ES2164929T5 - Metodos para producir polinucleotidos con caracteristicas deseadas por seleccion interactiva y recombinacion. - Google Patents

Metodos para producir polinucleotidos con caracteristicas deseadas por seleccion interactiva y recombinacion. Download PDF

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Abstract

SE DESCRIBE UN METODO PARA LA REUNION DE DNA DESPUES DE LA FRAGMENTACION AL AZAR Y SU APLICACION A LA MUTAGENESIS DE SECUENCIAS DE ACIDO NUCLEICO MEDIANTE RECOMBINACION IN VITRO O IN VIVO. EN PARTICULAR, SE DESCRIBE UN METODO PARA LA PRODUCCION DE FRAGMENTOS DE ACIDO NUCLEICO O POLINUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN PROTEINAS MUTANTES. LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UN METODO PARA LA REALIZACION DE CICLOS REPETIDOS DE MUTAGENESIS, MEZCLADO Y SELECCION QUE PERMITEN LA EVOLUCION MOLECULAR DIRECTA DE PROTEINAS IN VITRO O IN VIVO.

Description

Métodos para producir polinucleótidos con características deseadas por selección interactiva y recombinación.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método para la producción de polinucleótidos confiriendo un fenotipo deseado y/o codificando una proteína con una propiedad ventajosa predeterminada que puede ser seleccionada o filtrada. En un aspecto, el método se utiliza para generar, seleccionar o cribar fragmentos de ácido nucleico deseados que codifican proteínas mutantes.
Antecedentes y descripción de la técnica relacionada
La complejidad de una secuencia activa de una macromolécula biológica, por ej. proteínas, ADN, etc., ha sido denominada su contenido de información ("IC"; 5-9). El contenido de información de una proteína se ha definido como la resistencia de la proteína activa a la variación de la secuencia de aminoácidos calculada a partir del número mínimo de aminoácidos invariables (bits) requeridos para describir una familia de secuencias relacionadas con la misma función (9, 10). Las proteínas que son sensibles a la mutagénesis aleatoria tienen un alto contenido de información. En 1974, cuando se estableció esta definición, la diversidad proteínica existía sólo como una diversidad taxo-
nómica.
Los desarrollos de biología molecular tales como las bibliotecas moleculares han permitido la identificación de un número superior de bases variables, e incluso la selección de secuencias funcionales de bibliotecas aleatorias. La mayoría de los residuos pueden ser alterados, aunque generalmente no todos a la vez, ya que se debe tener en cuenta la compensación de los cambios en el contexto. De esta forma, una proteína de aminoácido 100 puede contener sólo 2.000 mutaciones diferentes, y 20^{100} combinaciones posibles de mutaciones.
La densidad de información es el Contenido de Información/longitud de unidad de una secuencia. Los lugares activos de enzimas tienden a tener una alta densidad de información. En contraste, los enlaces flexibles en enzimas tienen una densidad de información baja (8).
Los métodos actuales de uso difundido para crear proteínas mutantes en formato de biblioteca son la reacción en cadena de la polimerasa con tendencia al error (11, 12, 19) y la mutagénesis "de cassette" (8, 20, 21, 22, 40, 41, 42), en los que la zona específica que debe ser optimizada es reemplazada con un oligonucleótido mutagenizado de forma sintética. De forma alternativa, las cepas mutágenas de células huésped han sido utilizadas para añadir frecuencia mutacional (Greener and Callahan (1995) Strategies in Mol. Biol. 7: 32). En cada caso, se genera una "nube de mutantes" (4) alrededor de algunos lugares en la secuencia original.
La tendencia al error de la RCP (Reacción en cadena de polimerasa) emplea unas condiciones de polimerización de baja fidelidad para introducir un bajo nivel de mutación puntual de forma aleatoria sobre una secuencia larga. La tendencia al error de la RCP puede ser utilizada para mutagenizar una mezcla de fragmentos de secuencia desconocida. Sin embargo, las simulaciones electrónicas han sugerido que la mutagénesis puntual sola pueda ser a menudo demasiado gradual como para permitir los cambios de bloque requeridos para la evolución de secuencia continua. Los protocolos de tendencia al error de la RCP publicados son generalmente inapropiados para una amplificación fiable de los fragmentos de ADN superiores comprendidos entre 0,5 y 1,0 kb, lo que limita su aplicación práctica. Además, los ciclos reiterados de tendencia al error de la RCP preceden a una acumulación de mutaciones neutras, la cual, por ejemplo, puede crear un inmunogénico proteínico.
En la mutagénesis dirigida por un oligonucleótido, una secuencia corta es reemplazada con un oligonucleótido mutagenizado de forma sintética. Esta aproximación no genera combinaciones a mutaciones distantes y por lo tanto, no es significativamente combinatoria. El tamaño relativamente limitado de la biblioteca respecto a la gran longitud de la secuencia implica que se requieran diferentes etapas de selección para la optimización proteínica. La mutagénesis con oligonucleótidos sintéticos requiere la secuenciación de clones individuales después de cada etapa de selección seguida del reagrupamiento en familias, eligiendo de forma arbitraria una única familia y reduciéndola a un motivo unánime que vuelve a ser sintetizado e introducido en un único gen seguido de selección adicional. Este proceso constituye un cuello de botella estadístico, se trata de un trabajo muy laborioso y nada práctico para muchas etapas de mutagénesis.
La tendencia al error de la RCP y la mutagénesis dirigida a un oligonucleótido son por lo tanto útiles para los ciclos únicos de buena sintonía de secuencia pero conocen una rápida limitación cuando se aplica en el caso de ciclos múltiples.
La tendencia al error de la RCP puede utilizarse para mutagenizar una mezcla de fragmentos de secuencia desconocida (11, 12). Sin embargo, los protocolos de tendencia al error de la RCP publicados (11, 12) sufren de una baja procesividad de la polimerasa. En consecuencia, el protocolo es muy difícil de emplear para la mutagénesis aleatoria de un gen de tamaño medio. Esta incapacidad limita la aplicación práctica de tendencia al error de la RCP.
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Otra limitación seria de la tendencia al error de la RCP es que el aumento del nivel de mutaciones desfavorecedoras crece con el contenido de información de la secuencia. En un determinado contenido de información, tamaño de biblioteca y nivel de la mutagénesis, el equilibrio entre las mutaciones desfavorecedoras respecto a las mutaciones favorecedoras impedirá, de forma estadística la selección de mejoras posteriores (límite superior estadístico).
Finalmente, los ciclos repetidos de tendencia al error de la RCP también preceden a la acumulación de mutaciones neutras, que puede influir, por ejemplo, en la inmunogenicidad pero no en la afinidad de enlace.
De esta forma se ha constatado que la tendencia al error de la RCP es demasiado gradual para permitir los cambios de bloque requeridos para la evolución continua de la secuencia (1, 2).
En la mutagénesis "de cassette", un bloque de secuencia de un único modelo es reemplazado (parcialmente) generalmente por una secuencia aleatoria. En consecuencia, el contenido de información máximo que puede obtenerse es limitado estadísticamente por el número de secuencias aleatorias (es decir, tamaño de la biblioteca). Esto constituye un cuello de botella estadístico, lo que elimina otras familias de secuencia que actualmente no son mejores, pero que a largo plazo pueden tener un mejor potencial.
Además, la mutagénesis con oligonucleótidos sintéticos requiere la secuenciación de clones individuales después de cada etapa de selección (20). En consecuencia, esta proximidad es tediosa y poco práctica para muchas etapas de mutagénesis.
De esta forma, la tendencia al error de la RCP y la mutagénesis "de cassette" son más adecuadas y han conocido un uso extendido para la buena sintonía de regiones que en comparación, cuentan con un bajo contenido informativo. Un ejemplo es la selección de una ribozima ligasa ARN de una biblioteca aleatoria mediante el uso de muchas etapas de amplificación por tendencia al error de la RCP y por selección (13).
Se ha puesto de manifiesto que las herramientas de nuestros científicos para el diseño de secuencias biológicas lineales de recombinación como la proteína, ARN y ADN no son adecuadas para la generación de la diversidad de secuencia necesaria para optimizar las diferentes propiedades deseadas de una macromolécula u organismo. El hecho de encontrar unos mutantes cada vez mejores depende de la necesidad de buscar cada vez más secuencias dentro de bibliotecas cada vez más grandes, al igual que una mayor cantidad de números de ciclos de amplificación y de selección mutagénica. Sin embargo, tal y como se ha mencionado con anterioridad, los métodos de mutagénesis existentes que cuentan con un uso difundido presentan diferentes limitaciones en su uso en ciclos repetidos.
La evolución de la mayoría de los organismos se produce por selección natural y reproducción sexual. La reproducción sexual asegura la mezcla y la combinación de los genes de descendencia de los individuos seleccionados. Durante la meiosis, los cromosomas homólogos de los padres se alinean el uno con el otro y atraviesan una parte de su longitud, intercambiando de esta forma el material genético. Este tipo de intercambio o de transposición del ADN permite que los organismos evolucionen de una forma más rápida (1, 2). En el caso de recombinación sexual, puesto que las secuencias introducidas tuvieron una utilidad probada en un ambiente homólogo, dichas secuencias introducidas pueden seguir incluyendo un contenido de información sustancial tras su introducción en la nueva secuencia.
Marton et al., (27) describen el uso de la RCP in vitro para el control de la recombinación en un plásmido con secuencias directamente repetidas. Marton et al. exponen que la recombinación se producirá durante la RCP como resultado de la ruptura o complementación del ADN. Esto producirá el aumento de moléculas recombinantes. Meyerhans et al. (23) también revelan la existencia de la recombinación de ADN durante la RCP in vitro.
El término evolución molecular aplicada ("AME") hace referencia a la aplicación de un algoritmo de diseño evolutivo para un objetivo útil y específico. Aunque se ha presentado un gran número de formatos diferentes de biblioteca de AME para polinucleótidos (3, 11-14), péptidos y proteínas (fago (15-17), lad (18)) y polisomas, en ninguno de estos formatos se ha utilizado una recombinación por cruces aleatorios para crear deliberadamente una biblioteca combinatoria.
En teoría, existen 2.000 mutantes diferentes únicos de una proteína de 100 aminoácidos. Una proteína de 100 aminoácidos tiene 20^{100} combinaciones posibles de mutaciones, número que es demasiado grande para ser explorado por los métodos convencionales. Sería ventajoso desarrollar un sistema que permita la generación y el cribado de todas estas posibles combinaciones de mutaciones.
Winter y colaboradores (43,44) han utilizado un sistema de recombinación específica de sitio in vivo para combinar genes de anticuerpos de cadena ligera con genes de anticuerpos de cadena pesada para su expresión en un sistema de fago. Sin embargo, su sistema se basa en sitios específicos de recombinación, por lo que está limitado. Hayashi et al. (48) muestran una mutagénesis simultánea de regiones RDC de anticuerpos en anticuerpos de cadena única (scFv) por extensión de superposición y RCP.
Caren et al. (45) describen un método para generar una amplia población de mutantes múltiples mediante el uso de una recombinación aleatoria in vivo. Sin embargo, su método requiere la recombinación de dos bibliotecas diferentes de plásmidos, donde cada biblioteca tendría un marcador seleccionable diferente. De esta forma, el método se limita a un número finito de recombinaciones equivalente al número existente de marcadores seleccionables, a la vez que produce un aumento lineal concomitante en el número de genes marcadores conectados a la(s) secuencia(s) seleccionada(s). Caren et al. no describen el uso de ciclos de selección múltiple; la recombinación se utiliza solamente para construir bibliotecas de mayor tamaño.
Calogero et al. (46) y Galizzi et al. (47) muestran que la recombinación in vivo entre dos genes homólogos pero truncados de toxinas de insectos sobre un plásmido pueden producir un gen híbrido. Radman et al. (49) hacen referencia a una recombinación in vivo de secuencias de ADN sustancialmente desequilibradas en una célula huésped que tiene enzimas de reparación del desequilibrio defectuoso, dando como resultado la formación de moléculas híbridas.
Sería ventajoso desarrollar un método para la producción de proteínas mutantes cuyo método permitiera el desarrollo de grandes bibliotecas de secuencias de ácidos nucleicos mutantes que se pudieran buscar con facilidad. La invención descrita en este caso se refiere al uso de ciclos repetidos de mutagénesis puntual, transposición del ácido nucleico y selección permitiendo la evolución molecular dirigida in vitro de secuencias lineales altamente complejas, como es el caso de las proteínas mediante recombinación aleatoria.
En consecuencia, sería ventajoso desarrollar un método que permita la producción de bibliotecas grandes de ADN, ARN o proteínas mutantes al igual que la selección de inutantes particulares para un objetivo deseado. La invención descrita en este caso se refiere al uso de ciclos repetidos de mutagénesis, recombinación in vivo y selección que permite la evolución molecular dirigida in vivo e in vitro de secuencias lineales altamente complejas, como ADN, ARN o proteínas mediante recombinación.
Otras ventajas de la presente invención resultarán evidentes de la lectura de la siguiente descripción con referencia a los dibujos anexos.
Resumen de la invención
La presente invención se refiere a un método para generar una secuencia polinucleótida seleccionada o población de secuencias polinucleótidas seleccionadas, generalmente en forma de polinucleótidos donados y/o amplificados, donde la(s) secuencia(s) de polinucleótido seleccionada(s) posee(n) una característica fenotípica deseada (por ej., codificar un polipéptido, promover la transcripción de polinucleótidos conectados, enlazar una proteína, y similar) que puede ser seleccionada. Un método para identificar polipéptidos que poseen una estructura deseada o propiedad funcional, como el enlace de una macromolécula biológica predeterminada (por ej., un receptor), implica la selección de una biblioteca grande de polipéptidos para los miembros de la biblioteca individuales que poseen la estructura deseada o propiedad funcional conferida por la secuencia de aminoácidos del polipéptido.
En un aspecto general, la invención se refiere a un método, denominado "transposición de secuencia", para generar bibliotecas de polinucleótidos recombinantes que tienen una característica deseada que puede ser seleccionada o filtrada. En un protocolo de "transposición de secuencia", las bibliotecas de polinucleótidos de recombinación son generadas a partir de una población de polinucleótidos de secuencia relacionada que comprenden zonas de secuencia con una identidad de secuencia sustancial que se puede recombinar homólogamente in vitro o in vivo. En el método, se combinan al menos dos especies de polinucleótidos de secuencia relacionada en un sistema de recombinación adecuado para generar polinucleótidos de secuencia recombinada, donde dichos polinucleótidos de secuencia recombinada comprenden una porción de al menos una primera especie de un polinucleótido de secuencia relacionada con al menos una porción adyacente de al menos una segunda especie de un polinucleótido de secuencia relacionada. Los sistemas de recombinación adecuados para generar polinucleótidos de secuencia recombinada pueden ser: (1) sistemas in vitro para la recombinación homologa o la transposición de secuencia por medio de amplificación u otros formatos descritos aquí, o (2) sistemas in vivo para la recombinación homologa o recombinación específica de sitio tal y como se describe aquí. La población de polinucleótidos de secuencia recombinada comprende una subpoblación de polinucleótidos que poseen las características deseadas o ventajosas y que pueden ser seleccionadas mediante un método de selección o de cribado adecuado. Los polinucleótidos de secuencia recombinada seleccionados pueden entonces ser sometidos a al menos un ciclo recurrente donde al menos un polinucleótido de secuencia recombinada seleccionado es combinado con al menos una especie diferente de polinucleótido de secuencia relacionada (que puede ser por sí mismo un polinucleótido de secuencia recombinada seleccionado) en un sistema de recombinación adecuada para generar polinucleótidos de secuencia recombinada, de modo que las generaciones adicionales de secuencias de polinucleótidos de secuencia recombinada son generadas de los polinucleótidos seleccionados de secuencia recombinada obtenidos mediante el método de selección o cribado empleado.
Más particularmente, la presente invención provee un método de evolución de un polinucleótido variante para la adquisición de una propiedad funcional deseada, que incluye:
la conducción de una reacción de amplificación de un polinucleótido sobre substratos iniciales que incluyen una pluralidad de variantes de un polinucleótico, donde al menos un ciclo de la reacción de amplificación es un ciclo de amplificación incompleto realizado bajo condiciones que generan productos de amplificación que incluyen de forma incompleta variantes extendidas del polinucleótido, cuyos productos de amplificación son desnaturalizados en cadenas de componentes, que son sometidas a una hibridación en diferentes parejas para formar productos de amplificación recombinados, que forman los substratos para un ciclo subsiguiente de amplificación hasta que los productos de amplificación incluyan variantes recombinantes del polinucleótido;
y la selección o cribado de las variantes recombinantes del polinucleótido para identificar al menos una variante recombinante teniendo una propiedad funcional deseada.
De esta forma, la recombinación de la secuencia recurrente genera miembros de biblioteca que son polinucleótidos de secuencia recombinada con características deseadas. Este tipo de características pueden ser cualquier propiedad o atributo susceptible de ser seleccionada o detectada en un sistema de cribado, y puede incluir propiedades de: una proteína codificada, un elemento transcripcional, una transcripción de control de secuencia, procesamiento de ARN, estabilidad de ARN, conformación o selección de cromatina, u otra propiedad de expresión de un gen o transgen, un elemento replicante, un elemento de enlace proteínico, o similar, así como cualquier característica que confiera una propiedad que pueda ser seleccionada o detectada.
Aspectos de la siguiente descripción que no se refieren específicamente a la invención reivindicada son provistos para comparación e ilustración.
Puede aplicarse un método de la invención para generar bibliotecas de polipéptidos expuestos o anticuerpos expuestos adecuados para la selección de interacción por afinidad o selección fenotípica. El método comprende (1) la obtención de una primera pluralidad de miembros de biblioteca seleccionados que incluyen un polipéptido expuesto o anticuerpo expuesto y un polinucleótido asociado que codifica dicho polipéptido expuesto o anticuerpo expuesto, y la obtención de dichos polinucleótidos asociados que comprenden una región de secuencia sustancialmente idéntica, opcionalmente, mediante la introducción de mutaciones en dichos polinucleótidos o copias, y (2) la reunión y fragmentación de dichos polinucleótidos asociados o copias para formar sus fragmentos en condiciones adecuadas para la amplificación RCP, formando la amplificación RCP y opcionalmente, la mutagénesis, y por lo tanto, la recombinación de forma homologa de dichos fragmentos para formar un grupo transpuesto de polinucleótidos recombinados, y donde por consiguiente, una fracción sustancial (por ej., superior a un 10 por ciento) de polinucleótidos recombinados de dicho grupo transpuesto no se encuentra presente en la primera pluralidad de miembros seleccionados de la biblioteca, donde dicho grupo transpuesto compone una biblioteca de polipéptidos expuestos o anticuerpos expuestos apropiados para la selección con interacción por afinidad. En al menos uno de tales ciclos de transposición, la etapa de agrupamiento será precedida por una amplificación RCP de extensión parcial. El método siguiente comprende la etapa adicional de seleccionar los miembros de la biblioteca del grupo transpuesto para identificar los miembros de la biblioteca individuales transpuestos que presentan la capacidad de enlazar o de interactuar (por ej., como los anticuerpos catalíticos) con una macromolécula predeterminada, como por ejemplo un receptor, péptido, oligosacárido, virión proteináceos u otro compuesto o estructura predeterminados. Los polipéptidos, anticuerpos, anticuerpos peptidomiméticos expuestos y las secuencias de región variable identificadas a partir de este tipo de bibliotecas pueden ser utilizados para la investigación terapéutica, el diagnóstico y objetivos similares (por ej., catalizadores, solutos para aumentar la osmolaridad de una solución acuosa y similares), y/o pueden ser sometidos a uno o más ciclos adicionales de selección por afinidad y/o de transposición. El método puede ser modificado ya que este tipo de etapa de selección tiene una característica fenotípica diferente a la afinidad de enlace para una molécula predeterminada (por ej., para la actividad catalítica, estabi-
lidad, resistencia a la oxidación, resistencia del fármaco, o fenotipo detectable conferido sobre una célula huésped).
En una forma de realización, la primera pluralidad de miembros de la biblioteca seleccionados son fragmentados y recombinados homólogamente por RCP in vitro. La generación del fragmento se lleva a cabo mediante digestión de nucleasa, amplificación RCP de la extensión parcial, perturbación RCP, u otro medio de fragmentación adecuado, tal y como se describe aquí, con la condición de que la perturbación de la RCP sea empleada en al menos un ciclo de la transposición. La perturbación es empleada de ahora en adelante para hacer referencia a la fragmentación mediante la extensión de la polimerasa incompleta de los modelos. Se procedió a emplear un formato de recombinación basado en unas duraciones de extensión RCP muy cortas para crear productos RCP parciales, que continúan extendiéndose hasta un modelo diferente en el(los) ciclo(s) siguiente(s) y subsiguiente(s).
En una forma de realización se proveen las combinaciones de transposición in vitro e in vivo para reforzar la diferencia combinatoria.
La presente invención provee un método para generar bibliotecas de anticuerpos expuestos adecuados para la selección de interacción por afinidad. El método comprende (1) la obtención de una primera pluralidad de miembros de la biblioteca seleccionados que incluyen un anticuerpo expuesto y un polinucleótido asociado que codifica dicho anticuerpo expuesto, y la obtención de dichos polinucleótidos asociados o sus copias, donde dichos polinucleótidos asociados comprenden una región con una secuencia de la estructura de la región variable sustancialmente idéntica, y (2) agrupación y fragmentación de dichos polinucleótidos asociados o copias para formar fragmentos de estos con condiciones adecuadas para la amplificación RCP y de ese modo, recombinar homólogamente dichos fragmentos para formar un grupo transpuesto de polinucleótidos recombinados que incluyen combinaciones nuevas de RDCs, por lo que una fracción sustancial (p. ej., superior a 10 por ciento) de los polinucleótidos recombinados de dicho grupo transpuesto comprenden combinaciones RDC que no están presentes en la primera pluralidad de miembros de la biblioteca seleccionada, dicho grupo transpuesto componiendo una biblioteca de anticuerpos expuestos que incluyen permutaciones RDC y siendo adecuados para la selección de interacción por afinidad. Opcionalmente, el grupo transpuesto se encuentra sujeto al cribado por afinidad para seleccionar miembros de la biblioteca transpuesta que se enlazan con un epítopo predeterminado (antígeno) y de ese modo seleccionar una pluralidad de miembros seleccionados de la biblioteca transpuesta. Opcionalmente, la pluralidad de miembros de la biblioteca seleccionada transpuesta pueden ser un grupo transpuesto y seleccionado interactivamente, de 1 a alrededor de 1000 ciclos o según se desee hasta que se consiga que los miembros de la biblioteca tengan la afinidad de enlace deseada.
En consecuencia, un aspecto de la presente invención provee un método para introducir una o más mutaciones en un polinucleótido bicatenario modelo, donde el polinucleótido bicatenario modelo ha sido dividido o amplificado con RCP (mediante extensión parcial o perturbación) en fragmentos aleatorios de un tamaño deseado, añadiendo a la población resultante de fragmentos bicatenarios uno o más oligonucleótidos bicatenarios o monocatenarios, donde dichos oligonucleótidos comprenden una región de identidad y una región de heterología respecto al polinucleótido modelo; desnaturalizar la mezcla resultante de fragmentos aleatorios y oligonucleótidos bicatenarios en fragmentos monocatenarios; incubar la población resultante de fragmentos monocatenarios con una polimerasa bajo condiciones que den por resultado la hibridación de dichos fragmentos monocatenarios en regiones de identidad entre los fragmentos monocatenarios y la formación de un polinucleótido mutagenizado bicatenario; y repetir las etapas anteriormente mencionadas según se desee.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir proteínas recombinantes que tienen una actividad biológica tratando una muestra que incluye polinucleótidos bicatenarios modelos que codifican una proteína de tipo salvaje bajo condiciones que proveen la disociación de dichos polinucleótidos modelos en fragmentos bicatenarios aleatorios de tamaño deseado; añadir a la población resultante de fragmentos aleatorios uno o más oligonucleótidos bicatenarios o monocatenarios, donde dichos oligonucleótidos comprenden regiones de identidad y regiones de heterología con el polinucleótido modelo; desnaturalizar la mezcla resultante de fragmentos y oligonucleótidos bicatenarios en fragmentos monocatenarios; incubar la población resultante de fragmentos monocatenarios con una polimerasa bajo condiciones que proporcionen la hibridación de dichos fragmentos monocatenarios en las regiones de identidad y formación de un polinucleótido bicatenario mutagenizado; repetir las etapas anteriormente mencionadas, según se desee; y a continuación, expresar la proteína recombinante del polinucleótido bicatenario mutagenizado.
Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a un método para obtener un polinucleótido quimérico mediante el tratamiento de una muestra que incluye polinucleótidos bicatenarios modelos diferentes donde dichos polinucleótidos modelos diferentes contienen regiones de identidad y regiones de heterología bajo condiciones que permitan la disociación de dichos polinucleótidos modelos en fragmentos bicatenarios aleatorios de un tamaño deseado; desnaturalizar los fragmentos bicatenarios aleatorios resultantes contenidos en la muestra tratada en fragmentos monocatenarios; incubar los fragmentos monocatenarios resultantes con polimerasa bajo condiciones que permitan la hibridación de los fragmentos monocatenarios en las regiones de identidad y la formación de una secuencia de polinucleótidos bicatenarios quiméricos que incluya secuencias de polinucleótidos modelos; y repetir las etapas anteriormente mencionadas, según se desee.
Un cuarto aspecto de la presente invención se refiere a un método para replicar un polinucleótido modelo combinando polinucleótidos monocatenarios modelos in vitro con fragmentos monocatenarios aleatorios pequeños que resultan de la disociación y la desnaturalización de polinucleótido modelo, e incubar dicha mezcla de fragmentos de ácido nucleico en presencia de una polimerasa de ácido nucleico bajo condiciones en las que se forme una población de polinucleótidos bicatenarios modelos.
La transposición de los polinucleótidos de la invención puede llevarse a cabo transponiendo aquellos polinucleótidos que codifiquen polipéptidos y/o aquellos polinucleótidos que incluyan secuencias reguladoras transcripcionales.
También se puede aplicar un método de la invención para transponer una población de genes virales (por ej., proteínas cápsidas, glicoproteínas estudiadas e solución, polimerasas, proteasas, etc.) o genomas virales (por ej., paramixoviridae, ortomixoviridato, herpesvirus, retrovirus, reovirus, rinovirus, etc.). En una forma de realización, la invención provee un método para transponer secuencias que codifiquen la totalidad o porciones de proteínas virales inmunogénicas para generar combinaciones nuevas de epítopos así como epítopos nuevos creados por recombinación; este tipo de proteínas virales transpuestas pueden comprender epítopos o combinaciones de epítopos que pueden provenir del entorno natural como consecuencia de la evolución viral (p. ej., como recombinación de cepas del virus de la gripe).
La transposición del polinucleótido de la invención puede también utilizarse para la transposición de una población de variantes proteínicas, como enzimas relacionadas taxonómica, estructural, y/o funcionalmente, y/o sus variantes mutadas para crear e identificar nuevos polipéptidos ventajosos, como enzimas con alteraciones en sus propiedades de catálisis, perfil de temperatura, estabilidad, resistencia a la oxidación, u otra característica deseada que pueda ser seleccionada con este fin. Se proveen métodos adecuados para la evolución molecular y la evolución molecular dirigida. Se proveen métodos para localizar la(s) presión(es) de selección sobre porciones específicas de polinucleótidos (como un segmento de una región de codificación).
La invención también provee un método adecuado para la transposición de secuencias de polinucleótidos con el fin de generar portadores de terapia génica y construcciones de terapia génica con defecto de replicación, que pueden utilizarse por ejemplo, para la terapia génica humano, incluyendo pero sin limitarse a vectores de vacunación para vacunas a base de ADN, al igual que la terapia génica antineoplástica y otros formatos de terapia génica.
Como un ejemplo particular, la transposición de secuencia puede emplearse para generar una proteína fluorescente verde reforzada (PFV) y polinucleótidos que codifican la misma, comprendiendo la realización de la transposición del ADN realizada en un vector de expresión que codifica la PFV y la selección o cribado de aquellas variantes que tienen una propiedad deseada reforzada, como una fluorescencia reforzada. En una variación, una forma de realización comprende una etapa de tendencia al error o amplificación mutagénica, la propagación en una cepa mutágena (p. ej., una célula huésped con un fenotipo hipermutacional; mut^{1}, etc.; cepas de levadura como aquéllas descritas en Klein (1995) Progr. Nucl. Acid Res. Mol. Biol. 51:217) mutagénesis química, o mutagénesis dirigida. En una forma de realización, la proteína reforzada PFV comprende una mutación puntual fuera de la región del cromoforo (aminoácidos 64-69), preferiblemente en la región comprendida desde el aminoácido 100 al aminoácido 173, con formas de realización preferidas específicas en el residuo 100, 154, y 164; generalmente, la mutación es una mutación de sustitución, como F100S, M154T o V164A. En una forma de realización, la mutación sustituye un residuo hidrofílico por un residuo hidrofóbico. En una forma de realización, las mutaciones múltiples están presentes en la proteína reforzada PFV y su polinucleótido de codificación.
Para mejorar un método de transposición de secuencia se puede emplear al menos un aditivo que refuerce el nivel o extensión de hibridación o recombinación de los polinucleótidos de secuencia relacionada. En una forma de realización, el aditivo es polietilenoglicol (PEG) típicamente añadido, generalmente, a una reacción de transposición con una concentración final del 0,1 a 25 por ciento, a menudo con una concentración final del 2,5 a 15 por ciento, con una concentración final de alrededor de un 10 por ciento. En una forma de realización, el aditivo es sulfato de dextrano, añadido, generalmente, a una reacción de transposición con una concentración final del 0,1 a 25 por ciento, a menudo, de alrededor de un 10 por ciento. En una forma de realización, el aditivo es un agente que reduce la especificidad de la secuencia de hibridación y promueve la hibridación promiscua y/o recombinación in vitro. En una forma de realización alternativa, el aditivo es un agente que aumenta la especificidad de la secuencia de hibridación y promueve una hibridación de alta fidelidad y/o una recombinación in vitro. Igualmente, se pueden emplear otros polímeros de cadena larga que no interfieran en la reacción (por ej., poli vinilpirrolidona, etc.).
Un método de transposición perfeccionado puede incluir la adición de al menos un aditivo que es un detergente catiónico. Existen ejemplos de detergentes catiónicos adecuados que incluyen pero que no se limitan al: bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), bromuro de dodeciltrimetilamonio (DTAB), y cloruro de tetrametilamonio (TMAC), y similares.
Un método de transposición perfeccionado puede incluir:
la adición de al menos un aditivo que es una proteína recombinogénica que catalice o refuerce de forma no catalítica el acoplamiento homólogo y/o el intercambio catenario in vitro. Existen ejemplos de proteínas recombinogénicas adecuadas que incluyen pero no se limitan a la: proteína recA E. coli, proteína nvsX T4, proteína rd de Tistilago maydis, otras recombinasas de la familia recA de otras especies, una proteína de enlace monocatenal (SSB), ribonucleoproteína A1, y similares. La transposición puede utilizarse para mejorar una o más propiedades de una proteína recombinogénica; por ejemplo, las secuencias mutantes que codifican recA pueden ser variantes transpuestas y perfeccionadas estables al calor seleccionadas por recombinación de secuencia recurrente.
Las recombinasas no específicas (recombinación general) como la Topoisomerasa I, Topoisomerasa II (Tse et al. (1980) .1. Biol. Chem. 255: 5560; Trask et al. (1984) EMBO J. 3: 671) y similares puede utilizarse para catalizar reacciones de recombinación in vitro para transponer una pluralidad de especies de polinucleótidos de secuencias relacionadas por los métodos recurrentes de la invención.
Un método de transposición perfeccionado puede incluir la adición de al menos un aditivo que es una enzima con una actividad exonucleasa que actúe eliminando nucleótidos no modelados introducidos en los extremos 3' de los polinucleótidos del producto en las reacciones de amplificación de transposición catalizadas por una polimerasa sin capacidad correctora. Un ejemplo de una enzima adecuada con actividad exonucleasa incluye pero no se limita a la polimerasa Pfu. Otras polimerasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a la:
Polimerasa de ADN de Thermus flavus (Tf1).
Polimerasa de ADN de Thermus thermophilus (Tth)
Polimerasa de ADN de Thermococcus litoralis (Tli, Vent)
Polimerasa de ADN de Pyrococcus Woesei (Pwo)
Polimerasa de ADN de Thermotoga maritima (UltMa)
Polimerasa de ADN de Thermus brockianus (thermozyma)
Polimerasa de ADN de Pyrococcus furiosus (Polimerasa Pfu)
Polimerasa de ADN de Thermococcus sp. (9.Nm)
Polimerasa de ADN de Pyrococcus sp ("Deep Vent")
Polimerasa de ADN T4 bacteriófaga
Polimerasa de ADN T7 Bacteriófaga
Polimerasa I de ADN de E. Coli (nativo y Kienow)
Polimerasa III de ADN de E. Coli.
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La presente invención provee un método de transposición donde al menos un ciclo de amplificación es decir, de extensión con una polimerasa) de polinucleótidos miembro de una biblioteca fragmentada rehibridada es conducido bajo condiciones de "perturbación" produciendo una fracción sustancial, generalmente de al menos un 20 por ciento o más, de productos de amplificación extendidos incompletos. Los productos de amplificación, incluyendo los productos de amplificación extendidos de forma incompleta son desnaturalizados y sometidos a al menos un ciclo adicional de rehibridación y de amplificación. En este ciclo adicional, los productos extendidos de forma incompleta rehibridan y ceban la extensión sobre diferentes especies modelo de secuencia relacionada.
Al menos un ciclo de amplificación puede ser conducido mediante el uso de un conjunto de fragmentos le ADN monocatenarios superpuestos de diferentes longitudes correspondientes a una primera especie le polinucleótido o serie de especie de polinucleótido de secuencia relacionada, donde cada fragmento superpuesto puede hibridar y cebar cada extensión de la cadena polinucleótida de una segunda especie de polinucleótido que sirve como modelo, creando de esta forma polinucleótidos de secuencia recombinada, donde dichos polinucleótidos de secuencia recombinada comprenden una porción de al menos una primera especie de polinucleótido con una porción adyacente de la segunda especie de polinucleótido que sirve como modelo. En una variación, la segunda especie de polinucleótido que sirve como modelo contiene iracilo (es decir, un modelo de tipo Kunkel) y sustancialmente no se puede replicar en células. Este aspecto de la invención puede también comprender al menos dos ciclos recurrentes de esta variación.
En una forma de realización, la RCP puede conducirse donde la mezcla de nucleótidos comprenda una especie de nucleótido con uracilo como base. El(los) producto(s) de la RCP pueden entonces ser fragmentado(s) por digestión con UDC glicolasa que produce rupturas de la cadena. El tamaño del fragmento puede ser controlado por la fracción de NIP que contiene uracilo en la mezcla de la RCP.
Un método de la invención puede comprender al menos un ciclo de amplificación conducido con un aditivo o polimerasa en condiciones adecuadas que promuevan la conmutación del modelo. En una forma le realización donde la laq polimerasa es empleada para la amplificación, la adición de recA u otras polimerasas (p. ej., polimerasas virales, transcriptasa inversa) refuerza la conmutación del modelo. La conmutación del modelo puede también incrementarse mediante el aumento de la concentración de ADN en el modelo, entre otros medios conocidos por los expertos en la materia.
En una forma de realización, las bibliotecas de polinucleótidos de secuencia recombinada son generalas a partir de polinucleótidos de secuencia relacionada que son genes de origen natural o alelos de un gen. En este aspecto, al menos dos genes y/o alelos de origen natural que comprenden regiones de al menos 50 nucleótidos consecutivos con al menos un 70 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente al menos un 90 por ciento de identidad de secuencia, son seleccionados de un grupo de secuencias génicas, como por selección híbrida o a través de análisis de secuencia informatizado usando datos de secuencia de una base de datos. En un aspecto, al menos tres genes y/o alelos de origen natural que comprenden regiones de al menos 50 nucleótidos consecutivos con al menos un 70 por ciento de identidad le secuencia, preferiblemente al menos un 90 por ciento de identidad de secuencia, son seleccionados de in grupo de secuencias génicas, como por selección híbrida o mediante análisis de secuencia informatizada con el uso de datos de secuencia de una base de datos. Las secuencias seleccionadas son obtenidas como polinucleótidos, mediante la donación o por medio de síntesis de ADN, y transpuestas según cualquiera le las diferentes formas de realización de la invención.
En una forma de realización de la invención, se realiza la transposición de grupos múltiples. La transposición de grupos múltiples de secuencias polinucleótidas permite que cada grupo separado genere una solución combinatoria diferente para producir la propiedad deseada. En esta variación, el grupo de secuencias de polinucleótidos parentales (o cualquier biblioteca transpuesta subsiguiente o grupo seleccionado de miembros de biblioteca) es subdividido (o segregado) en dos o más grupos diferenciados de secuencias y son sometidos de forma separada a una o más etapas de recombinación de la secuencia recurrente y selección (o cribado). Si se desea, de forma opcional, los miembros de la biblioteca seleccionados le cada grupo separado pueden ser recombinados (integrados) en las últimas etapas de transposición. Alternativamente se pueden utilizar grupos parentales separados múltiples. La endogamia, en la que los miembros de la biblioteca seleccionados (o cribados) dentro de un grupo son cruzados entre sí mediante los métodos de recombinación de secuencias recurrentes de la invención, se puede realizar sola o combinándola con la exogamia, donde los miembros de la biblioteca de diferentes grupos son cruzados entre sí por los métodos de recombinación de secuencias recurrentes de la invención.
En una forma de realización de la invención, el método comprende la etapa posterior de eliminación de productos no transpuestos (p. ej., secuencias parentales) de polinucleótidos de secuencia recombinada producidos por cualquiera de los métodos descritos de transposición. Los productos no transpuestos pueden ser eliminados o evitados realizando la amplificación con: (1) un primer cebador de la RCP que híbrida a una primera especie de polinucleótido parental pero que no híbrida sustancialmente una segunda especie de polinucleótido parental, y (2) un segundo cebador de la RCP que híbrida una segunda especie de polinucleótido parental pero no híbrida sustancialmente a la primera especie de polinucleótido parental, este tipo de amplificación produciéndose a partir de modelos que incluyen la porción de la primera secuencia parental que hibrida el primer cebador de la RCP e incluyendo también la porción de la segunda secuencia parental que hibrida al segundo cebador de la RCP, amplificando de esta forma sólo los polinucleótidos de secuencia recombinada.
Se apreciará que las diferentes técnicas mutagénicas in vitro pueden ser empleadas en la preparación de una población inicial de variantes polinucleótidas, incluyendo la administración de mutágenos químicos o radiológicos a células huésped. Unos ejemplos de este tipo de mutágenos incluyen pero no se limitan a: MNU, ENU, MNNG, nitrosourea, BuDR, y similares. La luz ultravioleta puede también emplearse para generar mutaciones. También se puede utilizar la radiación ionizante y los agentes clastogénicos para reforzar la frecuencia mutacional y/o para reforzar la recombinación y/o efectuar la fragmentación polinucleótida.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un diagrama esquemático que compara la transposición mutagénica sobre la tendencia al error de la RCP; (a) la biblioteca inicial; (b) el grupo de secuencias seleccionadas en la primera etapa de selección de afinidad; (d) la recombinación in vitro de las secuencias seleccionadas ("transposición"); (f) el grupo de secuencias seleccionadas en la segunda etapa de selección de la afinidad tras la transposición; (c) la tendencia al error de la RCP; (e) el grupo de secuencias seleccionadas en una segunda etapa de selección de la afinidad tras la tendencia al error de la RCP.
La figura 2 ilustra el reensamblaje de un fragmento génico alfa LacZ de 1,0 kb a partir de los fragmentos aleatorios de 10-50 bp, (a) La fotografía de un gel de fragmento de ADN amplificado por RCP que tiene el gen alfa Lacz. (b) La fotografía de un gel de fragmentos de ADN tras la digestión con ADNsel. (c) La fotografía de un gel de fragmentos de ADN de 10-50 bp purificado a partir del fragmento de ADN génico alfa LacZ; (d) La fotografía de un gel de fragmentos de ADN 10-50 bp tras el número indicado de ciclos de reensamblaje de ADN; (e) La fotografía de un gel de la mezcla de recombinación tras la amplificación mediante RCP con cebadores.
La figura 3 es una ilustración esquemática de los mutantes de codón de terminación génica alfa LacZ y de sus secuencias de ADN. Las regiones incluidas en un recuadro son regiones heterólogas que sirven como marcadores. Los codones de terminación se encuentran localizados en recuadros más pequeños o subrayados. "+" indica un gen de tipo salvaje y "-" indica una zona mutada en el gen.
La figura 4 es una ilustración esquemática de la introducción o adición de un oligonucleótido sintético en el proceso de reensamblaje del gen alfa LacZ.
La figura 5 ilustra las regiones de homología entre un gen (M) IL1-B de la murina y un gen humano (H) IL1-B con uso de codón de E. coli. Las regiones de heterología están incluidas en un recuadro, "-!^{-}" indica los cruces obtenidos sobre la transposición de los dos genes.
La figura 6 es un diagrama esquemático de un sistema de modelo de transposición de anticuerpo RDC mediante el uso de scFv de un anticuerpo IgG de anti-conejo (A1OB).
La figura 7 (paneles A-D) ilustra la frecuencia observada de incidencia de ciertas combinaciones de RDCs en el ADN transpuesto del scFv. El panel (A) muestra muestra la construcción de biblioteca para la transposición scFv con todos los seis RD Cs. El panel (C) muestra la inserción de los iones de combinación RDC determinada mediante RCP con cebadores para RDCs nativos. El panel (D) muestra los índices de inserción y distribuciones de inserciones de los iones de combinación RDC sintéticos.
La figura 8 ilustra la avidez perfeccionada del anticuerpo de anti-conejo scFv tras la transposición de ADN y cada ciclo de selección.
La figura 9 ilustra de forma esquemática pBR322-Sfi-BL-LA-Sfi y recombinación intraplasmídica in vivo mediante repeticiones directas, así como el nivel de generación de colonias resistentes a la ampicilina por recombinación intraplasmídica que reconstituye un gen funcional beta-lactamasa.
La figura 10 muestra de forma esquemática pBR322-Sfi-2Bla-Sfi y recombinación intraplasmídica in vivo por medio de repeticiones directas, así como el nivel de generación de colonias resistentes a la ampicilina por recombinación intraplasmídica que reconstruye un gen funcional beta-lactamasa.
La figura 11 ilustra el método para examinar la eficiencia de múltiples etapas de recombinación homologa tras la introducción de fragmentos polinucleótidos en células para la generación de proteínas recombinantes.
La figura 12 muestra de forma esquemática la generación de una biblioteca de vectores por "cassettes" de transposición en las posiciones siguientes: promotor, péptido principal, terminador, gen con resistencia al fármaco seleccionable, y origen de replicación. Las múltiples líneas paralelas de cada lugar representan la multitud de "cassettes" para dicho cassette.
La figura 13 muestra de forma esquemática algunos ejemplos de cassettes adecuados para diferentes posiciones con el fin de construir bibliotecas de vectores procarióticos mediante transposición.
La figura 14 muestra que el vector de expresión PBAD-PFV (5,371 bp) del procariótico PFV se ha derivado de pBAD18 (Guzman et al. (1995) J. Bacteriol. 177:4121). El vector de expresión Alfa+PFV del eucariótico PFV (7,591 bp) se derivó del vector Alfa+ (Whitehorn et al. (1995) Bio/Technology 13:1215).
La figura 15A y 15B muestran la comparación de la fluorescencia de las diferentes construcciones de la PFV en la totalidad de las células E. coli. Se procede a comparar la construcción "Clontech" que contiene una extensión N-terminal de 24 aminoácidos, la construcción de tipo salvaje Affymax ("ts", con uso de codón perfeccionado), y los mutantes obtenidos después de 2 y después de 3 ciclos de RCP sexual y selección ("ciclo 2", "ciclo 3"). La construcción "Clontech" se indujo con IPTG, mientras que las otras construcciones fueron inducidas con arabinosa. Todas las muestras fueron evaluadas con un OD_{600} equivalente. La figura 15A muestra espectros de fluorescencia que indican que toda la señal de fluorescencia celular de la construcción "ts" es 2.8 veces superior a la construcción "Clontech". La señal del mutante de "ciclo 3" aumenta 16 veces sobre el Affymax "ts", y 45 veces sobre la construcción "ts" "Clontech". La figura 1SB es una comparación de espectros de excitación de construcciones PFV en E. coli. Las longitudes de onda de la excitación de valor máximo no han sido alteradas por las mutaciones seleccionadas.
La figura 16 muestra el análisis de SDS-PAGE de los niveles de expresión de proteína relativos PFV. Panel (a): análisis de SDS-PAGE de trisglicina al 12% (Novex, Encinitas, CA) de cantidades equivalentes (ODmo) de la totalidad de las células E. Coli que expresan el tipo salvaje, el mutante del ciclo 2 o el mutante del ciclo 3 de PFV. Coloreado con Coomassie Blue. La PFV (27 kD) representa alrededor de un 75% de la proteína total, y la selección no aumentó el nivel de expresión. Panel (b): análisis de SDS-PAGE de tris-glicina al 12% (Novex, Encinitas, CA) de cantidades equivalentes (ODmo) de fracciones de E. coli. Recorrido 1: Sobrenadante de células lisificadas que expresan PFV de tipo salvaje; recorrido 2: Sobrenadante de células lisificadas que expresan la PFV de tipo salvaje. La mayor parte de la PFV de tipo salvaje se encuentra en cuerpos de inclusión; recorrido 3: Granulado de células lisificadas que expresan mutantes del ciclo 3 PFV; recorrido 4: Sobrenadante de células lisificadas que expresan un mutante del ciclo 3 mutante de la PFV. La mayor parte de la PFV de tipo salvaje es soluble. La PFV que termina en cuerpos de inclusión no contiene el cromóforo, puesto que no existe fluorescencia detectable en esta fracción.
La figura 17 muestra el análisis de mutación de los mutantes del ciclo 2 y del ciclo 3 respecto al tipo salvaje de la PFV. El panel (A) muestra que las mutaciones tienden más a dispersarse que a agruparse cerca del cromóforo tripéptido. Las mutaciones F100S, M1S4T y V164A implican el reemplazo de residuos hidrofóbicos con más residuos hidrofílicos. La hidrofilicidad aumentada puede ayudar a guiar a la proteína por un camino de replegado nativo mejor que hacia la formación de un cuerpo de inclusión y agregación. El panel (B) muestra un mapa de restricción que indica la región de cromóforo y las posiciones de las mutaciones introducidas.
Las figuras 18A y 18B muestran la comparación de las células CHO que expresan diferentes proteínas PFV. La figura 18A es un análisis con un separador de células por fluorescencia de los clones de células CHO que expresan diferentes mutantes PFV. La figura 18B B muestra la espectroscopia de fluorescencia de clones de células CHO que expresan diferentes mutantes de la PFV.
La figura 19 muestra la intensificación de la resistencia a la toxicidad del arseniato como resultado de la transposición del plásmido pGJ 103 que contiene el operón del recorrido de la desintoxicación del arseniato.
La figura 20 muestra de forma esquemática la generación de bibliotecas combinatorias mediante el uso de secuencias de intrón de origen natural o sintético como base para recombinar una pluralidad de especies de exones que pueden crear lagunas de identidad de secuencia (tal y como ejemplifican los exones de secuencia aleatoria) donde la recombinación específica de sitio y/u homologa se produce entre secuencias de intrón de diferentes miembros de la biblioteca.
La figura 21 muestra de forma esquemática las variaciones del método para transponer exones. Los números se refieren a fases de lectura, tal y como se muestra en el panel (a). El panel (B) muestra las diferentes clases de intrones y exones relativos a sus fases de unión individuales. El panel (C) provee un ejemplo de un gen de origen natural (genes de inmunoglobulina Y) adecuado para la transposición. Los paneles B a F muestran cómo los exones múltiples pueden ser concatemerizados por medio de RCP usando cebadores que se extienden sobre segmentos de intrón, de modo que si se desea, se puede obtener una unión de fases adecuada. El panel (G) ejemplifica el proceso de transposición de exones (IC: inmnunoglobulina exón; IEN: interferon exón).
La figura 22 muestra de forma esquemática un diagrama de fases de unión de exones para diferentes genes humanos, mostrando que las unidades preferidas para transponer exones empiezan y acaban en la misma fase de unión, este tipo de módulo de unión (o transposición de exones) puede comprender unos exones múltiples de origen natural pero generalmente tienen la misma fase de unión en cada extremidad.
La figura 23 muestra de forma esquemática cómo la extensión parcial RCP (perturbación) puede utilizarse para proporcionar la recombinación de secuencias recurrentes (transposición) dando una biblioteca de quimeras que representan cruces múltiples.
La figura 24 muestra cómo puede utilizarse la perturbación para la transposición de una secuencia de tipo salvaje con una secuencia mutada de multiplicación para generar un conjunto óptimo de mutaciones mediante transposición.
La figura 25 muestra de forma esquemática una recombinación de plásmido-plásmido mediante electroporación de una población celular que representa una especie de plásmido múltiple presentado de forma inicial como una única especie de plásmido por célula antes de la electroporación y especie de plásmido múltiple por célula adecuada para una recombinación in vivo posterior para la electroporación de la población celular.
La figura 26 muestra la recombinación plásmido-plásmido.
La figura 27 muestra la recombinación plásmido-virus.
La figura 28 muestra la recombinación virus-virus.
La figura 29 muestra la recombinación cromosoma-plásmido.
La figura 30 muestra la recombinación de conjugación conciliada.
La figura 31 muestra un nivel de recuperación del fago Ab respecto al ciclo de selección. Se procedió a aplicar la transposición tras las etapas de selección de dos a ocho. El aumento total es 440 veces mayor.
La figura 32 muestra la especificidad de enlace tras diez ciclos de selección, incluyendo dos ciclos de retrocruce. La señal ELISA de diferentes clones del fago Ab para ocho objetivos proteínicos humanos.
La figura 33 muestra la recuperación del fago Ab respecto al método de mutagénesis.
Descripción de las formas de realización preferidas
La presente invención se refiere a un método para la reagrupación de moléculas de ácido nucleico tras la fragmentación aleatoria y a su aplicación en la mutagénesis de secuencias de ADN. También se describe un método para la producción de fragmentos de ácido nucleico que codifican proteínas mutantes con una actividad biológica reforzada. En particular, la presente invención también se refiere a un método de ciclos repetidos de mutagénesis, transposición de ácido nucleico y selección que permite la creación de proteínas mutantes con una actividad biológica reforzada.
La presente invención se refiere a un método para generar una gran biblioteca de ADN, ARN o mutantes proteínicos; en aquellas formas de realización en las que una enzima metabólica o recorrido de varios componentes es sometido a transposición, una biblioteca puede componer los metabolitos resultantes en la adición a una biblioteca de enzima(s) transpuesta(s). Este método presenta unas ventajas particulares en la generación de fragmentos de ADN relacionados a partir de los cuales se puede seleccionar el(los) fragmento(s) de ácido nucleico deseado(s). En particular, la presente invención también se refiere a un método de ciclos repetidos de mutagénesis, recombinación homologa y selección, que permite la creación de proteínas mutantes con una actividad biológica reforzada.
Sin embargo, antes de describir esta invención con más detalle, se procederá en primer lugar, a definir los términos siguientes.
Definiciones
Tal y como se utiliza en este caso, los términos que se relacionan a continuación tienen los siguientes significados:
El término "reagrupación de ADN" se usa cuando se produce una recombinación entre secuencias idénticas.
Por el contrario, el término "transposición de ADN" se utiliza en este caso para indicar la recombinación entre secuencias sustancialmente homologas pero no idénticas. En algunas formas de realización, la transposición de ADN puede implicar el cruce mediante recombinación no homologa, como por medio de sistemas cre/lox y/o fip/frt y similares, no requiriendo dicho tipo de recombinación secuencias de polinucleótido sustancialmente homologas. Se pueden emplear formatos de recombinación homólogos y no homólogos y, en algunas formas de realización, se pueden generar quimeras moleculares y/o híbridos moleculares de secuencias sustancialmente diferentes.
El término "amplificación" significa que se aumenta el número de copias de un fragmento de ácido nucleico.
El término "idéntico" o "identidad" significa que dos secuencias de ácido nucleico tienen la misma secuencia o una secuencia complementaria. De esta forma, "áreas de identidad" significa que las regiones o áreas de un fragmento de ácido nucleico o polinucleótido son idénticas o complementarias a otro polinucleótido o fragmento de ácido nucleico.
El término "corresponde con" se utiliza en este caso para significar que una secuencia polinucleótida es homologa (es decir, idéntica, que no está estrictamente relacionada de una forma evolutiva) con la totalidad o con una porción de una secuencia polinucleótida de referencia, o con una secuencia de polipéptido idéntica a un polipéptido de secuencia de referencia. En contraposición, el término "complementario a" se utiliza en este caso para significar que la secuencia complementaria es homologa a la totalidad o a una porción de secuencia polinucleótida de referencia. Para su ilustración, la secuencia de nucleótido "TATAC" corresponde con una secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria a una secuencia de referencia "GTATA".
Los términos siguientes se utilizan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos: "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia", e "identidad de secuencia". Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida usada como base para una comparación de secuencia; una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia mayor, por ejemplo, como un segmento de un cuerpo entero de ADNc (ADN complementario) o secuencia génica relatada en una lista de secuencias, como una secuencia polinucleótida según la Fig. 1 o la Fig. 2(b), o puede comprender una secuencia completa génica o de ADNc. Generalmente, una secuencia de referencia tiene una longitud de al menos 20 nucleótidos, frecuentemente al menos una longitud de 25 nucleótidos, y a menudo al menos una longitud de 50 nucleótidos. Puesto que dos polinucleótidos pueden cada uno (1) comprender una secuencia (es decir, una porción de la secuencia de polinucleótido completa) similar entre los dos polinucleótidos, y (2) comprender a continuación, una secuencia divergente entre los dos polinucleótidos, generalmente, se realizan comparaciones de secuencia entre dos (o más) polinucleótidos mediante la comparación de secuencias de los dos polinucleótidos en una "ventana de comparación" para identificar y confrontar regiones locales con similitud de secuencia.
Una "ventana de comparación", tal y como se utiliza aquí, se refiere a un segmento conceptual de al menos 20 posiciones de nucleótidos contiguos donde una secuencia polinucleótida puede compararse con una secuencia de referencia de al menos 20 nucleótidos contiguos y donde la porción de secuencia polinucleótida en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (por ejemplo espacios vacíos) de un 20 por ciento o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para una óptima alineación de las dos secuencias. Una óptima alineación de secuencias para comprobar una ventana de comparación puede ser conducida por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Ac/v. Áppl. Math. 2: 482, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443 mediante el método de búsqueda por similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci (E.E.U.U.) 85: 2444, mediante implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package Versión 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección, y seleccionando la mejor alineación (es decir, la resultante del porcentaje máximo de homología en la ventana de comparación) generada por los diferentes métodos.
El término "identidad de secuencia" significa que dos secuencias de polinucleótidos son idénticas (es decir, sobre una base de nucleótido por nucleótido) en la ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula comparando dos secuencias alineadas de forma óptima sobre la ventana de comparación, la determinación del número de posiciones en las que la base de ácido nucleico idéntica (p. ej., A,T, C,G,U, o I) se produce en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones de equilibrio, la división del número de posiciones adaptadas por el número total de posiciones en la ventana de comparación (por ejemplo, el tamaño de la ventana), y la multiplicación del resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de secuencia. Los términos "identidad sustancial" tal y como se utilizan en este caso, denotan una característica de una secuencia polinucleótida, donde el polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos un 80 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente al menos un 85 por ciento de identidad y a menudo entre un 90 y un 95 por ciento de identidad de secuencia normalmente al menos un 99 por ciento de identidad de secuencia en comparación con una secuencia de referencia en una ventana de comparación de al menos 20 posiciones de nucleótido frecuentemente, en una ventana de al menos 25-50 nucleótidos, donde el porcentaje de identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia polinucleótida que puede incluir eliminaciones o adiciones de un total de un 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia en la ventana de comparación.
Las sustituciones de aminoácido conservadoras se refieren al carácter intercambiable de residuos que tienen unas cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos con cadenas laterales alifáticas es la glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales hidróxilo-alifáticas es la seria y la treonina; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales con amidas es la asparraguina y la glutamina; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales aromáticas es la fenilalanina tirosina, y triptófano; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales es la lisina, arginina, y histidina; y un grupo de aminoácidos con cadenas laterales con contenido de sulfuro es la cistemna y la metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservadores preferidos son: la valina-leucinaisoleucina, tirosina de fenilalanina, arginina de lisina, valina de alanina, y asparragina-glutamina.
El término "homólogo" u "homeólogo" significa que una secuencia de ácido nucleico monocatenario puede hibridar una secuencia de ácido nucleico monocatenario complementaria. El grado de hibridación puede depender de varios factores que incluyen la cantidad de identidad entre las secuencias y la condiciones de hibridación como pueden ser la temperatura y la concentración de sal tal y como se procederá a discutir a continuación. Preferiblemente, la región de identidad es superior a alrededor de 5 bp más preferiblemente, la región de identidad es superior a 10 bp.
El término "heterólogo" hace referencia al hecho de que una secuencia de ácido nucleico monocatenario es incapaz de hibridar otra secuencia de ácido nucleico monocatenario o su complemento. De esta forma, las regiones de heterología hacen alusión a que los fragmentos de ácido nucléico o polinucleótidos tienen regiones o áreas en la secuencia incapaces de hibridar otro ácido nucleico o polinucleótido. Este tipo de regiones o áreas son, por ejemplo, áreas de mutaciones.
El término "cognado" tal y como se utiliza en este caso, se refiere a una secuencia génica que está evolutiva y funcionalmente relacionada entre especies. Por ejemplo, pero no de forma limitativa, en el genoma humano, el gen humano CD4 es el gen análogo al gen de ratón CD4, puesto que las secuencias y estructuras de estos dos genes indican que son altamente homólogos y los dos genes codifican una proteína que funciona en la señalización de la activación de la célula T a través del reconocimiento de antígenos restringidos de clase II MHC.
El término "de tipo salvaje" significa que el fragmento de ácido nucleico no comprende ninguna mutación. Una proteína de "tipo salvaje" significa que la proteína estará activa a un nivel de actividad que se encuentra en la naturaleza y generalmente, comprenderá la secuencia de aminoácidos encontrada en la naturaleza. En un aspecto, el término "tipo salvaje" o "secuencia parental" puede indicar un inicio o secuencia de referencia anterior a la manipulación de la invención.
El término "polinucleótidos relacionados" significa que las regiones o áreas de los polinucleótidos son idénticas y las regiones o áreas de los polinucleótidos son heterólogas.
El término "polinucleótido quimérico" significa que el polinucleótido comprende regiones de tipo salvaje y regiones mutadas. También puede significar que el polinucleótido comprende regiones de tipo salvaje de un polinucleótido y regiones de tipo salvaje de otros polinucleótidos relacionados.
El término "división" hace alusión a la digestión del polinucleótido con enzimas o a la ruptura del polinucleótido o a la generación de copias de longitud parcial de una(s) secuencia(s) parental(es) mediante extensión parcial de la RCP, perturbación de la RCP, amplificación de fragmento diferencial, u otros medios de producción de copias de longitud parcial de una o más secuencias parentales.
El término "población" tal y como se utiliza en este caso significa una colección de componentes como polinucleótidos, fragmentos de ácido nucleico o proteínas. Una "población mixta" hace referencia a una colección de componentes que pertenecen a la misma familia de ácidos nucleicos o proteínas (que por ejemplo están relacionadas) pero que difieren en su secuencia (es decir, que no son idénticos) y por lo tanto, en su actividad biológica.
El término "fragmento de ácido nucleico específico" significa un fragmento de ácido nucleico que tiene ciertos puntos finales y que tienen una cierta secuencia de ácido nucleico. Dos fragmentos de ácido nucleico donde un fragmento de ácido nucleico tiene una secuencia idéntica a una porción del segundo fragmento de ácido nucleico pero diferentes extremos comprenden dos fragmentos de ácido nucleico específicos diferentes.
El término "mutaciones" significa cambios en la secuencia de una secuencia de un ácido nucleico de tipo salvaje o a cambios en la secuencia de un péptido. Este tipo de mutaciones pueden ser mutaciones puntuales como transiciones o transversiones. Las mutaciones pueden ser eliminaciones, inserciones o duplicaciones.
En la notación del polipéptido utilizada aquí, la dirección izquierda es la dirección amino-terminal y la dirección derecha es la dirección carboxi-terminal, según el uso y el convenio estándar. De forma similar, a menos que se especifique lo contrario, el extremo izquierdo de las secuencias de polinucleótidos monocatenario es el extremo 5'; la dirección izquierda de secuencias de polinucleótidos bicatenarios se denomina dirección 5'. La dirección de la adición de 5' a 3' de transcripciones de ARN naciente se denomina dirección de transcripción; las regiones de secuencia sobre la cadena de ADN con la misma secuencia que el ARN y que son 5' para el extremo 5' de la transcripción de ARN se denominan "secuencias corriente arriba"; las regiones de secuencia de la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARM y que son 3' para el extremo 3' de la transcripción de codificación ARN son denominadas "secuencias corriente abajo".
El término "de origen natural" tal y como se utiliza en este caso, aplicado a un objeto se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, un polipéptido o secuencia polinucleótida presente en un organismo (incluyendo virus) que puede ser aislado de una fuente natural y que no ha sido modificado de forma intencional por el hombre en el laboratorio, es de origen natural. Generalmente, el término de origen natural se refiere a un objeto como el que se encuentra presente en un individuo (no enfermo) no patológico, como sería normal para la especie.
El término "agente" se utiliza en este caso para indicar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una serie de compuestos localizados espacialmente (por ej., una serie de péptidos VLSIPS, serie de polinucleótidos, y/o serie de moléculas pequeñas combinatorias), una macromolécula biológica, una biblioteca de selección de péptidos bacteriófagos, una biblioteca de selección (por ej., scFv) de anticuerpos bacteriófagos, una biblioteca de selección de péptidos de polisomas, o un extracto hecho de materiales biológicos como células o tejidos de origen bacteriano, vegetal, fúngico o animal (en particular mamíferos). Los agentes son valorados en cuanto a su actividad potencial como antineoplásticos, anti-inflamatorios, o moduladores de la apoptosis por inclusión en pruebas de selección descritas a continuación. Los agentes son valorados en cuanto a su actividad potencial como inhibidores de la interacción proteínica específica (es decir, un agente que inhibe de forma selectiva una interacción de unión entre dos polipéptidos predeterminados pero que no interfiere de forma sustancial en la viabilidad celular) mediante inclusión en las pruebas de selección descritas a continuación.
Tal y como se utiliza en este caso, "sustancialmente puro" significa que una especie de objeto es la especie predominante presente (es decir, sobre una base molar de 30 es más abundante que cualquier otra especie macromolecular individual en la composición) y preferiblemente, una fracción sustancialmente purificada es una composición donde la especie de objeto comprende al menos alrededor de un 50 por ciento (sobre una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, una composición substancialmente pura comprenderá más de entre un 80 y un 90 por ciento de todas las especie macromoleculares presentes en la composición. Más preferiblemente, la especie de objeto es purificada hasta su homogeneidad esencial (la especie contaminante no puede detectarse en la composición mediante métodos de detección convencionales) donde la composición consiste esencialmente en una única especie macromolecular. No se consideran especies macromoleculares a las especies de solventes, moléculas pequeñas (<500 Daltons), y especies iónicas elementales.
Tal y como se utiliza en este caso, el término "condiciones fisiológicas" se refiere a la temperatura, el pH, la resistencia iónica, la viscosidad, y los parámetros bioquímicos compatibles con un organismo viable, y/o que existe generalmente de forma intracelular en una célula de levadura o célula mamífera cultivada viable. Por ejemplo, las condiciones intracelulares en una célula de levadura cultivada bajo condiciones normales de cultivo en un laboratorio son condiciones fisiológicas. Las condiciones de reacción in vitro adecuadas para los cócteles de transcripción in vitro son condiciones generalmente fisiológicas. En general, las condiciones fisiológicas in vitro comprenden 50-200 mM NaCl o 1,01, pH 6.5-8.5, 20-45ºC y 0,001-10 mM de catión divalente (por ej., Mg++, Ca++); preferiblemente alrededor de 150 mM NaCl o RCI, pH 7.2-7.6, 5 mM de catión divalente, y a menudo incluye 0,01-1,0 por ciento de proteína no específica (por ej., BSA). Un detergente no iónico (Tween, NP-40, Tritón X-100) puede a menudo estar presente, normalmente en alrededor de 0,001 a un 2%, generalmente, entre 0,05-0,2% (v/v). Un experto puede seleccionar las condiciones acuosas particulares según los métodos convencionales. Como guía general, se pueden aplicar las siguientes condiciones acuosas tamponadas: 10-250 mM NaCl, 5-50 mM Tris HCl, pH 5-8, con la adición opcional de catión(es) divalente(s) y/o queladores metálicos y/o detergentes no iónicos y/o fracciones de membrana y/o agentes antiespumantes y/o escintilantes.
La hibridación específica se define en este caso como la formación de híbridos entre un polinucleótido del primero y segundo polinucleótido (por ej., un polinucleótido que tiene una secuencia diferente pero sustancialmente idéntica al primer polinucleótido), donde el primer polinucleótido híbrida preferentemente al segundo polinucleótido bajo condiciones de hibridación rigurosas donde las secuencias de polinucleótido sustancialmente no relacionadas no forman híbridos en la mezcla.
Tal y como se utiliza en este caso, el término "anticuerpo monocatenario" se refiere a un polipéptido que incluye un dominio VH y un dominio\TL en conexión con el polipéptido, generalmente conectado mediante un péptido separador (por ej., [Gly-Gly - Gly-Gly-Ser]), y que pueden comprender secuencias de aminoácidos adicionales en las terminales carboxi y/o amino. Por ejemplo, un anticuerpo monocatenario puede comprender un segmento de enlace para conectar al polinucleótido de codificación. Como ejemplo, un scFv es un anticuerpo monocatenario. Los anticuerpos monocatenarios son generalmente las proteínas que consisten en uno o más segmentos de polipéptido de al menos 10 aminoácidos contiguos sustancialmente codificados por genes de la superfamilia de inmunoglobulinas (por ej., ver The Immunoglobulin Gene Superfamily, A.F. Williams y A.N. Barclay, en Immunoglobulin Genes, T. Honjo, FW. Alt, y TA. Rabbitts, eds., (1989) Prensa académica: San Diego, CA, pp. 361-387), codificado muy frecuentemente por una secuencia génica de cadena pesada o ligera de un roedor, primate no humano, aviar, porcina, bovina, ovina, caprina, o humana. Un anticuerpo monocatenario funcional contiene generalmente una porción suficiente de un producto génico de la superfamilia de la inmunoglobulina para conservar la propiedad de unión con una molécula de objetivo específico, generalmente, un receptor o antígeno (epítopo).
Tal y como se utiliza aquí, el término "región de determinación de la complementariedad" y "RDC" hacen referencia al término reconocido en la técnica tal y como ejemplifican las definiciones de RDC Kabat y Chothia, generalmente, también conocidas como regiones hipervariables o asas hipervariables (Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901; Chothia et al. (1989) Nature 342: 877; EA. Rabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD) (1987); y Traniontano et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 175). Los dominios de región variable comprenden generalmente, el amino-terminal de aproximadamente 105-115 aminoácidos de una cadena de la inmunoglobulina de origen natural (por ej., 1-110 aminoácidos), aunque los dominios variables algo más cortos o más largos son también adecuados para formar anticuerpos monocatenarios.
Una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina de región variable consiste en una región "tipo" interrumpida por tres regiones hipervariables, también llamadas RDC's. La extensión de la región de la estructura y RDC's se han definido de forma precisa (ver, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", E. Rabat et al., 4t Ed., U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda, MD (1987)). Las secuencias de las regiones tipo de las diferentes cadenas pesadas o ligeras se conservan de forma relativa dentro de una especie. Tal y como se utiliza en este caso, una "región tipo humana" es una región tipo sustancialmente idéntica (alrededor de un 85% o más, normalmente entre un 90-95% o más) a la región tipo de inmunoglobulina humana de origen natural. La región de la estructura de un anticuerpo es decir, las regiones tipo combinadas de las cadenas pesadas y ligeras, sirve para posicionar y alinear los RDC's. Los RDC's son principalmente responsables de la unión con un epítopo de un antígeno.
Tal y como se utiliza aquí, el término "segmento variable" se refiere a una porción de un péptido naciente que comprende una secuencia núcleo aleatoria, pseudo aleatoria, o definida. Un segmento variable puede comprender las dos posiciones de residuo variantes e invariantes, y el grado de variación de residuo se puede limitar en una posición de residuo; las dos opciones son seleccionadas según la discreción del experto. Generalmente, los segmentos variables tienen una longitud de aproximadamente de 5 a 20 residuos aminoácidos (por ej., entre 8 y 10), aunque los segmentos variables pueden ser más largos y pueden comprender porciones de anticuerpo o proteínas receptoras, como un fragmento de anticuerpo, una proteína de enlace de ácido nucleico, una proteína receptora, y similares.
Tal y como se utiliza aquí, "secuencia péptida aleatoria" se refiere a una secuencia de aminoácidos compuesta por dos o más monómeros de aminoácido, construidos por un proceso aleatorio o estocástico. Un péptido aleatorio puede incluir un sistema de referencia o motivos de andamio, que pueden comprender secuencias invariables.
Tal y como se utiliza aquí, la expresión "biblioteca péptida aleatoria" se refiere a una serie de secuencias polinucleótidas que codifican una serie de péptidos aleatorios, al igual que la serie de péptidos aleatorios codificados por estas secuencias polinucleótidas, así como a las proteínas de fusión que contienen dichos péptidos aleatorios.
Tal y como se utiliza aquí, el término "pseudo aleatorio" se refiere a una serie de secuencias que tienen variabilidad limitada de modo que por ejemplo, el grado de variabilidad del residuo respecto a una posición es diferente al grado de variabilidad del residuo en otra posición, pero cualquier posición pseudo aleatoria permite en cierto grado una variación del residuo, que sin embargo se encuentra circunscrito.
Tal y como se utiliza aquí, el término "sistema de referencia de secuencias definidas" se refiere a una serie de secuencias definidas seleccionadas sobre una base no aleatoria, generalmente en base a datos experimentales o datos estructurales; por ejemplo, un sistema de referencia de secuencias definidas puede comprender una serie de secuencias de aminoácidos predeterminados para formar una estructura/3-laminada o puede comprender un motivo de repetición heptavalente con cremalleras de leucina y dedos de zinc, entre otras variaciones. Un "núcleo de secuencia definida" es una serie de secuencias que comprenden un objetivo limitado de variabilidad. Mientras que (1) una secuencia de 10-iner completamente aleatoria de 20 aminoácidos convencionales puede ser cualquiera de las secuencias
(20)^{10}, y (2) una secuencia de 10-mer pseudoaleatoria de 20 aminoácidos convencionales puede ser cualquiera de las secuencias (20)^{10} pero mostrará una desviación en el caso de algunos residuos en determinadas posiciones y/o de forma global, (3) un núcleo de secuencia definido es un subconjunto de secuencias que es inferior al número máximo de secuencias potenciales si cada posición de residuo puede ser cualquiera de los 20 aminoácidos convencionales admisibles (y/o amino/amino ácidos no convencionales admisibles). Generalmente, un núcleo de secuencia definido comprende posiciones de residuo variantes e invariantes y/o posiciones de residuo variantes que pueden comprender un residuo seleccionado de un subconjunto definido de residuos aminoácidos, y similares, de forma segmental o sobre la totalidad de la longitud de la secuencia del miembro seleccionado de la biblioteca individual. Los núcleos de secuencias definidas pueden hacer referencia a secuencias de aminoácidos o a secuencias polinucleótidas. Para su ilustración y no su limitación, las secuencias (NNK)_{10} y (NNM)_{10}, en las que N representa A, T, G, o C; K representa G o T; y M representa A o C, son definidos como núcleos de secuencia.
Tal y como se utiliza aquí "epítopo" se refiere a la porción de un antígeno u otra macromolécula capaz de formar una interacción de enlace que interactúa con el núcleo aislado de enlace de un anticuerpo de región variable. Generalmente, este tipo de interacción de unión se manifiesta como un contacto intermolecular con uno o más residuos aminoácidos de un RDC.
Tal y como se utiliza aquí, "receptor" se refiere a una molécula que tiene una afinidad respecto a un ligante determinado. Los receptores pueden ser de origen natural o ser moléculas sintéticas. Los receptores pueden emplearse en un estado inalterado o como agregados con otra especie. Los receptores pueden ser unidos, de manera covalente o no covalente, a un miembro de enlace, de forma directa o mediante una sustancia de unión específica. Los ejemplos de receptores incluyen, pero no se limitan a anticuerpos, incluyendo anticuerpos monocionales y antisueros reactivos con determinantes antigénicos específicos (como sobre virus, células, u otros materiales), receptores de membrana celular, carbohidratos complejos y glicoproteínas, enzimas, y receptores hormonales.
Tal y como se utiliza aquí "ligante" se refiere a una molécula, como un péptido aleatorio o secuencia de segmento variable, que es reconocida por un receptor particular. Tal y como reconocerá un experto en la materia una molécula (o complejo macromolecular) puede ser tanto un receptor como un ligante. En general, el asociado por enlace que tiene un peso molecular inferior se denomina ligante y el asociado por enlace que tiene un peso molecular mayor se denomina receptor.
Tal y como se utiliza aquí, "enlazador" o "separador" se refiere a una molécula o grupo de moléculas que conecta dos moléculas, como una proteína de enlace de ADN y un péptido aleatorio, y sirve para situar las dos moléculas en una configuración preferida, por ej., de manera que el péptido aleatorio pueda enlazarse a un receptor con mínimo impedimento estérico de la proteína de enlace de ADN.
Tal y como se utiliza aquí, el término "enlazado de forma operable" se refiere a una conexión de elementos polinucleótidos en una relación funcional. Un ácido nucleico se encuentra "enlazado de forma operable" cuando es colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o intensificador se encuentra operablemente conectado a una secuencia de codificación si afecta a la transcripción de la secuencia de codificación. Operablemente enlazado significa que las secuencias de ADN enlazadas son generalmente contiguas y, allí donde es necesario unir dos regiones de codificación de proteínas, contiguas y en fase de lectura.
El término "recombinación de secuencia recurrente" tal y como se utiliza aquí se refiere a un método mediante el cual una población de secuencias polinucleótidas son recombinadas entre sí por cualquier medio adecuado de recombinación (por ej., RCP sexual, recombinación homologa, recombinación específica de sitio, etc.) para generar una biblioteca de especies de secuencia recombinada que se procede entonces a filtrar o a seleccionar para obtener aquellas especies de secuencia recombinada que tienen una propiedad deseada; las especies seleccionadas son entonces sometidas a al menos un ciclo adicional de recombinación con ellas mismas y/o con otra especie de polinucleótido y a una selección o filtración posterior para la propiedad deseada.
La selección es, en general, un proceso de dos etapas en las que la primera determina qué células expresan y cuales no expresan un marcador de selección para proceder a continuación a separar las células que tienen la propiedad deseada. La selección es una forma de cribado en la que la identificación y la separación física se consiguen de forma simultánea por expresión de un marcador de selección, el cual, en algunas circunstancias genéticas, permite que las células que expresan el marcador sobrevivan mientras otras células mueren (o viceversa). Los marcadores de selección incluyen luciferasa, \beta-galactosidasa, y proteína fluorescente verde. Los marcadores de selección incluyen genes con resistencia a los fármacos y a las toxinas. Aunque la selección espontánea puede producirse y se produce en el transcurso de la evolución natural, en el caso de los presentes métodos, la selección es realizada por el hombre.
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Metodología
La transposición del ácido nucleico es un método para la recombinación homologa recurrente in vitro o in vivo de grupos de fragmentos de ácido nucleico o polinucleótidos. Las mezclas de secuencias de ácidos nucleicos relacionados o polinucleótidos son fragmentadas de forma aleatoria o pseudo-aleatoria, y reagrupadas para proporcionar una biblioteca o población mixta de moléculas de ácido nucleico o polinucleótidos recombinantes.
A diferencia de la mutagénesis de "cassette", sólo la transposición y la tendencia al error de la RCP uso de otros métodos de intensificación de la mutación; mutagénesis química, cepas mutágenas, etc.) permiten la mutación a ciegas de un grupo de secuencias (sin otra información de secuencia aparte de los cebadores).
La ventaja de la transposición mutagénica de esta invención sobre la tendencia al error de la RCP ;ola para la selección repetida, puede explicarse con mayor claridad con un ejemplo de ingeniería de anticuerpos. En la figura 1 se muestra un diagrama esquemático de transposición de ADN tal y como se describe aquí. La biblioteca inicial puede consistir en secuencias relacionadas de origen diverso (es decir anticuerpos de ANRm original) o puede derivarse mediante cualquier tipo de mutagénesis (incluyendo la transposición) de un único gen de anticuerpo. Se obtiene una colección de regiones determinantes de la complementariedad seleccionada ("RD Cs") tras el primer ciclo de selección por afinidad (Fig. 1). En el diagrama el RDC's denso confiere a la molécula de anticuerpo una afinidad aumentada del antígeno. La transposición permite la asociación combinatoria libre de todos los RDC con todos los RDC2s, con todos os RDC3s, etc. (Fig. 1).
Este método difiere de la RCP, por el hecho de ser una reacción en cadena inversa. En la RCP, el numero de moléculas crece exponencialmente. Sin embargo, en la transposición, el número de los sitios le inicio de la polimerasa y el número de moléculas permanece esencialmente igual. Cuando se utiliza la dilución para permitir la prolongación posterior de la molécula, el proceso de transposición se transforma n una reacción en cadena inversa que genera menos moléculas.
Puesto que los cruces se producen en zonas de homología, la recombinación se producirá en primer lugar, entre miembros de la misma familia de secuencia. Esto hace disminuir las combinaciones de RDC que son incompatibles en gran medida (por ej. dirigidas contra diferentes epítopos del mismo antígeno). e contempla que las familias múltiples de secuencias pueden ser transpuestas en la misma reacción. Además, la transposición conserva el orden relativo, de manera que, por ejemplo, el RDC1 no se encontrara en la posición de RDC2.
Los transponedores raros contendrán un gran número de los mejores RDCs (por ej. afinidad máxima) estos transponedores raros pueden ser seleccionados basándose en su afinidad superior (Figura. 1).
El RDCs de un grupo de 100 secuencias diferentes de anticuerpos seleccionados pueden ser permutados en hasta 1006 formas diferentes. Este gran número de permutaciones no puede representarse en una única biblioteca de secuencias de ADN. En consecuencia, se contempla que los ciclos múltiples de transposición de ADN y de selección pueden ser requeridos dependiendo de la longitud de secuencia y de x diferencia de secuencia deseada.
Por el contrario, la tendencia al error de la RCP mantiene todos los RDCs seleccionados en la misma secuencia relativa (Figura. 1), generando una nube de mutantes mucho más pequeña.
El polinucleótido modelo, que se puede usar en los métodos de esta invención, puede ser ADN o ARN. Puede tener diferentes longitudes dependiendo del tamaño del gen o del fragmento de ADN que se debe combinar o, reagrupar. Preferiblemente, el polinucleótido modelo es de 50 bp a 50 kb. Se contempla que todos los vectores conteniendo el ácido nucleico que codifica la proteína de interés puedan ser utilizados n los métodos de esta invención, y de hecho, esto se ha realizado con éxito.
El polinucleótido modelo puede obtenerse mediante amplificación usando la reacción RCP (Patente norteamericana Nº. 4,683, 2 y 4,683,19) u otros métodos de amplificación o de donación. Sin embargo, a extracción de cebadores libres del producto de la RCP antes de la fragmentación provee un resultado más eficaz. El fracaso en eliminar de forma adecuada los cebadores puede deberse a una baja frecuencia le clones de cruce.
El polinucleótido modelo debería ser a menudo bicatenario. Se requiere una molécula de ácido nucleico icatenaria para asegurar que las zonas de fragmentos de ácido nucleico monocatenario resultantes sean complementarias entre sí y de esta forma, puedan hibridar para formar una molécula bicatenaria.
Se contempla que los fragmentos de ácido nucleico monocatenario o bicatenario con regiones de identidad respecto al polinucleótido modelo y regiones de heterología respecto al polinucleótido modelo puedan ser añadidos al polinucleótido modelo en esta etapa. Se contempla igualmente que dos modelos de polinucleótido relacionados diferentes puedan ser mezclados en esta etapa.
El polinucleótido bicatenario modelo y cualquier fragmento monocatenario o bicatenario añadido son digeridos de forma aleatoria en fragmentos de alrededor de 5 bp a 5 kb o más. Preferiblemente, el tamaño de los fragmentos aleatorios es de alrededor de 10 bp o 1000 hp más preferiblemente el tamaño de los fragmentos de ADN se sitúa entre 20 bp y 500 bp.
De forma alternativa se contempla igualmente que el ácido nucleico bicatenario que tiene múltiples mellas pueda ser usado en los métodos de esta invención. Una mella es una rotura en una cadena de un ácido nucleico bicatenario. La distancia entre este tipo de mella es preferiblemente de 5 bp a 5 kb más preferiblemente entre 10 bp y
1000 bp.
El fragmento de ácido nucleico puede ser digerido por un número de métodos diferentes. El fragmento de ácido nucleico puede ser digerido con una nucleasa, como la ADNsa 1 o la ARNsa. El ácido nucleico puede ser cortado de forma aleatoria por el método de sonicación o mediante el pasaje a través de un tubo con un pequeño orificio.
Se contempla igualmente, que el ácido nucleico puede también ser parcialmente digerido con una o más enzimas de restricción, de manera que algunos puntos de cruce puedan ser considerados estadísticamente.
Sin embargo, en al menos un ciclo de la reacción de amplificación, la fragmentación se realizará mediante extensión incompleta.
La concentración de cualquier fragmento específico de ácido nucleico no será superior a un 1% en peso del ácido nucleico total, más preferiblemente, la concentración de cualquier secuencia de ácido nucleico específica no será superior a un 0 1% en peso del ácido nucleico total.
El número de diferentes fragmentos de ácido nucleico específico presentes en la mezcla será al menos de alrededor de 100, preferiblemente, al menos alrededor de 500, y más preferiblemente al menos alrededor de 1000.
En esta etapa, los fragmentos de ácido nucleico monocatenarios o bicatenarios, sintéticos o naturales, pueden ser añadidos a los fragmentos de ácido nucleico bicatenarios aleatorios con el objetivo de aumentar la heterogeneidad de la mezcla de fragmentos de ácido nucleico.
Se contempla igualmente que las poblaciones de fragmentos de ácido nucleico bicatenario aleatoriamente rotos o con mella pueden ser mezcladas o combinadas en esta etapa. El ADN dañado puede ser aprovechado para intensificar la recombinación mediante las porciones de mella que pueden participar en la invasión de la cadena, sirviendo la formación de conjunciones de recombinación como extremos libres 3' para la formación híbrida y similares.
Allí donde se desee la inserción de mutaciones en el polinucleótido modelo, los fragmentos de ácido nucleico monocatenario o bicatenario que tienen una región de identidad respecto al polinucleótido modelo y una región de heterología respecto al polinucleótido modelo pueden ser añadidos en un exceso de 20 veces en peso en comparación con el ácido nucleico total, más preferiblemente, los fragmentos de ácido nucleico monocatenarios pueden ser añadidos en un exceso de 10 veces en peso en comparación con la totalidad de ácido nucleico.
Allí donde se desee una mezcla de polinucleótidos modelo diferentes pero relacionados, las poblaciones de fragmentos de ácido nucleico de cada uno de los modelos puede combinarse con una proporción inferior a alrededor de 1:40, más preferiblemente, la proporción es inferior a alrededor de 1:40. Por ejemplo, puede desearse un retrocruce de polinucleótido de tipo salvaje con una población de polinucleótido mutado para eliminar mutaciones neutras (por ej., mutaciones que obtienen como resultado una alteración insustancial en la propiedad fenotípica seleccionada). En este tipo de ejemplo, la proporción de fragmentos de polinucleótido de tipo salvaje digerido de forma aleatoria que pueden añadirse a los fragmentos de ácido nucleico mutante digeridos de forma aleatoria es de aproximadamente 1:1 a alrededor de 100:1, y más preferiblemente de 1:1 a 40:1.
Las poblaciones mixtas de fragmentos de ácido nucleico de longitud aleatoria son desnaturalizadas para formar fragmentos de ácido nucleico monocatenarios y después rehibridados. Sólo aquellos fragmentos de ácido nucleico monocatenarios que tengan regiones de homología con otros fragmentos de ácido nucleico monocatenarios serán rehibridados.
Los fragmentos de ácido nucleico de longitud aleatoria pueden ser desnaturalizados mediante calentamiento. Un experto en la materia podría determinar las condiciones necesarias para desnaturalizar en su totalidad el ácido nucleico bicatenario. Preferiblemente, la temperatura es de 80 a 100ºC, más preferiblemente, la temperatura es de 90 a 96ºC. Otros métodos que se pueden utilizar para desnaturalizar los fragmentos de ácido nucleico, incluyen la presión (36)
y el pH.
Los fragmentos de ácido nucleico pueden ser rehibridados por enfriamiento. Preferiblemente, la temperatura se ubica entre 20 y 75ºC, más preferiblemente, la temperatura se encuentra entre 40 y 65ºC. En el caso de requerir una frecuencia alta de cruces en base a un promedio de sólo 4 bases consecutivas o de homología, se puede forzar la recombinación usando una temperatura de hibridación baja, aunque esto dificultaría el proceso. El grado de renaturación producido dependerá del grado de homología entre la población de fragmentos de ácido nucleico monocatenarios.
La renaturación puede ser acelerada mediante la adición de polietilenoglicol ("PEG") o sal. La concentración de sal se sitúa preferiblemente entre 0 mM y alrededor de 400 mM, más preferiblemente, la concentración de sal se sitúa entre 10 mM y 100 mM. La sal puede ser ECl o NaCl. La concentración de PEG es preferiblemente de 0 a 20%, más preferiblemente de 5 a 10%. En caso de desearlo, se pueden utilizar concentraciones más altas de sal y/o PEG.
A continuación, los fragmentos de ácido nucleico hibridados son incubados en presencia de una polimerasa de ácido nucleico y dNTP's (es decir, dATP, dCTP, dGTP y dTTP). La polimerasa de ácido nucleico puede ser el fragmento Klenow, Taq polimerasa o cualquier otra polimerasa de ADN conocida en la técnica.
El procedimiento que debe ser utilizado para el agrupamiento depende del grado mínimo de homología que todavía debe proporcionar cruces. Si las regiones de identidad son grandes, la Taq polimerasa puede ser utilizada con una temperatura de hibridación de entre 45-65ºC. Si las regiones de identidad son pequeñas, la polimerasa Klenow puede utilizarse con una temperatura de hibridación de entre 20-30ºC. Los expertos en la materia pueden variar la temperatura de hibridación con el fin de aumentar el número de cruces conseguidos.
La polimerasa puede ser añadida a los fragmentos de ácido nucleico aleatorios anteriormente a la hibridación, simultáneamente a la hibridación o posteriormente a ésta.
El ciclo de desnaturalización, renaturación e incubación en presencia de polimerasa puede denominarse transposición o reagrupación del ácido nucleico. Este ciclo se repite todas las veces que se desee. Preferiblemente, el ciclo se repite de 2 a 50 veces, más preferiblemente, la secuencia se repite de 10 a 40 veces. El término "transposición" incluye un margen más amplio de procesos de recombinación recurrentes que pueden incluir, aunque no obligatoriamente, la amplificación por RCP o métodos similares de amplificación; de esta forma, la transposición puede implicar recombinación homologa, recombinación específica de localizador, formación de quimeras (por ej., Levichkin et al. op, cit), y similares, en la medida en que se usa de forma recurrente (es decir., para más de un ciclo de recombinación de secuencia) con selección y/o cribado. La recombinación no determinista, como la recombinación homologa general puede utilizarse en combinación o en lugar de la recombinación determinista, como recombinación específica del sitio dónde los sitios de recombinación son conocidos y/o definidos.
El ácido nucleico resultante es un polinucleótido bicatenario más grande de 50 bp a alrededor 100 kb, preferiblemente, el polinucleótido más grande es de 500 bp a 50 kb.
Este fragmento de polinucleótido más grande puede contener un número de copias de un fragmento de ácido nucleico con el mismo tamaño que el polinucleótido modelo en serie. A continuación, este fragmento concatemérico es digerido para formar copias únicas del polinucleótido modelo. El resultado será una población de fragmentos de ácido nucleico de aproximadamente el mismo tamaño que el polinucleótido modelo. La población será una población mixta en la que los fragmentos de ácido nucleico monocatenarios o bicatenarios con una región de identidad y una región de heterología han sido añadidos al polinucleótido modelo anteriormente a la transposición. De forma alternativa, el concatémero puede introducirse (por ej., mediante electroporación, lipofección, o similares) de forma directa sin monomerización. En el caso de secuencias grandes, se puede desear subdividir la secuencia grande en varias subporciones que son transpuestas separadamente con otras porciones sustancialmente similares, y el grupo de subporciones transpuestas resultantes son entonces ligadas, generalmente, siguiendo el orden original, para generar un grupo de secuencias grandes transpuestas que pueden entonces ser utilizadas para la transformación de una célula huésped, o similar.
A continuación, se procede a clonar dichos fragmentos para formar el vector apropiado y la mezcla de ligadura usada para transformar bacterias.
Se contempla que los fragmentos de ácido nucleico individuales pueden obtenerse a partir del fragmento de ácido nucleico concatemérico más grande mediante amplificación de los fragmentos de ácido nucleico individuales anteriormente a la donación mediante una variedad de métodos que incluyen la RCP (Patente norteamericana Nº 4,683,19 y 4,683,2) mejor que mediante digestión del concatémero. De forma alternativa, el concatémero puede ser introducido (p. ej., por medio de electroporación, lipofección, o similares) directamente sin monomerización.
El vector usado para la donación no es fundamental siempre que tolere un fragmento de ADN del tamaño deseado. Si se desea la expresión del fragmento de ADN, el vehículo de donación posterior comprenderá la transcripción y las señales de traslación junto al localizador de inserción del fragmento de ADN para permitir la expresión del fragmento de ADN en la célula huésped. Los vectores preferidos incluyen las series pUC y series pBR de plásmidos.
La población bacteriana resultante incluye varios fragmentos de ADN recombinante con mutaciones aleatorias. Esta población mixta puede ser evaluada para identificar el fragmento de ácido nucleico recombinante deseado. El método de selección dependerá del fragmento de ADN deseado.
Por ejemplo, si se desea que un fragmento de ADN codifique una proteína con una eficacia de unión aumentada respecto a un ligante, las proteínas expresadas por cada uno de los fragmentos de ADN en la población o biblioteca pueden ser evaluadas para determinar su capacidad de enlace con el ligante mediante el uso de métodos conocidos en la técnica (es decir inmunopurificación, cromatografía de afinidad). Si se desea un fragmento de ADN que codifique una proteína con una resistencia aumentada a los fármacos, las proteínas expresadas por cada uno de los fragmentos de ADN en la población o biblioteca puede evaluarse por su capacidad para conferir resistencia a los fármacos respecto al organismo huésped, un experto en la materia, dado su conocimiento de la proteína deseada, podría realizar inmediatamente un ensayo sobre la población con el fin de identificar los fragmentos de ADN que confirieran la propiedades deseadas sobre la proteína.
Se contempla que un experto en la materia podría utilizar un sistema de exposición en fago en el que los fragmentos de la proteína se expresaran como proteínas de fusión en una superficie del fago (Pharmacia, Milwaukee WI). Las moléculas recombinantes de ADN son donadas para formar un fago de ADN en el localizador resultante en la transcripción de la proteína de fusión, una porción en la que se codifica mediante una molécula recombinante de ADN. El fago que contiene la molécula de ácido nucleico recombinante lleva a cabo la replicación y la transcripción en la célula. La secuencia de inicio de la proteína de fusión dirige el transporte de la proteína de fusión hasta el extremo de la partícula del fago. De esta forma, la proteína de fusión que se encuentra parcialmente codificada por la molécula está expuesta en la partícula del fago para la detección y la selección de los métodos anteriormente descritos.
Además se contempla que varios ciclos de transposición de ácido nucleico pueden ser conducidos con fragmentos de ácido nucleico a partir de una subpoblación de la primera población, cuya subpoblación contiene ADN que codifica la proteína recombinante deseada. De esta forma, se podrían conseguir proteínas con unas afinidades o actividades enzimáticas incluso más altas.
Se contempla igualmente, que un número de ciclos de transposición de ácido nucleico podría llevarse a cabo con una mezcla de fragmentos de ácido nucleico de tipo salvaje y una subpoblación de ácido nucleico a partir de la primera etapa de transposición o posteriores del ácido nucleico con el fin de eliminar cualquier mutación silenciosa de la subpoblación.
Se puede utilizar cualquier fuente de ácido nucleico de forma purificada como es el caso del ácido nucleico inicial. De esta forma, el proceso puede emplear ADN o ARN incluyendo ARN mensajero, ADN o ARN que pueden ser mono o bicatenario. Además, se puede utilizar un ADN híbrido que contenga cada una de las cadenas. Las secuencia de ácido nucleico pueden tener diferentes longitudes dependiendo del tamaño de secuencia del ácido nucleico que se deba mutar. Preferiblemente, la secuencia específica de ácido nucleico tiene de 50 a 50000 pares base. Se contempla que todos los vectores que contengan el ácido nucleico que codifica la proteína de interés puedan ser usados en los métodos de esta invención.
El ácido nucleico puede obtenerse a partir de cualquier fuente, por ejemplo, de plásmidos como pBR322, a partir de ADN o ARN donado o de ADN o ARN natural de cualquier fuente incluyendo bacterias, levadura, virus y organismos superiores, como es el caso de vegetales o animales. El ADN o el ARN pueden extraerse de la sangre o material tisular. El polinucleótido modelo puede obtenerse mediante amplificación usando la reacción en cadena polinucleótida (RCP) (Patente norteamericana n 4,683, 202 y 4,683,195). De forma alternativa, el polinucleótido puede estar presente en un vector incluido en una célula y se puede obtener ácido nucleico suficiente para cultivar la célula y para extraer el ácido nucleico de la célula usando métodos conocidos en la técnica.
Se puede utilizar cualquier secuencia de ácido nucleico específica para producir la población de mutantes mediante el presente proceso. Solamente es necesario que una pequeña población de secuencias mutantes de la secuencia de ácido nucleico específica exista o sea creada anteriormente al presente proceso.
La pequeña población inicial de secuencias de ácidos nucleicos específicas con mutaciones puede crearse mediante varios métodos diferentes. Las mutaciones pueden crearse mediante tendencia al error de la RCP. Los usos de la tendencia al error de la RCP reducen las condiciones de fidelidad de la polimerización para introducir de forma aleatoria, un bajo nivel de mutaciones puntuales sobre una secuencia larga. De forma alternativa, las mutaciones pueden ser introducidas en el polinucleótido modelo mediante mutagénesis dirigida por un oligonucleótido. En la mutagénesis dirigida por un oligonucleótido una secuencia corta del polinucleótido es extraída del polinucleótido usando digestión enzimática de restricción y es reemplazada con un polinucleótido sintético en el que se han alterado diferentes bases a partir de la secuencia original. La secuencia polinucleótida puede también alterarse mediante mutagénesis química. Los mutágenos químicos incluyen, por ejemplo, bisulfito de sodio, ácido nitroso, hidroxilanina, hidracina o ácido fórmico. Otros agentes análogos a los precursores de nucleótido, incluyen bramouracilo, 2-aminopurina, o acridina. Generalmente, estos agentes son añadidos a la reacción RCP en lugar del nucleótido precursor procediendo a mutar de este modo la secuencia. Igualmente, se pueden utilizar agentes intercalantes como la profiavina, acrifiavina, quinacrina y similares. La mutagénesis aleatoria de la secuencia polinucleótida puede también conseguirse mediante irradiación con rayos X o luz ultravioleta. Generalmente, los plásmidos de ADN o fragmentos de ADN mutagenizados de esta forma son introducidos en E. coli y propagado como un grupo o biblioteca de plásmidos mutantes.
De forma alternativa, la pequeña población mixta de ácidos nucleicos específicos puede encontrarse en la naturaleza por el hecho de que pueden componerse de diferentes alelos del mismo gen o del propio gen a partir de distintas especies relacionadas (es decir, genes análogos). De forma alternativa, se pueden relacionar secuencias de ADN encontradas en una especie, por ejemplo, genes de inmunoglobulina.
Una vez generada la población mixta de secuencias de ácidos nucleicos específicos, los polinucleótidos pueden utilizarse directamente o se pueden insertar en un vector de donación apropiado, usando técnicas bien conocidas en la técnica.
La elección del vector depende del tamaño de la secuencia polinucleótida y de la célula huésped que debe ser empleada en los métodos de esta invención. Los modelos de esta invención pueden ser plásmidos, fagos, cósmidos, fagémidos, virus (por ej., retrovirus, parainfluenzavirus, herpesvirus, reovirus, parainixovirus, y similares), o porciones seleccionadas a partir de éstos (p. ej., proteína de revestimiento, glicoprotema de hebra, proteína cápsida). Por ejemplo, los cósmidos, fagémidos, YAC's, y BAC's se prefieren allí dónde la secuencia de ácido nucleico específica que debe ser mutada es superior porque dichos vectores son capaces de propagar grandes fragmentos estables de ácido nucleico.
Si la población mixta de la secuencia de ácido nucleico específica es donada en un vector, éste puede ser clónicamente amplificado realizando la inserción de cada vector en una célula huésped y permitiendo que la célula huésped amplifique el vector. Esto se denomina amplificación clónica ya que mientras el número absoluto de secuencias de ácidos nucleicos aumenta, el número de mutantes no lo hace.
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RCP en paralelo
En la RCP en paralelo se produce un gran número de diferentes reacciones RCP en paralelo en el mismo recipiente, con los productos de una reacción cebando los productos de otra reacción. Puesto que los productos RCP se ceban mutuamente, el índice de tamaño del producto aumenta con el número de ciclos de RCP.
Mediante el uso de cebadores múltiples en paralelo, se pueden amplificar las secuencias que tengan un exceso de 50 kb. Los genes enteros y los plásmidos enteros pueden ser agrupados en un único tubo de oligonucleótidos sintéticos mediante RCP en paralelo. Las secuencias pueden mutagenizarse de forma aleatoria a diferentes niveles mediante fragmentación aleatoria y reagrupación de los fragmentos mediante cebado mutuo. Las mutaciones específicas de sitio pueden introducirse en secuencias largas mediante fragmentación aleatoria del modelo seguida de reagrupación de los fragmentos en presencia de oligonucleótidos mutagénicos. Una aplicación particularmente útil de RCP en paralelo se denomina RCP sexual.
En la RCP sexual, también denominada transposición de ADN, la RCP en paralelo se usa para realizar la recombinación in vitro sobre un grupo de secuencias de ADN. Una mezcla de secuencias de ADN relacionadas pero no idénticas (generalmente productos de la RCP, fragmentos de restricción o plásmidos enteros) es fragmentada aleatoriamente, por ejemplo mediante tratamiento de ADNsa. A continuación, se procede a reagrupar estos fragmentos aleatorios mediante RCP en paralelo. Puesto que los fragmentos aleatorios y sus productos RCP se ceban mutuamente, el tamaño medio de los fragmentos aumenta con el número de ciclos de RCP. La recombinación, o cruce, se produce por conmutación modelo, como cuando un fragmento de ADN derivado de un modelo ceba sobre la posición homologa de un modelo relacionado pero diferente. Por ejemplo, la RCP sexual puede utilizarse para construir bibliotecas de quimeras génicas de distintas especies ("bibliotecas zoo"). El RCP sexual es útil para la evolución in vitro de secuencias de ADN. Las bibliotecas de combinaciones mutantes nuevas obtenidas por RCP sexual son seleccionadas a partir de las mejores secuencias recombinantes a nivel de ADN y ARN, proteína o pequeña molécula. Este proceso de recombinación, selección y amplificación es repetido por tantos ciclos como sean necesarios para obtener una propiedad o función deseada.
Muchas versiones de RCP en paralelo no utilizan cebadores. Los fragmentos de ADN, ya sean sintéticos, obtenidos por digestión aleatoria, o por RCP con cebadores, sirven como modelo, al igual que los cebadores. Puesto que la concentración de cada secuencia final diferente en la reacción de reensamblaje es muy baja, no se observa la formación del dímero de cebado, y en el caso de producirse un cebado erróneo, solo puede crecer en el mismo nivel que el producto correctamente hibridado. La RCP en paralelo requiere muchos ciclos de RCP porque sólo la mitad de los pares hibridados tienen desbordes extensibles y la concentración de los extremos 3' es baja.
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Utilidad
El método de transposición del ADN de esta invención puede realizarse a ciegas sobre un grupo de secuencias desconocidas. Mediante la adición a los oligonucleótidos de la mezcla de reensamblaje (con extremos que son homólogos a las secuencias reagrupadas) se puede incorporar cualquier mezcla de la secuencia a cualquier posición específica en otra mezcla de la secuencia. De esta forma, se contempla que las mezclas de oligonucleótidos sintéticos, fragmentos RCP o incluso genes enteros pueden mezclarse en otra biblioteca de secuencia en posiciones definidas. La inserción de una secuencia (mezcla) es independiente de la inserción de una secuencia en otra parte del modelo. De esta forma, el grado de recombinación, la homología requerida, y la diferencia de la biblioteca puede variar de forma independiente y simultánea a lo largo de la longitud del ADN reagrupado.
Este proceso de mezclar dos genes puede ser útil para la humanización de anticuerpos de hibridomas murinos. La proximidad de la mezcla de dos genes o la inserción de secuencias mutantes en genes puede ser útil para cualquier proteína de uso terapéutico, por ejemplo, interleuquina I, anticuerpos, tPA, hormona de crecimiento, etc. El proceso puede también ser útil en cualquier ácido nucleico, por ejemplo, en promotores o intrones o región no codificante 3' o regiones no codificantes 5' de genes para aumentar la expresión o alterar la especificidad de expresión de las proteínas. El proceso puede también utilizarse para mutar ribozimas o tecnologías de aplicación.
La transposición requiere la presencia de regiones homologas que separen las regiones de diversidad. Si las secuencias que deben ser transpuestas no son sustancialmente idénticas, generalmente, es preferible emplear la transposición a base de intrones y/o recombinación específica de sitio. Las estructuras proteínicas en forma de andamio pueden ser particularmente adecuadas para la transposición. El andamio conservado determina el pliegue global mediante autoasociación, mientras expone asas relativamente no restringidas que median el enlace específico. Existen ejemplos de este tipo de andamios como el barril beta de inmunoglobulina, y el paquete de cuatro espirales (24). Esta transposición puede utilizarse para crear proteínas en forma de andamio con diferentes combinaciones de secuencias mutadas para el enlace.
Los equivalentes de algunos cruces genéticos estándares pueden también realizarse mediante transposición in vitro. Por ejemplo, un "retrocruce molecular" puede realizarse mediante la mezcla repetida del ácido nucleico del mutante con el ácido nucleico de tipo salvaje durante la selección de las mutaciones de interés. Como una mejora tradicional, este proceso puede utilizarse para combinar fenotipos de distintas fuentes en un contexto de elección. Esto es de utilidad, por ejemplo, para la extracción de mutaciones neutras que influencian las características no seleccionadas (es decir la inmunogenicidad). De esta forma, esto puede ser útil para determinar qué mutaciones se encuentran implicadas en la actividad biológica reforzada y cuales no, una ventaja imposible de conseguir mediante mutagénesis con tendencia al error o con métodos de mutagénesis de "cassette".
Los genes grandes funcionales pueden ensamblarse correctamente a partir de una mezcla de fragmentos aleatorios pequeños. Esta reacción puede emplearse para el reensamblaje de genes extraídos de ADN de fósiles altamente fragmentados (25). Además, los fragmentos de ácido nucleico aleatorios de fósiles pueden combinarse con fragmentos de ácido nucleico de genes similares a partir de especies relacionadas.
Se contempla igualmente que el método según esta invención puede utilizarse para la amplificación in vitro de un genoma entero de una única célula tal y como se requiere para una variedad de aplicaciones de diagnóstico y de búsqueda. La amplificación de ADN mediante RCP se ve limitada en la práctica a una longitud de alrededor de 40 kb. La amplificación de un genoma entero como es el caso de E. coli (5.000 kb) mediante RCP requeriría alrededor de 250 cebadores que proporcionaría como resultado 125 fragmentos de cuarenta kb. Este proceso no es práctico debido a la indisponibilidad de datos suficientes de la secuencia. Por otra parte, la digestión aleatoria del genoma con ADNsa, seguida de purificación de gel de fragmentos pequeños proporcionan una multitud de posibles cebadores. El uso de esta mezcla de fragmentos pequeños aleatorios como cebadores en una reacción RCP solos o con el genoma entero como el modelo, proporciona como resultado una reacción en cadena inversa con el teórico punto final (asumiendo la dilución y el RCP adicional) de un único concatémero que contiene muchas copias del genoma.
Puede obtenerse una amplificación 100 veces mayor en el número de copia y un tamaño medio del fragmento superior a 50 kb cuando sólo se utilizan los fragmentos aleatorios (ver Ejemplo 2). Se piensa que el concatémero más grande es generado mediante la superposición de muchos fragmentos más pequeños. La calidad de los productos específicos RCP obtenidos mediante el uso de cebadores sintéticos no se podrá distinguir del producto obtenido del ADN no amplificado. Se espera que este proceso sea útil para el mapeo de genomas.
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Métodos de exposición de péptidos
El presente método puede utilizarse para transponer secuencias polinucleótidas seleccionadas por métodos de exposición de péptidos, donde un polinucleótido asociado codifica un péptido expuesto seleccionado para un fenotipo (por ej., para la afinidad de un receptor predeterminado (ligante)).
Un aspecto cada vez más importante de desarrollo de fármacos biofarmacéuticos y biología molecular es la identificación de estructuras péptidas, que incluyen las secuencias de aminoácidos primarios, de péptidos o de peptidomiméticos que interactúan con macromoléculas biológicas, Un método de identificación de péptidos que posee una estructura deseada o propiedad funcional, como la unión a una macromolécula biológica predeterminada (por ej., un receptor), implica la selección de una biblioteca grande o de péptidos para los miembros individuales de una biblioteca que poseen la estructura deseada o propiedad funcional proporcionada por la secuencia de aminoácidos del péptido.
Además de los métodos químicos de síntesis directos para generar bibliotecas péptidas, también se ha hecho alusión a diferentes métodos de ADN recombinante. Un tipo implica la exposición de una secuencia péptida, anticuerpo, u otra proteína sobre la superficie de una célula o partícula bacteriófaga. Generalmente, en estos métodos, cada partícula o célula bacteriófaga sirve como miembro de biblioteca individual que expone una única especie de péptido expuesto añadido al bacteriófago natural o secuencias de proteína celular. Cada bacteriófago o célula contiene la información de secuencia nucleótida que codifica la secuencia péptida expuesta particular; de esta forma, la secuencia péptida expuesta puede constatarse mediante la determinación de secuencia nucleótida de un elemento de la biblioteca aislado.
Un método de exposición de péptido conocido implica la presentación de una secuencia péptida sobre la superficie de un bacteriófago filamentoso, normalmente, como una fusión con una proteína de revestimiento bacteriófaga. La biblioteca bacteriófaga puede ser incubada con una macromolécula inmovilizada, predeterminada o molécula pequeña (por ej., un receptor) de manera que las partículas bacteriófagas que presentan una secuencia péptida que enlaza la macromolécula inmovilizada puede dividirse de forma diferencial a partir de aquellas que no presentan secuencias péptidas que enlazan con la macromolécula predeterminada. Las partículas bacteriófagas (es decir, los miembros de la biblioteca) que se enlazan a la macromolécula inmovilizada son entonces recuperadas y replicadas para amplificar la subpoblación bacteriófaga seleccionada para un ciclo posterior de enriquecimiento de afinidad y replicación del fago. Después de varias etapas de enriquecimiento de la afinidad y replicación del fago, se procede a aislar los miembros de biblioteca bacteriófagos seleccionados de esta forma y se determina la secuencia nucleótida que codifica la secuencia péptida expuesta, identificando de ese modo la(s) secuencia(s) de péptidos que enlazan con la macromolécula predeterminada (por ej., receptor). Este tipo de métodos están descritos con mayor detalle en la publicación de patente PCT Nº 91/17271, 91/8980, y 91/9818 y 93108278.
La última publicación PCT describe un método de ADN recombinante para la exposición de ligantes péptidos que implica la producción de una biblioteca de proteínas de fusión con cada proteína de fusión, compuesta por una primera porción de polipéptido, que incluye normalmente, una secuencia variable, es decir disponible para el enlace potencial con una macromolécula predeterminada, y una segunda porción de polipéptido que enlaza con el ADN, corno el vector de ADN que codifica la proteína de fusión individual. Cuando se procede a cultivar las células huésped transformadas en condiciones que permiten la expresión de la proteína de fusión, dicha proteína de fusión enlaza el vector de ADN codificándolo. A partir de la tisis de la célula huésped, los complejos de proteínalvector de ADN pueden ser seleccionados contra una macromolécula predeterminada de la misma forma que se seleccionan las partículas bacteriófagas en el sistema de exposición a base de fago, con la replicarán y secuenciación de los vectores de ADN en la fusión seleccionada de los complejos de proteínalvector de ADN que sirven como base para la identificación de la(s) secuencia(s) de péptido de biblioteca seleccionada.
Otros Sistemas de generación de bibliotecas de péptidos y polímeros similares presentan aspectos de los recombinantes y de los métodos de síntesis química in vitro. En estos métodos híbridos, se emplea la maquinaria enzimática libre de células para realizar la síntesis in vitro de los miembros de biblioteca (es decir, péptidos o polinucleótidos). En un tipo de método, las moléculas de ARN con capacidad para enlazar una proteína predeterminada o una molécula colorante predeterminada fueron seleccionadas mediante etapas de selección alternas y amplificación por RCP (Tuerk y Oro (1990) Science 249: 505; Ellington y Szostak (1990) Nature 346: 818). Una técnica similar se utilizó para identificar las secuencias de ADN que enlazan un factor de transcripción humano predeterminado (Thiesen y Bach (1990) Nucleic Acids Res. 18: 3203; Beaudry y Joyce (1992) Science 257; 635; publicación de patente PCT Nos. 92/05258 y 92/14843). De una forma similar, la técnica de traducción in vitro ha sido utilizada para sintetizar las proteínas de interés y ha sido propuesta como un método para generar grandes bibliotecas de péptidos. Estos métodos basados en la traducción in vitro que incluyen generalmente complejos estabilizados de polisomas han sido descritos con mayor detalle en la publicación de la patente PCT Nº. 88/08453, 90105785, 90/07003, 91/02076, 91/05058 y 92/02536. Los solicitantes han descrito métodos en los que los miembros de la biblioteca comprenden una proteína de fusión con una primera porción de polipéptido con actividad de enlace de ADN y una segunda porción de polipéptido con una secuencia péptida única del miembro de la biblioteca; este tipo de método es adecuado para el uso en formatos de selección libres de células in vitro, entre otros.
Una variación del método es la recombinación de secuencia recurrente realizada por recombinación a base de intrones, donde las secuencias deben ser recombinadas están presentes como exones (por ej., en forma de exones de origen natural o artificial) que pueden compartir una identidad de secuencia sustancial, mínima, o inexistente y que están separados por uno o más intrones (que pueden ser secuencias intrónicas de origen natural o no) que comparten la identidad de secuencia suficiente para soportar la recombinación homologa entre intrones. Un ejemplo no limitativo es el caso de una población de polinucleótidos que comprende miembros de la biblioteca donde cada miembro de la biblioteca tiene una o más copias de un primer conjunto de exones conectados por medio de una primera serie de intrones con una o más copias de un segundo conjunto de exones conectados mediante un segundo conjunto de intrones con una o más copias de un tercer conjunto de exones. Cada uno de los miembros del primer conjunto de exones puede compartir de forma sustancial una identidad de secuencia, mínima o inexistente entre sí o con los miembros del segundo o tercer conjunto de exones. De forma similar, cada uno de los miembros del segundo conjunto de exones puede compartir una identidad de secuencia sustancial, pequeña, o inexistente entre sí o con los miembros del primer o tercer conjunto de exones. De forma similar, cada uno de los miembros del tercer conjunto de exones puede compartir la identidad de secuencia de forma sustancial, mínima, o inexistente entre sí o con los miembros del primer o segundo conjunto de exones. Cada uno de los miembros de cada conjunto (primero, segundo, tercero, etc.) de intrones comparte una identidad de secuencia suficiente con los otros miembros del conjunto para soportar la recombinación (recombinación de localizador homologa o específica que incluye la restricción de localizador mediante recombinación) entre miembros del mismo conjunto de intrones, pero normalmente, no con miembros de otros conjuntos de intrones (por ej., el segundo o tercer conjunto), de modo que la recombinación interna de conjunto entre intrones de los miembros de biblioteca produce y genera un grupo de miembros de biblioteca recombinados donde el primer conjunto de exones, segundo conjunto de exones, y tercer conjunto de exones se transponen entre sí de forma eficaz.
Las secuencias péptidas expuestas pueden tener unas longitudes variables, normalmente de 3-5000 aminoácidos de largo o más, frecuentemente, de 5-100 aminoácidos de largo, y a menudo de alrededor de 8-15 aminoácidos de largo. Una biblioteca puede comprender miembros de biblioteca con unas longitudes variables de secuencia péptida expuesta, o puede comprender miembros de biblioteca con una longitud fija de secuencia péptida expuesta. Las porciones o la totalidad de secuencia(s) del péptido expuesto puede ser aleatoria, pseudoaleatoria, de núcleo de conjunto definido, fijo, o similar. Los presentes métodos de exposición incluyen métodos para la exposición in vitro e in vivo de anticuerpos monocatenarios, como scFv naciente sobre polisomas o scFv de exposición en fago, que permite una gran amplitud de selección de bibliotecas scFv con una amplia diferencia de secuencias de región variable y especificidades de enlace.
La presente invención también provee bibliotecas y métodos péptidos de estructura de secuencia, definida, pseudoaleatoria y aleatoria para generar y seleccionar dichas bibliotecas con el fin de identificar compuestos útiles (por ej., péptidos, que incluyen anticuerpos monocatenarios) que enlazan moléculas receptoras, epítopos de interés o productos génicos que modifican los péptidos o el ARN de una forma deseada. Los péptidos del sistema de referencia de la secuencia definida pseudoaleatoria y aleatoria son producidos a partir de bibliotecas de miembros de biblioteca de péptidos que comprenden péptidos expuestos o anticuerpos monocatenarios expuestos unidos a un modelo polinucleótido a partir del cual el péptido expuesto ha sido sintetizado. El método de enlace puede variar según la forma de realización específica de la invención seleccionada, y puede incluir encapsidación en una partícula de fago o incorporación en una célula.
Un método de enriquecimiento de afinidad permite una gran biblioteca de péptidos y anticuerpos monocatenarios que deben ser seleccionados al igual que la secuencia polinucleótida que codifica el(los) péptido(s) deseado(s) o anticuerpos monocatenarios que deben ser seleccionados. El grupo de polinucleótidos puede entonces ser aislado y transpuesto recombinando de forma combinatoria la secuencia de aminoácidos del(de los) péptido(s) seleccionado(s) (o porciones predeterminadas de estos) o anticuerpos monocatenarios (o sólo VH, \TL, o sus porciones RD C). Usando estos métodos se puede identificar un péptido o anticuerpo monocatenario como aquél que tiene una afinidad de enlace deseada para una molécula y puede aprovechar el proceso de transposición para converger rápidamente hasta alcanzar un péptido o scFv de alta afinidad. El péptido o anticuerpo puede entonces ser sintetizado en grandes cantidades por medios convencionales para cualquier uso adecuado (por ej., como un agente terapéutico o diagnóstico).
Una ventaja significativa de la presente invención es que no se requiere ninguna información precedente en relación a una estructura esperada del ligante para aislar ligantes péptidos o anticuerpos de interés. El péptido identificado puede tener una actividad biológica que debe incluir al menos una afinidad de enlace específica para una molécula receptora seleccionada y, en algunos ejemplos, incluirá además la capacidad para bloquear el enlace de otros compuestos, para estimular o inhibir las vías metabólicas, para actuar como señal o mensajero; para estimular o inhibir la actividad celular, y similares.
La presente invención también provee un método para transponer un grupo de secuencias polinucleótidas seleccionadas por afinidad seleccionando una biblioteca de polisomas que exponen los péptidos nacientes (incluyendo anticuerpos monocatenarios) para los miembros de la biblioteca que enlazan con un receptor predeterminado (por ej., un receptor proteínico mamífero como, por ejemplo, un receptor de hormona peptidérgica, un receptor de superficie celular, una proteína intracelular que enlaza con otra(s) proteína(s) para formar complejos de proteína intracelulares como heterodímeros y similares) o epítopo (por ej., una proteína inmovilizada, glicoproteína, oligosacárido, y similares).
Las secuencias de polinucleótidos seleccionadas en una primera etapa de selección (normalmente mediante selección de afinidad para enlazar con un receptor (p. ej., un ligante)) son agrupadas según cualquiera de estos métodos y el(los) grupo(s) es/son transpuesto(s) mediante recombinación in vivo y/o in vitro para producir un grupo transpuesto que incluye una población de secuencias recombinadas de polinucleótidos seleccionadas. Las secuencias recombinadas de polinucleótidos seleccionadas son sometidas al menos a una etapa de selección posterior. Las secuencias de polinucleótidos seleccionadas en la(s) etapa(s) de selección posterior pueden utilizarse directamente (como un grupo o en clones individuales), secuenciadas, y/o sometidas a una o más etapas o transposición adicional y selección posterior. Las secuencias seleccionadas pueden también ser sometidas a un retrocruce con secuencias polinucleótidas que codifican secuencias neutrales (es decir, que tienen un efecto funcional insustancial sobre el enlace), como por ejemplo mediante el retrocruce con una secuencia de tipo salvaje o de origen natural sustancialmente idéntica a una secuencia seleccionada para producir péptidos funcionales de tipo natural, que pueden ser al menos inmunogénicos. Generalmente, durante el retrocruce se aplica la selección posterior para considerar la propiedad de enlace (u otra propiedad o fenotipo deseado que pueda ser seleccionado o cribado) con el receptor predeterminado (ligante). Se ejemplifican otras propiedades por la capacidad para bloquear una interacción de enlace predeterminada (por ej., actuar como un antagonista completo o especie de enlace competitiva) o para exponer una función catalítica, o similar, entre otros.
Anterior o simultáneamente a la transposición de secuencias seleccionadas, las secuencias pueden ser mutagenizadas. En una forma de realización, los miembros de la biblioteca seleccionada son donados en un vector procariótico (por ej., plásmido, fagómido, o bacteriófago) donde se produce una extracción de colonias individuales (o placas) que representan miembros de la biblioteca diferenciados. Los miembros de la biblioteca seleccionada individuales pueden entonces ser manipulados (por ej., mediante mutagénesis dirigida, mutagénesis de "cassette", mutagénesis química, mutagénesis RCP, y similares) para generar una colección de miembros de la biblioteca que representan un núcleo de diversidad de secuencia basado en la secuencia del miembro de la biblioteca seleccionada. La secuencia de un miembro o grupo de la biblioteca seleccionada individual puede ser manipulado para incorporar una mutación aleatoria, mutación pseudoaleatoria, mutación de núcleo definido (es decir, que incluye las posiciones de residuo variantes y/o invariantes que pueden incluir un residuo seleccionado de un subconjunto definido de residuos aminoácidos), mutación a base de codón, y similares, de forma segmental o sobre la totalidad de la longitud del miembro de secuencia de la biblioteca seleccionada individual. Los miembros mutagenizados de la biblioteca seleccionada son entonces transpuestos mediante transposición combinatoria in vivo y/o in vitro tal y como se describe aquí.
La invención también provee bibliotecas de péptidos que incluyen una pluralidad de miembros de biblioteca individuales según la invención, donde (1) cada miembro de la biblioteca individual de dicha pluralidad comprende una secuencia producida mediante transposición de un grupo de secuencias seleccionadas, y (2) cada miembro de biblioteca individual comprende una secuencia del segmento péptido variable o secuencia del segmento del anticuerpo monocatenario diferente de las secuencias del segmento péptido variable o secuencias del anticuerpo monocatenario de otros miembros de la biblioteca individuales de dicha pluralidad (aunque algunos miembros de la biblioteca pueden estar presentes en más de una copia por biblioteca debido a la amplificación desigual, probabilidad estocástica, o similar).
La invención también provee un producto mediante proceso, en el que las secuencias de polinucleótidos seleccionadas que tienen (o que codifican un péptido que tiene) una especificidad de enlace predeterminada son formadas mediante el proceso de: (1) selección de un péptido expuesto o biblioteca de anticuerpo monocatenario expuesta contra un receptor predeterminado (por ej., ligante) o epítopo (por ej., macromolécula de antígeno) e identificación y/o enriquecimiento de los miembros de la biblioteca que enlazan con el receptor predeterminado o epítopo para producir un grupo de miembros de la biblioteca seleccionada, (2) transposición mediante recombinación de los miembros de la biblioteca seleccionada (o sus copias amplificadas o donadas) que enlazan el epítopo predeterminado y han sido aislados y/o enriquecidos de ese modo a partir de la biblioteca para generar una biblioteca transpuesta, y (3) selección de la biblioteca transpuesta contra el receptor predeterminado (por ej., ligante) o epítopo (por ej., macromolécula del antígeno) e identificación y/o enriquecimiento de los miembros de biblioteca transpuestos que enlazan al receptor predeterminado o epítopo para producir un grupo de miembros de la biblioteca transpuesta seleccionada.
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Exposición de anticuerpo y métodos de selección
El presente método puede utilizarse para transponer secuencias de polinucleótidos seleccionadas mediante métodos de exposición de anticuerpo, donde un polinucleótido asociado codifica un anticuerpo expuesto seleccionado por un fenotipo (por ej., para la afinidad para el enlace de un antígeno predeterminado (ligante)).
Los diferentes procedimientos genéticos moleculares han sido concebidos para abarcar el amplio repertorio inmunológico representado por el número extremadamente grande de regiones variables diferentes que pueden estar presentes en las cadenas de la inmunoglobulina. El locus de cadena pesada de la inmunoglobulina de línea germinal de origen natural se compone de conjuntos en serie separados de genes de segmento variable (V) localizados corriente arriba de un conjunto en serie de los genes del segmento de diversidad (D), localizados por sí mismos corriente arriba de un conjunto en serie de genes de región adyacente (J), localizados corriente arriba de los genes de región constante (C_{H}). Durante el desarrollo del linfocito B, el reordenamiento V-D-J se produce donde un gen de región variable de cadena pesada (V_{H}) se forma mediante reordenamiento para formar un segmento fusionado D-J seguido de reordenamiento con un segmento V para formar un gen V-D-J del producto unido que, si se reordena de forma productiva, codificaría una región variable funcional (V_{H}) de una cadena pesada. De forma similar, los locus de cadenas ligeras reordenan uno de varios segmentos V con uno de varios segmentos J para formar un gen que codifica la región variable (V_{L}) de una cadena ligera.
El amplio repertorio de regiones variables posible en inmunoglobulinas deriva en parte de las numerosas posibilidades combinatorias para unir los segmentos V y J (y, en el caso de lugares geométricos de cadena pesada, segmentos D) durante el reordenamiento en desarrollo de la célula B. La diversidad de secuencias adicionales en las regiones variables de cadena pesada surge a partir de reordenamientos no uniformes de segmentos D durante la unión V-D-J y la adición de regiones N. Además, la selección antigénica de clones de células B específicas selecciona los variantes de mayor afinidad que contienen mutaciones de línea no germinal en una o en las dos regiones variables de cadena ligera o pesada; fenómeno denominado "maduración de afinidad" o "afinidad pronunciada". Normalmente, estas mutaciones de "afinidad pronunciada" se reagrupan en áreas específicas de región variable, más frecuentemente en las regiones de determinación de la complementariedad (RD Cs).
Con el objetivo de superar muchas de las limitaciones en la producción e identificación de las inmunoglobulinas de alta afinidad a través del desarrollo de la célula B de antígeno estimulado (es decir, inmunización), se han desarrollado varios sistemas de expresión procariótica que se pueden manipular con el fin de producir bibliotecas combinatorias de anticuerpos que pueden ser seleccionadas para los anticuerpos de alta afinidad respecto a antígenos específicos. Los últimos avances en la expresión de anticuerpos en Escherichia coli y sistemas bacteriófagos (ver, "Métodos de presentación de péptidos alternativos", infra) han incrementado la posibilidad de que se obtenga de forma virtual cualquier especificidad mediante donación de genes de anticuerpos a partir de hibridomas caracterizados o mediante una nueva selección con el uso de bibliotecas génicas de anticuerpos (p. ej., de Ig ADNc).
Las bibliotecas combinatorias de anticuerpos han sido generadas en sistemas de expresión bacteriófagos lambda que pueden ser seleccionados como placas bacteriófagas o como colonias de lisógenos (Huse et al. (1989) Science 246:1275; Catón y Koprowski (1990) Proc. Natl. Acad. Sci (U.S.A.) 87: 6450; Mullinax et al (1990) Proc. Natl. Acad. Sci (U.S.A.) 87: 8095; Persson et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 2432). Varias formas de realización de bibliotecas de exposición de anticuerpos bacteriófagos y bibliotecas de expresión de fago lambda han sido descritas en Rang et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci (U.S.A.) 88: 4363; Clackson et al. (1991) Nature 352: 624; McCafferty et al. (1990) Nature 348: 552; Burton et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sd. (U.S.A.) 88:10134; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4133; Chang et al. (1991) J. Immunol. 147:3610; Breitling et al. (1991) Gene 104:147; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581; Barbas et al. (1992) Proc. Natl Acad. Sci. (U.S.A.) 89: 4457; Hawkins y Winter (1992) J. Immunol. 22: 867; Marks et al. (1992) Biotechnology 10: 779; Marks et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:16007; Lownian et al (1991) Biochemistry 30:10832; Lerner et al. (1992) Science 258:1313; Normalmente, se selecciona una biblioteca de exposición de anticuerpos bacteriófagos con un receptor (p. ej., polipéptido, carbohidrato, glicoproteína, ácido nucleico) que se encuentra inmovilizado (p. ej., por conexión covalente respecto a una resma de cromatografía para enriquecer el fago reactivo mediante cromatografía de afinidad) y/o marcado (p. ej., para seleccionar una placa o transportador de colonias).
Un proceso particularmente ventajoso constituye el uso de las llamadas bibliotecas variables de fragmento monocatenario (scFv) (Marks et al. (1992) Biotechnoiogy 10: 779; Winter C y Milstein C (1991) Nature 349:293; Clackson et al. (1991) op. cit.; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581; Chaudhary et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 87:1066; Chiswell et al. (1992) TIBTECH 10: 80; McCafferty et al. (1990) op. cit.; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 5879). Se han descrito varias formas de realización de bibliotecas scFv de exposición sobre proteínas de revestimiento bacteriófagas.
A principios de 1988, los análogos monocatenarios de fragmentos Fv y sus proteínas de fusión eran generados de una forma fiable mediante métodos de ingeniería de anticuerpos. La primera etapa implica generalmente la obtención de genes que codifican dominios V_{H} y V_{L}. con propiedades de enlace deseadas; estos genes V pueden aislarse a partir de una línea específica de célula hibridoma seleccionada a partir de una biblioteca combinatoria génica V, o realizada mediante síntesis de genes V. La monocadena Ev se forma conectando los genes del componente V con oligonucleótido que codifica un péptido de enlace correctamente diseñado, como (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_{3} o péptido(s)
de enlace equivalente. El enlace enlaza con el término C de la primera región V y con el término N de la segunda, ordenado como V_{H}-enlace-V_{L} o V_{L}-enlace-V_{H}. En principio, el localizador de enlace scEv puede replicar fielmente la afinidad y la especificidad de su localizador original de combinación de anticuerpos.
De esta forma, los fragmentos scFv se encuentran incluidos en los dominios VL y conectados en una monocadena polipéptida mediante un péptido de enlace flexible. A continuación, se procede a ensamblar los genes scFv, clonarlos en un fagómido y expresarlos en el extremo del fago M13 (o bacteriófago filamentoso similar) como una proteína de fusión con la proteína bacteriófaga pIII de revestimiento (gen 3). El enriquecimiento del fago que expresa un anticuerpo de interés se realiza mediante la inmnunopurificación del fago recombinante que expone una población scFv para el enlace con un epítopo predeterminado (p. ej. antígeno objetivo, receptor).
El polinucleótido enlazado de un miembro de biblioteca provee la base para la replicación del miembro de biblioteca tras un procedimiento de cribado o de selección al igual que provee la base para la determinación, mediante secuenciación nucleótida, de la identidad de la secuencia péptida presentada o secuencia de aminoácido V_{H} y V_{L}. El(los)
péptido(s) presentado(s) o anticuerpo monocatenario (p. ej., scFv) y/o sus dominios V_{H} y V_{L} o sus RDCs pueden ser donados y expresados en un sistema de expresión adecuado. A menudo, los polinucleótidos que codifican los dominios V_{H} y V_{L} aislados estarán frecuentemente ligados a polinucleótidos que codifican regiones constantes (C_{H} y C_{L}) para formar polinucleótidos que codifiquen anticuerpos completos (por ej., quiméricos o completamente humanos), fragmentos de anticuerpo, y similares. Frecuentemente, los polinucleótidos que codifican los RDCs aislados serán injertados en polinucleótidos que codifican una estructura de región variable adecuada (y de forma opcional, regiones constantes) para formar polinucleótidos que codifiquen anticuerpos completos (por ej., humano o completamente humano), fragmentos de anticuerpo, y similares. Los anticuerpos pueden ser utilizados para aislar cantidades preparatorias de antígeno mediante cromatografía de inmunoafinidad. Se utilizan otros usos de este tipo de anticuerpos para diagnosticar y/o clasificar enfermedades (por ej., la neoplasia), y para la aplicación terapéutica para tratar enfermedades, como por ejemplo: la neoplasia, enfermedades auto inmunes, SIDA, enfermedades cardiovasculares, infecciones, y similares.
Se han relatado varios métodos para aumentar la diferencia combinatoria de una biblioteca scFv con el fin de ampliar el repertorio de especies de enlace (espectro de idiotipo). El uso de la RCP ha permitido que las regiones variables sean donadas con rapidez a partir de una fuente de hibridoma específica o como una biblioteca génica a partir de células no inmunizadas, permitiendo una diferencia combinatoria de almacenamiento en el grupo de cassettes V_{H} y V_{L} que pueden ser combinados. Además, los cassettes V_{H} y V_{L} pueden ser diversificados por sí mismos, mediante mutagénesis aleatoria, psendoaleatoria y dirigida. Normalmente, los cassettes V_{H} y V_{L} son diversificados cerca de las regiones de determinación de la complementariedad (RDCs), a menudo, el tercer RDC, RDC3. Se ha mostrado que la mutagénesis de RCP enzimática inversa es un método simple y fiable para construir bibliotecas relativamente grandes de mutantes dirigidos scFv (Stemmer et al. (1993) Biotechniques 14: 256), puesto que tiene tendencia al error RCP y mutagénesis química (Deng et al. (1994) J. Biol. Chem. 259: 9533). Riechmann et al. (1993) Biochemistry 32: 8848 ha mostrado un diseño semi racional de un fragmento de anticuerpo scFv mediante el uso de aleatorización dirigida con la degeneración del oligonucleótido RCP y la exposición en serie posterior de los mutantes resultantes scFv. Barbas et al. (1992) op. cit. han intentado resolver el problema de limitación de los tamaños del repertorio resultantes del uso de secuencias de región variable distorsionada mediante la aleatorización de la secuencia en una región sintética de región RDC Fab de enlace toxoide de tétanos humano.
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La aleatorización RDC tiene el potencial para crear aproximadamente 1 x 10^{20} RDCs para la cadena pesada RDC3 sola, y un número de variantes similar en términos generales de la cadena pesada RDC1 y RDC2, y variantes de cadena ligera RDC1-3. Si se toman de forma individual o conjunta, los combinatorios de aleatorización RDC de cadenas ligeras y/o pesadas requieren la generación de un número prohibitivo de clones bacteriófagos para producir una biblioteca de clones que represente todas las combinaciones posibles, la gran mayoría de las cuales no será de enlace. La generación de este tipo de grandes números de transformantes primarios no se puede realizar con la tecnología de transformación actual y los sistemas de visualización de bacteriófagos. Por ejemplo, Barbas et al. (1992) op. cit. sólo han generado 5 x 10^{7} transformantes, que representan únicamente una mínima fracción de la diversidad potencial de una biblioteca de RDCs aleatorizados de forma íntegra.
A pesar de estas limitaciones sustanciales, la presentación bacteriófaga de scFv ya ha liberado una variedad de anticuerpos útiles y proteínas de fusión de anticuerpos. Se ha procedido a mostrar un anticuerpo biespecífico de monocadena para mediar una lisis de célula tumoral eficaz (Gruber et al. (1994) J. Immunol. 152: 5368). Se ha mostrado la expresión intracelular de un scFv de anti-Rev para inhibir la replicación in vitro del virus HIV-1 (Duan et al. (1994) Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 91: 5075), y la expresión intracelular de un scFv anti-p21^{ras} para inhibir la maduración melótica de Xenopus oocytes (Biocca et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 197: 422. Igualmente, se ha relatado la posibilidad de utilizar el recombinante scFv para diagnosticar la infección del VIII, que demuestra la utilidad diagnóstica de scFv (Lilley et al, (1994) J. Immnunol. Meth. 171: 211). De la misma forma se han expuesto las proteínas de fusión en las que un scFv es unido con un segundo polipéptido, como una toxina o proteína activadora fibrinolítica (Holvost et al. (1992) Eur. J. Biochem. 210: 945; Nicholls et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 5302).
En el caso de que fuera posible generar bibliotecas scFv con una diversidad de anticuerpos más amplia y superando muchas de las limitaciones de mutagénesis RE C convencional y métodos de aleatorización que pueden cubrir sólo una ínfima fracción de combinaciones de secuencia potencial, el número y la calidad de los anticuerpos scFv adecuados para el uso diagnóstico y terapéutico podrían ser enormemente perfeccionados. Para llevar a cabo este proceso, los métodos de transposición in vivo e in vitro según la invención son utilizados para recombinar RDCs obtenidos (normalmente mediante amplificación por RCP o donación) de ácidos nucleicos producidos a partir de anticuerpos expuestos seleccionados. Este tipo de anticuerpos expuestos pueden exponerse sobre células, sobre partículas bacteriófagas, sobre polisomas, o cualquier sistema de presentación de anticuerpos adecuado en el que el anticuerpo es asociado con su(s) ácido(s) nucleico(s) de codificación. En una variación, los RDCs son obtenidos inicialmente a partir del ANRm (o ADNc) de células productoras de anticuerpos (por ej., esplenocitos/células de plasma de un ratón, humano o ratón transgénico de tipo salvaje inmunizado, capaz de crear un anticuerpo humano como en las WO92/03918, WO93/12227, y WO94/25585), incluyendo hibridomas derivados de estos.
Las secuencias de polinucleótidos seleccionadas en una primera etapa de selección (normalmente, mediante selección por afinidad para el enlace del anticuerpo presentado respecto a un antígeno (por ej., un ligante)) según cualquiera de estos métodos son agrupadas y el(los) grupos(s) es/son transpuesto(s) por recombinación in vitro y/o in vivo, especialmente transposición de RDCs (normalmente cadena pesada de transposición RDCs con otra cadena pesada RDCs y cadena ligera RDCs con otra cadena ligera RDCs) para producir un grupo transpuesto que incluye una población de secuencias de polinucleótidos seleccionadas recombinadas. Las secuencias de polinucleótidos seleccionadas recombinadas son expresadas en un formato de selección como un anticuerpo expuesto y sometido a al menos una etapa de selección posterior. Las secuencias polinucleótidas seleccionadas en la(s) etapa(s) de selección posterior(es) pueden ser empleadas directamente, secuenciadas y/o sometidas a una o más etapas adicionales de transposición y selección posterior hasta la obtención de un anticuerpo de afinidad de enlace deseado. Las secuencias seleccionadas pueden ser sometidas igualmente a retrocruce con secuencias de referencia de anticuerpos neutras que codifique secuencias de polinucleótidos (es decir, que tengan un efecto funcional insustancial sobre el enlace del antígeno), como por ejemplo retrocruzando con un sistema de referencia de región variable humano para producir anticuerpos de la secuencia similares a los humanos. Generalmente, durante el retrocruce posterior se aplica la selección para retener la propiedad de enlace con el antígeno predeterminado.
De forma alternativa, o en combinación con las variaciones mencionadas, la valencia del epítopo objetivo puede variarse para controlar el promedio de afinidad de enlace de los miembros de la biblioteca scFv seleccionada. El epítopo puede enlazarse con una superficie o sustrato de densidades variables, como mediante la inclusión de un epítopo competidor, por dilución, o por otro método conocido por los expertos en la materia. Una alta densidad (valencia) de epítopo predeterminado puede utilizarse para enriquecer miembros de biblioteca scFv con una afinidad relativamente baja, mientras que una densidad baja (valencia) puede enriquecer preferentemente una afinidad más alta de los miembros de biblioteca scFv.
Para generar segmentos variables diferentes, se puede insertar una colección de oligonucleótidos sintéticos que codifican un conjunto de secuencias internas de secuencias de péptidos aleatorias, pseudoaleatorias, o definidas ligándola a un localizador predeterminado (por ej., un RDC). De forma similar, la diversidad de secuencia de uno o más RDCs de cassette(s) de anticuerpos monocatenarios puede ser expandida mediante mutación del RDC(s) con mutagénesis dirigida, sustitución de RDC, y similares. Las moléculas de ADN resultantes pueden ser propagadas en un huésped para la donación y amplificación antes de la transposición, o pueden ser usadas directamente (es decir, evitando la pérdida de diversidad que se puede producir mediante la propagación en una célula huésped) y los miembros de la biblioteca seleccionada se transpondrían posteriormente.
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Los complejos de péptidos/polinucleótidos expuestos (miembros de la biblioteca) que codifican una secuencia de péptidos de segmento variable de interés o un anticuerpo monocatenario de interés son seleccionados de la biblioteca mediante una técnica de enriquecimiento de afinidad. Esto se realiza mediante una macromolécula inmovilizada o epítopo específico para la secuencia péptida de interés, como un receptor, otra macromolécula, u otra especie de epítopo. Repitiendo el procedimiento de selección de afinidad, se provee un enriquecimiento de miembros de la biblioteca que codifican las secuencias deseadas, permitiendo entonces el aislamiento para el agrupamiento y transposición, secuenciación, y/o para la propagación posterior y el enriquecimiento de la afinidad.
Los miembros de la biblioteca que no cuentan con la especificidad deseada son eliminados mediante lavado. El grado y el rigor de lavado requerido se determinará para cada secuencia de péptido o anticuerpo monocatenario de interés y macromolécula predeterminada inmovilizada o epítopo. Puede ejercerse un cierto grado de control sobre las características de enlace de los complejos de ADN/péptido naciente recuperados para ajustar las condiciones de la incubación de enlace y el lavado posterior. La temperatura, el pH, la resistencia iónica, la concentración divalente de los cationes, el volumen y la duración de lavado seleccionará complejos de ADN/péptido naciente dentro de las gamas particulares de afinidad para la macromolécula inmovilizada. La selección basada en la reducción del nivel de disociación, que normalmente predice la alta afinidad, es a menudo la vía más práctico. Esta puede realizarse mediante incubación continua en presencia de una cantidad saturada de macromolécula predeterminada libre, o mediante el aumento del volumen, número, y duración de los lavados. En cada caso, se impide el reenlace del ADN/péptido naciente disociado o complejo ARN/péptido, y con un aumento del tiempo se recupera el ADN/péptido naciente o complejos de ARN/péptido con una afinidad cada vez más alta.
Las modificaciones adicionales del enlace y los procedimientos de lavado se pueden aplicar para encontrar péptidos con características especiales. Las afinidades de algunos péptidos dependen de la resistencia iónica o concentración del catión. Esta es una característica útil para los péptidos que serán utilizados en la purificación de la afinidad de varias proteínas cuando se requieran condiciones favorables para la eliminación de la proteína de los péptidos.
Una variación implica el uso de objetivos de enlace múltiples (especies de epítopo múltiples, especies receptoras múltiples), de manera que pueda seleccionarse una biblioteca scFv simultáneamente para una multitud de scFv con diferentes especificidades de enlace. Suponiendo que el tamaño de una biblioteca scFv limite a menudo la diversidad de las secuencias scFv potenciales, se desea normalmente el uso de bibliotecas scFv que cuenten con el mayor tamaño posible. El tiempo y las consideraciones económicas de generación de varias bibliotecas de exposición scEv de polisoma de gran tamaño pueden ser prohibitivos. Para evitar este problema sustancial, se puede utilizar una especie predeterminada de epítopo múltiple (especie receptora) seleccionada de forma simultánea en una única biblioteca, o selección secuencial contra varias especies de epítopo. En una variación, múltiples especies de epítopos objetivo, cada una codificada en un nódulo separado (o subconjunto de nódulos), pueden ser mezcladas o incubadas con una biblioteca scFv de exposición de polisomas en condiciones de enlace favorables. La colección de nódulos, que incluyen una especie múltiple de epítopo, puede entonces usarse para aislar miembros de la biblioteca scFv mediante selección de afinidad. Generalmente, las etapas posteriores de selección de afinidad pueden incluir la misma mezcla de nódulos, de sus subconjuntos, o de nódulos que contengan sólo una o dos especies individuales de epítopo. Este procedimiento provee una selección eficaz y compatible con la automatización del laboratorio, procesamiento por lotes, y altos métodos de selección de procesamiento.
Se puede hacer uso de una variedad de técnicas en la presente invención para diversificar una biblioteca péptida, biblioteca de anticuerpo monocatenario, o para diversificar, anterior o simultáneamente a la transposición, péptidos de segmento variable o V_{H}, V_{L}, o RDCs que se encuentran en etapas precoces de inmunopurificación para obtener una actividad de enlace suficiente para la macromolécula o epítopo predeterminado. En un procedimiento, los complejos péptidos/polinucleótidos positivos seleccionados (aquellos identificados en una etapa anterior de enriquecimiento de afinidad) son secuenciados para determinar la identidad de los péptidos activos. A continuación, se procede a sintetizar los oligonucleótidos basados en estas secuencias péptidas activas, empleando un bajo nivel de todas las bases incorporadas en cada etapa para introducir unas ligeras variaciones de las secuencias oligonucleótidas primarias. Posteriormente, esta mezcla de oligonucleótidos (ligeramente) degenerados es donada para formar secuencias variables de segmento en las ubicaciones apropiadas. Este método produce variaciones sistemáticas controladas de secuencias péptidas de inicio que pueden ser transpuestas. Sin embargo, esto requiere que los complejos péptidos/polinucleótidos nacientes positivos individuales sean secuenciados anteriormente a la mutagénesis, por lo que sería de utilidad expandir la diversidad de pequeños números de complejos recuperados y variantes de selección que cuentan con una afinidad de enlace superior y/o una especificidad de enlace superior. En una variación, la amplificación mutagénica RCP de complejos péptidos/polinucleótidos seleccionados positivos (especialmente de las secuencias de región variable), los productos de amplificación transpuestos in vitro y/o in vivo y una o más etapas adicionales de selección se realizan previamente a la secuenciación. Se puede emplear el mismo procedimiento general con anticuerpos monocatenarios con el objetivo de expandir la diversidad e intensificar la afinidad/especificidad de enlace, normalmente mediante diversificación RDCs o regiones tipo adyacentes anterior o simultáneamente a la transposición. Si se desea, las reacciones de transposición pueden ser estudiadas en solución con oligonucleótidos mutagénicos capaces de recombinar in vitro con los miembros de la biblioteca seleccionada. De esta forma, las mezclas de oligonucleótidos sintéticos y fragmentos RCP (sintetizadas por tendencia al error o métodos de alta fidelidad) pueden añadirse a la mezcla de transposición in vitro e incorporarse a miembros de biblioteca transpuestos resultantes (transponedores).
La presente invención de transposición permite la generación de una amplia biblioteca de anticuerpos monocatenarios de variante RDC. Una forma de generar este tipo de anticuerpos es insertando RDCs sintéticos en el anticuerpo monocatenario y/o aleatorización RDC anterior o simultáneamente a la transposición. Las secuencias de cassettes RDC sintéticos se seleccionan haciendo referencia a datos de secuencia de RDC humano conocidos y se seleccionan según el criterio del experto siguiendo las pautas siguientes: El RDCs sintético contará al menos con un 40 por ciento de identidad de secuencia posicional respecto a las secuencias RDC conocidas, y preferentemente tendrá al menos entre un 50 y un 70 por ciento de identidad de secuencia posicional respecto a las secuencias RDC conocidas. Por ejemplo, una colección de secuencias de RDC sintéticos puede ser generada sintetizando una colección de secuencias oligonucleótidas en la base de secuencias humanas RDC de origen natural incluidas en Rabat et al. (1991) op. cit.;
el(los) grupos(s) de secuencias sintéticas RDC son calculado(s) para codificar secuencias péptidas RDCs con al menos un 40 por ciento de identidad de secuencia a al menos una secuencia humana RDC de origen natural. De forma alternativa, una colección de secuencias RDC producidas de forma natural puede compararse para generar secuencias de consenso de manera que los aminoácidos usados en una posición del residuo se incorporen frecuentemente (es decir, en al menos un 5 por ciento de las secuencias RDC conocidas) en el RDCs sintético en la(s) posición(es) correspondiente(s). Normalmente, se comparan diferentes secuencias de RDC conocidas (por ej., de 3 a alrededor de 50) y se procede a tabular las variaciones de secuencia naturales, a continuación, se sintetiza una colección de oligonucleótidos que codifican las secuencias péptidas que circundan la totalidad o la mayoría de las permutaciones de las variaciones de secuencia naturales observadas. Un ejemplo que no constituye una limitación se lleva a cabo en el caso de que una extracción de secuencias humanas V_{H} RDC incluya aminoácidos carboxiterminales que sean Tir, Val, Fe, o Asp,
el(los) grupos(s) de secuencias oligonucleótidas sintéticas RDC están diseñadas para permitir que el residuo carboxi-terminal RDC sea cualquiera de dichos aminoácidos. En algunas formas de realización, se procede a incorporar los residuos de origen no natural en una posición de residuo en la colección de secuencias RDC: las sustituciones de conservación de aminoácidos se incorporan frecuentemente, y se pueden variar hasta 5 posiciones de residuo para incorporar sustituciones no conservadoras de aminoácidos en comparación con secuencias RDC conocidas de origen natural. Este tipo de secuencias de R.DC pueden emplearse en miembros de biblioteca primarios (previamente a la primera etapa de selección) y/o puede utilizarse para estudiar en una solución reacciones de transposición in vitro de secuencias seleccionadas de miembro de biblioteca. La construcción de este tipo de grupos de secuencias definidas y/o degeneradas será realizada fácilmente por los expertos en la técnica.
La colección de secuencias sintéticas RDC comprende al menos un elemento no conocido que será una secuencia RDC de origen natural. Será del criterio del experto el incluir o no incluir una porción de secuencia aleatoria o pseudo aleatoria correspondiente a la adición de región N en la cadena pesada RDC; La secuencia de la región N dispone de 1 nucleótido hasta alrededor de 4 nucleótidos que se producen en las conjunciones V-D y D-J. Una colección de secuencias sintéticas RDC de cadena pesada comprende al menos alrededor de 100 secuencias RDC únicas, normalmente al menos alrededor de 1.000 secuencias RDC únicas, preferentemente al menos alrededor de 10.000 secuencias RDC únicas, frecuentemente más de 50.000 secuencias RDC únicas; como siempre, normalmente no se incluyen en la colección un número superior a 1 x 10^{6} secuencias RDC únicas, aunque de forma ocasional, están presentes de 1 x 10^{7} a 1 x 10^{8} secuencias RDC únicas, especialmente si se permiten las sustituciones conservadoras de aminoácido en posiciones en las que el sustituyente conservador de aminoácido no se encuentra presente o es raro (es decir, inferior a un 0,1 por ciento) en dicha posición en RDCs humano de origen natural. En general, el número de secuencias RDC únicas incluidas en una biblioteca no excede el número esperado de transformantes primarios en la biblioteca en más de un factor de 10. Este tipo de anticuerpos monocatenarios generalmente enlazan con un antígeno predeterminado (por ej., el inmunógeno) con una afinidad de alrededor de al menos 1 x 10^{7} M^{-1}, preferentemente con una afinidad de alrededor de al menos 5 x 10 M^{-1}, más preferentemente con una afinidad de al menos 1 x 10^{8} M^{-1} a 1 x 10^{9} M^{-1} o más, a veces hasta 1 x 10^{10} M^{-1} o más frecuentemente, el antígeno predeterminado es una proteína humana, como por ejemplo un antígeno de superficie celular humana (por ej, CD4, CDS, receptor IL-2, receptor FCE (Factor de crecimiento epidérmico), receptor PDPFV), otra macromolécula biológica humana (por ej., la trombomodnlina, proteína C, antígeno de carbohidrato, antígeno de sialilo Lewis, L-selectina), o macromolécula asociada a una enfermedad no humana (por ej., LPS bacteriano, proteína cápsida de virión o glicoproteína de revestimiento) y similares.
Los anticuerpos monocatenarios de alta afinidad de la especificidad deseada pueden crearse mediante ingeniería genética y expresarse en una variedad de sistemas. Por ejemplo, el scFv se ha producido en plantas (Firek et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23: 861) y se puede producir fácilmente en sistemas procarióticos (Owens RJ y Joven RJ (1994) J. Immunol. Meth. 168:149; Johnson Sand Bird RE (1991) Methods Enzymol. 203: 88). Además, los anticuerpos monocatenarios pueden ser usados como una base para construir anticuerpos enteros o fragmentos diferentes de estos (Kettleborough et al. (1994) Eur. J. Immunol 24: 952). La secuencia de codificación de región variable puede ser aislada (por ej., mediante amplificación RCP o subclonación) y conectada a una secuencia que codifica una región constate deseada humana para codificar un anticuerpo humano de secuencia más adecuada para los usos terapéuticos humanos en los que la inmunogenicidad es preferentemente minimizada. El(los) polinucleótido(s) que tiene(n) la(s) secuencia(s) resultante(s) de codificación completamente humanas puede expresarse en una célula huésped (por ej., a partir de un vector de expresión en una célula mamífera) y purificarse para la formulación farmacéutica.
Las construcciones de expresión de ADN incluyen normalmente, una secuencia de ADN de control de expresión, conectada de forma operable a las secuencias de codificación, incluyendo las regiones del promotor asociadas de forma natural o heteróloga. Preferentemente, las secuencias de control de expresión serán sistemas promotores eucarióticos en vectores capaces de transformar o de transfectar células huésped eucarióticas. Una vez que el vector ha sido incorporado en el huésped apropiado, el huésped es mantenido en condiciones adecuadas para mantener un alto nivel de expresión de las secuencias nucleótidas, y para la extracción y la purificación de los anticuerpos mutantes "creados por ingeniería genética".
Tal y como se ha expuesto con anterioridad, las secuencias de ADN se expresarán en huéspedes después de que las secuencias hayan sido conectadas de forma operable a una secuencia de control de expresión (es decir, situada para asegurar la transcripción y la traducción del gen estructural). Estos vectores de expresión son normalmente replicables en los organismos huésped como episomas o como una parte íntegra del ADN cromosómico huésped. Comunmente, los vectores de expresión incluirán marcadores de selección, por ej., tetraciclina o neomicina, para permitir la detección de estas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas (ver, por ej., la patente norteamericana 4.704.362, que se incorpora aquí como referencia).
Además de los microorganismos eucarióticos como la levadura, también puede utilizarse el cultivo de células de tejido mamífero para producir polipéptidos según la presente invención (ver, Winnacker, "From Genes to Clones", VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987), que se incorpora aquí como referencia). En realidad, se prefieren las células eucarióticas, porque se han desarrollado en la técnica varias células huésped adecuadas capaces de segregar inmunoglobulinas intactas, a la vez que incluyen líneas celulares CHO, diferentes líneas celulares COS, células HeLa, líneas celulares, mielomas, etc., pero preferiblemente células-3 o hibridomas. Los vectores de expresión de estas células pueden incluir secuencias de control de expresión, como origen de la replicación, un promotor, un intensificador (Queen et al. (1986) Immunol. Rev. 89: 49), y localizadores de información de procesamiento necesarios, como sitios de enlace del ribosoma, sitios de unión del ARN, sitios de poliadenilación, y secuencias de terminador transcripcionales. Las secuencias de control de expresión preferidas son promotores derivados de genes de inmunoglobulina, citomegalovirus, 5V40, Adenovirus, virus del Papilloma bovino, y similares.
La transcripción eucariótica de ADN puede aumentarse insertando una secuencia intensificadora en el vector. Los intensificadores son secuencias de actuación en cis de entre 10 a 300 bp que aumentan la transcripción mediante un promotor. Los intensificadores pueden aumentar de una forma eficaz la transcripción cuando existe la presencia de 5' o 3' en la unidad de la transcripción. Son igualmente eficaces si están situados en el interior de un intrón o de la secuencia de codificación misma. Normalmente, se utilizan los intensificadores virales, que incluyen intensificadores SV40, intensificadores de citomegalovirus, intensificadores de poliomas, e intensificadores de adenovirus. Las secuencias intensificadoras de sistemas mamíferos también son utilizadas comúnmente, como el intensificador de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón.
Los sistemas de vectores de expresión mamíferos también incluyen normalmente un gen marcador seleccionable. Los ejemplos de marcadores adecuados incluyen el gen de la reductasa de dihidrofolato (DE FR), el gen de quinasa de timidina (TN), o los genes procarióticos que confieren resistencia a los fármacos. Los primeros dos genes marcadores prefieren el uso de líneas celulares mutantes que impiden la capacidad para crecer sin la adición de timidina al medio del crecimiento. Las células transformadas pueden entonces ser identificadas por su capacidad para hacerse más fuertes en medios no suplementarios. Los ejemplos de genes procarióticos de resistencia a los fármacos útiles como marcadores incluyen genes que confieren resistencia a 0418, ácido micofenólico e higromicín.
Los vectores que contienen los segmentos de ADN de interés pueden ser transferidos a la célula huésped mediante métodos conocidos, dependiendo del tipo de huésped celular. Por ejemplo, la transfección de cloruro cálcico se utiliza comúnmente para células procarióticas, mientras que el tratamiento de fosfato de calcio, lipofección, o electroporación puede utilizarse para otros huéspedes celulares. Otros métodos usados para transformar células mamíferas incluyen el uso de polibreno, protoplasto, fusión, liposomas, electroporación y microinyección (ver, generalmente. Sambrook et al., supra).
Una vez expresados los anticuerpos, cadenas de inmunoglobulina mutadas individuales, fragmentos de anticuerpos mutados, y otros polipéptidos de inmunoglobulina de la invención pueden purificarse según los procedimientos estándares de la técnica, que incluyen la precipitación de sulfato de amonio, cromatografía en columna de fracción, electroforesis en gel y similares (ver, generalmente. Scopes, R., Protein Purification. Springer-Verlag, N.Y. (1982)). Una vez purificado, de forma parcial o hasta alcanzar la homogeneidad deseada, los polipéptidos pueden entonces ser utilizados terapéuticamente o en el desarrollo y la realización de procedimientos de ensayo, coloraciones inmunofluorescentes, y similares (ver, generalmente, Immunological Methods, Vols. I y II, Eds. Lefkovits y Pernis, Academic Press, New York, N.Y. (1979 y 1981)).
Los anticuerpos generados según el método de la presente invención pueden ser utilizados para el diagnóstico y la terapia. De una forma ilustrativa no limitativa, se puede emplear para tratar el cáncer, las enfermedades autoinmunes, o las infecciones virales. Para el tratamiento contra el cáncer, normalmente los anticuerpos enlazan con un antígeno expresado preferentemente sobre células cancerígenas, como erbB-2, ACE (antígeno carcinoembrionario), CD33, y muchos otros antígenos y miembros de enlace bien conocidos por los expertos en la materia.
Ensayos de selección de dos híbridos de levadura
La transposición puede también utilizar de forma recombinatoria un grupo de miembros de biblioteca seleccionados, obtenido mediante selección de un sistema de cribado de dos híbridos para identificar miembros de biblioteca que enlacen una secuencia polipéptida predeterminada. Los miembros de la biblioteca seleccionados son agrupados y transpuestos por recombinación in vitro y/o in vivo. El grupo transpuesto puede entonces ser seleccionado en una sistema híbrido de dos levaduras para filtrar los miembros de la biblioteca que enlacen dicha secuencia polipéptida predeterminada (por ej., un dominio SH2) sobre el que enlaza una secuencia polipéptida predeterminada alterna (por ej., un dominio SH2 de otra especie proteínica).
Un procedimiento de identificación de secuencias polipéptidas que enlazan con una secuencia polipéptida predeterminada usa el denominado sistema de "dos híbridos" donde la secuencia polipéptida predeterminada está presente en una proteína de fusión (Chien et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 88: 9578). Este procedimiento identifica las interacciones proteína-proteína in vivo mediante reconstitución de un activador transcripcional (Fields S y Song O (1989) Nature 340: 245), proteína de transcripción de levadura Ca14. Normalmente, el método se basa en las propiedades de la proteína de levadura Ca14, que consiste en dominios separables responsables del enlace de ADN y de la activación transcripcional. Uno de los polinucleótidos que codifican das proteínas híbridas consiste en el dominio de enlace de ADN de levadura Ca14 fusionado en una secuencia polipéptida de una proteína conocida y el otro, en el dominio de activación Ca14 fusionado en una secuencia polipéptida de una segunda proteína, ambos construidos e introducidos en una célula huésped de levadura. El enlace intermolecular entre las dos proteínas de fusión reconstruye el dominio de enlace de ADN del dominio de activación Ca14 con el dominio de activación Ga14, que conduce a la activación transcripcional de un gen indicador (por ej., lacZ, HIS3) que se conecta de forma operable a un localizador de enlace de dominio de activación 0 a14. Normalmente, el método de dos híbridos se usa para identificar secuencias polipéptidas nuevas que interactúan con una proteína conocida (Silver SC y Hunt SW (1993) Mat. Biol. Rep. 17:155; Durfee et al. (1993) Genes Devel 7; 555; Yang et al. (1992) Science 257: 680; Luban et al. (1993) Cell 73:1067; Hardy et al. (1992) Genes Devel 6; 801; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14: 920; y Vojtek et al. (1993) Cell 74: 205). Sin embargo, las variaciones del método de dos híbridos han sido empleadas para identificar mutaciones de una proteína conocida que influencia su enlace con una segunda proteína conocida (Li B y Fields 5 (1993) FASEB J. 7: 957; Lab et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90:5524; Jackson et al. (1993) Mol. Cell. Biol. 13; 2899; y Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 12046). Los sistemas de dos híbridos también han sido utilizados para identificar los dominios estructurales de interacción de dos proteínas conocidas (Bardwell et al. (1993) Med. Microbiol 8 :1177; Chakraberty et al. (1992). J Biol. Chem. 267:17498; Staudinger et al.(1993) J. Biol. Chem. 268: 4608; y Mime CT y Weaver DI (1993) Genes Devel 7; 1755) o dominios responsables de oligomerización de una proteína única (Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8; 1693; Bogerd et al. (1993) J. Virol 67: 5030). Las variaciones de sistemas de dos híbridos han sido utilizadas para estudiar la actividad in vivo de una enzima proteolítica (Dasmahapatra et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:4159). De forma alternativa, se puede utilizar un sistema de selección interactivo E. coli (Germino et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci (USA). 90: 933; Guarente L (1993) Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 90: 1639) para identificar secuencias proteínicas de interacción (es decir, secuencias proteínicas que heterodimerizan o forman heteromultímeros de un orden más alto). Las secuencias seleccionadas por un sistema de dos híbridos pueden ser agregadas, transpuestas e introducidas en un sistema de dos híbridos para uno o más ciclos de selección posteriores para identificar secuencias polipéptidas que enlazan al híbrido que contiene la secuencia de enlace predeterminada. Las secuencias identificadas de este modo pueden ser comparadas para identificar secuencia(s) de consenso y núcleos de secuencia de consenso.
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Mejoras/Formatos alternativos Aditivos
En un aspecto, el método de transposición perfeccionado incluye la adición de al menos un aditivo que intensifica el nivel o la extensión de rehibridación o recombinación de polinucleótidos de secuencia relacionada. En general, los aditivos que aumentan la estabilidad híbrida de secuencias desequilibradas pueden utilizarse para intensificar la frecuencia de generación de los miembros de la biblioteca sustancialmente mutados (es decir, que tienen una densidad mutacional superior). Además de los aditivos, la modulación de resistencia iónica (por ej., concentración iónica Na^{+} y/o K^{+}) puede modular la estabilidad relativa de híbridos desequilibrados, de manera que el aumento de concentración de sal pueda incrementar la frecuencia de híbridos desequilibrados y contribuir a la formación de miembros de biblioteca con mutaciones múltiples.
En una forma de realización, el aditivo es polietilenoglicol (PEG), normalmente añadido a una reacción de transposición en una concentración final de 0,1 a 25 por cien, a menudo en una concentración final de 2,5 a 15 por cien, en una concentración final de alrededor de un 10 por cien. En una forma de realización, el aditivo es sulfato de dextrano, normalmente añadido a una reacción de transposición con una concentración final de 0,1 a 25 por cien, a menudo hasta alrededor de un 10 por cien. En una forma de realización, el aditivo es un agente que reduce la especificidad de de rehibridación de la secuencia y promueve la hibridación promiscua y/o recombinación in vitro. En una forma de realización alternativa, el aditivo es un agente que incrementa la especificidad de rehibridación de la secuencia y promueve la hibridación de alta fidelidad y/o la recombinación in vitro. Igualmente, se pueden utilizar otros polímeros de cadena larga que no interfieren con la reacción (por ej., la polivinilpirrolidona, etc.).
En un aspecto, el método de transposición perfeccionado incluye la adición de al menos un aditivo que es un detergente catiónico. Unos ejemplos de detergentes catiónicos adecuados incluyen pero no se limitan a: bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), bromuro de dodeciltrimetilamonio (DTAB), cloruro de tetrametilamonio (TMAC), y similares.
En un aspecto, el método de transposición perfeccionado incluye la adición de al menos un aditivo que es una proteína recombinogénica que cataliza o intensifica de forma no catalítica el acoplamiento homogéneo y/o intercambio de cadena in vitro. Unos ejemplos de proteínas recombinogénicas adecuadas incluyen pero no se limitan a: proteína E. coli recA, proteína T4 uvsX, proteína rd de Ustilago maydis, otras recombinasas de la familia de recA incluidas en otras especies, proteína única de enlace de cadena (SSB), ribonucleoproteina A1 y similares. A menudo, se añaden nucleasas y polimerasas de corrección de ensayos para mejorar el mantenimiento de integridad del extremo 3'. Cada uno de estos aditivos proteínicos pueden ser perfeccionados por sí mismos mediante etapas múltiples de recombinación de secuencia recurrente y selección y/o cribado. La invención incluye este tipo de aditivo perfeccionado y sus usos para la transposición de intensificación posterior.
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Proteínas recombinasas
Las recombinasas son proteínas que, cuando están incluidas con un polinucleótido objetivo exógeno, proporcionan un aumento que se puede medir en la frecuencia de recombinación y/o frecuencia de localización entre el polinucleótido objetivo y una secuencia de ADN predeterminada endógena. En la presente invención, la recombinasa se refiere a una familia de proteínas de recombinación de tipo RecA en la que todas o la mayoría cuentan esencialmente con las mismas funciones, en particular: (i) la habilidad de la proteína recombinasa de enlazar de forma adecuada y situar los polinucleótidos objetivo sobre sus objetivos homólogos y (ii) la capacidad de los complejos polinucleótidos blanco/proteínicos de recombinasa para encontrar y enlazar de una forma eficaz con secuencias endógenas complementarias. La proteína recA mejor caracterizada se obtiene a partir de E. coli, como adición a la proteína de tipo salvaje, se han identificado varias proteínas mutantes de tipo recA (por ej., recA803). Además, muchos organismos incluyen recombinasas de tipo recA con actividades de transferencia de cadena (por ej., Fugisawa et al. (1985) Nucl. Acids Res. 13: 7473; Hsieh et al., (1986) Cell 44: 885; Hsieh et al., (1989) J. Biol. Chem. 264: 5089; Fishel et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 3683; Cassuto et al., (1987) Mol. Gen. Genet. 208:10; Cauca et al., (1987) Mol. Cell Biol. 7: 3124; Moore et al., (1990) J. Biol. Chem. 19: 11108; FCeene et al., (1984) Nucl. Acids Res. 12: 3057; Kimiec, (1984) Cold Spring Harbor Symp. 48:675; Kimeic, (1986) Cell 44: 545; Kolodner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:5560; Sugino et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 3683; Halbrook et al., (1989) J. Biol. Chem. 264: 21403; Eisen et al., (1988) Proc. Natl Acad. Sci. USA 85: 7481; McCarthy et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5854; Lowenhaupt et al., (1989) J. Biol. Chem. 264:20568). Unos ejemplos de este tipo de proteínas recombinasas incluyen, por ejemplo pero no de forma limitativa: recA, recA803, uvsX, y otros mutantes recA y recombinasas de tipo recA (Roca, A.I. (1990) Cnt. Rev. Biochem. Molec. Biol. 25: 415), sep1 (Kolodner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84: 5560; Tishkoff et al. Molec. Cell. Biol. 11:2593), RuvC (Dunderdale et al. (1991) Nature 354: 506), DST2, KEMi, XRN1 (Dykstra et al. (1991) Molec. Cell. Biol. 11: 2583), STP\alpha/DST1 (Clark et al. (1991) Molec. Cell. Biol. 11:2576), HPP-1 (Moore et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA.) 88: 9067), otras recombinasas eucarióticas (Bishop et al. (1992) Cell 69:439; Shinohara et al. (1992) Cell 69: 457) RecA pueden ser purificadas a partir de cepas E. coli, como las cepas E. coli JC12772 y JC15369 (disponibles en A.J. Clark y M. Madiraju, Universidad de California-Berkeley). Estas cepas contienen las secuencias de codificación recA sobre un vector plásmido "antorreplicable" presente con un alto número de copias por célula. La proteína recA803 es un mutante de alta actividad de tipo salvaje recA. La técnica nuestra diferentes ejemplos de proteínas recombinasas, por ejemplo, células de levadura de Drosofila, vegetales, humanas, y mamíferas no humanas, incluyendo proteínas con propiedades biológicas similares al recA (es decir, recombinasas de tipo recA).
La proteína recA se obtiene normalmente de cepas bacterianas que sobreproducen la proteína: recA E. coli de tipo salvaje y la recA803 mutante que pueden purificarse a partir de este tipo de cepas. De forma alternativa, la proteína recA puede también comprarse, por ejemplo en, Pharmacia (Piscataway, NJ).
La proteína recA forma un filamento nucleoproteínico cuando reviste un ADN monocatenario. En este filamento nucleoproteínico, un monómero de proteína recA se enlaza con aproximadamente 3 nucleótidos. Esta propiedad de recA de revestimiento del ADN monocatenario constituye esencialmente la secuencia independiente, aunque las secuencias particulares favorecen la carga inicial de recA sobre un polinucleótido (por ej., secuencias de nucleación). El(los) filamento(s) nucleoproteínico(s) pueden formarse sobre esencialmente cualquier polipéptido de secuencia relacionada que se deba transponer y que pueda estar formado en células (por ej., células bacterianas, de levadura, o mamíferas), formando complejos con ADN monocatenario y bicatenario.
La recombinación específica de sitio puede utilizarse para realizar la recombinación de secuencia recurrente. Normalmente, las secuencias que se deben transponer están flanqueadas por una o más secuencias de recombinación específica de sitio, como por ejemplo un sitio objetivo de recombinación FLP (FRT) que consiste a menudo en las dos repeticiones de base 13 invertidas y en un separador de 8 bp (O'Gorman et al. (1991) Science 251:1351; Parsons et al. (1990) J. Biol. Cheat. 26,5:4527; Amin et al. (1991) Mol. Cell. Biol. 11: 4497). Cuando se emplean secuencias FRI también se emplea normalmente la recombinasa FLP, in vitro o expresada en una célula huésped allí donde las secuencias que se deben recombinar son introducidas o ya están presentes. Las alternativas al sistema FLP/FRT incluyen, pero no se limitan a, el sistema cre/lox del fago P1 (Hoess y Abremski (1985) J. Mol. Biol. 181: 351), la resolvasa \gamma/\delta (Steitz et al. (1990) Ouarterly Rev. Biophys. 23: 205). El sistema attB/attP de \lambda (Nunes-Duby et al. (1987) Cell 50: 779), y sistemas de recombinación específica de sitio similares a partir de bacteriófagos \lambda, \phi80, P22, P2, P4, P1, y otros sistemas de recombinación específica de sitio de este tipo seleccionados por el experto en la materia. La guía en relación con la familia de integrasa de recombinasas se encuentra en Argos et al. (1986) EMBO J. 5: 433, incorporada aquí como referencia.
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Exonucleasa
En un aspecto, el método de transposición perfeccionado incluye la adición de al menos un aditivo que es una enzima con una actividad exonucleasa activa en la eliminación de nucleótidos sin modelo introducidos en los extremos 3' de los polinucleótidos del producto durante las reacciones de amplificación de transposición catalizadas por una polimerasa sin corrección de ensayo. Unos ejemplos de una enzima adecuada con una actividad de exonucleasa incluyen pero no se limitan a la polimerasa Pfu. Unos ejemplos de exonucleasas son:
Bal31
Exonucleasa Lambda Bacteriófaga
Exonudeasa I E. coli
Exonucleasa II E. coli
Exonudeasa VII E. coli
Gen 6 de bacteriófago 17.
Al menos un ciclo de amplificación en un método según la invención puede llevarse a cabo mediante uso de una colección de fragmentos de ADN monocatenario superpuestos, que cuentan con longitudes variables correspondientes a una primera especie de polinucleótido o serie de especies de polinucleótidos le secuencia relacionada, donde cada fragmento superpuesto puede hibridar y cebar cada extensión de cadena polinucleótida de una segunda especie polinucleótida que sirve como un modelo, formando de esto nodo, polinucleótidos de secuencia recombinada, donde dichos polinucleótidos de secuencia recombinada comprenden una porción de al menos una primera especie de polinucleótidos con una porción adyacente le la segunda especie polinucleótida que sirve de modelo. En una variación, la segunda especie polinucleótida que sirve de modelo contiene uracilo (es decir, un modelo de tipo Kunkel) y sustancialmente no e puede replicar en células. Este aspecto según la invención puede también comprender al menos dos áclos recurrentes de esta variación. En una forma de realización, los ciclos recurrentes de transposición usan el método de Levitchkin et al. (1995) Mol. Biol. 29: 572, que produce fragmentos RCP de extensión parcial utilizados para generar quimeras de un grupo de secuencias parentales que se transponen de forma recursiva.
Tal y como se ha indicado anteriormente, un método de transposición puede comprender la modificación de al menos un ciclo de amplificación llevado a cabo con un aditivo o polimerasa en condiciones adecuadas que promuevan la conmutación modelo. En una forma de realización en la que la Taq polimerasa es empleada para la amplificación, la adición de recA u otras polimerasas se intensifica la conmutación modelo. La conmutación modelo puede también incrementarse mediante el aumento de la concentración modelo de ADN, entre otros medios conocidos por los expertos en la materia.
En una forma de realización de transposición de secuencia, las bibliotecas de polinucleótidos de secuencia recombinada son generadas a partir de polinucleótidos de secuencia relacionada que son genes le origen natural o alelos de un gen. En este aspecto, al menos tres genes de origen natural y/o alelos fue comprenden regiones de al menos 50 nucleótidos consecutivos que tienen al menos un 70 por cien de dentidad de secuencia, preferiblemente al menos un 90 por cien de identidad de secuencia, son selecciónalos de un grupo de secuencias génicas, mediante selección híbrida o análisis de secuencias informatizadas empleando datos de secuencia a partir de una base de datos. Las secuencias seleccionadas son obtenidas como polinucleótidos bien por donación o mediante síntesis de ADN, y transpuestas por cualquiera de as diferentes formas de realización según la invención.
En una forma de realización según la invención, el método comprende la etapa posterior de eliminación le productos no transpuestos (por ej., secuencias parentales) de polinucleótidos de secuencia recombinada producidos mediante cualquiera de los métodos de transposición descritos. Los productos no transpuestos pueden ser eliminados o evitados realizando la amplificación con: (1) un primer cebador RCP que híbrida una primera especie de polinucleótido parental pero no hibrida sustancialmente una segunda especie de polinucleótido parental, y (2) un segundo cebador RCP que hibrida una segunda especie de polinucleótido parental pero no hibrida de forma sustancial a la primera especie polinucleótida parental, este tipo de amplificación se produce sobre unos modelos que incluyen la porción de la primera secuencia parental fue hibrida al primer cebador RCP y también que incluye la porción de la segunda secuencia parental fue hibrida al segundo cebador RCP, de modo que sólo se amplifican los polinucleótidos de secuencia recombinada.
En una forma de realización según la invención, se pueden sintetizar genes "de enlace". En el caso de que dos o más polinucleótidos parentales (por ej., genes) carezcan de una similaridad de secuencia satisfactoria para la recombinación homologa efectiva o para un cebado cruzado eficaz en la amplificación FICP, los genes intermedios (o "de enlace") pueden ser sintetizados compartiendo la suficiente secuencia le identidad con las secuencias parentales. El gen de enlace no necesita estar activo o conferir un fenotipo propiedad seleccionable, ya que solo necesita proporcionar un modelo con una identidad de secuencia suficiente para realizar la transposición de las secuencias parentales. La homología intermedia del gen de enlace, y la(s) secuencia(s) necesaria(s) puede(n) determinarse por ordenador o de forma manual.
Tal y como se puede apreciar a partir de la descripción anterior, la presente invención cuenta con una amplia variedad de aplicaciones. Los ejemplos siguientes se proponen como ilustración de la transposición de secuencia. El ejemplo 18 ilustra la transposición de ADN que emplea la perturbación según la presente invención.
Los otros ejemplos se proveen únicamente a modo de ilustración.
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Ejemplos experimentales
En los ejemplos que se relatan a continuación, las siguientes abreviaturas constan de los siguientes significados. En el caso de que no se defina a continuación, las abreviaturas tendrán los significados reconocidos en su técnica.
ml = mililitro
\mul = microlitros
\muM = micromolar
nM = nanomolar
PBS = suero salino tamponado con fosfato
ng = nanogramos
\mug = microgramos
IPTG = isopropiltio-3-D-galactosida
bp = pares base
kb = kilobasepares
DNTP = trifosfatos de desoxinucleosida
RCP = reacción en cadena de polimerasa
X-gal = 5-bromo-4-cloro-3-indolil-3-D-galactosida
ADNsa I = desoxirribonucleasa
PBS = Suero salino tamponado con fosfato
RDC = regiones que determinan la complementariedad
CIM = concentración inhibitoria mínima.
scFv = anticuerpos Fv de cadena simple
En general, las técnicas estándar de la tecnología del ADN recombinante aparecen descritas en diferentes publicaciones como, por ej., Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Ausubel et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, vols. 1 y 2 y suplementos, y Berger y FCimmel, Methods in enzimology, Volumen 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, CA, Las enzimas de restricción y el polinucleótido que modifican las enzimas se emplearon según las recomendaciones de los fabricantes. Los oligonucleótidos se sintetizaron en un sintetizador de ADN modelo 394 de Applied Biosystems Inc. usando de productos químicos ABI. Si se desea, se pueden seleccionar los amplímeros de RCP para amplificar una secuencia de ADN predeterminada a discreción del experto en la materia.
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Ejemplos Ejemplo 1 Reensamblaie de gen alfa LacZ 1) Preparación del substrato
El substrato para la reacción de reensamblaje fue el producto de la reacción en cadena de la polimerasa dsADN ("RCP") del LacZ de tipo salvaje.
TABLA 1
1 
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Se procedió a ordenar una totalidad de 4,437 bases de ADN de lacZ transpuesto.
El índice de mutagénesis puntual durante el reensamblaje de ADN de 10-70 bp piezas se determinó a partir de la secuenciación de ADN para ser 0,7% (N=4,473), que es similar a la RPC con tendencia al error. Sin verse limitada por ninguna teoría, se cree que el índice de mutagénesis puntual puede ser inferior si los fragmentos más grandes se utilizan para el reensamblaje, o si se añade una polimerasa de corrección de ensayo.
Cuando el ADN plásmido de 14 de estas colonias LacZ^{-} mutadas de forma puntual se combinan y se vuelven a reensamblar/transponer por el método descrito anteriormente, un 34% (N=291) de las colonias resultantes eran LacZ^{+}, y supuestamente, estas colonias emergieron mediante recombinación del ADN de diferentes colonias.
El nivel esperado de inversión de una única mutación puntual mediante tendencia al error RCP, asumiendo un índice de mutagénesis de 0,7% (10), sería <1.
De esta forma, las grandes secuencias de ADN pueden reagruparse a partir de pequeños fragmentos aleatorios mediante una reacción sorprendentemente eficaz y simple. Una aplicación de esta técnica es la recombinación o transposición de secuencias relacionadas basadas en homología.
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Ejemplo 2 Transposición de ADN plásmido entero y gen LacZ 1) Transposición del gen lacZ
El cruce entre dos marcadores separados por 75 bases se midió usando dos construcciones gónicas lacZ. Los codones de terminación se insertaron en dos regiones separadas del alfa gen LacZ para servir como marcadores negativos. Cada marcador es una secuencia no homologa de 25 bp con cuatro codones de terminación, de entre los cuales dos constituyen la estructura de lectura génica lacZ. La secuencia no homologa de 25 bp se indica en la figura 3 mediante una caja grande. Los codones de parada se encuentran encuadrados o subrayados. Una mezcla 1:1 de los dos modelos LacZ 1,0 kb que contienen las versiones +- y -+ del alfa gen LacZ (Figura. 3) se digirieron con ADNsa y 100-200 fragmentos bp fueron purificados tal y como se describe en el Ejemplo 1. El programa de transposición se llevó a cabo en condiciones similares a aquellas descritas para el reensamblaje en el Ejemplo 1 excepto 0,5 \mul añadidos de polimerasa, el volumen total me entonces de 100 \mul.
Tras la clonación, el número de colonias azules obtenidas fue de un 24%; (N=386) que se encuentra cercano al número máximo teórico de colonias azules (es decir un 25%), que indica que la recombinación entre los dos marcadores fue completa. La totalidad de las 10 colonias azules contenían el fragmento de restricción esperado HindIII-NheI.
2) Transposición de ADN de plásmido completo
También se sometieron a examen 2,7 kb de plásmidos completos (pUC18 -+ y pUC18+-). Se digirió una mezcla 1:1 de los dos plásmidos de 2,9 kb que contienen las versiones +- y -+ del alfa gen LacZ (Figura 3) con ADNsa 1 y se purificaron fragmentos 100-200 bp tal y como se describe en el ejemplo 1. El programa de transposición se llevó a cabo bajo condiciones similares a las descritas para el reensamblaje de la etapa (1) anteriormente mencionada, excepto por el hecho de que el programa fue de 60 ciclos [94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 30 segundos]. El análisis de gel mostró que, tras el programa de transposición, la mayor parte del producto era superior a 20 kb. De este modo, se reensamblaron de una forma eficaz plásmidos completos de 2,7 kb (pUC18 -+ y pUC18 +-) a partir de fragmentos aleatorios de 100-200 bp sin cebadores añadidos.
Tras la digestión con una enzima de restricción con un localizador único sobre el plásmido (EcoO109), la mayor parte del producto estaba compuesto de una única banda con el tamaño esperado. Dicha banda se purifico mediante gel, se religó y se usó el ADN para transformar la E. coli. Los transformantes se dispusieron en placas de gel de aproximadamente 0,004% X tal y como se describe en el Ejemplo 1. El 11% (N= 328) de los plásmidos resultantes fueron azules y, en consecuencia, ++ recombinantes.
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3) Transposición de ADN estudiada en la solución
Los oligonucleótidos combinados en la mezcla de transposición se pueden incorporar al producto final basado en la homología de las secuencias flanqueantes del oligonucleótido en el ADN del modelo (Figura 4). Se empleó el mutante de codón de terminación LacZ^{-} (pUC18 - -) descrito anteriormente como modelo digerido mediante ADNsa 1. Se procedió a añadir un oligonucleótido de 66-mer que incluye 18 bases de homología en el gen LacZ de tipo salvaje en ambos extremos a la reacción con un exceso molar de 4 veces para corregir las mutaciones que el codón de terminación presenta en el gen original. La reacción de transposición se llevó a cabo bajo condiciones similares a las de la etapa 2 anteriormente mencionada. El producto resultante se digirió, se ligó y se insertó en la E. coli según el método anteriormente descrito.
TABLA 2
2
El ADNss resultó ser más eficaz que el dsADN, supuestamente debido a la hibridación competitiva. El grado de incorporación puede variar a lo largo de un amplio margen para ajustar el exceso molar, la temperatura de hibridación o la longitud de la homología.
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Ejemplo 3 Reensamblaie de ADN en completa ausencia de cebadores
Se digirió el plásmido pUC18 con las enzimas de restricción EcoRI, EcoOIO9, XmnI y AlwNI, dando como resultado fragmentos de aproximadamente 370, 460, 770 y 1080 bp. Estos fragmentos fueron sometidos a electroforesis y se purificaron separadamente a partir de gel de agarosa con un bajo punto de fusión al 2% (las bandas con 370 y 460 pares base podrían no estar separadas), obteniendo un fragmento grande, un fragmento medio y una mezcla de dos fragmentos pequeños en 3 tubos diferentes.
Se digirió cada fragmento con ADNsa I tal y como se describe en el Ejemplo 1 y se purificaron fragmentos de 50-130 bp a partir de un gel de agarosa con un bajo punto de fusión al 2% para cada uno de los fragmentos originales.
La mezcla RCP (tal y como se describe en ejemplo 1 anteriormente mencionado) fue añadida a los fragmentos digeridos purificados con una concentración final de 10 ng/\mul de fragmentos. No se añadió ningún cebador. Se llevó a cabo una reacción de reensamblaje durante 75 ciclos [94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos] separadamente en cada una de las tres mezclas de fragmento de ADN digerido y se analizaron los productos mediante electroforesis en gel de agarosa.
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Los resultados mostraron claramente que las bandas 1080, 770, 370 y 460 bp reformaban de manera eficaz a partir de los fragmentos purificados, mostrando que la transposición no requiere en absoluto el uso de ninguno de los cebadores.
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Ejemplo 4 Transposición del gen 1L-1\beta
Este ejemplo ilustra que se pueden obtener superposiciones basadas en las homologías inferiores a 15 bases. Por ejemplo, se transpuso un gen IL-1B humano y derivado de la murina.
Se emplearon un gen IL-1\beta de murina (BBG49) y un gen IL1-B humano con el uso del codón de E. coli (BBG2; R&D Systems, Inc., Minneapolis MN) como modelos en la reacción de transposición. Las regiones de homología completa entre las secuencias IL-1\beta humanas y derivadas de la murina miden como media tan sólo 4,1 bases (Figura 5, las regiones de heterología se introducen en recuadros).
La preparación de los productos RCP de dsADN para cada uno de los genes, la extracción de cebadores, la digestión con ADNsa I y la purificación de 10-50 fragmentos de bp fue similar a la anteriormente descrita en Ejemplo 1. Las secuencias de los cebadores usadas en la reacción RCP fueron 5'TTAGGCACCCCAGGCTTT3' (SEC ID Nº: 3) y 5'ATGTGCTGCAAGGCGATT3' (SEC ID Nº: 4).
Los primeros 15 ciclos de la reacción de transposición se llevaron a cabo con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa 1, añadiendo 1 unidad de enzima fresca en cada ciclo. Se añadió el ADN a la y RCP según el ejemplo 1, cuya mezcla carecía de polimerasa. El programa manual fue de 94ºC durante 1 minuto y, a continuación, 15 ciclos de: [95ºC durante 1 minuto, 10 segundos en hielo seco/etanol (hasta que estuvo congelado), se incubo durante aproximadamente 20 segundos a 25ºC, se le añadió IU de fragmento Klenow y se incubo a 25ºC durante 2 minutos]. En cada ciclo, tras la etapa de denaturación, se enfrió rápidamente el tubo en hielo secoletanol y se volvió a calentar a temperatura de hibridación. Asimismo, se añadió la polimerasa termolábil. Se debe añadir la enzima en cada ciclo. Mediante el uso de este procedimiento, se obtiene un alto nivel de superposiciones, basándose sólo en unas pocas bases de homología ininterrumpidas (Figura 5, las posiciones de superposición se indican mediante "-!^{-}").
Tras estos 15 ciclos manuales, se añadió la Taq polimerasa y se llevaron a cabo 22 ciclos adicionales de la reacción de transposición [94ºC durante 30 segundos, 35ºC durante 30 segundos] sin cebadores.
Los cebadores siguientes se añadieron en una concentración final de 0,8 \muM: 5'AACGCCGCATGCAAGCTTG
GATCCTTATT3' (SEC ID Nº: 5) y 5'AAAGCCCTCTAGATGATTACGAATTCATAT3' (SEC ID Nº: 6) y una reacción RCP se llevó a cabo del modo descrito anteriormente en el ejemplo 1. El segundo par de cebadores difirió del primer par sólo debido al hecho de que se creyó necesario un cambio en los lugares de restricción.
Tras la digestión del producto RCP con XbaI y SphI, se ligaron los fragmentos en un pUC18 digerido con XbaI-SphI. Las secuencias de los insertos de varias colonias se determinaron mediante un equipo de secuenciación de ADN dideoxi (United Stated Biochemical Co. Cleveland OH) según las instrucciones del fabricante.
Se halló un total de 17 superposiciones mediante secuenciación del ADN de las nueve colonias. Algunas superposiciones se basaron sólo en 1-2 bases de homología ininterrumpida.
Se descubrió que para forzar superposiciones eficaces basadas en homologías cortas se necesita una temperatura de hibridación eficaz muy baja. Con cualquier polimerasa termoestable, el tiempo de enfriamiento de la máquina de RCP (de 94ºC a 25ºC a 1-2 grados/segundo) hace que la temperatura de hibridación eficaz sea superior a la temperatura de hibridación establecida. De este modo, ninguno de los protocolos basados en la Taq polimerasa dio como resultado superposiciones, incluso en aquellos casos en los que se empleó un exceso de diez veces de uno de los genes IL1-\beta. Por el contrario una polimerasa termolábil, como el fragmento Klenow de la ADN polimerasa 1, puede utilizarse para obtener cuidadosamente una baja temperatura de hibridación.
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Ejemplo 5 Transposición de ADN del gen de betalactamasa TEM-1
La utilidad de la transposición mutagénica de ADN para conseguir una evolución molecular dirigida se sometió a examen en un sistema modelo con betalactamasa. La betalactamasa TEM-1 es una enzima muy eficaz, limitada en su índice de reacción principalmente mediante difusión. Este ejemplo determina si es posible cambiar su especificidad de reacción y obtener una resistencia ante el fármaco cefotaxima que normalmente no se hidrolíce.
La concentración inhibitoria mínima (CIM) de cefotaxima o células bacterianas que carecen de un plásmido se determinó al colocar 10 MI de una dilución 102 de un cultivo bacteriano durante toda la noche (aproximadamente 1000 efu) de células XLI-blue de E. coli (Stratagene, San Diego CA) en placas con diferentes niveles de cefotaxima (Sigma, St. Louis MO), procediendo con la incubación durante 24 horas a 37ºC.
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El crecimiento en la cefotaxima es sensible a la densidad de las células y, en consecuencia, se necesité colocar un número similar de células en cada una de las placas (obtenidas al colocarlas en placas LB sencillas). Se llevó a cabo este proceso de disposición en placas de 1000 células de una forma consistente.
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1) Construcción del plásmido inicial
Se empleó un derivado de pUC18 que transporta el gen de betalactamasa TEM-1 bacteriano (28). El gen de betalactamasa TEM-1 confiere resistencia a las bacterias contra aproximadamente 0,02 \mug/ml de cefotaxima. A los lugares de restricción Sfi1 se les añadió 5' del promotor y 3' de la extremidad del gen mediante RCP de la secuencia de vectores con dos cebadores:
Cebador A (SEC ID Nº 7):
5'TTCTATTGACGGCCTGTCAGGCCTCATATATACTTTAGATTGATTT3' y
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Cebador B (SEC ID Nº 8)
5'TTGACGCACTGGCCATGGTGGCCAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTT3'
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y mediante RCP de la secuencia de genes de betalactamasa con dos otros cebadores:
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Cebador C (SEC ID Nº: 9):
5'AACTGACCACGGCCTGACAGGCCGGTCTCTGACAGTTACCAATGCTT, y
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Cebador D (ID de S EC Nº: 10):
5'AACCTGTCCTGGCCACCATGGCCTAAATACATTCAAATATGTAT.
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Los dos productos de la reacción fueron digeridos con SfiI, se mezclaron, se ligaron y se emplearon para transformar las bacterias.
El plásmido resultante fue pUC182Sfi. Este plásmido contiene un fragmento sfiI que transporta el gen TEM-1 y el promotor P-3.
La concentración inhibitoria mínima de cefotaxima para el XL1-blue de E. coli (Stratagene, San Diego CA) que transporta este plásmido fue de 0,02 ng/ml tras 24 horas a 37ºC.
La capacidad para mejorar la resistencia del gen de betalactamasa ante la cefotaxima sin transposición se determine al relacionar de forma gradual un grupo diluido de células (aproximadamente 107 efu) en niveles de fármacos incrementados dos veces. Se pudo obtener una resistencia de hasta 1,28 jtg/nil sin transposición. Esto representó un incremento de 64 veces en cuanto a la resistencia.
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2) Digestión con ADNsa I
El sustrato para la primera reacción de transposición fue dsADN de 0,9 kb obtenido mediante RCP de pUC182Sfi con los cebadores C y D, conteniendo ambos un lugar SfiI.
Los cebadores libres derivados del producto de RCP se eliminaron mediante una preparación de RCP Wizard (Promega, Madison WI) en cada ciclo.
Se digirieron aproximadamente 5 ng del (de los) substrato(s) de ADN con 0,15 unidades de ADNsa I (Sigma, St. Louis MO) en 100 Mi de 50 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM de MgCl_{2}, durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se purificaron fragmentos de 100-300 bp derivados de geles de agarosa con un bajo punto de fusión en un 2% mediante electroforesis en papel de intercambio iónico DES 1 (Whatman, Hillsborough, OR), se eluyó con 1 M de NaCl y se precipitó con etanol a través del método descrito en el ejemplo 1.
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3) Transposición del gen
Los fragmentos purificados se volvieron a suspender en la mezcla RCP (0,2 mM por cada dNTP, 2,2 mM de MgCl_{2}, 50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl, pH 9,0, Tritón X-100 al 0,1%), a una concentración de 10-30 ng/\mul. No se añadió ningún cebador en este punto. Se empleó un programa de reensamblaje de [94ºC durante 60 segundos]; a continuación, 40 ciclos de [94ºC durante 30 segundos, 50-55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 30 segundos] y, entonces, a 72ºC durante 5 minutos en un termociclador PTC-150 de MJ Indagan (Watertown MA).
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4) Amplificación de producto del reensamblaje con cebadores
Tras haber diluido el producto de reensamblaje en la mezcla RCP con 0,8 \muM de cada cebador (C y D) y 20 ciclos de RCP [94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 30 segundos] se obtuvo un único producto de 900 bp de tamaño.
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5) Clonación y análisis
Tras la digestión del producto de 900 bp con la enzima de restricción terminal SfiI y tras la purificación con gel de agarosa, se ligó el producto de 900 bp en el vector pUC1S2Sfi en el único lugar SfiI con la ligasa T4 del ADN (BRL, Gaithersburg MD). La mezcla fue sometida a electroporación en células XLI-blue de E. coli y se dispusieron en placas LB con 0,32-0,64 [\mug/ml de cefotaxima (Sigma, St. Louis MO). Se dejó que las células crecieran durante 24 horas a 37ºC, se desecharon las colonias resultantes para que salieran de la placa a modo de grupo y se usaron como modelo de RCP para la siguiente etapa de transposición.
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6) Etapas de reensamblaje subsiguientes
Los transformantes obtenidos tras cada una de las tres etapas de transposición se colocaron en placas en niveles en aumento de cefotaxima. Las colonias (>100, para mantener la diversidad) de la placa con el nivel máximo de cefotaxima se reagruparon y se emplearon como modelo para la reacción RCP de la siguiente etapa.
Una mezcla de las colonias de cefotaxima obtenidas con 0,32-0,64 \mug/ml en la etapa (5) anteriormente mencionada fue empleada a modo de modelo en la siguiente etapa de transposición. Se emplearon 10 ul de células en caldo de cultivo LB como modelo en un programa de reensamblaje de 10 minutos a 99ºC; a continuación, 35 ciclos de [94ºC durante 30 segundos, 52ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 30 segundos] y, entonces, 5 minutos a 72ºC según el método descrito con anterioridad.
Los productos del reensamblaje se digirieron y se ligaron en pUC182Sfi según el modo descrito en la etapa (5) anteriormente mencionada. La mezcla fue sometida a electroporación en células XL1-blue de E. coli y se colocaron en placas LB que contenían entre 5 y 10 pg/ml de cefotaxima.
Las colonias obtenidas con 5-10 \mug/ml se emplearon en una tercera etapa similar a la primera y segunda etapa, salvo por el hecho de que las células se colocaron en placas LB que contenían 80-160 \mug/ml de cefotaxima. Tras la tercera etapa, se obtuvieron colonias con 80-160 \mug/ml y, tras volver a disponerlas en placas con concentraciones en aumento de cefotaxima, se pudieron obtener colonias de hasta 320 \mug/ml tras 24 horas a 37ºC (CIM=320 \mug/ml).
El crecimiento de la cefotaxima depende de la densidad de la célula y requiere que todas las concentraciones inhibitorias mínimas se estandaricen (en nuestro caso, a aproximadamente unas 1.000 células por placa). Con unas densidades de la célula más altas, se obtuvo un crecimiento de hasta 1280 \mug/ml. Las 5 colonias más grandes crecidas a 1,280 \mug/ml se dispusieron dos veces en placas para colonias únicas y los insertos SfiI fueron analizados mediante mapeo de restricción de los productos RCP de la colonia.
Se obtuvo un mutante con una resistencia a la cefotaxima incrementada 16.000 veces (CIM=0,02 \mug/ml para un CIM=320 \mug/ml).
Tras la selección, el plásmido de los clones seleccionados se transfirió de nuevo a las células XLI-blue de tipo salvaje de la E. coli (Stratagene, San Diego CA) para garantizar que la resistencia medida del fármaco no se debía en ningún caso a mutaciones cromosómicas.
Tres ciclos de transposición y selección dieron como resultado un incremento de 1,6 x 10' veces en la concentración inhibitoria mínima de la cefotaxima antibiótica con espectro ancho extendido para la betalactamasa TEM-1. Por el contrario, al volverlos a disponer en placas sin que se produjera una transposición, sólo dio como resultado un aumento de 16 veces en la resistencia (RCP propenso al error o mutagénesis de "cassette").
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7) Análisis de secuencia
La totalidad de las 5 colonias más grandes crecidas con 1,280 \mug/ml presentaban un mapa de restricción idéntico a la enzima TEM-1 de tipo salvaje. Se secuenció el inserto SfiI del plásmido obtenido a partir de una de estas colonias mediante secuenciación del ADN con dideoxi (United States Biochemicals Co., Cleveland OH) según las instrucciones del fabricante. Todos los números básicos se corresponden a la secuencia pBR322 revisada (29) y los números del aminoácido se corresponden con el esquema de numeración estándar ABL (30). Los aminoácidos son designados mediante sus códigos de tres letras y los nucleótidos mediante sus códigos de una letra. El término G4205A significa que el nucleótido 4205 cambió de guanidina a adenina.
Se encontraron nueve sustituciones de base únicas. El G4205A está localizado entre los lugares 35 y -10 del promotor P3 de la betalactamasa (31). El mutante favorecedor observado por Chen y Clowes (31) está localizado en la zona externa del fragmento SfiI usado en este caso y, de este modo, podría no ser detectado. Cuatro mutaciones fueron silenciosas (A3689G, 03713A, G3934A y T3959A) y cuatro produjeron en un cambio de aminoácido (C3445T resultante en Gly2385er, A3615C resultante en Metl82Thr, C3850T resultante en Glu104Lys y G4107A resultante en Ala18Val).
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8) Retrocruce molecular
Asimismo, se empleó el retrocruce molecular con un exceso de ADN de tipo salvaje con el objetivo de eliminar las mutaciones no esenciales.
El retrocruce molecular se llevó a cabo en un plásmido seleccionado a partir de la tercera etapa de transposición de ADN mediante un método idéntico a la transposición normal tal y como se ha descrito con anterioridad, salvo por el hecho de que la digestión con ADNsa 1 y la reacción de transposición, se llevaron a cabo en presencia de un exceso de 40 veces de un fragmento del gen TEM-1 de tipo salvaje. Para aumentar la eficacia del retrocruce, se emplearon fragmentos de ADN muy pequeños (de 30 a 100 bp) en la reacción de transposición. Se volvieron a seleccionar los mutantes retrocruzados en placas LB con 80-60 \mug/ml de cefotaxima (Sigma, St. Louis MO).
Se repitió esta transposición del retrocruce con ADN derivado de colonias de la primera etapa de retrocruce en presencia de un exceso de 40 veces de ADN TEM-1 de tipo salvaje. Se emplearon fragmentos pequeños de ADN (30-100 bp) para aumentar la eficacia del retrocruce. Se volvió a seleccionar la segunda etapa de mutantes retrocruzados en placas LB con 80-160 \mug/ml de cefotaxima.
Los transformantes resultantes se dispusieron el placas con 160 \mug/ml de cefotaxima y se volvió a disponer en las placas un grupo de colonias en niveles en aumento de cefotaxima de hasta 1,280 \mug/ml. La colonia más grande obtenida con 1,280 \mug/ml se volvió a disponer en placas en el caso de las colonias únicas.
Este mutante retrocruzado era 32.000 veces más resistente que el de tipo salvaje (CIM=640 \mug/ml).
La cepa mutante es 64 veces más resistente ante la cefotaxima que las cepas derivadas de TEM-1 creadas por ingeniería o publicadas en medios clínicos. De este modo, parece que la transposición de ADN es una herramienta rápida y potente como mínimo para diferentes ciclos de evolución molecular dirigida.
La secuencia de ADN del inserto SfiI del mutante retrocruzado se determinó usando un equipo de secuenciación de ADN con dideoxi (United States Biochemicals Co., Cleveland OH) según las instrucciones del fabricante (Tabla 3). El mutante presentó mutaciones con 9 pares base únicos. Tal y como se esperaba, se perdieron las cuatro mutaciones silenciosas previamente identificadas, volviendo a la secuencia del gen de tipo salvaje. La mutación del promotor (G4205A), así como tres de las cuatro mutaciones del aminoácido (Glu104Lys, Met182Thr y Gly238Ser) permanecieron en el clon retrocruzado, sugiriendo que éstas resultan esenciales para una resistencia a la cefotaxima de alto nivel. Sin embargo, se hallaron tanto las nuevas dos mutaciones silenciosas (T3842C y A3767C) como las tres nuevas mutaciones que tienen como resultado los cambios aminoácidos (C3441T resultante en Arg241His, C3886T resultante en Gly92Ser y G4035C resultante en Ala42Gly). Mientras que estas dos mutaciones silenciosas no influyen sobre la secuencia primaria proteínica, éstas pueden influir sobre el nivel proteínico de expresión (por ejemplo mediante una estructura de mARN) y, posiblemente, incluso un ensamblaje de proteínas (al cambiar el uso del codón y, en consecuencia, el lugar de pausa implicado en el ensamblaje de proteínas).
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TABLA 3
3 
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Tanto los mutantes retrocruzados como los no retrocruzados presentan una mutación en el promotor (que, por sí misma o en combinación, ocasiona un aumento de 2-3 veces en el nivel de expresión), así como tres cambios aminoácidos comunes (Glu104Lys, Met182Thr y Gly238Ser). Glu104Lys y Gly238Ser son mutaciones presentes en varios derivados de TEM-1 resistentes a la cefotaxima o a derivados de otro tipo (Tabla 4).
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9) Comparación del nivel de expresión
Se ha procedido a comparar el nivel de expresión del gen de betalactamasa en el plásmido de tipo salvaje, el mutante no retroemzado y el mutante retrocruzado mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (4-20; Novex, San Diego CA) de extractos periplásmicos preparados por impacto osmótico según el método de Witholt, B. (32).
La betalactamasa TEM-1 purificada (Sigma, St. Louis MO) se empleó a modo de estándar del peso molecular y la célula XL1-blue de E. coli carente de plásmido se empleó como control negativo.
Resultó que el mutante y el mutante retrocruzado produjeron un nivel de 2 a 3 veces más alto que la proteína de la betalactamasa comparada con el gen de tipo salvaje. La mutación del promotor pareció tener como resultado un aumento de 2 a 3 veces mayor en la betalactamasa.
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Ejemplo 6 Construcción de combinaciones mutantes del gen de la betalactamasa TEM-1
Con el fin de determinar la resistencia a las diferentes combinaciones de mutaciones y para comparar los nuevos mutantes con los diferentes mutantes publicados se han construido con unos antecedentes plásmidos idénticos. Dos de las mutaciones, Glu104Lys y Gly238Ser, son conocidas como mutantes de la cefotaxima. Todas las combinaciones mutantes construidas presentan la mutación del promotor para permitir la comparación con los mutantes seleccionados. Los resultados se muestran en la Tabla 4.
Las combinaciones específicas de mutaciones se introdujeron en el pUC182Sfi de tipo salvaje mediante RCP, usando dos oligonucleótidos por mutación.
Para obtener dichas mutaciones, se emplearon los siguientes oligonucleótidos:
Ala42Gly
(SEC ID Nº: 11) AGTTGGGTGGACGAGTGGGTTACATCGAACT y
(SEC ID Nº: 12) AACCCACTCGTCCACCCAACTGATCTTCAGCAT;
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Gln39Lys
(SEC ID Nº: 13) AGTAAAAGATGCTGAAGATAAGTTGGGTGCACGAGTGGGT y
(SEC ID Nº: 14) ACTTATCTTCAGCATCTTTTACTT;
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Gly92Ser
(SEC ID Nº: 15) AAGAGCAACTCAGTCGCCGCATACACTATTCT y
(SEC ID Nº: 16) ATGGCGGCGACTGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAAT;
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Glu104Lys
(SEC ID Nº: 17) TATTCTCAGAATGACTTGGTTAAGTACTCACCAGTCACAGAA y
(SEC ID Nº: 18) TTAACCAAGTCATTCTGAGAAT;
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Met182Thr
(SEC ID Nº: 19) AACGACGAGCGTGACACCACGACGCCTGTAGCAATG y
(SEC ID Nº: 20) TCGTGGTGTCACGCTCGTCGTT;
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Gly238Ser sola:
(SEC ID NO: 21) TTCCTCATAAATCTCCACCCACTGACCCTGCCTCTCGCCCTA y
(SEC ID Nº: 22) TCCCTCCACATTTATCACCAA;
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Gly238Ser y Arg241His (combinados)
(SEC ID Nº: 23) ATGCTCACTGGCTCCAGATTTATCAGCAAT y
(SEC ID Na: 24) TCTGGAGCCAGTGAGCATGGGTCTCGCGGTATCATT;
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G4205A:
(SEC ID Nº: 25) AACCTGTCCTGGCCACCATGGCCTAAATACAATCAAATATGTATCCGCTTATGAGACAA
{}\hskip0.4cm TAACCCTGATA
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Se purificaron mediante gel otros fragmentos de RCP separados a partir de los oligonucleótidos sintéticos. Se combinaron 10 ng de cada fragmento y se llevó a cabo una reacción de reensambla e a 94ºC durante 1 minuto y, a continuación, 25 ciclos: [94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 45 segundos]. Se llevó a cabo el RCP sobre el producto de reensamblaje durante 25 ciclos en presencia de los cebadores externos que contienen 5111 (cebadores C y D del ejemplo 5). El ADN fue digerido con Sfi1 se insertó en el vector pUC182S11 de tipo salvaje. Se obtuvieron las siguientes combinaciones mutantes (Tabla 4).
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TABLA 4
4 
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Se ha llegado a la conclusión de que las mutaciones conservadas son 9 de las 15 duplicaciones; de la CIM.
Se ha mostrado que la Glu104Lys sola proporcionaba como resultado sólo una duplicación de la CIM a 0,08 \mug/ml y que la Gly238Ser (en diferentes contextos con un cambio de aminoácido adicional) ofrecía como resultado sólo una CIM de 0,16 \mug/ml (26). El mutante doble Glu104Lys/Gly238Ser cuenta una CIM de 10 \mug/ml. Este mutante se corresponde con TEM-15.
Estas mismas mutaciones con Glu104Lys y Gly238Ser, en combinación con Gln39Lys (TEM-3) o Thr263Met (TEM-4) proporcionan como resultado un alto nivel de resistencia (2-32 \mug/ml para TEM-3 y 8-32 \mug/ml para TEM-4 (34, 35)).
Un mutante que contiene los tres cambios de aminoácido conservados tras el retrocruce (Glu104Lys/Met/E2Thr/
Gly2385er) también presenta una CIM de 10 \mug/ml. Esto significa que las mutaciones que presentaban cada uno de los nuevos mutantes seleccionados junto con las tres mutaciones conocidas eran responsables de un incremento de entre 32 y 64 veces en la resistencia del gen a la cefotaxima.
Cada una de las enzimas derivadas de TEM-1 clínicas producidas de forma natural (TEM-1-19) contienen una combinación diferente de sólo 5-7 mutaciones idénticas (revisiones). Puesto que estas mutaciones se localizan en lugares bien separados entre sí dentro del gen, no se puede obtener un mutante con una alta resistencia a la cefotaxima mediante mutagénesis de "cassette" de una única región. Esto puede explicar porque el CIM máximo que se obtuvo mediante el enfoque estándar de la mutagénesis de "cassette" es sólo de 0,64 \mug/ml (26). Por ejemplo, se halló por separado que tanto la mutación Glu104Lys como la mutación Gly23Ser presentaban una CIMs por debajo de 0,16 \mug/ml. El uso de la transposición de ADN permitió la combinatoriedad y, en consecuencia, se halló que la combinación Glu 104Lys/Gly238Ser presentaba una CIM de 10 \mug/ml.
Una limitación importante de este ejemplo es el uso de un único gen como punto inicial. Se contempla que se pueden hallar combinaciones mejores en caso de que se transponga un gran número de genes relacionados producidos de forma natural. La diversidad presente en este tipo de mezcla es más significativa que las mutaciones aleatorias generadas mediante transposición mutagénica. Por ejemplo, se contempla que se podría emplear un repertorio de genes relacionados de una única especie, como la diversidad preexistente del sistema inmunológico o los genes relacionados obtenidos a partir de varias especies diferentes.
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Ejemplo 7 Mejora del anticuerpo A10B mediante transposición de ADN o una biblioteca con los seis RDC mutantes
El anticuerpo A10B scFv, un anticonejo IgG de ratón, fue una donación de Pharmacia (Milwaukee WI). Se empleó el sistema de exposición en fago comercialmente disponible de Pharmacia, haciendo uso del vector de exposición en fago pCANTAB5.
El anticuerpo A10B original en términos reproductivos sólo presenta una avidez reducida, ya que se obtuvieron los clones que sólo están débilmente vinculados al antígeno (conejo IgC), (medidos mediante el fago ELISA (equipo de ensayo Pharmacia) o mediante el título del fago). La concentración de conejo IgC que proporcionó como resultado una inhibición del 50% del anticuerpo A10B que se enlazaba en un ensayo de competición fue de 13 picomolares. La avidez reducida observada también puede deberse a la inestabilidad del clon A10B.
Se procedió a secuenciar el ADN de A10B scFv (United States Biochemicals Co., Cleveland OH) según las instrucciones del fabricante. La secuencia fue similar a los anticuerpos existentes, basándose en la comparación con el método Kabat (33).
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1) Preparación del ADN del fago
Se ha procedido a incubar el ADN del fago presentado por el gen del anticuerpo de tipo salvaje A10B (10 \mul) a 99ºC durante 10 minutos y, a continuación, a 72ºC durante 2 minutos. Se ha añadido la mezcla con RCP (50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl, pH 9,0, Tritón X-100 al 0,1%, 200 \muM por cada dNTP, 1,9 mM de MgCl), 0,6 \mum de cada cebador y 0,5 \mul de la Taq Polimerasa de ADN (Promega, Madison WI) al ADN del fago. Se ha puesto en marcha un programa con RCP durante 35 ciclos de [30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 45ºC, 45 segundos a 72ºC]. Los cebadores utilizados fueron:
5' ATGATTACGCCAAGCTTT 3' (SEC ID Nº: 26) y
5' TTGTCGTCTTTCCAGACGTT 3' (SEC ID Nº: 27).
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Asimismo, se ha sometido a electroforesis al producto de RCP de 850 bp y se ha purificado a partir de un gel de agarosa con un bajo punto de fusión de un 2.
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2) Fragmentación
Se han digerido 300 ng de una banda 850 bp purificada mediante 0,18 unidades de ADNsa I (Sigma, St. Louis MO) en 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM de MgCl durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se ha preparado el ADN digerido en gel de agarosa con un bajo punto de fusión al 2%) y se han purificado las bandas de entre 50 y 200 bp del gel.
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3) Construcción de la Biblioteca de ensayo
El objetivo de este experimento consiste en comprobar si la inserción de los RDC resulta eficaz.
Se han sintetizado las siguientes secuencias de RDC que tienen lugares internos de enzima de restricción. El término "RDC H" hace referencia a un RDC en la cadena pesada y "RDC L" hace referencia a un RDC en la cadena ligera del anticuerpo.
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Oligos de RDC con lugares de restricción
RDC H1 (SEC ID Nº: 34)
5'TTCTGGCTACATCTTCACAGAATTCATCTAGATTTGGGTGAGGCAGACGCCTGAA3'
\newpage
RDC H2 (SEC ID Nº: 35)
5'ACAGGGACTTGAGTGGATTGGAATCACAGTCAAGCTTATCCTTTATCTCGGTCTCGAGTCCAAGTAC
{}\hskip0.4cm TTAAAGGGCCACACTGAGTGTA3'
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RDC H3 (SEC ID Nº: 36)
5'TGTCTATTTCTGTGCTAGATCTTGACTGCAGTCTTATACGAGGATCCATTGGGCCAAGGGACCAGGT
{}\hskip0.4cm CA3'
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RDC L1 (SEC ID Nº: 37)
5'AGAGGGTCACCATGACCTGCGGACGTCTTTAAGCGATCGGGCTGATGGCCTGGTACCAACAGAAGC
{}\hskip0.4cm CTGGAT3'
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RDC L2 (SEC ID Nº: 38)
5'TCCCCCAGACTCCTCATTTATTAAGCGAGATCTAAACAGCTGTTCCTCCCTTTTCGCTTCAGT3'
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RDC L3 (SEC ID Nº: 39)
5'ATGCTGCCACTTATTACTGCTTCTGCGCGCTTAAAGGATATCTTCATTTCGGAGGGGGGACCAAG
{}\hskip0.4cm CT3'
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Se añadieron los oligos de RDC a los fragmentos de ADN del anticuerpo A10B purificado de entre 50 a 200 bp a partir de la etapa (2) anteriormente mencionada hasta alcanzar un exceso molar de 10 veces. Se añadió la mezcla RCP (50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl, pH 9,0, Tritón x-100 al 0,1%, 1,9 mM de MgCl, 200 \mum por cada dNTP, 0,3 \mul de Taq polimerasa de ADN (Promega, Madison WI), 50 \mul de volumen total y se puso en marcha el programa de transposición durante 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 72ºC, y, a continuación, durante 35 ciclos: 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 55ºC, 30 segundos a 72ºC.
Se añadió 1 \mul de la mezcla transpuestas a 100 \mul de una mezcla con RCP (50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl, pH 9,0, Tritón X-100 al 0,1%, 200 \mum por cada dNTP, 1,9 mM de MgCl, 0,6 \muM por cada uno de los dos cebadores externos (SEC ID Nº: 26 y 27, ver a continuación), 0,5 \mul de Taq polimerasa de ADN) y se puso en marcha el programa RCP durante 30 ciclos de [30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 45ºC, 45 segundos a 72ºC]. La mezcla resultante de fragmentos de ADN con un tamaño de 850 pares base fue fenol/cloroformo extraído y etanol precipitado.
Los cebadores externos fueron:
Cebador externo 1: SEC ID Nº: 27
5'TTGTCGTCTTTCCAGACGTT3'
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Cebador externo 2: SEC ID Nº: 26
5'ATGATTACGCCAAGCTTT 3'
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El producto de RCP de 850 bp fue digerido con las enzimas de restricción Sfi y NotI, se purificó con gel de agarosa con un bajo punto de fusión y se ligó en el vector de expresión pCANTAB5 obtenido gracias a Pharmacia, Milwaukee WI. Se sometió a electroporación al vector ligado según el método establecido por Invitrogen (San Diego CA) hasta obtener células TG] (Pharmacia, Milwaukee WI) y se dispuso en placas diferentes para cada colonia.
Se añadió el ADN de las colonias resultantes a 100 \mul de una mezcla con RCP (50 mM de ECl 10 mM de Tris-HCl, pH 9,0, Tritón X-100 al 0,1%, 200 m por cada dNTP, 1,9 mM de MgCl, 0,6 \muM por cada cebador externo 1 (SEC ID Nº: 27; ver a continuación), seis cebadores internos (SEC ID Nº: 40-45; ver abajo), y 0,5 \mul de la Taq polimerasa de ADN) y se puso en marcha un programa con RCP durante 35 ciclos de [30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 45ºC, 45 segundos a 72ºC], Las dimensiones de los productos con RCP fueron determinadas mediante electroforesis en gel de agarosa y se emplearon para determinar qué RDC con lugares de restricción se insertaban.
\newpage
Cebadores internos con RDC:
H1 (SEC ID Nº: 40) 5'AGAATTCATCTAGATTTG 3',
H2 (SEC ID Nº: 41) 5'GCTTATCCTTTATCTCAGGTC 3',
H3 (SEC ID Nº: 42) 5'ACTGCAGTCTTATACGAGGAT 3'
L1 (SEC ID Nº: 43) 5'GACGTCTTTAAGCGATCG 3',
L2 (SEC ID Nº: 44) 5'TAAGGGAGATCTAAACAG 3'
L3 (SEC ID Nº: 45) 5'TCTGCGCGCTTAAAGGAT 3'
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Se insertaron los seis RDC sintéticos en los lugares esperados en el ADN del anticuerpo A10B de tipo salvaje (Figura 7). Estos estudios demostraron que, mientras que cada uno de los seis RDC presentaban en un clon específico una pequeña probabilidad de ser un RDC con un lugar de restricción, la mayor parte de los clones transportaba como mínimo un RDC con un lugar de restricción generando cualquier combinación posible de RDC con lugares de restricción.
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4) Construcción de regiones que determinan la complementariedad ("RDCs") entre mutantes
Se crearon seis oligonucleótidos correspondientes a seis RDCs basándose en nuestros datos sobre la secuencia. Los RDC fueron mutagenizados sintéticamente (definición de Kabat) en una proporción de 70 (bases existentes): 10:10:10, y se flanquearon en los extremos 5' y 3' de aproximadamente 20 bases de la secuencia flanqueante, que establece la homología para la incorporación de los RDC cuando se introducen en una mezcla de los fragmentos sin mutagenizar del gen del anticuerpo con un exceso molar. A continuación se enumeran las secuencias mutantes resultantes. Oligos para la biblioteca con RDC
100 
\newpage
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Las secuencias en negrita y subrayadas fueron las secuencias mutantes sintetizadas mediante una mezcla de nucleósidas de 70:10:10:10 en donde el 70% era una nucleósida de tipo salvaje.
Se añadió un exceso molar de 10 veces de los oligos mutantes con RDC a los fragmentos de ADN del anticuerpo A10B purificado entre 50 y 200 bp de longitud según la etapa (2) anteriormente mencionada. Se añadió la mezcla con RCP (50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl, pH 9.0, Tritón x-100 al 0,1%, 1,9 mM de MgCl, 200 pm por cada dNTPI 0,3 \mul de Taq polimerasa de ADN (Promega, Madison WI), 50 pl de volumen total) y se puso en marcha el programa de transposición durante 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 72ºC y, a continuación, 35 ciclos: [30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 55ºC, 30 segundos a 72ºC].
Se añadió 1 \mul de mezcla transpuesta a 100 \mul de una mezcla con RCP (50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl, pH 9,0, Tritón X-100 al 0,1%, 200 pm por cada dNTP, 1,9 mM de MgCl, 0,6 pM por cada uno o de los dos cebadores externos (SEC ID Nº: 26 y 27, ver abajo), 0,5 gl de Taq polimerasa de ADN) y se puso en marcha el programa con RCP durante 30 ciclos de [30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 45ºC, 45 segundos a 72ºC]. La mezcla resultante de los fragmentos de ADN con un tamaño de SSO pares base fue fenol/cloroformo extraído y etanol precipitado.
Los cebadores externos fueron:
Cebador externo 1: SEC ID Nº: 27 5' TTGTCGTCTTTCCAGACGTT 3'
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Cebador externo 2: SEC ID Nº: 26 5' ATGATTACGCCAAGCTTT 3'
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5) Clonación del ADN del anticuerpo scFv en pCANTAB5
El producto con RCP de 850 bp fue digerido mediante las enzimas de restricción SfiI y NotI, se purificó mediante un gel de agarosa con un bajo punto de fusión y se ligó en el vector de expresión pCANTAB5 obtenido gracias a Pharmacia, Milwaukee WI. Se sometió a electroporación el vector enlazado según el método establecido por Invitrogen (San Diego CA) basta obtener células TG1 (Pharmacia, Milwaukee WI) y se hizo crecer la biblioteca del fago usando el fago auxiliar según las pautas recomendadas por el fabricante.
La biblioteca generada de esta forma para conseguir la presencia de anticuerpos perfeccionados fue seleccionada usando seis ciclos de selección.
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6) Selección de clones de alta afinidad
Se recubrieron 15 pocillos de una placa microtiter de 96 pocillos con IgG de conejo (Jackson Inmunoresearch, Bar Harbor ME) a 10 \mug/pocillo durante 1 hora a 37ºC y, a continuación, se bloquearon con un 2% de leche en polvo desnatada en PBS durante 1 hora a 37ºC.
Se bloquearon 100 \mul de la biblioteca del fago (1x10^{10} cfu) con 100 \mul de un 2% de leche durante 30 minutos a temperatura ambiente y, a continuación, se añadió a cada uno de los 15 pocillos y se incubó durante 1 hora a 37ºC.
Asimismo, se lavaron los pocillos tres veces con PBS que contenía Tween-20 al 0,5% a 37ºC durante 10 minutos por cada lavado. Se eluyó el fago enlazado con 100 la de tampón de elución (Glicina-HCl, pH 2.2), seguido de una neutralización inmediata con 2M de Tris, pH 7,4 y de la transfección para conseguir la producción del fago. Se repitió este ciclo de selección en seis ocasiones.
Tras el sexto ciclo, se recogieron los clones individuales del fago, se compararon las afinidades relativas mediante el fago ELISA y se evaluó la especificidad del IgC de conejo con un equipo de Pharmacia (Milwaukee WI) según los métodos recomendados por el fabricante. El mejor clon presenta aproximadamente un índice de expresión mejorado 100 veces en comparación con el A10B de tipo salvaje cuando se somete a examen mediante el ensayo Western. La concentración del IgG de conejo que proporcionó como resultado una inhibición del 50% en un ensayo de competición con el mejor clon fue de 1 picomolar.
El mejor clon era reproductivamente específico en el caso del antígeno de conejo. El número de copias del anticuerpo mostrado por el fago parece haber aumentado.
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Ejemplo 8 Recombinación in vivo a través de repeticiones directas de genes parciales
Se construyó un plásmido con dos copias parciales e inactivas del mismo gen (beta-lactamasa) para demostrar que la recombinación entre las regiones comunes de estas dos repeticiones directas conlleva unos genes recombinantes activos de longitud completa.
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Se empleó un derivado de pUC18 que transportaba el gen TEM-1 bacteriano de la betalactamasa (Yanish-Perron et al., 1985, Gene 33:103-119). El gen TEM-1 de la betalactamasa ("Bla") confiere resistencia a las bacterias contra aproximadamente 0,02 \mug/ml de cefotaxima. A los lugares de restricción SfiI se les añadieron el 5' del promotor y la extremidad 3' del gen de la betalactamasa mediante RCP de la secuencia de vectores con dos cebadores: Cebador A (SEC ID Nº: 46)
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y mediante RCP de la secuencia de genes de la beta-lactamasa con dos otros cebadores:
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Se digirieron los dos productos de reacción con Sfi1, se mezclaron, se ligaron y se emplearon para transformar las bacterias competentes de E. coli mediante el procedimiento descrito a continuación. El plásmido resultante fue pUC182Sfi-Bla-Sfi. Este plásmido contiene un fragmento Sfi1 que transporta el gen Bla y el promotor P-3.
La concentración inhibitoria mínima de cefotaxima para el XL1-blue de E. coli (Stratagene, San Diego CA) que transporta el pUC182Sfi-Bla-Sfi fue de 0,02 \mug/ml tras 24 horas a 37ºC.
Se clonó el gen de tetraciclina de pBR322 en pUC18SfiBla-Sfi usando las regiones homologas, con lo que se obtuvo pBR322TetSfiBla-Sfi. Asimismo, se borró el gen TEM-1 mediante digestión de restricción del pBR322TetSfi -Bla-Sfi con SspI y FspI y mediante ligadura de extremo romo, con lo que se obtiene pUC322TetSfi-Sfi.
Se amplificaron las regiones superpuestas del gen TEM-1 usando técnicas RCP estándar y los siguientes cebadores:
Cebador 2650 (SEC ID Nº: 50) 5' TTCTTAGACGTCAGGTGGCACTT 3'
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Cebador 2493 (SEC ID Nº: 51) 5' TTT TAA ATC AAT CTA AAG TAT 3'
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Cebador 2651 (SEC ID Nº:52) 5' TGCTCATCCACGAGTGTGGAGAAGTGGTCCTGCAACTTTAT 3'; y
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Cebador 2652 (SEC ID Nº: 53) ACCACTTCTCCACACTCGTGGATGAGCACTTTTAAAGTT
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Los dos fragmentos de ADN resultantes fueron digeridos con Sfi1 y BstX1 y se ligaron en el lugar Sfi de
pBR322TetSfi-Sfi. El plásmido resultante recibió el nombre de pBR322Sfi-BL-LA-Sfi. En la figura 9 se muestra un mapa del plásmido, así como un esquema de la recombinación intraplasmídica y la reconstitución de la beta-lactamasa funcional.
El plásmido fue sometido a electroporación en células TG-1 o en células JC8679 de E. coli. El JC8679 de E. coli es RecBC sbcA (Oliner et al. 1993, NAR 21:5192). Se dispusieron las células en placas de agar que contenían tetraciclina sólida. Asimismo, se colocaron las colonias que crecieron en placas de agar sólido que contenía 100 tg/ml de ampicilina y se contó el número posible de colonias. Se amplificaron los insertos del gen de la beta-lactamasa en aquellos transformantes que mostraban resistencia a la ampicilina mediante técnicas RCP estándar usando el Cebador 2650 (SEC ID Nº: 50) 5' TTCTTAGACGTCAGGTGGCACTT 3' y el Cebador 2493 (SEC ID Nº: 51) 5'TTTTAAAT
CAATCTAAAGTAT 3' y se midió la longitud del inserto. La presencia de un inserto de 1 kb indica que se recombinó el gen con éxito tal y como se muestra en la Fig. 9 y en Tabla 5.
TABLA 5
6
Aproximadamente el 17-25% de las colonias resistentes a la tetraciclina también eran resistentes a la ampicilina y se recombinaron correctamente todas las colonias resistentes a la ampicilina en el modo determinado mediante el RCP para colonias. En consecuencia los genes parciales localizados en el mismo plásmido se recombinarán con éxito para crear un gen funcional.
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Ejemplo 9 Recombinación in vivo mediante repeticiones directas de genes de longitud completa
Se construyó un plásmido con dos copias de longitud completa de diferentes alelos del gen de la beta-lactamasa. La recombinación homóloga de los dos genes tuvo como resultado una única copia recombinante de longitud completa de dicho gen.
La construcción de pBR322Tet-Sfi-Sfi y pBR322TetSfi-Bla-SfI aparece descrita anteriormente.
Los dos alelos del gen de la beta-lactamasa se construyeron tal y como se describe a continuación. Se llevaron a cabo dos reacciones de RCP con pLC18Sfi-Bla-Sfi a modo de modelo. Se llevó a cabo una reacción con los siguientes cebadores.
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La segunda reacción con RCP se llevó a cabo con los siguientes cebadores:
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Esto proporcionó como resultado dos genes Bla, uno con un lugar 5' SfiI y un lugar 3' BstXI, el otro con un lugar 5' BstXI y un lugar 3' SfiI.
Tras la digestión de estos dos genes con BstXI y SfiI y tras la ligadura en el plásmido digerido pBR322TetSfi-Sfi mediante SfiI, se obtuvo un plásmido (pBR322-Sfi-2BLA-Sfi) con un repetición en serie del gen Bla (Ver Figura 10).
El plásmido fue sometido a electroporación en células E. coli. Se dispusieron las células en placas de agar sólidas que contenían 15 \mug/ml de tetraciclina. Asimismo, se dispusieron las colonias que crecieron en placas de agar sólido que contenían 100 \mug/ml de ampicilina y se contó el número de colonias posibles. Se amplificaron los insertos Bla de los transformantes que mostraban resistencia a la ampicilina mediante técnicas RCP estándar usando el método y los cebadores descritos en el ejemplo 8. La presencia de un inserto de 1 kb indicó que los genes duplicados se habían recombinado, tal y como se indica en la Tabla 6.
TABLA 6
7
El RCP de las colonias confirmó que se había procedido a recombinar de una forma eficaz la repetición en serie con el fin de formar un único gen recombinante.
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Ejemplo 10 Ciclos múltiples de recombinación directa Interplasmídica
Para determinar si se podían utilizar con más rapidez los ciclos múltiples de recombinación para producir células resistentes, se llevaron a cabo los ciclos múltiples según el método descrito en el ejemplo 9.
El control de recombinación substractiva consistía en una única copia del gen de la betalactamasa, mientras que el experimento con la recombinación aditiva consistió en insertar dos copias de la betalactamasa a modo de repetición directa. Se empleó el marcador de la tetraciclina para igualar el numero de colonias seleccionadas para que contuvieran la resistencia a la cefotaxima en cada etapa con el fin de compensar las eficiencias de la ligadura.
En la primera etapa, se digirió el pBR322TetSfi-Bla-Sfi con EcrI y lo sometieron al RCP con una mezcla 1:1 (1 ml) de mezcla de RCP normal Cadwell (Cadwell y Joyce (1992) MR, Methods and Applications 2: 28-33) para localizar el RCP propenso al error. El programa con RCP fue de 70ºC durante 2 minutos inicialmente y, a continuación, 30 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 52ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 3 minutos y 6 segundos por ciclo, seguido de 72ºC durante 10 minutos.
Los cebadores empleados en la reacción con RCP para crear el plásmido de control del gen Bla fueron el Cebador 2650 (SEC ID Nº: 50) y el cebador 2719 (SEC ID NO: 55) 5'TTAACCCATTTTGCTCATGAGATT 3'. Esto proporcionó como resultado una población mixta de fragmentos de ADN amplificados, a los que se les asigna el nombre colectivo de Fragmento #59. Estos fragmentos presentan varias mutaciones diferentes.
Los cebadores usados en dos reacciones con RCP diferentes para crear los dos plásmidos del gen Bla fueron el Cebador 2650 (SEC ID Nº: 50) y el Cebador 2649 (SEC ID Nº: 51) para el primer gen y los Cebadores 2648 (SEC ID Nº: 54) y el Cebador 2719 (SEC ID Nºa: 55) para el segundo gen. Esto proporcionó como resultado una población mixta de cada uno de los dos fragmentos de ADN amplificados: el Fragmento #89 (amplificado con los cebadores 2648 y 2719) y el Fragmento #90 (amplificado con los cebadores 2650 y 2649). En cada caso se introdujeron varias mutaciones diferentes en la población mixta de cada uno de los fragmentos.
Tras el RCP propenso al error, se digirió la población del Fragmento de ADN amplificado con SfiI y, a continuación, se clonó en pBR322TetSfi-Sfi para crear una población mixta del plásmido pBR322SfiBla-Sfi'.
Tras el RCP propenso al error, se digirió la población de los Fragmentos #90 y #89 de ADN amplificado con SilI y BstXI a 50-C y se ligó en pBR322TetSfi-Sfi para crear una población mixta del plásmido pBR322TetSfl-2Bla-SfiI (Figura 10).
Los plásmidos fueron sometidos a electroporación pBR322Sfl-Bla-SfiI y pBR322Sfi-2Bla SfiI en un JC8679 de E. coli y se colocaron en placas de agar que presentaban diferentes concentraciones de cefotaxima para seleccionar cepas resistentes y en las placas de tetraciclina para efectuar una evaluación.
Se recogió un número idéntico de colonias (basado en el número de colonias que crece en la tetraciclina), se dejó que crecieran en LB y se extrajo el ADN de dichas colonias. Esta fue una etapa de recombinación. El ADN fue digerido mediante EcrI y se empleó en una segunda etapa de RCP propenso al error en el modo anteriormente descrito.
Tras cinco etapas, la CIM (concentración inhibitoria mínima) de la cefotaxima para un plásmido del fragmento fue de 0,32, mientras que la CIM para los dos plásmidos del fragmento fue de 1,28. Los resultados mostraron que, tras cinco ciclos, la resistencia obtenida con la recombinación era cuatro veces más elevada en presencia de una recombinación in vivo.
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Ejemplo 11 Recombinación in vivo mediante electroporación de fragmentos
Se prepararon las células de E. coli competentes que contenían pUCI8Sfi-Bla-Sfi según el modo descrito. El plásmido pUC18Sfi-Bla-Sfi contiene el gen de la beta-lactamasa TEM-1 estándar según el modo descrito con anterioridad.
Se obtuvo un gen TEM-1 derivado de la resistencia a la cefotaxima derivada de pUC1SSfi-cef-Sfi, (clon ST2) (Stemmer WPC (1994) Nature, 370:389-91, incorporada a la presente en la referencia) que confiere al E. coli que transporta el plásmido una CIM de 640 \mug/ml en el caso de la cefotaxima. En un experimento, se sometió a electroporación al ADN del plásmido completo pUC1SSfi-cef-Sfi en células de E. coli que contenían el plásmido pUC18Sfi-Bla-Sfi.
En otro experimento, se amplificó el fragmento de ADN que contenía el gen de la cefotaxima derivado de pUCI8Sfi-cef-Sfi mediante RCP usando los cebadores 2650 (SEC ID Nº: 50) y 2719 (SEC ID Nº: 55). El producto de RCP de 1 kb resultante fue digerido en fragmentos de ADN de <100 bp mediante ADNsa y se sometió a electroporación estos fragmentos en las células de E. coli competentes que ya contenían pUC18Sfi-Bla-Sfi.
A continuación, se sometió a examen las células transformadas de ambos experimentos para comprobar su resistencia a la cefotaxima al disponer las células transformadas en placas de agar con concentraciones variables de cefotaxima. Los resultados aparecen en la Tabla 7.
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TABLA 7
8 
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A partir de los resultados, se puede observar que se insertó el gen Cef ST-2 completo en el genoma bacteriano o en el plásmido tras la electroporación. Debido a que la mayor parte de las inserciones son homologas, se espera que el gen se insertará en el plásmido, reemplazando el gen de tipo salvaje. También se insertó de una forma eficaz los fragmentos del gen Cef de St-2 en el gen de tipo salvaje del plásmido. No se observó ningún aumento pronunciado en la resistencia a la cefotaxima con la introducción del gen de tipo salvaje (entero o en fragmentos), ni tampoco ningún ADN. En consecuencia, se demostró que los fragmentos ST-2 proporcionaron como resultado una resistencia mayor a la cefotaxima que la mayoría que los fragmentos de tipo salvaje. Se contempló que las inserciones repetidas de fragmentos obtenidos a partir de grupos de genes cada vez más resistentes conllevaban una resistencia en aumento.
En consecuencia, se aisló las colonias que producían una resistencia incrementada ante la cefotaxima con los fragmentos del gen St-2 y se extrajo el ADN del plásmido. Se amplificó el ADN usando RCP según el método descrito anteriormente. Se digirió el ADN amplificado con ADNsa en fragmentos (<100 bp) y se sometieron a electroporación 2-4 fig de los fragmentos en células de E. coli competentes que ya contenían pUC322Sfi-Bla-SfI según el modo descrito con anterioridad. Se dispusieron las células transformadas en placas de agar que contenían concentraciones variables de cefotaxima.
También se emplearon células de E. coli competentes que presentaban el plásmido pLTC1SSfl-Kan-Sfi a modo de control. Se sometió a electroporación fragmentos de ADN derivados de la digestión del producto con RCP de pUC1SSfl-cef-SfI en estas células. No existe ninguna homología entre el gen de la canamicina y el gen de la beta-lactamasa y, en consecuencia, no se produce recombinación.
Se repitió el experimento durante 2 ciclos y los resultados aparecen en la Tabla 8.
TABLA 8
9
Ejemplo 12 Determinación de los formatos de recombinación
Este experimento fue diseñado para determinar qué formato de recombinación generaba más recombinantes por ciclo.
En un primer proceso, se amplificó el vector pIJCISSfi-Bla-Sfi con cebadores de RCP para generar un fragmento grande y uno pequeño. El fragmento grande presentaba un plásmido y unos extremos que contenían porciones del gen Bla y el fragmento pequeño codificaba la parte media de dicho gen Bla. Se creó un tercer fragmento que contenía el gen Bla completo usando el RCP mediante el método del ejemplo S. Se sometió a electroporación el fragmento del plásmido más grande y el fragmento que contiene el gen Bla completo en células JC8679 de E. coli y, al mismo tiempo, a través del método descrito anteriormente y se dispusieron en placas los transformantes con diferentes concentraciones de cefotaxima.
En el proceso 2, se amplificó el vector pUC1 SSfi-Bla-Sfi para producir el fragmento de plásmido grande aislado como en el proceso 1 anteriormente mencionado. También se obtuvieron mediante RCP los dos fragmentos que comprendían una porción del gen Bla completo, de manera que los dos fragmentos fragmentan el gen Bla completo. El fragmento del plásmido grande y los dos fragmentos del gen Bla fueron sometidos a electroporación en células JC8679 competentes de E. coli y los transformantes fueron dispuestos en placas con concentraciones variables de cefotaxima.
En el tercer proceso, tanto el vector como el plásmido fueron sometidos a electroporación en células JC5679 de E. coli y los transformantes fueron dispuestos en placas con concentraciones variables de cefotaxima.
En el cuarto proceso, se sometió a electroporación al gen Bla completo en células JC8679 de E. coli que ya contenían el vector pUCSfi-Sfi y los transformantes fueron dispuestos en placas con concentraciones variables de cefotaxima. Se sometieron a electroporación las células J7C8679 de E. coli con el gen Bla completo o con el vector solo a modo de control.
Los resultados aparecen representados en la figura 11. La eficacia de la inserción de dos fragmentos en el vector es 100 veces inferior que cuando se emplea un fragmento que contiene el gen Bla completo. El proceso 3 indicaba que la eficacia de inserción depende de la presencia de los extremos de ADN desnudo puesto que no se obtuvo ningún recombinante gracias a este proceso. Sin embargo, los resultados del proceso 3 también se debieron a la baja eficacia de la electroporación del vector. Cuando el vector de expresión se encuentra ya en las células competentes, la eficacia de la electroporación del vector ya no constituye un factor y se puede conseguir una recombinación homologa eficaz incluso con un vector sin cortar.
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Ejemplo 13 Equipo de transposición de "cassette" para optimizar el rendimiento del vector
Con el objetivo de proporcionar un vector capaz de conferir un fenotipo optimizado (p. ej., la expresión máxima de una secuencia codificada mediante un vector como, por Ejemplo, un gen donado), se estableció un equipo que incluía una variedad de cassettes que pueden ser transpuestas y se pueden seleccionar los transponedores optimizados. La figura 12 muestra esquemáticamente una forma de realización en la que cada lugar geométrico presenta una pluralidad de cassettes. Por ejemplo, en un sistema de expresión bacteriana, la figura 13 muestra como ejemplo cassettes usados en los lugares geométricos correspondientes. Cada cassette de un lugar geométrico determinado (por ej., todos los promotores de este ejemplo) se ven flanqueados por las secuencias sustancialmente idénticas capaces de superponer la(s)
secuencia(s) de cassettes flanqueada(s) de un lugar geométrico adyacente y, preferentemente, también es capaz de tomar parte en la recombinación homologa o en la recombinación no homologa (por ej., los sistemas lox/cre o flp/frt), para crear una transposición de cassettes dentro de un lugar geométrico, aunque no lo hace sustancialmente entre los lugares geométricos.
Los cassettes se incluyen en el equipo a modo de fragmentos de RCP, en los que cada tipo de cassette o especie individual de cassette se incluyen en un tubo aparte. Las bibliotecas del vector se crean al combinar el contenido de los tubos para ensamblar plásmidos completos o porciones sustanciales de los mismos mediante hibridación de las secuencias flanqueantes superpuestas de cassettes en cada lugar geométrico con cassettes en los lugares geométricos adyacentes. El vector ensamblado se liga a un gen predeterminado de interés para formar una biblioteca de vectores en la que cada elemento de la biblioteca comprende el gen predeterminado de interés y una combinación de cassettes determinada mediante la asociación de cassettes. Los vectores se transfieren a una célula huésped adecuada, se cultivaron las células en condiciones adecuadas para la expresión y se seleccionó el fenotipo deseado.
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Ejemplo 14 Transposición para optimizar las propiedades (PFV) fluorescentes verdes Antecedentes
La proteína verde fluorescente ("PFV") es un polipéptido derivado de un apopéptido que tiene 238 residuos aminoácidos y un peso molecular de aproximadamente 27.000. La PFV contiene un cromóforo formado de residuos aminoácidos 65 a través de 67. Tal y como su nombre indica, PFV fluorece; no bioluminesce como la luciferasa. In vivo, el cromóforo de PFV se activa mediante transferencia de energía de coelenterazina complejada con la fotoproteína aequorina, en la que la PFV muestra la fluorescencia verde a 510 nm. Tras una irradiación con luz UV o azul, la PFV muestra una fluorescencia verde de aproximadamente 510 nm.
La proteína verde fluorescente (PFV) de la medusa Aequorea victoria es un indicador muy útil para la expresión y la regulación del gen (Prasher et al. (1992) Gen 111: 229; Prasher et al. (1995) Trends In Genetics 11: 320; Chalfie et al. (1994) Science 263: 802,). La WO 95121191 muestra una secuencia polinucleótida que codifica una apoproteína PFV de aminoácido 238 que contiene un cromóforo formado a partir de aminoácidos 65 a través de 67. La WO95121191 revela que una modificación del ADNc para el apopéptido de A. victoria PFV se produce en la síntesis de un péptido que cuenta con unas propiedades fluorescentes alteradas. Se la relatado la existencia de un mutante PFV (565T) con una mejora de 4 a 6 veces en una amplitud de excitación (Heim et al, (1904) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA.) 91: 12501).
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Perspectiva
La proteína verde fluorescente (PFV) se ha transformado con rapidez en un indicador de regulación del gen extensamente usado. Sin embargo, en muchos organismos, en particular eucariotas, se constató que la señal fluorescente de célula entera era demasiado baja. El objetivo era la mejora de la fluorescencia de la célula entera de PFV para su uso como un indicador en la regulación del gen de células E. coli y mamíferas. La mejora de PFV mediante un diseño racional parecía difícil visto que el límite cuántico de PFV se encontraba ya ubicado entre un 0,7 y un 0,8 (Ward et al. (1982) Photochem. Photobiol. 35: 803) y el nivel de expresión de PFV en un estándar de construcción E. coli era ya de alrededor de un 75% de la proteína total.
Se realizó una primera mejora de PFV mediante síntesis de un gen de PFV con el uso de un codón perfeccionado. Se procedió entonces a perfeccionar el gen de PFV mediante el(los) método(s) descrito(s), que consisten en ciclos recurrentes de transposición de ADN o RCP sexual del gen de PFV, combinado con selección visual de los clones más brillantes. La señal de fluorescencia de célula completa en E. coli se optimizó y los mutantes seleccionados fueron entonces evaluados para determinar el rendimiento de los mejores mutantes de PFV en células eucarióticas.
Se procedió a sintetizar un gen sintético mediante el uso de un codón perfeccionado con una mejora de 2,8 de la señal de fluorescencia de la célula completa E. coli comparada con la construcción PFV del estándar industrial (Clontech, Palo Alto, CA). Se obtuvo una mejora adicional de 16 veces a partir de tres ciclos de RCP sexual y selección visual de las colonias E. coli más brillante, para una mejora de 45 veces sobre la construcción estándar. Expresado en células de ovario de hámster chino (CHO), este mutante transpuesto mostró una mejora de 42 veces respecto a la señal en la construcción sintética. El nivel de expresión en E. coli fue inalterado en alrededor de un 75% de la proteína total. La emisión y excitación máxima de la PFV fue también invariable. Mientras que en las E. coli la mayor parte de PFV de tipo salvaje finaliza en cuerpos de inclusión, incapaces de activar su cromóforo, la mayor parte de la(s) proteína(s) mutante(s) eran solubles y activas. De este modo, las tres mutaciones de aminoácido guían a la proteína mutante en el recorrido de ensamblaje nativo mejor que hacia la agregación. Los resultados muestran que la transposición de la secuencia de ADN (RCP sexual) puede resolver problemas prácticos complejos y generar variantes mutantes ventajosas de una forma rápida y eficaz.
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Materiales y métodos Construcción del gen de PFV
Un gen que codifica la proteína de PFV con la secuencia publicada (Prasher et al. (1995) op. cit., incorporada en este caso en la referencia 35) (238 AA, 27 kD) fue construido a partir de oligonucleótidos. A diferencia de la construcción de PFV disponible de forma comercial (Clontech, Palo Alto, CA), la secuencia incluía el Ala residuo después de fMet, tal y como se encontró en el clon de ADNc original. Se procedió a ensamblar catorce oligonucleótidos que varían de 54 a 85 bases como siete pares por extensión RCP. Estos segmentos fueron digeridos con enzimas de restricción y se clonaron de forma separada en el vector Alfa+PFV (Whitehorn et al. (1995) Bio/Technology 13: 1215), para ordenarse a continuación. Estos segmentos fueron entonces ligados en el vector de expresión eucariótico Alfa+ para formar la construcción de PFV en toda su extensión, Alpha+PFV (Figura. 14). El Gen de PFV resultante contenía codones de arginina alterados en posiciones de aminoácido 73 (CGT), SO (CCC), 96 (CCC) y 122 (CGT). Para reducir el sesgo del codón y facilitar la expresión en E. coli, un número de otras mutaciones silenciosas fue creado mediante ingeniería genética en la secuencia para crear los lugares de restricción usados en el ensamblaje del gen. Estos fueron S2 (ACT para ACC; para crear un lugar NheI), K41 (AAA a AAC; HinDIII), Y74 (TACtOTAT) y P75 (CCAtOCCG; BspEI), T10S (ACAte ACC; NnuI), L141 (CTC para TTC) y E142 (CAA para GAG; XhoI), 5175 (TCC a ACC; BamHI) y S202 (TCC para TCC; SaiI). Las extremidades no traducidas 5' y 3' del gen contenía lugares XbaI y EcoRI, respectivamente. La secuencia génica fue confirmada mediante secuenciación.
Otros vectores de PFV adecuados y secuencias pueden obtenerse a partir de la base de datos del Banco de Cenes, como vía Internet World Wide Web, en los archivos: CVU36202, CVU36201, XXP35SPFV, XXU19282, XXU19279, XXU19277, XXU19276, AVPFV2, AVPFV1, XXU19281, XXU192SO, XXU 19278, AEVPFV, y XXU 17997.
El fragmento XbaI-EcoRI de Alfa+PFV, que contiene el Gen de PFV entero, fue subclonado en el vector de expresión procariótico pBADIS (Guzman et al. (1995) J. Bacteriol. 177: 4121), resultante en el vector de expresión bacteriano pBAD 18-PFV (Figura. 14). En este vector, la expresión génica de PFV se encuentra bajo el control del intensificador/represor de arabinosa (araBAD), que se puede inducir con arabinosa (0,2%). Puesto que esta es la única construcción con la secuencia aminoácida original, se denomina PFV de tipo salvaje (wt). El vector bacteriano de expresión PFV se obtuvo de Clontech (Palo Alto, CA), que se denomina en este caso construcción "Clontech". La expresión de PFV de la construcción "Clontech" requiere inducción IPTG.
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Transposición y selección génica
Un fragmento de ADN de aproximadamente 1 kb que contiene el Gen de PFV entero se obtuvo del vector PBAD-PFV mediante RCP con cebadores 5'-TAGCGCATCCTACCTCACCC (cerca del lugar NheI) y 5'-GAAAATCTTCT
CTCATCCG (cerca del lugar EcoRI) y purificado por RCP prep Wizard (Promega, Madison, WI). Este Producto RCP fue digerido en fragmentos aleatorios con ADNsa 1 (Sigma) y los fragmentos 50 a 300 bp fueron purificados a partir de un 2% de geles de agarosa con un bajo punto de fusión. Los fragmentos purificados fueron nuevamente suspendidos a 10-30 ng/ul en una mezcla RCP (Promega, Madison, WI; 0,2 mM cada dNTPI2,2 MM MgC12/50 MM Kcl/10 mM Tris-01, pH 9,0/0,1% Triton-K-100) con Taq polimerasa de ADN (Promega) y ensamblado (sin cebadores) usando un programa RCP de 35 ciclos de 94ºC 30s, 45ºC 30s, 72ºC 30s, tal y como se describe en Stemmer, WPC (1994) Nature 370: 389). El producto de esta reacción fue diluido a 40x en una nuevo mezcla RCP, y el producto de la longitud total se amplificó con los mismos dos cebadores en un RCP de 25 ciclos de 94ºC 30s, 50ºC 30s, 72ºC 30 s, seguido de 72ºC durante 10 mm. Tras la de digestión del producto reagrupado con NheI y EcoRI, esta biblioteca de genes PFV recombinados in vitro y de mutación puntual fue donada de nuevo en el vector PBAD, sometido a electroporación en E. coli TUI (Pharmacia), y dispuesto sobre placas LB con 100 mg/ml de ampicilina y un 0,2% de arabinosa para inducir la expresión de la PFV del promotor de arabinosa.
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Selección mutante
Sobre un estándar de caja de luz UV (365 nm) las 40 colonias más brillantes fueron seleccionadas y agrupadas. El grupo de colonias se utilizó como el modelo para una reacción RCP con el fin de obtener un grupo de genes de PFV. Los ciclos 2 y 3 fueron realizadas de forma idéntica al ciclo 1. El mejor mutante del ciclo 3 fue identificado mediante el crecimiento de colonias en placas microtiter y espectrometría de fluorescencia de las placas microtiter.
Para la caracterización de los mutantes en E. coli, se realizó una secuenciación de ADN sobre un secuenciador de ADN 391 de biosistemas aplicados.
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Expresión de célula CHO de PFV
El tipo salvaje y las versiones de mutantes de los ciclos 2 y 3 del gen de PFV fueron transferidos al vector de expresión eucariótico Alfa+ (16) como un fragmento EcoRI-XbaI. Los plásmidos fueron modificados en células CHO por electroporación de 10 7 células en 0,8 mi con 40 mg de plásmido a 400V y 250 mF. Los transformantes fueron seleccionados usando 1 mg/ml 0418 durante 10-12 días.
El análisis de técnica fluorescente de células activadas se efectuó sobre un Becton Dickinson Facstar Plus mediante el uso de un láser de ion Argón sintonizado a 488 nm. Se observó una fluorescencia con la administración de un filtro pasabanda de 535130.
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Resultados Uso del codón
La E. coli que expresa la construcción sintética de PFV ("ts") con el uso del codón alterado liberó casi 3 veces más de señal de fluorescencia de célula completa que las células que expresan la construcción "Clontech" (Figura. 15A). La comparación fue realizada con una inducción completa y con una OD_{600} equivalente. Además de la sustitución de codones pobres en arginina en la construcción "ts" y la extensión N-terminal presentes en la construcción "Clontech", los vectores de expresión y promotores de la PFV son bastante diferentes. La causa de la señal de fluorescencia perfeccionada no es el nivel de expresión realzado, sino el rendimiento proteínico perfeccionado.
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RCP sexual
La señal de fluorescencia de la construcción PFV "ts" sintética fue perfeccionada posteriormente mediante la construcción de una biblioteca mutante por métodos de RCP sexual tal y como se describe en este caso y en Stemmer WPC (1994) Proc. Natl. Acad. Sci (U.S.A.) 91:10747 y Stemmer WPC (1994) Nature 370: 389, seguido de la disposición en placas y selección de las colonias más brillantes. Tras el segundo ciclo de RCP sexual y selección, se obtuvo un mutante ("ciclo" 2) perfeccionado unas 8 veces sobre "wt", y unas 23 veces sobre la construcción "Clontech". Tras el tercer ciclo, se obtuvo un mutante (ciclo 3) que era entre 16-18 veces más perfeccionado que la construcción "ts", y 45 veces que la construcción "Clontech" (Figura. 15B). Las longitudes de onda máximas de los espectros de excitación y de emisión de los mutantes fueron idénticas a aquellas de la construcción "ts" (Figura. 15B). El análisis de SDS-PAGE de células enteras mostraron que el nivel total de la proteína PFV expresada en las tres construcciones no varió, a un nivel sorprendentemente alto de alrededor de un 75% de proteína total (Figura 16, paneles (a) y (b)). El fraccionamiento de las células mediante sonicación y centrifugado mostrado en la construcción "wt" contenía principalmente PFV inactiva en forma de cuerpos de inclusión, mientras que el mutante de PFV del "ciclo 3" permanecía principalmente soluble y fue capaz de activar su cromóforo. Los genes mutantes se ordenaron y se observó que el mutante de "ciclo 1" contenía más mutaciones que el mutante de "ciclo 3" (Figura 17). El "ciclo 3" contenía 3 mutaciones proteínicas y 3 mutaciones silenciosas relativas a la construcción "ts". Las mutaciones Ff005, M154T y V164A implican la sustitución de residuos hidrofóbicos con más residuos hidrofílicos (Ryte y Doolittle, 1982). Una explicación plausible es que una PFV nativa tiene un lugar hidrofóbico sobre su superficie mediante el cual enlaza normalmente con la Aequorina, o con otra proteína. En ausencia de esta otra proteína, el lugar hidrofóbico puede causar agregación e impedir la activación autocatalítica del cromóforo. Las tres mutaciones hidrofílicas pueden contrarrestar el lugar hidrofóbico, que resulta en la agregación reducida y la activación aumentada del cromóforo. Los experimentos de búsqueda por impulso con bacterias enteras a 37ºC mostraron que el Ti/2 para la formación del fluoróforo fue de 95 minutos en el caso del "ts" y el mutante PFV de "ciclo 3".
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Células CHO
Las mejoras en las características autónomas como el autoensamblaje pueden ser transferibles a ambientes celulares diferentes. Después de ser seleccionado en bacterias, el mutante de PFV de "ciclo 3" fue transferido al Alfa+vector eucariótico y se expresó en células de ovario de hámster chino (CHO). Mientras que en el E. coli la construcción de "ciclo 3" proporcionó una señal entre 16 y 18 veces mayor a la construcción "wt", la espectroscopia de fluorescencia de células CHO que expresan el mutante de "ciclo 3" mostraron una señal de fluorescencia de la célula completa 42 veces superior a la construcción "ts" bajo condiciones idénticas (Figura. 1 8A). La técnica fluorescente de células activadas confirmó que la señal de fluorescencia media de los clones de célula CHO que expresan la construcción "ts" de ciclo 3 era 46 veces superior a las células que expresan la construcción "ts" (Figura 18B). En cuanto a la construcción "ts", se observó que la adición de 2 mM de butirato del sodio aumenta la señal de fluorescencia de 4 a 8 veces.
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Cribado versus selección
Estos resultados fueron obtenidos mediante selección visual de aproximadamente 10.000 colonias, y las 40 colonias más brillantes fueron captadas en cada ciclo. Se pueden obtener unas mejoras significantes en la función proteínica con un número relativamente bajo de variantes. En vista de este sorprendente hallazgo, el RCP sexual puede ser combinado con unos altos procedimientos de selección como un proceso perfeccionado para la optimización del gran número de enzimas comercialmente importantes para las cuales, las selecciones de mutantes a gran escala no se pueden realizan o son poco eficaces.
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Ejemplo 15 Transposición para generar bibliotecas de presentación de péptidos perfeccionadas Antecedentes
Una vez que los recombinantes han sido caracterizados a partir de una biblioteca de exposición en fago, biblioteca de exposición de polisoma, o similar, es a menudo útil construir y seleccionar una segunda biblioteca de generación que muestre las variantes de la(s) secuencia(s) originariamente expuesta(s). Sin embargo, puesto que el número de combinaciones para polipéptidos más largos que siete residuos es tan grande, todas las permutaciones no están generalmente presentes en la biblioteca primaria. Además, mediante la mutación de secuencias, el "paisaje de secuencia" alrededor de la secuencia aislada puede ser examinado para encontrar unos locales óptimos.
Existen diferentes métodos disponibles para el experimentador en relación con los objetivos de la mutagénesis. Por ejemplo, unos métodos adecuados que incluyen mutagénesis dirigida, mutagénesis de "cassette", y tendencia al error RCP.
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Perspectiva
El método descrito para generar mutaciones in vitro se conoce como transposición de ADN. En una forma de realización de transposición de ADN, los genes se rompen en pequeños fragmentos aleatorios con ADNsa I, y son entonces reagrupados en una reacción de tipo RCP, pero normalmente sin ningún cebador. El proceso de reagrupamiento puede ser mutagénico en ausencia de una polimerasa de lectura y corrección que genera hasta alrededor de un 0,7% de nivel del error. Esto consiste en las dos transiciones y transversiones, a menudo distribuidas de forma aleatoria sobre la longitud del segmento reagrupado.
Una vez que se aísla un recombinante de exposición en fago con propiedades deseables, es generalmente apropiado mejorar o alterar las propiedades de enlace a través de un ciclo de evolución molecular mediante transposición de ADN. Las bibliotecas de segunda generación de péptidos de exposición y anticuerpos fueron generadas y aisladas en fago con (es decir, 3-1000 veces) una resistencia de enlace aparente perfeccionada. De esta forma, a través de unos ciclos repetidos de generación de biblioteca y selección es posible realizar un "proceso de escalada" a través del espacio de la secuencia para obtener un óptimo enlace.
Muy a menudo, a partir de las bibliotecas de segunda generación, se pueden aislar las especies de enlace más fuertes. El enriquecimiento selectivo de este tipo de fago puede ser realizado mediante selección con unas concentraciones blanco inferiores inmovilizadas sobre una placa de microtiter o en la solución, combinado con un lavado extensivo o por otros medios conocidos en la técnica. Otro opción es la de exponer la población mutagenizada de moléculas con una valencia inferior sobre el fago para seleccionar moléculas con unas constantes de afinidad superiores. Finalmente, es posible seleccionar librerías de segunda generación en presencia de una concentración baja de inhibidor de enlace (es decir, blanco, ligante) que bloquea el enlace eficaz del fago parenteral.
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Métodos Protocolos de mutagénesis ejemplar
Una forma de mutagénesis recombinante a base de ADN es conocida como mutagénesis dirigida mediante oligonucleótido. Se procede a diseñar un oligonucleótido de manera que su par base pueda ser un ADN meta, mientras difiere en una o más bases cerca del centro del oligonucleótido. Cuando este oligonucleótido es de par base respecto al modelo de ADN monocatenario, el heteroduplex se convierte en ADN bicatenario in vitro; de esta forma, una cadena del producto incluirá la secuencia nucleótida específica mediante el oligonucleótido mutagénico. Estas moléculas de ADN son entonces propagadas in vivo y el recombinante deseado se identifica en último lugar entre la población de transformantes.
A continuación, se procede a describir un protocolo para mutagénesis monocatenaria.
1. Preparar ADN monocatenario de fago o fagémidos M13. Aislar 2 \mug de ADN. El ADN puede aislarse de un huésped bacteriano dutung (fuente) de modo que el ADN recuperado contenga uracilo en lugar de muchos residuos de timina.
2. Diseñar un oligonucleótido que tenga al menos 15 o 20 residuos de complementariedad respecto a las regiones de codificación situadas junto al localizador que se debe mutar. En el oligonucleótido, la región que se debe aleatorizar puede ser representada mediante degeneración de codones. Si la región no complementaria es grande (es decir > 12 nucleótidos), entonces las regiones colindantes se extenderían para asegurar unos pares base apropiados. El oligonucleótido que se debe sintetizar con un grupo 5'PO4, puesto que mejora la eficacia del procedimiento de mutagénesis; este grupo puede también ser añadido de forma enzimática con quinasa polinucleótida T4. (En un tubo Eppendorf, incubar 100 ng de oligonucleótido con 2 unidades de quinasa polinucleótida T4 en 50 mM (pH 7,5), 10 mM de MgCl, 2,5 mM DTI, y OA mM ATP durante 30 mm.
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3. Hibridar el oligonucleótido con el ADN monocatenario en un tubo Eppendorf de 500 mg que contenga:
1 \mug de ADN monocatenario, 10 ng de oligonucleótido, 20 mM de Tr@Cl (pH 7,4), 2 mM de MgCl_{2}, 50 mM de NaCl.
4. Mezclar las soluciones de forma conjunta y centrifugar el tubo durante unos segundos para extraer el líquido. Calentar el tubo en un frasco que contenga agua calentada a 70ºC. Después de 5 min, transferir el frasco al banco de laboratorio y dejar que se enfríe lentamente a temperatura ambiente.
5. Retirar el tubo del baño maría y ponerlo sobre hielo. Añadir los reactivos siguientes al tubo, para un volumen total de 100 IA: 20 mM deTris-Cl (pH 7,4), 2 mM de DTT, 0,5 mM de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, 0,4 mM de ATP, 1 unidad de polimerasa de ADN T7, 2 unidades de ligasa de ADN T4.
6. Después de 1 hora, añadir EDTA a 10 mM de la concentración final.
7. Extraer 20 \mul de la muestra y utilizar un gel de agarosa. La mayor parte del ADN monocatenario se convertirá en un ADN circular cerrado de manera covalente. Electrophorese algunos controles de electrolorese en posibilidades adyacentes (por ejemplo, modelo, reacción modelo sin oligonucleótido). Añadir 14 Ligasa de ADN para cerrar el ADN circular bicatenario.
8. Retirar el resto del ADN (80 ml) mediante extracción de fenol y recuperar por precipitación de etanol.
9. Electroporar en bacterias ung^{+}.
10. Retirar la segunda generación de fago mediante precipitación PEG.
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Mutagénesis de "cassette"
Un medio apropiado de introducción de mutaciones en un lugar particular dentro de una zona de codificación es mediante mutagénesis de "cassette". El cassette puede ser generado de diferentes formas: A) mediante la hibridación de dos oligonucleótidos de forma conjunta y la conversión de estos en ADN bicatenario; B) Mediante una primera amplificación de segmentos de ADN con oligonucleótidos que llevan secuencias aleatorizadas y a continuación, reamplificando el ADN para crear el cassette para clonar; G) Mediante una primera amplificación de cada mitad de segmento de ADN con oligonucleótidos con secuencias aleatorizadas, y entonces mediante el calentamiento de las dos piezas juntas para crear el cassette para clonar; y D) Mediante tendencia al error RCP. Los cassettes formados según estos cuatro procedimientos se fijan en su longitud y marco de codificación, pero tienen codones que no son específicos a una baja frecuencia. De esta forma, la donación y expresión de los cassettes generará una pluralidad de péptidos o proteínas que tengan uno o más residuos mutantes a lo largo de la longitud completa del cassette.
Normalmente, se pueden usar dos tipos de esquema de mutagénesis. En primer lugar, algunos residuos en una proteína de exposición en fago o péptido pueden ser completamente aleatorizados. Los codones situados en estas posiciones pueden ser NNN, NNK, o NNS que usan 32 codones para codificar la totalidad de los 20 residuos. Estos también pueden sintetizarse como tripletes previamente formados o mediante la mezcla de oligonucleótidos sintetizados por el método de partición de resma que cubre de forma conjunta la totalidad de los 20 codones en cada posición deseada. Recíprocamente, un subconjunto de codones pueden utilizarse para favorecer ciertos aminoácidos y excluir otros. En segundo lugar, todos los codones incluidos en el cassette pueden tener una pequeña posibilidad de ser mutados. Esto se realiza mediante oligonucleótidos sintetizados con botellas "estudiadas en soluciones" con las otras tres bases o mediante alteración de la proporción de oligonucleótidos mezclados con el método de partición de resina.
Para la mutagénesis de regiones limitadas, se prefiere de forma general la mutagénesis de "cassette" con oligonucleótido sintético. Más de un cassette puede utilizarse a la vez para alterar las diferentes regiones de forma simultánea. Esta proximidad se prefiere cuando se crea una biblioteca de anticuerpos mutantes, en la que la totalidad de las seis regiones de determinación complementaria (RDG) se alteran de forma contemporánea.
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Codones aleatorios
1. Diseñar oligonucleótidos con posiciones fijas y mutadas. Las posiciones fijas corresponderían a los lugares de donación y a aquellas regiones de codificación que presuntamente serían esenciales para el enlace o la función.
2. Durante la síntesis del oligonucleótido, hacer que el oligonucleótido sintetizador entregue cantidades equimolares de cada base para N, guanosina y citosina para K, guanosina y timidina para S.
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Codones "estudiados en soluciones"
1. Diseñar oligonucleótidos con posiciones fijas y mutadas. Las posiciones fijas corresponden a los lugares de donación y dichas regiones de codificación son presuntamente esenciales para el enlace o la función. La probabilidad de hallar n errores a lo largo de un cassette de polinucleótidos largos m sintetizado con una fracción x de los otros tres nucleótidos en cada posición se representa mediante:
10
2. Durante la síntesis de oligonucleótido, desconexión de las botellas de base. Utilizar botellas con un 100% de cada base para las posiciones fijas y botellas con 100-x% de una base y x/3% de cada una de las otras tres bases. La proporción de impurificación puede también diferir basándose en el uso medio de aminoácido en proteínas globulares naturales u otros algoritmos. Existe un programa informático disponible de forma comercial, CyberDope, que puede ser usar para ayudar en la determinación de las mezclas de la base con el fin de sintetizar oligonucleótidos con esquemas de impurificación particulares. Una muestra del programa CyberDope puede obtenerse mediante el envío de una solicitud por e-mail a cyberdope@aol.com.
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Codones dirigidos
1. Diseñar oligonucleótidos con posiciones fijas y mutadas. Las posiciones fijas corresponden con los lugares de donación y con aquellas regiones de codificación que presuntamente son esenciales para el enlace o función. Se ha descrito un método para insertar una serie de oligonucleótidos en un lugar de enzima de restricción específica que codifica la totalidad de los veinte aminoácidos (Kegler-Ebo et al. (1994) Nucl. Acids Res. 22: 1593, incorporados en este caso mediante referencia).
2. Durante la síntesis de oligonucleótido dividir la resma en cada codón.
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Tendencia al error RCP
Existen diferentes protocolos basados en la alteración de las condiciones estándar RCP (Saiki et al. 1988) Science 239: 487, incorporada en este caso mediante referencia) para incrementar el nivel de mutación durante la amplificación. La adición de concentraciones elevadas dNTP y/o Mn^{+2} aumenta el nivel de mutación de forma significativa. Puesto que teóricamente, las mutaciones se introducen de forma aleatoria, se trata de un mecanismo para generar poblaciones de proteínas nuevas. Por otra parte, la secuencia al error RCP no es adecuada para modificar las secuencias péptidas cortas porque las regiones le codificación son cortas, y el nivel de cambio sería demasiado bajo para generar un número adecuado le mutantes para la selección, ni sería ideal para proteínas largas, porque habrían muchas mutaciones dentro de la zona de codificación que complica el análisis.
1. Diseñar cebadores oligonucleótidos situados junto a la zona de codificación de interés en el fago. Estos son a menudo aproximadamente 21 nucleótidos en longitud y se encuentran junto a la región que se debe mutagenizar. El fragmento que se debe amplificar puede llevar lugares de restricción en su interior para permitir una subclonación sencilla en el vector apropiado.
2. La reacción siguiente se establece:
1 pmole de cada cebador; 1 pmole del modelo de ADN; 100 mM NaCl, 1 MM MnCb, 1 mM DTT, 0,2 mM de cada dNTP, 2 unidades de Taq polimerasa de ADN.
3. Cubrir el líquido con aceite mineral.
4. Someter a un ciclo de operaciones 24 veces entre 30 seg a 94ºC, 30 seg 45ºC, y 30 seg a 72ºC para amplificar fragmentos hasta 1 kb. Para fragmentos más largos, se alarga la etapa de 72ºC en aproximadamente 30 seg para cada kb.
5. Extender la reacción RCP durante 5-10 mm a 72ºC para aumentar la fracción de moléculas que son de cuerpo entero. Esto es importante si los terminales del fragmento contienen lugares de restricción usados en la subclonación posterior.
6. La Reacción RCP se controla de forma opcional por electroforesis de gel.
7. El Producto RCP se digiere con la(s) enzima(s) de restricción apropiada para generar extremos adhesivos. Los fragmentos de restricción pueden ser gel purificado.
8. El Segmento de ADN es donado en un vector adecuado mediante ligadura y se introduce en células huésped.
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Transposición de ADN
En la transposición de ADN, los genes se rompen en pequeños fragmentos aleatorios con un agente lítico de enlace fosfodiéster, como ADNsa I y entonces se reagrupa en una reacción de tipo RCP, pero sin requerir ningún cebador añadido. El proceso de reagrupamiento puede ser mutagénico en ausencia de un polimerasa de lectura y corrección, que genera hasta aproximadamente un 0,7% de error cuando se utilizan de 10 a 50 fragmentos bp.
1. El RCP amplifica el fragmento que se debe transponer. A menudo es conveniente para el RCP de una colonia bacteriana o placa. Tocar la colonia o placa con un palillos estériles y remover en una mezcla de la reacción RCP (tampon, deoxinucleótidos, cebadores oligonucleótidos). Eliminar los palillos y remover la reacción durante 10 mm a 99ºC. Enfriar la reacción a 72ºC, añadir 1-2 unidades de Taq polimerasa de ADN, y se somete la reacción a un ciclo 35 veces durante 30 seg a 94ºC, 30 seg a 45ºC, 30 seg a 72ºC y finalmente calentar la muestra durante 5 mm a 72ºC. (Las condiciones dadas son para un gen de 1 kb y son modificados según la longitud de la secuencia tal como se describe).
2. Eliminar los cebadores libres. Es importante la extracción completa del cebador.
3. Se fragmentan aproximadamente 2-4 mg de ADN con 0,15 unidades de ADNsa 1 (Sigma, St. Louis, MO) en 100 ml de 50 mM Tris-Cl (pH 7.4), 1 MM MgCl_{2}, durante 5-10 mm a temperatura ambiente. Congelar sobre hielo seco, verificar el tamaño de control de fragmentos sobre un 2% gel de agarosa con un bajo punto de fusión o equivalente, y descongelar para continuar la digestión hasta el uso de las posibilidades de tamaño deseado. Las posibilidades de tamaño deseado dependen de la aplicación; para transponer un gen de un 1 kb, los fragmentos de 100-300 bases son normalmente adecuados.
4. Las posibilidades de tamaño de un fragmento de ADN deseado es gel purificado a partir de un 2% de gel de agarosa con un bajo punto de fusión o equivalente. Un método preferido consiste en insertar una pequeña pieza de papel de intercambio de iones Whatman DE-81 justo delante del ADN, se administra el ADN en el papel, se pone el papel en 0,5 ml 1,2 M NaCl en TE, vortex 30 seg, entonces se gira cuidadosamente todo el papel, se transfiere el sobrenadante y se añaden 2 volúmenes de 100% de etanol para precipitar el ADN; no es necesario ningún tipo de enfriamiento de la muestra. Se procede entonces a lavar el ADN granulado con 70% de etanol para eliminar los restos de sal.
5. El ADN granulado es resuspendido en la mezcla RCP (Promega, Madison, WI) que contiene 0,2 mM cada DNTP, 2,2 MM MgCl_{2}, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl, pH 9,0; 0,1% Tritón X100, con una concentración de alrededor de 10-30 ng de fragmentos por ml de mezcla RCP (normalmente de 100-600 ng por 10-20 ml de reacción RCP). No se requiere que los cebadores se añadan a esta reacción RCP. La Taq polimerasa de ADN (Promega, Madison, WI) solo puede ser usada si se desea un nivel sustancial de mutagénesis (hasta 0,7% con 10-50 bp fragmentos de ADN). Se espera la inclusión de una polimerasa de lectura y corrección, como un 1:30 (vol/vol) mezcla de Taq y Pfu ADN polimerasa (Stratagene, San Diego, CA) para obtener un nivel de error inferior y permitir unas secuencias RCP muy largas. Un programa de 30-45 ciclos de 30 seg 94ºC, 30 seg 45-50ºC, 30 seg 72ºC, llevado a cabo a 4ºC se usa en un MJ Research PTC-150 minimezclador (Cambridge, MA). El progreso del ensamblaje puede controlarse mediante análisis de gel. A este punto, el producto RCP contiene el producto de tamaño correcto en una extensión de dimensiones más grandes y más pequeñas.
6. El producto correctamente reagrupado de este primer RCP se amplifica en una segunda reacción RCP que contiene cebadores externos. Se procede a diluir 40x las partes alícuotas de 7,5 ml del reensamblaje RCP con la mezcla RCP que contiene 0,8 pM de cada cebador. Se administra un programa RCP de 20 ciclos de 30 seg 94ºC, 30 seg 50ºC, y 30-45 seg a 72ºC, con 5 min a 72ºC al final.
7. Se digiere entonces el producto RCP deseado con enzimas de restricción terminales, gel purificado, y donado en un vector, que se introduce a menudo, en una célula huésped.
La recombinación específica de lugar puede también ser usada, por ejemplo, para transponer cadenas de anticuerpos pesadas y ligeras en células bacterianas infectadas como un medio de aumentar la afinidad de enlace y la especificidad de moléculas de anticuerpos. Es posible usar el sistema Cre/lox (Waterhouse et al. (1993) Nucl. Acids Res. 21: 2265; Griffiths et al. (1994) EMBO J. 13: 3245, y el sistema int.
Es posible coger recombinantes y transponerlos de forma conjunta para combinar mutaciones ventajosas que se producen sobre moléculas de ADN diferentes y es también posible coger un inserto de exposición recombinante y "retrocruzarlo" con secuencias parentales por transposición de ADN para eliminar todas las mutaciones que no contribuyen a los rasgos deseados.
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Ejemplo 16 Transposición Perfeccionada para generar bacterias de detoxificación de arseniato
La detoxificación arsenical es importante para el aurífero de arsenopirita que contiene minerales de oro y otros usos, como remedios medioambientales. El plásmido pCJ103, que contiene un arseniato de operón de detoxificación de la codificación del operón (Wang et al, (1989) Bacteriol. 171: 83), se obtuvo de Prof. Simon Silver (U. of Illinois, Chicago, IL). E. coli TC1 que contiene pJC103, que contiene el p1258 ars operón donado en pUC19, tenía una CIM (concentración inhibitoria mínima) de 4 \mug/ml sobre placas amp LB. El plásmido entero 5,5 kb fue fragmentado con ADNsa 1 en fragmentos de 100-1000 bp, y reagrupado por RCP usando los reactivos Perkin Elmer XL RCP. Tras el ensamblaje, el plásmido fue digerido con la enzima de restricción única BamHI. El monómero de longitud total fue purificado a partir del gel de agarosa, ligado y sometido a electroporación en células E. coli TG1. Las células transformadas fueron dispuestas en placas sobre un margen de concentraciones del arseniato del sodio (2, 4, 8,16 mM en la etapa 1), y aproximadamente 1000 colonias fueron agregadas a partir de las placas con un nivel máximo de arseniato mediante raspado de dichas placas. Las células crecieron en líquido en presencia de la misma concentración de arseniato, y se obtuvo el plásmido a partir de dicho cultivo. Las etapas 2 y 3 fueron idénticas a la etapa 1, exceptuando el hecho de que las células fueron dispuestas en placas a unos niveles de arseniato superiores. 8, 16, 32, 64 mM fueron usados para la etapa 2; y 32, 64,128, 256 mM fueron usados para la selección de la etapa 3.
Los mejores mutantes crecieron durante la noche hasta 12B mM de arseniato (CIM=256), obteniendo una mejora de 64 veces. Una de las cepas perfeccionadas mostraron que el TG1 (tipo salvaje pCGJ103) creció en líquido a hasta 10 mM, mientras que el TC1 transpuesto (mutante pGJ103) creció hasta obtener una concentración de arseniato de 150 mM.
El programa RCP para el ensamblaje fue de 94ºC 20s, 50x(94ºC 15s, 50ºC 1 mm, 72ºC 30s+2s/ciclo), usando un formato circular RCP sin cebadores.
Resultaron cuatro ciclos del proceso de 50 a 100 veces mejores en la resistencia al arseniato conferido por el operón transpuesto de la resistencia al arseniato; las bacterias que contienen el operón perfeccionado crecieron sobre un medio que incluía hasta 500 mM de arseniato.
La figura 19 muestra la intensificación de resistencia a la toxicidad del arseniato como resultado de la transposición del plásmido pGJ102 que contiene el vehículo de operón de detoxificación del arseniato.
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Ejemplo 17 Transposición para generar una bacteria perfeccionado de detoxileación del cadmio
El plásmido pYW333 puesto que contiene un operón para la detoxificación del mercurio es un plásmido de 15,5 kb que incluye al menos 8 genes que codifican un recorrido para la detoxificación del mercurio (Wang et al. (1989) Bacteriol. 171:83), se obtuvo a partir de Prof. Simon Silver (Univ. Ilinois, Chicago, IL). Se obtuvieron 400-1500 fragmentos bp tal y como se ha descrito anteriormente y se han ensamblado con los reactivos XL-RCP. Tras la electroporación directa del ADN ensamblado en E. coli TGI, las células fueron dispuestas en placas sobre un margen de niveles de cloruro de mercurio (sigma) bajo un protocolo similar al descrito para el arseniato en el Ejemplo 15. El CIM inicial de mercurio fue de 50-70 \muM. Se llevaron a cabo cuatro ciclos de transposición de plásmido entero y se aumentó la detoxificación medida como resistencia bacteriana al mercurio de alrededor de 50-70 \muM para sobre 1000 \muM con una mejora de 15 a 20 veces.
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Ejemplo 18 Intensificación de reacciones de transposición por adición de detergente catiónico
El nivel de renaturación de cadenas complementarias de ADN se limita a la transposición de secuencias de transposición largas y complejas. Este nivel de la renaturación puede ser realzado 10.000 veces mediante la adición de detergente catiónico simple (Pontins and Berg (1991) PNAS 88: 8237). La renaturación es específica e independiente de hasta un exceso de 106 veces de ADN heterólogo. En presencia de estos agentes, el nivel en el que las cadenas complementarias de ADN se encuentran mutuamente en la solución se transforma en limitación.
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La adición de TMAC en una reacción de ensamblaje de un plásmido de 15 kb seguida de electroporación en E. Coli obtuvo los resultados siguientes:
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La adición de CTAB en una reacción de ensamblaje de un plásmido de 15 kb seguida de electroporación en E. coli obtuvo los resultados siguientes:
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Ejemplo 19 Transposición de secuencia mediante perturbación RCP
La perturbación constituye la fragmentación por extensión de polimerasa incompleta de modelos. Se procedió a emplear un formato de recombinación basado en duraciones muy cortas de extensión RCP para crear productos RCP parciales, que continúan extendiendo un modelo diferente en el(los) ciclo(s) (y posterior(es)). Existía un sesgo pronunciado del nivel de crecimiento entre modelos muy similares, que indicaba que este formato cuenta con unas limitaciones significantes para la aplicación de grupos complejos. Si se usa con un mezclador rápido como el mezclador de aire, este formato puede trabajar mejor.
Los programas RCP usados para la perturbación RCP fueron 100 ciclos de (94ºC 15 seg, 60ºC 15 seg). Dos reacciones separadas RCP fueron llevadas a cabo para obtener 1 kb de fragmentos RCP que contienen cada uno de los dos sustratos de ensayo GFP negativo (PFV de terminación 1 y PFV de terminación 2). Los recombinantes PFV positivos sólo pueden obtenerse por recombinación de estos dos modelos. Los cebadores oligonucleótidos usados en la extremidad 5 son 5'TAGCGGATCCTACCTACCTGACGC, que contienen un localizador NheI, y el oligo en la extremidad 3 es 5'GAAAATCTTCTCTCATCC, que contiene un lugar EcoRI. Se procedió a elaborar una reacción RCP con un ing de cada gen negativo PFV como un modelo. Los reactivos Taq RCP pueden utilizarse, pero el uso de condiciones RCP con tendencia al error (Leung, 1989; Cadwell and Joyce, 1992) que reducen la procesividad, pueden aumentar el porcentaje de recombinantes positivos PFV.
Un programa de perturbación de 50-150 ciclos de 94ºC 10-20s, 60ºC 10-30s fue usado sobre un Stratagene Robocycler. El producto RCP perturbado fue digerido con NheI y EcoRI y donado de nuevo en el vector digerido pBAD 18 con NheI y EcoRI y sometido a electroporación en E. coli y dispuesto en placas amp. Las colonias positivas PFV aumentan mediante recombinación entre las secuencias de ADN negativas GEP y fueron detectadas. El porcentaje de colonias positivas GEP obtenidas mediante perturbación fue de entre 0,1-10%, dependiendo de las condiciones.
Un gen sintético fue diseñado para cada proteína, usando el (óptimo E. coli) uso de codón idéntico basado en la secuencia nativa de aminoácidos. Este proceso aumenta la homología ADN de los genes sintéticos relativos a los genes que se producen de forma natural, y nos permite transponer de una forma más lejana secuencias relacionadas que serían posibles sin el ajuste del uso del codón. Se ensamblaron cada uno de los cuatro genes de 30 60 mer oligos y 6 40 mers. El ensamblaje fue realizado por ensamblaje RCP tal y como se describe en Stemmer et al (1995; Gene 164:49-53). Tras el ensamblaje, los genes fueron donados en lugares Sf 11 del vector pUC322 Sfi-BLA-Sfi (Stemmer et al (1995) Gene 164:49-53), y se dispusieron en placas sobre unos medios selectivos. La actividad inhibitoria mínima de estas cuatro construcciones se estableció para una amplia variedad de antibióticos de betalactama. La cefotaxima fue uno de los antibióticos seleccionados para una optimización en contra. Los cuatro genes fueron transpuestos para la fusión de 1 ng de producto CR de cada gen, seguido de digestión de la ADNsa 1 del grupo y purificación de 100-300 bp de fragmentos de geles de agarosa. Los fragmentos purificados fueron reagrupados mediante RCP sexual inicialmente sin cebadores externos, y entonces el producto de cuerpo entero fue amplificado en presencia de los cebadores externos. Los genes de cuerpo entero resultantes fueron digeridos con Sfii y ligados creando vectores frescos pUC322Sfi-Sfi, sometido a electroporación creando células de E. coli frescas, y disponiendo en placas aumentando la concentración de varios antibióticos, que incluye cefotaxima, tal y como ha sido previamente descrito por Stemmer (1994) Nature 370:389-391.
Se prefiere una transposición manual de protocolo RCP para la mezcla de genes que son menos de 80-90% homólogos. El RCP manual utiliza un termolábil de polimerasa de ADN, como un fragmento Klenow de sondeo de ADN. El programa inicial RCP con fragmentos en tampón Klenow a 10-30 ng/ul y dNTPS:
1- Desnaturalizar 94ºC 20s
2- Enfriamiento rápido: etanol en hielo seco 5s, hielo 15 s
3- Añadir enzima Klenow
4- hibridar/extender 2 mm 25ºC
5- Remover de nuevo para desnaturalizar (ciclo 1)
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Esto se repite durante 10-20 ciclos para iniciar la conmutación modelo, después de lo cual se continua creando un RCP regular con polimerasas termoestables para unos 10-20 ciclos adicionales con el fin de amplificar la cantidad de producto.
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Ejemplo 20 Transposición de bibliotecas de anticuerpos de exposición en fago
Una estructura Fv de monocadena humana estable y bien expresada (VH 2S1-Yr A25) se obtuvo de una biblioteca de ab-fago construida a partir de un humano original mARN por selección para el enlace en la toxina de la difteria. Esta estructura scFv fue usada para construir una biblioteca de ab-fago original que contiene seis RDCs mutados sintéticamente basados en las secuencias de línea germinal. El grado de mutagénesis de cada residuo fue similar a su variabilidad de origen natural dentro de su familia de región V.
Un Producto RCP que contiene el gen scFv fue fragmentado de forma aleatoria con digestión ADNsa I y los fragmentos de 50-100 bp fueron purificados. Los oligonucleótidos sintéticos, que contienen cada uno un RDC mutado situado junto a 19 bp de homología respecto al modelo scFv, fueron añadidos a los fragmentos aleatorios con una proporción molar de 10:1. Una biblioteca de genes ScFV mutados, de longitud total fue reagrupada a partir de los fragmentos mediante RCP sexual. La donación en la proteína de píldora de M13 fago obtuvo como resultado una biblioteca de ab-fago con unidades 4 x 10^{7} en forma de placa. Las combinaciones de RDCs mutante y nativo fueron caracterizadas mediante la colonia RCP con cebadores específicos para el RDCs nativo (ver, Figura. 7). Los seis RDCs mutados fueron incorporados con un 32-65% de eficacia y una amplia variedad de combinaciones. La secuenciación del RDCs mutado mostró que el nivel de mutación observado alcanzaba el nivel esperado.
Esta biblioteca de Ab-fago fue inmunopurificada durante dos ciclos en placas microtiter para el enlace con diez de proteínas humanas blanco, y siete de estos objetivos produjeron clones ELISA positivos. Un reconocimiento que produjo clones positivos fue el receptor humano G-CSF. Los clones positivos de receptor G-CSF estaban sujetos a una segunda etapa y un cuarto de unos clones de fago de segunda etapa fueron ELISA positivos para el enlace con el receptor G-CSF.
Este grupo diferente fue empleado para valorar la idoneidad de tres estrategias de optimización de secuencia diferente (RCP convencional, tendencia al error RCP, y transposición de ADN). Después de un ciclo único de cada una de estas alternativas. La transposición de ADN ha mostrado una ventaja siete veces superior, ambos en el porcentaje de Ab-fago recuperado y en el receptor específico de señal ELISA G-CSF. La inmunopurificación fue continua durante seis ciclos adicionales, mediante la transposición del grupo de genes scFv después de cada etapa. El rigor de selección aumentó de forma gradual hasta dos lavados de una hora a 50ºC en PBS-Tween con la presencia de un receptor G-CSF de exceso soluble. En las etapas de 3 a 8, casi un 100 por cien de los clones fueron ELISA positivo. Cuando los grupos de distintos ciclos fueron evaluados con un rigor idéntico el porcentaje de enlace de fago aumentó 440 veces del ciclo 2 al ciclo 8, tal y como se muestra en la Fig. 31. Los clones de fago individuales de cada etapa mostraron un aumento similar en la señal específica ELISA. La secuenciación mostró que el scFv contenía un promedio de 34 (n=4) mutaciones de aminoácido, de las cuales sólo cuatro estuvieron presentes en todas las secuencias valoradas.
Con el objetivo de reducir la inmunogenicidad potencial, contribuyendo de forma neutra o débil, las mutaciones fueron eliminadas mediante dos ciclos de retrocruce, con un exceso de 40 veces de un gen scFv de línea germinal construida de forma sintética, seguido de inmunopurificación rigurosa. El número medio de mutaciones de aminoácido en el scFvs retrocruzado fue casi dividido en 18 (n=3), del cual sólo cuatro estuvieron presentes en todas las secuencias. Los clones de Ab fago retrocruzados mostraron que enlazaban fuertemente y con una especificidad excelente el receptor humano G-CSF. La Figura 32 muestra el efecto de diez ciclos de selección para diferentes proteínas humanas blanco; se llevaron a cabo seis ciclos de transposición y dos ciclos de retrocruce. La Figura 33 muestra los índices de recuperación relativos de fago, para la inmunopurificación con BSA, Ab 179, o receptor G-CSF, después del RCP convencional ("no transpuesto"), tendencia al error RCP, o recombinación de secuencia recurrente ("transpuesta").
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Ejemplo 21 Optimización de PFV en Células mamíferas
El vector plásmido pCMV-PFV, que codifica la PFV y la expresa bajo el control de un promotor CMV, fue crecido en células TG1 y se utilizó para transferir las Células CHO en ensayos de expresión transitorios.
El plásmido fue salvado de la técnica fluorescente de células activadas seleccionada de forma transitoria que expresa células TG1 mediante un método de proteinasa K o un método PreTaq (GibcoIBRL). Básicamente, la técnica fluorescente de células activadas fue recogida mediante centrifugado, congelada y descongelada de forma repetitiva, incubada con proteinasa K o PreTaq, extraída de fenol/cloroformo, precipitada de etanol, usada para transformar E. coli dispuestas a continuación en placas amp. Los resultados fueron:
Método de proteinasa K: entrada - 5 x 10^{4} salvado 3 x 10^{4}
Método pretaq: entrada - 5 x 10^{4} salvado 2 x 10^{4}
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El plásmido salvado creció sobre y 5 \mug fue parcialmente digerido, con ADNsa 1 y entre 50 y 700 fragmentos bp fueron gel purificado, precipitado de etanol, y resuspendido en 330 \mul de 3,3x RCP tampón, 44 \mul Mg(OAc)_{2} (Perkin-Elmer),193 \mul 40% PEG, 80 \mul 10 mM dNTPs, 20 \mul Tth polimerasa, 2 \mul de polimerasa Pfu, 7 \mul de TMAC (Sigma), y 367 \mul H_{2}O. El RCP fue conducido sobre un minimezclador MJ Research PTC-150 durante 40 ciclos (94ºC, 30 seg; 50ºC, 30 seg, 72ºC, 60 seg) con tres conjuntos de cebadores, obteniendo como resultado tres fragmentos RCP de extremidad superpuesta, que de forma conjunta y tras la digestión y la ligadura procedió a reconstruir el plásmido entero. Los Fragmentos RCP fueron digeridos con AlwN1 y los fragmentos fueron gel purificado, ligado y sometido a electroporación en células TG1. El ADN del plásmido fue preparado y sometido a electroporación en células CHO, seleccionadas mediante técnica fluorescente de células activadas para los células, expresando de forma transitoria las señales PFV más brillantes.
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Claims (11)

1. Método para desarrollar una variante de polinucleótido para la adquisición de una propiedad funcional deseada, que incluye
la conducción de una reacción de amplificación polinucleótida sobre substratos iniciales incluyendo una pluralidad de variantes de un polinucleótido, donde al menos un ciclo de la reacción de amplificación es un ciclo de amplificación incompleto realizado bajo condiciones que produzcan los productos de amplificación que incluyen las variantes de polinucleótido extendidos de forma incompleta, dichos productos de amplificación siendo desnaturalizados en cadenas de componentes, que son rehibridados en parejas diferentes para formar productos de amplificación recombinada, que forman los substratos para un ciclo posterior de amplificación hasta que los productos de amplificación incluyan variantes recombinantes del polinucleótido; y
la selección o cribado de las variantes recombinantes del polinucleótido para identificar al menos una variante recombinante que tenga una propiedad funcional deseada.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1 donde las condiciones que resultan en una extensión incompleta son conseguidas acortando el tiempo de extensión del proceso de amplificación relativo a las condiciones de amplificación que conducen a una extensión completa de las variantes del polinucleótido.
3. Método según la reivindicación 1 donde las condiciones que resultan en una extensión incompleta son obtenidas añadiendo un aditivo o polimerasa.
4. Método según la reivindicación 1 comprendiendo además la adición de oligonucleótidos que se hibridan con componentes de productos de amplificación en la etapa de hibridación.
5. Método según la reivindicación 1 donde la reacción de amplificación polinucleótida es realizada usando taq polimerasa y recA o una segunda polimerasa es añadida en al menos un ciclo de amplificación incompleta.
6. Método según la reivindicación 1 donde las variantes del polinucleótido comprenden variantes naturales, opcionalmente, variantes alélicas o de especies.
7. Método según la reivindicación 6 donde las variantes de origen natural del polinucleótido comprenden variantes de especies de un gen.
8. Método según la reivindicación 1 donde al menos un polinucleótido variante muestra al menos un 80% de identidad de secuencia con un polinucleótido variante a lo largo de la secuencia del segundo polinucleótido variante.
9. Método según la reivindicación 1 donde la propiedad deseada de un polinucleótido recombinante producido es una propiedad del polinucleótido o su producto de expresión seleccionado del grupo que consiste en la capacidad de enlazar un receptor, resistencia a un fármaco, actividad terapéutica, adecuación para la terapia genética y adecuación para su uso como vacuna a base de ADN.
10. Método según lo reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 9 que incluye de forma adicional la expresión de al menos una variante recombinante que tiene la propiedad deseada para producir una proteína recombinante.
11. Método según la reivindicación 10 donde dicha proteína es una enzima, una proteína viral o un anticuerpo.
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