JP2004187694A - 反復的選択および組換えにより所望の特徴を有するポリヌクレオチドを作製する方法 - Google Patents
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Abstract
変異DNA、RNAまたはタンパク質の大規模ライブラリーの生成を可能にする方法、および所望の目的のために特定の変異体を選択することを可能にする方法を開発すること。
【解決手段】
選択されたポリヌクレオチド配列または選択されたポリヌクレオチド配列の集団を、代表的には増幅されたポリヌクレオチドおよび/またはクローニングされたポリヌクレオチドの形態において生成する方法であって、それによって選択されたポリヌクレオチド配列は、選択され得る所望の表現型の特徴(例えば、ポリペプチドをコードする、連結されたポリヌクレオチドの転写を促進する、タンパク質に結合するなどの特徴)を有する、方法。
【選択図】 なし
Description
本出願は、1996年3月25日に出願されたUSSN 08/621,859の一部継続出願であり、そして1995年11月30日に出願されたUSSN 08/564,955の一部継続出願である。
シャッフルされるべきポリヌクレオチドの複数の改変体を選択する工程であって、該ポリヌクレオチドは複数の遺伝子をコードする、工程;
該ポリヌクレオチドの複数の選択された改変体からの配列を有する部分的にアニールされたポリヌクレオチド鎖においてマルチサイクリックポリヌクレオチド伸長プロセスを行う工程であって、1つの鎖が、組換えポリヌクレオチドの集団を生成するように部分的にアニールされている別の鎖の伸長のためのテンプレートとして作用する条件下で、該ポリヌクレオチド鎖が互いに類似な領域および異種の領域を有し、そして該類似な領域を通して部分的にアニールされる、工程、
遺伝子またはその発現産物によって付与される所望の性質について、該複数の遺伝子をコードする組換えポリヌクレオチドをスクリーニングまたは選択する工程、
を包含する、方法が提供される。
Chem.271:4497に記載される)を含む超変異誘発性哺乳動物細胞が使用され得る。
本明細書で使用される以下の用語は、以下の意味を有する:
用語「DNA再組立」は、同一の配列の間で組換えが生じる場合に使用される。
核酸シャッフリングは、核酸フラグメントまたはポリヌクレオチドのプールをインビトロまたはインビボで反復的に相同組換えする方法である。関連核酸配列またはポリヌクレオチドの混合物を、ランダムにまたは疑似ランダムにフラグメント化し、そして再組立して、組換え核酸分子またはポリヌクレオチドのライブラリーまたは混合集団を生じる。
平行PCRにおいて、PCR反応の多くの異なる反応が同じ容器内で平行して生じ、1つの反応の産物は別の反応の産物をプライムする。PCR産物が互いにプライムするので、平均的な産物の大きさはPCRサイクル数とともに増大する。
本発明のDNAシャッフリング方法は、未知の配列のプールにおいて盲目的に実施され得る。再組立の混合オリゴヌクレオチド(再組立される配列に相同である末端を有する)に添加することにより、任意の配列混合物が任意の特定位置で別の配列混合物中に取り込まれ得る。従って、合成オリゴヌクレオチド、PCRフラグメント、または全遺伝子さえも混合物が、規定の位置で別の配列ライブラリーへ混合され得ることが意図される。1つの配列(混合物)の挿入は、テンプレートの別の部分での配列の挿入から独立している。従って、組換えの程度、要求される相同性の程度、およびライブラリーの多様性の程度は、再組立されるDNAの長さに従って独立してまたは同時に変化され得る。
同等のいくつかの標準的な遺伝子交配もまた、インビトロにおけるシャッフリングにより実施され得る。例えば、「分子戻し交配」は、目的の変異について選択しながら、変異体の核酸と野生型核酸との混合を反復することにより実施され得る。従来の育種でのように、このアプローチは、異なる供給源に由来する表現型を選択のバックグランドと組み合わせるために使用され得る。これは、例えば、選択されない特徴(すなわち、免疫原性)に影響する中立変異を除去するために有用である。従って、このアプローチは、タンパク質におけるどの変異が増強される生物学的活性に関与するか関与しないかを決定するために有用であり得、これは、誤りがちな変異誘発方法またはカセット変異誘発方法によっては達成され得ない利点である。
インビボでのシャッフリングの1つの実施態様において、特定核酸配列の混合された集団は、各宿主細胞において少なくとも2つの異なる核酸配列が存在する条件下で、細菌細胞(例えば、Archeaebacteria)または真核生物細胞へ導入される。フラグメントは種々の異なる方法により、宿主細胞へ導入され得る。宿主細胞は、当業者に公知の方法(例えば、塩化カルシウムでの処理)を使用してフラグメントで形質転換され得る。フラグメントがファージゲノムに挿入される場合、宿主細胞は特定核酸配列を有する組換えファージゲノムを用いてトランスフェクトされ得る。あるいは、核酸配列は、エレクトロポレーション、本来の能力、形質導入、トランスフェクション、リポフェクション、バイオリスティック(biolistic)、接合など、または細胞へポリヌクレオチド配列を導入する他の適切な方法を用いて、宿主細胞へ導入され得る。
本発明のインビボ組換え方法は、特定核酸フラグメントもしくは配列の未知の変異体または対立遺伝子のプール、または反復組換えに適切な、多様であるが関連する配列もしくは1つ以上の組換え配列(例えば、部位特異的組換え部位、相同組換えのために実質的な同一性を有する配列相同性の局在セグメント、相同組換え「ホットスポット」配列、制限部位など)を共有する配列のファミリーについて、盲目的に実施され得る。しかし、特定核酸フラグメントの実際のDNAまたはRNA配列を知る必要はない。
本方法は、開示された方法のいずれかによるインビトロおよび/またはインビボ組換えにより、および任意の組み合わせで、ペプチドディスプレイ法により選択されるポリヌクレオチド配列をシャッフリングするために使用され得、ここでは、会合されたポリヌクレオチドは、表現型について(例えば、予め決定されたレセプター(リガンド)に対する親和性について)スクリーニングされるディスプレイされたペプチドをコードする。
本発明の方法は、開示された方法のいずれかによるインビトロおよび/またはインビボ組換えおよび任意の組み合わせにより、抗体ディスプレイ法により選択されたポリヌクレオチド配列をシャッフリングするために用いられ得る。ここで会合されたポリヌクレオチドは、表現型(例えば、予め決定された抗原(リガンド)への結合についての親和性)についてスクリーニングされたディスプレイされた抗体をコードする。
(U.S.A.) 87:8095;Perssonら、(1991) Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.) 88:2432)。バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリーおよびλファージ発現ライブラリーの種々の実施様態が、記載されている(Kangら、(1991) Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.) 88:4363;Clacksonら、(1991) Nature 352:624;McCaffertyら、(1990) Nature 348:552;Burtonら、(1991) Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.) 88:10134;Hoogenboomら、(1991) Nucleic Acids Res.19:4133;Changら、(1991) J.Immunol.147:3610;Breitlingら、(1991) Gene 104:147;Marksら、(1991) J.Mol.Biol.222:581;Barbasら、(1992) Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.) 89:4457;HawkinsおよびWinter (1992) J.Immunol.
22:867;Marksら、(1992) Biotechnology 10:779;Marksら、(1992) J.Biol.Chem.
267:16007;Lowmanら、(1991) Biochemistry 30:10832;Lernerら、(1992) Science 258:1313は、参考として本明細書中に援用される)。代表的には、バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリーは、固定化(例えば、親和性クロマトグラフィーにより反応性ファージについて富化するためのクロマトグラフィー樹脂への共有結合による)および/または標識(例えば、プラークまたはコロニーリフトをスクリーニングするために)されているレセプター(例えば、ポリペプチド、炭水化物、糖タンパク質、核酸)でスクリーニングされる。
シャッフリングはまたは、予め決定されたポリペプチド配列に結合するライブラリーメンバーを同定するためのツーハイブリッドスクリーニングシステムをスクリーニングすることにより得られた選択されたライブラリーメンバーのプールを組換え的に多様化するために用いられ得る。選択されたライブラリーメンバーは、プールされ、そしてインビトロおよび/またはインビボ組換えによりシャッフルされる。次いでシャッフルされたプールは、上記の予め決定されたポリペプチド配列(例えば、SH2ドメイン)に結合するライブラリーメンバー、または別の予め決定されたポリペプチド配列(例えば、他のタンパク質の種由来のSH2ドメイン)に結合するライブラリーメンバーを選択するために、酵母ツーハイブリッドシステムにおいてスクリーニングされ得る。
Genes Devel.7;1755)、または単一のタンパク質のオリゴマー形成に機能するドメインを同定するためにも用いられている(Iwabuchiら、(1993) Oncogene 8;1693;Bogerdら、(1993) J.Virol.67:5030)。ツーハイブリッドシステムの改変は、タンパク質分解酵素のインビボでの活性を研究するために用いられている(Dasmahapatraら、(1992) Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 89:4159)。あるいは、E.
coli/BCCP 相互作用的スクリーニングシステム(Germinoら、(1993) Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)
90:933;Guarente L (1993) Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.) 90:1639)は、相互作用するタンパク質配列(すなわち、ヘテロ二量体化するか、またはより高次のヘテロ多量体を形成するタンパク質配列)を同定するために用いられ得る。ツーハイブリッドシステムにより選択された配列は、プールおよびシャッフルされ、そして予め決定された結合配列を含有するハイブリッドに結合するポリペプチド配列を同定するためのスクリーニングの1つ以上の引き続く回のために、ツーハイブリッドシステムに導入され得る。このようにして同定された配列は、コンセンサス配列(単数または複数)およびコンセンサス配列核を同定するために比較され得る。
(添加剤)
1つの局面において、改善されたシャッフリング法は、関連する配列ポリヌクレオチドの再アニーリングまたは組換えの割合または程度を増大させる少なくとも1つの添加剤の添加を含む。一般に、ミスマッチ配列のハイブリッド安定性を増加させる添加剤を使用して、実質的に変異したライブラリーメンバーを生じる頻度を増大させ得る(すなわち、より高い変異密度を有する) 。添加剤に加えて、イオン強度(例えば、Na+および/またはK+イオン濃度) の調節により、ミスマッチハイブリッドの相対的な安定性を調節し得、その結果、増加した塩濃度が、ミスマッチハイブリッドの頻度を増加させ、そして複数の変異を有するライブラリーメンバーの形成に寄与し得る。
リコンビナーゼは、外来性標的化ポリヌクレオチドと共に含まれる場合は、標的化ポリヌクレオチドと外来性の予め決定されたDNA配列との間の組換え頻度および/または局在化頻度において測定可能な増加を提供するタンパク質である。本発明では、リコンビナーゼは、全てが特に以下の同一の機能の全てまたはほとんどを有するRecA様組換えタンパク質のファミリーをいう:(i)その相同標的上で標的化ポリヌクレオチドに正確に結合しそして位置決めする、リコンビナーゼタンパク質の能力、および(ii)相補的外来配列を効率的に見出しそしてこれに結合する、リコンビナーゼタンパク質/標的化ポリヌクレオチド複合体の能力。同定されている多くの変異型recA様タンパク質の野生型タンパク質に加えて、最も良く特徴付けられているrecAタンパク質は、E.coli由来のものである(例えば、recA803)。さらに多くの微生物が、鎖転移活性を有するrecA様リコンビナーゼを有する(例えば、Fugisawaら、(1985) Nucl.Acids res.13:7473;Hsiehら、(1986) Cell 44:885;Hsiehら、(1989) J.Biol.Chem.264:5089;Fishelら、(1988) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:3683;Cassutoら、(1987) Mol.Gen.Genet.208:10;Ganeaら、(1987) Mol.
Cell.Biol.7:3124;Mooreら、(1990) J.Biol.Chem.19:11108;Keeneら、(1984) Nucl.Acids Res.12:3057;Kimiec, (1984) Cold Spring Harbor Symp.48:675;Kimeic, (1986) Cell 44:545;
Kolonderら、(1987) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:5560;Suginoら、(1985) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:3683;Halbrookら、(1989) J.Biol.Chem.264:21403;Eisenら、(1988) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:7481;McCarthyら、(1988) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5854;Lowenhauptら、(1989) J.Biol.Chem.
264:20568、その全体が本明細書中で参考として援用される)。このようなリコンビナーゼタンパク質の例として、例えば、以下が挙げられるが、これらに限定されない:recA、recA803、uvsX、および他のrecA変異体およびrecA様リコンビナーゼ(Roca.A.I.(1990) Crit.Rev.Biochem.Molec.Biol.
25:415)、sep1(Kolodner ら、(1987) Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.) 84:5560;Tishkoffら、Molec.Cell.Biol.11:2593)、RuvC(Dunderdaleら、(1991) Nature
354:506)、DST2、KEM1、XRN1(Dykstraら、(1991) Molec.Cell.Biol.11:2583)、STPα/DST1(Clarkら、(1991) Molec.Cell.Biol.11:2576)、HPP−1(Mooreら、(1991) Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.) 88:9067)、他の真核生物リコンビナーゼ(Bishopら、(1992) Cell 69:439;Shinoharaら、(1992) Cell 69:457;本明細書中で参考として援用される)。RecAは、E.coli株(例えば、E.coli JC12772株およびJC15369株(A.J.ClarkおよびM.Madiraju、University
of California−Berkeleyから入手可能))から精製され得る。これらの株は、細胞あたり高コピー数で存在する「ランアウェイ」複製プラスミドベクター上にrecAコード配列を含む。recA803タンパク質は、野生型recAの高活性変異体である。当該分野は、例えば、Drosophila、酵母、植物、ヒト、および非ヒト哺乳動物細胞由来の、recAに類似する生物学的特性を有するタンパク質(すなわち、recA様リコンビナーゼ)を含むリコンビナーゼタンパク質のいくつかの例を教示する。
1351;Parsonsら、(1990) J, Biol.Chem.265:4527;Aminら、(1991) Mol.Cell.
Biol.11:4497、本明細書中で参考として援用される))に隣接される。FRT配列が用いられる場合、FLPリコンビナーゼはまた、代表的には、インビトロまたは宿主細胞内で発現されるかのいずれかである。ここで、組み換えられるべき配列は、導入されるかまたは既に存在する。FLP/FRT系の代替は、以下を含むがこれらに限定されない:ファージP1のcre/lox系(HoessおよびAbremski (1985) J.Mol.Biol.181:351)、γ/δ分解酵素(Steitzら、(1990) Quarterly Rev.Biophys.23:205)、λのattB/attP系(Nunes−Dubyら、(1987) Cell 50:779)、およびバクテリオファージλ、φ80、P22、P2、P4、P1由来の同様の部位特異的組換え系、および実施者によって選択される他の同様の部位特異的組換え系。リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーに関する手引きは、Argosら、(1986) EMBO J.5:433(本明細書中で参考として援用される)に見出される。
1つの局面において、改善されたシャッフリング法は、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素である少なくとも1つの添加剤の添加を包含する。この活性は、非プルーフリーディングポリメラーゼによって触媒されるシャッフリング増幅反応の際に産物のポリヌクレオチドの3’末端に導入された非鋳型ヌクレオチドを除去することにおいて活性である。エキソヌクレアーゼ活性を有する適切な酵素の例としては、Pfuポリメラーゼが挙げられるが挙げられるが、これらに限定されない。エキソヌクレアーゼの例は、以下である:
Ba131
バクテリオファージλエキソヌクレアーゼ
E.coliエキソヌクレアーゼI
E.coliエキソヌクレアーゼIII
E.coliエキソヌクレアーゼVII
バクテリオファージT7遺伝子6。
1つの局面では、改善されたシャッフリング法は、再アニーリングされフラグメント化されたライブラリーメンバーポリヌクレオチドの増幅(すなわち、ポリメラーゼでの伸長)の少なくとも1サイクルが、不完全に伸長された増幅産物の実質的な(代表的には少なくとも20パーセント以上)画分を生じる条件下で行われる改変を含む。増幅産物(不完全に伸長された増幅産物を含む)は変性され、そして再アニーリングおよび増幅の少なくとも1回のさらなるサイクルに供される。この改変(少なくとも1サイクルの再アニーリングおよび増幅によって不完全に伸長された産物の実質的な画分が提供される)は、「スタッタリング」と呼ばれ、そして次の増幅の回で、不完全に伸長された産物は、異なる配列間連テンプレート種上で再アニールしそして、伸長をプライムする。
組換えのための最初の基質は、遺伝子の変異形態を含むポリヌクレオチドの収集物である。変異形態は、通常、基質間での相同組換えを可能にするに十分な互いの実質的な配列同一性を示す。ポリヌクレオチド間の多様性は、天然のもの(例えば、対立形質または種改変体)、誘導されたもの(例えば、誤りがちなPCR、合成遺伝子、コドン使用改変配列改変体)、またはインビトロ組換えの結果である。基質間には、少なくとも、組換えによって開始物質よりも多様な産物が生じ得る、十分な多様性が存在しなければならない。少なくとも2つの部位で異なる少なくとも2つの基質が存在しなければならない。しかし、通常は、103〜108メンバーの基質のライブラリーが使用される。多様性の程度は、組み換えられている基質の長さおよび進化されるべき機能的変化の範囲に依存する。0.1〜25%の間の位置での多様性が、典型的である。
プラスミド−プラスミド組換えに用いられるストラテジーはまた、ウイルス−プラスミド組換え(通常は、ファージプラスミド組換え)にも使用され得る。しかし、特にウイルスの使用に関するいくつかのさらなる注釈が適切である。組換えのための最初の基質は、プラスミドおよびウイルスベクターの両方にクローニングされる。基質がウイルスベクターに挿入され、そしてプラスミドに挿入されることは、通常重要ではないが、通常ウイルスベクターは、プラスミド由来の異なる基質を含むはずである。以前のように、プラスミドは、代表的には、選択マーカーを含む。プラスミドおよびウイルスベクターは共に、上記のように、トランスフェクションによって細胞に導入され得る。しかし、より有効な手順は、プラスミドで細胞をトランスフェクションし、トランスフェクタントを選択し、そしてウイルスでトランスフェクタントを感染させることである。多くのウイルスの感染の効率は、細胞の100%にほぼ等しいので、この経路でトランスフェクションされそして感染されたほとんどの細胞は、異なる基質を有するプラスミドおよびウイルスの両方を有する。
プラスミド−プラスミド組換えおよびプラスミド−ウイルス組換えについて記載した原理は、いくつかの改変を加えて、ウイルス−ウイルス組換えに適用され得る。組換えのための最初の基質は、ウイルスベクターにクローニングされる。通常、全ての基質について同じベクターが使用される。好ましくは、ウイルスは、本来、または変異の結果、細胞を殺さないウイルスである。挿入後、ウイルスゲノムは、通常インビトロでパッケージされる。パッケージされたウイルスは、高多重度で細胞を感染するために使用され、従って、細胞が異なる基質を保有する複数のウイルスを受容する確率は高い。
このフォーマットは、染色体およびプラスミドを保有する基質の両方を進化させるために使用され得る。このフォーマットは、多くの染色体遺伝子が表現型に寄与する状況、または進化させるべき染色体遺伝子の正確な位置が不明である状況で、特に有用である。組換えのための最初の基質が、プラスミドベクターにクローニングされる。進化させる染色体遺伝子が既知である場合、基質は、高い程度の配列同一性を示すが、染色体遺伝子由来のいくらかの多様性も示す配列のファミリーを構成する。進化させる染色体遺伝子が位置づけされていない場合、最初の基質は、通常、ごく少数のみしか進化させるべき遺伝子(単数または複数)に対する配列同一性を示さないDNAセグメントのライブラリーを構成する。プラスミド保有基質と染色体遺伝子(単数または複数)との間の多様性は、変異原誘発によって誘導され得るか、または染色体を保有する細胞の種とは異なる種から基質を保有するプラスミドを得ることによって誘導され得る。
上記の他の方法におけるように、ウイルスは、通常、細胞を殺すウイルスではなく、そしてしばしばファージまたはファージミドである。手順は、実質的にプラスミド−染色体組換えと同じである。組換えのための基質が、ベクター中にクローニングされる。次いで、基質を含むベクターが、細胞へトランスフェクトされるか、またはインビトロでパッケージされ、そして感染によって細胞に導入され得る。ウイルスゲノムは、単に培養物を増殖させることによって、宿主染色体と組換わる。進化は、エレクトロポレーションによるウイルスゲノムに細胞内で転移されることによって、または子孫ビリオンによる細胞の再感染によって、加速され得る。スクリーニング/選択によって、所望の特性を獲得するように進化した染色体および/またはウイルスゲノムを有する細胞が同定される。
上記のように、接合により細胞間のプラスミドの転移を可能にすることによって、プラスミドDNAのインビボでの進化の割合が加速され得る。接合は、細胞間の接触の間に起こるDNAの転移である。Guiney(1993):Bacterial Cnjugation (Clewell編、Plenum Press, New York)、75〜104頁;ReimmannおよびHass、Bacterial Conjugation (Clewell編、Pleunm Press, New York 1993)、137−188頁(その全体が本明細書中で参考として援用される)を参照のこと。接合は、多くのタイプのグラム陰性細菌およびいくつかのタイプのグラム陽性細菌の間で起こる。接合性転移はまた、細菌と植物細胞(Agrobacterium tumefaciens)または酵母との間でも知られている。同時係属中の出願の代理人番号16528J−014612に議論されるように、接合性転移を担う遺伝子は、そのような転移が生じ得る間の細胞型の範囲(例えば、細菌から哺乳動物)に広がるように進化され得る。
B, およびC)、ならびにtraと呼ばれる接合を生じるために必要な構造および酵素をコードする15〜25遺伝子から生じる。転移の起点は、DNA転移のcisにおいて必要とされる部位として規定される。tra遺伝子は、tra、A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、U、V、W、X、Y、Z、vir AB(対立形質1〜11)、C、D、E、G、IHF、およびFinOPを含む。oriTはまた、時にtra遺伝子とも呼ばれる。他の細胞性酵素(RecBCD経路の酵素、RecA、SSBタンパク質、DNAジャイレース、DNApolI、およびDNAリガーゼを含む)もまた、接合性転移に関与する。recEまたはrecF経路が、RecBCDを置換し得る。
(編Clewell, Plenum Press, NY 1993)第6章を参照のこと。
ml = ミリリットル
μl = マイクロリットル
μM = マイクロモル濃度
nM = ナノモル濃度
PBS = リン酸緩衝化生理食塩水
ng = ナノグラム
μg = マイクログラム
IPTG = イソプロピルチオ−β−D−ガラクトシド
bp = 塩基対
kb = キロ塩基対
dNTP = デオキシヌクレオシド3リン酸
PCR = ポリメラーゼ連鎖反応
X−gal = 5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトシド
DNAseI = デオキシリボヌクレアーゼ
PBS = リン酸緩衝化生理食塩水
CDR = 相補性決定領域
MIC = 最小阻止濃度
scFv = 抗体の単鎖Fvフラグメント。
1)基質の調製
再組立反応のための基質は、pUC18由来の野生型LacZα遺伝子のdsDNAポリメラーゼ連鎖反応(「PCR」)産物であった(図2)(28;Gene Bank第XO2514号)。プライマー配列は、5’AAAGCGTCGATTTTTGTGAT3’(配列番号1)および5’ATGGGGTTCCGCGCACATTT3’(配列番号2)であった。遊離したプライマーを、製造業者の指示に従い、Wizard PCR prep(Promega, Madison WI)によりPCR産物から除去した。遊離したプライマーの除去は、重要であることが見い出された。
約5μgのDNA基質を、10〜20分間室温にて、100μlの[50mM
Tris−HCl pH 7.4, 1mM MgCl2]中で、0.15単位のDNAseI(Sigma, St.Louis MO)で消化した。消化されたDNAを、2%低融点アガロースゲルで泳動した。10〜70塩基対(bp)のフラグメントを、DE81イオン交換紙(Whatman, Hillsborough OR)上への電気泳動により2%低融点アガロースゲルから精製した。DNAフラグメントを、1M NaClを用いてこの紙から溶出してエタノール沈澱した。
精製されたフラグメントを、PCR Mix(0.2mM 各dNTP、2.2mM MgCl2、50mM KCl、10mM Tris−HCl pH 9.0、0.1% Triton X−100、0.3μl Taq DNAポリメラーゼ、50μlの総容量)中に10〜30ng/μlの濃度で再懸濁させた。この時点では、プライマーを添加しなかった。94℃60秒間、[94℃30秒間、50〜55℃30秒間、72℃30秒間]の30〜45サイクル、および72℃5分間の再組立プログラムを、MJ Research(Watertown MA)PTC−150サーマルサイクラーにおいて用いた。より大きな配列への小さなフラグメントのPCR再組立に続いて、再組立の25、30、35、40、および45サイクル後の反応のサンプルを採取した(図2)。
それぞれ0.8μMの上記のプライマー(配列番号1および2)を有するPCR Mixへの再組立産物の希釈、および約15サイクルのPCR(それぞれのサイクルは、[94℃30秒間、50℃30秒間、および72℃30秒間]からなる)の後、正確なサイズの単一の産物が得られた(図2)。
上記の工程4由来のPCR産物を、末端の制限酵素BamHIおよびEco0109で消化し、そして上記の工程2に記載のようにゲル精製した。再組立されたフラグメントを、BamHIおよびEco0109で消化したpUC18に連結した。E.coliを、製造業者(Stratagene, San Diego CA)により推奨されるような標準的な条件下で、この連結混合物を用いて形質転換し、そして100μg/mlアンピシリン、0.004% X−galおよび2mM IPTGを有するアガープレートに播いた。++組換え体と判定されるHinDIII−NheIフラグメントを有する得られたコロニーを、それが青く見えることにより同定した。
1)LacZ遺伝子シャッフリング
2つのLacZ遺伝子構築物を用いて、75塩基離れた2つのマーカー間の交差を計測した。終止コドンを、LacZα遺伝子の2つの離れた範囲に挿入し、ネガティブマーカーとして用いた。それぞれのマーカーは、4つの終止コドンを有する25bpの非相同配列であり、終止コドンのうち2つは、LacZ遺伝子のリーディングフレーム内にある。25bpの非相同配列を、大きな四角により図3に示す。終止コドンは、四角で囲むか、または下線を付すかした。+−および−+型のLacZα遺伝子(図3)を含有する2つの1.0kbのLacZテンプレートの1:1混合物を、DNAseIで消化し、そして100〜200bpのフラグメントを実施例1に記載のように精製した。シャッフリングプログラムを、0.5μlのポリメラーゼを添加し、そして全容量が100μlであった以外は、実施例1における再組立について記載された条件と同様の条件下で実施した。
2.7kbプラスミド全体(pUC18−+およびpUC18+−)もまた、試験した。+−および−+型のLacZα遺伝子(図3)を含有する2つの2.9kbのプラスミドの1:1混合物を、DNAseIで消化し、そして100〜200bpのフラグメントを実施例1に記載のように精製した。プログラムが[94℃30秒間、55℃30秒間、72℃30秒間]の60サイクルであった以外は、上記の工程(1)における再組立について記載された条件と同様の条件下でシャッフリングプログラムを実施した。ゲル分析は,シャッフリングプログラム後、産物のほとんどが20kbよりも大きいことを示した。このようにして、2.7kbのプラスミド全体(pUC18−+およびpUC18+−)を、プライマーの添加なしにランダムな100〜200bpのフラグメントから効率的に再組立した。
シャッフリング混合物中に混合されるオリゴヌクレオチドは、テンプレートDNAに対するオリゴヌクレオチドのフランキング配列の相同性に基づき最終産物中に取り込まれ得る(図4)。上述のLacZ-終止コドン変異体(pUC18−+)をDNAseI消化テンプレートとして用いた。両末端に野生型LacZ遺伝子に対する18塩基の相同性を含有する66量体のオリゴヌクレオチドを、4倍モル濃度過剰量で反応物中に添加し、本来の遺伝子中に存在する終止コドン変異を補正した。シャッフリング反応を、上記の工程2における条件と同様の条件下で実施した。得られた産物を消化し、連結し、そして上述のようにE.coliに挿入した。
プラスミドpUC18を制限酵素EcoRI、Eco0109、XmnI、およびAlwNIで消化し、約370、460、770、および1080bpのフラグメントを産生した。これらのフラグメントを電気泳動し、そして2%低融点アガロースゲルから別々に精製した(370塩基対のバンドと460塩基対のバンドは、分離され得なかった)。これにより、3つの別個のチューブに、大きなフラグメント、中程度のフラグメント、および2つの小さなフラグメントの混合物を得た。
この実施例は、15塩基よりも少ない相同性に基づいて交差が得られ得ることを説明する。例として、ヒトおよびマウスのIL−1β遺伝子をシャッフリングした。
直接分子進化のための変異誘発DNAシャッフリングの利用性を、βラクタマーゼモデルシステムにおいて試験した。TEM−1βラクタマーゼは、非常に効率的な酵素であり、主に拡散によりその反応速度は限定される。この実施例は、その反応特異性を変化すること、および通常加水分解しない薬物セフォタキシムに対して耐性を得ることが可能であるかを決定する。
細菌のTEM−1βラクタマーゼ遺伝子を保有するpUC18誘導体を用いた(28)。TEM−1βラクタマーゼ遺伝子は、細菌に約0.02μg/mlのセフォタキシムに対する耐性を与える。2つのプライマー:
プライマーA(配列番号7):
5’TTCTATTGACGGCCTGTCAGGCCTCATATATACTTTAGATTGATTT3’およびプライマーB(配列番号8):
5’TTGACGCACTGGCCATGGTGGCCAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTT3’
を用いるベクター配列のPCRおよび2つの他のプライマー:
プライマーC(配列番号9):
5’AACTGACCACGGCCTGACAGGCCGGTCTGACAGTTACCAATGCTT、および
プライマーD(配列番号10):
5’AACCTGTCCTGGCCACCATGGCCTAAATACATTCAAATATGTAT
を用いるβラクタマーゼ遺伝子配列のPCRにより、プロモーターの5’および遺伝子の末端の3’にSfi1制限部位を付加した。
第1のシャッフリング反応のための基質は、プライマーCおよびD(両方ともSfiI部位を含有する)を用いるpUC182SfiのPCRにより得られた0.9kbのdsDNAであった。
精製したフラグメントを、10〜30ng/μlの濃度でPCR混合物(0.2mM 各dNTP、2.2mM MgCl2、50mM KCl、10mM Tris−HCl pH 9.0、0.1% Triton X−100)に再懸濁した。この時点でプライマーを添加しなかった。94℃60秒間、次いで[94℃30秒間、50〜55℃30秒間、72℃30秒間]の40サイクル、そして次いで72℃5分間の再組立プログラムを、MJ Research(Watertown MA)PTC−150サーマルサイクラーにおいて使用した。
0.8μMのそれぞれのプライマー(CおよびD)を有するPCR混合物への再組立産物の希釈、および20のPCRサイクル[94℃30秒間、50℃30秒間、72℃30秒間]の後、900bpのサイズの単一の産物を得た。
末端の制限酵素SfiIでの900bp産物の消化、およびアガロースゲル精製の後、900bp産物を、T4 DNAリガーゼ(BRL, Gaithersburg MD)を用いて唯一のSfiI部位でベクターpUC182Sfiに連結した。混合物を、E.coli XL1−blue細胞にエレクトロポレートし、そして0.32〜0.64μg/mlのセフォタキシム(Sigma, St.Louis MO)を有するLBプレートに播いた。細胞を、37℃で24時間まで増殖させ、得られたコロニーをプールとしてプレートから掻き取り、そして次の回のシャッフリングのためのPCRテンプレートとして用いた。
3回のシャッフリングのそれぞれの後に得られた形質転換体を、漸増するレベルのセフォタキシムに播いた。最も高いレベルのセフォタキシムを有するプレート由来のコロニー(>100、多様性を維持するために)をプールし、次の回のPCR反応のためのテンプレートとして用いた。
1,280μg/mlで生育した5つの最も大きいコロニーの全ては、野生型TEM−1酵素と同一な制限地図を有した。これらのコロニーの内の1つから得られたプラスミドのSfiI挿入物を、製造業者の指示に従い、ジデオキシDNA配列決定法(United States Biochemical Co., Cleveland OH)により配列決定した。全ての塩基番号は、改訂されたpBR322配列(29)に対応し、そしてアミノ酸番号は、ABL標準番号付けスキーム(30)に対応する。アミノ酸は3文字表記で示され、そしてヌクレオチドは1文字表記で示される。用語G4205Aは、ヌクレトチド4205が、グアニジンからアデニンに変化したことを意味する。
次いで非必須変異を除去するために、過剰量の野生型DNAを用いた分子戻し交配を用いた。
野生型プラスミド、非戻し交配変異体、および戻し交配変異体におけるβラクタマーゼ遺伝子の発現レベルを、Witholt, B.(32)の方法に従い浸透圧ショックにより調製された周辺質の抽出物のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(4〜20%;Novex, San Diego CA)により比較した。
変異の異なる組み合わせの耐性を決定するため、そして発表された変異体と新規の変異体とを比較するために、いくつかの変異体を、同一のプラスミドバックグ回中に構築した。2つの変異(Glu104LysおよびGly238Ser)は、セフォタキシム変異体として知られている。構築した全ての変異体の組み合わせは、プロモーター変異を有しており、これは選択された変異体の比較を可能にした。結果を図4に示す。
A10B scFv抗体、マウス抗ウサギIgGは、Pharmacia(Milwaukee WI)から寄贈された。pCANTAB5ファージディスプレイベクターを使用する市販のPharmaciaファージディスプレイシステムを使用した。
OH)。Kabat(33)との比較に基づくと、この配列は、既存の抗体と同様であった。
A10B野生型抗体遺伝子を有するファージDNA(10μl)を、99℃にて10分間インキュベートし、次いで72℃にて2分間インキュベートした。PCR混合物(50mM KCl、10mM Tris−HCl pH 9.0、0.1% Triton X−100、200μM 各dNTP、1.9mM MgCl)、0.6μmのそれぞれのプライマー、および0.5μl Taq DNAポリメラーゼ(Promega, Madison WI)をファージDNAに添加した。PCRプログラムを[94℃30秒間、45℃30秒間、72℃45秒間]の35サイクルにわたって実施した。用いたプライマーは:
5I ATGATTACGCCAAGCTTT 3I(配列番号26)および
5I TTGTCGTCTTTCCAGACGTT 3I(配列番号27)
であった。
300ngのゲル精製した850bpのバンドを、20分間室温にて、50mM Tris−HCl pH 7.5、10mM MgCl中で0.18単位のDNAse I(Sigma, St.Louis MO)で消化した。消化したDNAを、2%低融点アガロースゲルにおいて分離し、そして50〜200bp間のバンドをゲルから精製した。
本実験の目的は、CDRの挿入が効果的であるか否かを試験することである。
KCl、10mM Tris−HCl pH9.0、0.1% Triton
X−100、1.9mM MgCl、200μmの各dNTP、0.3μl Taq DNAポリメラーゼ(Promega、Madison WI)、総容積50μl)を添加し、そして94℃で1分間、72℃で1分間、次いで35サイクル:94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で30秒間のシャッフリングプログラムを行った。
外側プライマー1:配列番号27
5’ TTGTCGTCTTTCCAGACGTT 3’
外側プライマー2:配列番号26
5’ ATGATTACGCCAAGCTTT 3’
850bpのPCR生成物を制限酵素SfiIおよびNotIで消化し、低融点アガロースゲルから精製し、そしてPharmacia、Milwaukee
WIから得たpCANTAB5発現ベクターに連結した。Invitrogen (San Diego CA)により記載される方法に従って、 連結したベクターをTG1細胞(Pharmacia、Milwaukee WI)にエレクトロポレートし、そして単一のコロニーについてプレートした。
本発明者らの配列データに基づき、6つのCDRに対応する6オリゴヌクレオチドを作製した。CDR(Kabat定義)を70(個の存在塩基):10:10:10の比率で合成的に変異を誘発し、そして約20塩基のフランキング配列により5’末端および3’末端側に隣接させた。このフランキング配列は、変異を誘発しない抗体遺伝子フラグメントの混合物に過剰なモル量で混合する場合、CDRの取り込みに対して相同性を提供する。得られる変異配列を以下に示す。
外側プライマー1:配列番号27 5’ TTGTCGTCTTTCCAGACGTT 3’
外側プライマー2:配列番号26 5’ ATGATTACGCCAAGCTTT 3’。
850bpのPCR生成物を制限酵素SfiIおよびNotIで消化し、低融点アガロースゲルから精製し、そしてPharmacia、Milwaukee
WIから得たpCANTAB5発現ベクターに連結した。Invitrogen (San Diego CA)により記載される方法に従って連結したベクターをTG1細胞(Pharmacia Milwaukee WI)にエレクトロポレートし、そして製造業者により推薦されるガイドラインに従ってヘルパーファージを用いてファージライブラリーを増殖させた。
96ウェルのマイクロタイタープレートの15ウェルを、ウサギIgG(Jackson Immunoresearch、Bar Harbor ME)で10μg/ウェル、37℃で1時間コートし、次いでPBS中の2%のノンファットドライミルクで37℃で1時間ブロックした。
プラスミドを2つの部分で構築した。この2つの部分は、これらの2つの直列反復の共通範囲間の組換えが完全長の活性組換え遺伝子をもたらすことを示す同一遺伝子(β−ラクタマーゼ)の不活性コピーである。
プライマーA(配列番号46) 5’ TTCTATTGACGGCCTGTCAGGCCTCATATATACTTTAGATTGATTT 3’
プライマーB(配列番号47) 5’ TTGACGCACTGGCCATGGTGGCCAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTT 3’
および他の2つのプライマーを用いるβラクタマーゼ遺伝子配列のPCRによる場合:
プライマーC(配列番号48) 5’ AACTGACCACGGCCTGACAGGCCGGTCTGACAGTTACCAATGCTT 3’
プライマーD(配列番号49) 5’ AACCTGTCCTGGCCACCATGGCCTAAATACATTCAAATATGTAT 3’。
プライマー2650(配列番号50) 5’ TTCTTAGACGTCAGGTGGCACTT 3’
プライマー2493(配列番号51) 5’ TTT TAA ATC AAT
CTA AAG TAT 3’
プライマー2651(配列番号52) 5’ TGCTCATCCACGAGTGTGGAGAAGTGGTCCTGCAACTTTAT 3’、および
プライマー2652(配列番号53) 5’ ACCACTTCTCCACACTCGTGGATGAGCACTTTTAAAGTT 3’。
プライマー2650(配列番号50) 5’ TTCTTAGACGTCAGGTGGCACTT 3’と
プライマー2493(配列番号51) 5’ TTTTAAATCAATCTAAAGTAT 3’とを用いて標準的なPCR技術により増幅し、そして挿入物の長さを測定した。1kbの挿入物の存在は、図9および表5に示されるように遺伝子がうまく組換えられたことを示す。
β−ラクタマーゼ遺伝子の異なる対立遺伝子の2つの完全長コピーを有するプラスミドを構築した。2つの遺伝子の相同組換えによりこの遺伝子の1つの組換え完全長コピーを得た。
プライマー2650(配列番号50) 5’ TTCTTAGACGTCAGGTGGCACTT 3’
プライマー2649(配列番号51) 5’ ATGGTAGTCCACGAGTGTGGTAGTGACAGGCCGGTCTGACAGTTACCAATGCTT 3’
第2のPCR反応を以下のプライマーを用いて行った:
プライマー2648(配列番号54) 5’ TGTCACTACCACACTCGTGGACTACCATGGCCTAAATACATTCAAATATGTAT 3’
プライマー2493(配列番号51) 5 TTT TAA ATC AAT CTA AAG TAT 3’
これにより2つのBla遺伝子(一方のBla遺伝子は5’末端Sfi1部位および3’末端BstX1部位を有し、他方のBla遺伝子は5’末端BstX1部位および3’末端Sfi1部位を有する)を得た。
さらに迅速に耐性細胞を生産するために多数サイクルの組換えを用い得るか否かを決定するために、実施例9に記載される多数サイクルの方法を行った。
pUC18Sfi−Bla−Sfiを含む適切なE.coli細胞を記載のように調製した。プラスミドpUC18Sfi−Bla−Sfiは、前出に記載のような標準的なTEM−1 β−ラクタマーゼ遺伝子を含有する。
本実験は、どの組換え形式が1サイクルあたり最大の組換え体を生成するかを決定するために設計された。
最適化された表現型(例えば、クローニング遺伝子のような、ベクターがコードされる配列の最大の発現)を与え得るベクターを提供するために、シャッフリングされ得る種々のカセットを含むキットが提供され、そして最適化されたシャッフリング体が選択され得る。図12は、それぞれの遺伝子座が複数のカセットを有する1つの実施態様を概略的に示す。例えば、細菌の発現システムにおいて、図13はそれぞれの遺伝子座で使用される例示のカセットを示す。与えられた遺伝子座のそれぞれのカセット(例えば、本実施例のすべてのプロモーター)は、隣接する遺伝子座のカセットのフランキング配列に重複し得、そしてまた、好ましくは相同組換えまたは非相同組換えに関与し得る(例えば、lox/creまたはflp/frt系)実質的に同一な配列と隣接し、遺伝子座内であるが実質的に遺伝子座間ではないカセットのシャッフリングを提供するようにする。
(背景)
緑色蛍光タンパク質(「GFP」)は、238アミノ酸残基および約27,000の分子量を有するアポタンパク質由来のポリペプチドである。GFPは、アミノ酸残基65〜67から形成される発色団を含む。その名前が示すように、GFPは蛍光を発する;それは、ルシフェラーゼのように生体発光しない。インビボでは、GFPの発色団は、発光タンパク質エクオリンと複合体化したコエレンテラジン(coelenterazine)からのエネルギー転移により活性化され、GFPは510nmでの緑色蛍光を示す。青色光またはUV光での照射の際には、GFPは、約510nmで緑色蛍光を示す。
緑色蛍光タンパク質(GFP)は、遺伝子調節のレポーターとして急速に幅広く使用されるようになってきている。しかし、多くの生物(特に、真核生物)において全細胞の蛍光シグナルは低すぎることが見出された。目的は、E.coliおよび哺乳動物細胞に対する遺伝子調節のレポーターとして使用するためにGFPの全細胞蛍光を改善することであった。GFPの量子収率は既に0.7〜0.8であり(Wardら、(1982) Photochem.Photobiol.35:803)、そして標準的なE.coli構築物におけるGFPの発現レベルは、既に総タンパク質の75%であったので、合理的な設計によるGFPの改善は、困難であると思われた。
(GFP遺伝子構築)
公開された配列(Prasherら、(1995)、前出、これは本明細書中に参考として援用される)(238AA、27kD)を有する、GFPタンパク質をコードする遺伝子を、オリゴヌクレオチドから構築した。市販のGFP構築物(Clontech, Palo Alto, CA)とは対照的に、この配列は、元のcDNAクローンに見出されるように、fMetの後にAla残基を含んでいた。54〜85塩基の範囲の14オリゴヌクレオチドを、PCR伸長により7対として組み立てた。これらのセグメントを、制限酵素により消化し、そしてベクターAlpha+GFP(Whitehornら、(1995) Bio/Technology 13:1215、これは本明細書中に参考として援用される)に別々にクローニングし、そして配列決定した。次いで、これらのセグメントを、真核生物発現ベクターAlpha+に連結して、完全長GFP構築物、Alpha+GFPを形成した(図14)。得られたGFP遺伝子は、アミノ酸73位(CGT)、80位(CGG)、96位(CGC)、および122位(CGT)で変化したアルギニンコドンを含んでいた。コドンの偏りを減少させ、そしてE.coliにおける発現を容易にするために、多くの他のサイレント変異を配列に操作して、遺伝子の組立に使用される制限部位を作製した。これらは、S2(AGTからAGC;NheI部位を作製するため)、K41(AAAからAAG;HinDIII)、Y74(TACからTAT)、およびP75(CCAからCCG;BspE1)、T108(AGAからAGG;NnuI)、L141(CTCからTTG)、およびE142(GAAからGAG;XhoI)、S175(TCCからAGC;BamHI)、ならびにS202(TCGからTCC;SalI)であった。この遺伝子の5’および3’非翻訳末端は、それぞれ、XbaI部位およびEcoRI部位を含んでいた。遺伝子の配列を、配列決定により確認した。
J.Bacteriol.177:4121)にサブクローニングし、細菌発現ベクターpBAD18−GFP(図14)を得た。このベクターにおいて、GFP遺伝子発現は、アラビノースプロモーター/リプレッサー(araBAD)の制御下にあり、これはアラビノース(0.2%)で誘導可能である。これは、元のアミノ酸配列を有する唯一の構築物であるので、野生型GFP(「WT」)と呼ばれる。GFP発現細菌ベクターを、Clontech(Palo Alto, CA )から入手したが、これは本明細書中で「Clontech」構築物という。「Clontech」構築物からのGFP発現は、IPTG誘導を必要とする。
全GFP遺伝子を含む約1kbのDNAフラグメントを、プライマー5’TAGCGGATCCTACCTGACGC(NheI付近)および5’GAAAATCTTCTCTCATCCG(EcoRI付近)を用いるPCRによりPBAD−GFPベクターから得、そしてWizard PCR prep(Promega, Madison, WI)により精製した。このPCR産物を、DNase I(Sigma)を用いてランダムフラグメントに消化し、そして50〜300bpのフラグメントを、2%低融点アガロースゲルから精製した。精製したフラグメントを、Taq DNAポリメラーゼ(Promega)と共にPCR混合物(Promega, Madison, WI;0.2mM 各dNTP/ 2.2mM MgCl2/ 50mM KCl/ 10mM Tris−HCl、pH9.0/0.1% Triton−X−100)に10〜30ng/μlで再懸濁し、そしてStemmer, WPC (1994) Nature 370:389(本明細書中に参考として援用される)に記載されたように、94℃30秒、45℃30秒、72℃30秒の35サイクルのPCRプログラムを用いて(プライマーを用いずに)組み立てた。この反応産物を、新しいPCR混合物に40倍に希釈し、そして完全長産物を、94℃30秒、50℃30秒、72℃30秒、続いて72℃10分間の25サイクルのPCRで同じ2つのプライマーを用いて増幅した。NheIおよびEcoRIを用いた再組立産物の消化の後、点変異させ、そしてインビトロで組換えたGFP遺伝子のこのライブラリーを、PBADベクターにクローニングし戻し、E.coli TG1(Pharmacia)にエレクトロポレーションし、そして100μg/mlアンピシリンおよび0.2%アラビノースを含むLBプレートにプレーティングして、アラビノースプロモーターからのGFP発現を誘導した。
標準UV光ボックス(365nm)の上で、40の最も明るいコロニーを選択し、そしてプールした。コロニーのプールをPCR反応のテンプレートとして使用し、GFP遺伝子のプールを得た。サイクル2および3を、サイクル1と同一に行った。サイクル3の最良の変異体を、マイクロタイタープレート中でコロニーを増殖させ、そしてマイクロタイタープレートで、蛍光分光測定することにより同定した。
GFP遺伝子の野生型ならびにサイクル2および3変異体バージョンを、EcoRI−XbaIフラグメントとして、真核生物発現ベクターAlpha+(16)に移入した。プラスミドを、400Vおよび250μFで、40μgのプラスミドを含む0.8ml中で107細胞のエレクトロポレーションによりCHO細胞にトランスフェクトした。形質転換体を、10〜12日間、1mg/ml G418を用いて選択した。
(コドン使用頻度)
コドン使用頻度が改変された合成GFP構築物(「WT」)を発現するE.coliは、「Clontech」構築物を発現する細胞よりほぼ3倍大きな全細胞蛍光シグナルを生じた(図15A)。この比較を、完全な誘導および等しいOD600で行った。「WT」構築物中の乏しいアルギニンコドンの置換および「Clontech」構築物に存在するN末端伸長に加えて、発現ベクターおよびGFPプロモーターは全く異なる。蛍光シグナルの改善の原因は、発現レベルの増強でなはく、タンパク質性能の改善である。
合成「WT」GFP構築物の蛍光シグナルを、本明細書中およびStemmer WPC (1994) Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.) 91:10747およびStemmer WPC (1994) Nature 370:389(これらは、本明細書中に参考として援用される)に記載される有性PCR法により、変異体ライブラリーを構築し、続いてプレーティングし、そして最も明るいコロニーを選択することにより、さらに改善した。有性PCRおよび選択の2回目のサイクルの後、「WT」より約8倍、そして「Clontech」構築物より23倍改善された、変異体(「サイクル2」)を得た。3回目のサイクルの後、「WT」構築物より約16〜18倍、そして「Clontech」より45倍大きく改善された、変異体(「サイクル3」)を得た(図15B)。変異体の励起および放出スペクトルのピーク波長は、「WT」構築物のそれと同一であった。全細胞のSDS−PAGE分析により、3つ全ての構築物で発現したGFPタンパク質の総レベルは、総タンパク質の約75%という驚くべき高い割合で変化しないことが示された(図16、パネル(a)および(b))。超音波処理および遠心分離による細胞の分画化により、「WT」構築物は封入体の形態でほとんど不活性なGFPを含むが、「サイクル3」変異体GFPはほとんど可溶性のままであり、そしてその発色団を活性化し得ることが示された。変異遺伝子を配列決定し、そして「サイクル1」変異体は、「サイクル3」変異体よりも多く変異を含むことが見出された(図17)。「サイクル3」は、「WT」構築物と比較して3つのタンパク質変異および3つのサイレント変異を含んでいた。変異F100S、M154T、およびV164Aは、疎水性残基のより親水性残基での置換を含む(KyteおよびDoolittle、1982)。1つのもっともらしい説明は、天然のGFPは、その表面上に疎水性部位を有し、これによりエクオリンまたは別のタンパク質に正常に結合することである。この他のタンパク質がなければ、疎水性部位は凝集を引き起こし得、そして発色団の自己触媒活性化を妨げ得る。3つの親水性変異体は、疎水性部位を相殺し得、これは凝集の低減および発色団活性化の増大をもたらす。37℃での全細菌を用いたパルスチェイス実験により、発蛍光団形成のT1/2は、「WT」GFPおよび「サイクル3」変異体GFPの両方について95分であることが示された。
自己フォールディングのような自立的特性における改善は、異なる細胞環境に移入可能であり得る(tranferable)。細菌において選択した後、「サイクル3」変異GFPを、真核生物Alpha+ベクターに移入し、そしてチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)において発現させた。E.coliにおいて「サイクル3」構築物は、「WT」構築物より16〜18倍強いシグナルを与えたが、「サイクル3」変異体を発現するCHO細胞の蛍光分光測定は、同一の条件下で「WT」構築物より42倍大きな全細胞蛍光シグナルを示した(図18A)。FACS分別により、「サイクル3」を発現するCHO細胞クローンの平均蛍光シグナルは、「WT」構築物を発現するCHO細胞より46倍大きいことが確認された(図18B)。「WT」構築物に関する限りでは、2mMの酪酸ナトリウムの添加により、蛍光シグナルが約4〜8倍増加することが見出された。
これらの結果を、約10,000コロニーの視覚的スクリーニングにより得、そして最も明るい40のコロニーを各サイクルで採集した。タンパク質機能における著しい改善を、比較的少ない数の改変体により得ることができた。この驚くべき発見を考慮すると、有性PCRは、多数の商業的に重要な酵素の最適化(これについては、大規模な変異体選択は実行可能でも効率的でもない)のために改善されたプロセスとして、高スループットスクリーニング手順と組合せ得る。
(背景)
一旦組換え体がファージディスプレイライブラリー、ポリソームディスプレイライブラリーなどから特徴づけられると、元々ディスプレイされた(displayed)配列の改変体をディスプレイする第2世代ライブラリーを構築およびスクリーニングすることはしばしば有用である。しかし、7残基より長いポリペプチドの組合せの数は非常に多いので、全ての順列は、一般的に一次ライブラリーには存在しない。さらに、配列を変異することにより、単離された配列周辺の「配列景観(landscape)」は、局所的最適(local optima)を見出すために調べられ得る。
インビトロで変異を作製するための開示された方法は、DNAシャッフリングとして知られている。DNAシャッフリングの実施態様において、遺伝子は、DNase Iで小さなランダムフラグメントに破壊され、次いでPCR様反応において、典型的にはいずれのプライマーも使用することなく再組立される。再組立するプロセスは、プルーフリーディングポリメラーゼの非存在下では変異原性であり得、エラー率が約0.7%まで生じる。これらの変異はトランジションおよびトランスバージョンの両方からなり、これらは、しばしば再組立されたセグメント長にわたってランダムに分布する。
(例示的な変異誘発プロトコル)
組換えDNAを基礎とした変異誘発の形態は、オリゴヌクレオチド媒介部位指定変異誘発として知られている。オリゴヌクレオチドは、標的DNAと塩基対を形成するが、一方このオリゴヌクレオチドの中心部近くで1つ以上の塩基が異なるように設計される。このオリゴヌクレオチドが一本鎖テンプレートDNAと塩基対形成した場合、ヘテロ二重鎖は、インビトロで二本鎖DNAに変換される;このように、一本鎖の産物は、変異原性オリゴヌクレオチドにより、ヌクレオチド配列を特異的にする。次いで、これらのDNA分子は、インビボで増殖され、そして所望の組換え体は、最終的に、形質転換体の集団間で同定される。
3.1μgの一本鎖DNA、10ngのオリゴヌクレオチド、20mM Tr@Cl(pH7.4)、2mM MgCl2、50mM NaClを含む、500μlのEppendorfチューブ中でオリゴヌクレオチドと一本鎖DNAとをアニーリングする。
コーディング領域内の特定の部位で変異を導入する簡便な手段は、カセット変異誘発によるものである。「カセット」は、いくつかの異なる方法により作製され得る:A)2つのオリゴヌクレオチドを共にアニーリングし、そしてそれらを二本鎖DNAに変換することによる;B)最初に、ランダム化された配列を有するオリゴヌクレオチドを用いてDNAのセグメントを増幅し、次いでこのDNAを再増幅してクローニングのためのカセットを作製するにことによる;C)最初に、DNAセグメントの各半分を、ランダム化された配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて増幅し、次いで2つの断片を共に加熱して、クローニングのためのカセットを作製することによる;およびD)誤りがちなPCRによる。これらの4つの手順により形成されたカセットは、長さおよびコーディングフレームが固定されているが、低頻度で不特定なコドンを有する。従って、カセットのクローニングおよび発現は、カセットの全長に沿って1つ以上の変異残基を有する、複数のペプチドまたはタンパク質を生成する。
1.固定位置および変異位置を有するオリゴヌクレオチドを設計する。固定位置は、結合または機能に必須であると推測されるクローニング部位およびそれらのコーディング領域に対応しなければならない。
1.固定位置および変異位置を有するオリゴヌクレオチドを設計する。固定位置は、結合または機能に必須であると推測されるクローニング部位およびそれらのコーディング領域に対応しなければならない。各位置で別々の3つのヌクレオチドの画分(x)で合成された長さ(m)のポリヌクレオチドカセットにおいて、誤り(n)を見出す確率を以下のように表す:
P=[m!/(m−n)n!][xn][1−X]m-n。
1.固定位置および変異位置を有するオリゴヌクレオチドを設計する。固定位置は、結合または機能に必須であると推測されるクローニング部位結合およびそれらのコーディング領域に対応しなければならない。20アミノ酸全てをコードする特定の制限酵素部位でオリゴヌクレオチドのセットを挿入するための1つの方法が記載されている(Kegler−Eboら、(1994) Nucl.Acids Res.22:1593(これは本明細書中に参考として援用される))。
増幅の間に変異のレベルを上昇させるための、標準的なPCR条件(Saikiら、(1988) Science 239:487(これは、本明細書中に参考として援用される))に基づいたいくつかのプロトコルが存在する。上昇したdNTP濃度およびMn+2の添加は、変異速度を著しく増加させる。変異は理論的にはランダムに導入されるので、これは、新規のタンパク質の集団を生成するための1つの機構である。一方、誤りがちなPCRは、コード領域が短いので、短いペプチド配列を改変するのにはあまり適切ではなく、そして変化の速度が遅すぎて、選択に適切な数の変異体を生成できない。また、これは、コーディング領域内で多くの変異が存在して解析を複雑にするので、長いタンパク質についても理想的でない。
1pmoleの各プライマー;1pmoleのDNAテンプレート;100mM NaCl、1mM MnCl2、1mM DTT、0.2mMの各dNNP、2単位のTaq DNAポリメラーゼ。
DNAシャッフリングにおいて、遺伝子は、ホスホジエステル結合溶解剤(例えば、DNase I)を用いて小さなランダムフラグメントに破壊され、次いで、PCR様反応(しかし、いずれのプライマー添加も必要としない)において再組立される。再組立するプロセスは、プルーフリーディングポリメラーゼの非存在下では変異原性であり得、これは10〜50bpのフラグメントが使用される場合、約0.7%までの誤りを生じる。
2.遊離プライマーを取り除く。プライマーを完全に除去することが重要である。
ヒ素解毒は、金鉱を含む硫砒鉄鉱の金採掘および他の使用(例えば、環境改善)に重要である。ヒ酸塩解毒オペロンをコードするオペロンを含むプラスミドpGJ103(Wangら、(1989) Bateriol.171:83(これは、本明細書中に参考として援用される))を、Prof.Simon
Silver (U.of Illinois, Chicago, IL)から入手した。pGJ103(pUC19にクローニングされたp1258 arsオペロンを含む)を含むE.coli TG1は、LB ampプレート上で4μg/mlのMIC(最小阻害濃度)を有していた。全5.5kbのプラスミドを、DNase Iを用いて100〜1000bpのフラグメントにフラグメント化し、そしてPerkin Elmer XL−PCR試薬を用いてPCRにより再組立した。組立後、プラスミドを、独特の制限酵素BamHIを用いて消化した。完全長モノマーを、アガロースゲルから精製し、連結し、そしてE.coli TG1細胞にエレクトロポレーションした。形質転換細胞を、一定の範囲のヒ酸ナトリウム濃度(1回目では2、4、8、16mM)上にプレーティングし、そして最高のヒ酸塩レベルを有するプレートから約1000コロニーを、プレートをかきとることによりプールした。細胞を、同濃度のヒ酸塩の存在下で液体中で増殖させ、そしてプラスミドをこの培養物から調製した。2回目および3回目は、細胞をより高いヒ酸塩濃度でプレーティングした以外は1回目と同一であった。8、16、32、64mMを2回目に使用した;そして32、64、128、256mMを3回目の選択に使用した。
水銀解毒のためのオペロンを含むプラスミドpYW333は、水銀解毒の経路をコードする少なくとも8つの遺伝子を含む15.5kbのプラスミドであり(Wangら、(1989) Bateriol, 171:83,(これは、本明細書中に参考として援用される))、Prof.Simon Silver (Univ.Illinois, Chicago, IL)から入手した。400〜1500bpのフラグメントを、上述のように得、そしてXL−PCR試薬を用いて再組立した。組立されたDNAのE.coli TG1への直接的なエレクトロポレーションの後、細胞を、実施例15でヒ酸塩について記載されたのと類似のプロトコル下で、一定の範囲レベルの塩化水銀(Sigma)上にプレーティングした。水銀の最初のMICは、50〜70μMであった。4サイクルの全プラスミドシャッフリングを行い、そして約50〜70μMから1000μMを超えて水銀に対する細菌耐性として測定された解毒を増大させた(15〜20倍の改善)。
相補的DNA鎖の再生の確率は、シャッフリングする長い複雑な配列を制限するようになる。この再生の確率は、単純なカチオン性界面活性剤の添加より10,000倍増強され得る(PontiusおよびBerg(1991) PNAS 88:8237)。再生は特異的であり、そして106倍までの過剰な異種DNAから独立している。これらの薬剤の存在下で、相補的DNA鎖が溶液中でそれぞれの他方に遭遇する確率は限定的になる。
スタッタリングは、テンプレートの不完全なポリメラーゼ伸長によるフラグメント化である。非常に短いPCR伸長時間に基づく組換え形式を利用して、部分的なPCR産物を作製する。これは、次の(および引き続く)サイクルにおいて異なるテンプレートから伸長し続ける。非常に類似したテンプレート間には強い増殖速度の偏りが存在し、これはこの形式が、複雑なプールにへの適用について著しい制限を有することを示す。エアサイクラーのような急速なサイクラーと共に使用する場合、この形式は、より良好に作用し得る。
(1994) Nature 370:389−391により以前に記載されたように、得られた完全長遺伝子をSfiIを用いて消化し、そして新鮮なpUC322Sfi−Sfiベクターに連結し、そして新鮮なE.coli細胞にエレクトロポレーションし、そして漸増濃度のいくつかの抗生物質(セフォタキシムを含む)上にプレーティングした。
1−変性94℃20秒
2−迅速な冷却:ドライアイスエタノール5秒、氷15秒
3−Klenow酵素添加
4−アニール/伸長2分25℃
5−変性へサイクルし戻す(サイクル1)
これを、テンプレートスイッチングを開始するために10〜20サイクル反復し、この後、熱安定性ポリメラーゼを用いた通常のPCRを、産物量を増幅するためにさらに10〜20サイクル続ける。
安定なかつ良好に発現するヒト単鎖Fvフレームワーク(VH251−VLA25)を、ジフテリア毒素に対する結合についての選択により、天然のヒトmRNAから構築されたAbファージライブラリーから得た。このscFvフレームワークを用いて、生殖系配列に基づく6つの合成的に変異させたCDRを含む天然のAbファージライブラリーを構築した。各残基の変異誘発の程度は、そのV領域ファミリー内のその天然に存在する変異性に類似していた。
が、32〜65%の効率および広範な種々の組合せで取り込まれた。変異CDRの配列決定により、観察された変異率が予測した率と適合することを示した。
プラスミドベクターpCMV−GFP(これは、GFPをコードしそしてCMVプロモーターの制御下でそれを発現させる)を、TG1細胞内で増殖させ、そしてこれを用いて、一過性発現アッセイのためにCHO細胞をトランスフェクトした。
プロテイナーゼK法:投入量−5×104 レスキュー 3×104
PreTaq法:投入量−5×104 レスキュー 2×104。
以下の参考文献は、本願の関連部分で本願において引用される。
本発明のさらなる利点については、添付の図面を参考にして、本発明の以下の記載から明らかになる。
Claims (1)
- 所望の機能的性質の獲得のための改変体ポリヌクレオチドを進化させる方法であって、
ポリヌクレオチドの複数の改変体を含む最初の基質においてポリヌクレオチド増幅反応を行う工程であって、ここで、該増幅反応の少なくとも1サイクルは、該ポリヌクレオチドの不完全な伸長増幅改変体を含む少なくとも20%の増幅産物を産生する条件下で行われる不完全な増幅サイクルであり、該増幅産物を成分鎖に変性させ、該成分鎖は異なった対形成で再アニールして組換え増幅産物を形成し、該組換え増幅産物は、該増幅産物が複数の交差を有する該ポリヌクレオチドの組換え改変体を含むまで、後続の増幅サイクルのための基質を形成する、工程;および
該ポリヌクレオチドの組換え改変体を、該所望の機能的性質を有する少なくとも1つの組換え改変体を同定するために選択またはスクリーニングする工程、
を包含する、方法。
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