のアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２もしくは３個の改変（例えば、置換）であるが３０、２０もしくは１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／または表３において提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列もしくは表３のアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２もしくは３個の改変（例えば、置換）であるが３０、２０もしくは１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号５９の配列、またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインはｓｃＦｖであり、本明細書で、例えば表３で説明されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、リンカー、例えば本明細書で説明されるリンカーを介して、本明細書で、例えば表３で説明されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に付着している。一実施形態において、抗原結合ドメインは、（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）ｎリンカーを包含し、ここでｎは、１、２、３、４、５または６、例えば３または４（配列番号５３）である。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、以下の配置：軽鎖可変領域－リンカー－重鎖可変領域または重鎖可変領域－リンカー－軽鎖可変領域のいずれであってもよい。
さらに、本発明は、Ｂ細胞阻害剤と適宜組み合わせたＣＤ１９ ＣＡＲ組成物、および疾患の中でも、ＣＤ１９を発現する細胞または組織を侵すがんまたはあらゆる悪性腫瘍または自己免疫疾患を処置するための医薬品または方法におけるそれらの使用を（とりわけ）提供する。
一態様において、本発明のＣＡＲは、ＣＤ１９を発現する正常細胞を根絶するのに使用することができ、それによって細胞移植前の細胞調整療法（cellular conditioning therapy）としての使用に適用できる。一態様において、ＣＤ１９を発現する正常細胞は、ＣＤ１９を発現する正常幹細胞であり、細胞移植は、幹細胞移植である。
一態様において、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように加工された細胞（例えば、Ｔ細胞）を提供し、ここでＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ Ｔ細胞（「ＣＡＲＴ」）は、抗がん特性を示す。好適な抗原は、ＣＤ１９である。一態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、部分的にヒト化された抗ＣＤ１９抗体フラグメントを含む。一態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む、部分的にヒト化された抗ＣＤ１９抗体フラグメントを含む。したがって、本発明は、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインを含み、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞に遺伝子操作される、ＣＤ１９－ＣＡＲ、および養子療法のためのそれらの使用方法を（とりわけ）提供する。
一態様において、ＣＡＲ、例えばＣＤ１９－ＣＡＲは、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータシグナルドメイン、およびそれらのあらゆる組合せの群から選択される少なくとも１つの細胞内ドメインを含む。一態様において、ＣＡＲ、例えばＣＤ１９－ＣＡＲは、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）またはＣＤ２８以外の１つまたは複数の共刺激分子由来の少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
本発明は、これに限定されないが、ＣＡＲをコードする配列を含む組換えＤＮＡコンストラクトを包含し、前記ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１、例えば、ヒトＣＤ１９、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１と特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを含み、前記抗体フラグメントの配列は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と連続しており同じリーディングフレーム内にある。細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメイン、例えばゼータ鎖を含んでいてもよい。共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインの少なくとも一部を構成するＣＡＲの一部を指す。一実施形態において、抗原結合ドメインは、本明細書で説明されるマウス抗体または抗体フラグメントである。一実施形態において、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体または抗体フラグメントである。
具体的な態様において、本発明のＣＡＲコンストラクトは、配列番号１～１２からなる群より選択されるｓｃＦｖドメインまたは配列番号５９のｓｃＦＶドメインを含み、ここでｓｃＦｖの前に、配列番号１３で提供されるもののような任意のリーダー配列、それに続いて配列番号１４または配列番号４５または配列番号４７または配列番号４９で提供されるもののような任意のヒンジ配列、配列番号１５で提供されるもののような膜貫通領域、配列番号１６または配列番号５１などの細胞内シグナル伝達ドメイン、および配列番号１７または配列番号４３などのＣＤ３ゼータ配列が存在していてもよく、ここでドメインは連続しており同じリーディングフレーム内にあり、単一の融合タンパク質を形成する。また本発明は（とりわけ）、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号５９からなる群より選択されるｓｃＦｖフラグメントのそれぞれのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。また本発明は（とりわけ）、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号５９からなる群より選択されるｓｃＦｖフラグメントのそれぞれ、ならびに配列番号１３～１７のドメインのそれぞれのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、加えてコードされた本発明のＣＤ１９ ＣＡＲ融合タンパク質も包含する。一態様において、典型的なＣＤ１９ ＣＡＲコンストラクトは、任意のリーダー配列、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、および細胞内刺激ドメインを含む。一態様において、典型的なＣＤ１９ ＣＡＲコンストラクトは、任意のリーダー配列、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメインおよび細胞内刺激ドメインを含む。一部の実施形態において、本発明のヒト化ｓｃＦｖドメインを含有する特異的ＣＤ１９ ＣＡＲコンストラクトは、配列番号３１～４２として提供されるか、または配列番号５９として提供されるようなマウスｓｃＦｖドメインである。
完全長ＣＡＲ配列も、表２および表３に示される通り、配列番号３１～４２および５８として本明細書において提供される。
典型的なリーダー配列は、配列番号１３として提供される。典型的なヒンジ／スペーサー配列は、配列番号１４または配列番号４５または配列番号４７または配列番号４９として提供される。典型的な膜貫通ドメイン配列は、配列番号１５として提供される。４－１ＢＢタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの典型的な配列は、配列番号１６として提供される。ＣＤ２７の細胞内シグナル伝達ドメインの典型的な配列は、配列番号５１として提供される。典型的なＣＤ３ゼータドメイン配列は、配列番号１７または配列番号４３として提供される。これらの配列を、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１の１つまたは複数を認識するｓｃＦｖと組み合わせて使用してもよい。
様々なｓｃＦｖフラグメントおよび他のＣＡＲ構成要素の典型的な配列が本明細書において提供される。リーダー配列のない（例えば、配列番号１３のアミノ酸配列も、配列番号５４のヌクレオチド配列もない）これらのＣＡＲ構成要素（例えば、配列番号１２１のもの、または表２、３、６、１１Ａ、１１Ｂ、１６もしくは２５の配列）も本明細書において提供されることに留意されたい。
実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ配列は、ＣＤ３ゼータ鎖由来の共刺激ドメインのシグナルドメインにおけるＱ／Ｋ残基変化を含有する。
一態様において、本発明は、ＣＡＲをコードする核酸分子を含む組換え核酸コンストラクトを包含し、前記核酸分子は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と連続しておりそれと同じリーディングフレーム内にある、例えば本明細書で説明される、抗ＣＤ１９結合ドメインをコードする核酸配列を含む。一態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号１～１２および５８の１つまたは複数から選択される。一態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号６７～７２および９７の１つまたは複数で提供される配列のヌクレオチド残基６４～８１３によってコードされる。一態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号６１のヌクレオチド残基６４～８１３によってコードされる。一態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号６２のヌクレオチド残基６４～８１３によってコードされる。一態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号６３のヌクレオチド残基６４～８１３によってコードされる。一態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号６４のヌクレオチド残基６４～８１３によってコードされる。一態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号６５のヌクレオチド残基６４～８１３によってコードされる。一態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号６６のヌクレオチド残基６４～８１３によってコードされる。一態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号６７のヌクレオチド残基６４～８１３によってコードされる。一態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号６８のヌクレオチド残基６４～８１３によってコードされる。一態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号６９のヌクレオチド残基６４～８１３によってコードされる。一態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号７０のヌクレオチド残基６４～８１３によってコードされる。一態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号７１のヌクレオチド残基６４～８１３によってコードされる。一態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号７２のヌクレオチド残基６４～８１３によってコードされる。
ＣＤ１９阻害剤および併用療法が本明細書において提供される。一部の実施形態において、ＣＤ１９阻害剤（例えば、細胞治療薬または抗体）は、Ｂ細胞阻害剤、例えばＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１の１つまたは複数の阻害剤と組み合わせて投与される。ＣＤ１９阻害剤としては、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＤ１９ ＣＡＲＴ細胞、あるいは抗ＣＤ１９抗体（例えば、抗ＣＤ１９単一もしくは二重特異性抗体）またはそのフラグメントもしくはコンジュゲートが挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、ＣＤ１９阻害剤は、Ｂ細胞阻害剤、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞と組み合わせて投与される。
多数のＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞が本開示で説明される。例えば、一部の実施形態において、ＣＤ１９阻害剤は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、例えば、表２に記載の抗ＣＤ１９ ＣＡＲコンストラクトを発現するか、または表２、４もしくは５に記載のｓｃＦｖ、ＣＤＲもしくはＶＨおよびＶＬ鎖を含むＣＤ１９結合ＣＡＲによってコードされている、細胞を包含する。例えば、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴは、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞と組み合わせて投与するために、ＣＤ１９－ＣＡＲ（ＣＤ１９結合ドメインを含む）を細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）に遺伝子操作することによって生成される。本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞の養子療法のための使用方法も本明細書において提供される。
一実施形態において、抗原結合ドメインは、本明細書に、例えば表２、４もしくは５に、列挙した抗体からの、１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の、重鎖ＣＤＲのＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３、ならびに／または本明細書に、例えば表２、４もしくは５に、列挙した抗体からの、１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の、軽鎖ＣＤＲのＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３を含む。一実施形態において、抗原結合ドメインは、上に列挙または記載した抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む。
ある実施形態において、ＣＤ１９結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、表２において提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列もしくは表２のアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２もしくは３個の改変（例えば、置換）であるが３０、２０もしくは１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／または表２において提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列もしくは表２のアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２もしくは３個の改変（例えば、置換）であるが３０、２０もしくは１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。実施形態において、ＣＤ１９結合ドメインは、表４もしくは表５の１つもしくは複数のＣＤＲ（例えば、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３の各々１つ）、または前記ＣＤＲの１つもしくは複数の１個、２個、３個、４個、５個もしくは６個の改変（例えば、置換）を有するＣＤＲを含む。
典型的な抗ＣＤ１９抗体またはそれらのフラグメントもしくはコンジュゲートとしては、ブリナツモマブ、ＳＡＲ３４１９（Ｓａｎｏｆｉ）、ＭＥＤＩ－５５１（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ ＬＬＣ）、Ｃｏｍｂｏｔｏｘ、ＤＴ２２１９ＡＲＬ（Ｍａｓｏｎｉｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、ＭＯＲ－２０８（ＸｍＡｂ－５５７４とも呼ばれる；ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ）、ＸｍＡｂ－５８７１（Ｘｅｎｃｏｒ）、ＭＤＸ－１３４２（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＳＧＮ－ＣＤ１９Ａ（Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、およびＡＦＭ１１（Ａｆｆｉｍｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Hammer.MAbs.4.5(2012): 571-77を参照されたい。ブリナツモマブは、２つのｓｃＦｖ－ＣＤ１９と結合するものとＣＤ３と結合するもの－からなる二重特異性抗体である。ブリナツモマブは、Ｔ細胞にがん細胞を攻撃させる。例えば、Hammer et al.；臨床試験識別番号ＮＣＴ００２７４７４２およびＮＣＴ０１２０９２８６を参照されたい。ＭＥＤＩ－５５１は、増強された抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有するように加工されたＦｃを有するヒト化抗ＣＤ１９抗体である。例えば、Hammer et al.；および臨床試験識別番号ＮＣＴ０１９５７５７９を参照されたい。Ｃｏｍｂｏｔｏｘは、ＣＤ１９と結合する免疫毒素と、ＣＤ２２と結合する免疫毒素の混合物である。前記免疫毒素は、脱グリコシル化リシンＡ鎖に融合されたｓｃＦｖ抗体フラグメントで構成されている。例えば、Hammer et al.；およびHerrera et al.J. Pediatr.Hematol.Oncol.31.12(2009):936-41；Schindler et al.Br. J. Haematol.154.4(2011):471-6を参照されたい。ＤＴ２２１９ＡＲＬは、２つのｓｃＦｖとトランケートされたジフテリア毒素とを含む、ＣＤ１９およびＣＤ２２を標的とする二重特異性免疫毒素である。例えば、Hammer et al.；および臨床試験識別番号ＮＣＴ００８８９４０８を参照されたい。ＳＧＮ－ＣＤ１９Ａは、合成細胞毒性細胞殺滅剤であるモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）に連結された抗ＣＤ１９ヒト化モノクローナル抗体からなる抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。例えば、Hammer et al.；ならびに臨床試験識別番号ＮＣＴ０１７８６０９６およびＮＣＴ０１７８６１３５を参照されたい。ＳＡＲ３４１９は、切断可能なリンカーを介してメイタンシン誘導体とコンジュゲートしている抗ＣＤ１９ヒト化モノクローナル抗体を含む抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。例えば、Younes et al.J. Clin.Oncol.30.2(2012): 2776-82；Hammer et al.；臨床試験識別番号ＮＣＴ００５４９１８５；およびBlanc et al.Clin Cancer Res.、2011;17:6448-58を参照されたい。ＸｍＡｂ－５８７１は、Ｆｃが加工されたヒト化抗ＣＤ１９抗体である。例えば、Hammer et al.を参照されたい。ＭＤＸ－１３４２は、増強されたＡＤＣＣを有する、Ｆｃが加工されたヒト抗ＣＤ１９抗体である。例えば、Hammer et al.を参照されたい。実施形態において、抗体分子は、二重特異性抗ＣＤ１９および抗ＣＤ３分子である。例えば、ＡＦＭ１１は、ＣＤ１９およびＣＤ３を標的とする二重特異性抗体である。例えば、Hammer et al.；および臨床試験識別番号ＮＣＴ０２１０６０９１を参照されたい。一部の実施形態において、本明細書で説明される抗ＣＤ１９抗体は、治療剤、例えば、化学療法剤、ペプチドワクチン（例えば、Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971で説明されているもの）、免疫抑制剤、もしくは免疫除去剤（immunoablative agents）、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノール酸塩、ＦＫ５０６、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン（cytoxan）、フルダラビン、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、またはサイトカインとコンジュゲートされるか、または他の形で結合される。
典型的な抗ＣＤ１９抗体分子（抗体またはそれらのフラグメントもしくはコンジュゲートを含む）としては、表２、４または５に記載のｓｃＦｖ、ＣＤＲ、またはＶＨおよびＶＬ鎖を挙げることができる。ある実施形態において、ＣＤ１９結合抗体分子は、表２において提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列もしくは表２のアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２もしくは３個の改変（例えば、置換）であるが３０、２０もしくは１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／または表２において提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列もしくは表２のアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２もしくは３個の改変（例えば、置換）であるが３０、２０もしくは１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。実施形態において、ＣＤ１９結合抗体分子は、表４もしくは表５の１つもしくは複数のＣＤＲ（例えば、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３の各々１つ）、または前記ＣＤＲの１つもしくは複数の１個、２個、３個、４個、５個もしくは６個の改変（例えば、置換）を有するＣＤＲを含む。抗体分子は、例えば、単離された抗体分子であってもよい。
一実施形態において、ＣＤ１９に対する抗原結合ドメインは、本明細書中の表に記載の抗原結合ドメインの抗原結合部分、例えばＣＤＲである。一実施形態において、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、任意のＣＤ１９ ＣＡＲ、例えば、ＬＧ－７４０；米国特許第８，３９９，６４５号；米国特許第７，４４６，１９０号；Xu et al., Leuk Lymphoma.2013 54(2):255-260(2012)；Cruz et al., Blood 122(17):2965-2973 (2013)；Brentjens et al., Blood, 118(18):4817-4828 (2011)；Kochenderfer et al., Blood 116(20):4099-102 (2010)；Kochenderfer et al., Blood 122 (25):4129-39(2013)；および16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther (ASGCT) (May 15-18, Salt Lake City) 2013, Abst 10からのものであってもよく、前記参考文献の各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
一実施形態において、ＣＤ１９と特異的に結合するＣＡＲ Ｔ細胞は、ＵＳＡＮ名ＴＩＳＡＧＥＮＬＥＣＬＥＵＣＥＬ－Ｔを有する。ＣＴＬ０１９は、Ｔ細胞の遺伝子改変によって作製され、この改変は、ＥＦ－１アルファプロモーターの制御下のＣＴＬ０１９導入遺伝子を含有する自己不活性化、複製欠損レンチウイルス（ＬＶ）ベクターでの形質導入による安定的挿入によって媒介される。ＣＴＬ０１９は、パーセント導入遺伝子陽性Ｔ細胞に基づいて対象にデリバリーされる導入遺伝子陽性Ｔ細胞と導入遺伝子陰性Ｔ細胞の混合物であってもよい。
一態様において、本発明のＣＡＲコンストラクトの核酸配列は、配列番号８５～９６の１つまたは複数から選択される。一態様において、ＣＡＲコンストラクトの核酸配列は、配列番号８５である。一態様において、ＣＡＲコンストラクトの核酸配列は、配列番号８６である。一態様において、ＣＡＲコンストラクトの核酸配列は、配列番号８７である。一態様において、ＣＡＲコンストラクトの核酸配列は、配列番号８８である。一態様において、ＣＡＲコンストラクトの核酸配列は、配列番号８９である。一態様において、ＣＡＲコンストラクトの核酸配列は、配列番号９０である。一態様において、ＣＡＲコンストラクトの核酸配列は、配列番号９１である。一態様において、ＣＡＲコンストラクトの核酸配列は、配列番号９２である。一態様において、ＣＡＲコンストラクトの核酸配列は、配列番号９３である。一態様において、ＣＡＲコンストラクトの核酸配列は、配列番号９４である。一態様において、ＣＡＲコンストラクトの核酸配列は、配列番号９５である。一態様において、ＣＡＲコンストラクトの核酸配列は、配列番号９６である。一態様において、ＣＡＲコンストラクトの核酸配列は、配列番号９７である。一態様において、ＣＡＲコンストラクトの核酸配列は、配列番号９８である。一態様において、ＣＡＲコンストラクトの核酸配列は、配列番号９９である。
ＣＤ２０阻害剤および結合ドメイン
本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ２０」は、Ｂ細胞上で検出可能であることが公知の抗原決定基のことをいう。ヒトＣＤ２０は、４膜貫通ドメイン、サブファミリーＡ、メンバー１（ＭＳ４Ａ１）とも呼ばれる。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔおよびＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔなどの公開データベースで見出すことができる。例えば、ヒトＣＤ２０のアミノ酸配列は、受託番号ＮＰ＿６９０６０５．１およびＮＰ＿０６８７６９．２として見出すことができ、ヒトＣＤ２０の転写変異体１および３をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ、受託番号ＮＭ＿１５２８６６．２およびＮＭ＿０２１９５０．３で見出すことができる。本明細書で使用される場合、「ＣＤ２０」は、完全長野生型ＣＤ２０の突然変異、例えば点突然変異、フラグメント、挿入、欠失およびスプライス変異体を含むタンパク質を包含する。一態様において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＣＤ２０タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、それに結合する。一態様において、ＣＤ２０タンパク質は、がん細胞上で発現される。
一部の態様において、本開示は、ＣＤ２０阻害剤または結合ドメイン、例えば、本明細書で説明されるようなＣＤ２０阻害剤または結合ドメインを提供する。本開示は、ＣＤ２０結合ドメインをコードする核酸、またはＣＤ２０結合ドメインを含むＣＡＲも提供する。ＣＤ２０阻害剤としては、ＣＤ２０ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＤ２０ ＣＡＲＴ細胞、または抗ＣＤ２０抗体（例えば、抗ＣＤ２０単一もしくは二重特異性抗体）もしくはそのフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、第二の薬剤、例えば、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、またはＣＤ１９結合ドメインも含んでいてもよい。薬剤は、例えば、単一の核酸によってコードされていてもよく、または異なる核酸によってコードされていてもよい。
一部の態様において、ＣＤ２０阻害剤または結合ドメインは、単剤療法として投与される。一部の態様において、ＣＤ２０阻害剤または結合ドメインは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞などの第二の薬剤と組み合わせて投与される。ある実施形態において、ＣＤ２０阻害剤は、ＣＤ１９阻害剤、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞、例えば、マウスのものであるか、ヒトのものであるか、またはヒト化されている抗体結合ドメインを含むＣＡＲを発現する細胞と組み合わせて投与される。
ＣＤ２０ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ
ある実施形態において、ＣＤ２０抗体分子は、表１５Ａもしくは１５Ｂにおいて提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列または表１５Ａもしくは１５Ｂのアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２または３個の改変（例えば、置換）であるが３０、２０または１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／あるいは表１４Ａもしくは１４Ｂにおいて提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列または表１４Ａもしくは１４Ｂのアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２または３個の改変（例えば、置換）であるが３０、２０または１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態において、ＣＤ２０抗体分子は、本明細書で説明されるＣＤ２０結合ドメインの、１つもしくは複数（例えば、３つ全て）の、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）、ならびに／または本明細書で説明されるＣＤ２０結合ドメインの、１つもしくは複数（例えば、３つ全て）の、重鎖結合ドメインアミノ酸配列の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含み、例えば、１つまたは複数、例えば３つ全てのＬＣ ＣＤＲおよび１つまたは複数、例えば３つ全て、のＨＣ ＣＤＲを含むＣＤ２０結合ドメインを含む。これらのＣＤＲは、例えば、表１２Ａ、１２Ｂ、および／もしくは表１３のもの、またはそれらと実質的に同一の配列であってもよい。ある実施形態において、ＣＤ２０抗体分子は、表１２Ａ、１２Ｂおよび／または表１３のアミノ酸配列の１個、２個、３個、４個、５個または６個の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む１つまたは複数のＣＤＲ（例えば、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３）を含む。抗体分子は、例えば、単離された抗体分子であってもよい。
一部の実施形態において、ＣＤ２０阻害剤は、抗ＣＤ２０ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、例えば、表１１Ａもしくは１１Ｂに記載の抗ＣＤ２０ ＣＡＲコンストラクト、またはそれと実質的に同一の配列を発現するか、あるいは表１１Ａ～１５Ｂに記載のｓｃＦｖ、ＣＤＲもしくはＶＨおよびＶＬ鎖、またはそれと実質的に同一の配列を含むＣＤ２０結合ＣＡＲによってコードされてい、細胞を包含する。例えば、抗ＣＤ２０ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴは、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞と組み合わせて投与するために、ＣＤ２０－ＣＡＲ（ＣＤ２０結合ドメインを含む）を細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）に遺伝子操作することによって生成される。本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞の養子療法のための使用方法も本明細書において提供される。
ある実施形態において、ＣＤ２０結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、表１５Ａもしくは１５Ｂにおいて提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列または表１５Ａもしくは１５Ｂのアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２または３個の改変（例えば、置換）であるが３０、２０または１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／あるいは表１４Ａもしくは１４Ｂにおいて提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列または表１４Ａもしくは１４Ｂのアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２または３個の改変（例えば、置換）であるが３０、２０または１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、本明細書で説明されるＣＤ２０結合ドメインの、１つもしくは複数（例えば、２つもしくは３つ全て）の、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）、ならびに／または本明細書で説明されるＣＤ２０結合ドメインの、１つもしくは複数（例えば、３つ全て）の、重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含み、例えば、１つまたは複数、例えば３つ全て、のＬＣ ＣＤＲおよび１つまたは複数、例えば３つ全て、のＨＣ ＣＤＲを含むＣＤ２０結合ドメインを含む。これらのＣＤＲは、例えば、表１２Ａ、１２Ｂ、および／もしくは表１３のもの、またはそれらと実質的に同一の配列であってもよい。ある実施形態において、ＣＤ２０結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、表１２Ａ、１２Ｂおよび／または表１３のアミノ酸配列の１個、２個、３個、４個、５個または６個の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む１つまたは複数のＣＤＲ（例えば、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３）を含む。
一部の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２０結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを包含する、抗体または抗体フラグメントを含む。ＣＤ２０結合ドメインは、表１３、１５Ａまたは１５Ｂに列挙したいずれかのＣＤ２０軽鎖結合ドメインアミノ酸配列の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）の１つまたは複数、ならびに表１２Ａ、１２Ｂ、１４Ａまたは１４Ｂに列挙したいずれかのＣＤ２０重鎖結合ドメインアミノ酸配列の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）の１つまたは複数を含んでいてもよい。
ある実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、ＣＡＲ２０－１、ＣＡＲ２０－２、ＣＡＲ２０－３、ＣＡＲ２０－４、ＣＡＲ２０－５、ＣＡＲ２０－６、ＣＡＲ２０－７、ＣＡＲ２０－８、ＣＡＲ２０－９、ＣＡＲ２０－１０、ＣＡＲ２０－１１、ＣＡＲ２０－１２、ＣＡＲ２０－１３、ＣＡＲ２０－１４、ＣＡＲ２０－１５、またはＣＡＲ２０－１６のいずれか１つまたはそれと実質的に同一の配列の、６つのＣＤＲ（例えば、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３の各々１つ）を含む。ある実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、ＣＡＲ２０－１、ＣＡＲ２０－２、ＣＡＲ２０－３、ＣＡＲ２０－４、ＣＡＲ２０－５、ＣＡＲ２０－６、ＣＡＲ２０－７、ＣＡＲ２０－８、ＣＡＲ２０－９、ＣＡＲ２０－１０、ＣＡＲ２０－１１、ＣＡＲ２０－１２、ＣＡＲ２０－１３、ＣＡＲ２０－１４、ＣＡＲ２０－１５、またはＣＡＲ２０－１６のいずれか１つまたはそれと実質的に同一の配列の、３つのＣＤＲ（例えば、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３の各々１つ、またはＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３の各々１つ）を含む。
一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、本明細書で（例えば、表１５Ａもしくは１５Ｂで）説明される軽鎖可変領域、および／または本明細書で（例えば、表１４Ａもしくは１４Ｂで）説明される重鎖可変領域、あるいはそれと実質的に同一の配列を含む。ある実施形態において、ＣＤ２０結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、表１５Ａもしくは１５Ｂにおいて提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列または表１５Ａもしくは１５Ｂのアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２または３個の改変（例えば、置換）であるが３０、２０または１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／あるいは表１４Ａもしくは１４Ｂにおいて提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列または表１４Ａもしくは１４Ｂのアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２または３個の改変（例えば、置換）であるが３０、２０または１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
さらなる実施形態は、このセクションで説明されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する。例えば、さらなる実施形態は、表１１Ａ～１５Ｂのいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する。例えば、ヌクレオチド配列は、表１１Ａまたは１１ＢのＣＡＲコンストラクトまたはｓｃＦｖを含んでいてもよい。ヌクレオチドは、表１４Ａもしくは１４ＢのＶＨ、表１５Ａもしくは１５ＢのＶＬ、または両方をコードし得る。ヌクレオチドは、表１２Ａもしくは１２ＢのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２もしくはＶＨ ＣＤＲ３の１つもしくは複数（例えば、２つもしくは３つ）をコードし得るか、および／またはヌクレオチドは、表１３のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２もしくはＶＬ ＣＤＲ３の１つもしくは複数（例えば、２つもしくは３つ）をコードし得る。ヌクレオチド配列はまた、配列番号１３、１４、１５、１６、１７および５１のドメインの１つまたは複数、例えば全てを包含し得る。
別の態様において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞とＣＤ２０ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む、ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞、の集団が本明細書において提供される。例えば、一実施形態において、ＣＡＲＴ細胞の集団は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する第一の細胞、およびＣＤ２０ ＣＡＲを発現する第二の細胞を包含し得る。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを包含するＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ＣＤ２０ ＣＡＲ、またはＣＤ２２ ＣＡＲ）を発現する第一の細胞、および二次シグナル伝達ドメインを包含するＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ＣＤ２０ ＣＡＲ、またはＣＤ２２ ＣＡＲ）を発現する第二の細胞を包含する。
ＣＤ２０ ＣＡＲはまた、膜貫通ドメイン、例えば本明細書で説明されるような膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば本明細書で説明されるような細胞内シグナル伝達ドメイン、共刺激ドメイン、例えば本明細書で説明されるような共刺激ドメイン、リーダー配列、例えば本明細書で説明されるようなリーダー配列、またはヒンジ、例えば本明細書で説明されるようなヒンジ、の１つまたは複数を含んでいてもよい。
典型的な抗ＣＤ２０抗体としては、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブ、オビヌツズマブ、ＴＲＵ－０１５（Ｔｒｕｂｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、オカラツズマブおよびＰｒｏ１３１９２１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Lim et al. Haematologica. 95. 1 (2010):135-43を参照されたい。
一部の実施形態において、抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブを含む。リツキシマブとは、例えば、www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdfにおいて説明されているように、ＣＤ２０と結合し、ＣＤ２０発現細胞の細胞溶解を引き起こす、キメラマウス／ヒトモノクローナル抗体ＩｇＧ１カッパである。一部の実施形態において、リツキシマブを使用して、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）（例えば、濾胞性ＮＨＬ、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫）および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）などの、Ｂ細胞悪性腫瘍を処置することができる。他の実施形態において、リツキシマブは、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、自己免疫性貧血、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、エバンス症候群、血管炎、水疱性皮膚障害、１型糖尿病、シェーグレン症候群、抗ＮＭＤＡ受容体脳炎およびデビック病、グレーブス眼症、ならびに自己免疫性膵炎などの、自己免疫疾患を処置するために使用することができる。一部の実施形態において、リツキシマブは、移植片拒絶を処置するために使用することができる。
いくつかの実施形態において、リツキシマブを、静脈内投与する、例えば、静脈内注入として投与する。例えば、各回の注入は、約５００～２０００ｍｇ（例えば、約５００～５５０、５５０～６００、６００～６５０、６５０～７００、７００～７５０、７５０～８００、８００～８５０、８５０～９００、９００～９５０、９５０～１０００、１０００～１１００、１１００～１２００、１２００～１３００、１３００～１４００、１４００～１５００、１５００～１６００、１６００～１７００、１７００～１８００、１８００～１９００、または１９００～２０００ｍｇ）のリツキシマブを施す。
いくつかの実施形態において、リツキシマブを、１５０ｍｇ／ｍ２～７５０ｍｇ／ｍ２、例えば、約１５０～１７５ｍｇ／ｍ２、１７５～２００ｍｇ／ｍ２、２００～２２５ｍｇ／ｍ２、２２５～２５０ｍｇ／ｍ２、２５０～３００ｍｇ／ｍ２、３００～３２５ｍｇ／ｍ２、３２５～３５０ｍｇ／ｍ２、３５０～３７５ｍｇ／ｍ２、３７５～４００ｍｇ／ｍ２、４００～４２５ｍｇ／ｍ２、４２５～４５０ｍｇ／ｍ２、４５０～４７５ｍｇ／ｍ２、４７５～５００ｍｇ／ｍ２、５００～５２５ｍｇ／ｍ２、５２５～５５０ｍｇ／ｍ２、５５０～５７５ｍｇ／ｍ２、５７５～６００ｍｇ／ｍ２、６００～６２５ｍｇ／ｍ２、６２５～６５０ｍｇ／ｍ２、６５０～６７５ｍｇ／ｍ２、または６７５～７００ｍｇ／ｍ２（表記中、ｍ２は、対象の体表面積を指し示す）の用量で投与する。
いくつかの実施形態において、リツキシマブを、少なくとも４日間、例えば、４、７、１４、２１、２８、３５日間、またはこれを超える投与間隔で投与する。例えば、リツキシマブを、少なくとも０．５週間、例えば、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８週間、またはこれを超える投与間隔で投与する。
いくつかの実施形態において、リツキシマブを、本明細書で説明される用量および投与間隔で、ある期間、例えば、少なくとも２週間、例えば、少なくとも、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０週間、またはこれを超える期間にわたり投与する。例えば、リツキシマブを、本明細書で説明される用量および投与間隔で、処置サイクル１つあたり、のべ少なくとも４回の投与（dose）（例えば、処置サイクル１つあたり、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６回、またはこれを超える投与）にわたり投与する。
一部の態様において、抗ＣＤ２０抗体は、オファツムマブを含む。オファツムマブとは、分子量を約１４９ｋＤａとする、抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１κヒトモノクローナル抗体である。例えば、オファツムマブは、トランスジェニックマウスおよびハイブリドーマ技術を使用して生成し、組換えマウス細胞株（ＮＳ０）から発現し、精製する。例えば、www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf；ならびに臨床試験識別番号ＮＣＴ０１３６３１２８、ＮＣＴ０１５１５１７６、ＮＣＴ０１６２６３５２、およびＮＣＴ０１３９７５９１を参照されたい。
オファツムマブは、ＣＬＬ、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）（例えば、濾胞性ＮＨＬおよびＤＬＢＣＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、マントル細胞リンパ腫、関節リウマチおよび多発性硬化症などの疾患を処置するために使用することができる。
いくつかの実施形態において、オファツムマブを、静脈内注入として投与する。例えば、各回の注入は、約１５０～３０００ｍｇ（例えば、約１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～３５０、３５０～４００、４００～４５０、４５０～５００、５００～５５０、５５０～６００、６００～６５０、６５０～７００、７００～７５０、７５０～８００、８００～８５０、８５０～９００、９００～９５０、９５０～１０００、１０００～１２００、１２００～１４００、１４００～１６００、１６００～１８００、１８００～２０００、２０００～２２００、２２００～２４００、２４００～２６００、２６００～２８００、または２８００～３０００ｍｇ）のオファツムマブを施す。
一部の実施形態において、オファツムマブは、少なくとも４日間、例えば、４、７、１４、２１、２８、３５日間、またはこれを超える投与間隔で投与される。例えば、オファツムマブは、少なくとも１週間、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、２６、２８、２０、２２、２４、２６、２８、３０週間、またはこれを超える投与間隔で投与する。
一部の実施形態において、オファツムマブは、本明細書で説明される用量および投与間隔で、ある期間、例えば、少なくとも１週間、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、４０、５０、６０週間、もしくはこれを超える期間、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２カ月、もしくはこれを超える期間、または１、２、３、４、５年、もしくはこれを超える期間にわたり投与される。例えば、オファツムマブは、本明細書で説明される用量および投与間隔で、処置サイクル１つあたり、のべ少なくとも２回の投与（例えば、処置サイクル１つあたり、少なくとも、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０回、またはこれを超える投与）にわたり投与される。
一部の態様において、抗ＣＤ２０抗体は、オクレリズマブを含む。オクレリズマブとは、例えば、臨床試験識別番号ＮＣＴ０００７７８７０、ＮＣＴ０１４１２３３３、ＮＣＴ００７７９２２０、ＮＣＴ００６７３９２０、ＮＣＴ０１１９４５７０、およびKappos et al.Lancet.19.378(2011):1779-87において説明されているような、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。例えば、オクレリズマブは、関節リウマチ、多発性硬化症および狼瘡などの疾患を処置することために使用するができる。
一部の実施形態において、オクレリズマブは、静脈内注入として投与される。例えば、各回の注入は、約５０～２０００ｍｇ（例えば、約５０～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～３５０、３５０～４００、４００～４５０、４５０～５００、５００～５５０、５５０～６００、６００～６５０、６５０～７００、７００～７５０、７５０～８００、８００～８５０、８５０～９００、９００～９５０、９５０～１０００、１０００～１１００、１１００～１２００、１２００～１３００、１３００～１４００、１４００～１５００、１５００～１６００、１６００～１７００、１７００～１８００、１８００～１９００、または１９００～２０００ｍｇ）のオクレリズマブを施す。
一部の実施形態において、オクレリズマブは、少なくとも７日間、例えば、７、１４、２１、２８、３５日間、またはこれを超える投与間隔で投与される。例えば、オクレリズマブは、少なくとも１週間、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、２６、２８、２０、２２、２４、２６、２８、３０週間、またはこれを超える投与間隔で投与される。
一部の実施形態において、オクレリズマブは、本明細書で説明される用量および投与間隔で、ある期間、例えば、少なくとも２週間、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、４０、５０、６０週間、もしくはこれを超える期間、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２カ月、もしくはこれを超える期間、または１、２、３、４、５年、もしくはこれを超える期間にわたり投与される。例えば、オクレリズマブは、本明細書で説明される用量および投与間隔で、処置サイクル１つあたり、のべ少なくとも４回の投与（例えば、処置サイクル１つあたり、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０回、またはこれを超える投与）にわたり投与される。
一部の態様において、抗ＣＤ２０抗体は、ベルツズマブを含む。ベルツズマブとは、ＣＤ２０に対するヒト化モノクローナル抗体である。例えば、臨床試験識別番号ＮＣＴ００５４７０６６、ＮＣＴ００５４６７９３、ＮＣＴ０１１０１５８１、およびGoldenberg et al.Leuk Lymphoma.51(5)(2010):747-55を参照されたい。例えば、ベルツズマブは、ＮＨＬ（例えば、ＤＬＢＣＬ、濾胞性リンパ腫）、ＣＬＬ、および自己免疫疾患、例えば免疫血小板減少性紫斑病（ＴＩＰ）を処置するために使用することができる。
一部の実施形態において、ベルツズマブは皮下投与されるか、または例えば静脈内注入として静脈内投与される。一部の実施形態において、ベルツズマブは、５０～８００ｍｇ／ｍ２、例えば、約５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１１０、１１０～１２０、１２０～１３０、１３０～１４０、１４０～１５０、１５０～１６０、１６０～１７０、１７０～１８０、１８０～１９０、１９０～２００、２００～２２５、２２５～２５０、２５０～２７５、２７５～３００、３００～３２５、３２５～３５０、３５０～３７５、３７５～４００、４００～４２５、４２５～４５０、４５０～４７５、４７５～５００、５００～５２５、５２５～５５０、５５０～５７５、５７５～６００、６００～６２５、６２５～６５０、６５０～６７５、６７５～７００、７００～７２５、７２５～７５０、７５０～７７５、または７７５～８００ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。一部の実施形態において、５０～４００ｍｇ、例えば、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、または４００ｍｇの用量のベルツズマブが投与される。
一部の実施形態において、ベルツズマブは、少なくとも７日間、例えば、７、１４、２１、２８、３５日間、またはこれを超える投与間隔で投与される。例えば、ベルツズマブは、少なくとも１週間、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、２６、２８、２０、２２、２４、２６、２８、３０週間、またはこれを超える投与間隔で投与される。
一部の実施形態において、ベルツズマブは、本明細書で説明される用量および投与間隔で、ある期間、例えば、少なくとも２週間、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、４０、５０、６０週間、もしくはこれを超える期間、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２カ月、もしくはこれを超える期間、または１、２、３、４、５年、もしくはこれを超える期間にわたり投与される。例えば、ベルツズマブは、本明細書で説明される用量および投与間隔で、処置サイクル１つあたり、のべ少なくとも４回の投与（例えば、処置サイクル１つあたり、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０回、またはこれを超える投与）にわたり投与される。
一部の態様において、抗ＣＤ２０抗体は、ＧＡ１０１を含む。ＧＡ１０１（オビヌツズマブまたはＲＯ５０７２７５９とも呼ばれる）とは、ヒト化および糖鎖加工された抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。例えば、ＧＡ１０１は、Ｂ細胞リンパ系悪性腫瘍、例えば、ＣＬＬ、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）およびびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）などの疾患を処置するために使用することができる。例えば、Robak.Curr.Opin.Investig.Drugs.10.6(2009):588-96；臨床試験識別番号ＮＣＴ０１９９５６６９、ＮＣＴ０１８８９７９７、ＮＣＴ０２２２９４２２およびＮＣＴ０１４１４２０５；ならびにwww.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdfを参照されたい。
一部の実施形態において、ＧＡ１０１は、例えば静脈内注入として、静脈内投与される。例えば、各回の注入は、約１００～３０００ｍｇ（例えば、約１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～５００、３００～３５０、３５０～４００、４００～４５０、４５０～５００、５００～５５０、５５０～６００、６００～６５０、６５０～７００、７００～７５０、７５０～８００、８００～８５０、８５０～９００、９００～９５０、９５０～１０００、１０００～１２００、１２００～１４００、１４００～１６００、１６００～１８００、１８００～２０００、２０００～２２００、２２００～２４００、２４００～２６００、２６００～２８００、または２８００～３０００ｍｇ）のＧＡ１０１を施す。
一部の実施形態において、ＧＡ１０１は、少なくとも７日間、例えば、７、１４、２１、２８、３５日間、またはこれを超える投与間隔で投与される。例えば、ＧＡ１０１は、少なくとも１週間、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、２６、２８、２０、２２、２４、２６、２８、３０週間、またはこれを超える投与間隔で投与される。例えば、ＧＡ１０１は、少なくとも１カ月、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２カ月、またはこれを超える投与間隔で投与される。一部の実施形態において、ＧＡ１０１は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日間の投与間隔で投与される。
一部の実施形態において、ＧＡ１０１は、本明細書で説明される用量および投与間隔で、ある期間、例えば、少なくとも１週間、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、４０、５０、６０週間、もしくはこれを超える期間、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２カ月、もしくはこれを超える期間、または１、２、３、４、５年、もしくはこれを超える期間にわたり投与される。例えば、ＧＡ１０１は、本明細書で説明される用量および投与間隔で、処置サイクル１つあたり、のべ少なくとも２回の投与（例えば、処置サイクル１つあたり、少なくとも、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０回、またはこれを超える投与）にわたり投与される。
一部の態様において、抗ＣＤ２０抗体は、ＡＭＥ－１３３ｖを含む。ＡＭＥ－１３３ｖ（ＬＹ２４６９２９８またはオカラツズマブとも呼ばれる）とは、ＣＤ２０に対するヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体であって、リツキシマブと比較して、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体に対する親和性を増加させ、抗体依存性細胞介在性細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性を増強した、ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。例えば、Robak et al.BioDrugs 25.1(2011):13-25を参照されたい。一部の実施形態において、ＡＭＥ－１３３ｖは、ＮＨＬ、例えば濾胞性リンパ腫などの、がんを処置するために使用することができる。例えば、Forero-Torres et al.Clin Cancer Res.、18.5(2012):1395-403を参照されたい。
一部の態様において、抗ＣＤ２０抗体は、ＰＲＯ１３１９２１を含む。ＰＲＯ１３１９２１とは、リツキシマブと比較して、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合が良好となり、ＡＤＣＣが増強されるように加工された、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。例えば、Robak et al.BioDrugs 25.1(2011):13-25；およびCasulo et al.Clin Immunol.154.1(2014):37-46を参照されたい。一部の実施形態において、ＰＲＯ１３１９２１は、ＮＨＬを処置するために使用することができる。例えば、臨床試験識別番号ＮＣＴ００４５２１２７を参照されたい。一部の実施形態において、ＰＲＯ１３１９２１は、例えば静脈内注入として、静脈内投与される。一部の実施形態において、ＰＲＯ１３１９２１は、１５ｍｇ／ｍ２～１０００ｍｇ／ｍ２、例えば、約１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５０～５５、５５～６０、６０～６５、６５～７０、７０～７５、７５～８０、８０～８５、８５～９０、９０～９５、９５～１００、１００～１２５、１２５～１５０、１５０～１７５、１７５～２００、２００～２２６、２２５～２５０、２５０～３００、３００～３２５、３２５～３５０、３５０～３７５、３７５～４００、４００～４２５、４２５～４５０、４５０～４７５、４７５～５００、５００～５２５、５２５～５５０、５５０～５７５、５７５～６００、６００～６２５、６２５～６５０、６５０～６７５、６７５～７００、７００～７２５、７２５～７５０、７５０～７７５、７７５～８００、８００～８２５、８２５～８５０、８５０～８７５、８７５～９００、９００～９２５、９２５～９５０、９５０～９７５、または９７５～１０００ｍｇ／ｍ２の用量で投与され、ここで、ｍ２は、対象の体表面積を示す。
一部の態様において、抗ＣＤ２０抗体は、ＴＲＵ－０１５を含む。ＴＲＵ－０１５とは、ＣＤ２０に対する抗体のドメイン由来の抗ＣＤ２０融合タンパク質である。ＴＲＵ－０１５は、モノクローナル抗体より小型であるが、Ｆｃに媒介されるエフェクター機能を保持する。例えば、Robak et al.BioDrugs 25.1(2011):13-25を参照されたい。ＴＲＵ－０１５は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに連結されているが、ＣＨ１およびＣＬドメインを欠く、抗ＣＤ２０単鎖可変性フラグメント（ｓｃＦｖ）を含有する。一部の実施形態において、ＴＲＵ－０１５は、Ｂ細胞リンパ腫および関節リウマチを処置するために使用することができる。場合によって、ＴＲＵ－０１５は、例えば静脈内注入として、静脈内投与される。一部の実施形態において、ＴＲＵ－０１５は、０．０１～３０ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．０１～０．０１５、０．０１５～０．０５、０．０５～０．１５、０．１５～０．５、０．５～１、１～１．５、１．５～２．５、２．５～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、または２５～３０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。一部の実施形態において、ＴＲＵ－０１５は、少なくとも１日、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日間離した投与間隔で投与される。例えば、Burge et al.Clin Ther.30.10(2008):1806-16を参照されたい。
一部の実施形態において、本明細書で説明される抗ＣＤ２０抗体は、本明細書で説明される治療剤、例えば、化学療法剤（例えば、シトキサン、フルダラビン、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、脱メチル化剤、ペプチドワクチン、抗腫瘍抗生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、アルキル化剤、抗微小管剤または抗有糸分裂薬剤、本明細書で説明されるＣＤ２０抗体またはＣＤ２０抗体薬物コンジュゲート）、抗アレルギー剤、吐き気止め（または制吐剤）、鎮痛剤、または細胞保護剤にコンジュゲートされるか、または他の形で結合される。
ＣＤ２２阻害剤および結合ドメイン
本明細書で使用される場合、「ＣＤ２２」は、白血病前駆細胞上で検出可能であることが公知の抗原決定基を指す。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔおよびＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔなどの公開データベースで見出すことができる。例えば、アイソフォーム１～５ヒトＣＤ２２のアミノ酸配列は、受託番号ＮＰ ００１７６２．２、ＮＰ ００１１７２０２８．１、ＮＰ ００１１７２０２９．１、ＮＰ ００１１７２０３０．１およびＮＰ ００１２６５３４６．１でそれぞれ見出すことができ、ヒトＣＤ２２の変異体１～５をコードするヌクレオチド配列は、受託番号ＮＭ ００１７７１．３、ＮＭ ００１１８５０９９．１、ＮＭ ００１１８５１００．１、ＮＭ ００１１８５１０１．１およびＮＭ ００１２７８４１７．１でそれぞれ見出すことができる。本明細書で使用される場合、「ＣＤ２２」は、完全長野生型ＣＤ２２の突然変異、例えば点突然変異、フラグメント、挿入、欠失およびスプライス変異体を含むタンパク質を包含する。一態様において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＣＤ２２タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、それに結合する。一態様において、ＣＤ２２タンパク質は、がん細胞上で発現される。
一部の態様において、本開示は、ＣＤ２２阻害剤または結合ドメイン、例えば、本明細書で説明されるようなＣＤ２２阻害剤または結合ドメインを提供する。本開示は、ＣＤ２２結合ドメインをコードする核酸、またはＣＤ２２結合ドメインを含むＣＡＲも提供する。ＣＤ２２阻害剤としては、ＣＤ２２ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＤ２２ ＣＡＲＴ細胞、または抗ＣＤ２２抗体（例えば、抗ＣＤ２２単一もしくは二重特異性抗体）もしくはそのフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。組成物はまた、第二の薬剤、例えば、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞またはＣＤ１９結合ドメインを含んでいてもよい。薬剤は、例えば、単一の核酸によってコードされていてもよく、または異なる核酸によってコードされていてもよい。
一部の態様において、ＣＤ２２阻害剤または結合ドメインは、単剤療法として投与される。一部の態様において、ＣＤ２２阻害剤または結合ドメインは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞などの第二の薬剤と組み合わせて投与される。ある実施形態において、ＣＤ２２阻害剤は、ＣＤ１９阻害剤、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞、例えば、マウスのものであるか、ヒトのものであるか、またはヒト化されている抗体結合ドメインを含むＣＡＲを発現する細胞と組み合わせて投与される。
ＣＤ２２ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ
一実施形態において、ＣＤ２２阻害剤は、ＣＤ２２ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＤ２２結合ドメインを含み、ならびにＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴと組み合わせて投与するためにおよび養子療法のためのそれらの使用方法のために、細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）に遺伝子操作される、ＣＤ２２－ＣＡＲである。
別の態様において、本発明は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞とＣＤ２２ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む、ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞、の集団を提供する。例えば、一実施形態において、ＣＡＲＴ細胞の集団は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する第一の細胞、およびＣＤ２２ ＣＡＲを発現する第二の細胞を包含し得る。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを包含するＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲまたはＣＤ２２ ＣＡＲ）を発現する第一の細胞、および二次シグナル伝達ドメインを包含するＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲまたはＣＤ２２ ＣＡＲ）を発現する第二の細胞を包含する。
一態様において、ＣＤ２２－ＣＡＲは、任意のリーダー配列（例えば、本明細書で説明される任意のリーダー配列）、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ（例えば、本明細書で説明されるヒンジ）、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書で説明される膜貫通ドメイン）、および細胞内刺激ドメイン（例えば、本明細書で説明される細胞内刺激ドメイン）を含む。一実施形態において、典型的なＣＤ２２ ＣＡＲコンストラクトは、任意のリーダー配列（例えば、本明細書で説明されるリーダー配列）、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメイン（例えば、本明細書で説明される細胞内共刺激ドメイン）、および細胞内刺激ドメインを含む。
一態様において、ＣＡＲ２２結合ドメインは、配列番号２００～４２８のいずれかで提供されるアミノ酸配列（または核酸配列によってコードされるアミノ酸配列）のｓｃＦｖ部分を含む。一態様において、ＣＡＲ２２結合ドメインは、配列番号２０３、２０９、２１５、２２１、２２７、２３２、２３８、２４４、２５０、２５６、２６２、２６８、２７４、２８０、２８６、２９２、２９８、３０４、３１０、３１６、３２２、３２８、３３４、３４０、３４６、３５２、３５８、３６４、３７０、３７６、３８２、３８８、３９４、４００、４０６、４１２、４１８、または４２３のいずれかで提供されるｓｃＦｖ部分を含む。
特異的な態様において、本発明のＣＡＲコンストラクトは、配列番号２０３、２０９、２１５、２２１、２２７、２３２、２３８、２４４、２５０、２５６、２６２、２６８、２７４、２８０、２８６、２９２、２９８、３０４、３１０、３１６、３２２、３２８、３３４、３４０、３４６、３５２、３５８、３６４、３７０、３７６、３８２、３８８、３９４、４００、４０６、４１２、４１８、または４２３からなる群より選択されるｓｃＦｖドメインを含み、ｓｃＦｖの前に、配列番号１３で提供されるもののようなリーダー配列、それに続いて、配列番号１４または配列番号４５または配列番号４７または配列番号４９で提供されるもののような任意のヒンジ配列、配列番号１５で提供されるもののような膜貫通領域、配列番号１６または配列番号５１を包含する細胞内シグナル伝達ドメイン、および配列番号１７または配列番号４３を包含するＣＤ３ゼータ配列が存在していてもよく、これらのドメインは連続しており同じリーディングフレーム内にあり、単一の融合タンパク質を形成する。一部の実施形態において、ｓｃＦｖドメインは、配列番号２０３、２０９、２１５、２２１、２２７、２３２、２３８、２４４、２５０、２５６、２６２、２６８、２７４、２８０、２８６、２９２、２９８、３０４、３１０、３１６、３２２、３２８、３３４、３４０、３４６、３５２、３５８、３６４、３７０、３７６、３８２、３８８、３９４、４００、４０６、４１２、４１８、または４２３からなる群より選択されるヒトｓｃＦｖドメインである。
また本発明は、配列番号２０３、２０９、２１５、２２１、２２７、２３２、２３８、２４４、２５０、２５６、２６２、２６８、２７４、２８０、２８６、２９２、２９８、３０４、３１０、３１６、３２２、３２８、３３４、３４０、３４６、３５２、３５８、３６４、３７０、３７６、３８２、３８８、３９４、４００、４０６、４１２、４１８、または４２３からなる群より選択されるｓｃＦｖフラグメントのそれぞれのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する。また本発明は、配列番号２０３、２０９、２１５、２２１、２２７、２３２、２３８、２４４、２５０、２５６、２６２、２６８、２７４、２８０、２８６、２９２、２９８、３０４、３１０、３１６、３２２、３２８、３３４、３４０、３４６、３５２、３５８、３６４、３７０、３７６、３８２、３８８、３９４、４００、４０６、４１２、４１８、または４２３、からなる群より選択されるｓｃＦｖフラグメントのそれぞれ、ならびに配列番号１３～１７のドメインのそれぞれのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、加えてコードされた本発明のＣＤ２２ ＣＡＲを包含する。
一部の実施形態において、完全長ＣＤ２２ ＣＡＲ配列も、表６Ａまたは６Ｂで示される通り、配列番号２０７、２１３、２１９、２２５、２３０、２３６、２４２、２４８、２５４、２６０、２６６、２７２、２７８、２８４、２９０、２９６、３０２、３０８、３１４、３２０、３２６、３３２、３３８、３４４、３５０、３５６、３６２、３６８、３７４、３８０、３８６、３９２、３９８、４０４、４１０、４１６、４２２、または４２７として本明細書において提供される。
一態様において、本発明は、ＣＡＲをコードする核酸分子を含む組換え核酸コンストラクトを包含し、前記核酸分子は、例えば本明細書で説明される、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と連続しておりそれと同じリーディングフレーム内にあるＣＤ２２結合ドメインをコードする核酸配列を含む。一態様において、ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号２０３、２０９、２１５、２２１、２２７、２３２、２３８、２４４、２５０、２５６、２６２、２６８、２７４、２８０、２８６、２９２、２９８、３０４、３１０、３１６、３２２、３２８、３３４、３４０、３４６、３５２、３５８、３６４、３７０、３７６、３８２、３８８、３９４、４００、４０６、４１２、４１８、または４２３の１つまたは複数から選択される。一態様において、本発明は、ＣＡＲをコードする核酸分子を含む組換え核酸コンストラクトを包含し、前記核酸分子は、ＣＤ２２結合ドメインをコードする核酸配列を含み、例えば、前記配列は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と連続しておりそれと同じリーディングフレーム内にある。ＣＡＲにおいて使用することができる典型的な細胞内シグナル伝達ドメインとしては、例えば、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、および同種のものの１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合において、ＣＡＲは、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ２８、４－１ＢＢおよび同種のもののあらゆる組合せを含んでいてもよい。
一態様において、本発明のＣＡＲコンストラクトの核酸配列は、配列番号２００、２０８、２１４、２２０、２２６、２３１、２３７、２４３、２４９、２５５、２６１、２６７、２７３、２７９、２８５、２９１、２９７、３０３、３０９、３１５、３２１、３２７、３３３、３３９、３４５、３５１、３５７、３６３、３６９、３７５、３８１、３８７、３９３、３９９、４０５、４１１、４１７、４２２、または４２８の１つまたは複数のＣＡＲコンストラクトを含む。一態様において、本発明のＣＡＲコンストラクトの核酸配列は、配列番号２０４、２１０、２１６、２２２、１１６、２３３、２３９、２４５、２５１、２５７、２６３、２６９、２７５、２８１、２８７、２９３、２９９、３０５、３１１、３１７、３２３、３２９、３３５、３４１、３４７、３５３、３５９、３６５、３７１、３７７、３８３、３８９、３９５、４０１、４０７、４１３、１１７、または４２４の１つまたは複数の、ｓｃＦｖをコードする配列を含む。
いくつかの場合において、抗原結合ドメインにとって、ＣＡＲが最終的に使用されると予想される同じ種由来であることが有益である。例えば、ヒトで使用するためには、ＣＡＲの抗原結合ドメインにとって、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインに関してヒトまたはヒト化残基を含むことが有益であり得る。したがって、一態様において、抗原結合ドメインは、ヒト抗体または抗体フラグメントを含む。一実施形態において、ヒトＣＤ２２結合ドメインは、本明細書で説明されるヒトＣＤ２２結合ドメインの、１つもしくは複数（例えば、３つ全て）の、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）、ならびに／または本明細書で説明されるヒトＣＤ２２結合ドメインの、１つもしくは複数（例えば、３つ全て）の、重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含み、例えば、１つまたは複数、例えば３つ全て、のＬＣ ＣＤＲおよび１つまたは複数、例えば３つ全て、のＨＣ ＣＤＲを含むヒトＣＤ２２結合ドメインを含む。一実施形態において、ヒトＣＤ２２結合ドメインは、本明細書で説明されるヒトＣＤ２２結合ドメインの、１つまたは複数（例えば、３つ全て）の、重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含み、例えば、ヒトＣＤ２２結合ドメインは、本明細書で説明されるＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を各々が含む２つの可変重鎖領域を有する。一実施形態において、ヒトＣＤ２２結合ドメインは、本明細書で（例えば、表６Ａ、６Ｂ、１０Ａもしくは１０Ｂで）説明されるヒト軽鎖可変領域、および／または本明細書で（例えば、表６Ａ、６Ｂ、９Ａもしくは９Ｂで）説明されるヒト重鎖可変領域を含む。一実施形態において、ヒトＣＤ２２結合ドメインは、本明細書で（例えば、表６Ａ、６Ｂ、９Ａもしくは９Ｂで）説明されるヒト重鎖可変領域、例えば、本明細書で（例えば、表６Ａ、８Ｂ、９Ａもしくは９Ｂで）説明される少なくとも２つのヒト重鎖可変領域を含む。一実施形態において、ＣＤ２２結合ドメインは、表６Ａ、６Ｂ、９Ａ、９Ｂ、１０Ａまたは１０Ｂのアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むｓｃＦｖである。ある実施形態において、ＣＤ２２結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、表６Ａ、６Ｂ、１０Ａもしくは１０Ｂにおいて提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列または表６Ａ、６Ｂ、１０Ａもしくは１０Ｂのアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２または３個の改変（例えば、置換）であるが３０、２０または１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／あるいは表６Ａ、６Ｂ、９Ａもしくは９Ｂにおいて提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列または表６Ａ、６Ｂ、９Ａもしくは９Ｂのアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列の、少なくとも１、２または３個の改変（例えば、置換）であるが３０、２０または１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態において、ヒトＣＤ２２結合ドメインは、配列番号２０３、２０９、２１５、２２１、２２７、２３２、２３８、２４４、２５０、２５６、２６２、２６８、２７４、２８０、２８６、２９２、２９８、３０４、３１０、３１６、３２２、３２８、３３４、３４０、３４６、３５２、３５８、３６４、３７０、３７６、３８２、３８８、３９４、４００、４０６、４１２、４１８、または４２３からなる群より選択される配列、またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、ヒトＣＤ２２結合ドメインはｓｃＦｖであり、本明細書で、例えば表６Ａ、６Ｂ、１０Ａまたは１０Ｂで説明されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、リンカー、例えば本明細書で説明されるリンカーを介して、本明細書で、例えば表６Ａ、６Ｂ、９Ａまたは９Ｂで説明されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に付着している。一実施形態において、ヒトＣＤ２２結合ドメインは、（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）ｎリンカーを包含し、ここでｎは、１、２、３、４、５または６、例えば３または４（配列番号５３）である。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、以下の配置：軽鎖可変領域－リンカー－重鎖可変領域または重鎖可変領域－リンカー－軽鎖可変領域のいずれであってもよい。
一態様において、ＣＤ２２結合ドメインは、抗体または抗体フラグメントの特定の機能的な特徴または特性を特徴とする。例えば、一態様において、抗原結合ドメインを含む本発明のＣＡＲ組成物の一部は、ヒトＣＤ２２またはそのフラグメントに特異的に結合する。一態様において、本発明は、抗体または抗体フラグメントを含む抗原結合ドメインであって、抗体結合ドメインがＣＤ２２タンパク質またはそのフラグメントと特異的に結合し、前記抗体または抗体フラグメントが、配列番号７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５、７３６、７３７、または７３８のいずれかのアミノ酸配列を包含する可変重鎖および／または配列番号７３９、７４０、７４１、７４２、７４３、７４４、７４５、７４６、７４７、７４８、７４９、７５０、７５１、７５２、７５３、７５４、７５５、７５６、７５７、７５８、７５９、７６０、７６１、７６２、７６３、７６４、７６５、７６６、７６７、７６８、７６９、７７０、７７１、７７２、７７３、７７４、７７５、７７６、または７７７のいずれかのアミノ酸配列を包含する可変軽鎖を含む、抗原結合ドメインに関する。ある特定の態様において、ｓｃＦｖは、リーダー配列と連続しており同じリーディングフレーム内にある。一態様において、リーダー配列は、配列番号１３として提供されるポリペプチド配列である。
実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２２結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを包含する、抗体または抗体フラグメントを含む。実施形態において、ＣＤ２２結合ドメインは、表８Ａ、８Ｂ、１０Ａまたは１０Ｂに列挙したいずれかのＣＤ２２軽鎖結合ドメインアミノ酸配列の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）の１つまたは複数、ならびに表７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、９Ａまたは９Ｂに列挙したいずれかのＣＤ２２重鎖結合ドメインアミノ酸配列の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）の１つまたは複数を含む。
一態様において、ＣＤ２２結合ドメインは、フラグメント、例えば、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。一態様において、ＣＤ２２結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、または二重機能性（例えば、二重特異的）ハイブリッド抗体［例えば、Lanzavecchia et al., Eur.J. Immunol.17, 105 (1987)］である。一態様において、本発明の抗体およびそれらのフラグメントは、野生型の、または増強された親和性でＣＤ２２タンパク質またはそのフラグメントに結合する。
いくつかの場合において、ヒトｓｃＦｖは、ディスプレイライブラリーに由来し得る。
一実施形態において、突然変異したｓｃＦｖによってＣＡＲＴ２２コンストラクトに安定性の向上が付与されるように、ＣＤ２２Ａ結合ドメイン、例えばｓｃＦｖは、少なくとも１つの突然変異を含む。別の実施形態において、突然変異したｓｃＦｖによってＣＡＲＴ２２コンストラクトに安定性の向上が付与されるように、ＣＤ２２結合ドメイン、例えばｓｃＦｖは、例えばヒト化プロセスから生じる少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の突然変異を含む。
一態様において、本発明は、機能的に同等な分子を生成する開始時の抗体またはフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）のアミノ酸配列の改変を意図している。例えば、ＣＡＲに含まれる、ＣＤ２２結合ドメイン、例えばｓｃＦｖ、のＶＨまたはＶＬは、ＣＤ２２結合ドメイン、例えばｓｃＦｖ、の開始時のＶＨまたはＶＬフレームワーク領域の、少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％，８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性が保持されるように改変してもよい。本発明は、機能的に同等な分子を生成するために、ＣＡＲコンストラクト全体の改変、例えば、ＣＡＲコンストラクトの様々なドメインの１つまたは複数のアミノ酸配列における改変を意図している。ＣＡＲコンストラクトは、開始時のＣＡＲコンストラクトの、少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％，８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性が保持されるように改変してもよい。
ある実施形態において、ＣＤ２２結合ドメインは、ＣＡＲ２２－１、ＣＡＲ２２－２、ＣＡＲ２２－３、ＣＡＲ２２－４、ＣＡＲ２２－５、ＣＡＲ２２－６、ＣＡＲ２２－７、ＣＡＲ２２－８、ＣＡＲ２２－９、ＣＡＲ２２－１０、ＣＡＲ２２－１１、ＣＡＲ２２－１２、ＣＡＲ２２－１３、ＣＡＲ２２－１４、ＣＡＲ２２－１５、またはＣＡＲ２２－１６、ＣＡＲ２２－１７、ＣＡＲ２２－１８、ＣＡＲ２２－１９、ＣＡＲ２２－２０、ＣＡＲ２２－２１、ＣＡＲ２２－２２、ＣＡＲ２２－２３、ＣＡＲ２２－２４、ＣＡＲ２２－２５、ＣＡＲ２２－２６、ＣＡＲ２２－２７、ＣＡＲ２２－２８、ＣＡＲ２２－２９、ＣＡＲ２２－３０、ＣＡＲ２２－３１、ＣＡＲ２２－３２、ＣＡＲ２２－３３、ＣＡＲ２２－３４、ＣＡＲ２２－３５、ＣＡＲ２２－３６、ＣＡＲ２２－３７、またはＣＡＲ２２－３８（例えば、表７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８Ａおよび／もしくは８Ｃに記載のもの）のいずれか１つまたはそれと実質的に同一の配列の、６つのＣＤＲ（例えば、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３の各々１つ）を含む。ある実施形態において、ＣＤ２２結合ドメインは、ＣＡＲ２２－１、ＣＡＲ２２－２、ＣＡＲ２２－３、ＣＡＲ２２－４、ＣＡＲ２２－５、ＣＡＲ２２－６、ＣＡＲ２２－７、ＣＡＲ２２－８、ＣＡＲ２２－９、ＣＡＲ２２－１０、ＣＡＲ２２－１１、ＣＡＲ２２－１２、ＣＡＲ２２－１３、ＣＡＲ２２－１４、ＣＡＲ２２－１５、またはＣＡＲ２２－１６、ＣＡＲ２２－１７、ＣＡＲ２２－１８、ＣＡＲ２２－１９、ＣＡＲ２２－２０、ＣＡＲ２２－２１、ＣＡＲ２２－２２、ＣＡＲ２２－２３、ＣＡＲ２２－２４、ＣＡＲ２２－２５、ＣＡＲ２２－２６、ＣＡＲ２２－２７、ＣＡＲ２２－２８、ＣＡＲ２２－２９、ＣＡＲ２２－３０、ＣＡＲ２２－３１、ＣＡＲ２２－３２、ＣＡＲ２２－３３、ＣＡＲ２２－３４、ＣＡＲ２２－３５、ＣＡＲ２２－３６、ＣＡＲ２２－３７、またはＣＡＲ２２－３８（例えば、表７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８Ａおよび／もしくは８Ｃに記載のもの）のいずれか１つまたはそれと実質的に同一の配列の、３つのＣＤＲ（例えば、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３の各々１つ、またはＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３の各々１つ）を含む。
さらなる実施形態は、このセクションで説明されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する。例えば、さらなる実施形態は、表６Ａ～１０Ｂのいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する。例えば、ヌクレオチド配列は、表６Ａまたは６ＢのＣＡＲコンストラクトまたはｓｃＦｖを含んでいてもよい。ヌクレオチドは、表９Ａもしくは９ＢのＶＨ、表１０Ａもしくは１０ＢのＶＬ、または両方をコードしていてもよい。ヌクレオチドは、表７Ａ、７Ｂもしくは７ＣのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２もしくはＶＨ ＣＤＲ３の１つもしくは複数（例えば、２つもしくは３つ）をコードしていてもよく、および／またはヌクレオチドは、表８Ａもしくは８ＢのＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２もしくはＶＬ ＣＤＲ３の１つもしくは複数（例えば、２つもしくは３つ）をコードしていてもよい。ヌクレオチド配列はまた、配列番号１３、１４、１５、１６、１７および５１のドメインの１つまたは複数、例えば全てを包含し得る。
ＣＤ２２ ＣＡＲはまた、膜貫通ドメイン、例えば本明細書で説明されるような膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば本明細書で説明されるような細胞内シグナル伝達ドメイン、共刺激ドメイン、例えば本明細書で説明されるような共刺激ドメイン、リーダー配列、例えば本明細書で説明されるようなリーダー配列、またはヒンジ、例えば本明細書で説明されるようなヒンジ、の１つまたは複数を含んでいてもよい。
一実施形態において、ＣＤ２２阻害剤は、本明細書で説明されるＣＤ２２阻害剤である。ＣＤ２２阻害剤は、例えば、抗ＣＤ２２抗体（例えば、抗ＣＤ２２単一もしくは二重特異性抗体）、小分子、またはＣＤ２２ ＣＡＲＴであってもよい。一部の実施形態において、抗ＣＤ２２抗体を治療剤とコンジュゲートされるか、または他の形で結合される。典型的な治療剤としては、例えば、微小管破壊剤（例えば、モノメチルオーリスタチンＥ）および毒素（例えば、ジフテリア毒素または緑膿菌外毒素－Ａ、リシン）が挙げられる。ある実施形態において、ＣＤ２２阻害剤は、ＣＤ１９阻害剤、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞、例えば、マウスのものであるか、ヒトのものであるか、またはヒト化されている抗体結合ドメインを含むＣＡＲを発現する細胞と組み合わせて投与される。
一実施形態において、抗ＣＤ２２抗体は、抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性リガンド指向型毒素［例えば、ジフテリア毒素（ＤＴ）、ＤＴ ３９０、例えばＤＴ２２１９ＡＲＬ、の最初の３８９アミノ酸に連結されている、ヒトＣＤ１９およびＣＤ２２を認識する、２つのｓｃＦｖリガンド］；抗ＣＤ２２モノクローナル抗体－ＭＭＡＥコンジュゲート（例えば、ＤＣＤＴ２９８０Ｓ）；緑膿菌外毒素－Ａ（例えば、ＢＬ２２）のフラグメントに融合された抗ＣＤ２２抗体ＲＦＢ４のｓｃＦｖ；脱グリコシル化リシンＡ鎖とコンジュゲートしている抗ＣＤ１９／抗ＣＤ２２（例えば、Ｃｏｍｂｏｔｏｘ）；ヒト化抗ＣＤ２２モノクローナル抗体（例えば、エプラツズマブ）；または緑膿菌外毒素－Ａの３８ＫＤａフラグメントに共有結合で融合している抗ＣＤ２２抗体（例えば、モキセツモマブパスドトクス）のＦｖ部分から選択される。
一実施形態において、抗ＣＤ２２抗体は、抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性リガンド指向型毒素（例えば、ＤＴ２２１９ＡＲＬ）であり、前記抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性リガンド指向型毒素は、約１μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇ、４μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、６μｇ／ｋｇ、７μｇ／ｋｇ、８μｇ／ｋｇ、９μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１１μｇ／ｋｇ、１２μｇ／ｋｇ、１３μｇ／ｋｇ、１４μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、８０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１２０μｇ／ｋｇ、１４０μｇ／ｋｇ、１６０μｇ／ｋｇ、１８０μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２２０μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、４５０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、１ｍｇ．ｋｇ（例えば、３０μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、または８０μｇ／ｋｇ）の用量で、ある期間にわたり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２日またはこれを超える日数ごとに投与される。一部の実施形態において、抗ＣＤ１９／２２二重特異性リガンド指向型毒素は、静脈内注入によって投与される。
一実施形態において、抗ＣＤ２２抗体はＢＬ２２であり、ＢＬ２２は、約１μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇ、４μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、６μｇ／ｋｇ、７μｇ／ｋｇ、８μｇ／ｋｇ、９μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１１μｇ／ｋｇ、１２μｇ／ｋｇ、１３μｇ／ｋｇ、１４μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、８０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１２０μｇ／ｋｇ、１４０μｇ／ｋｇ、１６０μｇ／ｋｇ、１８０μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２２０μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、４５０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、１ｍｇ．ｋｇ（例えば、３μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、または５０μｇ／ｋｇ）の用量で、ある期間にわたり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２日またはそれを超える日数ごとに投与される。一部の実施形態において、ＢＬ２２は、ある期間にわたり、例えば、４日間のサイクル、６日間のサイクル、８日間のサイクル、１０日間のサイクル、１２日間のサイクル、または１４日間のサイクルにわたり、毎日、１日おきに、３日おきに、または４日おきに投与される。一実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはこれを超えるサイクルのＢＬ２２が投与される。一部の実施形態において、ＢＬ２２は、静脈内注入によって投与される。
一部の実施形態において、抗ＣＤ２２抗体は、脱グリコシル化リシンＡ鎖とコンジュゲートしている抗ＣＤ１９／抗ＣＤ２２（例えば、Ｃｏｍｂｏｔｏｘ）であり、前記脱グリコシル化リシンＡ鎖とコンジュゲートしている抗ＣＤ１９／抗ＣＤ２２は、約５００μｇ／ｍ２、６００μｇ／ｍ２、７００μｇ／ｍ２、８００μｇ／ｍ２、９００μｇ／ｍ２、１ｍｇ／ｍ２、２ｍｇ／ｍ２、３ｍｇ／ｍ２、４ｍｇ／ｍ２、５ｍｇ／ｍ２、６ｍｇ／ｍ２、または７ｍｇ／ｍ２の用量で、ある期間にわたり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２日またはこれを超える日数ごとに投与される。一部の実施形態において、脱グリコシル化リシンＡ鎖とコンジュゲートしている抗ＣＤ１９／抗ＣＤ２２は、ある期間にわたり、例えば、４日間のサイクル、６日間のサイクル、８日間のサイクル、１０日間のサイクル、１２日間のサイクル、または１４日間のサイクルにわたり、毎日、１日おきに、３日おきに、または４日おき（例えば、６日間にわたり１日おきに）に投与される。一実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはこれを超えるサイクルの、脱グリコシル化リシンＡ鎖とコンジュゲートしている抗ＣＤ１９／抗ＣＤ２２が投与される。一部の実施形態において、脱グリコシル化リシンＡ鎖とコンジュゲートしている抗ＣＤ１９／抗ＣＤ２２は、静脈内注入によって投与される。
一実施形態において、抗ＣＤ２２抗体は、ヒト化抗Ｃ２２モノクローナル抗体（例えば、エプラツズマブ）であり、前記ヒト化抗ＣＤ２２モノクローナル抗体は、約１０ｍｇ／ｍ２／週、２０ｍｇ／ｍ２／週、５０ｍｇ／ｍ２／週、１００ｍｇ／ｍ２／週、１２０ｍｇ／ｍ２／週、１４０ｍｇ／ｍ２／週、１６０ｍｇ／ｍ２／週、１８０ｍｇ／ｍ２／週、２００ｍｇ／ｍ２／週、２２０ｍｇ／ｍ２／週、２５０ｍｇ／ｍ２／週、２６０ｍｇ／ｍ２／週、２７０ｍｇ／ｍ２／週、２８０ｍｇ／ｍ２／週、２９０ｍｇ／ｍ２／週、３００ｍｇ／ｍ２／週、３０５ｍｇ／ｍ２／週、３１０ｍｇ／ｍ２／週、３２０ｍｇ／ｍ２／週、３２５ｍｇ／ｍ２／週、３３０ｍｇ／ｍ２／週、３３５ｍｇ／ｍ２／週、３４０ｍｇ／ｍ２／週、３４５ｍｇ／ｍ２／週、３５０ｍｇ／ｍ２／週、３５５ｍｇ／ｍ２／週、３６０ｍｇ／ｍ２／週、３６５ｍｇ／ｍ２／週、３７０ｍｇ／ｍ２／週、３７５ｍｇ／ｍ２／週、３８０ｍｇ／ｍ２／週、３８５ｍｇ／ｍ２／週、３９０ｍｇ／ｍ２／週、４００ｍｇ／ｍ２／週、４１０ｍｇ／ｍ２／週、４２０ｍｇ／ｍ２／週、４３０ｍｇ／ｍ２／週、４４０ｍｇ／ｍ２／週、４５０ｍｇ／ｍ２／週、４６０ｍｇ／ｍ２／週、４７０ｍｇ／ｍ２／週、４８０ｍｇ／ｍ２／週、４９０ｍｇ／ｍ２／週、５００ｍｇ／ｍ２／週、６００ｍｇ／ｍ２／週、７００ｍｇ／ｍ２／週、８００ｍｇ／ｍ２／週、９００ｍｇ／ｍ２／週、１ｇ／ｍ２／週、または２ｇ／ｍ２／週（例えば、３６０ｍｇ／ｍ２／週または４８０ｍｇ／ｍ２／週）の用量で、ある期間にわたり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２週またはこれ超える週数ごとに投与される。一部の実施形態において、初回用量は、後続用量より低い（例えば、３６０ｍｇ／ｍ２／週の初回用量、続いて３７０ｍｇ／ｍ２／週の後続用量）。一部の実施形態において、ヒト化抗ＣＤ２２モノクローナル抗体は、静脈内注入によって投与される。
一実施形態において、抗ＣＤ２２抗体はモキセツモマブパスドトクスであり、モキセツモマブパスドトクスは、約１μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇ、４μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、６μｇ／ｋｇ、７μｇ／ｋｇ、８μｇ／ｋｇ、９μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１１μｇ／ｋｇ、１２μｇ／ｋｇ、１３μｇ／ｋｇ、１４μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、８０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１２０μｇ／ｋｇ、１４０μｇ／ｋｇ、１６０μｇ／ｋｇ、１８０μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２２０μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、４５０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ（例えば、５μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、または５０μｇ／ｋｇ）の用量で、ある期間、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２日またはこれを超える日数ごとに投与される。一部の実施形態において、モキセツモマブパスドトクスは、ある期間にわたり、例えば、４日間のサイクル、６日間のサイクル、８日間のサイクル、１０日間のサイクル、１２日間のサイクル、または１４日間のサイクルにわたり、毎日、１日おきに、３日おきに、または４日おき（例えば、６日間にわたり１日おきに）に投与される。一実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはこれを超えるサイクルのモキセツモマブパスドトクスが投与される。一部の実施形態において、モキセツモマブパスドトクスは、静脈内注入によって投与される。
ある実施形態において、ＣＤ２２抗体分子は、ＣＡＲ２２－１、ＣＡＲ２２－２、ＣＡＲ２２－３、ＣＡＲ２２－４、ＣＡＲ２２－５、ＣＡＲ２２－６、ＣＡＲ２２－７、ＣＡＲ２２－８、ＣＡＲ２２－９、ＣＡＲ２２－１０、ＣＡＲ２２－１１、ＣＡＲ２２－１２、ＣＡＲ２２－１３、ＣＡＲ２２－１４、ＣＡＲ２２－１５、またはＣＡＲ２２－１６、ＣＡＲ２２－１７、ＣＡＲ２２－１８、ＣＡＲ２２－１９、ＣＡＲ２２－２０、ＣＡＲ２２－２１、ＣＡＲ２２－２２、ＣＡＲ２２－２３、ＣＡＲ２２－２４、ＣＡＲ２２－２５、ＣＡＲ２２－２６、ＣＡＲ２２－２７、ＣＡＲ２２－２８、ＣＡＲ２２－２９、ＣＡＲ２２－３０、ＣＡＲ２２－３１、ＣＡＲ２２－３２、ＣＡＲ２２－３３、ＣＡＲ２２－３４、ＣＡＲ２２－３５、ＣＡＲ２２－３６、ＣＡＲ２２－３７、またはＣＡＲ２２－３８（例えば、表７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８Ａおよび／もしくは８Ｃに記載のもの）のいずれか１つまたはそれと実質的に同一の配列の、６つのＣＤＲ（例えば、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３の各々１つ）を含む。ある実施形態において、ＣＤ２２抗体分子は、ＣＡＲ２２－１、ＣＡＲ２２－２、ＣＡＲ２２－３、ＣＡＲ２２－４、ＣＡＲ２２－５、ＣＡＲ２２－６、ＣＡＲ２２－７、ＣＡＲ２２－８、ＣＡＲ２２－９、ＣＡＲ２２－１０、ＣＡＲ２２－１１、ＣＡＲ２２－１２、ＣＡＲ２２－１３、ＣＡＲ２２－１４、ＣＡＲ２２－１５、またはＣＡＲ２２－１６、ＣＡＲ２２－１７、ＣＡＲ２２－１８、ＣＡＲ２２－１９、ＣＡＲ２２－２０、ＣＡＲ２２－２１、ＣＡＲ２２－２２、ＣＡＲ２２－２３、ＣＡＲ２２－２４、ＣＡＲ２２－２５、ＣＡＲ２２－２６、ＣＡＲ２２－２７、ＣＡＲ２２－２８、ＣＡＲ２２－２９、ＣＡＲ２２－３０、ＣＡＲ２２－３１、ＣＡＲ２２－３２、ＣＡＲ２２－３３、ＣＡＲ２２－３４、ＣＡＲ２２－３５、ＣＡＲ２２－３６、ＣＡＲ２２－３７、またはＣＡＲ２２－３８（例えば、表７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８Ａおよび／もしくは８Ｃに記載のもの）のいずれか１つまたはそれと実質的に同一の配列の、３つのＣＤＲ（例えば、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３の各々１つ、またはＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３の各々１つ）を含む。ある実施形態において、ＣＤ２２抗体分子は、表６Ａもしくは６Ｂに記載の重鎖可変領域、軽鎖可変領域、もしくは重鎖可変領域と軽鎖可変領域の両方、またはｓｃＦｖ、あるいはそれらと実質的に同一の配列を含む。実施形態において、ＣＤ２２抗体分子は、単離された抗体分子である。
ＲＯＲ１阻害剤
本明細書で使用される場合、用語「ＲＯＲ１」は、白血病前駆細胞上で検出可能であることが公知の抗原決定基を指す。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔおよびＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔなどの公開データベースで見出すことができる。例えば、ヒトＲＯＲ１のアイソフォーム１および２前駆体のアミノ酸配列は、受託番号ＮＰ＿００５００３．２およびＮＰ＿００１０７７０６１．１でそれぞれ見出すことができ、それらをコードするｍＲＮＡ配列は、受託番号ＮＭ＿００５０１２．３およびＮＭ＿００１０８３５９２．１でそれぞれ見出すことができる。本明細書で使用される場合、「ＲＯＲ１」は、完全長野生型ＲＯＲ１の突然変異、例えば点突然変異、フラグメント、挿入、欠失およびスプライス変異体を含むタンパク質を包含する。一態様において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＲＯＲ１タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、それに結合する。一態様において、ＲＯＲ１タンパク質は、がん細胞上で発現される。
ＲＯＲ１阻害剤および併用療法も本明細書において提供される。ＲＯＲ１阻害剤としては、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、および抗ＲＯＲ抗体（例えば、抗ＲＯＲ１単一もしくは二重特異性抗体）もしくはそれらのフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、抗ＲＯＲ１阻害剤は、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、ＣＣＬなどの白血病、マントル細胞リンパ腫などのＢ細胞リンパ腫；ＡＬＬ；小リンパ球性リンパ腫；辺縁細胞Ｂ細胞リンパ腫；およびバーキットリンパ腫）または上皮がん（例えば、乳がん、腎細胞癌、肺がん、結腸直腸がん、卵巣がんおよび黒色腫）を処置するために使用することができる。ある実施形態において、ＣＤ２０阻害剤は、ＣＤ１９阻害剤、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞、例えば、マウスのものであるか、ヒトのものであるか、またはヒト化されている抗体結合ドメインを含むＣＡＲを発現する細胞と組み合わせて投与される。
典型的な抗ＲＯＲ１阻害剤は、参照により本明細書に組み入れられるHudecek, et al.Clin.Cancer Res.19.12(2013):3153-64において説明されている。例えば、抗ＲＯＲ１阻害剤は、Hudecek et al.において説明されている（例えば、参照により本明細書に組み入れられるHudecek et al.の３１５５頁の第一段落全体で説明されているように生成された）抗ＲＯＲ１ ＣＡＲＴを包含する。他の例において、抗ＲＯＲ１阻害剤は、参照により本明細書に組み入れられる、Hudecek et al.の３１５４～５５頁にまたがる段落；Baskar et al.MAbs 4(2012):349-61；およびYang et al.PLoS ONE 6(2011):e21018において説明されている、２Ａ２およびＲ１２抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体のＶＨおよび／またはＶＬ配列を含む抗体またはそのフラグメントを包含する。
他の実施形態において、ＲＯＲ１阻害剤は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１３／０１０１６０７号において説明されているもの、例えば、米国特許出願公開第２０１３／０１０１６０７号の配列番号１または２を包含する、ＲＯＲ１を標的とする抗体またはそのフラグメント［例えば、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）］を包含する。一部の実施形態において、抗ＲＯＲ１抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）は、例えば、ＲＯＲ１発現細胞に応答するように免疫細胞、例えばＴ細胞に指示するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を形成するために、生物学的に活性な分子にコンジュゲートまたは融合される。
一部の実施形態において、典型的なＲＯＲ１阻害剤としては、ＵＣ－９６１（シルムツズマブ）と呼ばれる抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体が挙げられる。例えば、臨床試験識別番号ＮＣＴ０２２２２６８８を参照されたい。シルムツズマブは、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、卵巣がんおよび黒色腫などのがんを処置するために使用することができる。例えば、Hojjat-Farsangi et al.PLoS One.8(4): e61167；およびＮＣＴ０２２２２６８８を参照されたい。
一部の実施形態において、シルムツズマブは、例えば静脈内注入として、静脈内投与される。例えば、各回の注入は、約７００～７０００μｇ（例えば、７００～７５０、７５０～８００、８００～８５０、８５０～９００、９００～９５０、９５０～１０００、１０００～１５００、１５００～２０００、２０００～２５００、２５００～３０００、３０００～３５００、３５００～４０００、４０００～４５００、４５００～５０００、５０００～５５００、５５００～６０００、６０００～６５００、または６５００～７０００μｇ）のシルムツズマブを施す。他の実施形態において、シルムツズマブは、１０～１００μｇ／ｋｇ体重、例えば、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５０～５５、５５～６０、６０～６５、６５～７０、７０～７５、７５～８０、８０～８５、８５～９０、９０～９５、または９５～１００μｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。一実施形態において、シルムツズマブは、１５μｇ／ｋｇ体重の開始用量で投与される。
一部の実施形態において、シルムツズマブは、少なくとも７日間、例えば、７、１４、２１、２８、３５日間、またはこれを超える投与間隔で投与される。例えば、シルムツズマブは、少なくとも１週間、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、２６、２８、２０、２２、２４、２６、２８、３０週間、またはこれを超える投与間隔で投与される。
一部の実施形態において、シルムツズマブは、本明細書で説明される用量および投与間隔で、ある期間、例えば、少なくとも１週間、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、４０、５０、６０週間、もしくはこれを超える期間、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２カ月、もしくはこれを超える期間、または１、２、３、４、５年、もしくはこれを超える期間にわたり投与される。例えば、シルムツズマブは、本明細書で説明される用量および投与間隔で、処置サイクル１つあたり、のべ少なくとも２回の投与（例えば、処置サイクル１つあたり、少なくとも、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０回、またはこれを超える投与）にわたり投与される。
一部の実施形態において、抗ＲＯＲ１抗体は、治療剤とコンジュゲートされるか、または他の形で結合される。
一部の実施形態において、ＲＯＲ１阻害剤は、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲコンストラクトを発現する、またはｓｃＦｖ、ＣＤＲもしくはＶＨおよびＶＬ鎖を含むＲＯＲ１結合ＣＡＲによってコードされている、細胞を包含する。例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴは、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞と組み合わせて投与するために、ＲＯＲ１－ＣＡＲ（ＲＯＲ１結合ドメインを含む）を細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）に遺伝子操作することによって生成される。本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞の養子療法のための使用方法も本明細書において提供される。
別の態様において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞とＲＯＲ１ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む、ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞、の集団が本明細書において提供される。例えば、一実施形態において、ＣＡＲＴ細胞の集団は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する第一の細胞、およびＲＯＲ１ ＣＡＲを発現する第二の細胞を包含し得る。
ＣＤ１２３阻害剤
ＣＤ１２３阻害剤は、インターロイキン－３受容体のアルファ鎖（ＩＬ－３ＲＡ）とも呼ばれる。ＩＬ－３受容体（ＩＬ－３Ｒ）は、アルファおよびベータ鎖で構成されているヘテロ二量体である。ＩＬ－３Ｒは、膜受容体である。ＩＬ－３Ｒα鎖は、３６０アミノ酸残基の糖タンパク質である。一部の白血病性障害ではＣＤ１２３の異常が観察されることが多い。ＣＤ１２３は、多発性血液悪性疾患、例えば、急性骨髄性およびＢリンパ性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞の新生物（ＢＰＤＣＮ）およびヘアリーセル白血病において過剰発現される。
本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ１２３」は、一部の悪性血液がん細胞、例えば白血病細胞上で検出可能であることが公知の抗原決定基を指す。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔおよびＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔなどの公開データベースで見出すことができる。例えば、ヒトＣＤ１２３のアミノ酸配列は、受託番号ＮＰ＿００２１７４．１（アイソフォーム１前駆体）、ＮＰ＿００１２５４６４２．１（アイソフォーム２前駆体）で見出すことができ、それらをコードするｍＲＮＡ配列は、受託番号ＮＭ＿００２１８３．３（変異体１）、ＮＭ＿００１２６７７１３．１（変異体２）で見出すことができる。本明細書で使用される場合、「ＣＤ１２３」は、完全長野生型ＣＤ１２３の突然変異、例えば点突然変異、フラグメント、挿入、欠失およびスプライス変異体を含むタンパク質を包含する。一態様において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＣＤ１２３タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、それに結合する。一態様において、ＣＤ１２３タンパク質は、がん細胞上で発現される。
ＣＤ１２３阻害剤および併用療法が本明細書において提供される。ＣＤ１２３阻害剤としては、小分子、組換えタンパク質、抗ＣＤ１２３ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、および抗ＣＤ１２３抗体（例えば、抗ＣＤ１２３単一または二重特異性抗体）およびこれらのフラグメントが挙げられるが、それらに限定されない。一部の実施形態において、抗ＣＤ１２３阻害剤は、本明細書で説明されるＢ細胞悪性腫瘍を処置するために使用することができる。ある実施形態において、ＣＤ１２３阻害剤は、ＣＤ１９阻害剤、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞、例えば、マウスのものであるか、ヒトのものであるか、またはヒト化されている抗体結合ドメインを含むＣＡＲを発現する細胞と組み合わせて投与される。
一実施形態において、ＣＤ１２３阻害剤は、例えばＣＤ１２３受容体の天然リガンド（またはフラグメント）を含む、組換えタンパク質である。例えば、組換えタンパク質は、トランケートされたジフテリア毒素に融合しているヒトＩＬ－３を含む融合タンパク質であるＳＬ－４０１（ＤＴ３８８ＩＬ３とも呼ばれる；テキサス大学サウスウエスタンメディカルセンター）である。例えば、Testa et al.Biomark Res.2014；2：4；および臨床試験識別番号ＮＣＴ００３９７５７９を参照されたい。
別の実施形態において、ＣＤ１２３阻害剤は、抗ＣＤ１２３抗体またはそのフラグメントである。一実施形態において、抗ＣＤ１２３抗体またはそのフラグメントは、モノクローナル抗体、例えば、単一特異性もしくは二重特異性抗体またはそのフラグメントを含む。例えば、抗ＣＤ１２３抗体またはそのフラグメントは、ＣＳＬ３６０（ＣＳＬ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を含む。ＣＳＬ３６０は、ＣＤ１２３と結合する組換えキメラモノクローナル抗体である。一部の実施形態において、ＣＳＬ３６０は、例えば静脈内注入によって、静脈内投与される。例えば、ＣＳＬ３６０は、０．１～１０ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．１～０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５～１ｍｇ／ｋｇ、１～５ｍｇ／ｋｇ、または５～１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。例えば、臨床試験識別番号ＮＣＴ０１６３２８５２；およびTesta et al.を参照されたい。
別の実施形態において、ＣＤ１２３抗体またはそのフラグメントは、ＣＳＬ ３６２（ＣＳＬ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を含む。ＣＳＬ３６２は、ＣＤ１２３を標的とするヒト化モノクローナル抗体であり、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の活性化を増強するように最適化されている。一部の実施形態において、ＣＳＬ３６２は、例えば静脈内注入によって、静脈内投与される。一部の例において、ＣＳＬ３６２は、０．１～１２ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．１～０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２～０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５～１ｍｇ／ｋｇ、１～６ｍｇ／ｋｇ、または６～１２ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。例えば、臨床試験識別番号ＮＣＴ０１６３２８５２を参照されたい。
一実施形態において、ＣＤ１２３抗体またはそのフラグメントは、二重特異性抗体、例えばＭＧＤ００６（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）を含む。ＭＧＤ００６は、ＣＤ１２３およびＣＤ３を標的とする二重特異性抗体である。例えば、臨床試験識別番号ＮＣＴ０２１５２９５６を参照されたい。
一部の実施形態において、ＣＤ１２３阻害剤は治療剤とコンジュゲートされるか、または他の形で結合される。
一部の実施形態において、ＣＤ１２３阻害剤は、抗ＣＤ１２３ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、例えば、抗ＣＤ１２３ ＣＡＲコンストラクトを発現する、またはｓｃＦｖ、ＣＤＲもしくはＶＨおよびＶＬ鎖を含むＣＤ１２３結合ＣＡＲによってコードされている、細胞を包含する。例えば、抗ＣＤ１２３ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴは、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞と組み合わせて投与するために、ＣＤ１２３－ＣＡＲ（ＣＤ１２３結合ドメインを含む）を細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）に遺伝子操作することによって生成される。ある実施形態において、抗ＣＤ１２３ ＣＡＲコンストラクトは、ｓｃＦｖ配列、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１４／０３２２２１２号Ａ１において提供されているｓｃＦｖ配列を含む。一実施形態において、抗ＣＤ１２３結合ドメインは、米国特許出願公開第２０１４／０３２２２１２号Ａ１において説明されているｓｃＦｖである。ある実施形態において、抗ＣＤ１２３結合ドメインは、米国特許出願公開第２０１４／０３２２２１２号Ａ１において提供されているＣＡＲコンストラクトの一部である。本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞の養子療法のための使用方法も本明細書において提供される。
別の態様において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞とＣＤ１２３ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞、の集団が本明細書において提供される。例えば、一実施形態において、ＣＡＲＴ細胞の集団は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する第一の細胞、およびＣＤ１２３ ＣＡＲを発現する第二の細胞を包含し得る。
ＣＤ１０阻害剤
表面抗原分類１０（ＣＤ１０）は、ネプリライシン、膜メタロエンドペプチダーゼ（ＭＭＥ）、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）、および急性リンパ芽球性白血病共通抗原（ＣＡＬＬＡ）とも呼ばれる。ＣＤ１０は、膜メタロエンドペプチダーゼ（ＭＭＥ）遺伝子によってコードされる酵素である。ＣＤ１０は、プレＢ表現型の白血病細胞上で発現され、急性リンパ球性白血病共通抗原である。
本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ１０」は、白血病細胞上で検出可能であることが公知の抗原決定基を指す。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔおよびＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔなどの公開データベースで見出すことができる。例えば、ヒトＣＤ１０のアミノ酸配列は、受託番号ＮＰ＿００９２１８．２、ＮＰ＿０００８９３．２、ＮＰ＿００９２１９．２、ＮＰ＿００９２２０．２で見出すことができ、それらをコードするｍＲＮＡ配列は、受託番号ＮＭ＿００７２８７．２（異性体１ｂｉｓ）、ＮＭ＿０００９０２．３（異性体１）、ＮＭ＿００７２８８．２（異性体２ａ）、ＮＭ＿００７２８９．２（異性体２ｂ）で見出すことができる。本明細書で使用される場合、「ＣＤ１０」は、完全長野生型ＣＤ１０の突然変異、例えば点突然変異、フラグメント、挿入、欠失およびスプライス変異体を含むタンパク質を包含する。一態様において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＣＤ１０タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、それに結合する。一態様において、ＣＤ１０タンパク質は、がん細胞上で発現される。
ＣＤ１０阻害剤および併用療法も本明細書において提供される。ＣＤ１０阻害剤としては、小分子、組換えタンパク質、抗ＣＤ１０ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、および抗ＣＤ１０抗体（例えば、抗ＣＤ１０単一または二重特異性抗体）およびそれらのフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、抗ＣＤ１０阻害剤は、本明細書で説明されるＢ細胞悪性腫瘍を処置するために使用することができる。ある実施形態において、ＣＤ１０阻害剤は、ＣＤ１９阻害剤、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞、例えば、マウスのものであるか、ヒトのものであるか、またはヒト化されている抗体結合ドメインを含むＣＡＲを発現する細胞と組み合わせて投与される。
ある実施形態において、ＣＤ１０阻害剤は、サクビトリル（ＡＨＵ－３７７；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）｛４－｛［（２Ｓ，４Ｒ）－１－（４－ビフェニリル）－５－エトキシ－４－メチル－５－オキソ－２－ペンタニル］アミノ｝－４－オキソブタン酸｝、またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体を含む。サクビトリルの構造を下記に示す。
Figure 0007227331000001
別の実施形態において、ＣＤ１０阻害剤は、バルサルタン／サクビトリル（ＬＣＺ６９６；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体を含む。バルサルタン／サクビトリルは、バルサルタンとサクビトリルの１：１混合物を含む複合薬である。バルサルタン｛（Ｓ）－３－メチル－２－（Ｎ－｛［２’－（２Ｈ－１，２，３，４－テトラゾール－５－イル）ビフェニル－４－イル］メチル｝ペンタンアミド）ブタン酸｝の構造を下記に示す。
Figure 0007227331000002
ある実施形態において、ＣＤ１０阻害剤は、オマパトリラート（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）｛（４Ｓ，７Ｓ，１０ａＳ）－５－オキソ－４－｛［（２Ｓ）－３－フェニル－２－スルファニルプロパノイル］アミノ｝－２，３，４，７，８，９，１０，１０ａ－オクタヒドロピリド［６，１－ｂ］［１，３］チアゼピン－７－カルボン酸｝、またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体を含む。オマパトリラートの構造を下記に示す。
Figure 0007227331000003
ある実施形態において、ＣＤ１０阻害剤は、ＲＢ－１０１｛ベンジルＮ－（３－｛［（２Ｓ）－２－アミノ－４－（メチルチオ）ブチル］ジチオ｝－２－ベンジルプロパノイル）－Ｌ－フェニルアラニネート｝、またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体を含む。ＲＢ－１０１の構造を下記に示す。
Figure 0007227331000004
ある実施形態において、ＣＤ１０阻害剤は、ＵＫ－４１４，４９５（Ｐｆｉｚｅｒ）｛（Ｒ）－２－（｛１－［（５－エチル－１，３，４－チアジアゾール－２－イル）カルバモイル］シクロペンチル｝メチル）吉草酸｝、またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体を含む。ＵＫ－４１４，４９５の構造を下記に示す。
Figure 0007227331000005
一部の実施形態において、ＣＤ１０阻害剤は、治療剤とコンジュゲートされるか、または他の形で結合される。
一部の実施形態において、ＣＤ１０阻害剤は、抗ＣＤ１０ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、例えば、抗ＣＤ１０ ＣＡＲコンストラクトを発現する、またはｓｃＦｖ、ＣＤＲもしくはＶＨおよびＶＬ鎖を含むＣＤ１０結合ＣＡＲによってコードされている、細胞を包含する。例えば、抗ＣＤ１０ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴは、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞と組み合わせて投与するために、ＣＤ１０－ＣＡＲ（ＣＤ１０結合ドメインを含む）を細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）に遺伝子操作することによって生成される。本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞の養子療法のための使用方法も本明細書において提供される。
別の態様において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞とＣＤ１０ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞、の集団が本明細書において提供される。例えば、一実施形態において、ＣＡＲＴ細胞の集団は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する第一の細胞、およびＣＤ１０ ＣＡＲを発現する第二の細胞を包含し得る。
ＣＤ３４阻害剤
表面抗原分類３４（ＣＤ３４）は、造血前駆細胞抗原ＣＤ３４とも呼ばれ、細胞間接着因子として機能する細胞表面糖タンパク質である。ＣＤ３４は、一部のがん／腫瘍、例えば、肺胞軟部肉腫、プレＢ－ＡＬＬ、ＡＭＬ、ＡＭＬ－Ｍ７、隆起性皮膚線維肉腫、消化管間質腫瘍、巨細胞線維芽腫、顆粒球性肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、髄膜（mengingeal）血管周皮腫、髄膜腫、神経線維腫、シュワン腫、および甲状腺乳頭癌上で発現されることがある。
本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ３４」は、造血幹細胞および一部のがん細胞上で検出可能であることが公知の抗原決定基を指す。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔおよびＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔなどの公開データベースで見出すことができる。例えば、ヒトＣＤ３４のアミノ酸配列は、受託番号ＮＰ＿００１０２０２８０．１（アイソフォームａ前駆体）、ＮＰ＿００１７６４．１（アイソフォームｂ前駆体）で見出すことができ、それらをコードするｍＲＮＡ配列は、受託番号ＮＭ＿００１０２５１０９．１（変異体１）、ＮＭ＿００１７７３．２（変異体２）で見出すことができる。本明細書で使用される場合、「ＣＤ３４」は、完全長野生型ＣＤ３４の突然変異、例えば点突然変異、フラグメント、挿入、欠失およびスプライス変異体を含むタンパク質を包含する。一態様において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＣＤ３４タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、それに結合する。一態様において、ＣＤ３４タンパク質は、がん細胞上で発現される。
ＣＤ３４阻害剤および併用療法も本明細書において提供される。ＣＤ３４阻害剤としては、小分子、組換えタンパク質、抗ＣＤ３４ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、および抗ＣＤ３４抗体（例えば、抗ＣＤ３４単一または二重特異性抗体）およびこれらのフラグメントが挙げられるが、それらに限定されない。一部の実施形態において、抗ＣＤ３４阻害剤は、本明細書で説明されるＢ細胞悪性腫瘍を処置するために使用することができる。ある実施形態において、ＣＤ３４阻害剤は、ＣＤ１９阻害剤、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞、例えば、マウスのものであるか、ヒトのものであるか、またはヒト化されている抗体結合ドメインを含むＣＡＲを発現する細胞と組み合わせて投与される。
ある実施形態において、ＣＤ３４阻害剤は、抗体またはそのフラグメント、例えば、Mercadal et al.Biochim.Biophys.Acta.1371.1(1998):17-23において説明されているような、Ｍｙ－１０モノクローナル抗体またはＭｙ－１０モノクローナル抗体を含むイムノリポソームを含む。他の実施形態において、ＣＤ３４阻害剤は、Carrion et al.Life Sci.75.3(2004):313-28において説明されているような、ＣＤ３４発現細胞を標的とするがんの薬、例えばドキソルビシン、を含有するイムノリポソームを含む。ある実施形態において、ＣＤ３４阻害剤は、Maleki et al.Hum.Antibodies.22(2013):1-8において説明されているような、ＣＤ３４に対するモノクローナル抗体を含む。別の実施形態において、ＣＤ３４阻害剤は、Maleki et al.Cell J. 16.3(2014):361-66において説明されているような、ＣＤ３４を標的とするモノクローナル抗体を含む。
一部の実施形態において、ＣＤ３４阻害剤は、治療剤とコンジュゲートされるか、または他の形で結合される。
一部の実施形態において、ＣＤ３４阻害剤は、抗ＣＤ３４ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、例えば、抗ＣＤ３４ ＣＡＲコンストラクトを発現する、またはｓｃＦｖ、ＣＤＲもしくはＶＨおよびＶＬ鎖を含むＣＤ３４結合ＣＡＲによってコードされている、細胞を包含する。例えば、抗ＣＤ３４ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴは、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞と組み合わせて投与するために、ＣＤ３４－ＣＡＲ（ＣＤ３４結合ドメインを含む）を細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）に遺伝子操作することによって生成される。本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞の養子療法のための使用方法も本明細書において提供される。
別の態様において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞とＣＤ３４ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞、の集団が本明細書において提供される。例えば、一実施形態において、ＣＡＲＴ細胞の集団は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する第一の細胞、およびＣＤ３４ ＣＡＲを発現する第二の細胞を包含し得る。
ＦＬＴ－３阻害剤
Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３）は、表面抗原分類抗原１３５（ＣＤ１３５）、受容体型チロシンプロテインキナーゼＦＬＴ３、または胎児肝キナーゼ－２（Ｆｌｋ２）とも呼ばれ、受容体チロシンキナーゼである。ＦＬＴ－３は、そのリガンドであるサイトカインＦｌｔ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）のサイトカイン受容体である。ＦＬＴ－３は、多くの造血前駆細胞の表面で発現され、リンパ球発生にとって重要である。ＦＬＴ３遺伝子は、白血病、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）では一般に突然変異している。
本明細書で使用される場合、用語「ＦＬＴ－３」は、造血前駆細胞および一部のがん細胞、例えば白血病細胞上で検出可能であることが公知の抗原決定基を指す。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔおよびＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔなどの公開データベースで見出すことができる。例えば、ヒトＦＬＴ－３のアミノ酸配列は、受託番号ＮＰ＿００４１１０．２で見出すことができ、それらをコードするｍＲＮＡ配列は、受託番号ＮＭ＿００４１１９．２で見出すことができる。本明細書で使用される場合、「ＦＬＴ－３」は、完全長野生型ＦＬＴ－３の突然変異、例えば点突然変異、フラグメント、挿入、欠失およびスプライス変異体を含むタンパク質を包含する。一態様において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＦＬＴ－３タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、それに結合する。一態様において、ＦＬＴ－３タンパク質は、がん細胞上で発現される。
ＦＬＴ－３阻害剤および併用療法も本明細書において提供される。ＦＬＴ－３阻害剤としては、小分子、組換えタンパク質、抗ＦＬＴ－３ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、および抗ＦＬＴ－３抗体（例えば、抗ＦＬＴ－３単一または二重特異性抗体）およびそれらのフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、抗ＦＬＴ－３阻害剤は、本明細書で説明されるＢ細胞悪性腫瘍を処置するために使用することができる。ある実施形態において、ＦＬＴ－３阻害剤は、ＣＤ１９阻害剤、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞、例えば、マウスのものであるか、ヒトのものであるか、またはヒト化されている抗体結合ドメインを含むＣＡＲを発現する細胞と組み合わせて投与される。
一部の実施形態において、ＦＬＴ－３阻害剤は、キザルチニブ（ＡＣ２２０；Ａｍｂｉｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体を含む。キザルチニブは、小分子受容体チロシンキナーゼ阻害剤である。キザルチニブ｛１－（５－（ｔｅｒｔ－ブチル）イソオキサゾール－３－イル）－３－（４－（７－（２－モルホリノエトキシ）ベンゾ［ｄ］イミダゾ［２，１－ｂ］チアゾール－２－イル）フェニル）尿素｝の構造を下記に示す。
Figure 0007227331000006
一部の実施形態において、ＦＬＴ－３阻害剤は、ミドスタウリン（ＰＫＣ４１２；Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｄｒｅｓｄｅｎ）またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体を含む。ミドスタウリンは、細菌ストレプトマイセス・スタウロスポレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｅｕｓ）からのアルカロイドであるスタウロスポリンの半合成誘導体である、プロテインキナーゼ阻害剤である。
ミドスタウリン｛（９Ｓ，１０Ｒ，１１Ｒ，１３Ｒ）－２，３，１０，１１，１２，１３－ヘキサヒドロ－１０－メトキシ－９－メチル－１１－（メチルアミノ）－９，１３－エポキシ－１Ｈ，９Ｈ－ジインドロ［１，２，３－ｇｈ：３’，２’，１’－ｌｍ］ピロロ［３，４－ｊ］［１，７］ベンゾジアゾニン（ｂｅｎｚｏｄｉａｍｚｏｎｉｎｅ）－１－オン｝の構造を下記に示す。
Figure 0007227331000007
一部の実施形態において、ミドスタウリンは、例えば約２５～２００ｍｇ、例えば、約２５～５０ｍｇ、５０～１００ｍｇ、１００～１５０ｍｇ、または１５０～２００ｍｇの用量で、経口投与される。例えば、ミドスタウリンは、例えば、１日２回、約２５～２００ｍｇ、例えば、１日２回、約２５～５０ｍｇ、５０～１００ｍｇ、１００～１５０ｍｇ、または１５０～２００ｍｇの用量で、例えば経口で投与される。例えば、臨床試験識別番号ＮＣＴ０１８３０３６１を参照されたい。
ある実施形態において、ＦＬＴ－３阻害剤は、ソラフェニブ（ＢａｙｅｒおよびＯｎｙｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体を含む。ソラフェニブは、複数のチロシンプロテインキナーゼ（例えば、ＶＥＧＦＲおよびＰＤＧＦＲ）、Ｒａｆキナーゼ（例えば、Ｃ－ＲａｆおよびＢ－Ｒａｆ）、およびいくつかの細胞内セリン／スレオニンキナーゼ（例えば、Ｃ－Ｒａｆ、野生型Ｂ－Ｒａｆ、および突然変異Ｂ－Ｒａｆ）の小分子阻害剤である。例えば、labeling.bayerhealthcare.com/html/products/pi/ Nexavar_PI.pdfを参照されたい。ソラフェニブ｛４－［４－［［４－クロロ－３－（トリフルオロメチル）フェニル］カルバモイルアミノ］フェノキシ］－Ｎ－メチル－ピリジン－２－カルボキサミド｝の構造を下記に示す。
Figure 0007227331000008
一部の実施形態において、ＦＬＴ－３阻害剤は、スニチニブ（旧称ＳＵ１１２４８；Ｐｆｉｚｅｒ）またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体を含む。スニチニブは、ＦＬＴ３を包含する複数の受容体チロシンキナーゼを阻害する、小分子経口薬である。スニチニブは、腎細胞癌（ＲＣＣ）およびイマチニブ耐性消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）の処置用に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されている。スニチニブ｛Ｎ－（２－ジエチルアミノエチル）－５－［（Ｚ）－（５－フルオロ－２－オキソ－１Ｈ－インドール－３－イリデン）メチル］－２，４－ジメチル－１Ｈ－ピロール－３－カルボキサミド｝の構造を下記に示す。
Figure 0007227331000009
一部の実施形態において、ＦＬＴ－３阻害剤は、レスタウルチニブ（ＣＥＰ－７０１；Ｃｅｐｈａｌｏｎ）またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体を含む。レスタウルチニブは、スタウロスポリンに構造的に関連しているチロシンキナーゼ阻害剤である。レスタウルチニブ｛（９Ｓ，１０Ｓ，１２Ｒ）－２，３，９，１０，１１，１２－ヘキサヒドロ－１０－ヒドロキシ－１０－（ヒドロキシメチル）－９－メチル－９，１２－エポキシ－１Ｈ－ジインドロ［１，２，３－ｆｇ：３’，２’，１’－ｋｌ］ピロロ［３，４－ｉ］［１，６］ベンゾジアゾシン－１－オン｝の構造を下記に示す。
Figure 0007227331000010
一部の実施形態において、レスタウルチニブは、例えば、１日２回、約４０～１００ｍｇ、例えば、１日２回、約４０～６０ｍｇ、５０～７０ｍｇ、６０～８０ｍｇ、７０～９０ｍｇ、または８０～１００ｍｇの用量で、経口投与される。例えば、臨床試験識別番号ＮＣＴ０００７９４８２、またはＮＣＴ０００３０１８６を参照されたい。
一部の実施形態において、ＦＬＴ－３阻害剤は、治療剤とコンジュゲートされるか、または他の形で結合される。
一部の実施形態において、ＦＬＴ－３阻害剤は、抗ＦＬＴ－３ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、例えば、抗ＦＬＴ－３ ＣＡＲコンストラクトを発現する、またはｓｃＦｖ、ＣＤＲもしくはＶＨおよびＶＬ鎖を含むＦＬＴ－３結合ＣＡＲによってコードされている、細胞を包含する。例えば、抗ＦＬＴ－３ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴは、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞と組み合わせて投与するために、ＦＬＴ－３－ＣＡＲ（ＦＬＴ－３結合ドメインを含む）を細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）に遺伝子操作することによって生成される。本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞の養子療法のための使用方法も本明細書において提供される。
別の態様において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞とＦＬＴ－３ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞、の集団が本明細書において提供される。例えば、一実施形態において、ＣＡＲＴ細胞の集団は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する第一の細胞、およびＦＬＴ－３ ＣＡＲを発現する第二の細胞を包含し得る。
一実施形態において、抗原結合ドメインＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１０、ＣＤ３４、またはＦＬＴ－３抗原結合ドメイン）は、ｓｃＦｖタンパク質、例えばヒトｓｃＦｖ部分を含む。ｓｃＦｖの前に、配列番号１３で提供されるもののような任意のリーダー配列、それに続いて、配列番号１４または配列番号４５または配列番号４７または配列番号４９で提供されるもののような任意のヒンジ配列、配列番号１５で提供されるもののような膜貫通領域、配列番号１６または配列番号５１を包含する細胞内シグナル伝達ドメイン、および配列番号１７または配列番号４３を包含するＣＤ３ゼータ配列が存在していてもよく、例えば、これらのドメインは連続しており同じリーディングフレーム内にあり、単一の融合タンパク質を形成する。
一部の態様において、本開示は、ＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ＣＤ２０ ＣＡＲ、ＣＤ２２ ＣＡＲ、ＣＤ１２３ ＣＡＲ、ＣＤ１０ ＣＡＲ、ＣＤ３４ ＣＡＲ、またはＦＬＴ－３ ＣＡＲ）をコードする核酸分子を含む組換え核酸コンストラクトを包含し、前記核酸分子は、例えば本明細書で説明される、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と連続しておりそれと同じリーディングフレーム内にある、抗原結合ドメインをコードする核酸配列を含む。ＣＡＲにおいて使用することができる典型的な細胞内シグナル伝達ドメインとしては、例えば、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、および同種のものの１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合において、ＣＡＲは、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ２８、４－１ＢＢおよび同種のもののあらゆる組合せを含んでいてもよい。
一実施形態において、抗原結合ドメイン（例えば、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１０、ＣＤ３４またはＦＬＴ－３抗原結合ドメイン）は、抗体または抗体フラグメントの特定の機能的特徴または特性を特徴とする。例えば、一実施形態において、抗原結合ドメインを含む本発明のＣＡＲ組成物の一部は、ヒトＢ細胞抗原（例えば、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１０、ＣＤ３４、もしくはＦＬＴ－３）またはそのフラグメントに特異的に結合する。ある特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、リーダー配列と連続しており同じリーディングフレーム内にある。一態様において、リーダー配列は、配列番号１３として提供されるポリペプチド配列である。
一実施形態において、抗原結合ドメインは、フラグメント、例えば、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。一実施形態において、抗原結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、または二重機能性（例えば、二重特異的）ハイブリッド抗体［例えば、Lanzavecchia et al., Eur.J. Immunol.17, 105 (1987)］である。一態様において、本発明の抗体およびそれらのフラグメントは、野生型の、または増強された親和性でＢ細胞タンパク質またはそのフラグメントに結合する。いくつかの場合において、ヒトｓｃＦｖは、ディスプレイライブラリーに由来し得る。
一実施形態において、突然変異したｓｃＦｖによってＣＡＲコンストラクトに安定性の向上が付与されるように、抗原結合ドメイン、例えばｓｃＦｖは、少なくとも１つの突然変異を含む。別の実施形態において、突然変異したｓｃＦｖによってＣＡＲコンストラクトに安定性の向上が付与されるように、抗原結合ドメイン、例えばｓｃＦｖは、例えばヒト化プロセスから生じる、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の突然変異を含む。
一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを包含するＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ＣＤ２０ ＣＡＲ、ＣＤ２２ ＣＡＲ、ＣＤ１２３ ＣＡＲ、ＣＤ１０ ＣＡＲ、ＣＤ３４ ＣＡＲ、またはＦＬＴ－３ ＣＡＲ）を発現する第一の細胞、および二次シグナル伝達ドメインを包含するＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ＣＤ２０ ＣＡＲ、ＣＤ２２ ＣＡＲ、ＣＤ１２３ ＣＡＲ、ＣＤ１０ ＣＡＲ、ＣＤ３４ ＣＡＲ、またはＦＬＴ－３ ＣＡＲ）を発現する第二の細胞を包含する。
ＣＤ７９ｂ阻害剤
本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ７９ｂ」は、一部の悪性血液がん細胞、例えば白血病細胞上で検出可能であることが公知の抗原決定基を指す。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔおよびＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔなどの公開データベースで見出すことができる。例えば、ヒトＣＤ７９ｂのアミノ酸配列は、受託番号ＮＰ＿０００６１７．１（アイソフォーム１前駆体）、ＮＰ＿０６７６１３．１（アイソフォーム２前駆体）、またはＮＰ＿００１０３５０２２．１（アイソフォーム３前駆体）で見出すことができ、それらをコードするｍＲＮＡ配列は、受託番号ＮＭ＿０００６２６．２（転写変異体１）、ＮＭ＿０２１６０２．２（転写変異体２）、またはＮＭ＿００１０３９９３３．１（転写変異体３）で見出すことができる。本明細書で使用される場合、「ＣＤ７９ｂ」は、完全長野生型ＣＤ７９ｂの突然変異、例えば点突然変異、フラグメント、挿入、欠失およびスプライス変異体を含むタンパク質を包含する。一態様において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＣＤ７９ｂタンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、それに結合する。一態様において、ＣＤ７９ｂタンパク質は、がん細胞上で発現される。実施形態において、ＣＤ７９ｂタンパク質は、野生型ＣＤ７９ｂタンパク質であり、他の実施形態において、ＣＤ７９ｂタンパク質は、突然変異ＣＤ７９ｂタンパク質である。
ＣＤ７９ｂは、免疫グロブリン関連ベータとも呼ばれ、これはＢリンパ球抗原受容体多量体複合体の構成要素である。ＣＤ７９ｂは、ＣＤ７９ａ（免疫グロブリン関連アルファ）と呼ばれる別のアクセサリータンパク質を有するヘテロ二量体を形成し、このヘテロ二量体は、Ｂ細胞上の表面免疫グロブリンと複合体化する。ＣＤ７９ｂは、Ｂリンパ球抗原受容体のアセンブリーおよび表面発現にとって重要である。ＣＤ７９ｂおよびＣＤ７９ａは、前駆Ｂ細胞およびＢ細胞発生にとって重要である。突然変異および異常なＣＤ７９発現が多くのＢ－ＣＬＬ細胞において起こり、そのような発現は、Ｂ－ＣＬＬにおけるＢリンパ球抗原受容体の表面発現の減少および／または不完全なシグナル伝達と相関関係がある可能性がある。例えば、Thompson et al.Blood 90.4(1997):1387-94を参照されたい。一部の症例において、ＣＤ７９ｂの突然変異形またはスプライス変異体の過剰発現は、Ｂ－ＣＬＬおよび他のリンパ系悪性腫瘍においてＢリンパ球抗原受容体減少との相互関係が証明されている。例えば、Cragg et al.Blood 100.9(2002):3068-76を参照されたい。
ＣＤ７９ｂ阻害剤および併用療法が本明細書において提供される。ＣＤ７９ｂ阻害剤としては、小分子、組換えタンパク質、抗ＣＤ７９ｂ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、および抗ＣＤ７９ｂ抗体（例えば、抗ＣＤ７９ｂ単一または二重特異性抗体）およびそれらのフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、抗ＣＤ７９ｂ阻害剤は、本明細書で説明されるＢ細胞悪性腫瘍を処置するために使用することができる。ある実施形態において、ＣＤ７９ｂ阻害剤は、ＣＤ１９阻害剤、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞、例えば、マウスのものであるか、ヒトのものであるか、またはヒト化されている抗体結合ドメインを含むＣＡＲを発現する細胞と組み合わせて投与される。
ある実施形態において、ＣＤ７９ｂ阻害剤は、抗ＣＤ７９ｂ抗体またはそのフラグメントである。一実施形態において、抗７９ｂ抗体またはそのフラグメントは、モノクローナル抗体、例えば、単一特異性もしくは二重特異性抗体またはそのフラグメントを含む。例えば、抗ＣＤ７９ｂ抗体またはそのフラグメントは、ポラツズマブベドチン（Ｒｏｃｈｅ）などの抗ＣＤ７９ｂ抗体薬物コンジュゲートを含む。実施形態において、ポラツズマブベドチンは、がん、例えばＮＨＬ、例えば、濾胞性リンパ腫またはＤＬＢＣＬ、例えば、再発性または難治性濾胞性リンパ腫またはＤＬＢＣＬを処置するために使用される。例えば、ＮＣＴ０２２５７５６７を参照されたい。実施形態において、抗ＣＤ７９ｂ抗体またはそのフラグメントは、ＭＧＤ０１０（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）などの、ＣＤ３２ＢおよびＣＤ７９Ｂと結合する構成要素を含む二重特異性抗体である。例えば、ＮＣＴ０２３７６０３６を参照されたい。
一部の実施形態において、ＣＤ７９ｂ阻害剤は、治療剤とコンジュゲートされるか、または他の形で結合される。
一部の実施形態において、ＣＤ７９ｂ阻害剤は、抗ＣＤ７９ｂ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、例えば、抗ＣＤ７９ｂ ＣＡＲコンストラクトを発現する、またはｓｃＦｖ、ＣＤＲもしくはＶＨおよびＶＬ鎖を含むＣＤ７９ｂ結合ＣＡＲによってコードされている、細胞を包含する。例えば、抗ＣＤ７９ｂ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴは、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞と組み合わせて投与するために、ＣＤ７９ｂ－ＣＡＲ（ＣＤ７９ｂ結合ドメインを含む）を細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）に遺伝子操作することによって生成される。本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞の養子療法のための使用方法も本明細書において提供される。
別の態様において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞とＣＤ７９ｂ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲを発現するＮＫ細胞、の集団が本明細書において提供される。例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する第一の細胞、およびＣＤ７９ｂ ＣＡＲを発現する第二の細胞を包含し得る。
Ｃ１７９ｂ阻害剤
本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ１７９ｂ」は、一部の悪性血液がん細胞、例えば白血病細胞上で検出可能であることが公知の抗原決定基を指す。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔおよびＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔなどの公開データベースで見出すことができる。例えば、ヒトＣＤ１７９ｂのアミノ酸配列は、受託番号ＮＰ＿０６４４５５．１（アイソフォームａ前駆体）またはＮＰ＿６９０５９４．１（アイソフォームｂ前駆体）で見出すことができ、それらをコードするｍＲＮＡ配列は、受託番号ＮＭ＿０２００７０．３（転写変異体１）またはＮＭ＿１５２８５５．２（転写変異体２）で見出すことができる。本明細書で使用される場合、「ＣＤ１７９ｂ」は、完全長野生型ＣＤ１７９ｂの突然変異、例えば点突然変異、フラグメント、挿入、欠失およびスプライス変異体を含むタンパク質を包含する。一態様において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＣＤ１７９ｂタンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、それに結合する。一態様において、ＣＤ１７９ｂタンパク質は、がん細胞上で発現される。実施形態において、ＣＤ１７９ｂタンパク質は、野生型ＣＤ１７９ｂタンパク質であり、他の実施形態において、ＣＤ１７９ｂタンパク質は、突然変異ＣＤ１７９ｂタンパク質である。
ＣＤ１７９ｂは、免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）とも呼ばれる。ＣＤ１７９ｂは、膜結合Ｉｇ ｍｕ重鎖と複合体化するヘテロ二量体軽鎖のサブユニットである。一緒に軽鎖と重鎖が前駆Ｂ細胞受容体を形成する。ＣＤ１７９ｂの突然変異は、Ｂ細胞欠損および無ガンマグロブリン血症との相互関係が証明されている。ＣＤ１７９ｂは、一部のがん細胞、例えば、前駆体Ｂ細胞リンパ芽球性リンパ腫細胞において発現される。
ＣＤ１７９ｂ阻害剤および併用療法が本明細書において提供される。ＣＤ１７９ｂ阻害剤としては、小分子、組換えタンパク質、抗ＣＤ１７９ｂ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、および抗ＣＤ１７９ｂ抗体（例えば、抗ＣＤ１７９ｂ単一または二重特異性抗体）およびそれらのフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、抗ＣＤ１７９ｂ阻害剤は、本明細書で説明されるＢ細胞悪性腫瘍を処置するために使用することができる。ある実施形態において、ＣＤ１７９ｂ阻害剤は、ＣＤ２０阻害剤、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞、例えば、マウスのものであるか、ヒトのものであるか、またはヒト化されている抗体結合ドメインを含むＣＡＲを発現する細胞と組み合わせて投与される。
ある実施形態において、ＣＤ１７９ｂ阻害剤は、抗ＣＤ１７９ｂ抗体またはそのフラグメントである。一実施形態において、抗１７９ｂ抗体またはそのフラグメントは、モノクローナル抗体、例えば、単一特異性もしくは二重特異性抗体またはそのフラグメントを含む。
一部の実施形態において、ＣＤ１７９ｂ阻害剤は、治療剤とコンジュゲートされるか、または他の形で結合される。
一部の実施形態において、ＣＤ１７９ｂ阻害剤は、抗ＣＤ１７９ｂ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、例えば、抗ＣＤ１７９ｂ ＣＡＲコンストラクトを発現する、またはｓｃＦｖ、ＣＤＲもしくはＶＨおよびＶＬ鎖を含むＣＤ１７９ｂ結合ＣＡＲによってコードされている、細胞を包含する。例えば、抗ＣＤ１７９ｂ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴは、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞と組み合わせて投与するために、ＣＤ１７９ｂ－ＣＡＲ（ＣＤ１７９ｂ結合ドメインを含む）を細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）に遺伝子操作することによって生成される。本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞の養子療法のための使用方法も本明細書において提供される。
別の態様において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞とＣＤ１７９ｂ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞、の集団が本明細書において提供される。例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する第一の細胞、およびＣＤ１７９ｂ ＣＡＲを発現する第二の細胞を包含し得る。
ＣＤ７９ａ阻害剤
本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ７９ａ」は、一部の悪性血液がん細胞、例えば白血病細胞上で検出可能であることが公知の抗原決定基を指す。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔおよびＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔなどの公開データベースで見出すことができる。例えば、ヒトＣＤ７９ａのアミノ酸配列は、受託番号ＮＰ＿００１７７４．１（アイソフォーム１前駆体）またはＮＰ＿０６７６１２．１（アイソフォーム２前駆体）で見出すことができ、それらをコードするｍＲＮＡ配列は、受託番号ＮＭ＿００１７８３．３（転写変異体１）またはＮＭ＿０２１６０１．３（転写変異体２）で見出すことができる。本明細書で使用される場合、「ＣＤ７９ａ」は、完全長野生型ＣＤ７９ａの突然変異、例えば点突然変異、フラグメント、挿入、欠失およびスプライス変異体を含むタンパク質を包含する。一態様において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＣＤ７９ａタンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、それに結合する。一態様において、ＣＤ７９ａタンパク質は、がん細胞上で発現される。実施形態において、ＣＤ７９ａタンパク質は、野生型ＣＤ７９ａタンパク質であり、他の実施形態において、ＣＤ７９ａタンパク質は、突然変異ＣＤ７９ａタンパク質である。
ＣＤ７９ａは、免疫グロブリン関連アルファとも呼ばれる。ＣＤ７９ａは、ＣＤ７９ｂとヘテロ二量体化して、Ｂリンパ球抗原受容体多量体複合体の構成要素を形成する。ＣＤ７９ａは、多くの血液がん、例えば、急性白血病（例えば、ＡＭＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、および骨髄腫において発現される。
ＣＤ７９ａ阻害剤および併用療法が本明細書において提供される。ＣＤ７９ａ阻害剤としては、小分子、組換えタンパク質、抗ＣＤ７９ａ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、および抗ＣＤ７９ａ抗体（例えば、抗ＣＤ７９ａ単一または二重特異性抗体）およびそれらのフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、抗ＣＤ７９ａ阻害剤は、本明細書で説明されるＢ細胞悪性腫瘍を処置するために使用することができる。ある実施形態において、ＣＤ７９ａ阻害剤は、ＣＤ１９阻害剤、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞、例えば、マウスのものであるか、ヒトのものであるか、またはヒト化されている抗体結合ドメインを含むＣＡＲを発現する細胞と組み合わせて投与される。
ある実施形態において、ＣＤ７９ａ阻害剤は、抗ＣＤ７９ａ抗体またはそのフラグメントである。一実施形態において、抗ＣＤ７９ａ抗体またはそのフラグメントは、モノクローナル抗体、例えば、単一特異性もしくは二重特異性抗体またはそのフラグメントを含む。例えば、抗ＣＤ７９ａ抗体またはそのフラグメントは、参照により本明細書に組み入れられるPolson et al.Blood 110.2(2007):616-23において説明されている抗ＣＤ７９ａ抗体またはそのフラグメント（例えば、可変領域もしくはＣＤＲ）を含む。例えば、抗ＣＤ７９ａ抗体またはそのフラグメントは、Polson et al.において説明されている７Ｈ７、１５Ｅ４または１６Ｃ１１抗体またはそのフラグメント（例えば、可変領域もしくはＣＤＲ）を含む。同文献を参照されたい。
一部の実施形態において、ＣＤ７９ａ阻害剤は、治療剤とコンジュゲートされるか、または他の形で結合される。
一部の実施形態において、ＣＤ７９ａ阻害剤は、抗ＣＤ７９ａ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、例えば、抗ＣＤ７９ａ ＣＡＲコンストラクトを発現する、またはｓｃＦｖ、ＣＤＲもしくはＶＨおよびＶＬ鎖を含むＣＤ７９ａ結合ＣＡＲによってコードされている、細胞を包含する。例えば、抗ＣＤ７９ａ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴは、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞と組み合わせて投与するために、ＣＤ７９ａ－ＣＡＲ（ＣＤ７９ａ結合ドメインを含む）を細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）に遺伝子操作することによって生成される。本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞の養子療法のための使用方法も本明細書において提供される。
別の態様において、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞とＣＤ７９ａ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞、の集団が本明細書において提供される。例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ２０ ＣＡＲを発現する第一の細胞、およびＣＤ７９ａ ＣＡＲを発現する第二の細胞を包含し得る。
ＣＡＲ療法
本明細書における阻害剤、例えば、ＣＤ１０，ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａに対して向けられたＣＡＲ発現細胞は、本明細書で説明される組成物、例えば、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、共刺激ドメイン、リーダー配列またはヒンジの１つまたは複数を含んでいてもよい。
一態様において、本発明は、ＣＡＲをコードする導入遺伝子を含む組換え核酸コンストラクトを包含する。一部の実施形態において、核酸分子は、配列番号６１～７２の１つまたは複数から選択される抗ＣＤ１９結合ドメインをコードする核酸配列を含み、前記配列は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と連続しており同じリーディングフレーム内にある。ＣＡＲにおいて使用することができる典型的な細胞内シグナル伝達ドメインとしては、例えば、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、および同種のものの１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合において、ＣＡＲは、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、および同種のもののあらゆる組合せを含んでいてもよい。
一態様において、本発明は、機能的に同等な分子を生成する開始時の抗体またはフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）のアミノ酸配列の改変を意図している。例えば、ＣＡＲに含まれる、抗原結合ドメイン、例えばｓｃＦｖ、のＶＨまたはＶＬは、抗原結合ドメイン、例えばｓｃＦｖ、の開始時のＶＨまたはＶＬフレームワーク領域との少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％，８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性が保持されるように改変してもよい。本発明は、機能的に同等な分子を生成するために、ＣＡＲコンストラクト全体の改変、例えば、ＣＡＲコンストラクトの様々なドメインの１つまたは複数のアミノ酸配列における改変を意図している。ＣＡＲコンストラクトを、開始時のＣＡＲコンストラクトとの少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％，８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性が保持されるように改変してもよい。本発明は、機能的に同等な分子を生成するために、ＣＤＲの改変、例えば、ＣＡＲコンストラクトの１つまたは複数のＣＤＲの１つまたは複数のアミノ酸配列における改変も意図している。例えば、ＣＤＲは、本明細書において提供されるＣＤＲ配列と比較して１、２、３、４、５または６個を含めてこの数までの変更（例えば、置換）を有してもよい。
所望の分子をコードする核酸配列は、当業界公知の組換え方法を使用して得ることができ、例えば遺伝子を発現する細胞からのライブラリーをスクリーニングすること、遺伝子を包含することがわかっているベクターからその遺伝子を抽出すること、またはその遺伝子を含有する細胞および組織から標準的な技術を使用して直接単離することなどによって得ることができる。その代わりに、対象の核酸は、クローニングされるのではなく合成的に産生されてもよい。
本発明は、とりわけ、細胞に直接形質導入することができる、ＣＡＲを発現するレトロウイルスおよびレンチウイルスベクターコンストラクトを包含する。
本発明はまた、細胞に直接トランスフェクトすることができるＲＮＡコンストラクトも包含する。トランスフェクションで使用するためのｍＲＮＡを生成するための方法は、長さが典型的には５０～２０００塩基の３’および５’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）、５’キャップおよび／または内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、発現しようとする核酸、およびポリＡテールを含有するコンストラクト（配列番号１１８）を産生するために、インビトロでの特別に設計されたプライマーを用いた鋳型の転写（ＩＶＴ）、それに続くポリＡ付加を含む。このようにして産生されたＲＮＡは、異なる種の細胞に効率的にトランスフェクトすることができる。一実施形態において、鋳型は、ＣＡＲに関する配列を包含する。ある実施形態において、ＲＮＡ ＣＡＲベクターは、エレクトロポレーションによってＴ細胞に形質導入される。
抗原結合ドメイン
一態様において、本発明のＣＡＲは、他に抗原結合ドメインと称される標的特異性の結合要素を含む。成分の選択は、標的細胞の表面を特徴付けるリガンドのタイプおよび数に依存する。例えば、抗原結合ドメインは、特定の病状に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選ぶことができる。したがって、本発明のＣＡＲにおける抗原結合ドメインのリガンドとして作用することができる細胞表面マーカーの例としては、ウイルス、細菌および寄生虫感染症、自己免疫疾患およびがん細胞に関連するものが挙げられる。抗原結合ドメインは、例えば、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａの１つまたは複数に結合することができる。
一態様において、ＣＡＲが介在するＴ細胞応答は、ＣＡＲの中に所望の抗原と特異的に結合する抗原結合ドメインを作製することによって、対象の抗原に向けることができる。
抗原結合ドメイン（例えば、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａの１つまたは複数に結合する抗原結合ドメイン）は、これらに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、およびこれらの機能的なフラグメント［これらに限定されないが、単一ドメイン抗体、例えば、ラクダ由来のナノボディの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および可変ドメイン（ＶＨＨ）を包含する］を包含する抗体、ならびに組換えフィブロネクチンドメインおよび同種のものなどの、抗原結合ドメインとして機能することが当業界公知の代替足場と結合するあらゆるドメインであり得る。
いくつかの場合において、抗原結合ドメインにとって、ＣＡＲが最終的に使用されると予想される同じ種由来であることは有益である。例えば、ヒトに使用する場合、ＣＡＲの抗原結合ドメイン（例えば、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａの１つまたは複数に結合する抗原結合ドメイン）にとって、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインにヒトまたはヒト化残基を含むことは有益であり得る。
ヒト化抗体は、当業界公知の様々な技術を使用して産生することができ、このような技術としては、これらに限定されないが、ＣＤＲグラフティング（例えば、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み入れられる欧州特許ＥＰ２３９，４００号；国際特許公開ＷＯ９１／０９９６７；および米国特許第５，２２５，５３９号、５，５３０，１０１号、および５，５８５，０８９号を参照）、ベニアリング（veneering）またはリサーフェイシング（resurfacing）［例えば、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み入れられる欧州特許ＥＰ５９２，１０６号およびＥＰ５１９，５９６号；Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498；Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814；およびRoguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973を参照］、チェーンシャッフリング（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許第５，５６５，３３２号を参照）、ならびに例えば、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２００５／００４２６６４号、米国特許出願公開第２００５／００４８６１７号、米国特許第６，４０７，２１３号、米国特許第５，７６６，８８６号、国際特許公開ＷＯ９３１７１０５、Tan et al., J. Immunol., 169:1119-25 (2002)、Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000)、Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000)、Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997)、Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996)、Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995)、Couto et al., Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995)、Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994)、およびPedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994)で開示された技術などが挙げられる。抗原結合を変更する、例えば向上させるために、しばしばフレームワーク領域中のフレームワーク残基は、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基で置換されると予想される。これらのフレームワーク置換は、当業界周知の方法によって同定され、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するための、ＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリング、および特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって同定される（例えば、参照によりそれらの全体が開示に組み入れられるQueen et alの米国特許第５,５８５,０８９号；およびRiechmann et al., 1988, Nature, 332:323を参照）。
ヒト化抗体または抗体フラグメントは、その中に非ヒトである源からの残存する１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入」残基と称されることが多く、これは、典型的には「移入」可変ドメインから採取される。本明細書で示したように、ヒト化抗体または抗体フラグメントは、非ヒト免疫グロブリン分子からの１つまたは複数のＣＤＲおよびフレームワーク領域を含み、ここでフレームワークを含むアミノ酸残基は、完全にまたは大部分がヒト生殖細胞系由来である。抗体または抗体フラグメントのヒト化に関する複数の技術が当業界周知であり、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒおよび協同研究者の方法［Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)］に従って、げっ歯類ＣＤＲまたはヒト抗体の対応する配列に関するＣＤＲ配列を置換すること、すなわち、ＣＤＲグラフティング（その内容が参照によりそれらの全体として本明細書に組み入れられるＥＰ２３９，４００；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７；および米国特許第４，８１６，５６７号；６，３３１，４１５号；５，２２５，５３９号；５，５３０，１０１号；５，５８５，０８９号；６，５４８，６４０号）によって行うことができる。このようなヒト化抗体および抗体フラグメントにおいて、無傷のヒト可変ドメインより実質的に小さい部分が、非ヒト種からの対応する配列で置換されている。ヒト化抗体は、いくつかのＣＤＲ残基および場合によってはいくつかのフレームワーク（ＦＲ）残基がげっ歯類抗体中の類似の部位からの残基で置換されているヒト抗体であることが多い。また抗体および抗体フラグメントのヒト化は、ベニアリングまたはリサーフェイシング［その内容が参照によりそれらの全体として本明細書に組み入れられるＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498；Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994)；およびRoguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994)］またはチェーンシャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）によっても達成することができる。
ヒト化抗体を作製するのに使用するために、軽鎖および重鎖の両方のヒト可変ドメインを選択することは、抗原性を低下させることになる。いわゆる「最良適合（best-fit)」法に従って、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してげっ歯類抗体の可変ドメインの配列がスクリーニングされる。次いでげっ歯類配列に最も近いヒト配列がヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として容認される［その内容が参照によりそれらの全体として本明細書に組み入れられるSims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)］。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループにおける全てのヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを使用する。様々な異なるヒト化抗体に同じフレームワークを使用することができる［例えば、その内容が参照によりそれらの全体として本明細書に組み入れられるNicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)；Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)を参照］。いくつかの実施形態において、フレームワーク領域、例えば重鎖可変領域の全ての４つのフレームワーク領域は、ＶＨ４＿４－５９生殖細胞系配列由来である。一実施形態において、フレームワーク領域は、例えば、対応するマウス配列（例えば配列番号５９の）におけるアミノ酸からの１、２、３、４または５つの改変、例えば置換を含んでいてもよい。一実施形態において、フレームワーク領域、例えば軽鎖可変領域の全ての４つのフレームワーク領域は、ＶＫ３＿１．２５生殖細胞系配列由来である。一実施形態において、フレームワーク領域は、例えば、対応するマウス配列（例えば配列番号５９の）におけるアミノ酸からの１、２、３、４または５つの改変、例えば置換を含んでいてもよい。
いくつかの態様において、抗体フラグメントを含む本発明のＣＡＲ組成物の一部は、標的抗原への高親和性および他の好都合な生物学的特性を保持したままヒト化される。本発明の一態様によれば、ヒト化抗体および抗体フラグメントは、親の配列およびヒト化された配列の三次元モデルを使用して、親の配列および様々な概念的なヒト化生成物を分析するプロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルが一般的に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の可能性がある三次元立体配座構造を例示して表示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらの表示を精査することで、候補免疫グロブリン配列の機能化において見込みのある残基の役割の分析、例えば、候補免疫グロブリンの標的抗原と結合する能力に影響を与える残基の分析が可能になる。この方法で、標的抗原に対する高い親和性などの所望の抗体または抗体フラグメントの特徴が達成されるように、レシピエントおよび移入配列からＦＲ残基を選択して組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基が、直接的にかつ最も実質的に抗原結合への影響に関与する。
ヒト化抗体または抗体フラグメントは、元の抗体と類似の抗原特異性、例えば、本発明においてはヒトＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２と結合する能力を保持している可能性がある。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体または抗体フラグメントは、ヒトＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２への結合の向上した親和性および／または特異性を有する可能性がある。
一態様において、結合ドメイン（例えば、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａの１つまたは複数に結合する抗原結合ドメイン）は、フラグメント、例えば単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。一態様において、結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、または二重機能性（例えば、二重特異的）ハイブリッド抗体［例えば、Lanzavecchia et al., Eur.J. Immunol.17, 105 (1987)］である。一態様において、本発明の抗体およびそれらのフラグメントは、野生型の、または増強された親和性でＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２タンパク質に結合する。
いくつかの場合において、ｓｃＦｖは、当業界公知の方法に従って調製できる［例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426およびHuston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照］。ｓｃＦｖ分子は、フレキシブルなポリペプチドリンカーを使用してＶＨおよびＶＬ領域を一緒に連結することによって産生することができる。ｓｃＦｖ分子は、長さおよび／またはアミノ酸組成が最適化されたリンカー（例えば、Ｓｅｒ－Ｇｌｙリンカー）を含む。リンカーの長さは、ｓｃＦｖの可変領域がどのようにフォールディングして相互作用するかに大きく影響を与える可能性がある。実際、短いポリペプチドリンカーが採用される場合（例えば、５～１０アミノ酸の間）、鎖内のフォールディングが予防される。鎖間のフォールディングは、２つの可変領域を一緒に架橋して機能的なエピトープ結合部位を形成するのにも必要である。リンカーの方向およびサイズの例に関しては、例えば、参照により本明細書に組み入れられるHollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448、米国特許出願公開第２００５／０１００５４３号、２００５／０１７５６０６号、２００７／００１４７９４号、およびＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０２０２５８およびＷＯ２００７／０２４７１５を参照されたい。
ｓｃＦｖは、そのＶＬとＶＨ領域との間に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０アミノ酸残基、またはそれより多くのアミノ酸残基のリンカーを含んでいてもよい。リンカー配列は、あらゆる天然に存在するアミノ酸を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、アミノ酸であるグリシンおよびセリンを含む。別の実施形態において、リンカー配列は、一連のグリシンおよびセリン反復を含み、例えば（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含み、ここで式中ｎは、１以上の正の整数である（配列番号１８）。一実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号１０６）または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１０７）であってもよい。リンカーの長さを変化させることで、活性を保持したりまたは強化したりすることが可能であり、それにより活性研究において優れた効能がもたらされる。
一部の実施形態において、例えば保存的置換によって、抗原結合ドメイン（例えば、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂもしくはＣＤ７９ａの１つまたは複数に結合する抗原結合ドメイン）または他の部分もしくはＣＡＲ全体のアミノ酸配列を改変してもよく、例えば本明細書で説明されるアミノ酸配列を改変してもよい。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当業界において定義されており、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を包含する。
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の状況における完全同一（Percent identity）とは、２つ以上の配列が同一であることを指す。以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して、または手作業でのアライメントと目視検査により測定する場合、比較ウィンドウ、または指示された領域にわたり最大限一致するように比較して並べたときに、２つの配列が、同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定のパーセンテージ（例えば、特定の領域にわたり、または特に指定されない場合は配列全体にわたり、６０％の同一性であり、７０％、７１％。７２％。７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％，８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性であってもよい）を有する場合、その２つの配列は「実質的に同一」である。同一性は、長さが少なくとも約５０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）の領域にわたり、または長さが１００～５００もしくは１０００以上のヌクレオチド（または２０、５０、２００以上のアミノ酸）の領域にわたり存在してもよい。
配列の比較のために、典型的には１つの配列が、テスト配列と比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、テストおよび参照配列をコンピューターに入力し、部分配列の座標を指定し、必要に応じて配列アルゴリズムのプログラムパラメーターを指定する。デフォルトプログラムのパラメーターを使用してもよいし、または代替パラメーターを指定してもよい。次いで配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づき参照配列に対するテスト配列のパーセント配列同一性を計算する。比較のための配列のアライメント方法は当業界周知である。比較のための最適な配列のアライメントは、例えば、Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cのローカルホモロジーアルゴリズムによって、Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443のホモロジーアライメントアルゴリズムによって、Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおける、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）によって、または手作業でのアライメントと目視検査［例えば、Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biologyを参照］によって行うことができる。
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402；およびAltschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410で説明されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を介して公共的に利用可能である。
また２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれ、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップの伸長ペナルティーおよび４のギャップペナルティーを使用するＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ［(1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17］のアルゴリズムを使用しても決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（www.gcg.comで利用可能）に組み込まれ、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５、または６のレングスウェイトを使用するＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ［(1970) J. Mol. Biol. 48:444-453］のアルゴリズムを使用して決定することもできる。
一態様において、本発明は、機能的に同等な分子を生成する開始時の抗体またはフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）のアミノ酸配列の改変を意図している。例えば、ＣＡＲに含まれる結合ドメイン（例えば、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａの１つまたは複数に結合する抗原結合ドメイン）、例えばｓｃＦｖ、のＶＨまたはＶＬは、抗ＣＤ１９結合ドメイン、例えばｓｃＦｖ、の開始時のＶＨまたはＶＬフレームワーク領域との少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％，８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性が保持されるように改変してもよい。より広義には、ＣＡＲに含まれる、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１へのＢ細胞抗原結合ドメイン、例えばｓｃＦｖ、のＶＨまたはＶＬは、抗原結合ドメイン、例えばｓｃＦｖ、の開始時のＶＨまたはＶＬフレームワーク領域との少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％，８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性が保持されるように改変してもよい。本発明は、機能的に同等な分子を生成するために、ＣＡＲコンストラクト全体の改変、例えば、ＣＡＲコンストラクトの様々なドメインの１つまたは複数のアミノ酸配列における改変を意図している。ＣＡＲコンストラクトを、開始時のＣＡＲコンストラクトとの少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％，８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性が保持されるように改変してもよい。
二重特異性ＣＡＲ
一実施形態において、多重特異性抗体分子は、二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体は、２つ以下の抗原に特異性を有する。二重特異性抗体分子は、第一のエピトープに結合特異性を有する第一の免疫グロブリンの可変ドメイン配列および第二のエピトープに結合特異性を有する第二の免疫グロブリンの可変ドメイン配列を特徴とする。一実施形態において、第一および第二のエピトープは、同じ抗原、例えば、同じタンパク質（または多量体タンパク質のサブユニット）上にある。一実施形態において、第一および第二のエピトープは、オーバーラップしている。一実施形態において、第一および第二のエピトープは、オーバーラップしていない。一実施形態において、第一および第二のエピトープは、異なる抗原、例えば、異なるタンパク質（または異なる多量体タンパク質のサブユニット）上にある。一実施形態において、二重特異性抗体分子は、第一のエピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列、ならびに第二のエピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列を含む。一実施形態において、二重特異性抗体分子は、第一のエピトープに結合特異性を有する半抗体、および第二のエピトープに結合特異性を有する半抗体を含む。一実施形態において、二重特異性抗体分子は、第一のエピトープに結合特異性を有する半抗体、またはそれらのフラグメント、および第二のエピトープに結合特異性を有する半抗体、またはそれらのフラグメントを含む。一実施形態において、二重特異性抗体分子は、第一のエピトープに結合特異性を有するｓｃＦｖ、またはそれらのフラグメント、および第二のエピトープに結合特異性を有するｓｃＦｖ、またはそれらのフラグメントを含む。ある実施形態において、第一のエピトープはＣＤ１９上に位置し、第二のエピトープはＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１上に位置する。
ある特定の実施形態において、抗体分子は、多重特異性（例えば、二重特異性または三重特異性）抗体分子である。二重特異性またはヘテロ二量体抗体分子を生成するためのプロトコールは当業界において公知であり、例えば、これらに限定されないが、例えばＵＳ５７３１１６８で説明されている、例えば、「ノブインアホール（knob in a hole）」アプローチ；例えばＷＯ０９／０８９００４、ＷＯ０６／１０６９０５およびＷＯ２０１０／１２９３０４で説明されている、静電的操作によるＦｃ対形成；例えばＷＯ０７／１１０２０５で説明されている、鎖交換加工ドメイン（Strand Exchange Engineered Domains：ＳＥＥＤ）ヘテロ二量体形成；例えばＷＯ０８／１１９３５３、ＷＯ２０１１／１３１７４６、およびＷＯ２０１３／０６０８６７で説明されている、Ｆａｂアーム交換；例えばＵＳ４４３３０５９で説明されている、例えば、アミン応答性基とスルフヒドリル応答性基とを有するヘテロ二官能性試薬を使用して二重特異性構造を生成するための抗体架橋による、二重の抗体コンジュゲート；例えばＵＳ４４４４８７８で説明されている、２つの重鎖間のジスルフィド結合の還元および酸化のサイクルを介して異なる抗体からの半抗体（重鎖－軽鎖対またはＦａｂ）を組み換えることによって生成された二重特異性抗体決定基；例えばＵＳ５２７３７４３で説明されている、スルフヒドリル（sulfhdryl）応答性基を介して架橋された三官能性の抗体、例えば、３つのＦａｂ’フラグメント；例えばＵＳ５５３４２５４で説明されている、Ｃ末端尾部を介して架橋された、好ましくはジスルフィドまたはアミン応答性の化学的架橋を介した、生合成結合タンパク質、例えばｓｃＦｖ対；例えばＵＳ５５８２９９６で説明されている、二機能性抗体、例えば、定常ドメインと置き換えられたロイシンジッパー（例えば、ｃ－ｆｏｓおよびｃ－ｊｕｎ）を介して二量体化された異なる結合特異性を有するＦａｂフラグメント；例えばＵＳ５５９１８２８で説明されている、二重特異性および多重特異性のモノ－および多価受容体、例えば、一方の抗体のＣＨ１領域と、典型的には軽鎖が結合した他方の抗体のＶＨ領域との間でポリペプチドスペーサーを介して連結された２つの抗体（２つのＦａｂフラグメント）のＶＨ－ＣＨ１領域；例えばＵＳ５６３５６０２で説明されている、二重特異性ＤＮＡ－抗体コンジュゲート、例えば、ＤＮＡの二本鎖断片を介した抗体またはＦａｂフラグメントの架橋形成；例えばＵＳ５６３７４８１で説明されている、二重特異性融合タンパク質、例えば、親水性のらせん状ペプチドリンカーを間に有する２つのｓｃＦｖおよび完全な定常領域を含有する発現コンストラクト；例えばＵＳ５８３７２４２で説明されている、多価および多重特異性結合タンパク質、例えば、一般的にダイアボディと呼ばれるＩｇ重鎖可変領域の結合領域を有する第一のドメインとＩｇ軽鎖可変領域の結合領域を有する第二のドメインとを有するポリペプチドの二量体（二重特異性、三重特異性、または四重特異性の分子のために作り出されるより高次の構造も包含される）；例えばＵＳ５８３７８２１で説明されている、ＶＬおよびＶＨ鎖が連結されており、さらにペプチドスペーサーを用いて抗体のヒンジ領域およびＣＨ３領域と接続されているミニボディコンストラクトであって、二量体化されて二重特異性／多価分子を形成することができるミニボディコンストラクト；短いペプチドリンカー（例えば、５または１０アミノ酸）を用いて、またはまったくリンカーを用いずにいずれかの方向で連結されたＶＨおよびＶＬドメインであって、二量体を形成して、二重特異性ダイアボディを形成することができる、ドメイン；例えばＵＳ５８４４０９４で説明されている、三量体および四量体；例えばＵＳ５８６４０１９で説明されている、Ｃ末端で架橋性基を用いたペプチド結合によって接続され、ＶＬドメインとさらに結合して一連のＦＶ（またはｓｃＦｖ）を形成する、ＶＨドメイン（またはファミリーメンバー中のＶＬドメイン）のストリング；ならびに例えばＵＳ５８６９６２０で説明されている、ＶＨおよびＶＬドメインの両方がペプチドリンカーを介して連結された単一の鎖結合ポリペプチドであって、非共有結合または化学的な架橋形成を介して多価構造に組み合わされて、ｓｃＦＶまたはダイアボディタイプの様式の両方を使用して例えばホモ２価、ヘテロ２価、３価、および４価構造を形成する、ポリペプチドが挙げられる。追加の例示的な多重特異性および二重特異性分子ならびにそれらの作製方法は、例えば、ＵＳ５９１０５７３、ＵＳ５９３２４４８、ＵＳ５９５９０８３、ＵＳ５９８９８３０、ＵＳ６００５０７９、ＵＳ６２３９２５９、ＵＳ６２９４３５３、ＵＳ６３３３３９６、ＵＳ６４７６１９８、ＵＳ６５１１６６３、ＵＳ６６７０４５３、ＵＳ６７４３８９６、ＵＳ６８０９１８５、ＵＳ６８３３４４１、ＵＳ７１２９３３０、ＵＳ７１８３０７６、ＵＳ７５２１０５６、ＵＳ７５２７７８７、ＵＳ７５３４８６６、ＵＳ７６１２１８１、ＵＳ２００２００４５８７Ａ１、ＵＳ２００２０７６４０６Ａ１、ＵＳ２００２１０３３４５Ａ１、ＵＳ２００３２０７３４６Ａ１、ＵＳ２００３２１１０７８Ａ１、ＵＳ２００４２１９６４３Ａ１、ＵＳ２００４２２０３８８Ａ１、ＵＳ２００４２４２８４７Ａ１、ＵＳ２００５００３４０３Ａ１、ＵＳ２００５００４３５２Ａ１、ＵＳ２００５０６９５５２Ａ１、ＵＳ２００５０７９１７０Ａ１、ＵＳ２００５１００５４３Ａ１、ＵＳ２００５１３６０４９Ａ１、ＵＳ２００５１３６０５１Ａ１、ＵＳ２００５１６３７８２Ａ１、ＵＳ２００５２６６４２５Ａ１、ＵＳ２００６０８３７４７Ａ１、ＵＳ２００６１２０９６０Ａ１、ＵＳ２００６２０４４９３Ａ１、ＵＳ２００６２６３３６７Ａ１、ＵＳ２００７００４９０９Ａ１、ＵＳ２００７０８７３８１Ａ１、ＵＳ２００７１２８１５０Ａ１、ＵＳ２００７１４１０４９Ａ１、ＵＳ２００７１５４９０１Ａ１、ＵＳ２００７２７４９８５Ａ１、ＵＳ２００８０５０３７０Ａ１、ＵＳ２００８０６９８２０Ａ１、ＵＳ２００８１５２６４５Ａ１、ＵＳ２００８１７１８５５Ａ１、ＵＳ２００８２４１８８４Ａ１、ＵＳ２００８２５４５１２Ａ１、ＵＳ２００８２６０７３８Ａ１、ＵＳ２００９１３０１０６Ａ１、ＵＳ２００９１４８９０５Ａ１、ＵＳ２００９１５５２７５Ａ１、ＵＳ２００９１６２３５９Ａ１、ＵＳ２００９１６２３６０Ａ１、ＵＳ２００９１７５８５１Ａ１、ＵＳ２００９１７５８６７Ａ１、ＵＳ２００９２３２８１１Ａ１、ＵＳ２００９２３４１０５Ａ１、ＵＳ２００９２６３３９２Ａ１、ＵＳ２００９２７４６４９Ａ１、ＥＰ３４６０８７Ａ２、ＷＯ０００６６０５Ａ２、ＷＯ０２０７２６３５Ａ２、ＷＯ０４０８１０５１Ａ１、ＷＯ０６０２０２５８Ａ２、ＷＯ２００７０４４８８７Ａ２、ＷＯ２００７０９５３３８Ａ２、ＷＯ２００７１３７７６０Ａ２、ＷＯ２００８１１９３５３Ａ１、ＷＯ２００９０２１７５４Ａ２、ＷＯ２００９０６８６３０Ａ１、ＷＯ９１０３４９３Ａ１、ＷＯ９３２３５３７Ａ１、ＷＯ９４０９１３１Ａ１、ＷＯ９４１２６２５Ａ２、ＷＯ９５０９９１７Ａ１、ＷＯ９６３７６２１Ａ２、ＷＯ９９６４４６０Ａ１で見出される。上記で参照した出願の内容は、この参照によりそれらの全体が開示に組み入れられる。
二重特異性抗体分子の各抗体または抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）内で、ＶＨは、ＶＬの上流であってもよいし、または下流であってもよい。一部の実施形態において、上流の抗体または抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）は、全体的な二重特異性抗体分子がＶＨ１－ＶＬ１－ＶＬ２－ＶＨ２のアレンジメントを有するように、そのＶＬ（ＶＬ１）の上流にそのＶＨ（ＶＨ１）があるようにアレンジされ、下流の抗体または抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ２）の上流にそのＶＬ（ＶＬ２）があるようにアレンジされる。他の実施形態において、上流の抗体または抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）は、全体的な二重特異性抗体分子がＶＬ１－ＶＨ１－ＶＨ２－ＶＬ２のアレンジメントを有するように、そのＶＨ（ＶＨ１）の上流がそのＶＬ（ＶＬ１）にあるようにアレンジされ、下流の抗体または抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ２）の上流にそのＶＨ（ＶＨ２）があるようにアレンジされる。リンカーは、２つの抗体または抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）の間に配置されてもよく、例えば、コンストラクトがＶＨ１－ＶＬ１－ＶＬ２－ＶＨ２のようにアレンジされる場合はＶＬ１とＶＬ２との間に、またはコンストラクトがＶＬ１－ＶＨ１－ＶＨ２－ＶＬ２のようにアレンジされる場合はＶＨ１とＶＨ２との間に配置されてもよい。リンカーは、本明細書で説明されるリンカー、例えば、（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）ｎリンカーであってもよく、ここでｎは、１、２、３、４、５、または６であり、例えば４（配列番号５３）である。一般的に、２つのｓｃＦｖ間のリンカーは、２つのｓｃＦｖのドメイン間での誤った対形成が回避される程度に長いと予想される。リンカーは、第一のｓｃＦｖのＶＬとＶＨとの間に配置されてもよい。リンカーは、第二のｓｃＦｖのＶＬとＶＨとの間に配置されてもよい。複数のリンカーを有するコンストラクトにおいて、リンカーのいずれか２つ以上は、同一のものであってもよいし、または異なるものであってもよい。したがって、一部の実施形態において、二重特異性ＣＡＲは、本明細書で説明されるアレンジメントにおいて、ＶＬ、ＶＨ、および任意に１つまたは複数のリンカーを含む。
ある特定の実施形態において、抗体分子は、第一のＢ細胞エピトープへの第一の結合特異性、および別のＢ細胞抗原への第二の結合特異性を有する、二重特異性抗体分子である。例えば、一部の実施形態において、二重特異性抗体分子は、ＣＤ１９への第一の結合特異性、およびＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａの１つまたは複数への第二の結合特異性を有する。一部の実施形態において、二重特異性抗体分子は、ＣＤ１９への第一の結合特異性、およびＣＤ２２への第二の結合特異性を有する。
キメラＴＣＲ
一態様において、本明細書で開示される抗体および抗体フラグメント（例えば、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａに対して向けられたもの）をＴ細胞受容体（「ＴＣＲ」）鎖、例えば、ＴＣＲアルファまたはＴＣＲベータ鎖の１つまたは複数の定常ドメインにグラフト化して、がん関連抗原と特異的に結合するキメラＴＣＲを作り出すことができる。理論に縛られることはないが、キメラＴＣＲは、抗原結合直後にＴＣＲ複合体を介してシグナル伝達すると考えられる。例えば、本明細書で開示されるｓｃＦｖは、ＴＣＲ鎖、例えば、ＴＣＲアルファ鎖および／またはＴＣＲベータ鎖の、定常ドメイン、例えば細胞外定常ドメインの少なくとも一部、膜貫通ドメインおよび細胞質内ドメインにグラフト化されてもよい。別の例として、抗体フラグメント、例えば本明細書で説明されるＶＬドメインは、ＴＣＲアルファ鎖の定常ドメインにグラフト化されてもよいし、抗体フラグメント、例えば本明細書で説明されるＶＨドメインは、ＴＣＲベータ鎖の定常ドメインにグラフト化されてもよい（または代替として、ＶＬドメインは、ＴＣＲベータ鎖の定常ドメインにグラフト化されてもよいし、ＶＨドメインは、ＴＣＲアルファ鎖にグラフト化されてもよい）。別の例として、抗体または抗体フラグメントのＣＤＲ、例えば、本明細書のあらゆる表で説明されるような抗体または抗体フラグメントのＣＤＲをＴＣＲアルファおよび／またはベータ鎖にグラフト化して、がん関連抗原と特異的に結合するキメラＴＣＲを作り出してもよい。例えば、本明細書で開示されるＬＣ ＣＤＲをＴＣＲアルファ鎖の可変ドメインにグラフト化してもよいし、本明細書で開示されるＨＣ ＣＤＲをＴＣＲベータ鎖の可変ドメインにグラフト化してもよく、または逆もまた同様である。このようなキメラＴＣＲは、任意の適切な方法によって産生され得る［例えば、Willemsen RA et al, Gene Therapy 2000；7: 1369-1377；Zhang T et al, Cancer Gene Ther 2004；11: 487-496；Aggen et al, Gene Ther.2012 Apr;19(4):365-74］。
非抗体足場
実施形態において、抗原結合ドメインは、非抗体足場、例えば、フィブロネクチン、アンキリン、ドメイン抗体、リポカリン、小モジュラー免疫薬、マキシボディ（maxybody）、プロテインＡまたはアフィリンを含む。非抗体足場は、細胞上の標的抗原と結合する能力を有する。実施形態において、抗原結合ドメインは、細胞上で発現される天然に存在するタンパク質のポリペプチドまたはそのフラグメントである。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、非抗体足場を含む。結果として得られるポリペプチドが、標的細胞上の標的抗原と特異的に結合する少なくとも１つの結合領域を含むのであれば、多種多様な非抗体足場を利用することができる。
非抗体足場としては、フィブロネクチン（Ｎｏｖａｒｔｉｓ、ＭＡ）、アンキリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、およびＡｂｌｙｎｘ ｎｖ、Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、リポカリン（Ｐｉｅｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｏｌａｂ ＡＧ、Ｆｒｅｉｓｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、小モジュラー免疫薬（Ｔｒｕｂｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）、マキシボディ（Ａｖｉｄｉａ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、プロテインＡ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ ＡＧ、Ｓｗｅｄｅｎ）、およびアフィリン（ガンマ－クリスタリンまたはユビキチン）（Ｓｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ、Ｈａｌｌｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられる。
フィブロネクチン足場は、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン［例えば、１０番目のフィブロネクチンＩＩＩ型モジュール（１０Ｆｎ３ドメイン）］に基づくこともある。フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインは、２つのベータシート間に分布している７または８本のベータ鎖を有し、該ベータ鎖は、それら自体が互いに密集してタンパク質のコアを形成しており、および前記ドメインは、（ＣＤＲに類似した）ループをさらに含有し、該ループは、前記ベータ鎖を互いに接続しており、溶媒に露出している。ベータシートサンドイッチの各縁部にはこのようなループが少なくとも３つあり、前記縁部は、ベータ鎖の方向に対して垂直のタンパク質の境界である（米国特許第６，８１８，４１８号を参照されたい）。この構造のため、この非抗体足場は、抗体のものと性質および親和性の点で類似している抗原結合特性を模倣する。これらの足場をインビトロでのループランダム化およびシャフリング戦略に使用することができ、この戦略は、インビボ（in vivo）での抗体の親和性成熟過程に類似している。
アンキリン技術は、異なる標的との結合に使用することができる可変領域を支持するための足場としてアンキリン由来の反復モジュールを有するタンパク質を使用することに基づく。アンキリン反復モジュールは、２つの逆平行のαヘリックスとβターンからなる３３アミノ酸ポリペプチドである。可変領域の結合は、ほとんどの場合、リボソームディスプレイを使用することによって最適化される。
アビマーは、ＨＥＲ３などの天然Ａドメイン含有タンパク質に由来する。これらのドメインは、本質的にタンパク質間相互作用に使用され、ヒトの場合、２５０を超えるタンパク質が構造的にＡドメインに基づいている。アビマーは、アミノ酸リンカーを介して連結された多数の異なる「Ａドメイン」単量体（２～１０）からなる。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７５７５６号、同第２００５／００５３９７３号、同第２００５／００４８５１２号および同第２００６／０００８８４４号において説明されている方法論を使用して、標的抗体と結合することができるアビマーを作り出すことができる。
アフィボディ親和性リガンドは、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインの１つの足場に基づく３ヘリックスバンドルで構成されている、小さい単純なタンパク質である。プロテインＡは、細菌ストレプトコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）からの表面タンパク質である。この足場ドメインは５８のアミノ酸からなり、そのうちの１３がランダム化されて、多数のリガンド変異体を有するアフィボディライブラリーが生成される（例えば、米国特許第５，８３１，０１２号を参照されたい）。アフィボディ分子は抗体を模倣する。それらは、１５０ｋＤａである抗体の分子量と比較して、６ｋＤａの分子量を有する。その小さいサイズにもかかわらず、アフィボディ分子の結合部位は、抗体のものに類似している。
タンパク質エピトープ模倣体（ＰＥＭ）は、タンパク質間相互作用に関与する主要二次構造であるタンパク質のベータ－ヘパリン二次構造を模倣する、中型で環状のペプチド様分子（ＭＷ１～２ｋＤａ）である。抗体結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体またはラクダ化抗体を含むものを、本明細書で説明されるいずれかの標的受容体／リガンド、例えば、ＰＤ１受容体、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に指向させることができる。
ある実施形態において、抗原結合ドメインは、標的細胞の表面のカウンターリガンドに結合する分子の細胞外ドメインまたはそのカウンターリガンド結合フラグメントを含む。
抗原結合ドメインは、阻害性受容体の細胞外ドメインを含んでいてもよい。共阻害分子のカウンターリガンドとの会合は、免疫エフェクター応答の最適化にリダイレクトされる。
抗原結合ドメインは、共刺激ＥＣＤドメインと称される共刺激分子の細胞外ドメインを含んでいてもよい。共刺激分子のカウンターリガンドとの会合は、免疫エフェクター細胞の最適化をもたらす。
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、様々な実施形態において、ＣＡＲの細胞外ドメインに付着した膜貫通ドメインが含まれるように、ＣＡＲを設計することができる。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接する１つまたは複数の追加のアミノ酸、例えば、膜貫通が誘導されたタンパク質の細胞外領域と会合する１つまたは複数のアミノ酸（例えば、細胞外領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から最大１５のアミノ酸）、および／または膜貫通タンパク質が誘導されたタンパク質の細胞内領域に会合した１つまたは複数の追加のアミノ酸（例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から最大１５のアミノ酸）を包含していてもよい。一態様において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの他のドメインの１つと会合しているものであり、例えば、一実施形態において、膜貫通ドメインは、シグナル伝達ドメイン、共刺激ドメインまたはヒンジドメインが由来する同じタンパク質からのものであってもよい。別の態様において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲのいずれかの他のドメインが由来する同じタンパク質に由来しない。いくつかの場合において、膜貫通ドメインが同一または異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインと結合しないように、例えば、受容体複合体の他の一員との相互作用が最小化されるように、膜貫通ドメインを選択してもよいし、またはアミノ酸置換によって改変してもよい。一態様において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲを発現する細胞表面上で別のＣＡＲとホモ二量体化することができる。異なる態様において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じＣＡＲを発現する細胞に存在する天然型の結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小化するように改変または置換されていてもよい。
膜貫通ドメインは、天然源から得てもよいし、または組換え源から得てもよい。源が天然である場合、そのドメインは、あらゆる膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来するものであってもよい。一態様において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲが標的に結合したときはいつでも細胞内ドメインにシグナル伝達することができる。本発明において特定の用途を有する膜貫通ドメインは、少なくとも、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の膜貫通領域を包含していてもよい。一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、少なくとも膜貫通領域、例えば、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、またはＣＤ１９と特異的に結合するリガンドを包含していてもよい。
いくつかの場合において、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えばヒトタンパク質由来のヒンジを介して、ＣＡＲの細胞外領域、例えばＣＡＲの抗原結合ドメインに付着していてもよい。例えば、一実施形態において、ヒンジは、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）ヒンジ、例えばＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＤヒンジ、ＧＳリンカー（例えば、本明細書で説明されるＧＳリンカー）、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジ、またはＣＤ８ａヒンジであってもよい。一実施形態において、ヒンジまたはスペーサーは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む（例えば、からなる）。一態様において、膜貫通ドメインは、配列番号１５の膜貫通ドメインを含む（例えば、からなる）。
一態様において、ヒンジまたはスペーサーは、ＩｇＧ４ヒンジを含む。例えば、一実施形態において、ヒンジまたはスペーサーは、アミノ酸配列ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM（配列番号４５）のヒンジを含む。一部の実施形態において、ヒンジまたはスペーサーは、GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG（配列番号４６）のヌクレオチド配列によってコードされたヒンジを含む。
一態様において、ヒンジまたはスペーサーは、ＩｇＤヒンジを含む。例えば、一実施形態において、ヒンジまたはスペーサーは、アミノ酸配列RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH（配列番号４７）のヒンジを含む。一部の実施形態において、ヒンジまたはスペーサーは、AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTCGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT（配列番号４８）のヌクレオチド配列によってコードされたヒンジを含む。
一態様において、膜貫通ドメインは組換えであってもよく、その場合、膜貫通ドメインは、主としてロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含むと予想される。一態様において、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンの三つ組は、組換え膜貫通ドメインのそれぞれの末端で見出すことができる。
ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質内領域との間で、長さが２から１０アミノ酸の間の短いオリゴリンカーまたはポリペプチドリンカーが連結を形成していてもよい。グリシン－セリンの二つ組が特に好適なリンカーを付与する。例えば、一態様において、リンカーは、GGGGSGGGGS（配列番号４９）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、リンカーは、GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC（配列番号５０）のヌクレオチド配列によってコードされる。
一態様において、ヒンジまたはスペーサーは、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジを含む。
細胞質内ドメイン
ＣＡＲの細胞質内ドメインまたは領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを包含する。細胞内シグナル伝達ドメインは、一般的に、ＣＡＲが導入されている免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与する。
本発明のＣＡＲで使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、抗原受容体と接触した後にシグナル伝達を開始させるように協同して作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および補助受容体の細胞質内配列、加えて同じ機能的な能力を有するこれらの配列およびあらゆる組換え配列のあらゆる誘導体または変異体が挙げられる。
ＴＣＲ単独により生成されたシグナルは、Ｔ細胞を完全に活性化させるには不十分であり、さらに二次的および／または共刺激シグナルも必要であることが知られている。したがって、Ｔ細胞の活性化は、細胞質内シグナル伝達配列の２つの別個のクラス：ＴＣＲを介した抗原依存性の一次活性化を開始させるクラス（一次細胞内シグナル伝達ドメイン）および抗原非依存性の方式で作用して二次シグナルまたは共刺激シグナルを提供するクラス（二次細胞質内ドメイン、例えば共刺激ドメイン）によって媒介されるということができる。
一次シグナル伝達ドメインは、刺激による方式または阻害による方式のいずれかでＴＣＲ複合体の一次的な活性化を調節する。刺激による方式で作用する一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含有していてもよい 。
本発明において特に有用なＩＴＡＭを含有する一次細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲ１ｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（「ＩＣＯＳ」としても公知）ＦｃεＲＩ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２およびＣＤ６６ｄの上記ドメインが挙げられる。一実施形態において、本発明のＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３－ゼータの一次シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、改変されたＩＴＡＭドメイン、例えば、天然ＩＴＡＭドメインと比較して活性が変更された（例えば、増加または減少した）、突然変異したＩＴＡＭドメインを含む。一実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、改変されたＩＴＡＭを含有する一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、最適化および／またはトランケートされたＩＴＡＭを含有する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれより多くのＩＴＡＭモチーフを含む。
本発明において特定の用途を有する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含有する分子のさらなる例としては、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、およびＣＤ３２のものが挙げられる。
共刺激シグナル伝達ドメイン
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインそれ自身を含んでいてもよいし、または本発明のＣＡＲの状況において有用な他のあらゆる所望の細胞内シグナル伝達ドメインと組み合わせることができる。例えば、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖の部分、および共刺激シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部を指す。一実施形態において、細胞内ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一態様において、細胞内ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＩＣＯＳのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。
共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子であり得る。このような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ならびに同種のものが挙げられる。例えば、ＣＤ２７の共刺激は、インビトロにおけるヒトＣＡＲＴ細胞の拡大、エフェクター機能、および生存を強化し、インビボにおけるヒトＴ細胞の持続性および抗腫瘍活性を増大させることが実証されている［Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706］。このような共刺激分子のさらなる例としては、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドが挙げられる。
本発明のＣＡＲの細胞質内部分内の細胞内シグナル伝達配列は、ランダムな順番または特定の順番で互いに連結されていてもよい。例えば長さが２から１０アミノ酸の間（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸）の短いオリゴリンカーまたはポリペプチドリンカーが、細胞内シグナル伝達配列間の連結を形成していてもよい。一実施形態において、好適なリンカーとして、グリシン－セリンの二つ組を使用することができる。一実施形態において、好適なリンカーとして、単一のアミノ酸、例えばアラニン、グリシンを使用することができる。
一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つ以上、例えば、２、３、４、５、またはそれより多くの共刺激シグナル伝達ドメインが含まれるように設計される。ある実施形態において、２つ以上、例えば、２、３、４、５、またはそれより多くの共刺激シグナル伝達ドメインは、リンカー分子、例えば本明細書で説明されるリンカー分子によって隔てられる。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、リンカー分子は、グリシン残基である。いくつかの実施形態において、リンカーは、アラニン残基である。
一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一態様において、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号１６のシグナル伝達ドメインである。一態様において、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号１７のシグナル伝達ドメインである。
一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２７のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一態様において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP（配列番号５１）のアミノ酸配列を含む。一態様において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC（配列番号５２）の核酸配列によってコードされる。
ナチュラルキラー細胞受容体（ＮＫＲ）ＣＡＲ
一実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ分子は、ナチュラルキラー細胞受容体（ＮＫＲ）の１つまたは複数の構成要素を含み、それによってＮＫＲ－ＣＡＲを形成する。ＮＫＲの構成要素は、以下のナチュラルキラー細胞受容体：キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＤＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１／Ｓ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＰ１、およびＫＩＲ３ＤＰ１；天然細胞毒性（cyotoxicity）受容体（ＮＣＲ）、例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６；免疫細胞受容体のシグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）ファミリー、例えば、ＣＤ４８、ＣＤ２２９、２Ｂ４、ＣＤ８４、ＮＴＢ－Ａ、ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥ、およびＣＤ２Ｆ－１０；Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）、例えば、ＣＤ１６、およびＣＤ６４；ならびにＬｙ４９受容体、例えば、ＬＹ４９Ａ、ＬＹ４９Ｃのいずれかからの、膜貫通ドメイン、ヒンジドメイン、または細胞質内ドメインであり得る。本明細書で説明されるＮＫＲ－ＣＡＲ分子は、アダプター分子または細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＤＡＰ１２と相互作用する可能性がある。ＮＫＲ構成要素を含むＣＡＲ分子の例示的な配置および配列は、その内容が参照により本明細書に組み入れられる国際公報ＷＯ２０１４／１４５２５２号で説明されている。
キメラ抗原受容体を調節するための戦略
一部の実施形態において、ＣＡＲ活性を制御することができる調節可能なＣＡＲ（ＲＣＡＲ）は、ＣＡＲ療法の安全性および効能を最適化するのに望ましい。ＣＡＲ活性を調節することができる多くの方法がある。例えば二量体化ドメインに融合したカスパーゼを使用してアポトーシスを誘導すること（例えば、Di et al., N Engl. J. Med. 2011 Nov. 3;365(18):1673-1683を参照）は、例えば本発明のＣＡＲ療法における安全性スイッチとして使用できる。一実施形態において、本発明のＣＡＲを発現する細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）は、ヒトカスパーゼ（例えば、カスパーゼ９）または改変バージョンをヒトＦＫＢタンパク質の改変形に融合させることで条件付き二量体化を可能にするアポトーシス誘導性スイッチをさらに含む。ラパログ（例えば、ＡＰ １９０３、ＡＰ２０１８７）などの小分子の存在下で、誘導性カスパーゼ（例えば、カスパーゼ９）は活性化され、本発明のＣＡＲを発現する細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の急速なアポトーシスおよび死滅をもたらす。カスパーゼベースのアポトーシス誘導性スイッチ（またはこのようなスイッチの１つもしくは複数の態様）の例は、例えば、米国特許出願公開第２００４０４００４７号、同第２０１１０２８６９８０号、同第２０１４０２５５３６０号、ＷＯ１９９７０３１８９９、ＷＯ２０１４１５１９６０、ＷＯ２０１４１６４３４８、ＷＯ２０１４１９７６３８、ＷＯ２０１４１９７６３８において説明されており、これらの特許文献の全てが参照により本明細書に組み入れられる。
別の例において、ＣＡＲを発現する細胞はまた、二量体化剤［例えば、リミヅシド（rimiducid）（ＡＰ１９０３（Ｂｅｌｌｉｃｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）またはＡＰ２０１８７（Ａｒｉａｄ）とも呼ばれる］投与の際にカスパーゼ－９の活性化および細胞のアポトーシスを引き起こす誘導性カスパーゼ－９（ｉカスパーゼ－９）分子も発現することができる。ｉカスパーゼ－９分子は、ＣＩＤの存在下で二量体化を媒介する二量体化（ＣＩＤ）結合ドメインの化学的な誘導物質を含有する。これは、ＣＡＲを発現する細胞の誘導性で選択的な枯渇を引き起こす。いくつかの場合において、ｉカスパーゼ－９分子は、ＣＡＲをコードするベクターとは別の核酸分子によってコードされる。いくつかの場合において、ｉカスパーゼ－９分子は、ＣＡＲをコードするベクターと同じ核酸分子によってコードされる。ｉカスパーゼ－９は、ＣＡＲを発現する細胞のあらゆる毒性を回避するための安全性スイッチを提供することができる。例えば、Song et al. Cancer Gene Ther. 2008; 15(10):667-75;臨床試験識別番号NCT02107963;およびDi Stasi et al. N. Engl. J. Med. 2011; 365:1673-83を参照されたい。
本発明のＣＡＲ療法を調節するための代替の戦略としては、例えば、ＣＡＲを発現する細胞を欠失させることによって、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導することによって、ＣＡＲ活性を非活性化したりまたは止めたりする小分子または抗体を利用することが挙げられる。例えば、本明細書で説明されるＣＡＲを発現する細胞もまた、細胞死、例えばＡＤＣＣまたは補体（compliment）誘導性の細胞死を誘導することが可能な分子によって認識される抗原を発現する可能性がある。例えば、本明細書で説明されるＣＡＲを発現する細胞はまた、抗体または抗体フラグメントによって標的化される可能性がある受容体を発現する可能性もある。このような受容体の例としては、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦＲ、インテグリン（例えば、インテグリンανβ３、α４、αΙ３／４β３、α４β７、α５β１、ανβ３、αν）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバー（例えば、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２）、ＰＤＧＦ受容体、インターフェロン受容体、葉酸受容体、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ－１、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＥＡ、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ１、ＴＡＧ－７２、ＩＬ－６受容体、５Ｔ４、ＧＤ２、ＧＤ３、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ／ＬＦＡ－１、ＣＤ１５、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３／ｌｇＥ受容体、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７／ベイシジン、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ－４、ＣＤ１５４／ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１９５／ＣＣＲ５、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ７、およびＥＧＦＲ、ならびにそれらのトランケートされたバージョン（例えば、１つまたは複数の細胞外のエピトープを保存するが細胞質内ドメイン内の１つまたは複数の領域が欠失したバージョン）が挙げられる。
例えば、本明細書で説明されるＣＡＲを発現する細胞はまた、シグナル伝達能力を欠失しているが、ＡＤＣＣ、例えばセツキシマブ［ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）］を誘導することが可能な分子によって認識されるエピトープを保持するトランケートされた上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を発現してもよく、それにより、セツキシマブの投与が、ＡＤＣＣとその後のＣＡＲを発現する細胞の枯渇を誘導するようになる（例えば、ＷＯ２０１１／０５６８９４、およびJonnalagadda et al., Gene Ther. 2013; 20(8)853-860を参照）。別の戦略としては、リツキシマブと結合し、その結果として例えばＡＤＣＣによるＣＡＲを発現する細胞の選択的な枯渇を引き起こす、本明細書で説明されるＣＡＲを発現する細胞中でＣＤ３２およびＣＤ２０抗原の両方からの標的エピトープを組み合わせた高度に圧縮されたマーカー／自殺遺伝子を発現することが挙げられる（例えば、Philip et al., Blood. 2014; 124(8)1277-1287を参照）。本明細書で説明されるＣＡＲを発現する細胞を枯渇させるための他の方法としては、例えばＡＤＣＣを誘導することによる破壊のために、成熟リンパ球、例えばＣＡＲを発現する細胞と選択的に結合してそれを標的とする、モノクローナル抗ＣＤ５２抗体であるＣＡＭＰＡＴＨの投与が挙げられる。他の実施形態において、ＣＡＲリガンド、例えば抗イディオタイプ抗体を使用して、ＣＡＲを発現する細胞を選択的に標的化することができる。一部の実施形態において、抗イディオタイプ抗体は、エフェクター細胞活性、例えばＡＤＣＣまたはＡＤＣ活性を引き起こすことによって、ＣＡＲを発現する細胞の数を低減させることができる。他の実施形態において、ＣＡＲリガンド、例えば抗イディオタイプ抗体を、細胞の死滅を誘導する薬剤、例えば毒素とカップリングさせることによって、ＣＡＲを発現する細胞の数を低減させることができる。代替として、ＣＡＲ分子それ自身を、後述するように、活性を調節することができるように、例えば開始させたり止めたりすることができるように設計することができる。
他の実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲを発現する細胞は、Ｔ細胞枯渇剤によって認識される標的タンパク質を発現することもできる。一実施形態において、標的タンパク質はＣＤ２０であり、Ｔ細胞枯渇剤は、抗ＣＤ２０抗体、例えばリツキシマブである。このような実施形態において、Ｔ細胞枯渇剤は、ＣＡＲを発現する細胞を低減または排除すること、例えばＣＡＲ誘導毒性を減弱することが望ましくなったら、投与される。他の実施形態において、Ｔ細胞枯渇剤は、抗ＣＤ５２抗体、例えばアレムツズマブである。
ある態様において、ＲＣＡＲは、ポリペプチドのセット、最も簡単な実施形態において、典型的には、２つのポリペプチドのセットを含み、別々のポリペプチドまたはメンバーに、本明細書で説明される標準的なＣＡＲの構成要素、例えば抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインが分配されている。一部の実施形態において、ポリペプチドのセットは、二量体化分子の存在下でポリペプチドを互いにカップリングすることができ、例えば抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインにカップリングすることができる、二量体化スイッチを包含する。一実施形態において、本発明のＣＡＲは、例えば参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１４１２７２６１において説明されているもののような二量体化スイッチを利用する。このような調節可能なＣＡＲのさらなる説明および例示的な配置は、本明細書において提供され、その全体が参照により本明細書に組み入れられる国際公報ＷＯ２０１５／０９０２２９において提供されている。
一部の実施形態において、ＲＣＡＲは、スイッチドメイン、例えば、配列番号１２２に記載のＦＫＢＰスイッチドメインを含むか、またはＦＲＢと結合する能力を有する、例えば配列番号１２３に記載の、ＦＫＢＰのフラグメントを含む。一部の実施形態において、ＲＣＡＲは、例えば配列番号１２４に記載のＦＲＢ配列、または例えばD V P D Y A S L G G P S S P K K K R K V S R G V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S Y（配列番号１２２）
V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S（配列番号１２３）
ILWHEMWHEG LEEASRLYFG ERNVKGMFEV LEPLHAMMER GPQTLKETSF NQAYGRDLME AQEWCRKYMK SGNVKDLTQA WDLYYHVFRR ISK（配列番号１２４）
のいずれかに記載の突然変異ＦＲＢ配列を含む、スイッチドメインを含む。
Figure 0007227331000011
スプリットＣＡＲ
一部の実施形態において、ＣＡＲを発現する細胞は、スプリットＣＡＲを使用する。スプリットＣＡＲアプローチは、公報ＷＯ２０１４／０５５４４２およびＷＯ２０１４／０５５６５７においてより詳細に説明されている。簡単に言えば、スプリットＣＡＲシステムは、第一の抗原結合ドメインおよび共刺激ドメイン（例えば、４１ＢＢ）を有する第一のＣＡＲを発現する細胞を含み、この細胞は、第二の抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ゼータ）を有する第二のＣＡＲも発現する。細胞が第一の抗原と遭遇すると、共刺激ドメインが活性化され、細胞は増殖する。細胞が第二の抗原と遭遇すると、細胞内シグナル伝達ドメインが活性化され、細胞を殺滅する活性が開始される。したがって、ＣＡＲを発現する細胞は、両方の抗原の存在下でのみ完全に活性化される。
ＲＮＡトランスフェクション
本明細書において、インビトロで転写されたＲＮＡ ＣＡＲを産生する方法が開示される。本発明はまた、細胞に直接トランスフェクトすることができる、ＣＡＲをコードするＲＮＡコンストラクトを（とりわけ）包含する。トランスフェクションで使用するためのｍＲＮＡを生成するための方法は、３’および５’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）、５’キャップおよび／または内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、発現しようとする核酸、およびポリＡテールを含有する、長さが典型的には５０～２０００塩基のコンストラクト（配列番号１１８）を産生するために、特別に設計されたプライマーを用いる鋳型のインビトロで転写（ＩＶＴ）、それに続くポリＡ付加を含み得る。このようにして産生されたＲＮＡは、異なる種類の細胞に効率的にトランスフェクトすることができる。一態様において、鋳型は、ＣＡＲに関する配列を包含する。
一態様において、ＣＡＲは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）によってコードされる。一態様において、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡは、ＣＡＲを発現する細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ ＮＫ細胞の産生のために、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に導入される。
一実施形態において、インビトロで転写されたＲＮＡ ＣＡＲは、一過性トランスフェクションの形態として細胞に導入することができる。ＲＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で生成した鋳型を使用したインビトロでの転写によって産生される。あらゆる源からの対象のＤＮＡを、インビトロでの適切なプライマーおよびＲＮＡポリメラーゼを使用したｍＲＮＡ合成のための鋳型に直接ＰＣＲで変換させることができる。ＤＮＡ源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列または他のあらゆる適切なＤＮＡ源であってもよい。インビトロでの転写のための所望の鋳型（temple）は、本発明のＣＡＲである。例えば、ＲＮＡ ＣＡＲのための鋳型は、抗腫瘍抗体の単鎖可変ドメインを含む細胞外領域；ヒンジ領域、膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８ａの膜貫通ドメイン）；ならびに細胞内シグナル伝達ドメインを包含する細胞質内領域を含み、前記細胞質内領域は、例えば、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態において、ＰＣＲに使用しようとするＤＮＡは、オープンリーディングフレームを含有する。ＤＮＡは、生物のゲノムからの天然に存在するＤＮＡ配列由来であってもよい。一実施形態において、核酸は、５’および／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の一部または全部を包含していてもよい。核酸は、エキソンおよびイントロンを包含していてもよい。一実施形態において、ＰＣＲに使用しようとするＤＮＡは、ヒト核酸配列である。別の実施形態において、ＰＣＲに使用しようとするＤＮＡは、５’および３’ＵＴＲを包含するヒト核酸配列である。その代わりにＤＮＡは、天然に存在する生物では通常発現されない人工ＤＮＡ配列であってもよい。典型的な人工ＤＮＡ配列は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成するために一緒にライゲートされる遺伝子の一部を含有する配列である。一緒にライゲートされるＤＮＡの一部は、単一の生物由来であってもよいし、または１種より多くの生物由来であってもよい。
ＰＣＲは、トランスフェクションに使用されるｍＲＮＡのインビトロでの転写のための鋳型を生成するために使用される。ＰＣＲを行う方法は当業界周知である。ＰＣＲで使用するためのプライマーは、ＰＣＲのための鋳型として使用しようとするＤＮＡの領域に実質的に相補的な領域を有するように設計される。「実質的に相補的」は、本明細書で使用される場合、プライマー配列中の塩基の大部分または全部が相補的であるか、または１つもしくは複数の塩基が非相補的であるかもしくはミスマッチであるヌクレオチド配列を指す。実質的に相補的な配列は、ＰＣＲに使用されるアニーリング条件下で、意図したＤＮＡ標的にアニールしたり、または意図したＤＮＡ標的とハイブリダイズしたりすることが可能である。プライマーは、ＤＮＡ鋳型のいずれかの部分に実質的に相補的になるように設計することができる。例えば、プライマーは、５’および３’ＵＴＲを包含する、細胞中で正常に転写される核酸（オープンリーディングフレーム）の一部が増幅されるように設計することができる。プライマーは、対象の特定のドメインをコードする核酸の一部が増幅されるように設計することもできる。一実施形態において、プライマーは、５’および３’ＵＴＲの全部または一部を包含するヒトｃＤＮＡのコード領域が増幅されるように設計される。ＰＣＲに有用なプライマーは、当業界周知の合成方法によって生成することができる。「フォワードプライマー」は、増幅されるべきＤＮＡ配列の上流にあるＤＮＡ鋳型上のヌクレオチドに実質的である相補的なヌクレオチドの領域を含有するプライマーである。「上流」は、コード鎖を基準にして、増幅しようとするＤＮＡ配列の５位を指すものとして本明細書では使用される。「リバースプライマー」は、増幅されるべきＤＮＡ配列の下流にある二本鎖ＤＮＡ鋳型に実質的に相補的であるヌクレオチドの領域を含有するプライマーである。「下流」は、コード鎖を基準にして、増幅しようとするＤＮＡ配列の３’位を指すものとして本明細書では使用される。
本明細書で開示される方法において、ＰＣＲに有用なあらゆるＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。試薬およびポリメラーゼは、多数の供給元から市販されている。
安定性および／または翻訳効率を促進する能力を有する化学構造も使用が可能である。ＲＮＡは、一部の実施形態において、５’および３’ＵＴＲを有する。一実施形態において、５’ＵＴＲは、長さが１から３０００ヌクレオチドの間である。コード領域に付加しようとする５’および３’ＵＴＲ配列の長さは、これらに限定されないが、ＵＴＲの異なる領域にアニールするＰＣＲのためのプライマーを設計することなど様々な方法によって変更することができる。このアプローチを使用すれば、当業者は、転写されたＲＮＡのトランスフェクション後に最適な翻訳効率を達成するのに必要な５’および３’ＵＴＲの長さを改変することができる。
５’および３’ＵＴＲは、対象の核酸にとって、天然に存在する内因性５’および３’ＵＴＲであってもよい。その代わりに、フォワードおよびリバースプライマーにＵＴＲ配列を取り入れることによって、または鋳型の他のあらゆる改変によって、対象の核酸にとって内因性ではないＵＴＲ配列を付加してもよい。対象の核酸にとって内因性ではないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を改変するのに有用な可能性がある。例えば、３’ＵＴＲ配列中のＡＵリッチ要素は、ｍＲＮＡの安定性を減少させる可能性があることが知られている。それゆえに、当業界周知のＵＴＲの特性に基づき転写されたＲＮＡの安定性を増加させるには、３’ＵＴＲを選択または設計することができる。
一実施形態において、５’ＵＴＲは、内因性核酸のコザック配列を含有していてもよい。その代わりに、対象の核酸にとって内因性ではない５’ＵＴＲを上述したようにＰＣＲによって付加しようとする場合、５’ＵＴＲ配列を付加することによってコンセンサスコザック配列の設計を改めてもよい。コザック配列は一部のＲＮＡ転写物の翻訳効率を増加させることができるが、効率的な翻訳を可能にするために全てのＲＮＡに必要であるとは考えられていない。多くのｍＲＮＡにとってのコザック配列の必要条件は当業界公知である。他の実施形態において、５’ＵＴＲは、ＲＮＡのゲノムが細胞中で安定であるＲＮＡウイルスの５’ＵＴＲであってもよい。他の実施形態において、様々なヌクレオチド類似体は、３’または５’ＵＴＲにおいて、エキソヌクレアーゼによるｍＲＮＡの分解を妨害するのに使用できる。
遺伝子クローニングを必要とすることなくＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの合成を可能にするためには、転写プロモーターは、転写しようとする配列の上流でＤＮＡ鋳型に付着すると予想される。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列がフォワードプライマーの５’末端に付加される場合、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターは、転写しようとするオープンリーディングフレームの上流でＰＣＲ産物に取り入れられるようになる。一実施形態において、プロモーターは、本明細書の他所で説明したように、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターとしては、これらに限定されないが、Ｔ３およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが挙げられる。Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列は、当業界公知である。
ある実施形態において、ｍＲＮＡは、５’末端上のキャップと３’ポリ（Ａ）テールの両方を有しており、これらがリボソーム結合、翻訳開始および細胞中でのｍＲＮＡの安定性を決定する。環状ＤＮＡ鋳型、例えばプラスミドＤＮＡにおいて、ＲＮＡポリメラーゼは、真核細胞での発現には好適ではない長いコンカテマー様の生成物を産生する。３’ＵＴＲの末端で直線化したプラスミドＤＮＡの転写は、正常なサイズのｍＲＮＡをもたらすが、これは転写後にポリアデニル化されたとしても真核性のトランスフェクションにおいて有効ではない。
直鎖状ＤＮＡ鋳型において、ファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型の最後の塩基を過ぎても転写物の３’末端を伸長することができる［（Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985)；Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)］。
ポリＡ／ＴストレッチをＤＮＡ鋳型に統合する従来の方法は、分子クローニングである。しかしながら、プラスミドＤＮＡに統合されたポリＡ／Ｔ配列は、プラスミドを不安定化する可能性があり、これが、なぜ細菌細胞から得られたプラスミドのＤＮＡ鋳型に、欠失や他の異常が高度に混入していることが多いのかの理由である。そのため、クローニング手法は面倒で時間がかかるだけでなく、信頼できないものになっている。これが、クローニングを用いずにポリＡ／Ｔ３’ストレッチを有するＤＮＡ鋳型の構築が可能になる方法が極めて望ましい理由である。
転写のＤＮＡ鋳型のポリＡ／Ｔセグメントは、ポリＴテール、例えば１００Ｔテール（配列番号２９）［サイズは、５０～５０００Ｔであり得る（配列番号３０）］を含有するリバースプライマーを使用することによってＰＣＲ中に産生してもよいし、またはこれらに限定されないがＤＮＡライゲーションまたはインビトロでの組換えを包含する他のいずれかの方法によってＰＣＲ後に産生してもよい。またポリ（Ａ）テールは、ＲＮＡに安定性ももたらし、それらの分解を少なくする。一般的に、ポリ（Ａ）テールの長さは、転写されたＲＮＡの安定性と正の相関がある。一実施形態において、ポリ（Ａ）テールは、１００から５０００アデノシンの間である（配列番号５７）。
ＲＮＡのポリ（Ａ）テールは、Ｅ．コリのポリＡポリメラーゼ（Ｅ－ＰＡＰ）などのポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用して、インビトロでの転写の後にさらに伸長させることができる。一実施形態において、ポリ（Ａ）テールの長さを１００ヌクレオチドから、３００～４００ヌクレオチド（配列番号１０４）に増加させることにより、ＲＮＡの翻訳効率の約２倍の増加が得られる。加えて、３’末端への異なる化学基の付着は、ｍＲＮＡの安定性を増加させることができる。このような付着は、改変された／人工ヌクレオチド、アプタマーおよび他の化合物を含有していてもよい。例えば、ＡＴＰ類似体は、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用してポリ（Ａ）テールに取り入れられてもよい。ＡＴＰ類似体は、ＲＮＡの安定性をさらに増加させることができる。
また５’キャップは、ＲＮＡ分子に安定性ももたらす。ある実施形態において、本明細書で開示された方法によって産生されたＲＮＡは、５’キャップを包含する。５’キャップは、当業界公知の技術や本明細書で説明される技術を使用してもたらされる［Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001)；Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001)；Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)］。
本明細書で開示された方法によって産生されたＲＮＡはまた、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列を含有していてもよい。ＩＲＥＳ配列は、あらゆるウイルス配列、染色体配列または人工的に設計された配列であってもよく、これは、キャップ非依存性のｍＲＮＡへのリボソーム結合を開始させて翻訳開始を容易にするものである。細胞のエレクトロポレーションに好適なあらゆる溶質、すなわち糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤、および界面活性剤などの細胞の透過性および生存能力を助長する因子を含有し得る溶質が包含されていてもよい。
ＲＮＡは、多数の異なる方法、例えば市販の方法のいずれかを使用して標的細胞に導入することができ、このような方法としては、これらに限定されないが、エレクトロポレーション［Amaxa Nucleofector-II(Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ)］、［ＥＣＭ８３０（ＢＴＸ）（Ｈａｒｖａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．］またはジーンパルサーＩＩ（BioRad、Denver、Colo.）、マルチポレーター（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｔ、Ｈａｍｂｕｒｇ Ｇｅｒｍａｎｙ）、リポフェクションを使用したカチオン性リポソーム介在トランスフェクション、ポリマーのカプセル封入、ペプチド介在トランスフェクション、または遺伝子銃粒子デリバリー系、例えば「ジーンガン」［例えば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)を参照］が挙げられる。
非ウイルスのデリバリー方法
いくつかの態様において、非ウイルス方法は、細胞または組織または対象に本明細書で説明されるＣＡＲをコードする核酸をデリバリーするのに使用することができる。
一部の実施形態において、非ウイルス方法としては、トランスポゾン（転移因子とも呼ばれる）の使用が挙げられる。一部の実施形態において、トランスポゾンは、ゲノム中の位置にそれ自身を挿入することができるＤＮＡの断片、例えば、自己増殖してそのコピーをゲノムに挿入することができるＤＮＡの断片、またはより長い核酸からプライシングしてゲノム中の別の場所に挿入することができるＤＮＡの断片である。例えば、トランスポゾンは、転移のための遺伝子の端にある逆方向反復配列で構成されるＤＮＡ配列を含む。
トランスポゾンを使用する核酸デリバリーの例示的な方法としては、スリーピングビューティートランスポゾンシステム（ＳＢＴＳ）およびｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポゾンシステムが挙げられる。例えば、全てが参照により本明細書に組み入れられる、Aronovich et al. Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011):R14-20; Singh et al. Cancer Res. 15(2008):2961-2971; Huang et al. Mol. Ther. 16(2008):580-589; Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010):1200-1209; Kebriaei et al. Blood. 122.21(2013):166; Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16; Bell et al. Nat. Protoc. 2.12(2007):3153-65;およびDing et al. Cell. 122.3(2005):473-83を参照されたい。
ＳＢＴＳは、２つの構成要素：１）導入遺伝子を含有するトランスポゾンおよび２）トランスポゼース酵素源を包含する。トランスポゼースは、担体プラスミド（または他のドナーＤＮＡ）から標的ＤＮＡ、例えば宿主細胞染色体／ゲノムにトランスポゾンを転移させることができる。例えば、トランスポゼースは、担体プラスミド／ドナーＤＮＡに結合し、プラスミドからトランスポゾン（導入遺伝子を包含する）を切り出して、それを宿主細胞のゲノムに挿入する。例えばAronovich et al.を参照されたい。
例示的なトランスポゾンとしては、ｐＴ２ベースのトランスポゾンが挙げられる。例えば、全てが参照により本明細書に組み入れられる、Grabundzija et al. Nucleic Acids Res. 41.3(2013):1829-47;およびSingh et al. Cancer Res. 68.8(2008): 2961-2971を参照されたい。例示的なトランスポゼースとしては、Ｔｃ１／マリナー型トランスポゼース、例えばＳＢ１０トランスポゼースまたはＳＢ１１トランスポゼース（例えばサイトメガロウイルスプロモーターから発現させることができる過剰活性化トランスポゼース）が挙げられる。例えば、全てが参照により本明細書に組み入れられるAronovich et al.；Kebriaei et al.；およびGrabundzija et al.を参照されたい。
ＳＢＴＳの使用は、導入遺伝子、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲをコードする核酸の効率的な統合および発現を許容する。例えばＳＢＴＳなどのトランスポゾンシステムを使用して本明細書で説明されるＣＡＲを安定して発現する細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞を生成する方法が本明細書で示される。
本明細書で説明される方法によれば、一部の実施形態において、ＳＢＴＳ構成要素を含有する１つまたは複数の核酸、例えばプラスミドが、細胞（例えば、ＴまたはＮＫ細胞）にデリバリーされる。例えば、核酸は、核酸（例えば、プラスミドＤＮＡ）デリバリーの標準的な方法、例えば本明細書で説明される方法、例えば、エレクトロポレーション、トランスフェクション、またはリポフェクションによってデリバリーされる。一部の実施形態において、核酸は、導入遺伝子、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲをコードする核酸を含むトランスポゾンを含有する。一部の実施形態において、核酸は、導入遺伝子（例えば、本明細書で説明されるＣＡＲをコードする核酸）に加えてトランスポゼース酵素をコードする核酸配列を含むトランスポゾンを含有する。他の実施形態において、２つの核酸を含むシステムが提供され、例えば、二重プラスミドシステム、例えば、第一のプラスミドが導入遺伝子を含むトランスポゾンを含有し、第二のプラスミドがトランスポゼース酵素をコードする核酸配列を含有するシステムが提供される。例えば、第一および第二の核酸は、宿主細胞にともにデリバリーされる。
一部の実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲを発現する細胞、例えば、ＴまたはＮＫ細胞は、ＳＢＴＳを使用した遺伝子挿入と、ヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、または加工されたメガヌクレアーゼを再加工したホーミングエンドヌクレアーゼ）を使用した遺伝学的編集との組合せを使用することによって生成される。
一部の実施形態において、デリバリーの非ウイルス方法の使用は、細胞、例えばＴまたはＮＫ細胞の再プログラミング、および細胞の対象への直接注入を許容する。非ウイルスベクターの利点としては、これらに限定されないが、患者集団を満たすのに必要となる十分な量を生産するのが容易かつ比較的低コストであること、貯蔵中の安定性、および免疫原性の欠如が挙げられる。
ＣＡＲ、例えばＣＤ１９ ＣＡＲ、ＣＤ２０ ＣＡＲまたはＣＤ２２ ＣＡＲ、をコードする核酸コンストラクト
本発明はまた、本明細書で説明される１種または複数のＣＡＲコンストラクト、例えばＣＤ１９ ＣＡＲ、ＣＤ２０ ＣＡＲまたはＣＤ２２ ＣＡＲ、をコードする核酸分子も提供する。一態様において、核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡの転写物として提供される。一態様において、核酸分子は、ＤＮＡコンストラクトとして提供される。
したがって、一態様において、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離された核酸分子であって、前記ＣＡＲが、結合ドメイン（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２に結合する結合ドメイン）、膜貫通ドメイン、ならびに刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、共刺激シグナル伝達ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメイン、例えばゼータ鎖を含む、単離された核酸分子に関する。
一実施形態において、結合ドメインは、本明細書で説明される抗ＣＤ１９結合ドメイン、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号５９からなる群より選択される配列、またはそれらと９５～９９％の同一性を有する配列を含む、抗ＣＤ１９結合ドメインである。
一実施形態において、核酸は、表６Ａに記載の、ＣＤ２２をコードする核酸（CD22-encoding a nucleic acid）、またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、核酸は、表６Ａ～１０Ｂのいずれかに記載のアミノ酸配列またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列をコードする核酸である。
一実施形態において、核酸は、表１１Ａに記載の、ＣＤ２０をコードする核酸（CD22-encoding a nucleic acid）、またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、核酸は、表１１Ａ～１５Ｂのいずれかに記載のアミノ酸配列またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列をコードする核酸である。
一実施形態において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群より選択されるタンパク質の膜貫通ドメインである。一実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号１５の配列、またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、ヒンジ領域、例えば本明細書で説明されるヒンジ領域によって膜貫通ドメインに接続されている。一実施形態において、ヒンジ領域は、配列番号１４もしくは配列番号４５もしくは配列番号４７もしくは配列番号４９、またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、単離された核酸分子は、共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む。一実施形態において、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群より選択されるタンパク質の機能的なシグナル伝達ドメインである。一実施形態において、共刺激ドメインは、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群より選択されるタンパク質の機能的なシグナル伝達ドメインである。一実施形態において、共刺激ドメインは、配列番号１６の配列、またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢの機能的なシグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ゼータの機能的なシグナル伝達ドメインを含む。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１６もしくは配列番号５１の配列、またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列、および配列番号１７もしくは配列番号４３の配列、またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列を含み、前記細胞内シグナル伝達ドメインを構成する前記配列は、同じフレーム内で単一のポリペプチド鎖として発現される。
別の態様において、本発明は、配列番号１３のリーダー配列と、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号５９からなる群より選択される配列（またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列）を有するｓｃＦｖドメインと、配列番号１４もしくは配列番号４５もしくは配列番号４７もしくは配列番号４９（またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列）のヒンジ領域と、配列番号１５の配列（またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列）を有する膜貫通ドメインと、配列番号１６の配列を有する４－１ＢＢ共刺激ドメインまたは配列番号５１の配列（もしくはそれと９５～９９％の同一性を有する配列）を有するＣＤ２７共刺激ドメインと、配列番号１７もしくは配列番号４３の配列（またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列）を有するＣＤ３ゼータ刺激ドメインとを含むＣＡＲコンストラクトをコードする、単離された核酸分子に関する。
別の態様において、本発明は、核酸分子によってコードされた、単離されたポリペプチド分子に関する。一実施形態において、単離されたポリペプチド分子は、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号５９からなる群より選択される配列、またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列を含む。
別の態様において、本発明は、抗ＣＤ１９結合ドメインと、膜貫通ドメインと、刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子をコードする核酸分子であって、前記抗ＣＤ１９結合ドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号５９からなる群より選択される配列、またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列を含む、核酸分子に関する。
一実施形態において、コードされたＣＡＲ分子（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＣＤ２０ ＣＡＲ、またはＣＤ２２ ＣＡＲ）は、共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む。一実施形態において、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群より選択されるタンパク質の機能的なシグナル伝達ドメインである。一実施形態において、共刺激ドメインは、配列番号１６の配列を含む。一実施形態において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群より選択されるタンパク質の膜貫通ドメインである。一実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号１５の配列を含む。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢの機能的なシグナル伝達ドメイン、およびゼータの機能的なシグナル伝達ドメインを含む。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１６の配列および配列番号１７の配列を含み、前記細胞内シグナル伝達ドメインを構成する前記配列は、同じフレーム内で単一のポリペプチド鎖として発現される。一実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、ヒンジ領域によって膜貫通ドメインに接続されている。一実施形態において、ヒンジ領域は、配列番号１４を含む。一実施形態において、ヒンジ領域は、配列番号４５または配列番号４７または配列番号４９を含む。
別の態様において、本発明は、配列番号１３のリーダー配列と、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号５９からなる群より選択される配列またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列を有するｓｃＦｖドメインと、配列番号１４または配列番号４５または配列番号４７または配列番号４９のヒンジ領域と、配列番号１５の配列を有する膜貫通ドメインと、配列番号１６の配列を有する４－１ＢＢ共刺激ドメインまたは配列番号５１の配列を有するＣＤ２７共刺激ドメインと、配列番号１７または配列番号４３の配列を有するＣＤ３ゼータ刺激ドメインとを含むコードされたＣＡＲ分子に関する。一実施形態において、コードされたＣＡＲ分子は、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、および配列番号５９からなる群より選択される配列、またはそれと９５～９９％の同一性を有する配列を含む。
所望の分子をコードする核酸配列は、当業界公知の組換え方法を使用して得ることができ、例えば遺伝子を発現する細胞からのライブラリーをスクリーニングすること、遺伝子それを包含することがわかっているベクターからその遺伝子を抽出すること、またはその遺伝子を含有する細胞および組織から標準的な技術を使用して直接単離することなどによって得ることができる。その代わりに、対象の遺伝子は、クローニングされるのではなく合成的に産生されてもよい。
本発明はまた、本発明のＤＮＡが挿入されるベクターも提供する。レンチウイルスなどのレトロウイルス由来ベクターは、導入遺伝子の長期にわたり安定な統合および娘細胞中でのその増殖を可能にすることから、長期にわたる遺伝子移入を達成するためのツールとして好適である。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖細胞に形質導入することができるという点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルス由来のベクターに勝る追加の利点を有する。またレンチウイルスベクターは、低い免疫原性という追加の利点も有する。またレトロウイルスベクターは、例えば、ガンマレトロウイルスベクターであってもよい。ガンマレトロウイルスベクターは、例えば、プロモーター、パッケージングシグナル（Ψ）、プライマー結合部位（ＰＢＳ）、１つまたは複数の（例えば、２つの）ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）、および目的の導入遺伝子、例えば、ＣＡＲをコードする遺伝子を包含していてもよい。ガンマレトロウイルスベクターは、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖなどのウイルスの構造遺伝子（gens）を欠失していてもよい。例示的なガンマレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）、および骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）、およびそれら由来のベクターが挙げられる。他のガンマレトロウイルスベクターは、例えば、Tobias Maetzig et al., “Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application” Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713で説明されている。
別の実施形態において、本発明の所望のＣＡＲをコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター（Ａ５／３５）である。別の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸の発現は、スリーピングビューティー、ｃｒｉｓｐｒ、ＣＡＳ９、およびジンクフィンガーヌクレアーゼなどのトランスポゾンを使用して達成することができる。以下の、参照により本明細書に組み入れられるJune et al. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716を参照されたい。
ベクターはまた、例えば、分泌を容易にするためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナルおよび転写ターミネーター（例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子からのもの）、エピソームの複製および原核生物における複製を可能にする要素（例えばＳＶ４０オリジンおよびＣｏｌＥ１または当業界において公知の他のもの）ならびに／または選択を可能にする要素（例えば、アンピシリン耐性遺伝子および／またはゼオシンマーカー）を包含していてもよい。
簡単にまとめると、ＣＡＲをコードする天然または合成核酸の発現は、典型的には、ＣＡＲポリペプチドまたはそれらの一部をコードする核酸をプロモーターに機能するように連結して、そのコンストラクトを発現ベクターに取り入れることによって達成される。ベクターは、真核生物の複製および統合に好適であってもよい。典型的なクローニングベクターは、転写および翻訳ターミネーター、開始配列、ならびに所望の核酸配列の発現の調節に有用なプロモーターを含有する。
一部の態様において、発明の発現コンストラクトは、標準的な遺伝子デリバリープロトコールを使用して核酸の免疫化および遺伝子治療にも使用することができる。遺伝子デリバリー方法は、当業界公知である。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる米国特許第５，３９９，３４６号、５，５８０，８５９号、５，５８９，４６６号を参照されたい。別の実施形態において、本発明は、遺伝子治療用ベクターを提供する。
核酸は、多数のタイプのベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸は、これらに限定されないが、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、およびコスミドなどのベクターにクローニングすることができる。特に興味深いベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター（probe generation vector）、および配列決定ベクターが挙げられる。
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に供給されてもよい。ウイルスベクター技術は当業界周知であり、例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NYや他のウイルス学および分子生物学マニュアルで説明されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、これらに限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスが挙げられる。一般的に、好適なベクターは、少なくとも１種の生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、および１つまたは複数の選択マーカーを含有する（例えば、ＷＯ０１／９６５８４；ＷＯ０１／２９０５８；および米国特許第６，３２６，１９３号）。
哺乳動物細胞への遺伝子移入のための多数のウイルスベース系が開発されてきた。例えば、レトロウイルスは、遺伝子デリバリー系に便利なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子を、当業界公知の技術を使用してベクターに挿入し、レトロウイルス粒子中にパッケージ化してもよい。次いで組換えウイルスを単離して、インビボまたはエクスビボのいずれかで対象の細胞にデリバリーしてもよい。多数のレトロウイルス系が当業界公知である。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。多数のアデノウイルスベクターが当業界公知である。一実施形態において、レンチウイルスベクターが使用される。
追加のプロモーター要素、例えばエンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。これらは、典型的には開始部位上流の領域３０～１１０ｂｐに配置されるが、多数のプロモーターが開始部位の下流に同様に機能的な要素を含有することが示されている。要素が互いに逆転または移動したときにプロモーターの機能が保存されるように、プロモーター要素間の間隔はフレキシブルであることが多い。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターにおいて、プロモーター要素間の間隔は、活性が衰退し始める手前の５０ｂｐの間隔まで大きくすることができる。個々の要素は、転写を活性化するために、プロモーターに応じて協調的または独立的のいずれかによって機能する可能性があることが考えられる。典型的なプロモーターとしては、ＣＭＶ ＩＥ遺伝子、ＥＦ－１α、ユビキチンＣ、またはホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが挙げられる。ある実施形態において、プロモーターは、ＰＧＫプロモーター、例えば、本明細書で説明されるトランケートされたＰＧＫプロモーターである。
哺乳動物のＴ細胞においてＣＡＲの導入遺伝子を発現することができるプロモーターの例は、ＥＦ１ａプロモーターである。天然型のＥＦ１ａプロモーターは、アミノアシルｔＲＮＡのリボソームへの酵素によるデリバリーに関与する延長因子－１複合体のアルファサブユニットの発現を駆動する。ＥＦ１ａプロモーターは、哺乳動物の発現プラスミドにおいて広く使用されおり、レンチウイルスベクターにクローニングした導入遺伝子からのＣＡＲ発現の駆動において有効であることが示されてきた。例えば、Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)を参照されたい。一態様において、ＥＦ１ａプロモーターは、配列番号１００として提供される配列を含む。
プロモーターの別の例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに機能するように連結したあらゆるポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強い構成的プロモーター配列である。しかしながら他の構成的プロモーター配列も使用が可能であり、このような構成的プロモーター配列としては、これらに限定されないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン－バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、加えてヒト遺伝子プロモーター、例えば、これらに限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、延長因子－１αプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターなどが挙げられる。さらに本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されないものとする。誘導性プロモーターも、本発明の一部として意図される。誘導性プロモーターの使用は、分子スイッチを提供し、このような分子スイッチは、分子スイッチが機能するように連結したポリヌクレオチド配列の発現が望ましい場合に、そのポリヌクレオチド配列の発現を開始させ、または発現が望ましくない場合に、その発現を停止させることができる。誘導性プロモーターの例としては、これらに限定されないが、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが挙げられる。
プロモーターの別の例は、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターである。実施形態において、トランケートされたＰＧＫプロモーター（例えば、野生型ＰＧＫプロモーター配列と比較した場合、１つまたは複数の、例えば、１、２、５、１０、１００、２００、３００、または４００個のヌクレオチド欠失を有するＰＧＫプロモーター）が望ましい場合がある。例示的なＰＧＫプロモーターのヌクレオチド配列を以下に示す。
ＷＴ ＰＧＫプロモーター：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGGCCTTGGTGCGGGTCTCGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCGACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGCACCATAAGCT
（配列番号１３２３）
例示的なトランケートされたＰＧＫプロモーター：
ＰＧＫ１００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTG
（配列番号１３２４）
ＰＧＫ２００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACG
（配列番号１３２５）
ＰＧＫ３００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCG
（配列番号１３２６）
ＰＧＫ４００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG
（配列番号１３２７）
ベクターはまた、例えば、分泌を容易にするためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナルおよび転写ターミネーター（例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子からの）、エピソームの複製および原核生物における複製を可能にする要素（例えばＳＶ４０オリジンおよびＣｏｌＥ１または当業界において公知の他のもの）ならびに／または選択を可能にする要素（例えば、アンピシリン耐性遺伝子および／またはゼオシンマーカー）を包含していてもよい。
ＣＡＲポリペプチドまたはそれらの一部の発現を検討するために、細胞に導入しようとする発現ベクターはまた、ウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染させたようとする細胞の集団から発現する細胞を同定および選択しやすくするために、選択マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子のいずれかまたはその両方を含有していてもよい。他の態様において、選択マーカーは、ＤＮＡの別の断片に搭載させてコトランスフェクション手法で使用されてもよい。選択マーカーおよびレポーター遺伝子はどちらも、宿主細胞で発現できるように適切な調節配列を端部に有していてもよい。有用な選択マーカーとしては、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子および同種のものが挙げられる。
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされる可能性がある細胞を同定するために、さらには調節配列の機能性を評価するために使用することができる。一般的に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織に存在しないかまたはそれらによって発現されない遺伝子であり、さらに、その発現がいくつかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性によって証明されるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエントの細胞に導入された後の好適な時間にアッセイされる。好適なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子を挙げることができる（例えば、Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82）。好適な発現系は周知であり、公知の技術を使用して調製してもよいし、または商業的に入手してもよい。一般的に、レポーター遺伝子の最大レベルの発現を示す最小の５’フランキング領域を有するコンストラクトは、プロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結されて、プロモーターによって駆動された転写を調整する能力に関して薬剤を評価するために使用することができる。
実施形態において、ベクターは、ＣＡＲ、例えば、ＣＤ１９と結合する第一のＣＡＲ、および第二のＣＡＲ、例えば、阻害性ＣＡＲ、または第二の抗原、例えばＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａと特異的に結合するＣＡＲをコードする、２つ以上の核酸配列を含んでいてもよい。このような実施形態において、ＣＡＲをコードする２つ以上の核酸配列は、同じフレーム中で単一のポリペプチド鎖として単一の核酸分子によってコードされる。この態様において、２つ以上のＣＡＲは、例えば、１つまたは複数のペプチド切断部位（例えば、自動切断部位または細胞内プロテアーゼの基質）によって分離していてもよい。ペプチド切断部位の例としては、以下が挙げられ、ここでＧＳＧ残基は任意である：
Ｔ２Ａ：(GSG) E G R G S L L T C G D V E E N P G P（配列番号１３２８）
Ｐ２Ａ：(GSG) A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P（配列番号１３２９）
Ｅ２Ａ：(GSG) Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P（配列番号１３３０）
Ｆ２Ａ：(GSG) V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P（配列番号１３３１）
遺伝子を細胞に導入して発現させる方法は当業界公知である。発現ベクターの場合において、ベクターは、当業界におけるあらゆる方法によって宿主細胞、例えば哺乳動物、細菌、酵母、または昆虫細胞に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、または生物学的な手段によって宿主細胞に移入させることができる。
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する物理的な方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、および同種のものが挙げられる。ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を産生する方法は当業界周知である。例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NYを参照されたい。宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する好適な方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
宿主細胞に対象のポリヌクレオチドを導入する生物学的な方法としては、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用が挙げられる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えばヒト細胞に遺伝子を挿入するための最も広く使用されている方法になりつつある。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純疱疹ウイルスＩ、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス、ならびに同種のもの由来のものであってもよい。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号および５，５８５，３６２号を参照されたい。
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための化学的手段としては、例えば高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームなどの脂質ベースの系が挙げられる。インビトロおよびインビボでのデリバリービヒクルとして使用するための典型的なコロイド系は、リポソーム（例えば人工膜小胞）である。最先端の核酸の標的化デリバリーの他の方法が利用可能であり、例えば、標的化ナノ粒子を用いたポリヌクレオチドのデリバリー、または他の好適なサブミクロンサイズのデリバリーシステムなどが挙げられる。
非ウイルスデリバリーシステムが利用されるケースにおいて、典型的なデリバリービヒクルは、リポソームである。脂質調合物の使用は、宿主細胞への核酸の導入（インビトロ、エクスビボまたはインビボ）を意図している。別の態様において、核酸は、脂質と会合していてもよい。脂質に会合した核酸は、リポソームの水性の内部に封入されていてもよいし、リポソームの脂質二重層内に点在させてもよいし、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方と会合する連結分子を介してリポソームに付着していてもよいし、リポソーム中に閉じ込められていてもよいし、リポソームと複合体化していてもよいし、脂質を含有する溶液中に分散されていてもよいし、脂質と混合されてもよいし、脂質と組み合わされていてもよいし、脂質中の懸濁液として含有されてもよいし、ミセルとともに含有されるかもしくはミセルと複合体化していてもよいし、またはそれ以外の方法で脂質と会合していてもよい。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクターが会合した組成物は、溶液中におけるいかなる特定の構造にも限定されない。例えば、上記組成物は、二重層構造で、ミセルとして、または「崩壊した」構造で存在していてもよい。また上記組成物は、単に溶液中に点在した状態であってもよく、サイズまたは形状が均一でない凝集体を形成する可能性もある。脂質は、天然に存在する可能性がある脂肪性の物質であるか、または合成脂質である。例えば、脂質としては、細胞質中で自然に発生する脂肪の小滴、加えて長鎖脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体、例えば脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、ならびにアルデヒドなどを含有する化合物のクラスが挙げられる。
使用に好適な脂質は、商業的な供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから得ることができ、リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）は、Ｋ＆Ｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ）から得ることができ、コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｂｅｈｒｉｎｇから得ることができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）から得ることができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質のストック溶液は、約－２０℃で保存することができる。クロロホルムは、メタノールより容易に蒸発するため、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」は、封入された脂質二重層または凝集体の生成によって形成された様々な単層および多層の脂質ビヒクル（lipid vehicles）を包括する一般名称である。リポソームは、リン脂質二重層膜と内部の水性媒体とを有する小胞構造を有することを特徴とすることができる。多重膜リポソームは、水性媒体によって隔てられた複数の脂質層を有する。これらは、リン脂質が過量の水溶液中に懸濁されると自発的に形成される。脂質成分は、閉じた構造が形成される前に自己再構成を経て、水を閉じ込め、脂質二重層の間に溶質を溶解させる（Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10）。しかしながら、溶液中で通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物も包括される。例えば、脂質は、ミセル構造であると推定することができ、または単に脂質分子の不均一な凝集体として存在する可能性もある。また、リポフェクトアミン－核酸複合体も考慮される。
宿主細胞に外因性核酸を導入するのに使用される方法、またはそれとは別に細胞を本発明の阻害剤に晒す方法にかかわらず、宿主細胞中の組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために様々なアッセイを行うことができる。このようなアッセイとしては、例えば、当業者周知の「分子生物学的な」アッセイ、例えばサザンおよびノーザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲ；「生化学的な」アッセイ、例えば、免疫学的な手段（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット）による、または本発明の範囲内に含まれる薬剤を同定するための本明細書で説明されるアッセイによる、特定のペプチドの存在または非存在の検出などが挙げられる。
本発明はさらに、ＣＡＲをコードする核酸分子を含むベクターを提供する。一態様において、ＣＡＲベクターは、細胞、例えばＴ細胞に直接形質導入することができる。一態様において、ベクターは、クローニングまたは発現ベクターであり、例えば、これらに限定されないが、１つまたは複数のプラスミド（例えば、発現プラスミド、クローニングベクター、ミニサークル、ミニベクター、二重微小染色体）、レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターコンストラクトなどのベクターである。一態様において、ベクターは、哺乳動物のＴ細胞中でＣＡＲコンストラクトを発現することができる。一態様において、哺乳動物Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞である。
ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞
別の態様において、本発明は、ＣＡＲ発現細胞の集団を提供する。一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、本明細書で説明される１つまたは複数のＣＡＲを発現する細胞を含む。一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、異なるＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む。
例えば、一実施形態において、ＣＡＲＴ細胞の集団は、本明細書で説明される腫瘍抗原、例えばＣＤ１９、に対する抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第一の細胞、および異なる抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第二の細胞であって、例えば、本明細書で説明される異なる腫瘍抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、第一の細胞によって発現されるＣＡＲの抗原結合ドメインによって結合される腫瘍抗原とは異なる本明細書で説明される腫瘍抗原、例えばＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａに対する抗原結合ドメイン、を有するＣＡＲを発現する第二の細胞を包含し得る。
別の例として、ＣＡＲ発現細胞の集団は、本明細書で説明される腫瘍抗原に対する抗原結合ドメインを包含するＣＡＲを発現する第一の細胞、および本明細書で説明されるような腫瘍抗原以外の標的に対する抗原結合ドメインを包含するＣＡＲを発現する第二の細胞を包含し得る。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを包含するＣＡＲを発現する第一の細胞、および二次シグナル伝達ドメインを包含するＣＡＲを発現する第二の細胞を包含する。前記ＣＡＲ発現細胞のいずれか一方または両方は、ＣＡＲをコードする核酸に機能するように連結した、例えば本明細書で説明されるような、トランケートされたＰＧＫプロモーターを有してもよい。
別の態様において、本発明は、集団中の少なくとも１種の細胞が、本明細書で説明される腫瘍抗原に対する抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現し、第二の細胞が、別の薬剤、例えばＣＡＲを発現する細胞の活性を増強する薬剤を発現する、細胞の集団を提供する。集団のＣＡＲ発現細胞は、ＣＡＲをコードする核酸に機能するように連結した、例えば本明細書で説明されるような、トランケートされたＰＧＫプロモーターを有してもよい。一実施形態において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であってもよい。阻害分子、例えばＰＤ－１は、一部の実施形態において、免疫エフェクター応答を開始するＣＡＲ発現細胞の能力を低下させることができる。阻害分子の例としては、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、およびＴＧＦＲ（例えば、ＴＧＦＲベータ）が挙げられる。一実施形態において、阻害分子を阻害する薬剤は、第一のポリペプチド、例えば阻害分子を含み、このようなポリペプチドは、細胞に正のシグナルを提供する第二のポリペプチド、例えば、本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメインと会合している。一実施形態において、薬剤は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３および／もしくはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４もしくはＴＧＦＲベータなどの阻害分子の第一のポリペプチド、またはこれらのいずれかのフラグメント、ならびに本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメインである［例えば、共刺激ドメイン（例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７、ＯＸ４０またはＣＤ２８、例えば、本明細書で説明されているようなもの）および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で説明されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）を含む］第二のポリペプチドを含む。一実施形態において、薬剤は、ＰＤ－１の第一のポリペプチドまたはそのフラグメント、および本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で説明されるＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／または本明細書で説明されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）の第二のポリペプチドを含む。
ＣＡＲと他の分子または薬剤の共発現
第二のＣＡＲの共発現
一態様において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞は、第二のＣＡＲ、例を挙げると、例えば同じ標的（ＣＤ１９）または異なる標的（例えば、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂもしくはＣＤ７９ａ）に対する、異なる抗原結合ドメインを包含する第二のＣＡＲをさらに含んでいてもよい。一実施形態において、第二のＣＡＲは、急性骨髄性白血病細胞上で発現される標的、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、ＣＤ１０、ＣＤ３３、ＣＬＬ－１、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ３、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ７９ａに対する抗原結合ドメインを包含する。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、第一の抗原を標的とし、共刺激シグナル伝達ドメインを有するが一次シグナル伝達ドメインを有さない細胞内シグナル伝達ドメインを包含する第一のＣＡＲ、および第二の異なる抗原を標的とし、一次シグナル伝達ドメインを有するが共刺激シグナル伝達ドメインを有さない細胞内シグナル伝達ドメインを包含する第二のＣＡＲを含む。理論に縛られることは望まないが、第一のＣＡＲにおける、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、またはＯＸ－４０、および第二のＣＡＲにおける、一次シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ゼータの設置は、両方の標的が発現される細胞に対するＣＡＲ活性を制限することができる。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ１９結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激ドメインを包含する第一のＣＤ１９ ＣＡＲ、ならびにＣＤ１９以外の抗原（例えば、ＡＭＬ細胞上で発現される抗原、例えば、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＲＯＲ１、ＣＤ１０、ＣＤ３３、ＣＬＬ－１、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、もしくはＣＤ７９ａ）を標的とし、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを包含する第二のＣＡＲを含む。別の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ１９結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを包含する第一のＣＤ１９ ＣＡＲ、ならびにＣＤ１９以外の抗原（例えば、ＡＭＬ細胞上で発現される抗原、例えば、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＲＯＲ１、ＣＤ１０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＬＬ－１、ＣＤ３４、ＦＬＴ３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、もしくはＣＤ７９ａ）を標的とし、抗原に対する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを包含する第二のＣＡＲを含む。
一態様において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞は、第二のＣＡＲ、例を挙げると、例えば同じ標的（例えば、ＣＤ１９）または異なる標的（例えば、ＣＤ１９以外の標的、例えばＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂもしくはＣＤ７９ａ）に対する、異なる抗原結合ドメインを包含する第二のＣＡＲをさらに含んでいてもよい。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、第一の抗原を標的する第一のＣＡＲであって、共刺激シグナル伝達ドメインを有するが一次シグナル伝達ドメインを有さない細胞内シグナル伝達ドメインを包含する第一のＣＡＲと、第二の異なる抗原を標的とする第二のＣＡＲであって、一次シグナル伝達ドメインを有するが共刺激シグナル伝達ドメインを有さない細胞内シグナル伝達ドメインを含有する第二のＣＡＲとを含む。第一のＣＡＲへの共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ－４０、もしくはＩＣＯＳの配置、および第二のＣＡＲへの一次シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ゼータの配置は、両方の標的が発現される細胞に対するＣＡＲ活性を制限し得る。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激ドメインを包含する第一のＣＡＲと、別の抗原を標的とし、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを包含する第二のＣＡＲとを含む。別の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを包含する第一のＣＡＲと、別の抗原を標的とし、抗原に対する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを包含する第二のＣＡＲとを含む。
一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、本明細書で説明されるＸＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＣＤ２０ ＣＡＲ、またはＣＤ２２ ＣＡＲ）、および阻害性ＣＡＲを含む。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、本明細書で説明されるＣＤ１９ ＣＡＲ、および阻害性ＣＡＲを含む。一実施形態において、阻害性ＣＡＲは、がん細胞ではなく正常細胞、例えば、ＣＤ１９も発現する正常細胞上で見出すことができる抗原に結合する抗原結合ドメインを含む。一実施形態において、阻害性ＣＡＲは、阻害分子の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む。例えば、阻害性ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、およびＴＧＦＲ（例えばＴＧＦＲベータ）の細胞内ドメインであってもよい。
一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞が２種以上の異なるＣＡＲを含む場合、異なるＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインが互いに相互作用しないようになっていてもよい。例えば、第一および第二のＣＡＲを発現する細胞は、例えばフラグメント、例えばｓｃＦｖとして、第二のＣＡＲの抗原結合ドメインとの会合を形成しない第一のＣＡＲの抗原結合ドメインを有していてもよく、例えば、第二のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＶＨＨである。
ＣＡＲ活性を増強する薬剤の共発現
別の態様において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞は、別の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強するまたは適合度を向上させる薬剤をさらに発現することができる。
例えば、一実施形態において、薬剤は、Ｔ細胞機能をモジュレートまたは調節する、例えば阻害する分子を阻害する薬剤であってもよい。一部の実施形態において、Ｔ細胞機能をモジュレートまたは調節する分子は、阻害分子である。いくつかの実施形態において、阻害分子、例えばＰＤ１は、免疫エフェクター応答を仕掛けるＣＡＲ発現細胞の能力を減少させることができる。阻害分子の例としては、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、およびＴＧＦＲ（例えばＴＧＦＲベータ）が挙げられる。
一実施形態において、阻害核酸、例えば、例えば本明細書で説明されるような、阻害核酸、例えばｄｓＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ、クラスター化規則的間隔短鎖回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ＣＡＲ発現細胞におけるＴ細胞の機能をモジュレートまたは調節する、例えば阻害する分子の発現を阻害するために使用することができる。ある実施形態において、薬剤は、ｓｈＲＮＡ、例えば本明細書で説明されるｓｈＲＮＡである。ある実施形態において、Ｔ細胞の機能をモジュレートまたは調節する、例えば阻害する薬剤は、ＣＡＲ発現細胞内で阻害される。例えば、Ｔ細胞の機能をモジュレートまたは調節する、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子は、ＣＡＲの構成要素、例えば構成要素の全て、をコードする核酸に連結される。
一実施形態において、阻害分子を阻害する薬剤は、第一のポリペプチド、例えば阻害分子を含み、このようなポリペプチドは、細胞に正のシグナルを提供する第二のポリペプチド、例えば、本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメインと会合している。一実施形態において、薬剤は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、またはＴＧＦＲ（例えばＴＧＦＲベータ）、またはこれらのいずれかのフラグメント（例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部）などの阻害分子の第一のポリペプチド、ならびに本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメインである［例えば、共刺激ドメイン（例えば、本明細書で説明されるような４１ＢＢ、ＣＤ２７、またはＣＤ２８）および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で説明されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む］第二のポリペプチドを含む。ＰＤ１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、およびＢＴＬＡも包含するＣＤ２８受容体ファミリーの阻害性の一員である。ＰＤ－１は、活性化されたＢ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞で発現される（Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75）。ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２に対する２つのリガンドは、ＰＤ１に結合したときのＴ細胞の活性化を下方調節することが示されている（Freeman et a. 2000 J Exp Med 192:1027-34；Latchman et al.2001 Nat Immunol 2:261-8； Carter et al.2002 Eur J Immunol 32:634-43）。ＰＤ－Ｌ１は、ヒトがんにおいて豊富である（Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7；Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314；Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094）。免疫抑制は、ＰＤ１とＰＤ－Ｌ１との局所的な相互作用を阻害することによって、回復させることができる。
一実施形態において、薬剤は、阻害分子、例えばプログラム死１（ＰＤ１：Programmed Death 1）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、４１ＢＢおよびＣＤ３ゼータなどの膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインに融合させることができる（また本明細書では、ＰＤ１ＣＡＲとも称される）。一実施形態において、ＰＤ１ ＣＡＲは、本明細書で説明されるＣＤ１９ ＣＡＲと組み合わせて使用される場合、Ｔ細胞の持続性を向上させる。一実施形態において、ＣＡＲは、配列番号１２１において下線で示されたＰＤ１の細胞外ドメインを含むＰＤ１ ＣＡＲである。一実施形態において、ＰＤ１ ＣＡＲは、配列番号１２１のアミノ酸配列を含む。
Malpvtalllplalllhaarppgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号１２１）。
一実施形態において、ＰＤ１ ＣＡＲは、以下に示されるアミノ酸配列（配列番号１１９）を含む。
pgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号１１９）。
一実施形態において、薬剤は、ＰＤ１ ＣＡＲ、例えば本明細書で説明されるＰＤ１ ＣＡＲをコードする核酸配列を含む。一実施形態において、ＰＤ１ ＣＡＲに関する核酸配列は、以下に示され、ＰＤ１ ＥＣＤは、以下の配列番号１２０において下線で示される。
atggccctccctgtcactgccctgcttctccccctcgcactcctgctccacgccgctagaccacccggatggtttctggactctccggatcgcccgtggaatcccccaaccttctcaccggcactcttggttgtgactgagggcgataatgcgaccttcacgtgctcgttctccaacacctccgaatcattcgtgctgaactggtaccgcatgagcccgtcaaaccagaccgacaagctcgccgcgtttccggaagatcggtcgcaaccgggacaggattgtcggttccgcgtgactcaactgccgaatggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaacgactccgggacctacctgtgcggagccatctcgctggcgcctaaggcccaaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgaccgagcgcagagctgaggtgccaactgcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtcacgaccactccggcgccgcgcccaccgactccggccccaactatcgcgagccagcccctgtcgctgaggccggaagcatgccgccctgccgccggaggtgctgtgcatacccggggattggacttcgcatgcgacatctacatttgggctcctctcgccggaacttgtggcgtgctccttctgtccctggtcatcaccctgtactgcaagcggggtcggaaaaagcttctgtacattttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcaaaccacccaggaggaggacggttgctcctgccggttccccgaagaggaagaaggaggttgcgagctgcgcgtgaagttctcccggagcgccgacgcccccgcctataagcagggccagaaccagctgtacaacgaactgaacctgggacggcgggaagagtacgatgtgctggacaagcggcgcggccgggaccccgaaatgggcgggaagcctagaagaaagaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctactccgaaattgggatgaagggagagcggcggaggggaaaggggcacgacggcctgtaccaaggactgtccaccgccaccaaggacacatacgatgccctgcacatgcaggcccttccccctcgc（配列番号１２０）。
別の例では、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、共刺激分子または共刺激分子リガンドであってもよい。共刺激分子の例としては、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡおよびＴｏｌｌリガンド受容体、ならびにＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）が挙げられる。このような共刺激分子のさらなる例としては、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、例えば本明細書で説明されるようなものが挙げられる。共刺激分子リガンドの例としては、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬおよびＩＬＧＨＴが挙げられる。実施形態において、共刺激分子リガンドは、ＣＡＲの共刺激分子ドメインとは異なる共刺激分子のリガンドである。実施形態において、共刺激分子リガンドは、ＣＡＲの共刺激分子ドメインと同じである、共刺激分子のリガンドである。ある実施形態において、共刺激分子リガンドは、４－１ＢＢＬである。ある実施形態において、共刺激リガンドは、ＣＤ８０またはＣＤ８６である。ある実施形態において、共刺激分子リガンドは、ＣＤ７０である。実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、１つまたは複数の追加の共刺激分子または共刺激分子リガンドを発現するようにさらに加工され得る。
ＣＡＲとケモカイン受容体の共発現
実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞は、ケモカイン受容体分子をさらに含む。Ｔ細胞におけるケモカイン受容体ＣＣＲ２ｂまたはＣＸＣＲ２のトランスジェニック発現は、黒色腫および神経芽細胞腫を包含するＣＣＬ２分泌またはＣＸＣＬ１分泌固形腫瘍へのトラフィッキングを増進する［Craddock et al., J Immunother.2010 Oct；33(8):780-8およびKershaw et al., Hum Gene Ther.2002 Nov 1；13(16):1971-80］。したがって、理論に縛られることは望まないが、腫瘍、例えば固形腫瘍によって分泌されるケモカインを認識するＣＡＲ発現細胞において発現されるケモカイン受容体は、ＣＡＲ発現細胞の腫瘍へのホーミングを向上させ、ＣＡＲ発現細胞の腫瘍への浸潤を助長し、ＣＡＲ発現細胞の抗腫瘍効能を増強すると考えられる。ケモカイン受容体分子は、天然に存在するケモカイン受容体もしくは組換えケモカイン受容体またはそれらのケモカイン結合フラグメントを含んでいてもよい。本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞における発現に好適なケモカイン受容体分子としては、ＣＸＣケモカイン受容体（例えば、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６もしくはＣＸＣＲ７）、ＣＣケモカイン受容体（例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０もしくはＣＣＲ１１）、ＣＸ３Ｃケモカイン受容体（例えば、ＣＸ３ＣＲ１）、ＸＣケモカイン受容体（例えば、ＸＣＲ１）、またはそれらのケモカイン結合フラグメントが挙げられる。一実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲとともに発現されるケモカイン受容体分子は、腫瘍によって分泌されるケモカインに基づいて選択される。一実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞は、ＣＣＲ２ｂ受容体またはＣＸＣＲ２受容体をさらに含む、例えば発現する。ある実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ、およびケモカイン受容体分子は、同じベクター上にあるか、または２つの異なるベクター上にある。本明細書で説明されるＣＡＲ、およびケモカイン受容体分子が、同じベクター上にある実施形態において、前記ＣＡＲおよびケモカイン受容体分子は、各々が２つの異なるプロモーターの制御下にあるか、または同じプロモーターの制御下にある。
免疫応答増強剤の条件付き発現（conditional expression）
本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞の免疫応答または活性を増強する薬剤を条件付きで発現させるための組成物および方法も、本明細書において提供する。
一態様において、本開示は、本明細書では非条件付きＣＡＲとも称される、ＣＡＲを構成的に発現するように加工されている免疫エフェクター細胞を特徴とする。一実施形態において、本明細書で説明されるような非条件付きＣＡＲは、がん関連抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１と結合する抗原結合ドメインを含む。実施形態において、非条件付きＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の治療の効能、例えば免疫応答を増強する、条件付きで発現される薬剤をさらに含む。このような実施形態において、条件付きで発現される薬剤の発現は、非条件付きＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の活性化直後に、例えば、非条件付きＣＡＲ分子のその標的、例えばがん関連抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１への結合直後に起こる。
本明細書で説明されるような免疫応答増進剤は、次の１つまたは複数を特徴とし得る：１）非条件付きＣＡＲによって標的にされるものとは異なるがん関連抗原を標的とするか、もしくはそれと結合する；２）免疫チェックポイントもしくは阻害分子の発現もしくは活性を阻害する；ならびに／または３）免疫エフェクター細胞の免疫応答もしくは活性化を増強する構成要素の発現および／もしくは分泌を活性化する。免疫応答増強剤は、ポリペプチドであってもよく、または核酸、例えば、免疫応答を増強するポリペプチドをコードする核酸であってもよい。免疫応答を増進する、条件付きで発現される薬剤の例としては、追加のＣＡＲ（条件付きＣＡＲと称される）；ＴＣＲベースの分子（例えば、ＴＣＲ－ＣＡＲ）；免疫チェックポイントもしくは阻害分子の阻害剤；および／またはサイトカインが挙げられるが、これらに限定されない。実施形態において、条件付きＣＡＲは、非条件付きＣＡＲによって標的にされるものとは異なるがん関連抗原と結合する。実施形態において、本明細書で説明される免疫チェックポイントまたは阻害分子の阻害剤は、抗体またはその抗原結合フラグメント；阻害核酸（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）；あるいはＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３および／もしくはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４もしくはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシンまたはＴＧＦＲベータから選択される免疫チェックポイントもしくは阻害分子の活性を阻害するか、またはそれを低下させる小分子である。実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５もしくはＩＬ－２１、またはそれらの機能的なフラグメントもしくは誘導体を含む。
実施形態において、免疫エフェクター細胞は、非条件付きＣＡＲおよび１つまたは複数の条件付きＣＡＲを含み、前記条件付きＣＡＲは、非条件付きＣＡＲによって標的にされるものとは異なるがん関連抗原と結合する。例として、一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ＣＤ１９と結合する非条件付きＣＡＲ、およびＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３もしくはＲＯＲ１またはこれらの組合せと結合する１つまたは複数の条件付きＣＡＲを含む。別の実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１と結合する非条件付きＣＡＲ、およびＣＤ１９と結合する条件付きＣＡＲを含む。
ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の活性化直後に免疫応答を増強する薬剤の条件付き発現は、免疫応答（例えば、このような薬剤をコードする核酸配列への応答）を増強する薬剤に活性化条件付き制御領域を機能するように連結させることによって達成される。一実施形態において、活性化条件付き制御領域は、機能するように連結した免疫応答増強剤の発現、例えば転写、を免疫エフェクター細胞の活性化直後に開始させるプロモーター配列を含む。一実施形態において、活性化条件付き制御領域は、免疫エフェクター細胞の活性化直後の発現開始を助長する１つまたは複数の調節配列（例えば、転写因子結合配列または部位）を含む。実施形態において、活性化条件付き制御領域は、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）活性化、Ｔ細胞分化、Ｔ細胞極性化またはヘルパーＴ細胞発生の１つまたは複数の直後に上方調節される遺伝子のプロモーター配列、および／または、そのような遺伝子のプロモーターもしくは調節配列からの１つもしくは複数の転写因子結合配列を含む。このような遺伝子の例としては、ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞核内因子）、ＡＴＦ２（活性化転写因子２）、ＮＦ－κＢ（核内因子－κＢ）、ＩＬ－２、ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）、ＩＬ－３、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１０およびＩＦＮ－γが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、活性化条件付き制御領域は、１つまたは複数、例えば１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ以上のＮＦＡＴ結合配列または部位を含む。実施形態において、プロモーター内のＮＦＡＴ結合配列は、（５’－ＧＧＡＡＡ－３’）（配列番号１３１２）を含み、これは、５’（Ａ／Ｔ）ＧＧＡＡＡ（Ａ／Ｎ）（Ａ／Ｔ／Ｃ）Ｎ ３’（配列番号１３１３）のより長いコンセンサス配列中に位置していてもよい。実施形態において、ＮＦＡＴ結合配列は、ＧＧＧＡＣＴ（配列番号１３１４）などのκｂ様配列である。（Gibson et al., The Journal of Immunology, 2007, 179: 3831-3840を参照されたい）。
一実施形態において、活性化条件付き制御領域は、ＩＬ－２プロモーター（もしくは最小ＩＬ－２プロモーター）、ＩＬ－２Ｒプロモーター、ＡＴＦ２プロモーターもしくはＮＦ－κＢプロモーター、またはこれらのいずれかの機能的なフラグメントもしくは誘導体をさらに含む。一実施形態において、活性化条件付き制御領域は、１つまたは複数のＮＦＡＴ結合配列、例えば、３つまたは６つのＮＦＡＴ結合配列、およびＩＬ－２プロモーター、例えばＩＬ－２最小プロモーターを含む。一実施形態において、活性化条件付き制御領域は、AGCTTGGATCCAAGAGGAAAATTTGTTTCATACAGAAGGCGTTAAGAGGAAAATTTGTTTCATACAGAAGGCGTTAAGAGGAAAATTTGTTTCATACAGAAGGCGTTCAAGCTTGTCGAC（配列番号１３１５）の配列を含む。
細胞源
拡大および遺伝子改変または他の改変の前に、細胞源、例えば、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞源を対象から得ることができる。対象の例としては、ヒト、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が挙げられる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸膜滲出、脾臓組織、および腫瘍などの多数の源から得ることができる。
本開示の所定の態様において、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）セパレーションなどの当業者公知の多数の技術を使用して対象から収集された血液のユニットから得ることができる。一態様において、個体の循環血液からの細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞などのリンパ球、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核の白血球、赤血球、および血小板を含有する。一態様において、アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して血漿画分を除去し、それに続く処理工程のために細胞を適切な緩衝液または培地中に適宜、置くことができる。一実施形態において、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。代替の実施形態において、洗浄溶液はカルシウムを含まず、マグネシウムを含んでいなくもよく、または２価カチオンの全てとはいかないまでもその多くを含んでいなくてもよい。
カルシウムの非存在下における初期の活性化工程により、活性化を増大させることができる。当業者であれば容易に認識するものと予想されるが、洗浄工程は、当業者公知の方法によって、例えば半自動の「流水式」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１細胞処理装置、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ ５）を製造元の説明書に従って使用することによって達成されてもよい。洗浄後、細胞は、様々な生体適合性緩衝液、例えばＣａ非含有、Ｍｇ非含有ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａなど、または他の緩衝液含有または非含有食塩水に再懸濁されもよい。その代わりに、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁させてもよい。
適用方法は、５％またはそれ未満、例えば２％のヒトＡＢ血清を含む培養培地条件を利用でき、公知の培養培地条件および組成、例えばSmith et al., “Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement” Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31で説明されるものを採用できることが認識されている。
一態様において、Ｔ細胞は、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）の勾配を介した遠心分離によって、または対向流遠心溶出法によって赤血球を溶解させ単球を枯渇させることにより末梢血リンパ球から単離される。
本明細書で説明される方法は、例えば陰性選択技術、例えば本明細書で説明される陰性選択技術を使用する、免疫エフェクター細胞の特定の部分集団、例えば、調節性Ｔ細胞枯渇集団、ＣＤ２５＋細胞枯渇集団であるＴ細胞の選択を包含していてもよい。一部の実施形態において、調節性Ｔ細胞枯渇集団は、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含有する。
一実施形態において、調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ２５抗体、もしくはそれらのフラグメント、またはＣＤ２５結合リガンド、ＩＬ－２を使用して集団から除去される。一実施形態において、抗ＣＤ２５抗体、もしくはそれらのフラグメント、またはＣＤ２５結合リガンドは、基質、例えばビーズにコンジュゲートされているか、または別の方法で基質、例えばビーズ上にコーティングされている。一実施形態において、抗ＣＤ２５抗体、またはそれらのフラグメントは、本明細書で説明される基質にコンジュゲートされている。
一実施形態において、調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋Ｔ細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ（商標）からのＣＤ２５枯渇試薬を使用して、集団から除去される。一実施形態において、ＣＤ２５枯渇試薬に対する細胞の比率は、２０μＬに対して細胞１×１０７個、または１５μＬに対して細胞１×１０７個、または１０μＬに対して細胞１×１０７個、または５μＬに対して細胞１×１０７個、または２．５μＬに対して細胞１×１０７個、または１．２５μＬに対して細胞１×１０７個である。一実施形態において、例えば調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋枯渇の場合、細胞５億個／ｍｌより多くが使用される。さらなる態様において、細胞６億、７億、８億、または９億個／ｍｌの細胞濃度が使用される。
一実施形態において、枯渇させる免疫エフェクター細胞の集団は、約６×１０９個のＣＤ２５＋Ｔ細胞を包含する。他の態様において、枯渇させる免疫エフェクター細胞の集団は、約１×１０９から１×１０１０個、およびその間のあらゆる整数値のＣＤ２５＋Ｔ細胞を包含する。一実施形態において、結果得られた調節性Ｔ細胞枯渇集団は、２×１０９個またはそれ未満の調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋細胞（例えば、１×１０９、５×１０８、１×１０８、５×１０７、１×１０７個、またはそれ未満のＣＤ２５＋細胞）を有する。
一実施形態において、調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋細胞は、ＣｌｉｎｉＭＡＣシステムを例えばチュービング１６２－０１などの枯渇チュービングセットとともに使用して、集団から除去される。一実施形態において、ＣｌｉｎｉＭＡＣシステムは、例えばＤＥＰＬＥＴＩＯＮ２．１などの枯渇設定で実行される。
特定の理論に縛られることは望まないが、アフェレーシスの前の対象において、またはＣＡＲを発現する細胞生成物の製造中に、免疫細胞の負の調節因子のレベルを減少させること（例えば、不要な免疫細胞、例えばＴＲＥＧ細胞の数を減少させること）は、対象の再発リスクを有意に低減させることができる。例えば、ＴＲＥＧ細胞を枯渇させる方法は、当業界公知である。ＴＲＥＧ細胞を減少させる方法としては、これらに限定されないが、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体（本明細書で説明される抗ＧＩＴＲ抗体）、ＣＤ２５枯渇、ｍＴＯＲ阻害剤、およびそれらの組合せが挙げられる。
一部の実施形態において、製造方法は、ＣＡＲを発現する細胞の製造前に、ＴＲＥＧ細胞の数を低減させること（例えば、枯渇させること）を含む。例えば、製造方法は、例えば、ＣＡＲを発現する細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）生成物の製造前にＴＲＥＧ細胞を枯渇させるために、試料、例えばアフェレーシス試料を、抗ＧＩＴＲ抗体および／もしくは抗ＣＤ２５抗体（もしくはそれらのフラグメント、またはＣＤ２５結合リガンド）と接触させることを含む。
特定の理論に縛られることは望まないが、対象においてアフェレーシスの前にまたはＣＡＲを発現する細胞生成物の製造中に免疫細胞の負の調節因子のレベルを減少させること（例えば、不要な免疫細胞、例えばＴＲＥＧ細胞の数を減少させること）は、ＴＲＥＧ再発リスクを低減させることができる。ある実施形態において、対象は、ＣＡＲを発現する細胞生成物の製造のために細胞を収集する前に、ＴＲＥＧ細胞を低減させる１つまたは複数の療法で前処置され、それによって対象がＣＡＲを発現する細胞の処置に戻るリスクを低減させる。ある実施形態において、ＴＲＥＧ細胞を減少させる方法としては、これらに限定されないが、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇の１つまたは複数、またはそれらの組合せを対象に投与することが挙げられる。ある実施形態において、ＴＲＥＧ細胞を減少させる方法としては、これらに限定されないが、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇、ｍＴＯＲ阻害剤の１つまたは複数、またはそれらの組合せを対象に投与することが挙げられる。シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５－枯渇の１つまたは複数、またはそれらの組合せの投与は、ＣＡＲを発現する細胞生成物の注入の前に、その間に、またはその後に行うことができる。シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇、ｍＴＯＲ阻害剤の１つまたは複数、またはそれらの組合せの投与は、ＣＡＲを発現する細胞生成物の注入の前に、その間に、またはその後に行うことができる。
一部の実施形態において、製造方法は、ＣＡＲを発現する細胞の製造前に、ＴＲＥＧ細胞の数を低減すること（例えば、を枯渇させること）を含む。例えば、製造方法は、例えば、ＣＡＲを発現する細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）生成物の製造前にＴＲＥＧ細胞を枯渇させるために、試料、例えばアフェレーシス試料を、抗ＧＩＴＲ抗体および／もしくは抗ＣＤ２５抗体（もしくはそれらのフラグメント、またはＣＤ２５結合リガンド）と接触させることを含む。
一実施形態において、対象は、ＣＡＲを発現する細胞生成物の製造のために細胞を収集する前に、ＴＲＥＧ細胞を低減させる１つまたは複数の療法で前処置され、それによって対象がＣＡＲを発現する細胞の処置に戻るリスクを低減させる。一実施形態において、ＴＲＥＧ細胞を減少させる方法としては、これらに限定されないが、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇の１つまたは複数、またはそれらの組合せを対象に投与することが挙げられる。シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５－枯渇の１つまたは複数、またはそれらの組合せの投与は、ＣＡＲを発現する細胞生成物の注入の前に、その間に、またはその後に行うことができる。
一実施形態において、対象は、ＣＡＲを発現する細胞生成物の製造のために細胞を収集する前に、シクロホスファミドで前処置され、それによって対象がＣＡＲを発現する細胞の処置に戻るリスクを低減させる。一実施形態において、対象は、ＣＡＲを発現する細胞生成物の製造のために細胞を収集する前に、抗ＧＩＴＲ抗体で前処置され、それによって対象がＣＡＲを発現する細胞の処置に戻るリスクを低減させる。
一実施形態において、除去される細胞の集団は、調節性Ｔ細胞または腫瘍細胞ではなく、別の様式でＣＡＲＴ細胞、例えばＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ１５、または免疫抑制細胞によって発現される可能性がある他のマーカーを発現する細胞の拡張および／または機能に負の影響を与える細胞である。一実施形態において、このような細胞は、調節性Ｔ細胞および／もしくは腫瘍細胞と同時に、または前記枯渇の後に、または別の順番で除去されることが想定される。
本明細書で説明される方法は、１つより多くの選択工程、例えば１つより多くの枯渇工程を包含していてもよい。陰性選択によるＴ細胞集団の濃縮は、例えば、陰性選択された細胞に独特な表面マーカーに向けられた抗体の組合せを用いて達成することができる。１つの方法は、陰性選択された細胞上に提示される細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルを使用する負磁気免疫接着またはフローサイトメトリーによるセルソーティングおよび／もしくは選択である。例えば、陰性選択によりＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を包含していてもよい。
本明細書で説明される方法は、集団から、腫瘍抗原、例えばＣＤ２５を含まない腫瘍抗原、例えばＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂを発現する細胞を除去することにより、ＣＡＲ、例えば本明細書で説明されるＣＡＲの発現に好適な、調節性Ｔ細胞枯渇、例えばＣＤ２５＋枯渇、および腫瘍抗原枯渇細胞の集団を提供することをさらに包含していてもよい。一実施形態において、腫瘍抗原を発現する細胞は、調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそれらのフラグメント、および抗腫瘍抗原抗体またはそれらのフラグメントは、同じ基質、例えば細胞を除去するのに使用できるビーズに付着することができ、または抗ＣＤ２５抗体もしくはそれらのフラグメント、または抗腫瘍抗原抗体もしくはそれらのフラグメントは、別々のビーズに付着することができ、それらの混合物は、細胞を除去するのに使用することができる。他の実施形態において、調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋細胞の除去、および腫瘍抗原を発現する細胞の除去は、逐次的であり、例えばどちらの順番でも行うことができる。
また、集団から、チェックポイント阻害剤、例えば本明細書で説明されるチェックポイント阻害剤を発現する細胞、例えばＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞、およびＴＩＭ３＋細胞の１種または複数を除去することによって、調節性Ｔ細胞枯渇、例えばＣＤ２５＋枯渇細胞、およびチェックポイント阻害剤枯渇細胞、例えばＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋および／またはＴＩＭ３＋枯渇細胞の集団を提供することを包含する方法も提供される。例示的なチェックポイント阻害剤としては、例えば本明細書で説明されるように、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、およびＴＧＦＲ（例えばＴＧＦＲベータ）が挙げられる。一実施形態において、チェックポイント阻害剤を発現する細胞は、調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメント、および抗チェックポイント阻害剤抗体またはそのフラグメントを同じビーズに付着させることができ、これを使用して細胞を除去することができ、または抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメント、および抗チェックポイント阻害剤抗体またはそのフラグメントを別々のビーズに付着させることができ、その混合物を使用して細胞を除去することができる。他の実施形態において、調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋細胞の除去、およびチェックポイント阻害剤を発現する細胞の除去は、逐次的であり、例えばどちらの順番でも行うことができる。
本明細書で説明される方法は、陽性選択工程を包含し得る。例えば、所望のＴ細胞の陽性選択に十分な期間にわたり、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば、３×２８）がコンジュゲートしたビーズ、例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔとインキュベートすることによって、Ｔ細胞を単離することができる。一態様において、期間は、約３０分である。さらなる態様において、期間は、３０分から３６時間の範囲またはそれより長く、およびその間の全ての整数値である。さらなる態様において、期間は、少なくとも１、２、３、４、５、または６時間である。さらに別の態様において、期間は、１０から２４時間である。一態様において、インキュベート期間は、２４時間である。腫瘍組織または免疫不全個体から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離する場合のように、他の細胞型と比較してＴ細胞がわずかしかないあらゆる状況においてＴ細胞を単離するためには、より長いインキュベート時間が使用される可能性がある。さらに、より長いインキュベート時間の使用は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕獲効率を増加させることができる。したがって、時間を単に短くしたりまたは長くしたりすることによって、Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合させることができ、および／またはＴ細胞に対するビーズの比率（本明細書でさらに説明されるように）を増加または減少させることによって、培養開始時またはプロセス中の他のタイムポイントで、Ｔ細胞の部分集団を可否に応じて優先的に選択することができる。加えて、ビーズまたは他の表面に対する抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体の比率を増加または減少させることによって、培養開始時または他の所望のタイムポイントで、Ｔ細胞の部分集団を可否に応じて優先的に選択することができる。
一実施形態において、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、グランザイムＢ、およびパーフォリンの１種または複数、または他の適切な分子、例えば他のサイトカインを発現するＴ細胞集団を選択する場合がある。細胞発現に関してスクリーニングする方法は、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／１２６７１２で説明されている方法によって決定することができる。
陽性または陰性選択によって細胞の所望の集団を単離するために、細胞および表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度は様々であってもよい。所定の態様において、細胞およびビーズの接触を最大にするために、ビーズおよび細胞が一緒に混合される容量を有意に減少させる（例えば、細胞濃度を増加させる）ことが望ましい場合がある。例えば、一態様において、細胞約１００億個／ｍｌ、９０億個／ｍｌ、８０億個／ｍｌ、７０億個／ｍｌ、６０億個／ｍｌ、または５０億個／ｍｌの濃度が使用される。一態様において、細胞１０億個／ｍｌの濃度が使用される。一態様において、１ｍｌあたり、細胞７５００万個以上、８０００万個以上、８５００万個以上、９０００万個以上、９５００万個以上、または１億個の細胞濃度が使用される。さらなる態様において、１ｍｌあたり細胞１億２５００万または１億５０００万個の濃度が使用できる。
高濃度の使用は、細胞収量、細胞の活性化、および細胞拡大の増加をもたらすことができる。さらに、高い細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの対象の標的抗原の発現が弱い可能性がある細胞、または多くの腫瘍細胞が存在する試料（例えば、白血病の血液、腫瘍組織など）からの細胞のより効率的な捕獲を可能にする。このような細胞集団は治療的価値を有する可能性があり、取得が望ましいと予想される。例えば、高濃度の細胞の使用は、通常のＣＤ２８発現が比較的弱いＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
関連する態様において、より低い細胞の濃度を使用することが望ましい場合がある。Ｔ細胞および表面（例えば、ビーズなどの粒子）の混合物を相当に希釈することによって、粒子と細胞との相互作用を最小化する。それにより、粒子に結合させるために、大量の所望の抗原を発現する細胞が選択される。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、より高レベルのＣＤ２８を発現するが、薄い濃度でＣＤ８＋Ｔ細胞より効率的に捕捉される。一態様において、使用される細胞の濃度は、５×１０６／ｍｌである。他の態様において、使用される濃度は、約１×１０５／ｍｌから１×１０６／ｍｌまで、およびその間のあらゆる整数値であってもよい。
他の態様において、細胞は、回転器で、様々な長さの時間にわたり、様々な速度、２～１０℃または室温のいずれかでインキュベートすることができる。
刺激のためのＴ細胞を洗浄工程後に凍結してもよい。理論に縛られるつもりはないが、凍結工程とそれに続く融解工程は、細胞集団中の顆粒球とある程度の単球を除去することによってより均一な生成物をもたらす。血漿と血小板を除去する洗浄工程の後、細胞を凍結溶液に懸濁してもよい。多くの凍結のための溶液およびパラメーターが当業界公知であり、この状況において有用であると予想されるが、１つの方法は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、または１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンならびに７．５％ＤＭＳＯを含有する培養培地、または３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ－Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン、および７．５％ＤＭＳＯを含有する培養培地、または例えばヘスパンおよびＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含有する他の好適な細胞凍結媒体を使用し、次いで細胞を１度／分の速度で－８０℃に凍結させ、液体窒素貯蔵タンクの蒸気相中で保存することを含む。他の制御冷凍方法を使用してもよいし、同様に－２０℃で即座に、または液体窒素中で非制御冷凍してもよい。
所定の態様において、低温保存した細胞を融解させて、本明細書で説明したようにして洗浄し、本発明の方法を使用して活性化する前に室温で１時間そのまま置く。
また、本発明の状況では、本明細書で説明したようにして拡大させた細胞が必要になるかもしれないときの前の期間に、対象から血液試料またはアフェレーシス産物を収集することも考慮される。そのようなものとして、拡大させようとする細胞の源を必要なあらゆる時点で収集することができ、さらに、本明細書で説明されるものなどの免疫エフェクター細胞治療によって利益を得ると予想される多数の疾患または状態のための免疫エフェクター細胞治療で後に使用するために、Ｔ細胞などの所望の細胞を単離して凍結してもよい。一態様において、血液試料またはアフェレーシスは、全般的に健康な対象から採取される。所定の態様において、血液試料またはアフェレーシスは、疾患を発症させる危険性があるが、まだ疾患を発症させていない、全般的に健康な対象から採取され、さらに、後の使用のために対象の細胞を単離して凍結してもよい。所定の態様において、Ｔ細胞は、後の時点で拡大、凍結、および使用されてもよい。所定の態様において、本明細書で説明したような特定の疾患の診断の直後に、ただしいかなる処置の前に、試料が患者から収集される。さらなる態様において、これらに限定されないが、ナタリズマブ、エファリズマブなどの薬剤、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノール酸塩、およびＦＫ５０６、抗体、または他の免疫除去剤（immunoablative agents）、例えばＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、マイコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、および放射線照射での処置などの多数の関連する処置様式の前に、細胞が、対象からの血液試料またはアフェレーシスから単離される。
本発明のさらなる態様において、対象に機能的なＴ細胞を残す処置の後に、患者から直接Ｔ細胞を得る。これに関して、所定のがん処置の後、特定には、免疫系にダメージを与える薬物での処置の後、患者が通常処置から回復すると予想される期間中の処置の直後に、得られたＴ細胞の品質が、エクスビボで拡大するそれらの能力に関して最適であるかまたは向上している可能性があることが観察されている。同様に、本明細書で説明される方法を使用したエクスビボでの操作の後、これらの細胞は、生着およびインビボでの拡大の強化にとって好ましい状況にある可能性がある。したがって、本発明の内容において、この回収期間中に、Ｔ細胞、樹状細胞、または造血細胞系の他の細胞を包含する血液細胞を収集することが考慮される。さらに、所定の態様において、動員（例えば、ＧＭ－ＣＳＦを用いた動員）および前処置レジメン（conditioning regimen）を使用して、特に療法後の規定の時間帯中に、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生、および／または拡大にとって好都合な対象における状態を作り出すことができる。例示的な細胞型としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、および他の免疫系細胞が挙げられる。
一実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ分子を発現する免疫エフェクター細胞は、免疫を増強する低い用量のｍＴＯＲ阻害剤を受けた対象から得られる。一実施形態において、対象における、または対象から回収された、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞のレベル、またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞の比率、例えばＴ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞が少なくとも一時的に増加した状態になるように、十分な時間の後、または十分な免疫を増強する低い用量のｍＴＯＲ阻害剤投与の後に、ＣＡＲを発現するように加工される免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の集団が回収される。
他の実施形態において、ＣＡＲを発現するように加工されているかまたは加工されると予想される免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の集団は、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の数を増加させる、またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞の比率、例えばＴ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞を増加させる量のｍＴＯＲ阻害剤との接触によって、エクスビボで処置され得る。
一実施形態において、Ｔ細胞集団は、ジアシルグリセロールキナーゼ（diaglycerol kinase）（ＤＧＫ）欠損である。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫのＲＮＡまたはタンパク質を発現しない細胞を包含するか、または低減または阻害されたＤＧＫ活性を有する。ＤＧＫ欠損細胞は、遺伝学的アプローチによって、例えば、ＤＧＫ発現を低減または予防するためにＲＮＡ干渉剤、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡを投与することによって生成することができる。代替として、ＤＧＫ欠損細胞は、本明細書で説明されるＤＧＫ阻害剤での処置によって生成することができる。
一実施形態において、Ｔ細胞集団は、イカロス欠損である。イカロス欠損細胞は、イカロスのＲＮＡまたはタンパク質を発現しない細胞を包含するか、または低減または阻害されたイカロス活性を有する。イカロス欠損細胞は、遺伝学的アプローチによって、例えば、イカロス発現を低減または予防するためにＲＮＡ干渉剤、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡを投与することによって生成することができる。代替として、イカロス欠損細胞は、イカロス阻害剤、例えばレナリドマイドでの処置によって生成することができる。
実施形態において、Ｔ細胞集団は、ＤＧＫ欠損およびイカロス欠損であり、例えば、ＤＧＫおよびイカロスを発現しないか、または低減もしくは阻害されたＤＧＫおよびイカロス活性を有する。このようなＤＧＫおよびイカロス欠損細胞は、本明細書で説明される方法のいずれかによって生成することができる。
一実施形態において、ＮＫ細胞は、対象から得られる。別の実施形態において、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞株、例えばＮＫ－９２細胞株（Ｃｏｎｋｗｅｓｔ）である。
同種異系ＣＡＲ
本明細書で説明される実施形態において、免疫エフェクター細胞は、同種異系の免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞であってもよい。例えば、細胞は、同種異系のＴ細胞、例えば、機能的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および／またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、例えばＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩの発現が欠失した同種異系のＴ細胞であってもよい。
機能的なＴＣＲが欠失したＴ細胞は、例えば、その表面上にいかなる機能的なＴＣＲも発現しないように加工されていてもよいし、機能的なＴＣＲを含む１つまたは複数のサブユニットを発現しないように加工されていてもよいし［例えば、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＴＣＲガンマ、ＴＣＲデルタ、ＴＣＲイプシロン、および／またはＴＣＲゼータを発現しない（またはその低減された発現を示す）ように加工される］、またはその表面上に非常にわずかな機能的なＴＣＲしか生産しないように加工されていてもよい［例えば、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＴＣＲガンマ、ＴＣＲデルタ、ＴＣＲイプシロン、および／またはＴＣＲゼータを発現しない（またはその低減された発現を示す）ように加工される］。代替として、Ｔ細胞は、例えば、ＴＣＲのサブユニットの１つまたは複数の突然変異またはトランケートされた形態の発現によって、実質的に機能が損なわれたＴＣＲを発現することができる。用語「実質的に機能が損なわれたＴＣＲ」は、このＴＣＲが、宿主において有害な免疫反応を惹起しないと予想されることを意味する。
本明細書で説明されるＴ細胞は、例えば、その表面上に機能的なＨＬＡを発現しないように加工されていてもよい。例えば、本明細書で説明されるＴ細胞は、ＨＬＡ、例えばＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩの細胞表面での発現が下方調節されるように加工されていてもよい。一部の実施形態において、ＨＬＡの下方調節は、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の発現を低減したりまたはなくしたりすることによって達成され得る。
一部の実施形態において、Ｔ細胞は、機能的なＴＣＲおよび機能的なＨＬＡ、例えばＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩを欠失していてもよい。
機能的なＴＣＲおよび／またはＨＬＡの発現が欠失した改変Ｔ細胞は、ＴＣＲまたはＨＬＡの１つまたは複数のサブユニットのノックアウトまたはノックダウンなどのあらゆる好適な手段により得ることができる。例えば、Ｔ細胞は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、クラスター化規則的間隔短鎖回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）転写活性化剤様のエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用した、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡのノックダウンを包含していてもよい。
一部の実施形態において、同種異系の細胞は、阻害分子を発現しないかまたは低いレベルで発現する細胞、例えば本明細書で説明されるいずれかの方法によって加工された細胞であってもよい。例えば、細胞は、阻害分子を発現しないかまたは低いレベルで発現する細胞、例えば、ＣＡＲを発現する細胞の免疫エフェクター応答を展開する能力を減少させることができる細胞であってもよい。阻害分子の例としては、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、およびＴＧＦＲ（例えばＴＧＦＲベータ）が挙げられる。阻害分子の阻害、例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルでの阻害による阻害は、ＣＡＲを発現する細胞の性能を最適化することができる。実施形態において、阻害核酸、例えば、本明細書で説明される阻害核酸、例えばｄｓＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、クラスター化規則的間隔短鎖回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）、転写活性化剤様のエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が使用できる。
ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ
いくつかの実施形態において、ＴＣＲの発現および／またはＨＬＡの発現は、Ｔ細胞におけるＴＣＲ、および／またはＨＬＡ、および／または本明細書で説明される阻害分子［例えば、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、およびＴＧＦＲベータ］をコードする核酸を標的とするｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを使用して阻害することができる。
ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡのための発現系、ならびに典型的なｓｈＲＮＡは、例えば、参照によりその全体が組み入れられる２０１５年３月１３日に出願された国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５の段落６４９および６５０において説明されている。
ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するＣＲＩＳＰＲ
本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ」または「ＴＣＲおよび／もしくはＨＬＡに対するＣＲＩＳＰＲ」または「ＴＣＲおよび／もしくはＨＬＡを阻害するＣＲＩＳＰＲ」とは、クラスター化規則的間隔短鎖回文配列リピートのセット、またはリピートのこのようなセットを含む系を指す。本明細書で使用される場合、「Ｃａｓ」とは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を指す。「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」系とは、ＣＲＩＳＰＲおよびＣａｓに由来する系であって、ＴＣＲ遺伝子および／もしくはＨＬＡ遺伝子、ならびに／または本明細書で説明される阻害分子［例えば、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、およびＴＧＦＲベータ］をサイレンシングするか、または突然変異させるのに使用し得る系を指す。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系およびその使用は、例えば、参照によりその全体が組み入れられる２０１５年３月１３日に出願された国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５の段落６５１～６５８において説明されている。
ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害するＴＡＬＥＮ
「ＴＡＬＥＮ」または「ＨＬＡおよび／もしくはＴＣＲに対するＴＡＬＥＮ」または「ＨＬＡおよび／もしくはＴＣＲを阻害するＴＡＬＥＮ」とは、ＨＬＡ遺伝子および／もしくはＴＣＲ遺伝子、ならびに／または本明細書で説明される阻害分子［例えば、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、およびＴＧＦＲベータ］を編集するのに使用し得る人工ヌクレアーゼである、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼを指す。
ＴＡＬＥＮ、ＴＡＬＥ、およびそれらの使用は、例えば、参照によりその全体が組み入れられる２０１５年３月１３日に出願された国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５の段落６５９～６６５において説明されている。
ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するジンクフィンガーヌクレアーゼ
「ＺＦＮ」または「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」または「ＨＬＡおよび／もしくはＴＣＲに対するＺＦＮ」または「ＨＬＡおよび／もしくはＴＣＲを阻害するＺＦＮ」とは、ＨＬＡ遺伝子および／もしくはＴＣＲ遺伝子、ならびに／または本明細書で説明される阻害分子［例えば、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、およびＴＧＦＲベータ］を編集するのに使用し得る人工ヌクレアーゼである、ジンクフィンガーヌクレアーゼを指す。
ＺＦＮ、およびそれらの使用は、例えば、参照によりその全体が組み入れられる２０１５年３月１３日に出願された国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５の段落６６６～６７１において説明されている。
テロメラーゼの発現
いかなる特定の理論にも縛られるつもりはないが、いくつかの実施形態において、患者における治療的Ｔ細胞の持続性は、Ｔ細胞におけるテロメアの短縮に起因して短期間であり、したがって、テロメラーゼ遺伝子のトランスフェクションは、Ｔ細胞のテロメアを長くし、患者におけるＴ細胞の持続性を改善する可能性がある。Carl June, “Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic”, Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007)を参照されたい。したがって、ある実施形態において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞は、テロメラーゼサブユニット、例えば、テロメラーゼの触媒性サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴを異所的に発現する。いくつかの態様において、本開示は、ＣＡＲ発現細胞を作製する方法であって、細胞を、テロメラーゼサブユニット、例えば、テロメラーゼの触媒性サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸と接触させることを含む方法を提示する。細胞は、ＣＡＲをコードするコンストラクトと接触させる前に、核酸と接触させることもでき、これと並列して接触させることもでき、この後で接触させることもできる。
一態様において、本開示は、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の集団を作製する方法を特徴とする。ある実施形態において、方法は、免疫エフェクター細胞の集団（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）を用意することと；免疫エフェクター細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸と接触させることと；ＣＡＲおよびテロメラーゼの発現を可能とする条件下で、免疫エフェクター細胞の集団をテロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸と接触させることとを含む。
ある実施形態において、テロメラーゼサブユニットをコードする核酸は、ＤＮＡである。ある実施形態において、テロメラーゼサブユニットをコードする核酸は、テロメラーゼサブユニットの発現を駆動することが可能なプロモーターを含む。
ある実施形態において、ｈＴＥＲＴは、ＧｅｎＢａｎｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ ＡＡＣ５１７２４．１のアミノ酸配列［Meyerson et al., “hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization” Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795］であって、以下：
MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRGCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD（配列番号１３３２）
のアミノ酸配列を有する。
ある実施形態において、ｈＴＥＲＴは、配列番号１３３２の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一な配列を有する。ある実施形態において、ｈＴＥＲＴは、配列番号１３３２の配列を有する。ある実施形態において、ｈＴＥＲＴは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはこれらの両方において、欠失（例えば、５、１０、１５、２０、または３０アミノ酸を超えない）を含む。ある実施形態において、ｈＴＥＲＴは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはこれらの両方において、トランスジェニックのアミノ酸配列（例えば、５、１０、１５、２０、または３０アミノ酸を超えない）を含む。
ある実施形態において、ｈＴＥＲＴは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０１８１６７の核酸配列（Meyerson et al., “hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization” Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795）：
1 caggcagcgt ggtcctgctg cgcacgtggg aagccctggc cccggccacc cccgcgatgc
61 cgcgcgctcc ccgctgccga gccgtgcgct ccctgctgcg cagccactac cgcgaggtgc
121 tgccgctggc cacgttcgtg cggcgcctgg ggccccaggg ctggcggctg gtgcagcgcg
181 gggacccggc ggctttccgc gcgctggtgg cccagtgcct ggtgtgcgtg ccctgggacg
241 cacggccgcc ccccgccgcc ccctccttcc gccaggtgtc ctgcctgaag gagctggtgg
301 cccgagtgct gcagaggctg tgcgagcgcg gcgcgaagaa cgtgctggcc ttcggcttcg
361 cgctgctgga cggggcccgc gggggccccc ccgaggcctt caccaccagc gtgcgcagct
421 acctgcccaa cacggtgacc gacgcactgc gggggagcgg ggcgtggggg ctgctgttgc
481 gccgcgtggg cgacgacgtg ctggttcacc tgctggcacg ctgcgcgctc tttgtgctgg
541 tggctcccag ctgcgcctac caggtgtgcg ggccgccgct gtaccagctc ggcgctgcca
601 ctcaggcccg gcccccgcca cacgctagtg gaccccgaag gcgtctggga tgcgaacggg
661 cctggaacca tagcgtcagg gaggccgggg tccccctggg cctgccagcc ccgggtgcga
721 ggaggcgcgg gggcagtgcc agccgaagtc tgccgttgcc caagaggccc aggcgtggcg
781 ctgcccctga gccggagcgg acgcccgttg ggcaggggtc ctgggcccac ccgggcagga
841 cgcgtggacc gagtgaccgt ggtttctgtg tggtgtcacc tgccagaccc gccgaagaag
901 ccacctcttt ggagggtgcg ctctctggca cgcgccactc ccacccatcc gtgggccgcc
961 agcaccacgc gggcccccca tccacatcgc ggccaccacg tccctgggac acgccttgtc
1021 ccccggtgta cgccgagacc aagcacttcc tctactcctc aggcgacaag gagcagctgc
1081 ggccctcctt cctactcagc tctctgaggc ccagcctgac tggcgctcgg aggctcgtgg
1141 agaccatctt tctgggttcc aggccctgga tgccagggac tccccgcagg ttgccccgcc
1201 tgccccagcg ctactggcaa atgcggcccc tgtttctgga gctgcttggg aaccacgcgc
1261 agtgccccta cggggtgctc ctcaagacgc actgcccgct gcgagctgcg gtcaccccag
1321 cagccggtgt ctgtgcccgg gagaagcccc agggctctgt ggcggccccc gaggaggagg
1381 acacagaccc ccgtcgcctg gtgcagctgc tccgccagca cagcagcccc tggcaggtgt
1441 acggcttcgt gcgggcctgc ctgcgccggc tggtgccccc aggcctctgg ggctccaggc
1501 acaacgaacg ccgcttcctc aggaacacca agaagttcat ctccctgggg aagcatgcca
1561 agctctcgct gcaggagctg acgtggaaga tgagcgtgcg gggctgcgct tggctgcgca
1621 ggagcccagg ggttggctgt gttccggccg cagagcaccg tctgcgtgag gagatcctgg
1681 ccaagttcct gcactggctg atgagtgtgt acgtcgtcga gctgctcagg tctttctttt
1741 atgtcacgga gaccacgttt caaaagaaca ggctcttttt ctaccggaag agtgtctgga
1801 gcaagttgca aagcattgga atcagacagc acttgaagag ggtgcagctg cgggagctgt
1861 cggaagcaga ggtcaggcag catcgggaag ccaggcccgc cctgctgacg tccagactcc
1921 gcttcatccc caagcctgac gggctgcggc cgattgtgaa catggactac gtcgtgggag
1981 ccagaacgtt ccgcagagaa aagagggccg agcgtctcac ctcgagggtg aaggcactgt
2041 tcagcgtgct caactacgag cgggcgcggc gccccggcct cctgggcgcc tctgtgctgg
2101 gcctggacga tatccacagg gcctggcgca ccttcgtgct gcgtgtgcgg gcccaggacc
2161 cgccgcctga gctgtacttt gtcaaggtgg atgtgacggg cgcgtacgac accatccccc
2221 aggacaggct cacggaggtc atcgccagca tcatcaaacc ccagaacacg tactgcgtgc
2281 gtcggtatgc cgtggtccag aaggccgccc atgggcacgt ccgcaaggcc ttcaagagcc
2341 acgtctctac cttgacagac ctccagccgt acatgcgaca gttcgtggct cacctgcagg
2401 agaccagccc gctgagggat gccgtcgtca tcgagcagag ctcctccctg aatgaggcca
2461 gcagtggcct cttcgacgtc ttcctacgct tcatgtgcca ccacgccgtg cgcatcaggg
2521 gcaagtccta cgtccagtgc caggggatcc cgcagggctc catcctctcc acgctgctct
2581 gcagcctgtg ctacggcgac atggagaaca agctgtttgc ggggattcgg cgggacgggc
2641 tgctcctgcg tttggtggat gatttcttgt tggtgacacc tcacctcacc cacgcgaaaa
2701 ccttcctcag gaccctggtc cgaggtgtcc ctgagtatgg ctgcgtggtg aacttgcgga
2761 agacagtggt gaacttccct gtagaagacg aggccctggg tggcacggct tttgttcaga
2821 tgccggccca cggcctattc ccctggtgcg gcctgctgct ggatacccgg accctggagg
2881 tgcagagcga ctactccagc tatgcccgga cctccatcag agccagtctc accttcaacc
2941 gcggcttcaa ggctgggagg aacatgcgtc gcaaactctt tggggtcttg cggctgaagt
3001 gtcacagcct gtttctggat ttgcaggtga acagcctcca gacggtgtgc accaacatct
3061 acaagatcct cctgctgcag gcgtacaggt ttcacgcatg tgtgctgcag ctcccatttc
3121 atcagcaagt ttggaagaac cccacatttt tcctgcgcgt catctctgac acggcctccc
3181 tctgctactc catcctgaaa gccaagaacg cagggatgtc gctgggggcc aagggcgccg
3241 ccggccctct gccctccgag gccgtgcagt ggctgtgcca ccaagcattc ctgctcaagc
3301 tgactcgaca ccgtgtcacc tacgtgccac tcctggggtc actcaggaca gcccagacgc
3361 agctgagtcg gaagctcccg gggacgacgc tgactgccct ggaggccgca gccaacccgg
3421 cactgccctc agacttcaag accatcctgg actgatggcc acccgcccac agccaggccg
3481 agagcagaca ccagcagccc tgtcacgccg ggctctacgt cccagggagg gaggggcggc
3541 ccacacccag gcccgcaccg ctgggagtct gaggcctgag tgagtgtttg gccgaggcct
3601 gcatgtccgg ctgaaggctg agtgtccggc tgaggcctga gcgagtgtcc agccaagggc
3661 tgagtgtcca gcacacctgc cgtcttcact tccccacagg ctggcgctcg gctccacccc
3721 agggccagct tttcctcacc aggagcccgg cttccactcc ccacatagga atagtccatc
3781 cccagattcg ccattgttca cccctcgccc tgccctcctt tgccttccac ccccaccatc
3841 caggtggaga ccctgagaag gaccctggga gctctgggaa tttggagtga ccaaaggtgt
3901 gccctgtaca caggcgagga ccctgcacct ggatgggggt ccctgtgggt caaattgggg
3961 ggaggtgctg tgggagtaaa atactgaata tatgagtttt tcagttttga aaaaaaaaaa
4021 aaaaaaa（配列番号１３３３）
によりコードされる。
ある実施形態において、ｈＴＥＲＴは、配列番号１３３３の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６、９７％、９８％、または９９％同一な配列を有する核酸によりコードされる。ある実施形態において、ｈＴＥＲＴは、配列番号１３３３の核酸によりコードされる。
免疫エフェクター細胞（例えばＴ細胞）の活性化および拡大
Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、一般的に、例えば米国特許第６，３５２，６９４号；６，５３４，０５５号：６，９０５，６８０号：６，６９２，９６４号：５，８５８，３５８号：６，８８７，４６６号：６，９０５，６８１号：７，１４４，５７５号：７，０６７，３１８号：７，１７２，８６９号：７，２３２，５６６号：７，１７５，８４３号：５，８８３，２２３号：６，９０５，８７４号：６，７９７，５１４号：６，８６７，０４１号：および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号で説明されているような方法を使用して活性化させて拡大させてもよい。
エクスビボで造血幹および前駆細胞を拡大させるための手法は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，１９９，９４２号で説明されており、本発明の細胞に適用することができる。他の好適な方法が当業界公知であり、それゆえに本発明は、いかなる特定のエクスビボでの細胞拡大方法にも限定されない。簡単に言えば、エクスビボでのＴ細胞の培養および拡大は、（１）末梢血液の回収物または骨髄外植片から、哺乳動物由来のＣＤ３４＋造血幹および前駆細胞を収集すること；および（２）このような細胞をエクスビボで拡大させることを含み得る。米国特許第５，１９９，９４２号で説明されている細胞成長因子に加えて、ｆｌｔ３－Ｌ、ＩＬ－１、ＩＬ－３およびｃ－ｋｉｔリガンドなどの他の因子を細胞の培養および拡大に使用することができる。
一般に、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤と、Ｔ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドとを付着させた表面と接触させることによって、免疫エフェクター細胞集団を拡大させることができる。特定には、本明細書で説明したようにして、例えば、表面上に固定された抗ＣＤ３抗体もしくはそれらの抗原結合フラグメント、または抗ＣＤ２抗体と接触させることによって、またはカルシウムイオノフォアとともにプロテインキナーゼＣ活性化剤（例えば、ブリオスタチン）と接触させることによって、Ｔ細胞集団を刺激してもよい。Ｔ細胞表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で、Ｔ細胞の集団を抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させてもよい。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するため、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を使用することができる。抗ＣＤ２８抗体の例としては、９．３、Ｂ－Ｔ３、ＸＲ－ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられ、これらは、一般的に当業界で知られている他の方法と同様にして使用することができる［Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998；Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999；Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999］。
一部の実施形態において、免疫エフェクター細胞（例えば、ＰＢＭＣまたはＴ細胞）は、該細胞を抗ＣＤ３抗体およびＩＬ２の一方または両方と接触させることによって拡大され、刺激される。実施形態において、細胞は、抗ＣＤ３ビーズも抗ＣＤ２８ビーズも用いずに拡大される。
所定の態様において、Ｔ細胞に関する一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、様々なプロトコールによって供給することができる。例えば、各シグナルを供給する薬剤は、溶解した状態かまたは表面にカップリングされていてもよい。表面にカップリングされる場合、薬剤は、同じ表面にカップリングされてもよいし（すなわち、「シス」形成）、または別の表面に（すなわち、「トランス」形成）カップリングされてもよい。その代わりに、１種の薬剤が表面にカップリングされ、他の薬剤が溶解した状態であってもよい。一態様において、共刺激シグナルを供給する薬剤が細胞表面に結合しており、一次活性化シグナルを供給する薬剤が、溶解した状態かまたは表面にカップリングされていてもよい。所定の態様において、両方の薬剤が溶解した状態であってもよい。一態様において、薬剤は、可溶性の形態であってもよく、次いで、Ｆｃ受容体を発現する細胞などの表面に、または薬剤に結合すると予想される抗体もしくは他の結合剤に架橋されていてもよい。これに関して、例えば、本発明においてＴ細胞を活性化して拡大させることに使用することが意図された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）に関する米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号および２００６００３４８１０号を参照されたい。
一態様において、２種の薬剤が、同じビーズ上、すなわち「シス」、または別のビーズ上、すなわち「トランス」のいずれかでビーズ上に固定される。一例として、一次活性化シグナルを供給する薬剤は、抗ＣＤ３抗体またはそれらの抗原結合フラグメントであり、共刺激シグナルを供給する薬剤は、抗ＣＤ２８抗体またはそれらの抗原結合フラグメントであり、どちらの薬剤も、等しい分子の量で同じビーズにともに固定される。一態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞の拡大およびＴ細胞成長のために、ビーズに結合した１：１の比率の各抗体が使用される。所定の態様において、１：１の比率を使用して観察された拡大と比較してＴ細胞拡大の増加が観察されるような、ビーズに結合した抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比率が使用される。特定の一態様において、１：１の比率を使用して観察された拡大と比較して、約１から約３倍の増加が観察される。一態様において、ビーズに結合したＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比率は、１００：１から１：１００の範囲、およびその間の全ての整数値である。一態様において、抗ＣＤ３抗体より多くの抗ＣＤ２８抗体が、粒子に結合しており、すなわちＣＤ３：ＣＤ２８の比率は１未満である。所定の態様において、ビーズに結合した抗ＣＤ２８抗体と抗ＣＤ３抗体との比率は、２：１より大きい。特定の一態様において、１：１００のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。一態様において、１：７５のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。さらなる態様において、１：５０のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。一態様において、１：３０のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。一態様において、１：１０のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。一態様において、１：３のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。さらなる一態様において、３：１のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。
Ｔ細胞または他の標的細胞を刺激するために、１：５００から５００：１まで、およびその間のあらゆる整数値の粒子と細胞との比率を使用することができる。当業者であれば容易に認識できるように、粒子と細胞との比率は、標的細胞に対する粒度によって決まる可能性がある。例えば、小さいサイズのビーズは、わずかな数の細胞としか結合できないが、より大きいビーズは多くと結合できる。所定の態様において、細胞と粒子との比率は、１：１００から１００：１の範囲、およびその間のあらゆる整数値であり、さらなる態様において、この比率は、１：９から９：１、およびその間のあらゆる整数値を含み、Ｔ細胞を刺激するのにも使用することができる。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８がカップリングされた粒子とＴ細胞との、Ｔ細胞の刺激をもたらす比率は上述したように様々なであってよいが、所定の好ましい値としては、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、および１５：１が挙げられ、１つの好ましい比率は、粒子とＴ細胞とが少なくとも１：１である。一態様において、１：１またはそれ未満の粒子と細胞との比率が使用される。特定の一態様において、好ましい粒子：細胞の比率は、１：５である。さらなる態様において、粒子と細胞との比率は、刺激の日に応じて変更することができる。例えば、一態様において、粒子と細胞との比率は、１日目では１：１から１０：１であり、その後、毎日または１日おきに最大１０日まで細胞に追加の粒子が添加され、最終的には１：１から１：１０の比率である（添加した日の細胞数に基づく）。特定の一態様において、粒子と細胞との比率は、刺激の１日目には１：１であり、刺激の３日目および５日目には１：５に調整される。一態様において、粒子は、毎日または１日おきに添加して、１日目に最終的な１：１の比率にし、刺激の３日目および５日目に１：５にする。一態様において、粒子と細胞との比率は、刺激の１日目には２：１であり、刺激の３日目および５日目には１：１０に調整される。一態様において、粒子は、毎日または１日おきに添加して、１日目に最終的な１：１の比率にし、刺激の３日目および５日目に１：１０にする。当業者であれば、様々な他の比率が本発明で使用するのに適している可能性があることを認識するものと予想される。特定には、比率は、粒度ならびに細胞のサイズおよびタイプに応じて様々であると予想される。一態様において、使用のための最も典型的な比率は、１日目に１：１、２：１および３：１の付近である。
本発明のさらなる態様において、Ｔ細胞などの細胞は、薬剤でコーティングされたビーズと組み合わされ、その後ビーズおよび細胞を分離して、次いで細胞を培養する。代替の態様において、培養の前に薬剤でコーティングしたビーズと細胞とを分離せずに、一緒に培養する。さらなる態様において、まず磁力などの力の適用によってビーズおよび細胞を濃縮し、その結果として細胞表面マーカーのライゲーションを増加させることにより、細胞の刺激を誘導する。
一例として、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が付着している常磁性ビーズ（３×２８個のビーズ）をＴ細胞に接触させることによって、細胞表面タンパク質をライゲートさせることができる。一態様において、細胞（例えば、１０４から１０９個のＴ細胞）およびビーズ［例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ常磁性ビーズを１：１の比率で］を、緩衝液、例えばＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムなどの２価カチオンを含まない）中で組み合わせる。ここでも、あらゆる細胞濃度が使用できることは、当業者であれば容易に認識することができる。例えば、標的細胞は、試料中で極めて希少であってもよいし、試料のわずか０．０１％しか含んでいなくてもよいし、または試料全体（すなわち、１００％）が対象の標的細胞を構成していてもよい。したがって、あらゆる細胞数が本発明の内容に含まれる。所定の態様において、細胞と粒子とが最大限に接触するように、粒子および細胞が一緒に混合されている容量を有意に減少させること（すなわち、細胞の濃度を増加させること）が望ましい場合がある。例えば、一態様において、細胞約２０億個／ｍｌの濃度が使用される。一態様において、１ｍｌあたり１億個より多くの細胞が使用される。さらなる態様において、１ｍｌあたり細胞１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万個の細胞の濃度が使用される。さらなる一態様において、１ｍｌあたり細胞７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億個の細胞の濃度が使用される。例えば、一態様において、１ｍｌあたりの細胞約１００億個、１ｍｌあたりの細胞９０億個、１ｍｌあたりの細胞８０億個、１ｍｌあたりの細胞７０億個、１ｍｌあたりの細胞６０億個、または１ｍｌあたりの細胞５０億個、または１ｍｌあたりの細胞２０億個の濃度を使用する。一態様において、１ｍｌあたりの細胞１億個超を使用する。さらに、高い細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの対象の標的抗原の発現が弱い可能性がある細胞のより効率的な捕獲を可能にする。所定の態様において、このような細胞集団は治療的価値を有する可能性があり、取得が望ましいと予想される。例えば、高濃度の細胞の使用は、通常のＣＤ２８発現が比較的弱いＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
一実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲで形質導入した細胞を、例えば、本明細書で説明される方法により拡大する。一実施形態において、細胞を、培養物中で、数時間（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、１８、２１時間）～約１４日間（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日間）にわたり拡大させる。一実施形態において、細胞を、４～９日間にわたり拡大させる。一実施形態において、細胞を、８日間またはこれ未満、例えば、７、６、または５日間にわたり拡大させる。一実施形態において、細胞、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ細胞を、培養物中で、５日間にわたり拡大させると、結果として得られる細胞は、培養物中の同じ培養条件下において９日間にわたり拡大させた同じ細胞より強力である。効力は、例えば、種々のＴ細胞機能、例えば、増殖、標的細胞の殺滅、サイトカインの産生、活性化、遊走、またはこれらの組合せにより規定することができる。一実施形態において、細胞、例えば、本明細書で説明されるＣＤ１９ ＣＡＲ細胞であって、５日間にわたり拡大させたＣＤ１９ ＣＡＲ細胞は、抗原刺激時に、培養物中の同じ培養条件下において９日間にわたり拡大させた同じ細胞と比較して、細胞倍加の少なくとも１、２、３、または４倍の増加を示す。一実施形態において、細胞、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲを発現する細胞を、培養物中で、５日間にわたり拡大させると、結果として得られる細胞は、培養物中の同じ培養条件下において９日間にわたり拡大させた同じ細胞と比較して、高度な炎症促進性サイトカインの産生、例えば、ＩＦＮ－γレベルおよび／またはＧＭ－ＣＳＦレベルを呈示する。一実施形態において、細胞、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ細胞であって、５日間にわたり拡大させたＣＡＲ細胞は、培養物中の同じ培養条件下において９日間にわたり拡大させた同じ細胞と比較して、炎症促進性サイトカインの産生、例えば、ＩＦＮ－γレベルおよび／またはＧＭ－ＣＳＦレベルの、ｐｇ／ｍｌ単位で、少なくとも１、２、３、４、５、１０倍、またはこれを超える増加を示す。
本発明の一態様において、混合物は、数時間（約３時間）から約１４日間、またはその間の１時間ごとのあらゆる整数値の時間、培養されてもよい。一態様において、混合物は、２１日間培養されてもよい。本発明の一態様において、ビーズおよびＴ細胞は、約８日間、一緒に培養される。一態様において、ビーズおよびＴ細胞は、２～３日間、一緒に培養される。
またＴ細胞の培養時間が６０日間またはそれより長くなるように、数サイクルの刺激が望ましい場合がある。Ｔ細胞培養に適切な条件としては、血清（例えば、ウシ胎児またはヒト血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦβ、およびＴＮＦ－αなどの増殖および生存能力に必要な因子、または当業者公知の細胞成長に関する他のあらゆる添加剤を含有していてもよい適切な培地［例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０または、Ｘ－ｖｉｖｏ １５、（Ｌｏｎｚａ）］が挙げられる。細胞成長に関する他の添加剤としては、これらに限定されないが、界面活性剤、プラスマネート、ならびにＮ－アセチル－システインおよび２－メルカプトエタノールなどの還元剤が挙げられる。培地としては、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンが添加され、無血清であるか、または適切な量の血清（または血漿）または規定された一連のホルモン、および／またはＴ細胞の成長および拡大に十分な量のサイトカインが補充されたかのいずれかの、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ １５、およびＸ－Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを挙げることができる。抗生物質、例えばペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験的培養の場合のみに包含され、対象に注入しようとする細胞の培養の場合は包含されない。標的細胞は、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気および５％ＣＯ２）などの成長を支持するのに必要な条件下で維持される。
一実施形態において、細胞を、１つまたは複数のインターロイキンを含む、適切な培地（例えば、本明細書で説明される培地）中で拡大させ、これにより、１４日間の拡大期間にわたり、例えば、フローサイトメトリーなど、本明細書で説明される方法により測定される通り、細胞の、少なくとも２００倍（例えば、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍）の増加を結果としてもたらす。一実施形態において、細胞を、ＩＬ－１５および／またはＩＬ－７（例えば、ＩＬ－１５およびＩＬ－７）の存在下において拡大させる。
いくつかの実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞（例えばＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞などのＴ細胞）を、ＣＡＲ発現細胞の製造時に、例えば、エクスビボにおいて、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）ポリペプチド、インターロイキン１５受容体アルファ（ＩＬ－１５Ｒａ）ポリペプチド、またはＩＬ－１５ポリペプチドおよびＩＬ－１５Ｒａポリペプチド、例えば、ｈｅｔＩＬ－１５の両方の組合せを含む組成物と接触させる。実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞の製造時に、例えば、エクスビボにおいて、ＩＬ－１５ポリペプチドを含む組成物と接触させる。実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞の製造時に、例えば、エクスビボにおいて、ＩＬ－１５ポリペプチドおよびＩＬ－１５Ｒａポリペプチドの両方の組合せを含む組成物と接触させる。実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞の製造時に、例えば、エクスビボにおいて、ｈｅｔＩＬ－１５を含む組成物と接触させる。
一実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞（例えばＴ細胞またはＮＫ細胞）を、エクスビボにおける拡大時に、ｈｅｔＩＬ－１５を含む組成物と接触させる。ある実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、エクスビボにおける拡大時に、ＩＬ－１５ポリペプチドを含む組成物と接触させる。ある実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、エクスビボにおける拡大時に、ＩＬ－１５ポリペプチドおよびＩＬ－１５Ｒａポリペプチドの両方を含む組成物と接触させる。一実施形態において、接触させることは、リンパ球亜集団、例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の生存および増殖を結果としてもたらす。
ある実施形態において、本明細書で開示される作製方法は、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の集団と、テロメラーゼサブユニット、例えばｈＴＥＲＴをコードする核酸とを接触させることをさらに含む。テロメラーゼサブユニットをコードする核酸は、ＤＮＡであってもよい。
様々な刺激時間に晒されたＴ細胞は、異なる特徴を示す可能性がある。例えば、典型的な血液またはアフェレーシスで得られた末梢血単核細胞産物は、細胞毒性またはサプレッサーＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）より大きいヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。エクスビボでのＣＤ３およびＣＤ２８受容体を刺激することによるＴ細胞拡大は、約８～９日目の前には主としてＴＨ細胞からなるＴ細胞集団を産生するが、約８～９日目の後、Ｔ細胞の集団は、よりいっそう多くのＴＣ細胞集団を含む。したがって、処置目的に応じて、主としてＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を対象に注入することが有利な場合がある。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的なサブセットが単離された場合、このようなサブセットは、このサブセットをより高度に拡大させるのに有益な場合がある。
さらに、ＣＤ４およびＣＤ８マーカーに加えて、細胞拡大プロセスの経過中、他の表現型マーカーが有意に、ただし大部分は再生可能に変化する。したがって、このような再現性は、活性化されたＴ細胞産物を特定の目的に合わせる能力を可能にする。
ＣＡＲ、例えばＣＤ１９ ＣＡＲが構築されたら、これらに限定されないが、抗原刺激後にＴ細胞を拡大させて再刺激の非存在下でＴ細胞の拡大を維持する能力、および適切なインビトロおよび動物モデルにおける抗癌活性などの分子の活性を評価するために、様々なアッセイを使用することができる。ＣＡＲ、例えばＣＤ１９ ＣＡＲの作用を評価するためのアッセイは、以下のさらなる詳細で説明される。
初代Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現のウェスタンブロット分析は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる２０１５年３月１３日に出願された国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５の段落６９５において説明されているように、単量体および二量体の存在を検出するために使用することができる。
インビトロにおける抗原刺激後のＣＡＲ＋Ｔ細胞拡大は、フローサイトメトリーによって測定することができる。例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を、αＣＤ３／αＣＤ２８ビーズで刺激し、続いて分析しようとするプロモーターの制御下でＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターを移入させる。典型的なプロモーターとしては、ＣＭＶ ＩＥ遺伝子、ＥＦ－１α、ユビキチンＣ、またはホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが挙げられる。培養から６日目に、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットにおいてＧＦＰ蛍光をフローサイトメトリーによって評価する。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)を参照されたい。その代わりに、０日目に、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を、αＣＤ３／αＣＤ２８でコーティングされた磁気ビーズで刺激し、１日目に、２Ａリボゾームスキッピング配列（ribosomal skipping sequence）を使用してｅＧＦＰとともにＣＡＲを発現するバイシストロン性のレンチウイルスベクターを使用して、ＣＡＲで形質導入する。培養物は、洗浄の後、ＣＤ１９＋Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２－ＣＤ１９）、野生型Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２野生型）、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体の存在下でｈＣＤ３２および４－１ＢＢＬを発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２－ＢＢＬ－３／２８）のいずれかで再刺激する。１日おきに外因性ＩＬ－２を１００ＩＵ／ｍｌで培養に添加する。ＧＦＰ＋Ｔ細胞は、ビーズベースの計数を使用するフローサイトメトリーによって数えられる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464(2009)を参照されたい。
再刺激の非存在下において持続されるＣＡＲ＋Ｔ細胞拡大もまた、測定することができる。例えば、［Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)］を参照されたい。略述すると、０日目における、αＣＤ３／αＣＤ２８でコーティングされた磁気ビーズによる刺激、および１日目における、表示のＣＡＲの形質導入に続き、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ粒子カウンター、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｖｉｓｉｏｎ、またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｃｅｐｔｅｒを使用して、培養の８日目に、平均Ｔ細胞容量（ｆｌ）を測定する。
ＣＡＲ発現細胞活性を測定するために、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる２０１５年３月１３日に出願された国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５の段落６９８において説明されているように、動物モデルもまた使用することができる。
用量依存的ＣＡＲ処置応答は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる２０１５年３月１３日に出願された国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５の段落６９９において説明されているように、評価することができる。細胞増殖およびサイトカイン産生の査定は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる２０１５年３月１３日に出願された国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５の段落７００において説明されているように、すでに説明されている。細胞毒性は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる２０１５年３月１３日に出願された国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５の段落７０１において説明されているように、標準的な５１Ｃｒｅ放出アッセイによって査定することができる。腫瘍を有する動物モデルにおけるＣＡＲの特異的なトラフィッキングおよび増殖を評価するために、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる２０１５年３月１３日に出願された国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５の段落７０２において説明されているように、イメージング技術を使用することができる。
また、本明細書における実施例のセクションで説明されているアッセイはもちろん当業界公知のアッセイも包含する他のアッセイも、本明細書で説明されるＣＡＲを評価するために使用することができる。
代替的に、または本明細書で開示された方法と組み合わせて、ＣＡＲ発現細胞の検出および／または定量化［例えば、インビトロまたはインビボ（例えば、臨床モニタリング）］；免疫細胞の拡大および／もしくは活性化；ならびに／またはＣＡＲリガンドの使用を伴う、ＣＡＲ特異的選択の１つまたは複数のための方法および組成物も開示される。例示的な一実施形態において、ＣＡＲリガンドは、ＣＡＲ分子に結合する抗体、例えば、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインに結合する抗体（例えば、抗原結合ドメインに結合する抗体、例えば、抗イディオタイプ抗体；または細胞外結合ドメインの定常領域に結合する抗体）である。他の実施形態において、ＣＡＲリガンドは、ＣＡＲ抗原分子（例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ抗原分子）である。
一態様において、ＣＡＲ発現細胞を検出および／または定量化するための方法が開示される。例えば、ＣＡＲリガンドを使用して、インビトロまたはインビボにおいて、ＣＡＲ発現細胞を検出および／または定量化する（例えば、患者におけるＣＡＲ発現細胞または患者への投与の臨床モニタリングを行う）ことができる。方法は、
ＣＡＲリガンド（適宜、標識されたＣＡＲリガンド、例えば、タグ、ビーズ、放射性標識または蛍光標識を含むＣＡＲリガンド）を用意することと；
ＣＡＲ発現細胞を得ること（例えば、製造用試料または臨床試料など、ＣＡＲ発現細胞を含有する試料を得ること）と；
結合が生じる条件下において、ＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲリガンドと接触させ、これにより、存在するＣＡＲ発現細胞のレベル（例えば、量）を検出することと
を含む。ＣＡＲ発現細胞の、ＣＡＲリガンドとの結合は、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡなど、標準的な技術を使用して検出することができる。
別の態様において、細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）を拡大および／または活性化させる方法が開示される。方法は、
ＣＡＲ発現細胞（例えば、第一のＣＡＲ発現細胞またはＣＡＲを一過性に発現する細胞）を用意することと；
前記ＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲリガンド、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲリガンドと、免疫細胞の拡大および／または増殖が生じる条件下において接触させ、これにより、活性化および／または拡大させた細胞集団をもたらすことと
を含む。
ある特定の実施形態において、ＣＡＲリガンドは、存在する（例えば、基質、例えば、天然では存在しない基質に固定化するかまたは接合させる）。いくつかの実施形態において、基質は、非細胞性基質である。非細胞性基質は、例えば、プレート（例えば、マイクロ滴定プレート）、膜（例えば、ニトロセルロース膜）、マトリックス、チップ、またはビーズから選択される固体支持体であり得る。実施形態において、ＣＡＲリガンドは、基質（例えば、基質表面上）に存在する。ＣＡＲリガンドは、基質に固定化することもでき、接合させることもでき、共有結合的または非共有結合的に会合させる（例えば、架橋する）こともできる。一実施形態において、ＣＡＲリガンドは、ビーズに接合させる（例えば、共有結合的に接合させる）ことができる。前述の実施形態において、免疫細胞集団は、インビトロまたはエクスビボにおいて拡大させることができる。方法はさらに、例えば、本明細書で説明される方法のいずれかを使用して、ＣＡＲ分子のリガンドの存在下において、免疫細胞の集団を培養することを含み得る。
他の実施形態において、細胞を拡大および／または活性化させる方法は、第二の刺激分子、例えば、ＣＤ２８の添加をさらに含む。例えば、ＣＡＲリガンドおよび第二の刺激分子を、基質、例えば、１つまたは複数のビーズに固定化し、これにより、細胞の拡大および／または活性化を増加させることができる。
他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞について選択または濃縮する方法が提供される。方法は、ＣＡＲ発現細胞を、本明細書で説明されるＣＡＲリガンドと接触させることと；ＣＡＲリガンドの結合に基づき、細胞を選択することとを含む。
さらに他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞を枯渇させる（例えば、低減し、かつ／または死滅させる）ための方法が提供される。方法は、ＣＡＲ発現細胞を、本明細書で説明されるＣＡＲリガンドと接触させることと；ＣＡＲリガンドの結合に基づき、細胞を標的とし、これにより、ＣＡＲ発現細胞の数を低減し、かつ／またはこれらを死滅させることとを含む。一実施形態において、ＣＡＲリガンドを、毒性薬剤（例えば、毒素または細胞除去薬）にカップリングさせることができる。別の実施形態において、抗イディオタイプ抗体は、エフェクター細胞活性、例えば、ＡＤＣＣまたはＡＤＣ活性を引き起こし得る。
本明細書で開示された方法において使用し得る例示的な抗ＣＡＲ抗体は、例えば、その内容が参照により組み入れられる、ＷＯ２０１４／１９０２７３およびJena et al., “Chimeric Antigen Receptor (CAR)-Specific Monoclonal Antibody to Detect CD19-Specific T cells in Clinical Trials”, PLOS March 2013 8:3 e57838において説明されている。いくつかの態様および実施形態において、本明細書における組成物および方法を、例えば、その内容が参照によりそれらの全体において本明細書に組み入れられる、２０１５年７月３１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０４３２１９において説明されている通り、Ｔ細胞の特異的なサブセットについて最適化する。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の最適化されたサブセットは、対照Ｔ細胞、例えば、同じコンストラクトを発現する、異なるタイプのＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋ＴまたはＣＤ４＋Ｔ）と比較して、持続性の増強を提示する。
いくつかの実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、本明細書で説明されるＣＡＲであって、ＣＤ４＋Ｔ細胞に適する細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞について最適化された細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞における持続性の増強をもたらす細胞内シグナル伝達ドメイン）、例えば、ＩＣＯＳドメインを含むＣＡＲを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、本明細書で説明されるＣＡＲであって、ＣＤ８＋Ｔ細胞に適する細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞について最適化された細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞における持続性の増強をもたらす細胞内シグナル伝達ドメイン）、例えば、４－１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメイン、またはＩＣＯＳドメイン以外の、別の共刺激ドメインを含むＣＡＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲは、本明細書で説明される抗原結合ドメイン、例えば、ＣＡＲは、抗原結合ドメインを含む。
ある態様において、本明細書では、対象、例えば、がんを有する対象を処置する方法が説明される。方法は、前記対象に、
１）ＣＡＲ（ＣＡＲＣＤ４＋）を含むＣＤ４＋Ｔ細胞であって、
抗原結合ドメイン、例えば、本明細書で説明される抗原結合ドメインと；
膜貫通ドメインと；
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、第一の共刺激ドメイン、例えば、ＩＣＯＳドメインと
を含むＣＤ４＋Ｔ細胞；および
２）ＣＡＲ（ＣＡＲＣＤ８＋）を含むＣＤ８＋Ｔ細胞であって、
抗原結合ドメイン、例えば、本明細書で説明される抗原結合ドメインと；
膜貫通ドメインと；
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、第二の共刺激ドメイン、例えば、４－１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメイン、またはＩＣＯＳドメイン以外の、別の共刺激ドメインと
を含み、
ＣＡＲＣＤ４＋とＣＡＲＣＤ８＋とが互いに異なる、
ＣＤ８＋Ｔ細胞
の有効量を投与することを含む。
方法はさらに、
３）ＣＡＲ（第二のＣＡＲＣＤ８＋）を含む、第二のＣＤ８＋ Ｔ細胞であって、
抗原結合ドメイン、例えば、本明細書で説明される抗原結合ドメインと；
膜貫通ドメインと；
細胞内シグナル伝達ドメインと
を含み、第二のＣＡＲＣＤ８＋が、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＡＲＣＤ８＋において存在しない共刺激シグナル伝達ドメインを含み、適宜、ＩＣＯＳシグナル伝達ドメインを含まない、第二のＣＤ８＋Ｔ細胞
を投与することを含んでもよい。
製造／産生方法
一部の実施形態において、本明細書で開示される方法は、細胞（例えば、本明細書で説明されるような免疫エフェクター細胞、例えば、トランケートされたＰＧＫ１プロモーターによって駆動されるＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞）での処置後にＴ細胞枯渇剤を投与することによってＣＡＲ発現細胞（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞）を低減させること（例えば、枯渇させること）をさらに含む。このようなＴ細胞枯渇剤は、ＣＡＲ発現細胞（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞）を有効に枯渇させて毒性を減弱するために使用することができる。一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞を、本明細書における方法に従って製造し、例えば、本明細書における方法に従ってアッセイを（例えば、トランスフェクションまたは形質導入の前または後に）行った。
一部の実施形態において、Ｔ細胞枯渇剤は、本明細書で説明される細胞、例えば免疫エフェクター細胞集団の投与の１、２、３、４または５週間後に投与される。
一実施形態において、Ｔ細胞枯渇剤は、例えば、抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）および／または補体誘導性の細胞死を誘導することによって、ＣＡＲ発現細胞を枯渇させる薬剤である。例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞はまた、細胞死、例えばＡＤＣＣまたは補体誘導性の細胞死を誘導することが可能な分子によって認識される抗原（例えば、標的抗原）を発現する可能性がある。例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞はまた、抗体または抗体フラグメントによって標的化される可能性がある標的タンパク質（例えば、受容体）を発現する可能性もある。このような標的タンパク質の例としては、これらに限定されないが、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦＲ、インテグリン（例えば、インテグリンανβ３、α４、αΙ３／４β３、α４β７、α５β１、ανβ３、αν）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバー（例えば、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２）、ＰＤＧＦ受容体、インターフェロン受容体、葉酸受容体、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ－１、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＥＡ、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ１、ＴＡＧ－７２、ＩＬ－６受容体、５Ｔ４、ＧＤ２、ＧＤ３、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ／ＬＦＡ－１、ＣＤ１５、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３／ｌｇＥ受容体、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７／ベイシジン、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ－４、ＣＤ１５４／ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１９５／ＣＣＲ５、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ７、およびＥＧＦＲ、ならびにそれらのトランケートされたバージョン（例えば、１つまたは複数の細胞外のエピトープを保存するが細胞質内ドメイン内の１つまたは複数の領域が欠失したバージョン）が挙げられる。
一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＡＲおよび標的タンパク質を共発現し、例えば、標的タンパク質を自然に発現し、または標的タンパク質を発現するように加工される。例えば、細胞、例えば免疫エフェクター細胞集団は、ＣＡＲ核酸（例えば、本明細書で説明されるようなＣＡＲ核酸）および標的タンパク質をコードする核酸を含む核酸（例えば、ベクター）を包含し得る。
一実施形態において、Ｔ細胞枯渇剤は、ＣＤ５２阻害剤、例えば、抗ＣＤ５２抗体分子、例えばアレムツズマブである。
他の実施形態において、細胞、例えば免疫エフェクター細胞集団は、本明細書で説明されるようなＣＡＲ分子（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ）、およびＴ細胞枯渇剤によって認識される標的タンパク質を発現する。一実施形態において、標的タンパク質は、ＣＤ２０である。標的タンパク質がＣＤ２０である実施形態において、Ｔ細胞枯渇剤は、抗ＣＤ２０抗体、例えばリツキシマブである。
上述の方法のさらなる実施形態において、方法は、細胞、例えば造血幹細胞、または骨髄を、哺乳動物に移植することをさらに含む。
別の態様において、本発明は、細胞移植の前に哺乳動物を調整する方法を特徴とする。方法は、ＣＡＲ核酸またはポリペプチド、例えばＣＤ１９ ＣＡＲ核酸またはポリペプチド、を含む細胞の有効量を哺乳動物に投与することを包含する。一部の実施形態において、細胞移植は、幹細胞移植、例えば造血幹細胞移植、または骨髄移植である。他の実施形態において、細胞移植前の対象の調整は、対象における標的を発現する細胞、例えば、ＣＤ１９を発現する正常細胞またはＣＤ１９を発現するがん細胞の数を低減させることを含む。
バイオポリマーのデリバリー法
いくつかの実施形態において、本明細書で開示された、１つまたは複数のＣＡＲ発現細胞を、対象に、バイオポリマー足場、例えば、バイオポリマーインプラントを介して、投与またはデリバリーすることができる。バイオポリマー足場は、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞のデリバリー、拡大、および／または分散を支援または増強し得る。バイオポリマー足場は、天然に存在する場合もあり、合成の場合もある、生体適合性ポリマー（例えば、炎症応答または免疫応答を実質的に誘導しない）および／または生体分解性ポリマーを含む。典型的なバイオポリマーは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる２０１５年３月１３日に出願された国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５の段落１００４～１００６において説明されている。
治療的適用
ＣＤ１９関連疾患および／または障害
一態様において、本発明は、ＣＤ１９発現に関連する疾患を処置する方法を提供する。一態様において、本発明は、がんの一部がＣＤ１９に関して陰性であり、がんの一部がＣＤ１９に関して陽性である疾患を処置する方法を提供する。例えば、本発明の方法および組成物は、ＣＤ１９の発現に関連する疾患の処置を受けたことがある対象を処置するのに有用であり、この場合、ＣＤ１９発現に関する処置、例えばＣＤ１９ ＣＡＲでの処置を受けたことがある対象は、ＣＤ１９の発現に関連する疾患を呈示する。
別の態様において、本発明は、Ｂ細胞抗原、例えばＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１の１つまたは複数、の発現に関連する疾患を処置する方法を提供する。一態様において、本発明は、腫瘍の一部がＢ細胞抗原に関して陰性であり、腫瘍の一部がＢ細胞抗原に関して陽性である疾患を処置する方法を提供する。例えば、本発明の組成物および方法は、Ｂ細胞抗原の発現に関連する疾患の処置を受けたことがある対象を処置するのに有用であり、この場合、Ｂ細胞抗原の発現に関する処置、例えばＢ細胞抗原を標的とするＣＡＲでの処置を受けたことがある対象は、Ｂ細胞抗原の発現に関連する疾患を呈示する。第三の態様において、本発明は、Ｂ細胞抗原の発現に関連する、例えば、ＣＤ１９および１つまたは複数の他のＢ細胞抗原の発現に関連する、疾患を処置する方法を提供する。
一態様において、本発明は、哺乳動物細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞における発現のためにプロモーターに機能するように連結したＣＤ１９ ＣＡＲを含むベクターに関する。一態様において、本発明は、ＣＤ１９を発現するがんの処置に使用するためのＣＤ１９ ＣＡＲを発現する組換え細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞を提供し、ここで前記ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する組換えＴ細胞は、ＣＤ１９ ＣＡＲＴと称される。一態様において、本明細書で説明されるＣＤ１９ ＣＡＲＴは、その表面上で発現される少なくとも１つのＣＤ１９ ＣＡＲとがん細胞を接触させることが可能であり、その結果、前記ＣＡＲＴが、前記がん細胞を標的とし、前記がんの成長を阻害する。
一態様において、本発明は、ＣＤ２２を発現する腫瘍の処置にＣＤ１９ ＣＡＲＴＳと組み合わせて使用するための、ＣＤ２２ ＣＡＲを発現するＣＤ２２ ＣＡＲＴ、例えばＴ細胞であるＣＤ２２阻害剤に関し、ここで前記ＣＤ２２ ＣＡＲを発現する組換えＴ細胞は、ＣＤ２２ ＣＡＲＴと称される。一態様において、本明細書で説明されるＣＤ２２ ＣＡＲＴは、その表面上で発現される少なくとも１つのＣＤ２２ ＣＡＲと腫瘍細胞を接触させることが可能であり、その結果、前記ＣＤ２２ ＣＡＲＴが、腫瘍細胞を標的とし、腫瘍の成長を阻害する。
一態様において、本発明は、ＣＤ１９を発現するがん細胞の成長を阻害する方法であって、前記がん細胞を、記載のＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＤ１９ ＣＡＲＴ細胞、および１つまたは複数のＣＡＲ発現細胞、例えば本明細書で説明されるようなものと接触させることを含み、その結果、前記ＣＡＲＴが抗原に応答して活性化され、前記がん細胞を標的とし、前記がんの成長が阻害される、方法に関する。ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えばＴ細胞は、Ｂ細胞阻害剤、例えば本明細書で説明されるＢ細胞阻害剤と組み合わせて投与される。
一部の実施形態において、ＣＤ１９阻害剤（例えば、ＣＤ１９に結合するＣＡＲ分子、例えば本明細書で説明されるＣＤ１９に結合するＣＡＲ分子、を発現する１つまたは複数の細胞）およびＢ細胞阻害剤（例えば、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１の１つまたは複数の阻害剤、例えば本明細書で説明されるようなもの）は、同時に投与される。一部の実施形態において、ＣＤ１９阻害剤およびＢ細胞阻害剤は、対象に同時に注入され、例えば、同じ注入容積で混合される。他の実施形態において、同時投与は、ＣＤ１９阻害剤およびＢ細胞阻害剤の別々の投与を含み、例えば、各々の投与が所定の時間間隔以内（例えば、互いに１５、３０または４５分以内）に開始される。
一部の実施形態において、ＣＤ１９阻害剤のデリバリーの開始とＢ細胞阻害剤のデリバリーの開始は、互いに１、２、３、４、６、１２、１８もしくは２４時間以内、または互いに１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、６０、８０もしくは１００日以内である。一部の実施形態において、ＣＤ１９阻害剤のデリバリーの終了とＢ細胞阻害剤のデリバリーの終了は、互いに１、２、３、４、６、１２、１８もしくは２４時間以内、または互いに１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、６０、８０もしくは１００日以内である。一部の実施形態において、ＣＤ１９阻害剤のデリバリー（例えば、注入）とＢ細胞阻害剤のデリバリー（例えば、注入）終了の間の投与に関する重複は、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０または４５分である。
一部の実施形態において、Ｂ細胞阻害剤は、ＣＤ１９に結合するＣＡＲ分子を発現する１つまたは複数の細胞が対象において存在する（例えば、拡大されている）間に投与される。一部の実施形態において、ＣＤ１９阻害剤は、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａの１つまたは複数に結合するＣＡＲ分子を発現する１種また
は複数の細胞が対象において存在する（例えば、拡大されている）間に投与される。
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するようにＴ細胞を遺伝子改変し、それを必要とするレシピエントにそのＣＡＲ Ｔ細胞を注入する、細胞療法のタイプを（とりわけ）包含する。注入される細胞は、レシピエントにおける腫瘍細胞を死滅させることが可能である。抗体療法と異なり、ＣＡＲで改変されたＴ細胞は、インビボにおける複製が可能であり、持続的な腫瘍制御につながり得る、長期にわたる持続性を結果としてもたらす。種々の態様において、患者に投与されたＴ細胞、またはそれらの子孫細胞は、Ｔ細胞の、患者への投与後、少なくとも４カ月間、５カ月間、６カ月間、７カ月間、８カ月間、９カ月間、１０カ月間、１１カ月間、１２カ月間、１３カ月間、１４カ月間、１５カ月間、１６カ月間、１７カ月間、１８カ月間、１９カ月間、２０カ月間、２１カ月間、２２カ月間、２３カ月間、２年間、３年間、４年間、または５年間にわたり、患者において存続する。
本発明は、例えば、インビトロで転写されるＲＮＡにより、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を一過性に発現するように免疫エフェクター細胞、例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞を改変し、それを必要とするレシピエントに、ＣＡＲ発現（例えば、ＣＡＲ Ｔ）細胞を注入する、細胞療法のタイプも包含する。注入される細胞は、レシピエントにおけるがん細胞を死滅させることが可能である。したがって、様々な態様において、患者に投与されたＣＡＲ発現細胞、例えばＴ細胞は、患者への該ＣＡＲ発現細胞、例えばＴ細胞の投与後、１カ月間未満、例えば、３週間、２週間、１週間にわたり存在する。
いかなる特定の理論にも縛られるつもりはないが、ＣＡＲで改変されたＴ細胞により惹起される抗がん免疫応答は、能動的免疫応答である場合もあり、受動的免疫応答である場合もあり、代替的に、間接的免疫応答と対比される直接的免疫応答に起因する場合もある。一態様において、ＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９－ＣＡＲ）が形質導入されたＴ細胞は、標的抗原（例えばＣＤ１９）を発現するヒトがん細胞に応答して、特異的な炎症促進性サイトカインの分泌および強力な細胞溶解活性を呈示し、可溶性標的抗原による阻害に抵抗し、バイスタンダー死滅を媒介し、確立されたヒトがんの退縮を媒介する。例えば、標的抗原を発現するがんの不均質場内の無抗原がん細胞は、標的抗原によりリダイレクトされたＴ細胞であって、隣接する抗原陽性がん細胞に対してあらかじめ反応しているＴ細胞による間接的破壊を受けやすい可能性がある。
一態様において、本発明のＣＡＲで改変された細胞、例えば完全ヒトＣＡＲ Ｔ細胞は、エクスビボでの免疫化のためのワクチンのタイプであってもよく、および／または哺乳動物におけるインビボ治療のためのワクチンのタイプであってもよい。一態様において、哺乳動物はヒトである。
エクスビボでの免疫化に関して、哺乳動物に細胞を投与する前に、インビトロで、以下：ｉ）細胞の拡大、ｉｉ）細胞へのＣＡＲをコードする核酸の導入、またはｉｉｉ）細胞の低温保存のうち少なくとも１つが行われる。
エクスビボの手法は当業界周知であり、以下でより詳細に論じられる。簡単に言えば、哺乳動物（例えば、ヒト）から細胞を単離し、本明細書で開示されたＣＡＲを発現するベクターで遺伝子改変する（すなわち、インビトロで形質導入またはトランスフェクトする）。ＣＡＲで改変された細胞を哺乳動物のレシピエントに投与することによって、治療的利益をもたらすことができる。哺乳動物のレシピエントはヒトであってもよいし、ＣＡＲで改変された細胞はレシピエントにとって自己であってもよい。その代わりに、細胞は、レシピエントにとって同種異系、同系または異種であってもよい。
エクスビボで造血幹および前駆細胞を拡大させる手法は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，１９９，９４２号で説明されており、本発明の細胞に適用することができる。他の好適な方法が当業界公知であり、それゆえに本発明は、いかなる特定のエクスビボでの細胞拡大方法にも限定されない。簡単に言えば、エクスビボでのＴ細胞の培養および拡大は、（１）末梢血液の回収物または骨髄外植片から、哺乳動物由来のＣＤ３４＋造血幹および前駆細胞を収集すること；および（２）このような細胞をエクスビボで拡大させることを含み得る。米国特許第５，１９９，９４２号で説明されている細胞成長因子に加えて、ｆｌｔ３－Ｌ、ＩＬ－１、ＩＬ－３およびｃ－ｋｉｔリガンドなどの他の因子を細胞の培養および拡大に使用することができる。
エクスビボでの免疫化に関して細胞ベースのワクチンを使用することに加えて、本明細書で説明される方法には、患者における抗原に対して向けられる免疫反応を惹起するためのインビボでの免疫化のための、組成物および方法も包含される。
一般的に、本明細書で説明されるように活性化され拡大された細胞は、免疫不全の個体において生じる疾患の処置および予防に利用することができる。特に、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞は、１つまたは複数のＢ細胞抗原の発現に関連する疾患、障害および状態の処置に使用される。ある特定の態様において、細胞は、１つまたは複数のＢ細胞抗原の発現に関連する疾患、障害および状態を発症するリスクがある患者の処置に使用される。したがって、本発明は、Ｂ細胞抗原の発現に関連する疾患、障害および状態の処置または予防のための方法であって、それを必要とする対象に、本明細書で説明されるＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞の治療有効量を、本明細書で説明されるＢ細胞阻害剤の１つまたは複数と組み合わせて投与することを含む方法を（とりわけ）提供する。
本発明は、増殖を阻害するためのまたはＣＤ１９発現細胞集団を低減させるための方法であって、ＣＤ１９発現細胞含む細胞集団を、該ＣＤ１９発現細胞と結合する本明細書で説明される抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞と接触させること、および前記ＣＤ１９発現細胞集団を本明細書で説明されるＢ細胞阻害剤の１つまたは複数と接触させることを含む方法も提供する。特異的な態様において、本発明は、ＣＤ１９を発現するがん細胞の増殖を阻害するためのまたはそのようながん細胞の集団を低減させるための方法であって、ＣＤ１９発現がん細胞集団を、ＣＤ１９発現細胞と結合する本明細書で説明される抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞と接触させること、および前記ＣＤ１９発現細胞を本明細書で説明される１つまたは複数のＢ細胞と接触させることを含む方法を提供する。一態様において、本発明は、ＣＤ１９を発現するがん細胞の増殖を阻害するためのまたはそのようながん細胞の集団を低減させるための方法であって、ＣＤ１９発現がん細胞集団を、ＣＤ１９発現細胞と結合する本明細書で説明される抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞と接触させること、および前記ＣＤ１９発現細胞を本明細書で説明される１つまたは複数のＢ細胞と接触させることを含む方法も提供する。ある特定の態様において、本明細書で説明される抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞と本明細書で説明される１つまたは複数のＢ細胞の組合せは、細胞および／またはがん細胞の量、数、数量またはパーセンテージを、ＣＤ１９発現細胞に関連する血液がんまたは別のがんを有する対象またはこれらのがんの動物モデルにおいて、陰性対照と比べて少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％低減させる。一態様において、対象はヒトである。
本発明は、増殖を阻害するためのまたはＣＤ１９発現細胞および第二のＢ細胞抗原を発現する細胞を含む細胞集団を低減させるための方法も提供する。一態様において、ＣＤ１９および第二のＢ細胞抗原は、集団内の同じ細胞によって発現される。別の態様において、ＣＤ１９および第二のＢ細胞抗原は、集団内の細胞の異なるサブセットによって発現される。別の態様において、ＣＤ１９および第二のＢ細胞抗原は、集団内の細胞の重複するサブセットによって発現され、したがって、ＣＤ１９および第二のＢ細胞抗原を発現する細胞もあり、ＣＤ１９を発現する細胞もあり、第二のＢ細胞抗原を発現する細胞もある。
本発明は、増殖を阻害するためのまたはＣＤ１９および第二のＢ細胞抗原を発現する細胞集団を低減させるための方法であって、（ｉ）ＣＤ１９発現細胞を含む細胞の集団を、ＣＤ１９発現細胞と結合する本明細書で説明される抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞と接触させること、および（ｉｉ）第二のＢ細胞抗原発現細胞を、第二のＢ細胞抗原発現細胞と結合する本明細書で説明される第二のＣＡＲ発現細胞と接触させることを含む方法も提供する。特異的な態様において、本発明は、ＣＤ１９および第二のＢ細胞抗原を発現するがん細胞の増殖を阻害するためのまたはそのようながん細胞の集団を低減させるための方法であって、（ｉ）ＣＤ１９発現がん細胞集団を、ＣＤ１９発現細胞と結合する本明細書で説明される抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞と接触させること、および（ｉｉ）第二のＢ細胞抗原発現細胞集団を、第二のＢ細胞抗原を発現する細胞と結合する本明細書で説明される第二のＣＡＲ発現細胞と接触させることを含む方法も提供する。一態様において、本発明は、ＣＤ１９および／もしくは第二のＢ細胞抗原を発現するがん細胞の増殖を阻害するためのまたはそのようながん細胞の集団を低減させるための方法であって、（ｉ）ＣＤ１９発現がん細胞集団を、ＣＤ１９発現細胞と結合する本明細書で説明される抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞と接触させること、および（ｉｉ）第二のＢ細胞抗原発現細胞集団を、第二のＢ細胞抗原を発現する細胞と結合する本明細書で説明される第二のＣＡＲ発現細胞と接触させることを含む方法を提供する。ある特定の態様において、本明細書で説明される抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞と本明細書で説明される第二のＣＡＲ発現細胞の組合せは、細胞および／またはがん細胞の量、数、数量またはパーセンテージを、ＣＤ１９および／または第二のＢ細胞抗原を発現する細胞に関連する血液がんまたは別のがんを有する対象またはこれらのがんの動物モデルにおいて、陰性対照と比べて少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％低減させる。一態様において、対象はヒトである。
本発明は、ＣＤ１９発現細胞に関連する疾患（例えば、ＣＤ１９を発現する血液がんまたは非定型的ながん）を予防、処置および／または管理するための方法であって、それを必要とする対象に、ＣＤ１９発現細胞と結合する抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞を投与すること、および本明細書で説明されるものまたはＢ細胞阻害剤を投与することを含む方法も提供する。一態様において、対象はヒトである。ＣＤ１９発現細胞に関連する障害の非限定的な例としては、自己免疫障害（例えば、狼瘡）、炎症性疾患（例えば、アレルギーおよび喘息）およびがん（例えば、ＣＤ１９を発現する血液がんまたは非定型的ながん）が挙げられる。
本発明は、ＣＤ１９および／または第二のＢ細胞抗原を発現する細胞に関連する疾患（例えば、ＣＤ１９および／または第二のＢ細胞抗原を発現する血液がんまたは非定型的ながん）を予防、処置および／または管理するための方法であって、それを必要とする対象に、ＣＤ１９発現細胞およびＢ細胞阻害剤と結合する抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞を投与することを含む方法も提供する。
本発明は、ＣＤ１９発現細胞に関連する疾患を予防、処置および／または管理するための方法であって、必要とする対象に、ＣＤ１９発現細胞と結合する本発明の抗ＣＤ１９ ＣＡＲＴ細胞を投与することを含む方法も提供する。一態様において、対象はヒトである。
本発明は、ＣＤ１９発現細胞に関連するがんの再発を予防する方法であって、それを必要とする対象に、ＣＤ１９発現細胞と結合する本発明の抗ＣＤ１９ ＣＡＲＴ細胞を投与することを含む方法も提供する。一態様において、方法は、それを必要とする対象に、ＣＤ１９発現細胞と結合する本明細書で説明される抗ＣＤ１９ ＣＡＲＴ細胞の有効量を、別の治療の有効量と組み合わせて投与することを含む。
一態様において、本発明は、対象におけるがんを処置する方法に関する。方法は、対象におけるがんを処置するために、本明細書で説明されるＣＤ１９発現細胞、例えばＴ細胞をＢ細胞阻害剤と組み合わせて対象に投与することを含む。本明細書で説明される方法によって処置可能であるがんの一例は、ＣＤ１９の発現に関連するがんである。一実施形態において、疾患は、固形または液性腫瘍である。一実施形態において、疾患は、血液がん、例えば本明細書で説明されるような血液がんである。
ＣＤ１９の発現に関連する非がん関連の徴候としては、例えば、自己免疫疾患（例えば、狼瘡）、炎症性障害（アレルギーおよび喘息）および移植が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態において、本明細書で説明される組合せで処置することができるがんは、多発性骨髄腫である。多発性骨髄腫は、骨髄への形質細胞クローンの蓄積を特徴とする血液のがんである。多発性骨髄腫の現行の治療としては、サリドマイドの類似体であるレナミドマイドでの処置が挙げられるが、これに限定されない。レナミドマイドは、抗腫瘍活性、血管新生阻害およびイムノモジュレーションを包含する活性を有する。一部の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲ、例えば本明細書で説明されるようなＣＤ１９ ＣＡＲは、骨髄腫細胞を処置するために使用することができる。一部の実施形態において、本明細書で説明される組合せは、１つまたは複数の追加の治療、例えばレナミドマイド処置とともに使用することができる。
本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞は、単独で投与してもよいし、あるいは希釈剤とおよび／または他の構成要素、例えばＩＬ－２または他のサイトカインもしくは細胞集団と組み合わせて医薬組成物として投与してもよい。
血液がん
血液がん状態とは、血液、骨髄およびリンパ系を冒す白血病、リンパ腫および悪性リンパ増殖性状態などのがんの型である
一実施形態において、血液がんは、白血病である。一実施形態において、がんは、これらに限定されないが、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を包含する、１種または複数の急性白血病；これらに限定されないが、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を包含する、１種または複数の慢性白血病；これらに限定されないが、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞の新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリーセル白血病、小細胞型または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性のリンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、脊髄形成異常および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞リンパ腫、形質細胞様樹状細胞の新生物、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、および骨髄の血液細胞の無効な産生（または異形成）を併せもつ血液学的な状態の多様な集合体である「前白血病状態」を包含する、追加の血液がんまたは血液学的状態からなる群より選択される。ＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２発現に関連する疾患としては、これらに限定されないが、ＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２を発現する非定型的および／または非典型的ながん、悪性腫瘍、前がん状態または増殖性疾患、ならびにそれらのあらゆる組合せが挙げられる。
白血病は、急性白血病および慢性白血病として分類することができる。急性白血病は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）としてさらに分類することができる。慢性白血病は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を包含する。他の関連する状態は、骨髄の血液細胞の無効な産生（または異形成）およびＡＭＬに形を変えるリスクを併せもつ血液学的な状態の多様な集合体である骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、旧称「前白血病状態」）を包含する。
リンパ腫は、リンパ球から発生する血液細胞腫瘍の一群である。典型的なリンパ腫としては、非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫が挙げられる。
一態様において、本発明は、ホジキンリンパ腫を有する哺乳動物を処置する方法であって、ＣＤ１９ ＣＡＲ分子、例えば本明細書で説明されるＣＤ１９ ＣＡＲ分子およびＢ細胞阻害剤を発現する細胞の有効量を前記哺乳動物に投与することを含む方法に関する。
ある態様において、本発明の組成物およびＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞は、非ホジキンリンパ腫、例えばＤＬＢＣＬ、濾胞性リンパ腫、またはＣＬＬなどの、Ｂ細胞悪性腫瘍を処置するのに特に有用である。
非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は、Ｂ細胞またはＴ細胞のいずれかから形成される、リンパ球のがんの一群である。ＮＨＬは、あらゆる年齢で起こり、多くの場合、正常なものより大きいリンパ節、体重減少および発熱を特徴とする。異なるＮＨＬ型は、中悪性度（aggressive）（急速進行）および低悪性度（緩徐進行）型として大別される。Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫は、バーキットリンパ腫、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、およびマントル細胞リンパ腫を包含する。Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫の例としては、菌状息肉症、未分化大細胞リンパ腫、および前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫が挙げられる。骨髄または幹細胞移植後に起こるリンパ腫は、通常はＢ細胞非ホジキンリンパ腫である。例えば、Maloney.NEJM.366.21(2012):2008-16を参照されたい。
びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）は、Ｂ細胞から発生するＮＨＬの一形態である。ＤＬＢＣＬは、リンパ節内またはリンパ系の外部、例えば、胃腸管、精巣、甲状腺、皮膚、乳房、骨または脳において生じ得る中悪性度リンパ腫である。ＤＬＢＣＬでは細胞の形状の３つの変異体、中心芽球型、免疫芽球型および未分化型が、一般に観察される。中心芽球型の形状が最もよく見られ、最小の細胞質を伴う中～大型リンパ球の外観を有する。ＤＬＢＣＬにはいくつかの亜型がある。例えば、原発性中枢神経系リンパ腫は、もっぱら脳を冒すＤＬＢＣＬの１つの型のことをいい、脳外の領域を冒すＤＬＢＣＬとは別ものとして処置される。ＤＬＢＣＬのもう１つの型は、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫であり、これは、多くの場合、若年患者において起こり、胸部で急速に進行する。ＤＬＢＣＬの症状としては、肥大したリンパ節に起因する頸部、腋窩部または鼠径部における無痛の急速な腫脹が挙げられる。一部の対象については、腫脹が有痛であることもある。ＤＬＢＣＬの他の症状としては、寝汗、原因不明の発熱、および体重減少が挙げられる。ＤＬＢＣＬを有するほとんどの患者は成人であるが、この疾患が小児において起こることもある。ＤＬＢＣＬの処置としては、化学療法（例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン、エトポシド）、抗生物質（例えば、リツキサン）、放射線、または幹細胞移植が挙げられる。
非ホジキンリンパ腫の１つの型である濾胞性リンパ腫は、少なくとも部分的に濾胞性のパターンを有する、濾胞中心Ｂ細胞（セントロサイトおよび中心芽球）のリンパ腫である。濾胞性リンパ腫細胞は、Ｂ細胞マーカーＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２２を発現する。濾胞性リンパ腫細胞は、一般に、ＣＤ５に関して陰性である。形態学的には、濾胞性リンパ腫腫瘍は、セントロサイト（くびれのある濾胞中心細胞または小細胞とも呼ばれる）と中心芽球（くびれのない大型濾胞中心細胞または大細胞とも呼ばれる）の混合物を含有する濾胞で構成されている。濾胞は、非悪性細胞、主にＴ細胞、によって包囲されている。濾胞は、主としてセントロサイトを含有し、少数の中心芽細胞を有する。世界保健機関（ＷＨＯ）は、形態学的にこの疾患を次のように分類している：グレード１［高倍率視野（ｈｐｆ）あたり＜５個の中心芽球］；グレード２（６～１５個の中心芽球／ｈｐｆ）；グレード３（＞１５個の中心芽球／ｈｐｆ）。グレード３は、以下のグレードにさらに細分される：グレード３Ａ（セントロサイトがまだ存在する）；グレード３Ｂ（濾胞がほぼ全て中心芽球からなる）。濾胞性リンパ腫の処置としては、化学療法、例えばアルキル化剤、ヌクレオシド類似体、アントラサイクリン含有レジメン、例えばＣＨＯＰと呼ばれる併用療法－シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン／プレドニゾロン、抗体（例えば、リツキシマブ）、放射免疫療法、および造血幹細胞移植が挙げられる。
ＣＣＬは、骨髄、血液、リンパ節および脾臓における新生物細胞増殖および蓄積を特徴とするＢ細胞悪性腫瘍である。ＣＬＬの診断時の年齢中央値は、約６５歳である。現行の処置としては、化学療法、放射線療法、生物学的療法、または骨髄移植が挙げられる。症状は、外科的に（例えば、肥大した脾臓の脾摘出術での除去）、または放射線療法（例えば、腫脹したリンパ節を減量すること）によって処置されることもある。ＣＬＬを処置するための化学療法剤としては、例えば、フルダラビン、２－クロロデオキシアデノシン（クラドリビン）、クロラムブシル、ビンクリスチン、ペントスタチン、シクロホスファミド、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈ）、ドキソルビシンおよびプレドニゾンが挙げられる。ＣＬＬのための生物学的療法としては、抗体、例えば、アレムツズマブ、リツキシマブおよびオファツムマブ；ならびにチロシンキナーゼ阻害剤療法が挙げられる。多数の基準、例えば、ＲａｉまたはＢｉｎｅｔシステムを使用して、ＣＬＬの病期を分類することができる。Ｒａｉシステムは、５つの病期を有するものとして（has having）ＣＬＬを説明する：リンパ球増加のみが存在する病期０；リンパ節腫大が存在する病期Ｉ；巨脾症、リンパ節腫大、または両方が存在する病期ＩＩ；貧血、臓器肥大、または両方が存在する病期ＩＩＩ（進行は体重減少、疲労、発熱、広範囲の臓器肥大、およびリンパ球数急増によって定義される）；および貧血、血小板減少症、臓器肥大、またはこれらの組合せが存在する病期ＩＶ。Ｂｉｎｅｔ病期分類システムのもとには３つのカテゴリーがある：リンパ球増加が存在し、３つ未満のリンパ節が肥大している病期Ａ（この病期は、Ｒａｉ病期０の患者全て、Ｒａｉ病期Ｉの患者の半分、およびＲａｉ病期ＩＩの患者の３分の１を含む）；３つ以上のリンパ節が罹患している病期Ｂ；および貧血もしくは血小板減少症、または両方が存在する病期Ｃ。これらの分類システムを免疫グロブリン遺伝子の突然変異の測定値と併用して、その疾患の状況のより正確な特徴付けを行うことができる。突然変異した免疫グロブリン遺伝子の存在は、予後改善と相関する。
別の実施形態において、本発明のＣＡＲ発現細胞は、例えば白血病幹細胞を用いて、がんまたは白血病を処置するために使用される。例えば、白血病幹細胞は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８－白血病細胞である。
ＣＤ２０およびＣＤ２２関連疾患および／または障害
本発明は、例えば、がんもしくは悪性腫瘍などの増殖性疾患または前がん状態を包含する、ＣＤ２０もしくはＣＤ２２の発現に関連する疾患またはＣＤ２０もしくはＣＤ２２を発現する細胞に関連する状態；あるいはＣＤ２０またはＣＤ２２を発現する細胞に関連する非がん関連の徴候を処置するための組成物および方法をとりわけ提供する。一態様において、ＣＤ２２の発現に関連するがんは、血液がん、例えば本明細書で説明される血液がんである。
ＣＤ２０またはＣＤ２２の発現に関連する非がん関連の徴候も包含され得る。ＣＤ２０またはＣＤ２２の発現に関連する非がん関連の徴候としては、例えば、自己免疫疾患（例えば、狼瘡、関節リウマチ、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少性紫斑病、エバンス症候群、血管炎、水疱性皮膚障害、１型糖尿病、シェーグレン症候群、抗ＮＭＤＡ受容体脳炎およびデビック病、グレーブス眼症、ならびに自己免疫性膵炎）、炎症性障害（アレルギーおよび喘息）および固形臓器移植または造血細胞移植が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で開示される組成物および方法は、これらに限定されないが、とりわけ、脊髄形成異常、貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症、再生不良性貧血、後天性赤芽球ろう（acquired pure red cell anemia）、ダイアモンド・ブラックファン貧血（Diamon-Blackfan anemia）、ファンコニ貧血、血球減少症、無巨核球性（amegakaryotic）血小板減少症、骨髄増殖性障害、真正赤血球増加症、本態性血小板増加症、骨髄線維症、ヘモグロビン異常症、鎌状赤血球症、重症型βサラセミアなどの血液疾患を処置するために使用することができる。
一態様において、本発明は、ＣＤ２２発現に関連する疾患を処置する方法を提供する。一態様において、本発明は、腫瘍の一部がＣＤ２０またはＣＤ２２に関して陰性であり、腫瘍の一部がＣＤ２０またはＣＤ２２に関して陽性である疾患を処置する方法を提供する。例えば、本発明のＣＡＲは、ＣＤ２０またはＣＤ２２の発現に関連する疾患の処置を受けたことがある対象を処置するのに有用であり、この場合、ＣＤ２０またはＣＤ２２９の発現に関する処置を受けたことがある対象は、ＣＤ２０またはＣＤ２２の発現に関連する疾患を呈示する。
一態様において、本発明は、ＣＤ２０またはＣＤ２２を発現する腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、前記腫瘍細胞を、本発明のＣＤ２０またはＣＤ２２ ＣＡＲ細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）と接触させることを含み、その結果、ＣＡＲＴが、抗原に応答して活性化され、がん細胞を標的とし、腫瘍の成長が阻害される、方法に関する。
一態様において、本発明は、対象におけるがんを処置する方法に関する。方法は、対象におけるがんを処置するために、本発明のＣＤ２０またはＣＤ２２ ＣＡＲ発現細胞（例えばＴ細胞またはＮＫ細胞）を対象に投与することを含む。本発明のＣＤ２０またはＣＤ２２ ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）によって処置可能であるがんの例は、ＣＤ２０またはＣＤ２２の発現に関連するがんである。本発明のＣＤ２０またはＣＤ２２ ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）によって処置可能であるがんの例としては、本明細書で説明される血液がんが挙げられるが、これに限定されない。
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）を遺伝子改変し、それを必要とするレシピエントにＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）を注入する、細胞療法のタイプを包含する。注入される細胞は、レシピエントにおける腫瘍細胞を死滅させることが可能である。抗体療法とは異なり、ＣＡＲで改変された細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）は、インビボでの複製が可能であり、持続的な腫瘍制御につながり得る、長期にわたる持続性を結果としてもたらす。様々な態様において、患者に投与された細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）、またはそれらの子孫細胞は、患者へのＴ細胞の投与後、少なくとも４カ月間、５カ月間、６カ月間、７カ月間、８カ月間、９カ月間、１０カ月間、１１カ月間、１２カ月間、１３カ月間、１４カ月間、１５カ月間、１６カ月間、１７カ月間、１８カ月間、１９カ月間、２０カ月間、２１カ月間、２２カ月間、２３カ月間、２年間、３年間、４年間、または５年間にわたり、患者において存続する。
本発明は、例えば、インビトロで転写されたＲＮＡにより、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を一過性に発現するように免疫エフェクター細胞、例えばＮＫ細胞またはＴ細胞を改変し、それを必要とするレシピエントに、ＣＡＲ発現（例えば、ＣＡＲＴまたはＣＡＲ発現ＮＫ細胞）細胞を注入する、細胞療法のタイプも包含する。注入される細胞は、レシピエントにおけるがん細胞を死滅させることが可能である。したがって、様々な態様において、ＣＡＲ発現細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞は、患者に投与され、患者へのＣＡＲ発現細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞の投与後、１カ月間未満、例えば、３週間、２週間、１週間にわたり存在する。
いかなる特定の理論にも縛られるつもりはないが、ＣＡＲで改変された細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）により惹起される抗腫瘍免疫応答は、能動的免疫応答である場合もあり、受動的免疫応答である場合もあり、代替的に、間接的免疫応答と対比される直接的免疫応答に起因する場合もある。一態様において、ＣＡＲが形質導入された細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）は、ＣＤ２０またはＣＤ２２を発現するヒトがん細胞に応答して、特異的な炎症促進性サイトカインの分泌および強力な細胞溶解活性を呈示し、可溶性ＣＤ２０またはＣＤ２２による阻害に抵抗し、バイスタンダー死滅を媒介し、確立されたヒト腫瘍の退縮を媒介する。例えば、ＣＤ２０またはＣＤ２２を発現する腫瘍の不均質場内の無抗原腫瘍細胞は、ＣＤ２０またはＣＤ２２によりリダイレクトされたＴ細胞であって、隣接する抗原陽性がん細胞に対してあらかじめ反応しているＴ細胞による間接的破壊を受けやすい可能性がある。
一態様において、本発明のＣＡＲで改変された細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）、例えば、完全ヒトＣＡＲ発現細胞は、エクスビボでの免疫化のためのワクチンのタイプであってもよく、および／または哺乳動物におけるインビボ治療のためのワクチンのタイプであってもよい。一態様において、哺乳動物はヒトである。
エクスビボでの免疫化に関しては、哺乳動物に細胞を投与する前に、次の少なくとも１つがインビトロで行われる：ｉ）細胞の拡大、ｉｉ）細胞へのＣＡＲをコードする核酸の導入、またはｉｉｉ）細胞の低温保存。
エクスビボの手法は当業界周知であり、以下でより詳細に論じられる。簡単に言えば、哺乳動物（例えば、ヒト）から細胞を単離し、本明細書で開示されるＣＡＲを発現するベクターで遺伝子改変する（すなわち、インビトロで形質導入またはトランスフェクトする）。ＣＡＲで改変された細胞を哺乳動物のレシピエントに投与することによって、治療的利益をもたらすことができる。哺乳動物のレシピエントはヒトであってもよいし、ＣＡＲで改変された細胞はレシピエントにとって自己であってもよい。その代わりに、細胞は、レシピエントにとって同種異系、同系または異種であってもよい。
エクスビボで造血幹および前駆細胞を拡大させる手法は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，１９９，９４２号で説明されており、本発明の細胞に適用することができる。他の好適な方法が当業界公知であり、それゆえに本発明は、いかなる特定のエクスビボでの細胞拡大方法にも限定されない。簡単に言えば、エクスビボでのＴ細胞の培養および拡大は、（１）末梢血液の回収物または骨髄外植片から、哺乳動物由来のＣＤ３４＋造血幹および前駆細胞を収集すること；および（２）このような細胞をエクスビボで拡大させることを含む。米国特許第５，１９９，９４２号で説明されている細胞成長因子に加えて、ｆｌｔ３－Ｌ、ＩＬ－１、ＩＬ－３およびｃ－ｋｉｔリガンドなどの他の因子を細胞の培養および拡大に使用することができる。
エクスビボでの免疫化に関して細胞ベースのワクチンを使用することに加えて、本発明はまた、患者中の抗原に対して向けられた免疫反応を惹起するための、インビボでの免疫化のための組成物および方法も提供する。
一般的に、本明細書で説明したようにして活性化され拡大させた細胞は、免疫不全の個体において生じた疾患の処置および予防で利用することができる。特に、本発明のＣＡＲで改変された細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）は、ＣＤ２０またはＣＤ２２の発現に関連する疾患、障害、および状態の処置において使用される。所定の態様において、本発明の細胞は、ＣＤ２０またはＣＤ２２の発現に関連する疾患、障害および状態を発症する危険性がある患者の処置に使用することができる。したがって、本発明は、ＣＤ２０またはＣＤ２２の発現に関連する疾患、障害、および状態の処置または予防のための方法であって、それを必要とする対象に、本発明のＣＡＲで改変された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
一態様において、本発明のＣＡＲ発現細胞は、がんもしくは悪性腫瘍などの増殖性疾患、または前がん状態を処置するために使用することができる。一態様において、ＣＤ２０またはＣＤ２２の発現に関連するがんは、細胞の異常成長を特徴とする血液がん、前白血病状態、過剰増殖性障害、過形成または異形成である。
本発明のＣＡＲで改変された細胞は、単独で投与されてもよいし、または希釈剤と、および／またはＩＬ－２もしくは他のサイトカインなどの他の成分もしくは細胞集団と組み合わせた医薬組成物として投与されてもよい。
本発明は、増殖を阻害するためのまたはＣＤ２０もしくはＣＤ２２発現細胞集団を低減させるための方法であって、ＣＤ２０またはＣＤ２２発現細胞を含む細胞の集団を、ＣＤ２０またはＣＤ２２発現細胞と結合する本発明のＣＤ２０またはＣＤ２２ ＣＡＲ発現細胞と接触させることを含む方法も提供する。特異的な態様において、本発明は、ＣＤ２０もしくはＣＤ２２を発現するがん細胞の増殖を阻害するためのまたはそのようながん細胞の集団を低減させるための方法であって、ＣＤ２０またはＣＤ２２発現がん細胞集団を、ＣＤ２０またはＣＤ２２発現細胞と結合する本発明のＣＤ２０またはＣＤ２２ ＣＡＲ発現細胞と接触させることを含む方法を提供する。一態様において、本発明は、ＣＤ２０もしくはＣＤ２２を発現するがん細胞の増殖を阻害するためのまたはそのようながん細胞の集団を低減させるための方法であって、ＣＤ２０またはＣＤ２２発現がん細胞集団を、ＣＤ２０またはＣＤ２２発現細胞と結合する本発明のＣＤ２０またはＣＤ２２ ＣＡＲＴと接触させることを含む方法を提供する。ある特定の態様において、本明細書のＣＤ２０またはＣＤ２２ ＣＡＲ発現細胞は、細胞および／またはがん細胞の量、数、数量またはパーセンテージを、ＣＤ２０またはＣＤ２２発現細胞に関連するＢ細胞悪性腫瘍もしくは別のがんを有する対象、またはそのような悪性腫瘍もしくはがんの動物モデルにおいて、陰性対照と比べて少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％低減させる。一態様において、対象はヒトである。
本発明は、ＣＤ２０またはＣＤ２２発現細胞に関連するがんの再発を予防する方法であって、それを必要とする対象に、ＣＤ２０またはＣＤ２２発現細胞と結合する本発明のＣＤ２０またはＣＤ２２ ＣＡＲ発現細胞を投与することを含む方法を提供する。一態様において、方法は、それを必要とする対象に、ＣＤ２０またはＣＤ２２発現細胞と結合する本明細書で説明されるＣＤ２０またはＣＤ２２ ＣＡＲ発現細胞の有効量を、別の治療の有効量と組み合わせて投与することを含む。
一部の実施形態において、ＣＤ２２発現細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ－１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ１０、ＣＤ３４および／またはＣＤ２０を発現する。ある特定の実施形態において、ＣＤ２２発現細胞は、ＣＤ１９を発現する。一部の実施形態において、ＣＤ２２発現細胞は、ＣＤ１９を発現しない。一部の実施形態において、ＣＤ２０発現細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ－１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ１０、ＣＤ３４および／またはＣＤ２２を発現する。ある特定の実施形態において、ＣＤ２０発現細胞は、ＣＤ１９を発現する。一部の実施形態において、ＣＤ２０発現細胞は、ＣＤ１９を発現しない。
一部の実施形態において、対象は、ＣＤ１９ ＣＡＲ療法に対する非応答例である。一部の実施形態において、対象は、ＣＤ１９ ＣＡＲ療法に対する部分応答例である。一部の実施形態において、対象は、ＣＤ１９ ＣＡＲ療法に対する完全応答例である。一部の実施形態において、対象は、ＣＤ１９ ＣＡＲ療法に対する非再発例である。一部の実施形態において、対象は、ＣＤ１９ ＣＡＲ療法に対する部分再発例である。一部の実施形態において、対象は、ＣＤ１９ ＣＡＲ療法に対する完全再発例である。
一部の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞での処置に以前に応答性であったがんまたは他の状態は、ＣＤ１９を発現しない。一部の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞での処置に以前に応答性であったがんまたは他の状態は、前記がんまたは他の状態がＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞での処置に応答性であったときと比べてＣＤ１９発現レベルの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％以上の低減を有する。一部の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞での処置に以前に応答性であったがんまたは他の状態は、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、またはそれらのいずれかの組合せを発現する。
一部の実施形態において、本発明のＣＤ２０またはＣＤ２２ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞で以前に処置されたがんまたは他の状態の再発後に投与される。一部の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞およびＣＤ２０またはＣＤ２２ＣＡＲ発現細胞は、本明細書で説明されるように、同時に投与される。
骨髄除去
一態様において、本発明は、骨髄除去のための組成物および方法を提供する。例えば、一態様において、本発明は、対象における既存の骨髄の少なくとも一部の除去のための組成物および方法を提供する。ある特定の場合において、本発明のＣＡＲを含むＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２ ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２陽性の骨髄の骨髄腫前駆細胞を除去することが、本明細書において説明される。
一態様において、本発明は、骨髄除去の方法であって、骨髄除去を必要とする対象に本発明のＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２発現ＣＡＲ細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）を投与することを含む方法を提供する。例えば、本方法は、骨髄移植または骨髄リコンディショニングが有益な治療戦略である疾患または障害を有する対象の既存の骨髄の一部または全てを除去するために使用することができる。一態様において、本明細書の他の箇所で説明されるＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２発現ＣＡＲ細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の投与を含む本発明の骨髄除去方法は、対象において骨髄移植の前に行われる。したがって、一態様において、本発明の方法は、骨髄または幹細胞移植の前の細胞調整レジメンを提供する。一態様において、骨髄移植は、幹細胞の移植を含む。骨髄移植は、自己または同種異系細胞の移植を含み得る。
本発明は、疾患または障害を処置する方法であって、本発明のＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２発現ＣＡＲ細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）を投与して、既存の骨髄の少なくとも一部を除去することを含む方法を提供する。この方法は、骨髄移植が有益であるあらゆる疾患または障害を処置するための処置レジメンの少なくとも一部として使用することができる。すなわち、本方法は、移植骨髄を必要とするあらゆる対象において使用することができる。一態様において、ＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２発現ＣＡＲ細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の投与を含む骨髄除去は、ＡＭＬの処置に有用である。ある特定の態様において、本方法による骨髄除去は、血液がん、固形腫瘍、血液疾患、代謝障害、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、リソソーム蓄積障害、および免疫不全の処置に有用である。
本明細書で開示される組成物および方法は、これらに限定されないが、本明細書で説明されるがん、例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫、ＡＬＬ、ＡＭＬ、ＣＬＬ、ＣＭＬ、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、ＤＬＢＣＬまたは濾胞性リンパ腫）および多発性骨髄腫を包含する、血液がんを処置するために、既存の骨髄の少なくとも一部を除去するために使用することができる。
一態様において、本発明は、がんを処置する方法であって、対象の骨髄の少なくとも一部が本発明のＣＤ２２ ＣＡＲ細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）によって除去される骨髄調整（bone marrow conditioning）を含む方法を提供する。例えば、ある特定の場合において、対象の骨髄は、悪性前駆細胞を含み、それをＣＤ２０またはＣＤ２２ ＣＡＲ細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の活性によって標的化し、排除することができる。一態様において、骨髄調整療法は、天然骨髄の除去後に対象に骨髄移植または幹細胞移植を投与することを含む。一態様において、骨髄リコンディショニング療法は、これらに限定されないが抗腫瘍ＣＡＲ療法、化学療法、照射線および同種のものを包含する、１種またはそれ以上の他の抗がん療法と併用される。
一態様において、骨髄移植または幹細胞移植の注入の前に、投与されたＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２ＣＡＲ発現細胞の除去が必要とされることがある。ＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２発現ＣＡＲ細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の除去は、これらに限定されないが、自殺遺伝子、ＲＮＡにコードされたＣＡＲを使用するＣＡＲの持続性制限、または抗体もしくは化学療法を包含する抗Ｔ細胞様式の使用を包含する、いずれの好適な戦略または処置を使用して果たしてもよい。
併用療法
本明細書で説明されるようなＣＡＲの組合せ（例えば、本明細書で説明されるＣＤ２０ ＣＡＲ、ＣＤ２２ ＣＡＲまたはＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば、それと１つまたは複数のＢ細胞阻害剤、例えば本明細書で説明されるようなＢ細胞阻害剤）を、他の公知の薬剤および療法と組み合わせて使用してもよい。
本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞（例えば、ＣＤ２０ ＣＡＲ、ＣＤ２２ ＣＡＲまたはＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞）、適宜、１種または複数のＢ細胞阻害剤、および／または少なくとも１種の追加の治療剤を、同じまたは別の組成物で同時に投与してもよいし、または逐次的に投与してもよい。逐次的な投与の場合、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞（例えば、ＣＤ２０ ＣＡＲ、ＣＤ２２ ＣＡＲまたはＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞）を最初に投与し、２番目に追加の薬剤を投与してもよいし、または投与順はその逆でもよい。
ＣＡＲ療法および／または他の治療剤（第二のＣＡＲ療法など）、手順、もしくはモダリティーは、障害が活性である期間において投与することもでき、寛解期間または疾患がそれほど活性でない期間において投与することもできる。ＣＡＲ療法は、他の処置の前に投与することもでき、他の処置と並列して投与することもでき、他の処置後に投与することもでき、障害の寛解時に投与することもできる。
例えば、一部の実施形態において、ＣＡＲ療法を、ＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２発現に関連する疾患、例えばがんを有する対象に投与する。対象を、応答性または再発の徴候についてアッセイしてもよい。一部の実施形態において、対象が１つまたは複数の再発の徴候、例えば、ＣＤ１９におけるフレームシフトおよび／または未成熟終止コドンを示した場合、追加の治療を投与する。実施形態において、追加の治療は、Ｂ細胞阻害剤である。ＣＤ１９療法を継続してもよく（例えば、検出可能ないくつかのＣＤ１９発現がん細胞が対象にまだ存在する場合）、または中止してもよい（例えば、損益分析が治療の中止を支持した場合）。
組み合わせて投与する場合、ＣＡＲ療法およびさらなる薬剤（例えば、第二の薬剤または第三の薬剤）、または全ての薬剤は、個別に、例えば、単剤療法として使用される各薬剤の量または投与量より高量または高用量で投与することもでき、これより低量または低用量で投与することもでき、これと同量または同用量で投与することもできる。ある特定の実施形態において、ＣＡＲ療法、追加の薬剤（例えば、２番目もしくは３番目の薬剤）、または全ての投与される量または投与量は、個別に、例えば、単剤療法として使用される各薬剤の量または投与量より低量または低投与量（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％の量または投与量）である。他の実施形態において、所望の効果（例えば、がんの処置）を結果としてもたらす、ＣＡＲ療法、さらなる薬剤（例えば、第二の薬剤または第三の薬剤）、または全ての薬剤の量または投与量は、同じ治療効果を達成するのに必要とされる個別に、例えば、単剤療法として使用される各薬剤の量または投与量より低量または低投与量（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％の低量または低投与量）である。
実施形態において、併用療法における治療薬の１つまたは複数は、抗体分子である。モノクローナル抗体療法を用いて、がん抗原を標的化することができる。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）療法は、標的分子を過剰発現する腫瘍細胞に対する補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞介在細胞毒性（ＡＤＣＣ）および直接細胞阻害またはアポトーシス誘導効果を包含する、複数のメカニズムによって強力な抗腫瘍効果を発揮することが証明されている。
さらなる態様において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞の組合せ（例えば、１つまたは複数のＢ細胞阻害剤と適宜組み合わせて、ＣＤ２０ ＣＡＲ、ＣＤ２２ ＣＡＲまたはＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞）は、外科手術、化学療法、放射線、ｍＴＯＲ経路阻害剤、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノール酸塩、およびＦＫ５０６、抗体、または他の免疫除去剤、例えばＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体もしくは他の抗体療法、シトキサン（cytoxin）、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、マイコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、ならびに放射線照射、ペプチドワクチン、例えばIzumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971で説明されているものと組み合わせた処置レジメンで使用することができる。
一実施形態において、本明細書で説明されるＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２ ＣＡＲ発現細胞（例えば、それと１つまたは複数のＢ細胞阻害剤）の組合せは、化学療法剤と組み合わせて使用することができる。典型的な化学療法剤としては、アントラサイクリン［例えば、ドキソルビシン（例えば、リポソーマルドキソルビシン（liposomal doxorubicin））］；ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン）；アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、ダカルバジン（decarbazine）、メルファラン、イフォスファミド、テモゾロマイド）；免疫細胞抗体（例えば、アレムツズマブ（alemtuzamab）、ゲムツズマブ、リツキシマブ、トシツモマブ）；代謝拮抗物質（例えば、葉酸アンタゴニスト、ピリミジン類似体、プリン類似体およびアデノシン－デアミナーゼ阻害剤（例えば、フルダラビン）など）；ＴＮＦＲグルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）アゴニスト；プロテアソーム阻害剤（例えば、アクラシノマイシンＡ、グリオトキシンまたはボルテゾミブ）；イムノモジュレーター、例えばサリドマイドまたはサリドマイド誘導体（例えば、レナリドマイド）が挙げられる。
併用療法で使用するために考慮される一般的な化学療法剤としては、アナストロゾール［Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標）］、ビカルタミド［Ｃａｓｏｄｅｘ（登録商標）］、硫酸ブレオマイシン［Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標）］、ブスルファン［Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標）］、ブスルファン注射剤［Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標）］、カペシタビン［Ｘｅｌｏｄａ（登録商標）］、Ｎ４－ペントキシカルボニル－５－デオキシ－５－フルオロシチジン、カルボプラチン［Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標）］、カルムスチン［ＢｉＣＮＵ（登録商標）］、クロラムブシル［Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標）］、シスプラチン［Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）］、クラドリビン［Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（登録商標）］、シクロホスファミド［Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）またはＮｅｏｓａｒ（登録商標）］、シタラビン、シトシンアラビノシド［Ｃｙｔｏｓａｒ－Ｕ（登録商標）］、シタラビンリポソーム注射剤［ＤｅｐｏＣｙｔ（登録商標）］、ダカルバジン［ＤＴＩＣ－Ｄｏｍｅ（登録商標）］、ダクチノマイシン［アクチノマイシンＤ、コスメガン（Ｃｏｓｍｅｇａｎ）］、塩酸ダウノルビシン［Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標）］、クエン酸ダウノルビシンリポソーム注射剤［ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標）］、デキサメタゾン、ドセタキセル［Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）］、塩酸ドキソルビシン［Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｒｕｂｅｘ（登録商標）］、エトポシド［Ｖｅｐｅｓｉｄ（登録商標）］、リン酸フルダラビン［Ｆｌｕｄａｒａ（登録商標）］、５－フルオロウラシル［Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標）、Ｅｆｕｄｅｘ（登録商標）］、フルタミド［Ｅｕｌｅｘｉｎ（登録商標）］、テザシチビン（ｔｅｚａｃｉｔｉｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ジフルオロデオキシシチジン）、ヒドロキシ尿素［Ｈｙｄｒｅａ（登録商標）］、イダルビシン［Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標）］、イフォスファミド［ＩＦＥＸ（登録商標）］、イリノテカン［Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標）］、Ｌ－アスパラギナーゼ［ＥＬＳＰＡＲ（登録商標）］、ロイコボリンカルシウム、メルファラン［Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標）］、６－メルカプトプリン［Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（登録商標）］、メトトレキセート［Ｆｏｌｅｘ（登録商標）］、ミトキサントロン［Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標）］、マイロターグ、パクリタキセル［Ｔａｘｏｌ（登録商標）］、ｎａｂ－パクリタキセル［Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）］、フェニックス（イットリウム９０／ＭＸ－ＤＴＰＡ）、ペントスタチン、カルムスチンインプラント含有ポリフェプロサン２０［Ｇｌｉａｄｅｌ（登録商標）］、クエン酸タモキシフェン［Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標）］、テニポシド［Ｖｕｍｏｎ（登録商標）］、６－チオグアニン、チオテパ、チラパザミン［Ｔｉｒａｚｏｎｅ（登録商標）］、注射用の塩酸トポテカン［Ｈｙｃａｍｐｔｉｎ（登録商標）］、ビンブラスチン［Ｖｅｌｂａｎ（登録商標）］、ビンクリスチン［Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標）］、およびビノレルビン［Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標）］が挙げられる。
化学療法剤と本明細書で説明されるＣＡＲ分子を発現する細胞との組合せでの処置を使用して、本明細書で説明される血液がん、例えばＡＭＬを処置することができる。実施形態において、化学療法剤とＣＡＲ発現細胞の組合せは、例えばＡＭＬを有する対象において、がん幹細胞、例えば白血病幹細胞を標的化する、例えば死滅させるのに有用である。実施形態において、化学療法剤とＣＡＲ発現細胞の組合せは、微小残存病変（ＭＲＤ）を処置するのに有用である。ＭＲＤは、処置、例えば化学療法中に、または処置後に、対象に残存する少数のがん細胞を指す。ＭＲＤは、再発の主原因であることが多い。本発明は、がん、例えばＭＲＤを処置する方法であって、ＣＡＲ発現細胞、例えば本明細書で説明されるようなＣＡＲ発現細胞と組み合わせて化学療法剤を投与することを含む方法を提供する。
ある実施形態において、化学療法剤は、ＣＡＲ分子、例えば本明細書で説明されるＣＡＲ分子、を発現する細胞の投与の前に投与される。化学療法剤の１回を超える投与が所望される化学療法レジメンの場合、ＣＡＲ分子、例えば本明細書で説明されるＣＡＲ分子、を発現する細胞の投与の前に化学療法レジメンを開始または完了する。実施形態において、ＣＡＲ分子を発現する細胞の投与の少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、２０日、２５日または３０日前に化学療法剤を投与する。実施形態において、ＣＡＲ分子を発現する細胞の投与の少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、２０日、２５日または３０日前に、化学療法レジメンを開始または完了する。実施形態において、前記化学療法剤は、がん細胞、例えば腫瘍細胞上のＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２の発現を、例えば正常細胞または非がん細胞上での発現と比較して、増加させる化学療法剤である。発現は、例えば、免疫組織化学染色またはフローサイトメトリー分析により、判定することができる。例えば、化学療法剤は、シタラビン（Ａｒａ－Ｃ）である。
本発明の化合物と組み合わせるための、特に目的の抗がん剤は、代謝拮抗剤；カルシウム依存性ホスファターゼであるカルシニューリンもしくはｐ７０Ｓ６キナーゼであるＦＫ５０６を阻害する薬物、またはｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する薬物；アルキル化剤；ｍＴＯＲ阻害剤；イムノモジュレーター；アントラサイクリン；ビンカアルカロイド；プロテアソーム（proteosome）阻害剤；ＧＩＴＲアゴニスト；タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤；ＣＤＫ４キナーゼ阻害剤；ＢＴＫキナーゼ阻害剤；ＭＫＮキナーゼ阻害剤；ＤＧＫキナーゼ阻害剤；または腫瘍崩壊ウイルスを含む。
典型的な代謝拮抗剤としては、限定ではないが、葉酸アンタゴニスト（本明細書では葉酸代謝拮抗薬とも称される）、ピリミジン類似体、プリン類似体およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤：メトトレキセート［Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ（登録商標）、Ｔｒｅｘａｌｌ（登録商標）］、５－フルオロウラシル［Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標）、Ｅｆｕｄｅｘ（登録商標）、Ｆｌｕｏｒｏｐｌｅｘ（登録商標）］、フロクスウリジン［ＦＵＤＦ（登録商標）］、シタラビン［Ｃｙｔｏｓａｒ－Ｕ（登録商標）、Ｔａｒａｂｉｎｅ ＰＦＳ］、６－メルカプトプリン［Ｐｕｒｉ－Ｎｅｔｈｏｌ（登録商標）］、６－チオグアニン［Ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ Ｔａｂｌｏｉｄ（登録商標）］、リン酸フルダラビン［Ｆｌｕｄａｒａ（登録商標）］、ペントスタチン［Ｎｉｐｅｎｔ（登録商標）］、ペメトレキセド［Ａｌｉｍｔａ（登録商標）］、ラルチトレキセド［Ｔｏｍｕｄｅｘ（登録商標）］、クラドリビン［Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（登録商標）］、クロファラビン［Ｃｌｏｆａｒｅｘ（登録商標）、Ｃｌｏｌａｒ（登録商標）］、メルカプトプリン［Ｐｕｒｉ－Ｎｅｔｈｏｌ（登録商標）］、カペシタビン［Ｘｅｌｏｄａ（登録商標）］、ネララビン［Ａｒｒａｎｏｎ（登録商標）］、アザシチジン［Ｖｉｄａｚａ（登録商標）］およびゲムシタビン［Ｇｅｍｚａｒ（登録商標）］が挙げられる。好ましい代謝拮抗剤としては、例えば、５－フルオロウラシル［Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標）、Ｅｆｕｄｅｘ（登録商標）、Ｆｌｕｏｒｏｐｌｅｘ（登録商標）］、フロクスウリジン［ＦＵＤＦ（登録商標）］、カペシタビン［Ｘｅｌｏｄａ（登録商標）］、ペメトレキセド［Ａｌｉｍｔａ（登録商標）］、ラルチトレキセド［Ｔｏｍｕｄｅｘ（登録商標）］およびゲムシタビン［Ｇｅｍｚａｒ（登録商標）］が挙げられる。
典型的なアルキル化剤としては、これらに限定されないが、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソウレアおよびトリアゼン）：ウラシルマスタード［Ａｍｉｎｏｕｒａｃｉｌ Ｍｕｓｔａｒｄ（登録商標）、Ｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎａｃｉｌ（登録商標）、Ｄｅｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｄｅｓｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｈａｅｍａｎｔｈａｍｉｎｅ（登録商標）、Ｎｏｒｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌｌｏｓｔ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌｍｏｓｔａｚａ（登録商標）、Ｕｒａｍｕｓｔｉｎ（登録商標）、Ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ（登録商標）］、ｃｈｌｏｒｍｅｔｈｉｎｅ［Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標）］、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｃｌａｆｅｎ（登録商標）、Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（商標））、イフォスファミド［Ｍｉｔｏｘａｎａ（登録商標）］、メルファラン［Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標）］、クロラムブシル［Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標）］、ピポブロマン［Ａｍｅｄｅｌ（登録商標）、Ｖｅｒｃｙｔｅ（登録商標）］、トリエチレンメラミン［Ｈｅｍｅｌ（登録商標）、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標）、Ｈｅｘａｓｔａｔ（登録商標）］、トリエチレンチオホスファラミン、テモゾロマイド［Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標）］、チオテパ［Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標）］、ブスルファン［Ｂｕｓｉｌｖｅｘ（登録商標）、Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標）］、カルムスチン［ＢｉＣＮＵ（登録商標）］、ロムスチン［ＣｅｅＮＵ（登録商標）］、ストレプトゾシン［Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標）］、およびダカルバジン［ＤＴＩＣ－Ｄｏｍｅ（登録商標）］が挙げられる。追加の典型的なアルキル化剤としては、これらに限定されないが、オキサリプラチン［Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標）］；テモゾロマイド［Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標）およびＴｅｍｏｄａｌ（登録商標）］；ダクチノマイシン［また、アクチノマイシン－Ｄとしても公知、Ｃｏｓｍｅｇｅｎ（登録商標）］；メルファラン［また、Ｌ－ＰＡＭ、Ｌ－サルコリシン、およびフェニルアラニンマスタードとしても公知、Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標）］；アルトレタミン［また、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）としても公知、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標）］；カルムスチン［ＢｉＣＮＵ（登録商標）］；ベンダムスチン［Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標）］；ブスルファン［Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標）およびＭｙｌｅｒａｎ（登録商標）］；カルボプラチン［Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標）］；ロムスチン［また、ＣＣＮＵとしても公知、ＣｅｅＮＵ（登録商標）］；シスプラチン（また、ＣＤＤＰとしても公知、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）およびＰｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）－ＡＱ）；クロラムブシル［Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標）］；シクロホスファミド［Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）およびＮｅｏｓａｒ（登録商標）］；ダカルバジン［また、ＤＴＩＣ、ＤＩＣおよびイミダゾールカルボキサミドとしても公知、ＤＴＩＣ－Ｄｏｍｅ（登録商標）］；アルトレタミン［また、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）としても公知、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標）］；イフォスファミド［Ｉｆｅｘ（登録商標）］；プレドニマスチン（prednumustine）；プロカルバジン［Ｍａｔｕｌａｎｅ（登録商標）］；メクロレタミン［また、ナイトロジェンマスタード、ムスチンおよび塩酸メクロレタミン（mechloroethamine）としても公知、Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標）］；ストレプトゾシン［Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標）］；チオテパ［また、チオホスファミド（thiophosphoamide）、ＴＥＳＰＡおよびＴＳＰＡとしても公知、Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標）］；シクロホスファミド［Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（登録商標）］；およびベンダムスチンＨＣｌ［Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標）］が挙げられる。
実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、フルダラビン、シクロホスファミド、および／またはリツキシマブと組み合わせて投与する。実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、フルダラビン、シクロホスファミド、およびリツキシマブ（ＦＣＲ）と組み合わせて投与する。実施形態において、対象は、ＣＬＬを有する。例えば、対象は、第１７染色体の短腕部における欠失［例えば、白血病性細胞におけるｄｅｌ（１７ｐ）］を有する。他の例において、対象は、ｄｅｌ（１７ｐ）を有さない。実施形態において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＩｇＶＨ）遺伝子において突然変異を含む白血病性細胞を含む。他の実施形態において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＩｇＶＨ）遺伝子において突然変異を含む白血病性細胞を含まない。実施形態において、フルダラビンを、約１０～５０ｍｇ／ｍ２（例えば、約１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、または４５～５０ｍｇ／ｍ２）の投与量で、例えば、静脈内投与する。実施形態において、シクロホスファミドを、約２００～３００ｍｇ／ｍ２（例えば、約２００～２２５、２２５～２５０、２５０～２７５、または２７５～３００ｍｇ／ｍ２）の投与量で、例えば、静脈内投与する。実施形態において、リツキシマブを、約４００～６００ｍｇ／ｍ２（例えば、４００～４５０、４５０～５００、５００～５５０、または５５０～６００ｍｇ／ｍ２）の投与量で、例えば、静脈内投与する。
実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、ベンダムスチンおよびリツキシマブと組み合わせて投与する。実施形態において、対象は、ＣＬＬを有する。例えば、対象は、第１７染色体の短腕部における欠失［例えば、白血病性細胞におけるｄｅｌ（１７ｐ）］を有する。他の例において、対象は、ｄｅｌ（１７ｐ）を有さない。実施形態において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＩｇＶＨ）遺伝子において突然変異を含む白血病性細胞を含む。他の実施形態において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＩｇＶＨ）遺伝子において突然変異を含む白血病性細胞を含まない。実施形態において、ベンダムスチンを、約７０～１１０ｍｇ／ｍ２（例えば、７０～８０、８０～９０、９０～１００、または１００～１１０ｍｇ／ｍ２）の投与量で、例えば、静脈内投与する。実施形態において、リツキシマブを、約４００～６００ｍｇ／ｍ２（例えば、４００～４５０、４５０～５００、５００～５５０、または５５０～６００ｍｇ／ｍ２）の投与量で、例えば、静脈内投与する。
実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、リツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、および／またはコルチコステロイド（例えば、プレドニゾン）と組み合わせて投与する。実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、リツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン（Ｒ－ＣＨＯＰ）と組み合わせて投与する。実施形態において、対象は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を有する。実施形態において、対象は、巨大腫瘤がない限局期ＤＬＢＣＬ（例えば、サイズ／直径が７ｃｍ未満である腫瘍を含む）を有する。実施形態において、対象を、Ｒ－ＣＨＯＰと組み合わせた放射線により処置する。例えば、対象に、Ｒ－ＣＨＯＰ（例えば、Ｒ－ＣＨＯＰの１～６サイクル、例えば、１、２、３、４、５、または６サイクル）に続いて、放射線を投与する。場合によって、対象に、Ｒ－ＣＨＯＰ（例えば、Ｒ－ＣＨＯＰの１～６サイクル、例えば、１、２、３、４、５、または６サイクル）に続いて、放射線を投与する。
実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、エトポシド、プレドニゾン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、および／またはリツキシマブと組み合わせて投与する。実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、エトポシド、プレドニゾン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、およびリツキシマブ（ＥＰＯＣＨ－Ｒ）と組み合わせて投与する。実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、用量を調整したＥＰＯＣＨ－Ｒ（ＤＡ－ＥＰＯＣＨ－Ｒ）と組み合わせて投与する。実施形態において、対象は、Ｂ細胞リンパ腫、例えば、Ｍｙｃが再構成された侵襲性Ｂ細胞リンパ腫を有する。
実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、リツキシマブおよび／またはレナリドマイドと組み合わせて投与する。レナリドマイド（（ＲＳ）－３－（４－アミノ－１－オキソ１，３－ジヒドロ－２Ｈ－イソインドール－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン）は、イムノモジュレーターである。実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、リツキシマブおよびレナリドマイドと組み合わせて投与する。実施形態において、対象は、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）またはマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）を有する。実施形態において、対象は、ＦＬを有し、かつてがん治療により処置されたことがない。実施形態において、レナリドマイドを、約１０～２０ｍｇ（例えば、１０～１５、または１５～２０ｍｇ）の投与量で、例えば、毎日投与する。実施形態において、リツキシマブを、約３５０～５５０ｍｇ／ｍ２（例えば、３５０～３７５、３７５～４００、４００～４２５、４２５～４５０、４５０～４７５、または４７５～５００ｍｇ／ｍ２）の投与量で、例えば、静脈内投与する。
典型的なｍＴＯＲ阻害剤としては、例えば、テムシロリムス；リダフォロリムス（公式には、デフォロリムス（deferolimus）、（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）－４－［（２Ｒ）－２［（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ、２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｚ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）－１，１８－ジヒドロキシ－１９，３０－ジメトキシ－１５，１７，２１，２３、２９，３５－ヘキサメチル－２，３，１０，１４，２０－ペンタオキソ－１１，３６－ジオキサ－４－アザトリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ－１６，２４，２６，２８－テトラエン－１２－イル］プロピル］－２－メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネートとして公知であり、また、ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としても公知であり、ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０６４３８３で説明されている）；エベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標）またはＲＡＤ００１）；ラパマイシン［ＡＹ２２９８９、Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ（登録商標）］；セマピモド（simapimod）（ＣＡＳ１６４３０１－５１－３）；テムシロリムス（emsirolimus）、（５－｛２，４－ビス［（３Ｓ）－３－メチルモルホリン－４－イル］ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７－イル｝－２－メトキシフェニル）メタノール（ＡＺＤ８０５５）；２－アミノ－８－［トランス－４－（２－ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］－６－（６－メトキシ－３－ピリジニル）－４－メチル－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７（８Ｈ）－オン（ＰＦ０４６９１５０２、ＣＡＳ１０１３１０１－３６－４）；およびＮ２－［１，４－ジオキソ－４－［［４－（４－オキソ－８－フェニル－４Ｈ－１－ベンゾピラン－２－イル）モルホリニウム－４－イル］メトキシ］ブチル］－Ｌ－アルギニルグリシル－Ｌ－α－アスパルチルＬ－セリン－、分子内塩（ＳＦ１１２６、ＣＡＳ９３６４８７－６７－１）（配列番号１３１６）、およびＸＬ７６５が挙げられる。
典型的なイムノモジュレーターとしては、例えば、アフツズマブ（Ｒｏｃｈｅ（登録商標）より入手可能）；ペグフィルグラスチム［Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標）］；レナリドマイド［ＣＣ－５０１３、Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（登録商標）］；サリドマイド［Ｔｈａｌｏｍｉｄ（登録商標）］、アクチミド（ＣＣ４０４７）；およびＩＲＸ－２（インターロイキン１、インターロイキン２、およびインターフェロンγなどのヒトサイトカインの混合物、ＣＡＳ９５１２０９－７１－５、ＩＲＸ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓより入手可能）が挙げられる。
典型的なアントラサイクリンとしては、例えば、ドキソルビシン［Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）およびＲｕｂｅｘ（登録商標）］；ブレオマイシン［ｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標）］；ダウノルビシン［塩酸ダウノルビシン（dauorubicin hydrochloride）、ダウノマイシン、および塩酸ルビドマイシン、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標）］；ダウノルビシンリポソーム［クエン酸ダウノルビシンリポソーム、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標）］；ミトキサントロン［ＤＨＡＤ、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標）］；エピルビシン［Ｅｌｌｅｎｃｅ（商標）］；イダルビシン［Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｉｄａｍｙｃｉｎ ＰＦＳ（登録商標）］；マイトマイシンＣ［Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（登録商標）］；ゲルダナマイシン；ハービマイシン；ラビドマイシン；およびデスアセチルラビドマイシンが挙げられる。
典型的なビンカアルカロイドとしては、例えば、酒石酸ビノレルビン［Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標）］、ビンクリスチン［Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標）］、およびビンデシン［Ｅｌｄｉｓｉｎｅ（登録商標）］；ビンブラスチン［また、硫酸ビンブラスチン、ビンカロイコブラスチンおよびＶＬＢとしても公知、Ａｌｋａｂａｎ－ＡＱ（登録商標）およびＶｅｌｂａｎ（登録商標）］；およびビノレルビン［Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標）］が挙げられる。
典型的なプロテオソーム阻害剤としては、ボルテゾミブ［Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標）］；カーフィルゾミブ（ＰＸ－１７１－００７、（Ｓ）－４－メチル－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－４－メチル－１－（（Ｒ）－２－メチルオキシラン－２－イル）－１－オキソペンタン－２－イル）アミノ）－１－オキソ－３－フェニルプロパン－２－イル）－２－（（Ｓ）－２－（２－モルホリノアセトアミド）－４－フェニルブタンアミド）－ペンタンアミド）；マリゾミブ（ＮＰＩ－００５２）；クエン酸イキサゾミブ（ＭＬＮ－９７０８）；デランゾミブ（ＣＥＰ－１８７７０）；およびＯ－メチル－Ｎ－［（２－メチル－５－チアゾリル）カルボニル］－Ｌ－セリル－Ｏ－メチル－Ｎ－［（１Ｓ）－２－［（２Ｒ）－２－メチル－２－オキシラニル］－２－オキソ－１－（フェニルメチル）エチル］－Ｌ－セリンアミド（ＯＮＸ－０９１２）が挙げられる。
実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、ブレンツキシマブと組み合わせて投与する。ブレンツキシマブとは、抗ＣＤ３０抗体とモノメチルアウリスタチンＥとの抗体－薬物コンジュゲートである。実施形態において、対象は、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、例えば、再発性ＨＬまたは不応性ＨＬを有する。実施形態において、対象は、ＣＤ３０＋ ＨＬを含む。実施形態において、対象は、自己幹細胞移植（ＡＳＣＴ）を受けている。実施形態において、対象は、ＡＳＣＴを経ていない。実施形態において、ブレンツキシマブを、約１～３ｍｇ／ｋｇ（例えば、約１～１．５、１．５～２、２～２．５、または２．５～３ｍｇ／ｋｇ）の投与量で、例えば、静脈内において、例えば、３週間ごとに投与する。
実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、ブレンツキシマブおよびダカルバジンと組み合わせるか、またはブレンツキシマブおよびベンダムスチンと組み合わせて投与する。ダカルバジンとは、化学名を５－（３，３－ジメチル－１－トリアゼニル）イミダゾール－４－カルボキサミドとするアルキル化剤である。ベンダムスチンとは、化学名を４－［５－［ビス（２－クロロエチル）アミノ］－１－メチルベンズイミダゾール－２－イル］ブタン酸とするアルキル化剤である。実施形態において、対象は、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）を有する。実施形態において、対象は、かつてがん治療により処置されたことがない。実施形態において、対象は、少なくとも６０歳であり、例えば、６０、６５、７０、７５、８０、８５歳、またはこれを超える。実施形態において、ダカルバジンを、約３００～４５０ｍｇ／ｍ２（例えば、約３００～３２５、３２５～３５０、３５０～３７５、３７５～４００、４００～４２５、または４２５～４５０ｍｇ／ｍ２）の投与量で、例えば、静脈内投与する。実施形態において、ベンダムスチンを、約７５～１２５ｍｇ／ｍ２（例えば、７５～１００、または１００～１２５ｍｇ／ｍ２の投与量で、例えば、約９０ｍｇ／ｍ２）、例えば、静脈内投与する。実施形態において、ブレンツキシマブを、約１～３ｍｇ／ｋｇ（例えば、約１～１．５、１．５～２、２～２．５、または２．５～３ｍｇ／ｋｇ）の投与量で、例えば、静脈内において、例えば、３週間ごとに投与する。
いくつかの実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、ＣＤ２０阻害剤、例えば、抗ＣＤ２０抗体（例えば、抗ＣＤ２０単一特異性抗体または抗ＣＤ２０二特異性抗体）またはそのフラグメントと組み合わせて投与する。例示的な抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブ、オビヌツズマブ、ＴＲＵ－０１５（Ｔｒｕｂｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、オカラツズマブ、およびＰｒｏ１３１９２１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を含むがこれらに限定されない。例えば、Lim et al. Haematologica. 95.1(2010):135-43を参照されたい。
いくつかの実施形態において、抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブを含む。リツキシマブとは、例えば、www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdfにおいて説明されている通りに、ＣＤ２０に結合し、ＣＤ２０を発現する細胞の細胞溶解を引き起こす、マウス／ヒトキメラモノクローナル抗体ＩｇＧ１カッパ鎖である。実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、リツキシマブと組み合わせて投与する。実施形態において、対象は、ＣＬＬまたはＳＬＬを有する。
一部の実施形態において、リツキシマブを、例えば静脈内注入として、静脈内投与する。例えば、各回の注入は、約５００～２０００ｍｇ（例えば、約５００～５５０、５５０～６００、６００～６５０、６５０～７００、７００～７５０、７５０～８００、８００～８５０、８５０～９００、９００～９５０、９５０～１０００、１０００～１１００、１１００～１２００、１２００～１３００、１３００～１４００、１４００～１５００、１５００～１６００、１６００～１７００、１７００～１８００、１８００～１９００、または１９００～２０００ｍｇ）のリツキシマブを施す。一部の実施形態において、リツキシマブを、１５０ｍｇ／ｍ２～７５０ｍｇ／ｍ２、例えば、約１５０～１７５ｍｇ／ｍ２、１７５～２００ｍｇ／ｍ２、２００～２２５ｍｇ／ｍ２、２２５～２５０ｍｇ／ｍ２、２５０～３００ｍｇ／ｍ２、３００～３２５ｍｇ／ｍ２、３２５～３５０ｍｇ／ｍ２、３５０～３７５ｍｇ／ｍ２、３７５～４００ｍｇ／ｍ２、４００～４２５ｍｇ／ｍ２、４２５～４５０ｍｇ／ｍ２、４５０～４７５ｍｇ／ｍ２、４７５～５００ｍｇ／ｍ２、５００～５２５ｍｇ／ｍ２、５２５～５５０ｍｇ／ｍ２、５５０～５７５ｍｇ／ｍ２、５７５～６００ｍｇ／ｍ２、６００～６２５ｍｇ／ｍ２、６２５～６５０ｍｇ／ｍ２、６５０～６７５ｍｇ／ｍ２、または６７５～７００ｍｇ／ｍ２（表記中、ｍ２は、対象の体表面積を指し示す）の用量で投与する。一部の実施形態において、リツキシマブを少なくとも４日間、例えば、４、７、１４、２１、２８、３５日間、またはこれを超える投与間隔で投与する。例えば、リツキシマブを少なくとも０．５週間、例えば、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８週間、またはこれを超える投与間隔で投与する。一部の実施形態において、リツキシマブを、本明細書で説明される用量および投与間隔で、ある期間、例えば、少なくとも２週間、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０週間、またはこれを超える期間にわたり投与する。例えば、リツキシマブを、本明細書で説明される用量および投与間隔で、処置サイクル１つあたり、のべ少なくとも４回の投与（例えば、処置サイクル１つあたり、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６回、またはこれを超える投与）にわたり投与する。
一部の実施形態において、抗ＣＤ２０抗体は、オファツムマブを含む。オファツムマブとは、分子量を約１４９ｋＤａとする、抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１κヒトモノクローナル抗体である。例えば、オファツムマブは、トランスジェニックマウスおよびハイブリドーマ技術を使用して生成し、組換えマウス細胞株（ＮＳ０）から発現し、精製する。例えば、www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf；ならびに臨床試験識別番号ＮＣＴ０１３６３１２８、ＮＣＴ０１５１５１７６、ＮＣＴ０１６２６３５２およびＮＣＴ０１３９７５９１を参照されたい。実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、オファツムマブと組み合わせて投与する。実施形態において、対象は、ＣＬＬまたはＳＬＬを有する。
一部の実施形態において、オファツムマブを静脈内注入として投与する。例えば、各回の注入は、約１５０～３０００ｍｇ（例えば、約１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～３５０、３５０～４００、４００～４５０、４５０～５００、５００～５５０、５５０～６００、６００～６５０、６５０～７００、７００～７５０、７５０～８００、８００～８５０、８５０～９００、９００～９５０、９５０～１０００、１０００～１２００、１２００～１４００、１４００～１６００、１６００～１８００、１８００～２０００、２０００～２２００、２２００～２４００、２４００～２６００、２６００～２８００、または２８００～３０００ｍｇ）のオファツムマブを施す。実施形態において、オファツムマブを、約３００ｍｇの出発投与量に続いて、２０００ｍｇで、例えば、約１１回の投与、例えば、２４週間にわたり投与する。いくつかの実施形態において、オファツムマブを、少なくとも４日間、例えば、４、７、１４、２１、２８、３５日間、またはこれを超える投与間隔で投与する。例えば、オファツムマブを、少なくとも１週間、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、２６、２８、２０、２２、２４、２６、２８、３０週間、またはこれを超える投与間隔で投与する。いくつかの実施形態において、オファツムマブを、本明細書で説明される用量および投与間隔で、ある期間、例えば、少なくとも１週間、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、４０、５０、６０週間、もしくはこれを超える期間、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２カ月間、もしくはこれを超える期間、または１、２、３、４、５年間、もしくはこれを超える期間にわたり投与する。例えば、オファツムマブを、本明細書で説明される用量および投与間隔で、処置サイクル１つあたり、のべ少なくとも２回の投与（例えば、処置サイクル１つあたり、少なくとも、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０回、またはこれを超える投与）にわたり投与する。
場合によって、抗ＣＤ２０抗体は、オクレリズマブを含む。オクレリズマブとは、例えば、臨床試験識別番号ＮＣＴ０００７７８７０、ＮＣＴ０１４１２３３３、ＮＣＴ００７７９２２０、ＮＣＴ００６７３９２０、ＮＣＴ０１１９４５７０、およびKappos et al. Lancet. 19.378(2011):1779-87において説明されている、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。
場合によって、抗ＣＤ２０抗体は、ベルツズマブを含む。ベルツズマブとは、ＣＤ２０に対するヒト化モノクローナル抗体である。例えば、臨床試験識別番号ＮＣＴ００５４７０６６、ＮＣＴ００５４６７９３、ＮＣＴ０１１０１５８１、およびGoldenberg et al. Leuk Lymphoma. 51(5) (2010):747-55を参照されたい。
場合によって、抗ＣＤ２０抗体は、ＧＡ１０１を含む。ＧＡ１０１（オビヌツズマブまたはＲＯ５０７２７５９ともまた呼ばれる）とは、ヒト化され、糖鎖加工された、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。例えば、Robak. Curr. Opin. Investig. Drugs. 10.6(2009):588-96；臨床試験識別番号ＮＣＴ０１９９５６６９、ＮＣＴ０１８８９７９７、ＮＣＴ０２２２９４２２、およびＮＣＴ０１４１４２０５；ならびにwww.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdfを参照されたい。
場合によって、抗ＣＤ２０抗体は、ＡＭＥ－１３３ｖを含む。ＡＭＥ－１３３ｖ（ＬＹ２４６９２９８またはオカラツズマブともまた呼ばれる）は、ＣＤ２０に対するヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体であって、リツキシマブと比較して、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体に対するアフィニティーを増加させ、抗体依存性細胞介在性細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性を増強した、ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。例えば、Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25；およびForero-Torres et al. Clin Cancer Res. 18.5(2012):1395-403を参照されたい。
場合によって、抗ＣＤ２０抗体は、ＰＲＯ１３１９２１を含む。ＰＲＯ１３１９２１とは、リツキシマブと比較して、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合が良好となり、ＡＤＣＣが増強されるように加工された、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。例えば、Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25；およびCasulo et al. Clin Immunol. 154.1(2014):37-46；ならびに臨床試験識別番号ＮＣＴ００４５２１２７を参照されたい。
場合によって、抗ＣＤ２０抗体は、ＴＲＵ－０１５を含む。ＴＲＵ－０１５とは、ＣＤ２０に対する抗体のドメインに由来する、抗ＣＤ２０融合タンパク質である。ＴＲＵ－０１５は、モノクローナル抗体より小型であるが、Ｆｃに媒介されるエフェクター機能を保持する。例えば、Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25を参照されたい。ＴＲＵ－０１５は、ヒトＩｇＧ１のヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインに連結されているが、ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインを欠く、抗ＣＤ２０単鎖可変性フラグメント（ｓｃＦｖ）を含有する。
いくつかの実施形態において、本明細書で説明される抗ＣＤ２０抗体を、本明細書で説明される治療剤、例えば、化学療法剤（例えば、シトキサン、フルダラビン、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、脱メチル化剤、ペプチドワクチン、抗腫瘍抗生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、アルキル化剤、抗微小管剤または抗有糸分裂薬剤）、抗アレルギー剤、吐き気止め（または制吐剤）、鎮痛剤、または細胞保護剤にコンジュゲートさせるか、または他の形で結合させる。
実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、Ｂ細胞リンパ腫２（ＢＣＬ－２）阻害剤（例えば、ＡＢＴ－１９９またはＧＤＣ－０１９９ともまた呼ばれるベネトクラクス）および／またはリツキシマブと組み合わせて投与する。実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、ベネトクラクスおよびリツキシマブと組み合わせて投与する。ベネトクラクスとは、抗アポトーシスタンパク質であるＢＣＬ－２を阻害する低分子である。ベネトクラクス｛４－（４－｛［２－（４－クロロフェニル）－４，４－ジメチルシクロへキス－１－エン－１－イル］メチル｝ピペラジン－１－イル）－Ｎ－（｛３－ニトロ－４－［（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イルメチル）アミノ］フェニル｝スルホニル）－２－（１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－５－イルオキシ）ベンズアミド｝の構造を、下記に示す。
Figure 0007227331000012
実施形態において、対象は、ＣＬＬを有する。実施形態において、対象は、再発性ＣＬＬを有し、例えば、対象は、かつて、がん治療を投与されたことがある。実施形態において、ベネトクラクスを、約１５～６００ｍｇ（例えば、１５～２０、２０～５０、５０～７５、７５～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、または５００～６００ｍｇ）の投与量で、例えば、毎日投与する。実施形態において、リツキシマブを、約３５０～５５０ｍｇ／ｍ２（例えば、３５０～３７５、３７５～４００、４００～４２５、４２５～４５０、４５０～４７５、または４７５～５００ｍｇ／ｍ２）の投与量で、例えば、静脈内において、例えば、毎月投与する。
いくつかの実施形態において、本明細書で説明される１つまたは複数のＣＡＲ発現細胞（例えば、ＣＡＲ）を、オキサリプラチンと組み合わせて投与する。実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、オキサリプラチンと組み合わせて投与して、がん、例えば、固形がん、例えば、前立腺がん、膵臓がん、または肺がんを処置する。いくつかの実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、腫瘍崩壊ウイルスと組み合わせて投与する。実施形態において、腫瘍崩壊ウイルスは、がん細胞において選択的に複製され、がん細胞の死を惹起するか、またはその増殖を遅らせることが可能である。場合によって、腫瘍崩壊ウイルスは、非がん細胞に対して影響を及ぼさないか、またはその影響が最小限である。腫瘍崩壊ウイルスは、腫瘍崩壊アデノウイルス、腫瘍崩壊単純ヘルペスウイルス、腫瘍崩壊レトロウイルス、腫瘍崩壊パルボウイルス、腫瘍崩壊ワクシニアウイルス、腫瘍崩壊シンドビスウイルス、腫瘍崩壊インフルエンザウイルス、または腫瘍崩壊ＲＮＡウイルス［例えば、腫瘍崩壊レオウイルス、腫瘍崩壊ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、腫瘍崩壊麻疹ウイルス、または腫瘍崩壊水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）］を含むがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態において、腫瘍崩壊ウイルスとは、ウイルス、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、ＵＳ２０１０／０１７８６８４Ａ１において説明されている、組換え腫瘍崩壊ウイルスである。いくつかの実施形態において、組換え腫瘍崩壊ウイルスは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、ＵＳ２０１０／０１７８６８４Ａ１において説明されている、免疫応答または炎症応答の阻害剤をコードする核酸配列（例えば、異種核酸配列）を含む。実施形態において、組換え腫瘍崩壊ウイルス、例えば、腫瘍崩壊ＮＤＶは、アポトーシス促進性タンパク質（例えば、アポプチン）、サイトカイン（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、インターフェロンガンマ、インターロイキン２（ＩＬ－２）、腫瘍壊死因子アルファ）、免疫グロブリン（例えば、ＥＤ－Ｂフィブロネクチンに対する抗体）、腫瘍関連抗原、二特異性アダプタータンパク質（例えば、ＮＤＶ ＨＮタンパク質およびＣＤ３またはＣＤ２８などのＴ細胞共刺激受容体に対して方向付けられた、二特異性抗体または二特異性抗体フラグメント；またはヒトＩＬ－２と、ＮＤＶ ＨＮタンパク質に対して方向付けられた単鎖抗体との融合タンパク質）を含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Zamarin et al. Future Microbiol. 7.3(2012):347-67を参照されたい。いくつかの実施形態において、腫瘍崩壊ウイルスとは、それらの各々が参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、ＵＳ８５９１８８１Ｂ２、ＵＳ２０１２／０１２２１８５Ａ１、またはＵＳ２０１４／０２７１６７７Ａ１において説明されている、キメラ腫瘍崩壊ＮＤＶである。
いくつかの実施形態において、腫瘍崩壊ウイルスは、がん細胞においてもっぱら複製されるように設計された、条件づけ複製型アデノウイルス（ＣＲＡｄ）を含む。例えば、Alemany et al. Nature Biotechnol. 18(2000):723-27を参照されたい。いくつかの実施形態において、腫瘍崩壊アデノウイルスは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Alemany et al.の７２５頁の表１において説明されている、腫瘍崩壊アデノウイルスを含む。
例示的な腫瘍崩壊ウイルスは、以下：
群Ｂ腫瘍崩壊アデノウイルス（ＣｏｌｏＡｄ１）（ＰｓｉＯｘｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｔｄ．）（例えば、臨床試験識別子：ＮＣＴ０２０５３２２０を参照されたい）；
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）を含むアデノウイルスである、ＯＮＣＯＳ－１０２（旧称：ＣＧＴＧ－１０２）（Ｏｎｃｏｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）（例えば、臨床試験識別子：ＮＣＴ０１５９８１２９を参照されたい）；
ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼをコードする、遺伝子改変された腫瘍崩壊ヒトアデノウイルスである、ＶＣＮ－０１（ＶＣＮ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓ．Ｌ．）（例えば、臨床試験識別子：ＮＣＴ０２０４５６０２およびＮＣＴ０２０４５５８９を参照されたい）；
網膜芽細胞腫／Ｅ２Ｆ経路が調節異常であるがん細胞（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｃａｔａｌａ ｄ’Ｏｎｃｏｌｏｇｉａ）において選択的に複製されるように改変された、野生型ヒトアデノウイルス血清型５（Ｈａｄ５）に由来するウイルスである、条件づけ複製型アデノウイルスであるＩＣＯＶＩＲ－５（例えば、臨床試験識別子：ＮＣＴ０１８６４７５９を参照されたい）；
腫瘍崩壊アデノウイルスである、ＩＣＯＶＩＲ５を感染させた骨髄由来の自己間葉系幹細胞（ＭＳＣ）（Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｉｎｆａｎｔｉｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉｏ Ｎｉｎｏ Ｊｅｓｕｓ、Ｍａｄｒｉｄ、Ｓｐａｉｎ／ Ｒａｍｏｎ Ａｌｅｍａｎｒｙ）を含む、Ｃｅｌｙｖｉｒ（例えば、臨床試験識別子：ＮＣＴ０１８４４６６１を参照されたい）；
ヒトＥ２Ｆ－１プロモーターが、不可欠のＥ１ウイルス遺伝子の発現を駆動し、これにより、ウイルスの複製および細胞毒性を、Ｒｂ経路欠損腫瘍細胞に制限する、条件づけ複製型腫瘍崩壊血清型５アデノウイルス（Ａｄ５）である、ＣＧ００７０（Ｃｏｌｄ Ｇｅｎｅｓｙｓ，Ｉｎｃ．）（例えば、臨床試験識別子：ＮＣＴ０２１４３８０４を参照されたい）；または
網膜芽細胞腫（Ｒｂ）経路欠損細胞において選択的に複製され、インテグリンに結合するある特定のＲＧＤを発現する細胞により効率的に感染するように加工されたアデノウイルスである、ＤＮＸ－２４０１（旧称：Ｄｅｌｔａ－２４－ＲＧＤ）（Ｃｌｉｎｉｃａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ ｄｅ Ｎａｖａｒｒａ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ ｄｅ Ｎａｖａｒｒａ／ＤＮＡｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．）（例えば、臨床試験識別子：ＮＣＴ０１９５６７３４を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態において、本明細書で説明される腫瘍崩壊ウイルスを、注射、例えば、皮下注射、動脈内注射、静脈内注射、筋内注射、髄腔内注射、または腹腔内注射により投与する。実施形態において、本明細書で説明される腫瘍崩壊ウイルスを、腫瘍内投与、皮内投与、経粘膜投与、経口投与、鼻腔内投与するか、または肺内投与を介して投与する。
ある実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲを発現する細胞を、対象に、Ｔｒｅｇ細胞集団を減少させる分子と組み合わせて投与する。Ｔｒｅｇ細胞の数を減少させる（例えば、枯渇させる）方法は、当業界公知であり、例えば、ＣＤ２５の枯渇、シクロホスファミドの投与、ＧＩＴＲ機能をモジュレートすることを含む。理論に縛られるつもりはないが、アフェレーシスの前、または本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞の投与の前に、対象におけるＴｒｅｇ細胞の数を低減することは、腫瘍微小環境における望ましくない免疫細胞（例えば、Ｔｒｅｇ）の数を低減し、対象の再発の危険性を低減すると考えられる。
ある実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、Ｔｒｅｇ細胞集団を減少させる分子と組み合わせて投与する。Ｔｒｅｇ細胞の数を減少させる（例えば、枯渇させる）方法は、当業界公知であり、例えば、ＣＤ２５の枯渇、シクロホスファミドの投与、ＧＩＴＲ機能をモジュレートすることを含む。理論に縛られるつもりはないが、アフェレーシスの前、または本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞の投与の前に、対象におけるＴｒｅｇ細胞の数を低減させることは、腫瘍微小環境における望ましくない免疫細胞（例えば、Ｔｒｅｇ）の数を低減させ、対象の再発の危険性を低減させると考えられる。一実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、ＧＩＴＲアゴニストおよび／または調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を枯渇させるＧＩＴＲ抗体などの、ＧＩＴＲを標的とする分子および／またはＧＩＴＲ機能をモジュレートする分子と組み合わせて投与する。一実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、シクロホスファミドと組み合わせて投与する。一実施形態において、ＧＩＴＲ結合分子および／またはＧＩＴＲ機能をモジュレートする分子（例えば、ＧＩＴＲアゴニストおよび／またはＴｒｅｇを枯渇させるＧＩＴＲ抗体）を、ＣＡＲ発現細胞の前に投与する。例えば、一実施形態において、ＧＩＴＲアゴニストは、細胞のアフェレーシスの前に投与することができる。実施形態において、シクロホスファミドを、対象に、ＣＡＲ発現細胞の投与（例えば、注入もしくは再注入）の前、または細胞のアフェレーシスの前に投与する。実施形態において、シクロホスファミドおよび抗ＧＩＴＲ抗体を、対象に、ＣＡＲ発現細胞の投与（例えば、注入もしくは再注入）の前、または細胞のアフェレーシスの前に投与する。一実施形態において、対象は、がん（例えば、固形がん、またはＡＬＬもしくはＣＬＬなどの血液がん）を有する。一実施形態において、対象は、ＣＬＬを有する。実施形態において、対象は、固形がん、例えば、本明細書で説明される固形がんを有する。
一実施形態において、本明細書で説明されるＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞と本明細書で説明される１つまたは複数のＢ細胞阻害剤の組合せを、対象に、ＧＩＴＲアゴニスト、例えば本明細書で説明されるＧＩＴＲアゴニストと組み合わせて投与する。一実施形態において、ＧＩＴＲアゴニストをＣＡＲ発現細胞、例えばＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞の前に投与する。例えば、一実施形態において、ＧＩＴＲアゴニストは、細胞のアフェレーシスの前に投与することができる。一実施形態において、対象は、ＣＬＬを有する。
一実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、ＧＩＴＲアゴニスト、例えば、本明細書で説明されるＧＩＴＲアゴニストと組み合わせて投与する。一実施形態において、ＧＩＴＲアゴニストをＣＡＲ発現細胞の前に投与する。例えば、一実施形態において、ＧＩＴＲアゴニストを細胞のアフェレーシスの前に投与することができる。
典型的なＧＩＴＲアゴニストとしては、例えば、ＧＩＴＲ融合タンパク質および抗ＧＩＴＲ抗体（例えば、２価抗ＧＩＴＲ抗体）、例えば、米国特許第６，１１１，０９０号、欧州特許第０９０５０５号Ｂ１、米国特許第８，５８６，０２３号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１０／００３１１８および２０１１／０９０７５４で説明されているＧＩＴＲ融合タンパク質、または例えば米国特許第７，０２５，９６２号、欧州特許第１９４７１８３号Ｂ１、米国特許第７，８１２，１３５号、米国特許第８，３８８，９６７号、米国特許第８，５９１，８８６号、欧州特許ＥＰ１８６６３３９号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０２８６８３、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／０３９９５４、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／００７１９０、ＰＣＴ公開ＷＯ２００７／１３３８２２、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／０５５８０８、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／４０１９６、ＰＣＴ公開ＷＯ２００１／０３７２０、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／２０７５８、ＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０８３２８９、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／１１５４５１、米国特許第７，６１８，６３２号、およびＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０５１７２６で説明されている抗ＧＩＴＲ抗体が挙げられる。
一実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤、例えば、本明細書で説明されるタンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤と組み合わせて投与する。一実施形態において、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤は、ＳＨＰ－１阻害剤、例えば、本明細書で説明されるＳＨＰ－１阻害剤、例えば、スチボグルコン酸ナトリウムなどである。一実施形態において、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤は、ＳＨＰ－２阻害剤、例えば、本明細書で説明されるＳＨＰ－２阻害剤である。
一実施形態において、１つまたは複数のＢ細胞阻害剤と適宜組み合わせた、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、キナーゼ阻害剤と組み合わせて使用することができる。一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤、例えば、本明細書で説明されるＣＤＫ４阻害剤、例えば、６－アセチル－８－シクロペンチル－５－メチル－２－（５－ピペラジン－１－イル－ピリジン－２－イルアミノ）－８Ｈ－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７－オン塩酸塩（パルボシクリブまたはＰＤ０３３２９９１ともまた称する）などの、例えば、ＣＤ４／６阻害剤である。一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブなど、例えば、本明細書で説明されるＢＴＫ阻害剤である。一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシン、ラパマイシン類似体である、ＯＳＩ－０２７など、例えば、本明細書で説明されるｍＴＯＲ阻害剤である。ｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤、例えば、ｍＴＯＲＣ１阻害剤および／または本明細書で説明されるｍＴＯＲＣ２阻害剤であり得る。一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ＭＮＫ阻害剤、例えば、４－アミノ－５－（４－フルオロアニリノ）－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジンなど、例えば、本明細書で説明されるＭＮＫ阻害剤である。ＭＮＫ阻害剤は、例えば、ＭＮＫ１ａ阻害剤、ＭＮＫ１ｂ阻害剤、ＭＮＫ２ａ阻害剤、および／またはＭＮＫ２ｂ阻害剤であり得る。
一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、アロイシンＡ；２－（２－クロロフェニル）－５，７－ジヒドロキシ－８－［（３Ｓ，４Ｒ）－３－ヒドロキシ－１－メチル－４－ピペリジニル］－４－クロメノンである、フラボピリドールまたはＨＭＲ－１２７５；クリゾチニブ（ＰＦ－０２３４１０６６；２－（２－クロロフェニル）－５，７－ジヒドロキシ－８－［（２Ｒ，３Ｓ）－２－（ヒドロキシメチル）－１－メチル－３－ピロリジニル］－４Ｈ－１－ベンゾピラン－４－オン塩酸塩（Ｐ２７６－００）；１－メチル－５－［［２－［５－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－４－ピリジニル］オキシ］－Ｎ－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］－１Ｈ－ベンズイミダゾール－２－アミン（ＲＡＦ２６５）；インジスラム（Ｅ７０７０）；ロスコビチン（ＣＹＣ２０２）；パルボシクリブ（ＰＤ０３３２９９１）；ジナシクリブ（ＳＣＨ７２７９６５）；Ｎ－［５－［［（５－ｔｅｒｔ－ブチルオキサゾール－２－イル）メチル］チオ］チアゾール－２－イル］ピペリジン－４－カルボキサミド（ＢＭＳ ３８７０３２）；４－［［９－クロロ－７－（２，６－ジフルオロフェニル）－５Ｈ－ピリミド［５，４－ｄ］［２］ベンズアゼピン－２－イル］アミノ］－安息香酸（ＭＬＮ８０５４）；５－［３－（４，６－ジフルオロ－１Ｈ－ベンズイミダゾール－２－イル）－１Ｈ－インダゾール－５－イル］－Ｎ－エチル－４－メチル－３－ピリジンメタンアミン（ＡＧ－０２４３２２）；４－（２，６－ジクロロベンゾイルアミノ）－１Ｈ－ピラゾール－３－カルボン酸Ｎ－（ピペリジン－４－イル）アミド（ＡＴ７５１９）；４－［２－メチル－１－（１－メチルエチル）－１Ｈ－イミダゾール－５－イル］－Ｎ－［４－（メチルスルホニル）フェニル］－２－ピリミジンアミン（ＡＺＤ５４３８）；およびＸＬ２８１（ＢＭＳ９０８６６２）から選択されるＣＤＫ４阻害剤である。
一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤、例えば、パルボシクリブ（ＰＤ０３３２９９１）であり、パルボシクリブを、約５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、７５ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１０５ｍｇ、１１０ｍｇ、１１５ｍｇ、１２０ｍｇ、１２５ｍｇ、１３０ｍｇ、１３５ｍｇ（例えば、７５ｍｇ、１００ｍｇ、または１２５ｍｇ）の用量で、ある期間にわたり毎日、例えば、２８日間のサイクルの１４～２１日間にわたり毎日、または２１日間のサイクルの７～１２日間にわたり毎日を投与する。一実施形態において、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、またはこれを超えるサイクルのパルボシクリブを投与する。
実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）４阻害剤またはＣＤＫ６阻害剤、例えば、本明細書で説明されるＣＤＫ４阻害剤またはＣＤＫ６阻害剤と組み合わせて投与する。実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、ＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６の両方を標的とする阻害剤）、例えば、本明細書で説明されるＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせて投与する。ある実施形態において、対象は、ＭＣＬを有する。ＭＣＬとは、現行で利用可能な治療に対する応答性が不良である、すなわち、本質的に治癒不可能である、侵襲性のがんである。ＭＣＬの多くの症例において、サイクリンＤ１（ＣＤＫ４／６の調節因子）は、ＭＣＬ細胞において（例えば、免疫グロブリンおよびＣｙｃｌｉｎ Ｄ１遺伝子を伴う染色体転座に起因して）発現される。したがって、理論に縛られずに述べると、ＭＣＬ細胞は、ＣＤＫ４／６の阻害に対して、高度な特異性で、高度に感受性である（すなわち、正常な免疫細胞に対する影響は最小限である）と考えられる。ＣＤＫ４／６阻害剤は、単独でも、ＭＣＬの処置において、ある程度の効能をもたらしたが、部分寛解を達成したのにとどまり、再発率は高かった。例示的なＣＤＫ４／６阻害剤は、ＬＥＥ０１１（リボシクリブともまた呼ばれる）であり、その構造を下記に示す。
Figure 0007227331000013
理論に縛られずに述べると、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞の、ＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、ＬＥＥ０１１または他の本明細書で説明されるＣＤＫ４／６阻害剤）を伴う投与は、例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤単独と比較して、例えば、高い寛解率および／または低い再発率を伴う、高い応答性を達成し得ると考えられる。
一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、イブルチニブ（ＰＣＩ－３２７６５）；ＧＤＣ－０８３４；ＲＮ－４８６；ＣＧＩ－５６０；ＣＧＩ－１７６４；ＨＭ－７１２２４；ＣＣ－２９２；ＯＮＯ－４０５９；ＣＮＸ－７７４；およびＬＦＭ－Ａ１３から選択されるＢＴＫ阻害剤である。ある実施形態において、ＢＴＫ阻害剤は、インターロイキン２誘導性キナーゼ（ＩＴＫ）のキナーゼ活性を低減または阻害せず、ＧＤＣ－０８３４；ＲＮ－４８６；ＣＧＩ－５６０；ＣＧＩ－１７６４；ＨＭ－７１２２４；ＣＣ－２９２；ＯＮＯ－４０５９；ＣＮＸ－７７４；およびＬＦＭ－Ａ１３から選択される。
一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブ（ＰＣＩ－３２７６５）である。実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、ＢＴＫ阻害剤（例えば、イブルチニブ）と組み合わせて投与する。実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、イブルチニブ（ＰＣＩ－３２７６５ともまた呼ばれる）と組み合わせて投与する。イブルチニブ｛１－［（３Ｒ）－３－［４－アミノ－３－（４－フェノキシフェニル）－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン－１－イル］ピペリジン－１－イル］プロプ－２－エン－１－オン｝の構造を、下記に示す。
Figure 0007227331000014
実施形態において、対象は、ＣＬＬ、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、または小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）を有する。例えば、対象は、第１７染色体の短腕部における欠失［例えば、白血病性細胞におけるｄｅｌ（１７ｐ）］を有する。他の例において、対象は、ｄｅｌ（１７ｐ）を有さない。実施形態において、対象は、再発性ＣＬＬまたはＳＬＬを有し、例えば、対象は、かつて、がん治療を投与されたことがある（例えば、かつて、１つ、２つ、３つ、または４つの既往のがん治療を投与されたことがある）。実施形態において、対象は、不応性ＣＬＬまたはＳＬＬを有する。他の実施形態において、対象は、濾胞性リンパ腫、例えば、再発性リンパ腫または不応性濾胞性リンパ腫を有する。一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ＢＴＫ阻害剤、例えばイブルチニブ（ＰＣＩ－３２７６５）であり、イブルチニブを、約２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４２０ｍｇ、４４０ｍｇ、４６０ｍｇ、４８０ｍｇ、５００ｍｇ、５２０ｍｇ、５４０ｍｇ、５６０ｍｇ、５８０ｍｇ、６００ｍｇ（例えば、２５０ｍｇ、４２０ｍｇまたは５６０ｍｇ）の用量で、ある期間にわたり毎日、例えば、２１日間のサイクルにわたり毎日、または２８日間のサイクルにわたり毎日投与する。一実施形態において、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、またはこれを超えるサイクルのイブルチニブを投与する。いくつかの実施形態において、イブルチニブを、リツキシマブと組み合わせて投与する。例えば、Burger et al. (2013) Ibrutinib In Combination With Rituximab (iR) Is Well Tolerated and Induces a High Rate Of Durable Remissions In Patients With High-Risk Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL): New, Updated Results Of a Phase II Trial In 40 Patients, Abstract 675 presented at 55th ASH Annual Meeting and Exposition, New Orleans, LA 7-10 Decを参照されたい。理論に縛られずに述べると、イブルチニブの添加は、Ｔ細胞増殖性応答を増強し、Ｔ細胞を、ヘルパーＴ２（Ｔｈ２）表現型から、ヘルパーＴ１（Ｔｈ１）表現型にシフトさせると考えられる。Ｔｈ１およびＴｈ２は、ヘルパーＴ細胞の表現型であり、Ｔｈ１は、Ｔｈ２と対比して、異なる免疫応答経路を方向付ける。Ｔｈ１表現型は、例えば、細胞内病原体／ウイルスまたはがん性細胞などの細胞を死滅させるための炎症促進性応答、または永続的な自己免疫応答に関連する。Ｔｈ２表現型は、好酸球の蓄積および抗炎症性応答に関連する。本明細書の方法、使用、および組成物のいくつかの実施形態において、ＢＴＫ阻害剤は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、国際出願第ＷＯ／２０１５／０７９４１７号において説明されている、ＢＴＫ阻害剤である。例えば、いくつかの実施形態において、ＢＴＫ阻害剤は、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩である。
Figure 0007227331000015
 ［式中、
Ｒ１は、水素、ヒドロキシにより適宜置換される、Ｃ１～Ｃ６アルキルであり、
Ｒ２は、水素もしくはハロゲンであり、
Ｒ３は、水素もしくはハロゲンであり、
Ｒ４は、水素であり、
Ｒ５は、水素もしくはハロゲンであるか、
またはＲ４およびＲ５は、互いと接合し、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨ＝ＣＨ－、－ＣＨ＝ＣＨ－ＣＨ２－；－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ－；もしくは－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－を表し、
Ｒ６およびＲ７は、互いと独立に、Ｈ、ヒドロキシルにより適宜置換される、Ｃ１～Ｃ６アルキル、ハロゲンもしくはヒドロキシにより適宜置換される、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、またはハロゲンを表し、
Ｒ８、Ｒ９、Ｒ、Ｒ’、Ｒ１０、およびＲ１１は、互いと独立に、Ｈ、もしくはＣ１～Ｃ６アルコキシにより適宜置換される、Ｃ１～Ｃ６アルキルを表すか；またはＲ８、Ｒ９、Ｒ、Ｒ’、Ｒ１０、およびＲ１１の任意の２つは、それらが結合する炭素原子と併せて、３～６員の飽和炭素環を形成することが可能であり、
Ｒ１２は、水素、またはハロゲンもしくはＣ１～Ｃ６アルコキシにより適宜置換される、Ｃ１～Ｃ６アルキルであり、
またはＲ１２、およびＲ８、Ｒ９、Ｒ、Ｒ’、Ｒ１０、またはＲ１１の任意の１つは、それらが結合する原子と併せて、４、５、６、または７員のアザシクロ環を形成することが可能であり、この環は、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシル、Ｃ１～Ｃ６アルキル、またはＣ１～Ｃ６アルコキシにより適宜置換され、
ｎは、０、または１であり、
Ｒ１３は、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、もしくはＮ，Ｎ－ジ－Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノにより適宜置換される、Ｃ２～Ｃ６アルケニル；Ｃ１～Ｃ６アルキルもしくはＣ１～Ｃ６アルコキシにより適宜置換される、Ｃ２～Ｃ６アルキニル；またはＣ１～Ｃ６アルキルにより適宜置換される、Ｃ２～Ｃ６酸化アルキレニルである］
いくつかの実施形態において、式ＩのＢＴＫ阻害剤は、Ｎ－（３－（５－（（１－アクリロイルアゼチジン－３－イル）オキシ）－６－アミノピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；（Ｅ）－Ｎ－（３－（６－アミノ－５－（（１－（ブタ－２－エノイル）アゼチジン－３－イル）オキシ）ピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；Ｎ－（３－（６－アミノ－５－（（１－プロピオロイルアゼチジン－３－イル）オキシ）ピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；Ｎ－（３－（６－アミノ－５－（（１－（ブタ－２－イノイル）アゼチジン－３－イル）オキシ）ピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；Ｎ－（３－（５－（（１－アクリロイルピペリジン－４－イル）オキシ）－６－アミノピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；Ｎ－（３－（６－アミノ－５－（２－（Ｎ－メチルアクリルアミド）エトキシ）ピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；（Ｅ）－Ｎ－（３－（６－アミノ－５－（２－（Ｎ－メチルブタ－２－エンアミド）エトキシ）ピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；Ｎ－（３－（６－アミノ－５－（２－（Ｎ－メチルプロピオルアミド）エトキシ）ピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；（Ｅ）－Ｎ－（３－（６－アミノ－５－（２－（４－メトキシ－Ｎ－メチルブタ－２－エンアミド）エトキシ）ピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；Ｎ－（３－（６－アミノ－５－（２－（Ｎ－メチルブタ－２－インアミド）エトキシ）ピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；Ｎ－（２－（（４－アミノ－６－（３－（４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）ピリミジン－５－イル）オキシ）エチル）－Ｎ－メチルオキシラン－２－カルボキサミド；Ｎ－（２－（（４－アミノ－６－（３－（６－シクロプロピル－８－フルオロ－１－オキソイソキノリン－２（１Ｈ）－イル）フェニル）ピリミジン－５－イル）オキシ）エチル）－Ｎ－メチルアクリルアミド；Ｎ－（３－（５－（２－アクリルアミドエトキシ）－６－アミノピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；Ｎ－（３－（６－アミノ－５－（２－（Ｎ－エチルアクリルアミド）エトキシ）ピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；Ｎ－（３－（６－アミノ－５－（２－（Ｎ－（２－フルオロエチル）アクリルアミド）エトキシ）ピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；Ｎ－（３－（５－（（１－アクリルアミドシクロプロピル）メトキシ）－６－アミノピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；（Ｓ）－Ｎ－（３－（５－（２－アクリルアミドプロポキシ）－６－アミノピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；（Ｓ）－Ｎ－（３－（６－アミノ－５－（２－（ブタ－２－インアミド）プロポキシ）ピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；（Ｓ）－Ｎ－（３－（６－アミノ－５－（２－（Ｎ－メチルアクリルアミド）プロポキシ）ピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；（Ｓ）－Ｎ－（３－（６－アミノ－５－（２－（Ｎ－メチルブタ－２－インアミド）プロポキシ）ピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；Ｎ－（３－（６－アミノ－５－（３－（Ｎ－メチルアクリルアミド）プロポキシ）ピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；（Ｓ）－Ｎ－（３－（５－（（１－アクリロイルピロリジン－２－イル）メトキシ）－６－アミノピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；（Ｓ）－Ｎ－（３－（６－アミノ－５－（（１－（ブタ－２－イノイル）ピロリジン－２－イル）メトキシ）ピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；（Ｓ）－２－（３－（５－（（１－アクリロイルピロリジン－２－イル）メトキシ）－６－アミノピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－（ヒドロキシメチル）フェニル）－６－シクロプロピル－３，４－ジヒドロイソキノリン－１（２Ｈ）－オン；Ｎ－（２－（（４－アミノ－６－（３－（６－シクロプロピル－１－オキソ－３，４－ジヒドロイソキノリン－２（１Ｈ）－イル）－５－フルオロ－２－（ヒドロキシメチル）フェニル）ピリミジン－５－イル）オキシ）エチル）－Ｎ－メチルアクリルアミド；Ｎ－（３－（５－（（（２Ｓ，４Ｒ）－１－アクリロイル－４－メトキシピロリジン－２－イル）メトキシ）－６－アミノピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；Ｎ－（３－（６－アミノ－５－（（（２Ｓ，４Ｒ）－１－（ブタ－２－イノイル）－４－メトキシピロリジン－２－イル）メトキシ）ピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；２－（３－（５－（（（２Ｓ，４Ｒ）－１－アクリロイル－４－メトキシピロリジン－２－イル）メトキシ）－６－アミノピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－（ヒドロキシメチル）フェニル）－６－シクロプロピル－３，４－ジヒドロイソキノリン－１（２Ｈ）－オン；Ｎ－（３－（５－（（（２Ｓ，４Ｓ）－１－アクリロイル－４－メトキシピロリジン－２－イル）メトキシ）－６－アミノピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；Ｎ－（３－（６－アミノ－５－（（（２Ｓ，４Ｓ）－１－（ブタ－２－イノイル）－４－メトキシピロリジン－２－イル）メトキシ）ピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；Ｎ－（３－（５－（（（２Ｓ，４Ｒ）－１－アクリロイル－４－フルオロピロリジン－２－イル）メトキシ）－６－アミノピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；Ｎ－（３－（６－アミノ－５－（（（２Ｓ，４Ｒ）－１－（ブタ－２－イノイル）－４－フルオロピロリジン－２－イル）メトキシ）ピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；（Ｓ）－Ｎ－（３－（５－（（１－アクリロイルアゼチジン－２－イル）メトキシ）－６－アミノピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；（Ｓ）－Ｎ－（３－（６－アミノ－５－（（１－プロピオロイルアゼチジン－２－イル）メトキシ）ピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；（Ｓ）－２－（３－（５－（（１－アクリロイルアゼチジン－２－イル）メトキシ）－６－アミノピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－（ヒドロキシメチル）フェニル）－６－シクロプロピル－３，４－ジヒドロイソキノリン－１（２Ｈ）－オン；（Ｒ）－Ｎ－（３－（５－（（１－アクリロイルアゼチジン－２－イル）メトキシ）－６－アミノピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；（Ｒ）－Ｎ－（３－（５－（（１－アクリロイルピペリジン－３－イル）メトキシ）－６－アミノピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；Ｎ－（３－（５－（（（２Ｒ，３Ｓ）－１－アクリロイル－３－メトキシピロリジン－２－イル）メトキシ）－６－アミノピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；Ｎ－（３－（５－（（（２Ｓ，４Ｒ）－１－アクリロイル－４－シアノピロリジン－２－イル）メトキシ）－６－アミノピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミド；またはＮ－（３－（５－（（（２Ｓ，４Ｓ）－１－アクリロイル－４－シアノピロリジン－２－イル）メトキシ）－６－アミノピリミジン－４－イル）－５－フルオロ－２－メチルフェニル）－４－シクロプロピル－２－フルオロベンズアミドから選択される。
他の形で提示されない限りにおいて、式ＩのＢＴＫ阻害剤を説明するのに上記で使用した化学用語は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、国際出願第ＷＯ／２０１５／０７９４１７号において明示されるそれらの意味に従い使用する。
一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、テムシロリムス；ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としてもまた公知の、リダホロリムス｛（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）－４－［（２Ｒ）－２［（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｚ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）－１，１８－ジヒドロキシ－１９，３０－ジメトキシ－１５，１７，２１，２３、２９，３５－ヘキサメチル－２，３，１０，１４，２０－ペンタオキソ－１１，３６－ジオキサ－４－アザトリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ－１６，２４，２６，２８－テトラエン－１２－イル］プロピル］－２－メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート｝；エベロリムス（ＲＡＤ００１）；ラパマイシン（ＡＹ２２９８９）；セマピモド（simapimod）；（５－｛２，４－ビス［（３Ｓ）－３－メチルモルホリン－４－イル］ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７－イル｝－２－メトキシフェニル）メタノール（ＡＺＤ８０５５）；２－アミノ－８－［ｔｒａｎｓ－４－（２－ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］－６－（６－メトキシ－３－ピリジニル）－４－メチル－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７（８Ｈ）－オン（ＰＦ０４６９１５０２）；およびＮ２－［１，４－ジオキソ－４－［［４－（４－オキソ－８－フェニル－４Ｈ－１－ベンゾピラン－２－イル）モルホリニウム－４－イル］メトキシ］ブチル］－Ｌ－アルギニルグリシル－Ｌ－α－アスパルチルＬ－セリン－の分子内塩（ＳＦ１１２６）（配列番号１３１６）；およびＸＬ７６５から選択される、ｍＴＯＲ阻害剤である。
一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンであり、ラパマイシンを、約３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ（例えば、６ｍｇ）の用量で、ある期間にわたり毎日、例えば、２１日間のサイクルにわたり毎日、または２８日間のサイクルにわたり毎日投与する。一実施形態において、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、またはこれを超えるサイクルのラパマイシンを投与する。一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、エベロリムスであり、エベロリムスを、約２ｍｇ、２．５ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ（例えば、１０ｍｇ）の用量で、ある期間にわたり毎日、例えば、２８日間のサイクルにわたり毎日投与する。一実施形態において、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、またはこれを超えるサイクルのエベロリムスを投与する。
一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ＣＧＰ０５２０８８；４－アミノ－３－（ｐ－フルオロフェニルアミノ）－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン（ＣＧＰ５７３８０）；セルコスポラミド；ＥＴＣ－１７８０４４５－２；および４－アミノ－５－（４－フルオロアニリノ）－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジンから選択される、ＭＮＫ阻害剤である。
実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤（例えば、本明細書で説明されるＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば、イデラリシブまたはドゥベリシブ）および／またはリツキシマブと組み合わせて投与する。実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、イデラリシブおよびリツキシマブと組み合わせて投与する。実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、ドゥベリシブおよびリツキシマブと組み合わせて投与する。イデラリシブ（ＧＳ－１１０１またはＣＡＬ－１０１ともまた呼ばれる；Ｇｉｌｅａｄ）は、ＰＩ３Ｋのデルタアイソフォームを遮断する低分子である。イデラリシブ｛５－フルオロ－３－フェニル－２－［（１Ｓ）－１－（７Ｈ－プリン－６－イルアミノ）プロピル］－４（３Ｈ）－キナゾリノン｝の構造を、下記に示す。
Figure 0007227331000016
ドゥベリシブ（ＩＰＩ－１４５ともまた呼ばれる；Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓおよびＡｂｂｖｉｅ）は、ＰＩ３Ｋ－δ、ＰＩ３Ｋ－γを遮断する低分子である。ドゥベリシブ｛８－クロロ－２－フェニル－３－［（１Ｓ）－１－（９Ｈ－プリン－６－イルアミノ）エチル］－１（２Ｈ）－イソキノリノン｝の構造を、下記に示す。
Figure 0007227331000017
実施形態において、対象は、ＣＬＬを有する。実施形態において、対象は、再発性ＣＬＬ、例えば、対象は、かつて、がん治療を投与されたことがある（例えば、かつて、抗ＣＤ２０抗体を投与されたことがあるか、またはイブルチニブを投与されたことがある）。例えば、対象は、第１７染色体の短腕部における欠失［例えば、白血病性細胞におけるｄｅｌ（１７ｐ）］を有する。他の例において、対象は、ｄｅｌ（１７ｐ）を有さない。実施形態において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＩｇＶＨ）遺伝子において突然変異を含む白血病性細胞を含む。他の実施形態において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＩｇＶＨ）遺伝子において突然変異を含む白血病性細胞を含まない。実施形態において、対象は、第１１染色体の長腕部における欠失［ｄｅｌ（１１ｑ）］を有する。他の実施形態において、対象は、ｄｅｌ（１１ｑ）を有さない。実施形態において、イデラリシブを、約１００～４００ｍｇ（例えば、１００～１２５、１２５～１５０、１５０～１７５、１７５～２００、２００～２２５、２２５～２５０、２５０～２７５、２７５～３００、３２５～３５０、３５０～３７５、または３７５～４００ｍｇ）の投与量で、例えば、毎日２回投与する。実施形態において、ドゥベリシブを、約１５～１００ｍｇ（例えば、約１５～２５、２５～５０、５０～７５、または７５～１００ｍｇ）の投与量で、例えば、毎日２回投与する。実施形態において、リツキシマブを、約３５０～５５０ｍｇ／ｍ２（例えば、３５０～３７５、３７５～４００、４００～４２５、４２５～４５０、４５０～４７５、または４７５～５００ｍｇ／ｍ２）の投与量で、例えば、静脈内投与する。
一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、２－アミノ－８－［ｔｒａｎｓ－４－（２－ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］－６－（６－メトキシ－３－ピリジニル）－４－メチル－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７（８Ｈ）－オン（ＰＦ－０４６９１５０２）；Ｎ－［４－［［４－（ジメチルアミノ）－１－ピペリジニル］カルボニル］フェニル］－Ｎ’－［４－（４，６－ジ－４－モルホリニル－１，３，５－トリアジン－２－イル）フェニル］尿素（ＰＦ－０５２１２３８４、ＰＫＩ－５８７）；２－メチル－２－｛４－［３－メチル－２－オキソ－８－（キノリン－３－イル）－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル］フェニル｝プロパンニトリル（ＢＥＺ－２３５）；アピトリシブ（ＧＤＣ－０９８０、ＲＧ７４２２）；２，４－ジフルオロ－Ｎ－｛２－（メチルオキシ）－５－［４－（４－ピリダジニル）－６－キノリニル］－３－ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド（ＧＳＫ２１２６４５８）；８－（６－メトキシピリジン－３－イル）－３－メチル－１－（４－（ピペラジン－１－イル）－３－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２（３Ｈ）－オンマレイン酸（ＮＶＰ－ＢＧＴ２２６）；３－［４－（４－モルホリニルピリド［３’，２’：４，５］フロ［３，２－ｄ］ピリミジン－２－イル］フェノール（ＰＩ－１０３）；５－（９－イソプロピル－８－メチル－２－モルホリノ－９Ｈ－プリン－６－イル）ピリミジン－２－アミン（ＶＳ－５５８４、ＳＢ２３４３）；およびＮ－［２－［（３，５－ジメトキシフェニル）アミノ］キノキサリン－３－イル］－４－［（４－メチル－３－メトキシフェニル）カルボニル］アミノフェニルスルホンアミド（ＸＬ７６５）から選択される、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）およびｍＴＯＲの二重阻害剤である。
実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤と組み合わせて投与する。例示的なＡＬＫキナーゼは、クリゾチニブ（Ｐｆｉｚｅｒ）、セリチニブ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、アレクチニブ（Ｃｈｕｇａｉ）、ブリガチニブ（ＡＰ２６１１３ともまた呼ばれる；Ａｒｉａｄ）、エントレクチニブ（Ｉｇｎｙｔａ）、ＰＦ－０６４６３９２２（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＴＳＲ－０１１（Ｔｅｓａｒｏ）（例えば、臨床試験識別番号ＮＣＴ０２０４８４８８を参照されたい）、ＣＥＰ－３７４４０（Ｔｅｖａ）、およびＸ－３９６（Ｘｃｏｖｅｒｙ）を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、対象は、固形がん、例えば、本明細書で説明される固形がん、例えば、肺がんを有する。
クリゾチニブの化学名は、３－［（１Ｒ）－１－（２，６－ジクロロ－３－フルオロフェニル）エトキシ］－５－（１－ピペリジン－４－イルピラゾール－４－イル）ピリジン－２－アミンである。セリチニブの化学名は、５－クロロ－Ｎ２－［２－イソプロポキシ－５－メチル－４－（４－ピペリジニル）フェニル］－Ｎ４－［２－（イソプロピルスルホニル）フェニル］－２，４－ピリミジンジアミンである。アレクチニブの化学名は、９－エチル－６，６－ジメチル－８－（４－モルホリノピペリジン－１－イル）－１１－オキソ－６，１１－ジヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［ｂ］カルバゾール－３－カルボニトリルである。ブリガチニブの化学名は、５－クロロ－Ｎ２－｛４－［４－（ジメチルアミノ）－１－ピペリジニル］－２－メトキシフェニル｝－Ｎ４－［２－（ジメチルホスホリル）フェニル］－２，４－ピリミジンジアミンである。エントレクチニブの化学名は、Ｎ－（５－（３，５－ジフルオロベンジル）－１Ｈ－インダゾール－３－イル）－４－（４－メチルピペラジン－１－イル）－２－（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）アミノ）ベンズアミドである。ＰＦ－０６４６３９２２の化学名は、（１０Ｒ）－７－アミノ－１２－フルオロ－２，１０，１６－トリメチル－１５－オキソ－１０，１５，１６，１７－テトラヒドロ－２Ｈ－８，４－（メテノ）ピラゾロ［４，３－ｈ］［２，５，１１］－ベンゾキサジアザシクロテトラデシン－３－カルボニトリルである。ＣＥＰ－３７４４０の化学構造は、（Ｓ）－２－（（５－クロロ－２－（（６－（４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル）－１－メトキシ－６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－２－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）アミノ）－Ｎ－メチルベンズアミドである。Ｘ－３９６の化学名は、（Ｒ）－６－アミノ－５－（１－（２，６－ジクロロ－３－フルオロフェニル）エトキシ）－Ｎ－（４－（４－メチルピペラジン－１－カルボニル）フェニル）ピリダジン－３－カルボキサミドである。
一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、イブルチニブ；Ｎ－（５－（５－（４－アセチルピペラジン－１－カルボニル）－４－メトキシ－２－メチルフェニルチオ）チアゾール－２－イル）－４－（（３，３－ジメチルブタン－２－イルアミノ）メチル）ベンズアミド（ＢＭＳ－５０９７４４）；７－ベンジル－１－（３－（ピペリジン－１－イル）プロピル）－２－（４－（ピリジン－４－イル）フェニル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｇ］キノキサリン－６（５Ｈ）－オン（ＣＴＡ０５６）；Ｒ）－３－（１－（１－アクリロイルピペリジン－３－イル）－４－アミノ－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン－３－イル）－Ｎ－（３－メチル－４－（１－メチルエチル））ベンズアミド（ＰＦ－０６４６５４６９）から選択されるＩＴＫ阻害剤である。
カルシウム依存性ホスファターゼであるカルシニューリンを阻害する薬物（サイクロスポリンおよびＦＫ５０６）、または増殖因子によって誘導されたシグナル伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する薬物（ラパマイシン）（Liu et al., Cell 66:807-815, 1991；Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991；Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993）のいずれかも使用することができる。さらなる態様において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤を使用したＴ細胞除去療法、外部ビーム放射線療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、および／またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体とともに（例えば、その前、それと同時またはその後に）患者に投与することができる。一態様において、本発明の細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えばリツキサンなどのＢ細胞除去療法の後に投与される。例えば、一実施形態において、対象は、高用量化学療法、それに続いて末梢血幹細胞移植での標準的な処置を受けてもよい。所定の実施形態において、移植後、対象は、本発明の拡大させた免疫細胞の注入を受ける。さらなる実施形態において、拡大させた細胞は、外科手術の前に、またはその後に投与される。
実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤と組み合わせて投与する。ＩＤＯとは、アミノ酸であるＬ－トリプトファンの、キヌレニンへの分解を触媒する酵素である。多くのがん、例えば、前立腺がん、結腸直腸がん、膵臓がん、子宮頚がん、胃がん、卵巣がん、頭部がん、および肺がんは、ＩＤＯを過剰発現する。ｐＤＣ、マクロファージ、および樹状細胞（ＤＣ）は、ＩＤＯを発現し得る。理論に縛られずに述べると、Ｌ－トリプトファンの減少（例えば、ＩＤＯにより触媒される）は、Ｔ細胞のアネルギーおよびアポトーシスを誘導することにより、免疫抑制環境を結果としてもたらすと考えられる。したがって、理論に縛られずに述べると、ＩＤＯ阻害剤は、例えば、ＣＡＲ発現免疫細胞の抑制または死を減少させることにより、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞の効能を増強し得ると考えられる。実施形態において、対象は、充実性腫瘍、例えば、本明細書で説明される充実性腫瘍、例えば、前立腺がん、結腸直腸がん、膵臓がん、子宮頚がん、胃がん、卵巣がん、頭部がん、または肺がんを有する。例示的なＩＤＯ阻害剤は、１－メチル－トリプトファン、インドキシモド（ＮｅｗＬｉｎｋ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）（例えば、臨床試験識別番号：ＮＣＴ０１１９１２１６；ＮＣＴ０１７９２０５０を参照されたい）、およびＩＮＣＢ０２４３６０（Ｉｎｃｙｔｅ Ｃｏｒｐ．）（例えば、臨床試験識別番号：ＮＣＴ０１６０４８８９；ＮＣＴ０１６８５２５５を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。
実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）のモジュレーターと組み合わせて投与する。ＭＤＳＣは、末梢および多くの充実性腫瘍の腫瘍部位に蓄積される。これらの細胞は、Ｔ細胞応答を抑制し、これにより、ＣＡＲ発現細胞療法の効能を妨げる。理論に縛られずに述べると、ＭＤＳＣモジュレーターの投与は、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞の効能を増強すると考えられる。ある実施形態において、対象は、充実性腫瘍、例えば、本明細書で説明される充実性腫瘍、例えば、神経膠芽腫を有する。例示的なＭＤＳＣモジュレーターは、ＭＣＳ１１０およびＢＬＺ９４５を含むがこれらに限定されない。ＭＣＳ１１０とは、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。例えば、臨床試験識別番号ＮＣＴ００７５７７５７を参照されたい。ＢＬＺ９４５とは、コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）の低分子阻害剤である。例えば、Pyonteck et al. Nat. Med. 19(2013):1264-72を参照されたい。ＢＬＺ９４５の構造を、下記に示す。
Figure 0007227331000018
実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、ＣＤ１９ ＣＡＲＴ細胞（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、ＷＯ２０１２／０７９０００において説明されている、例えば、ＣＴＬ０１９）と組み合わせて投与する。実施形態において、対象は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、例えば、ＣＤ１９陽性ＡＭＬまたはＣＤ１９陰性ＡＭＬを有する。実施形態において、対象は、ＣＤ１９＋リンパ腫、例えば、ＣＤ１９＋非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ＣＤ１９＋ ＦＬ、またはＣＤ１９＋ ＤＬＢＣＬを有する。実施形態において、対象は、再発性ＣＤ１９＋リンパ腫または不応性ＣＤ１９＋リンパ腫を有する。実施形態において、リンパ枯渇化学療法を、対象に、ＣＤ１９ ＣＡＲＴ細胞の投与（例えば、注入）の前に、投与と並列して、または投与の後で投与する。ある例では、リンパ枯渇化学療法を、対象に、ＣＤ１９ ＣＡＲＴ細胞の投与の前に投与する。例えば、リンパ枯渇化学療法は、ＣＤ１９ ＣＡＲＴ細胞の注入の１～４日（例えば、１、２、３、または４日）前に終了する。実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲＴ細胞の複数回投与を、例えば、本明細書で説明される通りに行う。例えば、単回投与は、ＣＤ１９ ＣＡＲＴ細胞約５×１０８個を含む。実施形態において、リンパ枯渇化学療法を、対象に、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞、例えば、非ＣＤ１９ ＣＡＲ発現（expresing）細胞の投与（例えば、注入）の前に、投与と並列して、または投与の後で投与する。実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲＴを、対象に、非ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば、本明細書で説明される非ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞の投与（例えば、注入）の前に、投与と並列して、または投与の後で投与する。
いくつかの実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、ＷＯ２０１２／０７９０００において説明されている、例えば、ＣＴＬ０１９と組み合わせて、ＣＬＬ－１の発現に関連する疾患、例えば、本明細書で説明されるがんの処置のために投与する。理論に縛られずに述べると、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞と組み合わせて投与することは、初期系統のがん幹細胞、例えば、がん幹細胞を標的とし、免疫応答をモジュレートし、調節性Ｂ細胞を枯渇させ、かつ／または腫瘍微小環境を改善することにより、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞の効能を改善すると考えられる。例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞が、初期系統マーカーを発現するがん細胞、例えば、がん幹細胞およびＣＤ１９発現細胞を標的とするのに対し、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞は、後期系統マーカーを発現するがん細胞、例えば、ＣＬＬ－１を標的とする。このプレコンディショニング法は、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞の効能を改善し得る。このような実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞を、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞投与（例えば、注入）の前に、投与と並列して、または投与の後で投与する。
実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞はまた、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲ、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲも発現する。ある実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲおよびＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞を、対象に、本明細書で説明されるがん、例えば、ＡＭＬの処置のために投与する。ある実施形態において、ＣＡＲ分子の一方または両方の配置は、一次細胞内シグナル伝達ドメインと、共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。別の実施形態において、ＣＡＲ分子の一方または両方の配置は、一次細胞内シグナル伝達ドメインと、２つまたはこれを超える、例えば、２、３、４、もしくは５つ、またはこれを超える共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。このような実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ分子と、ＣＤ１９ ＣＡＲとは、同じ一次細胞内シグナル伝達ドメインを有してもよく、異なる一次細胞内シグナル伝達ドメインを有してもよく、同じ共刺激シグナル伝達ドメインを有してもよく、異なる共刺激シグナル伝達ドメインを有してもよく、同じ数の共刺激シグナル伝達ドメインを有してもよく、異なる数の共刺激シグナル伝達ドメインを有してもよい。代替的に、本明細書で説明されるＣＡＲと、ＣＤ１９ ＣＡＲとは、ＣＡＲ分子の１つが、抗原結合ドメインおよび共刺激ドメイン（例えば、４－１ＢＢ）を含むのに対し、他のＣＡＲ分子は、抗原結合ドメインおよび一次細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ゼータ）を含む、スプリットＣＡＲとしても配置される。
いくつかの実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）ポリペプチド、インターロイキン１５受容体アルファ（ＩＬ－１５Ｒａ）ポリペプチド、またはＩＬ－１５ポリペプチドおよびＩＬ－１５Ｒａポリペプチド、例えば、ｈｅｔＩＬ－１５（Ａｄｍｕｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＬＬＣ）の両方の組合せと組み合わせて投与する。ｈｅｔＩＬ－１５とは、ＩＬ－１５とＩＬ－１５Ｒａとの、ヘテロ二量体の非共有結合的複合体である。ｈｅｔＩＬ－１５は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Ｕ．Ｓ．８，１２４，０８４、Ｕ．Ｓ．２０１２／０１７７５９８、Ｕ．Ｓ．２００９／００８２２９９、Ｕ．Ｓ．２０１２／０１４１４１３、およびＵ．Ｓ．２０１１／００８１３１１において説明されている。実施形態において、ｈｅｔ－ＩＬ－１５を、皮下投与する。実施形態において、対象は、がん、例えば、固形がん、例えば、黒色腫または結腸がんを有する。実施形態において、対象は、転移性がんを有する。
実施形態において、本明細書で説明される疾患、例えば血液障害、例えばＡＭＬまたはＭＤＳを有する対象に、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、薬剤、例えば、細胞毒性薬剤もしくは化学療法剤、生物学的療法（例えば、抗体、例えばモノクローナル抗体、もしくは細胞療法）、または阻害剤（例えば、キナーゼ阻害剤）と組み合わせて投与する。実施形態において、対象に、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、細胞毒性薬剤、例えば、ＣＰＸ－３５１（Ｃｅｌａｔｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、シタラビン、ダウノルビシン、ボサロキシン（Ｓｕｎｅｓｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、サパシタビン（Ｃｙｃｌａｃｅｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、イダルビシンまたはミトキサントロンと組み合わせて投与する。ＣＰＸ－３５１とは、シタラビンとダウノルビシンを５：１のモル比で含むリポソーム製剤である。実施形態において、対象に、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、ＤＮＡメチル化抑制剤（hypomethylating agent）、例えばＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、例えば、アザシチジンまたはデシタビンと組み合わせて投与する。実施形態において、対象に、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、生物学的療法、例えば抗体または細胞療法、例えば、２２５Ａｃ－リンツズマブ（Ａｃｔｉｍａｂ－Ａ；Ａｃｔｉｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＩＰＨ２１０２（Ｉｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ／Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＳＧＮ－ＣＤ３３Ａ（Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、またはゲムツズマブ・オゾガマイシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ；Ｐｆｉｚｅｒ）と組み合わせて投与する。ＳＧＮ－ＣＤ３３Ａとは、抗ＣＤ３３抗体に付着しているピロロベンゾジアゼピン二量体を含む、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）である。Ａｃｔｉｍａｂ－Ａとは、アクチニウムで標識された抗ＣＤ３３抗体（リンツズマブ）である。ＩＰＨ２１０２とは、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）を標的とするモノクローナル抗体である。実施形態において、対象に、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、ＦＬＴ３阻害剤、例えば、ソラフェニブ（Ｂａｙｅｒ）、ミドスタウリン（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、キザルチニブ（第一三共株式会社）、クレノラニブ（Ａｒｏｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＰＬＸ３３９７（第一三共株式会社）、ＡＫＮ－０２８（Ａｋｉｎｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、またはＡＳＰ２２１５（アステラス製薬株式会社）と組み合わせて投与する。実施形態において、対象に、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ）阻害剤、例えば、ＡＧ－２２１（Ｃｅｌｇｅｎｅ／Ａｇｉｏｓ）またはＡＧ－１２０（Ａｇｉｏｓ／Ｃｅｌｇｅｎｅ）と組み合わせて投与する。実施形態において、対象に、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、細胞周期調節剤、例えば、ポロ様キナーゼ１（Ｐｌｋ１）の阻害剤、例えばボラセルチブ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）；またはサイクリン依存性キナーゼ９（Ｃｄｋ９）の阻害剤、例えばアルボシジブ（Ｔｏｌｅｒｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｓａｎｏｆｉ Ａｖｅｎｔｉｓ）と組み合わせて投与する。実施形態において、対象に、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、Ｂ細胞受容体シグナル伝達ネットワーク阻害剤、例えば、Ｂ細胞リンパ腫２（Ｂｃｌ－２）の阻害剤、例えば、ベネトクラクス（Ａｂｂｖｉｅ／Ｒｏｃｈｅ）；またはブルトン型チロシンキナーゼ（Ｂｔｋ）の阻害剤、例えばイブルチニブ（Ｐｈａｒｍａｃｙｃｌｉｃｓ／Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｊａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）と組み合わせて投与する。実施形態において、対象に、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、Ｍ１アミノペプチダーゼの阻害剤、例えば、トセドスタット（ＣＴＩ ＢｉｏＰｈａｒｍａ／Ｖｅｒｎａｌｉｓ）；ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）の阻害剤、例えば、プラシノスタット（ＭＥＩ Ｐｈａｒｍａ）；多標的キナーゼ阻害剤、例えば、リゴサチブ（Ｏｎｃｏｎｏｖａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ／Ｂａｘｔｅｒ／ＳｙｍＢｉｏ）；またはペプチド性ＣＸＣＲ４インバースアゴニスト、例えば、ＢＬ－８０４０（ＢｉｏＬｉｎｅＲｘ）と組み合わせて投与する。
別の実施形態において、細胞の移植、例えば同種異系幹細胞移植の前に、対象に、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、本発明の組成物の注入を施す。好ましい実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、例えば、ｍＲＮＡ ＣＡＲのエレクトロポレーションにより、ＣＡＲを一過性に発現し、それによって、ＣＡＲの標的にされる抗原、例えばＣＤ１９の発現をドナー幹細胞の注入の前に停止させて生着不全を回避する。一実施形態において、対象は、ＣＡＲ発現細胞の投与に関連する副作用を低減または改善する薬剤を投与されてもよい。ＣＡＲ発現細胞の投与に関連する副作用としては、これらに限定されないが、ＣＲＳ、およびマクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）とも称される血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）が挙げられる。ＣＲＳの症状としては、高熱、吐き気、一過性の低血圧、低酸素症、および同種のものが挙げられる。したがって、本明細書で説明される方法は、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を対象に投与することと、薬剤をさらに投与して、ＣＡＲ発現細胞による処置から生じる可溶性因子のレベルの上昇を管理することとを含み得る。一実施形態において、対象において上昇する可溶性因子は、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα、ＩＬ－２およびＩＬ－６の１つまたは複数である。したがって、この副作用を処置するのに投与される薬剤は、これらの可溶性因子の１つまたは複数を中和する薬剤であり得る。このような薬剤の例は、ステロイド（例えば、コルチコステロイド）、ＴＮＦαの阻害剤、およびＩＬ－６の阻害剤を含むがこれらに限定されない。ＴＮＦα阻害剤の例は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、およびゴリムマブなどの抗ＴＮＦα抗体分子である。ＴＮＦα阻害剤の別の例は、融合タンパク質、エタネルセプトなどである。ＴＮＦαの低分子阻害剤は、キサンチン誘導体（例えば、ペントキシフィリン）およびブプロピオンを含むがこれらに限定されない。ＩＬ－６阻害剤の例は、トシリズマブ（ｔｏｃ）、サリルマブ、エルシリモマブ、ＣＮＴＯ ３２８、ＡＬＤ５１８／ＢＭＳ－９４５４２９、ＣＮＴＯ １３６、ＣＰＳＩ－２３６４、ＣＤＰ６０３８、ＶＸ３０、ＡＲＧＸ－１０９、ＦＥ３０１、およびＦＭ１０１などの抗ＩＬ－６抗体分子である。一実施形態において、抗ＩＬ－６抗体分子は、トシリズマブである。ＩＬ－１Ｒベースの阻害剤の例は、アナキンラである。
実施形態において、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲを発現する１つまたは複数の細胞を投与する前に、対象においてリンパ枯渇を実施する。実施形態において、リンパ枯渇は、メルファラン、シトキサン、シクロホスファミドおよびフルダラビンの１つまたは複数を投与することを含む。
実施形態において、リンパ枯渇化学療法を、対象に、ＣＡＲ細胞、例えば、本明細書で説明される細胞の投与（例えば、注入）の前に、投与と並列して、または投与の後で投与する。ある例では、リンパ枯渇化学療法を、対象に、ＣＡＲ細胞の投与の前に投与する。例えば、リンパ枯渇化学療法は、ＣＡＲ細胞の注入の１～４日（例えば、１、２、３、または４日）前に終了する。実施形態において、ＣＡＲ細胞の複数回投与を、例えば、本明細書で説明される通りに行う。例えば、単回投与は、ＣＡＲ細胞約５×１０８個を含む。実施形態において、リンパ枯渇化学療法を、対象に、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞の投与（例えば、注入）の前に、投与と並列して、または投与の後で投与する。
一部の実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＴＬ０１９、例えば、参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１２／０７９０００において説明されているようなＣＴＬ０１９と組み合わせて、がん抗原の発現に関連する疾患、例えば、本明細書で説明されるがんの処置のために投与する。理論に縛られずに述べると、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞を、別のＣＡＲ発現細胞と組み合わせて投与することは、初期系統のがん細胞、例えば、がん幹細胞を標的とすること、免疫応答をモジュレートすること、調節性Ｂ細胞を枯渇させること、および／または腫瘍微小環境を改善することにより、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞の効能を改善すると考えられる。例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞は、初期系統マーカーを発現するがん細胞、例えば、がん幹細胞およびＣＤ１９発現細胞を標的とするのに対し、本明細書で説明される一部の他のＣＡＲ発現細胞は、後期系統マーカーを発現するがん細胞を標的とする。このプレコンディショニング法は、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞の効能を改善し得る。このような実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞を、第二のＣＡＲ発現細胞の投与（例えば、注入）の前に、投与と並列して、または投与の後で投与する。
実施形態において、ＣＤ１９以外のがん抗原を標的とするＣＡＲを発現するＣＡＲ発現細胞はまた、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲ、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲも発現する。ある実施形態において、非ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞を、対象に、本明細書で説明されるがん、例えば、ＡＭＬの処置のために投与する。ある実施形態において、前記ＣＡＲ分子の一方または両方の配置は、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを含む。別の実施形態において、前記ＣＡＲ分子の一方または両方の配置は、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび２つ以上、例えば、２つ、３つ、４つまたは５つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。このような実施形態において、非ＣＤ１９ ＣＡＲ分子およびＣＤ１９ ＣＡＲは、同じ一次細胞内シグナル伝達ドメインを有してもよく、異なる一次細胞内シグナル伝達ドメインを有してもよく、同じ共刺激シグナル伝達ドメインを有してもよく、異なる共刺激シグナル伝達ドメインを有してもよく、同じ数の共刺激シグナル伝達ドメインを有してもよく、異なる数の共刺激シグナル伝達ドメインを有してもよい。代替的に、非ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ１９ ＣＡＲは、前記ＣＡＲ分子の一方が抗原結合ドメインおよび共刺激ドメイン（例えば、４－１ＢＢ）を含むのに対して他方のＣＡＲ分子が抗原結合ドメインおよび一次細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ゼータ）を含む、スプリットＣＡＲとして配置される。
阻害分子阻害剤／チェックポイント阻害剤
一実施形態において、対象に、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を投与することができる。例えば、一実施形態において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であってもよく、例えば、薬剤は、チェックポイント阻害剤である。阻害分子またはチェックポイント分子、例えばプログラム死１（ＰＤ１）は、一部の実施形態において、免疫エフェクター応答を開始するＣＡＲ発現細胞の能力を低下させることができる。阻害分子の例としては、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲ（例えば、ＴＧＦＲベータ）が挙げられる。実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞は、スイッチ共刺激受容体、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるＷＯ２０１３／０１９６１５において説明されているようなスイッチ共刺激受容体を含む。
本明細書で説明される方法は、ＣＡＲ発現細胞をチェックポイント阻害剤と組み合わせて投与することを包含し得る。一実施形態において、対象は、完全応答例である。別の実施形態において、対象は、部分応答例または非応答例であり、例えば、一部の実施形態において、チェックポイント阻害剤をＣＡＲ発現細胞の前に、例えば、ＣＡＲ発現細胞の投与の２週間、１２日、１０日、８日、１週間、６日、５日、４日、３日、２日または１日前に投与する。一部の実施形態において、チェックポイント阻害剤をＣＡＲ発現細胞と同時に投与する。
例えば、ＤＮＡレベル、ＲＮＡレベル、またはタンパク質レベルにおける阻害による阻害分子の阻害は、ＣＡＲ発現細胞の性能を最適化し得る。実施形態において、阻害核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、またはクラスター化規則的間隔短鎖回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用して、ＣＡＲ発現細胞における阻害分子の発現を阻害することができる。一実施形態において、阻害剤は、ｓｈＲＮＡである。ある実施形態において、阻害分子は、ＣＡＲ発現細胞内で阻害される。これらの実施形態において、阻害分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子は、構成要素、例えばＣＡＲの構成要素の全てをコードする核酸に連結されている。
ある実施形態において、Ｔ細胞の機能をモジュレートまたは調節する、例えば、Ｔ細胞の機能を阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子が発現される、例えば、ＣＡＲ発現細胞内で発現されるように、Ｔ細胞の機能をモジュレートまたは調節する、例えば、Ｔ細胞の機能を阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子を、プロモーター、例えば、Ｈ１由来のプロモーターまたはＵ６由来のプロモーターに作動可能に連結する。例えば、Tiscornia G., “Development of Lentiviral Vectors Expressing siRNA,” Chapter 3, in Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA (eds.Friedmann and Rossi).Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 2007；Brummelkamp TR, et al.(2002) Science 296: 550-553；Miyagishi M, et al.(2002) Nat. Biotechnol.19: 497-500を参照されたい。ある実施形態において、Ｔ細胞機能をモジュレートまたは調節する、例えば阻害する、分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲの構成要素、例えば構成要素の全て、をコードする核酸分子を含む同じベクター、例えばレンチウイルスベクター、上に存在する。このような実施形態において、Ｔ細胞の機能をモジュレートまたは調節する、例えば、Ｔ細胞の機能を阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ベクター、例えば、レンチウイルスベクターの、ＣＡＲの構成要素、例えば、構成要素の全てをコードする核酸に対して、５’側または３’側に配置される。Ｔ細胞の機能をモジュレートまたは調節する、例えば、Ｔ細胞の機能を阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲの構成要素、例えば、構成要素の全てをコードする核酸と、同じ方向に転写される場合もあり、異なる方向に転写される場合もある。ある実施形態において、Ｔ細胞の機能をモジュレートまたは調節する、例えば、Ｔ細胞の機能を阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲの構成要素、例えば、構成要素の全てをコードする核酸分子を含むベクター以外のベクターに存在する。ある実施形態において、Ｔ細胞の機能をモジュレートまたは調節する、例えば、Ｔ細胞の機能を阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲ発現細胞内で一過性に発現される。ある実施形態において、Ｔ細胞の機能をモジュレートまたは調節する、例えば、Ｔ細胞の機能を阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲ発現細胞のゲノムに安定的に統合される。ある実施形態において、Ｔ細胞機能をモジュレートまたは調節する、例えば阻害する分子は、ＰＤ－１である。
一実施形態において、阻害シグナルの阻害剤は、例えば阻害分子に結合する抗体または抗体フラグメントであってもよい。例えば、薬剤は、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２またはＣＴＬＡ４に結合する抗体または抗体フラグメントであってもよい［例えば、イピリムマブ（また、ＭＤＸ－０１０およびＭＤＸ－１０１とも称され、Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）として販売されている；Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ；トレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒより入手可能なＩｇＧ２モノクローナル抗体、以前はチシリムマブとして公知、ＣＰ－６７５，２０６）。］。ある実施形態において、薬剤は、ＴＩＭ３に結合する抗体または抗体フラグメントである。ある実施形態において、薬剤は、ＬＡＧ３に結合する抗体または抗体フラグメントである。ある実施形態において、薬剤は、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）と結合する、抗体または抗体フラグメントである。実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤、例えば、阻害分子の阻害剤を、同種異系のＣＡＲ、例えば、本明細書で説明される（例えば、本明細書の「同種異系のＣＡＲ」節において説明される）同種異系のＣＡＲと組み合わせて投与する。
ＰＤ１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、およびＢＴＬＡも包含する受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害性の一員である。ＰＤ１は、活性化されたＢ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞で発現される（Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75）。ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２に関する２つのリガンドは、ＰＤ１に結合する際にＴ細胞の活性化を下方調節することが示されている（Freeman et a.2000 J Exp Med 192:1027-34；Latchman et al.2001 Nat Immunol 2:261-8； Carter et al.2002 Eur J Immunol 32:634-43）。ＰＤ－Ｌ１は、ヒトがんにおいて豊富である（Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7；Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314；Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094）。免疫抑制は、ＰＤ１とＰＤ－Ｌ１との局所的な相互作用を阻害することによって、回復させることができる。
当業界では、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、およびＰＤ－Ｌ２の、抗体、抗体フラグメント、および他の阻害剤が利用可能であり、本明細書で説明されるＣＤ１９ ＣＡＲと組み合わせて使用することができる。例えば、ニボルマブ（また、ＢＭＳ－９３６５５８またはＭＤＸ１１０６とも称される；Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）は、ＰＤ１を特異的にブロックする完全ヒトＩｇＧ４ モノクローナル抗体である。ＰＤ１に特異的に結合するニボルマブ（クローン５Ｃ４）および他のヒトモノクローナル抗体は、ＵＳ８，００８，４４９およびＷＯ２００６／１２１１６８に開示されている。ピジリズマブ（Ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）（ＣＴ－０１１；Ｃｕｒｅ Ｔｅｃｈ）は、ＰＤ１ピジリズマブに結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体であり、他のヒト化抗ＰＤ１モノクローナル抗体は、ＷＯ２００９／１０１６１１に開示されている。ペンブロリズマブ（かつては、ランブロリズマブとして公知であり、また、キイトルーダ、ＭＫ０３４７５とも称する；Ｍｅｒｃｋ）とは、ＰＤ１に結合するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ペンブロリズマブ および他のヒト化抗ＰＤ１抗体は、ＵＳ８，３５４，５０９およびＷＯ２００９／１１４３３５において開示されている。ＭＥＤＩ４７３６（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）は、ＰＤＬ１に結合するヒトモノクローナル抗体であり、リガンドの、ＰＤ１との相互作用を阻害する。ＭＤＰＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）は、ＰＤ－Ｌ１に結合するヒトＦｃに最適化されたＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ＭＤＰＬ３２８０Ａおよび他のＰＤ－Ｌ１に対するヒトモノクローナル抗体は、米国特許第７，９４３，７４３号および米国特許出願公開第２０１２００３９９０６号に開示されている。他の抗ＰＤ－Ｌ１結合剤としては、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（ＷＯ２０１０／０７７６３４において、重鎖および軽鎖可変領域は、配列番号２０および２１に示される）およびＭＤＸ－１ １０５（また、ＢＭＳ－９３６５５９とも称され、例えばＷＯ２００７／００５８７４で開示された抗ＰＤ－Ｌ１結合剤である）が挙げられる。ＡＭＰ－２２４（Ｂ７－ＤＣＩｇ；アンプリミューン；例えば、ＷＯ２０１０／０２７８２７およびＷＯ２０１１／０６６３４２で開示されたもの）は、ＰＤ１とＢ７－Ｈ１との相互作用をブロックするＰＤ－Ｌ２Ｆｃ融合可溶性受容体である。他の抗ＰＤ１抗体としては、なかでもＡＭＰ５１４（アンプリミューン）が挙げられ、例えば、ＵＳ８，６０９，０８９、ＵＳ２０１００２８３３０、および／またはＵＳ２０１２０１１４６４９で開示された抗ＰＤ１抗体である。
一部の実施形態において、本明細書で説明されるＰＤ１阻害剤（例えば、ＰＤ１抗体、例えば本明細書で説明されるＰＤ１抗体）を、本明細書で説明されるＣＤ１９ ＣＡＲと組み合わせて使用して、ＣＤ１９の発現に関連する疾患を処置する。一部の実施形態において、本明細書で説明されるＰＤ－Ｌ１阻害剤（例えば、ＰＤ－Ｌ１抗体、例えば本明細書で説明されるＰＤ－Ｌ１抗体）を、本明細書で説明されるＣＤ１９ ＣＡＲと組み合わせて使用して、ＣＤ１９の発現に関連する疾患を処置する。疾患は、例えばリンパ腫、例えば、原発性ＤＬＢＣＬまたは続発性ＤＬＢＣＬを包含するＤＬＢＣＬであってもよい。一部の実施形態において、対象は、ＣＤ３＋／ＰＤ１＋であるがん細胞、例えばＤＬＢＣＬ細胞、少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を有してもよく、またはこれを有するものとして同定されてもよい。一部の実施形態において、対象は、がん、例えばがん微小環境において、実質的に重複しないＣＤ１９＋細胞およびＰＤ－Ｌ１＋細胞集団を有するか、またはこれを有するものとして同定される。例えば、一部の実施形態において、がん、例えばがん微小環境において、細胞の２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％未満は、ＣＤ１９およびＰＤ－Ｌ１に関して二重陽性である。
一部の実施形態において、対象をＣＤ１９ ＣＡＲとＰＤ１阻害剤とＰＤ－Ｌ１阻害剤の組合せで処置する。一部の実施形態において、対象をＣＤ１９ ＣＡＲとＰＤ１阻害剤とＣＤ３阻害剤の組合せで処置する。一部の実施形態において、対象をＣＤ１９ ＣＡＲとＰＤ１阻害剤とＰＤ－Ｌ１阻害剤とＣＤ３阻害剤の組合せで処置する。
一部の実施形態において、本明細書における方法は、生体試料、例えば、ＤＬＢＣＬ細胞を含む試料中の細胞を、ＣＤ３および／またはＰＤ－１（例えば、ＣＤ３および／またはＰＤ－１発現）についてアッセイする工程を包含する。一部の実施形態において、方法は、生体試料、例えば、ＤＬＢＣＬ細胞を含む試料中の細胞を、ＣＤ１９および／またはＰＤ－Ｌ１（例えば、ＣＤ１９および／またはＰＤ－Ｌ１発現）についてアッセイする工程を包含する。一部の実施形態において、方法は、例えば、がん細胞を含む試料を用意する工程、およびＣＤ３、ＰＤ－１、ＣＤ１９またはＰＤ－Ｌ１の１つまたは複数についての検出工程を、例えば、免疫組織化学によって実施する工程を包含する。方法は、処置、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲを含む処置を推奨または投与するさらなる工程を含んでいてもよい。
一実施形態において、抗ＰＤ－１抗体またはそのフラグメントは、参照によりその全体が組み入れられる、「Antibody Molecules to PD-1 and Uses Thereof」という表題の米国特許出願公開第２０１５／０２１０７６９号において説明されているような、抗ＰＤ－１抗体分子である。一実施形態において、抗ＰＤ－１抗体分子は、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０４９－Ｃｌｏｎｅ－Ａ、ＢＡＰ０４９－Ｃｌｏｎｅ－Ｂ、ＢＡＰ０４９－Ｃｌｏｎｅ－Ｃ、ＢＡＰ０４９－Ｃｌｏｎｅ－ＤもしくはＢＡＰ０４９－Ｃｌｏｎｅ－Ｅ、あるいは米国特許出願公開第２０１５／０２１０７６９号の表１に記載のもの、または表１のヌクレオチド配列、もしくは前述の配列のいずれかと実質的に同一の（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超えて同一の）配列、によってコードされるもの、のいずれかから選ばれる抗体からの重鎖および軽鎖可変領域からの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＣＤＲ（またはまとめて全てのＣＤＲ）；あるいは密接な関連のあるＣＤＲ、例えば、同一であるＣＤＲ、または少なくとも１つのアミノ酸の変更を有するが、２つ、３つもしくは４つより多くの変更（例えば、置換、欠失もしくは挿入、例えば保存的置換）を有さないＣＤＲを包含する。
さらに別の実施形態において、抗ＰＤ－１抗体分子は、本明細書で説明される抗体、例えば、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０４９－ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０４９－Ｃｌｏｎｅ－Ａ、ＢＡＰ０４９－Ｃｌｏｎｅ－Ｂ、ＢＡＰ０４９－Ｃｌｏｎｅ－Ｃ、ＢＡＰ０４９－Ｃｌｏｎｅ－ＤもしくはＢＡＰ０４９－Ｃｌｏｎｅ－Ｅ、あるいは米国特許出願公開第２０１５／０２１０７６９号の表１に記載のもの、または表１のヌクレオチド配列、もしくは前述の配列のいずれかと実質的に同一の（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超えて同一の）配列、によってコードされるもの、のいずれかから選ばれる抗体からの少なくとも１つ、２つ、３つまたは４つの可変領域を含む。
ＴＩＭ３（Ｔ細胞免疫グロブリン３）もまた、特に、ＩＦＮ－ｇを分泌するＣＤ４＋ １型ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋ １型細胞毒性Ｔ細胞において、Ｔ細胞の機能を負に調節し、Ｔ細胞の消耗において極めて重要な役割を果たす。ＴＩＭ３と、そのリガンド、例えば、ガレクチン９（Ｇａｌ９）、ホスファチジルセリン（phosphotidylserine）（ＰＳ）、およびＨＭＧＢ１との相互作用の阻害は、免疫応答を増加させ得る。当業界では、ＴＩＭ３およびそのリガンドの抗体、抗体フラグメント、および他の阻害剤が利用可能であり、本明細書で説明されるＣＤ１９ ＣＡＲと組み合わせて使用することができる。例えば、ＴＩＭ３を標的とする、抗体、抗体フラグメント、低分子、またはペプチド阻害剤は、ＴＩＭ３のＩｇＶドメインに結合して、そのリガンドとの相互作用を阻害する。ＴＩＭ３を阻害する抗体およびペプチドは、ＷＯ２０１３／００６４９０およびＵＳ２０１００２４７５２１において開示されている。他の抗ＴＩＭ３抗体は、ＲＭＴ３－２３（Ngiow et al., 2011, Cancer Res, 71:3540-3551において開示されている）およびクローン８Ｂ．２Ｃ１２（Monney et al., 2002, Nature, 415:536-541において開示されている）のヒト化形を含む。ＴＩＭ３およびＰＤ－１を阻害する二特異性抗体は、ＵＳ２０１３０１５６７７４において開示されている。
一実施形態において、抗ＴＩＭ３抗体またはそのフラグメントは、参照によりその全体が組み入れられる、「Antibody Molecules to TIM3 and Uses Thereof」という表題の米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号において説明されているような、抗ＴＩＭ３抗体分子である。一実施形態において、抗ＴＩＭ３抗体分子は、ＡＢＴＩＭ３、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０１、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０２、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０３、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０４、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０５、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０６、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０７、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０８、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０９、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１０、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１１、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１２、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１３、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１４、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１５、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１６、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１７、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１８、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１９、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ２０、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ２１、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ２２、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ２３、あるいは米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号の表１～４に記載のもの、または表１～４のヌクレオチド配列、もしくは前述の配列のいずれかと実質的に同一の（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超えて同一の）配列、によってコードされるもの、のいずれかから選ばれる抗体からの重鎖および軽鎖可変領域からの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＣＤＲ（またはまとめて全てのＣＤＲ）；あるいは密接な関連のあるＣＤＲ、例えば、同一であるＣＤＲ、または少なくとも１つのアミノ酸の変更を有するが、２つ、３つもしくは４つより多くの変更（例えば、置換、欠失もしくは挿入、例えば保存的置換）を有さないＣＤＲを包含する。
さらに別の実施形態において、抗ＴＩＭ３抗体分子は、本明細書で説明される抗体、例えば、ＡＢＴＩＭ３、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０１、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０２、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０３、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０４、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０５、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０６、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０７、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０８、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０９、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１０、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１１、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１２、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１３、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１４、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１５、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１６、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１７、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１８、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１９、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ２０、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ２１、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ２２、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ２３、あるいは米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号の表１～４に記載のもの、または表１～４のヌクレオチド配列、もしくは前述の配列のいずれかと実質的に同一の（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超えて同一の）配列、によってコードされるもの、のいずれかから選ばれる抗体からの少なくとも１つ、２つ、３つまたは４つの可変領域を含む。
他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、ＣＥＡＣＡＭ阻害剤（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、および／またはＣＥＡＣＡＭ－５阻害剤）である。一実施形態において、ＣＥＡＣＡＭの阻害剤は、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体分子である。例示的な抗ＣＥＡＣＡＭ－１抗体は、ＷＯ２０１０／１２５５７１、ＷＯ２０１３／０８２３６６、ＷＯ２０１４／０５９２５１、およびＷＯ２０１４／０２２３３２において説明されており、例えば、ＵＳ２００４／００４７８５８、ＵＳ７，１３２，２５５、およびＷＯ９９／０５２５５２において説明されている、例えば、モノクローナル抗体である、３４Ｂ１、２６Ｈ７、および５Ｆ４、またはこれらの組換え形態である。他の実施形態において、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体は、例えば、Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529 (DOI:10:1371/journal.pone.0021146)において説明されているＣＥＡＣＡＭ－５に結合するか、または例えば、ＷＯ２０１３／０５４３３１およびＵＳ２０１４／０２７１６１８において説明されている、ＣＥＡＣＡＭ－１およびＣＥＡＣＡＭ－５と交差反応する。
理論に縛られるつもりはないが、ＣＥＡＣＡＭ－１およびＣＥＡＣＡＭ－５などの癌胎児性抗原細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）は、少なくとも部分的に、抗腫瘍免疫応答の阻害を媒介すると考えられる（例えば、Markel et al. J Immunol. 2002 Mar 15;168(6):2803-10; Markel et al. J Immunol. 2006 Nov 1;177(9):6062-71; Markel et al. Immunology. 2009 Feb;126(2):186-200; Markel et al. Cancer Immunol Immunother. 2010 Feb;59(2):215-30; Ortenberg et al. Mol Cancer Ther. 2012 Jun;11(6):1300-10; Stern et al. J Immunol. 2005 Jun 1;174(11):6692-701; Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529を参照されたい）。例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１は、ＴＩＭ－３に対する異好性リガンドとして、ＴＩＭ－３に媒介されるＴ細胞の忍容性および消耗において、役割を果たすものとして説明されている（例えば、ＷＯ２０１４／０２２３３２；Huang, et al. (2014) Nature doi:10.1038/nature13848を参照されたい）。実施形態において、ＣＥＡＣＡＭ－１およびＴＩＭ－３の共遮断は、異種移植片結腸直腸がんモデルにおいて、抗腫瘍免疫応答を増強することが示されている（例えば、ＷＯ２０１４／０２２３３２；Huang, et al. (2014), supraを参照されたい）。他の実施形態において、ＣＥＡＣＡＭ－１およびＰＤ－１の共遮断は、例えば、ＷＯ２０１４／０５９２５１において説明されている、Ｔ細胞忍容性を低減する。したがって、ＣＥＡＣＡＭ阻害剤は、がん、例えば、黒色腫、肺がん（例えば、ＮＳＣＬＣ）、膀胱がん、結腸がん、卵巣がん、および本明細書で説明される他のがんに対する免疫応答を増強するのに、本明細書で説明される他のイムノモジュレーター（例えば、抗ＰＤ－１および／または抗ＴＩＭ－３阻害剤）とともに使用することができる。
ＬＡＧ３（リンパ球活性化遺伝子３またはＣＤ２２３）は、活性化したＴ細胞およびＢ細胞において発現される細胞表面分子であって、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の消耗において役割を果たすことが示されている細胞表面分子である。当業界では、ＬＡＧ３およびそのリガンドの抗体、抗体フラグメント、および他の阻害剤が利用可能であり、本明細書で説明されるＣＤ１９ ＣＡＲと組み合わせて使用することができる。例えば、ＢＭＳ－９８６０１６（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂ）は、ＬＡＧ３を標的とするモノクローナル抗体である。ＩＭＰ７０１（Ｉｍｍｕｔｅｐ）は、ＬＡＧ３アンタゴニスト抗体であり、ＩＭＰ７３１（ＩｍｍｕｔｅｐおよびＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）は、ＬＡＧ３枯渇抗体である。他のＬＡＧ３阻害剤は、ＬＡＧ３の可溶性部分と、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を活性化させる、Ｉｇとの組換え融合タンパク質である、ＩＭＰ３２１（Ｉｍｍｕｔｅｐ）を含む。他の抗体は、例えば、ＷＯ２０１０／０１９５７０において開示されている。
一実施形態において、抗ＬＡＧ３抗体またはそのフラグメントは、参照によりその全体が組み入れられる、「Antibody Molecules to LAG3 and Uses Thereof」という表題の米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２０号において説明されているような、抗ＬＡＧ３抗体分子である。一実施形態において、抗ＬＡＧ３抗体分子は、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１７、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１８、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１９、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ２０、ｈｕＢＡＰ０５０（Ｓｅｒ）（例えば、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０１－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０２－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０３－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０４－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０５－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０６－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０７－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０８－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０９－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１０－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１１－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１２－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１３－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１４－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１５－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１８－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１９－Ｓｅｒ、もしくはＢＡＰ０５０－ｈｕｍ２０－Ｓｅｒ）、ＢＡＰ０５０－Ｃｌｏｎｅ－Ｆ、ＢＡＰ０５０－Ｃｌｏｎｅ－Ｇ、ＢＡＰ０５０－Ｃｌｏｎｅ－Ｈ、ＢＡＰ０５０－Ｃｌｏｎｅ－Ｉ、もしくはＢＡＰ０５０－Ｃｌｏｎｅ－Ｊ、あるいは米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２０号の表１に記載のもの、または表１のヌクレオチド配列、もしくは前述の配列のいずれかと実質的に同一の（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超えて同一の）配列、によってコードされるもの、のいずれかから選ばれる抗体からの重鎖および軽鎖可変領域からの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つのＣＤＲ（またはまとめて全てのＣＤＲ）；あるいは密接な関連のあるＣＤＲ、例えば、同一であるＣＤＲ、または少なくとも１つのアミノ酸の変更を有するが、２つ、３つもしくは４つより多くの変更（例えば、置換、欠失もしくは挿入、例えば保存的置換）を有さないＣＤＲを包含する。
さらに別の実施形態において、抗ＬＡＧ３抗体分子は、本明細書で説明される抗体、例えば、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１７、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１８、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１９、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ２０、ｈｕＢＡＰ０５０（Ｓｅｒ）（例えば、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０１－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０２－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０３－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０４－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０５－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０６－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０７－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０８－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０９－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１０－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１１－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１２－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１３－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１４－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１５－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１８－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１９－Ｓｅｒ、もしくはＢＡＰ０５０－ｈｕｍ２０－Ｓｅｒ）、ＢＡＰ０５０－Ｃｌｏｎｅ－Ｆ、ＢＡＰ０５０－Ｃｌｏｎｅ－Ｇ、ＢＡＰ０５０－Ｃｌｏｎｅ－Ｈ、ＢＡＰ０５０－Ｃｌｏｎｅ－Ｉ、もしくはＢＡＰ０５０－Ｃｌｏｎｅ－Ｊ、あるいは米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２０号の表１に記載のもの、または表１のヌクレオチド配列、もしくは前述の配列のいずれかと実質的に同一の（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超えて同一の）配列、によってコードされるもの、のいずれかから選ばれる抗体からの少なくとも１つ、２つ、３つまたは４つの可変領域を含む。
理論に縛られるつもりはないが、一部の実施形態において、腫瘍微小環境は、該腫瘍微小環境内のＰＤ－Ｌ１＋発現細胞またはＰＤ１＋Ｔ細胞の存在によって発揮される直接的または間接的な阻害効果のため、がん細胞を攻撃するＣＡＲＴ細胞へ伝導性を有さない。より具体的には、腫瘍微小環境は、腫瘍細胞（一般にＣＤ１９＋である）、免疫エフェクター細胞（ＣＤ３＋Ｔ細胞であってもよく、およびＰＤ１＋であってもまたはＰＤ１－であってもよく、および内在性細胞であってもまたはＣＡＲ発現細胞であってもよい）、および活性化骨髄腫細胞（一般にＰＤ－Ｌ１＋である）を含み得る。ＰＤ１＋Ｔ細胞は、腫瘍へのＣＡＲＴ細胞の侵入を妨げる（preventing entry of CART cells the tumor）ことによって腫瘍微小環境の周囲に「バリア」を作り出すことができる。本明細書中の非限定的理論によれば、ＰＤ１阻害剤および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤の事前投与は、腫瘍微小環境を、該腫瘍微小環境へのＣＡＲ発現細胞の侵入および標的陽性がん細胞の有効なクリアランスに有利なものにする。このモデルを支持するデータを、本明細書において、例えば実施例２０および２１において提供する。
したがって、ある特定の態様において、本開示は、併用療法の方法であって、対象に、ＣＤ１９に結合するＣＡＲ分子、例えばＣＤ１９ ＣＡＲ、を発現する細胞を、ＰＤ１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、または両方と組み合わせて投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、ＰＤ１阻害剤および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤をＣＡＲ療法の前に投与する。他の実施形態において、ＰＤ１阻害剤および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤をＣＡＲ療法と同時に、またはその後に投与する。一部の態様において、対象は、ＣＤ１９の発現に関連する疾患、例えば血液系悪性腫瘍、例えば、白血病またはリンパ腫、例えばＤＬＢＣＬ、例えば原発性ＤＬＢＣＬを有する対象である。一部の実施形態において、患者は、ＰＤ１、ＰＤＬ１もしくはＣＤ３またはこれらのいずれかの組合せの上昇したレベルを有するか、またはそれを有するものとして同定される。一部の実施形態において、患者は、ＣＤ３およびＰＤ１に関して陽性であるＤＬＢＣＬ細胞少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を有するか、またはこれを有するものとして同定される。
ＣＡＲ療法、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ療法の効能をモニタリングする方法も、本明細書において提供される。ＣＡＲ発現細胞を、該細胞が腫瘍細胞にホーミングする、例えば、腫瘍に浸潤することを意図して、患者の血流に投与することができる。したがって、一部の実施形態において、方法は、腫瘍試料をＣＡＲ発現細胞の存在についてアッセイすることを含む。実施形態において、方法は、腫瘍マーカー、例えばＣＤ１９を検出することを含む。実施形態において、方法は、ＣＡＲ発現細胞のマーカー、例えば、ＣＡＲコンストラクトのマーカー、またはＣＡＲコンストラクトをコードする核酸のマーカーを検出することを含む。実施形態において、方法は、Ｔ細胞マーカー、例えばＣＤ３を検出することを含む。一部の態様において、対象は、ＣＤ１９の発現に関連する疾患、例えば血液系悪性腫瘍、例えば、白血病またはリンパ腫、例えばＤＬＢＣＬ、例えば原発性ＤＬＢＣＬを有する対象である。一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞が腫瘍の不良な浸潤を示した場合、対象は、良好な腫瘍浸潤を有する対象と比較して再発リスクが高いものとして同定される。一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞が不良な腫瘍浸潤を示した場合、対象に、ＰＤ１阻害剤および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤を、例えば、ＣＡＲ発現細胞の第二の用量と組み合わせて投与する。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の活性を強化する薬剤は、例えば、第一のドメインおよび第二のドメインを含む融合タンパク質であってもよく、ここで第一のドメインは阻害分子またはそれらのフラグメントであり、第二のドメインは、正のシグナルと会合するポリペプチドであり、例えば、本明細書で説明したような細胞内（antracellular）シグナル伝達ドメインを含む（comrpsing）ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、正のシグナルと会合するポリペプチドとしては、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳの共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ２７および／またはＩＣＯＳの細胞内シグナル伝達ドメイン、および／または例えば、本明細書で説明されたような、例えばＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達ドメインを挙げることができる。一実施形態において、融合タンパク質は、ＣＡＲを発現した同じ細胞によって発現される。別の実施形態において、融合タンパク質は、細胞、例えば抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現しないＴ細胞によって発現される。
一実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞の活性を強化する薬剤は、ｍｉＲ－１７－９２である。
一実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲの活性を増強する薬剤は、サイトカインである。サイトカインは、Ｔ細胞の拡大、分化、生存、およびホメオスタシスに関する、重要な機能を有する。本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を施される対象に投与し得るサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、およびＩＬ－２１、またはこれらの組合せを含む。実施形態において、投与されるサイトカインは、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはＩＬ－２１、またはこれらの組合せである。サイトカインは、毎日１回、または毎日１回を超えて、例えば、毎日２回、毎日３回、または毎日４回投与することができる。サイトカインは、１日超にわたり投与することができ、例えば、サイトカインを、２日間にわたり、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、または４週間にわたり投与する。例えば、サイトカインを、毎日１回ずつ７日間にわたり投与する。
実施形態において、サイトカインを、ＣＡＲ発現細胞と組み合わせて投与する。サイトカインは、ＣＡＲ発現細胞と同時に投与することもでき、並列して、例えば、同じ日に投与することもできる。サイトカインは、ＣＡＲ発現細胞と同じ医薬組成物中に調製することもでき、別個の医薬組成物中に調製することもできる。代替的に、サイトカインは、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の投与の直後に、例えば、ＣＡＲ発現細胞の投与の１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、または７日後に投与することができる。サイトカインを、１日超にわたり施される投与レジメンにおいて投与する、実施形態において、サイトカイン投与レジメンの１日目は、ＣＡＲ発現細胞の投与と同じ日であってもよく、サイトカイン投与レジメンの１日目は、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の投与の１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、または７日後であってもよい。一実施形態において、１日目に、ＣＡＲ発現細胞を、対象に投与し、２日目に、サイトカインを、毎日１回ずつ、次の７日間にわたり投与する。ある実施形態において、ＣＡＲ発現細胞と組み合わせて投与されるサイトカインは、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、および／またはＩＬ－２１である。
他の実施形態において、サイトカインを、ＣＡＲ発現細胞の投与後、十分な期間にわたり、例えば、ＣＡＲ発現細胞を投与して、少なくとも２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、１０週間、１２週間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、７カ月間、８カ月間、９カ月間、１０カ月間、１１カ月間、もしくは１年間、またはこれを超える後に投与する。一実施形態において、サイトカインを、対象の、ＣＡＲ発現細胞への応答を評価した後で投与する。例えば、対象に、本明細書で説明される投与量およびレジメンに従い、ＣＡＲ発現細胞を投与する。本明細書で説明される方法のいずれかを使用して、対象の、ＣＡＲＴ療法への応答であって、腫瘍増殖の阻害、循環腫瘍細胞の低減、または腫瘍の退縮を含む応答を、ＣＡＲ発現細胞を投与した、２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、１０週間、１２週間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、７カ月間、８カ月間、９カ月間、１０カ月間、１１カ月間、もしくは１年間、またはこれを超える後に評価する。ＣＡＲＴ療法に対して十分な応答を呈示しない対象には、サイトカイン投与することができる。ＣＡＲＴ療法に対する応答が最適未満である対象へのサイトカインの投与は、ＣＡＲＴの効能および／または抗がん活性を改善する。ある実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の投与の後で投与されるサイトカインは、ＩＬ－７である。
さらなる併用療法は、抗アレルギー剤、制吐剤、鎮痛薬、補助療法を包含し得る。
一部の患者は、本明細書で説明される療法および／または他の抗がん剤に対して、投与中または投与後にアレルギー反応を経験することがあるため、アレルギー反応のリスクを最小化するために抗アレルギー剤を投与することが多い。好適な抗アレルギー剤としては、コルチコステロイド、例えば、デキサメタゾン［例えば、Ｄｅｃａｄｒｏｎ（登録商標）］、ベクロメタゾン［例えば、Ｂｅｃｌｏｖｅｎｔ（登録商標）］、ヒドロコルチゾン［コルチゾン、ヒドロコルチゾンコハク酸エステルナトリウム、ヒドロコルチゾンリン酸エステルナトリウムとしてもまた公知であり、Ａｌａ－Ｃｏｒｔ（登録商標）、ヒドロコルチゾンリン酸エステル、Ｓｏｌｕ－Ｃｏｒｔｅｆ（登録商標）、Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔ Ａｃｅｔａｔｅ（登録商標）およびＬａｎａｃｏｒｔ（登録商標）の商標名で販売されている］、プレドニゾロン［Ｄｅｌｔａ－Ｃｏｒｔｅｌ（登録商標）、Ｏｒａｐｒｅｄ（登録商標）、Ｐｅｄｉａｐｒｅｄ（登録商標）およびＰｒｅｌｏｎｅ（登録商標）の商標名で販売されている］、プレドニゾン［Ｄｅｌｔａｓｏｎｅ（登録商標）、Ｌｉｑｕｉｄ Ｒｅｄ（登録商標）、Ｍｅｔｉｃｏｒｔｅｎ（登録商標）およびＯｒａｓｏｎｅ（登録商標）の商標名で販売されている］、メチルプレドニゾロン［６－メチルプレドニゾロン、メチルプレドニゾロン酢酸エステル、メチルプレドニゾロンコハク酸エステルナトリウムとしてもまた公知であり、Ｄｕｒａｌｏｎｅ（登録商標）、Ｍｅｄｒａｌｏｎｅ（登録商標）、Ｍｅｄｒｏｌ（登録商標）、Ｍ－Ｐｒｅｄｎｉｓｏｌ（登録商標）およびＳｏｌｕ－Ｍｅｄｒｏｌ（登録商標）の商標名で販売されている］；抗ヒスタミン剤、例えば、ジフェンヒドラミン［例えば、Ｂｅｎａｄｒｙｌ（登録商標）］、ヒドロキシジンおよびシプロヘプタジン；ならびに気管支拡張剤、例えば、ベータ－アドレナリン作動性受容体アゴニスト、アルブテロール［例えば、Ｐｒｏｖｅｎｔｉｌ（登録商標）］、およびテルブタリン［Ｂｒｅｔｈｉｎｅ（登録商標）］が挙げられる。
一部の患者は、本明細書で説明される療法および／または他の抗がん剤の投与中または投与後に悪心を経験することがあるため、悪心（胃）および嘔吐の予防に制吐剤を使用する。好適な制吐剤としては、アプレピタント［Ｅｍｅｎｄ（登録商標）］、オンダンセトロン［Ｚｏｆｒａｎ（登録商標）］、グラニセトロンＨＣｌ［Ｋｙｔｒｉｌ（登録商標）］、ロラゼパム［Ａｔｉｖａｎ（登録商標）、デキサメタゾン［Ｄｅｃａｄｒｏｎ（登録商標）］、プロクロルペラジン［Ｃｏｍｐａｚｉｎｅ（登録商標）］、カソピタント［Ｒｅｚｏｎｉｃ（登録商標）およびＺｕｎｒｉｓａ（登録商標）］、ならびにこれらの組合せが挙げられる。
患者をより快適にするために、処置期間中に経験する疼痛を緩和するための薬物を処方することが多い。Ｔｙｌｅｎｏｌ（登録商標）などの一般的な市販の鎮痛薬を使用することが多い。しかし、ヒドロコドン／パラセタモールまたはヒドロコドン／アセトアミノフェン［例えば、Ｖｉｃｏｄｉｎ（登録商標）］、モルヒネ［例えば、Ａｓｔｒａｍｏｒｐｈ（登録商標）またはＡｖｉｎｚａ（登録商標）］、オキシコドン［例えば、ＯｘｙＣｏｎｔｉｎ（登録商標）またはＰｅｒｃｏｃｅｔ（登録商標）］、オキシモルフォン塩酸塩［Ｏｐａｎａ（登録商標）］およびフェンタニル［例えば、Ｄｕｒａｇｅｓｉｃ（登録商標）］などのオピオイド鎮痛剤も中等度から重度の疼痛に有用である。
正常細胞を処置の毒性から保護し、臓器毒性を制限するための努力の一環として、細胞保護剤（例えば、神経保護剤、フリーラジカルスカベンジャー、心保護剤、アントラサイクリン、血管外漏出中和剤、栄養剤および同種のもの）を補助療法として使用してもよい。好適な細胞保護剤としては、アミフォスチン［Ｅｔｈｙｏｌ（登録商標）］、グルタミン、ジメスナ［Ｔａｖｏｃｅｐｔ（登録商標）］、メスナ［Ｍｅｓｎｅｘ（登録商標）］、デクスラゾキサン［Ｚｉｎｅｃａｒｄ（登録商標）またはＴｏｔｅｃｔ（登録商標）］、キサリプロデン［Ｘａｐｒｉｌａ（登録商標）］、およびロイコボリン（ロイコボリンカルシウム、シトロボラム因子およびフォリン酸としても公知）が挙げられる。
コード番号、遺伝子名または商品名によって識別される活性化合物の構造は、標準的便覧「Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ」の現行版から、またはデータベース、例えばＰａｔｅｎｔｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（例えば、ＩＭＳ Ｗｏｒｌｄ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）から得ることができる。
本発明の化合物と組み合わせて使用することができる上述の化合物は、当業界において、例えば、上で引用した文献において説明されているように調製し、投与することができる。
一実施形態において、本発明は、薬学的に許容される担体と一緒に本発明の少なくとも１つの化合物（例えば、本発明の化合物）またはその薬学的に許容される塩を含む、単独でまたは他の抗がん剤と一緒にヒトまたは動物対象に投与するのに好適な医薬組成物を提供する。
一実施形態において、本発明は、がんなどの細胞増殖性疾患を患っているヒトまたは動物対象を処置する方法を提供する。本発明は、そのような処置を必要とするヒトまたは動物対象を処置する方法であって、前記対象に、本発明の化合物（例えば、本発明の化合物）またはその薬学的に許容される塩の治療有効量を、単独で、または他の抗がん剤と組み合わせて投与することを含む方法を提供する。
詳細には、組成物は、併用療法薬として一緒に製剤化されるか、または別々に投与されることになる。
併用療法の場合、本発明の化合物および他の抗がん剤を、具体的な時間制限なく、同時に、並行して、または逐次的に投与してもよく、このような投与により患者の体内で前記２種の化合物の治療上有効なレベルが得られる。
好ましい実施形態において、本発明の化合物および他の抗がん剤は、一般に、任意の順序で、逐次的に、注入により投与されるか、または経口投与される。投与レジメンは、疾患の病期、患者の身体フィットネス、個々の薬物の安全性プロファイル、および個々の薬物の許容度、ならびにその組合せを投与する主治医および医師によく知られている他の基準によって変わることもある。本発明の化合物および他の抗がん剤は、処置に使用される特定のサイクルに依存して、互いに数分以内に投与してもよく、数時間、数日またはさらには数週間離して投与してもよい。加えて、サイクルは、処置サイクル中に一方の薬物を他方のものより高頻度に、および薬物の投与ごとに異なる用量で投与することを包含し得る。
本発明の別の態様において、本発明の１つまたは複数の化合物と本明細書に開示の組合せパートナーとを包含するキットを提供する。代表的なキットは、（ａ）本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩、（ｂ）少なくとも１つの組合せパートナー、例えば上で示したような組合せパートナーを包含し、それでこのようなキットは、投与の指示を包含する添付文書または他の標識を含むことがある。
本発明の化合物を公知の治療プロセス、例えば、ホルモン剤または特に放射線の投与と組み合わせて使用して利益を得ることもできる。本発明の化合物は、特に、放射線増感剤として、特に、放射線療法に対して低い感度を示す腫瘍の処置に使用することができる。
免疫を増強する低い用量のｍＴＯＲ阻害剤との組合せ
一実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば本明細書で説明されるＣＡＲ分子、を発現する細胞を、免疫を増強する低い用量のｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて投与する。例えば、ある実施形態において、併用療法は、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、Ｂ細胞阻害剤（ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１の１つまたは複数の阻害剤、例えば、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１の１つまたは複数を標的とするＣＡＲ発現細胞）、およびｍＴＯＲ阻害剤を包含する。本明細書で説明される方法は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１など、ラパログを含む、ｍＴＯＲのアロステリック阻害剤の、免疫を増強する低用量を使用する。ｍＴＯＲ阻害剤の、免疫を増強する低用量（例えば、免疫系を完全に抑制するには不十分であるが、免疫機能を改善するには十分な用量）の投与は、対象における免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＣＡＲ発現細胞の性能を最適化し得る。ｍＴＯＲの阻害を測定するための方法、投与量、処置レジメン、および適切な医薬組成物は、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願第２０１５／０１２４００３６号において説明されている。
ある実施形態において、ｍＴＯＲ阻害剤の、免疫を増強する低用量の投与は、以下：
ｉ）ＰＤ－１陽性免疫エフェクター細胞の数の減少；
ｉｉ）ＰＤ－１陰性免疫エフェクター細胞の数の増加；
ｉｉｉ）ＰＤ－１陰性免疫エフェクター細胞／ＰＤ－１陽性免疫エフェクター細胞の比の増加；
ｉｖ）ナイーブＴ細胞の数の増加；
ｖ）例えば、メモリーＴ細胞、例えば、メモリーＴ細胞前駆体における、以下のマーカー：ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ、ＣＤ１２７ｈｉｇｈ、ＣＤ２７＋、およびＢＣＬ２、の１つまたは複数の発現の増加；
ｖｉ）例えば、メモリーＴ細胞、例えば、メモリーＴ細胞前駆体における、ＫＬＲＧ１の発現の減少；または
ｖｉｉ）メモリーＴ細胞前駆体、例えば、以下の特徴：ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈの増加、ＣＤ１２７ｈｉｇｈの増加、ＣＤ２７＋の増加、ＫＬＲＧ１の減少、およびＢＣＬ２の増加の任意の１つまたはこれらの組合せを有する細胞の数の増加；
の１つまたは複数を結果としてもたらすことができ、
この場合、前出、例えば、ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）、ｖ）、ｖｉ）、またはｖｉｉ）のいずれかは、例えば、処置されていない対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に生じる。
別の実施形態において、ｍＴＯＲ阻害剤の、免疫を増強する低用量の投与は、例えば、培養物または対象における、ＣＡＲ発現細胞の増殖または持続性の、例えば、処置されていないＣＡＲ発現細胞または処置されていない対象と比較した増加または延長を結果としてもたらす。実施形態において、増殖または持続性の増加は、ＣＡＲ発現細胞の数の増加に関連する。増殖の増加または延長を測定するための方法は、実施例１８および１９において説明されている。別の実施形態において、ｍＴＯＲ阻害剤の、免疫を増強する低用量の投与は、例えば、培養物または対象における、ＣＡＲ発現細胞によるがん細胞の殺滅の、例えば、処置されていないＣＡＲ発現細胞または処置されていない対象と比較した増加を結果としてもたらす。実施形態において、がん細胞の殺滅の増加は、腫瘍容量の減少に関連する。
一実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ分子を発現する細胞を、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ｍＴＯＲのアロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１、またはｍＴＯＲの触媒阻害剤の、免疫を増強する低用量と組み合わせて投与する。例えば、ｍＴＯＲ阻害剤の、免疫を増強する低用量の投与は、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞の投与の前に開始し、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞の投与の前に完了することもでき、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞の投与と同時に開始し、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞の投与と重複させることもでき、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞の投与の後で持続することもできる。
代替的にまたは加えて、ｍＴＯＲ阻害剤の、免疫を増強する低用量の投与は、本明細書で説明されるＣＡＲ分子を発現するように加工される、免疫エフェクター細胞を最適化することができる。このような実施形態において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１、または触媒阻害剤の、免疫を増強する低用量の投与を、本明細書で説明されるＣＡＲ分子を発現するように加工される、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の、対象からの採取の前に開始または完了する。
別の実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ分子を発現するように加工される、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、例えば、対象からの採取の後で、ｍＴＯＲ阻害剤の、免疫を増強する低用量の存在下において培養することもでき、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、例えば、対象への投与の前に、ｍＴＯＲ阻害剤の、免疫を増強する低用量の存在下において培養することもできる。
ある実施形態において、対象への、ｍＴＯＲ阻害剤の、免疫を増強する低用量の投与は、例えば、毎週１回、例えば、即放剤形で、０．１～２０、０．５～１０、２．５～７．５、３～６、もしくは約５ｍｇのＲＡＤ００１、またはその生物学的同等用量を投与することを含む。ある実施形態において、対象への、ｍＴＯＲ阻害剤の、免疫を増強する低用量の投与は、例えば、毎週１回、例えば、徐放剤形で、０．３～６０、１．５～３０、７．５～２２．５、９～１８、もしくは約１５ｍｇのＲＡＤ００１、またはその生物学的同等用量を投与することを含む。
ある実施形態において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％であるが９０％を超えないか、少なくとも１０％であるが９０％を超えないか、少なくとも１５％であるが９０％を超えないか、少なくとも２０％であるが９０％を超えないか、少なくとも３０％であるが９０％を超えないか、少なくとも４０％であるが９０％を超えないか、少なくとも５０％であるが９０％を超えないか、少なくとも６０％であるが９０％を超えないか、少なくとも７０％であるが９０％を超えないか、少なくとも５％であるが８０％を超えないか、少なくとも１０％であるが８０％を超えないか、少なくとも１５％であるが８０％を超えないか、少なくとも２０％であるが８０％を超えないか、少なくとも３０％であるが８０％を超えないか、少なくとも４０％であるが８０％を超えないか、少なくとも５０％であるが８０％を超えないか、少なくとも６０％であるが８０％を超えないか、少なくとも５％であるが７０％を超えないか、少なくとも１０％であるが７０％を超えないか、少なくとも１５％であるが７０％を超えないか、少なくとも２０％であるが７０％を超えないか、少なくとも３０％であるが７０％を超えないか、少なくとも４０％であるが７０％を超えないか、少なくとも５０％であるが７０％を超えないか、少なくとも５％であるが６０％を超えないか、少なくとも１０％であるが６０％を超えないか、少なくとも１５％であるが６０％を超えないか、少なくとも２０％であるが６０％を超えないか、少なくとも３０％であるが６０％を超えないか、少なくとも４０％であるが６０％を超えないか、少なくとも５％であるが５０％を超えないか、少なくとも１０％であるが５０％を超えないか、少なくとも１５％であるが５０％を超えないか、少なくとも２０％であるが５０％を超えないか、少なくとも３０％であるが５０％を超えないか、少なくとも４０％であるが５０％を超えないか、少なくとも５％であるが４０％を超えないか、少なくとも１０％であるが４０％を超えないか、少なくとも１５％であるが４０％を超えないか、少なくとも２０％であるが４０％を超えないか、少なくとも３０％であるが４０％を超えないか、少なくとも３５％であるが４０％を超えないか、少なくとも５％であるが３０％を超えないか、少なくとも１０％であるが３０％を超えないか、少なくとも１５％であるが３０％を超えないか、少なくとも２０％であるが３０％を超えないか、または少なくとも２５％であるが３０％を超えない、ｍＴＯＲの阻害に関連するか、またはｍＴＯＲの阻害をもたらす。
ｍＴＯＲ阻害の程度は、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ阻害の程度として伝え得るか、またはこれに対応し得る、例えば、ｍＴＯＲ阻害の程度は、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ活性の減少のレベルにより、例えば、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ基質のリン酸化の減少により決定することができる。ｍＴＯＲ阻害のレベルは、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願第２０１５／０１２４００３６号において説明されている、または参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第７，７２７，９５０号において説明されている、ブーレーアッセイにより、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ活性を測定すること；ウェスタンブロットによりリン酸化したＳ６のレベルを測定すること；またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞の、ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞に対する比の変化を査定することなど、種々の方法により査定することができる。
本明細書で使用される場合、用語「ｍＴＯＲ阻害剤」は、細胞内のｍＴＯＲキナーゼを阻害する化合物もしくはリガンド、または薬学的に許容されるその塩を指す。ある実施形態において、ｍＴＯＲ阻害剤は、アロステリック阻害剤である。ｍＴＯＲのアロステリック阻害剤は、中性の三環式化合物であるラパマイシン（シロリムス）、ラパマイシンと構造的類似性および機能的な類似性を有する化合物であり、例えば、ラパマイシン誘導体、ラパマイシン類似体（ラパログともまた称する）を含む、ラパマイシン関連化合物、およびｍＴＯＲ活性を阻害する、他のマクロリド化合物を含む。ある実施形態において、ｍＴＯＲ阻害剤は、触媒阻害剤である。
ラパマイシンとは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓにより産生される、公知のマクロリド抗生剤であって、式Ａに示される構造を有する抗生剤である。
Figure 0007227331000019
例えば、McAlpine, J.B., et al., J. Antibiotics (1991) 44: 688; Schreiber, S.L., et al., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113: 7433；米国特許第３，９２９，９９２号を参照されたい。ラパマイシンについては、種々の番号付けスキームが提起されている。混乱を回避するために、本明細書では、具体的なラパマイシン類似体を名づける場合、式Ａの番号付けスキームを使用する、ラパマイシンを参照して、名称を与える。
本発明において有用なラパマイシン類似体は、例えば、ラパマイシンのシクロヘキシル環におけるヒドロキシル基を、ＯＲ１［式中、Ｒ１は、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、アシルアミノアルキル、またはアミノアルキルである］により置き換えた、Ｏ置換された類似体；例えば、各々の内容が参照により組み入れられる、ＵＳ５，６６５，７７２およびＷＯ９４／０９０１０において説明されている、エベロリムスとしてもまた公知のＲＡＤ００１である。
他の適切なラパマイシン類似体は、２６位または２８位において置換されたラパマイシン類似体を含む。ラパマイシン類似体は、上述の類似体のエピマー、特に、４０、２８、または２６位において置換された類似体のエピマーであることが可能であり、例えば、それらの内容が参照により組み入れられるＵＳ６，０１５，８１５、ＷＯ９５／１４０２３およびＷＯ９９／１５５３０において説明されている通り、さらに水素化してもよく、例えば、ゾタロリムスとしてもまた公知のＡＢＴ５７８、またはそれらの内容が参照により組み入れられる、ＵＳ７，０９１，２１３、ＷＯ９８／０２４４１、およびＷＯ０１／１４３８７において説明されている、ラパマイシン類似体、例えば、リダホロリムスとしてもまた公知のＡＰ２３５７３であり得る。
本発明における使用に適するラパマイシン類似体の例であって、ＵＳ５，６６５，７７２による例は、４０－Ｏ－ベンジル－ラパマイシン、４０－Ｏ－（４’－ヒドロキシメチル）ベンジル－ラパマイシン、４０－Ｏ－［４’－（１，２－ジヒドロキシエチル）］ベンジル－ラパマイシン、４０－Ｏ－アリル－ラパマイシン、４０－Ｏ－［３’－（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４（Ｓ）－イル）－プロパ－２’－エン－１’－イル］－ラパマイシン、（２’Ｅ，４’Ｓ）－４０－Ｏ－（４’，５’－ジヒドロキシペンタ－２’－エン－１’－イル）－ラパマイシン、４０－Ｏ－（２－ヒドロキシ）エトキシカルボニルメチル－ラパマイシン、４０－Ｏ－（２－ヒドロキシ）エチル－ラパマイシン、４０－Ｏ－（３－ヒドロキシ）プロピル－ラパマイシン、４０－Ｏ－（６－ヒドロキシ）ヘキシル－ラパマイシン、４０－Ｏ－［２－（２－ヒドロキシ）エトキシ］エチル－ラパマイシン、４０－Ｏ－［（３Ｓ）－２，２－ジメチルジオキソラン－３－イル］メチル－ラパマイシン、４０－Ｏ－［（２Ｓ）－２，３－ジヒドロキシプロパ－１－イル］－ラパマイシン、４０－Ｏ－（２－アセトキシ）エチル－ラパマイシン、４０－Ｏ－（２－ニコチノイルオキシ）エチル－ラパマイシン、４０－Ｏ－［２－（Ｎ－モルホリノ）アセトキシ］エチル－ラパマイシン、４０－Ｏ－（２－Ｎ－イミダゾリルアセトキシ）エチル－ラパマイシン、４０－Ｏ－［２－（Ｎ－メチル－Ｎ’－ピペラジニル）アセトキシ］エチル－ラパマイシン、３９－Ｏ－デスメチル－３９，４０－Ｏ，Ｏ－エチレン－ラパマイシン、（２６Ｒ）－２６－ジヒドロ－４０－Ｏ－（２－ヒドロキシ）エチル－ラパマイシン、４０－Ｏ－（２－アミノエチル）－ラパマイシン、４０－Ｏ－（２－アセトアミノエチル）－ラパマイシン、４０－Ｏ－（２－ニコチンアミドエチル）－ラパマイシン、４０－Ｏ－（２－（Ｎ－メチル－イミダゾ－２’－イルカルボエトキサミド）エチル）－ラパマイシン、４０－Ｏ－（２－エトキシカルボニルアミノエチル）－ラパマイシン、４０－Ｏ－（２－トリルスルホンアミドエチル）－ラパマイシンおよび４０－Ｏ－［２－（４’，５’－ジカルボエトキシ－１’，２’，３’－トリアゾール－１’－イル）－エチル］－ラパマイシンを含むがこれらに限定されない。
本発明において有用な他のラパマイシン類似体は、ラパマイシンのシクロヘキシル環におけるヒドロキシル基および／または２８位におけるヒドロキシ基を、ヒドロキシエステル基により置き換えた類似体であり、例えば、ＵＳＲＥ４４，７６８において見出されるラパマイシン類似体、例えば、テムシロリムスが公知である。
本発明において有用な他のラパマイシン類似体は、１６位におけるメトキシ基を、別の置換基、例えばアルキニルオキシ、ベンジル、オルトメトキシベンジル、もしくはクロロベンジルにより置き換え（ヒドロキシにより適宜置換される）、かつ／またはラパマイシンのシクロヘキシル環が、３９位のメトキシ（methyoxy）基を欠くシクロペンチル環となるように、３９位におけるメトキシ（mexthoxy）基を、３９炭素と併せて欠失させた類似体であって、例えば、それらの内容が参照により組み入れられる、ＷＯ９５／１６６９１およびＷＯ９６／４１８０７において説明されている類似体を含む。類似体は、ラパマイシンの４０位におけるヒドロキシをアルキル化し、かつ／または３２カルボニルを還元するように、さらに改変することができる。
ＷＯ９５／１６６９１によるラパマイシン類似体は、１６－デメトキシ（demthoxy）－１６－（ペンタ－２－イニル）オキシ－ラパマイシン、１６－デメトキシ－１６－（ブタ－２－イニル）オキシ－ラパマイシン、１６－デメトキシ－１６－（プロパルギル）オキシ－ラパマイシン、１６－デメトキシ－１６－（４－ヒドロキシ－ブタ－２－イニル）オキシ－ラパマイシン、１６－デメトキシ－１６－ベンジルオキシ－４０－Ｏ－（２－ヒドロキシエチル）－ラパマイシン、１６－デメトキシ－１６－ベンジルオキシ－ラパマイシン、１６－デメトキシ－１６－オルト－メトキシベンジル－ラパマイシン、１６－デメトキシ－４０－Ｏ－（２－メトキシエチル）－１６－ペンタ－２－イニル）オキシ－ラパマイシン、３９－デメトキシ－４０－デスオキシ－３９－ホルミル－４２－ノル－ラパマイシン、３９－デメトキシ－４０－デスオキシ－３９－ヒドロキシメチル－４２－ノル－ラパマイシン、３９－デメトキシ－４０－デスオキシ－３９－カルボキシ－４２－ノル－ラパマイシン、３９－デメトキシ－４０－デスオキシ－３９－（４－メチル－ピペラジン－１－イル）カルボニル－４２－ノル－ラパマイシン、３９－デメトキシ－４０－デスオキシ－３９－（モルホリン－４－イル）カルボニル－４２－ノル－ラパマイシン、３９－デメトキシ－４０－デスオキシ－３９－［Ｎ－メチル、Ｎ－（２－ピリジン－２－イル－エチル）］カルバモイル－４２－ノル－ラパマイシンおよび３９－デメトキシ－４０－デスオキシ－３９－（ｐ－トルエンスルホニルヒドラゾノメチル）－４２－ノル－ラパマイシンを含むがこれらに限定されない。
ＷＯ９６／４１８０７によるラパマイシン類似体は、３２－デオキソ－ラパマイシン、１６－Ｏ－ペント－２－イニル－３２－デオキソ－ラパマイシン、１６－Ｏ－ペント－２－イニル－３２－デオキソ－４０－Ｏ－（２－ヒドロキシ－エチル）－ラパマイシン、１６－Ｏ－ペント－２－イニル－３２－（Ｓ）－ジヒドロ－４０－Ｏ－（２－ヒドロキシエチル）－ラパマイシン、３２（Ｓ）－ジヒドロ－４０－Ｏ－（２－メトキシ）エチル－ラパマイシン、および３２（Ｓ）－ジヒドロ－４０－Ｏ－（２－ヒドロキシエチル）－ラパマイシンを含むがこれらに限定されない。
別の適切なラパマイシン類似体は、その内容が参照により組み入れられる、ＵＳ２００５／０１０１６２４において説明されている、ウミロリムスである。
他にエベロリムス［Ａｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標）］としても公知のＲＡＤ００１は、各々の内容が参照により組み入れられる、ＵＳ５，６６５，７７２およびＷＯ９４／０９０１０において説明されている通り、化学名（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｅ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）－１，１８－ジヒドロキシ－１２－｛（１Ｒ）－２－［（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）－４－（２－ヒドロキシエトキシ）－３－メトキシシクロヘキシル］－１－メチルエチル｝－１９，３０－ジメトキシ－１５，１７，２１，２３，２９，３５－ヘキサメチル－１１，３６－ジオキサ－４－アザ－トリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ－１６，２４，２６，２８－テトラエン－２，３，１０，１４，２０－ペンタオンを有する。
ｍＴＯＲのアロステリック阻害剤のさらなる例は、シロリムス（ラパマイシン、ＡＹ－２２９８９）、４０－［３－ヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）－２－メチル－プロパノエート］－ラパマイシン（テムシロリムスまたはＣＣＩ－７７９ともまた呼ばれる）、およびリダホロリムス（ＡＰ－２３５７３／ＭＫ－８６６９）を含む。ｍＴｏｒのアロステリック阻害剤の他の例は、ゾタロリムス（ＡＢＴ５７８）およびウミロリムスを含む。
代替的にまたは加えて、ｍＴＯＲキナーゼドメインを直接標的とし、ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２の両方を標的とする、ｍＴＯＲのＡＴＰ競合型触媒阻害剤も見出されている。これらはまた、４ＥＢＰ１－Ｔ３７／４６のリン酸化およびキャップ依存性翻訳など、ラパマイシン耐性ｍＴＯＲＣ１のアウトプットをモジュレートするため、ラパマイシンなど、ｍＴＯＲのアロステリック阻害剤より有効な、ｍＴＯＲＣ１の阻害剤でもある。
触媒阻害剤は、ＢＥＺ２３５、もしくは２－メチル－２－［４－（３－メチル－２－オキソ－８－キノリン－３－イル－２，３－ジヒドロ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）－フェニル］－プロピオニトリル、またはモノトシル酸塩形態（ＢＥＺ２３５の合成は、ＷＯ２００６／１２２８０６において説明されている）；化学名｛５－［２，４－ビス－（（Ｓ）－３－メチル－モルホリン－４－イル）－ピリド［２，３ｄ］ピリミジン－７－イル］－２－メトキシ－フェニル｝－メタノールを有する、ＣＣＧ１６８［他にＡＺＤ－８０５５としても公知である；Chresta, C.M., et al., Cancer Res, 2010, 70(1), 288-298］；３－［２，４－ビス［（３Ｓ）－３－メチルモルホリン－４－イル］ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７－イル］－Ｎ－メチルベンズアミド（ＷＯ０９１０４０１９）；３－（２－アミノベンゾ［ｄ］オキサゾール－５－イル）－１－イソプロピル－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン－４－アミン（ＷＯ１００５１０４３およびＷＯ２０１３０２３１８４）；Ｎ－（３－（Ｎ－（３－（（３，５－ジメトキシフェニル）アミノ）キノキサリン－２－イル）スルファモイル）フェニル）－３－メトキシ－４－メチルベンズアミド（ＷＯ０７０４４７２９およびＷＯ１２００６５５２）；化学名１－［４－［４－（ジメチルアミノ）ピペリジン－１－カルボニル］フェニル］－３－［４－（４，６－ジモルホリノ－１，３，５－トリアジン－２－イル）フェニル］尿素を有する、ＰＫＩ－５８７（Venkatesan, A.M., J. Med.Chem., 2010, 53, 2636-2645）；化学名２，４－ジフルオロ－Ｎ－｛２－メトキシ－５－［４－（４－ピリダジニル）－６－キノリニル］－３－ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドを有する、ＧＳＫ－２１２６４５８（ACS Med. Chem. Lett., 2010, 1, 39-43）；５－（９－イソプロピル－８－メチル－２－モルホリノ－９Ｈ－プリン－６－イル）ピリミジン－２－アミン（ＷＯ１０１１４４８４）；および（Ｅ）－Ｎ－（８－（６－アミノ－５－（トリフルオロメチル）ピリジン－３－イル）－１－（６－（２－シアノプロパン－２－イル）ピリジン－３－イル）－３－メチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２（３Ｈ）－イリデン）シアナミド（ＷＯ１２００７９２６）を含む。
さらなるｍＴＯＲの触媒阻害剤の例は、８－（６－メトキシ－ピリジン－３－イル）－３－メチル－１－（４－ピペラジン－１－イル－３－トリフルオロメチル－フェニル）－１，３－ジヒドロ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オン（ＷＯ２００６／１２２８０６）、およびＫｕ－００６３７９４［Garcia-Martinez JM, et al., Biochem J., 2009, 421(1), 29-42；Ｋｕ－００６３７９４とは、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）の特異的阻害剤である］を含む。ＷＹＥ－３５４とは、別のｍＴＯＲの触媒阻害剤の例である（Yu K, et al. (2009). Biochemical, Cellular, and In vivo Activity of Novel ATP-Competitive and Selective Inhibitors of the Mammalian Target of Rapamycin. Cancer Res. 69(15): 6232-6240）。
本発明に従い有用なｍＴＯＲ阻害剤はまた、前出のいずれかのプロドラッグ、誘導体、薬学的に許容される塩、または類似体も含む。ＲＡＤ００１などのｍＴＯＲ阻害剤は、本明細書で説明される特定の投与に基づく、当業界で十分に確立された方法に基づくデリバリーのために製剤化することができる。特に、米国特許第６，００４，９７３号（参照により本明細書に組み入れられる）は、本明細書で説明されるｍＴＯＲ阻害剤とともに使用可能な製剤の例を提示している。
ＣＡＲの有効性または試料の適性を査定するための方法およびバイオマーカー
本開示は、ＣＡＲ療法で処置されたがん患者が、再発する可能性があるかどうか、または再発したかどうかを示す遺伝子シグネチャーを、とりわけ提供する。理論に縛られるつもりはないが、この遺伝子シグネチャーについての実験の基礎を実施例１２において述べる。
ある実施形態において、本明細書で（例えば、実施例１２の表２９で）説明される新規転写遺伝子シグネチャーを使用して、製造された生成物の改善を可能にすることによって、患者の再発の尤度を低下させる。ある実施形態において、本明細書で説明される遺伝子シグネチャーを使用して、製造された生成物の治療的適用を改変することによって、患者の再発の尤度を低下させる。
ある実施形態において、本明細書で（例えば、実施例１２の表２９で）説明される遺伝子シグネチャーは、ＣＡＲ発現細胞での処置、例えばＣＡＲＴ処置（例えば、ＣＡＲＴ１９処置、例えばＣＴＬ０１９治療）での処置の前の対象において同定され、それによって、ＣＡＲ処置に対する再発が予測される。ある実施形態において、本明細書で説明される遺伝子シグネチャーは、アフェレーシス試料または骨髄試料において同定される。ある実施形態において、本明細書で説明される遺伝子シグネチャーは、製造されたＣＡＲ発現細胞生成物、例えばＣＡＲＴ生成物（例えば、ＣＡＲＴ１９生成物、例えばＣＴＬ０１９）において、注入前に同定される。
本開示はまた、（理論に縛られるつもりはないが）アフェレーシスの前またはＣＡＲＴ生成物の製造中に患者のＴＲＥＧシグネチャーを減少させることが患者の再発リスクを低減させるということの証拠を例えば実施例１２において提供する。
ある実施形態において、ＣＡＲ生成物の製造、例えば、ＣＡＲＴ生成物の製造のために細胞を収集する前に、ＴＲＥＧ細胞を低減させる１つまたは複数の療法で患者を前処置し、それによって患者がＣＡＲ発現細胞処置（例えば、ＣＴＬ０１９処置）に戻るリスクを低減させる。ＴＲＥＧ細胞を減少させる方法としては、これらに限定されないが、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇、およびそれらの組合せが挙げられる。
ある実施形態において、ＣＡＲ発現細胞生成物の製造のために細胞を収集する前に、シクロホスファミドまたは抗ＧＩＴＲ抗体で患者を前処置し、それによって患者がＣＡＲ発現細胞処置（例えば、ＣＴＬ０１９処置）に戻るリスクを低減させる。
ある実施形態において、ＣＡＲ発現細胞製造プロセスを、ＣＡＲ発現細胞生成物（例えば、ＣＴＬ０１９生成物）の製造の前に、ＴＲＥＧ細胞を枯渇させるように改変する。ある実施形態において、ＣＤ２５枯渇を使用して、ＣＡＲ発現細胞生成物（例えば、ＣＴＬ０１９生成物）の製造の前に、ＴＲＥＧ細胞を枯渇させる。
ある実施形態において、ＴＲＥＧ細胞を低減させる処置での患者またはＣＡＲ発現細胞生成物の処置の後、患者を併用療法で処置する。併用療法は、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞などのＣＤ１９阻害剤、および１つまたは複数のＢ細胞阻害剤、例えば本明細書で説明されるようなＢ細胞阻害剤を含んでいてもよい。
ある実施形態において、患者を、患者試料、例えば、がん細胞を含む試料および／または腫瘍微小環境を表す試料中のＴＲＥＧ細胞のレベルについてアッセイする。ある実施形態において、この情報を使用して、患者のための処置コースを決定する。例えば、ある実施形態において、患者が、対照と比較して上昇したＴＲＥＧ細胞レベルを有するものとして同定された場合、治療は、ＣＡＲ発現細胞以外の処置を投与することを含む。例えば、治療は、抗体分子の投与、小分子治療薬の投与、外科手術もしくは放射線療法、またはこれらの任意の組合せを含み得る。この治療は、１つまたは複数のＢ細胞抗原を標的とすることもある。
ある実施形態において、再発例とは、非再発例と比較して、次の遺伝子：ＭＩＲ１９９Ａ１、ＭＩＲ１２０３、ｕｃ０２１ｏｖｐ、ＩＴＭ２ＣおよびＨＬＡ－ＤＱＢ１、の１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、または全て）の発現レベルの上昇（例えば、ＲＮＡレベルの上昇）、ならびに／または非再発例と比較して、次の遺伝子：ＰＰＩＡＬ４Ｄ、ＴＴＴＹ１０、ＴＸＬＮＧ２Ｐ、ＭＩＲ４６５０－１、ＫＤＭ５Ｄ、ＵＳＰ９Ｙ、ＰＲＫＹ、ＲＰＳ４Ｙ２、ＲＰＳ４Ｙ１、ＮＣＲＮＡ００１８５、ＳＵＬＴ１Ｅ１およびＥＩＦ１ＡＹ、の１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、または全て）の発現レベルの低下（例えば、ＲＮＡレベルの低下）を有するか、またはこれを有するものとして同定される患者である。
別の態様において、本発明は、対象（例えば、がんを有する対象）におけるＣＡＲ発現細胞療法の有効性、またはＣＡＲ療法、例えば、免疫を増強する低い用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与を包含する治療のための試料（例えば、アフェレーシス試料）の適性を、査定またはモニタリングする方法を特徴とする。方法は、ＣＡＲ療法の有効性または試料の適性の値を得ることを含み、この場合、前記値は、ＣＡＲ発現細胞療法の有効性または適性を示す。
実施形態において、ＣＡＲ療法の有効性または試料の適性の値は、以下の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはこれ超（全て）の尺度を含む：
（ｉ）試料（例えば、アフェレーシス試料または製造されたＣＡＲ発現細胞生成物の試料）中の休眠中のＴＥＦＦ細胞、休眠中のＴＲＥＧ細胞、幼若Ｔ細胞（例えば、幼若ＣＤ４細胞もしくは幼若ＣＤ８細胞、またはガンマ／デルタＴ細胞）、もしくは初期メモリーＴ細胞、またはこれらの組合せの１つ、２つ、３つ、またはこれ超（例えば、全て）のレベルまたは活性；
（ｉｉ）試料（例えば、アフェレーシス試料または製造されたＣＡＲ発現細胞生成物の試料）中の、活性化したＴＥＦＦ細胞、活性化したＴＲＥＧ細胞、経時Ｔ細胞（例えば、経時ＣＤ４細胞または経時ＣＤ８細胞）、もしくは後期メモリーＴ細胞、またはこれらの組合せの１つ、２つ、３つ、またはこれ超（例えば、全て）のレベルまたは活性；
（ｉｉｉ）試料（例えば、アフェレーシス試料または製造されたＣＡＲ発現細胞生成物の試料）中の、免疫細胞消耗マーカー、例えば、１つ、２つ、またはこれを超える免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＭ－３および／またはＬＡＧ－３）のレベルまたは活性。一実施形態において、免疫細胞は、消耗表現型を有し、例えば、少なくとも２つの消耗マーカーを共発現し、例えば、ＰＤ－１およびＴＩＭ－３を共発現する。他の実施形態において、免疫細胞は、消耗表現型を有し、例えば、少なくとも２つの消耗マーカーを共発現し、例えば、ＰＤ－１およびＬＡＧ－３を共発現する；
（ｉｖ）試料（例えば、アフェレーシス試料または製造されたＣＡＲ発現細胞生成物の試料）中の、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団内またはＣＤ８＋Ｔ細胞集団内の、ＣＤ２７および／またはＣＤ４５ＲＯ－（例えば、ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＯ－）免疫エフェクター細胞のレベルまたは活性；
（ｖ）ＣＣＬ２０、ＩＬ－１７ａおよび／またはＩＬ－６、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＣＤ５７、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ６２Ｌ、ＫＬＲＧ１から選ばれるバイオマーカーの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、１２、またはこれ超のレベルまたは活性；
（ｖｉ）ＣＡＲ発現細胞生成物の試料中のサイトカインのレベルまたは活性（例えば、サイトカインレパートリーの質）；あるいは
（ｖｉｉ）製造されたＣＡＲ発現細胞生成物の試料中の、ＣＡＲ発現細胞の形質導入効率。
本明細書で開示された方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、ＣＡＲ発現細胞療法は、複数のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の集団）、例えば、複数のＴ細胞またはＮＫ細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の集団）、またはこれらの組合せを含む。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞療法は、免疫を増強する低い用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与を包含する。
本明細書で開示された方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、（ｉ）～（ｖｉｉ）の１つまたは複数の尺度は、対象から入手されたアフェレーシス試料から得る。アフェレーシス試料は、注入または再注入の前に査定することができる。
本明細書で開示された方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、（ｉ）～（ｖｉｉ）の１つまたは複数の尺度は、製造されたＣＡＲ発現細胞生成物の試料から得る。製造されたＣＡＲ発現細胞生成物は、注入または再注入の前に査定することができる。
本明細書で開示された方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、ＣＡＲ発現細胞療法を施される前に、これを施されるときに、またはこれを施された後で、対象を査定する。
本明細書で開示された方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、（ｉ）～（ｖｉｉ）の１つまたは複数の尺度は、遺伝子発現、フローサイトメトリー、またはタンパク質発現の１つまたは複数についてのプロファイルを査定する。
本明細書で開示された方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、方法は、（ｉ）～（ｖｉｉ）の１つまたは複数の尺度に基づき、対象を、応答例、非応答例、再発例、または非再発例として同定することをさらに含む。
本明細書で開示された方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、応答例（例えば、完全応答例）は、ＧＺＭＫ、ＰＰＦ１ＢＰ２、またはナイーブＴ細胞の１つ、２つ、またはこれ超（全て）の、非応答例と比較して、高度なレベルまたは大きな活性を有するか、またはこれを有するものとして同定される。
本明細書で開示された方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、非応答例は、ＩＬ２２、ＩＬ－２ＲＡ、ＩＬ－２１、ＩＲＦ８、ＩＬ８、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２２、エフェクターＴ細胞、または調節性Ｔ細胞の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、またはこれ超（例えば、全て）の、応答例と比較して、高度なレベルまたは大きな活性を有するか、またはこれを有するものとして同定される。
ある実施形態において、再発例とは、以下の遺伝子：ＭＩＲ１９９Ａ１、ＭＩＲ１２０３、ｕｃ０２１ｏｖｐ、ＩＴＭ２Ｃ、およびＨＬＡ－ＤＱＢ１の１つまたは複数（例えば、以下の遺伝子の２つ、３つ、４つ、または全て）の発現レベルの、非再発例と比較した上昇、ならびに／または以下の遺伝子：ＰＰＩＡＬ４Ｄ、ＴＴＴＹ１０、ＴＸＬＮＧ２Ｐ、ＭＩＲ４６５０－１、ＫＤＭ５Ｄ、ＵＳＰ９Ｙ、ＰＲＫＹ、ＲＰＳ４Ｙ２、ＲＰＳ４Ｙ１、ＮＣＲＮＡ００１８５、ＳＵＬＴ１Ｅ１、およびＥＩＦ１ＡＹの１つまたは複数（例えば、以下の遺伝子の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、または全て）の発現のレベルの、非再発例と比較した低下を有するか、またはこれを有するものとして同定される患者である。
本明細書で開示された方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、完全応答例は、参照値、例えば、非応答例におけるＣＤ８＋ Ｔ細胞のパーセンテージと比較して大きな、例えば、統計学的に有意な大きな、ＣＤ８＋ Ｔ細胞のパーセンテージを有するか、またはこれを有するものとして同定される。
本明細書で開示された方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、完全応答例は、参照値、例えば、非応答例におけるＣＤ２７＋ ＣＤ４５ＲＯ－免疫エフェクター細胞の数と比較して大きな、例えば、ＣＤ８＋ 集団内の、ＣＤ２７＋ ＣＤ４５ＲＯ－免疫エフェクター細胞のパーセンテージを有するか、またはこれを有するものとして同定される。
本明細書で開示された方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、完全応答例または部分応答例は、参照値、例えば、非応答例におけるＣＤ４＋ Ｔ細胞のパーセンテージと比較して大きな、例えば、統計学的に有意な大きな、ＣＤ４＋ Ｔ細胞のパーセンテージを有するか、またはこれを有するものとして同定される。
本明細書で開示された方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、完全応答例は、休眠中のＴＥＦＦ細胞、休眠中のＴＲＥＧ細胞、幼若Ｔ細胞（例えば、幼若ＣＤ４細胞もしくは幼若ＣＤ８細胞、またはガンマ／デルタＴ細胞）、もしくは初期メモリーＴ細胞、またはこれらの組合せの１つ、２つ、３つ、またはこれ超（例えば、全て）の、参照値、例えば、非応答例における休眠中のＴＥＦＦ細胞、休眠中のＴＲＥＧ細胞、幼若Ｔ細胞（例えば、幼若ＣＤ４細胞または幼若ＣＤ８細胞）、または初期メモリーＴ細胞の数と比較して大きなパーセンテージを有するか、またはこれを有するものとして同定される。
本明細書で開示された方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、非応答例は、活性化したＴＥＦＦ細胞、活性化したＴＲＥＧ細胞、経時Ｔ細胞（例えば、経時ＣＤ４細胞または経時ＣＤ８細胞）、もしくは後期メモリーＴ細胞、またはこれらの組合せの１つ、２つ、３つ、またはこれ超（例えば、全て）の、参照値、例えば、応答例における活性化したＴＥＦＦ細胞、活性化したＴＲＥＧ細胞、経時Ｔ細胞（例えば、経時ＣＤ４細胞または経時ＣＤ８細胞）、または後期メモリーＴ細胞の数と比較して大きなパーセンテージを有するか、またはこれを有するものとして同定される。
本明細書で開示された方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、非応答例は、免疫細胞消耗マーカー、例えば、１つ、２つ、またはこれを超える免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＭ－３、および／またはＬＡＧ－３）大きなパーセンテージを有するか、またはこれを有するものとして同定される。一実施形態において、非応答例は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＬＡＧ－３を発現する免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞）（例えば、ＣＡＲ発現ＣＤ４＋ 細胞および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞）の、応答例に由来するＰＤ－１またはＬＡＧ－３を発現する免疫エフェクター細胞のパーセンテージと比較して大きなパーセンテージを有するか、またはこれを有するものとして同定される。
一実施形態において、非応答例は、消耗表現型を有する免疫細胞、例えば、少なくとも２つの消耗マーカーを共発現する、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１および／またはＴＩＭ－３を共発現する免疫細胞大きなパーセンテージを有するか、またはこれを有するものとして同定される。他の実施形態において、非応答例は、消耗表現型を有する免疫細胞、例えば、少なくとも２つの消耗マーカーを共発現する、例えば、ＰＤ－１およびＬＡＧ－３を共発現する免疫細胞が大きなパーセンテージを有するか、またはこれを有するものとして同定される。
本明細書で開示された方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、非応答例は、ＣＡＲ発現細胞集団内のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１＋／ＬＡＧ－３＋細胞の、ＣＡＲ発現細胞療法に対する応答例（例えば、完全応答例）と比較して大きなパーセンテージを有するか、またはこれを有するものとして同定される。
本明細書で開示された方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、部分応答例は、ＣＡＲ発現細胞集団内のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１＋／ＬＡＧ－３＋細胞の、応答例より高度なパーセンテージを有するか、またはこれを有するものとして同定される。
本明細書で開示された方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、非応答例は、ＣＡＲ発現細胞集団内のＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１＋ ＣＡＲ＋の消耗表現型およびＬＡＧ３の共発現を有するか、またはこれを有するものとして同定される。
本明細書で開示された方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、非応答例は、ＣＡＲ発現細胞集団内のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１＋／ＴＩＭ－３＋細胞の、応答例（例えば、完全応答例）と比較して大きなパーセンテージを有するか、またはこれを有するものとして同定される。
本明細書で開示された方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、部分応答例は、ＣＡＲ発現細胞集団内のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１＋／ＴＩＭ－３＋細胞の、応答例より高度なパーセンテージを有するか、またはこれを有するものとして同定される。
本明細書で開示された方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、アフェレーシス試料中のＣＤ８＋ ＣＤ２７＋ ＣＤ４５ＲＯ－ Ｔ細胞の存在は、ＣＡＲ発現細胞療法に対する対象の応答の、正の予測因子である。
本明細書で開示された方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、アフェレーシス試料中のＰＤ１＋ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞およびＬＡＧ３＋ Ｔ細胞またはＴＩＭ３＋ Ｔ細胞の高度なパーセンテージは、ＣＡＲ発現細胞療法に対する対象の応答の、予後不良の予測因子である。
本明細書で開示された方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、応答例（例えば、完全応答例または部分応答例）以下のプロファイル：
（ｉ）ＣＤ２７＋免疫エフェクター細胞の数が、参照値、例えば、非応答例におけるＣＤ２７＋免疫エフェクター細胞の数と比較して大きいこと；
（ｉｉ）ＣＤ８＋ Ｔ細胞の数が、参照値、例えば、非応答例におけるＣＤ８＋ Ｔ細胞の数と比較して大きいこと；
（ｉｉｉ）１つまたは複数のチェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、もしくはＫＬＲＧ－１、またはこれらの組合せから選択されるチェックポイント阻害剤を発現する免疫細胞の数が、参照値、例えば、非応答例における１つまたは複数のチェックポイント阻害剤を発現する細胞の数と比較して小さいこと；あるいは
（ｉｖ）休眠中のＴＥＦＦ細胞、休眠中のＴＲＥＧ細胞、ナイーブＣＤ４細胞、刺激されていないメモリー細胞もしくは初期メモリーＴ細胞、またはこれらの組合せの１つ、２つ、３つ、４つ、またはこれ超（全て）の数が、参照値、例えば、非応答例における休眠中のＴＥＦＦ細胞、休眠中のＴＲＥＧ細胞、ナイーブＣＤ４細胞、刺激されていないメモリー細胞または初期メモリーＴ細胞の数と比較して大きいこと
の１つ、２つ、３つ、またはこれ超（または全て）を有する。
本明細書で開示された方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、（ｖｉ）のサイトカインのレベルまたは活性は、サイトカインである、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ３ａ、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ６、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１３、ＩＬ２、ＩＬ２１、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ９、もしくはＴＮＦα、またはこれらの組合せの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、またはこれ超（全て）から選択される。サイトカインは、ＩＬ－１７ａ、ＣＣＬ２０、ＩＬ２、ＩＬ６、またはＴＮＦａの１つ、２つ、３つ、４つ、またはこれ超（全て）から選択することができる。一実施形態において、サイトカインのレベルの上昇または活性の増加は、ＩＬ－１７ａおよびＣＣＬ２０の一方または両方から選択され、応答性の増加または再発の減少を指し示す。
本明細書で開示された方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、（ｖｉｉ）における形質導入効率が１５％またはこれを超えることは、応答性の増加または再発の減少を指し示す。
本明細書で開示された方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、（ｖｉｉ）における形質導入効率が１５％未満であることは、応答性の減少または再発の増加を指し示す。
実施形態において、本明細書の方法により同定される応答例、非応答例、再発例、または非再発例は、臨床基準に従い、さらに査定することができる。例えば、完全応答例は、疾患、例えば、がんを有するか、またはこれを有する対象であって、処置に対する完全応答、例えば、完全寛解を呈示する対象として同定される。完全応答は、例えば、本明細書で説明される通り、ＮＣＣＮ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ（登録商標）（参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）を使用して、同定することができる。部分応答例は、疾患、例えば、がんを有するか、またはこれを有する対象であって、処置に対する部分応答、例えば、部分寛解を呈示する対象として同定される。部分応答は、例えば、本明細書で説明される通り、ＮＣＣＮ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ（登録商標）を使用して同定することができる。非応答例は、疾患、例えば、がんを有するか、またはこれを有する対象であって、処置に対する応答を呈示しない対象として同定され、例えば、患者は、安定（stable disease）または進行（progressive disease）を有する。非応答例は、例えば、本明細書で説明される通り、ＮＣＣＮ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ（登録商標）を使用して同定することができる。
代替的に、または本明細書で開示された方法と組み合わせて、前記値に応じて、
例えば、応答例または非再発例に、ＣＡＲ発現細胞療法を投与すること；
ＣＡＲ発現細胞療法の用量を変更して投与すること；
ＣＡＲ発現細胞療法のスケジュールまたは時間経過を変更すること；
例えば、非応答例または部分応答例に、ＣＡＲ発現細胞療法と組み合わせたさらなる薬剤、例えば、本明細書で説明されるチェックポイント阻害剤、例えば、チェックポイント阻害剤を投与すること；
非応答例または部分応答例に、ＣＡＲ発現細胞療法による処置の前に、対象における幼若Ｔ細胞の数を増加させる治療を投与すること；
ＣＡＲ発現細胞療法の製造工程を改変すること、例えば、ＣＡＲをコードする核酸を導入する前に、幼若Ｔ細胞を濃縮すること、または、例えば、非応答例もしくは部分応答例として同定された対象について、形質導入効率を増加させること；
例えば、非応答例または部分応答例または再発例のための代替的治療を投与すること；あるいは
対象が、非応答例または再発例であるか、またはこれとして同定される場合、例えば、ＣＤ２５の枯渇、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、またはこれらの組合せの投与の１つまたは複数により、ＴＲＥＧ細胞集団および／またはＴＲＥＧ遺伝子シグネチャーを減少させること
の１つ、２つ、３つ、４つ、またはこれ超を実施する。
ある特定の実施形態において、対象を、抗ＧＩＴＲ抗体により前処置する。ある特定の実施形態において、注入または再注入の前に、対象を、抗ＧＩＴＲ抗体により処置する。
本明細書で説明される方法の一部の実施形態において、ＦＤＧ－ＰＥＴ／ＣＴ（ＰＥＴ／ＣＴ）でのイメージングを、ＣＡＲ療法で処置されたことのある対象に関して実施する。この測定は、前記療法に対する応答を予測することができる。例えば、実施形態において、代謝活性腫瘍体積（ＭＴＶ）および／または［１１Ｆ］－２－フルオロ－２－デオキシ－Ｄ－グルコース（ＦＤＧ）取り込みを測定する。実施形態において、ＭＴＶの減少は、応答、例えば、ＣＲ（完全応答）またはＰＲ（部分応答）を示し、例えば、処置後の約０のＭＴＶ値はＣＲを示すのに対して、ＭＴＶの増加はＰＤ（進行）を示す。実施形態において、ＦＤＧ取り込みの減少は、応答、例えば、ＣＲまたはＰＲを示すのに対して、ＦＤＧ取り込みの増加はＰＤを示す。実施形態において、イメージングは、ＣＡＲ療法の投与後に、例えば、ＣＡＲ療法の投与の約１週間、２週間、３週間、４週間、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月または６カ月後に実施する。実施形態において、ＣＲＳ（サイトカイン放出症候群）の症状を有さない対象、例えば、ＣＲＳを患っていたがイメージングの前に症状が解消された患者に関してイメージングを実施する。実施形態において、ＣＲＳの症状を有する対象に関してイメージングを実施する。実施形態において、イメージングをＣＡＲ療法の前に実施し、この療法前の画像を療法後の画像と比較する。実施形態において、対象は、がん、例えばリンパ腫、例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）または濾胞性リンパ腫（ＦＬ）を有する。一部の実施形態において、ＣＡＲ療法は、ＣＡＲ１９発現細胞、例えばＣＴＬ０１９を含む。一部の実施形態において、ＣＡＲ療法は、本明細書で説明されるＣＡＲ療法、例えば、ＣＡＲ２０発現細胞、ＣＡＲ２２発現細胞、またはＣＡＲ１９発現細胞を、適宜、Ｂ細胞療法と組み合わせて含む。
個別化医療（セラノスティクス）
ＣＤ１９の特徴、Ｅ．Ｇ．突然変異
理論に縛られるつもりはないが、一部のがん患者は、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞などのＣＤ１９阻害剤に対して初期応答を示し、そしてその後、再発する。一部の実施形態において、再発は、がん細胞のＣＤ１９におけるフレームシフトおよび／もしくは未成熟終止コドン、またはがん細胞を標的とするＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞の能力を低減させるＣＤ１９の発現の他の変化（発現レベルの変化を含む）に、（少なくとも一部は）起因する。このような突然変異は、ＣＤ１９療法の有効性を低下させ、患者の再発の一因となり得る。したがって、一部の実施形態において、ＣＤ１９療法に、第二の、異なる標的、例えば、Ｂ細胞において発現される標的、例えば、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１の１つまたは複数、に向けた治療を補充すると、またはＣＤ１９療法をそのような治療で置き換えると、有益であり得る。このタイプの様々な例示的な併用療法を本明細書において開示する。
本出願は、がんを有する対象を処置する方法であって、（１）対象が、参照特徴に対してＣＤ１９の特徴の差、例えば統計学的に有意な差を有するかどうかを判定すること、および（２）決定された特徴と参照特徴とに差があった場合、ＣＡＲ療法、例えばＣＡＲＴの治療有効用量を対象に投与することによって対象を処置すること、の１つまたは複数を含む方法を、とりわけ、開示する。患者は、例えば、ＣＤ１９阻害剤、例えばＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞での処置後に再発した患者であってもよい。患者は、ＣＤ１９ ＣＡＲ療法を受けたことがあるか、またはこれを受けていて、再発のリスクがある患者であってもよい。患者は、ＣＤ１９ ＣＡＲ療法に対する非応答例であってもよい。
特徴は、例えばＣＤ１９配列、例えば、タンパク質または核酸配列であってもよい。配列は、例えば実施例で説明するように、ハイスループット核酸シークエンシングによって、またはタンパク質の質量分析によって決定することができる。本明細書の実施例で説明するように、患者は、ＣＤ１９ ＣＡＲＴ療法後、ＣＤ１９における、例えばＣＤ１９のエキソン２における突然変異、例えば、ＣＤ１９におけるフレームシフトおよび未成熟終止コドンを引き起こす突然変異のため、再発することがある。実施形態において、挿入または欠失は、フレームシフトおよび未成熟終止コドンの一方または両方を引き起こさない。突然変異は、例えば、挿入、欠失、置換、転移、または前述のもののいずれかの組合せであってもよい。挿入、欠失または置換には、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２０または５０のヌクレオチドが関与し得る。挿入、欠失または置換には、例えば、最大で２、３、４、５、１０、１５、２０、２０、５０または１００のヌクレオチドが関与し得る。場合によっては、細胞の集団は、１つより多くの突然変異を含むことになる。このような場合、突然変異は、重複する、細胞の部分集団におけるものであることもあり、または重複しない、細胞の部分集団におけるものであることもある。
場合によっては、患者は、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞などのＣＤ１９阻害剤と会合するＣＤ１９の能力を低減させるＣＤ１９の特徴を有するものとして同定される。このような特徴は、例えば、フレームシフト突然変異、未成熟終止コドン、核酸配列の変化、または一次ｍＲＮＡ転写物の構造の変化であってもよい。特徴は、例えば、スプライシングより先に起こるＣＤ１９の正常な産生からの逸脱であってもよい。特徴は、例えば、エキソンスキッピング以外の特徴であってもよい。このような患者は、別の標的の阻害剤、例えばＢ細胞阻害剤、例えば、別のエピトープ、例えばＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１の１つまたは複数の中のエピトープに対して向けられたＣＡＲ発現細胞で処置することができる。
場合によっては、患者は、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞などのＣＤ１９阻害剤と会合するＣＤ１９の能力を低減させるが、ＣＤ１９上の異なる領域と結合するＣＤ１９阻害剤などの第二のＣＤ１９阻害剤と会合するＣＤ１９の能力を低減または消失させない、ＣＤ１９の特徴を有するものとして同定される。このような特徴は、例えば、フレームシフト突然変異または未成熟終止コドンの一方または両方を引き起こさない突然変異であってもよい。このような特徴は、例えば、核酸配列の変化、または一次ｍＲＮＡ転写産物の構造の変化であってもよく、スプライシングより先に起こるＣＤ１９の正常な産生からの逸脱であってもよく、またはエキソンスキッピング以外の特徴であってもよい。このような患者は、ＣＤ１９の阻害剤、例えば、ＣＤ１９の無傷の領域、例えばＣＤ１９の野生型部分、に対して向けられたＢ細胞阻害剤で、処置することができる。例えば、突然変異がエキソン２に存在した場合、第二のＣＤ１９阻害剤は、エキソン２以外のエキソンと結合することもあり、または突然変異がないエキソン２の部分と結合することもある。第二のＣＤ１９阻害剤は、例えば、本明細書で説明されるＣＤ１９阻害剤であってもよい。
ＴＥＦＦおよびＴＲＥＧシグネチャー
本明細書における方法は、例えば、患者における、または細胞、例えば免疫細胞、の集団における、ＴＲＥＧシグネチャーを決定する工程またはＴＥＦＦ細胞もしくはＴＲＥＧ細胞のレベルを決定する工程を包含し得る。本明細書における方法は、患者における、または細胞の集団における、ＴＲＥＧ細胞のレベルを低減させる工程またはＴＲＥＧシグネチャーを減少させる工程も包含し得る。一部の実施形態において、ＴＥＦＦは、次の遺伝子：ＡＩＭ２、ＡＬＡＳ１、Ｂ４ＧＡＬＴ５、ＢＡＴＦ、Ｃ３ｏｒｆ２６、Ｃ４ｏｒｆ４３、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＴ３、ＣＣＴ７、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＨＡＣ２、ＣＳＦ２、ＣＴＮＮＡ１、ＥＢＮＡ１ＢＰ２、ＥＤＡＲＡＤＤ、ＥＥＦ１Ｅ１、ＥＩＦ２Ｂ３、ＥＩＦ２Ｓ１、ＦＡＢＰ５、ＦＡＭ４０Ｂ、ＦＫＢＰ４、ＦＯＳＬ１、ＧＦＯＤ１、ＧＬＲＸ２、ＨＳＰＤ１、ＨＳＰＥ１、ＩＦＮＧ、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ２１、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ３、ＫＣＮＫ５、ＫＩＡＡ００２０、ＬＡＲＰ４、ＬＲＰ８、ＬＴＡ、ＭＡＮＦ、ＭＩＲ１１８２、ＭＩＲ１５５、ＭＩＲ１５５ＨＧ、ＭＴＣＨ２、ＭＹＯＦ、ＮＤＵＦＡＦ１、ＮＬＮ、ＮＭＥ１、ＮＭＥ１－ＮＭＥ２、ＯＴＵＤ７Ｂ、ＰＡＭ、ＰＤＩＡ６、ＰＥＡ１５、ＰＦＫＭ、ＰＧＡＭ１、ＰＧＡＭ４、ＰＰＩＬ１、ＰＲＤＸ４、ＰＲＳＳ２３、ＰＳＭＤ１、ＰＳＭＤ１１、ＰＳＭＤ１４、ＰＴＲＨ２、ＰＵＳ７、ＲＢＢＰ８、ＲＰＦ２、ＲＰＰ２５、ＳＦＸＮ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＬＣ３９Ａ１４、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＯＲＤ、ＳＰＲ、ＳＲＸＮ１、ＳＴＩＰ１、ＳＴＴ３Ａ、ＴＢＸ２１、ＴＭＣＣ２、ＴＭＥＭ１６５、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＸＮ、ＴＸＮＤＣ５、ＵＣＫ２、ＶＤＲ、ＷＤＲ１２、ＹＷＨＡＧ、およびＺＤＨＨＣ１６の１つまたは複数（例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または全て）の発現が上方調節された細胞である。一部の実施形態において、ＴＲＥＧ細胞は、次の遺伝子：ＡＩＭ２、ＡＬＡＳ１、ＢＡＴＦ、Ｃ５ｏｒｆ３２、ＣＣＬ１７、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＨＡＣ２、ＣＳＦ１、ＣＴＳＬ１、ＥＢＮＡ１ＢＰ２、ＥＤＡＲＡＤＤ、ＥＭＰ１、ＥＰＡＳ１、ＦＡＢＰ５、ＦＡＭ４０Ｂ、ＦＫＢＰ４、ＦＯＳＬ１、ＧＣＬＭ、ＧＫ、ＧＰＲ５６、ＨＭＯＸ１、ＨＳＰＤ１、ＨＳＰＥ１、ＩＫＢＩＰ、ＩＬ１０、ＩＬ１３、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１ＲＮ、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ９、ＫＣＮＫ５、ＬＴＡ、ＭＡＮＦ、ＭＩＲ１１８２、ＭＩＲ１５５、ＭＩＲ１５５ＨＧ、ＭＹＯＦ、ＮＤＵＦＡＦ１、ＮＬＮ、ＮＭＥ１、ＮＭＥ１－ＮＭＥ２、ＰＡＮＸ２、ＰＤＩＡ６、ＰＧＡＭ４、ＰＰＩＬ１、ＰＰＰＤＥ２、ＰＲＤＸ４、ＰＲＫＡＲ１Ｂ、ＰＳＭＤ１、ＰＳＭＤ１１、ＰＵＳ７、ＲＢＢＰ８、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＬＣ３９Ａ１４、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＲＸＮ１、ＳＴＩＰ１、ＳＴＴ３Ａ、ＴＢＸ２１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＸＮ、ＵＣＫ２、ＶＤＲ、ＶＴＲＮＡ１－３、ＷＤＲ１２、ＹＷＨＡＧ、ＺＤＨＨＣ１６、およびＺＮＦ２８２の１つまたは複数（例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０または全て）の発現が上方調節された細胞である。上方調節された発現は、例えば、刺激の１６時間後に測定することができる。上方調節された発現は、例えば、示した遺伝子についてのＲＮＡレベルを測定することによって、決定することができる。
医薬組成物および処置
本発明の医薬組成物は、一部の態様において、本明細書で説明されるようなＣＡＲ発現細胞、例えば複数のＣＡＲ発現細胞を、１つまたは複数の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含むことができる。このような組成物は、緩衝液、例えば中性緩衝食塩水、リン酸緩衝生理食塩水および同種のもの；炭水化物、例えばグルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えばグリシン；抗酸化剤；キレート剤、例えばＥＤＴＡまたはグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含んでいてもよい。一態様において、本発明の組成物は、静脈内投与用に製剤化される。
本発明の医薬組成物は、処置しようとする（または予防しようとする）疾患に適切な方式で投与されてもよい。投与の量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患のタイプおよび重症度のような要素によって決定されると予想されるが、適切な投薬は臨床試験によって決定してもよい。
一実施形態において、医薬組成物は、例えば、内毒素、マイコプラスマ、複製能を有するレンチウイルス（ＲＣＬ）、ｐ２４、ＶＳＶ－Ｇ核酸、ＨＩＶ ｇａｇ、残留した抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８でコーティングされたビーズ、マウス抗体、プールされたヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地の成分、ベクターのパッケージング細胞またはプラスミド成分、細菌および真菌からなる群より選択される汚染物質を実質的に含まず、例えば、それらのレベルが検出可能ではない。一実施形態において、細菌は、アルカリゲネス・フェカーリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、およびストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ａ群からなる群より選択される少なくとも１つである。
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、または「治療量」が提示される場合、投与しようとする本発明の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍のサイズ、感染または転移の程度、および状態の個体差を医師が検討することによって決定することができる。一部の実施形態において、細胞、例えば、本明細書で説明されるＴ細胞を含む医薬組成物を、範囲内の全ての整数値を含めて、細胞１０４～１０９個／ｋｇ体重の投薬量、いくつかの場合において細胞１０５～１０６個／ｋｇ体重の投薬量で投与してもよい。一部の実施形態において、細胞、例えば、本明細書で説明されるＴ細胞を、細胞３×１０４、１×１０６、３×１０６、または１×１０７個／ｋｇ体重で投与してもよい。細胞組成物はまた、これらの投薬量で複数回投与してもよい。細胞は、免疫療法で一般的によく知られている注入技術を使用することによって投与してもよい（例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med.319:1676, 1988を参照されたい）。
一部の実施形態において、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１ ＣＡＲ細胞）の用量は、細胞約１×１０５、２×１０５、５×１０５、１×１０６、１．１×１０６、２×１０６、３．６×１０６、５×１０６、１×１０７、１．８×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８または５×１０８個／ｋｇを含む。一部の実施形態において、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１ ＣＡＲ細胞）の用量は、細胞少なくとも約１×１０５、２×１０５、５×１０５、１×１０６、１．１×１０６、２×１０６、３．６×１０６、５×１０６、１×１０７、１．８×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８または５×１０８個／ｋｇを含む。一部の実施形態において、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１ ＣＡＲ細胞）の用量は、細胞約１×１０５、２×１０５、５×１０５、１×１０６、１．１×１０６、２×１０６、３．６×１０６、５×１０６、１×１０７、１．８×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８または５×１０８個／ｋｇ以下を含む。一部の実施形態において、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１ ＣＡＲ細胞）の用量は、細胞約１．１×１０６～１．８×１０７個／ｋｇ、または細胞約８×１０５～１．５×１０６個／ｋｇを含む。一部の実施形態において、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１ ＣＡＲ細胞）の用量は、細胞約１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９、または５×１０９個を含む。一部の実施形態において、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１ ＣＡＲ細胞）の用量は、細胞少なくとも約１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９、または５×１０９個を含む。一部の実施形態において、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３またはＲＯＲ１ ＣＡＲ細胞）の用量は、細胞約１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９、または５×１０９個以下を含む。
ある特定の態様において、活性化された細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞、を対象に投与し、その後続いて血液（またはアフェレーシスを行った）を再び採取し、それからの細胞を本発明に従って活性化し、これらの活性化され拡大した細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスを数週間ごとに複数回実行してもよい。ある特定の態様において、１０ｃｃ～４００ｃｃの採取された血液から、細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞を活性化することができる。ある特定の態様において、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、または１００ｃｃの採取された血液から、細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞を活性化する。
本組成物の投与は、例えばエアロゾル吸入法、注射、取り込み、輸注、埋め込みまたは移植などによるあらゆる便利な方式で実行することができる。本明細書で説明される組成物は、動脈経由、皮下、皮内、腫瘍内、リンパ節経由（intranodally）、髄内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射で、または腹腔内で、患者に投与されてもよい。一態様において、本発明の細胞組成物、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞組成物を、患者に皮内または皮下注射によって投与する。一態様において、本発明の細胞組成物、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞組成物を、ｉ．ｖ．注射によって投与する。細胞組成物、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞組成物を、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接注射してもよい。
特定の例示的な態様において、対象は、リューカフェレーシスを受けることがあり、この場合、白血球を、エクスビボで収集するか、濃縮するか、または枯渇させて、目的の細胞、例えばＴ細胞を選択および／または単離する。これらの細胞単離物、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞単離物を、当業界公知の方法により拡大し、本発明の１つまたは複数のＣＡＲコンストラクトを導入しすることができるように処置し、これにより、本発明のＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞を作り出すことができる。それを必要とする対象は、その後、高用量の化学療法による標準的な処置に続き、末梢血幹細胞移植を受けることができる。ある特定の態様において、移植に続き、または移植と並列して、対象に、拡大させた本発明のＣＡＲ発現細胞の注入を施す。さらなる態様において、拡大させた細胞を、外科手術の前に、または外科手術に続いて投与する。
患者に投与される上記の処置の投与量は、処置される状態の正確な性質および処置を受けるレシピエントに応じて変わることになる。ヒトへの投与に関する投与量の尺度化は、当業界で容認された実施に従って行うことができる。例えば、治療薬、例えば抗体、例えばＣＡＭＰＡＴＨに関する用量は、例えば、成人の患者の場合、１～約１００ｍｇの範囲であってもよく、例えば、１～３０日の期間にわたって毎日投与してもよい。好適な１日用量は、１～１０ｍｇ／日であるが、いくつかの場合において、それより多い最大４０ｍｇ／日の用量が使用されることもある（米国特許第６，１２０，７６６号で説明されている）。
一実施形態において、例えば、インビトロでの転写を使用して、ＣＡＲを、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に導入し、対象（例えば、ヒト）に、本発明のＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞の初回投与、および本発明のＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ Ｔ細胞の１回または複数回の後続投与を施し、この場合、前記１回または複数回の後続投与は、先行投与の１５日未満後、例えば、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２日後に行う。一実施形態において、本発明のＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ Ｔ細胞の１回を超える投与を対象（例えば、ヒト）に毎週行い、例えば、本発明のＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ Ｔ細胞の、２、３、または４回の投与を毎週行う。一実施形態において、対象（例えば、ヒト対象）にＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ Ｔ細胞の１回を超える毎週の投与（例えば、２、３、または４回の毎週の投与）（本明細書ではまた、サイクルとも称する）を施し、続いて１週間、ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ Ｔ細胞を投与せず、そしてその後、ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ Ｔ細胞の、１回または複数回のさらなる投与（例えば、ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ Ｔ細胞の、１回を超える毎週の投与）を、対象に行う。別の実施形態において、対象（例えば、ヒト対象）に、１つを超えるサイクルのＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ Ｔ細胞を施し、各サイクルの間の時間は、１０、９、８、７、６、５、４、または３日間未満である。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ Ｔ細胞を、隔日で、毎週３回の投与にわたり投与する。一実施形態において、本発明のＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ Ｔ細胞を、少なくとも２、３、４、５、６、７、８週間、またはこれを超えて投与する。
一部の実施形態において、対象は、成人対象（すなわち、１８歳以上）であり得る。ある特定の実施形態において、対象は、１～３０歳であり得る。一部の実施形態において、対象は、１６歳以上である。ある特定の実施形態において、対象は、１６～３０歳である。一部の実施形態において、対象は、小児対象（すなわち、１～１８歳）である。
一態様において、レンチウイルスなど、レンチウイルスウイルスベクターを使用して、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴを生成する。このようにして生成されたＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴは、安定的なＣＡＲ発現を示すであろう。
一態様において、ガンマレトロウイルスベクター、例えば、本明細書で説明されるガンマレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターを使用して、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴを生成する。これらのベクターを使用して生成されたＣＡＲＴは、安定的なＣＡＲ発現を示すことができる。
一態様において、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴは、ＣＡＲベクターを、形質導入後４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５日間にわたり、一過性に発現する。ＣＡＲの一過性発現は、ＲＮＡ ＣＡＲベクターのデリバリーにより実行することができる。一態様において、ＣＡＲ ＲＮＡで細胞、例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞に、エレクトロポレーションにより形質導入する。
一過性に発現するＣＡＲ Ｔ細胞を使用して（特に、ＣＡＲＴを保有するマウスｓｃＦｖを用いて）処置される患者において生じ得る潜在的な問題は、複数回の処置の後のアナフィラキシーである。
この理論に縛られることは望まないが、このようなアナフィラキシー応答は、患者が体液性抗ＣＡＲ応答、すなわち抗ＩｇＥアイソタイプを有する抗ＣＡＲ抗体を発生させることによって引き起こされる可能性があると考えられる。抗原への曝露が１０～１４日中断されると、患者の抗体産生細胞が、ＩｇＧアイソタイプ（アナフィラキシーを引き起こさない）からＩｇＥアイソタイプへのクラススイッチを経ると考えられる。
患者が、一過性ＣＡＲ療法の経過中に、抗ＣＡＲ抗体応答（ＲＮＡの形質導入により発生する抗ＣＡＲ抗体応答など）を発生させる危険性が高い場合も、ＣＡＲＴの注入の中断は、１０～１４日間を超えないものとする。
ＣＤ１９抗体およびＣＡＲ
マウス抗ＣＤ１９抗体のヒト化
マウスＣＤ１９抗体のヒト化は、ＣＡＲＴ１９処置、すなわち、ＣＡＲ１９コンストラクトが形質導入されたＴ細胞での処置を受けている患者において、マウス特異的な残基がヒト抗マウス抗原（ＨＡＭＡ）応答を誘導することが可能な臨床条件にとって望ましい。ヒト化ＣＤ１９ ＣＡＲ配列の産生、特徴付けおよび効能は、実施例１～５（１１５～１５９頁）、例えば表３、４および５（１２５～１４７頁）を含めて、その全体が参照により本明細書に組み入れられる国際出願ＷＯ２０１４／１５３２７０において説明されている。
ＣＡＲコンストラクト、例えばＣＤ１９ ＣＡＲコンストラクト
国際出願ＷＯ２０１４／１５３２７０に記載のＣＤ１９ ＣＡＲコンストラクトのうち、ある特定の配列を本明細書において再現する。当然のことながら、このセクションにおける配列は、他のＣＡＲ、例えば、ＣＤ１０ ＣＡＲ、ＣＤ２０ ＣＡＲ、ＣＤ２２ ＣＡＲ、ＣＤ３４ ＣＡＲ、ＣＤ１２３ ＣＡＲ、ＦＬＴ－３ ＣＡＲ、ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ＣＤ７９ｂ ＣＡＲ、ＣＤ１７９ｂ ＣＡＲ、またはＣＤ７９ａ ＣＡＲに関しても使用することができる。
ヒト化ｓｃＦｖフラグメント（配列番号１～１２）の配列を下の表２に提供する。配列番号１～１２と、下に示されている追加の配列、配列番号１３～１７、を使用して完全ＣＡＲコンストラクトを生成して、配列番号３１～４２を有する完全ＣＡＲコンストラクトを生成した。
・リーダー（アミノ酸配列）（配列番号１３）
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ
・リーダー（核酸配列）（配列番号５４）
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCC
・ＣＤ８ヒンジ（アミノ酸配列）（配列番号１４）
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ
・ＣＤ８ヒンジ（核酸配列）（配列番号５５）
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT
・ＣＤ８膜貫通（アミノ酸配列）（配列番号１５）
ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ
・膜貫通（核酸配列）（配列番号５６）
ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
・４－１ＢＢ細胞内ドメイン（アミノ酸配列）（配列番号１６）
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
・４－１ＢＢ細胞内ドメイン（核酸配列）（配列番号６０）
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
・ＣＤ３ゼータドメイン（アミノ酸配列）（配列番号１７）
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
・ＣＤ３ゼータ（核酸配列）（配列番号１０１）
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
・ＣＤ３ゼータドメイン（アミノ酸配列；ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００７３４．３）（配列番号４３）
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
・ＣＤ３ゼータ（核酸配列；ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００７３４．３）（配列番号４４）
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAG
AACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTT
TGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGA
AGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGG
AGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGC
ACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGC
CCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
ＣＤ２８ドメイン（アミノ酸配列）（配列番号１３１７）
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
ＣＤ２８ドメイン（核酸配列）（配列番号１３１８）
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
野生型ＩＣＯＳドメイン（アミノ酸配列、配列番号１３１９）
TKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL
野生型ＩＣＯＳドメイン（核酸配列、配列番号１３２０）
ACAAAAAAGAAGTATTCATCCAGTGTGCACGACCCTAACGGTGAATACATGTTCATGAGAGCAGTGAACACAGCCAAAAAATCCAGACTCACAGATGTGACCCTA
Ｙ→Ｆ突然変異ＩＣＯＳドメイン（アミノ酸配列、配列番号１３２１）
TKKKYSSSVHDPNGEFMFMRAVNTAKKSRLTDVTL
ＩｇＧ４ヒンジ（アミノ酸配列）（配列番号１０２）
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM
ＩｇＧ４ヒンジ（核酸配列）（配列番号１０３）
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG
これらのクローンは全て、４－１ＢＢ由来の共刺激ドメインのシグナルドメインにおけるＱ／Ｋ残基変化を含有した。
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一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、表２に列挙したいずれかの重鎖結合ドメインアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を含む。実施形態において、抗原結合ドメインは、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３をさらに含む。実施形態において、抗原結合ドメインは、表２に列挙したいずれかの軽鎖結合ドメインアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３を含む。
一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、表２に列挙したいずれかの軽鎖結合ドメインアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３の１つ、２つまたは全て、ならびに表２に列挙したいずれかの重鎖結合ドメインアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３の１つ、２つまたは全てを含む。
一部の実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム、またはこれらの組合せに従って定義される。
ｓｃＦｖドメインのヒト化ＣＤＲ配列の配列を、重鎖可変ドメインについて表４に、軽鎖可変ドメインについて表５に示す。「ＩＤ」は、各ＣＤＲのそれぞれの配列番号を意味する。
Figure 0007227331000048
Figure 0007227331000049
次いで、ＣＡＲのｓｃＦｖフラグメントを、レンチウイルスベクターにクローニングして、単一のコーディングフレーム中に、発現のためのＥＦ１アルファプロモーター（配列番号１００）を使用して、全長ＣＡＲコンストラクトを作り出した。
ＥＦ１アルファプロモーター
CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA（配列番号１００）
ＣＡＲ２２コンストラクト：設計および機能
完全ヒト抗ＣＤ２２単鎖可変フラグメントを単離した。抗ＣＤ２２ ＳｃＦｖを、ＣＤ３ゼータ鎖および４－１ＢＢ共刺激分子を有するレンチウイルスＣＡＲ発現ベクターにクローニングした。ＣＡＲ含有プラスミドを、ＳＴＢＬ３細胞における細菌形質転換よって増幅させ、続いて、エンドトキシンフリーＱｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｋｉキットを使用するＭａｘｉｐｒｅｐによって増幅させた。レンチウイルスの上清は、標準的な技術を使用して２９３Ｔ細胞において産生した。
ヒトＣＡＲの配列を下の表６Ａおよび６Ｂに提供する。
これらのクローンは全て、ＣＤ３ゼータ鎖由来の共刺激ドメインのシグナルドメインにおけるＱ／Ｋ残基変化を含有した。
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いくつかの追加のＣＤ２２ ｓｃＦｖ配列を生成した。それらを下の表６Ｂに記載する。クローンＣＤ２２－６４およびＣＤ２２－６５は、上記クローンＣＤ２２－１２の親和性成熟に基づいた。一部の実施形態において、親和性成熟した結合ドメインのＣＤ２２に対する親和性は、ＣＤ２２－１２のＣＤ２２に対する親和性より強い。一部の実施形態において、親和性成熟した結合ドメインのＣＤ２２に対する結合速度（on-rate）は、ＣＤ２２－１２のＣＤ２２に対する結合速度より速い。
Figure 0007227331000149
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一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、表６Ａまたは６Ｂに列挙したいずれかの重鎖結合ドメインアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を含む。実施形態において、抗原結合ドメインは、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３をさらに含む。実施形態において、抗原結合ドメインは、表６Ａまたは６Ｂに列挙したいずれかの軽鎖結合ドメインアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３を含む。
一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、表６Ａまたは６Ｂに列挙したいずれかの軽鎖結合ドメインアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３の１つ、２つまたは全て、ならびに表６Ａまたは６Ｂに列挙したいずれかの重鎖結合ドメインアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３の１つ、２つまたは全てを含む。
一部の実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム、またはこれらの組合せに従って定義される。
ＣＤ２２－６４およびＣＤ２２－６５は、クローンＣＤ２２－１２の親和性成熟に基づいた。３つ全てのコンストラクトを試験し、活性を有することを見出した（本明細書中の実施例２５を参照されたい）。これらの観察に基づいて、これらの実施例を包含するように構造属を設計した。したがって、一部の実施形態において、本明細書で説明されるＣＤ２２結合ドメインは、配列：ＸＲＬＱＤＧＮＳＷＳＤＡＦＤＶ（配列番号１４１）を有するＨＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、Ｘは、いずれかのアミノ酸、いずれかの標準的アミノ酸、非極性アミノ酸（例えば、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｍ、ＦもしくはＷ）、芳香族環を有さない非極性アミノ酸（例えば、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＰもしくはＭ）、または酸性アミノ酸（例えば、ＤもしくはＥ）である。
さらに、ＣＡＲ２２－５３およびＣＡＲ２２－５７からＣＡＲ２２－６５は、それらのＣＤＲに関して構造的類似性を有する。これらの実施例を包含するように構造属を設計した。したがって、一部の実施形態において、本明細書で説明されるＣＤ２２結合ドメインは、配列：ＴＧＸ１Ｘ２Ｘ３ＤＸ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＶＳ（配列番号＿）を有するＬＣＤＲ１を含む。一部の実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７もしくはＸ８、またはこれらのいずれかの組合せは、各々独立して、いずれかのアミノ酸、例えば、いずれかの標準的アミノ酸である。一部の実施形態において、Ｘ４もしくはＸ５、または両方は、各々独立して、非極性アミノ酸（例えば、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｍ、ＦもしくはＷ）、または芳香族環を有さない非極性アミノ酸（例えば、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＰもしくはＭ）である。一部の実施形態において、Ｘ６は、芳香族アミノ酸（例えば、Ｆ、ＹまたはＷ）である。一部の実施形態において、Ｘ１は、ＳまたはＴであり、Ｘ２は、ＲまたはＳであり、Ｘ３は、ＮまたはＳであり、Ｘ４は、ＶまたはＩであり、Ｘ５は、ＡまたはＧであり、Ｘ６は、ＹまたはＦであり、Ｘ７は、ＥまたはＮであり、あるいはＸ８は、ＳもしくはＹ、またはこれらのいずれかの組合せである。一部の実施形態において、Ｘ１は、ＳまたはＴであり、Ｘ２は、ＲまたはＳであり、Ｘ３は、ＮまたはＳであり、Ｘ４は、ＶまたはＩであり、Ｘ５は、ＡまたはＧであり、Ｘ６は、ＹまたはＦであり、Ｘ７は、ＥまたはＮであり、およびＸ８は、ＳまたはＹである。
同様に、一部の実施形態において、本明細書で説明されるＣＤ２２結合ドメインは、配列：Ｘ１ＶＸ２ＮＲＰＳ（配列番号＿）を有するＬＣＤＲ２を含む。一部の実施形態において、Ｘ１もしくはＸ２、または両方は、各々独立して、いずれかのアミノ酸、例えば、いずれかの標準的アミノ酸である。一部の実施形態において、Ｘ１は、酸性アミノ酸（例えば、ＤもしくはＥ）、非極性アミノ酸（例えば、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｍ、ＦもしくはＷ）、または芳香族環を有さない非極性アミノ酸（例えば、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＰもしくはＭ）である。実施形態において、Ｘ２は、非極性アミノ酸（例えば、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｍ、ＦもしくはＷ）、芳香族環を有さない非極性アミノ酸（例えば、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＰもしくはＭ）、または極性非荷電アミノ酸（例えば、Ｓ、Ｔ、ＮもしくはＱ）である。一部の実施形態において、Ｘ１は、Ｅ、ＧもしくはＤであり、および／またはＸ２は、Ｎ、Ｉ、ＳもしくはＴである。
同様に、一部の実施形態において、本明細書で説明されるＣＤ２２結合ドメインは、配列：ＳＳＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９（配列番号＿）を有するＬＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７もしくはＸ８、またはこれらのいずれかの組合せは、各々独立して、いずれかのアミノ酸、例えば、いずれかの標準的アミノ酸である。一部の実施形態において、Ｘ１は、芳香族アミノ酸（例えば、Ｆ、ＹもしくはＷ）または正荷電アミノ酸（例えば、Ｋ、ＲもしくはＨ）である。一部の実施形態において、Ｘ２は、非極性アミノ酸（例えば、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｍ、ＦもしくはＷ）、芳香族環を有さない非極性アミノ酸（例えば、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＰもしくはＭ）、または極性非荷電アミノ酸（例えば、Ｓ、Ｔ、ＮもしくはＱ）である。一部の実施形態において、Ｘ３は、極性非荷電アミノ酸（例えば、Ｓ、Ｔ、ＮまたはＱ）である。一部の実施形態において、Ｘ４は、非極性アミノ酸（例えば、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｍ、ＦもしくはＷ）、芳香族環を有さない非極性アミノ酸（例えば、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＰもしくはＭ）、または極性非荷電アミノ酸（例えば、Ｓ、Ｔ、ＮもしくはＱ）である。一部の実施形態において、Ｘ５は、正荷電アミノ酸（例えば、Ｋ、ＲもしくはＨ）または極性非荷電アミノ酸（例えば、Ｓ、Ｔ、ＮもしくはＱ）である。一部の実施形態において、Ｘ６は、極性非荷電アミノ酸（例えば、Ｓ、Ｔ、ＮもしくはＱ）、非極性アミノ酸（例えば、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｍ、ＦもしくはＷ）、芳香族環を有さない非極性アミノ酸（例えば、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＰもしくはＭ）である。一部の実施形態において、Ｘ７は、非極性アミノ酸（例えば、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｍ、ＦもしくはＷ）、芳香族環を有さない非極性アミノ酸（例えば、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＰもしくはＭ）、または芳香族アミノ酸（例えば、Ｆ、ＹもしくはＷ）である。一部の実施形態において、Ｘ８は、非存在であるか、または芳香族アミノ酸（例えば、Ｆ、ＹまたはＷ）である。一部の実施形態において、Ｘ９は、非極性アミノ酸（例えば、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｍ、ＦもしくはＷ）、芳香族環を有さない非極性アミノ酸（例えば、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＰもしくはＭ）である。一部の実施形態において、Ｘ１は、ＹまたはＨであり、Ｘ２は、ＡまたはＴであり、Ｘ３は、ＳまたはＴであり、Ｘ４は、Ｇ、ＴまたはＳであり、Ｘ５は、ＲまたはＳであり、Ｘ６は、ＴまたはＰであり、Ｘ７は、ＬまたはＹであり、Ｘ８は、Ｙであるか、非存在であり、あるいはＸ９は、ＶもしくはＩ、またはこれらのいずれかの組合せである。一部の実施形態において、Ｘ１は、ＹまたはＨであり、Ｘ２は、ＡまたはＴであり、Ｘ３は、ＳまたはＴであり、Ｘ４は、Ｇ、ＴまたはＳであり、Ｘ５は、ＲまたはＳであり、Ｘ６は、ＴまたはＰであり、Ｘ７は、ＬまたはＹであり、Ｘ８は、Ｙであるか、非存在であり、およびＸ９は、ＶまたはＩである。ｓｃＦｖドメインのヒトＣＤＲ配列の配列を、重鎖可変ドメインについて表７Ａ、７Ｂまたは７Ｃに、軽鎖可変ドメインについて表８Ａまたは８Ｂに示す。「ＩＤ」は、各ＣＤＲのそれぞれの配列番号を意味する。
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一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、表９Ａまたは９Ｂに列挙したいずれかの重鎖結合ドメインアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を含む。実施形態において、抗原結合ドメインは、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３をさらに含む。実施形態において、抗原結合ドメインは、表１０Ａまたは１０Ｂに列挙したいずれかの軽鎖結合ドメインアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３を含む。
一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、表１０Ａまたは１０Ｂに列挙したいずれかの軽鎖結合ドメインアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３の１つ、２つまたは全て、ならびに表９Ａまたは９Ｂに列挙したいずれかの重鎖結合ドメインアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３の１つ、２つまたは全てを含む。
一部の実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム、またはこれらの組合せに従って定義される。
ＶＬおよびＶＨドメインがｓｃＦｖ内に出現する順番は様々（すなわち、ＶＬ－ＶＨ、またはＶＨ－ＶＬ方向）であってもよく、この場合、各サブユニットが配列ＧＧＧＧＳ（配列番号１８）［例えば、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号１０７）または（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１０６）］を含む「Ｇ４Ｓ」（配列番号１８）サブユニットの３つか４つのコピーが、前記可変ドメインを接続して、ｓｃＦｖドメイン全体を作り出すことができる。代替的に、ＣＡＲコンストラクトは、例えば、配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１３２２）を包含するリンカーを包含していてもよい。
これらのクローンは全て、ＣＤ３ゼータ鎖由来の共刺激ドメインのシグナルドメインにおけるＱ／Ｋ残基変化を含有する。
ＣＡＲ２０コンストラクト
抗ＣＤ２０単鎖可変フラグメントを単離した。表１１Ａおよび１１Ｂを参照されたい。抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖを、ＣＤ３ゼータ鎖および４－１ＢＢ共刺激分子を有するレンチウイルスＣＡＲ発現ベクターにクローニングした。ＣＡＲ含有プラスミドを、ＳＴＢＬ３細胞における細菌形質転換よって増幅させ、続いて、エンドトキシンフリーＱｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｋｉキットを使用するＭａｘｉｐｒｅｐによって増幅させた。レンチウイルスの上清は、標準的な技術を使用して２９３Ｔ細胞において産生した。
ＣＡＲの配列を下の表１１Ａおよび１１Ｂに提供する。ＣＡＲのさらなる構成要素（例えば、リーダー、ヒンジ、膜貫通およびシグナル伝達ドメイン）は、本明細書中で説明されている。
Figure 0007227331000170
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一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、表１１Ａおよび１１Ｂに列挙したいずれかの重鎖結合ドメインアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を含む。実施形態において、抗原結合ドメインは、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３をさらに含む。実施形態において、抗原結合ドメインは、表１１Ａまたは１１Ｂに列挙したいずれかの軽鎖結合ドメインアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３を含む。
一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、表１１Ａまたは１１Ｂに列挙したいずれかの軽鎖結合ドメインアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３の１つ、２つまたは全て、ならびに表１１Ａまたは１１Ｂに列挙したいずれかの重鎖結合ドメインアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３の１つ、２つまたは全てを含む。
一部の実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム、またはこれらの組合せに従って定義される。
ｓｃＦｖドメインのヒトＣＤＲ配列の配列を、重鎖可変ドメインについて表１２Ａまたは１２Ｂに、軽鎖可変ドメインについて表１３に示す。「ＩＤ」は、各ＣＤＲのそれぞれの配列番号を意味する。
Figure 0007227331000211
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一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、表１４Ａまたは１４Ｂに列挙したいずれかの重鎖結合ドメインアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を含む。実施形態において、抗原結合ドメインは、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３をさらに含む。実施形態において、抗原結合ドメインは、表１５Ａまたは１５Ｂに列挙したいずれかの軽鎖結合ドメインアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３を含む。
一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、表１５Ａまたは１５Ｂに列挙したいずれかの軽鎖結合ドメインアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３の１つ、２つまたは全て、ならびに表１４Ａまたは１４Ｂに列挙したいずれかの重鎖結合ドメインアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３の１つ、２つまたは全てを含む。
一部の実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム、またはこれらの組合せに従って定義される。
ＣＡＲ１２３コンストラクト
抗ＣＤ１２３単鎖可変フラグメントを単離した。抗ＣＤ１２３ ｓｃＦｖを、ＣＤ３ゼータ鎖および４－１ＢＢ共刺激分子を有するレンチウイルスＣＡＲ発現ベクターにクローニングした。ＣＡＲ含有プラスミドを、ＳＴＢＬ３細胞における細菌形質転換よって増幅させ、続いて、エンドトキシンフリーＱｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｋｉキットを使用するＭａｘｉｐｒｅｐによって増幅させた。レンチウイルスの上清は、標準的な技術を使用して２９３Ｔ細胞において産生した。
ＣＡＲの配列を下の表１６に提供する。ＣＡＲのさらなる構成要素（例えば、リーダー、ヒンジ、膜貫通およびシグナル伝達ドメイン）は、本明細書中で説明されている。
ＶＬおよびＶＨドメインがｓｃＦｖ内に出現する順番は様々（すなわち、ＶＬ－ＶＨ、またはＶＨ－ＶＬ方向）であった。この場合、各サブユニットが配列ＧＧＧＧＳ（配列番号１８）[例えば、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号１０７）または（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１０６）］を含む「Ｇ４Ｓ」（配列番号１８）サブユニットの３つか４つのコピーが、可変ドメインを接続して、ｓｃＦｖドメイン全体を作り出している。
ヒトＣＡＲの配列を下の表１６に提供する。
これらのクローンは全て、ＣＤ３ゼータ鎖由来の共刺激ドメインのシグナルドメインにおけるＱ／Ｋ残基変化を含有する。
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一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、表１６に列挙したいずれかの重鎖結合ドメインアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を含む。実施形態において、抗原結合ドメインは、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３をさらに含む。実施形態において、抗原結合ドメインは、表１６に列挙したいずれかの軽鎖結合ドメインアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３を含む。
一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、表１６に列挙したいずれかの軽鎖結合ドメインアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３の１つ、２つまたは全て、ならびに表１６に列挙したいずれかの重鎖結合ドメインアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３の１つ、２つまたは全てを含む。
一部の実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム、またはこれらの組合せに従って定義される。
ｓｃＦｖドメインのヒトＣＤＲ配列の配列を、重鎖可変ドメインについて表17に、軽鎖可変ドメインについて表１８に示す。「ＩＤ」は、各ＣＤＲのそれぞれの配列番号を意味する。
Figure 0007227331000227
Figure 0007227331000228
ある実施形態において、Ｂ細胞阻害剤は、ＣＤ１２３ ＣＡＲを含み、前記ＣＤ１２３ ＣＡＲは、ＣＤ１２３結合ドメインを含む抗体または抗体フラグメントを含み、前記ＣＤ１２３結合ドメインは、表１８に列挙した軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）アミノ酸配列の１つまたは複数、ならびに表１７に列挙したいずれかのＣＤ１２３重鎖結合ドメインアミノ酸配列の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）の１つまたは複数を含む。
ｓｃＦｖドメインのさらなるＣＤ１２３ ＣＤＲ配列の配列を、重鎖可変ドメインについて表１９、２１および２３に、軽鎖可変ドメインについて表２０、２２および２４に示す。「ＩＤ」は、各ＣＤＲのそれぞれの配列番号を意味する。
表１９および２０において提供するＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けスキームとＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームの組合せによるものである。
Figure 0007227331000229
Figure 0007227331000230
ある実施形態において、Ｂ細胞阻害剤は、ＣＤ１２３ ＣＡＲを含み、前記ＣＤ１２３ ＣＡＲは、ＣＤ１２３結合ドメインを含む抗体または抗体フラグメントを含み、前記ＣＤ１２３結合ドメインは、表２０に列挙した軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）アミノ酸配列の１つまたは複数、ならびに表１９に列挙したいずれかのＣＤ１２３重鎖結合ドメインアミノ酸配列の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）の１つまたは複数を含む。
Figure 0007227331000231
Figure 0007227331000232
ある実施形態において、Ｂ細胞阻害剤は、ＣＤ１２３ ＣＡＲを含み、前記ＣＤ１２３ ＣＡＲは、ＣＤ１２３結合ドメインを含む抗体または抗体フラグメントを含み、前記ＣＤ１２３結合ドメインは、表２２に列挙した軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）アミノ酸配列の１つまたは複数、ならびに表２１に列挙したいずれかのＣＤ１２３重鎖結合ドメインアミノ酸配列の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）の１つまたは複数を含む。
Figure 0007227331000233
Figure 0007227331000234
ある実施形態において、Ｂ細胞阻害剤は、ＣＤ１２３ ＣＡＲを含み、前記ＣＤ１２３ ＣＡＲは、ＣＤ１２３結合ドメインを含む抗体または抗体フラグメントを含み、前記ＣＤ１２３結合ドメインは、表２４に列挙した軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）アミノ酸配列の１つまたは複数、ならびに表２３に列挙したいずれかのＣＤ１２３重鎖結合ドメインアミノ酸配列の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）の１つまたは複数を含む。
これらのＣＤ１２３ ＣＡＲのさらなる説明は、例えば、ＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０９０５０８において提供されており、前記出願は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
ＮＦＡＴプロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーターを含有するジャーカット細胞株（ＪＮＬ細胞と称する）を使用して、ヒト抗ＣＤ１２３ ＣＡＲコンストラクトを活性について評価した。本明細書で説明される４つのヒトＣＡＲコンストラクト（ＣＤ１２３ ＣＡＲ１－４）ならびにマウスＣＤ１２３ ＣＡＲコンストラクト１１７２および１１７６について、ＣＤ１２３ ＣＡＲ活性を測定した。ＣＡＲ活性は、このＮＦＡＴ駆動レポーターの活性として測定した。ＣＡＲＴコンストラクトを含有するレンチウイルス上清を形質導入のためにＪＮＬ細胞に添加した。形質導入の４～６日後、ＪＮＬ細胞を、下で説明する通りのＦＡＣＳによってＣＡＲ発現について評価したか、または標的陽性［ＭＯＬＭ３、ＣＤ１２３を発現するように加工されたＫ５６２細胞（ＣＤ１２３－Ｋ５６２）］もしくは標的陰性（Ｋ５６２）細胞株と、３：１のエフェクター（ＪＮＬ）対標的細胞株（Ｅ：Ｔ）比で混合して活性化を誘発した（図４１）。コインキュベーションの２０時間後、図４２に示されているようにＥｎＶｉｓｉｏｎ装置でのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙを使用してルシフェラーゼシグナルを測定した。
ＣＤ１２３発現（「ＣＤ１２３＋」）標的に応じてのＣＤ１２３ ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞（「ＣＡＲＴ－ＣＤ１２３」または「ＣＡＲＴ－ＣＤ１２３ Ｔ細胞」）のエフェクターＴ細胞応答の量および質に基づいて、最適な抗ＣＤ１２３ ＣＡＲコンストラクトを選択した。エフェクターＴ細胞応答としては、細胞の拡大、増殖、倍加、サイトカイン産生および標的細胞死滅または細胞溶解活性（脱顆粒）が挙げられるが、これらに限定されない。
ＣＡＲＴ－ＣＤ１２３の生成
ヒトｓｃＦｖをコードするレンチウイルストランスファーベクター（human scFv encoding lentiviral transfer vectors）を使用して、ＶＳＶｇシュードタイプ化レンチウイルス粒子にパッケージングされたゲノム物質を生成した。レンチウイルストランスファーベクターＤＮＡを、リポフェクタミン試薬と組み合わせたＶＳＶｇ ｇａｇ／ｐｏｌおよびｒｅｖの３つのパッケージング構成要素と混合して、それらを一緒にＬｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にトランスフェクトした。
３０時間後、培地を収集し、濾過し、－８０℃で保存した。Ｔ細胞、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球の陰性選択によってナイーブＴ細胞を得た、アフェレーシスを受けた正常ドナーからの血液を用いて開始することにより、治療用ＣＡＲＴ－ＣＤ１２３を生成した。これらの細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で、ＲＰＭＩ １６４０、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのＬ－グルタミン、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン、１００μＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸Ｎａ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓおよび５５μＭの２－メルカプトエタノール中、１：３の比でのＣＤ３ｘ２８ビーズ［Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＣＤ２８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］によって活性化した。Ｔ細胞は、２４ウェルプレートの１ウェルあたり０．５ｍＬの培地中、Ｔ細胞１×１０６個で培養した。２４時間後、Ｔ細胞をブラスティングし、０．５ｍＬのウイルス上清を添加した。するとＴ細胞は対数成長パターンで分裂し始め、それを、ｍＬあたりの細胞数を測定することによってモニタリングし、Ｔ細胞を２日ごとに新鮮な培地で希釈した。およそ１０日後にＴ細胞が落ち着き始めると、対数成長が衰退した。成長速度の緩徐化と約３００ｆｌに近いＴ細胞のサイズの組合せが、後の分析のために凍結保存されるＴ細胞の状態を決めた。
凍結保存前に、形質導入された（細胞表面に抗ＣＤ１２３ ＣＡＲを発現している）細胞のパーセンテージおよびそれらの発現の相対的蛍光強度を、検出試薬としてプロテインＬを使用するＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａまたはＢＤ－ＦＡＣＳＣａｎｔｏでのフローサイトメトリー分析により決定した。このＦＡＣＳからの非染色細胞を超えるシグナルの相対的蛍光強度のゲーティングヒストグラムプロットが、形質導入Ｔ細胞のパーセンテージを示した。形質導入は、図４２に示されているように１２～４２％の範囲のＣＡＲＴ陽性細胞をもたらした。
ＣＡＲＴ－ＣＤ１２３によりリダイレクトされたＴ細胞の細胞溶解活性の評価
標的発現細胞を死滅させるＣＡＲＴ－ＣＤ１２３ Ｔ細胞の機能的能力を評価するために、細胞を解凍し、一晩、回復させた。
Ｔ細胞による死滅は、ルシフェラーゼを安定的に発現する、ＣＤ１２３発現ＭＯＬＭ１３急性骨髄性白血病細胞株に向けられた。非形質導入Ｔ細胞を使用して、非特異的バックグラウンド死滅レベルを決定した。４：１のエフェクター：標的細胞比に用量設定し、Ｔ細胞を２倍下方希釈して、ＣＡＲＴ－ＣＤ１２３の細胞溶解活性を測定し、この場合、エフェクターは、抗ＣＤ１２３キメラ受容体を発現するＴ細胞と定義した。アッセイを、適切な数のＴ細胞と一定数の標的細胞を混合することにより開始した。２０時間後、ルシフェラーゼシグナルを、ＥｎＶｉｓｉｏｎ装置でＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイを使用して測定した。ＣＤ１２３－ＣＡＲＴ発現細胞の非形質導入Ｔ細胞に対する比率を増加させると、ＣＤ１２３細胞の死滅も同様に増加した。本明細書において提示するデータは、ＣＤ１２３を発現する細胞が、もっぱらＣＤ１２３－ＣＡＲＴ発現細胞によって破壊され、非形質導入Ｔ細胞によって破壊されないことを示唆している。図４３。
Ｔ細胞形質導入
ヒト抗ＣＤ１２３クローンＮＶＳ２（ＣＡＲ１２３－２を発現する）、ＮＶＳ３（ＣＡＲ１２３－３を発現する）、ＮＶＳ４（ＣＡＲ１２３－４を発現する）をさらなる研究用に選択した。これらのクローンは、全て、カニクイザルＣＤ１２３に対して交差反応性であった。それらの活性を、軽鎖から重鎖の方向にＣＤ８ヒンジドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメインそして４１ＢＢ共刺激ドメインを有するＶＨおよびＶＬドメインを含むマウスクローン１１７２および１１７６と比較した。１１７６もまたカニクイザルＣＤ１２３に対して交差反応性である。１１７２は、そうではない。
プラスミドをコンピテント細胞に形質転換し、５００ｃｃのブロスで成長させ、ｍａｘｉｐｒｅｐにより単離し、標準的な方法を使用して２９３Ｔ細胞に形質導入した。レンチウイルス上清を２４および４８時間の時点で収集し、超遠心分離を使用して濃縮し、凍結した。
ＳｕｐＴ１細胞を用いてレンチウイルスの力価を測定し、３のＭＯＩでの初代Ｔ細胞への形質導入のためのウイルスの適量を決定した。初代正常ドナーＣＤ４＋ＣＤ８細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびインターロイキン－２ １００Ｕ／ｍｌを使用して６日間刺激し、その後、脱ビーズ（debeading）し、一度凍結した（and were and frozen once）。Ｔ細胞の細胞容量は、＜３００ｆＬに（およそ１０～１２日後）減少した。
Ｔ細胞形質導入効率は、全てのクローンについて事実上１００％であった（図４４Ａおよび４４Ｂ）。ＣＤ４：ＣＤ８比は、ＮＶＳクローンではおよそ１：１であり、１１７２および１１７６クローンでは３：２であった（図４５）。
脱顆粒
脱顆粒を評価するために、ＣＡＲＴ細胞（ＮＶＳ２～４、１１７２および１１７６クローン）を解凍し、Ｔ細胞培地中、細胞２ｅ６個／ｍｌの濃度で、一晩、休ませた。次いで、細胞を計数し、翌日、細胞１ｅ６個／ｍｌで再懸濁させた。腫瘍標的細胞（ＴＣＭ、ＰＭＡ／ｉｏｎｏ、ＭＯＬＭ１４またはジャーカット）を細胞５ｅ６個／ｍｌで再懸濁させた。細胞を、Ｔ細胞１ｅ５個：腫瘍細胞５ｅ５個の比で４８ウェルプレートに播種し、２時間、抗ＣＤ１０７ａ ＰＥＣｙ７、抗ＣＤ４９ｄ精製および抗ＣＤ２８精製抗体の存在下でインキュベートした。その後、細胞を回収し、抗ＣＤ３ ＡＰＣで染色し、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用して獲得した（図４６）。
Ｔ細胞脱顆粒が図４６の各プロットの右上象限に示されている。本明細書において提示する結果は、２時間インビトロアッセイ中の同様の脱顆粒によって明示された、ＣＤ１２３＋標的の同様のＴ細胞認識を示す。Ｃ１１７６は、他のクローンにおけるおよそ８０％と比較して６５％の劣った脱顆粒を有した。
細胞毒性
細胞毒性を評価するために、ＣＡＲＴ細胞（ＮＶＳ２～４、１１７２および１１７６クローン）を解凍し、一晩、Ｔ細胞培地中、細胞２ｅ６個／ｍｌで休ませた。細胞を計数し、翌日、細胞１ｅ６個／ｍｌで再懸濁させた。腫瘍標的細胞（ＭＯＬＭ１４）を細胞１ｅ６個／ｍｌで再懸濁させた。細胞を、黒色平底９６ウェルプレートに、示されている通りの漸減Ｅ：Ｔ比で（図４７）、２回ずつ播種した。２０時間のインキュベーション後、ルシフェリンを添加し、プレートをイメージングして、残留生細胞の尺度として光子束を判定した。ＭＯＬＭ１４細胞の死滅は、２０時間の時点で、ほとんどのエフェクター：標的比で、全てのクローン間で同等であった。
インビボマウスモデル
ＮＳＧマウスに、Ｄ０に、ルシフェラーゼ発現ＭＯＬＭ１４細胞１ｅ６個をｉｖ注射した。Ｄ６に、マウスを腫瘍量についてイメージング（ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）し、処置分に無作為化した。最低腫瘍量を有するマウスを対照群（非形質導入Ｔ細胞、ＵＴＤ）に割り当てた。ＣＡＲＴ細胞（ＮＶＳ２～４、１１７２および１１７６クローン）または対照Ｔ細胞（１ｅ６）をＤ７にｉ．ｖ．注射した。実施したＤ１３におけるイメージングからのデータを図４８に示す。注射の６日後、全ての抗ＣＤ１２３コンストラクトは、インビトロデータと一致する、同等の抗腫瘍効果をもたらした。
カニクイザルＣＤ１２３に対して交差反応性であるマウス１１７６に基づくヒト化抗ＣＤ１２３単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を生成し、細胞内ＣＤ３ゼータ鎖と４－１ＢＢの細胞内共刺激ドメインとを有するレンチウイルス発現ベクターにクローニングする。
ＶＬおよびＶＨドメインがｓｃＦｖ内に出現する順番は様々（すなわち、ＶＬ－ＶＨ、またはＶＨ－ＶＬ方向）であった。この場合、表２５に示すように、各サブユニットが配列ＧＧＧＧＳ（配列番号１８）[例えば、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号１０７）または（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１０６）］を含む「Ｇ４Ｓ」（配列番号１８）サブユニットの３つか４つのコピーが可変ドメインを接続してｓｃＦｖドメインの全体を作り出している。
ヒト化ＣＡＲの配列を下の表２５に提供する。
これらのクローンは全て、ＣＤ３ゼータ鎖由来の共刺激ドメインのシグナルドメインにおけるＱ／Ｋ残基変化を含有する。
Figure 0007227331000235
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Figure 0007227331000282
Figure 0007227331000283
ｈｚＣＤ１２３ ＣＡＲ１－３２のｓｃＦｖドメインのヒト化ＣＤＲ配列の配列を、重鎖可変ドメインについて表２６に、軽鎖可変ドメインについて表２７に示す。「ＩＤ」は、各ＣＤＲのそれぞれの配列番号を意味する。
Figure 0007227331000284
Figure 0007227331000285
一部の実施形態において、ＣＡＲ１２３は、配列ＹＣＡＲＧＮＷＤＤＹ（配列番号＿）を有するＨＣＤＲ３を有する。
次いで、ＣＡＲ ｓｃＦｖフラグメントを、レンチウイルスベクターにクローニングして、単一のコーディングフレーム中に、発現のためのＥＦ１アルファプロモーターを使用して、全長ＣＡＲコンストラクトを作り出した。
二重特異性ＣＡＲ１９／ＣＡＲ２２コンストラクトおよびそれらの機能
このセクションは、二重特異性ＣＡＲ１９／ＣＡＲ２２コンストラクトの産生および機能を説明する。２つの二重特異性ｓｃＦｖタンデム融合体：抗ＣＤ２２（ＨＬ）４Ｇ４Ｓ－抗ＣＤ１９（ＬＨ）および抗ＣＤ１９－４Ｇ４Ｓ－抗ＣＤ２２を設計した。表示（ＨＬ）は、重鎖可変領域が、示されているｓｃＦｖ内の軽鎖領域の上流にあることを示し、表示（ＬＨ）は、軽鎖可変領域が、示されているｓｃＦｖ内の重鎖領域の上流にあることを示す。抗ＣＤ２２ベース分子は、ｈＣＤ２２－２であり、ＨＬの向きを使用する。抗ＣＤ１９ベース分子は、本明細書において表２のコンストラクトＩＤ１０４８７６として提供するヒト化抗ＣＤ１９配列であり、これはＬＨの向きを使用する。これらのコンストラクトを図１３に模式的に示す。
両方の二重特性コンストラクトおよびそれらのｓｃＦｖ部分のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を下の表２８に与える。
Figure 0007227331000286
Figure 0007227331000287
Figure 0007227331000288
Figure 0007227331000289
Figure 0007227331000290
Figure 0007227331000291
Figure 0007227331000292
Figure 0007227331000293
一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、表２８に列挙したいずれかの重鎖結合ドメインアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を含む。実施形態において、抗原結合ドメインは、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３をさらに含む。実施形態において、抗原結合ドメインは、表２８に列挙したいずれかの軽鎖結合ドメインアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３を含む。
一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、表２８に列挙したいずれかの軽鎖結合ドメインアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３の１つ、２つまたは全て、ならびに表２８に列挙したいずれかの重鎖結合ドメインアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３の１つ、２つまたは全てを含む。
一部の実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム、またはこれらの組合せに従って定義される。
上で説明した二重特異性ＣＤ１９－ＣＤ２２およびＣＤ２２－ＣＤ１９コンストラクトを、下の実施例で説明する通り、ＮＦＡＴアッセイで試験した。対照として、抗ＣＤ１９単独のＣＡＲおよび抗ＣＤ２２単独のＣＡＲを使用した。このアッセイの結果を図１４に示す。データは、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖと抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖの両方がそれらの標的に対して活性であることを示した。
以下の実施例を参照しながら本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は単に例示のために示されたものであり、特に他の規定がない限り限定を意図していない。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されると決して解釈されず、本明細書で示された教示の結果として明らかになるありとあらゆるバリエーションを包含すると解釈されるものとする。
当業者は、さらなる説明がなくても、前述の説明および以下の説明に役立つ例を使用して、本発明の化合物を作製し利用して、特許請求された方法を実施することができると考えられる。以下の実施例は、本発明の様々な態様を具体的に指摘するが、開示のその他の部分を限定すると決して解釈されないものとする。
多発性骨髄腫の処置において使用するためのＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞
化学療法、標的化療法、および自己幹細胞移植の現行のレジメンを用いてさえも、骨髄腫は治療不能の疾患とみなされている。本発明の実施例は、キメラ抗原受容体（レンチウイルス／ＣＤ１９：４－１ＢＢ：ＣＤ３ゼータ；「ＣＡＲＴ１９」またはＣＴＬ０１９としても知られている）を有するＣＤ１９に向けられた自己Ｔ細胞での多発性骨髄腫（ＭＭ）の処置を説明する。この実施例から、ＣＤ１９を対象とするＣＡＲ療法は、極めて低い（ほとんどの方法で検出不可能な）レベルのＣＤ１９しか発現しない骨髄腫幹細胞および／または腫瘍細胞の標的化に基づいて、深く長期的に持続する寛解を確立する可能性を有することが実証される。
侵攻性二次プラズマ細胞性白血病を有する患者の処置において、本発明者らは、サルベージ自己幹細胞移植から２日後に投与されたＣＡＲＴ１９は、複数のラインの化学療法を経て進行している患者において、プラズマ細胞性白血病の急速なクリアランスと極めて優れた部分応答を引き起こしたことを見出した。処置前の数カ月間、この患者は輸血依存性であった。処置の２カ月後、彼女は彼女の血球数を回復しており（正常な範囲の血小板数および白血球数を有しており）、自身の処置のために入院していた病院から退院したために輸血は必要ではなかった。
骨髄腫細胞はＣＤ１９を自然に発現しないため、この腫瘍においてＣＡＲＴ１９処置が急速で有意な腫瘍応答を誘導したという発見は驚くべきことであった。特定の理論に縛られることは望まないが、骨髄腫を処置するのにＣＡＲＴ１９を使用することができるというのは、以下の理由：（１）骨髄腫細胞は従来、フローサイトメトリーによりＣＤ１９発現に関して陰性であると考えられているが、骨髄腫細胞は、ＲＮＡによっては発現が検出可能であるがフローサイトメトリーまたは免疫組織化学によっては検出不可能であるような極めて低いレベルのＣＤ１９を発現する場合があることを示すデータがあり；さらに（２）多発性骨髄腫を引き起こし、特に化学療法に耐性のがん性幹細胞であると考えられる、クローン型Ｂ細胞を標的化する概念であることから、理にかなっている。Ｂ細胞と骨髄腫腫瘍細胞とはクローンの関係であるが、従来の骨髄腫療法は、Ｂ細胞よりも悪性形質細胞を目的としている。したがって、骨髄腫を治療するためのＣＡＲＴ１９は、大部分の骨髄腫療法とは異なる細胞集団を標的とする。
本発明者らの一人の患者の経験においては、患者は循環血漿細胞を有し、本発明者らは、ＣＤ１９の発現のために患者の腫瘍細胞を試験することができた。患者の腫瘍細胞の約１～２％がＣＤ１９抗原を発現した。したがって、ＣＡＲＴ１９は、患者の腫瘍細胞のごく少数の集団に直接的な影響を及ぼす可能性があると推論された；しかし、非常に良好な部分応答は、ＣＤ１９＋腫瘍細胞のごく少数の集団のみを標的とすることに基づいては予測されなかった。
このケースでは、高用量のメルファラン後の自己幹細胞移植レスキューに続いてＣＡＲＴ１９が投与された。これは骨髄腫において標準的な療法であるが、治療効果はない。さらにこの患者は以前にタンデム自己幹細胞移植を受けており、移植後の初期（＜６カ月）に再発していた。特定の理論に縛られることは望まないが、本発明の実施例で説明されるようなＣＡＲＴ１９細胞の使用は、サルベージ自己幹細胞移植と組み合わせた場合、骨髄腫の処置において重複しないメカニズムを有する可能性がある。
１０人の追加の多発性骨髄腫患者は、第Ｉ相試験においてＣＡＲＴ１９で治療され、少なくとも３人の患者はこれまでに治療されている。
用量の論理的説明およびリスク／利益
本発明者らは、このプロトコールのための静脈内投与経路による一定の投薬を使用することを選択した。このプロトコールの主たる目的は、多発性骨髄腫を有する患者にＣＡＲＴ－１９細胞を投与することの安全性および実施可能性を試験することであった。予想された主たる毒性は、（Ｉ）ＣＡＲが悪性または正常Ｂ細胞上の代理ＣＤ１９抗原に遭遇したときのサイトカイン放出；（２）リツキシマブ療法と同様に正常Ｂ細胞の枯渇；（３）拡大／共刺激された自己Ｔ細胞がＭＭのためにＡＳＣＴと結合された場合に以前に見られたように、移植片対宿主病に似たステロイド応答性の皮膚および胃腸の症候群である。理論的な懸念は、ＣＡＲＴ－１９Ｔ細胞の形質転換または制御されない増殖が、高レベルのＣＤ１９に応答して起こり得るかどうかであった。これは、ＭＭにおけるクローン形質のＢ細胞の負荷が、その研究で治療された難治性ＣＬＬ患者における悪性Ｂ細胞の負担よりはるかに低いと予想されるため、本出願においては、ＣＬＬ患者の別の研究と比較して懸念が少なかった。
用量の論理的説明
第一の３人の患者に関して、１．４×１０7～１．１×１０9個のＣＡＲＴ－１９細胞の範囲の用量で臨床活性が観察された。この観察から、少なくとも処置された第一の３人の患者において、明白な用量応答関係はなかったことが実証される。用量において２の対数倍数差で投与された患者において、完全応答が観察された。したがって、代謝される標準的な薬物とは異なり、ＣＡＲＴ細胞は、広範な用量応答範囲を有する可能性がある。ＣＡＲＴ細胞は患者において広範にわたり増殖することができるために、これは最も可能性がある。それゆえに本発明者らは、注入の場合、１～５×１０８個のＣＡＲＴ－１９細胞の用量範囲を設定した。範囲外使用に基づき提供されたこの一人の患者の研究において、患者に最大５×１０８個のＣＡＲＴ１９細胞が提供され、用量の下限は設けなかった。患者１０人のトライアルの場合、患者には、１～５×１０７個のＣＡＲＴ－１９細胞が提供されると予想される。
一般的な設計
これは、範囲外使用に基づき提供された一人の患者の研究であった；これは、ＣＡＲＴ－１９が発現されるように形質導入された自己Ｔ細胞の注入が安全であるかどうかを決定するための第Ｉ相研究の後にモデル化された。この研究の主な目的は、１回目のＡＳＣＴに続く初期の再発後にサルベージＡＳＣＴを受けた患者におけるＣＡＲＴ－１９Ｔ細胞の安全性、忍容性および生着可能性を決定することであった。そのプロトコールは、非盲検の予備的研究からなる。
登録時に、対象は、骨髄生検と、それらのＭＭの慣例的な実験的およびイメージングの検討を受ける。適格の対象は、ＣＡＲＴ－１９製造のための膨大な数の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得るために、定常状態のアフェレーシスを受ける。ＴＣＲζ／４－１ＢＢレンチウイルスベクターで形質導入されたＰＢＭＣからＴ細胞を精製し、インビトロで拡大させ、次いで将来的な投与のために凍結する。Ｔ細胞がうまく製造された患者の数と比較して、Ｔ細胞の収集、拡大または製造が不十分な患者の数を記録する；この患者集団において、生成物製造の実行可能性は、問題があるとは予測されない。
対象は、一般的に、追加の２回のＡＳＣＴを行うためにそれらの１回目のＡＳＣＴのための調製で行われた動員／収集から保存されたままの十分な末梢血幹細胞を有していたとされる。そうではない対象は、処置を行う医師の選択に従ったレジメンを用いたそれらの定常状態のアフェレーシスの前または後のいずれかに２回目の動員／収集手法を受ける。最初の白血球除去血輸血からおよそ２週間後、対象は病院に入院して、高用量のメルファラン（－２日目）、それに続いて２日日後（０日目）に自己幹細胞の注入を受け、全ての対象は、１２～１４日後（＋１２～１４日目）にＣＡＲＴ－１９細胞の注入を受ける。最大１０人の患者が登録される。
全ての対象は、ＣＡＲＴ－１９細胞の安全性、および生着および持続性を検討するために、研究の４週目を過ぎたら定期的に血液テストを受ける。＋４２日目および＋１００日目に、骨髄の形質細胞の負荷およびＣＡＲＴ－１９細胞の骨髄へのトラフィッキングを検討するために、対象は骨髄穿刺液／生検を受ける。１００日目に、国際骨髄腫作業部会（ＩＭＷＧ：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｙｅｌｏｍａ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ）の基準１３６に従って形式的な応答の検討を行い、多発性骨髄腫を有する患者に関する慣例的な臨床実践に従ってＴＴＰをモニターする。この研究で測定された主要な効能の結果は、患者の最初のＡＳＣＴ後のＴＴＰと、この研究でのＡＳＣＴ後のＴＴＰとの比較である。
この研究の主たるエンドポイントは、ＡＳＣＴを用いたＣＡＲＴ－１９細胞注入の安全性および実施可能性であるため、この研究では早期停止規則が採用される。略述すると、治療された最初の５人の対象において生じた重大な予期しない有害事象が２つ未満の場合、研究は、標的被験者の１０人に向けてさらに５人の対象を獲得する。本発明者らは、５人の対象が登録され、そのように観察されるまで、その後の対象を登録する前に、処置された対象をＣＡＲＴ－１９注入後の４０日間（すなわち、４２日目の第一の公式な応答評価を通じて）観察する。５人の患者からなる第２群の処置のために、対象間の待ち時間は必要とされない。
６カ月間の徹底的なフォローアップ後、対象は、病歴、身体検査、および血液検査とともに、少なくとも四半期ごとに２年間評価される。この評価に続いて、対象は、新しい悪性腫瘍の発症などの長期的な健康問題の診断を評価するために、さらに１３年までの電話とアンケートによる毎年のフォローアップのためのロールオーバー試験に入る。
主たる研究エンドポイント
このパイロット試験は、最初のＡＳＣＴ後の早期再発後にＭＭについて救済ＡＳＣＴを受ける患者において、ＣＤ１９ ＴＣＲζ／４－１ＢＢで形質導入された自己Ｔ細胞の安全性および実施可能性を試験するために設計されている。
主たる安全性および実施可能性のエンドポイントは、以下を含む：
ＮＣＪ ＣＴＣ ２と定義される、研究に関連する有害事象の発生：注入から２４週までの任意の時点で研究治療に可能性があり、見込みがあり、または確かに関連している、グレード３の徴候／症状、実験室の毒性および臨床事象。これは、注入毒性およびＣＡＲＴ－１９細胞におそらく関連する毒性を含み、以下を含むが、これらに限定されない：
ａ．発熱
ｂ．発疹
ｃ．好中球減少症、血小板減少症、貧血、骨髄無形成症
ｄ．肝機能障害
ｅ．肺の浸潤または他の肺毒性
ｆ．胃腸管または皮膚に影響を及ぼすＧＶＨＤ様症候群。
患者アフェレーシス製品からＣＡＲＴ－１９細胞を製造する実施可能性。ベクター形質導入効率、Ｔ細胞純度、生存率、無菌性および腫瘍汚染のための放出基準を満たさない製造された製品の数が決定される。
ＣＡＲＴ１９を用いた自己幹細胞移植後の応答の深度および持続時間は、各患者が標準的自己幹細胞移植後に最初に達成した応答の深度および持続時間と比較される。
患者選択および取消し
試験対象患者基準
対象は、ＭＭについて前回ＡＳＣＴを受けていなければならず、幹細胞注入の３６５日以内に進行していなければならない。計画されたタンデムＡＳＣＴ統合レジメンの一部として前回ＡＳＣＴを２回受けた対象は適格である。進行は、進行性疾患のＩＭＷＧ基準、または最初のＡＳＣＴ後にＣＲまたはｓＣＲに達した患者について、ＣＲからの再発の基準（Durie et al. Leukemia 2006;20(9):1467-1473）に従って定義される。Ｎ．Ｂ．：患者が前回ＡＳＣＴの３６５日以内に登録しなければならないという要件はなく、患者は、この試験に登録する前の前回ＡＳＣＴ後の再発／進行に続いて、実験薬剤を含む他の薬剤を用いて治療することができる。
対象は書面によるインフォームドコンセントに署名していなければならない。
対象は、メルファラン注入日前の１２週間以内に測定される以下の基準により定義される高用量メルファランを受けるための十分な生存臓器機能を有していなければならない：ａ．血清クレアチニン≦２．５または推定クレアチニンクリアランス≧３０ｍｌ／分であり、透析依存ではない。ｂ．ＳＧＯＴ≦３倍の正常の上限および総ビリルビン≦２．０ｍｇ／ｄｌ（高ビリルビン血症がギルバート症候群に起因する患者を除く）。ｃ．左心室駆出率（ＬＶＥＦ）≧４５％、またはＬＶＥＦが＜４５％である場合、臨床的に有意な心血管機能障害のないものと同定する心臓病専門医による正式評価。登録から６週間以内にＬＶＥＦの評価が行われていなければならない。ｄ．ＦＥＶ１、ＦＶＣ、ＴＬＣ、ＤＬＣＯ（肺容量およびヘモグロビン濃度の適切な調整後）の予測される値が≧４０％である適切な肺機能。肺機能検査は、登録から６週間以内に実施されていなければならない。
高性能状態が骨痛のみに起因する場合を除いて、対象は、ＥＣＯＧ性能状態が０～２でなければならない。
除外基準
対象は：
いずれにおいて活性で制御されていない感染があってはならない。
活発なＢ型肝炎、Ｃ型肝炎、またはＨＩＶ感染があってはならない。
概説されているように参加を妨げる制御されていない医学的障害があってはならない。
処置レジメン
再発した／進行性多発性骨髄腫のための療法
患者は、登録前に、それらの処置を行う医師の選択に従って再発した／進行性の多発性骨髄腫のための療法を受けていてもよい。療法は、登録時に継続していてもよい。
患者は、アフェレーシスの２週間前および高用量のメルファランの２週間前に全ての療法を止めなければならない。アフェレーシスと高用量のメルファランとの間の中断が２週間より長いと予想される場合、患者は、それらの処置を行う医師の裁量でアフェレーシス後に療法を再開してもよい。
高用量のメルファラン（－２日目）
－３日目または－２日目に患者は病院に入院して、処置プロトコール開始の前に、腫瘍溶解症候群に関するパラメーターをモニターすることを包含する主治医による試験と慣例的な実験室検査を受ける。ＭＭをモニターする実験室検査（ＳＰＥＰ、定量的な免疫グロブリン、および無血清の軽鎖分析）のための血液は、このような検査で承認から７日以内に採血されなかった場合、療法開始前に採取する。
高用量療法は、－２日目に、２００ｍｇ／ｍ２の用量のメルファランをおよそ２０分かけて静脈内投与することからなる。メルファランの用量は、７０歳より高齢の患者か、または処置を行う医師の裁量で２００ｍｇ／ｍ２の用量に耐えられない可能性があるあらゆる年齢の患者である場合、１４０ｍｇ／ｍ２に下げる。全ての患者は、標準的な制吐剤の予防的投与を受け、このような予防的投与としては、デキサメタゾンおよび標準的な抗生物質の予防的投与を挙げることができる。
幹細胞の再注入（０日目）
幹細胞の注入は、０日目に、高用量メルファランの投与から少なくとも１８時間後に行われる。幹細胞は、標準的な規格化された実施に従って、前投与の後におよそ２０～６０分間かけて静脈内注入される。少なくとも２×１０６個のＣＤ３４＋前駆体／ｋｇ体重が注入されると予想される。加えて、少なくとも１×１０６個のＣＤ３４＋前駆体／ｋｇ体重が、生着の遅延のまたは後の移植片失敗の場合に注入され得るバックアップ用の幹細胞生成物として利用可能であると予想される。Ｇ－ＣＳＦは、＋５日目から開始してＳＱ投与され、標準的な規格化された実施に従って投薬されると予想される。輸注サポートなどの他の支持療法の測定が、標準的な規格化されたガイドラインに従って行われると予想される。
ＣＡＲＴ１９細胞の注入（＋１２～１４日目）
最大５×１０7個のＣＡＲＴ－１９細胞からなる、ＣＡＲＴ－１９を形質導入されたＴ細胞の単回投薬が与えられる。この単一患者プロトコールにおけるＣＤ１９ ＴＣＲζ４－１ＢＢベクターで形質導入された細胞の注入のための最小許容用量は、１×１０7である。ＣＡＲＴ－１９細胞は、胸骨細胞注入後の＋１２～１４日目に迅速なｉ．ｖ．注入により単回投薬として与えられる。患者が１２～１４日のウィンドウにおいて本明細書で説明される組み入れ基準のいずれも満たせない場合、ＣＡＲＴ－１９注入は基準が満たされるまで＋１２～１４日過ぎに遅延され得る。
維持的なレナリドマイド
それらの１回目のＡＳＣＴの後に維持的なレナリドマイドを受けてそれに耐えた対象は、処置を行う医師の判断で禁忌がないと仮定しておよそ＋１００日目に、レナリドマイド維持療法を再開させる。開始用量は、過去の経験が特定の患者に対して代わりの開始用量を指示していなければ一日１０ｍｇになる。維持療法は疾患進行または不耐性まで続くことになる。
研究薬物の調製および投与
ＣＡＲＴ－１９ Ｔ細胞は、ＣＶＰＦにおいて調製され、注入細胞のＦＤＡ承認による放出基準（例えば、細胞用量、細胞純度、無菌性、ベクター／細胞の平均コピー数など）が満たされるまで、ＣＶＰＦから放出されない。放出すると、細胞は、投与のためにベッドサイドに運ばれる。
細胞解凍。凍結された細胞は、ドライアイスで対象のベッドサイドに運ばれる。細胞は、３６～３８℃に維持された水浴を使用して、ベッドサイドで解凍される。バッグは、細胞がちょうど解凍するまで静かにマッサージされる。容器に凍結した塊が残らないようにしなければならない。ＣＡＲＴ－１９細胞製品が破損し、もしくはバッグが漏れているように見えるか、または他には損傷しているように見える場合は、注入するべきではなく、下記のようにＣＶＰＦに返却する必要がある。
前投薬。Ｔ細胞注入後の副作用には、一過性の発熱、悪寒および／または吐き気が含まれる；概説のためにＣｒｕｚ ｅｔ ａｌ（Cytotherapy 2010; 12(6):743-749）を参照されたい。対象は、ＣＡＲＴ－１９細胞の注入前に、アセトアミノフェンおよびジフェンヒドラミン塩酸塩で前投薬されることが推奨される。これらの投薬は、必要に応じて６時間ごとに繰り返してもよい。患者が発熱を続け、アセトアミノフェンで寛解しない場合、一連の非ステロイド系抗炎症薬の投薬を処方することができる。生命を脅かす緊急事態を除いて、患者は何どきでもヒドロコルチゾン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロンまたはデキサメタゾンなどの全身性コルチコステロイドを受けないことが推奨される。これはＴ細胞に悪影響を及ぼす可能性があるためである。
発熱反応。万一、対象が、ＣＡＲ Ｔ細胞注入後に敗血症または全身性菌血症を発症するような場合には、適切な培養および医学的管理を開始すべきである。汚染されたＣＡＲＴ－１９ Ｔ細胞生成物が疑われる場合、生成物は、ＣＶＰＦに保存された保存試料を用いて、無菌性について再試験することができる。
投与。注入は免疫抑制された患者のための予防策を使用して、Ｒｈｏｄｅｓの隔離室で行われる。形質導入されたＴ細胞は、三方活栓付の１８ゲージラテックスフリーＹ型血液セットを通じて１分間あたりおよそ１０ｍＬから２０ｍｌの流速で急速静脈注入により投与する。注入期間は注入される全容量および推奨される注入速度に基づくことになる。各注入バッグは、以下：「自己使用のみ」と記されたラベルが添付されている。加えてラベルには、対象のイニシャル、生年月日、および研究番号などの少なくとも２つの固有の識別子が記載されている。注入前、２人の人が独立して、対象立ち会いのもとでこの情報の全てを検証することにより、情報が参加者と正確に合致していることを確認する。
対象が、アレルギー反応、または重度の低血圧症の危機、または注入に対する他の反応を有する場合、救急医療機器（すなわち、緊急用トロリー）が注入中に利用可能となる。バイタルサイン（温度、呼吸数、脈拍数、および血圧）は、注入の前後で、１５分ごとに少なくとも１時間、これらの徴候が十分であり、安定するまで取られる。対象は、医師が、対象にそうすることが安全であると判断するまで、退院しないように求められる。
パッケージング
注入は、注入のための１×１０7個のＣＡＲＴ－１９細胞の最小許容用量で、１～５×１０7個のＣＡＲＴ１９を形質導入された細胞の単回用量で構成される。各バッグは、以下の注入可能なグレード試薬（ｖ／ｖ％）：３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ－Ａ、３１．２５％デキストロース（５％）、０．４５％ＮａＣｌ、最大７．５％ＤＭＳＯ、１％デキストラン４０、５％ヒト血清アルブミン、を含有する低温媒体のアリコート（容量は用量に依存する）を含有する。
アフェレーシス
アフェレーシスセンターで、大容量（１２～１５リットルまたは血液容量の４～６倍）のアフェレーシス手法を実行する。この手法の間にＣＡＲＴ－１９のためのＰＢＭＣを得る。目的は、１回の白血球除去血輸血で、ＣＡＲＴ－１９Ｔ細胞を製造するために少なくとも５×１０９個の白血球を回収することである。ＦＤＡの遡及要件および調査のためのベースラインの血液白血球も得て、低温保存する。細胞生成物は、およそ２～４週間後のリリースの準備ができていることが予測される。フローサイトメトリーによるリンパ球サブセットの定量は、ＣＤ１９およびＣＤ２０Ｂ細胞の決定を包含する。ベースラインの検討は、ヒト抗ＶＳＶ－Ｇおよび抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）に関して行われる。対象は、以前に臨床細胞およびワクチン生産施設における現在の適正製造基準に従って保存される十分なアフェレーシス回収を行っていた場合、これらの細胞は、ＣＡＲＴ－１９製造のための細胞源として使用され得る。保存されたアフェレーシス製品を使用することにより、追加のアフェレーシス回収を受ける対象に対する費用、時間、およびリスクを回避することができる。
腫瘍縮小化学療法（cytoreductive chemotherapy）
リンパ球枯渇化学療法（lymphodepleting chemotherapy）は、本明細書で説明したような高用量のメルファランである。
ＣＡＲＴ－１９注入
注入は、幹細胞再注入後の１２～１４日目に開始される。
最初の注入の＋１２～１４日前に、化学療法が部分的にリンパ球減少症を誘発するため、患者は、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８カウントの差異および評価を有するＣＢＣを有する。
第一の用量は、単回用量を使用して投与される。患者のベッドのそばで細胞を融解させる。融解させた細胞を、注入期間がおよそ１０～１５分間になるように、耐えられる限り速い注入速度で与える。混合を容易にするために、細胞は、Ｙ－アダプターを使用して同時に投与される。本明細書で説明したようにして、対象は注入を受けて前投与される。対象のバイタルサインを検討し、投与前に、注入の最後に、その後１時間にわたり１５分ごとに、これらが安定して問題のない状態になるまで、パルスオキシメトリーを行う。第一の注入前のあらゆる時間と各注入後に２０分から４時間まで、ベースラインのＣＡＲＴ－１９レベルを決定するための血液試料を得る（続いてＴＣＳＬに送る）。
高用量のメルファランに関連する毒性を経験している患者は、これらの毒性が解消するまで、その注入スケジュールを遅らせる。Ｔ細胞注入の遅れを保証する特定の毒性には以下が含まれる：１）肺：９５％超の飽和を維持する補充酸素の要求または漸進的である胸部Ｘ線上の放射線異常の存在；２）心臓：医療管理で制御されていない新しい心臓不整脈；３）昇圧剤を必要とする低血圧；４）能動的感染：Ｔ細胞注入の４８時間以内に細菌、真菌またはウイルスの陽性血液培養。
毒性の管理
制御されていないＴ細胞の増殖。同種異系または自己のＴ細胞注入に関連する毒性は、薬理学的免疫抑制の過程で管理されている。Ｔ体関連毒性は、全身性コルチコステロイドに応答することが報告されている。制御されていないＴ細胞増殖が起こる場合（ＣＡＲＴ－１９細胞に関連するグレード３または４の毒性）、対象は、コルチコステロイドを用いて処置され得る。対象は、パルスメチルプレドニゾロン（２ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．分割ｑ８時間×２日）で処置され、続いて迅速テーパが施される。
さらに、別のプロトコールで処置された対象の観察に基づいて、マクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）にはいくつかの懸念があるが、ＣＬＬ患者よりも骨髄腫を有する患者において、ＣＤ１９＋腫瘍負荷がはるかに低いと予想される。この毒性の処置および時期は、患者の医師および治験責任医師の裁量に委ねられる。推奨される管理には、対象が連続２日を超えて続く１０１°Ｆ超の発熱を示し、感染の徴候がない（陰性血液培養、ＣＸＲまたは他の供給源）場合、トシリズマブ４ｍｇ／ｋｇが考慮され得る。医師の判断により、コルチコステロイドおよび抗ＴＮＦ療法の追加が考慮され得る。
Ｂ細胞枯渇。Ｂ細胞の枯渇および低ガンマグロブリン血症が起こる可能性がある。これは、抗ＣＤ２０指向性療法に共通している。臨床的に重要な低ガンマグロブリン血症（すなわち、全身感染）の場合、リツキシマブで行われるように、対象は、血清免疫グロブリンレベルの正常なレベルを回復させるための確立された臨床投薬ガイドラインによって静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）が与えられる。
初回移植片不全。第一のＡＳＣＴと比較して第二のＡＳＣＴ後に初回移植片不全（すなわち、非生着）がより一般的であり得る。適格性基準は、初回移植片不全の場合に治療医師の裁量で救助の再注入に十分な幹細胞が利用可能でなければならないと規定している。
結果
３人の処置抵抗性、進行多発性骨髄腫患者が、この進行中の試験においてＣＴＬ０１９を用いてこれまで処置を受けてきた。これらの患者のうちの２人についての結果は、両者が３カ月時点での主要効能評価に基づいてＣＴＬ０１９療法から実質的な抗腫瘍効果を受けていることを示している。３人目の患者はまだ３カ月時点に達していない。２人の患者についての結果は下にさらに詳細に記載されている。
最初の骨髄腫患者は、＋１００日の応答評価を完了し、患者は、ＣＡＲＴ１９療法に対して非常に良好な反応を示した。以下のテストを行って、以下の結果を得た：
－ＳＰＥＰ／免疫固定：陰性
－尿免疫固定：患者の免疫固定における微弱な測定不能なカッパ軽鎖バンド（３８日目にも存在するため、新規ではない）。
他には、患者は、以下を含む厳格な完全寛解の基準を満たしている：
－無血清軽鎖比：正常
－骨髄生検：陰性
－ＩｇＡ免疫表現型検査：ＩｇＡは検出限界を下回る。
尿免疫固定による微弱な測定不可能なκ軽鎖の結果を除いて、患者は「厳格な完全寛解」の基準を全て満たしていた。３つの時点（－２日、＋３８日、＋１０３日）における血漿細胞の免疫表現型の概要を図８に示し、患者のＩｇＡが検出限界を下回ることが実証される。前記要約は、－２日目での重い骨髄腫負荷ならびに＋３８日目および＋１０３日目では検出可能な負荷なしを示しており、これにより患者はフロー分析による「ＭＲＤ陰性」に分類される。＋１０３日目、前記要約は正常なポリクローナルＣＤ１９＋形質細胞およびＢ細胞の回復を示している。患者には疾患または治療の症候がなく、健常人のように機能している。
処置を受けた第二の患者はまだ＋１００日時点に到達していない。しかし、この時点で、彼女は健康が回復しつつあるが、ＣＴＬ０１９注入の効果を判定するには時期尚早である。
ホジキンリンパ腫に対するＣＡＲ１９ Ｔ細胞療法
ＣＡＲ１９ Ｔ細胞療法はまた、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）を治療するために使用することができる。ホジキンリンパ腫は、クローン胚中心Ｂ細胞に由来する悪性ホジキンリードスターンバーグ（ＨＲＳ）細胞の存在により特徴付けられる。ＨＬに対するＣＡＲ１９ Ｔ細胞療法の治療効果を示すいくつかの要因が存在する。ＨＬ腫瘍のＣＤ１９染色は、腫瘍および腫瘍微小環境内のＣＤ１９発現細胞（ＣＤ１９+）を示す（図２）。研究は、ＣＤ１９を発現するクローンＢ細胞集団（ＣＤ２０+ＣＤ２７+ＡＬＤＨ+）がホジキンリンパ腫細胞株の発生および維持に関与し、またほとんどのＨＬ患者の血液中を循環することを示す（Jones et al., Blood, 2009, 113(23):5920-5926）。このクローン性Ｂ細胞集団はまた、悪性ＨＲＳ細胞の発生を引き起こし、またはそれに寄与することが示唆されている。したがって、ＣＡＲＴ１９療法は、腫瘍細胞の腫瘍形成または維持に寄与するこのＢ細胞集団を枯渇させる。別の研究は、Ｂ細胞枯渇が、複数のマウスモデルにおいて固形腫瘍増殖を遅らせることを示した（Kim et al., J Immunotherapy, 2008, 31(5):446-57）。ＨＬ腫瘍微小環境におけるＢ細胞の枯渇が、いくらかの抗腫瘍効果をもたらすという考えの支持において、リツキサンなどの現在の療法が、ＨＬにおける腫瘍性Ｂ細胞の標的化および枯渇について臨床的に試験されている（Younes et al., Blood, 2012, 119(18):4123-8）。慢性炎症に関連したデノボ発癌はまた、Ｂ細胞依存性であることが示されている（de Visser, et al., Cancer Cell, 2005, 7(5):411-23）。これらの研究からの結果は、Ｂ細胞集団、特にＨＬ腫瘍微小環境の標的化が、疾患の進行または腫瘍増殖を低減または阻害することによってＨＬを治療するために有用であることを示す。
さらに、正常なＣＤ１９発現Ｂ細胞はまたＨＬの腫瘍微小環境に浸潤する。ＣＬＬおよびＡＬＬにおけるＣＡＲＴ１９療法を用いた従前の研究（例えば、実施例４および５に記載される）は、ＣＤ１９＋標的へのＣＡＲＴ１９曝露が、サイトカイン産生およびマクロファージ産生をもたらすことを示す。したがって、前腫瘍微小環境から抗腫瘍微小環境へのＨＬ腫瘍微小環境の調節は、ＨＬ中に存在する正常なＣＤ１９＋Ｂ細胞と相互作用するようにＣＡＲＴ１９を注入することにより達成することができる。例えば、ＣＤ１９発現標的へのＣＡＲＴ１９曝露は、細胞傷害性Ｔ細胞の増殖、マクロファージの活性化、および腫瘍増殖を阻害する様々な機能を有する他の免疫エフェクター細胞、例えば、白血球、マクロファージ、および抗原提示細胞の動員によって、抗腫瘍活性を促進するサイトカイン産生、例えば、炎症性サイトカイン産生を引き起こす。標的ＣＤ１９＋Ｂ細胞は悪性ではない（例えば、正常に循環するＢ細胞である）ため、長期のＣＡＲＴ１９効果ではなく一時的なＣＡＲＴ１９効果が腫瘍微小環境の調節に好ましい場合がある。
ＨＬ患者におけるＣＡＲＴ１９療法の治療効果を調べるための研究は、以下に記載されるように行うことができる（図３）。この研究はまた、ＨＬ対象におけるＣＡＲＴ１９の安全性および忍容性を評価し、ＨＬ腫瘍微小環境におけるＣＡＲＴ１９細胞の効果を決定する。
この研究においては、古典的ＨＬを有する８人の患者が治療される。患者は全ての年齢であるが、小児および成人患者のためにドラッグデリバリーの別々のプロトコールを確立することができる。この研究の患者は、利用可能で潜在的な治癒的治療オプション（例えば、自己（ＡＳＣＴ）または同種異系の幹細胞移植など）がなく、またはこのような治癒的治療オプションには適していない。例えば、患者は、以下のいずれかであり得る：救済化学療法後のＰＥＴ＋、ブレントキシマブによる治療後のＰＥＴ＋、またはブレントキシマブの事前曝露の有無によるＡＳＣＴ後のＰＥＴ＋。患者は、現在利用可能な療法では限られた予後（数カ月から２年以下の期待生存率）を有する。最後に、患者は、抗ＣＤ２０抗体療法を受けていない。患者は、例えば、患者がＣＡＲＴ１９の６回の注入のためにＴ細胞の数が不十分である場合、実施可能性の欠如のために除外される。
ｍＲＮＡ ＣＡＲ１９は、インビトロ転写によって産生される。ＣＡＲ１９ ｍＲＮＡは、ドナーＴ細胞にエレクトロポレートされ、得られた細胞は拡大され、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを伴うインキュベーションにより刺激される。１×１０8～５×１０8個のＲＮＡがエレクトロポレートされＣＡＲ１９ Ｔ細胞を含む用量は、患者に週に３回、２週間（例えば、０、２、４、７、９および１１日目に）送達される。全反応率は、治療後１カ月で臨床、ＣＴ、およびＰＥＴスキャンによって評価される。応答および生存率は、最初の６カ月間毎月モニターされ、次に３カ月ごとに、最初のＣＡＲＴ１９注入（０日目）後２年までモニターされる。モニター技術には、腫瘍またはリンパ節の生検（例えば、免疫組織化学分析および／または遺伝子発現プロファイリングのためのＲＮＡ）およびＣＡＲＴ１９処置の前後のＰＥＴスキャンが含まれる。例えば、ＨＬ腫瘍微小環境におけるＣＡＲＴ１９細胞の効果は、処置前および処置後の約１週間（または細胞表現型の変化を可能にする処置後の適切な時間）の選択された患者からのアクセス可能なリンパ節生検で行われた遺伝子発現プロファイリングの結果を比較することによって分析される。ＣＡＲＴ１９処置の安全性および忍容性を評価するために、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）およびマクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）の頻度を含む有害事象の頻度および重症度が報告される。
化学療法は、ＣＡＲＴ１９処置と同時に投与することができる。ＣＡＲＴ１９の最初の投与に先立って、リンパ穿孔化学療法、例えば、シトキサンを行うことができる。
ＣＬＬ患者の非応答例サブセットは、免疫チェックポイント阻害剤分子の発現増加を示す
この研究において、３４人のＣＬＬ患者由来の臨床製造品からのＣＡＲＴ１９細胞は、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、およびＴＩＭ３などの免疫チェックポイント阻害剤分子の発現について評価された。ＣＡＲＴ１９に対するこのコホートの応答は公知であり、したがって、応答とバイオマーカー発現パターン間の相関を評価することができた。
ＣＡＲＴ療法に対する異なる応答を有するＣＬＬ患者由来の製造されたＣＡＲＴ１９細胞は、フローサイトメトリーで分析され、ＣＡＲおよび免疫チェックポイント阻害剤分子であるＰＤ－１、ＬＡＧ３およびＴＩＭ３の発現を測定した。ＣＡＲＴ１９細胞は、健常ドナー（ＨＤ）（ｎ＝２）；ＣＡＲＴ療法に応答したＣＬＬ患者（ＣＲ）（ｎ＝５）；ＣＡＲＴ療法に部分的に応答したＣＬＬ患者（ＰＲ）（ｎ＝８）；ＣＡＲＴ療法に応答しなかったＣＬＬ患者（ＮＲ）（ｎ＝２１）に由来した。細胞は、当該技術分野において公知であるフローサイトメトリー分析のための標準的な方法に従って、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＡＲ１９分子、ならびに免疫チェックポイント分子であるＰＤ－１、ＬＡＧ３およびＴＩＭ３を特異的に認識する蛍光標識抗体を用いて染色された。例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋などの各マーカーの発現は、フローサイトメトリー分析ソフトウェアにより決定され、さらに、亜集団（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはＣＡＲ１９発現Ｔ細胞）は、免疫チェックポイント分子であるＰＤ－１、ＬＡＧ３、およびＴＩＭ３の発現について分析された。
表面マーカー発現を決定するために使用されるフローサイトメトリープロファイル分析の例を図４Ａおよび４Ｂに示す。ＣＤ４を発現するＴ細胞は、フローサイトメトリーを用いて決定され、さらに、ＣＡＲ１９およびＰＤ－１発現について分析された。この場合、プロファイルのｘ軸は、ＣＡＲ１９発現を示し（左上象限（Ｑ５）および左下象限（Ｑ８）は、ＣＡＲ１９陰性ＣＤ＋細胞を示し、一方で、右上象限（Ｑ６）および右下象限（Ｑ７）は、ＣＡＲ１９を発現するＣＤ４＋細胞を示す）、ｙ軸は、ＰＤ－１発現を示す（左下象限（Ｑ８）および右下象限（Ｑ７）はＰＤ－１陰性ＣＤ４＋細胞を示し、左上象限（Ｑ５）および右上象限（Ｑ６）はＰＤ－１を発現するＣＤ４＋細胞を示す）。ＣＡＲＴ応答例由来のＣＤ４＋集団において、ＣＤ４＋細胞全体の４４．７％がＰＤ－１を発現し、ＣＡＲ１９を発現する細胞の約２２．３％がＰＤ－１陽性であり、一方で、ＣＡＲ１９を発現する細胞の２７．２％がＰＤ－１陰性であった（図４Ａ）。対照的に、非応答例由来のＣＤ４＋集団において、ＣＡＲ１９を発現する細胞全体で有意に減少し（ＣＲ中の４９．５％と比較して約１５．３％）、ＣＡＲ１９を発現する細胞の１４．７％がＰＤ－１陽性であり、一方で、わずか０．６４％がＰＤ－１陰性であった（図４Ｂ）。図４Ａと図４Ｂのプロファイル間の比較は、ＣＡＲＴ応答例（約４４．７％）と比較して、非応答例由来のＣＤ４＋細胞の非常に高いパーセンテージがＰＤ－１（約９２．９％）を発現することを示す。
上記の方法および分析を用いて、ＣＤ４＋集団およびＣＤ８＋集団のＰＤ－１発現（ＰＤ－１＋）細胞のパーセンテージは、各応答例群の各患者について決定された。非応答例は、ＣＡＲ療法に応答したもの（ＣＲ）と比較して、ＣＤ４＋集団（図４Ｃ）とＣＤ８＋（図４Ｄ）集団の両方においてＰＤ－１＋細胞のパーセンテージが高いことが示された；平均ＰＤ－１パーセンテージの増加は、ＣＤ４集団＋とＣＤ８＋集団の両方について統計的に有意であった。部分的応答例（ＰＲ）は、ＣＤ４＋集団（図４Ｃ）とＣＤ８＋（図４Ｄ）の両方の集団において、応答例（ＣＲ）よりもＰＤ－１＋細胞のパーセンテージが高いことを示した。
次に、ＣＡＲ１９を発現するＣＤ４＋集団およびＣＡＲ１９を発現するＣＤ８＋集団のＰＤ－１発現（ＰＤ－１＋）細胞のパーセンテージは、各応答群の各患者について決定された。同様の分析が上記のように行われ、ＣＡＲ１９発現についてのＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞を分析し、ＣＡＲ１９を発現する細胞を同定した後、ＣＡＲ１９を発現する細胞の集団からのＰＤ－１発現を伴う細胞のパーセンテージを決定する追加の工程も行われた。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋集団全体で観察された傾向と同様の傾向が、ＣＡＲ１９を発現するＣＤ４＋およびＣＤ８＋集団について観察された：非応答例は、ＣＡＲ療法に応答した集団（ＣＲ）と比較して、ＣＤ４＋集団（図５Ａ）とＣＤ８＋集団（図５Ｂ）の両方においてＰＤ－１＋細胞のパーセンテージが高いことを示した；平均ＰＤ－１パーセンテージの増加は、ＣＤ４＋集団とＣＤ８＋集団の両方について統計的に有意であった。部分応答例（ＰＲ）は、ＣＤ４＋集団（図５Ａ）とＣＤ８＋集団（図５Ｂ）の両方において、応答例（ＣＲ）よりもＰＤ－１＋細胞のパーセンテージが高いことを示した。
さらなる分析は、ＣＡＲ療法に対する異なる応答を有する患者由来のＰＤ－１、ＬＡＧ３、およびＴＩＭ３を発現する細胞の分布を決定するために行われた。ＣＤ４＋集団におけるＰＤ－１、ＬＡＧ３、およびＴＩＭ３発現の代表的な細胞プロファイル分析を図６に示す。細胞集団は、最初にＣＤ４＋およびＣＤ８＋発現について分析された。次に、ＣＤ４＋集団（またはＣＤ８＋集団、図示せず）は、ＰＤ－１およびＣＡＲ１９発現について分析された（図６、左のプロファイル）。先に記載されたように、非応答例（ＮＲ）は、ＣＡＲＴ応答例（ＣＲ）と比較して、ＰＤ－１＋全体であった細胞の割合が有意に増加した（ＣＲについて４４．７％ＰＤ－１陽性と比較してＮＲについて約９２．９％ＰＤ－１陽性）。さらに、非応答例において、ＣＡＲ１９を発現する細胞は、ほとんどＰＤ－１陽性であった（０．６４％ＰＤ－１陰性およびＣＡＲ＋と比較して１４．７％ＰＤ－１陽性およびＣＡＲ＋）。次に、集団は、ＰＤ－１およびＬＡＧ３の共発現について分析された（図６、中央プロファイル）。ＰＤ－１とＬＡＧ３の両方を発現する細胞は、右上象限（Ｑ２）に示される。非応答例は、ＣＡＲＴ応答例と比較して、免疫チェックポイント阻害剤であるＰＤ－１とＬＡＧ３の両方を発現した細胞のパーセンテージが有意に増加した（７．３１％と比較して６７．３％）。ＰＤ－１発現はまた、ＴＩＭ３発現とともに分析された。図６の右のプロファイルにおいて、ボックスは、ＰＤ－１とＴＩＭ３の両方を表現する細胞を示す。ＰＤ－１およびＬＡＧ３で得られた結果と同様に、非応答例は、ＣＡＲＴ応答例と比較して、免疫チェックポイント阻害剤であるＰＤ－１とＴＩＭ３の両方を発現した細胞のパーセンテージが有意に高かった（２８．３％と比較して８３．３％）。ＰＤ－１を発現する細胞（ＰＤ１＋）、ＰＤ－１およびＬＡＧ３を発現する細胞（ＰＤ１＋ＬＡＧ３＋）、ならびにＰＤ－１およびＴＩＭ３を発現する細胞（ＰＤ１＋ＴＩＭ３＋）のパーセンテージは、上記のようにフローサイトメトリー分析を用いて、各応答群の各患者について決定された。非応答例は、両方の細胞集団について統計的に有意であるＣＡＲＴ応答例と比較して、ＰＤ１＋ＬＡＧ３＋細胞（図７Ａ）およびＰＤ１＋ＴＩＭ３＋細胞（図７Ｂ）のパーセンテージが増加したことが示された。部分応答例はまた、ＣＡＲＴ応答例と比較して、両方の細胞集団の増加した割合を示し、非応答例と比較して平均が減少した。
これらの結果は、ＣＡＲ療法に応答しない患者が、ＣＡＲ療法に応答するかまたは部分的に応答する患者と比較して、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、およびＴＩＭ３）の発現増加を示すことを示す。したがって、これらの結果は、免疫チェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、またはＴＩＭ３の発現を阻害または減少させる薬剤が、免疫チェックポイント経路を介した（例えば、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、またはＴＩＭ３を媒介して）免疫抑制を予防するＣＡＲ療法を受けている患者への投与に有用であり、それによってＣＡＲを発現する細胞の効力を増加させることができる。
高齢者の免疫老化におけるｍＴＯＲ阻害の影響
免疫老化におけるｍＴＯＲ阻害の有効性は、例えば、国際出願第２０１５／０７３６４４号の実施例１に記載され、この出願の全体は参照により本明細書に組み込まれる。
高齢対象におけるワクチンに対する免疫応答の増強
免疫応答の増強におけるｍＴＯＲ阻害の有効性は、例えば、国際出願第２０１５／０７３６４４号の実施例２に記載され、この出願の全体は参照により本明細書に組み込まれる。
低用量ｍＴＯＲ阻害はエネルギーおよび運動を増加させる；
エネルギーおよび運動におけるｍＴＯＲ阻害の効果は、例えば、国際出願第２０１５／０７３６４４号の実施例３に記載され、この出願の全体は参照により本明細書に組み込まれる。
ＲＡＤ００１を用いたＰ７０ Ｓ６キナーゼ阻害
Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ阻害におけるｍＴＯＲ阻害の効果は、例えば、国際出願第２０１５／０７３６４４号の実施例４に記載され、この出願の全体は参照により本明細書に組み込まれる。
外因性ＩＬ－７はＣＡＲ Ｔ細胞の機能を増強する
ＣＡＲ Ｔ細胞の養子移入後、患者の一部は、ＣＡＲ Ｔ細胞の持続性が制限されることを経験し、これは、最適ではないレベルの抗腫瘍活性をもたらし得る。この実施例において、外因性ヒトＩＬ－７の投与の効果は、ＣＡＲＴ細胞に対する初期の最適な応答が観察されたマウス異種移植モデルにおいて評価される。
ＩＬ－７受容体ＣＤ１２７の発現は、最初に、異なる癌細胞株およびＣＡＲを発現する細胞において評価された。２つのマントル細胞リンパ腫細胞株（ＲＬおよびＪｅｋｏ－１）および１つのＢ－ＡＬＬ細胞株（Ｎａｌｍ－６）は、ＣＤ１２７発現についてフローサイトメトリーによって分析された。図９Ａに示されるように、試験された３つの癌細胞株のうちＲＬは、ＣＤ１２７、続いてＪｅｋｏ－１およびＮａｌｍ－６の発現が最も高いことが示された。ＣＡＲＴ１９細胞は、ＮＳＧマウスに注入され、ＣＤ１２７発現は、フローサイトメトリーにより循環ＣＡＲＴ１９細胞において評価された。図９Ｂに示されるように、ＣＤ１２７は、循環する全てのＣＡＲＴ１９細胞において均一に発現される。
次に、ＣＡＲＴ１９細胞の抗腫瘍活性における外因性ＩＬ－７処置の効果は、リンパ腫動物モデルにおいて評価された。ＮＳＧマウスに、０日目（Ｄ０）にルシフェラーゼを発現するマントル細胞株（ＲＬ ｌｕｃ）を生着させ、続いて、６日目にＣＡＲＴ１９細胞の処置を施した。ＮＳＧマウスを群に分け、第一の群はＣＡＲＴ１９細胞を受けず、第二の群は０．５×１０6個のＣＡＲＴ１９細胞を受け、第三の群は１×１０6個のＣＡＲＴ１９細胞を受け、第四の群は２×１０6個のＣＡＲＴ１９細胞を受けた。腫瘍サイズは、８０日を超える生着腫瘍の平均生物発光を測定することによってモニターされた。２×１０6個のＣＡＲＴ１９細胞を受けたマウスのみが、腫瘍の拒絶および腫瘍増殖の阻害を実証した（図１０Ａ）。０．５×１０6個のＣＡＲＴ１９細胞または１×１０6個のＣＡＲＴ１９細胞を受けた２つの群からのマウスは、最適ではない抗腫瘍応答を示した。次に、これらの２つの群のマウスを無作為化した。この場合、３匹のマウス（０．５×１０6個のＣＡＲＴ１９細胞を受けたマウス＃３８２７および＃３８２９、１×１０6個のＣＡＲＴ１９細胞を受けたマウス＃３８１５）は、外因性の組換えヒトＩＬ－７を２００ｎｇ／マウスの用量で腹腔内注射により受け、週に３回、８５日目から開始され、２匹のマウスは腹腔内注射されなかった。平均生物発光によって検出されるように、８５～１２５日目に外因性ＩＬ－７を受けたマウスの腫瘍負荷を図１０Ｂに示す。ＩＬ－７を受けた全てのマウスは、腫瘍負荷において１～３ｌｏｇの減少の劇的な応答を示した。もともと高用量のＣＡＲＴ１９細胞を受けたマウス（１×１０6個のＣＡＲＴ１９細胞を受けたマウス＃３８１５）は、より深遠な応答を示した。ＩＬ－７処置を受けたマウスの腫瘍負荷をＩＬ－７処置の前後で対照と比較すると、腫瘍負荷の腫瘍減少は、ＩＬ－７処置を受けたマウスでのみ見られた（図１０Ｃ）。
また、リンパ腫動物モデルにおけるＩＬ－７処理後のＴ細胞動態について調べた。ヒトＣＡＲＴ１９細胞は、ＩＬ－７処理前に血液中で検出できなかった。ＩＬ－７の処置に際して、処置されたマウスにおいてＴ細胞数は急速に増加したが、可変的な増加であった（図１１Ａ）。ＩＬ－７を受けたマウスにおいて観察されたＴ細胞増殖の程度もまた、腫瘍応答と相関した。ＩＬ－７処置中のピーク拡大時に血液中に検出された最大数のＴ細胞を有するマウス（マウス＃３８１５）は、腫瘍負荷において最も堅牢な減少を示した（図１０Ｂ参照）。さらに、ピークの拡大時間は、ベースラインとして注入されたＴ細胞用量と相関した。血液中のＣＤ３を発現する細胞の数／レベルもまた、ＩＬ－７処置の前後で測定された。対照マウスにおいて、ＣＤ３を発現する細胞はほとんど検出されず、一方で、ＩＬ－７処置されたマウスは、ＩＬ－７処置後にＣＤ３＋細胞の有意な増加を示した（図１１Ｂ）。
併せて、本実施例の結果は、外因性ＩＬ－７処置が、Ｔ細胞増殖および抗腫瘍活性をインビボで増加させることを実証し、これは、ＣＡＲ療法後の最適ではない結果を有する患者におけるＩＬ－７の使用が、これらの患者において抗腫瘍応答を改善することができることを示す。
ＣＤ２２ ＣＡＲの評価
自動化されたＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼ（ＪＮＬ）細胞アッセイ
自動化されたアッセイは、特定のＣＤ２２ ＣＡＲＴクローンの反応性を決定するために行われた。ＮＦＡＴプロモーターからのルシフェラーゼを安定的に発現する、３ｅ4個のレンチウイルス形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞株細胞（ＪＮＬ細胞）は、ＣＤ２２を発現する標的細胞株（Ｄａｕｄｉ、Ｒａｊｉ）、および陰性対照としてＣＤ２２を発現しない細胞株（Ｋ５６２）を用いて９６ウェルプレートに播種された。翌日、ルシフェリン基質を９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、ルシフェラーゼレポーターの相対発光を決定した。このアッセイにおいて、ＣＤ２２ ＣＡＲコンストラクトは、陽性対照として役立つＣＤ１９ ＣＡＲコンストラクトおよびＣＤ２２（ｍ９７１由来）ＣＡＲコンストラクト（ｍ９７１－ＨＬ）と比較された。ｍ９７１－ＨＬのＶＨおよびＶＬ鎖を含むが、逆方向（Ｈ－Ｌの代わりにＬ－Ｈ）を含むｍ９７１－ＬＨ ＣＡＲコンストラクトは、ＣＡＲを含有したが、特異性の欠如のために標的に結合することができず、陰性対照として役立った。ＣＡＲを含まない、非形質導入Ｔ細胞（Ｎｅｇ ｃｎｔ）もまた陰性対照として役立った。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞活性化からのルシフェラーゼ活性をグラフにした。本明細書に提示された結果は、ＣＤ－２２を形質導入したＪＮＬクローンのいくつかが、用量依存的に増加したＣＤ２２を発現する細胞株に対する特異的反応性を示したことを実証する（図１８Ａ～１８Ｃ）。
原発性ヒトＴ細胞におけるＣＤ２２ ＣＡＲの発現
原発性ヒトＴ細胞は、０日目に抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激ビーズを用いて活性化され、続いて１日目に特定のＣＡＲコンストラクトのレンチウイルス形質導入を行った。細胞は１０日目までインビトロで拡大させ、その時点で、ＣＡＲの表面発現についてサイトメトリーにより分析された。２つの異なるアプローチがＣＡＲの表面発現を決定するために利用された：プロテイン－Ｌ－ビオチン、続いてストレプトアビジン－ＰＥ、および組換えヒトＣＤ２２－Ｆｃ、続いて抗Ｆｃ－アレクサフルオロ４８８。結果を図１９に示す。本明細書に提示される結果は、ＣＤ２２ ＣＡＲクローン２（ｈＣＤ２２－２）、クローン５（ｈＣＤ２２－５）、クローン７（ｈＣＤ２２－７）、クローン８（ｈＣＤ２２－８）、クローン１０（ｈＣＤ２２－１０）、クローン１２（ｈＣＤ２２－１２）、クローン３０（ｈＣＤ２２－３０）およびクローン３１（ｈＣＤ２２－３１）が陽性の表面発現を示すことを実証した。ＣＤ２２ ＣＡＲ ｍ９７１は、Ｐｒｏｔｅｉｎ－ＬとｈｒＣＤ２２－Ｆｃの両方に対する結合の陽性対照として役立ち、特異性のないアイソタイプＣＡＲ（抗ｇＨ）は、Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｌに対する陽性対照として役立った。ＣＡＲを発現しないＴ細胞を陰性対照として使用した。
原発性Ｔ細胞腫瘍標的死滅アッセイ
上記のように活性化および形質導入された原発性Ｔ細胞は、示された比でルシフェラーゼを安定に発現する標的細胞株と混合された（図２０Ａ～２０Ｆ）。標的細胞株であるＲａｊｉ、ＳＥＭ、Ｋ５６２－ｈＣＤ２２、ＤａｕｄｉおよびＮａｌｍ６は全て、ＣＤ２２標的を発現したが、一方で、Ｋ５６２細胞株はＣＤ２２を発現せず、陰性対照として役立った（図２０Ａ～２０Ｆ）。本明細書に提示される結果は、いくつかのＣＤ２２ ＣＡＲクローン（例えば、ＣＤ２２ ＣＡＲクローン２、５、７、８、１０、１２、３０および３１）および陽性対照ＣＤ２２ ｍ９７１－ＨＬ ＣＡＲが、用量依存性の標的細胞死滅を示し、死滅の程度は標的細胞型の種類に応じて異なることを実証する。非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）は、標的細胞株を死滅させる能力を欠いていた。
原発性Ｔ細胞サイトカインビーズアレイ
ＣＤ２２を発現するＣＡＲＴ細胞からの炎症促進性サイトカインの放出を誘導するＣＤ２２を発現する細胞株の能力を調べた。炎症促進性サイトカイン濃度は、原発性Ｔ細胞死滅アッセイから採取された試料について、サイトカインビーズアレイキットを用いて決定された。インターフェロン－ｇ（ＩＦＮ－ｇ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａ）およびインターロイキン２（ＩＬ－２）は全て、２．５対１のＥ対Ｔ比および１０対１のＥ対Ｔ比の試料について測定された。結果を図２１Ａ～図２１Ｆに示す。本明細書に提示される結果は、複数のＣＤ２２ ＣＡＲクローンが、ｍ９７１－ＬＨ ＣＡＲ（陰性対照）または非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）よりも有意に多くのＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦａおよびＩＬ－２を誘導し、サイトカイン誘導レベルが標的細胞型によって異なることを実証する。
ＣＤ２２ ＣＡＲＴ処置の用量漸増研究
第１相臨床試験は、以前にＣＡＲＴ療法を受けていたかまたは以前に受けていないＡＬＬ対象において、ＣＤ１９ ＣＡＲＴの有無によるＣＤ２２ ＣＡＲＴの最適用量を決定するために実施される。この研究の目的は、確立された放出基準を満たす、抗ＣＤ２２ ＣＡＲ遺伝子操作されたＴ細胞の生成の実施可能性を決定し、シクロホスファミド／フルダラビンリンパ球枯渇レジメンに従って、Ｂ細胞悪性腫瘍を有する小児および若年成人における自己の抗ＣＤ２２ ＣＡＲ遺伝子操作されたＴ細胞の漸増用量の投与の安全性を評価することである。
対象は、１歳から３０歳までの年齢であり、体重が少なくとも１５ｋｇであり、ＣＤ２２＋ＡＬＬを有するものである。疾患活性は、骨髄分析またはＦＤＧ－ＰＥＴによって測定可能である。最小限の残存疾患活性を有する対象は許容される。中枢神経系（ＣＮＳ）の状態が１または２である対象は許容される。対象は、十分な臓器機能および十分なＣＤ３カウントを有していなければならない。
拡張コホートを用いた第１相用量漸増試験が実施される。対象は、ＣＡＲＴ療法を以前に受けていたかまたは受けていないかによって層別化される。対象には、３×１０5細胞／ｋｇ体重、１×１０6細胞／ｋｇ体重、３×１０6細胞／ｋｇ体重、および１×１０7細胞／ｋｇ体重の４種類の用量の自己抗ＣＤ２２ ＣＡＲ遺伝子操作されたＴ細胞の４つの用量レベルの１つが与えられる。３×１０6細胞／ｋｇ体重の用量を受ける対象のサブセットはまた、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子操作されたＴ細胞が投与される。各用量レベルの最初の２人の患者は１６歳以上である。
適格性が決定された後、アフェレーシスを実施してＴ細胞を単離する。その後、対象は分取化学療法を受ける。対象は、２５ｍｇ／ｍ2のフルダラビンを用いて３日間、毎日処置され、９００ｍｇ／ｍ2のシクロホスファミドの単回用量を与えられる。次に、抗ＣＤ２２ ＣＡＲ遺伝子操作されたＴ細胞を投与し、２８日後に応答および毒性を評価する。
Ｂ細胞悪性腫瘍を治療するためのＣＤ２０標的化キメラ抗原受容体（ＣＡＲＳ）の利用
Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼ（ＪＮＬ）細胞アッセイは、特定のＣＤ２０ ＣＡＲＴクローンの反応性を決定するために行われた。ＮＦＡＴプロモーター由来のルシフェラーゼを安定して発現するＪｕｒｋａｔ細胞（ＪＮＬ細胞）は、図１５Ａ～図１５Ｃに示されるＣＡＲコンストラクトを用いてレンチウイルスにより形質導入された。ＣＡＲを発現するＪＮＬ細胞（３ｅ４）は、０．５対１、１対１、２対１および４対１のエフェクター細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で、ＣＤ２０を発現する標的細胞株Ｄａｕｄｉ（図１５Ａ）およびＲａｊｉ（図１５Ｂ）、ならびにＣＤ２０を発現しない陰性対照Ｋ５６２（図１５Ｃ）と混合された。レンチウイルスで形質導入されたＪＮＬ細胞は、ＣＤ２０を発現する標的細胞株（Ｄａｕｄｉ、Ｒａｊｉ）、および陰性対照としてＣＤ２０を発現しない細胞株（Ｋ５６２）とともに９６ウェルプレートに播種された。翌日、ルシフェリン基質を９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、ルシフェラーゼレポーター（Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞活性化由来）の相対発光を決定した。このアッセイにおいて、ＣＤ２０ ＣＡＲコンストラクトは、陽性対象として役立つＣＤ１９ ＣＡＲコンストラクト、およびHaso et al., Blood, 14 Feb 2013, Vol. 121, No. 7に記載されるＣＤ２２（ｍ９７１由来）ＣＡＲコンストラクトと比較された。ＣＡＲを含むが、特異性の欠如のために標的に結合することができないアイソタイプＣＡＲ、およびＣＡＲを含まない非形質導入Ｔ細胞（Ｎｅｇ ｃｎｔ）は陰性対照として役立った。結果を図１５Ａ～１５Ｃに示す。ＣＤ２０を形質導入したＪＮＬクローンのいくつかは、用量依存的に増加するＣＤ２０を発現する細胞株に対して特異的反応性を示した。
Ｂ細胞急性リンパ球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）におけるＣＤ１９ ＣＡＲＴ療法に対する対象の再発を予測する因子の同定
本実施例は、とりわけ、本発明に従って使用するための、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）におけるＣＤ１９ ＣＡＲＴ療法（例えば、ＣＴＬ０１９療法）に対する患者の再発を予測する新規な転写遺伝子シグネチャーの同定を記載する。
とりわけ、本実施例は、ＣＤ１９ ＣＡＲＴ処置前の患者（例えば、ＣＴＬ０１９）（アフェレーシスまたは骨髄）、または再注入前の製造されたＣＤ１９ ＣＡＲＴ産物試料（例えば、ＣＴＬ０１９）における選択された遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルに基づく新規な遺伝子シグネチャーを記載する。一実施形態において、本実施例は、Ｂ－ＡＬＬにおけるＣＴＬ０１９療法に対する再発例とＢ－ＡＬＬにおけるＣＴＬ０１９療法に対する非再発例を区別する新規な遺伝子シグネチャーを記載する。
本実施例は、本発明による使用のための、Ｂ－ＡＬＬにおけるＣＤ１９ ＣＡＲＴ療法（例えば、ＣＴＬ０１９）に対する対象の再発を予測する新規な遺伝子サインを発見するための偏りのない特徴選択の方法を記載する。
本実施例はまた、本発明に従って使用するための新規遺伝子シグネチャーを発見するための遺伝子セット分析の方法を記載する。
Ｂ細胞急性リンパ球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）におけるＣＤ１９ ＣＡＲＴ療法に対する対象の再発を予測する、再輸注前の製造されたＣＤ１９ ＣＡＲＴ製造試料におけるｍＲＮＡ発現レベルに基づく新規な遺伝子シグネチャーが同定された。同定されたシグネチャーは、７つのＢ－ＡＬＬ対象試料を含む製造された製造物試料の全ゲノムＲＮＡｓｅｑ研究において発見された。Ｂ－ＡＬＬ対象試料（全７つ）は以下のように層別化された：生物学的試料は、ＣＴＬ０１９療法後に再発しなかった４人の対象（「非再発例」）およびＣＴＬ０１９治療後に再発した３人の対象（「再発例」）から採取された。製造された製造物試料における、応答例と非応答例、および再発例と非再発例を区別するいくつかの遺伝子シグネチャーが発見され、以下においてさらに詳細に記載される。
次に、新規な遺伝子シグネチャーは、様々なデータ解析アプローチ：１）不偏な特徴選択；２）遺伝子セット分析；および３）目的とする選択された遺伝子の差次的発現分析を用いて発見された。
不偏の特徴選択に由来する新規な遺伝子シグネチャーは、３人の再発例と４人の非再発例比較した再発例と非再発例の２群比較の間にどの遺伝子が差次的に発現しているかを決定することにより発見された。遺伝子は、その差異発現が、０．２５のＦＤＲ ｐ値カットオフを有する２群比較において統計学的に有意であった場合、差別的に発現されると定義された。再発例対非再発例比較（Ｎ＝１７）の遺伝子リストを表２９に一覧にする。２群統計モデルを適用して、メタ遺伝子が群間で統計的に異なるかどうかを判定し、そのアプローチを例証する概模式図を図２に示す。図３２は、ＣＬＬを有する、完全応答例（ＣＲ）、部分応答例（ＰＲ）および非応答例（ＮＲ）について、活性化されたＴEFF対休止ＴEFF細胞において上方調節された遺伝子の例示的ヒートマップを示す。
特定の理論に縛られることを望むものではないが、これらのデータは、ＣＤ１９ ＣＡＲＴ製造物（例えば、ＣＴＬ０１９）におけるＴ細胞の分化状態が、対象応答（すなわち、ＣＲ、ＰＲ、またはＮＲ）と相関し、Ｂ－ＡＬＬにおけるＣＤ１９ ＣＡＲＴ療法（例えば、ＣＴＬ０１９療法）に対して対象の再発を予測することを示す。完全な応答例の遺伝子シグネチャーは、ＴREGおよびＴEFF細胞の休止によく類似する。とりわけ、再発例（例えば、ＣＴＬ０１９療法に対して再発する完全応答例）の遺伝子シグネチャーは、休息時にＴREF細胞対ＴEFF細胞において上方調節された遺伝子を含む。特定の理論に縛られることを望むものではないが、これらのデータは、Ｂ－ＡＬＬにおけるＣＡＲＴ療法（例えば、ＣＴＬ０１９）に対する再発例が、ＣＡＲＴ療法に対する非再発例（例えば、ＣＴＬ０１９）と比較して、ＴREGのレベルが高いことを示す。図１７は、ＴREGが、再発例（Ｒ）対非再発例において差次的に富化され、例えば、再発例が、完全応答例（ＣＲ）（例えば、非再発例）と比較して高レベルのＴREG遺伝子を発現することを例証する例示的な結果を記載する。
Figure 0007227331000294
以下の遺伝子：ＭＩＲ１９９Ａ１、ＭＩＲ１２０３、ｕｃ０２１ｏｖｐ、ＩＴＭ２Ｃ、およびＨＬＡ－ＤＱＢ１は、再発例においてレベルの増加および非再発例においてレベルの減少を示した。以下の遺伝子：ＰＰＡＬ４Ｄ、ＴＴＴＹ１０、ＴＸＬＮＧ２Ｐ、ＭＩＲ４６５０－１、ＫＤＭ５Ｄ、ＵＳＰ９Ｙ、ＰＲＫＹ、ＲＰＳ４Ｙ２、ＲＰＳ４Ｙ１、ＮＣＲＮＡ００１８５、ＳＵＬＴ１Ｅ１、およびＥＩＦ１ＡＹは、再発例においてレベルの減少および非再発例においてレベルの増加を示した。
遺伝子セット分析は、Ｂ－ＡＬＬにおけるＣＴＬ０１９療法に対する対象の再発を予測する多数の遺伝子シグネチャーを提供した。
とりわけ、本実施例は、Ｂ－ＡＬＬにおけるＣＤ１９ ＣＡＲＴ療法（例えば、ＣＴＬ０１９）に対する患者（patent）の再発を予測する、遺伝子セット分析に基づく新規な遺伝子シグネチャーを記載する。遺伝子セット分析は、３つの遺伝子セットに基づいて行われた。すなわち、遺伝子セットは、（１）追加の実験が、Ｓｚａｂｏらによる未公開の実験（以下に記載）に基づく；（２）Genome Research 2005においてＡｂｂａｓらによって公開された遺伝子セット；および（３）Nature Medicine 2011においてＧａｔｔｉｎｏｎｉらによって公開された遺伝子セットから供給された。遺伝子セットは、Ｓｚａｂｏ、Ａｂｂｓ、およびＧａｔｔｉｎｏｎｉによって定義され、米国仮特許出願第６２／０６１５５３号の実施例１に記載されるこの分析において考慮された。
Ｓｚａｂｏコア遺伝子セットは、Ｔｅｆｆ細胞（１６時間ｖ０時間）において上方調節される以下の遺伝子：ＡＩＭ２、ＡＬＡＳ１、Ｂ４ＧＡＬＴ５、ＢＡＴＦ、Ｃ３ｏｒｆ２６、Ｃ４ｏｒｆ４３、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＴ３、ＣＣＴ７、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＨＡＣ２、ＣＳＦ２、ＣＴＮＮＡ１、ＥＢＮＡ１ＢＰ２、ＥＤＡＲＡＤＤ、ＥＥＦ１Ｅ１、ＥＩＦ２Ｂ３、ＥＩＦ２Ｓ１、ＦＡＢＰ５、ＦＡＭ４０Ｂ、ＦＫＢＰ４、ＦＯＳＬ１、ＧＦＯＤ１、ＧＬＲＸ２、ＨＳＰＤ１、ＨＳＰＥ１、ＩＦＮＧ、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ２１、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ３、ＫＣＮＫ５、ＫＩＡＡ００２０、ＬＡＲＰ４、ＬＲＰ８、ＬＴＡ、ＭＡＮＦ、ＭＩＲ１１８２、ＭＩＲ１５５、ＭＩＲ１５５ＨＧ、ＭＴＣＨ２、ＭＹＯＦ、ＮＤＵＦＡＦ１、ＮＬＮ、ＮＭＥ１、ＮＭＥ１－ＮＭＥ２、ＯＴＵＤ７Ｂ、ＰＡＭ、ＰＤＩＡ６、ＰＥＡ１５、ＰＦＫＭ、ＰＧＡＭ１、ＰＧＡＭ４、ＰＰＩＬ１、ＰＲＤＸ４、ＰＲＳＳ２３、ＰＳＭＤ１、ＰＳＭＤ１１、ＰＳＭＤ１４、ＰＴＲＨ２、ＰＵＳ７、ＲＢＢＰ８、ＲＰＦ２、ＲＰＰ２５、ＳＦＸＮ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＬＣ３９Ａ１４、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＯＲＤ、ＳＰＲ、ＳＲＸＮ１、ＳＴＩＰ１、ＳＴＴ３Ａ、ＴＢＸ２１、ＴＭＣＣ２、ＴＭＥＭ１６５、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＸＮ、ＴＸＮＤＣ５、ＵＣＫ２、ＶＤＲ、ＷＤＲ１２、ＹＷＨＡＧ、およびＺＤＨＨＣ１６を含む。また、Ｓｚａｂｏコア遺伝子セットは、Ｔｒｅｇ細胞（１６時間ｖ０時間）において上方調節される以下の遺伝子：ＡＩＭ２、ＡＬＡＳ１、ＢＡＴＦ、Ｃ５ｏｒｆ３２、ＣＣＬ１７、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＨＡＣ２、ＣＳＦ１、ＣＴＳＬ１、ＥＢＮＡ１ＢＰ２、ＥＤＡＲＡＤＤ、ＥＭＰ１、ＥＰＡＳ１、ＦＡＢＰ５、ＦＡＭ４０Ｂ、ＦＫＢＰ４、ＦＯＳＬ１、ＧＣＬＭ、ＧＫ、ＧＰＲ５６、ＨＭＯＸ１、ＨＳＰＤ１、ＨＳＰＥ１、ＩＫＢＩＰ、ＩＬ１０、ＩＬ１３、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１ＲＮ、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ９、ＫＣＮＫ５、ＬＴＡ、ＭＡＮＦ、ＭＩＲ１１８２、ＭＩＲ１５５、ＭＩＲ１５５ＨＧ、ＭＹＯＦ、ＮＤＵＦＡＦ１、ＮＬＮ、ＮＭＥ１、ＮＭＥ１－ＮＭＥ２、ＰＡＮＸ２、ＰＤＩＡ６、ＰＧＡＭ４、ＰＰＩＬ１、ＰＰＰＤＥ２、ＰＲＤＸ４、ＰＲＫＡＲ１Ｂ、ＰＳＭＤ１、ＰＳＭＤ１１、ＰＵＳ７、ＲＢＢＰ８、ＳＬＣ２７Ａ２、ＳＬＣ３９Ａ１４、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＲＸＮ１、ＳＴＩＰ１、ＳＴＴ３Ａ、ＴＢＸ２１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＸＮ、ＵＣＫ２、ＶＤＲ、ＶＴＲＮＡ１－３、ＷＤＲ１２、ＹＷＨＡＧ、ＺＤＨＨＣ１６、およびＺＮＦ２８２を含む。
各遺伝子セット（例えば、Ｓｚａｂｏ遺伝子セット、Ａｂｂａｓ遺伝子セット、およびＧａｔｔｉｎｏｎｉ遺伝子セット）を評価して、以下の方法において対象応答（すなわち、再発例または非再発例）との関連性を決定した：メタ遺伝子は各対象について計算され、ここで、対象ｊについてのメタ遺伝子スコアは、以下のように定義された。
Figure 0007227331000295
 式中、ｘijは、所与の遺伝子セットｎ＝１、．．．、Ｇについて対象ｊにおける遺伝子ｉの発現値であり、；μ（ｘ．j）は、対象ｊにおける遺伝子１、．．．、Ｇの平均であり；σ（ｘ．j）は、対象ｊにおける遺伝子１、．．．、Ｇの標準偏差である。
２群統計モデルを各遺伝子セットに適用して、メタ遺伝子が、再発例と非再発例の製造されたＣＴＬ０１９製造物間で統計的に異なるかどうかを決定した。このアプローチを示す模式図を図１６に示す。Ｓｚａｂｏ、Ａｂｂａｓ、およびＧａｔｔｉｎｏｎｉ遺伝子セットのうち、再発例と非再発例の間に有意に差次的に富化された１つの遺伝子セットがあった。この遺伝子セットは、Ｓｚａｂｏ回収に由来し、休止時にＴREF細胞対ＴEFF細胞において上方調節された遺伝子を含み、ＣＴＬ０１９療法に対する患者の再発と相関した。具体的には、この遺伝子セットは、再発例において富化されることが見出され、再発例は、非再発例と比較してより高いレベルのＴREGSを有することが示された。例えば、ＴEFF細胞と比較してＴREGにおいて上方調節された遺伝子を含む遺伝子セットのメタ遺伝子スコアは、製造物試料における患者の再発と相関することが見出された（図１７参照）。図１７は、ＴREG遺伝子が、非再発例の完全応答例（ＣＲ）と比較して、再発例（Ｒ）において高い発現レベルを有することを示す例示的な結果を記載する（ｐ＝０．０００２１５）。ｘ軸は、応答例群による試料であり、この場合、ＣＲ＝完全応答例であり、Ｒ＝再発例である。ｙ軸は、標準化されたメタ遺伝子発現スコアである。
特定の理論に縛られることを望むものではないが、これらのデータは、アフェレーシスに先立って、またはＣＡＲＴ製造物の製造中に患者におけるＴREGシグネチャーを減少させることが、患者の再発のリスクを有意に減少させることを示す。
挿入突然変異は、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）におけるＣＴＬ０１９治療に対する耐性の機構である
いくつかの耐性機構は、ベースライン時および再発後に採取されたＢ－ＡＬＬ患者試料由来のｍＲＮＡ配列決定データを比較することによって発見された。ある種の耐性機構は「ＣＤ１９－再発」と呼ばれ、すなわち、患者の腫瘍細胞は、フローサイトメトリーによって測定された、ＣＴＬ０１９において使用されるＦＭＣ６３エピトープに結合しないため、ＣＤ１９－として特徴付けられる。いくつかの耐性機構が発見されており、本実施例において詳細に記載される。
ｍＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）は、ＣＴＬ０１９処置前および再発後のＢ－ＡＬＬ患者の転写プロファイルを比較するために行われた。再発時にＣＤ１９－であった１人の患者（患者＃２９）、および再発時にＣＤ１９＋であった２人の患者（患者＃１０４および＃１０５）の３人の患者が考慮された。患者のリスト、それらの分類、および両方の時点での白血病のパーセンテージについては、以下の表３０を参照されたい。
Figure 0007227331000296
ＣＤ１９遺伝子のＲＮＡｓｅｑデータの分析は、いくつかの注目すべき観察結果を示した。
３つの挿入がＣＤ１９のエキソン２に見出された。挿入は、患者＃２９の再発試料においてのみ見出された。３つの挿入のいずれか、またはＣＤ１９のエキソン２における他の挿入を支持する読み取りは、他の２人の患者においておよび患者＃２９のベースライン時に観察されなかった。ゲノムの位置および実際の挿入を以下の表３１に示す。
Figure 0007227331000297
３つの挿入の長さは、それぞれ１、１、および４塩基長であり、全てのフレームシフト挿入である可能性が高い。３つ全ての挿入は、エキソン２内の早期終止コドンを生じる（挿入１および２については、新しい終止コドンはｃｈ１６：２８９４３７５２で起こり、挿入３については、ｃｈ１６：２８９４３８８７で起こる）。以下の表３２は、挿入および野生型、ならびに関連するパーセンテージを支持する読み取りの数を列挙する。最も一般的な挿入は「挿入３」であり、これは４塩基の挿入であり、約３０％生じる。さらに、１を超える挿入にまたがる１５対の読み取りのうち、対になった読み取りのいずれも１を超える挿入を含んでおらず、これは、挿入が相互に排他的であることを示唆している。
Figure 0007227331000298
この表において、「試料」は、ベースライン試料については「Ｂ」、または再発時に採取される試料については「Ｒ」が続く患者番号を列挙する。Ｉｎｓ１と表示された列は、Ｉｎｓ１（左の番号）対その位置での野生型配列（右の番号）を示す読み取りの数を示す；Ｉｎｓ２と表示された列は、Ｉｎｓ２（左の番号）対その位置での野生型配列（右の番号）を示す読み取りの数を示す；Ｉｎｓ３と表示された列は、Ｉｎｓ３（左の番号）対その位置での野生型配列（右の番号）を示す読み取りの数を示す。この表は、患者２９のみがこれら３つの挿入を示し、挿入は再発時にのみ観察されたことを示す。これらの結果は、ＣＤ１９のエキソン２における挿入が一部の患者において耐性をもたらすことを示唆している。
この研究は、Ｂ－ＡＬＬにおけるＣＴＬ０１９療法に対する耐性機構、すなわち、腫瘍細胞がＣＤ１９－になり、ＣＤＬ０１９治療に耐性となるＣＤ１９のエキソン２における挿入であることを同定した。この観察は、ＣＤ１９以外の標的、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ２２、およびＲＯＲ１に対するＣＡＲとのＣＴＬ０１９組合せ戦略のための支持を提供する。
再発したＡＬＬ癌患者におけるＢ細胞抗原の発現
種々のＢ細胞抗原の発現は、以前にＣＡＲ療法以外の癌療法で治療された、すなわち、いずれものＣＡＲ療法で治療されていなかった、再発性急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）癌患者において測定された。
方法
試料は、同定されていない原発性ヒトＡＬＬ骨髄（ＢＭ）および末梢血（ＰＢ）標本として得られた。抗ヒト抗体は、Ａｂｃａｍ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、またはＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから購入された。単核細胞はフィコール分離により単離され、２％ウシ胎仔血清が補充されたＰＢＳで１回洗浄され、室温で１５分間染色された。細胞数定量のために、Ｃｏｕｎｔｂｒｉｇｈｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ビーズを製造者の指示に従って使用した。全ての分析において、目的とする集団に順方向対側方散乱特性、続くシングレットゲーティングに基づいてゲートをかけ、生存細胞にＬｉｖｅ Ｄｅａｄ Ａｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてゲートをかけた。品質管理のためにタイムゲーティングが含まれた。動物研究のために、マウス抗ＣＤ４５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）は、マウス白血球をゲートアウトするために添加された。ＣＤ２２の表面発現は、クローンＨＩＢ２２由来の抗ＣＤ２２モノクローナル抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて染色することにより検出された。ＣＤ１２３の表面発現は、クローン６Ｈ６由来の抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて染色することにより検出された。ＦＬＴ３の表面発現は、クローンＩＭ２２３４Ｕ由来の抗ＦＬＴ３モノクローナル抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて染色することにより検出された。ＲＯＲ１の表面発現は、クローン２Ｈ６由来の抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）を用いて染色することにより検出された。ＣＤ７９ｂの表面発現は、クローンＣＢ３－１由来の抗ＣＤ７９ｂモノクローナル抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて染色することによって検出された。ＣＤ７９ａの表面発現は、クローンＨＭ４７の抗ＣＤ７９ａモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて染色することにより検出された。ＣＤ１０の表面発現は、クローンｅＢｉｏＣＶ－ＣＡＬＬＡ由来の抗ＣＤ１０モノクローナル抗体（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて染色することにより検出された。ＣＤ３４の表面発現は、クローン５６１の抗ＣＤ３４モノクローナル抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて染色することにより検出された。ＣＤ２０の表面発現は、クローンＬ２７由来の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて染色することにより検出された。抗体結合能（ＡＢＣ）単位における細胞抗原発現の定量は、標準的手順（http://static.abdserotec.com/uploads/ifu/fcsc815b.pdf）に従って、Ｑｕａｎｔｕｍ（商標）Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒ（登録商標）（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂ．，Ｉｎｃ）を用いて行われた。フローサイトメトリーは、４レーザーＦｏｒｔｅｓｓａ－ＬＳＲサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行われ、ＦｌｏｗＪｏ Ｘ １０．０．７ｒ２（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を用いて分析された。
結果
再発したＡＬＬ患者において、いくつかのＢ細胞抗原が発現され、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＣＤ１０、およびＣＤ３４が含まれる。図２２を参照されたい。
潜在的な追加のＢ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）標的を同定するために、１６ｒ／ｒ患者由来の試料は、以下のマーカー：ＣＤ１９（１６ｐｔｓ）、ＣＤ２２（１６ｐｔｓ）、ＣＤ１２３（１６ｐｔｓ）、ＦＬＴ－３（９ｐｔｓ）、ＲＯＲ－１（３ｐｔｓ）、ＣＤ７９ｂ（１５ｐｔｓ）、ＣＤ１７９ｂ（８ｐｔｓ）、ＣＤ７９ａ（１６ｐｔｓ）、ＣＤ１０（１６ｐｔｓ）、ＣＤ３４（１６ｐｔｓ）、およびＣＤ２０（１６ｐｔｓ）について多様性フローサイトメトリーによりスクリーニングされた。ＣＤ２２およびＣＤ１２３は、ｒ／ｒ ＡＬＬ患者の芽球において高く（＞６０％）および均一に発現された（バーは発現％中央値を示し、それぞれ９９．５０％、９８．８０％、９５．７０％、７２．００％、４７．００％、１５．００％、１３．４５％、４．２００％、９８．００％、８７．６５％および７．００％）（図２２）。
再発したＣＤ１９陰性癌患者におけるＢ細胞抗原の発現
様々なＢ細胞抗原の発現は、以前にＣＤ１９ ＣＡＲで治療され、ＣＤ１９陰性腫瘍で再発した患者において測定された。実施例１４の方法に従ってフローサイトメトリーを使用して、抗原の発現を決定し、図２３に示されるゲーティング戦略を用いた。
ＣＤ２２およびＣＤ１２３の発現は、ＣＡＲＴ１９処置前（ベースライン）および処置後（ＣＤ１９陰性再発）の両方で、ＣＤ１９陰性白血病で再発した６人の患者由来のＢＭおよびＰＢ試料において分析された。全ての分析において、目的とする集団に順方向対側方散乱特性、続くシングレットゲーティングに基づいてゲートをかけ、生存細胞にＬｉｖｅ Ｄｅａｄ Ａｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてゲートをかけた。品質管理のためにタイムゲーティングが含まれた。ゲーティング戦略には、タイムゲーティング→ＳＳＣ低→シングレット→生存→ＣＤ４５ｄｉｍ→ＣＤ１０＋を含んだ。
結果
ＣＤ１９陰性になったほとんど全ての患者は、ＣＤ２２陽性とＣＤ１２３陽性の両方のままであった。図２４および図２５を参照されたい。結果は、図２６に要約され、ＣＤ１９ ＣＡＲＴ処理はＣＤ１９発現の喪失を生じるが（フローサイトメトリーによって測定される）、ＣＤ２２およびＣＤ１２３の発現は高いままであることを実証する。
難治性Ｂ細胞悪性腫瘍における自己ＣＤ２２転嫁されたＣＡＲＴ細胞による拡大されたアクセス治療
再発／難治性（ｒ／ｒ）Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）は、小児および成人患者両方の予後不良と関連している。抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲＴ１９、ＣＴＬ０１９）または二重特異性抗ＣＤ１９／ＣＤ３抗体（ブリナツモマブ）などの白血病性芽球に関するＣＤ１９を標的とする新規療法は、この集団において有意な応答を誘発する。しかしながら、ＣＤ１９陰性の再発は、ＣＡＲＴ１９またはブリナツモマブ療法後の患者の５～１０％で報告されている。
方法
細胞株および原発性試料
ＡＬＬ細胞株であるＮＡＬＭ－６の細胞は、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン、およびストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ培地を用いて培養液中に維持された。いくつかの実験について、ＮＡＬＭ－６細胞は、ルシフェラーゼ／ＧＦＰ＋を形質導入され、次に選別して＞９９％の陽性集団を得た。急性骨髄性白血病細胞株であるＭＯＬＭ－１４またはＫ５６２およびＴ－ＡＬＬ細胞株であるＪＵＲＫＡＴは、ＣＤ２２陰性対照として使用された。
同定されなかった原発性ヒトＡＬＬ骨髄（ＢＭ）および末梢血（ＰＢ）標本、ならびにＣＡＲＴ－１９療法後に再発した２人の患者由来のＢＭおよびＰＢ試料を得た。ＣＡＲＴ－１９で処置され、ＣＤ１９陰性白血病で再発した患者由来の全ての芽球は、ベースライン（ＩＲ８２、ＣＡＲＴ１９療法前）および再発（ＩＲ２４３）で収集された。これら２つの時点からの原発性芽球は、ＮＳＧマウスにおいてインビボで拡大させ、いくつかの継代後にルシフェラーゼ／ＧＦＰで形質導入された（Barrett, D et al. (2011) Blood 118(15):e112-117）。全ての機能的研究について、ＡＬＬ細胞は、分析の少なくとも１２時間前に解凍され、３７℃で静置された。
ＣＡＲコンストラクトおよびＣＡＲ Ｔ細胞の生成
ＣＤ２２に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、抗ＣＤ２２完全ヒトモノクローナル抗体ｍ９７１（Xiao, X et al. (2009) MAbs. 1(3):297-303）の生成について記載する米国特許出願第２０１１／００２０３４４ Ａ１号に記載される抗ＣＤ２２一本鎖可変断片軽鎖（Ｌ）および重鎖（Ｈ）鎖配列を用いて生成した。配列はコドン最適化され、２つの異なるＣＡＲコンストラクトは、２つの異なる可変鎖配向（ＨからＬおよびＬからＨ）を使用して生成された。次に、これらの２つの抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖは、マウスＣＡＲ１９骨格（ＣＤ８ヒンジ、４１ＢＢ共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータシグナリングドメイン）にクローニングされ、続いてｐＴＲＰＥレンチウイルスベクターにクローニングされた。マウスＣＡＲ１９は、以前に記載されたように生成させた（Milone, M et al. (2009) Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 17(8):1453-1464）。
ＣＡＲ陽性Ｔ細胞の生成は、以前に記載されたように行われた（Gill, S et al. (2014) Blood 123(15):2343-2354）。正常なドナーＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞は、１対１のＣＤ４対ＣＤ８の比で１ｅ６／ｍｌの濃度にて播種され、培養１日目で添加され、６日目で除去される、Ｘ－ｖｉｖｏ １５培地（Ｌｏｎｚａ、０４－４１８Ｑ）、ヒト血清ＡＢ５％（Ｇｅｍｉｎｉ、１００－５１２）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、１５０７００６３）およびＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、３５０５００６１）中で、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１１６１Ｄ）を用いて拡大された。Ｔ細胞は、２日目にトランスフェクションされたＣＡＲ２２、ＣＡＲ１９または模造物のいずれかを保有するレンチウイルスを用いて形質導入された。Ｔ細胞は、１０～１５日間、培養液中で拡大され、細胞容量の中央値が３００ｆｌ以下になったときに回収された。次に、Ｔ細胞は、将来の実験のためにＦＢＳ１０％ＤＭＳＯ中で凍結保存された。全ての実験前に、Ｔ細胞を解凍し、３７℃で一晩静置した。
多様性フローサイトメトリー分析
抗ヒト抗体は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、またはＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから購入した。細胞は、インビトロ培養からまたは動物から単離され、２％ウシ胎仔血清が補充されたＰＢＳで１回洗浄され、室温で１５分間染色された。細胞数定量のために、Ｃｏｕｎｔｂｒｉｇｈｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ビーズを製造者の指示に従って使用した。全ての分析において、目的とする集団に順方向対側方散乱特性、続くシングレットゲーティングに基づいてゲートをかけ、生存細胞にＬｉｖｅ Ｄｅａｄ Ａｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてゲートをかけた。品質管理のためにタイムゲーティングが含まれた。動物研究のために、マウス抗ＣＤ４５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）は、マウス白血球をゲートアウトするために添加された。抗ＣＤ２２ ＣＡＲの表面発現は、ＣＤ２２－Ｈｉｓタンパク質（１１９５８－Ｈ０８Ｈ－５０）および抗Ｈｉｓ－ＡＰＣモノクローナル抗体（ＩＣ０５０Ａ）を用いて染色することにより検出された。ＣＡＲ１９は、以前に記載されたように検出された（Kalos, M et al. (2011) Science translational medicine 3(95):95ra73）。抗体結合能（ＡＢＣ）単位におけるＣＤ１９およびＣＤ２２細胞抗原発現の定量は、標準的手順（http://static.abdserotec.com/uploads/ifu/fcsc815b.pdf）に従って、Ｑｕａｎｔｕｍ（商標）Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒ（登録商標）（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂ．，Ｉｎｃ）を用いて、ＮＡＬＭ－６および対照について行われた。フローサイトメトリーは、４レーザーＦｏｒｔｅｓｓａ－ＬＳＲサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行われ、ＦｌｏｗＪｏ Ｘ １０．０．７ｒ２（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を用いて分析された。
脱顆粒化アッセイ
脱顆粒化アッセイは、以前に記載されたように行われた。Ｔ細胞は、Ｔ細胞培地中で１対５の比で標的細胞とともにインキュベートされた。抗ＣＤ１０７ａ－ＰＥＣＹ７（Ｂｉｏｌｅｎｇｅｎｄ）、抗ＣＤ２８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ４９ｄ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体およびモネンシン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、開始時間の３０分後に共培養に添加された。４時間後、細胞を回収し、ＣＡＲ発現、ＣＤ３、ＣＤ８、およびＬｉｖｅ Ｄｅａｄ Ａｑｕａ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）について染色された。細胞を固定し、透過性にし（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ緩衝液）、次に細胞内染色を行い、複数のサイトカイン（ＩＦＮ、ＴＮＦａ、ＩＬ－２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＭＩＰ１ｂ）を検出した。
増殖アッセイ
Ｔ細胞を洗浄し、１００μｌのＰＢＳ中に１×１０7／ｍｌで再懸濁し、１００μｌのＣＦＳＥ ２．５μＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて５分間、３７℃で染色した。次に、反応を冷培地で停止させ、細胞を３回洗浄した。標的は、１００Ｇｙの線量で照射された。Ｔ細胞は、照射された標的細胞とともに１対１の比で１２０時間インキュベートされ、２４時間で培地を添加した。次に、細胞を回収し、ＣＤ３、ＣＡＲおよびＬｉｖｅ Ｄｅａｄ Ａｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）について染色し、Ｃｏｕｎｔｂｒｉｇｈｔビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、絶対定量のためにフローサイトメトリー分析の前に添加した。
細胞毒性アッセイ
ルシフェラーゼ／ＧＦＰ＋ＮＡＬＭ－６細胞または原発性ＡＬＬ試料は、以前に記載されたように細胞毒性アッセイのために使用された。４つの標的は、示された比でエフェクターＴ細胞とともに４時間または１６時間インキュベートされた。死滅は、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ－２００ Ｓｐｅｃｔｒｕｍカメラによる生物発光イメージングまたはフローサイトメトリーのいずれかによって計算された。後者について、細胞を回収し、Ｃｏｕｎｔｂｒｉｇｈｔビーズおよび７－ＡＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を分析前に添加した。残存した標的生細胞は、ＣＦＳＥ陽性の７－ＡＡＤ陰性であった。
サイトカイン測定
エフェクター細胞および標的細胞は、Ｔ細胞培地中で１対１の比で２４時間、同時インキュベートされた。上清を回収し、製造業者のプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、３０－プレックスＬｕｍｉｎｅｘアレイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ、ＦＬＥＸＭＡＰ ３Ｄ）により分析された（Kalos, M et al. (2011)）。
インビボ実験
ＮＯＤ－ＳＣＩＤ－γ鎖－／－（ＮＳＧ）マウスを得た。全ての実験は、ペンシルベニア大学の施設動物管理および使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコールで行われた。利用された異種移植モデルの概説は、結果セクションで詳細に論じられる。示された濃度の２００μｌのＰＢＳ中の細胞（ＮＡＬＭ－６またはＴ細胞）がマウスの尾静脈に注射された。生物発光イメージングは、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ－２００ Ｓｐｅｃｔｒｕｍカメラを使用して実施され、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅソフトウェアｖ４．３．１（Ｃａｌｉｐｅｒ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析された。動物は、ＩＡＣＵＣの方針に従って、実験終了時または必要に応じて安楽死させた。
免疫組織化学
２８個のヒト正常組織（脂肪、副腎、虫垂、小脳、子宮頸部、結腸、子宮内膜、食道、脂肪、心臓、腎臓、肝臓、リンパ節、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、胎盤、前立腺、唾液、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、扁桃）の組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）は、ＣＤ２２の腫瘍外（off-tumor）発現を評価するために実施された（三連）。ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織の免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色は、Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いてＬｅｉｃａ Ｂｏｎｄ－ＩＩＩ機器で行われた。ＣＤ２２に対する抗体（クローンＦＰＣ１；Ｌｅｉｃａ ＰＡ０２４９）は、希釈せずに使用した。熱誘導エピトープ回収は、ＥＲ２溶液（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＲ９６４０）を用いて２０分間行われた。画像は、Ａｐｅｒｉｏ ＳｃａｎＳｃｏｐｅ（商標）を使用してデジタルで取得された。
遺伝子発現プロファイリング
公的に入手可能なＲＮＡ発現データベース（ＧｅｎｅＡｔｌａｓ Ｕ１３３Ａ、ｇｃ）は、ＣＤ２２発現のためのＢｉｏＧＰＳ．ｏｒｇウェブサイトを用いて分析された。中央値ＣＤ２２ ＲＮＡ発現は、７５種の異なるヒト正常細胞型および７つの腫瘍細胞株について報告された（図３９参照）。
５１－クロム放出アッセイ
可能性のある腫瘍外ＣＡＲＴ２２毒性について評価するために、正常なヒト組織（ＣＤ３４＋、ヒトニューロン、ヒトニューロン前駆細胞、ケラチノサイト）および対照としてのＫ５６２またはＮＡＬＭ－６を標的としてクロム放出アッセイを行った。標的細胞は、５１Ｃｒ ５０μＣｉ／０．５ｅ６細胞とともに１～２時間、３７℃でインキュベートされた。細胞を洗浄し、異なるＥ対Ｔ比でエフェクター細胞とともに３連で播種した。４時間のインキュベーション後、各ウェルからのアリコートをリーダープレートに入れ、一晩乾燥させた。翌日、クロム放出は、１４５０マイクロベータプラス液体シンチレーションカウンターを用いて定量された。
結果
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潜在的なＢ－ＡＬＬ標的を同定するために、ＣＡＲＴ１９療法による治療後に１６人のｒ／ｒ患者およびＣＤ１９陰性疾患で再発した４人の患者由来の試料は、Ｂ細胞マーカーＣＤ２２について多様性フローサイトメトリーによってスクリーニングされた。ＣＤ２２は、１１／１５ｒ／ｒ ＡＬＬ患者の芽球において高く（＞６０％）および均一に発現された（図２７Ａ）。ＣＤ２２はまた、ＣＡＲＴ１９処置前（ベースライン）と後（ＣＤ１９陰性再発）（２ｐｔｓ示される）の両方において、ＣＤ１９陰性白血病で再発した４人中４人の患者において陽性であった（図２７Ｂ）。（ゲーティング戦略：ＳＳＣ低→シングレット→生存→ＣＤ４５ｄｉｍ）。
異なる鎖配向（ＨからＬおよびＬからＨ）を用いて生成されたＣＡＲ２２コンストラクトの概要を図２８Ａに示す。抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖ（ｍ９７１）をコドン最適化し、ＣＤ８ヒンジ、４１－ＢＢ共刺激およびＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含有するマウスＣＡＲ１９ベクターにクローニングした。ＮＡＬＭ６ ＡＬＬ細胞株におけるＣＤ１９、ＣＤ２２およびアイソタイプ対照の発現は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）（図２８Ｂ）および抗体結合能（ＡＢＣ）として示される（図２８Ｃ）。本明細書に提示される結果は、ＮＡＬＭ－６細胞において、ＣＤ１９の発現がＣＤ２２よりも高いことを実証する。しかしながら、ほとんどの原発性ＡＬＬ試料において、ＣＤ１９およびＣＤ２２の発現は類似している（図２８Ａ参照）。
ＣＡＲＴ２２およびＣＡＲＴ１９（非形質導入細胞（ＵＴＤ）とともに）を生成するための正常なドナーＴ細胞の増殖を行った。集団倍加時間およびＴ細胞容量は、培養日数に対して測定された。増殖の終了時（培養１１日目）に、ＣＡＲＴ２２および対照のＴ細胞は、約４．５の集団倍加（ＰＤ）に達し、ＣＡＲＴ１９またはＵＴＤ細胞との比較で有意差はなかった（図２９Ａ）。培養６日目に、ピーク容量は約４５０ｆｌであったが、後日、容量は、細胞が回収され、凍結されたときに３００ｆｌまで低下した（図２９Ｂ）。ＣＡＲＴ１９またはＵＴＤと比較して、有意差は観察されなかった。ＣＤ４陽性およびＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現は、増殖の１１日目にフローサイトメトリーにより観察された（図２９Ｃ）。ＣＡＲ発現についてのゲーティングは、ＵＴＤに基づいている。（ゲーティング戦略：ＦＳＳ対ＳＳＣリンパ球→シングレット→生存→ＣＤ３＋）。
細胞質内サイトカイン産生によるＣＤ１０７ａ脱顆粒アッセイを行った。ＣＡＲＴ１９、ＣＡＲＴ２２ ＨｔｏＬおよびＬｔｏＨは、異なる標的（単独、ＰＭＡ／イオノマイシン、ＭＯＬＭ－１４およびＮＡＬＭ－６）とともに共培養された。ＣＡＲＴ１９およびＣＡＲＴ２２ ＨｔｏＬは、ＡＬＬ細胞株（ＮＡＬＭ－６）と共培養した場合であり、陰性対照と共培養しなかった場合は、高レベルのＣＤ１０７ａ脱顆粒、ＩＬ－２、ＩＦＮｇおよびＴＮＦａ産生を示した（図３０）。ＵＴＤおよびＣＡＲＴ２２ ＬｔｏＨは、脱顆粒およびサイトカイン産生を示さない（図３０）。（ゲーティング戦略：ＦＳＳ対ＳＳＣリンパ球→シングレット→生存→ＣＤ３＋）。
ルシフェラーゼに基づく死滅アッセイにおいて、２４時間、共培養した場合、ＵＴＤではなく、ＣＡＲＴ２２およびＣＡＲＴ１９ ＨｔｏＬは、ＮＵＴＭ－６細胞を溶解することができた（図３１）。細胞毒性活性とＥ対Ｔ比の間の直接相関が観察され、２対１のＥ対Ｔ比でより良好な抗白血病効果であった（ＣＡＲＴ１９およびＣＡＲＴ２２について７８％および７５％の死滅）。
ＣＦＳＥに基づく増殖アッセイにおいて、ＡＬＬ細胞株であるＮＡＬＭ－６とのＣＡＲＴ２２およびＣＡＲＴ１９の５日間の共培養は、有意なＴ細胞増殖（それぞれ９４％および９２．９％）をもたらした。対照もまた示される（ＴＣＭ＝培地単独、Ｐ－Ｉ＝ＰＭＡ／イオノマイシン、ＭＯＬＭ－１４）（図３２Ａ）。ＣＡＲＴ１９およびＣＡＲＴ２２におけるＣＦＳＥ希釈の動態を示すヒストグラムは、ほとんどのＴ細胞が複数の増殖サイクルを経たことを実証する（図３２Ｂ）。（ゲーティング戦略：ＦＳＳ対ＳＳＣリンパ球→シングレット→生存→ＣＤ３＋）
ＣＡＲＴ２２、ＣＡＲＴ１９およびＵＴＤ細胞は、異なる照射標的（単独、ＰＭＡ／イオノマイシン、ＭＯＬＭ－１４およびＮＡＬＭ－６）とともに２４時間インキュベートされた。ＡＬＬ細胞株であるＮＡＬＭ－６とともに共培養した場合、ＣＡＲＴ２２およびＣＡＲＴ１９ ＨｔｏＬのみが、複数のサイトカイン（ここではＩＦＮｇ、ＩＬ－２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦａおよびＭＩＰ１ｂを示す）を放出することができた（図３３）。
ＣＡＲＴ２２、ＣＡＲＴ１９およびＵＴＤ細胞は、ベースライン時、および患者がＣＤ１９陰性疾患で再発した場合にはＣＡＲＴ１９処置後に、ＡＬＬ患者由来の芽球（ＣＨＰ－９５９－１０１）とともに４時間、同時インキュベートされた。脱顆粒を測定した。ＣＡＲＴ１９とＣＡＲＴ２２はともに、ベースライン時（芽細胞がＣＤ１９＋およびＣＤ２２＋である）に脱顆粒することができたが、再発時にはＣＡＲＴ２２のみが脱顆粒された（疾患がＣＤ１９陰性の場合）（図３４Ａ）。ＣＤ１０７ａ脱顆粒は、再発時にＣＨＰ１０１試料を伴うインキュベーション後に、ＣＤ８陽性およびＣＤ８陰性ＣＡＲＴ１９およびＣＡＲＴ２２エフェクターにおいて測定された。ＣＡＲＴ２２のみが、ＣＤ８とＣＤ４ Ｔ細胞の両方で脱顆粒を示した（図３４Ｂ）。（ゲーティング戦略：ＦＳＳ対ＳＳＣリンパ球→シングレット→生存→ＣＤ３＋）。
ＮＡＬＭ－６に対するインビボＣＡＲＴ２２の有効性は、以下のように評価された：１００万個のＮＡＬＭ－６ルシフェラーゼ＋細胞／マウスをｉ．ｖ．でＮＳＧマウスに注射した。６日後、腫瘍の生着を生物発光によって評価した。次に、マウスは、無作為化され、非形質導入Ｔ細胞または異なる用量のＣＡＲＴ２２（７５％ＣＡＲ発現で１．２５～５００万の総細胞／マウス）を受けた。その後、マウスは、腫瘍負荷、ＰＢ Ｔ細胞増殖、および生存についてモニターされた（図３５Ａ）。生物発光（ＢＬＩ）による腫瘍負荷を測定し、用量関連の抗白血病応答が観察された。５ｅ６個のＣＡＲＴ２２細胞を受けたマウスは、より良好な腫瘍制御を示した（図３５Ｂ）。ＣＡＲＴ２２処置されたマウスは、ＵＴＤ処置されたマウスと比較して、統計的に有意に良好な全生存期間（ＯＳ）を示した。ＯＳについても、より高い用量のＣＡＲＴ２２とより良好なＯＳの間に有意な相関があった（図３５Ｃ）。Ｔ細胞のインビボ増殖は、眼窩後出血により毎週モニターされた。Ｔ細胞注入の１週間後、高用量のＣＡＲＴ２２を受けたマウスは、より良好なＣＡＲＴ増殖（１２Ｔ細胞／μｌの中央値）を示した（図３５Ｄ）。
ＮＡＬＭ－６に対するＣＡＲＴ２２とＣＡＲＴ１９間のインビボ比較を、以下のように評価した：１００万個のＮＡＬＭ－６ルシフェラーゼ＋細胞／マウスをＮＳＧマウスに静脈内注射した。６日後、腫瘍の生着を生物発光によって評価した。次に、マウスは、無作為化され、非形質導入Ｔ細胞、ＣＡＲＴ１９またはＣＡＲＴ２２（５００万の全細胞、７５％のＣＡＲ発現）を受けた。その後、マウスは、腫瘍負荷、ＰＢ Ｔ細胞増殖、および生存についてモニターされた（図３６Ａ）。生物発光（ＢＬＩ）による腫瘍負荷は測定され、抗白血病応答は、ＣＡＲＴ２２とＣＡＲＴ１９で処置されたマウスの両方において観察されたが、一方で、ＵＴＤマウスは急速に進行した（図３６Ｂ）。ＣＡＲＴ１９で処置されたマウスは、おそらくＮＡＬＭ－６（ＣＤ１９＞＞ＣＤ２２）における異なる標的発現のために、ＣＡＲＴ２２と比較してより良好な全生存（ＯＳ）を示した（図３６Ｃ）。
ＣＡＲＴ２２およびＣＡＲＴ１９は、原発性ＡＬＬのモデルにおいてインビボで比較された。初回ＡＬＬ患者の芽球（ＪＨ３３１）をインビボで継代し、ルシフェラーゼで形質導入して腫瘍負荷を追跡した。１００万個のＪＨ３３１ルシフェラーゼ＋細胞／マウスをＮＳＧマウスにｉ．ｖ．で注射した。１４日後、腫瘍生着を生物発光によって評価した。次に、マウスは、無作為化され、非形質導入Ｔ細胞、ＣＡＲＴ１９またはＣＡＲＴ２２（５００万の全細胞、７５％のＣＡＲ発現）を受けた。その後、マウスは、腫瘍負荷、ＰＢ Ｔ細胞増殖、および生存についてモニターされた（図３７Ａ）。生物発光（ＢＬＩ）による腫瘍負荷は測定され、抗白血病応答は、ＣＡＲＴ２２とＣＡＲＴ１９で処置されたマウスの両方において観察されたが、一方で、ＵＴＤ細胞で処置されたマウスは急速に進行した（図３７Ｂ）。
ＣＤ２２発現のための組織マイクロアレイは、免疫組織化学染色により２８個のヒト正常組織について行われた。リンパ器官は、ＣＤ２２発現に対して陽性であった（扁桃、リンパ節、脾臓および胸腺）（図３８Ａ）。全ての非リンパ様器官は、ＣＤ２２の発現を示さなかった（図３８Ｂ）。ＣＤ２２陽性の常在性Ｂ細胞は、複数の組織において観察された（図３８Ｃ）。
ＣＤ２２ ＲＮＡ発現は、ＧｅｎｅＡｔｌａｓ Ｕ１３３Ａからの発現データに示されるように、Ｂ細胞、扁桃およびリンパ節において高レベルで観察された。Ｂリンパ芽球および白血病／リンパ腫細胞株はまた高い陽性であった（図３９）。
ＵＴＤ細胞ではなく、ＣＡＲＴ２２とＣＡＲＴ１９の両方は、ＣＡＲＴ２２毒性についての５１クロム放出アッセイにおいて、ＡＬＬ細胞株であるＮＡＬＭ－６の溶解を誘発した（図４０）。ＣＡＲＴ２２の細胞毒性効果は、正常組織（ＣＤ３４＋、ヒトニューロン前駆体またはニューロンおよびケラチノサイト）または対照（Ｋ５６２細胞株）においては観察されなかった。
抗原欠損再発の治療および予防のための抗ＣＤ１２３および抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の組合せ
化学療法抵抗性または再発性（ｒ／ｒ）Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）は予後不良と関連するが、最近示されたように、免疫系に高い感受性のままである。特に、抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲＴ１９、ＣＴＬ０１９）および二重特異性抗ＣＤ１９／ＣＤ３抗体（ブリナツモマブ）は、この患者集団において４５～９０％の前例のない完全応答率を生じる。両方のアプローチは、自己Ｔ細胞を、ＣＤ１９発現細胞を認識するように再誘導する。ブリナツモマブは、抗ＣＤ１９一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）と抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを組み合わせた二重特異性コンストラクトの連続的な長期注入を使用する；ＣＡＲＴ１９の場合には、Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体に融合した抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖを発現し、組み込みの共刺激ドメインを用いてシグナル伝達するように遺伝子改変される。最近の研究は、ＣＴＬ０１９で処置されたｒ／ｒ Ｂ－ＡＬＬ患者の９０％が完全寛解（ＣＲ）に達し、６カ月で７８％が全生存期間（ＯＳ）であることが示された。ＣＡＲＴ１９による有望な結果はまた、慢性リンパ球性白血病および非ホジキンリンパ腫などの他のＢ細胞新生物を有する患者において得られた。
しかしながら、ＣＡＲＴ１９またはブリナツモマブを用いて処置された患者の一部は再発を起こし、これらの再発のかなりの部分がＣＤ１９の喪失によって特徴付けられる。Ｂ－ＡＬＬにおいて、ＣＤ１９陰性の再発は、ＣＡＲＴ１９またはブリナツモマブ療法後の患者の１０～２０％で報告されており、他の治療法の設定においては報告されていない；ブリナツモマブ後の全体で約３０％の再発、およびＣＡＲＴ１９後の最大５０％の再発はＣＤ１９陰性である。ＣＤ１９は、成熟Ｂ細胞へのＢ細胞発生の非常に初期の段階から発現されるプロトタイプのＢ細胞マーカーである。ＣＤ１９欠損Ｂ細胞は選択的増殖の欠点を示すため、ＣＤ１９はＢ細胞生物学において重要な役割を果たす。したがって、ＣＤ１９の欠如は、Ｂ－ＡＬＬにおいて非常に独特な所見であり、強力なＣＤ１９指向性免疫療法の時期以前にごく稀な患者において報告されている。抗原喪失の可能性のある機構は現在調査中であり、これら強力な抗ＣＤ１９薬剤による白血病サブクローンにおける選択圧によって引き起こされる可能性が最も高い。ブリナツモマブのＦＤＡによる最近の承認とＣＴＬ０１９によるブレークスルー状態のため、ｒ／ｒ Ｂ－ＡＬＬを有する増加する患者がこれらの薬剤を用いて治療される可能性が高い。したがって、ＣＡＲＴ１９またはブリナツモマブ後にＣＤ１９陰性の芽球により再発する患者を治療できるようにするために、新規の有効な戦略が必要である。理想的には、新たなアプローチは、活性な抗原喪失の再発を有する患者を治療するだけでなく、先験的に使用される場合、それらの発生を潜在的に防止することができる。
インターロイキン－３受容体アルファ（またはＣＤ１２３）は、造血に関与し、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、形質細胞様樹状細胞新生物、ヘアリー細胞白血病、ホジキンリンパ腫を含むいくつかの血液学的新生物において発現されることが示されている。ＣＤ３３（骨髄系）またはＣＤ１９（Ｂリンパ系）などの系統関連の表面抗原とは異なり、ＣＤ１２３は、造血前駆細胞およびＡＭＬについて階層的に発現される。ＣＤ１２３は、初期治療後の化学療法および再発に対する耐性に関与する白血病幹細胞において発現される。これらの特徴により、ＣＤ１２３は、標的療法に大きな関心を示しており、ＩＬ３－ジフテリア毒素融合タンパク質（ＳＬ－４０１、ＤＴ３８８ＩＬ３）、裸の抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体（ＣＳＬ－３６０、ＣＳＬ－３６２）、抗体－薬物コンジュゲート、二重特異性抗体またはＣＤ３Ｆｖ－ＩＬ３融合コンストラクト、およびより最近では、抗ＣＤ１２３キメラ抗原受容体Ｔ細胞などの複数の薬剤が開発されつつある。これらのアプローチのいくつかは、現在、臨床試験で検証されており、今後数年間でさらに多くが臨床において試験される。キメラ抗原レセプターＴ細胞（ＣＡＲＴ１２３）を用いてＣＤ１２３を標的化することは、ヒト原発性ＡＭＬ異種移植において深度および長期の応答をもたらし、抗白血病Ｔ細胞メモリーを確立することができる。ここで、ＣＤ１２３は、ＣＤ１９指向性療法後に生じるＣＤ１９陰性のＢ－ＡＬＬ再発において発現され、ＣＡＲＴ１９（ＣＴＬ０１９）と併用されるＣＡＲ－１２３Ｔ細胞は、Ｂ－ＡＬＬ異種移植片における抗原喪失再発の治療および予防のための有効な療法である。
材料および方法
細胞株および原発性試料。細胞株は、もともとＡＴＣＣ（バージニア州マナッサス）（Ｋ－５６２）またはＤＳＭＺ（ブラウンシュヴァイク、ドイツ）（ＭＯＬＭ－１４およびＮＡＬＭ－６）から得られた。全ての細胞株は、マイコプラズマ汚染の存在について試験された（ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（商標）Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＬＴ０７－３１８、Ｌｏｎｚａ、バーゼル、スイス）。いくつかの実験について、細胞株をホタルルシフェラーゼ／ｅＧＦＰを用いて形質導入し、次に、選別して、＞９９％の陽性集団を得た。ルシフェラーゼ陽性Ｋ－５６２細胞株はまた、切断型ＣＤ１９または切断型ＣＤ１２３を用いて形質導入され、それらのいずれも発現しない細胞株、ＣＤ１９のみまたはＣＤ１２３のみを得た。ＭＯＬＭ－１４およびＫ５６２は、関連する図に示されるように対照として使用された。細胞株は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｇｅｍｉｎｉ、１００－１０６、Ｗｅｓｔ Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）と５０ＵＩ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１５０７０－０６３）が補充されたＲＰＭＩ培地１６４０（Ｇｉｂｃｏ、１１８７５－０８５、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を含む培養液中に維持された。同定されていない原発性ヒトＡＬＬ骨髄（ＢＭ）および末梢血（ＰＢ）標本は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）プロトコールの下でペンシルベニア大学／フィラデルフィア小児病院の臨床実践から得られ、ペンシルベニア大学の幹細胞および異種移植片コアから購入されたか、または現在のＣＴＬ０１９臨床試験（ペンシルベニア大学の翻訳および相関試験研究所）の研究試料から購入された。全ての機能的研究について、初代細胞は、実験の少なくとも１２時間前に解凍され、３７℃で静置させた。
原発性Ｂ－ＡＬＬ芽球のインビボでの増殖。D. M. Barrett, A. E. Seif, C. Carpenito, D. T. Teachey, J. D. Fish, C. H. June, S. A. Grupp, G. S. Reid, Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia: a strategy for preclinical modeling. Blood 118, e112-117 (2011)に開示されている方法。
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および免疫組織化学。ＦＩＳＨ分析および免疫組織化学は、記述されているように標準的な方法に従って行われた。（M. A. Belaud-Rotureau, M. Parrens, P. Dubus, J. C. Garroste, A. de Mascarel, J. P. Merlio, A comparative analysis of FISH, RT-PCR, PCR, and immunohistochemistry for the diagnosis of mantle cell lymphomas. Modern pathology : an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc 15, 517-525 (2002)）。ＦＩＳＨ分析は、標準的な方法に従って行われた。簡単には、回収されたＡＬＬ細胞を固定液（酢酸およびメタノール）に懸濁させ、スライド上に沈着させ、乾燥させた。二色遺伝子融合プローブＢＣＲ／ＡＢＬ（Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）をハイブリダイゼーション緩衝溶液に適用した。スライドをカバーガラスに載せ、密封し、ＨＹＢｒｉｔｅチャンバー内に３７℃で６時間放置した。密封剤およびカバーガラスを除去した後、スライドを２回洗浄し、ブロットし、乾燥させ、ＤＡＰＩで対比染色した。スライドを蛍光顕微鏡下で検査し、各標本において最小２００核を評価した。
ＣＡＲコンストラクトおよびＣＡＲ Ｔ細胞の作製。マウス抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＤ８ヒンジ、４－１ＢＢ共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータシグナリングドメイン）を以前に記載されたように作製した。（Milone, et al., Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 17, 1453-1464 (2009) and Imai, et al., Leukemia 18, 676-684 (2004)）。これは、ペンシルベニア大学のＣＴＬ０１９臨床試験において現在使用されているものと同じコンストラクトである。ＣＡＲ１２３について、ｓｃＦｖ抗ＣＤ１２３（１１７２コンストラクト（配列番号７０７、および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０１７３２８号に記載されている）を使用し、これはＣＡＲ１９と同じ骨格のコンストラクトである。ＣＡＲを発現するＴ細胞の生成は、以前に記載されたように行われた。（Gill, et al., Blood 123, 2343-2354 (2014)）。正常ドナーであるＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞またはＰＢ単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ペンシルベニア大学のヒト免疫学コアから得た。Ｔ細胞は、１対１のＣＤ４対ＣＤ８比で１×１０6／ｍｌにて播種され、培養１日目に添加され、６日目に除去される抗ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１１６１Ｄ）を用いて、ヒトＡＢ血清５％（Ｇｅｍｉｎｉ、１００－５１２）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、１５０７００６３）およびＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、３５０５００６１）が補充されたＸ－ｖｉｖｏ １５培地（Ｌｏｎｚａ、０４－４１８Ｑ）中で増殖させた。Ｔ細胞は、２日目にレンチウイルスを用いて形質導入された。Ｔ細胞は、培養液中で８～１５日間増殖され、細胞容量の中央値が３００ｆｌを下回ったときに回収された。次に、Ｔ細胞は、将来の実験のために、１０％ＤＭＳＯを含むＦＢＳ中で凍結保存された。全ての実験前に、Ｔ細胞を解凍し、３７℃で一晩放置した。
多様性フローサイトメトリー。フローサイトメトリーは、以前に記載されたように行われた（Kenderian, et al., Leukemia, (2015)）。抗ヒト抗体は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、またはＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから購入された。細胞は、インビトロ培養または動物から単離され、２％ウシ胎仔血清が補充されたＰＢＳで１回洗浄され、１５分間、室温で染色された。細胞数の定量について、Ｃｏｕｎｔｂｒｉｇｈｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ビーズを製造者の指示に従って使用した。全ての分析において、目的とする集団に順方向対側方散乱特性、続くシングレットゲーティングに基づいてゲートをかけ、生存細胞は、Ｌｉｖｅ Ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてゲートをかけた。品質管理のためにタイムゲーティングが含まれた。ＣＡＲ１９の表面発現は、抗イディオタイプ抗体を用いて、以前に記載されたようにして検出された。ＣＡＲ１２３の検出は、ヤギ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）またはＣＤ１２３－Ｆｃ／Ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）および抗Ｈｉｓ－ＡＰＣ（Ｒ＆Ｄ）またはＰＥ（ＡｂＣａｍ）を用いて行われた。フローサイトメトリーは、４レーザーＦｏｒｔｅｓｓａ－ＬＳＲサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行われ、ＦｌｏｗＪｏ Ｘ １０．０．７ｒ２（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を用いて分析された。
インビトロＴ細胞エフェクター機能アッセイ。脱顆粒、ＣＦＳＥ増殖、細胞毒性アッセイおよびサイトカイン測定は、以前に記載されたように行われた。（Gill, et al., Blood 123, 2343-2354 (2014) and Kalos, et al., Science translational medicine 3, 95ra73 (2011)）。
脱顆粒アッセイ。略述すると、Ｔ細胞は、Ｔ細胞培地中で１対５の比で標的細胞とともにインキュベートされた。抗ＣＤ１０７ａ－ＰＥＣＹ７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ２８抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ４９ｄ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびモネンシン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を共培養物に添加した。４時間後、細胞を回収し、ＣＡＲ発現、ＣＤ３、ＣＤ８およびＬｉｖｅ Ｄｅａｄ Ａｑｕａ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）について染色した。細胞を固定し、透過性にし（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ緩衝液）、次に細胞内染色を行い、複数のサイトカイン（ＩＦＮ、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＭＩＰ１β）を検出した。
増殖アッセイ。Ｔ細胞を洗浄し、１００μｌのＰＢＳ中に１×１０7／ｍｌで再懸濁し、１００μｌのＣＦＳＥ２．５μＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて５分間、３７℃で染色した。次に、反応を冷培地で停止させ、細胞を３回洗浄した。標的は、１００Ｇｙの線量で照射された。Ｔ細胞は、照射された標的細胞とともに１対１の比で１２０時間インキュベートされ、２４時間で培地を添加した。次に、細胞を回収し、ＣＤ３、ＣＡＲおよびＬｉｖｅ Ｄｅａｄ Ａｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）について染色し、Ｃｏｕｎｔｂｒｉｇｈｔビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、絶対定量のためにフローサイトメトリー分析の前に添加した。
細胞毒性アッセイ。ルシフェラーゼ／ｅＧＦＰ細胞株は、以前に記載されたように細胞毒性アッセイのために使用された。略述すると、標的は、示された比でエフェクターＴ細胞とともに２４時間インキュベートされた。死滅は、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ－２００ Ｓｐｅｃｔｒｕｍカメラによる生物発光イメージングによって計算された。
サイトカイン測定。エフェクター細胞および標的細胞は、Ｔ細胞培地中で１対１の比で２４時間、同時インキュベートされた。上清を回収し、製造業者のプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、３０－プレックスＬｕｍｉｎｅｘアレイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ、ＦＬＥＸＭＡＰ ３Ｄ）により分析された。
動物実験。インビボ実験は、以前に記載されたように行われた。（Kenderian, et al., Leukemia, (2015)）。利用される異種移植片モデルのスキームは、関連する図、結果において詳述されている。もともとはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られたＮＯＤ－ＳＣＩＤ－γ鎖－／－（ＮＳＧ）は、ペンシルベニア大学の幹細胞および異種移植片コアから購入された。全ての実験は、実験動物のケアおよび使用についてのＮＩＨガイドに従う施設動物管理および使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコール（＃８０３２３０）に従って行われた。示された濃度の２００μｌのＰＢＳ中の細胞（白血病細胞株またはＴ細胞）がマウスの尾静脈に注射された。生物発光イメージングは、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ－２００ Ｓｐｅｃｔｒｕｍカメラを使用して実施され、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅソフトウェアｖ４．３．１（Ｃａｌｉｐｅｒ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析された。動物は、ＩＡＣＵＣプロトコールに従って、実験終了時またはあらかじめ指定されたエンドポイントを満たしたときに安楽死させた。
多光子顕微鏡法。マウスを麻酔し、３７℃の中心温度に維持した。頭皮を除去し、頭蓋骨を固定した後、骨髄を画像化した。イメージングは、ピコ秒レーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）を備えたＬｅｉｃａ ＳＰ５ ２光子顕微鏡システム（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行われた。各々のイメージング取得は、２０分間続き、その後、マウス鎮静の評価を行った。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ、ＧＦＰ、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｏｒａｎｇｅ（またはＴＲＩＴＣ）を８５０ｎｍのレーザー光で励起した。画像は、２０倍の水浸レンズを使用して得られた。得られた画像は、Ｖｏｌｏｃｉｔｙソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて分析された。
統計分析。全ての統計は、Ｗｉｎｄｏｗｓ用のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６、バージョン６．０４（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて指示通りに行われた。スチューデントｔ検定を用いて、２つの群を比較した；複数の群を比較した分析においては、複数比較のためにＨｏｌｍ－Ｓｉｄａ補正を用いて、一方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行った。複数の時点／比で複数の群を比較した場合、各時点／比についてスチューデントｔ検定またはＡＮＯＶＡを用いた。生存曲線を、対数ランク検定を用いて比較した。図中、アスタリスクを使用して、ｐ値（*＝＜０．０５、**＝＜０．０１、***＝＜０．００１、****＝＜０．０００１）を表し、「ｎｓ」は「有意でない」ことを意味する（ｐ＞０．０５）。各実験の統計の詳細は、図の凡例に列挙される。
結果
ＣＤ１２３は、Ｂ－ＡＬＬ、白血病幹細胞およびＣＤ１９陰性再発において発現される
Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病においてＣＤ１２３の発現を評価するために、本発明者らの現在のＣＴＬ０１９臨床試験に登録された１４人の対象を含む成人および小児のＡＬＬ患者由来の４２試料を分析した。図４９Ａ、４９Ｂおよび４９Ａに示されるように、ＣＤ１２３は、ほとんどのＡＬＬ芽球の表面上に高く、および均一に発現され、標的療法のための理想的な候補を示す。さらに、ＣＤ１２３はまた、ＣＤ３４＋ＣＤ３８－として同定された推定の白血病幹細胞（ＬＳＣ）において発現されることが見出される（図４９Ｃ）。ＣＤ１９陰性芽球の小さなサブセットが、一部のＢ－ＡＬＬ患者において同定され得、悪性表現型の細胞を含む場合、これらの細胞は抗原喪失再発に寄与する可能性がある。ＣＤ１９陰性サブセットにおける疾患の存在を評価するために、フィラデルフィア染色体陽性Ｂ－ＡＬＬバルク集団由来のＣＤ１９－ＣＤ１２３＋細胞を選別した（ＣＤ４５ｄｉｍ、図５６Ｂに示すゲーティング戦略）。これらの細胞は、ＣＤ１９＋芽球よりも低い頻度であるにもかかわらず、ＢＣＲ－ＡＢＬ転座のクローンであることが見出された（図４９Ｄ）。この知見は、ＣＤ１９単独を標的とすることが、場合によっては、ＣＤ１９－ＣＤ１２３＋細胞に由来するサブクローン性再発をもたらし得ることを示す。さらに、この知見は、ＣＤ１２３を標的とすることが、ＬＳＣおよび場合によってはＣＤ１９陰性白血病クローンの排除により、より深い応答を導くことができることを示唆している。
最後に、ＣＤ１２３の発現はまた、ＣＤ１９の喪失を伴うＣＴＬ０１９後に再発するＢ－ＡＬＬ患者の試料において評価された。重要なことに、ＣＤ１９の完全な喪失とは対照的に、大部分の患者は、再発時にＣＤ１２３発現を維持した（図４９Ｅ、４９Ｆおよび５６Ｃ）。これらの知見は、ＣＤ１２３が、ＣＡＲＴ１９またはブリナツモマブ後に起こるＣＤ１９陰性ＡＬＬ芽球を標的とするための理想的なマーカーであることを示している。
抗ＣＤ１２３キメラ抗原受容体Ｔ細胞は、インビトロおよびインビボにおけるヒトＢ－ＡＬＬに対して活性である
レンチウイルスを用いて形質導入され、抗ＣＤ３／ＣＤ２８磁性ビーズとともに拡大させた抗ＣＤ１２３キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲＴ１２３）を作製した。Ｂ急性リンパ芽球性白血病に対するＣＡＲＴ１２３のインビトロおよびインビボ活性を本明細書に記載されるように評価した。
ＣＤ１９＋＋およびＣＤ１２３＋であるＢ－ＡＬＬ細胞株ＮＡＬＭ－６（図５０Ａおよび５７Ａ）および原発性Ｂ－ＡＬＬ試料を使用した。ＣＡＲＴ１２３とＣＡＲＴ１９の間のインビトロでの直接比較は、Ｔ細胞をＮＡＬＭ－６または原発性ＡＬＬと共培養した場合のＣＤ１０７ａ脱顆粒の類似した比率を示した（図５０Ｂ）。ＣＡＲＴ１２３はまた、ＣＡＬ１９と同様の有効性を有するＮＡＬＭ－６細胞を用量依存的に死滅させることができた（図５０Ｃ）。より長期の実験では、ＮＡＬＭ－６または原発性ＡＬＬと３～５日間共培養した場合、ＣＡＲＴ１２３は増殖し（図５０Ｄおよび５０Ｅ）、複数のサイトカインを産生した（図５０Ｆ）。これらの結果は、ＣＡＲＴ１２３が複数のＢ－ＡＬＬ標的に対してＣＡＲＴ－１９と同等の効力を示すことを示す。
インビボモデルにおいてこれらのデータを確認するために、原発性ＡＬＬモデルを利用した。このモデルにおいて、Ｂ－ＡＬＬ患者から得られた原発性芽球をＮＯＤ－ＳＣＩＤ－γ鎖ノックアウト（ＮＳＧ）マウスにおいて継代し、ｅＧＦＰおよびクリックビートルルシフェラーゼ（ＧＦＰ／Ｌｕｃ）を含むレポーターコンストラクトを用いて形質導入した。ＮＳＧマウスは、ＧＦＰ／Ｌｕｃ＋原発性ＡＬＬ芽球をｉ．ｖ．注射され（ＪＨ３３１、ＣＤ１９＋、ＣＤ１２３＋、表現型を加える）、生着後、マウスは、無作為化され、ＣＡＲＴ１９、ＣＡＲＴ１２３または対照の非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を受けた。対照Ｔ細胞を用いて処置されたマウスは、疾患に対してすぐに死亡したが、ＣＡＲＴ１９またはＣＡＲＴ１２３のいずれかを用いて処置されたマウスは腫瘍根絶および長期生存を示した（図５１Ａおよび５１Ｂ）。ＣＡＲ１２３Ｔ細胞は、対照Ｔ細胞と比較してマウスの末梢血（ＰＢ）において有意に拡大し、高レベルのＣＡＲ１２３を発現した（図５１Ｃ）。ＣＡＲＴ１２３の抗白血病活性は特異的であり、芽球の表面におけるＣＤ１２３の認識に基づいた。これは、本発明者らがマウスにＣＤ１２３－ＣＤ１９＋白血病（ＡＶ５７６）を生着させた場合、ＣＡＲＴ１９のみが抗白血病活性を示し、一方で、ＣＡＲＴ１２３は、対照ＵＴＤと比較して効果がなかったためであった（図５７Ｂおよび５７Ｃ）。
ＣＡＲＴ１２３用量と抗腫瘍活性の相関関係を検出するために、（ＮＡＬＭ－６細胞株を用いて）高白血病負荷を有するマウスのインビボモデルを開発した。このモデルにおいて、ＣＡＲＴ１２３の標準用量（２００万個のＣＡＲ＋細胞）は、腫瘍を除くことができない。これらのマウスは、異なる用量のＣＡＲＴ１２３（１．２５、２および５００万個のＣＡＲ＋細胞）を用いて注射され、用量関連の抗白血病活性を観察した（図５７Ｄ）。
ＣＡＲＴ１９ではなくＣＡＲＴ１２３は抗原欠損再発の新規な前臨床モデルにおいて高く活性である
ＣＤ１９陰性再発を標的とする新しい戦略を試験するために、抗原喪失再発の新規なインビボモデルが開発された。本発明者らのＣＴＬ０１９臨床試験の１つに登録された患者（ＣＨＰ１０１）由来のＢ細胞芽球は、疾患がＣＤ１９＋＋およびＣＤ１２３＋である場合にはベースライン時（ＣＴＬ０１９療法前）、患者がＣＤ１９陰性疾患（ＣＤ１２３をなおも発現している、図５８Ａ）を発症している場合にはＣＴＬ０１９後の再発時に回収された。次に、芽球をＮＳＧマウスにおいて拡大させ、ベースライン疾患（ＣＤ１９＋）に関してはクリックビートルグリーンシフェラーゼ（ＣＢＧ）、または再発（ＣＤ１９－）に関してはクリックビートルレッドルシフェラーゼ（ＣＢＲ）を用いて形質導入した（方法の部を参照されたい）。重要なことに、インビボでの増殖中に、芽球は、ＣＤ１９以外のＢ細胞同一性のマーカーを保持した（データは示さず）。最初の実験において、ＮＳＧマウスに、ベースライン疾患ＣＤ１９＋（ＣＢＧ、緑色）またはＣＤ１９陰性（ＣＢＲ、赤色）の白血病のいずれかを生着させた。両方の群は、無作為化され、ＣＡＲＴ１９または対照Ｔ細胞（ＵＴＤ）を受けた（図５２Ａ）。図５２Ｂに示されるように、両方の群において、ＵＴＤで処置されたマウスは、ＣＤ１９の発現により独自に、ベースラインと再発疾患の両方の急速な進行を示した。反対に、ＣＡＲＴ１９を用いて処置されたマウスの群において、ベースライン疾患（ＣＤ１９陽性）を生着させたマウスのみがＣＡＲＴ１９処置に応答し、一方で、再発疾患（ＣＤ１９陰性）を生着させたマウスは予想通りに不応性を示した。これはまた、ＣＤ１０７ａ脱顆粒アッセイにおいてインビトロで再現された（図５８Ｂ）。ＣＤ１９を発現するかまたはそれを欠損している異なるクローンの存在をインビボでシミュレートするために、ＮＳＧマウスに、ベースラインおよび再発疾患の１対１混合物を生着させた；８日目に、マウスは、無作為化され、ＣＡＲＴ１９または対照Ｔ細胞を受けた。腫瘍負荷は、インビボでのＣＤ１９＋（ＣＢＧ、緑色）／ＣＤ１９－（ＣＢＲ、赤色）白血病の間の相対的増殖を識別することができる生物発光イメージングを用いてモニターされた。図５２Ｃに示されるように、ＵＴＤを受けたマウスにおいて、６日目に存在するＣＤ１９＋（緑色）およびＣＤ１９－（赤色）白血病の両方は、１１日目で同様に増加したが、一方で、ＣＡＲＴ１９を用いて処置されたマウスにおいて、ベースライン疾患（緑色）は完全に除去され、再発疾患（赤色）は進行を示した。
原発ＣＤ１９陰性Ｂ－ＡＬＬおよびＣＡＲＴ１９不全のこの独特な異種移植片モデルを用いて、抗原喪失再発の治療におけるＣＡＲＴ１２３の役割を評価した。原発ＣＤ１９陰性芽細胞（ＣＢＲ陽性）をＮＳＧマウスに注入し（図５２Ｄ）、マウスを無作為化して、ＣＡＲＴ１９、ＣＡＲＴ１２３または対照Ｔ細胞を与えた。ＣＡＲＴ１９および対照Ｔ細胞は、抗腫瘍活性の完全な欠如を示したが、ＣＡＲＴ１２３は、これらのマウスにおいて、疾患の完全な根絶および長期生存をもたらした（図５２Ｅおよび５２Ｆ）。実際に、ＣＡＲＴ１９に難治性の原発Ｂ－ＡＬＬの前臨床モデルにおいて、新規なＣＡＲＴ１２３は、この疾患を根絶し、長期生存をもたらすことができる。
単一細胞レベルでこのインビボモデルにおけるＣＡＲＴ１９およびＣＡＲＴ１２３の異なる挙動を理解するために、一連の実験は、差次的に標識されたＣＡＲＴ１９（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ、青色）およびＣＡＲＴ１２３（ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ ＯｒａｎｇｅまたはＴＲＩＴＣ、赤色）の混合物を、ＣＤ１９陽性原発芽球（ＧＦＰ）またはＣＤ１９陰性再発芽細胞（ＧＦＰ）を有するマウスに注入することによって行われ、注入後の約２４時間、頭蓋冠骨髄の２光子顕微鏡法を用いてそれらの挙動を追跡した（実験スキーム、図５３Ａ）。これらの研究は、ＣＡＲＴ１９およびＣＡＲＴ１２３が、白血病を含む骨髄空間に輸送され、同族抗原のＣＡＲＴ細胞認識が運動性停止と相関することを示した。具体的には、ベースラインＣＤ１９＋ＣＤ１２３＋白血病を生着させたマウスにおいて、６２．９±３．８％のＣＡＲＴ１９および８１．１±１．２％のＣＡＲＴ１２３は、芽球に隣接して、丸い形態で失速していることが見出されたが、再発ＣＤ１９－ＣＤ１２３＋白血病を生着させたマウスにおいて、ＣＡＲＴ１２３細胞のみが腫瘍細胞の次に停止した（ＣＡＲＴ１２３ ８０．９±５．１％対ＣＡＲＴ１９ １２．４±２．２％）（図５３Ｂおよび５３Ｃ）。これらの所見は、ＣＤ１９陰性の再発ＡＬＬにおいて、ＣＡＲＴ１２３のみが、白血病細胞（ＧＦＰ）との生産性シナプスを確立し、したがって、それらの運動性を低下させることができたが、ＣＡＲＴ１９細胞は、白血病芽球を認識せずに環境中でサンプリングおよび移動を続けることを示した。
ＣＡＲＴ１２３およびＣＡＲＴ１９の組合せはＣＤ１９陰性再発を防止することができる
ＣＡＲＴ１２３は、ＣＡＲＴ１９耐性の前臨床モデルにおいて、ＣＤ１９指向性療法後に生じるＣＤ１９陰性再発の治療に有効であることが判明した。しかしながら、コンビナトリアルアプローチは、同時に抗原損失再発を防止しながら、活性なＣＤ１９陽性疾患を治療することができた。この仮説を試験するために、ＣＤ１９陰性逃避の潜在性を有するＢ－ＡＬＬの新たな臨床的問題を、ＮＳ１９マウスにおける原発ＣＤ１９－およびＣＤ１９＋疾患を一緒に注射することによってモデル化した。次に、マウスを無作為化し、対照Ｔ細胞（ＵＴＤ）、ＣＡＲＴ１９またはＣＡＲＴ１９およびＣＡＲＴ１２３の組合せを与え、Ｔ細胞の総用量を同じにした（図５４Ａ）。図５４Ｂに示されるように、対照Ｔ細胞を用いて処置されたマウスは、両方の白血病クローンの進行を有し、ＣＡＲＴ１９はＣＤ１９陰性疾患（赤色）の大半の急速な進行を示した。対照的に、ＣＡＲＴ１２３およびＣＡＲＴ１９の組合せを用いて処置されたマウスは、図５４Ｃに示されるように、疾患のクリアランスおよび改善された全生存を示した。実験終了時に屠殺されたマウスの分析は、プールされたＣＡＲ Ｔ細胞群における残留白血病の証拠を示さなかった。対照的に、ＣＡＲＴ１９単独療法後の進行性疾患を有するマウスは、予想されるＣＤ１９陰性表現型を保持した（図５４Ｄ）。
最後に、ＣＤ１９および／またはＣＤ１２３の両方によって活性化され得るＣＡＲＴを開発するために、一方がＣＡＲ１９を保持し、他方がＣＡＲ１２３を有する２つのレンチウイルスを用いてＴ細胞に形質導入した。図５５Ａに示されるように、４つの異なる形質導入Ｔ細胞サブセットを検出した：ＣＡＲ１９およびＣＡＲ１２３二重陰性、ＣＡＲ１９単一陽性、ＣＡＲ１２３単一陽性、および二重陽性ＣＡＲ１９／ＣＡＲ１２３のＴ細胞。これらの４つのサブセットを選別し、それらの機能性および特異性をＫ５６２－ＷＴ、Ｋ５６２ ＣＤ１９＋またはＫ５６２ ＣＤ１２３＋に対して試験した。図５５Ｂは、単一陽性サブセットがそれらの特異的標的に応答し、二重陽性集団のみがＫ５６２を発現するＣＤ１９とＣＤ１２３の両方の存在下で脱顆粒することができるＣＤ１０７ａ脱顆粒アッセイの結果を示す。さらに、二重刺激ＣＡＲＴ細胞は、同等数の単刺激ＣＡＲＴ細胞と比較して、二重陽性標的に対してより強力な細胞毒性を示した。これは、２つの異なる抗原によって誘発されるＣＡＲを使用することによる効力の潜在的増加を示唆している（図５５Ｃ）。
検討
ＣＤ１９指向性免疫療法は、再発性および難治性急性リンパ芽球性白血病の治療のパラダイムを変えつつある。以前は結果が望ましくなかった患者は、現在は、完全応答と長期の疾患寛解を達成する現実的な可能性を有する。しかしながら、他の形態の強力な標的療法を用いて治療された白血病の一部の状況下で示されるように、白血病細胞は、耐性および再発をもたらす抗原欠損突然変異を発症する可能性がある。ＣＡＲＴ１９の場合、２つの主要な再発パターンが観察されている。持続性の欠如によるＣＡＲＴ１９の早期喪失を有する患者は、元のクローンの再発にリスクがある；確かに、最小の残存疾患分析は、悪性腫瘍を完全に根絶するためには、１～６カ月の持続的なＣＡＲＴ活性が必要とされ得ることを示している。対照的に、再発の約５０％は、ＣＡＲＴ１９持続性にもかかわらず生じ、ＣＤ１９陰性白血病の発生によって特徴付けられる。後者の観察は、ＣＡＲＴ１９による強力な選択圧を示唆している。特に、ＣＤ１９陰性再発はまた、ブリナツモマブ療法後に生じているが、これらは、おそらくそれほど強力でない療法後に少数の再発発生を示す。ＣＤ１９陰性疾患の発症には複数の可能性のある機構がある。これらのうちの１つは、非常に低い頻度でベースライン時に存在したＣＤ１９陰性クローンの選択および相対的生存の利点であり、これは当初、ＣＤ１９陰性再発をもたらす最も可能性の高い因子と考えられた。より最近では、ＣＤ１９のスプライシングの調節不全などの他の機構もまた重要であると考えられている。ここで、Ｂ－ＡＬＬの稀なＣＤ１９－ｖｅ芽細胞が、ＣＤ１９陰性再発の可能性のある機構として確認された、より一般的なＣＤ１９陽性白血病芽球に見出される顕著な細胞遺伝学的異常を含み得ることが初めて示される。本発明者らは、ＣＤ１２３＋ＣＤ１９－ｖｅ芽球を、免疫不全マウスに生着させることができることを実証することによってこれらの知見を確認し、これは、ＣＤ１２３が、ＡＭＬの場合と同じように、Ｂ－ＡＬＬにおける白血病幹細胞のマーカーであり得ることを示した。
この研究の目的は、ＣＤ１９指向性療法後の抗原喪失により再発する患者を治療するための新しい戦略を確定することであった。ＣＤ１２３は、Ｂ－ＡＬＬの大部分において高く発現され、特にＣＤ１２３はＣＤ１９陰性疾患で再発した患者において発現されたままである。ＣＤ１９－ＣＤ１２３＋集団におけるクローン性白血病細胞の存在が実証され、これは、ＣＡＲＴ１９と組み合わせたＣＤ１２３の標的化は、ＣＡＲＴ１９圧による選択的利点により、増殖することができるサブクローンの根絶の可能性を増加させる可能性があることを示す。ＣＤ１２３は、以前にＡＭＬにおける白血病幹細胞のマーカーとして確認されている。ここでは、ＣＤ１２３がＡＬＬの免疫表現型として定義された白血病幹細胞（ＬＳＣ）において発現され、ＬＳＣ上のＣＤ１２３を標的とすることがＡＬＬ根絶を促進する可能性を高まることが示された。
抗原喪失再発におけるＣＡＲＴ１２３の役割を研究するために、ペンシルベニア大学／フィラデルフィアの小児病院のＣＴＬ０１９試験の１つに登録されたＢ－ＡＬＬ患者（ＣＨＰ１０１）由来の原発芽球からＣＤ１９陰性再発の新規な異種移植片モデルが開発された。この患者は、ベースライン時に古典的なＣＤ１９＋ＣＤ１２３＋表現型を有したが、その後、ＣＤ１９－ＣＤ１２３＋疾患によるＣＡＲＴ１９治療後に再発した。このモデルを用いて、ＣＡＲＴ１２３が再発疾患を根絶でき、ＣＡＲＴ１９と組み合わせて、抗原喪失再発を予防することができることが実証された。これは、臨床関連の患者由来モデルにおける二重ＣＡＲＴコンビネーションの最初のデモンストレーションである。さらに、生体内イメージングの使用により、ＣＡＲＴ細胞は、静脈注射後の２４時間未満に骨髄に入り、それらの標的を探索し、同族抗原担持細胞と相互作用するために減速することが示された。さらに、二重シグナル伝達ＣＡＲＴ１２３／１９は、以前に公開された結果と一致して、ＣＡＲＴ単独または両方のＣＡＲのプールよりも効果的であることが示された。
これまで、急性骨髄性白血病の治療のための抗ＣＤ１２３キメラ抗原受容体の前臨床的有効性が示されていた。顕著な幹細胞毒性が恒久的な骨髄除去につながる可能性があるため、ＣＡＲＴ１２３は、臨床翻訳への潜在的な大きな課題である、造血幹細胞および前駆細胞上のＣＤ１２３の認識により造血毒性を引き起こす。造血毒性を最小限に抑えるために、ＣＤ１９とＣＤ１２３とがともに同時に結合したときにのみＴ細胞を活性化した新規コンストラクトが、この造血毒性を取り除き得ると仮定された。ここで、ＣＤ１９認識からの活性化シグナルおよびＣＤ１２３認識からの刺激シグナルを受けたＣＡＲＴ細胞は、Ｂ－ＡＬＬ細胞を死滅させ、ならびに本発明者らが以前に記載した顕著な造血毒性を回避することができることが見出された。この概念はＣＤ１９／ＰＳＭＡ認識の人工的なシステムを用いて以前公開されたが、この臨床的に関連するコンストラクトは、臨床翻訳への比較的明確な経路で、この分野における大きな進歩を表している。特に、このような二重ＣＡＲ設計は、毒性の減少と関連している可能性が高いが、ＣＡＲ認識をより限定的ではなくすることによって、抗原喪失再発の問題に取り組んでいない可能性がある。しかしながら、ＣＤ１２３の標的化がＡＬＬ幹細胞の根絶に成功すれば、このアプローチは安全であり、有効である可能性がある。
要約すると、ＣＤ１２３を標的とすることによりＢ－ＡＬＬを治療するための新規であり、有効な戦略がここで実証される。このアプローチは、ＣＤ１２３が、Ｂ－ＡＬＬを有する一部の患者において、稀なＣＤ１９陰性悪性細胞において発現され、ＣＤ１９指向性免疫療法後に生じる抗原喪失再発において保持されるため、特に魅力的である。さらに、ＣＡＲＴ１９とＣＡＲＴ１２３の組合せは、ＣＤ１９陰性再発の発生を防止することができる。
低用量のＲＡＤ００１は細胞培養モデルにおいてＣＡＲＴ増殖を刺激する
インビトロでのＣＡＲ Ｔ細胞増殖に対する低用量のＲＡＤ００１の効果を、ＣＡＲＴ発現細胞を異なる濃度のＲＡＤ００１の存在下で標的細胞と共培養することにより評価した。
材料および方法
ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の生成
ヒト化抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲ（ｈｕＣＡＲＴ１９）レンチウイルス移送ベクター（ｔｒａｎｓｆｅｒ ｖｅｃｔｏｒ）を使用して、ＶＳＶｇシュードタイプ化レンチウイルス粒子にパッケージングされたゲノム物質を生成した。ヒト化抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲ（ｈｕＣＡＲＴ１９）のアミノ酸およびヌクレオチド配列は、２０１４年３月１５日に提出されたＰＣＴ出願、ＷＯ２０１４／１５３２７０に記載されるＣＡＲ１、ＩＤ １０４８７５であり、その中で配列番号８５および３１と命名されている。
レンチウイルス移送ベクターＤＮＡは、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトするためのリポフェクタミン試薬と組み合わせて、３つのパッケージング成分、ＶＳＶｇ ｅｎｖ、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｒｅｖと混合させる。培地はその後２４時間および３０時間後に交換し、ウイルス含有培地は収集し、濾過して－８０℃で保存する。ＣＡＲＴは、健康なドナーの血液またはロイコパック（leukopak）の負磁気選択により得られる新鮮なまたは凍結未処理のＴ細胞の形質導入により生成される。Ｔ細胞は抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズと一緒の２４時間のインキュベーションにより活性化され、その後ウイルス上清または濃縮されたウイルス（それぞれ、ＭＯＩ＝２または１０）が培養物に添加される。改変されたＴ細胞は約１０日間拡大させておく。形質導入された細胞（細胞表面でＣＡＲを発現している）のパーセンテージおよびＣＡＲ発現のレベル（相対的蛍光強度、幾何平均）は７日目から９日目の間でフローサイトメトリー分析により決定される。遅い成長速度と約３５０ｆＬに近づくＴ細胞サイズの組合せによりＴ細胞が後の分析のために凍結保存される状態が決定される。
ＣＡＲＴの増殖を評価する
ＣＡＲＴの機能性を評価するため、Ｔ細胞を解凍し、計数し、生存率をセロメーター（Cellometer）により評価する。それぞれの培養物中のＣＡＲ陽性細胞の数は非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を使用して標準化する。ＣＡＲＴに対するＲＡＤ００１の効果はＲＡＤ００１を用いた滴定において試験し、５０ｎＭで開始した。共培養実験全てにおいて使用する標的細胞株はＮＡＬＭ６（Ｎａｌｍ－６）、ＣＤ１９を発現しルシフェラーゼを発現するように形質導入されているヒトプレＢ細胞急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）細胞株である。
ＣＡＲＴの増殖を測定するため、Ｔ細胞は１対１の比で標的細胞と一緒に培養する。細胞がＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＡＲ発現のために染色されるとき、アッセイは４日間実行される。Ｔ細胞の数は基準としてビーズの計数を使用するフローサイトメトリーにより評価する。
結果
ＣＡＲＴ細胞の増殖能力を４日間共培養アッセイにおいて試験した。ＣＡＲ陽性ＣＤ３陽性Ｔ細胞（暗いバー）および全ＣＤ３陽性Ｔ細胞（明るいバー）の数は、ＣＡＲ形質導入および非形質導入Ｔ細胞をＮＡＬＭ６（Ｎａｌｍ－６）と一緒に培養した後に評価した（図５９）。ｈｕＣＡＲＴ１９細胞は、０．０１６ｎＭ未満のＲＡＤ００１の存在下で培養すると拡大し、もっと高い濃度の化合物では拡大の程度はそれよりも少なかった。重要なのは、０．００３２と０．０１６ｎＭのＲＡＤ００１の両方で増殖はＲＡＤ００１の添加なしで観測された場合より高かったことである。非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）は検出可能な拡大を示さなかった。
低用量のＲＡＤ００１はＣＡＲＴ発現をインビボで刺激する
この実施例では、異なる濃度のＲＡＤ００１と一緒にインビボで増殖するｈｕＣＡＲ１９細胞の能力を評価する。
材料および方法
ＮＡＬＭ６－ｌｕｃ細胞：ＮＡＬＭ６ヒト急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）細胞株を再発ＡＬＬに罹った患者の末梢血から発現させた。次に、細胞にホタルルシフェラーゼをタグ付けした。これらの懸濁細胞は１０％の熱失活させたウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩにおいて成長する。
マウス：生後６週間のＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ストック番号００５５５７）から入手した。
腫瘍移植：ＮＡＬＭ６－ｌｕｃ細胞を１０％熱失活させたウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩにおいてインビトロで成長させ拡大させた。次に、細胞は１５ｍｌのコニカルチューブに移し、冷たい無菌ＰＢＳを用いて２度洗浄した。次に、ＮＡＬＭ６－ｌｕｃ細胞を計数し、ミリリットルのＰＢＳあたり１０×１０６細胞の濃度で再懸濁させた。細胞を氷上に置き、直ちに（１時間以内）マウスに移植した。ＮＡＬＭ６－ｌｕｃ細胞は尾静脈を経て静脈内に１００μｌ容量で注射され、マウスあたり総数で１×１０６細胞であった。
ＣＡＲ Ｔ細胞投与：マウスは腫瘍移植の７日後５×１０６Ｔ細胞を投与された。細胞は３７℃の水浴中で部分的に解凍し、次に細胞を含有するチューブに１ｍｌの冷たい無菌ＰＢＳを添加することにより完全に解凍させた。解凍された細胞は１５ｍｌのファルコンチューブに移し、ＰＢＳを用いて最終容量１０ｍｌに調整した。細胞は、毎回１０００ｒｐｍで１０分間２度洗浄し、次に血球計数器上で計数した。次に、Ｔ細胞は冷ＰＢＳ１ｍｌあたり５０×１０６ＣＡＲ Ｔ細胞の濃度で再懸濁し、マウスに投与するまで氷上で保管した。マウスは尾静脈を経て静脈内に１００μｌのＣＡＲ Ｔ細胞を注射され、マウスあたり５×１０６ＣＡＲ Ｔ細胞の用量であった。群あたり８マウスを１００μｌのＰＢＳ単独で（ＰＢＳ）、またはヒト化ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置した。
ＲＡＤ００１投与：１ｍｇのＲＡＤ００１に等しい濃縮したマイクロエマルジョン５０ｍｇを処方し、次に、投与時にＤ５Ｗ（デキストロース５％水溶液）に再懸濁した。マウスには毎日、所望の用量のＲＡＤ００１を、２００μｌを用いて経口投与した（経口経管栄養を介して）。
ＰＫ分析：マウスは腫瘍移植の７日後に開始してＲＡＤ００１を毎日投与した。投与群は以下の通りであった：０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇ。マウスは最初と最後のＲＡＤ００１投与に続いて０日目および１４日目にＰＫ分析のため以下の時点で血を採った：１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、および２４時間。
結果：
ＲＡＤ００１の展開および薬物動態はＮＳＧマウスにおいてＮＡＬＭ６－ｌｕｃ腫瘍を用いて試験した。ＲＡＤ００１だけを毎日経口投与してもＮＡＬＭ６－ｌｕｃ腫瘍の成長には影響を及ぼさなかった（図６０）。ＲＡＤ００１の薬物動態分析によれば、腫瘍担持マウスの血液中ではＲＡＤ００１はかなり安定していることが示されている（図６１Ａおよび６１Ｂ）。０日目と１４日目の両方でのＰＫ分析では、血液中のＲＡＤ００１濃度は、試験された最も低い用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）での投与の２４時間後でも約１０ｎｍであることを示している。
これらの用量に基づいて、ｈｕＣＡＲ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞は、これらの細胞の増殖能力を判定するためにＲＡＤ００１と一緒に、およびそれなしで投与された。使用した最も高い用量は、投与の２４時間後の血液中のＲＡＤ００１レベルに基づいて３ｍｇ／ｋｇであった。ＲＡＤ００１の濃度はＲＡＤ００１の最終投与の２４時間後１０ｎＭを超えていたので、ＣＡＲ Ｔ細胞を用いたインビボ研究ではいくつかのもっと低い用量のＲＡＤ００１が使用された。ＣＡＲ Ｔ細胞は毎日経口ＲＡＤ００１投与の開始に１日先立って静脈内投与された。マウスはＴ細胞拡大ではＦＡＣＳを介してモニターされた。
最も低い用量のＲＡＤ００１は、ＣＡＲ Ｔ細胞の増強された増殖を示している（図６２Ａおよび６２Ｂ）。この増強された増殖は、ＣＤ８＋ＣＡＲ Ｔ細胞よりもＣＤ４＋ＣＡＲ Ｔ細胞を用いる方が明白であり長期である。しかし、ＣＤ８＋ＣＡＲ Ｔ細胞を用いると増強された増殖は、ＣＡＲ Ｔ細胞投与に続く初期の時点で見ることが可能である。
原発性ＤＬＢＣＬを有する特定の患者はＣＤ３＋／ＰＤ１＋二重陽性癌細胞を示す
最近、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）修飾されたＴ細胞およびチェックポイント阻害剤の形態で癌免疫療法の分野において魅力的な進歩があったが、それらの組合せの療法機構を探索するための高度なツールは広く利用することができない。この増大する必要性に対処するために、多重ＡＱＵＡ（自動定量分析）技術を用いた堅牢な定量的蛍光免疫組織化学プラットフォームが開発され、チェックポイントインヒビター発現を評価し、ＣＡＲ Ｔ細胞を列挙し、新規な共局在化アルゴリズムを用いて腫瘍細胞と免疫細胞間の相互作用を決定した。この方法の有用性は、前臨床モデル系および臨床モデル系の両方において特徴付けられた。Ｂ細胞リンパ腫の免疫不全マウスモデルにおいて、一次リンパ器官の悪性Ｂ細胞へのＣＡＲ Ｔ細胞のホーミングが評価された。ＣＤ４、ＣＤ８、ＰＤ１およびＦＯＸＰ３発現の多重分析によるＣＡＲ Ｔ細胞の表現型および機能的状態が決定された。さらに、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）設定における免疫療法の併用を可能にするために、免疫細胞および腫瘍細胞コンパートメントにおけるＰＤ１およびＰＤ－Ｌ１の発現の形態における適応免疫耐性機構の有病率は、ＤＬＢＣＬ患者（ｎ＝６３）からの原発性と続発性の生検の両方において細胞質および核の染色によって作製される目印を介して調べられた。ＣＡＲ Ｔ試験のための患者選択を支持するために、従来の方法によって再現可能に採点できなかった関連腫瘍抗原の発現および罹患率を定量し、客観的なカットポイントを得た。患者の最適な選択のためのこれらの定量的多重化ＩＨＣ法は、今後の新規な組み合わせ免疫療法試験に利用することができる。
ＤＬＢＣＬ組織試料の試料調製、画像化、および画像化の分析を原発性ＤＬＢＣＬ（ｎ＝４９）および続発性ＤＬＢＣＬ（１５）ヒト患者において行われた。
試料調製。ホルマリン固定され、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）された組織試料を脱ろうした。次に、スライドは、蒸留水中でインキュベートする前に、一連のキシレンからアルコール洗浄までを通じて再水和させた。その後、熱誘発された抗原回収は、高圧および高温度条件を用いて行われ、冷却させ、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水に移された。次に、染色が行われ、この場合、以下のステップが実施された。最初に、内因性ペルオキシダーゼをブロックし、続いて、タンパク質ブロッキング溶液とともにインキュベートして、非特異的な抗体染色を減少させた。次に、スライドは、マウス抗ＰＤＬ１一次抗体を用いて染色させた。その後、スライドは、抗マウスＨＲＰ二次抗体とともにインキュベートする前に洗浄された。スライドを洗浄し、次にＰＤＡ１染色をＴＳＡ＋Ｃｙ（登録商標）５（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて検出した。次に、一次および二次抗体試薬をマイクロ波で除去した。再度、スライドを洗浄した後、ウサギ抗ＣＤ３一次抗体を用いて染色した。スライドを洗浄し、次いで抗ウサギＨＲＰ二次抗体＋４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）のカクテルとともにインキュベートした。スライドを洗浄し、次にＴＳＡ－Ｃｙ（登録商標）３（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いてＣＤ３染色を検出した。スライドを最終的に洗浄した後、積層媒体とともにカバーガラスに載せ、室温で一晩乾燥させた。
試料イメージングと分析。次に、蛍光画像は、Ｖｅｃｔｒａソフトウェア バージョン２．０．８（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用するＶｅｃｔｒａ ２インテリジェントスライド分析システムを用いて取得された。最初に、ＤＡＰＩを用いて倍率４倍のスライドの単色撮像を行った。自動アルゴリズム（ｉｎＦｏｒｍを使用して開発された）を用いて、組織を含むスライドの領域を同定した。
組織を含むものとして同定されたスライドの領域は、ＤＡＰＩ（青色）、Ｃｙ（登録商標）３（緑色）、およびＣｙ（登録商標）５（赤色）に関連するチャネルについて倍率４倍で画像化して、ＲＧＢ画像を作製した。これらの倍率４倍の画像は、視野セレクタの自動濃縮アルゴリズム（ｉｎＦｏｒｍを使用して開発された）を使用して処理され、Ｃｙ（登録商標）３の最大発現に従って可能な倍率２０倍の視野を識別し、ランク付けした。
ＤＡＰＩ、Ｃｙ（登録商標）３、およびＣｙ５（登録商標）波長にわたって倍率２０倍でトップ４０視野を撮像した。生の画像を受け入れ可能性について調べ、焦点が合っていないか、腫瘍細胞が欠如しているか、大部分が壊死しているか、または期待される抗体局在化に関連しない高レベルの蛍光シグナル（すなわち、バックグラウンド染色）を含む画像を分析前に排除した。受け入れられた画像は、ＡＱＵＡｄｕｃｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて処理され、ここで、各蛍光色素分子は、スペクトルアンミキサーによって個々のチャネルにスペクトル的に混在させないようにし、別々のファイルとして保存した。
処理されたファイルは、ＡＱＵＡｎａｌｙｓｉｓ（商標）を使用するか、またはＡＱＵＡｓｅｒｖｅ（商標）を使用する完全自動化プロセスによってさらに分析された。各ＤＡＰＩ画像は、その画像内の全ての細胞核を識別するために細胞マスカーによって処理され、次に、細胞全体のおおよその大きさを表すために２ピクセルだけ拡張された。この得られたマスクは、その画像内の全ての細胞を表した。各Ｃｙ（登録商標）５画像をバイオマーカーマスカーにより処理して、ＰＤ－１－陽性である全ての細胞のバイナリーマスクを作製した。各Ｃｙ（登録商標）３画像をバイオマーカーマスカーにより処理して、ＣＤ３陽性である全ての細胞のバイナリーマスクを作製した。ＰＤ－１－陽性およびＣＤ３－陽性である全ての細胞のバイナリーマスクを組み合わせて、ＰＤ－１およびＣＤ３に対して二重陽性である全ての細胞のバイナリーマスクを作製した。ＰＤ－１を発現する全てのＣＤ３細胞についてのバイオマーカー陽性％（ＰＢＰ）は、ピクセルで測定され、面積評価者によって決定される、全てのＰＤ－１陽性腫瘍細胞のマスクの総面積を、ピクセルで測定され、面積評価者によって決定される、全てのＣＤ３陽性細胞のマスクの総面積で割ることによって、陽性計算機を用いて導き出された。原発性および続発性のＤＬＢＣＬヒト試料においてＰＤ－１を発現する全てのＣＤ３陽性細胞についてのＰＢＰの代表値を図６３に示す。ＣＤ３およびＰＤ－１の状態は、原発性におけるＣＤ３＋／ＰＤ－１＋細胞の有病率が、続発性ＤＬＢＣＬ設定よりも高く、単一または組合せ処置のいずれかに患者を選択する機会を提供することを示した。
同様の実験が行われ、原発性ＤＬＢＣＬヒト患者由来のＤＬＢＣＬ組織試料について、ウサギ抗ＰＤＬ１一次抗体およびＴＳＡ＋Ｃｙ５（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いてＰＤ－Ｌ１が検出された。ＰＤ１およびＣＤ３はまた同じ試料で検出された。この実験は、腫瘍微小環境がＰＤ１、ＣＤ３およびＰＤＬ１を発現する細胞を含むことを示した。この実験はまた、ＣＤ３＋ＰＤ１＋である細胞の部分集団を同定した（データは示さず）。これらの結果は、腫瘍微小環境が、ＰＤ１＋またはＰＤ－Ｌ１＋細胞に特異的な薬剤を用いて標的化され得る免疫抑制細胞の温床となるとするモデルを支持する。
ＤＬＢＣＬ細胞を含む試料中のＣＤ１９およびＰＤ－Ｌ１の相互排他的発現
試料調製。ホルマリン固定され、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）された組織試料を脱ろうした。次に、スライドは、一連のキシレンからアルコール洗浄までを通じて再水和させた後、蒸留水中でインキュベートした。その後、熱誘発された抗原回収は、高圧および高温度条件を用いて行われ、冷却させ、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水に移された。次に、染色が行われ、この場合、以下のステップが実施された。最初に、内因性ペルオキシダーゼをブロックし、続いて、タンパク質ブロッキング溶液とともにインキュベートして、非特異的な抗体染色を減少させた。次に、スライドは、ウサギ抗ＰＤＬ１一次抗体を用いて染色させた。その後、スライドは洗浄され、その後抗ウサギＨＲＰ二次抗体とともにインキュベートされた。スライドを洗浄し、次にＰＤＡ１染色をＴＳＡ＋Ｃｙ（登録商標）３（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて検出した。次に、一次および二次抗体試薬をマイクロ波で除去した。再度、スライドを洗浄した後、マウス抗ＣＤ１９一次抗体を用いて染色した。スライドを洗浄し、次いで抗マウスＨＲＰ二次抗体＋４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）のカクテルとともにインキュベートした。スライドを洗浄し、次にＴＳＡ－Ｃｙ（登録商標）５（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いてＣＤ１９染色を検出した。スライドを最終的に洗浄した後、積層媒体とともにカバーガラスに載せ、室温で一晩乾燥させた。
試料イメージングと分析。次に、蛍光画像は、Ｖｅｃｔｒａソフトウェア バージョン２．０．８（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用するＶｅｃｔｒａ ２インテリジェントスライド分析システムを用いて取得された。最初に、ＤＡＰＩを用いて倍率４倍のスライドの単色撮像を行った。自動アルゴリズム（ｉｎＦｏｒｍを使用して開発された）を用いて、組織を含むスライドの領域を同定した。
組織を含むものとして同定されたスライドの領域は、ＤＡＰＩ（青色）、Ｃｙ（登録商標）３（緑色）、およびＣｙ（登録商標）５（赤色）に関連するチャネルについて倍率４倍で画像化して、ＲＧＢ画像を作製した。これらの倍率４倍の画像は、視野セレクタの自動濃縮アルゴリズム（ｉｎＦｏｒｍを使用して開発された）を使用して処理され、Ｃｙ（登録商標）３の最大発現に従って可能な倍率２０倍の視野を識別し、ランク付けした。
ＤＡＰＩ、Ｃｙ（登録商標）３、およびＣｙ（登録商標）５波長にわたって倍率２０倍でトップ４０視野を撮像した。生の画像を受け入れ可能性について調べ、焦点が合っていないか、腫瘍細胞が欠如しているか、大部分が壊死しているか、または期待される抗体局在化に関連しない高レベルの蛍光シグナル（すなわち、バックグラウンド染色）を含む画像を分析前に排除した。受け入れられた画像は、ＡＱＵＡｄｕｃｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて処理され、ここで、各蛍光色素分子は、スペクトルアンミキサーによって個々のチャネルにスペクトル的に混在させないようにし、別々のファイルとして保存した。
処理されたファイルは、ＡＱＵＡｎａｌｙｓｉｓ（商標）を使用するか、または先の実施例において記載されたようにＡＱＵＡｓｅｒｖｅ（商標）を使用する完全自動化プロセスによってさらに分析された。
原発性および続発性ＤＬＢＣＬヒト試料中の全てのＣＤ１９陽性およびＰＤ－Ｌ１陽性細胞についてのＰＢＰの代表値を図６４に示す。ＣＤ１９およびＰＤＬ１発現は、ＤＬＢＣＬ試料において変化した。ＣＤ１９およびＰＤＬ１の発現は、相互に排他的である傾向があり、すなわち、一般に、所与の細胞はＣＤ１９またはＰＤ－Ｌ１を発現したが、両方は発現しなかった。理論に縛られることを望むものではないが、これは、ＣＤ１９がＤＬＢＣＬ腫瘍細胞において発現され、一方で、ＰＤ－Ｌ１が非腫瘍細胞、例えば、腫瘍微小環境を支持する細胞において発現されるためであり得る。この観察は、ＣＤ１９阻害剤（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞）とＰＤ－Ｌ１シグナル伝達の阻害剤の併用療法が、これらの２つの細胞集団の標的化に有用であり得ることを示唆する。
同様の実験は、例えば、ＣＡＲＴ１９有効性をモニターするＡＱＵＡ分析の能力を実証するために実施された。この研究は、混合された細胞株をＣＡＲＴ１９＋Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＣＤ１９＋ＲＥＨ細胞とともに含む試料中のＣＤ１９、ＣＤ３、およびＣＡＲＴ１９核酸をモニターした。ＣＤ１９およびＣＤ３タンパク質は、抗体によって検出され、ＣＡＲＴ１９は、ＣＡＲ核酸の３’ＵＴＲに対するＲＮＡプローブを用いて検出された。この実験は、細胞株試料が、ＣＤ１９、ＣＤ３、およびＣＡＲＴ１９を発現する細胞を含むことを示した（データは示さず）。この実験はまた、細胞株試料がＣＤ３＋／ＣＡＲＴ１９＋である細胞の部分集団を含むことを示した（データは示さず）。近接分析を行ったところ、ＣＡＲＴ１９細胞はＣＤ１９＋細胞に物理的に近接していることが示された（データは示さず）。これらの実験は、ＣＤ３＋ＣＡＲＴ１９細胞が、ＣＤ１９＋細胞を含む腫瘍微小環境に浸潤し、ＣＤ１９およびＣＡＲＴ１９細胞の物理的位置がＣＡＲＴ１９療法の有効性を左右するというモデルを支持する。
ＣＡＲのバイシストロン性発現
この実施例において、２つのタイプの細胞集団の有効性を比較した。「プールされた」と呼ばれる最初の細胞集団において、各細胞は１つのＣＡＲを発現する。第一の複数の細胞はＣＤ１９ ＣＡＲを用いて形質導入され、第二の複数の細胞はＣＤ２２ ＣＡＲまたはＣＤ１２３ ＣＡＲを用いて形質導入され、次に２つの複数の細胞がプールされた。第二のタイプの細胞集団において、複数の細胞は、ＣＤ１９ ＣＡＲおよび第二のＣＡＲを発現するバイシストロン性ベクターを用いて形質導入され、それにより、ほとんどのまたは全ての細胞が両コンストラクトを発現した。第二のＣＡＲは、いくつかの実験においてはＣＤ２２ ＣＡＲであり、他の実験においてはＣＤ１２３ ＣＡＲであった。これらの細胞集団を図６５に示す。
図６６に図示された２つの新規なコンストラクトは、単一のバイシストロン性レンチウイルスベクターを用いて同じＴ細胞において２つの完全長ＣＡＲを発現させるためにＰ２Ａシステムを用いて作製された。Ｔ細胞は、標準プロトコールに従って拡大させ、ＣＡＲ１９とＣＡＲ１２３の両方を保有する単一レンチウイルス（感染多重度、ＭＯＩ＝３）を用いて形質導入された。同様の形質導入は、記載されたバイシストロン性レンチウイルスベクターを用いて得られた同じＴ細胞集団において、ＣＡＲ１９およびＣＡＲ２２について行われた。図６７は、ＣＤ１９およびＣＤ２２ ＣＡＲの同時発現を示す。二重のＣＡＲ１９＋／ＣＡＲ１２３＋集団および二重陰性集団を含む、ＣＡＲ１９および／またはＣＡＲ１２３の特異的発現に基づく明確な集団を認識することができる（図６８、上段パネル）。
バイシストロン性ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ１２３ ＣＡＲを用いて形質導入された細胞は、ＣＤ１９またはＣＤ１２３ ＣＡＲのいずれかを発現するプールされた細胞と比較された（図６８、下段パネル）。ＮＳＧマウスにＢ－ＡＬＬ細胞株（ＮＡＬＭ－６、ＣＢＧ＋）を生着させた。７日目に、マウスは、腫瘍負荷（ＢＬＩ、生物発光）に基づいて無作為化され、対照Ｔ細胞（ＵＴＤ）、ＣＡＲＴ１９、ＣＡＲＴ１２３、１対１のＣＡＲＴ１２３とＣＡＲＴ１９がプールされた組合せ、または二重ＣＡＲＴ１９／１２３（ＣＡＲ＋細胞の総数は同じ）を受けた。ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞単独（四角形）およびＣＤ１２３ ＣＡＲを発現する細胞単独（三角形）はともに、対照（丸）と比較して初期の有効性を示し、その後、白血病細胞レベルが上昇した。ＣＤ１９またはＣＤ１２３を発現するプールされた細胞（ダイアモンド）はまた、初期の有効性を示し、その後、白血病細胞のレベルが上昇した。対照的に、バイシストロン性ベクターをトランスフェクトされた細胞（逆三角形、「二重ＣＡＲＴ」）は、処置後、少なくとも６０日で延長された応答を維持した。この実験は、二重ＣＡＲＴが、単一のＣＡＲＴ処置より優れているだけでなく、プールされたＣＡＲＴ細胞よりも優れている、強力な抗白血病効果を発揮することを示す。
ＣＡＲＴ２２は動物モデルにおけるＣＤ１９陰性Ｂ－ＡＬＬに対して有効である。
ＣＤ１９陰性Ｂ－ＡＬＬ細胞は、動物モデルにおいてＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞およびＣＤ２２ ＣＡＲ発現細胞に対する応答性について試験された。１００万個のＣＤ１９陰性Ｂ－ＡＬＬ細胞が０日目にマウスに注入され、２ｅ６ＣＡＲ＋Ｔ細胞が７日目（無作為化後）に注入された。腫瘍負荷を生物発光によって測定した。図６９に示されるように、陰性対照マウスおよびＣＡＲＴ１９により処置されたマウスにおいて癌が進行し、一方で、ＣＡＲＴ２２は、ＮＳＧ異種移植においてＣＤ１９陰性ＡＬＬを消失させることができる。
アッセイは、以下のように行われた：１ｅ６個のＣＤ１９陰性ＡＬＬ細胞（ＣＢＧ＋）をＮＳＧマウスに注射した。５日目に、マウスは、無作為化され、２ｅ６個の対照の非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）、ＣＡＲＴ１９またはＣＡＲＴ２２（ｍ９７１ ｓｃＦｖ）のいずれかを受けた。次に、マウスは、腫瘍負荷（生物発光）について追跡された。
低レベルの免疫チェックポイント分子は、改善された結果と関連する
免疫チェックポイント分子（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１、ＬＡＧ３、およびＴＩＭ３）は、免疫組織化学によってリンパ腫患者由来の試料において検出された。陽性および陰性対照の組織および細胞株もまた実施された。免疫チェックポイント発現分析は、腫瘍細胞、および免疫細胞などの非腫瘍細胞を含むことができる、目的とする領域に関する定量的な画像解析を用いて行われた。試料は、組織、リンパ節または骨髄から採取された。
免疫チェックポイントのタンパク質発現は、ＣＤ１９標的化ＣＡＲ療法による処置後に、完全応答例（ＣＲ）、および進行性疾患（ＰＤ）を有する患者において比較された。図７０に示されるように、ＣＲ患者は、治療前後にＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３のレベルが低い傾向にあるが、一方で、ＰＤ患者は、治療前後でこれらの分子のレベルが高い傾向にあった。この実施例は、ＣＡＲ発現細胞および免疫チェックポイント阻害剤との併用療法を支持し、ＣＡＲ療法を受けている患者における免疫チェックポイント分子レベルを決定するために試験することを支持する。
ＣＤ２２ ＣＡＲを発現する細胞の機能的アッセイ
いくつかのＣＤ２２ ＣＡＲコンストラクトをＮＦＡＴアッセイにおいて機能的に検証した。略述すると、以下のように実験を行った。ＣＤ２２結合ｓｃＦｖドメインを有するＣＤ２２ ＣＡＲをコードする核酸を保有するレンチウイルスベクター（ｐＥＬＰＳ）は、ＮＦＡＴ応答エレメント（ＪＮＬ）の制御下でルシフェラーゼを発現するように修飾されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株にエレクトロポレーションによって導入された。細胞を培養し、ＣＡＲコンストラクトを発現させた。エレクトロポレートされた細胞を標的抗原（ＣＤ２２）でコーティングされたプレートに適用した。コーティングされたプレートにおけるルシフェラーゼシグナルの検出は、その抗原に対するＣＤ２２ ＣＡＲの結合活性を示し、Ｔ細胞の活性化およびルシフェラーゼの発現をもたらした。
図７１は、ｍ９７１ ｓｃＦｖ競合物質の存在下および非存在下において、いくつかのＣＤ２２ ＣＡＲコンストラクトの活性化（ＲＬＵ）を示すグラフである。これらの結果は、ＣＤ２２－５３およびＣＤ２２－１２、ならびに他のｓｃＦｖのサブセットが、ｍ９７１陽性対照とほぼ同様に抗原に結合することを示す。この結果はまた、異なるｓｃＦｖがｍ９７１と異なる程度で競合することを示す。
１６個の追加のヒトＣＤ２２結合ドメインを試験し、弱い結合活性を有することが見出されたため（データは示されない）、さらに追求しなかった。
図７２は、ＣＤ２２－５７、ＣＤ２２－５８、ＣＤ２２－５９、ＣＤ２２－６０、ＣＤ２２－６１、ＣＤ２２－６２、およびＣＤ２２－６３を含むいくつかのＣＤ２２ ＣＡＲを発現するＪＮＬ細胞の活性化（ＲＬＵ）を示すグラフであり、そのｓｃＦｖ配列は本明細書に提供される。３つの異なる標的タンパク質（ＣＤ２２－ＦＬ－Ｆｃ、ＣＤ２２－Ｄ５６７－Ｆｃ、およびＣＤ２２－Ｄ６７）を用いて、組織培養プレートをコートした；陰性対照（Ｆｃ）もまた含まれた。メソテリン結合ＣＡＲ（Ｍｅｓｏ－Ｇ０７）を陰性対照として使用した。ＣＤ２２－１２およびＣＤ２２－５３を陽性対照として使用した。本実験は、このアッセイにおいて、全てのＣＡＲ（ＣＤ２２－５７、ＣＤ２２－５８、ＣＤ２２－５９、ＣＤ２２－６０、ＣＤ２２－６１、ＣＤ２２－６２、およびＣＤ２２－６３）が機能的であることを示した。さらに、これらの結果は、試験したＣＡＲ（ＣＤ２２－１２および－５３を含む）がＣＤ２２のドメイン６および７に結合することを示した。ドメインマッピングは、ＣＤ２２結合ドメインについて行われた。以下の３つの異なる形態の抗原を用いた：７つの外部ドメインを有するＣＤ２２全長、Ｄｏｍａｉｎ５６７（ドメイン１～４が欠失している）、およびＤｏｍａｉｎ６７（ドメイン１～５が欠失している）。理論に縛られることを望むものではないが、様々なＣＤ２２クローンの結合が、図７５に示されるエピトープにマッピングされるようである。
ＣＤ２２ ＣＡＲコンストラクトはまた、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－２の分泌を促進する能力についても試験された。略述すると、異なるＣＤ２２ ＣＡＲを発現する健常ドナーからの形質導入された原発性Ｔ細胞は、ＣＤ２２陽性標的細胞であるＲａｊｉ－ＬｕｃおよびＤａｕｄｉ－Ｌｕｃ、ならびに陰性対照であるＫ５６２－Ｌｕｃとともに共培養された。Ｔ細胞および標的細胞を１０対１のエフェクター対標的細胞比（Ｅ対Ｔ）で培養した。２０時間の共培養後に上清を回収した。図７３は、ＩＦＮ－γ産生（ｐｇ／ｍＬ）を示す３つの棒グラフを示す。Ｒａｊｉ－Ｌｕｃ細胞株（上のパネル）およびＤａｕｄｉ－ｌｕｃ細胞株（中央のパネル）との共培養は、ｈＣＤ２２－１２、ｈＣＤ２２－５３ ＣＡＲ Ｔ細胞、ならびに２つの陽性対照であるＣＡＲ１９およびｍ９７１－ＨＬによるＩＦＮ－γ分泌を誘導した。注目すべきことに、最大量はｈＣＤ２２－５３細胞を試験した場合に観察され、ｈＣＤ２２－１２細胞を試験した場合にはより少ない程度で観察された。Ｎａｌｍ６－Ｌｕｃ、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ－Ｌｕｃ、およびＫ５６２－ＣＤ２２－Ｌｕｃ、ならびにＳＥＭ－Ｌｕｃ細胞を試験した場合、同様の結果が観察された（データは示さず）。Ｋ５６２－Ｌｕｃ陰性対照細胞株を試験した場合、最小のＩＦＮ－γの分泌が観察された（下段パネル）。
ＣＤ２２－１２は、細胞死滅アッセイおよびサイトカイン分泌アッセイにおいてｍ９７１に匹敵する活性を示した（実施例９）。ＣＤ２２－６４およびＣＤ２２－６５と命名された２つのｓｃＦｖは、ｈＣＤ２２－１２の親和性成熟によって産生された。これらのｓｃＦｖを含有するＣＡＲコンストラクトは、上記されるようにＮＦＡＴアッセイで活性について試験された。図７４に示されるように、ＣＤ２２－６４とＣＤ２２－６５の両方は、同様にＣＤ２２に結合し、またはＣＤ２２－１２とＣＤ２２－５３よりも良好であり、ＪＮＬ活性化をもたらす。図中のバーは、左から右に、ＣＤ２２全長－Ｆｃ；ＣＤ２２ Ｄ５６７－Ｆｃ；およびプレートのコーティングのために使用されるＦｃのみの陰性対照を表す。ＣＤ２２－１２の４つの変異体を試験することにより、ＬＣＤＲ３およびＨＣＤＲ３がある程度結合に寄与し（データは示されない）、ＨＣＤＲ３がＬＣＤＲ３よりも多くの突然変異を許容し得ることが示唆された。
等価体
本明細書において引用されたありとあらゆる特許、特許出願、および出版物の開示は、それによってそれらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。本発明を具体的な態様を参照しながら開示してきたが、本発明の他の態様およびバリエーションが、本発明の真の本質および範囲から逸脱することなく当業者によって考え出され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、このような態様および等価なバリエーションの全てを包含するものと解釈されることが意図される。

Claims (33)

  1. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子をコードする単離された核酸分子であって、前記ＣＡＲ分子が、ＣＤ２２結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記ＣＤ２２結合ドメインが：
    ｉ．配列番号６４８の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、配列番号６５９の軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）、および配列番号６７０の軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）；および
    ｉｉ．配列番号４９８または配列番号１３４５の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、配列番号５０９または配列番号１３５４の重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、および配列番号５２０または配列番号１３６３の重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）、
    を含む、単離された核酸分子。
  2. 前記ＣＤ２２結合ドメインが：
    ｉ．配列番号６９０と９５～９９％の配列同一性を有する軽鎖可変（ＶＬ）領域；および
    ｉｉ．配列番号６８０と９５～９９％の配列同一性を有する重鎖可変（ＶＨ）領域、
    を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  3. 前記ＣＤ２２結合ドメインが：
    ｉ．配列番号６９０のＶＬ領域；および
    ｉｉ．配列番号６８０のＶＨ領域、
    を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  4. 前記ＣＡＲ分子が、さらに配列番号１３のリーダー配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
  5. 前記ＣＡＲ分子が、さらに配列番号５３のリンカーを含む、請求項４に記載の単離された核酸分子。
  6. 前記ＣＡＲ分子が、さらに配列番号１４に示されるＣＤ８ヒンジを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
  7. 前記膜貫通ドメインが、配列番号１５に示されるＣＤ８膜貫通ドメインを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
  8. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、４－１ＢＢの機能的なシグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータの機能的なシグナル伝達ドメイン、またはその両方を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
  9. 前記４－１ＢＢの機能的なシグナル伝達ドメインが、配列番号１６に示される、請求項８に記載の単離された核酸分子。
  10. 前記ＣＤ３ゼータの機能的なシグナル伝達ドメインが、配列番号４３に示される、請求項８に記載の単離された核酸分子。
  11. 前記ＣＡＲ分子が、さらにＰ２Ａプロテアーゼ切断部位またはＴ２Ａプロテアーゼ切断部位を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
  12. 前記Ｐ２Ａプロテアーゼ切断部位が、配列番号１３２９に示される、および前記Ｔ２Ａプロテアーゼ切断部位が、配列番号１３２８に示される、請求項１１に記載の単離された核酸分子。
  13. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、細胞。
  14. ＣＤ２２結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子であって、前記ＣＤ２２結合ドメインが：
    ｉ．配列番号６４８の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、配列番号６５９の軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）、および配列番号６７０の軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）；および
    ｉｉ．配列番号４９８または配列番号１３４５の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、配列番号５０９または配列番号１３５４の重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、および配列番号５２０または配列番号１３６３の重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）、
    を含む、ＣＡＲ分子。
  15. 前記ＣＤ２２結合ドメインが：
    ｉ．配列番号６９０と９５～９９％の配列同一性を有する軽鎖可変（ＶＬ）領域；および
    ｉｉ．配列番号６８０と９５～９９％の配列同一性を有する重鎖可変（ＶＨ）領域、
    を含む、請求項１４に記載のＣＡＲ分子。
  16. 前記ＣＤ２２結合ドメインが：
    ｉ．配列番号６９０のＶＬ領域；および
    ｉｉ．配列番号６８０のＶＨ領域、
    を含む、請求項１４に記載のＣＡＲ分子。
  17. さらに配列番号１３のリーダー配列を含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載のＣＡＲ分子。
  18. さらに配列番号５３のリンカーを含む、請求項１４に記載のＣＡＲ分子。
  19. さらに配列番号１４に示されるＣＤ８ヒンジを含む、請求項１４～１８のいずれか一項に記載のＣＡＲ分子。
  20. 前記膜貫通ドメインが、配列番号１５に示されるＣＤ８膜貫通ドメインを含む、請求項１４～１９のいずれか一項に記載のＣＡＲ分子。
  21. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、４－１ＢＢの機能的なシグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータの機能的なシグナル伝達ドメイン、またはその両方を含む、請求項１４～２０のいずれか一項に記載のＣＡＲ分子。
  22. 前記４－１ＢＢの機能的なシグナル伝達ドメインが、配列番号１６に示される、請求項２１に記載のＣＡＲ分子。
  23. 前記ＣＤ３ゼータの機能的なシグナル伝達ドメインが、配列番号４３に示される、請求項２１に記載のＣＡＲ分子。
  24. さらにＰ２Ａプロテアーゼ切断部位またはＴ２Ａプロテアーゼ切断部位を含む、請求項１４～２３のいずれか一項に記載のＣＡＲ分子。
  25. 請求項１４～２４のいずれか一項に記載のＣＡＲ分子を含む、細胞。
  26. ＣＤ２２に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子であって、前記ＣＡＲ分子は、Ｎ－末端からＣ－末端にかけて：
    ｉ．配列番号１３のリーダー配列；
    ｉｉ．配列番号４９８または配列番号１３４５のＨＣ ＣＤＲ１；
    ｉｉｉ．配列番号５０９または配列番号１３５４のＨＣ ＣＤＲ２；
    ｉｖ．配列番号５２０または配列番号１３６３のＨＣ ＣＤＲ３；
    ｖ．配列番号６４８のＬＣ ＣＤＲ１；
    ｖｉ．配列番号６５９のＬＣ ＣＤＲ２；
    ｖｉｉ．配列番号６７０のＬＣ ＣＤＲ３；
    ｖｉｉｉ．配列番号１４のＣＤ８ヒンジ；
    ｉｘ．配列番号１５のＣＤ８膜貫通ドメイン；
    ｘ．配列番号１６の４－１ＢＢの機能的なシグナル伝達ドメイン；および
    ｘｉ．配列番号４３のＣＤ３ゼータの機能的なシグナル伝達ドメイン、
    を含む、ＣＡＲ分子。
  27. 配列番号６８０のＶＨ領域、および配列番号６９０のＶＬ領域を含む、請求項２６に記載のＣＡＲ分子。
  28. ＣＤ２２の発現に関連する疾患の処置のために使用される、請求項１４～２４、２６、２７のいずれか一項に記載のＣＡＲ分子または請求項１～１２のいずれか一項に記載の単離された核酸分子を含む、１つ以上の細胞。
  29. 血液がんを有する対象の処置のための薬剤の製造における、請求項１４～２４、２６、２７のいずれか一項に記載のＣＡＲ分子または請求項１～１２のいずれか一項に記載の単離された核酸分子を含む１つ以上の有効数の細胞の使用。
  30. 血液がんが、急性白血病、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性白血病、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、および骨髄腫からなる群から選択される、請求項２８に記載の細胞または請求項２９に記載の使用。
  31. 血液がんが、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）である、請求項２８に記載の細胞または請求項２９に記載の使用。
  32. 血液がんが、小児ＢＡＬＬである、請求項３１の細胞または使用。
  33. 血液がんが、成人ＢＡＬＬである、請求項３１の細胞または使用。
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